384 Kurze wissenschaftliche Mitteilungen Klin. Wschr.

tSber den Einflug yon Aet inomyein D auf die Acridinfluoreseenz von E-Zel len in vitro

W. DSSKgAUS* und W. Mi~nL~s Pathologisches Institut (Direktor: Prof. Dr. It. Ba~DT)

und Institut f~r Physiologisehe Chemie (Direktor: Prof. Dr. 1~. K. ZANY') tier Johannes Gutenberg-

Universit~,t Mainz

Eingegangen am 6. November 1968

Das Actinomycin D/C~ (AMD) ist nach den Untersuchungen von REICa u. Mitarb. 0964) als starker Inhibitor der DNA. ~bh~ngigen RNA-Polymerasereaktion anzusehen. SO~fd~EL- ~'~hD~ U. MRarb. (1958) konnten zeigen, da$ die Fluoro- chromierung mit Aeridinorange (AO) in ihrer FarbtSnung im wesentlichen yon den NucIeins~m'eanteilen der Zellbestand- teile beeinfluSt wird. Dabei ist die Desoxyribonucleins~ure mit ihrem Nueleoproteinanteil (DNP) durch ein Emissions- maximum bei ,~ 535 nm (gr~in) charakterisiert, w~hrend der cytoplasmatische Ribonucleinsgure-Proteinkomplex (RNP)

FErbung unterzogen. Ribonuelease eryst. Worthington Bio- chemical Corporation, Freehold, N.J . USA, gelSst in 0,05 m Tris/ItCl-Puffer, pH 7,0, Endkonzentration 0,5 mg/ml. In- kubationsdauer bei 37°C 90 rain. AnschlieBend spiilen in flieBendem Leitungswasser, 60 min.

Die Ergebnisse sind in Abb. i zusammengefaftt: W~hrend die Zetlen vor der AMD-Inkubation ~hezu alle deutlich rot fluo~seieren, weisen sic nach 48 Std aussehlieBlich eine griine AO-Ftuorescenz auf. Unter AMD-Einwirkung nimmt der prozentuale Anteil rot fluorescierender Zellen (Gruppe A) mit der Dauer der Inkubation ab, w~hrend der Anteil der ausschlieBlich griin fluorescierenden Zellen (Gruppe B) in gleiehem Ma6e ansteigt. Die Abnahme der Zellen der Gruppe A bzw. die Zunahme der Zellen der Gruppe B bezogen auf die Inkubationszeit folgen Kurven mit S-f6rmigem Verlauf; die Kurven hubert ihre Wendepunkte bei t = 8 Std.

Unterbrieht man den Stoffwechsel der Zellen 4, 8, 12 und 24 Std nach Versuchsbeginn dureh Zngabe yon Atha.nol (End- konzentration 35%) und h~lt sic bis zur letzten Entnahme - - 48 Std nach Versuchsbeginn-- in diesem Medium, so zeigen die Zellen trotz maximaler Inkubationszeit die fiir den

30 ~

1D0 20 ~_ \ Gruppe B

70- \ .'" \ ,+++ \ \ ...'+" ~ 50 10- ...<

~ 30 /" "-.. Y ~ z 10 ~ t , • J ~ ~ . . . . . ~ Gruppe A

4 8 12 2/, 48 Abb. 1. Verh~ltnis (A/B) yon L 5178-Y-Zellen mit Acridinorange-markierter RNA (Rotfluorescenz: Gruppe A) zu L-Zellen

ohne naohweisbaren l~NA-Gehalt (aussehlieglich griine, DNA-spezifische Kernfluorescenz: Gruppe B) im Verlauf einer 48st~ndigen Inkubation mit Aetinomycin

seine st~rkste Emission bei A 660 nm (kupferrot) zeigt (gIGnaR, Jg., 1966). Die rote bzw. grfine Sekund/~rfluorescenz ist dem- nach ein Indicator ffir das Vorhandensein yon DNP und I~NP in der Zelle.

Da mit der Hemmung der DNA-abhEngigen RNA-Poly- merase eine Abnahme der RNP einherzugehen scheint (BI~- L~¢~, 1960; MITTER~A¥~, If-ADEPt, TRO~I~ERSH-&USE~ U. SA~D~I~mE~., 1968), wurde der EinfluB yon Actinomyein auf die l~NP-spezifische AO-Fluorescenz an einer Suspensions- kultur yon L-Zellen gepriift.

L 5178-Y-Zellen (F:[scg~a, 1959) wurden in Fiscrmms Medium for Leukemic Cells in Mice (Grand Island Biological Company, Grand Island, USA) gezfiehtet. In der station~ren Phase, 72 Std naeh Inoculation - - angewaehsen yon 5000 auf 300000 pro ml - - wurden die Ansgtze mit Aetinomycin D (C1) eryst. (Fa. Serva, Heidelberg), Endkonzentration 0,09 vg/ml ffir 0, 4, 8, 12, 24 und 48 Std bei 37 ° C inkubiert. AnschlieBend wurden von jedem Ansatz 4 Ausstrichpr/~parate angefertigt. Nach 10 rain Lufttrocknung wurden die Prgparate mit einer 10 -4 molaren LSsung yon Aeridinorange (Fa. E. Merck, Darmstadt, C. I. Hr. 46005) in Citronens~ure-Phosphat- Puffer (SIcIlvaine), pH 4,5, angef~.rbt. Zuvor erfolgte Acetylie- rung mit Essigs~ureanhydrid (Fa. E. Merck, Darmstadt) ( R ~ n , 1966). Es wurden aus jedem Pr~parat willkiirlich ]00 Zellen ausgew~hlt und nach ihrer Sekund~rfluorescenz beurteilt. Die Zellen konnten in 2 Gruppen eingeteilt werden: Gruppe A umfafit alle Zellen, die im Kern oder Cytoplasina eine ]~otfluorescenz zeigen; die Zellen der Gruppe B weisen aussehlie61ieh eine grfine Sekund~rfluoreseenz auf. Zur Kern ~roIle wurden Zellen ohne Actinomycinbehandlung uud solche, deren RNA mit i~ibonuclease abgebaut worden w~r der gleiehen

* Mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemein- schaft.

Zeitpunkt der _X_thanolzugabe charakteristische Gruppen- verteilung. Nach tteraustSsen der t~,NA durch Behandlung mit t~ibonuclease zeigen L 5178-Y-Zellen dariiber hinaus einen deutlichen Farbwechsel yon rot naeh griin.

Da die Rotfluoreseenz der Zellen abh~ngig ist yon ihrem Gehalt an I~NP (RmL~ am, 1966), sprechen unsere Befunde fftr eine Abnahme des RNP-Gehaltes der L 5178-Y-Zellen nach Inkubation mit Actonomycin D (C 0. Voraussetzung ffir eine solehe Wirkung scheint uns ein intakter Zellstoffwechsel zu sein.

Zusammen/assung. L 5178-Y-Zellen wurden bis zu 48 Std mit Actinomyein D (C 0 inkubiert und auf ihre Sekund/ir- fluorescenz nach Acridinorange-Fluorochromierung nntersucht. Dabei zeigte sich, da$ vor Actinomycinzugabe nahezu alle Zellen eine kupferrote Fluorescenz in Kern und Cytoplasma aufweisen. Mit zunehmender Inkubationsdauer nimmt der Anteil der rot fluorescierenden Zellen stetig ab, wg, hrend der der Zellen mit ausschlieBlich gr/iner Sekund/irfluorescenz zu- nimmt. HerauslSsen der Ribonncleinsguren durch t~Nase- Behandlung ruff den gleiehen Farbwechsel hervor. Nach 48 Std fluorescieren nahezu alle Zellen grfin. Die Andemmg des Farbwer~ees l~Bt sieh dutch AbtSten der Zellen mit Athanol unterbrechen und fixieren.

Die Befunde sprechen fiir eine Abnahme der nucle~ren und eytoplasmatischen Ribonucleinsgure nach Inkubation mit Actinomyein.

Summary. L 5178-Y-cells were incubated with aetino- myein D/C 1 (AMD) up to 48 hom'es and stained with acridine orange (AO). I t has been shown, that cells without AMD- treatment are characterized by red fluorescence in nuclei and cytoplasm, which is typical for dye-binding RNA-POX groups. With increasing duration of AMD incubation this fluorescence

~7. Jg., Heft 7, 1969 Kurze wissenschMtliche Mitteilungen 385

decreases, so that after 48 h nearly all cells are showing a green fluorescence, typical for DNA-PO~ groups. Extraction of RNA by RNase is followed by the same change in fluores- cence emission. Inactivation of cells by ethanol stopes the change of AO-fluoreseenee emission. Since red AO-fluoreseence seems to be typicet for dye-binding to RNA whereas green AO-fluorescence characterized free DNA-PO~ groups, this phenomenon is assumed to be typical for a strong decrease of nuclear and cytoplasmic RNA in cells after incubation with actinomycin.

Literatur B~Enr~IN~, R.: Die Wirkung yon Aetinomycinen auf mensch-

liche Gewebe in vitro. Z. Krebsforsch. 63, 519--522 (1960). F~scI~E~, G. A.: Nutritional and amethopterin-resistand

characteristics of leukemic clones. Cancer I~es. 19, 372--376 (1959).

gEm~, E., and L GOLD~EI¢~: :Progress in nucleic acid research (J. DAWDSO~, and W. Com~, eds.), vol. 3, p. 183. New York: Acad. Press 1964.

S ~ - D n ~ n : Initiation of DNA synthesis in a system of synchronized L-cells: effect of actinomyein I). Histo- chemic 14, 113--122 (1968).

~m~E~, R., Jn.: Microfluorometrie eheracterisation of intra- cellular nucleic acids and nucleoproteins by acridine orange. Acta physiol, seand. 67, Suppl. 267, 1--123 (1966).

SCHUMMELFEI~DER, N., R. E. KROGH n. K. J. EI~SCHNER: Fg, rbungsanalysen zur Acridinorange-Fluorochromierung. Histochemie I, 1--28 (1958).

Dr. W. DENKIt~-US Dr. W. Mi)~n~ Physiologisch-Chemisehes Institut der Johannes Gutenberg-Universitiit 6500 Mainz

Bestimmung yon Lactat~ Pyruvat, Malat~ 0xataeetat and Alpha- Ketoglutarat in menschlicher Blasen- und Lebergalle

X. A~Lv~ I. Medizinische Klinik der Medizinisehen Akademie Lfibeck

(Direktor: Prof. Dr. reed. U. ~ g )

Eingegangen am 8. November 1968

~etaboliten des Kohlenhydratstoffwechsels sind in Serum, Ascites, Magensaft, Pleura- und Kniegelenksergiissen wieder- holt untersucht worden [9, 11, 19, 20, 24--26], doch fehlen bisher Angeben fiber ihr Vorkommen in der menschlichen Galle. Die folgende Arbeit enth~lt daher quantitative Bestim- mungen des Gehaltes menschlieher Blesen- und Lebergalle an Laetat, Pyruvat, Mater, Oxalaeetat und Alpha-Ketogluterat.

Material und Methodil~ Blasengalle wurde nach intreoperativer Punktion, Leber-

gelle neeh Auffangen in einem auf 0 ° C gekfitflten Dewar-Gel~.g (tiefgefrorenes Eis im Dialysiersehtaueh als Kfihlmittel) naeh Filtration (Schleieher und Schfill 589 s, Blauband) entweder sofor~ aufgearbeitet oder bei --40°C eingefroren. Nach Fgl- lung m..it gleichen Teilen eiskalter 1,5 M Perchlors?iure wurden 1 ml Uberstand mit 0,5 ml 1,4 M KI-ICO a neutralisiert und each Abzentrifugieren (4000 g × 5 min) auf ihren Gehalt an Lact0~t, Malat und Oxalacetat (in Anlehnung an HO~O~ST), an Pyruvat (nach BffCHNER) sowie auf ihren Gehalt auf Alpha-Ketoglutarat (in Anletmung an Bestimmungsverfahren v o n BERGIVIEYER und SOt~UlD'r u. SettwAt~z) untersucht. Des Analysenvolumen lag zwischen 10 und 100 ~l, des Endvolu- men betrug 330 fzl. Die Menge des eingesetzten Perchlorsgure- /iberstands war durch die Eigenf~rbung der Galle begrenzt.

Nach Vorinkubation und Start dureh Enzymzugabe wurde die Reaktion bis zum Stillstand fiber 20--60 min am auto- matischen Extinktionsschreiber verfolgt. Durch 2 Leerwerte (Ansatz ohne Analysenprobe end Ansatz ohne Enzym) wurde die infolge Enzymeigenextinktion bzw. die dutch Verdiin- nung ausgeISste Extinktionsanderung korrigiert.

E~yebnisse In der Tabelle sind die einzelnen Substratbestimmungen,

bezogen auf Milliliter Galle zusammengefaBt. Bei links steil

27 Klin. Wschr., 47. Jahrg.

verteilten MeBwerten ist des geometrische Mittel (Mg), sonst des arithmetische Mittel (Xm) engegeben. Die mittlere Kon- zentration liegt bei allen Substraten in der Blasengalle gering fiber der in Lebergalle. Des gleiche gilt ffir die F~lle, in denen vom selben Petienten Blasen- und LebergMle untersucht wurden.

Nut Lactat war in allen Blasen- und Lebergallen regeI- m~Big vorhanden. Wie der Standardabweichung zu entnehmen ist, streuen die Werte erheblich, auch wenn man die in der Zeiteinheit ~usgesehiedene Menge Galle berfieksichtigt. Lae- tatwerte oberhMb 10 ~zMol/ml wurden jedoch in der Blasen- galle nur 4real, in der Draingalle 3mal gefunden. Malat und 0xalacetat waren nut in wenigen Fi~llen fiberhaupt, und dann nur in geringen Mengen nachweisbar. Die angegebenen Werte fiir 0xalacetat sind trotz wiederholter Bestimmung nicht sicher zu verwerten, de sic nur wenig oberhalb der Naehweis- grenze liegen. Die ffir den verteilungsfreien Test (I~angkolwc- lation) errechneten Korrclationskocffizienten zwischen Bin- sen- and Lebergalle sind nur bei Lactat sieher yon 0 verschie- den (5 % -Grenze).

Eine Korrelation zwischen den Konzentrationen einzelner Substrate in einer untersuehten Gatte lieB sieh in keinem FalI aufzeigen. Bei den Lactatwerten oberhalb yon 10 ~xMol/ml war jedoch immer in Blasen- und Lebergalle Pyruvat nechzuweisen.

Aueh bei einer Gegeniiberstellung der Laetat- und Pyru- vatkonzentrationen mit den }Verten der Lactatdehydrogenase, die in denselben Gallen bestimmt wurde, konnten zwisehen Substrat und Enzym keine gesicherten festen Beziehungen aufgedeckt werdcn.

In den in einzelnen Fiillen bei denselben Patienten unter- suchten Sere fanden sich stets deutlich h6here Werte des untersuehten Substrats als in der Galle.

Diskussion Viele kleinmolekulare Stoffe linden sich in Galle und

Plasma in etwa gleicher Konzentration [2, 4, 5]. Der Konzen- trationsausgleich dieser Substanzen erfolgt wahrscheintich weniger durch Ultra.filtration [10] als vielmehr dureh Diffu- sionsausgteich im Bereich tier kleinsten Gatleng~nge [1, 4, 5, 7, 8]. Zumindest fiir einige Elektrolyte ist dieser Mechanis- mus eines Diffusionsausgteiehes nachgewiesen [4, 5].

Eine zweite Gruppe yon Stoffen mit einem Molekular- gewicht yon etwa 300 kommt in der Galle gegenfiber dem Serum bis I:1000 angereichert vor. Es wird heute angenom- men, dab zumindest die Ausscheidung der Gallensalze und Bilirubin einem energieabh~ingigen aktiven Transportmecha- nismus folgt [4, 5]. Zusammen mit weiteren, wahrseheinlich gleichfalls aktiv transportierten Substanzen und Wasser bil- den diese Stoffe die sot. Primiirgalle, die dann im Bereieh der ableitenden Gallenwege ihre endgfiltige Zusammensetzung erreicht.

Wenn auch der Leberzelle die zentrale Bedeutung bei der Bildung der Galle zukomm% besteht doch kein Zweifel darfibcr, dab die Gellenwege nicht nur passiv durch Diffusionsaus- gleich mit dem Blur juxtasinusoidal und im Bereich des sic umgebenden peribili/iren vascul~ren Plexus an der Bereitung der Galle beteilig~ sind [1, 8], sonderu dariiber hinaus ektiv die Zusammensetzung der Galle beeinflussen [7].

Die yon nns erhobenen Befunde sprechen zus~i, tztich zur aktiven Sekretion und Diffusion f/Jr des Vorliegen eines l~fick- resorptionsmechanismus bei der Gallebildung. Die Konzen- trationen aller bestimmten Substanzen liegen welt unterhalb der Serumspiegel oder erreichen in einzelnen wenigen F~llen gerade deren untere Normwerte (~bersichten fiber NormM- werte im Serum bei I-I]~sT~Y, G~ff~mG, K1~o~rm~GE~ und FImQ. Eine aktive Reabsorption nach vorausgegangener Dif- fusion aus dem Serum in die Galle scheint daher naheliegend.

Gegen d~s Vorliegen eines Rfickresorptionsmechanismus wird yon BAuE~ die Tatsache angefiihrt, da/~ Unterkfihlung der Leberzelle zu einer Abnahme des Galleflusses fShrt, nieht aber zu einer Zunahme, wie sie beim Vorliegen eines Riick- resorptionsmechanismus zu erwarten w~re. Dieses Argument. ist schon deswegen wenig einleuchtend, well BAVl~ gleiehzeitig eine a.ktive Wassersekretion annimmt.

F fir Glucose konnte schon WOODYATT neehweisen, dab sie beim Hund in der Gelle nur dann auftritt, wenn eine Be- handlung mit Phlorrhizin vorausgegangen war, einer Sub- stanz, yon der bekannt ist, dab sie in der Niere die tubul~re Rfickresorption der Glucose hemmt. Wahrend Glucose in der Rattengalle nachweisbar ist, konnten S c ~ I ~ u. Mitarb. kfirz- lich zeigen, dab bei einer enzymatischen Bestimmung Glucose