1020716

■ 公開

□ 密件、不公開

執行機關(計畫)識別碼：020106L309

行政院農業委員會畜產試驗所102年度科技計畫研究報告

計畫名稱： 種畜禽研究團隊─種豬與雞精子品質之檢測及應用 (第3年/全程3年)

(英文名稱) Food Animal Breeding ResearchConsortium (FABRC):Detection andApplication of Semen Quality inBreeding Boar and Rooster

計畫編號： 102農科-2.1.6-畜-L3(9)

全程計畫期間： 自 100年1月1日 至 102年12月31日

本年計畫期間： 自 102年1月1日 至 102年12月31日

計畫主持人： 郭廷雍

研究人員： 吳明哲、顏念慈、林德育、賴永裕、廖仁寶、陳佳萱、林秀蓮、林義福、劉曉龍、張雁智、邱智偉、李恆夫、曲鳳翔、鄭裕信、康定傑、陳裕信、吳啟瑞

執行機關： 行政院農業委員會畜產試驗所

種畜禽研究團隊─種猪與種土雞之產精能力檢測研究應用 農科-2.1.6-畜-L3(9)

畜產試驗所遺傳育種組(主持人：郭廷雍) 一、 中文摘要

針對市面販售之稀釋液產品品牌做全面調查，目前市售稀釋劑分為進口

與國產兩大類，目前常見之進口稀釋劑為德國Minitube、法國IMV及及國內動

科所、中化製藥，SGI及精海公司等較為普遍使用於各種猪場及肉猪場，首先

先以上述各稀釋劑產品合計15種對精液保存能力優劣加以試驗比較，初步顯

示不同效期(短效或長效性)之稀釋劑皆能提供受測精液之各項體能如精子細

胞膜、頭帽、粒線體、鈣離子變化、氧化傷害及抗菌等功能之保護效果。另

比較不同稀釋劑處理間之保護能力，初步顯示保護效果在細胞膜、頭帽、粒

線體、鈣離子變化、氧化傷害等參數存在差異，僅染色體保護效果則無存在

差異，在各不同測試試驗結果中，短效稀釋液以稀釋液代號D及J能提供較佳

保護效果而長效稀釋液中以稀釋液代號A及N較佳。另比較稀釋液選用與母猪

分娩頭數及配種率之影響，分別以兩種不同稀釋劑處理下，合計完成32頭次

人工授精，初步顯示配種母猪其平均分娩頭數在使用稀釋劑K及X顯現差異

(13.3頭V.S.15.7頭)，另進行兩批次計49頭次人工授精，第一批次配種率在

使用稀釋劑K及X下分別為(46%V.S.92%) ，第二批次配種率為為(42% V.S.

94%)，顯示稀釋液X的保護力與母猪分娩頭數存在密切之關聯性。已知猪單次

進行人工授精不得低於30億隻為最低總精子數條件，而一般猪場常以數倍於

最低總精子數的方式進行稀釋精液製備，究其原因爲保險起見與避免商譽受

損，今以一頭公猪精子活力等級90++、精液濃度4億/mL及總精子數600億為

例，該猪場爲求保險以80億隻精子數為標準下可生產6瓶授精小瓶精液產品，

惟該精液樣品經體能分析後，活率、完整頭帽及完整粒線體數分別為95％、

68％及85％，今設定頭帽完整百分率68％為限制條件換算後，可知每瓶只需

制備50億隻精子(50億*0.68=34億)能符合最低精子數之標準，並可提供製備

計10瓶(500/50)精液產品所製備之精液經人工受精於本所二股畜試黑猪後，

初步結果該母猪已順利懷孕，顯示以後者之標準分裝除可符合最低授精之精

子數條件是可行的，然實際分裝標準仍需依體能分析結果各參數值加以適當

調整。因此藉由透過具備客觀、大量、快速等優點之流式細胞儀電腦分析系

統之應用，有效且短時間內完成精子細部結構之功能性評估，取得種猪精液

內單一精子細微結構之受損程度並估算出真正具受精能力之精子數後，可解

決稀釋液及單次精液之分裝劑數之問題，將可增加每頭採精公猪其單次精液

之生產支數，進而提高種公猪產精效率，另外在人工授精稀釋液選用、調整

及換用之需求部份亦可協助國內種猪及種雞場進行各種廠牌或自家配方稀釋

液之保存能力評估，以改善母猪分娩頭數。

關鍵詞：猪(pig)、雞(chicken)、精子(sperm)、細胞分選儀(flow cytometer)、稀釋劑(extender)

14-1

二、 前言 我國種猪場與種土雞場，早已使用生長性能檢定、人工授精與產精基因

等 DNA 鑑定技術來選育後裔，未來若能將產精能力併入現代種畜禽選種之架構，將可提昇畜禽生產性能檢定體系強化及建置並且減少因選留產精不良種

畜禽所造成之損失。

由於精子之細微結構如精子細胞膜、頭帽細胞膜、粒線體膜及染色體的

完整性及細胞質內鈣離子濃度，均與受精力有關連。流式細胞儀是觀測細胞

細微結構及各類狀態之儀器，是檢測精子品質之機器。精子流式細胞儀為是

計算並檢測顯微粒子的技術設備，細胞被懸浮在流動液體中，經過電子檢測

儀器而被檢測，它可以在每秒內同時對上千個粒子進行物理和化學的多項分

析，目前業已應用在許多物種之精液品質分析 (Purvis K, 1990; Garner DL, 1994; Christensen P, 2005; Jun Tao, 2005)。 本研究目的乃藉由精子體能分析儀針對精子八項體能測定及一項精液性狀測定，完成每頭受測公畜禽至少建立 1000 至 5000 隻精子體能分佈圖型，來檢定高肉質公猪與土雞之產精能力，作為未來選留產精能力強的種公猪與

種土雞之應用。試驗中分別將採得之新鮮種猪及種雞精液，分別予以稀釋成

0.5×106 /ml 分析濃度後，依各分析項目加入所需螢光染劑後，於 37℃培養數分鐘後，上機分析精液樣品之活/死精子數、穿孔體及精子膜完整性、線粒體膜電位完整性與細胞凋亡比例、細胞內游離鈣水平的檢測、DNA 染色質結構完整性、精子細胞內自由基及精漿細菌污染等分析後，建立種畜禽猪及雞之

精子品質資料庫。

三、 試驗材料與方法

(一)種公猪產精性能檢定模式 種猪已採新鮮精液稀釋後人工授精，繁育後代。每劑精液的總精子數與

精液注入量等兩種評估準則是猪人工授精技術應用於母猪群，確保受精

率之要件，因此評選公畜禽之產精能力至為重要。進行個別精子型態、

核內DNA完整度、粒線體供能狀態等精子品質性狀分析，建立其精液中5,000至15,000隻精子體能分佈圖型，作為種公猪產精性能檢定之精子內在體能指標(圖1及圖2)，間接評估個別動物之產精能力依據。

(二)種猪產精能力之檢測

應用台灣區種猪產業協會的體型比賽會9.5月齡種公猪，研擬於8月齡

起種猪拍賣前進行採精，選取精液量、精子濃度及活力等合格樣本，進

一步進行個別精子型態、核內DNA完整度、粒線體供能狀態等精子體能性

狀分析，並每頭公猪建立其每次採精之精液中5,000至15,000隻精子品質

分佈圖型，作為精子內在體能指標，評估其產精能力。

應用種猪場自留公猪研擬於10、11及12月齡時進行採精，進一步進

14-2

行個別精子型態、核內DNA完整度、粒線體供能狀態等精子體能性狀分

析，並每頭公猪建立其每次採精之精液中5,000至15,000隻精子品質分佈

圖型，作為精子內在體能指標，評估其產精能力。

(三)人工授精站供精公猪之精子品質檢測 人工授精站供應冷藏精液時，自一批次冷藏精液中，選取樣品一件，進

行精子體能檢測，分析精子型態、核內DNA完整度、粒線體供能狀態等精

子品質。

(四)自留年輕種公雞產精品質檢測

應用本所自留之各品種種雞，進行個別精子型態、核內DNA完整度、

粒線體供能狀態等精子品質等參數分析，完成每隻公雞建立其每次採精

之精液中5,000至15,000隻精子體能分佈圖型，作為精子內在品質指標。

(五)精液保存與檢測前處理

1.種公猪採精與精液運送 將取得之新鮮種公猪精液倒入 100mL 注精瓶內，擠出瓶內氣體後，旋

蓋上緊後放入 16℃保溫箱內，帶回實驗室。

2.精液鏡檢與濃度測定

於實驗室內分別將吸取 20uL 採樣之種公猪精液放至於玻片上，以 37

℃培養箱培養 3 分鐘後進行鏡檢，以判定分析前之精子活力，同時就

精液顏色及濃度予以記錄及分析之。

3.精液稀釋

以 EB 緩衝液將精液進行稀釋，將受檢精液調整成每毫升 3.5×107個精

子之濃度後，作為精子品質分析之用。

4.精子品質分析儀操作

精子品質分析儀開機後，選取清洗指令後，將機器內管線及精子分析

毛細管進行清潔與清洗，完成後將清潔劑及去離子水充填至清洗槽內

之試管內，點選 cytosoft 軟體並開啟程式，點選動物種類及分析項目

後，放入載有樣品之 96 孔盤，點選分析並完成該項分析。

5.上機前進行精液濃度調整 在猪、牛、雞分別為 3.5x107 spz/ml、5.7 x107 spz/ml、3.5x107 spz/ml從儲精瓶中吸取約 0.2 毫升之精液原液至 96 孔盤，將 Plate 中之精液依比例以 Easy Buffer 稀釋至約 3.5x106 spz/ml。

(六)精子品質分析項目 1.精子活率檢測分析( Viability Assay )

Sybr14 working solution：取 1μl 之 Sybr14 + 49μl 之 Easy Buffer 混合

14-3

mix solution：取 1μl 之 Sybr14 working solution + 1μl 之 PI + 48μl 之Easy Buffer 混合。 取 3μl 之稀釋精液 + 147μl Easy Buffer + 50μl mix solution 混合後於37℃避光培養 10 分鐘後上機分析。 分析結果：猪新鮮精液活率須>70％或冷凍精液解凍後活率需>50%為合格。

2.頭帽及精子膜完整性分析( Acrosome & Sperm Membrane Integrity Assay ) stain mix：取 1μl 之 PI + 0.5μl 之 PNA-FITC + 48.5μl 之 Easy Buffer混合。 取 4μl 之稀釋精液 + 146μl Easy Buffer + 50μl 之 stain of mix 混合後於 37℃避光培養 10 分鐘後上機分析。 分析結果：猪新鮮精液活精且頂體膜完整之細胞百分比須>60％或解凍後精液活精且頂體膜完整之細胞百分比需>40%為合格。

3.線粒體膜電位與凋亡程度分析( Mitopotential assay ) mix solution：取 2μl 之 JC-1 + 48μl 之 Easy Buffer 混合 取 3μl 之稀釋精液 + 147μl Easy Buffer + 50μl mix solution 混合後於37℃避光培養 30 分鐘後上機分析。 分析結果：在猪新鮮精液中處於去極化狀態的精子細胞百分比需

程度所佔的百分比。 7.細菌數檢測分析

分別製備 Negative control: filter 2ml of raw or diluted semen sample through a 0.2 µ filter with a syringe 及 Tested sample: filter 2ml of raw or diluted semen sample with a 1.2 µ filter with a syringe.分別取 Negative control 及 Tested sample 各 1 ml 加入 1 µl staining A 於室溫下培養 5 分鐘後，再加入 10µl reference beads 混合均勻後，立即放入分析儀內進行分析。

(七)、統計分析 本試驗所收集之猪產精性狀之各項數值，均以平均值±標準機差

(Mean ± Standard error of mean, M ± SEM)表示之。試驗所得之各項數據，均使用統計分析系統（statistical analysis system, SAS 9.1, 2005）套裝軟體中之一般線性模式(General Linear Models)進行變方分析比較各性狀之差異性。

四、 結果與討論

(一)、稀釋液之應用

14-5

(二)、不同稀釋液間對猪精液冷藏前後之保存能力試驗

A.台灣紅猪為以畜產試驗所所育成之本土紅猪猪種。

14-6

14-7

B.畜試黑猪以畜產試驗所所育成之本土黑毛色外觀之猪種。

14-8

C.約克夏猪種為引進種，其常做為母系用。

D.杜洛克猪種，其常做為公系用

14-9

E.藍瑞斯猪種，其常做為母系用。

14-10

14-11

(三) 精液稀釋液保存能力對母猪生產效率之評估

14-12

(四)最佳精液濃度配種對母猪懷孕能力之評估試驗

14-13

(五) 自留種猪體能檢測參數及其對生育力之影響

自留種猪體能檢測可早期評選精子體能並有機會提升分娩率與分娩

頭數。

(六) 冷凍稀釋液對雞精液冷凍及解凍後之品質影響

分別以 20 隻畜試土雞做樣本，比較冷凍稀釋液 A,B 及 C 對受精率及

孵化率之影響，將冷凍精液解凍後分別進行人工授精，並於 7天後收集

種蛋，結果顯示以 B 液的受精率及孵化率最佳。

14-14

五、結論與建議 （一）2013年流式細胞儀體能分析(各物種之體能資料庫及監控)

完成2013年例行性精子體能檢查，分別為猪444頭次、雞289隻次、

水鹿2頭次、荷蘭年輕公牛4頭次，顯示在分析之物種及精液產品類

別已較2012年增加，精子品質檢測逐漸受到重視。。

（二）稀釋液保存能力之比較

完成市售猪稀釋劑/液合計15(國產6種及進口9種)種之保存能力測

試，結果顯示不同效期之稀釋劑皆能提供精子細胞膜、頭帽、粒線

體、鈣離子變化、氧化傷害及抗菌等參數保護效果。另比較不同稀

釋劑處理間之保護能力，顯示保護效果在細胞膜、頭帽、粒線體、

鈣離子變化、氧化傷害等參數存在差異，僅染色體保護效果則無存

在差異。因此不同稀釋液對猪精液短及長期冷藏保護之能力確實存

在差異，可提供產業進一步對稀釋液選用、調整及測試之應用。

（三）稀釋液對公猪生育力之影響

完成稀釋液對懷孕率、分娩率、產仔數等生育力表現的評估。顯示不

同稀釋液其配種率分別為46% 與92%，其平均分娩頭數分別為13.3頭

與15.7頭，稀釋液選用應審慎，否則將直接影響生育力表現。

(四) 公猪體能分析結果與其生育力之影響(母猪分娩比率與分娩頭數)

完成精子體能檢測結果對公猪生育力之關聯性，顯示配種公猪其體能

參數如頭帽、粒線體及染色體完整性差者與母猪平均分娩頭數下降有

關，另游離鈣離子濃度高者與母猪分娩比率下降有關，種猪場應及早

剔除產精性能差之公畜，將可有效提升母猪分娩胎仔數。

(五) 最佳化 AI 精液濃度配種

完成猪場及人工授精站計供精種猪其最佳化人工授精稀釋精液量，人

工授精後母猪預產期為 103 年 1 月 15 日，顯示最佳化人工授精稀釋精

液量不僅可減少每劑總精子數，進而增加種猪精液產品生產劑數，有

效提高種猪經濟效益。

(六) 冷凍稀釋液對雞精液冷凍及解凍後之品質影響

分別以 20 隻畜試土雞做樣本，比較冷凍稀釋液 A,B 及 C 對受精率及孵

化率之影響，將冷凍精液解凍後分別進行人工授精，並於 7 天後收集

種蛋，結果顯示以 B 液的受精率及孵化率最佳。

14-15

六、參考文獻 1.Christensen P, Boelling D, Pedersen KM, korsgaard IR, Jensen J. 2005.

Relationship between sperm viability as determined by flow cytometry and nonreturn rate of dairy bulls .J. Androl.,;26:98-106.

2.Garner DL, Johnson LA, Yue ST, Roth BL, Haugland RP. 1994. Dual DNA staining assessment of bovine sperm viability using SYBR-14 and propidium Iode .J. Androl. 15:620-629.

3.Jun T, Elizabeth S. Critser, John K. Critser, 2005. Evaluation of mouse sperm acrosomal status and viability by flow cytometry. Molecular Reproduction and Development, Vol 36, Issue 2: 183 – 194.

4.Purvis K, H. Rui, A. Scholberg, S. Hesla and O. P. Clausen. 1990. Application of flow cytometry to studies on the human acrosome. J. of Androl. 11, Issue 4:361-366.

14-16

14-17

(七)執行成果英文摘要 This study was to assess the effect on boar spermatozoa quality of in vitro

storage in short and long-term extenders by flow cytometer (FC). Fresh ejaculates from three healthy, sexually mature boars were diluted with equal volumes of seven short-term or seven long-term commercial extenders and stored at 18°C for 5 days (short-term) or 9 days (long-term). The extenders preservation ability were analyzed by staining the integrity of spermatozoa membranes, acrosome membrane, mitochondrial membrane, calcium mean level, DNA structure, oxidation stress and bacterial contamination through the flow cytometer. Our study showed that the number of viable spermatozoa with non-reacted acrosomes and intact mitochondria was positively correlated with the rate of intact structural spermatozoa irrespective of the extender used. In all extenders the number of intact spermatozoa significantly decreased as preservation period increased. FC test is a potent indicator of sperm function because it analyses mitochondrial integrity independently from observable alterations in motility. The best performing extenders were code D for short-term storage and code A for long-term storage. Therefore, further to establish an evaluation system on sperm capacity in high meat quality populations of breeding pig and chicken, it would be beneficial to having improvements of better prolificacy on semen production of breeding animal selection program.