Upload
votruc
View
225
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
SKRIPSI
ADIA ALGHAZIA
1112102000080
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
DESEMBER 2016
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG ENDOFIT
DAUN KAYU JAWA (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)
TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Helicobacter pylori DAN Pseudomonas aeroginosa
i
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
SKRIPSI
Diajukan sebagai syarat untuk mendapatkan gelar sarjana farmasi (S.Farm)
ADIA ALGHAZIA
1112102000080
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
DESEMBER 2016
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG ENDOFIT
DAUN KAYU JAWA (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)
TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Helicobacter pylori DAN Pseudomonas aeroginosa
iv
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS
SKRIPSI INI ADALAH HASIL KARYA SENDIRI,
DAN SEMUA SUMBER YANG DIKUTIP MAUPUN YANG DIRUJUK
TELAH SAYA NYATAKAN DENGAN BENAR
Nama : Adia Alghazia
NIM : 1112102000080
Tanda tangan :
Tanggal : 28 Desember 2016
v
ABSTRAK
Nama : Adia Alghazia
NIM : 1112102000080
Program Studi : Farmasi
Judul
Endofit merupakan mikroorganisme menguntungkan yang berinteraksi dengan
tanaman inangnya tanpa menyebabkan gangguan atau kerusakan pada tanaman
inang, Kapang endofit juga mampu menghasilkan metabolit sekunder yang
memiliki aktivitas serupa dengan tanaman inangnya. Tanaman kayu jawa (Lannea
coromandelica (Houtt.) Merr.) merupakan salah satu tanaman lokal yang biasa
digunakan sebagai tanaman obat yang diketahui mengandung senyawa glikosida,
tanin, flavonoid, fenol, dan triterpenoid yang berpotensi sebagai antibakteri.
Tujuan dari penelitiaan ini adalah untuk mengisolasi kapang endofit pada daun
kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) dan menguji aktivitas ekstrak
kapang endofit terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922, Helicobacter pylori ATCC 43504, dan
Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853. Metode yang digunakan dalam penelitian
ini adalah isolasi kapang endofit, karakterisasi, pemurnian, identifikasi bakteri uji,
fermentasi, ekstraksi dan uji aktivitas antibakteri ekstrak kapang endofit. Kapang
endofit yang dihasilkan dari proses isolasi sebanyak 4 isolat. Isolat kapang endofit
difermentasi statis selama 21 hari dengan medium PDY(Potato Dextrose Agar),
kemudian dilakukan ekstraksi sehingga diperoleh empat fraksi ekstrak. Ekstrak
air, metanol, etil asetat, dan n-heksan, kemudian diuji aktivitas antibakterinya
dengan metode difusi, cakram. Uji aktivitas antibakteri menunjukan dari 16 fraksi
ekstrak kapang endofit 8 fraksi yang berpotensi menghambat pertumbuhan
bakteri uji Staphylococcus aureus, 4 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan
Escherichia coli , 2 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan Helicobacter
pylori, dan 7 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan Pseudomonas
aeroginosa. Ekstrak metanol DM1K menunjukan hasil pengujian paling potensial
dibandingkan fraksi lain.
Kata kunci : Kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.), kapang endofit,
ekstrak kapang endofit, antibakteri, difusi cakram
Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit Daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)
Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Helicobacter pylori Dan Pseudomonas aeroginosa
:
vi
ABSTRACT
Name : Adia Alghazia
Department : Pharmacy
Title
Endophytic is benefical microorganism that interacts with plant without causing
any harm to the host. Endophytic can improve the host growing and adaptation.
Besides endophytic can product second metabolites which have similar activities
to the host. Kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) is known as
medicinal plant both empirically and scientifically. That were known to
containing of compounds such as glycocides, tannins, flavonoids, fenols and
triterpenoids. The aim of this experiments was to isolate the endophytic fungi
from leaf kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) and examine their
antibacterial activity againt Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli
ATCC 25922, Helicobacter pylori ATCC 43504, dan Pseudomonas aeroginosa
ATCC 27853 through disc diffusion method. The method used in this experiment
were isolation, purification, characterization, and examine their antibacterial
activity of endophytic fungi. A total of 4 isolates of endophytic fungi were
obtained from kayu jawa leaf. Fermentation of endophytic were fermented under
stationary condition for 21 days at room temperature to get secondary
metabolisms using potato dextrose-yeast (PDY), The crude ekstracts of these
fungi isolates with water, metanol, ethyl acetate, and n-hexane from fermentation
and extraction process were evaluated their antibacterial activity by disk diffusion
method. Test crude extracts showed antibacterial activity of 16 fractions of
endophytic fungi extract, 8 fractions of potentially inhibits the growth of test
bacteria Staphylococcus aureus, 4 fractions potential to inhibit the growth of
Escherichia coli, 2 fractions could potentially inhibit the growth of Helicobacter
pylori, and 7 fractions potential to inhibit the growth of Pseudomonas aeroginosa.
The crude metanol extract DM1K showed potential antibacterial activity instead
of other extracts.
Key Word : Antibacterial activity, Endophytic fungi, Kayu jawa (Lannea
coromandelica (Houtt.) Merr.), Endophytic fungi extrack, disc diffusion
Antibacterial Activity Test Of Endophytic Fungi From Leaf of
(Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) Againt Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori end
Pseudomonas aeroginosa
:
vii
KATA PENGANTAR
Bismillahirrahmanirrahim
Alhamdulillah, segala puji syukur selalu terpanjatkan atas segala nikmat,
karunia, dan ilmu yang bermanfaat yang diberikan oleh Allah
Subhanahuwata’ala, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penulisan skripsi ini. Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada Nabi
Muhammad SAW, beserta keluarga, sahabat, dan para pengikutnya hingga akhir
nanti semoga kita mendapat syafaat dari beliau.
Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit
Daun Kayu Jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) terhadap bakteri
staphylococcus aureus, escherichia coli, helicobacter pylori dan pseudomonas
aeroginosa” ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
sarjana farmasi di program studi farmasi, fakultas kedokteran dan ilmu kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Selama proses penyusunan dan penulisan laporan ini, penulis menyadari
begitu banyak bantuan dari berbagai pihak yang telah meluangkan waktunya,
mendidik dan membimbing, dan mendoakan yang terbaik kepada penulis. Maka
pada kesempatan kali ini, penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya
dan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak Prof. Dr. Arief Sumantri, SKM, M.Kes., selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta.
3. Ibu Eka Putri, M.Si., Apt., dan Bapak Saiful Bahri, M.Si. Sebagai
pembimbing 1 dan pembimbing 2 yang dengan sabar senantiasa meluangkan
waktu dan pikirannya untuk membimbing dan mendidik penulis
4. Ibu Dr, Azrifitria, M.Si.,Apt selaku dosen pembimbing akademik yang setia
membimbing dan memberikan arahan selama kuliah.
5. Bapak dan ibu dosen program studi farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan Universitas islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah
memberikan ilmunya kepada penulis
viii
6. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Nur Ansori dan ibunda Kinanti Sumarni
yang selalu memberikan doa, kasih sayang yang luar biasa, dukungan moril
maupun material dan nasihatnya yang tak akan pernah mampu penulis
membalas itu semua. Penulis hanya bisa berdoa kepada Allah yang maha
pengasih lagi maha penyayang agar kiranya dengan kebesarannya mengasihi
dan melindungi Ayahanda dan Ibunda tercinta, melimpahkan rezeki, dan
memberikan keselamatan di dunia dan akhirat kelak.Aamiinn
7. Adikku tersayang Zulfa Alfi Farida dan Aulia Khalda Salsabila yang selalu
memberikan semangat dan keceriaan dalam hidup penulis.
8. Teman-teman penelitiaan endofit dan mikrobiologi Ka Ambar, Ka Ati,
Ismatuz Zulfa, Gunawan, Okin, Vano, Wida, Fadil, Dimut, Lilis, Eha,
Zakiyah, santi yang bersama dalam melakukan penelitian baik suka maupun
duka.
9. Para laboran farmasi : Mba rani, kak lisna, Kak tiwi, Kak eris, kak Yaenab,
Kak rahmadi dan Kak Walid yang telah membantu selama penelitiaan
10. Teman-teman Kontrakan ceria Galih, Ghilman, Santo, Ivan, Irham, Bung
Okin, Brendi, Towi, Om Guns, Boy. Kalian sudah seperti saudara sendiri dan
bersama-sama menjalani keceriaan bersama
11. Teman-teman seperjuangan Mahasiswa/i S1 Farmasi UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta angkatan 2012 Yang selalu penuh kebersamaan dan berjuang bersama,
terkhusus buat Nurul Fitri Rukmana. Dan Tim PDR Dwi Putri dan Intan
Cahyani yang telah banyak membantu diakhir penyelesain penelitian.
12. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis selama ini yang tidak bisa
penulis sebut satu per satu.
Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas segala
bantuan dan dukungannya kepada penulis.Penulis menyadari bahwa dalam
penulisan skripsi ini masih banyak kelemahan dan kekurangan. Maka dari itu,
segala kerendahan hati penulis sangat mengharapkan kritik dan saran pembaca
agar lebih sempurnanya skripsi ini.
Jakarta, Desember 2016
Penulis
ix
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI
TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK
Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Adia Alghazia
NIM : 1112102000080
Program Studi : Farmasi
Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Jenis Karya : Skripsi
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya
ilmiah saya, dengan judul :
Untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital
Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.
Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat
dengan sebenarnya.
Dibuat di : Ciputat
Pada Tanggal : 28 Desember 2016
Yang menyatakan
(Adia Alghazia)
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG ENDOFIT
DAUN KAYU JAWA (LANNEA COROMANDELICA (HOUTT.) MERR.)
TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Helicobacter pylori DAN Pseudomonas aeroginosa
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ........................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iii
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iv
ABSTRAK ........................................................................................................... v
ABSTRACT ......................................................................................................... vi
KATA PENGANTAR ......................................................................................... vii
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI........................ ix
DAFTAR ISI ........................................................................................................ x
DAFTAR TABEL ............................................................................................... xii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4
1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4
1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tanaman Kayu Jawa ................................................................................ 5
2.2 Kandungan Kimia .................................................................................... 6
2.2 Mikroba Endofit ....................................................................................... 6
2.3 Kapang Endofit ........................................................................................ 7
2.4 Metabolit Sekunder Kapang Endofit ....................................................... 7
2.5 Isolat Kapang Endofit .............................................................................. 8
2.6 Fermentasi ................................................................................................ 9
2.7 Bakteri ...................................................................................................... 9
2.8 Bakteri Uji ................................................................................................ 10
2.8.1 Staphylococcus aureus ................................................................... 10
2.8.2 Escherichia coli ............................................................................. 10
2.8.3 Helicobacter pylori ........................................................................ 11
2.8.4 Pseudomonas aeruginosa .............................................................. 12
2.9 Anti Bakteri .............................................................................................. 12
2.10 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................................ 13
2.11 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Metode Difusi ............................... 15
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ................................................................... 17
3.2 Alat ........................................................................................................... 17
3.3 Bahan ....................................................................................................... 17
3.3.1 Tanaman ......................................................................................... 17
3.3.2 Bahan Kimia .................................................................................. 18
3.3.3 Bakteri Uji ...................................................................................... 18
xi
3.4 Pembuatan Media Pertumbuhan Kapang Endofit .................................... 18
3.4.1 Pembuatan Media PDA.................................................................. 18
3.4.2 Bahan Kimia .................................................................................. 18
3.4.3 Pembuatan Media PDY (Potato Dextrose Yeast) .......................... 18
3.5 Isolasi Kapang Endofit ............................................................................. 19
3.5.1 Sterilisasi Permukaan ..................................................................... 19
3.5.2 Pemurnian Kapang Endofit ............................................................ 19
3.6 Identifikasi Kapang Endofit ..................................................................... 20
3.7 Fermentasi Kapang Endofit ..................................................................... 20
3.8 Ekstraksi Hasil Fermentasi Kapang Endofit ............................................ 21
3.9 Identifikasi BakteriUji ............................................................................. 21
3.10 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................................ 22
3.10.1 Media NA (Nutrient Agar)........................................................... 22
3.10.2 Media MHA (Mueller Hinton Agar) ............................................ 22
3.10.3 Peremajaan Bakteri Uji ............................................................... 22
3.10.4 Pembuatan Suspensi Bakteri ........................................................ 22
3.10.5 Pembuatan Larutan Uji ................................................................ 23
3.10.6 Pembuatan Larutan Kontrol ......................................................... 23
3.11Uji Aktivitas Antibakteri ......................................................................... 23
3.12 Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat .......................................... 24
3.13 Penapisan Fitokimia Daun Kayu Jawa dan Ekstrak kapang yang
berpotensi ....................................................................................................... 24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Determinasi Tanaman .............................................................................. 25
4.2 Penyiapan Sampel .................................................................................... 25
4.3 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit .................................................... 27
4.4 Karakteristik Isolat Kapang Endofit ........................................................ 29
4.4.1 Isolat DA2K ................................................................................... 30
4.4.2 Isolat DA3K .................................................................................. 31
4.4.3 Isolat DM1K .................................................................................. 32
4.4.4 Isolat DM2K .................................................................................. 33
4.5 Fermentasi Kapang Endofit ..................................................................... 34
4.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi Kapang Endofit ............................................ 35
4.7 Uji Kemurnian Bakteri Uji ....................................................................... 38
4.8 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit Metode Difusi .......... 39
4.9 Penapisan Fitokimia ................................................................................ 43
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan .............................................................................................. 45
5.2 Saran ........................................................................................................ 45
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 46
LAMPIRAN ......................................................................................................... 49
xii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hasil isolasi dari variasi daun kayu jawa ................................................ 28
Tabel 2. Hasil pemurnian kapang endofit daun kayu jawa ................................... 29
Tabel 3. Hasil Perolehan berat ekstrak isolat kapang endofit ............................... 35
Tabel 4. Hasil kromatografi lapis tipis ekstrak kapang endofit ............................ 37
Tabel 5. Hasil Uji Kemurnian Bakteri Uji secara Mikroskopik............................ 38
Tabel 6. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen .......................... 40
Tabel 7. Hasil penapisan fitokimia daun dan ekstrak yang berpotensi ................. 43
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Tanaman Lannea coromandelica ........................................................ 5
Gambar 2. Sampel daun Lannea coromandelica .................................................. 26
Gambar 3. Isolat DA2K secara makroskopik dan Mikroskopik ........................... 30
Gambar 4. Isolat DA3K secara makroskopik dan Mikroskopik ........................... 31
Gambar 5. Isolat DM1K secara makroskopik dan Mikroskopik .......................... 32
Gambar 6. Isolat DM2K secara makroskopik dan Mikroskopik .......................... 33
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 : Alur Penelitian ................................................................................ 49
Lampiran 2 : Hasil Determinasi ........................................................................... 50
Lampiran 3 : Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Kapang Endofit ......................... 51
Lampiran 4 : Pemurnian Kapang Endofit ............................................................ 52
Lampiran 5 : Karakteristik Kapang Endofit ......................................................... 53
Lampiran 6 : Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit ..................................... 54
Lampiran 7 : Pembuatan Inokulum Bakteri Uji ................................................... 55
Lampiran 8 : Identifikasi Bakteri ......................................................................... 56
Lampiran 9 : Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Kapang Endofit ......................... 57
Lampiran 10 : Daun Kayu Jawa dan Isolasi Daun Kayu Jawa ............................. 58
Lampiran 11 : Hasil Kultur Kapang Endofit ......................................................... 59
Lampiran 12 : Fermentasi Isolat Kapang Endofit ................................................. 60
Lampiran 13 : Ekstrak Isolat DA2K Kapang Endofit ........................................... 61
Lampiran 14 : Ekstrak Isolat DA3K Kapang Endofit ........................................... 62
Lampiran 15 : Ekstrak Isolat DM1K Kapang Endofit .......................................... 63
Lampiran 16 : Ekstrak Isolat DM2K Kapang Endofit .......................................... 64
Lampiran 17 : Hasil Uji Isolat DA2K Terhadap Staphylococus aureus ............... 65
Lampiran 18 : Hasil Uji Isolat DA2K Terhadap E.coli dan H. pylori .................. 66
Lampiran 19 : Hasil Uji Isolat DA2K Terhadap Pseudomonas aeroginosa ......... 67
Lampiran 20 : Hasil Uji Isolat DA3K Terhadap Staphylococus aureus ............... 68
Lampiran 21 : Hasil Uji Isolat DA3K Terhadap E.coli, H. Pylori, P.aero ........... 69
Lampiran 22 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap Staphylococus aureus .............. 70
Lampiran 23 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap Escherichia coli ....................... 71
Lampiran 24 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap Helicobacter pylori .................. 72
Lampiran 25 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap P.aeroginosa ............................ 73
Lampiran 26 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap Staphylococus aureus .............. 74
Lampiran 27 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap Escherichia coli ....................... 75
Lampiran 28 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap Helicobacter pylori .................. 76
Lampiran 29 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap P.aeroginosa ............................ 77
Lampiran 30 : Hasil Uji Fraksi Air Terhadap ....................................................... 78
Lampiran 31 : Skrining Penapisan Fitokimia Ekstrak DM1K .............................. 79
1
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Resistensi penggunaan antibiotik telah menyebabkan masalah global yang
serius bagi kesehatan, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) menyatakan resistensi
antibiotik adalah salah satu masalah kesehatan global di dunia modern dan
menjadi salah satu tantangan terbesar dunia kesehatan. Resistensi antibiotik
menyebabkan banyak kuman atau bakteri penyebab penyakit kini tak mampu lagi
disembuhkan dengan obat antibiotik biasa. Oleh karena itu pencariaan untuk
mendapatkan jenis antibiotik baru masih sangat diperlukan (Kaitu,2013).
Beberapa sumber yang potensial dalam pencariaan antibiotik baru berasal
dari senyawa bioaktif yang diperoleh dari tumbuhan, hewan, mikroba, dan
organisme lain (Prihatiningtias, 2005). senyawa metabolit sekunder yang
dihasilkan dari jaringan tumbuhan yang tumbuh di hutan tropis memiliki aktivitas
biologi yang tinggi. Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka
bumi, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroorganisme
endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi. Indonesia merupakan negara yang
memiliki biodiversitas yang tinggi dan kawasan hutan hujan tropis yang luas
sehingga merupakan satu kelebihan dalam pencarian sumber-sumber senyawa
bioaktif. Indonesia merupakan negara yang memiliki area hutan hujan tropis yang
luas. Hutan hujan tropis merupakan sumber tumbuh-tumbuhan yang mengandung
senyawa bioaktif yang potensial (Strobel,2003).
Salah satu sumber senyawa bioaktif berasal dari mikroba endofit,
kemampuan mikroba endofit menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang
hampir sama dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan
dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder. Mikroba endofit yang
diisolasi dari tanaman inangnya dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif
yang memiliki daya antimikroba, antimalaria, antikanker dan sebagainya.
(Strobel, 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat
dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau
1
2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, sehingga tidak perlu menebang tanaman
aslinya untuk diambil sebagai simplisia (Radji, 2005).
Kapang endofit adalah bentuk organisme yang hidup didalam jaringan
tanaman tanpa merugikan inangnya, kapang endofit mampu menghasilkan
senyawa bioaktif atau metabolit sekunder yang diakibatkan transfer genetik dari
tanaman inangnya ke dalam kapang endofit (Tan & Zou, 2001). Kapang
dilaporkan memiliki potensi yang lebih besar untuk menghasilkan metabolit
sekunder yang bermanfaat sebagai senyawa obat dibandingkan bentuk organisme
endofit lainnya (Wahyudi,1998).
Salah satu tanaman obat tradisional yang banyak dimanfaatkan masyarakat
Indonesia, khususnya masyarakat Watampone, kabupaten Bone, Sulawesi Selatan
adalah Kayu jawa atau dalam masyarakat Bugis dikenal dengan sebutan “aju
jawa”. Tanaman ini adalah salah satu tanaman obat tradisional yang masih sering
digunakan oleh masyarakat Bugis sampai sekarang ini karena khasiatnya yang
dipercaya sangat ampuh dan biasanya digunakan untuk mengobati luka dalam
maupun luka luar. Masyarakat Bugis juga sering menggunakan tanaman aju jawa
ini untuk mengobati penyakit diare, mual dan muntah. Cara penggunaan tanaman
ini berbeda-beda tergantung tujuan penggunaanya, misalnya untuk pengobatan
diare atau muntah masyarakat meminum rebusan tanaman ini. Sedangkan untuk
mempercepat penyembuhan luka, masyarakat menggunakan bagian tanaman kayu
jawa dengan menempelkan ke bagian luka (Rahayu,2006).
kayu jawa (Lannea coromandelica) dengan kandungan metabolit
sekundernya memiliki banyak aktivitas biologis. Kulit batang Lannea
coromandelica (Houtt.) Merr. Mengandung karbohidrat, flavonoid, saponin,
fenol, tanin, terpenoid dan glikosida (Vadivel. et al,. 2012 ; Rajib, et al,. 2013).
Ranting Lannea coromandelica (Houtt.) Merr. Juga mengandung terpenoid, tanin
dan flavonoid yang dilaporkan memiliki aktivitas dalam penghambatan bakteri
(Gauniyal dkk, 2015).
Penelitiaan terdahulu juga menjelaskan bahwa daun Lannea
coromandelica (Houtt.) Merr. Mengandung polifenol, alkaloid, steroid, protein,
getah, saponin dan mucilago (Readdy G dkk, 2011). Glikosida, triterpenoid,
flavonoid, fenol, tanin, minyak dan lemak (Vedivel dkk, 2011).
3
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Daun lannea coromandelica (Houtt.) Merr. Dilaporkan mempunyai
aktivitas antioksidan, antimikroba, trombolitik (Wahid, 2009). Penelitian yang
telah ada pada tanaman ini menunjukkan bahwa tanaman kayu jawa yang berasal
dari Sulawesi selatan juga memiliki potensi sebagai antibakteri. Pada pengujian
antibakteri dari ekstrak etanol 96% kulit batang kayu jawa (lannea
coromandelica) memiliki aktivitas sebagai antibakteri (Rahmadani,2015). Maka
digunakan bakteri yang berhubungan dengan empiris yang digunakan masyarakat
untuk pengobatan, diantaranya adalah bakteri Staphylococcus aureus, merupakan
bakteri flora normal pada mulut dan saluran pernapasan tetapi bersifat patogen
menyebabkan infeksi pada kulit. Bakteri ini banyak terdapat pada selaput lendir,
kulit, bisul (Dwidjoseputro, 1990). Bakteri Escherichia coli, merupakan bakteri
normal usus namun dalam keadaan tidak normal bersifat patogen, umumnya
menyebabkan diare (Dwidjoseputro,1990). Bakteri Helicobacter pylori adalah
bakteri berbentuk spiral yang ditemukan pada lapisan mukosa lambung atau
melekat pada lapisan epitel lambung. Helicobacter pylori menyebabkan lebih dari
90% dari ulkus duodenum dan hingga 80% dari ulkus lambung (Jawetz, 1992).
Bakeri Pseudomonas aeruginosa, merupakan bakteri yang sering menyebabkan
penyakit bagi manusia, dimana sering diisolasi dari penderita neoplastik, luka dan
luka bakar yang berat.
Melihat adanya kandungan daun kayu jawa yang berpotensi sebagai
antibakteri, serta belum adanya penelitiaan tentang isolasi kapang endofit yang
berasal dari daun kayu jawa serta belum adanya publikasi ilmiah tentang
pengujian dari ekstrak isolat kapang endofit daun kayu jawa (Lannea
coromandelica) sebagai antibakteri ini di Indonesia, membuka kemungkinan
kapang endofit daun kayu jawa sebagai antibiotik yang lebih ramah lingkungan.
Penggunaan endofit daun kayu jawa ini dalam pengembangan antibiotik yang bisa
menjadi suatu eksplorasi kekayaan alam indonesia tanpa harus mengeksploitasi
keanekaragaman hayatinya.
Berdasarkan uraian diatas, maka dilakukan penelitiaan untuk mengisolasi
kapang yang mungkin ada dalam daun kayu jawa Lannea coromandelica dan
menguji aktivitas kapang tersebut terhadap Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Helicobacter pylori, dan Pseudomonas aeruginosa.
4
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana mengisolasi kapang endofit dari daun tanaman kayu jawa
(Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) ?
2. Bagaimana aktivitas antibakteri dari ekstrak isolat kapang endofit dari
daun kayu jawa (Lannea coromandelica) terhadap bakteri Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, dan Pseudomonas
aeruginosa.
1.3 Tujuan Penelitian
1. Mendapatkan isolat kapang endofit dari daun tanaman kayu jawa (Lannea
coromandelica (Houtt.) Merr.)
2. Memperoleh ekstrak kapang endofit dari daun tanaman kayu jawa (Lannea
coromandelica (Houtt.) Merr.) yang memiliki aktivitas penghambatan
terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Helicobacter pylori, dan Pseudomonas aeruginosa.
1.4 Manfaat Penelitian
1.4.1 Secara teoritis
Secara teoritis penelitian ini diharapkan akan menambah ilmu pengetahun
tentang aktivitas antibakteri dari kapang endofit yang diisolasi dari daun
tanaman kayu jawa (lannea coromandelica)(Houtt.) Merr.)
1.4.2 Secara metodologi
Secara metodologi penelitian ini diharapkan dapat menjadi refrensi dalam
proses isolasi dan uji antibakteri kapang endofit.
1.4.3 Secara aplikatif
Secara aplikatif hasil penelitian ini diharapkan dapat dikembangkan
sebagai dasar pembuatan antibiotik yang berasal dari ekstrak kapang
endofit daun kayu jawa (lannea coromandelica)(Houtt.) Merr.)
5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tanaman Kayu jawa (Lannea coromandelica)
Gambar 1 Tanaman Lannea coromandelica Daun Lannea coromandelica
(sumber : Erwin Prawirodiharjo, 2014) (sumber : Koleksi pribadi, 2015)
Secara taksonomi, tanaman Kayu Jawa digolongkan sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Phylum : Mannoliophyta
Class : Magnoliatae
Order : Sapindales
Family : Anacardiaceae
Genus : Lannea
Species : Lannea coromandelica
Kayu Jawa merupakan deciduous tree atau pohon gugur yang dapat
tumbuh hingga mencapai 25 m (umumnya 10-15 m). Permukaan batang berwarna
abu-abu sampai coklat tua, kasar, ada pengelupasan serpihan kecil yang tidak
teratur, batang dalam berserat berwarna merah atau merah muda gelap, dan
memiliki eksudat yang bergetah. Daun meruncing, dan berjumlah 7-11. Bunga
berkelamin tunggal berwarna hijau kekuningan. Buah berbiji, panjang 12 mm,
bulat telur, kemerahan, dan agak keras. Tanaman ini berbunga dan berbuah dari
bulan Januari hingga Mei. Lannea coromandelica memiliki sinonim Odina wodier
6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang tersebar di Himalaya (Swat-Bhutan), Assam, Burma, Indo-China, Ceylon,
Pulau Andaman, China, dan Malaysia (Avinash, 2004).
Tanaman Kayu Jawa (Lannea coromandelica) merupakan tanaman
pekarangan yang dapat dimanfaatkan daun dan kulit batangnya dengan cara
ditumbuk ataupun direbus untuk mengobati luka luar, luka dalam, dan perawatan
paska persalinan (Rahayu 2006). Kulit batang dapat digunakan sebagai astringen,
mengobati sakit perut, lepra, peptic ulcer, penyakit jantung, disentri, dan
sariawan. Perebusan daun juga dianjurkan untuk mengobati pembengkakan dan
nyeri lokal (Wahid, 2009).
2.2 Kandungan Kimia
Berdasarkan studi literatur Lannea coromandelica, Mengandung Alkaloid,
karbohidrat , flavonoid, triterepenoid, steroid, tanin, glikosida, saponin, serta
protein (Joshi, 2012). Md. Tofazzal dan Satoshi Tahara (2009) telah mengisolasi
senyawa dari kulit batang Lannea coromandelica berupa senyawa
dihydroflavonols, (2R,3S)-(+)-3’,5-dihydroxy-4’,7 dimetoxydihiydroflavonol, dan
(2R , 3R)-(+) -4’, 5 ,7- Trimetoxydihydroflavonol.
2.3 Mikroba Endofit
Mikroba endofit adalah mikroorganisme yang hidup di dalam jaringan
tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni
dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya (Tan RX, 2001). Bacon
dan White (2000) mendefinisikan endofit sebagai mikroorganisme yang
membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa menimbulkan gejala penyakit
pada inangnya. Mikroba endofit yang terdapat dalam jaringan tumbuhan ada
beberapa bentuk yaitu: fungi (kapang dan khamir), bakteria, mycoplasma,
archaebacteria. Diantara keempat bentuk organisme tersebut, fungi adalah bentuk
mikroorganisme yang paling banyak ditemukan sebagai endofit (Strobel, 2003).
7
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4 Kapang Endofit
Kapang endofit merupakan fungi yang hidup di dalam jaringan tanaman
pada jangka waktu tertentu dan membentuk koloni dalam jaringan tanaman
tersebut tanpa merugikan inangnya (Radji, 2005).
Kapang yang masih dalam bentuk spora baik dalam daun, akar dan batang
tidak dapat diamati tanpa ditumbuhkan dalam medium pertumbuhan. Populasi
kapang endofit yang terdapat pada batang dan daun lebih banyak dibandingkan
pada akar (Purwanto, 2011). Endofit dapat berperan sebagai perangsang
pertumbuhan tanaman dan meningkatkan hasil melalui produksi fitohormon dan
penyedia hara, sebagai penetral kontaminan tanah sehingga meningkatkan
fitoremidiasi, dan agen pengendali hayati. Endofit juga dapat berperan dalam
mengurangi infeksi nematoda, meningkatkan ketahanan tanaman, memproduksi
metabolit sekunder seperti alkaloid, steroid dan lain-lain (Yulianti, 2012).
2.5 Metabolit Sekunder Kapang Endofit
Metabolisme kapang endofit menghasilkan dua jenis metabolit yaitu
metabolit primer dan metabolit sekunder. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh
tanaman memiliki beberapa ciri antara lain spesifik, tidak perlu diproduksi setiap
saat, pada kebanyakan kasus fungsinya tidak diketahui. Berbagai jenis endofit
telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam
media perbenihan yang sesuai. Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi
oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil diisolasi. Metabolit sekunder yang
dihasilkan dari mikroba endofit memiliki bioaktivitas yang bermanfaat baik untuk
dunia farmasi maupun pertanian. Bioaktivitas dari kapang endofit yang telah
dilaporkan sangat beragam antara lain sebagai antimikroba, antiviral, antioksidan,
immunosupresif, antikanker, dan antimalaria. Kemampuan mikroba endofit
memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya
merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi
metabolit sekunder dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya
tersebut. Sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-
masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari
bakteri dan kapang (Strobel, 2003).
8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.6 Isolasi Kapang Endofit
Isolasi kapang endofit dilakukan dengan metode direct seed planting.
Tanaman sampel di isolasi langsung dari tanaman hidup atau tanaman yang
diawetkan. Apabila tanaman diawetkan, sedikit dari jaringan tanaman dipotong
dari tanaman dan ditaruh dalam plastik bersegel. Plastik tempat menyimpan
tanaman harus bebas dari udara lembab (Strobel, 2003). Sebelum dilakukan
sterilisasi permukaan, tanaman sampel yang langsung diperoleh dari alam dialiri
dengan air mengalir selama 10 menit hingga bersih dari pengotor seperti debu dan
tanah (Wahyudi P, 1998). Sterilisasi permukaan bertujuan untuk mengeliminasi
mikroba yang terkandung pada permukaan tanaman. Sterilisasi permukaan dapat
dilakukan dengan dicelupkan dalam alkohol 70% , dan direndam di larutan
NaOCl (Strobel, 2003).
Langkah selanjutnya setelah dilakukan sterilisasi permukaan, jaringan
bagian luar dihilangkan dengan pisau steril. Jaringan bagian dalam lalu dipotong
membujur dan diletakkan dengan hati-hati pada permukaan media agar. Potongan
tanaman pada media isolasi diinkubasi selama 7-21 hari
(Strobel,2003; Wahyudi P,1988). Medium isolasi yang umum digunakan untuk
kapang adalah Potato Dextrose Agar (PDA) (Margino, 2008 ; Noverita et al.,
2003 ; Pawle, 2014).
2.7 Fermentasi
Fermentasi merupakan suatu proses untuk mengubah bahan dasar menjadi
produk yang dikehendaki dalam kultur mikroba tertentu. Menurut Purwanto,
2011. dari proses fermentasi yang dilakukan bertujuan untuk menghasilkan
beberapa produk di antaranya :
a. Biomassa sel, misalnya protein sel tunggal.
b. Enzim, seperti enzim amilase dan protease.
c. Metabolit, merupakan senyawa hasil reaksi metabolisme dari kapang endofit,
seperti metabolit primer (misalnya polisakarida, protein, asam nukleat), serta
metabolit sekunder (yaitu senyawa antibiotika).
d. Produk rekombinan, seperti insulin dan interferon.
9
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
e. Biokonversi, konversi asam asetat dari etanol sorbitol dan produk steroid,
aseton dari propanol, antibiotika dan prostaglandin).
Proses fermentasi kapang endofit menggunakan media Potato Dextrose Yeast.
Medium PDY (Potato Dextrose Yeast) merupakan media fermentasi yang umum
di gunakan karena mengandung sumber karbon yang berasal dari kentang dan
dextrose, serta ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen (Kumala, & Pratiwi,
2014). Senyawa-senyawa sumber karbon dan nitrogen merupakan komponen
terpenting dalam medium fermentasi, karena sel-sel mikroba dan berbagai produk
fermentasi sebagian besar terdiri dari unsur-unsur karbon dan nitrogen, selain itu
juga mengandung garam-garam organik serta beberapa vitamin dan mineral
(Kusumaningtyas et al., 2010).
2.8 Bakteri
Bakteri dibagi dalam golongan Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan reaksinya terhadap pewarnaan Gram. Perbedaan antara Gram positif
dan Gram negatif diperlihatkan dari perbedaan dinding sel. Dinding sel bakteri
Gram positif sebagian besar terdiri atas beberapa lapisan peptidoglikan yang
membentuk struktur yang tebal dan kaku. Kekakuan dinding sel bakteri yang
disebabkan karena lapisan peptidoglikan dan ketebalan peptidoglikan ini membuat
bakteri Gram positif resisten terhadap lisis osmotik (Jawetz, 1996). Dinding sel
bakteri Gram negatif mengandung lapisan peptidoglikan yang tipis, membran luar
yang terdiri dari protein, lipoprotein, fosfolipid, lipopolisakarida dan membran
dalam. Selain itu dinding sel bakteri Gram negatif mengandung polisakarida dan
lebih rentan terhadap kerusakan mekanik dan kimia (Jawetz, 1996). Berdasarkan
bentuk morfologinya, maka bakteri dapat dibagi atas tiga golongan yaitu:
(Dwidjoseputro,1990).
1. Golongan basil
Basil (dari bacillus) berbentuk serupa batang, silindris. Sebagian besar bakteri
berupa basil. Ukuran bakteri basil ada yang lebarnya 0,2 sampai 2,0μ sedangkan
panjangnya ada yang 1 sampai 15μ.
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Golongan kokus
Kokus adalah bakteri yang bentuknya bulat. Golongan ini tidak sebanyak
golongan basil. Ukuran bakteri kokus ada yang berdiameter 0,5μ ada pula yang
berdiameter sampai 2,5μ.
3. Golongan spiral
Spiral adalah bakteri yang bengkok atau berbengkok-bengkok serupa spiral.
Bakteri yang berbentuk spiral ini tidak banyak terdapat jika dibandingkan dengan
golongan kokus maupun golongan basil.
2.9 Bakteri uji :
2.9.1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang bersifat
patogen. Morfologi bakteri ini selnya berbentuk bulat atau kokus berdiameter 0,8
- 1,0μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah
anggur, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu
optimum 37ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25ºC).
Pertumbuhan terbaik pada suasana aerob namun juga bersifat aerob fakultatif.
Bakteri ini sering ditemukan ditanah, air tawar, dan selaput lendir pada binatang
berdarah panas termasuk manusia (Jawetz, 1996).
Klasifikasi Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut.
Divisi : Protophyta atau Schizophyta
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Eubacteriales
Suku : Micrococcaceae
Marga : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
2.9.2. Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang
pendek yang memiliki panjang sekitar 2μm, diameter 0,7μm, lebar 0,4μm.
(Jawetz,1996). Bakteri ini tidak membentuk spora, tidak tahan asam, sebagian
besar bergerak dengan flagel pentrikus (merata tersebar diseluruh permukaan sel
11
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dan beberapa strain mempunyai kapsul). Escherichia coli ini bersifat patogen,
bakteri ini dapat menyebabkan beberapa penyakit pada manusia, antara lain:
menyebabkan infeksi primer pada usus manusia (diare pada anak), infeksi pada
saluran kemih. Bakteri ini banyak ditemukan dalam saluran pencernaan, habitat
pada umumnya adalah ditanah, lingkungan akuatik, makanan, air seni dan tinja.
klasifikasi Escherichia coli adalah sebagai berikut
Devisi : Bacteria
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Enterobacteriales
Suku : Enterobacteriaceae
Marga : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
2.9.3. Helicobacter pylori
H pylori adalah bakteri berbentuk spiral atau batang bengkok, bersifat
Gram negatif, dan hidup dalam lingkungan mikroaerofilik dalam lapisan mukosa,
epitel dan jaringan lambung. Infeksi H. pylori telah diketahui sebagai penyebab
utama penyakit peptic ulcer (tukak lambung dan duodenum).
Klasifikasi Helicobacter pylori adalah sebagai berikut.
Devisi : Bacteria
Kelas : Epsilon Probacteria
Bangsa : Campylobacteralis
Suku : Helicobateraceae
Marga : Helicobacter
Spesis : Helicobacter pylori
2.9.4. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa berbentuk batang dengan ukuran sekitar 0,6 x
2μm. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan terkadang
membentuk rantai yang pendek. P. aeruginosa termasuk bakteri Gram negatif.
Suhu optimum untuk pertumbuhan P. aeruginosa adalah 420C. P. aeruginosa
mudah tumbuh pada berbagai media pembiakan karena kebutuhan nutrisinya
12
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sangat sederhana. Bakteri ini dijumpai pada luka bakar, infeksi telinga serta luka-
luka setelah operasi. Klasifikasi Pseudomonas aerugenosa adalah sebagai berikut:
Divisi : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Marga : Pseudomonadales
Suku : Pseudomonadaceae
Genus : Pseudomonas
Species : Pseudomonas aeruginosa
2.10 Antibakteri
Antibakteri merupakan zat atau obat untuk membasmi jasad renik yang
diperoleh dari sintesis atau yang berasal dari senyawa non organik. Bakteriostatik
yaitu antimikroba yang hanya menghambat pertumbuhan mikroorganisme.
Bakterisidal adalah antimikroba yang dapat membunuh mikroorganisme.
Mekanisme kerja antibakteri:
1. Menghambat sintesis dinding sel
Struktur dinding sel dapat dirusak dengan cara menghambat
pembentukannya atau mengubah dinding sel setelah terbentuk (Pleczar, 1988).
2. Menganggu keutuhan membran sel mikroba
Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu didalam sel
serta mengatur aliran keluar-masuknya bahan-bahan lain. Membran memelihara
integritas komponen-komponen selular. Kerusakan pada membran ini akan
mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel (Pleczar, 1988).
3. Menghambat Sintesis Protein Sel Mikroba
Hidupnya suatu sel bergantung pada terpeliharanya molekul-molekul
protein dan asam nukleat dalam keadaan alaminya. Suatu kondisi atau substansi
yang mengubah keadaan ini, yaitu mendenaturasi protein dan asam-asam nukleat
dapat merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan konsentrasi
pekat beberapa zat kimia dapat mengakibatkan koagulasi (denaturasi) ireversible
(tidak dapat balik) komponen-komponen selular yang vital ini (Pleczar, 1988)
13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4. Menganggu metabolisme sel mikroba
Setiap enzim dari beratus-ratus enzim berbeda-beda ada yang di dalam sel
merupakan sasaran potensial bagi bekerjanya suatu penghambat. Banyak zat
kimia telah diketahui dapat mengganggu reaksi biokimia. Penghambatan ini dapat
mengakibatkan terganggunya metabolisme atau matinya sel (Pleczar, 1988).
5. Penghambatan sintesis asam nukleat dan protein
DNA, RNA dan protein memegang peranan penting di dalam proses
kehidupan normal sel. Hal itu berarti bahwa gangguan apa pun yang akan terjadi
pada pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat mengakibatkan
kerusakan total pada sel (Pleczar, 1988).
2.11 Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi
cakram,metode pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi cakram dilakukan
dengan mengukur diameter zona bening (clear zone) yang merupakan petunjuk
adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu senyawa
antibakteri. (Hermawan dkk., 2007).
2.10.1 Metode Difusi Cakram
Metode difusi cakram merupakan metode yang paling umum digunakan
untuk melakukan uji zat terhadap mikroorganisme. Metoda ini menghasilkan
kategori sensitivitas berdasarkan difusi antibakteri dari kertas cakram di dalam
media yang sudah mengandung inokulat. Kertas cakram uji diresapi zat uji
kemudian kertas cakram tersebut diletakkan pada permukaan media agar yang
sudah mengandung inokulat uji, selanjutnya diinkubasi. Setelah dilakukan
inkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya zona hambat
atau zona bening di sekeliling cakram (Kusmayati dan Agustini, 2007). Hal
tersebut terjadi karena selama masa inkubasi zat uji yang berada dalam kertas
cakram meresap ke media agar. Zona hambat ini dapat menjadi parameter untuk
menentukan tingkat sensitivitasnya apakah sensitif, parsial, atau resisten.
Metode ini dipengaruhi oleh beberapa faktor fisika dan kimia, selain faktor
antara obat dan organisme misalnya sifat medium dan kemampuan difusi, ukuran
molekular dan stabilitas obat (Jawetz et al., 2005).
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.10.2 Metode Dilusi
Antibakteri dibuat seri kadar konsentrasi yang menurun secara bertahap
menggunakan media padat atau media cair. Selanjutnya media diinokulasi bakteri
uji dan diinkubasi. Kemudian ditentukan KHM (Kadar Hambat Minimum)
antibakteri tersebut (Jawetz et al., 2005). Prinsip metode pengenceran ini adalah
senyawa antibakteri diencerkan hingga diperoleh beberapa macam konsentrasi,
kemudian masing-masing konsentrasi ditambahkan suspensi bakteri uji dalam
media cair. Perlakuan tersebut akan diinkubasi dan diamati ada atau tidaknya
pertumbuhan bakteri, yang ditandai dengan terjadinya kekeruhan. Larutan uji
senyawa antibakteri pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya
pertumbuhan bakteri uji, ditetapkan sebagai Kadar Hambat Minimal (KHM) atau
Minimal Inhibitory Concentration (MIC).
Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang
pada media cair tanpa penambahan bakteri uji ataupun senyawa antibakteri, dan
diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi
ditetapkan sebagai Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Minimal Bactericidal
Concentration (MBC) (Pratiwi, 2008).
2.11.3 Uji Bioautografi
Bioautografi merupakan metode spesifik untuk mendeteksi bercak pada
kromatogram hasil KLT yang memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, dan
antivirus. Dengan metode ini, maka dapat diketahui bercak yang memiliki
aktivitas dan dapat dilakukan isolasi senyawa aktif. Metode ini sangat praktis dan
mudah, namun memiliki kerugian yaitu tidak dapat digunakan untuk menentukan
KHM atau KBM-nya (Pratiwi,2008).
Ada dua macam uji bioautografi :
1. Bioautografi langsung
Metode ini dapat dilakukan dengan dua cara :
a. Plat hasil KLT disemprot dengan suspensi bakteri uji.
b. Plat KLT disentuhkan di atas media agar yang telah ditanami bakteri uji (sering
disebut bioautografi kontak). Setelah diinkubasi, area jernih di mana tidak
terdapat pertumbuhan bakteri merupakan spot senyawa aktif.
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Bioautografi overlay
Metode ini dilakukan dengan cara menuangkan media agar ke dalam petri
dan ditunggu hingga memadat. Selanjutnya plat hasil KLT diletakkan di atas
media agar tersebut. Media agar berisi bakteri uji dituang di atas plat hasil KLT
dan ditunggu hingga memadat. Area hambatan setelah inkubasi pada suhu 37°C
selama 18-24 jam dilihat dengan cara menyemprotkan tetrazolium klorida. Spot
senyawa aktif akan muncul sebagai area jernih dengan latar belakang ungu
(Pratiwi,2008).
Bioautografi langsung merupakan metode bioautografi yang paling banyak
digunakan dari semua metode bioautografi. Prinsip dari metode ini adalah plat
KLT dicelupkan pada suspensi mikroorganisme kemudian diinkubasi. Visualisasi
dari zona ini biasanya dilakukan dengan menggunakan reagen dehydrogenase
untuk deteksi aktivitas, yang paling umum adalah garam tetrazolium.
Dehydrogenase mikroorganisme mengkonversi garam tetrazolium menjadi
berwarna, sehingga terlihat spot krem-putih dengan latar belakang ungu pada
permukaan plat KLT menunjukan keberadaan agen antibakteri (Choma,2010).
2.12 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Uji Antibakteri Metode Difusi
Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil pengamatan aktivitas
antibakteri dengan metode difusi (Lorian, 1980 dalam Yulia, 2005), antara lain :
a. Kedalaman agar
Untuk memperoleh sensitivitas yang optimal, cawan petri diisi dengan
lapisan agar tidak lebih dari 2 sampai 3 mm dan merata pada setiap bagiannya.
b. Ukuran inokulum
Ukuran inokulum merupakan salah satu variabel penting yang
berpengaruh pada besar kecilnya zona hambatan dan konsentrasi hambat
minimum. Jika ukuran inokulum kecil, akan diperlukan lebih banyak waktu untuk
mencapai massa zat sel bakteri. Akibatnya zoba hambat yang terbentuk akan
menjadi lebih besar, dan konsentrasi hambat minimum menjadi lebih kecil.
c. Komposisi medium
Aktivitas zat antibakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti kation-
kation dalam medium, pH medium dan adanya berbagai macam bahan antagonis.
Kecepatan difusi zat antibakteri ditentukan oleh konsentrasi medium, konsentrasi
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
berbagai ion dan adanya ikatan elektrostatik antara zat antibakteri dengan
sekumpulan ion dalam medium. Kapasitas nutrisi dari medium perumbuhan juga
sangat mempengaruhi panjangnya fase pertumbuhan dari bakteri uji, dan akan
turut mempengaruhi ukuran zona hambatan dan konsentrasi hambat minimum.
d. Temperatur medium
Tiap-tiap golongan mikroba memiliki temperatur pertumbuhan optimal
(jamur umumnya 20-37°C, bakteri 30-37°C) (Pelczar dan Chan, 1986). Maka
temperatur inkubasi akan sangat mempengaruhi pertumbuhan mikroba uji.
Kecepatan pertumbuhan akan menurun pada temperatur yang lebih rendah dari
temperatur optimal pertumbuhan mikroba dan terhenti pada temperatur ekstrim
bagi mikroba. Hal yang sama terjadi pada temperatur yang lebih tinggi dari
temperatur optimal pertumbuhan.
e. Waktu inkubasi
Besarnya zona hambatan juga ditentukan oleh jangka waktu inkubasi,
misalnya kebanyakan bakteri patogen dapat diamati pertumbuhan setelah 5 atau 6
jam inkubasi. Pada inkubasi selanjutnya zona hambatan akan menjadi lebih kecil
karena terjadi pertumbuhan bakteri pada tepi zona hambatan dan konsentrasi
hambatan minimum akan besar.
f. Konsentrasi zat antimikroba
Semakin tinggi konsentrasi zat aktif antibakteri akan semakin besar
hambatan terhadap pertumbuhan mikroba, sehingga zona hambatan akan semakin
besar.
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian 1 , Laboratorium
Farmakognosi dan Fitokimia, Laboratorium Steril Fakultas Kesehatan dan Ilmu
Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian dimulai pada bulan
September 2015 - Juli 2016.
3.2 Alat
Laminar Air Flow, incubator (Memmert), timbangan (Scout Pro),
mikroskop cahaya (Shimadzu), autoklaf (Jall American), autoklaf digital (ALP),
hot plate (ARE Heating Magnetic Stirrer), vacum rotary evaporator, kertas saring
steril, paper disc, micro pipet dan tip, magnetic stirrer, pinset, cawan petri, tabung
reaksi, jarum ose, ose bulat, beaker glass, gelas ukur, tabung reaksi, bunsen, glass
object, cover glass, kaca arloji, batang pengaduk, batang penyebar kaca segitiga,
spatula, labu Erlenmeyer, labu ukur, botol fermentasi dan alat-alat gelas lainnya
yang umum digunakan pada Laboratorium Mikrobiologi.
3.3 Bahan
3.3.1 Tanaman
Sample uji tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun kayu
jawa (Lannea coromandelica) diperoleh dari daerah Watampone, Kabupaten
Bone, Sulawesi Selatan. Daun di kemas dalam tempat terpisah dari akar dan
batang. Daun dipilih yang masih hijau,belum terdapat cacat dan dikirim dalam
satu tangkai utuh agar bisa di variasikan. dikirim sudah dalam kondisi bersih dan
dikirim 6 oktober 2015 tiba 8 oktober 2015. Tanaman dideterminasi di Pusat
Penelitian Indonesia (LIPI) Kebun Raya Bogor.
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.2 Bahan Kimia
Larutan Natrium Hipoklorit (NaOCl) 5,25% (Baycline), Alkohol 70%,
Alkohol 96% dan akuades steril, Metanol teknis, n-heksan teknis, Etil asetat
teknis.
3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba
Nutrient Agar (NA) (Merck), Potato Dextrose Agar (PDA) (Merck),
Mueller Hinton Agar (MHA) (Merck), Dextrose Broth (Merck), Yeast Extract
(Merck).
3.3.4 Bahan untuk identifikasi kapang: pewarna Methylen blue
3.3.5 Bakteri Uji
Bakteri yang digunakan :
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922,
Helicobacter pylori ATCC 43504, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
3.4 Pembuatan Media Pertumbuhan Kapang Endofit
3.4.1 Pembuatan Media PDA
Potato Dextrose Agar 39 g ditimbang dan ditakar 1 liter akuades. Untuk
pembuatan media PDA 10% ditimbang Potato Dextrose Agar 2,4; agar 15 gram;
kloramfenikol 0,5 g; akuades 1 L. Panaskan masing-masing campuran bahan
hingga homogen. Sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit dengan suhu
121°C. Tuang ke dalam cawan petri, masing-masing 15 mL, kemudian dibiarkan
media membeku (Atika, 2011).
3.4.2 Media Agar Miring PDA
Ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram, dan ditakar 1 L akuades.
Campuran bahan dipanaskan hingga homogen. Sterilisasi dengan autoclave
selama 15 menit dengan suhu 121°C. Masukkan ke dalam tabung masing-masing
10 mL . Letakkan tabung dengan posisi miring ± 45° dan biarkan media membeku
(Purwanto,2011).
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.3 Pembuatan Media PDY (Potato Dextrose Yeast)
Ditimbang 200 g kentang yang telah dikupas dan dibersihkan,
ditambahkan 200 mL akuades, kemudian dipanaskan sampai mendidih. Ekstrak
kentang disaring, kemudian ditambahkan Dextrose sebanyak 10 g, Yeast Extract
2 g, dan ditambahkan akuades sampai 1000 mL. Campuran bahan dihomogenkan
sambil diaduk sampai mendidih diukur pHnya sampai 6. Medium dimasukkan ke
dalam botol fermentasi sebanyak 250 mL, kemudian disterilisasi dengan autoclave
selama 15 menit, pada suhu 121°C (Maryanti,2015).
3.5 Isolasi Kapang Endofit
3.5.1 Sterilisasi Permukaan
Bagian daun tanaman Lannea Coromandelica yang masih segar atau yang
masih terlihat hijau dipilih. Daun Tanaman dibersihkan hingga terbebas dari
pengotor seperti tanah, debu, dan lumut. bagian daun dipotong dengan ukuran 1x1
cm2. Setelah itu, bagian permukaan daun disterilisasi permukaannya.
Mula-mula masing-masing potongan daun uji direndam ke dalam etanol
70% selama 1 menit, lalu di pindahkan potongan daun uji ke dalam larutan NaOCl
5,25% rendam selama 5 menit, terakhir direndam tanaman uji di dalam etanol
70% selama 30 detik dan yang terakhir rendam dengan akuades steril 5 detik.
Daun yang sudah steril kemudiaan dikeringkan diatas kertas saring,
kemudiaan daun dipotong menjadi potongan-potongan kecil berukuran ±1,0 cm.
Daun ditanam diatas permukaan media PDA dan kemudiaan diinkubasi pada suhu
kamar selama 5 – 21 hari (Rustanti, 2007 ; Purwanto, 2011). Setiap cawan petri
dapat ditanam 2 potongan daun. Sebagai kontrol, diinokulasikan akuades bilasan
terakhir pada medium PDA. Proses isolasi dilakukan secara triplo dengan variasi
bagian daun yang muda, daun sedang, dan daun tua.
3.5.2 Pemurniaan Kapang Endofit
Kapang endofit yang tumbuh pada media isolasi selanjutnya dimurnikan
pada cawan petri berisi PDA. Pemurnian dilakukan berdasarkan kenampakan
morfologi secara makroskopis yang meliputi warna dan bentuk koloni dan hifa
yang tumbuh. Sedikit hifa kapang dipindahkan dengan jarum ose steril ke dalam
cawan petri yang berisi PDA, lalu hasil pemurnian tersebut diinkubasi pada suhu
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ruang 250C selama 7-14 hari (Rachmayani, 2008). Isolat kapang yang telah murni
dipindahkan ke agar miring PDA untuk dijadikan stock culture dan working
culture dan disimpan pada suhu 40C (Handayani, 2007)
3.6 Identifikasi Kapang Endofit
Pengamatan morfologi kapang secara makroskopik dilakukan dengan
mengamati karakteristik koloni suatu biakan, antara lain meliputi: warna dan
struktur permukaan koloni; ada atau tidaknya tetes eksudat; dan ada atau tidaknya
lingkatan kosentris. Pengamatan koloni dilakukan sejak awal penanaman hingga
beberapa waktu tertentu, dan segala macam perubahan yang terjadi harus dicatat
(Gandjar et al., 1999).
Pengamatan secara mikroskopis dilakukan dengan menggunakan metode
Slide Culture (Atlas et al., 1984). Tahapan metode Slide Culture yaitu : kertas
kering diletakkan pada dasar cawan petri dan diatasnya diletakkan kaca objek dan
cover glass, kemudian cawan petri tersebut disterisasi dalam auotoklaf pada suhu
121°C selama 15 menit. Setelah itu, kertas saring dalam cawan Petri dibasahi
dengan akuades steril (Kumala,2008). Kaca objek ditetesi medium PDA dan
dibiarkan memadat, kemudian isolat kapang endofit diinokulasikan pada medium.
Kaca objek yang telah mengandung medium dan isolat kapang ditutup dengan
cover glass. Kapang endofit diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Hasil
inkubasi diamati di bawah mikroskop pada pembesaran 20 kali, 40 kali dan 100
kali (Atlas et al., 1984 dalam Jauhari, 2010 dengan modifikasi)
Pengamatan pada mikroskopik meliputi hifa berseptum atau tidak,
miselium terang atau keruh, miselium berwarna atau tidak berwarna, jenis spora
aseksual : sporangiospora, konidia atau arhospora (oidia), ciri kepala pembawa
spora : Sporangium (ukuran, warna, bentuk), kepala spora pembawa konidia :
tunggal, berantai, pertunasan atau kumpulan, bentuk , penampakan spora aseksual
terutama konidia, penampakan sporangiofora atau konidiofora : sederhana atau
bercabang, jika bercabang bentuk percabangan, ukuran dan bentuk kulumela pada
ujung sporangiofora, konidiofora tunggal atau bergrombol (Waluyo,2007).
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.7 Fermentasi
Hasil metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit dapat
diperoleh melalui suatu proses fermentasi. Koloni kapang endofit yang telah
dikultur dalam medium PDA selama 7 hari, diambil menggunakan sedotan steril
berdiameter 6 mm empat potongan, bulatan agar yang mengandung isolat kapang
endofit dipindahkan menggunakan jarum ose dimasukkan ke dalam 250 mL
media PDY cair. Kemudian kultur tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama 21
hari dengan kultur diam (statis) (Phongpaichit et al., 2006) (Kumala et al.,2006
dengan modifikasi).
3.8 Ekstraksi Hasil Fermentasi
Koloni kapang yang diperoleh dari proses fermentasi dibagi menjadi 2
bagian. Bagian pertama, biomassa dihaluskan dengan lumpang dan alu kemudian
ditambahkan pelarut metanol ke dalam biomassa kemudiaan diamkan dalam
tempat gelap selama 48 jam, kemudian saring dan ambil filtrat kemudian
dipekatkan dengan vacum rotary evaporator hasilnya adalah ekstrak kental fraksi
metanol digunakan sebagai ekstrak uji 1. Bagian kedua medium air pertumbuhan
yang diperoleh dari fermentasi kapang diekstraksi dengan cara partisi dengan n-
heksan dan etil asetat yang kemudiaan juga dipekatkan dengan vacum rotary
evaporator hasilnya adalah ekstrak pekat yang digunakan sebagai uji 2 dan 3, dan
bagian medium fermentasinya diuji sebagai uji 4 sebagai uji fraksi airnya.
Tujuan ekstraksi dibagi menjadi 2 antara biomassa dan medium
pertumbuhannya adalah pada biomassa diharapkan eksudat di dalam sel keluar
dengan cara pengahalusan sehingga metabolit sekundernya keluar dari selnya
sedangkan ekstraksi dengan cara partisi pada medium fermentasi bertujuan untuk
menarik eksudat yang keluar dan jatuh kedalam medium fermentasi selama proses
fermentasi.
3.9 Identifikasi Bakteri Uji
Identifikasi bakteri uji dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik
pada bakteri uji yang berusia 18-24 jam. Identifikasi makroskopik dilakukan
dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni. Bakteri uji diambil satu
ose diletakkan diatas kaca objek yang telah ditetesi sedikit NaCl 0,9%. Bakteri
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
disebar pada kaca objek dengan menggunakan ose bulat kemudian difiksasi
dengan cara dilewatkan di atas api. Larutan kristal violet diteteskan di atas
preparat dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian preparat dicuci dengan air
mengalir. Preparat kemudian ditetesi cairan lugol dan dibiarkan selama 45-60
detik, kemudian dicuci dengan air mengalir. Preparat dicuci lagi dengan etanol
96% dan digoyang-goyangkan selama 30 detik. Setelah itu safranin diteteskan di
atas preparat dan dibiarkan selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan air dan
dikeringkan dengan tisu. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x,
200x, dan 400x (Rachmayani, 2008).
3.10 Uji Aktivitas Antibakteri
3.10.1 Medium Nutrient Agar (NA)
Medium yang digunakan untuk peremajaan bakteri adalah nutrient agar
(NA). NA dibuat berdasarkan aturan pakai yang tertera pada kemasan
(Merck).Serbuk NA sebanyak 10 gram dilarutkan dalam 500 mL aquadest dan
dipanaskan hingga mendidih dan agar tercampur rata. Kemudian disterilkan
menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selamat 15 menit. Setelah disterilisasi
medium dapat digunakan dan disimpan di lemari pendingin.
3.10.2 Mueller Hinton Agar (MHA)
Ditimbang sebanyak 37 g bubuk Mueller Hinton Agar (MHA),
ditambahkan 1000 mL aquades, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan
magnetik stirer dan dipanaskan di atas hot plate. Medium disterilisasi dalam
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Suciatmih, 2008).
3.10.3 Peremajaan Bakteri Uji
Peremajaan terhadap bakteri S.aureus,E.coli, H.pylori , dan P.aeruginosa.
dapat menggunakan medium nutrient agar (NA). Medium NA steril dituangkan
ke dalam tabung reaksi sebanyak ± 5 mL. Medium NA didinginkan pada suhu
ruang dengan posisi miring hingga memadat. Diambil satu ose bakteri uji dari
stok kultur, dioleskan secara zig-zag pada media NA miring dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37°C (Leboffe,Michael J. and Burton E. Pierce, 2010).
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.10.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri dibiakan dengan cara di inkubasi dengan nutrien agar miring
selama 24 jam pada suhu 37°C, kemudian diambil dengan ose dan disuspensikan
dengan cara dimasukan kedalam tabung berisi 3 mL NaCl fisiologis 0,9% lalu
divortex sampai homogen dan dilihat kekeruhannya yang menandai bahwa ada
pertumbuhan bakteri, kekeruhan disetarakan dengan Mc. Farland no. III yaitu
setara dengan 109 sel bakteri/mL. Kemudian diencerkan dengan NaCl fisiologis
0,9% steril sampai diperoleh konsentrasi 106 sel bakteri/mL (Kuete,2011).
Penggunaan konsentrasi 106 sel bakteri/mL pada suspensi bakteri berdasarkan
kerentanan anaerobik yaitu 106 – 10
4 (pokyni,2010).
3.10.5 Pembuatan Larutan Uji
Larutan uji ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol kapang endofit dari
daun kayu jawa (Lannea Coromandelica), dibuat dengan cara menimbang ekstrak
n-heksan, etil asetat dan metanol dan dilarutkan dalam pelarutnya masing-masing.
3.11 Uji Aktivitas Antibakteri dengan menggunakan difusi cakram
Uji aktivitas antibakteri dilakukan dalam LAF dengan metode difusi
cakram dalam kondisi aseptis. Larutan uji yaitu ekstrak isolat kapang diserapkan
sebanyak 20 μL pada kertas cakram steril dengan konsentrasi 1000 µg/ml.
Cakram yang sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan medium uji.
Kontrol positif yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri yaitu menggunakan
cakram kloramfenikol 30 µg. Kontrol negatif yang digunakan yaitu masing-
masing pelarutnya. Bakteri uji diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35°C,
Suspensi bakteri uji dimasukan kedalam cawan petri secara aseptis kemudian
ditambahkan medium agar MHA yang telah disterilkan sebanyak 10 ml kemudian
cawan petri digoyangkan perlahan untuk memperoleh suspensi bakteri yang
tersebar merata pada medium MHA (Rachmayani, 2008).
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.12 Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat
Cawan petri diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam.
Zona hambat antibakteri diamati berdasarkan diameter hambat yang ditunjukkan
dengan daerah bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dan diukur
dengan menggunakan jangka sorong. Lalu hasil pengukuran dicatat. Pengujian
aktivitas antibakteri dilakukan duplo. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam masa
inkubasi. Daerah bening merupakan petunjuk kepekaan bakteri terhadap antibiotik
atau bahan antibakteri lainnya yang digunakan sebagai bahan uji yang dinyatakan
dengan lebar diameter zona hambat (zona bening) (Vandepitte et al., 2005).
Kemudian diameter zona hambat tersebut dikategorikan kekuatan daya
antibakterinya berdasarkan penggolongan Davis and Stout (1971)
Menurut Davis and Stout (1971), kriteria kekuatan daya antibakteri
sebagai berikut : diameter zona hambat 5 mm atau kurang dikategorikan lemah,
zona hambat 5-10 mm dikategorikan sedang, zona hambat 10-20 mm.
3.13. Penapisan Fitokimia Daun Kayu Jawa dan Ekstrak Kapang Endofit
Yang Berpotensi
Analisis fitokimia merupakan analisis kualitatif yang dilakukan untuk
mengetahui komponen bioaktif yang terkandung dalam daun kayu jawa dan
membandingkannya dengan ekstrak yang berpotensi sebagai antibakteri dari
ekstrak isolat daun kayu. Tujuan dilakukannya skrining fitokimia ini adalah untuk
melihat apakah senyawa metabolit sekunder yang dikandung oleh tanaman
induknya akan sama dengan kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada
kapang endofitnya, Analisis fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid,
saponin, terpenoid dan steroid, flavonoid, tanin dan polifenol.
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak
isolat kapang endofit terhadap beberapa bakteri patogen. Sampel tanaman yang
digunakan adalah daun Kayu jawa yang diperoleh dari diperoleh dari daerah
Watampone, Kabupaten Bone, Sulawesi Selatan. Tanaman ini telah banyak
digunakan secara tradisional untuk mengobati berbagai penyakit. Menurut
Strobel, & Daisy (2003), salah satu kriteria tanaman yang dapat dipilih untuk
menghasilkan kapang endofit adalah tanaman yang memiliki sejarah etnobotani
seperti digunakan dalam pengobatan tradisional. Secara empiris, daun Kayu jawa
digunakan untuk mengobati penyakit diare, muntah, tukak peptik, dan luka bakar
(Beknal et al., 2010).
Secara garis besar penelitian ini terbagi menjadi beberapa tahap, yaitu
tahap isolasi dan pemurnian kapang endofit dari sampel tanaman, tahap
karakterisasi isolat kapang endofit, tahap fermentasi kapang endofit, tahap
ekstraksi senyawa metabolit sekunder kapang endofit, dan pengujian aktivitas
antibakteri dari ekstrak hasil fermentasi kapang endofit.
4.1 Determinasi Tanaman
Tanaman kayu jawa Lannea coromandelica (Houtt.)Merr. yang digunakan
dalam penelitian ini diambil dari Bone-Sulawesi selatan dan telah dilakukan
determinasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Pusat Konservasi
Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Hasil determinasi menunjukan bahwa sampel
tanaman yang digunakan adalah Lannea coromandelica (Houtt) Merr., suku
Anacardiacceae. Hasil determinasi tanaman kayu jawa dapat dilihat pada lampiran
2 halaman 47.
4.2 Penyiapan Sampel
Sampel daun dikemas dalam tempat terpisah dari akar dan batang. Daun
dipilih yang masih hijau, belum terdapat cacat dan dikirim dalam satu tangkai
utuh agar bisa divariasikan. dikirim sudah dalam kondisi bersih pada tanggal 6
oktober 2015 tiba 8 oktober 2015.
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Daun tersebut diambil dari berbagai bagian yang berbeda, yaitu: daun
bagian atas yang terdapat di bawah daun pucuk, daun bagian tengah, dan daun
bagian bawah dekat dengan percabangan batang. Perbedaan bagian dalam
pengambilan sampel ini bertujuan agar kapang endofit yang dihasilkan lebih
banyak dan memberikan hasil yang beraneka ragam. Sampel selanjutnya
dibersihkan dari debu, tanah, dan pengotor-pengotor lain dengan menggunakan air
bersih mengalir lalu permukaan daun dilakukan sterilisasi permukaan.
Gambar 2. Sampel daun Lannea Coromandelica
a. Bagian tua daun (DT)
b. Bagian muda daun (DM)
c. Bagian pucuk daun (DA)
a
C b
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.3 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit
Isolasi kapang endofit diawali dengan proses sterilisasi permukaan. Proses
ini dilakukan untuk menghilangkan mikroorganisme yang berada pada permukaan
tanaman sehingga koloni yang tumbuh pada media isolasi merupakan koloni
endofit (Strobel, & Daisy, 2003). Daun bagian pucuk, muda dan tua kemudian
dicuci dibawah air mengalir selama 10 menit. Tujuan pencucian dengan air
mengalir adalah untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel pada
permukaan daun (Hafsari dan Asterina, 2013). Masing-masing daun kemudian
direndam ke dalam etanol 70% selama 1 menit, larutan NaOCl 5,25% selama 5
menit, etanol 70% selama 30 detik dan terakhir dibilas dengan akuades steril
selama 3-5 detik. Proses sterilisasi permukaan menggunakan etanol 70% dan
larutan NaOCl 5,25% sebagai desinfektan. Etanol dan natrium hipoklorit yang
digunakan memiliki aktivitas yang berbeda. Etanol mendenaturasikan protein
dengan mendehidrasi dan menginaktifkan enzim (Rutala et al, 2008). Efek
bakterisida dari etanol 70% lebih baik dibandingkan etanol murni, karena protein
didenaturasi lebih cepat dengan adanya air (Rutala et al., 2008). Natrium
hipoklorit merupakan senyawa yang mengandung klorin yang bekerja dengan
mengoksidasi secara irreversible gugus sulfihidril pada enzim dan menganggu
fungsi metabolik dari sel bakteri (Valera, 2008; Rutala et al., 2008). Pembilasan
dengan aquades steril dilakukan untuk membersihkan mikroorganisme yang mati
oleh desinfektan (Hafsari dan Asterina, 2013) dan untuk menghilangkan sisa
etanol dan natrium hipoklorit yang masih menempel pada daun yang dapat
mengganggu pertumbuhan kapang (Kumala, 2014). Aquades bilasan terakhir ini
digunakan sebagai kontrol untuk mengetahui dan menentukan apakah kapang
yang tumbuh merupakan kapang endofit atau bukan. Jika pada media kontrol
terdapat pertumbuhan kapang, maka kapang yang tumbuh dari isolasi daun
bukanlah kapang endofit. Media yang digunakan untuk isolasi dan pemurnian
kapang endofit adalah media PDA (Potato Dextrose Agar). Media ini bersifat
selektif terhadap kapang dan mengandung kentang sebagai sumber karbohidrat
yang merupakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan kapang (Ariyono et al , 2014).
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Daun kayu jawa diisolasi dari tiga variasi daun yaitu daun pucuk, daun
muda dan daun tua dengan media potato dextrose agar. Tujuannya dilakukan
variasi adalah agar mendapatkan kapang endofit yang beranekaragam
Tabel 1 Hasil Isolasi dari Variasi Daun Kayu Jawa
Isolasi Daun Tua (DT)
Isolasi Daun Pucuk (DA)
DA1
DA2
DA3
Isolasi daun Muda (DM)
DM1
DM2
DM3
Hasil isolasi menunjukan dari ketiga variasi daun pada daun tua tidak ada
kapang endofit yang tumbuh, akan tetapi melihat ciri-ciri secara makroskopik
yang tumbuh pada isolasi daun tua adalah khamir, karena pada isolasi
menggunakan media PDA sangat dimungkinkan tumbuh kapang dan khamir. Pada
daun pucuk dan daun muda tumbuh kapang dilihat dari bentuk dan ciri-ciri secara
makroskopik dan mikroskopik, kemudian dilakukan proses pemurnian dimana
kapang endofit dari daun muda dan pucuk yang sama secara makroskopik dan
mikroskopik dianggap satu jenis.
29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 2. Hasil Pemurnian Kapang Endofit Daun Kayu Jawa
Sampel Bagian Daun Jumlah Isolat Kode Isolat
Daun Lannea
coromandelica
Houtt.(Merr.)
Daun dekat dengan
percabangan batang
[Daun Tua] (DT)
-
-
Daun bagian tengah/
Daun Muda (DM)
2
DM1K
DM2K
Daun bagian atas atau
pucuk daun (DA)
2
DA2K
DA3K
Pemurniaan dilakukan berdasarkan morfologi kapang secara mikroskopik
dan makroskopik (Ariyono, 2014). Setiap bentuk, warna, dan karakteristik yang
berbeda dari kapang, ditumbukan dalam satu cawan. Pemurnian dilakukan
berulang kali sehingga diperoleh satu isolat kapang murni.
Hasil dari pemurniaan ditanaman kembali dalam media PDA miring
sebagai stok kultur dan kultur kerja. Stok kultur digunakan sebagai persediaan
yang dapat diremajakan kembali yang diimpan dalam lemari pendingin,
sedangkan stok kerja digunakan untuk kelanjutan pekerjaan. Dari dua kali proses
isolasi dan pemurniaan didapatkan 4 isolat kapang endofit, tabel 2 menunjukan
bahwa kapang endofit dari daun kayu jawa ditemukan pada bagian pucuk dan
daun muda.
4.4 Karakterisasi Isolat Kapang Endofit
Karakterisasi kapang endofit dilakukan terhadap 4 isolat yang diperoleh,
pengamatan karakteristik makroskopik yang dilakukan dengan mengamati warna
koloni, warna sebalik, permukaan koloni (granular, seperti tepung, menggunung,
licin ada atau tidak tetes eksudat), diameter pertumbuhan koloni kapang dan
lingkaran-lingkaran konsentris (Kumala, 2014). Sedangkan pengamatan
karakteristik secara mikroskopik meliputi ada atau tidaknya sekat pada hifa,
pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak bercabang), ada tidaknya konidia, dan
bentuk konidia (Ariyono,2014). Diperoleh 4 isolat, yaitu isolat DA2K, DA3K,
DM1K, DM2K. .
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.4.1 Isolat DA2K
Permukaan koloni kapang abu-abu tua dan bagian pinggir berwarna putih
permukaan kapang bergelombang tidak rata, dan dengan diameter 7,5 cm pada
pertumbuhan hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam dan bagian
pinggir berwarna putih. Secara mikroskopik koloni kapang ini memiliki hifa yang
bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan memiliki konidia
bentuk bulat.
(a) (b)
(c)
Gambar 3. Isolat DA2K secara makroskopik dan mikroskopik
(a) Isolat DA2K umur 12 hari tampak depan
(b) Isolat DA2K umur 12 hari tampak sebalik
(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.4.2 Isolat DA3K
Permukaan koloni kapang coklat tua agak kehitaman dan bagian pinggir
berwarna hitam permukaan kapang rata atau tidak bergelombang dan dengan
diameter 5,5 cm pada hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam
dan bagian pinggir berwarna hitam. Secara mikroskopis koloni kapang ini
memiliki hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan
tidak memiliki konidia.
(a) (b)
(c)
Gambar 2. Isolat DA3K secara makroskopik dan mikroskopik
(a) Isolat DA3K umur 12 hari tampak depan
(b) Isolat DA3K umur 12 hari tampak sebalik
(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.4.3 Isolat DM1K
Permukaan koloni kapang coklat tua agak kehitaman dan bagian pinggir
berwarna hijau tua permukaan kapang pinggir kapang bergelombang dan dengan
diameter 8 cm pada hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam dan
bagian pinggir berwarna hitam. Secara mikroskopis koloni kapang ini memiliki
hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan memiliki
konidia
(a) (b)
(c)
Gambar 5. Isolat DM1K secara makroskopik dan mikroskopik
(a) Isolat DM1K umur 12 hari tampak depan
(b) Isolat DM1K umur 12 hari tampak sebalik
(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.4.4 Isolat DM2K
Permukaan koloni kapang berwarna putih seperti kapas dan bagian pinggir
berwarna putih permukaan kapang rata dan diameter 8,4 cm pada hari ke 12.
Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu putih kekuningan. Secara mikroskopis
koloni kapang ini memiliki hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang
ini bercabang dan tidak memiliki konidia
(a) (b)
(c)
Gambar 6. Isolat DM2K secara makroskopik dan mikroskopik
(a) Isolat DM2K umur 12 hari tampak depan
(b) Isolat DM2K umur 12 hari tampak sebalik
(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.5 Fermentasi
Fermentasi dilakukan untuk mendapatkan metabolit sekunder yang dihasilkan
oleh kapang (Stanbury dkk, 2003). Sebelum fermentasi dilakukan, kemurniaan
kapang benar dipastikan, dan penyiapan fermentasi dilakukan secara aseptis
sehingga terhindar dari kontaminan (Okafor, 2007).
Proses fermentasi berlangsung selama 21 hari yang dinilai bahwa kapang
sudah melewati masa stationer yang menjadi fase penghasil metabolit sekunder
(Stanbury dkk,2003). Ciri dari fase stationer adalah pertumbuhan kapang tetap,
karena terjadi kematian sel yang diikuti pembentukan sel baru (Pratiwi, 2008)
Proses fermentasi kapang endofit menggunakan media Potato Dextrose Yeast
broth (PDY broth) sebanyak 250 mL, Kandungan PDY broth sama dengan PDA
yang digunakan saat peremajaan, tapi berbentuk cair karena tanpa menggunakan
agar. Media Potato Dextrose Yeast (PDY) terdiri dari kentang, dan dextrose
sebagai sumber karbon, serta yeast ekstrak sebagai sumber nitrogen yang
membantu dalam proses fermentasi (Kumala, & Pratiwi, 2014). Proses fermentasi
dilakukan selama 21 hari pada suhu ruang secara statis (Phongpaichit et al.,2006).
Proses fermentasi mengunakan media PDY yang berupa media cair karena
fermentasi dengan media cair lebih efektif untuk memproduksi biomassa dan
lebih mudah dikerjakan secara aseptis (Pokhrel & Ohga, 2007).
Kapang endofit tumbuh di permukaan media fermentasi cair, media
fermentasi berubah seiring dengan pertumbuhan kapang endofit. Selama proses
fermentasi terjadi perubahan warna pada media. Hal ini diduga adanya metabolit
sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit. Menurut Gandjar et al. (2006),
pertumbuhan kapang endofit dapat diketahui dari penambahan masa sel dan
proses metabolisme kapang yang menyebabkan timbulnya perubahan warna pada
media cair. Metabolit sekunder yang dihasilkan dengan proses statis dapat
diekstraksi dari biomassa miselium dan bagian media (Pokhrel & Ohga, 2007).
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi Kapang Endofit
Hasil fermentasi diekstraksi dengan dua metode yaitu partisi untuk filtrat
dan maserasi untuk biomassanya, ekstraksi dilakukan untuk memisahkan senyawa
metabolit sekunder yang dihasilkan dari fermentasi berdasarkan kepolarannya
(Kumala, 2014), Hasil fermentasi setelah 21 hari dari masing-masing isolat
dipisahkan bagian biomassa dan Media pertumbuhan dengan menggunakan kertas
saring untuk dilakukan proses ekstraksi. Bagian biomassa dihaluskan dengan
lumpang dan alu kemudian dilakukan maserasi dengan pelarut metanol, kemudian
saring dan ambil filtrat kemudian pekatkan dengan vacum rotary evaporator
hasilnya adalah ekstrak kental fraksi metanol. Bagian kedua filtrat yang diperoleh
dari koloni kapang diekstraksi dengan cara partisi bertingkat dengan n-heksan dan
etil asetat yang kemudiaan juga dipekatkan dengan vacum rotary evaporator
hasilnya adalah ekstrak kental fraksi n-heksan dan ekstrak kental etil asetat.
Tabel 3. Hasil perolehan berat ekstrak isolat kapang endofit
Isolat Kapang
Endofit
Biomassa Media Fermentasi kapang
Ekstrak Metanol Ekstrak n-
Heksan
Ekstrak Etil
asetat
DA2K 440 mg 120 mg 210 mg
DA3K 330 mg 60 mg 530 mg
DM1K 660 mg 138 mg 260 mg
DM2K 210 mg 140 mg 99 mg
Ekstraksi dilakukan dengan tujuan untuk menarik senyawa metabolit
sekunder hasil fermentasi yang terdapat dalam isolat kapang endofit. Proses
ekstraksi bagian biomassa dilakukan dengan cara ekstraksi secara dingin yaitu
dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Maserasi merupakan
metode ekstraksi yang sederhana dengan merendam bahan dengan pelarut selama
beberapa hari pada temperatur ruang dan terhindar dari cahaya matahari
(Damayanti dan Fitriani, 2012). Keuntungan metode ini adalah peralatan yang
36
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
digunakan sederhana (Damayanti dan Fitriani, 2012). Bagian biomassa
dihancurkan terlebih dahulu menggunakan lumpang dan alu agar struktur sel
pecah sehingga memudahkan zat aktif terekstraksi oleh pelarut. Ukuran yang
semakin kecil akan meningkatkan luas permukaan sehingga proses ekstraksi akan
semakin efektif (Handa et al., 2008). Metanol dan golongan alkohol merupakan
pelarut serba guna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan (Harbone, 2006)
Proses maserasi dilakukan berulang kali hingga tidak terdapat lagi
senyawa yang tertarik oleh pelarut yang ditandai dengan warna pelarut menjadi
bening. Maserat yang didapat kemudian dipekatkan menggunakan rotary
evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental metanol kapang endofit.
Bagian media yang telah dipisahkan dari biomassa dilakukan partisi cair-
cair. Metode ini merupakan pemisahan komponen kimia diantara dua fase pelarut
yang tidak saling bercampur. Komponen kimia akan terpisah ke dalam kedua fase
sesuai dengan tingkat kepolarannya (Gu, 2000). Setiap isolat dilakukan partisi
bertingkat dilakukan menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Hasil partisi
diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat. Masing-masing fraksi kemudian
dipekatkan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental n-
heksana dan ekstrak kental etil asetat.
Fraksi ekstrak hasil maserasi dan partisi yang sudah diuapkan dengan
rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental kemudian ekstrak disimpan
dalam vial tertutup di lemari pendingin untuk menjaga kondisi ekstrak. Ekstrak
hasil ekstraksi dapat di lihit di lampiran 13.
Kemudian masing-masing ekstrak dielusi menggunakan kromatografi lapis
tipis (KLT) untuk mengetahui spot senyawa. Tabel 4 memperlihatkan perbedaan
spot serta eluen yang digunakan, hal ini menunjukan bahwa senyawa yang
terkandung dalam setiap ekstrak isolat tidak sama persis.
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Kapang Endofit
NO Isolat Metanol Etil Asetat N-Heksan
KLT Eluen KLT Eluen KLT Eluen
1
DA2K
M:EA
8:2
EA:NH
5:5
NH: M
5:5
2
DA3K
M:EA
8:2
EA:M
5:5
NH:M
5:5
3
DM1K
M:EA
8:2
EA:M
5:5
NH:M
3:7
4
DM2K
M:EA
8:2
EA:NH
8:2
NH:M
3:7
38
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.7 Uji Kemurnian Bakteri Uji
Identifikasi bakteri uji secara mikroskopik dilakukan dengan metode
pewarnaan Gram, uji kemurniaan bakteri uji dilakukan untuk memastikan bakteri
yang akan digunakan dalam pengujian antibakteri. Hasil pewarnaan gram akan
memperlihatkan perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Gram positif akan berwarna ungu sedangkan gram negatif berwarna merah.
Terdapat empat bakteri yang digunakan sebagai bakteri uji, yaitu Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori Dan Pseudomonas aeroginosa.
Table 5. Hasil Uji Kemurnian Bakteri Uji secara Mikroskopik
No. Bakteri Uji Gambar Mikroskopik
1 Staphylococcus
aureus
ATCC 25923
Merupakan bakteri Gram
positif dengan membentuk
warna ungu, sel berbentuk
kokus dan berkelompok
seperti buah anggur.
2 Escherichia
coli
ATCC 25922
Bakteri Gram negatif
dengan warna merah,
berbentuk batang tunggal.
3 Helicobacter
pylori
ATCC 43504
Merupakan bakteri Gram
negatif dengan membentuk
warna merah, sel berbentuk
batang agak pendek
4 Pseudomonas
aeroginosa
ATCC 27853
Merupakan bakteri gram
negatif dengan membentuk
warna merah
39
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Perbedaan warna yang terjadi disebabkan oleh adanya perbedaan struktur
pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung
peptidoglikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung
lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakeri
Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan
yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif alkohol akan
merusak lapisan lipopolisakarida sehingga kompleks kristal violet-iodin dapat
tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna
merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008).
4.8 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit Metode Difusi
Cakram
Empat fraksi ekstrak dari 4 isolat kapang endofit kayu jawa diujikan
aktivitas antibakterinya terhadap Escherichia coli, Helicobacter pylori Dan
Pseudomonas aeroginosa, empat fraksi tersebut yaitu fraksi metanol kapang
endofit dan fraksi air fermentasi yang di partisi dengan N-heksan dan etil asetat.
Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kapang endofit dilakukan dengan
menggunakan metode difusi cakram. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan
menggunakan bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Helicobacter pylori, dan Pseudomonas aeroginosa. Bakteri yang digunakan
karena bersifat patogen dan dapat menyebabkan terjadinya suatu penyakit, selain
itu juga bakteri uji yang digunakan juga mewakili bakteri Gram negatif
(Eschericia coli, Helicobacter pylori dan Pseudomonas aeroginosa ) dan bakteri
Gram positif (Staphylocccus aureus). Pengujian dilakukan dengan konsentrasi
1000 µg/ml, kemudian masing-masing ekstrak uji diserapkan ke dalam blank disk
yang berdiameter 6 mm sebanyak 20 µl dengan menggunakan mikropipet,
diresapkan pada tempat yang berbeda tidak secara langsung diatas permukaan
media hingga cakram kering. Hal ini bertujuan untuk mencegah pelarut ekstrak
memberikan zona hambat. Pengujian antibakteri menggunakan metode pour plate
dan kemudiaan diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC
setelah itu diamati zona bening disekitar cakram disk kemudian diukur dengan
menggunakan jangka sorong.
40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 6. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen
Isolat
Fraksi Uji
Rata-rata diameter zona hambat (mm)
S.aureus E.coli H.pylori P. aeroginosa
DA2K
Metanol 8,2 mm - - 7,0 mm
n-Heksan - - - 8,1 mm
Etil Asetat - - - 7,9 mm
Air - - - -
DA3K
Metanol 7,1 mm - - -
n-Heksan 7,7 mm - - -
Etil Asetat - - - -
Air - - - -
DM1K
Metanol 8,4 mm 8,1 mm 8,7 mm 7,2 mm
n-Heksan 8,1 mm - - -
Etil Asetat - 8,2 mm 7,6 mm 7,6 mm
Air - - - -
DM2K
Metanol 7,9 mm 7,7 mm - 7,5 mm
n-Heksan 8,3 mm - - -
Etil Asetat 8,2 mm 7,9 mm - 7,1 mm
Air - - - -
Kloramfenikol 26,1 mm 25,2 mm 24,2 mm 22,6 mm
Kontrol (-) - - - -
Keterangan : (-) = tidak ada aktivitas antibakteri
Pada uji aktivitas antibakteri ini dilakukan pengujian dua fraksi uji yaitu
fraksi metanol kapang endofit dan fraksi air yang dipartisi bertingkat dengan n-
Heksan dan etil asetat. Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukan bahwa
dari 16 fraksi ekstrak, fraksi metanol kapang DA2K memiliki aktivitas terhadap
pertumbuhan Staphylococcus aureus sebesar 8,2 mm dan Pseudomonas
aeroginosa sebesar 7,0 mm, Fraksi metanol DA3K memiliki aktivitas terhadap
pertumbuhan Staphylococcus aureus sebesar 7,1 mm, Fraksi metanol DM1K
memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan semua bakteri uji, dan fraksi metanol
DM2K memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan S.aureus sebesar 7,9 mm, E.coli
41
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sebesar 7,7 mm dan P.aeroginosa sebesar 7,5 mm. Hal ini terjadi diduga karena
perbedaan kemampuan senyawa yang terkandung dalam fraksi metanol kapang
endofit untuk berdifusi kedalam sel bakteri dan menimbulkan penghambatan
pertumbuhan (Rifda, dkk. 2005).
Pengujian pada fraksi air bertujuan untuk melihat adanya eksudat yang
mengandung senyawa metabolit sekunder yang tidak sengaja keluar dan jatuh
kedalam media fermentasi. Pada fraksi n-Heksan DA2K memiliki aktivitas
terhadap pertumbuhan P.aeroginosa, Fraksi n-Heksan DA3K dan DM1K
memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan P.aeroginosa dan fraksi DM2K
memiliki aktivitas terhadap Staphylococcus aureus.
Fraksi ekstrak etil asetat DA2K memiliki aktivitas terhadaap pertumbuhan
P.aeroginosa sebesar 7,9 mm. Fraksi ekstrak etil asetat DA3K tidak memiliki
aktivitas terhadap pertumbuhan bakteri. Fraksi ekstrak etil asetat DM1K memiliki
aktivitas terhadap pertumbuhan E.coli, H.pylori dan P.aeroginosa dan fraksi
ekstrak DM2K memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan S.aureus,E.coli dan
P.aeroginosa
Pada semua fraksi air tidak terbentuk zona hambat terhadap semua bakteri
uji, hal ini disebabkan karena pada fraksi air dimungkinakan sudah tidak ada lagi
kandungan metabolit yang tertinggal di dalamnya.
Kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut fraksi yaitu n-heksan, etil
asetat, dan metanol. Natheer et al (2012) menyebutkan bahwa zat yang dijadikan
sebagai kontrol negatif adalah pelarut yang digunakan sebagai pelarut uji.
Tujuannya adalah sebagai pembanding bahwa pelarut yang digunakan tidak
mempengaruhi hasil uji antibakteri fraksi. Hasil uji difusi cakram menunjukkan
bahwa tidak adanya zona hambat yang terbentuk pada kontrol negatif. Hal ini
mengindikasikan bahwa pelarut yang digunakan tidak berpengaruh terhadap
aktivitas antibakteri fraksi.
Kontrol positif yang digunakan adalah cakram disk kloramfenikol 30 µg.
Kloramfenikol dipilih karena merupakan antibiotik berspektrum luas yang dapat
menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram positif maupun Gram
negatif. Kloramfenikol memberikan efek dengan cara bereaksi pada sub unit 50S
ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase. Enzim ini berfungsi
42
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
untuk membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang masih melekat
pada tRNA dengan asam amino terakhir yang sedang berkembang. Sebagai
akibatnya, sintesis protein bakteri akan terhenti seketika dan menyebabkan bakteri
mati (Pratiwi, 2008).
Hasil pengujian menunjukkan bahwa hampir semua penghambatan bakteri
dengan zona hambat yang luas ditunjukkan oleh fraksi ekstrak yang bersifat polar
dan semipolar. Menurut Kanazawa et al (1995), suatu senyawa yang mempunyai
polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antibakteri maksimum, karena untuk
interaksi suatu senyawa antibakteri dengan bakteri diperlukan keseimbangan
hidrofilik dan lipofilik. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa larut
dalam fase air yang merupakan tempat hidup bakteri, tetapi senyawa yang bekerja
pada membran sel hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik sehingga senyawa
antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik dan lipofilik untuk mencapai
aktivitas yang optimal, dan penghambatan pertumbuhan bakteri lebih banyak
menghambat bakteri gram positif yang diwakili oleh Staphylococcus aureus.
Bakteri gram positif memang memiliki sensitifitas lebih besar terhadap senyawa
kimia daripada bakteri gram negatif (Pratiwi, 2008).
Hasil pengujian juga menunjukkan bahwa penghambatan pertumbuhan
yang terbentuk pada E.coli, H.pylori dan P.aeroginosa (gram negatif) lebih sedikit
dibandingkan dengan S.aureus (gram positif). Hal ini menunjukkan bahwa E.coli
dan H.pylori lebih tahan terhadap senyawa antibakteri dibandingkan S.aureus .
Hal ini sesuai dengan pernyataan Zuhud et al. (2001) bahwa bakteri Gram negatif
mempunyai ketahanan yang lebih baik terhadap senyawa antibakteri dibandingkan
bakteri Gram positif. Perbedaan ketahanan hambatan mungkin dikarenakan
perbedaan susunan dinding sel bakteri gram negatif mempunyai lapisan dinding
sel yang lebih kompleks dibandingkan bakteri gram positif (Natheer et al, 2012).
Hasil pengujian antibakteri menunjukan bahwa ekstrak metanol, n-Heksan
dan etil asetat masing-masing membentuk zona hambat pada pertumbuhan bakteri
uji. Ekstrak metanol DM1K menunjukan hasil pengujian yang paling potensial
dibandingkan dengan fraksi lain, karena ekstrak metanol DM1K mampu
memberikan zona hambar pada keempat bakteri uji. Ekstrak etil asetat menyusul
peringkat kedua terbanyak sebagai penghambatan antibakteri, lalu n-Heksan. Hal
43
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ini membuktikan bahwa mayoritas metabolit yang dihasilkan kapang endofit saat
fermentasi tetap berada di dalam sel kapang endofit walaupun ada juga yang
terlarut di dalam medianya, meskipun tanpa ada proses pengocokan. Selain itu,
kelarutan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antibakteri diberikan oleh
senyawa yang larut dalam pelarut polar dan semipolar.
4.9 Penapisan Fitokimia Daun Kayu Jawa dan Ekstrak Kapang Endofit
Dengan Zona Hambat Besar
Pada penelitian ini skrining fitokimia dilakukan terhadap daun yang yang
masih segar dan ekstrak kapang endofit yang memiliki zona hambat besar
terhadap bakteri patogen. Hal ini dilakukan untuk melihat apakah senyawa
metabolit sekunder yang dikandung oleh tanaman induknya akan sama dengan
kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada kapang endofitnya. Hasil
penapisan fitokimia daun kayu jawa ekstrak kapang endofit dengan zona hambat
besar adalah sebagai berikut :
Tabel 7. Penapisan fitokimia daun dan ekstrak yang berpotensi
Metabolit Sekunder Daun Kayu Jawa Ekstrak Metanol DM1K
Alkaloid - -
Saponin - -
Glikosida + +
Tanin + -
Flavonoid + +
Fenol + -
Triterpenoid + -
Keterangan : (+) = Mengandung Metabolit. (-) = Tidak Mengandung Metabolit
Hasil penapisan fitokimia ekstrak metanol DM1K (pelarut polar)
menunjukkan hasil positif pada pengujian terhadap Flavonoid dan glikosida.
Flavonoid merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoid larut dalam
pelarut polar seperti metanol, etanol, butanol dan air (Harborne, 1987; Markham,
1988), Keefektifan flavonoid sebagai antibakteri juga sudah banyak dilaporkan.
Flavonoid beraktivitas sebagai antibakteri melalui penghambatan sintesis asam
nukleat, penghambatan fungsi membran sitoplasma, dan penhambatan
44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
metabolisme energi (Chusnie dan Lamb, 2005). Glikosida adalah senyawa polar
yang keberadaannya dapat di ekstraksi dengan pelarut semi polar dan polar
(Oesman dkk. 2010), mekanisme kerja glikosida sebagai antibakteri adalah
merusak membran sel, rusaknya membran sel menyebabkan substansi intisel
keluar dari sel dan dapat juga mencegah masuknya bahan-bahan penting masuk
kedalam sel, jika fungsi membran sel dirusak maka akan mengakibatkan kematian
sel (Monalisa dkk, 2011).
Hal ini membuktikan bahwa kandungan kimia yang berasal dari daun kayu
jawa juga berada pada isolat kapang kapang endofit, ini dimungkinkan karena
terjadi proses interaksi antara kapang endofit yang hidup dalam jaringan tanaman
dengan tanaman daun kayu jawa tersebut, sehingga kandungan kimia yang berasal
dari tanaman induknya akan sama dengan kapang endofit yang berasal dari
tanaman tersebut, ini sesuai dengan penyataan strobel dan daisy (2003) bahwa
setiap tumbuhan tingkat tinggi dapat mengandung mikroba endofit yang mampu
menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang sama dengan
tumbuhan inangnya akibat koevolusi atau transfer genetik dari tumbuhan
inangnya ke dalam mikroba endofit dan ini merupakan peluang untuk
mendapatkan sumber bahan baku obat yang alami murah dan ramah terhadap
lingkungan.
45
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Diperoleh 4 isolat kapang endofit yang diisolasi dari pucuk daun dan daun
muda dari tanaman kayu jawa Lannea coromandelica (Houtt.) Merr. Yaitu
kapang endofit isolat DA2K, DA3K, DM1K, DM2K.
2. Isolat kapang endofit paling potensial dibandingkan isolat lain pada pengujian
aktivitas antibakteri ini adalah isolat DM1K. Hasil pengujian aktivitas
antibakteri 16 fraksi terhadap bakteri uji menunjukan bahwa terdapat 8 fraksi
ekstrak yang berpotensi menghambat pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus
aureus, 4 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan Escherichia coli,2 fraksi
berpotensi menghambat pertumbuhan Helicobacter pylori, dan 7 fraksi
berpotensi menghambat pertumbuhan Pseudomonas aeroginosa.
5.2 Saran
1. Perlu penelitiaan lebih lanjut tentang isolasi senyawa aktif sebagai antibakteri
dari ekstrak isolat kapang endofit, Terutama pada isolat DM1K fraksi metanol
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi kapang endofit
untuk mengetahui spesiesnya.
3. Perlu penelitiaan lebih lanjut terhadap ekstrak isolat kapang daun kayu jawa
(Lannea coromandelica) tidak hanya sebagai antibakteri, tetapi antimikroba
lainnya.
4. Melakukan optimasi dalam proses fermentasi baik waktu, medium maupun
perlakuan fermentasi (statis atau shaker), sehingga dapat menarik senyawa-
senyawa yang berfungsi sebagai antibakteri.
45
46
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Atika, Dian. 2007. Uji Aktivitas Antimikroba Hasil Fermentasi Kapang
Endofityang Diisolasi dari Akar, Batang, Daun Tanaman Garcinia fruticosa
Lauterb dan Garcinia latriflora Blume serta Akar dan Daun Tanaman
Garcinia cowa Roxb. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam. Universitas Indonesia: Depok
Atlas, R.M., A.E. Brown, K.W. Dobra and L. Miller. 1984. Experimental
Microbiology : Fundamentals and Applications. Collier Macmillan
Publishers. London
Avinash Kumar Reddy Lannea coromandelica: The Researcher’s Tree Journal of
Pharmacy Research 2011 ,4(3),577-579
Avinash Kumar Reddy. 2004. Harmacological investigations on the standardized
leaf extractsof Lannea coromandelica (Hout.) Merr. Journal Indian
Choma, I. M dan Grzelak, E. M., 2010. Bioautographic Detection in Thin-Layer
Chomatography. Journal of Chromatography A. Poland : Elsavier
Dwidjoseputro.1990. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Cetakan XI. Jakarta : Penerbit
Djambatan. Hal. 134.
Erwin, prawirodiharjo. 2014. Uji Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Ekstrak
Etanol 70% dan Ekstrak Air Kulit Batang Kayu Jawa (Lannea
coromandelica). Jurusan farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta.
Jawetz E. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran
EGC
Kumala Shirly, Erlita Agustina dan Priyo Wahyudi. 2006. Uji Aktivitas
Antimikroba Metabolit Sekunder Kapang Endofit Tanaman Trengguli
(Cassia fistula L). Jurnal Farmasi Indonesia. 3(2): 97-102
Kaitu, Sidharta, dan Atmojo. 2013. Aktivitas Antibakteri Fungi Endofit Jahe
Merah (Zingeber officinale var.rubrum) Terhadap Escherichia coli dan
Streptococcus pyogenes. Skripsi. Fakultas Teknobiologi. Universitas
Atmajaya:Yogyakarta
Kusumaningtyas, E., M. Natasia and Darmono. 2010. Potensi Metabolit Kapang
Endofit Rimpang Lengkuas Merah dalam Menghambat Pertumbuhan
Eschericia coli dan Staphylococcus aureus dengan Medium Fermentasi
Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Yeast (PDY). Seminar
Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Hal : 821-824
47
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Mariyanti, Ati. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Kapang Endofit Dari Ranting
Tanaman Parijoto (Mednilla speciosa Reinw.Ex Blume) Dan Uji
Aktivitasnya Sebagai Antibakteri. Jurusan farmasi. Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta
Manik, M.A. Wahid, S.M.A. Islam, A. Pal, K.T. Ahmed. 2013. A Comparative
Study of the Antioxidant, Antimicrobial and Thrombolytic Activity of the
Bark and Leaves of Lannea coromandelica (Anacardiaceae). International
Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. Vol. 4(7): 2609-2614. E-
ISSN: 0975-8232; P-ISSN: 2320-5148.
Margino, Sebastian. 2008. Produksi Metabolit Sekunder (Antibiotik) oleh Isolat
Jamur Endofit Indonesia. Majalah Farmasi Indonesia. 19(2) : 86-94
Merlin, J.N., Nimal C., P. Praveen K., and P. Agastian. 2013. Optimization Of
Growth And Bioactive Metabolite Production: Fusarium solani. Asian
Journal Of Pharmaceutical And Clinical Research. 6 (3) : 98-103
Pelczar, Michel J. Jr dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi cetakan
kesatu. Penerjemah: Ratna Sri H, dkk. Jakarta: UI Press
Pleczar, Michael J and Chan, E.C.S. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2.
Terjemahan: Ratna Siri Hadioetomo,. et al. Jakarta UI Press
Petrini, O., P.J. Fisher, and L.E. Petrini. 1992. Fungal Endophytes of Bracken
(Pteridium aquilinum), with Some Reflections on Their Use in Biological
Control. Sydowia. 44 : 282-293
Phongpaichit S, Rungjindamai N, Rucachaisiriku V, Sakayaroj J. Antimicrobial
Activity in Cultures of Endophytic Fungi Isolated from Garcinia Species.
FEMS Immunol Med Microbiol. 2006. 48; 367-372.
Pokyni et al,. 2010. Prepared Turbidity Standard Mc Farland. USA
Pratiwi , Silvya. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga
Purwanto. 2011. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Penghambat Polimerisasi HEM
dari Fungi Endofit Tanaman Artemisia annuna L. Tesis. Fakultas Farmasi.
Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta
Radji, Maksum. 2005. Peranan Biotekhnologi dan Mikroba Endofit dalam
Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol II no 3:113-
126
Radji, M., Atiek S., Renita R., and Berna E. 2011. Isolation of Fungal Endophytes
from Garcinia mangostana and Their Antibacterial Activity. African
Journal of Biotechnology. 10 (1) : 103-107
Rahayu, Sunarti , S. Diah, P. Suhardjono. 2006. Pemanfaatan Tumbuhan Obat
secara Tradisional oleh Masyarakat Lokal di Pulau Wawonii, Sulawesi
Tenggara. Jurnal Biodiversitas Vol. 7 (3).
48
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Rachmayani, Renita. 2008. Skrining Kapang Endofit Penghasil Antibakteri dan
Antioksidan dari Ranting dan Daun Tanaman Garcinia mangostana.
Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Indonesia : Depok
Rahmadani, fitri. 2015 Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Etanol 96% Kulit
Batang Kayu Jawa (Lannea Coromandelica) terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas
aeruginosa. Jurusan farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN
Syarif Hidayatullah. Jakarta
Rajib Majumder, Md. Safkath Ibne Jami,Md. Efte Kharul Alam and Md. Badrul
Alam Antidiarrheal Activity of Lannea coromandelica Linn. Bark Extract
American-Eurasian Journal of Scientific Research 8 (3): 128-134, 2013
Strobel G, Microbial Gift from Rain Forest. Can J Plant Pathol. 2002; 24:14-20
Strobel, Gary & Bryn Daisy., Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their
Natural
Suciatmih. 2008. Isolasi, Identifikasi Skrining dan Optimasi Kapang Endofit
Penghasil Antimikroorganisme dari Dendrobium crumenatum Sw (Anggrek
Merpati). Skripsi. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Indonesia : Depok
Tan, R.X And W.X. Zou. 2001. Endophyte : A Rich Source Of Fungtional
Metabolite. Nat. Prod, Rep. 18 : 448-459
Valgas, C., de Souza, S. M., Smania, E. F., Smania, A. 2007. Screening Methode
to Determine Antimicrobial Activity of Natural Product. Brazillian Journal
of Microbiology. 34 : 369-380
Wahid Arif. In Vitro Phytochemical and Biological Investigation of Plant Lannea
coromandelica(Family: Anacardiaceae). Thesis to Department of
Pharmacy, East West University. Bangladesh
Wahyudi, P. Mikroba Endofitik Sebagai Penghasil Materi yang Bermanfaat.
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. 1998; 1761/H/98:1- 9.
WHO. Overcoming Antimicrobial Resistance. Diakses dari: htttp://www.
who.int/infectious-disease-report/2000/ch1-5.htm;
Yulia, P. R. 2005. Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil pada Beberapa
Tanaman Obat Tradisional Indoneisa. Skripsi. Fakultas Matematika Dan
Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia : Depok
Yulianti, Titiek. 2012. Menggali Potensi Endofit untuk Meningkatkan Kesehatan
Tanaman Tebu Mendukung Peningkatan Produksi Gula. Perspektif. 11 (2) :
111 – 122
49
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 1
BAGAN TAHAPAN PENELITIAAN
Sampel Tanaman
Sterilisasi Permukaan
Isolasi Kapang Endofit
Pemurniaan dan Peremajaan
Kapang endofit
Fermentasi dan Ekstraksi
Uji Aktivitas Antibakteri
50
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 2
Surat Hasil Determinasi Tanaman kayu jawa (Lannea coromandelica)
LAMPIRAN 3
51
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tahapan Isolasi Kapang Endofit
Sampel Tanaman
Cuci Bersih Dengan Air Mengalir selama 10 Menit
Sterilisasi Permukaan
Tanam pada medium PDA, inkubasi selama 21 hari dalam suhu ruang
Pemurniaan Kapang endofit
Sampel
Alkohol 70% NaOCl 5,25% Alkohol 70% Akuades steril
1 menit 5 menit 30 detik 5 detik
Potong daun dengan ukuran 1x1 cm
52
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 4
Tahapan permunian kapang endofit
Kapang endofit yang
tumbuh pada medium
isolasi
Isolat kapang yang
telah murni working culture dan stock culture
53
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 5
Karakteristik Kapang
Hifa kapang ditanam
pada medium PDA
yang terletak pada
kaca objek
Kaca objek diletakkan
dalam petri steril
berisi sedikit air
Inkubasi pada suhu
ruang selama 7 hari
Tetesi dengan alkkohol
96%
Tetesi dengan larutan
metilen blue
Preparat diamati dengan
mikroskop
54
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 6
Fermentasi dan Ekstraksi kapang endofit
Kapang yang telah murni Inokulasi kapang kedalam medium PDY
Inkubasi pada suhu ruang selama 21 hari
Ekstraksi
pisahkan
Saring dan pisahkan antara biomasa dan
medium kapang endofit dengan kertas saring Biomasa kemudiaan
dihaluskan, kemudian
ditambahkan metanol lalu
didiamkan dalam tempat
gelap selama 48 jam
Kemudiaan saring antara
biomasa dengan metanol
dengan menggunakan
kertas saring, dan
didapatkan maserat
Kemudiaan pekatkan
dengan menggunakan
vacum Rotary evaporator
Di dapatkan ekstrak kental
yang di gunakan sebagai uji
antibakteri fraksi metanol
Uji 1
Filtrat/medium kapang endofit di
ekstraksi dengan cara partisi
bertingkat dengan corong pisah
Filtrat ditambahkan
pelarut n-heksan (1 : 1/2)
Didapatkan ekstrak fraksi n-
heksan kemudian pekatkan
dengan vacum Rotary
evaporator
Filtrat/medium
kapang endofit
Filtrat ditambahkan pelarut
etil asetat (1 : 1/2)
Didapatkan ekstrak fraksi etil
asetat kemudian pekatkan
dengan vacum Rotary
evaporator
Di dapatkan ekstrak kental
yang di gunakan sebagai uji
antibakteri fraksi n-heksan
Uji 2
Di dapatkan ekstrak kental
yang di gunakan sebagai uji
antibakteri fraksi etil asetat
Uji 3
Filtrat
digunakan
sebagai uji
4, fraksi
air
Uji 4
55
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 7
Pembuatan Inokulum Bakteri
Ambil dengan ose
Samakan kekeruhan
Biakan bakteri 10 ml Nacl 0,9% McFarland III
109
CFU/ml
1ml 1ml
9 ml NaCl 0,9% 9 ml NaCl 0,9% 9 ml NaCl 0,9%
108 107 106
1 ml
Bakteri
56
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 8
Identifikasi Bakteri Uji
Bersihkan dengan
alkohol 70 % Dilewatkan
di atas api
Ditetesi NaCl
steril 0,9 %
Diletakan satu
ose bakteri
ditambahankan
karbol kristal
Bilas
dengan
air
Ditambah
kan lugol
Dicuci dengan
alkohol 96%
Di teteskan
safranin
57
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 9
Uji Aktivitas Antibakteri
10 ml 1 mL
Agar MHA Suspensi bakteri 106
Ekstrak uji di larutkan dalam
pelarutnya masing-masing dengan
konsentrasi 1000 ppm
20 µL larutan uji di serapkan pada
kertas cakram steril. Kontrol positif
digunakan cakram kloramfenikol
Inkubasi selama 18-24 jam,
pada suhu 350 C
A B C D
E F G H
Suspensi digoyangkan perlahan
untuk memperoleh suspensi
bakteri yang tersebar merata,
dan biarkan agar membeku
Kemudiaan amati zona
hambat yang terbentuk dan
diukur dengan jangka
sorong
58
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 10
Daun Kayu jawa dan Isolasi Daun Kayu Jawa
Isolasi endofit Daun Tua (DT) Dilakukan Triplo
Isolasi endofit Daun Muda (DM) Dilakukan Triplo
Isolasi endofit Daun Pucuk (DA) Dilakukan Triplo
59
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 11
Hasil Kultur Kapang Endofit
Kapang Endofit DA2k dari daun pucuk
Kapang Endofit DA2k dari daun pucuk
Kapang Endofit DA3k dari daun Pucuk
Kapang Endofit DA3k dari daun Pucuk
Kapang Endofit DM1k dari daun Muda
Kapang Endofit Dm1k dari daun Muda
Kapang Endofit DM2k dari daun Muda
Kapang Endofit DM2k dari daun Muda
60
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 12
Fermentasi Isolat kapang Endofit
Fermentasi DA2K 21 hari Fermentasi DA3K 21 hari
Fermentasi DM1K 21 hari Fermentasi DM2K 21 hari
61
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 13
Ekstrak Isolat DA2K Kapang Endofit
ISOLAT DA2K
FRAKSI
GAMBAR KETERANGAN
METANOL
-bobot ekstrak : 440 mg -Warna : Kuning pekat -Bau : tidak berbau -konsistensi : kental
N-HEKSAN
-Bobot ekstrak : 120 mg -warna : kuning -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
ETIL ASETAT
-Bobot ekstrak : 210 mg -warna : kuning kecoklatan -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
AIR
-Warna : kuning bening -bau : tidak berbau -konsistensi : cair
62
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 14
Ekstrak Isolat DA3K Kapang Endofit
ISOLAT DA3KE FRAKSI
GAMBAR KETERANGAN
METANOL
-Bobot ekstrak : 330 mg -warna : hitam -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
N-HEKSAN
-Bobot ekstrak : 60 mg -warna : coklat kehitaman -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
ETIL ASETAT
-Bobot ekstrak : 530 mg -warna : hitam -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
AIR
-warna : coklat -bau : tidak berbau -konsistensi : cairan
63
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 15
Ekstrak Isolat DM1K Kapang Endofit
ISOLAT DM1K FRAKSI
GAMBAR KETERANGAN
METANOL
-Bobot ekstrak : 660 mg -warna : coklat muda -bau : berbau khas -konsistensi : kental
N-HEKSAN
-Bobot ekstrak : 138 mg -warna : coklat kemerahan -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
ETIL ASETAT
-Bobot ekstrak : 260 mg -warna : coklat -bau : berbau khas -konsistensi : kental
AIR
-warna : kuning jernih -bau : tidak berbau -konsistensi : cairan
64
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 16
Ekstrak Isolat DM2K Kapang Endofit
ISOLAT DM2K FRAKSI
GAMBAR KETERANGAN
METANOL
-Bobot ekstrak : 210 mg -warna : coklat -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
N-HEKSAN
-Bobot ekstrak : 140 mg -warna : kuning -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
ETIL ASETAT
-Bobot ekstrak : 99 mg -warna : coklat kehitaman -bau : tidak berbau -konsistensi : kental
AIR
-warna : kuning jernih -bau : tidak berbau -konsistensi : cairan
65
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 17. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DA2K daun Kayu
Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococus aureus
Ekstrak metanol Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
66
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 18. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DA2K daun Kayu
Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli dan
Helicobacter pylori
Ekstrak isolat DA2K tidak menunjukan Zona Hambat pada E.coli
Ekstrak isolt DA2K tidak menunjukan Zona Hambat pada H.pylori
67
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 19. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DA2K daun Kayu
Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Pseudomonas aeroginosa
Ekstrak metanol Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
68
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 20. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DA3K daun Kayu
Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus
Ekstrak metanol Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
69
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 21. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DA3K daun Kayu
Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli, Helicobacter
pylori , Pseudomonas aeroginosa
Ekstrak isolat DA3K tidak
menghasilkan zona hambat terhadap
Helicobacter pylori
Ekstrak isolat DA3K tidak
menghasilkan zona hambat terhadap
Escherichia coli
Ekstrak isolat DA3K tidak menghasilkan zona hambat terhadap Pseudomonas
aeroginosa
70
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 22. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM1K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus
Ekstrak metanol Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
71
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 23. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM1K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli
Ekstrak metanol
Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil aetat
Kloramfenikol (+)
Metanol
N-Heksan
E.asetat
72
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 24. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM1K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Helicobacter pylori
Ekstrak metanol Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
73
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 25. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM1K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Pseudomonas aeroginosa
Ekstrak metanol
Kloramfenikol (+)
Ekstrak Etil Asetat
74
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 26. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM2K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus
Ekstrak metanol
Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
75
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 27. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM2K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli
Ekstrak metanol
Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
76
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 28. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM2K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Helicobacter pylori
Ekstrak metanol Ekstrak n-Heksan
Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)
77
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 29. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM2K daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Pseudomonas aeroginosa
Ekstrak metanol
Kloramfenikol (+)
Ekstrak Etil Asetat
78
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 30. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Fraksi air isolat kapang daun
Kayu Jawa (Lannea coromandelica)
Fase air terhadap Staphylococcus aureus Fase air terhadap Pseudomonas aeroginosa
Fase air terhadap Escherichia coli
Fase air terhadap Helicobacter pylori
79
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN 31
Skrining Penapisan Fitokimia Ekstrak Metanol Kapang Endofit DM1K
NO ISOLAT DM1K(METANOL)
HASIL GAMBAR
1 ALKALOID negatif
2 FLAVONOID Positif
3 SAPONIN negatif
4 GLIKOSIDA positif
5 TRITERPENOID negatif
6 FENOL
negatif
7 TANIN negatif