Zeitsehrift fiir Krebsforschung 63, 372--377 (1960)

Onkopathologisehes Forsehungsinstitut Budapest (Direktor: Prof. Dr. B. KEI~L~EI~)

13ber die Resistenz der Gesehwulstzellen gegen Chemotherapeutica Von

Dr. l~vA GATI

Mit 4 Textabbildungen

(Eingegangen am 31. Mai 1959)

In den letzten Jahren hat man erkannt, dal~ die Gesehwulstzellen Mitteln gegenfiber, die ihr Wachstum anfangs sehr entsehieden hemmten, resistent werden kSnnen. So stellten LAW gegen Antifols/~uren, LETTI~ gegen Colehicin und Trypaflavin, JACKSON gegen TEM und SCI~UBEI~T gegen l~Sntgenbestrahlung resistente Geschwulstst~mme her.

Aus den friiheren Untersuchungen unseres Inst i tutes wissen wir, dal~ die naeh Verabreiehung einer grol3en Einzeldosis der die Zellteilung beeinflussenden Mittel zustande kommenden morphologisehen Ver~nderungen an Rattenorganen und soliden Tumoren einen rege]m~l~igen Verlauf zeigen (KELLNEI~ und MATKO ; HOL- CZlNGE~ und KELLNE~; SUGA~ und KELL~E~; KELLNEtt). Bei den Versuchen mit dem Ehrlichsehen Aseitescarcinom gelangten wit zum selben l~esultat (GiTI, INKE and BAJTA; GiTI, INKE und PALKOVITS). Nach Verabfolgung der Mittel kommt es eine kurze Zeit ]ang nur zur Sch~digung der mitotischen Formen, die Zahl der regelmaBigen Mitosen vermindert sich, und man sieht geseh~digte Mitosen; zur Zeit des Wirkungsmaximums ist ausgedehnter Kern- und Zellzerfall zu beobaehten, dann kommt mit der Bildung yon Riesenzellen die Norma]isierung des eytologischen Bildes in Gang.

Mit den bier besproehenen Versuchen waren wit bestrebt, einigen ehemothera- loeutisehen Mitte]n gegeniiber resistente Geschwiilste hervorzurufen und zu unter- suchen, ob eine Veranderung der obenerw~hnten morphologischen Geschehnisse naehgewiesen werden kann, wenn wir das Tier mit einer grol]en Dosis desselben Mittels vergiften und den Ver]~uf der morlohologischen Veri~nderungen beobaehten.

1. Versuch Methode. In die Bauehh6hle yon weiBen M~usen gleiehen Gewichts (20 g) und Alters aus

eigener Zueht fiihrten wir 10 Millionen Ehrlichsehe Aseitestumorzellen ein. 3 Tage nach der Impfung wurde die Beh~ndlung eingeleitet, indem wir je 5 Tieren ti~glich i.p. 2 7 Colchiein, 2 y Des~cetyl.thiocolehiein, 2 y Colecmid bzw. 10 7 Degranol (7) (1--6-bis-Chlor~thylamino- 1--6-desoxy-D-mannit-dichlorhydrut) insgesamt 10real verabreiehten. Nach der 10. Injektion erhielten die Tiere die DLs0 desselben Mittels. W~hrend der ganzen Versuehsdauer entnahmen wir ti~glich sowie 6, 12, 24, 48, 72 und 96 Std n~ch Verabreiehung der DL~0 einen Trolofen des Aseites, stellten Ausstriche her und f~rbten diese nach PAPA~WlCOLAU bzw. ~FEULGEN-GIEMSA. Auf Grund der Z~hlung yon 200--500 Zellen bestimmten wit in den Ausstrichen das Verhi~lt- his 1. der geseh~digten Zellen, 2. der gesehi~digten Mitosen und 3. der mehrkernigen Zellen.

Ergebnisse

Die auffallendste Vergnderung sahen wir im Erscheinen der zwei- und mehr- kernigen Zellen nach i.p. Dosierung yon 2 7 Colcemid und 10 y Degranol in 2~ Std.

Uber die Resistenz der Geschwulstzellen gegen Chemotherapeu~iea 373

Nach der 10. Colcemiddosis stieg die Zahl der mehrkernigen Zellen auf 80%, nach der 10. Degranol- dosis auf 40% (Abb. 1).

Abb. 2 zeigt den Effekt der einmaligen semiletalen Dosis yon Colcemid und Degranol auf eine Ascitesgeschwulst, die vorher nicht behandelt worden war, und auf eine solche, die wit vorher 10real mit Colcemid bzw. Degra- nol behandelt hattert. Im 14tggi- gen Ascitestumor kamen 5% ge- schgdigte (lytische, pykno~ische) und 7--12% mehrkernige Zellen vor. ~8 Std nach Verabfolgung yon 3 y /g Colcemid wurde die schwerste Schgdigung beobach- tet, und zwar sahen wir 30% Mitosenmi$bildungen und 51% zerfallende Zellen. ][n der chro- nisoh vorbehandelten Geschwulst waren viel weniger geschgdigte Mitosen (18%) und zerfallende Zellen (14%) anwesend. Nach Injek~ion yon 100 y /g

Degranol sahen wir die stgrkste Wirkung ebenfalls nach 2--3 Tagen. In der 48. Std waren 33 % geschg- digte Mitosen vorhanden, in der 72. Std 38% gesch~- digte Zellen. In dem 10real mit kleinen Mengen behan- delten Tumor waren in der 72. Std nachVera.breiehung des 3/iittels nur 12 % geschg- digge Mitosen und 10 % zer- fa]lende Zellen ~nzutreffen.

Abb. 3 gibt die Gestal- tung der Zahl der mehr- kernigen Zellen n~ch Ein- wirkung der DL~o yon Degrunol und der Colchi- cin-Derivate wieder. Im Ascitestumor linden wit im Durchschnitt k~um 5 % mehrkernige Zellen; den

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374 EvA G~TI:

hSehsten Wert - - 25% - - sahen wir 96 Std naeh Darreiehung yon 100 7/g De- granol. Bei den mit kleinen Mengen behandelten Tieren stieg die Anzahl der mehrkernigen Zellen auI 40%; unter der Wirkung yon 100y/g Degranol zeigt dieser Wert in der 96. Std eine 9 %ige Senkung, da naeh Einfiihrung der DLs0 aueh ein Teil der Riesenzellen zerfiel. Naeh Einsloritzung yon 3 ?/g Coleemid bzw. N-Desaeetylthiocolehiein war im unbehande]ten Tmnor der hSehste Wert in der 96. Std zu beobachten, da die Zunahme der mehrkernigen Zellen 22, 26

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Abb. 3

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bzw. 19% erreiehte. Im ehroniseh vorbehandelten Tumor zeigte die Anzahl der auf 71, 65 und 62% gestiegenen mehrkernigen Zellen in der 96. Std 21, 15 bzw. 23 %ige Senkung.

2. u M e t h o d e . In diesem Versuch iiberimpften wir den Ascites mit kleinenMengen behandel-

ten Tiere bei AbsehluB der Behandlung auf jeweils 2 • 5 Tiere, setzten die Behandlung bei diesen Tieren fort und wiederholten die l'3berimpfung nach 10maliger Behandlung. Die Dosis der Mittel wurde bei den einzelnen Passagen vorsichtig erh6ht. Nach der Colehiein- und Tho- colehieinbehandlung war der Tumor in der 3. bzw. 4. Passage versehwunden, weshalb wit bei den weiteren Versuehen Coleemid anwandten. Den einzelnen Tieren gaben wit in der 1., 2. und 3. ~dberimpfung 10 • 2y, in der 9. und 10. LJberimpfung 10 • 20, in der 11. und 12. Pas- sage 10 • 25, in der 13. und 14. Passage 10 • 30 und in der 15. Passage 10 • 35 y Coleemid. An 5 Tieren wurden die morphologischen Untersuehungen vorgenommen, an den anderen 5 Tieren nur die Gewiehtsveriinderungen und l~berlebensdauer registriert.

E r g e b n i s s e

Unter der Wirkung der ehronisehen Colcemidbehandlung maohte das Mehr- gewieht naeh der 2. und 3. Passage bis zum Ende der Behandlungsdauer insgesamt 4 g aus. Am 1/~ngsten war die ldberlebensdauer in der 3., 4. Passage (22 Tage), well der geschwulsthemmende Effekt des Mittels zu diesem Zeitpunkt am st//rksten zur Geltung kommt. Im weiteren versuehten wir vergebens, die Dosis zu erh6hen, der Tumor zeigte virulentes Waehstum, in der 10. Passage betrug das lV[ehrgewieht 14 de0,5 g, die l~berlebensdauer 13 Tage. In der Gesehwulst hatte sich offenbar dem Mittel gegeniiber l~esistenz entwiekelt.

lJber die l~esistenz der Geschwulstzellen gegen Chemotherapeutica 375

Zur CharakterisJierung des morphologisehen Bildes haben wir nur die Gestal- tung der Zahl der mehrkernigen Zellen hervorgehoben, well diese am auffallend- sten war. In der 1., 2. und 3. Passage war die Anzahl der mehrkernigen Zellen im Aseitestumor erh6ht. Naeh der 5., 6., 7 und 8. Uberimpfung nahm ihre Zahl indessen stark ab, und am Ende der 10. Passage waren kaum mehr mehrkernige Zellen anwesend als in den unbehandelten Tumoren. AuI Wirkung der 24 Std naeh den 10 kleinen Gaben eingesehalteten 3 y/g Coleemid verminderte sich die Anzahl der mehrkernigen Zel- len anl/~131ieh der 1., 2. und 3. Passage, weil ein Teil der g0 Riesenzellen naeh Verabrei- % chung der DLso zerfatlen 80 war. Den hSchsten Wert - - 3~% - - wies die Senkung 7o bei der 2. Uberimp:fung auf. In der 4. und 5. Passage war

6O die Anzahl der mehrkerni- gen Zellen nach Verabfolgung der DLso erhSht, bei der ~176 4. Uberimpfung urn 13 %, bei der 5. um 3r naeh der 6., ~o 7. und 8. Passage wurde die Zah] der mehrkernigen Zel- 30 len unter der Wirkung der DLso immer geringer, w/~h- 2o rend die DLso naeh der 9. und 10. Passage in der 1o Zahl der mehrkernigen Zel- len kaum eine Ver/inde- rung hervorrief, da lediglieh o' 0

eine 4--5 %ige Verminde- rung zustande kam (Abb. 4).

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Abb. 4

Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, spiegelt sieh die Gew6hnung an das Nit tel nicht nut im biologisehen Verhalten der Gesehwulst, sondern aueh im morphologischen Bild wider. Die f~r die Colcemidwirkung eharakteristisehen ZelIseh//digungen und Mitosenmil3bildungen sowie der Kern- und Zellzerfall t reten im Laufe der GewShnung an das Mittel immer seltener in Erscheinung, und sehlieglieh kommen sie nieht h/~ufiger vor als die im unbehandelten Aseitestumor aueh normalerweise anwesenden degenerierenden Zellen. Ein groBer Teil der Geschwulstzellen wandelt sieh unter der Wirkung des Mittels zu mehrkernigen Zellen urn. Ein Teil der mehrkernigen Zellen zeigt zu Begim~ der Gew6hnung an das Nittel naeh Verabreiehung der DLso sehwere Seh/~digungen und zerf/illt, wghrend das Ausmag der Seh/~digungen naeh den weiteren Uberimpfungen immer geringer wird, ja sogar die Zahl der i~iesenzellen ansteigt. I t iernaeh nimmt die Anzahl der I~iesenzellen wieder ab, was aber in diesem Fall nieht auf einer Sehgdi- gung oder dem Zerfall der l~iesenzellen beruht, sondern an die Stelle der t~iesen- zellen treten immer mehr intakte einkernige Zellen. In dem in seiner Mehrheit

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376 ]~w GiTI:

aus Riesenzellen bestehenden Tumor sehen wir nach Verabfolgung der DLs0 Col- eemiddosis auch Zellen, bei denen in einem Kern schwere Chromatinschadigung eingetreten ist, wi~hrend die anderen Kerne in derselben Zelle keine Seh~idigung aufweisen; oder aber in einem Kern hat eine normale Mitose stattgefunden, w~ihrend ira anderen Kern die fiir das Initialstadium der Amitose bezeiehnende nierenf6rmige Eindellung beobaehtet werden kann.

Besprechung In der Literatur wurde wiederholt erw~hnt, dad im Ehrlichschen Ascites-

tumor auf Wirkung ehemotherapeutiseher IV[it~el l%iesenzellen entstehen. Naeh L~TTI~ und Sc~I~nlCH sowie LETTI~ und BEI~ODOLT entsprechen im co]chicin- behandelten Tumor diese Zellen, die ,Endprodukte" der MetaphasenmiBbil- dungen, lebensunfs degenerierenden Zel]formen. Unsere Untersuchungen scheinen zu beweisen, dal~ der sozusagen nur aus l%iesenzellen bestehende Tumor der DL~0 der Chelnotherapeutica gegeniiber widerstandsf~higer ist als der in der tiberwiegenden ~ehrhei t aus einkernigen Zellen bestehende Tumor. Im Laufe der GewShnung an das Mittel erscheinen zu gleicher Zeit mit einer Verminderung der Anzahl der mehrkernigen Zellen wieder einkernige Zellen in grol~er Zahl, und zu- gleich sieht man kaum die fiir den Coleemideffekt bezeiehnenden geschs Zellen. Wir denken an die MSgliehkeit, daI3 die mehrkernigen Zellen in der nach der Schi~digung der Gesehwulst eintretenden l%estitution eine l%olle spielen (K~zL~g) und die Mehrzah] der auf einmat in groBer Menge erscheinenden ein- kernigen Zellen aus den mehrkernigen Zellen entsteht.

Zusammenfassung M~use mit Ehrlichschem Ascitestumor wurden mit kleinen Mengen Colchicin,

Colcemid, I~-Desacetylthioeolchicin und Degranol chronisch behandelt und erhiel- ten dann die DL~0 derselben Mittel. Bei den vorbehandelten Tieren war das Aus- real] der Zellsch~digung nach Verabreichung der DLa0 erheblich geringer als bei den Kontrolltieren, denen nut die DLs0 verabfolgt worden war. Nach weiterer Passage des Tumors der chronisch behandelten Tiere und Fortsetzung der Behand- lung konnte ein Colcemid gegentiber resistenter Tumor zustande gebracht werden. Im Laufe der GewShnung an das Pr~parat wandelte sieh unter der Wirkung des Mittels t in groi~er Teil der Geschwulstze]len zu mehrkernigen Zellen urn. Die ffir Colcemid bezeiehnenden Zellsch~digungen waren in st~ndig geringerer Zahl zu beobachten. Nach der l%esistenzentwicklung konnten die fiir Coleemid charakteri- stischen Zellsch~digungen nicht mehr angetroffen werden, und an der Stelle der l~iesenzellen befanden sieh intakte einkernige Zellen.

Summary Mice with Ehrlich aseites tumor were treated over long periods with small

doses of colehicine, colcemide, 2q-desaeetylthioeolehieine and degranol. They were then given a DL 50 dose of the respective chemotherapeutic agent. In the pretreated animals the extent of damage to the tumor cells after the DL 50 dose was considerably less than in the control animals to whom only the DL 50 dose had been given. On further transfer of the tumor cells from the animals which had

lJber die Resistenz der Geschwulstzellen gegen Chemotherapeutica 377

been t rea ted over long periods, and on cont inuing the chemotherapy , a tumor

resista,nt to colcemide could be produced. During the deve lopment of the resi-

s tance to the chemotherapeut ic agent a large number of the tumor cells became

nmlt inuclea ted . The cell damage character is t ic for colcemide was observed in

ever diminishing degree. After the resis tance had developed the characterist ics

of cell damage due to colcemide could not be found. In place of the giant cells

there were in tac t unLnuclea ted cells.

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