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UE Biopathologie cellulaire et tissulaire
Anatomie Pathologique
Introduction - Techniques
2017-2018
Dr Aurélie Cazes - Département de Pathologie- Bichat
Anatomie pathologique Modalités d’enseignement 2017-2018
En DFGSM2
Moodle Anatomie Pathologique DFGSM2
• 5 cours magistraux x 2 h : Introduction et techniques, lésions élémentaires, inflammation x2, métabolisme
– Dont 1 cours interactif (lésions élémentaires, 8/11) à préparer sur Moodle Paris Diderot (lire le document cours 2)
– Venir avec un smartphone
• 2 ED 2 heures
– Lames virtuelles à consulter avant la séance : Moodle Paris Diderot
• Examen L2 : Question rédactionnelle et QRM portant sur cours et ED
• Anapath dans d’autres UEs (respiratoire, cardiovasculaire…)
• Anatomie pathologique (ou Pathologie) = discipline médicale
• Etudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules
• Utilise des techniques principalement morphologiques
• Lésions = altérations morphologiques des organes, décelables par tout moyen d’observation.
• Ensemble de lésions: • +/- spécifiques d’une maladie
• Évocatrices d’un diagnostic
• Exemples = nécrose, inflammation, prolifération, fibrose….
Anatomie pathologique Introduction
• Etudie les lésions au cours d’une maladie, survenant sur les organes, tissus ou cellules
• Prélevés puis examinés
- A l’œil nu = « Macroscopie »
- Au microscope
Anatomie pathologique Introduction
Démarche diagnostique
Symptômes
Examen clinique
Imagerie
Biologie
Anatomie Pathologique
Diagnostic
Traitement Pronostic
Surveillance
Analyse lésions cellulaires et tissulaires Compte-rendu
Anatomo-pathologique
Patient
Synthèse Anatomo-radio-clinique
Patient
A partir de quels prélèvements?
• Cellules isolées = Cytologie
• Quel que soit le prélèvement: – Toujours envoyé en anapath
accompagné d’une feuille de demande
– Etat civil du patient
– Renseignements cliniques +++
– Imagerie
– Biologie….
– Et coordonnées du préleveur
• Tissus = Histologie
Cytologie - Techniques
• Etude de cellules isolées, déposées sur une lame de verre • Catégories de prélèvement
– Liquides
Physiologiques : liquide céphalo-rachidien Epanchements des séreuses : pleurésie, ascite Lavage : broncho-alvéolaire
– Grattage ou brossage : muqueuses (buccale, génitale) « frottis » col utérin
– Appositions de pièces opératoires (ganglion) – Ponction à l’aiguille masse ou organe plein / kyste: gg, nodule
sein, thyroïde
Cytologie - Techniques
• Techniques « traditionnelles »
– Frottis : étalement sur lame du matériel rapidement après prélèvement
– Cytocentrifugation d’un liquide
– Appositions ou empreintes d’un tissu sur lame de verre
• Séchage à l’air ou fixation par une laque
• Colorations : Papanicolaou, MGG
• Pas de « réserve » de matériel une fois lame colorée
• Techniques plus récentes
Cytologie en milieu liquide = immersion immédiate des cellules dans le milieu de conservation
• Concentration et transfert en couche mince sur une lame puis coloration
• « réserve » de matériel en cas de besoin .
Cytologie
• Indications Accès non chirurgical à une lésion profonde, nature? Dépistage, surveillance (peut être répété) Complément d’examen histologique (hématologie) Avantages: peu invasif, rapide, performant • Limites Qualité technique pas tjrs optimale Morphologie des cellules en suspension différente des cellules ds le tissu (compétence du cytologiste) Matériel peu abondant pour techniques complémentaires Si suspicion de malignité un prélèvement tissulaire de “contrôle” est souvent indiqué
Prélèvements tissulaires
• Biopsie : prélèvement d’un fragment de tissu pour analyse anatomo-pathologique
– par ponction (aiguille coupante ou trocart) (foie, rein, os, etc.) : « à l’aveugle » ou sous repérage (échographie, scanner) lorsque la ponction doit être dirigée sur une lésion focale
– au cours d’une endoscopie (pince montée sur l’endoscope)
– Au bistouri, au punch….
Biopsie pulmonaire à l’aiguille Biopsie bronchique à la pince Biopsie exérèse d’un polype colique
• Pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d’un ou de plusieurs organes
Prélèvements tissulaires
Valve aortique
Tumorectomie du sein
Pneumonectomie avec pariétectomie
1 cm
• Autopsie (ou nécropsie) = examen anatomopathologique pratiqué sur un cadavre. - Les autopsies médico-légales sont pratiquées sur ordre de la justice dans tous les cas de mort suspecte
- Les autopsies à but scientifique sont pratiquées dans les hôpitaux, généralement à la demande des médecins.
Prélèvements tissulaires
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
?
• Etape cruciale et irréversible: Fixation du tissu
Fixation= méthode permettant de conserver les cellules et le tissu dans un état fixe le plus proche possible de l'état physiologique, pour éviter qu'ils ne se dégradent. rapide après le prélèvement la plus utilisée = fixation au Formol, par immersion Durée variable selon taille (de quelques heures à quelques jours)
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
?
Film réalisé à St Antoine, illustrant la prise en charge macroscopique d’une pièce opératoire https://youtu.be/6-HdKZFb9xo
Biopsie
Examen microscopique
Prélèvements tissulaires
Pièce opératoire
Mise en cassettes Inclusion en paraffine
Coupe du tissu Coloration HES (Hématoxyline Eosine Safran)
Examen macroscopique sur tissu fixé
Fixation au Formol
Tem
ps
tech
niq
ue
2
4 à
72
h
+/- techniques complémentaires
Compte -rendu
Examen macroscopique sur tissu frais
Enregistrement des prélèvements au
laboratoire
Prélèvements tissulaires
Pièce opératoire fixée au formol
Inclusion en paraffine du tissu: Déshydrater dans bains d’alcool Remplacer alcool par solvant (toluène /xylène) Imprégner de paraffine liquide chaude Créer un « bloc de paraffine » refroidie contenant le tissu à analyser
Examen macroscopique: Description - Mesure de la pièce
Choix des lésions à analyser (ex: tumeur, marges de résection,
ganglion)
Zones d’intérêt mises en cassettes
Coloration standard = HES (Hématoxyline Eosine Safran)
Automate à colorations
Le tissu coupé et étalé sur lame est « déparaffiné » puis réhydraté et trempé dans différents bains de colorants
Prélèvements tissulaires
Coloration standard = HES Hématéine (hématoxyline): bleu, noyaux Eosine: rose, cytoplasme Safran: jaune, tissu conjonctif , collagène
Prélèvements tissulaires
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
?
Film réalisé à St Antoine illustrant la prise en charge complète d’une biopsie, avec inclusion et coloration https://youtu.be/pPe1CAVRibg
0,2 cm
Biopsie sous fibroscopie Lobectomie pulmonaire
Biopsie: Tumeur: 5 cm
Prélèvements tissulaires
Blocs de paraffine se conservent et sont exploitables pendant des dizaines d’années si fixation de bonne qualité….
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de l’examen extemporané • Examen histologique rapide • Réalisé en cours d’intervention chirurgicale • Résultats orientent les suites de l’intervention
Technique • Prélèvement frais (=non fixé +++) : 1 à 2 cm max. Sur pièce opératoire ou biopsie • Congélation dans un cryostat (-20°C): durcit le prélèvement permet la coupe 4 microns • Coloration rapide à la main • Résultat rendu immédiatement (téléphoné) • Durée environ 20 mn
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de l’examen extemporané • Examen histologique rapide • Réalisé en cours d’intervention chirurgicale • Résultats orientent les suites de l’intervention
• Film réalisé à St Antoine illustrant la prise en charge d’un
examen extemporané
https://youtu.be/kH1Z0A_TxTE
Prélèvements tissulaires
Limites de l’examen extemporané • Réalisé dans des conditions d’analyse non optimale:
• Congélation altère la morphologie • Analyse partielle (1 à 2 cm) • Coloration rapide manuelle
• Sera toujours confirmé par un examen après fixation/inclusion
en paraffine du reste du prélèvement
• Moins fiable que l’examen définitif
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de la congélation des tissus pour conservation • Possibilité de conserver les tissus/cellules à -80° après
congélation en azote liquide • Banque de tissu « Tissuthèque », « Tumorothèque »
• En vue d’études de biologie moléculaire (ARN++) • En vue d’études protéiques • En vue d’immunofluorescence….
• Dans le cadre du soin (=utile au diagnostic) • Dans le cadre de la recherche biomédicale = tissuthèque gérée
en conformité avec la loi (information et non opposition des patients)
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de la congélation des tissus pour conservation • Différent d’un examen extemporané • Se fait à partir d’un prélèvement frais (=non fixé) • Le plus rapidement possible à réception • Souvent réalisé à l’étape de « macroscopie fraîche »
• Stockage à -80° jusqu’à utilisation
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard: Fixation Macroscopie Inclusion en paraffine Coupe Coloration
Analyse au microscope optique
?
Principes d’analyse d’une coupe histologique
• Examen à faible grossissement :
architecture du tissu
Organe normal résiduel ou pas ?
repérage des zones lésionnelles
• Examen à plus fort grossissement :
détails cellulaires
• Diagnostic (s)
Pathologie 2.0… du microscope à la lame virtuelle
Principe: Numériser une lame
Stockage sur un serveur
Consultation avec logiciel approprié
Pathologie 2.0… du microscope à la lame virtuelle
Exemple : lame virtuelle ED1
Principales applications actuelles: Enseignement Présentation de cas aux réunions de concertation multidisciplinaires Demande d’avis Groupes d’experts…… Nécessite adaptation +++ des moyens matériels/des compétences
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard: Fixation Macroscopie Inclusion en paraffine Coupe Coloration HES
Analyse au microscope optique
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard: Fixation Macroscopie Inclusion en paraffine Coupe Coloration HES
Analyse au microscope optique Techniques complémentaires (spéciales)
Colorations Immunohistochimie Biologie moléculaire « in situ »
Mise en évidence de constituants particuliers « in situ »
• Des cellules : mucus, glycogène, pigments… • De la matrice extracellulaire : fibres élastiques, amylose • Agents infectieux : bactéries, parasites, champignons…
Colorations histochimiques « spéciales »
Techniques histochimiques basées sur des réactions biochimiques Exemple: identification du glycogène, des mucopolysaccharides neutres dans la réaction de Schiff (coloration de PAS) Oxydation de certains polysaccharides par l’acide Révélée par une coloration rouge
Colorations de la fibrose : Rouge Sirius se fixe sur le collagène
Colorations histochimiques « spéciales »
Colorations histochimiques « spéciales »
Grocott: colore les champignons (mycoses), filaments, levures, kystes
Filaments d’Aspergillus Kystes de Pneumocystis jirovecii
Colorations histochimiques « spéciales »
Coloration de Ziehl-Neelsen : coloration permettant l'identification des
mycobactéries (Bacille Acido-Alcoolo Resistants, BAAR).
Mycobacterium tuberculosis (Bacille de Koch, BK), agent de la tuberculose
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Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard: Fixation Macroscopie Inclusion en paraffine Coupe Coloration HES
Analyse au microscope optique Techniques complémentaires (spéciales)
Colorations Immunohistochimie Biologie moléculaire « in situ »
Immunohistochimie
• Mettre en évidence certaines protéines cellulaires (antigènes)
– Cytoplasmiques, membranaires, nucléaires
• A l'aide d'une réaction antigène (Ag) – anticorps (Ac)
• Complexe formé rendu visible par un marqueur
– Localisation
– Quantification
• Système révélateur : chromogène, fluorochrome
• Deux systèmes : direct et indirect
Immunohistochimie
Antigène cible
Anticorps primaire
Ac secondaire couplé
Substrat
• Méthode immunoenzymatique indirecte :
Sur une coupe tissulaire ou lame de cytologie Appliquer un anticorps primaire spécifique de la cible Puis un anticorps secondaire couplé à une enzyme, à laquelle on fournit un substrat Le produit coloré de la réaction enzymatique apparait au niveau du complexe Ag-Ac si la liaison a eu lieu
Immunohistochimie
Antigène cible
Anticorps primaire
Ac secondaire couplé
Substrat
Antigène: cytokératine 7 Antigène: TTF-1
Marqueur épithélial Marqueur pulmonaire
• Intérêt diagnostique : classification d’une tumeur (épithéliale,
lymphoïde, conjonctive….) • Mise en évidence d’un agent infectieux : CMV, herpès.. • Mettre en évidence une sécrétion • Détection de molécules ayant une importance pronostique (Ki-67) • Intérêt thérapeutique : recherche d’une cible : recherche de
récepteurs aux oestrogènes, protéine HER2 dans les cancers du sein….
Immunohistochimie : applications
Cancer du sein: IHC HER2 Surexpression du récepteur membranaire Indication d’un traitement par trastuzumab
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard: Fixation Macroscopie Inclusion en paraffine Coupe Coloration HES
Analyse au microscope optique Techniques complémentaires (spéciales)
Colorations Immunohistochimie Biologie moléculaire « in situ »
• Hybridation in situ (HIS) ou In situ Hybridization (ISH)
• But: mise en évidence et localisation sur coupes tissulaires ou étalements cellulaires, de séquences connues d’ARN ou ADN
• Par des sondes d’acides nucléiques complémentaires le plus souvent couplées à une enzyme ou un fluorochrome (Fluorescent ISH, nécessite un microscope à fluorescence +++)
• Fait appel aux propriétés de la molécule d'ADN possibilité de la dénaturer (séparation des 2 brins) tendance a se réassocier avec complémentarité des bases
Techniques de biologie moléculaire in situ
Techniques de biologie moléculaire in situ
• Localisation de l’expression d’un gène dans un tissu (quelles cellules ?)
• Mise en évidence de l’amplification d’un gène
• Mise de la perte d’un gène
• Mise en évidence de la cassure d’un gène (translocation protéine chimérique)
Cancer du sein: FISH gène HER2 Amplification du gène (marqué en rouge) par rapport au centromère du chr17 en vert Indication d’un traitement par trastuzumab
• Anatomie pathologique = discipline médicale
• Etudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules
• Lésions analysées en intégrant la connaissance de la clinique +++ et de l’imagerie
• Interprétation et non mesure exacte
• Utilise des techniques principalement morphologiques en constante évolution (veille technologique ++)
• Aboutit à la rédaction d’un compte-rendu comportant:
– diagnostic / hypothèses diagnostiques,
– indications sur potentialité évolutive des lésions
– éléments permettant d'orienter le pronostic/le traitement
Anatomie pathologique
http://campus.cerimes.fr/anatomie-pathologique/ Lien vers le texte
Ouvrage de référence