TUGAS AKHIR PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI …TUGAS AKHIR PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN 5-FLUOROURACIL TERHADAP

TUGAS AKHIR

PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIKBAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN

5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN

Karya Ilmiah Akhir sebagai salah satu persyaratan untuk menyelesaikanProgram Pendidikan Dokter Spesialis I Ilmu Bedah

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret / RSUD Dr. Moewardi Surakarta

Disusun oleh :Mohammad Ali Yusni

NIM.S5604002

Pembimbing :Dr.dr.Ida Bagus Metria, SpB(K)BD

Dra. Dyah Ratna Budiani, M.SiProf.Dr.dr. Ambar Mudigdo, SpPA(K)

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS ILMU BEDAHFAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET

/RSUD Dr.MOEWARDI SURAKARTA2008

ii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Alloh SWT yang telah melimpahkan

karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah akhir yang

berjudul :

PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK

BAWANG DAYAK (Eleutherine palmifolia, L.,Merr) DAN

5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN

PERTUMBUHAN GALUR SEL

KARSINOMA KOLON HT29

DAN EKSPRESI p53 MUTAN

Karya ilmiah akhir ini disusun sebagai salah satu persyaratan untuk

menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis I di bidang Ilmu Bedah di

Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum

Daerah Dr.Moewardi Surakarta.

Karya ilmiah akhir ini tidak akan terselesaikan tanpa dukungan dari berbagai

pihak lain, baik berupa dukungan moril maupun material. Penulis mengucapkan

terima kasih yang sebesar – besarnya kepada :

1. Dr.dr. Ida Bagus Metria,Sp.B(K)BD., selaku pembimbing utama yang telah

memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini.

2. Dra. Dyah Ratna Budiani,M.Si., selaku pembimbing pendamping yang telah

memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini.

3. Prof.Dr.dr. Ambar Mudigdo, Sp.PA(K)., selaku pembimbing pendamping

yang telah memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini.

4. dr.Bintang Soetjahjo, SPOT., selaku kepala Bagian/SMF Bedah Fakultas

Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah

Dr.Moewardi Surakarta.

5. dr. Soebandrijo, Sp.B,Sp.BTKV., selaku Ketua Program Studi PPDS I Ilmu

Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum


6. dr.Soeharto Wijanarko,SpU., selaku Sekretaris Program Studi PPDS I Ilmu

Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum


iii

7. Seluruh senior dan staf Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas

Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr.Moewardi Surakarta.

8. dr.William A.P,SpB, dr. Dyah Andriana, dr.Tumpal Daniel P, dr.Ivan Hendra

S yang telah bekerja sama dalam penelitian ini.

9. Seluruh Paramedis dan non Paramedis di RSUD Dr. Moewardi Surakarta.

10. orang tua, mertua, dan seluruh keluarga besar saya yang telah memberikan

suport dan semangat dan doa sehingga saya bisa menyelesaikan pendidikan

ini.

11. Istri tercinta (dr.Dwi Agustina Ramadani) dan putri tercinta ( Alyssa Rizqia

Putri) yang dengan setia, sabar dan tabah telah menemani, membantu dan

selalu memberikan motivasi dan doa agar pendidikan ini dapat terselesaikan.

12. Seluruh rekan – rekan residen bedah dan semua fihak yang tidak dapat saya

sebutkan satu persatu yang telah membantu baik secara langsung maupun

tidak langsung.

Semoga Alloh SWT melimpahkan rahmat-Nya kepada kita semua. Harapan

kami, semoga penelitian akhir ini dapat bermanfaat bagi semua fihak. Terimakasih.

Hormat kami,

Penulis

iv

Telah diuji dan diseminarkan pada hari Sabtu, 13 Desember 2008, di bagian Bedah

RSUD Dr. Moewardi Surakarta, penelitian tugas akhir yang berjudul :

PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN


KPS PPDS I Bedah FK UNS/ SPS PPDS I Bedah FK UNS/

RSUD Dr.Moewardi Surakarta RSUD Dr.Moewardi Surakarta

dr. Soebandrijo,SpB.SpBTKV dr. Soeharto Widjanarko,SpU

NIP : 140 153 956 NIP : 140 222 096

KSMF Bedah

RSUD Dr.Moewardi Surakarta

dr. Bintang Soetjahjo,SpOT

NIP : 140 228 594

iv

DAFTAR ISI

JUDUL PENELITIAN ……………………………………………………………. iKATA PENGANTAR .............................................................................................. iiDAFTAR ISI ............................................................................................................. ivDAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viDAFTAR TABEL ..................................................................................................... viiDAFTAR SINGKATAN ........................................................................................... viiiABSTRAK ................................................................................................................ xBAB I : PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang Masalah ...................................................... 1I.2. Perumusan Masalah .............................................................. 3I.3. Tujuan Penelitian ............................................................... 3I.4. Manfaat Penelitian ............................................................... 4

I.4.1. Manfaat teoritik ............................................................ 4I.4.2. Manfaat praktis ............................................................ 4

BAB II : TINJAUAN PUSTAKAII.1. Kanker ............................................................................. 5II.2. Siklus Sel ............................................................................. 9II.3. Apoptosis pada Kanker ..................................................... 14II.4. Adeno Karsinoma Kolon ..................................................... 18

II.4.1. Definisi ................................................................ 18II.4.2. Anatomi ................................................................ 19II.4.3. Insidensi ................................................................ 20II.4.4. Etiologi dan faktor predisposisi .......................... 20

II.4.4.1 Perubahan genetik ............................... 21II.4.4.1.1. Perubahan genetik pada

karsinoma kolon.................. 21II.4.4.1.2. Gen APC............................... 23II.4.4.1.3. Gen DCC............................... 24II.4.4.1.4. Gen p53................................. 24II.4.4.1.5. K-Ras proto-oncogens........... 26II.4.4.1.6. Mismatch repair genes......... 26

II.4.4.2 Pengaruh lingkungan ........................... 27II.4.5. Klasifikasi ............................................................... 28

II.4.5.1 Derajat histopatologi ............................. 28II.4.5.2 Stadium klinik ....................................... 29

II.4.6. Diagnosis ............................................................... 31II.4.7. Terapi .................................................................... 32

II.4.7.1 Pembedahan .......................................... 32II.4.7.2 Terapi adjuvant .................................... 33

II.4.8 Prognosis ............................................................... 34II.5. Bawang Dayak (Eleutherine Palmifolia L.Merr) .................. 34

II.5.1 Morfologi 35II.5.2 Kandungan bahan kimia umbi bawang dayak 37

II.5.2.1. Flavonoid 38

v

II.5.2.2. Antrakinon 41II.5.2.3. Terpenoid 42II.5.2.4. Kaumarin 42

II.6. 5-Fluorouracil (5-FU) ............................................................ 43II.7. Galur Sel Adeno Karsinoma Kolon HT29 ........................... 44II.8. Kerangka Teori ........................................................................ 45

BAB III : KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESISIII.1. Kerangka Konseptual ........................................................ 46III.2. Hipotesis ......................................................................... 47

BAB IV : METODE PENELITIANIV.1 Jenis Penelitian .................................................................. 48IV.2. Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................. 48IV.3. Subyek Penelitian ............................................................... 48IV.4 Besar Sampel ............................................................... 48IV.5. Alat dan Bahan ............................................................... 49

IV.4.1. Alat ............................................................... 49IV.4.2. Bahan ............................................................... 49

IV.6. Cara Kerja ........................................................................ 50IV.6.1. Kultur sel ............................................................ 50IV.6.2. Starvasi ............................................................ 51IV.6.3. Uji sitotoksisitas ................................................ 51

IV.6.3.1. Kontrol negatif ................................. 52IV.6.3.2. Kontrol positif ................................. 52IV.6.3.3. Perlakuan dengan fraksi etanolik

bawang dayak........................................53

IV.6.4. Imunohistokimia ................................................ 53IV.6. Variabel Penelitian ........................................................... 54

IV.6.1. Variabel bebas .................................................. 54IV.6.2. Variabel tergantung ......................................... 54

IV.7. Definisi Operasional Variabel ......................................... 54IV.8. Rancangan Penelitian ........................................................ 56IV.9. Analisa Data .................................................................... 57

BAB V HASIL DAN ANALISA DATAV.1 Hasil Penelitian .............................................................. 58V.2 Analisa Data .............................................................. 62

BAB VI PEMBAHASANVI.1 Ekspresi p53 Mutan ...................................................... 65VI.2 Sifat Sitostatik Ekstrak

Etanolik Bawang Dayak ......................................................70

BAB VII KESIMPULAN DAN SARANVII.1 Kesimpulan ........................................................................ 75VII.2 Saran ........................................................................ 75

DAFTAR PUSTAKA Lampiran 1Lampiran 2

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Kelainan allele pada gen penekan tumor ......................................... 7Gambar 2 Skema karsinogenesis ……………………………………………. 9Gambar 3 Siklus sel …………………………………………………………. 10Gambar 4 Siklus sel kanker …………………………………………………. 12Gambar 5 Alur kerja p53 …………………………………………………… 13Gambar 6 Alur kerja Apoptosis …………………………………………….. 16Gambar 7 Perubahan sel akibat apoptosis dan necrosis …………………… 18Gambar 8 Anatomi sistema gastrointestinal ……………………………….. 19Gambar 9 Skema jalur LOH pada perkembangan karsinoma kolon dan

rectum …………………………………………………………… 22Gambar 10 Skema jalur RER pada perkembangan karsinoma kolon dan rectum 23Gambar 11 Domain protein p53 dan lokasi hot spot ........................................ 25Gambar 12 Gen penekan tumor p53 dan pRb ………………………………… 25Gambar 13 Hubungan antara faktor genetik dan lingkungan pada

karsinogenesis karsinoma kolon dan rectum …………………….. 27Gambar 14 Proses perkembangan karsinoma kolorectal ……………………. 29Gambar 15 Foto pohon bawang dayak ………………………………………. 35Gambar 16 Foto umbi bawang dayak .............................................................. 36Gambar 17 Foto bunga bawang dayak yang mekar .......................................... 36Gambar 18 Foto bunga bawang dayak yang kuncup ........................................ 37Gambar 19 Struktur dasar flavonoid …………………………………………. 41Gambar 20 Struktur dasar atrakinon …………………………………………. 42Gambar 21 Struktur dasar kaumarin …………………………………………. 43Gambar 22 Ekspresi p53 mutan pada uji tanpa perlakuan ............................... 59Gambar 23 Ekspresi p53 mutan pada uji dengan fraksi etanolik ekstrak

bawang dayak 3,125µl/ml ……………………………………….. 60Gambar 24 Ekspresi p53 mutan pada uji dengan 5-fluorouracil 150 µl/ml ….. 60Gambar 25 Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada kelompok ekstrak

bawang dayak …………………………………………………… 61Gambar 26 Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada kelompok 5-FU ………. 62Gambar 27 Profil uji regresi bawang dayak ………………………………….. 63Gambar 28 Profil uji regresi 5_FU …………………………………………… 64

vii

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Perbedaan apoptosis dan necrose …………………………………… 18Tabel 2 Dukes clasification and 5 year survival …………………………….. 20Tabel 3 Stadium klinis dari karsinoma kolon .................................................. 31Tabel 4 Prosentase tampilan p53 mutan pada masing – masing sampel ......... 61

viii

DAFTAR SINGKATAN

DNA : Deoxiribo Nukleid Acid

Rb : Retinoblastoma

DCC : Deleted in cell Colorectal Carcinoma

APC : Adenomatous Polyposis Colli

WT-1 :Wilm’s Tumor-1

NF-1 : Neurofibromatosis type-1

RNA : Ribo Nukleid Acid

CDK : Cyclin Dependent Kinase

CDKI : Cyclin Dependent Kinase Inhibitor

DR : Death Reseptor

IGF-BP3 : Insulin like Growth Factor-Binding Protein 3

c-LAP2 : Celluler Inhibitor of Apoptosis Protein 2

NAIP1 : Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein

Fas-L : Fas Ligan

Mdm2 : Murine doble minute-2

PARP : Poly (Adenosine 5’diphosphate-Ribose) Polymerase

TNFR : Tumor Necrosis Factor Receptor

MAP : Mitogen Activating Protein

JNK : c-Jun N Terminal Kinase

PTP : Permeability Transition Pore

ATP : Adenosine Tri Phospat

FAP : Familial Adenomatous Polyposis

HNPCC : Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer

LOH : Loss of Heterozygocity

RER : Replication Error

TAD : Transcription-Activation Domain

PRD : Proline Rich Domain

DBD : DNA-Binding Core Domain

OD : Oligomerisation Domain

CEA : Carcino Embrionic Antigen

ix

MAP : Mitogen Activating Protein

dUMP : Deoxi Uridilate Mono Phosphate

dUTP : Deoxi Uridilate Tri Phosphate

dTMP : Deoxi Thymidine Mono Phosphate

dTTP : Deoxi Thymidine Tri Phosphate

F-dUMP : 5-Fluoro-2-deoxiuridin 5-Monophosphate

FBS : Fetal Bovine Serum

USG : Ultra Sono Gram

CT Scan : Computed Tomo Scan

x

PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN


Mohammad Ali Yusni

ABSTRAK

Latar belakang masalah : Angka kejadian kanker colon semakin meningkat dan dengan perkembangan ilmu pengetahuan dibidang biologi molekuler mempengauhi penatalaksanaan kanker kolon termasuk melihat perilaku sel neoplastik ,salah satunya adalah ekspresi p53mutan.Banyak tanaman obat di Indonesia yang terbukti bersifat sebagai anti kanker termasuk juga bawang dayak tetapi penggunaannya sebagian besar berdasarkan empiris dan belum diteliti secara eksperimental termasuk juga terhadap kanker kolon HT29, karena itu dilakukan penelitian invitroterhadap kanker kolon HT29 dengan melihat ekspresi p53 mutan .Metode : Sel kanker kolon HT29 dilakukan kultur kemudian distarvasi setelah itu dicari LC50 (Lethal Concentration )dari fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU. Setelah ditentukan LC50 dan 3 konsentrasi dibawahnya dilakukan pemeriksaan imunohistokimia dengan melakukan pengulangan sebanyak 6 kali kemudian ekspresi p53 mutan ditampilkan dalam bentuk prosentase sel.Hasil : Untuk 5-FU sebagai kontrol (+) pada konsentrasi 150 μg/ml didapatkan ekpresi p53 mutan sebesar 0%, konsentrasi 75 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 4%, konsentrasi 37,5 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 3,11%, konsentrasi 18,75 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 4,42% sedangkan untuk fraksi etanolik bawang dayak pada konsentrasi 3,125 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 5,49%, konsentrasi 1,516 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 6,55%, konsentrasi 0,78 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 8,89%, konsentrasi 0,39 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 32,41%Kesimpulan : fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU mempunyai potensi penekanan terhadap ekspresi p53 mutan dan tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU terhadap penekanan ekspresi p53 mutan.

Kata kunci : Fraksi etanolik bawang dayak (Eleutherine Palmifolia L.Merr), 5-FU, ekspresi p53 mutan

BAB I

PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang Masalah

Kanker kolon adalah penyebab kematian kedua terutama pada negara

berkembang. Pada tahun 2005 di Amerika didapatkan sebanyak 104.950 pasien

dengan kanker kolon dengan angka kematian mencapai 47.700 pasien dan ini

merupakan 11% dari seluruh kematian yang disebabkan kanker. Dalam setahun

didapatkan sekitar 940.000 kasus baru dari kanker kolon dengan angka kematian

mencapai 500.000 pasien di seluruh dunia (World Health Organisation,2003). Di

Indonesia, angka kejadian yang pasti dari kanker kolon belum ada, tetapi mempunyai

kecenderungan meningkat. Dari evaluasi data Departemen Kesehatan Republik

Indonesia pada tahun 1986 didapatkan angka kejadian 1,8 setiap 100.000 penduduk. 1

Berdasarkan data histopatologik kanker di Indonesia tahun 1996 dan 1999, kanker

kolon menempati urutan ke-9 yaitu sebanyak 3,11% dan 3,33 %.2,3. Insiden dari

kanker kolon sejak tahun 1950 semakin meningkat kemungkinan kebanyakan

disebabkan oleh pola konsumsi masyarakat yang sering mengkonsumsi makanan

daging dan banyak mengandung lemak dengan sedikit makanan yang mengandung

serat.28,33.

Masalah yang kita hadapi adalah pengelolaan kanker kolon yang sampai saat

ini masih berdasarkan pada stadium klinik dan tingkat diferensiasi sel secara

histopatologis, yang mungkin belum mencerminkan perilaku biologis sel pada

adenokarsinoma kolon.

Kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang kedokteran khususnya

bidang biologi molekuler yang sangat pesat, mempengaruhi tatacara penanganan

2

kanker kolon, mulai dari deteksi dini , diagnostik, terapi, prediksi tingkat keganasan,

prognosis dan penanganan tindak lanjut. Pemeriksaan imunohistokimia dapat

memberi informasi mengenai kandungan berbagai unsur protein didalam sel normal

maupun neoplastik . Banyak perkembangan baru dijumpai dalam bidang

biomolekuler, bidang diagnosis, prognosis dan terapi pada kanker kolon.4

Selain prosedur baku secara medis, banyak cara yang dilakukan penderita

untuk mencari kesembuhan dari penyakit kanker, salah satunya dengan menggunakan

tanaman obat. 5 Banyak jenis tanaman obat yang sudah lama dikenal sebagai obat anti

kanker, beberapa sudah diisolasi kandungannya menjadi obat kemoterapi. Obat-obat

kemoterapi berkembang dari empirik klinik, ditunjukkan dengan kenyataan bahwa

banyak bahan-bahan sitostatika telah mendapat tempat yang tetap di klinik. Hal

serupa juga terjadi dalam penggunaan tanaman obat untuk pengobatan kanker,

diantaranya kanker colon, meskipun efek dari tanaman obat tersebut dalam

menghambat proliferasi sel kanker belum teruji secara ilmiah.5

Tanaman obat Indonesia telah secara sporadis diteliti di berbagai Universitas

dan lembaga penelitian di Indonesia. Tujuan beberapa penelitian ini umumnya untuk

membuktikan apakah penggunaan suatu tanaman obat terhadap penyakit kanker bisa

dibuktikan secara ilmiah.6 Penelitian-penelitian yang pernah ada sebelumnya lebih

bersifat pembuktian atas rasionalitas atau irrasionalitas penggunaan tanaman tersebut

sebagai obat dan bukan suatu pencarian obat baru. Tanaman-tanaman obat tersebut

memang sudah biasa digunakan sebagai obat dan dirasakan efektivitasnya secara

empiris, sehingga penelitian yang dilakukan adalah upaya untuk memahaminya.6.7

Berdasarkan uraian diatas maka dianggap perlu dilakukan penelitian untuk

membuktikan adanya kemampuan ekstrak bawang dayak dalam menghambat

proliferasi sel kanker kolon sekaligus menekan ekspresi protein p53 mutan secara in

3

vitro dengan menggunakan galur sel kanker kolon HT29. Sehingga ekstrak tersebut

nantinya dapat digunakan sebagai terapi komplementer atau sebagai terapi substitusi

pada pengobatan medis konvensional.21

I.2. PERUMUSAN MASALAH

1. Apakah fraksi etanolik bawang dayak mempengaruhi tingkat ekspresi p53

mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro?

2. Apakah 5-fluorouracil mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada

biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro?

3. Apakah terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan

secara in vitro antara fraksi etanolik bawang dayak dengan 5-fluorouracil

pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro?

I.3.TUJUAN PENELITIAN

1. membuktikan potensi fraksi etanolik bawang dayak dalam mempengaruhi

tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29

secara in vitro

2. Membuktikan potensi 5-fluorouracil dalam mempengaruhi tingkat ekspresi

p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro

3. Membuktikan tidak terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53

mutan secara in vitro antara fraksi etanolik bawang dayak dengan 5-

fluorouracil pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro.

4

I.4. MANFAAT PENELITIAN

I.4.1. Manfaat Teoritik

1. Diharapkan dapat memberi informasi ilmiah mengenai kemampuan fraksi

etanolik bawang dayak dalam menghambat proliferasi sel kanker kolon dan

penekanan ekspresi P53 mutan secara in vitro.

2. sebagai sarana untuk meningkatkan pengetahuan dan kemampuan peneliti

dalam bidang biologi molekuler.

3. Memberi kontribusi ilmiah terhadap penelitian – penelitian kanker kolon

selanjutnya.

I.4.2. Manfaat Praktis.

Sebagai dasar ilmiah untuk mengkaji efek klinis lebih lanjut dari senyawa

bioaktif anti kanker dan kemopreventif yang terdapat pada bawang dayak dan

diharapkan dapat dikembangkan sebagai obat anti kanker yang baru ataupun

sebagai terapi komplementer dari terapi yang ada.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Kanker

Kanker adalah suatu penyakit dengan ciri gangguan atau kegagalan

mekanisme pengaturan multiplikasi pada organisme multiseluler sehingga terjadi

perubahan yang tidak terkontrol. Perubahan sel (transformasi) ini disebabkan

oleh perubahan gen di dalam sel. Sel-sel yang telah mengalami transformasi terus

menerus berproliferasi dan menekan pertumbuhan sel normal. Pertumbuhan

kanker yang tidak terkendali tersebut diikuti dengan invasi ke jaringan

sekitar dan metastase ke bagian tubuh lain6,7,8,17.

Karsinogenesis merupakan proses pembentukan sel kanker yang

patogenesisnya secara molekuler merupakan penyakit genetik. Proses ini terjadi

akibat pengaruh berbagai faktor (multifaktorial) yang menyerang tubuh secara

bertahap (multistage). Bahan – bahan yang dapat menyebabkan sel kanker disebut

karsinogen. Berdasarkan asalnya, maka karsinogen dapat berasal dari faktor

eksogen seperti karsinogen kimiawi, virus dan fisik, dan karsinogen yang berasal

dari faktor endogen seperti hormon sex. Adapula yang memasukkan kokarsinogen

seperti diet, umur, keturunan, rangsang menahun dan trauma sebagai perangsang

terbentuknya sel kanker.35

Perubahan sel normal menjadi sel kanker melalui 3 tahap yaitu tahap

inisiasi, promosi dan progresi. Pada tahap inisiasi, terdapat faktor inisiator

yang memulai pertumbuhan sel yang abnormal seperti radiasi, bahan kimia

mutagenic, virus, mutasi spontan. Pada tahap promosi dipicu oleh promotor

seperti tumor promotor, gowth faktor, virus sehingga terbentuk sel – sel yang

6

polimorfis dan anaplastik. Pada tahap progresi ditandai dengan adanya invasi

sel ganas ke membrana basalis atau kapsul.11 Perubahan keganasan melibatkan

beberapa gen yaitu onkogen, gen penekan tumor, gen yang berperan dalam

perbaikan DNA (DNA repair gen), dan gen pengatur apoptosis. 4, 11, 12

Onkogen adalah gen yang berkaitan dengan terjadinya transformasi

neoplastik. Onkogen ini berasal dari protoonkogen yang mengalami mutasi.

Protoonkogen adalah gen yang mengatur proliferasi normal. Perubahan yang

dialami protoonkogen seluler pada aktivasi menjadi onkogen selalu bersifat

mengaktivasi, artinya mereka menstimuli suatu fungsi sel yang mengakibatkan

pertumbuhan dan diferensiasi sel. Walau ada sel yang mengalami pembelahan diri

secara tak terkendali, masih belum mengarah ke bentuk kanker, karena sel-sel

sekitar akan bereaksi dengan mengeluarkan growth inhibitor (zat pengahambat

pertumbuhan). Zat pengahambat pertumbuhan ini akan mengikat ke reseptor sel

yang malfungsi, mengirimkan signal ke inti sel, mengaktifkan gen penekan

tumor. Proses timbulnya keganasan pada tingkat molekuler dapat diamati dari

produksi protein yang berlebihan yang dihasilkan oleh onkogen. Aktivasi onkogen

merangsang produksi reseptor faktor pertumbuhan yang tidak sempurna, yang

memberi isyarat pertumbuhan terus-menerus meskipun tidak ada rangsang dari

luar. Proses proliferasi yang tidak terkendali tanpa diiringi maturasi sel dapat

mengakibatkan gangguan diferensiasi sel. Pada tahap selanjutnya, gangguan

diferensiasi sel akan mencerminkan progesifitas sel menjadi ganas.5,8,19,20

Gen penekan tumor berfungsi sebagi penghambat pertumbuhan sel, apabila

diaktifkan maka akan menghentikan siklus pembelahan sel, sehingga dapat

mencegah pembelahan sel selanjutnya. Tetapi apabila gen penekan tumor

malfungsi disebabkan mutasi, maka sel abnormal yang terus membelah diri tidak

7

menanggapi pesan growth inhibitor yang dikeluarkan oleh sel sekitarnya untuk

menghentikan pembelahan sehingga terjadi proses malignansi. 19,20 Kelainan pada

gen penekan tumor bersifat resesif, artinya baru menimbulkan tumor kalau

kedua allele menunjukkan kelainan atau bahkan kehilangan kedua allele.19

Gambar 1. Kelainan allele pada gen penekan tumor. 54

Contoh gen penekan tumor adalah gen Rb, p53, DCC (Deleted in Cell

Colorectal Carsinoma), APC (Adenomatous Polyposis Colli), WT-1 (Wilm’s

Tumor-1), NF-1 (Neurofibromatosis type-1) dan NF-2 (Neurofibromatosis type-2).

20

Identifikasi mutasi gen penekan tumor telah membuka era baru pada

kemajuan ilmu genetika. Bila hasil tes molekuler menunjukkan bahwa

individu memiliki mutasi pada gen penekan tumor maka dapat segera

dilakukan tindakan untuk mengurangi kesempatan individu tersebut terserang

karsinoma.

TUMOR SUPPRESOR GENE“two-hit”theory

8

Apoptosis ialah kematian sel terprogram yang terjadi baik pada beberapa

proses fisiologik maupun proses neoplasma. Penumpukan sel pada neoplasma

tidak hanya terjadi sebagai akibat aktifasi gen perangsang pertumbuhan atau

tidak aktifnya gen penekan tumor, tetapi juga oleh karena mutasi gen pengatur

apoptosis. Pertumbuhan sel diatur oleh gen perangsang dan gen penghambat

pertumbuhan, maka kehidupan sel ditentukan oleh gen perangsang dan

penghambat apoptosis. 8,19,22

Tahap inisiasi diawali dengan kegagalan mekanisme DNA repair sehingga

paparan inisiator seperti hormon, radiasi, mutasi spontan dan bahan kimia

mutagenik pada sel yang terinisiasi menyebabkan terjadinya perubahan urutan

nukleotida DNA proto-onkogen sehingga ekspresi gen berubah meskipun

jaringan masih terlihat normal. Tahap inisiasi merupakan proses yang

berlangsung cepat dan bersifat reversibel. 19,20,22

Tahap inisiasi akan berlanjut menjadi tahap promosi apabila se1 yang

terinisiasi tadi terpapar oleh promotor seperti faktor pertumbuhan dan infeksi

virus sehingga sel akan berkembang menjadi sel preneoplasi. Pada sel

preneoplasi akan terjadi transformasi urutan DNA sel sehingga ekspresi protein

yang dikode gen tersebut ikut berubah. Tahap promosi ini tidak terjadi dalam

waktu singkat, selain itu juga harus ada serangan promotor yang terus-menerus.

Sebenarnya proses tersebut dapat dihambat oleh anti onkogen, gen penekan tumor

dan faktor diferensiasi, akan tetapi bila faktor- faktor anti karsinogenik tadi

gagal melaksanakan fungsinya maka sel preneoplasi akan menjadi sel tumor in

situ. 19,20,36

Sel tumor in situ jika kembali mendapat paparan inisiator akan berkembang

menjadi sel tumor infiltratif yang merupakan tahap akhir karsinogenesis yaitu

9

tahap progresi. Proses perkembangan menjadi sel tumor infiltratif dihambat oleh

mekanisme apoptosis, faktor diferensiasi, penghambat angiogenesis dan sistem

imun tubuh. 19,36

Pro-carcinogenetic factor Normal Cell Anti-carcinogenetic factor Normal Phenotype

Initiated Cell

Preneoplasia

Malignant Phenotype :Drug resistant, Angiogenesis

and Immunotolerant

Invasive tumor

Promotion

Progression

Initiation DNA Repair

Growth inhibitors.Diff. factors

Diff. FactorsImmunosurveillanceLack of Angiogenesis.Apoptosis.

Radiation

Mutagenic chemicals.

Viruses.

Spontaneous Mutation

Tumor PromotersGrowth FactorViruses.

Radiation

Mutagenic chemicals.

Viruses.

Spontaneous Mutation

Gambar 2. Skema Karsinogenesis 36

II.2. Siklus Sel

Siklus sel secara normal terbagi dalam empat fase, yaitu: G1, S, G2, M

dan diselingi dengan fase istirahat yaitu Go20.

Fase awal dimulai dengan G1 , pada fase ini sel mulai mempersiapkan

untuk melakukan sintesa DNA dan juga melakukan biosintesa RNA dan

protein10,11. Kemudian dilajutkan dengan fase S, dimana pada fase ini terjadi

replikasi DNA. Pada akhir fase ini sel telah berisi DNA ganda dan kromosom

telah mengalami replikasi 20. Setelah fase S berakhir sel masuk dalam fase pra

mitosis (G2) dengan ciri: sel berbentuk tetraploid, mengandung DNA dua kali

lebih banyak dari pada sel fase lain dan masih berlangsungnya sintesis RNA

dan protein. Sewaktu mitosis berlangsung (fase M) sistesis protein dan RNA

berkurang secara tiba-tiba, dan terjadi pembelahan menjadi 2 sel. Setelah itu sel

10

memasuki fase istirahat (Go). Sel dalam fase Go yang masih potensial untuk

berproliferasi disebut sel klonogenik atau sel induk (stem cell)10. Jadi yang

menambah jumlah sel kanker ialah sel yang dalam siklus proliferasi dan

dalam fase Go.20

Gambar 3. Siklus sel.57

Perubahan dari satu fase ke fase berikutnya pada siklus sel diatur oleh

beberapa checkpoint. Kontrol checkpoint berfungsi untuk memastikan bahwa

kromosom utuh dan tahap-tahap kritis siklus sel telah sempurna sebelum

memasuki tahap selanjutnya6. Pengaturan checkpoint tersebut melibatkan

aktivasi dan degradasi cyclin, aktivasi cyclin dependent kinases (CDKs),

cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKIs). Interaksi diantara ketiga kelas

protein tersebut berperan mengontrol berbagai tahap siklus sel, mencegah

sel ke tahap selanjutnya jika terjadi kerusakan DNA melalui mekanisme

checkpoint dan deregulasi proses ini berperan dalam kejadian kanker. 19,20

Pada kanker terjadi perubahan pada pengaturan siklus sel. Selama

11

perkembangan sel kanker, baik secara genetik maupun epigenetik,

biasanya mempengaruhi ekspresi protein-protein pengatur siklus sel. Hal

ini dapat menyebabkan overekspresi cyclin dan kehilangan ekspresi CDK

inhibitor dan mengakibatkan deregulasi aktivitas CDK. Pada sel kanker juga

terjadi ketidakmampuan kontrol checkpoint, mengakibatkan respon yang

menyimpang terhadap adanya kerusakan seluler. Contohnya, kerusakan DNA

pada fase G1 normalnya menyebabkan berhentinya siklus sel atau terjadi

apoptosis tergantung pada tingkat kerusakannya, sehingga sel tidak bisa

memasuki fase S karena dihentikan pada G16. Ketidakmampuan kontrol

checkpoint menyebabkan inisiasi fase S atau mitosis tetap berlangsung

meskipun ada kerusakan seluler dan ketidakstabilan genetik yang selanjutnya

menimbulkan clone maligna.12,15

Aktivitas dari kompleks cyclin-CDK yang mengontrol checkpoint

tersebut diatur dengan cara fosforilasi dan defosforilasi. Satu substrat protein

utama dari CDK adalah Rb. Rb saat kondisi hipofosforilasi berikatan dan

menginaktifkan faktor transkripsi E2F. Fosforilasi melepaskan E2F dari

kompleks Rb dan E2F. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E, cyclin A dan

protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Cyclin E membentuk

kompleks dengan CDK2 dan meningkatkan fosforilasi Rb. E2F yang dihasilkan

akan menginduksi transkripsi gen seperti DNA polymerase dan thymidin

kinase.7,12,13,15,

12

Gambar 4. Siklus sel kanker. 37

Protein lain yang berperan dalam kontrol checkpoint ini antara lain p53,

CDKI, p21. Pada sel yang normal, ekspresi p53 wild type rendah. Ketika

terjadi kerusakan DNA maka p53 wild type akan teraktivasi dan mengaktifkan

p21 yaitu suatu Cdk Inhibitor7,15. P21 ini akan mengikat dan menginaktifkan

kompleks CDK4 yang akan menyebabkan fosforilasi Rb terhambat dan

pelepasan faktor transkripsi E2F terhenti sehingga siklus sel terhenti pada

tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk

memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya6,7,12,15.

Jika kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi maka sel akan

memasuki jalur apoptosis.

Jalur aktivasi dari p53 dapat terbagi menjadi 5 bagian :

1. Signal stressor yang memacu dan merangsang p53

2. Upstream aktivasi mediator akibat rangsangan p53 protein

3. Core Regulation dari p53.

4. Dowstream efek terhadap sel sebagai respon rangsangan p53 protein

5. Output seluler sebagai respon dari rangsangan p53

13

gambar 5: Alur kerja p53.55

Adanya akumulasi dari protein p53 wild type yang terjadi akibat adanya

kerusakan DNA memegang peranan penting di dalam DNA repair. Protein p53

akan merangsang keluarnya p21 yang dapat mengakibatkan terjadinya cell cycle

arrest. Cell cycle arrest ini dapat memberikan waktu bagi sel untuk melakukan

DNA repair yang mengalami kerusakan sehingga apabila berhasil sel dapat

berproliferasi secara normal. Apabila terjadinya kerusakan sel hebat dan tidak

bisa dilakukan repair, maka jalur apoptosis akan diaktifkan untuk mengeliminasi

sel yang mengalami kerusakan. Apabila normal DNA repair tidak terjadi karena

terjadi mutasi dari p53 , maka sel dapat berproliferasi secara abnormal dan dapat

terjadi keganasan. p53 dapat merangsang apoptosis dengan merangsang expresi

dari gen pro apoptosis seperti Bax, Fas/Apo-1, Death Reseptor 5 (DR5) atau

insulin Like Growth Fator-Binding Protein 3 (IGF-BP3), atau dengan

merangsang expresi gen anti apoptosis seperti Bcl-2, celluler inhibitor of

14

Apoptosis Protein 2 (c-IAP2) dan Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein 1

(NAIP1). Jika Apoptosis tidak terjadi karena terjadi mutasi dari p53 atau

deregulasi dari interaksi Fas-FasL maka sel dapat berkembang kearah

keganasan. Aktivitas protein p53 wild type sebagai tumor supresor dapat

diturunkan atau dihambat oleh protein Mdm2 yang mengakibatkan terjadinya

degradasi dari p53 wild type menjadi lebih cepat. Gen Mdm2 itu sendiri juga

diaktifkan oleh p53 sehingga dapat dikatakan dapat memberikan umpan balik

negatif (negative autoregulatory loop).34,37

Tidak berfungsinya kontrol checkpoint yang mengakibatkan gagalnya

respon penghentian siklus sel pada sel kanker dapat menjadi target potensial

terapi antikanker6,43. Sel dengan kontrol checkpoint yang rusak lebih sensitif

terhadap perubahan genotoksik atau kerusakan mikrotubular. Pengembangan

obat antikanker yang didasarkan pada regulasi siklus sel selanjutnya diarahkan

pada penghambatan terjadinya proses pembelahan sel, sehingga senyawa atau

protein yang diberikan pada penderita dapat mencegah sintesis DNA dan

mitosis sehingga menghentikan proliferasi sel kanker.6,7,44,45

II.3. Apoptosis Pada Kanker

Pada organisme multiseluler, homeostasis jaringan dipengaruhi oleh

proliferasi, diferensiasi dan kematian sel. Sebagaimana proliferasi dan

diferensiasi, apoptosis penting dalam mengontrol pertumbuhan. Adanya

gangguan dalam program tersebut akan mengakibatkan pertumbuhan sel

abnormal.8,20

Apoptosis adalah tipe kematian sel yang terprogram melalui serangkaian

perubahan struktural sebagai hasil dari rangsang fisiologis atau

15

patologis8,26. Ciri morfologi apoptosis adalah pengkerutan sel, penonjolan

membran (membrane blebbing), kondensasi kromatin, dan fragmentasi inti

sel.26 Gambaran tersebut adalah hasil dari aktivasi caspase, yaitu keluarga

protease yang substratnya meliputi prekursor enzim yang dapat menyebabkan

destruksi proteolitik sitoskeleton dan metabolit protein yaitu poly (adenosine-

5’diphosphate-ribose) polymerase (PARP), DNA-dependent protein kinase,

lamin, protein kinase, dan aktin.20,50

Apoptosis terjadi melalui dua jalur utama yaitu, jalur ekstrinsik atau death

receptor (DR) dan jalur intrinsik atau jalur mitokondria.50,51

Death receptor pathway dimulai dengan pengaktifan tumor necrosis

factor receptor (TNFR), yang meliputi Fas, death receptor (DR) 4, TNFRI

dan TNFRII. Fas menginduksi apoptosis melalui dua jalur. Jalur pertama

dengan mengikat ligan. Ikatan ligan mengaktifkan reseptor TNFRI dan Fas

untuk menarik dan mengikat Protein death effector Fadd/Mort-1. Ikatan

Fadd/Mort-1 menarik procaspase 8. Procaspase 8 diubah menjadi bentuk

aktifnya yaitu caspase 8 dan dilepaskan kembali ke dalam sitosol50,52.

Caspase 8 akan memecah dan mengaktifkan caspase 3. Jalur kedua lewat

jalur alternatif sinyal transduksi. Reseptor Fas berikatan dengan protein

adapter yang akan mengaktifkan mitogen activating protein kinase (MAP3) dan

memicu kaskade fosforilasi yang meningkat pada aktivasi c-Jun N terminal

kinase (JNK). JNK yang teraktivasi memfosforilasi substrat seperti c-Jun dan

p53 dan menginduksi apoptosis lewat berbagai mekanisme, meliputi

modifikasi dan pengaturan protein pada famili Bcl-2.50

Pada jalur mitokondria, salah satu kejadian yang menyebabkan

apoptosis adalah pelepasan sitokrom c dari mitokondria melalui porus yang

16

dibentuk oleh mitochondrial permeability transition pore (PTP) dan protein

pro apoptosis Bax13,14. Jika PTP berasosiasi dengan Bax maka keduanya

dapat membentuk suatu kanal spesifik untuk sitokrom c dan faktor-faktor

yang menginduksi apoptosis. Asosiasi antara Bax dengan PTP dan

aktivitas pembentukan porus dicegah oleh protein anti apoptosis BcI-2.

Sitokrom c yang dilepaskan oleh mitokondria ke sitosol akan berinteraksi

dengan Apaf-1 untuk membentuk apoptosom yang akan merekrut dan

mengaktivasi procaspase-9. Caspase-9 yang aktif akan melakukan

pemecahan terhadap caspase efektor yaitu caspase-3, -6, dan -7. Caspase

efektor ini kemudian melakukan pemecahan terhadap banyak substrat di

dalam sel yang penting, dan menimbulkan perubahan morfologis yang khas

pada apoptosis.50,51.

Gambar 6. Alur kerja Apoptosis50,56

17

Apoptosis dan gen yang mengontrolnya mempunyai efek yang besar pada

fenotip keganasan. Gangguan pada program apoptosis akan menyebabkan

mortalitas sel. Mutasi onkogenik yang mengganggu apoptosis

mempengaruhi inisiasi tumor, progresifitas tumor dan metastase.50,51,52.

Hampir semua obat anti kanker yang digunakan sekarang,

dikembangkan dengan penyaringan yang dirancang untuk mengidentifikasi

bahan yang secara selektif membunuh tumor. 50 Hubungan antara apoptosis

dengan terjadinya kanker memberikan ide penelitian tentang target dan

mekanisme farmakologi obat-obat anti kanker. 50 Suatu obat anti kanker

yang poten untuk menginduksi dan mengaktifkan apoptosis dapat

menghindari banyaknya efek samping yang tidak diharapkan karena

pelepasan material-material sampah akibat nekrosis sel, dan mengurangi

kerusakan sel-sel normal yang disebabkan oleh kemoterapi. Proses apoptosis

juga dapat digunakan untuk mengevaluasi toksisitas obat. Gangguan dan

mutasi gen pada program apoptosis dapat mengurangi sensitivitas terapi dan

menyebabkan resistensi obat.50

Disamping apoptosis dikenal cara kematian yang lain yaitu nekrosis

yang dapat terjadi oleh karena kegagalan sintesa ATP oleh mitokondria.

Nekrosis merupakan kematian sel yang tejadi secara patologis, dengan

penyebab utama gangguan produksi ATP. Pada setiap kerusakan jaringan

misalnya akibat radikal bebas, bahan toksik, atau bahan infeksius, kedua

proses ini berjalan bersama dengan proporsi yang berbeda dan saling

berkaitan.50

18

Gambar 7. Perubahan sel akibat apoptosis dan nekrosis50

Apoptosis Nekrosis

Peran sel Aktif Pasif

Distribusi Tersebar Terkonsentrasi pada satu

daerah atau menyebar dari satu

titik ( contiguous)

Morfologi Volume sel menyusut Volume sel mengembang

Membran

sel

Dipertahankan Rusak

Induksi Perlahan ( jam) Cepat ( detik – menit)

Pembersihan

sel mati

Cepat Lambat

Inflamasi Tidak ada Ada

Tabel 1. Perbedaan Apoptosis dan Nekrose

II.4. Adenokarsinoma Kolon

II.4.1. Definisi

Adenokarsinoma kolon berasal dari sel epitel yang mengalami displasia,

yang berkembang menjadi adenoma, dan terus berkembang dan terjadi invasi ke

19

mukosa muskularis menuju proses keganasan. Tahapan-tahapan ini dianggap

sebagai dasar terjadinya adenokarsinoma kolon.1,6,7

II.4.2.Anatomi

Panjang kolon sekitar 150 cm yang terbagi menjadi beberapa bagian

meliputi coecum, kolon ascenden, kolon tranversum, kolon descenden dan kolon

sigmoid. Ileocoecal junction, coecum, kolon tranversum dan kolon sigmoid terletak

intraperitoneal dan kolon ascenden dan kolon descenden terletak retroperitoneal.

Vaskularisasi dari ilocoecal junction sampai dengan fleksura lienalis berasal dari

arteri mesenterika superior, sedangkan mulai dari fleksura lienalis sampai kolon

sigmoid berasaldari arteri mesenterika inferior.28,31

Gambar 8. Anatomi sistema Gastrointestinal 31

20

II.4.3. Insidensi

Resiko terjadinya karsinoma kolon mulai meningkat setelah usia 40 tahun,

dan meningkat tajam pada umur 50 sampai 55 tahun. 1 Karsinoma kolon memiliki

insidensi dan angka kematian yang cukup tinggi di negara-negara berkembang. Di

Amerika Serikat, angka kejadian pertahun lebih dari 150.000 dan rata-rata kejadian

kasus baru sekitar 110.000 untuk karsinoma kolon dan 45.000 kasus pada karsinoma

rektum, dan merupakan penyebab kematian kedua dari semua kematian akibat

kanker. Dengan diagnosa dini dan terapi yang adekuat angka ketahanan hidup

mencapai 5 tahun dapat ditingkatkan.29,30

Stage Description 5-Year Survival

A Limited to the bowel wall 83%

B Extension to pericolic fat; no nodes 70%

C Regional lymph node metastases 30%

D Distant metastases (liver, lung, bone) 10%

Table 2. Dukes Classification and 5-Year Survival

II.4.4 Etiologi dan faktor predisposisi

Penyebab karsinoma kolon belum diketahui dengan pasti. Secara umum

dinyatakan bahwa untuk perkembangan karsinoma kolon merupakan interaksi

antara faktor lingkungan dan faktor genetik. Faktor lingkungan multipel beraksi

terhadap predisposisi genetik atau defek yang didapat dan berkembang menjadi

karsinoma kolon.1,10 Tumor ini muncul pada lesi di tunika mukosa yang dalam

perkembangannya mengadakan invasi ke tunika muskularis, struktur vaskuler,

kelenjar limfe regional struktur sekitar dan akhirnya dapat metastase secara

sistemik.29,30

21

II.4.4.1. Perubahan Genetik

Dengan bertambahnya penelitian di bidang biologi molekuler, pengaruh

faktor genetik terbukti mempunyai hubungan yang erat dengan perkembangan

karsinoma kolon.

II.4.4.1.1. Perubahan Genetik pada Karsinoma Kolon

Terdapat 3 kelompok karsinoma kolon berdasarkan perkembangannya,

yaitu :

1. Kelompok yang diturunkan (inherited) yang mencakup kurang dari 10 % dari

karsinoma kolon dan rektum, terdapat pada mereka yang dilahirkan sudah

dengan mutasi germline (germline mutation) pada salah satu allele dan terjadi

mutasi somatik pada allele yang lain. Contohnya adalah FAP (Famillial

Adenomatous polyposis) dan HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal

Cancer). HNPCC terdapat pada sekitar 5% dari karsinoma kolon dan rektum. 1

2. Kelompok sporadik, yang mencakup sekitar 70%, pada kelompok ini

membutuhkan dua mutasi somatik, satu pada masing-masing allele-nya.

3. Kelompok familial, yang mencakup 20% dari karsinoma kolon dan rektum,

lebih dari 35% terjadi pada umur muda. 1

Terdapat 2 model perjalanan perkembangan karsinoma kolon dan rektum

(karsinogenesis) yaitu LOH (Loss of heterozygocity) dan RER (Replication Error).

Model LOH mencakup mutasi gen penekan tumor meliputi gen APC, DCC, dan

p53 serta aktifasi onkogen yaitu K-ras. Model ini contohnya adalah perkembangan

polip adenoma menjadi karsinoma.

22

Gambar 9. Skema Jalur LOH pada perkembangan karsinoma kolon dan rektum 53

Sementara model RER karena adanya mutasi gen hMSH2, hMLH1,

hPMS1, hPMS2. Model RER terdapat pada perkembangan HNPCC. Pada bentuk

sporadik, 80% berkembang lewat model LOH dan 20% berkembang lewat model

RER. 1,53

Gen yang terlibat dalam perkembangan karsinoma kolon adalah APC pada

kromosom 5q, myc pada kromosom 8, K-ras pada kromosom 12, p53 dan HER-

2/neu (c-erbB2) pada kromosom 17, pRb pada kromosom 13 dan DCC pada

kromosom 18q. K-ras, c-erbB2 dan myc berperan sebagai onkogen. APC, DCC,

pRb dan p53 sebagai gen penekan tumor.47,48

23

“RER” PATHWAY TO COLORECTAL CARCINOMA

Mutation or loss of mismatch repair genes

(inherited in HNPCC)

Accumulation of somatic mutations within microsatellites

Altered function of microsatellites

Altered function of genes that contain or are regulated

By microsatellites (type II TGR-ß receptor gene)

Sequential accumulation of genetic changes

In carcinoma-related genes

Adenoma-carcinoma sequence

(ussualy does not involve APC, MCC, K-ras, DCC, p53)

Gambar 10. Skema Jalur RER pada perkembangan kanker kolon dan rektum 53

II.4.4.1.2. Gen APC

Gen APC (Adenomatous Polyposis Colli) berlokasi pada lengan panjang

kromosom 5q. Gen ini mengalami mutasi pada kasus FAP (Famillial

Adenomatous polyposis) dan Gardner’s syndrome dan banyak ditemukan pada

Turcot’s Syndrome. Gen APC mengkode satu peptida yang terdiri dari 2843 asam

amino dengan berat molekul sekitar 300 kDa.53

Mutasi pada gen APC ditemukan secara mayoritas pada kasus

adenokarsinoma kolon, hampir 63 % adenoma, 60 % adenokarsinoma, dan tidak

dijumpai pada jaringan kolon yang tidak mengalami malignansi. Hal ini

mengindikasikan adanya mutasi somatic. Karena APC merupakan gen penekan

tumor, inaktivasi allele ke dua akan mengakibatkan sel kehilangan kemampuan

24

aktifitas tumor-penekan. Mutasi gen APC merupakan awal dari karsinogenesis

sporadic adenokarsinoma kolon. Beberapa mutasi gen APC menghasilkan

hilangnya fungsi protein produknya. Hilangnya kemampuan binding dengan

protein EB1 diduga berkaitan dengan hilangnya fungsi gen penekan tumor. 53

II.4.4.1.3. Gen DCC

Gen DCC (Delleted in Colorectal Carcinoma) yang berlokasi pada lengan

panjang kromosom 18 (18q). Gen ini menghasilkan produk protein yang terlibat

dalam adesi antar sel dan interaksi antara sel-matrik, yang sangat berguna pada

pencegahan pertumbuhan tumor, invasi, dan metastase. Pada adenokarsinoma

kolon dan rektum sporadik, DCC memegang peranan yang penting sebagai satu

critical role yang menentukan kemampuan metastase tumor. 53

II.4.4.1.4. Gen p53

Gen p53 merupakan phosphoprotein yang berukuran 53 kDa dan berlokasi

pada lengan pendek kromosom 17 (17p13.1). dan mengandung 393 asam amino.

Protein ini terdiri atas 5 domain, yaitu :

1. TAD : N-terminal transkription-activation domain . mengaktivasi faktor

transkripsi, asam amino 1-42.

2. PRD : Proline Rich Domain, residu asam amino 80-94.

3. DBD : Central DNA-Binding Core Domain, mengandung 1 atom Zn dan

beberapa asam amino arginine, residu asam amino 100-300.

4. OD : Homo-Oligomerisation Domain, asam amino 307-355. Tetramerasi

penting untuk aktivasi p53 in vivo.

5. C-terminal : Terlibat dalam regulasi pengikatan DNA pada central domain :

25

residu asam amino 356-393.

Gambar 11. Domain protein p53 dan lokasi Hot Spot(Seemann et al. Clinical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 2004, 41: 551-583)

protein p53 merupakan faktor determinan yang sangat penting dalam

malignansi selama karsinogenesis adenokarsinoma kolon. Gen yang diaktifkan

p53 kebanyakan merupakan gen penekan faktor pertumbuhan tumor. Dengan

demikian inaktivasi fungsi p53 berakibat pada unregulated cell growth. 47,48,53

Gambar 12. Gen penekan tumor p53 dan pRb.53

P53 adalah tumor supresor gen yang berfungsi sebagai penentu dari gen

dengan bermain pada jalur utama untuk mengetahui kerusakan DNA dan

menentukan apakah sel tersebut harus melakukan DNA repair terhadap kerusakan

DNA yang ada atau merangsang sel untuk menjalani proses Apoptosis. p53 mutan

kehilangan fungsi dari P53 wild type sehingga terjadi proliferasi sel yang

berlebihan akibat adanya kerusakan DNA sehingga sel dapat mengalami

tranformasi menjadi maligna.40

26

Lebih dari 50% tumor primer pada manusia kehilangan p53 wild type sebagai

tumor supresor gen bahkan menunjukkan peningkatan yang cepat dari level p53

mutan. Penelitian kanker selama ini bertujuan untuk mengembalikan fungsi dari

p53 wild type dan menekan ekspresi dari p53 mutan. Untuk mencapai tujuan

penelitian tersebut dalam jangka panjang dibutuhkan penjelasan tentang

mekanisme molekuler yang mengontrol aktivitas dari p53 wild type pada sel

normal dan apabila p53 wild type hilang pada perkembangan sel tumor.40

II.4.4.1.5. K-Ras Proto-oncogen

Lokasi K-ras sebagai onkogen terletak pada lengan pendek kromosom 12

(12p12.2). protein K-ras berinteraksi dengan molekul efektor, menghadirkan suatu

respon pertumbuhan. Mutasi pada K-ras mengakibatkan kacaunya signal

transduksi. Mutasi pada K-ras ditemukan sekitar 47 % kasus adenokarsinoma dan

50 % pada large adenoma. 53

II.4.4.1.6. Mismatch Repair genes

Mismatch Repair genes diperlukan sel untuk mengadakan reparasi

kesalahan DNA yang terjadi selama replikasi atau karena adanya kehilangan basa

N secara spontan. Ada 4 DNA mismatch repair genes yang ditemukan pada

manusia, yaitu :

1. hMSH2 (kromosom 2p)

2. hMLH1 (kromosom 3p21)

3. hPMS1 (kromosom 2q31-33)

4. hPMS2 (kromosom 7p22)

Mutasi pada keempat gen tersebut terlibat dalam kasus HNPCC (Hereditary

27

Non-Polyposis Colorectal Cancer) dan Lynch syndome, dalam variasi prosentase

kasus. 53

II.4.4.2. Pengaruh Lingkungan

Kejadian malignansi pada karsinoma kolon juga ditentukan oleh faktor

lingkungan, yang mempengaruhi faktor molekuler dalam sel. Faktor lingkungan

yang majemuk memungkinkan terjadinya predisposisi genetik dan menyebabkan

defek. Faktor genetik yang terlahir dengan berbagai lesi genetik akan menginisiasi

karsinogenesis atau hal ini dapat juga berawal dari faktor lingkungan, atau

kombinasi keduanya. Semuanya berakibat adanya genetik alterations dan

karsinogenesis.1,33

Gambar 13. Hubungan antara faktor genetik dan lingkungan pada karsinogenesis karsinoma kolon dan rektum. 33

28

II.4.5 Klasifikasi

II.4.5.1 Derajat Histopatologi.

Adenokarsinoma kolon sangat berbeda secara gambaran histologinya,

beberapa tumbuh relatif berdiferensiasi baik, lainnya menjadi lebih buruk. Secara

umum pertumbuhan papiliferous cenderung berdiferensiasi lebih baik daripada

lesi dengan ulserasi dan infiltrasi lebih dalam. 1

Broders, Grinnell dan Duke’s memperkenalkan suatu modifikasi sistem

penderajatan secara histologis, dimana terlihat bahwa ada hubungan erat antara

ekstensi penyebaran lesi dengan prognosis akhir setelah terapi pembedahan. 1

Duke’s pada tahun 1946 memodifikasi sistem penderajatan histologi

adenokarsinoma kolon menjadi beberapa kategori, yaitu :

1. Derajat keganasan rendah (diferensiasi baik) : gambaran tumor yang

menyerupai adenoma dengan tanda-tanda adanya proliferasi aktif epitel, tapi

dapat dikenali sebagai malignansi karena adanya infiltrasi ke lapisan

muskularis mukosa.

2. Derajat keganasan sedang (diferensiasi sedang) : Gambaran tumor dengan sel-

sel karsinoma yang banyak berkelompok tetapi tetap terbatas dalam bentuk

yang cukup rata pada satu atau 2 lapisan lebih dalam di sekitar ruang glandula.

Umum terlihat adanya nukleus yang berwarna dan bentuk mitosis yang tidak

teratur.

3. Derajat keganasan Tinggi (diferensiasi buruk) : gambaran sel tumor makin

anaplastik dan tidak membentuk sistem glandular sama sekali, tetapi meliputi

setiap jaringan atau dalam kelompok yang tidak teratur. 1:

29

gambar 14. proses perkembangan karsinoma colorectal.54

II.4.5.2. Stadium Klinik

Klasifikasi keganasan pada kolon berdasarkan ekstensi penyebaran

langsung dan adanya metastase ke sistem limfatik , pertama kali diajukan oleh

Duke’s pada tahun 1930, Dibagi menjadi 4 kategori yaitu :

Stadium A : hanya terbatas pada lapisan mukosa

Stadium B : sudah masuk dalam lapisan muskularis propia (B1),

masuk dalam lapisan subserosa (B2), masuk sampai struktur

yang berdekatan (B3).

Stadium C : bila sudah ada keterlibatan kelenjar, dibagi menjadi

stadium C 1 bila penyebarannya sudah melibatkan limfonodi

parakolika dan limfonodi epikolika , C 2 bila penyebarannya

sudah melampaui limfonodi parakolika dan limfonodi epikolika.

Stadium D : bila sudah ada metastase baik secara limfatik

maupun secara hematogen. 1,4,6,9

30

Pada tahun 1987 American Joint Committee on Cancer dan International

Union Againts Cancer memperkenalkan sistem klasifikasi TNM, dimana ekstensi

tumor (T) dibagi atas T1 s/d T4, adanya keterlibatan kelenjar (N) dibagai atas : N1

bila < 4 kelenjar, N2 bila > 4 kelenjar, dan N3 bila terdapat keterlibatan kelenjar

sepanjang pembuluh darah, dan adanya metastase jauh (M1). 1,9

pT – Tumor Primer

pTx : Tumor primer tidak dapat dinilai

pT0 : Tumor primer tidak ditemukan

pTis : Karsinoma insitu, intraepithelial atau ditemukan sebatas lapisan

mukosa saja

pT1 : Tumor menginvasi submukosa

pT2 : Tumor mengivasi lapisan muskularis propia

pT3 : Tumor menembus muskularis propia hingga lapisan serosa atau

jaringan perikolika/perirectal belum mencapai peritoneum

pT4 : Tumor menginvasi organ atau struktur disekitarnya atau

menginvasi sampai peritoneum visceral

pN – Kelenjar getah bening Regional

pNx : Kelenjar getah bening regional tidak dapat dinilai

pN0 : Tidak ditemukan metastasis pada kelenjar getah bening regional

pN1 : Ditemukan anak sebar pada -3 kelenjar getah bening regional

pN2 : Ditemukan anak sebar pada 4 atau lebih kelenjar getah bening regional

pM – Metastasis jauh

pMx : Metastasis jauh tidak dapat dinilai

pM0 : Tidak ditemukan metastasis jauh

pM1 : Ditemukan metastasis jauh

31

Stadium T N M

Stadium 0 : Tis N0 M0

Stadium IA : T1 N0 M0

IB : T2 N0 M0

Stadium IIA : T3 N0 M0

IIB : T4 N0 M0

Stadium IIIA : Semua T N1 M0

IIIB : Semua T N2 M0

Stadium IV : Semua T Semua N M1

Tabel 3. Stadium klinis dari karsinoma kolon

II.4.6. Diagnosis

Deteksi dini dan diagnosis pada pengelolaan tumor kolon dengan

kecurigaan keganasan memiliki peranan yang penting di dalam memperoleh hasil

yang optimal yaitu meningkatnya harapan hidup, dan menurunnya tingkat

morbiditas dan mortalitas pada penderita karsinoma kolon. 1,4,6

Mendiagnosis adanya tumor kolon dengan kecurigaan keganasan dapat

dilakukan dengan cara :

1. Pemeriksaan klinis, yang terdiri dari anamnesis dan pemeriksaan fisik termasuk

colok dubur.

2. Pemeriksaan laboratorium, yaitu test darah samar, test faal hati, dan Carcino-

embrionic antigen (CEA). Kadar CEA pada keadaan normal adalah 0 – 2,5

ng/mL. Terdapat beberapa keadaan yang dapat meningkatkan kadar CEA,

dengan kadar < 10 ng/mL dan bersifat reversible, antara lain pada penderita

obstruksi bilier, disfungsi hepatoseluler, bronkitis, divertikulitis, adenomatous

polyps, gastric ulcer, perokok, BPH, renal disease. Peningkatan kadar CEA

dapat dijumpai pada keganasan lain selain keganasan kolon. 10 Kadar CEA

32

pada karsinoma kolon berhubungan dengan volume tumor dan respon terapi

anti tumor, dan berhubungan dengan sisa tumor setelah reseksi. Sensitifitas

dan spesifitas CEA untuk mendeteksi kekambuhan antara 70 – 80 %. 1

3. Pemeriksaan penunjang, terdapat pemeriksaan penunjang yang terbukti efektif

dalam diagnosis tumor kolon dengan kecurigaan keganasan, yaitu barium

enema, kolonoskopi dan biopsi, Transrectal USG digunakan untuk

menentukan stadium dari karsinoma rektum, USG Abdomen digunakan untuk

mendeteksi adanya metastase ke organ intra abdomen, foto thorak untuk

mendeteksi adanya metastase ke paru, dan CT-Scan abdomen. Tingkat akurasi

dari pemeriksaan ini tergantung pada persiapan kolon yang baik. 1,14

4. Pemeriksaan Patologi Anatomi sebagai gold standar untuk menentukan

diagnosis patologi yang pasti.

II.4.7. Terapi

II.4.7.1. Pembedahan

Pembedahan masih merupakan standard terapi tumor kolon dengan

kecurigaan keganasan. Pembedahan dilakukan sebagai terapi kuratif, simptomatik,

diagnostik dan staging penyakit. Pengertian untuk aplikasi yang benar dari

pembedahan tumor pada kolon sangat penting baik untuk ahli bedah maupun

dokter yang terlibat dengan terapi penyakit ini. Sehingga pembedahan dapat

membawa kesembuhan, dan atau perbaikan kualitas hidup dan memperpanjang

survival penderita karsinoma kolon. 1,6,7

Terapi pembedahan yang dilakukan adalah reseksi kolon menurut lokasi

tumor dan mengikuti aliran darah bersangkutan. Drainase limfe mengikuti aliran

vaskuler, sampai pada asalnya pada arteri mesenterika superior atau arteri

33

mesenterika inferior. Teknik reseksi tidak banyak mengalami perubahan sejak

beberapa dekade ini. Bila tumor terletak pada kolon ascendens dapat dilakukan

hemicolectomy dextra, ditambah reseksi ileum terminal sepanjang kurang lebih 10

cm. Tumor yang terletak pada fleksura hepatika atau kolon transversum proksimal

dilakukan extended hemicolectomy dextra dan omentectomy, bila terletak pada

kolon transversum distal dan fleksura lienalis dilakukan extended hemicolectomy

sinistra disertai omentectomy atau hemicolectomy sinistra. Tumor yang terletak

pada kolon desendens dilakukan hemicolectomy sinistra, dan tumor yang terletak

pada kolon sigmoid dilakukan hemicolectomy sinistra atau reseksi sigmoid.

Tumor yang terletak pada rektum dilakukan operasi low anterior resection dan

abdomino-perineal resection. 1,6

II.4.7.2. Terapi adjuvan

Pasien dengan karsinoma kolon beresiko tinggi untuk terjadi kekambuhan

baik lokal maupun sistemik. Terapi adjuvan bertujuan untuk menanggulangi

kedua masalah tersebut. Terapi adjuvan dengan kemoterapi dan radioterapi baik

dilakukan sebelum maupun sesudah pembedahan, dari beberapa penelitian

terbukti efektif dan dapat dianggap sebagai terapi standar dan menghasilkan angka

kekambuhan yang lebih rendah. 1,3

Obat kemoterapi yang biasa digunakan pada karsinoma kolon dan rektum

adalah 5-fluorouracil (5-FU), Leukovarin, Irinotecan, Oxiliplatin, Capecitabine,

dan perkembangan terbaru pada terapi antibodi monoklonal karsinoma kolon

dengan menggunakan bevacizumab dan cetuximab telah digunakan pada terapi

karsinoma kolon. 1,3

34

II.4.8.Prognosis

Prognosis pada karsinoma kolon tergantung pada stadium tumornya, ada

tidaknya metastase jauh, yaitu klasifikasi penyebaran tumor dan tingkat keganasan

sel tumor, keadaan umum penderita, umur penderita, adanya komplikasi perforasi

dan obstruksi, serta pengelolaan pra dan pasca bedah yang teliti dengan

pembedahan dan pengangkatan tumor primer dan metastase seradikal mungkin.

1,6,7

II.5.Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L), Merr )

Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L), Merr ) merupakan tanaman

perdu. Tumbuhan ini dapat ditanam dengan mudah, dalam waktu 6 bulan

umbinya sudah dapat dimanfaatkan. Bawang ini mengandung senyawa alkaloid,

glikosida, flavonoid, fenolik dan steroid ( Herbone 1987)

Penyebaran tumbuhan bawang dayak banyak ditemukan mulai dari

semenanjung Malaysia hingga Filipina, Sumatera (Bawang kapal), Kalimantan

(Bawang Hantu , bawang makkah), Jawa (Brambang sabrang, bawang siyem,

luluan sapi, teki sabrang, bebawangan beureum), Sulawesi, Nusa Tenggara.

Secara ekologis tumbuhan bawang dayak tumbuh di daerah pegunungan pada

ketinggian 600-2000 meter di atas permukaan laut.

Sekilas taksonomi, dari tumbuhan bawang dayak (Eleutherine

palmifolia (L), Merr) dapat dijelaskan sebagai berikut :

35

Taxonomy

Division Magnoliophyta Magnoliophytina

Class Liliatae Liliiflorae

Order Liliales

Family Iridaceae Juss.

Genus Eleutherine Herb.

Species Eleutherine palmifolia (L.) Merr

II.5.1. Morfologi

Tumbuhan bawang dayak merupakan semak, berumpun, tumbuhan

semusim, tinggi sekitar 50 cm.

Batang : Tumbuh tegak atau merunduk, basah dan berumbi. Tumbuhan

ini menyukai tempat terbuka dan tanah kaya akan humus dan

cukup lembab. Untuk menanamnya dengan menggunakan

umbi.

gambar 15 : foto pohon bawang dayak

36

Daun : Tunggal lonjong berujung runcing dengan pangkal yang tumpul,

pertulangan menyirip, warna hijau (daun seperti tanaman

anggrek tanah).

Umbi : Umbi pada tumbuhan bawang dayak umumnya berbentuk

lonjong, bulat telur, merah seperti bawang merah, tidak berbau

sama sekali. Umbi dapat dikonsumsi setelah usia 6 bulan,

dengan tinggi 20 - 40 cm, lebar 1,5 - 3 cm.

Gambar 16. foto umbi bawang dayak

Bunga : tunggal,warna putih, berkelopak 6 dan mekar pada waktu sore

hari dalam beberapa jam.

37

Gambar 17 : Foto bunga bawang dayak yang mekar

Gambar 18 : Foto bunga bawang dayak yang kuncup

Tanaman ini ditemukan pada daerah tropis dan tumbuh dengan baik pada

ketinggian sekitar 600 – 1500 m dari permukaan laut. Biasanya

ditemukan di pinggir jalan yang berumput, di kebun teh, kina dan kebun

karet.

II.5.2. Kandungan bahan kimia umbi bawang dayak

Hingga saat ini belum banyak dipublikasikan mengenai kajian

kimia dan farmakologi dari tumbuhan bawang dayak. Banyak aspek

yang dapat diteliti untuk aplikasinya di bidang pengobatan, misalnya

aspek kandungan senyawa kimianya, aspek toksisitasnya dan aspek

38

aktifitas farmakologisnya. Penelitian masih terus dilakukan untuk

mengungkap lebih lanjut dari khasiat bawang dayak ini.

Aulia (2003) menegaskan hasil skrening umbi bawang dayak

dengan menggunakan pelarut petroleum eter dan ethanol, menunjukkan

bahwa umbi tanaman ini mengandung senyawa terpenoid, flavanoid,

antrakinon dan kaumarin. Lebih lanjut Aulia menegaskan bahwa ekstrak

petroleum eter bawang ini memiliki aktifitas antibakteri terhadap E. coli,

sedangkan terhadap S. dysenteriacea tidak berpotensi sebagai

antibacterial. Sedangkan ekstrak etanol memiliki aktifitas antibakteri

terhadap E coli maupun S. dysenteriacea. Nilai KBM ekstrak ethanol

masing-masing adalah 20 mg/ml untuk E. coli dan 12 mg/ml untuk S.

dysenteriacea.

II.5.2.1.Flavonoid

Merupakan golongan senyawa bahan alam yang terbesar dan

berasal dari senyawa fenolik yang banyak merupakan pigmen tumbuhan.

Saat ini lebih dari 6000 senyawa yang berbeda masuk ke dalam golongan

flavanoid (Feye, 1996).

Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air dan

dapat diextraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air

setelah extrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavanoid

merupakan bagian penting dari diet manusia karena banyak manfaatnya

bagi kesehatan. Fungsi kebanyakan flavanoid dalam tubuh manusia

adalah sebagai antioksidan sehingga sangat baik untuk pencegahan

kanker. Selain itu flavanoid juga berfungsi untuk melindungi struktur sel

39

dan memiliki hubungan sinergis dengan vitamin C (meningkatkan

efektifitas vitamin C)., anti inflamasi, mencegah keropos tulang dan

sebagai antibiotic. Flavonoid dapat berperan secara langsung sebagai

antibiotik dengan mengganggu secara langsung fungsi mikroorganisme

seperti bakteri atau virus. Fungsi flavonoid sebagai antivirus telah banyak

dipublikasikan, termasuk untuk virus HIV (AIDS) dan virus herpes.

Selain itu, flavonoid juga dilaporkan berperan dalam pencegahan dan

pengobatan beberapa penyakit lain seperti asma, katarak, diabetes, encok

atau rematik, migren, wasir dan periodontitis sehingga dapat dijelaskan

bahwa mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam

pengobatan tradisional.

Penelititan-penelitain mutahir telah mengungkap fungsi lain dari

flavonoid, tidak saja untuk pencegahan tetapi juga untuk pengobatan

kanker.

Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenol terbesar yang

ditemukan di alam. Senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan

biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-

tumbuhan.

Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari

15 atom karbon, dimana 2 cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai

propana (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6. Susunan

ini dapat menghasilkan 3 jenis struktur senyawa flavonoida yaitu :

a. Flavonoida atau 1,3-diarilpropana.

b. Isoflavonoida atau 1,2-diarilpropana

c. Neoflavonoida atau 1,1-diarilpropana

40

Istilah flavonoida diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang

berasal dari kata flavon, yaitu nama dari salah satu jenis flavonoida yang

terbesar jumlahnya dari tumbuhan. Senyawa – senyawa flavon ini

mempunyi kerangka 2 fenilkroman dimana posisi orto dari cincin A dan

atom karbon yang terikat pada cincin B dari 1,3-diarilpropana

dihubungkan oleh jembatn oksigen sehingga membentuk cincin

heterosiklik yang baru (cincin C).

Senyawa – senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis

tergantung dari tingkat oksidasi dari rantai propane dar system 1,3-

diarilpropana. Flavon, flavonol dan antasianidin adalah jenis yang

terbanyak di alam sehinga sering disebut flavonoid utama. Banyaknya

senyawa flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat hidroksilasi,

alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur tersebut.

Senyawa – senyawa isoflavonoida dan neoflavonoida hanya

ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan, terutama suku leguminosol.

Masing – masing jenis senyawa flavonoid mempunyai struktur

dasar tertentu. Flavonoida mempunyai beberapa ciri struktur yaitu :

Cincin A dari struktur flavonoid mempunyai pola oksigenasi yang

berselang – seling yaitu pada posisi 2, 4 dan 6. Cincin B pada flavonoida

mempunyai satu gugus fungsi oksigen pada posisi para atau 2 pada posisi

para dan meta atau tiga pada posisi 1 di para dan 2 di meta.

Biosintesa

Pertama kali disarankan oleh Birch, yaitu : Pada tahap-tahap

pertama biosintesa flavonoid suatu unit C6-C3 berkombinasi dengan 3

unit C2 menghasilkan unit C6-C3 (C2+C2+C2). Kerangka C15 yang

41

dihasilkan dari kombinasi ini telah mengandung gugus – gugus fungsi

oksigen pada posisi- posisi yang diperlukan.

Cincin A dari struktur flavonoida berasal dari jalur poliketida

yaitu kondensasi dari 3 unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan

tiga atom karbon dari rantai propane berasal dari jalur fenilropanoida

(Jalur shikimat). Sehingga kerangka dasar karbon dari flavonoida

dihasilkan dari kombinasi antara 2 jenis biosintesa utama untuk cincin

aromatic yaitu jalur shikimat dan jalur asetat-malonat.

Banyak mekanisme kerja dari flavanoid yang sudah terungkap

misalnya inaktifasi karsinogen, anti proliferasi, penghambatan siklus sel,

induksi apoptosis dan differensiasi, inhibisi angiogenesis serta

pembalikan resistensi multi-obat atau kombinasi dari mekanisme-

mekanisme tersebut.

Gambar 19. Struktur dasar flavonoid

II.5.2.2.Antrakinon

Golongan kuinon alam terbesar terdiri dari antrakinon.

Beberapa antrakinon merupakan zat warna dan sebagai pencahar.

Turunan antrakinon umumnya berupa senyawa berwarna kuning

kemerahan. Antrakinon mudah larut dalam air panas dan alcohol cair

(trease dan evans (1989)). Antrakinon terhidroksilasi jarang terdapat

dalam tumbuhan secara bebas tetapi sebagai glikosida. Antrakinon

42

berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi, senyawa ini biasanya

berwarna merah, dapat juga berwarna kuning sampai coklat.

Gambar 20. Struktur dasar atrakinon

II.5.2.3.Terpenoid

Berasal dari senyawa isoprena (CH2-C(CH3)-CH-CH2).

Banyak terpenoid terdapat secara alami pada tumbuhan tidak dalam

keadaan bebas sebagai ester atau glikosida (Robinson, 1995). Terpenoid

terdiri dari berbagai macam senyawa antara lain minyak atsiri yang

mudah menguap, diterpenin yang sukar menguap, triterpenoid,sterol dan

pigmen karotenoid yang tidak menguap.

Secara kimia larut dalam lemak dan terdapat dalam sitoplasma

sel tumbuhan. Kadang minyak atsiri terdapat dalam kelenjar khusus pada

permukaan daun. Sedangkan karotenoid terutama berhubungan dengan

kloroplast di dalam daun dan dengan kromoplast di dalam daun bunga

(petai). Biasanya terpenoid diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan

menggunakan eter minyak bumi, eter atau kloroform (Harbone, 1987).

II.5.2.4.Kaumarin

Kaumarin adalah senyawa fenol yang pada umumnya berasal dari

tumbuhan tinggi dan jarang sekali ditemukan pada mikroorganisme. Dari

segi biogenetik, kerangka benzopiran-z-on dari kaumarin berasal dari

asam – asam sincimat, melakiorto-hidroksilasi. Asam orto-kumarat yang

dihasilkan setelah menjalani isomerisasi cis-trans, menjalani kondensasi.

43

Hampir semua kaumarin alam mempunyai oksigen pada C-7.

Posisi lain dapat pula terokigenasi dan sering pula terdapat rantai

samping alkil. Kaumarin sering dijumpai sebagai glikosida (Robinson,

1995).

Penelitian mengenai biosintesa kaumarin pada beberapa jenis

tumbuhan ternyata mendukung biosintesa ini. Walaupun demikian,

mekanisme dari sebagian besar tahap – tahap reaksi tersebut masih belum

jelas. Misalnya reaksi isomerisasi cis-trans dari asam ortohidroksi

kumarat mungkin berlangsung dengan katalis enzim atau melalui proses

fotokimia atau melalui proses reduksi-dehidrogenasi yang beruntun.

Gambar 21. struktur dasar kaumarin

II.6. 5-Fluorouracil (5-FU)

5-FU merupakan salah satu obat kemoterapi tertua yang telah digunakan

beberapa dekade. Obat ini dapat digunakan untuk beberapa jenis kanker seperti

kolon, payudara, lambung, pankreas dan kulit. 5-FU berupa cairan jernih dan tidak

berwarna, dan diberikan secara intravena, dapat juga berupa krim yang digunakan

pada kanker kulit.

5-FU dapat diberikan melalui infus intravena, dalam 4-5 hari, atau diberikan

menurut jadwal tertentu, misalnya sekali seminggu, atau sekali tiap 3-4 minggu.

Keberadaan 5-FU di dalam darah dan jaringan tubuh sangat singkat, dalam

hitungan menit. 5-FU terikat dalam enzyme dalam sel kanker yang disebut

44

Thymidilate Synthetase dan karenanya dapat berefek sebagai anti kanker di dalam

sel. Leucovorin dapat mengubah ikatan di dalam enzyme tersebut dan memperlama

keberadaan 5-FU dalam sel kanker yang menyebabkan efek anti kanker yang lebih

besar.

Beberapa penderita dengan defisiensi enzym untuk metabolisme 5-FU dapat

mengalami efek samping setelah pemberian 5-FU, walaupun dengan dosis yang

kecil. Efek samping yang sering terjadi, antara lain : mulut kering, sulit menelan,

diare, nyeri lambung, penurunan jumlah sel darah putih, penurunan jumlah

trombosit, anemia, peningkatan sensitifitas kulit, peningkatan jumlah air mata. 54,55

II.7. Galur Sel Adenokarsinoma kolon HT29

Galur sel adenokarsinoma kolon HT29 diisolasi dari tumor primer wanita

Kaukasus berusia 44 tahun dengan golongan darah A, Rh(+), HLA

A1,A3,B12,B17,Cw5.

. Galur sel tersebut dapat menyebabkan terjadinya adenokarsinoma kolon

berdiferensiasi baik dari tumor primer grade I pada tikus dan hamster dan

differensiasi jelek pada manusia akibat efek tumorigeniknya. Ekspresi reseptor

human adrenergic alpha2A urokinase receptor (u-PAR);vitamin D(moderate

expression. Ekspresi oncogene pada galur sel ini menunjukkan p53 mutan (+), ras

(+), myc (+), Fos (+), Myb (+),sis (+), abl (-), ros (-),src (-). Penderita bisa

terinfeksi HIV dan LAV tetapi tidak pada sel tumor. Kultur dilakukan dengan

pemisahan hingga 70-80%, aproksimasi 1:3 sampai 1:10 (1-3 x 104 sel/cm2).

Pengikatan dengan menggunakan cairan NaCl 0,25% tanpa EDTA dan CO2 5%

pada suhu 37 0C.

Penyimpanan dilakukan pada es kering dengan suhu -196 0C.21

45

II.8. Kerangka Teori

progresi

Neoplasia HT29 : hiperfosforlasi pRB↑, p53 mutan ↑, p21 ↓

RadiasiVirusMutagenik kimiaMutasi spontan

Daya tahan tubuhDifferentiation

FactorsLack of angiogenesis

MG2

SCyclin A/E+CDK2

CyclinA/B+CDK1

Bawang Dayak :

Flavonoids

G1Cyclin Ds+CDK4/6

5FU

F-dUMP + Thimidilat sintetase

F-dUMP -Thimidilat sintetase kompleks

Timidilat (dTTP)

Siklus Sel

Fase S akhir & G1 :

Sel normal epitel kolon

Sel terinisiasi

promosi

Reparasi DNA

Ekspresi : Inhibitory Growth Factors &Differentiation Factors

inisiasi

Tumor promotors,Growth Factors, Virus

RadiasiVirusMutagenik kimiaMutasi spontan

Sel preneoplasia Pada Fase S Siklus Sel :

dTMP & dTTP↓↓; dUMP&

dUTP ↑↑

Sintesis DNA terhenti

Apoptosis

Siklus Sel Terhenti :P53 mutan ↓, p53 WT ↑, p21↑, HDAC-pRB-

E2F↑↑, hiperfosforilasi

pRB↓↓

BAB III

KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS

III.1. Kerangka Konseptual

Berdasarkan penjabaran pada bab – bab terdahulu maka dalam naskah

tulisan ini diajukan kerangka konseptual yang mendasari rencana penelitian ini

sebagaimana dijelaskan pada diagram berikut :

Galur sel kanker kolon HT29 dibiakkan pada media RPMI 1640 pada

konsentrasi CO2 5%. Selanjutnya dibagi dalam 3 kelompok , yaitu kelompok

perlakuan dengan fraksi etanolik bawang dayak (Eleutherine Palmifolia (L) Merr),

∑ p53 mutan ↑ ∑ p53 mutan↓∑ p53 mutan↓

Kultur sel HT29(p53 Mutan)

Ekstrak etanolikBawang Dayak

5 – Fluorouracil(kontrol (+))

Kontrol (-)

Pertumbuhan sel Pertumbuhan sel ↓ Pertumbuhan sel ↓

ANALISA STATISTIK

47

kontrol positif kelompok perlakuan dengan 5-FU dan kontrol negatif kelompok tanpa

perlakuan apapun.

Pada uji sitotoksisitas diharapkan fraksi etanolik bawang dayak memiliki potensi

untuk menghambat pertumbuhan sel kanker kolon HT29 melalui penekanan ekspresi

p53 mutan.

Pada kontrol positif digunakan bahan uji 5-FU, diharapkan pada kontrol

positif ini juga didapatkan penghambatan pertumbuhan sel kanker kolon HT29

melalui penekanan ekspresi p53 mutan .

Pada kontrol negatif diharapkan tidak terjadi penghambatan pertumbuhan sel

kanker kolon HT29 dengan ekspresi p53 yang meningkat.

Pada perlakuan dengan fraksi etanolik bawang dayak, 5-FU dan tanpa

perlakuan harus dikendalikan faktor-faktor luar, seperti suhu inkubator dalam media

kultur harus dipertahankan 37oC dengan konsentrasi CO2 5%, nutrisi yang cukup

dengan menggunakan FBS dan sterilitas media yang optimal.

III.2. Hipotesis

1. Fraksi etanolik bawang dayak mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada

biakan kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro.

2. Fraksi 5-fluorouracil mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan

kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro.

3. Tidak terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan secara in

vitro antara fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil pada biakan

kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro.

48

BAB IV

METODE PENELITIAN

IV.1. Jenis Penelitian

Penelitian ini berupa penelitian analitik eksperimental

IV.2. Lokasi dan Waktu Penelitian

IV.2.1.Laboratorium Penelitian Dan Pengujian. Terpadu (LPPT) Universitas

Gajah Mada Jogjakarta.

IV.2.2.Laboratorium Patologi Anatomi dan Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Dilaksanakan pada bulan

April 2008 sampai Juni 2008.

IV.3. Subjek Penelitian

Sel kanker kolon HT29 (Sumbangan dari Dra.Dyah Ratna Budiani, M.Si)

IV.4. Besar Sampel

Penelitian ini menggunakan 24 well kultur sel HT29 pada medium RPMI

1640, masing – masing well berisi 2x105 sel/200 μl. 6 well pengulangan pada

perlakuan dengan 5-FU atau fraksi etanolik bawang dayak, pada konsentrasi

LC50 dan 3 serial di bawahnya. Dalam menentukan jumlah sampel tersebut

digunakan patokan rule of thumb, sebagaimana dituliskan oleh Murti, (2006),

yang menyatakan apabila sampel dibagi dalam sejumlah kelompok studi

berdasar tingkat perlakuan maka jangan sampai kurang dari 5 subyek

49

1V.5. Alat dan Bahan

1V.5.1. Alat

- Laminar Air Flow Hood / Tissue Culture Cabinet

- Incubator CO2

- Sentrifuse

- Mikroskop Inverted

- Improved Neubauer Hemocytometer Chamber

- Microwave oven

- Shaker inkubator

- Counter

- Mikro pipet

- Mikro tube

- Yellow tips, Blue tips, white tips

- Mikrowell plate polistiren 24 dan 96 well

- Mikroskop cahaya biasa

- Mikroskop kamera

IV.5.2. Bahan

- Galur sel kanker kolon (sel kanker kolon HT29)

- Ekstrak Bawang Dayak

- 5 - Fluorourasil

- RPMI 1640

50

- Penicillin Streptomicin 2%

- Fetal Bovine Serum

- Fungizone : Amphotericin B 0,5%

- Monoclonal antibodi mouse anti-human p53 mutan

- Sistem deteksi berbasis avidin-biotin complek

- Subtrat enzim peroksidase DAB

- Pewarna tanding hematoksilin MEYER

- Cover slip plastik (untuk kultur sel), diameter 13 mm

- Cover slib kotak 20x20 mm

- Gelas obyek

- Minyak emersi

- PBS phosphat buffer saline pH 7,0

- Sitrat buffer pH 6,4

- Methanol H2O2 0,3%

IV.6. Cara Kerja

IV.6.1. Kultur Sel

Kultur sel HT29 dilakukan setelah thawing dari tangki nitrogen cair,

sel selanjutnya dikultur pada media RPMI 1640, FBS 10%, Penstrep 2%,

Fungizone 0,5% setelah konfluent sel dipanen dengan tripsin 0,25%.

IV.6.2. Starvasi

51

Tujuan langkah ini adalah mencapai keseragaman umur sel HT29

dalam kultur. Dalam menggunakan RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%,

Fungizone 0,5%, selama 7 hari setiap 3 hari sekali media diganti dengan

yang baru dalam inkubator CO 5%. Setelah hari ke-7, sel dilepas dari flask

dengan tripsin 0,25%, ditambah RPMI 1640, disentrifuse selama 5 menit

dan kemudian supernatan dibuang, jumlah sel dihitung dengan bilik hitung

Improved Neubeuer haemocytometer.

Disiapkan mikrokultur 96 sumuran yang terdiri baris A sampai dengan

H dan kolom 1 sampai 12. Masing – masing sumuran diisi dengan sel

karsinoma kolon HT29 yang telah dilakukan starvasi dengan kepadatan sel

sama, yaitu 2x105 sel/200 µl.

IV.6.3. Uji Sitotoksisitas

Bahan uji fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil

sebagai kontrol positif yang telah disiapkan dengan masing-masing tujuh

konsentrasi, ditambahkan dengan menggunakan mikro pipet ke dalam

sumuran. Setiap konsentrasi dibuat tiga kali ulangan.

A A A A A A

52

B B B B B B

C C C C C C

D D D D D D

E E E E E E

F F F F F F

G G G G G G

Keterangan:

Bawang dayak: 25µl/ml 5-FU: 300µg/ml

Bawang dayak: 12,5µl/ml 5-FU: 150µg/ml

Bawang dayak: 6,25µl/ml 5-FU: 75µg/ml

Bawang dayak: 3,125µl/ml 5-FU: 37,5 µg/ml

Bawang dayak: 1,51625 µl/ml 5-FU: 18,75µg/ml



IV.6.3.1. Kontrol Negatif

Sel HT29 yang dibiakan dengan media tanpa perlakuan apapun +

RPMI 1640, FBS 10%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%.

IV.6.3.2. Kontrol Positif

LC50 untuk 5 - Fluorourasil ditentukan dengan variasi konsentrasi :

300ug/ml, 150ug/ml, 75ug/ml, 37,5ug/ml, 18,75ug/ml, 9,75ug/ml, 4,6875

ug/ml. Pada media RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%.

Dilakukan penghitungan jumlah sel yang hidup dengan menggunakan

Improved Neubeuer dan mikroskop inverted.

A

B

C

E

A

G

D

F

B

C

D

E

F

G

53

IV.6.3.3. Perlakuan dengan Fraksi etanolik Bawang Dayak

LC50 untuk Bawang Dayak ditentukan dengan variasi konsentrasi :

25ul/ml, 12,5ul/ml, 6,25ul/ml, 3,125ul/ml, 1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml,

0,390625 ul/ml. Pada media RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%,

Fungizone 0,5%. Dilakukan penghitungan jumlah sel yang hidup dengan

menggunakan Improved Neubeuer dan mikroskop inverted

IV.6.4. Imunositokimia

Biakan sel HT29 pada media murni dan setelah diberi perlakuan

dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak serta 5 - fluorourasil pada

konsentrasi LC50 dan 3 serial dibawahnya dikulturkan pada media RPMI

1640 1% Amphotericin, 2% penstrep, 10% FBS dengan 24 well yang

dilengkapi dengan cover slips plastic dengan diameter 1,3 cm. Setelah 3

hari diperlakukan dengan konsentrasi bawang dayak 3,125ul/ml,

1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml, 0,390625 ul/ml dan 5-FU 150ug/ml, 75ug/ml,

37,5ug/ml, 18,75ug/ml pada 5% CO2 dan suhu 37oC (dalam inkubator).

Setelah itu media diambil dan diganti dengan PBS formalin 10% selama 30

menit. Kemudian PBS diambil dan dicuci dengan Aquadest kemudian

ditambah metanol dan 0,3% H2O2 selama 30 menit. Dilakukan blocking

dengan normal serum selama 20 menit, diinkubasi dengan antibodi primer

mouse anti p53 mutan (dengan pengenceran 1:100) selama 18 jam pada

40C. Dicuci dengan washing buffer (PBS) 2 kali selanjutnya diinkubasi 20

menit dengan polyvalent universal HRP conjugate. Dicuci dengan PBS 2

54

kali selanjutnya diinkubasi dengan DAB (Deamino Benzidin) sebagai

subtrat enzim. Pewarnaan tanding (counterstain) menggunakan

Hematoxilin Mayer. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop Olympus

DP40.

Penilaian makna tampilan p53 mutan dinyatakan sebagai prosentase

sel yang dihitung berdasarkan tampilan positif sel dengan inti sel kuning

keemasan sampai dengan coklat tua pada pembesaran 400X, dengan

pengamatan sebanyak 9 lapang pandang. Nilai prosentase yang ditampilkan

adalah nilai rerata prosentase ekspresi protein p53 mutan dari 9 lapang

pandang tersebut.

IV.7. Variabel Penelitian

IV.7.1. Variabel Bebas

a. Konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak

b. Konsentrasi 5-Fluorouracil

IV.7.2. Variabel Tergantung

ekspresi P53 mutan

IV.8. Definisi Operasional Variabel

IV.8.1. Fraksi etanolik ekstrak bawang dayak adalah ekstraksi etanolik bawang

dayak sehingga berbentuk larutan. Dalam penelitian digunakan fraksi

etanolik bawang dayak murni (Eleutherine Palmifolia (L) Merr).

55

IV.8.2. Konsentrasi dosis adalah banyaknya fraksi etanolik bawang dayak dan 5-

Fluorourasil dalam larutan yang akan dimasukkan kedalam mikrokultur

dengan konsentrasi bertingkat permililiter media kultur.

IV.8.3. LC50 (Lethal Concentration) aktivitas sitotoksik secara in vitro adalah

konsentrasi ekstrak yang menyebabkan kematian 50% sel kanker kolon

HT29 pada kultur yang menerima perlakuan fraksi etanolik bawang dayak

atau 5-FU

IV.8.4. Ekspresi P53 mutan adalah ekspresi protein yang terdapat pada inti sel

kanker kolon HT29 sebagai hasil pengecatan imunostaining dengan

metode avidin-biotin-complex menggunakan MoAb primer anti-p53

mutan. Sistem enzimatis yang digunakan adalah peroksidase substrat

enzim DAB. Nilai tampilan p53 mutan dinyatakan sebagai prosentase sel.

IV.8.5. Proliferasi sel dihitung setelah 24 jam inkubasi pada suhu 37oC dan

dilakukan penghitungan jumlah sel secara direct counting menggunakan

mikroskop inverted dan bilik hitung Improved Neubeuer haemocytometer.

56

IV.8. Rancangan Penelitian

Colon Cancer Cell Line HT29

Kultur

Kontrol Positif(Media + 5 -Fluorourasil)

Media + Ekstrak Bawang Dayak

IMUNOHISTOKIMIA

Serial Konsentrasi

LC50

3 serial dari LC50 ke bawah

PROSENTASE SEL YANG MENGEKSPRESIKAN P53 MUTAN (+)

UJI STATISTIK

Kontrol Negatif

Serial Konsentrasi

LC50

3 serial dari LC50 ke bawah

57

IV.9. Analisa Data

Dari data yang diperoleh dalam penelitian, dilakukan uji normalitas data

dengan menggunakan uji kolmogorov-smirnov. Untuk mengetahui pengaruh

terhadap tingkat ekspresi p53 mutan yang dimiliki oleh fraksi etanolik ekstrak

bawang dayak dan 5-fluorouracil dilaksanakan dengan menggunakan analisis

korelasi regresi pada masing – masing perlakuan (perlakuan kontrol positif

dengan 5-FU dan perlakuan menggunakan fraksi etanolik bawang dayak.) dan

untuk mengetahui perbedaan pengaruh terhadap tingkat ekspresi p53 mutan

antara kontrol positif dan fraksi etanolik bawang dayak dilakukan uji beda T-

Test .13,14,16

BAB V

HASIL DAN ANALISA DATA

V.1. Hasil Penelitian

Dalam penelitian ini digunakan galur sel karsinoma kolon HT29 untuk menguji

aktivitas sitostatik dari fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dalam

penghambatan pertumbuhan sel dan tingkat ekspresi p53 mutan. Galur sel

karsinoma kolon HT29 ditumbuhkan pada media kultur, yaitu RPMI 1640 yang telah

ditambah dengan FBS 10%, Penstrep 2% dan Fungizone 0,5%, selanjutnya diberi

perlakuan dengan bahan uji fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-

fluorouracil sebagai kontrol positif dan tanpa perlakuan sebagai kontrol

negatif.

Penilaian aktivitas sitostatik fraksi etanolik ekstrak bawang dayak

dilakukan dengan memberikan ekstrak bahan uji tersebut pada kultur galur sel

karsinoma kolon yang kemudian diinkubasikan selama 24 jam. Setelah

diinkubasikan selama 24 jam sel yang hidup dihitung secara visual

menggunakan bilik hitung hemositometer. Penghitungan tersebut menunjukkan

bahwa LC50 dari fraksi etanolik ekstrak bawang dayak adalah 3,125 µl/ml dan

LC50 5-FU adalah 150 µg/ml. Pada konsentrasi tertinggi 100µl/ml fraksi

etanolik ekstrak bawang dayak menghambat proliferasi sel kanker sebesar

100%, sedangkan 5-FU pada konsentrasi tertinggi 300µg/ml mampu

menghambat sebesar 100%.

Kultur dengan perlakuan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak atau

5-FU masing-masing ditentukan konsentrasi LC50, selanjutnya pada konsentrasi

LC50 dan 3 serial konsentrasi di bawahnya dikulturkan dengan 24 well plate

59

yang dilengkapi cover slips. Konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak

yang digunakan adalah 3,125ul/ml, 1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml dan 0,390625

ul/ml sedangkan konsentrasi 5-FU adalah 150ug/ml, 75ug/ml, 37,5ug/ml,

18,75ug/ml. Hasil kultur sel karsinoma kolon HT-29 yang diperlakukan dengan

serial konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak atau 5-FU kemudian

dilakukan pemeriksaan imunositokimia dengan menggunakan monoklonal

antibodi primer mouse anti p53 mutan. Ekspresi positif kuat dari p53 mutan

ditunjukkan dengan adanya granula kecoklatan pada sitoplasma, sedangkan sel

yang negatif tidak menampakkan adanya granula tersebut. Pengamatannya

menggunakan Mikroskop OLYMPUS DP40. hasilnya ditampilkan dalam bentuk

prosentase sel.

Intensitas warna dari setiap preparat diamati masing-masing sembilan

lapang pandang dengan pembesaran 400 kali. Setelah didapatkan hasilnya

dihitung nilai rerata untuk masing-masing preparat. Dari prosentase sel tersebut

kemudian dapat ditentukan tingkat ekspresi p53 mutan. Untuk uji tanpa

perlakuan didapatkan proliferasi sel dengan ekspresi p53 mutan (+).

Gambar 22.ekspresi p53 mutan pada uji tanpa perlakuan

60

Untuk uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan

konsentrasi LC50 yaitu 3,125µl/ml dan juga perlakuan dengan 5-fluorouracil

didapatkan proses apoptosis dengan ekspresi p53 mutan yang minimal.

Gambar 23. Ekspresi p53 mutan pada uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak3,125 μg/ml

Gambar 24. Ekspresi p53 mutan pada uji dengan 5-fluorouracil 150μg/ml

Berdasarkan hasil pengamatan masing – masing preparat baik yang

diberi perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun dengan

61

5-FU, dapat ditentukan tingkat ekspresi p53 mutan berdasarkan prosentase sel,

untuk masing-masing sampel. Hasilnya sebagai berikut:

No SAMPEL PROSENTASE

1 5-FU 150 0

2 5-FU 75 4

3 5-FU 37,5 3,11

4 5-FU 18,75 4,42

5 Bawang dayak 3,125 5,49



8 Bawang dayak 0,390625 32,41

Tabel 4. Prosentase tampilan p53 mutan pada sel karsinoma kolon HT29 pada masing-masing sampel.

0

5

10

15

20

25

30

35

3.125 1.516 0.781 0.39

ekspresi p53 mutan

Gambar 25. Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada ekstrak bawang dayak

62

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

150 75 37.5 18.75

ekspresi p53mutan

Gambar 26. Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada 5-FU.

V.2. Analisa Data

Analisa data dilakukan dengan menggunakan SPSS 15. Untuk

mengetahui data yang diperoleh mempunyai distribusi normal atau tidak

dilakukan uji statistik kolmogorov-smirnov untuk masing – masing

bahan uji. Dan didapatkan untuk bahan uji dengan menggunakan

ekstrak bawang dayak didapatkan berditribusi normal dan untuk bahan

uji dengan menggunakan 5FU juga berdistribusi normal. Selanjutnya

untuk menguji pengaruh peningkatan konsentrasi pada fraksi etanolik

extrak bawang dayak maupun 5-FU terhadap ekspresi p53 mutan

dilakukan uji statistik menggunakan analisis korelasi regresi. Dari uji

tersebut untuk fraksi etanolik extrak bawang dayak didapatkan

persamaan Y = 48,335 - log70,414X, R : 0,843, F hitung : 105,457, F

tabel distribusi : 2,87(5%). Dari uji tersebut didapatkan F hitung > F

tabel, yang menunjukkan ada korelasi antara konsentrasi ekstrak

bawang dayak dengan tingkat ekspresi p53 mutan. Yaitu dengan

63

meningkatnya konsentrasi ekstrak etanolik bawang dayak yang diberikan

pada sel carsinoma kolon HT29 ekspresi p53 juga semakin menurun.

konsentrasiBD5.004.003.002.001.00

120.00

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

ekspresip53mutan

LogarithmicObserved

Gambar 27. Profil uji regresi extrak bawang dayak

Persamaan untuk 5-FU didapatkan Y= 48,784 – log65,088X, R =

0,799, F hitung : 76,056, F tabel distribusi : 2,87(5%). Dari uji tersebut

didapatkan F hitung > F tabel, yang menunjukkan ada korelasi antara

konsentrasi 5-FU dengan tingkat ekspresi p53mutan. Yaitu dengan

meningkatnya konsentrasi 5-fluoro uracil yang diberikan pada sel carsinoma

kolon HT29 ekspresi p53 juga semakin menurun.

64

konsentrasi5FU5.004.003.002.001.00

120.00

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

ekspresip53mutan

LogarithmicObserved

Gambar 28. Profil uji regresi konsentrasi 5-FU terhadap ekspresi p53 mutan.

Kedua persamaan di atas menunjukkan peningkatan konsentrasi baik 5-FU

maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak berpengaruh nyata pada penekanan

ekspresi p53 mutan.

Selanjutnya data dilakukan uji T-test untuk mengetahui perbedaan pengaruh

terhadap tingkat ekspresi p53 mutan antara fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-

FU, tidak ditemukan perbedaan yang bermakna antar kelompok bahan uji (α = 0,00)

yang artinya tidak ada perbedaan yang signifikan antara potensi penekanan ekspresi

p53 mutan antara kontrol positif dan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak

Perhitungan statistik secara lengkap ditampilkan pada lampiran. Baik fraksi etanolik

ekstrak bawang dayak maupun 5-FU dengan uji T-test tidak menunjukkan perbedaan

yang signifikan dalam penekanan nilai ekspresi p53 mutan, sehingga pemakaian

ekstrak bawang dayak dapat diterima sebagai kandidat herba anti tumor.

BAB VI

PEMBAHASAN

VI.1. Ekspresi p53 mutan

Untuk menguji apakah fraksi etanolik ekstrak bawang dayak bersifat

sitostatik dan menghambat proliferasi sel karsinoma kolon HT29 melalui penekanan

ekspresi p53 mutan terhiperfosforilasi dilakukan pemeriksaan dengan

imunostaining. Hasil penelitian menunjukkan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak

mampu menekan ekspresi p53 mutan dengan nilai yang sebanding dengan 5-

fluorouracil sebagai kontrol positif. Uji statistik menggunakan uji beda T-test

terhadap prosentase ekstrak bawang dayak dengan 5-FU dan tidak menunjukkan

perbedaan yang signifikan dalam penekanan ekspresi p53 mutan pada fraksi

etanolik ekstrak bawang dayak dibandingkan dengan kontrol positif, sehingga

pemakaian ekstrak bawang dayak dapat diterima sebagai kandidat herba anti tumor

berdasarkan penelitian invitro.

Secara statistik yang dilakukan dengan uji korelasi regresi didapatkan ada

hubungan yang bermakna antara konsentrasi dengan tingkat ekspresi p53 mutan

dimana jika terdapat peningkatan konsentrasi baik pada fraksi etanolik bawang

dayak maupun 5 fluorouracil akan terjadi penurunan tingkat ekspresi dari p53

mutan secara signifikan, sedangkan berdasarkan uji T-test tidak didapatkan

perbedaan yang bermakna dari penekanan tingkat ekspresi p53 mutan pada bahan

uji dan kontrol, (α = 0,171). Hasil uji statistik diatas membuktikan bahwa tidak ada

66

perbedaan pengaruh yang bermakna pada tingkat ekspresi p53 mutan dari kelompok

perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil. Hal ini

menunjukkan bahwa fraksi etanolik ekstrak bawang dayak secara invitro dapat

menghambat pertumbuhan sel karsinoma kolon HT29, seperti juga pada 5-

fuorouracil. Proses penghambatan pertumbuhan dapat terjadi antara lain karena

penekanan ekspresi p53 mutan dan memacu apoptosis. Apoptosis yang terjadi dapat

dipacu oleh penekanan p53 mutan atau peningkatan tumor supressor gen yang lain

atau dapat juga melalui jalur lain selain dari kedua hal tersebut.

Proses penghambatan pertumbuhan sel kanker bisa melalui berbagai jalur,

salah satunya adalah apoptosis yang bisa diinduksi oleh gen p53 wild type. Adanya

akumulasi dari protein p53 wild type yang terjadi akibat adanya kerusakan DNA

memegang peranan penting di dalam DNA repair. Protein p53 wild type akan

merangsang keluarnya p21 yang dapat mengakibatkan terjadinya cell cycle arrest

.Cell cycle arrest ini dapat memberikan waktu bagi sel untuk melakukan DNA

repair yang mengalami kerusakan sehingga apabila berhasil sel dapat berproliferasi

secara normal. Apabila terjadinya kerusakan sel hebat dan tidak bisa dilakukan

repair, maka jalur apoptosis akan diaktifkan untuk mengeliminasi sel yang

mengalami kerusakan. Apabila normal DNA repair tidak terjadi karena terjadi

mutasi dari p53, maka sel dapat berproliferasi secara abnormal dan dapat terjadi

keganasan. p53 dapat merangsang apoptosis dengan merangsang expresi dari gen

pro apoptosis seperti Bax, Fas/Apo-1, Death Reseptor 5 (DR5) atau insulin Like

Growth Fator-Binding Protein 3 (IGF-BP3), atau dengan merangsang expresi gen

67

anti apoptosis seperti Bcl-2, celluler inhibitor of Apoptosis Protein 2 (c-IAP2) dan

Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein 1 (NAIP1). Jika Apoptosis tidak terjadi

karena terjadi mutasi dari p53 atau deregulasi dari interaksi Fas-FasL maka sel

dapat berkembang kearah keganasan. Aktivitas protein p53 sebagai tumor supresor

dapat diturunkan atau dihambat oleh protein Mdm2 yang mengakibatkan terjadinya

degradasi dari p53 menjadi lebih cepat. Gen Mdm2 itu sendiri juga diaktifkan oleh

p53 sehingga dapat dikatakan dapat memberikan umpan balik negatif (negative

autoregulatory loop).34,37

Tidak berfungsinya kontrol checkpoint yang mengakibatkan gagalnya respon

penghentian siklus sel pada sel kanker dapat menjadi target potensial terapi

antikanker6,43. Sel dengan kontrol checkpoint yang rusak lebih sensitif terhadap

perubahan genotoksik atau kerusakan mikrotubular.

Berdasarkan teori mekanisme efek toksik intra sel, zat kimia atau

metabolitnya yang telah masuk pada sel sasarannya dapat menyebabkan gangguan

sel melalui pendesakan, pengikatan, subtitusi atau peroksidasi. Gangguan yang

ditimbulkan akan direspon oleh sel untuk mengurangi dampaknya dan sel akan

beradaptasi atau melakukan perbaikan. Namun apabila sel tidak mampu

mengeliminir gangguan yang ada akan terjadi efek toksik dalam hal ini adalah

proses repair gen.60

Proses apoptosis dibedakan menjadi dua jalur, yaitu jalur ekstrinsik atau death

receptor (DR) dan intrinsik atau jalur mitokondria. DR pathway dimulai dengan

pengaktifan tumour necrosis factor receptor (TNFR), yang meliputi Fas, DR 4,

68

TNFR I dan TNFR II. Fas menginduksi apoptosis melalui dua jalur. Jalur pertama

dengan mengikat ligan. Ikatan ligan mengaktifkan reseptor TNFRI dan Fas untuk

menarik dan mengikat Protein death effector Fadd/Mort-1. Ikatan Fadd/Mort-1

menarik procaspase 8. Procaspase 8 diubah menjadi bentuk aktifnya yaitu caspase

8 dan dilepaskan kembali ke dalam sitosol. Caspase 8 akan memecah dan

mengaktifkan caspase 3. Jalur kedua lewat jalur alternatif sinyal transduksi.

Reseptor Fas berikatan dengan protein adapter yang akan mengaktifkan mitogen

activating protein (MAP) kinase dan memicu kaskade fosforilasi yang meningkat

pada aktivasi c-Jun N terminal kinase (JNK). JNK yang teraktivasi

memfosforilasi substrat seperti c-Jun dan p53 dan menginduksi apoptosis lewat

berbagai mekanisme, meliputi modifikasi dan pengaturan protein pada famili Bcl-

2 Disamping hal tersebut di atas aktifasi apoptosis bisa terjadi melalui jalur

intrinsik. Pada jalur ini inisiasi apoptosis ditimbulkan oleh produk biokimia yang

berasal dari intraseluler stress, seperti oksidatif stress, perubahan redoks, ikatan

kovalen, peroksidase lipid. Bahan-bahan tersebut memberikan sinyal kepada

mitokondria sehingga menyebabkan perubahan pada mitokondria yang dimulai

dengan terbukanya membran bagian luar diikuti pembengkakan matriks dan

hilangnya potensial membrane yang menyebabkan keluarnya protein-protein

mitokondria termasuk cytochrome-c. Apoptosis akan menghasilkan apoptotic

bodies yang terdiri dari fragmen sisa-sisa sel yang akan difagositosis oleh sistem

retikuloendotelial di sekitarnya.

69

Proses apoptosis tersebut dikendalikan oleh dua perangkat gen yang berfungsi

antagonistik yaitu memacu dan menghambat. Termasuk gen yang memacu proses

apoptosis adalah p53, pRB dan E2F, yang mana protein gen ini lebih berperan

dalam siklus sel. Ketika terjadi kerusakan DNA maka p53 akan teraktivasi dan

mengaktifkan p21 yaitu suatu CDK Inhibitor. p21 ini akan mengikat dan

menginaktifkan kompleks CDK4 yang akan menyebabkan fosforilasi Rb terhambat

dan pelepasan faktor transkripsi E2F terhenti sehingga siklus sel terhenti pada

tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk

memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya. Jika

kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi maka sel akan memasuki jalur

apoptosis. Komplek E2F dengan pRB merupakan komplek stabil untuk

mengaktivasi berbagai promotor untuk sintesis DNA. Pada kondisi tanpa adanya

sinyal pertumbuhan pRB dalam keadaan hipofosforilasi. Pada keadaan

hipofosforilasi pRB berikatan dengan E2F dan HDAC (histone deacetylase) dan

menginaktifkan faktor transkripsi E2F. Ikatan antara pRB dengan HDAC dan E2F

diatur oleh fosforilasi serine/threonine. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E,

cyclin A dan protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Fosforilasi tahap

pertama oleh cyclin D/CDK 4, dalam stimulus growth factor, melepaskan HDAC

dari kompleks HDAC-pRB-E2F. Fosforilasi tahap berikutnya oleh cyclin E/CDK 2

melepaskan E2F dari pRB. E2F yang dihasilkan akan menginduksi transkripsi gen

seperti DNA polymerase dan thymidin kinase yang diperlukan untuk masuk dalam

fase S.

70

Dari uraian diatas dapat diketahui dengan jelas bahwa proses apoptosis dapat

dipacu oleh berbagai faktor, baik dari jalur ekstrinsik maupun jalur intrinsik dan

siklus sel juga diatur dan dipengaruhi oleh berbagai macam enzin maupun protein

yang berperan sebagai tumor supressor gen. Sehingga dengan demikian penekanan

ekspresi p53 mutan sel karsinoma kolon HT29 pada uji dengan fraksi etanolik

ekstrak bawang dayak, yang menunjukkan adanya penghambatan proliferasi sel

dapat terjadi karena adanya apoptosis melalui jalur ekstrinsik atau instrinsik dan

faktor mana saja yang mempengaruhinya. Proses apoptosis yang terjadi belum

dapat ditentukan. Hal ini tentunya perlu dilakukan uji lebih lanjut untuk mencari

dan membuktikan faktor-faktor mana yang berpengaruh dalam menekan proliferasi

sel karsinoma kolon HT29 tersebut. Pengembangan obat antikanker yang

didasarkan pada regulasi siklus sel selanjutnya diarahkan pada penghambatan

terjadinya proses pembelahan sel, dan pemacu apoptosis sehingga senyawa atau

protein yang diberikan pada penderita dapat mencegah sintesis DNA dan mitosis

sehingga menghentikan proliferasi sel kanker.

VI.2. Sifat sitostatik ekstrak etanolik bawang dayak

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etanolik ekstrak bawang dayak

mempunyai aktivitas sitostatik yang sebanding terhadap sel karsinoma kolon HT29

secara invitro bila dibandingkan dengan kelompok perlakuan dengan 5-fluorouracil.

Hal ini terlihat pada LC50 fraksi etanolik ekstrak bawang dayak yaitu 3,125 µg/ml

dan LC50 5-FU yaitu 150 µg/ml. Efek sitostatik tersebut disebabkan oleh karena

71

apoptosis yang dipacu oleh berbagai faktor pro apoptotic. Dengan demikian ekstrak

bawang dayak merupakan bahan yang mengandung senyawa aktif yang potensial

untuk dikembangkan sebagai antikanker, khususnya untuk karsinoma kolon

berdasarkan penelitian invitro.

Penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian 5-FU maupun fraksi etanolik

ekstrak bawang dayak dengan konsentrasi yang berbeda memberikan pengaruh yang

nyata dalam penekanan proliferasi sel karsinoma kolon HT29 maupun ekspresi p53

mutan. Uji yang dilakukan menunjukkan ada korelasi antara konsentrasi 5-FU

maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan tingkat ekspresi p53 mutan.

Pada penelitian ini evaluasi terhadap proliferasi sel karsinoma kolon HT29

dilakukan dengan menggunakan metode kromogenik menggunakan pewarnaan

tryphan blue untuk mempermudah membedakan antara sel hidup dan sel yang mati.

Sel karsinoma hidup akan memberikan warna putih mengkilat, sedangkan sel yang

mati akan memberikan warna kebiruan. Warna kebiruan ini berasal dari pewarna

yang penetrasi ke dalam sitoplasma karena membran sel telah mengalami

disintegrasi akibat memberian bahan uji.

5-FU digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini karena 5-FU

merupakan agen kemoterapi yang poten untuk karsinoma kolon dan saat ini sudah

secara luas digunakan baik sebagai agen tunggal maupun kombinasi dengan agen

kemoterapi yang lain. Hasil penelitian menunjukan bahwa terdapat penekanan

ekspresi p53 mutan yang bermakna pada perlakuan menggunakan fraksi etanolik

ekstrak bawang dayak maupun 5-FU, yang berarti bahwa terdapat efek sitostasik dan

72

sitopatik 5-FU dan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak terhadap sel karsinoma

kolon HT29 dimana dengan tertekannya ekspresi dari p53 mutan akan dapat memacu

proses apoptosis. Kematian sel HT29 dipacu oleh apoptosis yang disebabkan karena

peningkatan berbagai protein pro apoptotic maupun enzim-enzim yang memacu

apoptosis, yang ekspresinya kemungkinan diinduksi oleh 5-FU atau fraksi etanolik

ekstrak bawang dayak.

Ekspresi p53 mutan yang semakin menurun pada konsentrasi 5FU 18,75

µg/ml sampai dengan 75 µg/ml dan mencapai statsioner pada konsentrasi 150 µg/ml,

menunjukan bahwa terjadi penghambatan sintesa DNA oleh karena terbentuknya

kompleks senyawa F-dUMP-Thymidilate Sintetase, sehingga terjadi penurunan

konsentrasi dTMP dan dTTP disertai peningkatan dUMP dan dUTP (Pecorino, 2005).

Penghambatan sintesa DNA akan menyebabkan terhentinya siklus sel. Siklus sel yang

terhenti akan memberi kesempatan bagi sel untuk melakukan reparasi DNA dan

apoptosis.

Peran fraksi etanolik ekstrak bawang dayak terhadap ekspresi p53 mutan

mengikuti fungsi logaritmik dengan persamaan Y = 48,335 – log70,414 dengan peran

kandungan senyawa terpenoid, flavanoid, antrakinon dan kaumarin yang terkandung

dalam ekstrak bawang dayak fraksi etanolik yang kemungkinan berperan dalam

penghambatan aktivasi kompleks cyclin-CDK yang hadir pada fase G1 dan S dalam

siklus sel. Sanderowics (2005), menyatakan bahwa dalam percobaan invitro diketahui

bahwa senyawa flavonoid yang berupa flavopiridol mampu mempengaruhi siklus sel

dengan cara menekan aktivitas cyclin-CDK yang aktif pada fase G1 dan G2.

73

Perubahan dari satu fase ke fase berikutnya pada siklus sel diatur oleh

beberapa checkpoint. Pengaturan checkpoint tersebut melibatkan aktivasi dan

degradasi cyclin, aktivasi cyclin dependent kinase (CDK), cyclin-dependent kinase

inhibitor (CDKI). Interaksi diantara ketiga kelas protein tersebut berperan

mengontrol berbagai tahap siklus sel, mencegah sel ke tahap selanjutnya jika

terjadi kerusakan DNA. Aktivitas dari kompleks cyclin-CDK yang mengontrol

checkpoint tersebut diatur dengan cara fosforilasi dan defosforilasi. Pada kondisi tanpa

adanya sinyal pertumbuhan pRB dalam keadaan hipofosforilasi. Pada keadaan

hipofosforilasi pRB berikatan dengan E2F dan HDAC (histone deacetylase) dan

menginaktifkan faktor transkripsi E2F. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E,

cyclin A dan protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Protein lain yang

berperan dalam kontrol checkpoint ini antara lain p53, CDKI p21. Ketika terjadi

kerusakan DNA maka p53 akan teraktivasi, demikian pula pada keadaan cell stress

atau sel hipoksia. p53 yang teraktivasi akan mengaktifkan p21 yaitu suatu CDK

Inhibitor. p21 ini akan mengikat dan menginaktifkan kompleks CDK4 yang akan

menyebabkan fosforilasi pRB terhambat dan pelepasan faktor transkripsi E2F

terhenti sehingga siklus sel terhenti pada tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti,

DNA mempunyai kesempatan untuk memperbaiki diri sebelum memasuki tahap

pembelahan selanjutnya. Jika kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi

maka sel akan memasuki jalur apoptosis.

Peningkatan konsentrasi yang diberikan pada penelitian ini akan diikuti

oleh respon penekanan terhadap ekspresi p53 mutan dan apabila digambarkan akan

74

membentuk kurva sigmoid seperti yang telah dicantumkan dalam hasil penelitian.

Kurva sigmoid ini dapat dibuat linear untuk dapat memungkinkan menganalisa

hubungan dosis versus respon yang lebih luas. Dalam kurva ini juga dapat dinilai

perubahan efek ekspresi p53 mutan jika terdapat peningkatan konsentrasi. Apabila

kurva mempunyai slope yang besar (relatif tegak) zat tersebut memiliki efek yang

besar karena dengan perubahan konsentrasi sedikit saja akan terjadi efek yang

relatif besar sebagai respon dari peningkatan konsentrasi. Sebaliknya pada kurva

yang slopenya relatif kecil peningkatan konsentrasi yang besar akan diikuti respon

yang relatif kecil. Hal ini berlaku juga untuk obat sehingga bisa dikatakan relatif

aman.

Berbagai penyebab yang kemudian mengaktivasi p53 akan memberi pengaruh

pada tahap selanjutnya. p21 yang terekspresi akibat aktivasi p53 akan mengikat

kompleks cyclin-CDK yang menyebabkan siklus sel terhenti. p21 juga akan mengikat

PCNA, yang bersama dengan XPC yang terekspresi akibat aktivasi p53 akan

mereparasi DNA. p53 yang teraktivasi akan mengekspresikan beberapa protein pro

apoptotic, seperti Bax dan sekaligus menghambat ekspresi protein inhibitor apoptotic

Bcl yang akan menyebabkan terjadinya apoptosis. Ekspresi thrombospondin, yang juga

akibat aktivasi p53, akan menghambat angiogenesis.

BAB VII

KESIMPULAN DAN SARAN

VII.1. Kesimpulan

Dari penelitian yang telah dilakukan, maka dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut :

1. Fraksi etanolik ekstrak bawang dayak mempunyai efek sitotoksik terhadap sel

karsinoma kolon HT29 secara in vitro yang ditunjukkan dengan nilai LC50

adalah sebesar 3,125 µl/ml.

2. Didapatkan adanya penekanan ekspresi dari p53 mutan yang signifikan pada

perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun dengan 5-FU

dengan konsentrasi yang berbeda mengikuti kurva logaritme sesuai dengan

perhitungan statistik, hal ini menunjukkan bahwa pemberian 5-FU maupun

fraksi etanolik ekstrak bawang dayak memberikan pengaruh yang nyata dalam

penekanan pertumbuhan sel kanker kolon HT29 maupun ekspresi p53 mutan.

3. Potensi penghambatan terhadap ekspresi p53 mutan dari sel kanker kolon

HT29 dari fraksi etanolik bawang dayak tidak menunjukkan adanya perbedaan

yang signifikan dengan 5-fluorouracil.

VII.2. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian terhadap ekspresi p53 mutan pada galur sel

karsinoma kolon yang lain atau penelitian secara invivo dengan konsentrasi

pada LC50 dan atau di bawahnya.

76

2. Perlu dilakukan penelitian dalam bidang biologi molekuler lebih lanjut

mengenai pengaruh ekstrak bawang dayak terhadap pertumbuhan sel

karsinoma kolon HT29, khususnya terhadap produk downstream dari protein

p53 seperti p21, puma ,noxa, bax dan lain – lain..

3. Perlu dilakukan penelitian lain mengenai genomik p53 dengan aras

DNA/mRNA

77

DAFTAR PUTAKA

1. Kelompok Kerja Adenokarsinoma Kolorektal,. 2006., Panduan Pengelolaan Adenokarsinoma Kolorektal,. pp. 1-56.

2. Tjarta, A,. 2001. Neoplasia : In Patologi Umum,. Sagung Seto,. Jakarta,. pp. 198 -199

3. Ashariati, A,. 2004., Adjuvant Chemotherapy of Colorectal Cancer,. In: Recent Advances and Challenges In General Surgeons in Indonesia,. Surabaya,.

4. Helena, R, C,. Kirby, I, B,. 1997,. Tumors of the Colon, In: Maingot’s Abdominal Operations,. Volume II, Tenth edition , Appleton & Lange, USA, pp.1281-1301

5. Tannock, I.E. Hil, R.P. 1998, . The Basic Science of Oncology, 3rd Edition, Mc Graw Hill, Singapore.

6. Alfred, M, C,. Bruce,D, M,. 1997., Cancer of The Colon,. In : Cancer, Principles & Practice of Oncology., 5th Ed,. Editors : Devita. V, T., Lippincott-Raben., USA., pp. 1144- 1185

7. Kodner, I,J,. Robert, D, F,. 1999.. Colon, Rectum, and Anus., In : Principles of Surgery,. 7th Ed., Vol. 2., Editors : Seymour I. Schwartz., McGraw-Hill Health Professions Division., NBew York., USA., pp. 1265 – 1380.

8. Allen, J,I,. 1995,. Molecular Biology of Colorectal Cancer : a Clinician’s View,. Perspect Colon Rectal Surgery., 8: 181 m- 202.

9. Carolyn, C,. Compton,. 2005., The Staging of Colorectal Cancer: 2004 and Beyond,. Ca Cancer Journal for Clinicians,., Vol. 54. No. 6. pp. 295 – 308.

10. Soetamto, W, P,. 2004., Pembedahan Karsinoma Kolon dan Rektum,. In : Recent Advance and Challenges in General Surgeon in Indonesia,. pp. 12-19.

11. Sjamsuhidayat, R,. Wim, D, J,. 1997., Buku Ajar Ilmu Bedah,. EGC,. Jakarta,. pp. 876-99

12. Janne, P, A,. 2000., Chemoprevention of colorectal cancer,. The New England Journal of Medicine. Vol. 342. no. 26: pp. 1960 – 1966.

13. Murti, B., 1996,, Penerapan Metode Statistik Nonparametrik untuk Ilmu-ilmu Kesehatan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, hal:37

14. Sudigdo, S,A,. Ismael, S,. 2002., Dasar-dasar Metodologi Penelitian Klinis., ed. 2.,Sagung Seto., Jakarta,

78

15. Budiani, D,R,. Retnaningsih, D,. et al ,. 2005.. Expression of LMP1 in Javanese Colon Carcinoma Patient’s with Duke’s classification System : indicated The Association of Epstein-Barr Virus infection In colon malignancies., Department of Patology anatomy, school of medicine, Sebelas Maret University, Surakarta,.

16. Arief T.Q.M., 2004, Pengantar Metodologi Penelitian untuk Ilmu Kesehatan, Cetakan Kedua, Penerbit CSGF, Klaten

17. Compton C.C., 2005, The Staging of Colorectal Cancer : 2004 and Beyond, Ca Cancer Journal for Clinicians, Vol. 54. No. 6, pp. 295 – 308

18. Katzung B.G., 2001, Basic & Clinical Pharmacology, 8th Ed, Mc Graw-Hill Companies, Philadelphia

19. Pusztai L., et al., 1996, Cell Proliferation in Cancer ; Regulatory Mechanisms of Neoplastic Cell growth, Oxford University Press, New York

20. Shengli C., 2001, Cell Cycle and Tumor Suppressor Genes, Charles Cai Tech, edit Tom Beron, pp. 1 – 36

21. Sigma A, 2007, HT29 Cell Line Human Colon Adenocarcinoma, http://sigmaaldrich.com

22. Teich N.M., 1997, Oncogenes and Cancer, In : Cellular and Molecular Biology of Cancer 3rd Ed, Editors : Franks L.M., Teich N.M., Oxford University Press, New York, pp. 169 – 201

23. Tim Skripsi FK UNS., 2007, Buku Panduan Skripsi, Fakultas kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta

24. Wolf J.C, Ginn P.E, HomerB, Fox L.E, Kurzman I.D., 1997 Immunohistochemical Deecion of p53 Tumor Suppressor Gene Protein in Canine Epithelial Colorectal Tumors.Vet Pathol;34:394-404

25. leonart ME, Vidal F,Gallardo D, Fuertez MD, Rojo F, Cuatrecasas M et all , 2006,New p53 Related Genes in Human Tunord:Significant down reguatin in Colon and Lung Carcinoma .Onkology reports;16:603-608

26. Petak I, Tilman DM, Hougthon JA. 2000, P53 Dependence of Fas Induction and Acute Apoptosis in Response to 5-Fluorouracil-Leucovrin in Human Colon Carcinoma Cell Lines. Clinical Cancer Research;6:4432-4441

27. Yang B, Stambrook P.J, Markowitz S.D, 1996. Wild Type p53 Demonstrates Functional Dominance in a Human Colon Carcinoma Cell Line in which it induces Reversible Growth Arrest. Clnical Cancer Research;2:1639-1647

79

28. Deiry W.S.Colon Cancer,Adenocarcinoma.http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007

29. Shalkow J. Colorectal Tumor. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007

30. Cirinaone E. Rectal Cancer. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007

31. Hassan I.Colon,Adenocarcinoma. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007

32. Tullo A, D’erchia A.M, Honda K, Mitry R.R, Kelly M.D, Hbib N.A, 1999.Characterization of p53 mutations in colorectal liver metastases and correlation with clinical parameters.Clinical Cancer Research;5:3523-3528

33. Slatery M.L, Curtin K, Edwards S, Schaffer D, Anderson K, Samowitz W., 2002Diet,activity and lifestyle associations with p53 mutations in colon tumor.CancerEpydemiology,Biomarker&Prevention .;11:541-548

34. Chen F, Chang D, Goh M, Klibanov S, Ljungman M. 2000. Role of p53 in Cell Cycle Regulation and Apoptosis following Exposure to Proteasome Inhibitor.;11:239-246

35. Tjarta A, 1973, Neoplasma in PATOLOGI. Bagian Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia,pp:77-82

36. Pusztai, L,. et al., 1996., Cell Proliferation in Cancer ; Regulatory Mechanisms of Neoplastic Cell growth., Oxford University Press.,

37. Anonim,2002.The Central Role of p53 Cell-Cycle Arrest, DNA Repair and Apoptosis Following UV Irradiation.http://www.expertreviews.org/

38. Basu A.,Haldar S.,1998. The Relationship between Bcl2,Bax and p53:Qonsequences for cell cycle progression and cell death.Molecular Human Reproduction;4:1099-1109.

39. Mohanna M.A.,Khodairy F.M.,Krezolek Z.,Bertilsson P.,Houssein K.A.,Aboussekhra A,2001.p53 is dispensable for UV-induced cell cycle arrest at late G1 in mammalian cells. Carcinogenesis;22:573-578.

40. Rotter V, 2002.Expression of the wild type p53 tumor supressor gene in normal cells and its deregulation in cancer cells. Departement of Molecular Cell Biology :p:176-177.

80

41. Offer H.,Zurer I.,Bontalvi G.,Reha’k M.,Falcovitz A.,Milyavsky M.,et all,2001. P53 modulates base excission repair activity in a cell cycle-spesific Manner after Genotoxic Stress. Cancer Research;61:88-96.

42. Sato T.,Koseki T.,Yamato K.,Saiki K.,Konishi K.,Yoshikawa M., et all.2002.p53-Independent Expression of P21CIPI/WAFI in Plasmacytic Cells During G2 Cells Cycle Arrest Induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans Cyto Lethal Distending Toxin.Infection and Immunity;70:528-534.

43. Abrhamson J.A.,Lee J.M.,Bernstein A., 1995. Regulation of p53-Mediated Apoptosis and Cell Cycle Arrest by Steel Factor. Molecular and Celluler Biology;15:6953-6960.

44. Pellegata N.,Antoniono R.J.,Redpath J.L.,Stanbridge E.J.,1996. DNA Damage andp53-mediated Cellcycle Arrest:A Reevaluation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA;93:15209-15214.

45. Sablino A.A., Ilyinskaya G.V.,Rubtsova S.N.,Aqapova L.S.,Chumakov P.M.,Kopnin B.P.,1998. Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in Response to Micronuclei Formation.Journal of Cell Science;111:977-984.

46. Moll.U.,Ostermeyer A.G.,Haladay R.,Winkfield B.,Frazier M.,Zambetti G., 1996. Cytoplasmic Sequestration of Wild Type p53 Protein Impairs the G1 Checkpoint After DNA Damage. Molecular and Celluler Biology;16:1126-1137.

47. Pines J. 1997.Tumor Suppressors and Cell Cycle Control.Oncogenes and Tumor Suppressors.Oxford University Press;p:189-214.

48. Gangopadhyay S.B.,Abraham J., Lin Y.P.,Benchimol S.,1997. The Tumour Suppressor gene p53. Oncogenes and Tumor Suppressors.Oxford University Press;p:261-280.

49. Yuwono T., 2005, Biologi Molekular, Penerbit Erlangga, Jakarta

50. Ghobrial I.M.,Witzig T.E.,Adjei A.A.,2005. Targeting Apoptosis Pathways in Cancer Therapy.CA Cancer J Clin;55:178-194

51. Schuler M.,Green D.R.,2001.Mechanisms of p53-dependent Apoptosis.Biochemical Society Transactions;29:684-688

52. Murphy M.E., 2000. Ellucidation of the p53- Dependent Apoptosis Pathway.Medical Science division:p:244-247

53. Allen, J,I,. 1995,. Molecular Biology of Colorectal Cancer : a Clinician’s View,. Perspect Colon Rectal Surgery., 8: 181 – 202

81

54. Bruce blumberg,.2000. Oncogenes and Cancer.BioSci 145 A lecture 18.Page 1 – 15

55.Levine A.J., Hu W., Feng Z. 2006. The p53 Pathway: What Questions Remain to be Explored?.Cell Death and Differentiation.,13:1027-1036

56. Aguda B.D., 2006. Oncogene and Tumor Suppressor gene networks in cell cycle check points,Apoptosis & cell Survival.

57. Wongpalee S.,2006. RNA interfere (RNAi) Screening of non coding RNAs (ncRNA) Essential for Cancer Cell Proliferation.

58. Winarto W.P.,2007. Tanaman obat indonesia untuk pengobatan herbal, 1:55-57.

59. Lenny S.,2006. Senyawa Flavonoida, Fenil-propanoida, dan Alkaloida. Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,Universitas Sumatera Utara, Medan.

60. Priyanto, 2007. Toksisitas Obat, Zat Kimia dan Terapi Antidotum,I:1-31

LAMPIRAN 1

Gambar 29.Foto sel karsinoma kolon HT29 tanpa perlakuan (kontrol negatif)

Gambar 30.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 18,755µl/ml

Gambar 31.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 37,5µl/ml

Gambar 32.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 75µl/ml

Gambar 33.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 150µl/ml

Gambar 34.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan Bawang Dayak dengan konsentrasi 0,390625µl/ml

Gambar 35.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5awang Dayak dengan konsentrasi 0,78125µl/ml

Gambar 36.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan bawang dayak dengan konsentrasi 1,51625µl/ml

Gambar 37.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan bawang dayak dengan konsentrasi 3,125µl/ml

Uji Kolmogorov Smirnov

Bawang dayak

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

4

13.3350

12.79575

.386

.386

-.270

.772

.591

N

Mean

Std. Deviation

Normal Parametersa,b

Absolute

Positive

Negative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov Z

Asymp. Sig. (2-tailed)

PROSENTASEP53

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.

5-fluorouracil

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

4

2.8825

1.99777

.295

.221

-.295

.591

.876

N

Mean

Std. Deviation

Normal Parametersa,b

Absolute

Positive

Negative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov Z

Asymp. Sig. (2-tailed)

PROSENTASEFU

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.

Regression

Descriptive Statistics

30.5100 39.97126 5

1.1626 1.23178 5

ekspresip53mutan

konsentrasiBD

Mean Std. Deviation N

Variables Entered/Removedb

konsentrasiBD

a . Enter

Model1

VariablesEntered

VariablesRemoved Method

All requested variables entered.a.

Dependent Variable: ekspresip53mutanb.

Model Summaryb

.663a .440 .254 34.53323Model1

R R SquareAdjustedR Square

Std. Error ofthe Estimate

Predictors: (Constant), konsentrasiBDa.


ANOVAb

2813.174 1 2813.174 2.359 .222a

3577.632 3 1192.544

6390.806 4

Regression

Residual

Total

Model1

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

Predictors: (Constant), konsentrasiBDa.


Coefficientsa

55.541 22.452 2.474 .090 -15.913 126.994

-21.530 14.018 -.663 -1.536 .222 -66.140 23.081

(Constant)

konsentrasiBD

Model1

B Std. Error

UnstandardizedCoefficients

Beta

StandardizedCoefficients

t Sig. Lower Bound Upper Bound

95% Confidence Interval for B

Dependent Variable: ekspresip53mutana.

konsentrasiBD4.003.002.001.000.00

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

ekspresip53mutan

LogisticObserved

Regression

Descriptive Statistics

22.1480 43.11370 5

56.2500 59.29271 5

ekspresip53mutan

konsentasi5FU

Mean Std. Deviation N

Variables Entered/Removedb

konsentasi5FU

a . Enter

Model1

VariablesEntered

VariablesRemoved Method

All requested variables entered.a.


Model Summaryb

.560a .314 .085 41.23382Model1

R R SquareAdjustedR Square

Std. Error ofthe Estimate

Predictors: (Constant), konsentasi5FUa.


ANOVAb

2334.478 1 2334.478 1.373 .326a

5100.685 3 1700.228

7435.163 4

Regression

Residual

Total

Model1

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

Predictors: (Constant), konsentasi5FUa.


Coefficientsa

73.318 29.246 2.507 .087 -19.755 166.390

-.771 .658 -.560 -1.172 .326 -2.864 1.322

(Constant)

p53mutan

Model1

B Std. Error

UnstandardizedCoefficients

Beta

StandardizedCoefficients

t Sig. Lower Bound Upper Bound

95% Confidence Interval for B

Dependent Variable: konsentrasi5FUa.

konsentrasi5FU5.004.003.002.001.00

120.00

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

ekspresip53mutan

LogarithmicObserved

T-Test

Paired Samples Statistics

30.5100 5 39.97126 17.87569

22.1480 5 43.11370 19.28103

ekspresip53BD

ekspresip535FU

Pair1

Mean N Std. DeviationStd. Error

Mean

Paired Samples Correlations

5 .966 .007ekspresip53BD &ekspresip535FU

Pair1

N Correlation Sig.

Paired Samples Test

8.36200 11.22359 5.01934 -5.57393 22.29793 1.666 4ekspresip53BD -ekspresip535FU

Pair1

Mean Std. DeviationStd. Error

Mean Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

Paired Differences

t df

Documents

TUGAS AKHIR PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI …TUGAS AKHIR PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN 5-FLUOROURACIL TERHADAP