UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... · Sekitar 99% bakteri berada dalam bentuk biofilmnya dan hanya 1 % dalam bentuk

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM IN VITRO MINYAK

ATSIRI HERBA KEMANGI TERHADAP BAKTERI

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, DAN

Staphylococcus aureus

SKRIPSI

MOHAMMAD AL FATTAH

NIM.1111102000053

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

Juni 2015

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM IN VITRO MINYAK

ATSIRI HERBA KEMANGI TERHADAP BAKTERI

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, DAN


SKRIPSI

MOHAMMAD AL FATTAH

NIM.1111102000053

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

Juni 2015

iii

iv

v

vi

ABSTRAK

Penelitian ini dilakukan untuk menguji aktivitas antibiofilm minyak atsiri dari

herba kemangi (Ocimum americanum L.). Minyak atsiri herba kemangi diperoleh

dengan menggunakan metode destilasi uap-air. Metode uji aktivitas antibiofilm

herba kemangi yang digunakan adalah microtitter plate assay. Hasil uji aktivitas

antibiofilm yang dilakukan menunjukkan minyak atsiri dari kemangi mampu

mencegah, menghambat, dan menghancurkan biofilm dari bakteri Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus. Aktivitas terbaik

minyak atsiri kemangi terjadi pada proses penghancuran biofilm Staphylococcus

aureus dengan persentase penghancuran 58,10% pada konsentrasi 0,25% (v/v).

Aktivitas terbaik minyak atsiri kemangi dilakukan optimasi dengan menggunakan

respon surface analysis (RSA). Hasil optimasi RSA menunjukan kondisi

penghancuran biofilm bakteri Staphylococcus aureus dengan perlakuan

konsentrasi 0,25%, suhu 50oC, dan waktu kontak ekstrak dengan biofilm 48

menit. Kondisi aktivitas terbaik minyak atsiri dilakukan uji kembali untuk

dibandingkan dengan kontrol positif (Biorem). Hasil uji menunjukan persentase

penghancuran biofilm dengan minyak atsiri dan Biorem bereturut-turut adalah

65,79% dan 75,59%. Berdasarkan penelitian ini, minyak atsiri herba kemangi

memiliki potensi sebagai antibiofilm.

Kata Kunci : Minyak atsiri herba kemangi (Ocimum americanum L.), antibiofilm,

microtitter plate assay, respon surface analysis (RSA)

Nama : Mohammad Al Fattah ProgramStudi : Farmasi Judul : UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM IN VITRO MINYAK

ATSIRI HERBA KEMANGI TERHADAP BAKTERI Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, DAN Staphylococcus aureus

vii

ABSTRACT

This study was conducted to test the antibiofilm activity of herbs basil essential

oils (Ocimum americanum L.). Herb basil essential oil was obtained by hydro

distillation. Microtitter plate method was used to test antibiofilm activity of herb

basil essential oil. Antibiofilm activity test results have shown that herbs basil

essential oil was able to prevent, inhibit, and destroy biofilm of bacteria

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus. The best

activity of herbs basil essential oil occurred in the process of Staphylococcus

aureus’s biofilm destruction with the 0.25% v/v concentration. The percentage of

Staphylococcus aureus’s biofilm destruction was 58.10%. The best activity of

herbs basil essential oils was optimized by using response surface analysis (RSA).

The result of the RSA optimization at the best condition of Staphylococcus

aureus’s biofilm destruction process was by using 0.25% of herb basil essential

oil at the temperature of 50oC, and using 48 minutes for contacting time of

essential oil with the biofilm. The optimal condition of herbs basil essential oils

was tested to compare the antibiofilm activity with the control positive (Biorem) .

The test results showed the percentage of biofilm destruction of essential oils and

Biorem in a row were 65.79% and 75.59%. Based on this research, herbs basil

essential oil has potential as an antibiofilm.

Key Word : Minyak atsiri herba kemangi (Ocimum americanum L.), antibiofilm,

microtitter plate assay, respon surface analysis (RSA)

Nama : Mohammad Al Fattah Study Program : Pharmacy Title : IN VITRO ANTIBIOFILM ACTIVITY TEST OF

HERB BASIL ESSENTIAL OIL TO BACTERIA Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, AND Staphylococcus aureus

viii

KATA PENGANTAR

Assalamu ‘alaikum warahmatullahi wabarakatuh

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur selalu terpanjatkan atas

kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala atas segala berkah dan kasih sayang-Nya,

sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini.

Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada keharibaan junjungan Nabi

Besar Muhammad SAW, beserta keluarga, sahabat, dan para pengikutnya hingga

hari akhir zaman.

Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibiofilm in Vitro Minyak Atsiri

Herba Kemangi Terhadap Bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

dan Staphylococcus aureus” ini disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat

menempuh ujian akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi pada Program

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis menyadari

begitu banyak bantuan dari berbagai pihak yang telah meluangkan waktunya,

mendidik dan membimbing, memberikan secercah harapan, dan mendoakan yang

terbaik kepada penulis. Maka pada kesempatan ini, penulis menyampaikan

penghargaan setinggi-tingginya dan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya

kepada :

1. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, SKM., M. Kes. selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

2. Bapak Yardi, Ph. D., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Eka Putri, M. Sc., Apt. dan Bapak Novik Nurhidayat, Ph.D sebagai

Pembimbing I dan Pembimbing II yang dengan sabar senantiasa

meluangkan waktu dan pikirannya untuk membimbing dan mendidik

penulis.

ix

4. Bapak dan Ibu Dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang

telah memberikan ilmunya kepada penulis, semoga ilmu yang diberikan

berkah dan menjadi ilmu yang bermanfaat. Aamiin.

5. Ibunda tercinta Hj. Ellya Dewi yang selalu memberikan cinta dan kasih

sayang, semangat, dukungan, doa, dan nasihatnya yang tak akan pernah

mampu penulis membalas itu semua. Penulis hanya bisa berdo’a kepada

Allah yang maha pengasih lagi maha penyayang agar kiranya dengan

segala kebesaran-Nya mengasihi dan melindungi Ibunda tercinta,

melimpahkan rezeki, dan memberikan keselamatan di dunia dan di akhirat

kelak. Aamiin

6. Firda, Resky, dan Rika sebagai teman seperjuangan penelitian biofilm di

LIPI Bogor yang selalu memberikan semangat dan dukungan selama

penelitian hingga penulisan skripsi ini.

7. Adit, Ambar, Ana, Askandari, Elsa, Faradhila, Khaerunisa, Miyadah, dan

Niekha sebagai teman yang seperjuangan yang selalu memberikan

semangat, dukungan, dan kebersamaan selama kuliah di farmasi ini dan

semoga terus berlanjut hingga seterusnya.

8. Teman-teman seperjuangan Farmasi Angkatan 2011 “Effervescence” yang

selalu memberikan warna baru dalam hidup penulis, kebersamaan yang

begitu indah, dan ilmu tentang hidup dan kehidupan yang begitu berharga.

9. Serta semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak

dapat penulis sebutkan satu per satu.

Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas segala

bantuan dan dukungannya kepada penulis. Penulis menyadari bahwa dalam

penulisan skripsi ini masih banyak kelemahan dan kekurangan. Maka dari itu,

dengan segala kerendahan hati penulis sangat mengharapkan kritik dan saran

pembaca agar lebih sempurnanya skripsi ini.

Jakarta, 17 Juni 2015

Penulis

https://en.wikipedia.org/wiki/Effervescence

x

xi

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ............................................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................ iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ v

ABSTRAK ......................................................................................................... vi

ABSTRACT ....................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR ..................................................................................... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ........................................... x

DAFTAR ISI ...................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xvi

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ............................................................................... 1

1.2. Rumusan Masalah .......................................................................... 3

1.3. Tujuan Penelitian ........................................................................... 3

1.5. Manfaat Penelitian ......................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................... 4

2.1. Infeksi ............................................................................................ 4

2.2. Biofilm ........................................................................................... 4

2.2.1. Tahap Perkembangan Biofilm ............................................ 4

2.2.2. Resistensi Biofilm Terhadap Antibiotik ............................. 5

2.3. Kontrol Biofilm .............................................................................. 7

2.4. Kultur Biofilm in Vitro Static Microtiter Plate Assays ................. 8

2.5. Tanaman Kemangi (Ocimum americanum Linn.) ......................... 9

2.5.1. Klasifikasi ........................................................................... 9

2.5.2. Sinonim ............................................................................ 10

2.5.3. Morfologi.......................................................................... 10

2.5.4. Kandungan Kimia............................................................. 10

2.5.5. Khasiat dan Kegunaan ...................................................... 11

xii

2.6. Sitral ............................................................................................. 11

2.7. Destilasi Uap ................................................................................ 12

2.8. Tinjauan Bakteri Uji ................................................................... 12

2.8.1. Escherichia coli ................................................................ 12

2.8.2. Pseudomonas aeruginosa ................................................. 13

2.8.3. Staphylococcus aureus ..................................................... 13

2.9. Gas Chromatography-Mass Spectrophotometer (GC-MS) ......... 14

2.10. Analisis Respon Permukaan (Respon Surface Analysis) .......... 14

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 16

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian ...................................................... 16

3.2. Alat dan Bahan ............................................................................. 16

3.2.1. Alat .................................................................................... 16

3.2.2. Bahan ................................................................................. 16

3.3. Ekstraksi Minya Atsiri ................................................................. 17

3.4. Penetuan Komponen Minyak Atsiri ............................................. 17

3.5. Penyiapan Larutan Uji ................................................................. 18

3.6. Pembuatan Media ......................................................................... 18

3.7. Kultur Escherichia coli ................................................................ 19

3.8. Kultur Pseudomonas aeruginosa ................................................. 20

3.9. Kultur Staphylococcus aureus ..................................................... 20

3.10. Penyiapan Suspensi Bakteri Uji ................................................. 21

3.11. Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri Uji ....................................... 21

3.12. Uji Antibiofilm Minyak Atsiri Herba Kemangi ......................... 21

3.12.1. Uji Aktivitas Pencegahan Biofilm ................................... 21

3.12.2. Uji Aktivitas Penghambatan Biofilm .............................. 22

3.12.3. Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm ............................... 23

3.13. Analisa Data Uji Terseleksi ....................................................... 24

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 25

4.1. Hasil ............................................................................................. 25

4.1.1. Determinasi........................................................................ 25

4.1.2. Hasil Penyiapan Sampel .................................................... 25

4.1.3. Analisis Komponen Kimia dengn GCMS ......................... 25

4.1.4. Hasil Kultur Bakteri .......................................................... 26

4.1.5. Hasil Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri ............................ 28

xiii

4.1.6. Hasil Uji Aktivitas Antibiofilm ......................................... 29

4.1.7. Hasil Uji Pertumbuhan Biofilm Staphylococcus aureus ... 31

4.1.8. Hasil Uji Aktivitas Terseleksi Penghancuran Biofilm ...... 31

4.2. Pembahasan .................................................................................. 33

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 45

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 46

LAMPIRAN ...................................................................................................... 49

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1. Hasil Analisis GCMS Komponen Kimia Minyak Atsiri ................. 26

Tabel 4.2. Kultur Bakteri Escherichia coli ....................................................... 26

Tabel 4.3. Kultur Bakteri Pseudomonas aeruginosa ........................................ 27

Tabel 4.4. Kultur Bakteri Staphylococcus aureus............................................. 27

Tabel 4.5. Uji Kultur Bakteri Staphylococcus aureus ...................................... 28

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Mekanisme Pembentukan Biofilm .................................................... 4

Gambar 2.2. Resistensi Biofilm Terhadap Antibiotik ........................................... 6

Gambar 2.3. Tumbuhan Kemangi .......................................................................... 9

Gambar 2.4. Struktur Kimia Sitral ....................................................................... 11

Gambar 4.1. Grafik Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri ........................................ 29

Gambar 4.2. Aktivitas Antibiofilm Minyak Atsiri Kemangi Terhadap Bakteri

Escherichia coli ............................................................................... 29


Pseudomonas aeruginosa ............................................................... 30


Staphylococcus aureus .................................................................... 30

Gambar 4.5. Densitas Optik Pertumbuhan Biofilm Staphylococcus aureus ...... 31

Gambar 4.6. Contour plot Persentase Penghancuran Biofilm dari Perbandingan

Suhu dengan Konsentrasi. ............................................................... 32

Gambar 4.7. Contour plot Persentasi Penghancuran Biofilm dari Perbandingan

Waktu Kontak dengan Suhu............................................................ 32

Gambar 4.8. Grafik Hasil Uji Aktivitas Terseleksi Minyak Atsiri Kemangi ...... 33

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Alur Kerja ........................................................................................ 49

Lampiran 2. Hasil Determinasi ............................................................................ 53

Lampiran 3. Hasil Destilasi Minyak Atsiri Herba Kemangi ................................ 54

Lampiran 4. Alat dan Bahan ................................................................................ 55

Lampiran 5. Hasil Pembuatan Larutan Uji .......................................................... 57

Lampiran 6. Hasil Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri Uji .................................... 57

Lampiran 7. Hasil Uji Antibiofilm Terhadap Escherichia coli ........................... 58

Lampiran 8. Hasil Uji Antibiofilm Terhadap Pseudomonas aeruginosa ............ 59

Lampiran 9. Hasil Uji Antibiofilm Terhadap Staphylococcus aureus ................. 60

Lampiran 10. Hasil Uji Statistika Aktivitas Pencegahan Biofilm Escherichia

coli…….. ........................................................................................ 61

Lampiran 11. Hasil Uji Statistika Aktivitas Penghambatan Biofilm

Escherichia.coli ............................................................................. 64

Lampiran 12. Hasil Uji Statistika Aktivitas Penghancuran Biofilm

Escherichia.coli ............................................................................. 67

Lampiran 13. Hasil Uji Statistika Aktivitas Pencegahan Biofilm Pseudomonas

aeruginosa ..................................................................................... 69

Lampiran 14. Hasil Uji Statistika Aktivitas Penghambatan Biofilm Pseudomonas

aeruginosa ..................................................................................... 72

Lampiran 15. Hasil Uji Statistika Aktivitas Penghancuran Biofilm Pseudomonas

aeruginosa ..................................................................................... 75

Lampiran 16. Hasil Uji Statistika Aktivitas Pencegahan Biofilm Staphylococcus

aureus…. ........................................................................................ 78

Lampiran 17. Hasil Uji Statistika Aktivitas Penghambatan Biofilm

Staphylococcus aureus .................................................................. 81

Lampiran 18. Hasil Uji Statistika Aktivitas Penghancuran Biofilm Staphylococcus

aureus….. ....................................................................................... 84

Lampiran 19. Hasil Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm Menggunakan Respon

Surfacce Analysis .......................................................................... 87

Lampiran 20. Hasil Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm Staphylococcus aureus

Pada Kondisi Respon Surface Analysis ......................................... 88

Lampiran 21. Hasil Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm Kondisi optimal ......... 90

Lampiran 22. Hasil Uji Statistik Aktivitas Penghancuran Kondisi Optimal Biofilm

Staphylococcus aureus .................................................................. 91

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

Infeksi adalah invasi tubuh oleh mikroorganisme patogen yang

mampu menyebabkan sakit (Potter et al, 2005). Mikroorganisme mampu

berdiferensiasi dan berkembang dengan cara yang kompleks dalam

membentuk morfologi baru yang tumbuh pada permukaan dikenal sebagai

biofilm (O’toole et al, 2000).

Bakteri memiliki dua formasi kehidupan, yaitu fomasi sel planktonik

bebas dan biofilm. Sekitar 99% bakteri berada dalam bentuk biofilmnya dan

hanya 1 % dalam bentuk planktonik. Diperkirakan 65% kasus infeksi

berkaitan dengan biofilm. Penting untuk menangani permasalahan biofilm

karena bakteri biofilm yang tumbuh dapat menyebabkan infeksi kronis yang

resisten terhadap terapi antibiotik dan stressor lainnya (Paraje, 2011).

Indonesia adalah negara megabiodiversity yang kaya akan tumbuhan

obat, dan sangat potensial untuk dikembangkan (Pers, 2010). Salah satu

tanaman obat tradisional yang banyak dimanfaatkan masyarakat Indonesia

adalah kemangi (Ocimum americanum L) (Umar, 2011). Minyak atsiri

merupakan komponen utama pada kemangi (Sarma et al, 2011). Senyawa

minyak atsiri kemangi yang paling utama adalah kamfor, metil sinamat, dan

sitral (Siemonsma, J.S & Piluek, K., 1994, Verma & Kotyal, 2012). Minyak

atsiri kemangi juga mengandung metil kavikol, linalool, eugenol, metil

eugenol, dan limonene (Shadia et al, 2007 & J. Wungsintaweekul et al,

2009).

Strategi yang dapat dilakukan dalam mengatasi permasalah biofilm

adalah dengan menggabungkan agen antimikroba dengan zat yang mampu

merusak lapisan permukaan pertumbuhan bakteri. Permasalahan biofilm

dapat dikendalikan dengan strategi antimikroba secara kimia, fisika, dan

biologi (Cortés et al, 2011). Minyak atsiri herba kemangi dalam hal ini

digunakan sebagai zat kimia yang diharapkan mampu mengatasi

permasalahan bakteri biofilm.

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pada penelitian yang dilakukan oleh Thaweboon & Thaweboon pada

tahun 2009, berkaitan dengan pemanfaatan minyak atsiri kemangi sebagai

antibakteri dan antibiofilm. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa

minyak atsiri kemangi selain mampu menghambat pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, dan pertumbuhan jamur Candida

albicans dalam bentuk planktoniknya, minyak atsiri juga menunjukkan

aktivitas dalam menghambat pertumbuhan bakteri dan jamur tersebut dalam

bentuk biofilmnya. Penelitian uji aktivitas antibakteri dari minyak atsiri

kemangi yang lain dilakukan oleh Wungsintaweekul et al tahun 2009 dan

Parida et al tahun 2014. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan minyak

atsiri kemangi mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Aspergillus flavus,

Bacillus subtilis, Escherichia coli, Mycobacterium phlei, Pseudomonas

aeruginosa, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis dan antijamur terhadap Candida albicans, Candida parapilosis,

Candida tropicalis.

Hasil penelitian uji antibakteri minyak atsiri kemang sebelumnya

menunjukkan adanya aktivitas minyak atsri terhadap bakteri planktonik

Escherchia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.

Namun, seperti yang sudah dikatakan sebelumnya yaitu permasalahan infeksi

lebih banyak disebabkan oleh bakteri dalam formasi biofilm dan ketiga

bakteri tersebut dapat membentuk biofilm sebagai mekanisme pertahanannya

(Bjarnsholt et al, 2011).

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas dan belum

adanya laporan mengenai aktivitas antibiofilm minyak atsiri kemangi

terhadap bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan

Staphylococcus aureus, sehingga dilakukanlah penelitian uji aktivitas

antibiofilm in vitro minyak atsiri herba kemangi terhadap bakteri Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus

3


1.2. Perumusan masalah

Belum adanya informasi mengenai aktivitas antibiofilm minyak atsiri

kemangi terhadap bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan

Staphylococcus aureus.

1.3. Tujuan Penelitian

Mendapatkan data dan informasi dari kemampuan minyak atsiri herba

kemangi dalam mencegah, menghambat dan menghancurkan biofilm bakteri

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

1.4. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi yang

cukup dari pemanfaatan minyak atsiri herba kemangi sebagai antibiofilm

bakteri.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Infeksi

Infeksi merupakan invasi tubuh oleh mikroorganisme patogen yang

mampu menyebabkan sakit (Potter et al, 2005). Infeksi disebabkan

pembiakan mikroorganisme pada jaringan tubuh, terutama yang

menyebabkan cedera selular lokal akibat kompetisi metabolisme, toksin,

replikasi intra selular, atau respon antigen-antibodi (Dorland, 1998).

Mikroorganisme penyebab terjadi infeksi adalah bakteri, virus, jamur

dan protozoa. Mikroorganisme dapat masuk ke tubuh inangnya melalui

saluran pernapasan, saluran pencernaan, kulit dan rongga mulut (Pratiwi,

2008).

2.2. Biofilm

Biofilm merupakan bentuk dari pola hidup multiseluler mikroba dan

didefinisikan sebagai komunitas bakteri yang terorganisir, saling

berkomunikasi dan melekat pada permukaan inert atau hidup.

Mikroorganisme dalam biofilm terdapat di dalam matriks polimer yang

diproduksinya sendiri dengan bahan utamanya eksopolisakarida. Matriks

biofilm tersusun atas polisakarida, protein dan DNA yang berasal dari

mikroba (Paraje, 2011).

2.2.1. Tahap Perkembangan Biofilm

Gambar 2.1. Mekanisme pembentukan biofilm (Ranganathan, 2014)

5


1. Perekatan Bakteri ke Permukaan

Bakteri planktonik bebas menuju suatu permukaan dan

melekat. Penempelan awal ini didasarkan pada daya tarik fisik dan

gaya elektrostatik tetapi belum ada penempelan secara kimia

(Paraje, 2011).

2. Perekatan Bakteri Secara Permanen

Beberapa dari sel reversibel yang teradsorpsi ini mulai

membuat persiapan untuk penempelan yang lebih kuat dengan

membentuk struktur tetap yang kemudian secara permanen

mengikat ke permukaan (Paraje, 2011).

3. Pembentukan Koloni

Sel-sel perintis biofilm akan memproduksi dan membuat

sel anakan yang akan membentuk mikrokoloni di permukaan

beberapa jam kemudian setelah penempelan permanen (Paraje,

2011).

4. Akumulasi Sel Biofilm

Biofilm yang terbentuk akan semakin banyak dan mulai

menghasilkan matriks polimer di sekitar mikrokoloni sebagai

langkah untuk penempelan yang ireversibel (Paraje, 2011).

5. Pelepasan Biofilm

Pada tahap berikutnya biofilm yang sudah matang akan

pecah dan sel-sel bakteri dibebaskan kemudian dapat menyebar ke

lokasi lain untuk membentuk biofilm yang baru (Paraje, 2011).

2.2.2. Resistensi Biofilm Terhadap Antibiotik

Satu aspek terpenting dari pembentukan biofilm bakteri

adalah peningkatan resistensi mikroba terhadap antibiotik dan

stressor lainnya. Sifat struktural dan karakteristik sel biofilm

menghasilkan resistensi terhadap agen antimikroba dan stressor

lainnya yang berkaitan dengan mekanisme perlindungan dan

pertahanan dari kondisi lingkungan yang buruk.

6


Gambar 2.2. Resistensi Biofilm Terhadap Antibiotik (Keller, 2014)

Faktor intrinsik dari resistensi merupakan bagian dari

perkembangan biofilm yang disebabkan dari struktur biofilm dan

sifat fisiologi hasil dari perubahan pola hidup biofilm. Pengaruh

dari beberapa faktor intrinsik biofilm yang berbeda mempengaruhi

resistensi antibiotik telah diidentifikasi. Berikut ini adalah

mekanisme pertahanan yang menyebabkan resistensi :

1. Matriks biofilm dapat bertindak sebagai penghalang difusi

Biofilm sebagai penghalang difusi fisik untuk

mencegah antibiotik mencapai target. Antibiotik mampu

menembus struktur campuran eksopolisakarida, DNA, dan

protein untuk mencapai target tetapi tidak mampu mencapai

konsentrasi efektif disemua bagian (Paraje, 2011).

2. Pembentukan lingkungan mikro dalam biofilm

Menipisnya jumlah nutrisi dan oksigen di dalam biofilm

dapat menyebabkan aktivitas metabolisme diubah dan

menyebabkan perlambatan pertumbuhan bakteri (Paraje, 2011).

3. Diferensiasi menjadi sel persister

Persister sel dianggap tidak tumbuh atau tumbuh

lambat, dan juga memiliki kerentanan yang sangat berkurang

terhadap antibiotik. Dalam teori persister, rute dari subpopulasi

kecil bakteri dalam biofilm berdiferensiasi menjadi sel aktif,

mampu bertahan terhadap pengobatan antibiotik yang ekstrim

karena perubahan genetik yang stabil (Paraje, 2011).

7


4. Peningkatan produksi tekanan oksidatif

Tekanan oksidatif yang disebabkan oleh

ketidakseimbangan antara jumlah oksidan, seperti radikal

bebas, peroksida dan oksida nitrat, dengan antioksidannya.

Gangguan keseimbangan prooksidan-antioksidan menyebabkan

kelebihan produksi senyawa oksigen reaktif (SOR) yang dapat

mengakibatkan kerusakan pada komponen seluler, termasuk

DNA, protein dan lipid. Bakteri akan membentuk senyawan

antioksidan sebagai respon fisiologis terhadap SOR, sehingga

bakteri dapat beradaptasi terhadap tekanan oksidatif yang

menyebabkan perubahan metabolik yang cepat. Enzim utama

yang terlibat dalam system pertahanan antioksidan dan

detoksifikasi SOR adalah superoksida dismutase (SOD) dan

katalase (CAT) (Paraje, 2011).

5. Aksi antagonis antibiotik dan mekanisme degradasi aktif di

beberapa bagian biofilm

Microenvironments dapat melawan aksi dari antibiotik

dengan mekanisme degradasi aktif dibeberapa bagian biofilm.

Bakteri saling berkomunikasi dan mengaktifkan gen-gen

tertentu sehingga menghasilkan enzim atau toksin yang dapat

mendegradasi antibiotik (Paraje, 2011).

2.3. Kontrol Biofilm

Sterilisasi merupakan proses penghilangan semua jenis organisme

hidup yang terdapat pada suatu benda. Proses ini melibatkan aplikasi Biocidal

agent atau proses fisik dengan tujuan untuk membunuh atau menghilangkan

mikroorganisme (Pratiwi, 2008). Strategi yang dilakukan dalam mengkontrol

biofilm dapat dengan menggunakan metode kimia, fisika, dan biologi (Rai,

2013).

a. Fisik ; metode dengan sterilisasi panas merupakan cara yang paling

dipercaya dan banyak digunakan. Sterilisasi panas dibagi dua yaitu

metode panas kering dan panas basah (Pratiwi, 2008).

8


b. Kimia ; metode yang dilakukan dengan menggunakan suatu bahan kimia

yang dapat membunuh atau menghilangkan mikroorganisme. Senyawa

kimia antibiofilm ini dapat menghambat quorum sensing sehingga

mengganggu pertukaran sinyal kimia antara sel-sel dalam sebuah proses

dan dapat merusak matriks biofilm sel-sel bakteri dalam koloni, sehingga

mendegradasi matriks yang menyebabkan pelepasan sel dari koloni dan

pembebasan sel ke lingkungan (Pratiwi, 2008 & Rai, 2013).

c. Biologi (Bakteriofage) ; Strategi dengan memanfaatkan virus tertentu

yang menginfeksi bakteri. Virus akan menghancurkan bakteri dengan

cara masuk ke sel inang dan melekat pada reseptor spesifik pada

permukaan bakteri, termasuk lipopolisakarida, protein, atau bahkan

flagella. Sehingga bakteri akan mati dan terjadinya penurunan biofilm

(Esperanza et al, 2011).

2.4. Kultur Biofilm in Vitro dengan Metode Static Microtiter Plate Assays

Metode ini dirancang untuk mengukur kemampuan mikroba yang dapat

menempel ke permukaan abiotik dalam waktu inkubasi berkisar 1-2 jam

sebagai inisiasi penempelan awal ke permukaan yang sudah dapat dinilai,

sedangkan untuk waktu inkubasi lebih lama dari 20 jam memungkinkan

untuk mengukur pembentukan biofilm (Bjarnsholt et al, 2011).

Keuntungan utama dari metode ini adalah hasil penepelan yang relatif

tinggi, memungkinkan perlindungan untuk bakteri yang kurang sempurna

dalam penempelan atau evaluasi perbedaan efek dari perlakuan atau senyawa

pada penempelan atau pembentukan biofilm. Kekurangan dari metode

mikrotiter adalah sulit dalam mempelajari struktur biofilm atau sifat

resistensi antimikroba. Hal ini disebabkan sulitnya dalam menvisualisasikan

biofilm secara mikroskopis dan dalam membedakan antara sel-sel hidup dan

bahan matriks diwarnai dengan pewarna (Bjarnsholt et al, 2011).

9


2.5. Tumbuhan Kemangi (Ocimum americanum Linn)

(Sumber : Koleksi Pribadi)

Gambar 2.3. Tumbuhan Kemangi (Ocimum americanum L.)

2.5.1. Klasifikasi (Tjitrosoepomo, 2002).

Kingdom : Plantae

Division : Spermatophyta

Sub Division : Angiospermae

Class : Dicotyledonae

Order : Tubiflorae

Family : Lamiaceae

Genus : Ocimum

Species :Ocimum americanum L.

2.5.2. Sinonim

Ocimum americanum L. di kenal dengan hoary basil, wild

basil, dan lemon basil. Indonesia: kemangi, selasih putih. Malaysia:

10


selaseh, kemangi, ruku-ruku. Thailand: Maenglak. (Siemonsma et al,

1994; Pitojo, 1996).

2.5.3. Morfologi

Karakteristik kemangi yaitu perawakan : herba tegak/semak,

tajuk membulat, bercabang banyak, sangat harum, tinggi 0,3 m-1,5 m;

batang : batang pokok tidak jelas, bercabang banyak, hijau, berambut

atau tidak; daun : tunggal, berhadapan, helaian daun bulat elips

memanjang, ujung meruncing-runcing, tangkai daun 0,25-3 cm,

pangkal bangun pasak sampai membulat, dikedua permukaan

berambut halus, berbintik-bintik, tepi daun bergerigi lemah –

bergelombang rata; bunga : susunan majemuk berkarang/tandan,

terminal, 2,5-14 cm, diketiak daun ujung, daun pelindung elip/bulat

telur, panjang 0,5-1 cm; kelopak : berjumlah 5 saling berlekatan

membentuk bibir, 1 membentuk bibir atas, bentuk bulat telur 2-3,5mm,

1 bibir buah membentuk 4 gigi, sisi luar berambut kelenjar, ungu atau

hijau; mahkota : berbibir, 3 bibir atas, 2 bibir bawah, panjang tabung

1,5-2mm, cuping mahkota 3-5mm, putih; benang sari : berjumlah 4,

tersisip di dasar mahkota, ada 2 yang panjang; putik : kepala putik

bercabang dua, tidak sama; buah : kelopak ikut menyusun buah, buah

tegak dan tertekan. (Sudarsono et al, 2002).

2.5.4. Kandungan Kimia

Ocimum americanum L. mengandung senyawa kimia alami

antara lain, minyak atsiri, karbohidrat, alkaloid, senyawa fenolik,

fitosterol, tanin, lignin, pati, saponin, flavonoid, terpenoid dan

antrakuinon. Minyak atsiri merupakan komponen kimia utama pada

Ocimum americanum L (Dhale et al, 2010; Sarma et al, 2011).

Senyawa kimia minyak atsiri yang paling utama pada kemangi adalah

kamfor, metil sinamat, sitral, metil cavikol, linalool, eugenol, metil

eugenol, dan limonene (Siemonsma et al, 1994; Verma et al, 2012;

Shadia et al, 2007; J. Wungsintaweekul et al, 2009).

11


2.5.5. Khasiat dan Kegunaan

Hasil penelitian yang telah ada menyebutkan bahwa minyak

atsiri dari kemangi memiliki efek antibakteri, antituberkolosis,

antijamur, dan antibiofilm (Sabra et al, 2007; Ntezurubanza et al,1986 ;

Thaweboon, 2009).

2.6. Sitral

Gambar 2.4. Struktur Kimia Sitral (Hamdard, 2007)

Sitral adalah salah satu komponen minyak atsiri yang banyak

ditemukan dalam berbagai tanaman aromatik dan memiliki bau lemon yang

khas. Sitral atau 3,7-dimetil-2,6 octadienal merupakan campuran dari dua

monoterpen asiklik yaitu geranial (trans-sitral atau sitral A) dan neral (cis-

sitral atau sitral B) dengan rumus molekul C10H16O (Chaimovitsh et al, 2010

& Shahzadi et al, 2014).

Sitral telah diketahui memiliki aktivitas sebagai antijamur, antibakteri,

dan insektisida. Sitral disebutkan juga merupakan senyawa alelopati aktif

(Chaimovitsh et al, 2010).

Sejumlah turunan monoterpene sendiri menunujukkan kemampuan

yang efektif sebagai kemoprevensi dan kemoterapi kanker pada tingkat sel

hewan uji maupun dalam uji klinis pada manusia. Senyawa terpen tak jenuh

mampu mengikat spesies oksigen aktif in vivo untuk memberikan epoksida

intermediet yang dapat mengalkilasi DNA, protein, dan bimolekular lainnya

(Assidqi, 2012).

12


2.7. Destilasi uap

Distilasi uap merupakan suatu metode untuk isolasi minyak atsiri dari

bahan tanaman. Bahan tanaman ditempatkan dalam alembik untuk diekstraksi

dengan uap-air tanpa menggunakan maserasi dalam air. Uap air dikeluarkan

melewati tanaman dari bagian dasar alembik lalu menuju ke atas. Uap yang

bercampur dengan minyak atsiri mengalir melalui saluran kolom dan

kemudian dikondensasikan sebelum didekantasi dan dikumpulkan dalam

suatu tabung. Minyak atsiri yang massa jenisnya lebih ringan daripada air

akan membentuk dua fase yang tidak bercampur yang dapat dengan mudah

dipisahkan. Prinsip dari teknik ini adalah menggabungkan kesetaraan tekanan

uap dengan dengan tekanan lingkungan di sekitar 100°C sehingga komponen

volatil dengan titik didih mulai dari 150-300°C dapat menguap pada suhu

yang mendekati titik didih air (Y. Li et al, 2014).

2.8. Tinjauan Bakteri Uji

2.8.1. Escherichia coli

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Species : Escherichia coli (Todar, 2008)

Escherichia coli adalah bakteri batang Gram negatif fermentatif

dengan panjang 0,4–0,7 μm, lebar 1–3 μm, dan dapat berupa satu

individu maupun berpasangan (Gyles et al. 2010; Songer dan Post

2005). Bakteri ini dapat menyebabkan diare enterik/hemoragik, infeksi

saluran kemih (ISK) dan sepsis/meningitis (Kaper, 2004).

13


2.8.2. Pseudomonas aeruginosa

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Proteobacteria

Ordo : Pseudomonadales

Family : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Species : Pseudomonas aeruginosa (Holt et al, 1994)

Bakteri berbentuk batang, berukuran 0,6-2 μm, bergerak aktif

dengan flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub), tidak berspora,

tidak mempunyai selubung, dan bersifat Gram negatif. Bakteri ini

dapat menyebabkan infeksi pada luka, meningitis, dan infeksi saluran

air kemih (ISK) akibat pemakaian kateter dan alat-alat medis yang

ditumbuhi biofilm bakteri (Jawetz, et al, 1996).

2.8.3. Staphylococcus aureus

Domain : Bacteria

Kingdom : Eubacteria

Phylum : Firmicutes

Class : Bacilli

Order : Bacillales

Family : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Species : Stapylococcus aureus (Rosenbach, 1884)

Staphylococcus aureus adalah bakteri berbentuk bulat, bersifat Gram

positif, biasanya tersusun dalam rangkaian tidak beraturan seperti buah

anggur (Jawetz, 2005). Bakteri ini ditemukan secara alami pada kulit

dan dalam nasofaring dari tubuh manusia. Bakteri ini dapat

menyebabkan infeksi lokal pada kulit, hidung, uretra, vagina dan

saluran pencernaan (Haris, 2002).

14


2.9. Gas Chromatography-Mass Spectrophotometer (GC-MS)

Kromatografi gas merupakan salah satu metode pemisahan yang

berdasarkan partisi cuplikan antara fase gerak yang berupa gas pembawa

dan fase diam yang menahan cuplikan secara selektif (Sastrohamidjojo

dan Pranowo, 1985). Metode spektrometri massa didasarkan pada

pengubahan molekul netral menjadi ion-ion bermuatan positif dan

memisahkannya berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan

elektron (m/e) (Hendayana, 1994).

Pemisahan komponen senyawa dengan menggunakan GC

(Chromatography Gas) terjadi di dalam kolom dengan melibatkan dua

fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam adalah zat di dalam kolom

sedangkan fase gerak adalah gas pembawa (Helium atau Hidrogen). GC

(Chromatography Gas) adalah teknik pemisahan dimana larutan yang

mudah menguap dan stabil terhadap pemanasan akan bermigrasi melalui

kolom yang merupakan fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung

pada rasio distribusinya. Pada umumnya larutan akan terelusi berdasarkan

pada peningkatan titik didihnya (kecuali jika terjadi interaksi khusus

antara solut dengan fase diam). Pemisahan pada kromatografi gas

didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua

interaksi yang mungkin terjadi antara larutan dengan fase diam. Fase gerak

yang berupa gas akan mengelusi larutan dari ujung kolom yang akan

dihantarkan ke detektor. Penggunaan suhu yang meningkat bertujuan

untuk menjamin bahwa larutan akan menguap dan akan cepat terelusi,

suhu yang digunakan 50-350⁰C (Sudjadi, 2007).

2.10. Analisis Respon Permukaan (Respon Surface Analysis)

Optimasi adalah sebuah proses yang bertujuan untuk mendapatkan

kondisi dari suatu penerapan prosedur untuk menghasilkan respon terbaik.

Optimasi mengacu pada peningkatkan kinerja sistem, proses, atau produk

hasil yang maksimal (Bezerra et al. 2008).

Metodologi respon permukaan adalah kumpulan teknik matematika

dan statistik yang didasarkan pada kecocokan dari model empiris dengan

15


data eksperimen yang diperoleh dalam kaitannya dengan desain

eksperimental. Desain eksperimental adalah seperangkat spesifik

eksperimen ditentukan oleh matriks penyusunnya dengan kombinasi

tingkat yang berbeda dari variabel yang diteliti (Bezerra et al. 2008).

Tahap penerapan RSM sebagai teknik optimasi yaitu

Pemilihan variabel independen yang menghasilkan efek paling utama

pada wilayah eksperimental, sesuai dengan tujuan penelitian.

Pemilihan desain eksperimental dan melaksanakan eksperimen sesuai

dengan matriks eksperimental yang dipilih.

Pengolahan secara matematika dan statistik dari data eksperimen yang

diperoleh dicocokan ke fungsi polinomial.

Evaluasi kecocokan model.

Verifikasi dari kebutuhan dan kemungkinan untuk melakukan

perubahan data ke wilayah yang optimal.

Memperoleh nilai optimum untuk masing-masing variabel (Bezerra et

al, 2008).


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari Maret sampai dengan Mei 2015 di

Laboratorium Genetika, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga

Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Peralatan gelas, jarum ose, kapas, kain kasa, kertas saring, spatula,

mikropipet, bunsen, pinset, alumunium foil, plastik wrap, neraca analitik,

autoklaf, oven, inkubator, microwave, Laminar Air flow (LAF), lemari

pendingin, vial, vortex, microtiterplate flat-bottom polystyrene 96 wells,

iMark Bio-Rad microplate reader.

3.2.2. Bahan

1) Tanaman

Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah

herba kemangi (Ocimum americanum L.) yang didapat di

Kampung Grogol. Kemangi dipanen pada umur 3 bulan dengan

kondisi tanah gembur, tanpa pestisida, dan pengairan dilakukan

menggunakan air hujan dan air kali di dekat kebun. Tanaman ini

telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense, LIPI, Cibinong,

Bogor.

2) Bahan Uji

Aquadest, DMSO (Dimethy Sulfoxide), Heterotrof Agar

(HTR Agar), Heterotrof Cair (HTR Cair), Eosin Methyl Blue

Agar (EMB), Pseudomonas Isolation Agar (PIA), Etanol 70%,

Etanol 96%, Kristal violet 1%.

17


3) Bakteri Uji

Escherichia coli DM6101 dan Pseudomonas aeruginosa

PMG203 didapatkan dari koleksi laboratorium mikrobiologi

kesehatan LIPI Cibinong dan Staphylococcus aureus didapatkan

dari hasil isolasi dari kulit manusia yang dilakukan di

laboratorium mikrobiologi kesehatan LIPI Cibinong, Bogor.

3.3. Ekstraksi Minyak Atsiri

Herba kemangi (batang, daun, dan bunga tanpa akar) diambil dalam

keadaan segar kemudian ditimbang sebanyak 25 kg. Herba kemangi

selanjutnya dicuci bersih untuk menghilangkan kotoran dan bahan asing yang

menempel. Herba kemangi yang sudah dicuci bersih lalu dirajang dan

dikeringkan dalam suhu ruangan tanpa terkena sinar matahari langsung

selama 48 jam untuk mengurangi kadar airnya. Proses selanjutnya adalah

destilasi minyak atsiri dengan menggunakan metode destilasi uap air.

Destilasi minyak atsiri dilakukan selama 4 jam. Minyak atsiri yang telah

didapatkan dibebas-airkan dengan penambahan natrium sulfat (Na2SO4)

anhidrat untuk menghilangkan kadar airnya. Minyak atsiri yang masa

jenisnya berbeda dengan air sehingga akan membentuk dua fase yang tidak

bercampur dapat dipisahkan (Parida et al, 2014). Minyak atsiri yang

dihasilkan dihitung nilai rendemennya berdasarkan perbandingan volume

minyak yang dihasilkan dari penyulingan dengan bobot sampel.

3.4. Penentuan Komponen Minyak Atsiri

Komponen kimia penyusun minyak atsiri dianalisa dengan

menggunakan kromatografi gas-spektroskopi massa (GC-MS, Agilent

19091S-433), kolom (30m x 250 m x 0,25 mm), gas pembawanya adalah

Helium dengan kecepatan aliran gas 0.5 mL/menit dan tekanan kolom 1,1

psi. Suhu kolom diprogram dari 50⁰C sampai 250⁰C dengan 2 tahap

kenaikan. Volume injeksi yang digunakan 1µL dengan metode split (1:20).

Pada tahap awal suhu kolom dibuat konstan 50⁰C selama 5 menit, lalu

dinaikkan sampai 80⁰C dengan kecepatan kenaikan 2⁰C/menit. Pada 80⁰C

18


suhu dipertahankan selama 1 menit dan selanjutnya dinaikkan menjadi 250⁰C

dengan kecepatan 4⁰C/menit. Kondisi pada suhu 250⁰C ini dipertahankan

selama 4,5 menit. Suhu injektor selama analisis berlangsung diprogram

konstan pada suhu 225⁰C, sedangkan suhu detektor (Elektron Impact) dibuat

konstan pada suhu 250⁰C. Proses analisa ini memakan waktu 68 menit.

Spektrum massa masing-masing puncak senyawa hasil kromatogram GC-MS

selanjutnya dibandingkan dengan spektrum massa autentik yang ada pada

bank NIST (National Institute of Standard Technology) library (Sulianti, Sri

Budi., 2008).

3.5. Penyiapan Larutan Uji

Minyak atsiri diencerkan dengan DMSO 9,8% steril. Serial

konsentrasi minyak atsiri yang dibuat adalah 0,25%, 0,5%, 0,75%, dan 1%.

Campuran minyak atsiri dengan DMSO di vortex selama 5 menit untuk

mencampurkannya.

3.6. Pembuatan Media

1) Heterotrof Agar (HTR Agar)

Media Heterotrof Agar dibuat dengan melarutkan 15 g Bacto

Agar, Pepton 15 g, Tripton, 3 g, NaCl 5 g, dan K2HPO4 2,5 g dalam 1 L

aquadest dengan cara dipanaskan menggunakan microwave dan

dihomogenkan dengan sesekali digoyangkan.

Larutan media disterilisasi dengan autoclave pada 121ºC, 15

menit. Media ini digunakan sebagai media peremajaan Escherichia coli

dan Pseudomonas aeruginosa.

2) Heterotrof Cair (HTR Cair)

Media Heterotrof cair dibuat dengan melarutkan Pepton 15 g,

Tripton, 3 g, NaCl 5 g, K2HPO4 2,5 g, dan Glukosa 2.5 g dalam 1 L

aquadest dengan cara dipanaskan menggunakan microwave dan


19



menit. Media ini digunakan sebagai media untuk menumbuhkan biofilm

bakteri uji.

3) Eosin methyl Blue Agar (EMB Agar)

Media Eosin methyl Blue Agar (EMB Agar) dibuat dengan

melarutkan media EMB Agar 24 g dalam 1 L aquades dengan cara

dipanaskan menggunakan microwave dan dihomogenkan dengan sesekali

digoyangkan.


menit. Media ini digunakan sebagai media differensiasi untuk

Escherichia coli.

4) Luria Bertani Agar (LB)

Media LB dibuat dengan melarutkan melarutkan Bacto Agar 2,25

g, Yeast ekstrak 0,75 g, Tripton, 1,5 g, dan NaCl 0,75 g dalam dalam 150

ml aquadest. dengan cara dipanaskan menggunakan microwave dan


Larutan disterilisasi dengan autoclave pada 121ºC, 15 menit.

Media ini digunakan sebagai peremajaan Staphylococcus aureus.

5) Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

Media Pseudomonas Isolation Agar (PIA) dibuat dengan

melarutkan media PIA 4,5 g dan Bacto Agar dalam 1 L aquadest dengan

cara dipanaskan menggunakan microwave dan dihomogenkan dengan

sesekali digoyangkan.

Larutan disterilisasi dengan autoclave pada 121ºC, 15 menit.

Media ini digunakan sebagai selektif untuk Pseudomonas aeruginosa.

3.7. Kultur Escherichia coli

Escherichia coli diinokulasi pada media Eosin Metyl Blue Agar

dengan metode streak dan diinkubasi selama 24 Jam pada suhu 37o C. Bakteri

hasil inokulasi selanjutnya diberikan pewarnaan Gram untuk melihat bentuk

mikroskopisnya.

20


3.8. Kultur Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media PIA dengan

metode streak dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Bakteri hasil

inokulasi selanjutnya diberikan pewarnaan Gram untuk melihat bentuk

mikroskopisnya.

3.9. Kultur Staphylococcus aureus

a) Isolasi Bakteri

Permukaan kulit digoreskan dengan menggunakan ose, kemudian

ose tersebut digoreskan ke media Brain Heart Infusion (BHI). Inkubasi

media BHI selama 24 jam pada suhu 37oC. Bakteri hasil inokulasi

selanjutnya diberikan pewarnaan Gram. Bakteri yang memiliki

karakteristik Gram positif dan berbentuk Staphylococcus dikarakterisasi

menggunakan H2O2 3%, media pelarut fosfat, media Klingler Iron Agar

(KIA), dan susu skim 20%.

b) Karakterisasi dengan Penambahan H2O2 3%

Satu ose bakteri uji digoreskan pada kaca objek, selanjutnya

ditambahkan satu tetes H2O2 3%.

c) Karakterisasi Bakteri dengan Media Pelarut Fosfat

Media Brain Heart Infusion ditambahkan Ca3(PO4)2 dan NaCl

sebagai media selektif untuk Staphylococcus aureus. Media dimasukkan

ke dalam cawan petri dan tunggu hingga mengeras. Satu ose bakteri

diambil dengan menggunakan ose berbentuk jarum lalu ose tersebut

ditusukkan ke media fosfat yang sudah mengeras. Inkubasi media selama

24 jam pada suhu 370C.

d) Karakterisasi Bakteri dengan Media Klingler Iron Agar (KIA)

Media KIA dibuat dalam tabung reaksi dengan posisi tegak. Satu

ose bakteri diambil dengan menggunakan ose berbentuk jarum lalu ose

tersebut ditusukkan ke dalam media.

21


e) Karakterisasi Bakteri dengan Susu Skim 20%

Susu skim dibuat dengan konsentrasi 20%, setelah itu susu

disterilisasi dengan cara pasteurisasi selama 30 menit pada suhu 90oC.

Sebanyak 2 ose kultur bakteri disuspensikan dalam 1 mL aquadest dalam

tabung appendorf dan divortex untuk menghomogenkannya. Susu hasil

pasteurisasi sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan 500 µL kultur bakteri uji. Inkubasi selama 24 jam pada suhu

37oC.

3.10. Penyiapan Suspensi Bakteri

Bakteri uji diremajakan pada media padat dan diinkubasi selama 24

jam pada suhu 37oC. Hasil inokulan diambil sebanyak satu ose lalu

dimasukkan ke dalam media heterotrof cair dan diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 37oC. Susepensi bakteri diukur dengan menggunakan

spektrofotometer dengan densitas optik 600nm (Bjarnsholt et al, 2011).

3.11. Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri Uji

Suspensi bakteri sebanyak 200 µL dimasukkan ke dalam mikroplat.

Mikroplat ditutup dan diinkubasi pada 37oC dengan waktu 24, 48, 72, dan 96

jam. Setelah diinkubasi, isi mikroplat dikeluarkan dan dicuci dengan air.

Mikroplat selanjutnya diberikan pewarna dengan cara dimasukkan 200 µL

larutan kristal violet 1% dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang.

Pewarna dicuci dengan air dan dibiarkan kering pada suhu ruang. Setelah

mikroplat kering, sebanyak 200 µL Etanol 96% dimasukkan ke dalam

mikroplat dan inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Mikroplat

selanjutnya diukur menggunakan microplate reader pada densitas optik

595nm (Bjarnsholt et al, 2011).

3.12. Uji Aktivitas Antibiofilm Minyak Atsiri Herba Kemangi

3.12.1. Uji Aktivitas Pencegahan Penempelan Biofilm

Sebanyak 200 µL seri konsentrasi minyak atsri yang sudah

dibuat sebelumnya dimasukkan ke dalam mikroplat, selanjutnya

22


mikroplat ditutup dan diinkubasi pada suhu 27ºC selama 1 jam.

Setelah diinkubasi, seluruh isi mikroplat dikeluarkan dan dimasukkan

200 µL suspensi bakteri ke dalam mikroplat yang tadi lalu mikroplat

ditutup dan diinkubasi pada suhu 37oC dengan waktu 24, 48, 72, dan

96 jam (Bjarnsholt et al, 2011). Mikroplat yang sudah diinkubasi

dikeluarkan isinya dan dicuci dengan air. Mikroplat diberikan

pewarna dengan cara dimasukkan sebanyak 200 µL larutan kristal

violet 1% dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Pewarna

selanjutnya dicuci dengan air bersih dan dibiarkan kering pada suhu

ruang. Setelah mikroplat kering, sebanyak 200 µL etanol 96%

dimasukkan kedalam mikroplat dan diinkubasi selama 15 menit pada

suhu ruang. Setelah itu mikroplat diukur pada densitas optik 595nm

menggunakan microplate reader (Bjarnsholt et al, 2011). Pengujian

dilakukan triplo dan persentase penghambatan biofilm dihitung

dengan menggunakan rumus berikut (Nikolić et al. 2014):

*Ket : DO (Densitas Optik)

3.12.2. Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm

Suspensi bakteri dicampurkan dengan minyak atsiri.

Konsentrasi suspensi bakteri-minyak atsiri dibuat menjadi 0,25%,

0,5%, 0,75%, dan 1% dan suspensi bakteri saja sebagai kontrol

negatif. Sebanyak 200 µL suspensi uji dan suspensi bakteri

dimasukkan ke dalam mikroplat, mikroplat ditutup dan diinkubasi

pada 37o C dengan waktu waktu 24, 48, 72, dan 96 jam. Setelah

diinkubasi, isi mikroplat dikeluarkan dan dicuci dengan air. Mikroplat

diberikan pewarna dengan cara dimasukkan 200 µL larutan kristal

violet 1% dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Pewarna

selanjutnya dicuci dengan air bersih dan dibiarkan kering pada suhu

ruang. Setelah mikroplat kering, sebanyak 200 µL etanol 96%

dimasukkan ke dalam mikroplat dan diinkubasi selama 15 menit pada

23


suhu ruang. Mikroplat diukur menggunakan microplate reader pada

densitas optik 595nm (Bjarnsholt et al, 2011). Pengujian dilakukan

triplo dan persentase penghambatan biofilm dihitung dengan

menggunakan rumus berikut (Nikolić et al. 2014):


3.12.3. Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm

Suspensi bakteri sebanyak 200 µL dimasukkan ke dalam

mikroplat, mikroplat ditutup, dan diinkubasi pada 37oC dengan waktu

24, 48, 72, dan 96 jam. Mikroplat yang sudah diinkubasi dikeluarkan

isinya lalu sebanyak 200 µL seri konsentrasi minyak atsiri

dimasukkan ke dalam mikroplat, kontrol negatif diisikan DMSO 9.8%

dan kontrol positif diisikan dengan Biorem, mikroplat ditutup dan

diinkubasi pada suhu dan waktu yang sudah ditentukan. Setelah

diinkubasi, isi mikroplat dikeluarkan, dicuci dengan air, dan mikroplat

diberikan pewarna. Pewarnaan dilakukan dengan cara dimasukkan

sebanyak 200 µL larutan kristal violet 1% dan diinkubasi selama 15

menit pada suhu ruang. Pewarna dicuci dengan air bersih dan

dibiarkan kering pada suhu ruang. Setelah mikroplat kering,

dimasukkan sebanyak 200 µL etanol 96% kedalam mikroplat dan

diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Setelah itu mikroplat

diukur pada densitas optik 595nm menggunakan microplate reader

(Bjarnsholt et al, 2011). Pengujian dilakukan triplo dan persentase

penghambatan biofilm dihitung dengan menggunakan rumus berikut

(Nikolić et al. 2014):


24


3.13. Analisa Data Uji Terseleksi

Metode analisis respon permukaan digunakan untuk membuat

kerangka uji dan mengolah data hasil uji terseleksi, Selanjutnya akan

didapatkan konsentrasi, waktu dan suhu optimal dari minyak atsiri herba

kemangi untuk diuji dan dibandingkan dengan kontrol positif (Bezerra et al,

2008).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

4.1.1. Determinasi

Hasil determinasi sampel tumbuhan dari Herbarium Bogoriense

LIPI bogor pada tanggal 29 Desember 2014 membuktikan bahwa

sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar jenis

Ocimum americanum L., suku Lamiaceae, Kemangi. (lampiran 2)

4.1.2. Hasil Penyiapan Sampel

Herba kemangi basah dengan bobot 25 kg yang sudah

dikeringkan lalu ditimbang dan didapatkan berat kering sebanyak 20

kg. Herba kemangi selanjutnya dilakukan proses destilasi. Minyak

atsiri yang didapat dari hasil destilasi 20 kg herba kemangi adalah 35

mL. Rendemen minyak atsiri kemangi yang didapatkan yaitu 0,18 %

v/b (lampiran 3).

4.1.3. Analisis Komponen Kimia Minyak Atsiri Kemangi dengan GCMS

Gambar 4.1. Spectrum GCMS Minyak Atsiri Kemangi

26


Tabel 4.1. Hasil Analisis GCMS Komponen Kimia Minyak Atsiri

NO Waktu

Retensi

Area

(%) Komponen

Kualitas Kesamaan

Senyawa

1 23,620 2,644 linalool 93

2 26,673 0,727 Citronellal 91

3 30,314 4,587 cis-Geraniol 93

4 30,939 31,737 β-Sitral 97

5 31,453 1,863 (Z)-Nerol 91

6 32,220 43,940 Sitral 96

7 36,158 0,185 Copaene 97

8 36,370 0,369 Geranyl Acetat 90

9 37,711 1,476 Caryophyllene 99

10 38,211 1,165 Trans-,alpha,-Bergamotene 91

11 38,857 0,398 Humulene 99

12 40,565 0,161 beta-Bisabolene 98

13 41,618 3,300 Cis-alpha-Bisabolene 90

4.1.4. Hasil Isolasi dan Karakterisasi Bakteri

Tabel 4.2. Kultur Bakteri Escherichia coli

Koloni Pertumbuhan Penampakan Mikroskopis

Perbesaran 100x

Koloni hitam dengan pinggiran

berwarna emas metalik pada EMB

Gram negatif, batang pendek sedikit

oval, susunan tidak teratur

27


Tabel 4.3. Kultur Bakteri Pseudomonas aeruginosa

Koloni Pertumbuhan Penampakan Mikroskopis

Perbesaran 100x

Koloni tumbuh pada media PIA

menghasilkan warna kehijauan

Gram negatif, batang pendek, warna

kemerahan

Tabel 4.5. Kultur Bakteri Staphylococcus aureus murni

Koloni Pertumbuhan Bakteri Uji

S.aureus no 6

Penampakan Mikroskopis

Perbesaran 100x

Koloni padat, bulat, halus, dan

berwarna putih kekuningan

Gram positif, warna ungu kemerahan,

berkelompok tidak teratur

28


Tabel 4.4. Uji Kultur Bakteri Staphylococcus aureus

Uji H2O2 3% Uji pada Media Pelarut Fosfat

Menghasilkan gelembung yang banyak

pada kaca objek no 6 Melarutkan fosfat paling banyak

Uji pada Media KIA (Kingler Iron

Agar) Koagulasi Susu Skim 20%

Terdapat warna kehitaman di titik

tempat penusukan tabung no 6

Penggumpalan dan pengendapan

sempurna dari susu pada tabung no 6

4.1.5. Hasil Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri

Pertumbuhan biofilm bakteri uji yang diinkubasi pada suhu

37oC selama 72 jam dapat dilihat pada grafik di bawah. Densitas optik

suspensi bakteri uji yang digunakan 0,2.

29


Gambar 4.1. Grafik Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri Uji

(OD595nm)

4.1.6. Hasil Uji Aktivitas Antibiofilm Minyak Atsiri Herba Kemangi

Uji aktivitas antibiofilm minyak atsiri terhadap biofilm

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus

aureus. Grafik persentase hasil uji aktivitas antibiofilm minyak atsiri

dapat diliat pada gambar dibawah.

Gambar 4.2. Aktivitas Antibiofilm Minyak Atsiri Terhadap Bakteri

Escherichia coli

0.324

0.467

0.829

De

nsi

tas

Op

tik

Bio

film

(O

D59

5)

Pencegahan Penghambatan Penghancuran

1.00% 40.68 41.28 14.64

0.75% 27.66 36.87 22.68

0.50% 20.24 35.47 23.92

0.25% 13.63 34.07 21.92

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

PER

SEN

TASE

AK

TIV

ITA

S A

NTI

BIO

FILM

30



Pseudomonas aeruginosa




1.00% 34.89 36.69 15.14

0.75% 34.74 41.59 34.4

0.50% 34.14 42.94 41.13

0.25% 20.54 40.47 42.66

0

10

20

30

40

50

60

PER

SEN

TASE

AK

TIV

ITA

S A

NTI

BIO

FILM


1.00% 16.41 41.53 46.41

0.75% 28.75 51.95 53.67

0.50% 34.64 53.69 54.11

0.25% 43.06 54.41 58.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

PER

SEN

TASE

AK

TIV

ITA

S A

NTI

BIO

FILM

31


4.1.7. Hasil Uji Pertumbuhan Biofilm Staphylococcus aureus

Uji pertumbuhan biofilm Staphylococcus aureus dilakukan

berdasarkan perbedaan waktu pertumbuhan. Densitas optik bakteri

yang digunakan sebagai inisiasi untuk penumbuhan biofilm adalah

0,5 (DO = 0,5) dan suhu inkubasi bakteri adalah 37 oC.

Gambar 4.5. Densitas Optik Pertumbuhan Biofilm

Staphylococcus aureus (OD595nm)

4.1.8. Hasil Uji Aktivitas Terseleksi Penghancuran Biofilm


Uji aktivitas terseleksi penghancuran biofilm Staphylococcus

aureus dibuat berdasarkan perbandingan konsentrasi dengan suhu,

konsentrasi dengan waktu kontak, dan waktu kontak dengan suhu.

Konsentrasi yang dibuat 0,25%, 0,625%, dan 1%. Suhu yang

digunakan 250C, 37

0C, dan 50

0C. Waktu kontak ekstrak dengan

biofilm yang dilakukan adalah 30 menit, 60 menit, dan 90 menit.

Hasil contour plot respon surface dapat dilihat pada gambar 4.6 dan

4.7.

0.30

0.87

0.75

0.46

De

nsi

tas

Op

tik

Bio

film

(D

O59

5)

Waktu inkubasi (jam)

32


Gambar 4.6. Contour plot Persentase Penghancuran Biofilm dari

Perbandingan Suhu dengan Konsentrasi

Gambar 4.7. Contour plot Persentase Penghancuran Biofilm dari

Perbandingan Waktu Kontak dengan Suhu

Contour plot di atas menunjukkan aktivitas penghancuran biofilm

Staphylococcus aureus berdasarkan perbandingan pengaruh

konsentrasi dengan suhu dan waktu kontak dengan suhu. Hasil

pengolahan data dengan menggunakan respon surface analysis

bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi, suhu, dan waktu kontak

terbaik untuk penghancuran biofilm Staphylococcus aureus. Saat data

kondisi optimal untuk penghancuran biofilm sudah didapatkan, maka

selanjutnya dilakukan kembali uji pada kondisi optimal penghancuran

biofilm untuk dibandingkan dengan Biorem sebagai kontrol positif

penghancuran biofilm.

33


Hasil uji aktivitas optimal minyak atsiri kemangi yang

dibandingkan dengan kontrol positif yaitu Biorem dan kontrol

pelarut minyak atsiri dengan DMSO 9,8%.

Gambar 4.8. Grafik Hasil Uji Aktivitas Terseleksi Minyak

Atsiri Kemangi

4.2. Pembahasan

Salah satu tanaman obat tradisional yang banyak dimanfaatkan

masyarakat Indonesia adalah Ocimum americanum atau yang lebih dikenal

dengan kemangi (Umar, 2011).

Hasil penelitian yang dilakukan oleh Thaweboon & Thaweboon tahun

2009, menunjukkan bahwa minyak atsiri kemangi memiliki aktivitas

antimikroba yang juga mampu dalam menghancurkan biofilm dari bakteri

Streptococcus mutans di mulut. Hasil penelitian lain yang telah ada juga

menyebutkan bahwa minyak atsiri dari kemangi memiliki efek antibakteri,

antituberkolosis, dan antijamur (Sabra et al, 2007; Ntezurubanza et al,1986;

Wungsintaweekul et al, 2009; Parida et al, 2014).

Bahan utama yang digunakan pada penelitian adalah minyak atsiri

dari herba kemangi (Ocimum americanum L.), dan telah di determinasi di

Herbarium Bogoriense Pusat Penelitian Botani, Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI), Bogor.

Minyak atsiri herba kemangi didapat dengan cara destilasi uap-air

dengan menggunakan destilasi uap-air yang prosesnya dilakukan selama 4

Ekstrak 0.25% DMSO 9.8% Biorem 0.25%

Series1 65.88 2.74 75.59

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Per

sen

tase

Akt

ivit

as P

engh

ancu

ran

Perlakuan Uji

34


jam. Metode destilasi uap dipilih karena merupakan salah satu metode yang

sudah lama disetujui dan resmi untuk isolasi minyak atsiri dari bahan tanaman

(Y. Li et al, 2014). Metode ini juga sudah dilakukan oleh Parida et al tahun

2014 untuk mengekstraksi minyak atsiri dari daun kemangi. Hasil rendemen

minyak atsiri kemangi yang didapat pada penelitian Parida et al adalah 0.2%

v/b sedangkan penelitian yang saat ini dilakukan menghasilkan rendemen

yang lebih rendah yaitu 0,18 % v/b. Perbedaan dapat disebabkan oleh faktor

lingkungan yaitu suhu udara dan tanah, intensitas cahaya dan kondisi

kelembaban. Sintesis metabolit sekunder sangat berkaitan dengan jumlah

cahaya yang dapat diterima oleh tumbuhan. Namun, faktor lingkungan

sepertinya yang paling berpengaruh pada akumulasi total minyak atsiri

(Shadia et al. 2007).

Minyak atsiri yang didapat selanjutnya dianalisis komponen kimianya

dengan menggunakan GCMS (Gas Chromatography-Mass

Spectrophotometer). Tujuannya adalah untuk mengetahui komponen-

komponen kimia yang terdapat didalam minyak atsiri. Hasil analisis kimia

minyak atsiri menunjukkan terdapat 13 komponen senyawa didalamnya.

Senyawa yang paling dominan diantaranya Sitral (43,94%) dan β-Sitral (

31,737%). Hasil jumlah komponen kimia yang didapat lebih rendah

dibandingkan jumlah komponen minyak atsiri pada penelitian Parida et al

tahun 2014 yang menunjukkan terdapat 18 komponen kima dari minyak

atsirinya. Perbedaan jumlah komponen ini kemungkinan penyebabnya sama

dengan perbedaan jumlah rendemen minyak atsiri yang sebelumnya dibahas.

Perbedaan ini juga kemungkinan dapat terjadi akibat perbedaan teknik

analisis komponen kimia yang dilakukan oleh Parida et al tahun 2014 yang

menggunakan kormatografi gas-cair sedangkan pada penelitian ini

menggunakan kromatografi gas-spektroskopi massa. Meskipun jumlah

komponen berbeda tetapi komponen utama dan jumlah komponen utama dari

minyak atsiri kemangi pada penelitian Parida dan yang saat ini dilakukan

hampir sama. Komponen utama dari kedua penelitian ini adalah sitral dan β-

sitral dengan kadar pada penelitian Parida et al masing-masing yaitu 47,18%

35


dan 36,57% sedangkan pada penelitian ini didapatkan kadar masing-masing

yaitu 43,94% dan 31,73%.

Minyak atsiri kemangi yang digunakan memiliki komponen kimia

terbesarnya yaitu sitral. Sitral merupakan monoterpen yang sudah diketahui

memiliki aktivitas farmakologi, termasuk didalamnya sebagai antibakteri,

antijamur, antibakteri, insektisida, dan antibiofilm (Lima et al. 2012; Kalia,

2015; Chaimovitsh et al, 2010). Sitral sebagai antibiofilm dengan

menghambat quorum sensing (QS) sehingga pembentukan biofilm terhambat.

Pada penelitian oleh Dalleau tahun 2007, menunjukkan sitral dapat

menghambat secara signifikan dari aktivitas metabolik ragi yang termasuk

dalamnya Candida albicans biofilm ketika ditambahkan pada konsentrasi

kurang dari 2,25 mg/mL pada saat awal pertumbuhan biofilm jamur.

Mekanisme yang mungkin terjadi saat penghambatan QS yaitu persaingan

pengikatan molekul sinyal pada reseptor, degradasi sinyal enzimatik seperti

pada asil homoserine lakton (AHL) acylases (Sistem komunikasi sel-sel yang

memungkinkan untuk mengkoordinasikan ekspresi gen), dan penghambatan

penerimaan molekul sinyal (Verbel et al, 2012). Sitral sebagai antibakteri dan

antibiofilm dapat mengikat oksigen saat didalam tubuh untuk membuat

epoksida intermediet yang dapat mengalkilasi DNA, protein dan sejumlah

biomolekular yang lainnya (Kalia, 2015 & Saddiq, 2010). Selain itu pada

penelitian yang dilakukan Thaweboon tahun 2012, menunjukkan minyak

atsiri kemangi secara keseluruhan juga dapat bekerja sebagai antibiofilm

dengan cara menghancurkan biofilm dari Streptococcus mutans yang sudah

terbentuk.

Minyak atsiri dibuat serial konsentrasi uji 1%, 0,75%, 0,5%, dan

0,25% v/v. Serial konsentrasi dibuat dengan mengencerkan minyak atsiri

dengan DMSO 9,8%. DMSO digunakan karena merupakan pelarut yang

dapat melarutkan hampir semua senyawa polar maupun non polar dan dapat

digunakan sebagai pengencer ekstrak. Pelarut DMSO merupakan pelarut

organik dan tidak bersifat bakterisidal hingga konsentrasi 10%. DMSO

direkomendasikan digunakan sebagai pelarut minyak atsiri (Assidqi, 2012 &

Thaweboon, 2009).

36


Pada penelitian ini minyak atsiri dilakukan uji aktivitas antibiofilm

terhadap bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan

Staphylococcus aureus menggunakan metode Microtitter Plate Biofilm

Assay. Pengujian ini dilakukan terhadap tiga aktivitas antibiofilm yaitu

pencegahan pertumbuhan biofilm, penghambatan pertumbuhan biofilm dan


Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa yang didapat dari koleksi laboratorium

mikrobiologi LIPI dan Staphylococcus aureus hasil isolasi. Ketiga bakteri

yang digunakan ini dapat menyebabkan infeksi pada manusia. Escherichia

coli merupakan flora normal di dalam usus tetapi dapat menjadi patogen jika

jumlah bakteri ini dalam saluran pencernaan meningkat atau berada di luar

usus. Escherichia coli dapat menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan

beberapa kasus diare, sepsis bila bakteri dapat memasuki aliran darah, infeksi

saluran kemih, dan penyebab utama meningitis pada bayi (Jawetz et al,

1996). Pseudomonas aeruginosa dapat menyebabkan infeksi pada luka,

membentuk nanah yang berwarna biru hijau, meningitis, dan infeksi saluran

air kemih akibat pemakaian kateter dan alat-alat medis yang ditumbuhi

biofilm bakteri (Jawetz, et al, 1996). Infeksi oleh Staphylococcus aureus

ditandai dengan kerusakan jaringan yang disertai abses bernanah. Beberapa

penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri ini adalah bisul, jerawat,

impetigo, dan infeksi luka. Infeksi yang lebih berat diantaranya pneumonia,

mastitis, plebitis, meningitis, infeksi saluran kemih, dan osteomielitis (Ryan

et al, 1994; Warsa, 1994).

Bakteri uji dikultur pada media padat untuk diamati bentuk

morfologinya. Bakteri Escherichia coli ditumbuhkan pada media EMB

(Eosin Methyl Blue Agar) dan dilakukan pewarnaan Gram untuk melihat

bentuk mikroskopisnya. Hasil dari inokulan menunjukkan ciri khas dari

Escherichia coli yaitu pada media EMB menghasilkan warna metalik emas

dan bentuk mikroskopis terlihat batang pendek sedikit oval, susunan tidak

teratur, dan berwarna kemerahan. Bakteri Pseudomonas aeruginosa

ditumbuhkan pada media PIA (Pseudomonas Isolation Agar) dan dilakukan

37


pewarnaan Gram untuk melihat bentuk mikroskopisnya. Hasil dari inokulan

menunjukkan ciri dari Pseudomonas aeruginosa yaitu pada media PIA

inokulan yang terbentuk menghasilkan warna hijau yang merupakan ciri

khasnya dan bentuk mikroskopisnya batang pendek, warna kemerahan, dan

tidak teratur. Hasil dari inokulan Staphylococcus aureus menunjukkan ciri

khasnya yaitu secara makroskopis koloni padat, bulat, halus, dan berwarna

putih kekuningan dan secara mikroskopis sel yang berbentuk bulat berwarna

ungu dan berkoloni seperti buah anggur. Uji biokimia dilakukan untuk

memastikan bahwa inokulan adalah spesies Staphylococcus aureus dengan

menggunakan larutan H2O2 3%, media pelarut fosfat, media KIA, dan susu

skim 20%. Bakteri hasil inokulasi dapat dipastikan Staphylococcus aureus

jika pada uji H2O2 3% menghasilkan gelembung gas yang banyak, uji dengan

susu skim 20% menyebabkan menggumpalnya susu, positif melarutkan fosfat

pada media fosfat, dan terdapatnya titik kehitaman pada dasar penusukan di

media KIA. Dari keseluruhan uji yang dilakukan terhadap tujuh jenis bakteri

yang diuga Staphylococcus aureus menunjukkan bahwa bakteri nomor 6

positif merupakan Staphylococcus aureus.

Setelah semua bakteri uji dipastikan sesuai, maka selanjutnya

dilakukan uji pembentukan biofilm. Hal ini bertujuan untuk mengetahui

kemampuan bakteri uji yang digunakan dalam membentuk biofilm. Suspensi

bakteri dengan densitas optik 0.2 (DO600) pada masing-masing bakteri

dimasukkan ke dalam mikroplat yang berbeda dan diinkubasi pada suhu 370C

selama 72 jam. Densitas optik biofilm Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, dan Staphylococcus aureus yang terbentuk masing-masing

adalah 0,324, 0,66, dan 0,829. Grafik pertumbuhan dapat dilihat pada gambar

4.1. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri dapat membentuk biofilm yang baik,

sehingga metode dan bakteri yang digunkan sudah cocok dan dapat

digunakan untuk uji aktivitas antibiofilm.

Uji aktivitas antibiofilm minyak atsiri dilakukan terhadap pencegahan,

penghambatan, dan penghancuran biofilm Escherichia coli. Data persentase

pencegahan biofilm Escherichia coli pada gambar 4.2. Grafik pada gambar

menunjukkan grafik eksponensial dimana terjadi peningkatan aktivitas

38


pencegahan biofilm seiring dengan meningkatnya konsentrasi minyak atsiri.

Hasil tertinggi ditunjukan pada konsentrasi 1% dengan persentase

pencegahan sebesar 40,68% dan yang terendah pada konsentrasi 0,25%

dengan persentase pencegahan 13,63%. Hasil uji statistik pencegahan biofilm

Escherichia coli dapat dilihat pada lampiran 10. Uji normalitas menunjukkan

data pencegahan biofilm terdistribusi normal (p ≥ 0,05) dan pada uji

homogenitas menunjukkan data pencegahan biofilm tidak terdistribusi

homogen (p ≤ 0,05) sehingga dilanjutkan ke uji Kruskal Wallis. Hasil uji

Kruskal Wallis (p ≤ 0,05) menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna

pada data uji pencegahan biofilm Escherichia coli sehingga dilanjutkan ke uji

Post Hoc untuk melihat perbedaanya. Hasil uji post hoc menunjukkan

densitas optik kontrol negatif berbeda secara bermakna terhadap masing-

masing konsentrasi uji.

Persentase aktivitas penghambatan Eschercia coli dapat dilihat pada

gambar 4.2. Grafik pada gambar menunjukkan grafik eksponensial dimana

terjadi peningkatan aktivitas penghambatan biofilm seiring dengan

meningkatnya konsentrasi minyak atsiri. Penghambatan biofilm tertinggi

ditunjukkan pada konsentrasi 1% dengan persentase penghambatan sebesar

41,28% dan yang terendah pada konsentrasi 0,25% dengan persentase

pencegahan 34,07%. Hasil uji statistik penghambatan biofilm Escherichia

coli dapat dilihat pada lampiran 11. Uji normalitas menunjukkan pencegahan

biofilm terdistribusi normal (p ≥ 0,05) dan pada uji homogenitas

menunjukkan penghambatan biofilm terdistribusi homogen (p ≥ 0,05).

Sehingga analisa dilanjutkan dengan uji Anova. Hasil uji Anova (p ≤ 0,05)

menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna pada data uji penghambatan

biofilm Escherichia coli sehingga dilanjutkan ke uji post hoc untuk melihat

perbedaanya. Hasil uji Post Hoc menunjukkan densitas optik kontrol negatif

berbeda secara bermakna terhadap masing-masing konsentrasi uji.

Uji terakhir terhadap Escherichia coli yaitu penghancuran biofilm.

Persentase aktivitas penghancuran Eschercia coli dapat dilihat pada gambar

4.2. Grafik pada gambar menunjukkan grafik dengan skema sigmoid, dimana

aktivitas terbaik berada di tengah yaitu pada konsentrasi 0,5% dengan

39


aktivitas penghancuran 23,92% dan turun kembali pada konsentrasi 0,25%

dengan persentase aktivitas penghancuran sebesar 21,92%. Aktivitas

penghancuran tersendah pada konsentrasi 1% dengan aktivtas penghancuran

sebesar 14,64%. Hasil uji statistik penghancuran biofilm Escherichia coli

dapat dilihat pada lampiran 12. Hasil uji normalitas menunjukkan pencegahan

biofilm terdistribusi normal (p ≥ 0.05) dan pada uji homogenitas

menunjukkan pencegahan biofilm terdistribusi homogen (p ≥ 0.05) sehingga

memenuhi persyataran untuk uji Anova. Hasil uji Anova (p ≥ 0.05)

menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang bermakna.

Uji aktivitas antibiofilm minyak atsiri selanjutnya dilakukan terhadap

pencegahan, penghambatan, dan penghancuran biofilm Pseudomonas

aeruginosa. Persentase pencegahan biofilm Pseudomonas aeruginosa pada

gambar 4.3. Grafik pada gambar menunjukkan peningkatan aktivitas

pencegahan biofilm seiring dengan meningkatnya konsentrasi minyak atsiri.

Pencegahan biofilm tertinggi ditunjukkan pada konsentrasi 1% dengan

persentase pencegahan sebesar 34,89% dan yang terendah pada konsentrasi

0,25% dengan persentase pencegahan 20,54%. Hasil uji statistik pencegahan

biofilm Pseudomonas aeruginosa dapat dilihat pada lampiran 13. Hasil uji

normalitas menunjukkan pencegahan biofilm Pseudomonas aeruginosa

terdistribusi normal (p ≥ 0,05) tetapi uji homogenitas (p ≤ 0,05)

menunjukkan pencegahan biofilm Pseudomonas aeruginosa tidak

terdistribusi homogen, sehingga analisa dilanjutkan dengan uji Kruskal-

Wallis. Hasil uji Kruskal-Wallis (p ≤ 0,05) menunjukkan terdapat perbedaan

yang bermakna, maka dilakukan uji post hoc. Hasil uji post hoc menunjukkan

densitas optik kontrol negatif berbeda secara bermakna terhadap masing-

masing konsentrasi uji.

Persentase aktivitas penghambatan biofilm Pseudomonas aeruginosa

dapat dilihat pada gambar 4.3. Grafik pada gambar menunjukkan grafik

dengan skema sigmoid, dimana aktivitas terbaik berada di tengah yaitu pada

konsentrasi 0,5% dengan aktivitas penghambatan sebesar 42,94% dan turun

kembali pada konsentrasi 0,25% degan persentase aktivitas penghambatan

sebesar 40,47%. Aktivitas penghambatan terendah pada konsentrasi 1%

40


dengan aktivtas penghancuran sebesar 36,69%. Hasil uji statistik

penghambatan biofilm Pseudomonas aeruginosa dapat dilihat pada lampiran

14. Hasil uji normalitas menunjukkan pencegahan biofilm terdistribusi

normal (p ≥ 0,05) dan pada uji homogenitas menunjukkan pencegahan

biofilm terdistribusi homogen (p ≥ 0,05) sehingga dilanjutkan ke uji Anova.

Hasil uji Anova (p ≤ 0,05) menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna

sehingga dilanjutkan ke uji post hoc. Hasil uji post hoc menunjukkan densitas

optik kontrol negatif berbeda secara bermakna terhadap masing-masing

konsentrasi uji.

Uji terakhir terhadap Pseudomonas aeruginosa adalah uji

penghancuran biofilm. Persentase aktivitas penghancuran Pseudomonas

aeruginosa dapat dilihat pada gambar 4.3. Grafik pada gambar menunjukkan

peningkatan aktivitas penghancuran biofilm seiring dengan menurunnya

konsentrasi minyak atsiri. Penghancuran biofilm tertinggi ditunjukkan pada

konsentrasi 0,25% dengan persentase penghancuran sebesar 42,66% dan yang

terendah pada konsentrasi 1% dengan persentase penghancuran biofilm

sebesar 15,14%. Hasil uji statistik penghancuran biofilm Pseudomonas

aeruginosa yang dapat dilihat pada lampiran 15. Hasil uji normalitas

menunjukkan penghancuran biofilm terdistribusi normal (p ≥ 0,05) dan pada

uji homogenitas menunjukkan penghancuran biofilm terdistribusi homogen (p

≥ 0,05) sehingga dilanjutkan uji Anova. Hasil uji Anova (p ≤ 0,05)

menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna pada konsentrasi uji.

Selanjutnya, dilakukan uji post hoc yang menjelaskan tentang perbandingan

densitas optik antar perlakuan uji. Hasil uji Post Hoc menunjukkan densitas

optik kontrol negatif berbeda secara bermakna terhadap masing-masing

konsentrasi uji.

Uji aktivitas antibiofilm minyak atsiri yang terakhir dilakukan

terhadap pencegahan, penghambatan, dan penghancuran biofilm

Staphylococcus aureus. Persentase aktivitas pencegahan biofilm

Staphylococcus aureus dapat dilihat pada gambar 4.4. Grafik pada gambar

menunjukkan peningkatan aktivitas pencegahan biofilm seiring dengan

menurunnya konsentrasi minyak atsiri. Pencegahan biofilm tertinggi

41


ditunjukan pada konsentrasi 0,25% dengan persentase pencegahan sebesar

43,06% dan yang terendah pada konsentrasi 1% dengan persentase

pencegahan biofilm sebesar 16,41%. Hasil uji statistik pencegahan biofilm

Staphylococcus aureus dapat dilihat pada lampiran 16. Hasil uji normalitas

menunjukkan pencegahan biofilm Staphylococcus aureus terdistribusi normal

(p ≥ 0,05) dan uji homogenitas menunjukkan pencegahan biofilm

Staphylococcus aureus terdistribusi homogen (p ≥ 0,05), sehingga dilanjutkan

uji Anova. Hasil uji Anova (p ≤ 0,05) menunjukkan terdapat perbedaan yang

bermakna. Sehingga dilanjutkan dengan uji post hoc yang menjelaskan

tentang perbandingan densitas optik antar perlakuan uji. Hasil uji post hoc

menunjukkan bahwa minyak atsiri kemangi dapat mencegah biofilm

Staphylococcus aureus secara bermakna.

Persentase aktivitas penghambatan biofilm Staphylococcus aureus

dapat dilihat pada gambar 4.4. Grafik pada gambar menunjukkan peningkatan

aktivitas penghambatan biofilm seiring dengan menurunnya konsentrasi

minyak atsiri. Penghambatan biofilm tertinggi ditunjukan pada konsentrasi

0,25% dengan persentase penghambatan sebesar 54,41% dan yang terendah

pada konsentrasi 1% dengan persentase penghambatan biofilm sebesar

41,53%. Hasil uji statistik penghambatan biofilm Staphylococcus aureus

dapat dilihat pada lampiran 17. Hasil uji normalitas menunjukkan pencegahan

biofilm terdistribusi normal (p ≥ 0,05) dan pada uji homogenitas

menunjukkan pencegahan biofilm tidak terdistribusi homogen ( p ≤ 0,05),

sehingga dilakukan uji Kruskal Wallis. Hasil uji Kruskal Wallis (p ≤ 0,05)

menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna pada perbedaan konsentrasi

uji sehingga dilanjutkan uji post hoc yang. Hasil uji post hoc menunjukkan

bahwa minyak atsiri kemangi dapat menghambat pertumbuhan biofilm

Staphylococcus aureus secara bermakna terhadap kontrol negatif.

Uji antibiofilm yang terakhir dilakukan terhadap Staphylococcus

aureus adalah aktivitas penghancuran biofilmnya. Persentase aktivitas

penghancuran biofilm Staphylococcus aureus dapat dilihat pada gambar 4.4.

Grafik menunjukan aktvitas yang sama seperti aktivitas pencegahan dan

penghambatan biofilm Staphylococcus aureus sebelumnya. Grafik pada

42


gambar menunjukkan peningkatan aktivitas penghancuran biofilm seiring

dengan menurunnya konsentrasi minyak atsiri. Penghancuran biofilm

tertinggi ditunjukkan pada konsentrasi 0,25% dengan persentase

penghancuran sebesar 58,10% dan yang terendah pada konsentrasi 1%

dengan persentase penghancuran biofilm sebesar 46,41%. Hasil uji statistik

penghancuran biofilm Staphylococcus aureus dapat dilihat pada lampiran 18.

Hasil uji normalitas menunjukkan penghancuran biofilm terdistribusi normal

(p ≥ 0,05) dan pada uji homogenitas menunjukkan penghancuran biofilm

terdistribusi homogen (p ≥ 0,05) sehingga dilanjutkan uji Anova. Hasil uji

Anova (p ≤ 0,05) menunjukkan aktivitas penghancuran biofilm berbeda

secara bermakna, sehingga dilanjutkan ke uji post hoc. Hasil uji post hoc

menunjukkan bahwa minyak atsiri kemangi dapat menghancurkan biofilm

Staphylococcus aureus secara bermakna terhadap kontrol negatif.

Setelah didapatkan hasil uji aktivitas antibiofilm kemangi, maka

penelitian dilanjutkan untuk menguji aktivitas terbaik dari aktivitas

antibiofilm minyak atsiri kemangi. Aktivitas antibiofilm terbaik kemangi

yang paling baik dapat dilihat pada persentase aktivitas penghancuran biofilm

Staphylococcus aureus. Hasil persentase penghancuran biofilm tertinggi

terjadi pada biofilm bakteri Staphylococcus aureus yaitu 58,1%. Nilai

penghancuran tersebut jauh di atas nilai aktivitas antibiofilm pada perlakuan

yang lain. Hal ini yang menjadi dasar pemilihan aktivitas penghancuran

biofilm Staphylococcus aureus untuk dilakukan optimasinya.

Sebelum melakukan optimasi, dilakukan uji penumbuhan biofilm

untuk mencari waktu pertumbuhan biofilm terbaik dengan waktu lebih cepat.

Hasil dari penumbuhan biofilm dapat dilihat pada gambar 4.5. Hasil

pertumbuhan biofilm terbaik memiliki densitas optik sebesar 0,87 dengan

waktu inkubasi 48 jam.

Metode Response Surface Analysis (RSA) digunakan untuk

merancang dan mengolah data penghancuran biofilm. Faktor yang digunakan

untuk optimasi biofilm adalah konsentrasi, suhu dan waktu kontak.

Rancangan optimasi yang didapatkan dari RSA sebanyak 20 perlakuan uji

yang dapat dilihat pada lampiran 20. Setelah didapatkan hasil densitas optik

43


dari 20 perlakuan uji RSA, data dimasukan ke dalam rancangan dan akan

diplotkan untuk didapatkan contour plot yang menunjukkan perbandingan

aktivitas dengan faktor uji yang digunakan.

Hasil contour plot ini digunakan untuk mengetahui suhu, konsentrasi

dan waktu yang optimal dalam menghasilkan aktivitas antibiofilm yang

paling baik. Hasil contour plot dapat dilihat pada gambar 4.6 dan 4.7.

Pengaruh konsentrasi pada contour plot menunjukkan bahwa semakin kecil

konsentrasi menunjukkan aktivtias penghancuran biofilm yang semakin baik

pada Staphylococcus aureus dibandingkan dengan konsentrasi yang besar.

Selain konsentrasi, pengaruh suhu dan juga waktu kontak memiliki peranan

dalam proses penghancuran biofilm. Semakin tinggi suhu dan lamanya waktu

kontak ekstrak dengan biofilm dapat menyebabkan penghancuran biofilm

oleh minyak atsiri kemangi yang semakin baik. Peningkatan suhu dapat

menyebabkan terganggunya kestabilan lapisan biofilm yang terbentuk dari

polisakarida, protein, dan DNA sehingga menyebabkan semakin mudahkan

minyak atsiri untuk masuk ke bagian dalam biofilm bakteri. Waktu kontak

yang lama akan menyebabkan minyak atsiri yang dapat masuk kedalam

biofilm bakteri akan semakin banyak sehingga akan dapat menghancurkan

biofilm bakteri tersebut. Warna yang ada pada contour plot menunjukkan

aktivitas penghancuran biofilm. Data RSA yang didapatkan menunjukkan

perlakuan uji optimal minyak atsiri untuk menghancurkan biofilm

Staphylococcus aureus yaitu pada konsentrasi 0,25%, suhu degradasi 50oC,

dan waktu kontak 0.79 jam (48 menit).

Hasil uji terseleksi penghancuran biofilm Staphylococcus aureus yang

didapat dari RSA dilakukan uji statistik yang dapat dilihat pada lampiran 18.

Hasil uji normalitas menunjukkan penghancuran biofilm terdistribusi normal

(p ≥ 0.05) dan pada uji homogenitas menunjukkan penghancuran biofilm

terdistribusi homogen (p ≥ 0.05) sehingga dilanjutkan uji Anova. Hasil uji

Anova (p ≤ 0.05) menunjukkan aktivitas optimasi penghancuran biofilm

berbeda secara bermakna, Sehingga dilanjutkan ke uji post hoc. Hasil uji post

hoc menunjukkan bahwa minyak atsiri kemangi dapat menghancurkan

biofilm Staphylococcus aureus secara bermakna terhadap kontrol negatif.

44


Persentase optimasi penghancuran biofilm Staphylococcus aureus

dapat dilihat pada gambar 4.8. grafik pada gambar menunjukkan bahwa

kontrol positif (Biorem) memiliki persentase penghancuran biofilm yang

lebih baik dengan 75,59% sedangkan minyak atsiri menghancurkan 65.79%.

sedangkan DMSO 9.8% hampir tidak memiliki aktivitas penghancuran

karena penghancurannya hanya sebesar 2.73%. Meskipun persentase

penghancuran biofilm optimal minyak atsiri lebih rendah dibandingkan

dengan kontrol positif. Namun, perbedaan yang tidak terlalu jauh

menunjukkan bahwa minyak atsiri mempunyak potensi yang sangat baik

untuk dikembangkan sebagai penghancur biofilm dari bakteri Stapylococcus

aureus.


BAB V

PENUTUP

5.1 KESIMPULAN

1. Minyak atsiri kemangi memiliki aktivitas pencegahan, penghambatan,

dan penghancuran biofilm Escherichia coli dengan persentase aktivitas

tertinggi pada konsentrasi berturut-turut yaitu 1%, 1%, dan 0,5%.


dan penghancuran biofilm Pseudomonas aeruginosa dengan

persentase aktivitas tertinggi pada konsentrasi berturut-turut yaitu 1%,

0.5%, dan 0,5%


dan penghancuran biofilm Staphylococcus aureus dengan persentase

aktivitas tertinggi pada konsentrasi 0,25%

4. Aktivitas optimal minyak atsiri herba kemangi (Ocimum americanum

L.) dari penelitian ini ditunjukan pada aktivititas penghancuran biofilm

dari Staphylococcus aureus. Kondisi optimal minyak atsiri herba

kemangi untuk penghancuran biofilm Staphylococcus aureus yaitu

pada konsentrasi 0,25%, suhu 500C dan waktu kontak ekstrak 48 menit

dengan menghasilkan persentase penghancuran biofilm sebesar

65,79%.

5.2 SARAN

Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengidentifikasi senyawa aktif

spesifik dan mekanisme kerja dari minyak atsiri herba kemangi (Ocimum

americanum L.) sebagai antibiofilm.


DAFTAR PUSTAKA

Assidqi, et al. 2012. Potensi Ekstrak Daun Patikan Kebo (Euphorbia Hirta)

Sebagai Antibakteri terhadap Aeromonas Hydrophila Secara in Vitro.

Surabaya. Journal of Marine and Coastal Science - Universitas Airlangga.

Hal 113-124

Bezerra et al. 2008. Response surface methodology (RSM) as a tool for

optimization in analytical chemistry. Elsevier. Hal 965-977

Bjarnsholt et al. 2011. Biofilm Infections, Springer-Verlag. New York. Hal : 251-

255

Chaimovitsh et al. 2010. Microtubules are An Intracellular Target of The Plant

Terpene Citral. The Plant Journal. Vol 61 Hal 399-408

Cortés et al. 2011. Biofilm Formation, Control and Novel Strategies for

Eradication. Department of Restorative Dentistry. Brazil. Formatex. Hal

896-905

Dhale et al. 2010. Premliminary Sreening of Antibacterial and Phytochemical

Studies of Ocimum americanum Linn. Journal of Ecobiotechnology. ISSN

2077-0464. Hal 11-13

Dorland. 1998. Kamus Saku Kedokteran Dorland. Edisi 25. Jakarta: Penerbit

Buku Kedokteran EGC. Hal 555

Fardiaz, et al. 1981. Masalah keamanan pangan dalam hubungannya dengan

mikrobiologi veteri-neri. Kumpulan makalah Kongres Nasional

Mikrobiologi ke III. Jakarta. Hal : 307 - 310.

Haris et al. 2002. An Introduction to Staphylococcus aureus, and Techniques for

Identifying and Quantifying S.aureus Adhesins in Relation to Adhesion to

Biomaterials Review. European Cells and Materials Vol. 4. Hal 39-60.

ISSN 1473-2262

Hendayana, S., 1994. Kimia Analitik Instrumen. Edisi kesatu, IKIP Press.

Semarang. Hal. 219 dan 243.

Holt, J.G. et al. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth

Edition, Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, USA.

Jawetz. E., J. Melnick, L. Adelberg, E.A. 1995. Mikrobiologi untuk Profesi

Kesehatan, Edisi 16. Alih Bahasa oleh Dr. H. Tonang. Jakarta : EGC

Jawetz. E., J. Melnick, L. Adelberg, E.A. 1996. Mikrobiologi Untuk Profesi

Kesehatan, Gramedia, Jakarta.

Jawetz. E., J. Melnick, L. Adelberg, E.A. 2005. Microbiologi Untuk Profesi

Kesehatan. Terjemahan Huriati dan Hartanto. Penerbit Buku Kedokteran

EGC, Jakarta.

Kalia, Vipin Chandra. 2015. Quorum Sensing Vs Quorum Quenching : A Battle

with No End in Sight.

47


Kaper et al. 2004 Phatogenic Escherchia coli. Department of Microbiology and

Immunology, and the Department of Pediatrics, University of Maryland

School of Medicine, Baltimore. Maryland 21201, USA

Keller et al, 2014. Oral Biofilm : Entry and Immune System Response. Inside

Dentistry

Kunarso, Djoko Hadi, 1987. Beberapa Catatan Tentang Bakteri Salmonella.

Balai Penelitian dan Pengembangan Lingkungan Laut, Pusat Penelitian

dan Pengembangan Oseanologi-LIPI, Jakarta. ISSN 0216-1877

Lima, et al. 2012 Anti-Candida albicans Effectiveness of Citral and Investigation

of Mode of Action. Pharmaceutical Biologi. 50(12):1536-41. doi:

10.3109/13880209.2012.694893.

Nikolić, et al. 2014. Antibacterial and Anti-biofilm Activity of Ginger (Zingiber

officinale (Roscoe)) Ethanolic Extract. Laboratory of Microbiology,

Department of Biology and Ecology, Faculty of Science, University of

Kragujevac. Kragujevac J. Sci. 36 129-136

Ntezurubanza L, Scheffer JJ, Looman A. Composition of the essential oil of

Ocimum americanum grown in Rawanda. Pharm Weekbl Sci 1986; 7: 273-

6.

O'Toole et al. 2000. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev

Microbiology. Vol 54 Hal 49-79

Paraje, M.G. et al. 2011. Antimicrobial resistance in biofilms. Argentina.

Formatex. Hal 736-744

Pers., 2010. Lokakarya Nasional Tanaman Obat Indonesia. PusatInformasi

Kehutanan Republik Indonesia.

Pitojo, Setijo. 1996. Kemangi dan Selasih. Trubus Agriwidya : Unggara.

Potter & perry. 2005. Fundamental Keperawatan edisi 4. Jakarta. EGC. hal : 933

– 942

Pratiwi, Sylvia. T. 2008. Mikrobologi Farmasi. Jakarta : Erlangga

Rai, Ravishankar. 2013. Microbial Biofilms and Ttheir Control by Various

Antimicrobial Strategies. Department of Studies in Microbiology,

University of Mysore. India. Formatex

S. Dalleau et al. 2007. In Vitro Activity of Essential oils and Their Major

Component Againt Candida albican Yeasts Growing Planktionically and

as Biofilm. Munich. European Society of Clinical Microbiology

Sarma dan Babu. 2011. Pharmacognostic and Phytochemical Studies of Ocimum

americanum. J. Chem. Pharm. Res., 3(3) : 337 – 347.

Sastrohamidjojo et al.1985. Kromatografi. Edisi kesatu. Penerbit Liberti.

Yogyakarta, hal. 6-8, 23, 26, 27, 46, 53-55, 92 dan 97.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=O%27Toole%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11018124

48


Shadia, El-Aziz, Omer, & Sabra. 2007. Chemical Composition of Ocimum

americanum Essential Oil and Its Biological Effects Againts, Agrotis

ipsilon, (Lepidoptera : Noctuidae). Resech journal of Agriculture and

Biological Sciences, 3 (6) : 740-747.

Shahzadi et al. 2014. Synthesis of 3, 7-Dimethyl-2, 6-Octadienal Acetals from

Citral Extracted from Lemon Grass, Cymbopogon citrates L. Journal

Antiviral & Antiretroviral. Vol 6:1

Siemonsma, J.S dan Pliuek, Kasem. 1994. Plants Resources of South-East Asia

No.8 Vegetables. Bogor, Indonesia. Hal. 218-220.

Sousa et al. 2012. Computational Approaches to Standard-compliant Biofilm

Data for Reliable Analysis and Integration. Journal of Integrative

Bioinformatics.

Sudarsono, Gunawan, D., Wahyuono, S., Danatus, I.A., Purnomo. 2002.

Tumbuhan Obat II. Yogyakarta : Pusat Studi Obat Tradisional, pp :136 –

8.

Sudjadi . 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta

Sulianti,Sri Budi. 2008. Studi Fitokimia Ocimum spp : Komponen Kimia Minyak

Atsiri Kemangi dan Ruku-Ruku. Berita Biologi 9(3). Bidang Botani, Pusat

Penelitian Biologi-LIPI.

Thaweboon, Sroisiri., & Thaweboon, Boonyanit. 2009. In Vitro Antimicrobial

Activity of Ocimum americanum L. Essential Oil Against Oral

Microorganisms. Southeast Asian J Trop Med Public Healt, Vol. 40 No. 5

Todar, K. 2008. Online Text Book of Bacteriology. University of Wisconsin-

Madison Department of Bacteriology.

Verber, et al. 2014. Composition, Anti-quorum Sensing and Antimicrobial Activity

of Essential Oil from Lippia alba. Colombia. Brazilian Journal of

Microbiology 45. Hal 759-767

Verma & Kothiyal. 2012. Pharmacological Activities of Different Species of

Tulsi. International Journal of Biopharm & Phytochemical Research; Vol.

1 (1). Hal: 21-37.

Y. Li et al. 2014. Essential Oils as Reagents in Green Chemistry,

SpringerBriefs in Green Chemistry for Sustainability, DOI 10.1007/978-3-

319-08449-7_2

LAMPIRAN

49


Lampiran 1. Alur Kerja

a. Escherichia coli

Herba Kemangi (Ocimum americanum L)

Destilasi Minyak Atsiri

Escherichia coli

Identifikasi Herba Kemangi

Pembuatan Suspensi Bakteri dan

Pengukuran OD bakteri

Analisis Data dan

Pembacaan dengan Microplate Reader

Inkulasi Bakteri Escherichia coli

Media EMB dan Heterotrof

Analisis Komponen Kimia

dengan GCMS

Uji Pencegahan

Biofilm

Uji Penghancuran

Biofilm

Uji Penghambatan Biofilm

Pembuatan Seri Konsentrasi

(0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%)

Uji Pertumbuhan Biofilm

Escherichia coli

50


b. Pseudomonas aeruginosa

Uji Pencegahan

Biofilm

Herba Kemangi (Ocimum americanum L)




Pembuatan Suspensi Bakteri

dan Pengukuran OD bakteri

Analisis Data dan


Inokulasi Bakteri Pseudomonas

aeruginosa di Media PIA dan

Heterotrof

Analisis Komponen

Kimia dengan GCMS

Uji Penghancuran

Biofilm Uji Penghambatan

Biofilm


(0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%)



51


c. Staphylococcus aureus

Analisis Data dan


Uji Pencegahan

Biofilm

Uji Penghancuran

Biofilm

Uji Penghambatan

Biofilm

Optimasi Aktivitas

terseleksi

Herba Kemangi (Ocimum americanum

L)




Pembuatan Suspensi Bakteri

dan Pengukuran OD Bakteri

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri


Inokulasi di Media Heterotrof

Analisis Komponen

Kimia dengan GCMS


(0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%)



52


d. Pewarnaan Gram

Penyiapan reagen pewarnaan Gram

(Kristal violet, safranin, lugol, dan etanol 70%)

Tambahkan kirstal violet 1 tetes, lalu diamkan 1

menit, setelah itu dibilas dengan air

Isolat bakteri digorekan pada kaca objek dan ditetesi dengan NaCl

fisiologis. Diamkan kaca objek beberapa saat hingga NaCl kering lalu

difiksasi di atas bunsen

Tambahkan lugol 1 tetes dan diamkan selama 1

menit, setelah itu bilas dengan air

Tambahkan safranin 1 tetes dan diamkan selama 1 menit,

setelah itu bilas dengan etanol dan dikering-anginkan

Pengamatan dengan mikroskop

53


Lampiran 2. Hasil Determinasi

54


Lampiran 3. Hasil Destilasi Minyak Atsiri Herba Kemangi

55


Lampiran 4. Alat dan Bahan

Timbangan Analitik

Mikroskop

Mikropipet

Inkubator Microwave

Spectrophotometer

Mikroplate Reader

Laminar Air Flow

Oven

Vortex Autoklaf Microplate

56


GC-MS Destilasi Mikro Tip

BIOREM

Etanol 96% Bahan Pewarnaan Gram

Minyak Atsiri Kemangi Media HTR Kristal Violet 1%

57


Lampiran 5. Hasil Pembuatan Larutan Uji

1. Minyak Atsiri 100%

2. Variasi Konsentrasi Minyak Atsiri

Lampiran 6. Hasil Uji Pertumbuhan Biofilm Bakteri Uji.

Bakteri Uji Absorbansi

1 2 3 Rata-Rata

Escherichia coli 0,427

0,246

0,299

0,324

Pseudomonas aerginosa 0,645 0,680 0,655 0,660

Staphylococcus aureus 0,756 0,905 0,826 0,829

58


Lampiran 7. Hasil Uji Antibiofilm Terhadap Escherichia coli

a. Densitas Optik Pencegahan Biofilm Escherichia coli

b. Densitas Optik Penghambatan Biofilm Escherichia coli

c. Densitas Optik Penghancuran Biofilm Escherichia coli

Perlakuan Absorbansi

% Pencegahan 1 2 3 Rata-Rata

Kontrol (-) 0,161 0,179 0,159 0,166 -

Ekstrak 1% 0,095 0,097 0,104 0,099 48,68

Ekstrak 0,75% 0,118 0,122 0,121 0,120 27,66

Ekstrak 0,5% 0,114 0,142 0,142 0,133 20,24

Ekstrak 0,25% 0,147 0,145 0,139 0,144 13,63


% Penghambatan 1 2 3 Rata-Rata

Kontrol (-) 0,161 0,179 0,159 0,166 -

Ekstrak 1% 0,092 0,104 0,097 0,098 41,28

Ekstrak 0,75% 0,100 0,101 0,114 0,105 36,87

Ekstrak 0,5% 0,098 0,101 0,123 0,107 35,47

Ekstrak 0,25% 0,112 0,109 0,108 0,110 34,07


% Penghancuran 1 2 3 Rata-Rata

Kontrol (-) 0,195 0,130 0,160 0,161 -

Ekstrak 1% 0,134 0,136 0,144 0,138 14,64

Ekstrak 0,75% 0,130 0,123 0,122 0,125 22,68

Ekstrak 0,5% 0,113 0,124 0,132 0,123 23,92

Ekstrak 0,25% 0,128 0,138 0,114 0,127 21,65

59


Lampiran 8. Hasil Uji Antibiofilm Terhadap Pseudomonas aeruginosa

a. Densitas Optik Pencegahan Biofilm Pseudomonas aeruginosa

b. Densitas Optik Penghambatan Biofilm Pseudomonas aeruginosa

c. Densitas Optik Penghancuran Biofilm Pseudomonas aeruginosa



Kontrol (-) 0,442 0,431 0,451 0,441 -

Ekstrak 1% 0,260 0,295 0,307 0,287 34,89

Ekstrak 0,75% 0,291 0,280 0,293 0,288 34,74

Ekstrak 0,5% 0,292 0,288 0,292 0,291 34,14

Ekstrak 0,25% 0,373 0,341 0,338 0,351 20,54



Kontrol (-) 0,321 0,292 0,279 0,297 -

Ekstrak 1% 0,176 0,190 0,172 0,179 39,69

Ekstrak 0,75% 0,260 0,183 0,178 0,174 41,59

Ekstrak 0,5% 0,167 0,166 0,176 0,170 42,94

Ekstrak 0,25% 0,187 0,184 0,160 0,177 40,47



Kontrol (-) 0,237 0,210 0,207 0,218 -

Ekstrak 1% 0,198 0,188 0,169 0,185 15,14

Ekstrak 0,75% 0,106 0,154 0,169 0,143 34,40

Ekstrak 0,5% 0,110 0,140 0,135 0,128 41,13

Ekstrak 0,25% 0,140 0,122 0,113 0,125 42,66

60


Lampiran 9. Hasil Uji Antibiofilm Terhadap Staphylococcus aureus

a. Densitas Optik Pencegahan Biofilm Staphylococcus aureus

b. Densitas Optik Penghambatan Biofilm Staphylococcus aureus

c. Densitas Optik Penghancuran Biofilm Staphylococcus aureus



Kontrol (-) 0,256 0,235 0,222 0,237 -

Ekstrak 1% 0,186 0,201 0,209 0,199 16,41

Ekstrak 0,75% 0,140 0,172 0,196 0,169 28,75

Ekstrak 0,5% 0,141 0,152 0,173 0,155 34,64

Ekstrak 0,25% 0,140 0,133 0,133 0,135 43,06



Kontrol (-) 0,318 0,215 0,158 0,230 -

Ekstrak 1% 0,113 0,130 0,141 0,135 41,53

Ekstrak 0,75% 0,112 0,110 0,110 0,111 51,95

Ekstrak 0,5% 0,109 0,098 0,113 0,107 53,69

Ekstrak 0,25% 0,093 0,096 0,126 0,105 54,41



Kontrol (-) 0,095 0,826 0,756 0,844 -

Ekstrak 1% 0,411 0,427 0,519 0,099 46,41

Ekstrak 0,75% 0,378 0,356 0,439 0,101 53,67

Ekstrak 0,5% 0,388 0,296 0,478 0,103 54,11

Ekstrak 0,25% 0,264 0,329 0,468 0,107 58,10

61


Lampiran 10. Hasil Uji Statistik Aktivitas Pencegahan Biofilm Escherichia

coli

a. Uji Normalitas One-Sample Kolmogorov Smirnov

Tujuan : Untuk melihat normalitas distribusi data densitas optik uji pencegahan

biofilm.

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm terdistribusi normal

Ha : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm tidak terdistribusi normal

Pengambilan Kesimpulan :

Bila signifikansi ≥ 0,05 Ho diterima

Bila signifikansi ≤ 0,05 Ho ditolak

Tabel 10.1. Hasil uji normalitas

Absorbansi

N 15

Normal Parametersa Mean .13233

Std. Deviation .024697

Most Extreme

Differences

Absolute .140

Positive .129

Negative -.140

Kolmogorov-Smirnov Z .541

Asymp. Sig. (2-tailed) .931

Kesimpulan : Data densitas optik pencegahan biofilm terdistribusi normal (p ≥ 0,05)

b. Uji Homogenitas (Levene)

Tujuan : Untuk melihat homogenitas data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm bervariasi homogen

Ha : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm tidak bervariasi homogen




62


Tabel 10.2. Hasil uji homogenitas

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

6.071 4 10 .010

Kesimpulan : Data densitas optik pencegahan biofilm tidak bervariasi homogen (p ≤

0,05), sehingga dilanjutkan ke uji Kruskal Wallis.

c. Uji Kruskal Wallis

Tujuan : Untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan bermakna dari data densitas

biofilm.

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm tidak berbeda secara

bermakna

Ha : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm berbeda secara

bermakna




Tabel 10.3. Hasil uji Kruskal Wallis

Absorbansi

Chi-Square 12.255

df 4

Asymp. Sig. .016

Kesimpulan : Densitas biofilm berbeda secara bermakna (p ≤ 0,05), sehingga

dilakukan pengujian dengan uji post hoc.

63


d. Post Hoc

(I) Konsentrasi (J) Konsentrasi

Mean

Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Kontrol Negatif 1 .067667* .007542 .000 .05086 .08447

0.75 .046000* .007542 .000 .02919 .06281

0.5 .033667* .007542 .001 .01686 .05047

0.25 .022667* .007542 .013 .00586 .03947

1 Kontrol Negatif -.067667* .007542 .000 -.08447 -.05086

0.75 -.021667* .007542 .017 -.03847 -.00486

0.5 -.034000* .007542 .001 -.05081 -.01719

0.25 -.045000* .007542 .000 -.06181 -.02819

0.75 Kontrol Negatif -.046000* .007542 .000 -.06281 -.02919

1 .021667* .007542 .017 .00486 .03847

0.5 -.012333 .007542 .133 -.02914 .00447

0.25 -.023333* .007542 .011 -.04014 -.00653

0.5 Kontrol Negatif -.033667* .007542 .001 -.05047 -.01686

1 .034000* .007542 .001 .01719 .05081

0.75 .012333 .007542 .133 -.00447 .02914

0.25 -.011000 .007542 .175 -.02781 .00581

0.25 Kontrol Negatif -.022667* .007542 .013 -.03947 -.00586

1 .045000* .007542 .000 .02819 .06181

0.75 .023333* .007542 .011 .00653 .04014

0.5 .011000 .007542 .175 -.00581 .02781

Kesimpulan : Densitas optik pencegahan biofilm berbeda secara bermakna (p ≥ 0,05).

64


Lampiran 11. Hasil Uji Statistik Aktivitas Penghambatan Biofilm

Escherichia coli


Tujuan : Untuk melihat normalalitas distribusi data densitas optik aktivitas

penghambatan biofilm.

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm terdistribusi normal

Ha : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm tidak terdistribusi

normal





Absorbansi

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .281

Positive .281

Negative -.174

Kolmogorov-Smirnov Z 1.087


Kesimpulan : Data densitas optik penghambatan biofilm terdistribusi normal (p ≥

0,05)


Tujuan : Untuk melihat homogenitas dari data densitas optik aktivitas penghambatan

biofilm

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm bervariasi homogen

Ha : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm tidak bervariasi homogen



65




Levene Statistic df1 df2 Sig.

3.349 4 10 .055

Kesimpulan : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm bervariasi

homogen (p ≥ 0,05). sehingga dilanjutkan dengan uji Anova

c. Uji One-Way ANOVA

Tujuan : untuk melihat data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm antar

konsentrasi terdapat perbedaan secara bermakna atau tidak.

Hipotesa :

Ho : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm tidak berbeda secara

bermakna

Ha : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm berbeda secara bermakna




Tabel 11.3. Hasil uji One-Way ANOVA

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .009 4 .002 28.387 .000

Within Groups .001 10 .000

Total .010 14

Kesimpulan : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm berbeda secara

bermakna (p ≤ 0,05), sehingga dilanjutkan uji post hoc

66


d. Uji post hoc


Mean

Difference




Kontrol Negatif 1 .068667* .007388 .000 .05221 .08513

0.75 .061333* .007388 .000 .04487 .07779

0.5 .059000* .007388 .000 .04254 .07546

0.25 .056667* .007388 .000 .04021 .07313

1 Kontrol Negatif -.068667* .007388 .000 -.08513 -.05221

0.75 -.007333 .007388 .344 -.02379 .00913

0.5 -.009667 .007388 .220 -.02613 .00679

0.25 -.012000 .007388 .135 -.02846 .00446

0.75 Kontrol Negatif -.061333* .007388 .000 -.07779 -.04487

1 .007333 .007388 .344 -.00913 .02379

0.5 -.002333 .007388 .759 -.01879 .01413

0.25 -.004667 .007388 .542 -.02113 .01179

0.5 Kontrol Negatif -.059000* .007388 .000 -.07546 -.04254

1 .009667 .007388 .220 -.00679 .02613

0.75 .002333 .007388 .759 -.01413 .01879

0.25 -.002333 .007388 .759 -.01879 .01413

0.25 Kontrol Negatif -.056667* .007388 .000 -.07313 -.04021

1 .012000 .007388 .135 -.00446 .02846

0.75 .004667 .007388 .542 -.01179 .02113

0.5 .002333 .007388 .759 -.01413 .01879

Kesimpulan : Data densitas optik pencegahan biofilm berbeda secara bermakna (p ≥

0,05).

67


Lampiran 12. Hasil Uji Statistik Aktivitas Penghancuran Biofilm Escherichia

coli


Tujuan : Untuk melihat normalitas distribusi data densitas optik aktivitas


Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm terdistribusi normal

Ha : Data densitas optik aktivitas penghancuran tidak terdistribusi normal





Absorbansi

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .239

Positive .239

Negative -.141



Kesimpulan : Data densitas optik penghancuran biofilm terdistribusi normal (p ≥

0,05)


Tujuan : Untuk melihat homogenitas dari data densitas optik aktivitas penghancuran

biofilm

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm bervariasi homogen

Ha : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak bervariasi homogen



68





2.305 4 10 .130

Kesimpulan : Data densitas optik penghancuran biofilm bervariasi homogen (p ≥

0,05), sehingga dapat dilanjutkan uji Anova


Tujuan : Untuk melihat data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm terdapat

perbedaan secara bermakna atau tidak.

Hipotesa :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak berbeda secara

signifikan

Ha : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm berbeda secara signifikan


Bila signifikansi ≥ 0.05 Ho diterima

Bila signifikansi ≤ 0.05 Ho ditolak


Sum of


Between Groups .003 4 .001 2.889 .079


Total .006 14

Kesimpulan : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak berbeda

secara bermakna (p ≥ 0,05), sehingga tidak dilanjutkan ke uji post hoc

69


Lampiran 13. Hasil Uji Statistik Aktivitas Pencegahan Biofilm Pseudomonas

aeruginosa



biofilm.

Hipotesis :







Absorbansi

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .252

Positive .252

Negative -.142





Tujuan : Untuk melihat homogenitas dari data densitas optik aktivitas pencegahan

biofilm

Hipotesis :






70




3.976 4 10 .035

Kesimpulan : Data densitas optik pencegahan biofilm tidak bervariasi homogen (p ≤

0,05). sehinggat dilanjutkan uji Kruskal Wallis



biofilm.

Hipotesis :


bermakna

Ha : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm berbeda secara

bermakna





Absorbansi

Chi-Square 11.053

df 4

Asymp. Sig. .026

Kesimpulan : Data densitas optis biofilm berbeda secara bermakna (p ≤ 0,05)

sehingga dilakukan uji post hoc.

71


d. Uji Post Hoc


Mean

Difference




Kontrol Negatif 1 .154000* .012260 .000 .12668 .18132

0.75 .153333* .012260 .000 .12602 .18065

0.5 .150667* .012260 .000 .12335 .17798

0.25 .090667* .012260 .000 .06335 .11798

1 Kontrol Negatif -.154000* .012260 .000 -.18132 -.12668

0.75 -.000667 .012260 .958 -.02798 .02665

0.5 -.003333 .012260 .791 -.03065 .02398

0.25 -.063333* .012260 .000 -.09065 -.03602

0.75 Kontrol Negatif -.153333* .012260 .000 -.18065 -.12602

1 .000667 .012260 .958 -.02665 .02798

0.5 -.002667 .012260 .832 -.02998 .02465

0.25 -.062667* .012260 .000 -.08998 -.03535

0.5 Kontrol Negatif -.150667* .012260 .000 -.17798 -.12335

1 .003333 .012260 .791 -.02398 .03065

0.75 .002667 .012260 .832 -.02465 .02998

0.25 -.060000* .012260 .001 -.08732 -.03268

0.25 Kontrol Negatif -.090667* .012260 .000 -.11798 -.06335

1 .063333* .012260 .000 .03602 .09065

0.75 .062667* .012260 .000 .03535 .08998

0.5 .060000* .012260 .001 .03268 .08732

Kesimpulan : Data pencegahan biofilm berbeda secara bermakna (p ≥ 0,05).

72





Tujuan : Untuk melihat normalitas distribusi data densitas optik penghambatan

biofilm.

Hipotesis :



normal





Densitas optik

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .372

Positive .372

Negative -.225




0,05)


Tujuan : Untuk melihat homogenitas dari data densitas optik penghambatan biofilm

Hipotesis :

Ho : data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm bervariasi homogen

Ha : data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm tidak bervariasi homogen




73




1.861 4 10 .194

Kesimpulan : Data densitas optik penghambatan biofilm bervariasi homogen (p ≥

0,05), sehingga dapat dilakukan uji Anova


Tujuan : Untuk melihat data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm antar


Hipotesa :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm tidak berbeda secara

signifikan

Ha : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm berbeda secara signifikan





Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .036 4 .009 47.667 .000


Total .038 14

Kesimpulan : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm berbeda secara

bermakna (p ≤ 0,05), sehingga dilanjutkan ke uji post hoc

74


d. Uji Post Hoc


Mean

Difference




Kontrol Negatif 1 .118000* .011239 .000 .09296 .14304

0.75 .123667* .011239 .000 .09863 .14871

0.5 .127667* .011239 .000 .10263 .15271

0.25 .120333* .011239 .000 .09529 .14537

1 Kontrol

Negatif -.118000

* .011239 .000 -.14304 -.09296

0.75 .005667 .011239 .625 -.01937 .03071

0.5 .009667 .011239 .410 -.01537 .03471

0.25 .002333 .011239 .840 -.02271 .02737

0.75 Kontrol

Negatif -.123667

* .011239 .000 -.14871 -.09863

1 -.005667 .011239 .625 -.03071 .01937

0.5 .004000 .011239 .729 -.02104 .02904

0.25 -.003333 .011239 .773 -.02837 .02171

0.5 Kontrol

Negatif -.127667

* .011239 .000 -.15271 -.10263

1 -.009667 .011239 .410 -.03471 .01537

0.75 -.004000 .011239 .729 -.02904 .02104

0.25 -.007333 .011239 .529 -.03237 .01771

0.25 Kontrol

Negatif -.120333

* .011239 .000 -.14537 -.09529

1 -.002333 .011239 .840 -.02737 .02271

0.75 .003333 .011239 .773 -.02171 .02837

0.5 .007333 .011239 .529 -.01771 .03237

Kesimpulan : Data densitas optik control negatif dengan aktivitas penghambatan biofilm

berbeda secara bermakna (p ≥ 0,05).

75


Lampiran 15. Hasil Uji Statistik Aktivitas Penghancuran Biofilm



Tujuan : Untuk melihat normalitas distribusi data densitas optik penghancuran

biofilm.

Hipotesis :


Ha : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak terdistribusi

normal





Absorbansi

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .153

Positive .153

Negative -.095



Kesimpulan : Data densitas optik penghancuran biofilm terdistribusi normal (p ≥

0,05)


Tujuan : Untuk melihat homogenitas dari data densitas optik penghancuran biofilm

Hipotesis :

Ho : data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm bervariasi homogen

Ha : data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak bervariasi homogen




76




1.697 4 10 .227


0,05), sehingga dilanjutkan ke Anova


Tujuan : Untuk melihat data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm terdapat

perbedaan secara bermakna atau tidak.

Hipotesa :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak berbeda secara

signifikan

Ha : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm berbeda secara signifikan





Sum of


Between Groups .020 4 .005 12.075 .001


Total .024 14

Kesimpulan : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm berbeda secara

bermakna (p ≤ 0,05), sehingga dilanjutkan uji post hoc

77


d. Uji Post Hoc


Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error Sig.



Kontrol Negatif 1 .033000 .016413 .072 -.00357 .06957

0.75 .075000* .016413 .001 .03843 .11157

0.5 .089667* .016413 .000 .05310 .12624

0.25 .093000* .016413 .000 .05643 .12957

1 Kontrol

Negatif -.033000 .016413 .072 -.06957 .00357

0.75 .042000* .016413 .028 .00543 .07857

0.5 .056667* .016413 .006 .02010 .09324

0.25 .060000* .016413 .004 .02343 .09657

0.75 Kontrol

Negatif -.075000

* .016413 .001 -.11157 -.03843

1 -.042000* .016413 .028 -.07857 -.00543

0.5 .014667 .016413 .393 -.02190 .05124

0.25 .018000 .016413 .298 -.01857 .05457

0.5 Kontrol

Negatif -.089667

* .016413 .000 -.12624 -.05310

1 -.056667* .016413 .006 -.09324 -.02010

0.75 -.014667 .016413 .393 -.05124 .02190

0.25 .003333 .016413 .843 -.03324 .03990

0.25 Kontrol

Negatif -.093000

* .016413 .000 -.12957 -.05643

1 -.060000* .016413 .004 -.09657 -.02343

0.75 -.018000 .016413 .298 -.05457 .01857

0.5 -.003333 .016413 .843 -.03990 .03324

Kesimpulan : Data densitas optik control penghancuran biofilm berbeda secara bermakna

(p ≥ 0,05).

78


Lampiran 16. Hasil Uji Statistik Aktivitas Pencegahan Biofilm




pembentukan biofilm.

Hipotesis :







Absorbansi

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .165

Positive .165

Negative -.122





Tujuan : untuk melihat homogenitas dari data densitas optik aktivitas pencegahan

biofilm

Hipotesis :





79





1.447 4 10 .289

Kesimpulan : Data densitas optik pencegahan biofilm bervariasi homogen (p ≥ 0,05),

sehingga dapat dilanjutkan ke Anova


Tujuan : untuk melihat data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm antar


Hipotesa :


bermakna

Ha : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm berbeda secara bermakna






Between Groups .019 4 .005 15.964 .000


Total .022 14

Kesimpulan : Data densitas optik pencegahan biofilm berbeda secara bermakna (p ≤

0,05), sehingga dilanjutkan uji post hoc

80


d. Uji post hoc


Mean

Difference




Kontrol Negatif 1 .039000* .014145 .020 .00748 .07052

0.75 .068333* .014145 .001 .03682 .09985

0.5 .082333* .014145 .000 .05082 .11385

0.25 .102333* .014145 .000 .07082 .13385

1 Kontrol Negatif -.039000* .014145 .020 -.07052 -.00748

0.75 .029333 .014145 .065 -.00218 .06085

0.5 .043333* .014145 .012 .01182 .07485

0.25 .063333* .014145 .001 .03182 .09485

0.75 Kontrol Negatif -.068333* .014145 .001 -.09985 -.03682

1 -.029333 .014145 .065 -.06085 .00218

0.5 .014000 .014145 .346 -.01752 .04552

0.25 .034000* .014145 .037 .00248 .06552

0.5 Kontrol Negatif -.082333* .014145 .000 -.11385 -.05082

1 -.043333* .014145 .012 -.07485 -.01182

0.75 -.014000 .014145 .346 -.04552 .01752

0.25 .020000 .014145 .188 -.01152 .05152

0.25 Kontrol Negatif -.102333* .014145 .000 -.13385 -.07082

1 -.063333* .014145 .001 -.09485 -.03182

0.75 -.034000* .014145 .037 -.06552 -.00248

0.5 -.020000 .014145 .188 -.05152 .01152

Kesimpulan : Data densitas optik control negatif dengan pencegahan biofilm berbeda

secara bermakna (p ≥ 0,05).

81





Tujuan : Untuk melihat normalitas distribusi data densitas optik penghambatan

biofilm.

Hipotesis :



normal





Absorbansi

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .276

Positive .276

Negative -.224




0,05)


Tujuan : Untuk melihat homogenitas dari data densitas optik aktivitas penghambatan

biofilm

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm bervariasi homogen

Ha : Data densitas optik aktivitas penghambatan biofilm tidak bervariasi homogen


82






5.658 4 10 .012

Kesimpulan : Data densitas optik penghambatan biofilm tidak bervariasi homogen (p

≤ 0,05), sehingga dilakukan uji Kruskal Wallis



biofilm.

Hipotesis :


bermakna

Ha : Data densitas optik aktivitas pencegahan biofilm berbeda secara

bermakna





Absorbansi

Chi-Square 11.120

df 4

Asymp. Sig. .025

Kesimpulan : Densitas biofilm berbeda secara bermakna (p ≤ 0,05) sehingga

dilanjutkan dengan pengujian dengan uji post hoc.

83


d. Uji Post Hoc


Mean

Difference




Kontrol Negatif 1 .095667* .030558 .011 .02758 .16375

0.75 .119667* .030558 .003 .05158 .18775

0.5 .123667* .030558 .002 .05558 .19175

0.25 .125333* .030558 .002 .05725 .19342

1 Kontrol Negatif -.095667* .030558 .011 -.16375 -.02758

0.75 .024000 .030558 .450 -.04409 .09209

0.5 .028000 .030558 .381 -.04009 .09609

0.25 .029667 .030558 .355 -.03842 .09775

0.75 Kontrol Negatif -.119667* .030558 .003 -.18775 -.05158

1 -.024000 .030558 .450 -.09209 .04409

0.5 .004000 .030558 .898 -.06409 .07209

0.25 .005667 .030558 .857 -.06242 .07375

0.5 Kontrol Negatif -.123667* .030558 .002 -.19175 -.05558

1 -.028000 .030558 .381 -.09609 .04009

0.75 -.004000 .030558 .898 -.07209 .06409

0.25 .001667 .030558 .958 -.06642 .06975

0.25 Kontrol Negatif -.125333* .030558 .002 -.19342 -.05725

1 -.029667 .030558 .355 -.09775 .03842

0.75 -.005667 .030558 .857 -.07375 .06242

0.5 -.001667 .030558 .958 -.06975 .06642

Kesimpulan : Data densitas optik penghambatan biofilm berbeda secara bermakna (p ≥

0,05).

84


Lampiran 18. Hasil Uji Statistik Aktivitas Penghancuran Biofilm




biofilm.

Hipotesis :


Ha : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak terdistribusi

normal





Densitas optik

N 15



Most Extreme

Differences

Absolute .249

Positive .249

Negative -.135



Kesimpulan : data densitas optik penghancuran biofilm terdistribusi normal (p ≥

0,05)


Tujuan : untuk melihat homogenitas dari data densitas optik aktivitas penghancuran

biofilm

Hipotesis :

Ho : data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm bervariasi homogen

85


Ha : data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak bervariasi homogen






.653 4 10 .638


0,05).


Tujuan : untuk melihat data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm antar


Hipotesa :

Ho : data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm tidak berbeda secara

signifikan

Ha : data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm berbeda secara signifikan






Between Groups .497 4 .124 18.240 .000


Total .565 14

Kesimpulan : Data densitas optik penghancuran biofilm berbeda

secara bermakna (p ≤ 0,05).

86


d. Uji Post Hoc


Mean

Difference




Kontrol Negatif 1 .391667* .067370 .000 .24156 .54178

0.75 .453000* .067370 .000 .30289 .60311

0.5 .456667* .067370 .000 .30656 .60678

0.25 .490333* .067370 .000 .34022 .64044

1 Kontrol Negatif -.391667* .067370 .000 -.54178 -.24156

0.75 .061333 .067370 .384 -.08878 .21144

0.5 .065000 .067370 .357 -.08511 .21511

0.25 .098667 .067370 .174 -.05144 .24878

0.75 Kontrol Negatif -.453000* .067370 .000 -.60311 -.30289

1 -.061333 .067370 .384 -.21144 .08878

0.5 .003667 .067370 .958 -.14644 .15378

0.25 .037333 .067370 .592 -.11278 .18744

0.5 Kontrol Negatif -.456667* .067370 .000 -.60678 -.30656

1 -.065000 .067370 .357 -.21511 .08511

0.75 -.003667 .067370 .958 -.15378 .14644

0.25 .033667 .067370 .628 -.11644 .18378

0.25 Kontrol Negatif -.490333* .067370 .000 -.64044 -.34022

1 -.098667 .067370 .174 -.24878 .05144

0.75 -.037333 .067370 .592 -.18744 .11278

0.5 -.033667 .067370 .628 -.18378 .11644

Kesimpulan : Data densitas optik penghancuran biofilm berbeda secara bermakna (p ≥ 0,05).

87


Lampiran 19. Hasil Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm Menggunakan

Response Surface Analysis

Hasil optimasi aktivitas penghancuran

Tabel 19.1. Hasil Optimasi Aktivitas Penghancuran biofilm

No Suhu Konsentrasi

Waktu

Kontak % Degradasi

1 25 1 0,5 3,005

2 25 1 1,5 52,277

3 25 0,625 1 48,454

4 25 0,25 0,5 26,230

5 25 0,25 1,5 52,484

6 37,5 1 1 64,717

8 37,5 0,625 1 55,153

9 37,5 0,625 1 61,653

10 37,5 0,625 1 61,838

11 37,5 0,625 1 56,267

12 37,5 0,625 1 55,153

13 37,5 0,625 1 52,089

14 37,5 0,625 0,5 64,129

15 37,5 0,625 1,5 47,970

7 37,5 0,25 1 67,038

16 50 1 0,5 55,216

17 50 1 1,5 64,094

20 50 0,625 1 67,563

18 50 0,25 0,5 68,448

19 50 0,25 1,5 66,667

88


Lampiran 20. Hasil Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm Staphylococcus

aureus Pada Kondisi Respon Surface Analysis

a. 250C, dan waktu kontak 30 menit

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,122 0,125 0,119 0,122 -

Ekstrak 0,25% 0,08 0,08 0,09 0,083 31,693

Ekstrak 1% 0,106 0,122 0,127 0,118 3,005

b. Pada suhu 25 0C dan waktu kontak 60 menit

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,312 0,287 0,276 0,291 -

Ekstrak 0,625% 0,14 0,155 0,155 0,15 48,453

c. Pada suhu 250C dan waktu kontak 90 menit

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,350 0,323 0,294 0,322 -

Ekstrak 0,25% 0,134 0,16 0,165 0,153 52,484

Ekstrak 1% 0,077 0,164 0,22 0,153 52,277

d. Pada suhu 370C dan waktu kontak 30 menit

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,316 0,287 0,264 0,289 -

89


Ekstrak 0,625% 0,077 0,083 0,151 0,103 64,129

e. Pada suhu 370C dan waktu kontak 60 menit

Perlakuan

Densitas Optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,336 0,376 0,366 0,359 -

Ekstrak 0,25% 0,066 0,121 0,168 0,118 67,038

Ekstrak 0,625% 0,151 0,167 0,165 0,161 55,153

Ekstrak 0,625% 0,062 0,174 0,177 0,137 61,652

Ekstrak 0,625% 0,06 0,174 0,177 0,137 61,838

Ekstrak 0,625% 0,158 0,163 0,15 0,157 56,267

Ekstrak 0,625% 0,151 0,166 0,166 0,161 55,153

Ekstrak 0,625% 0,166 0,174 0,176 0,172 52,089

Ekstrak 1% 0,069 0,153 0,158 0,126 64,716

f. Pada suhu 370C dan waktu kontak 90 menit

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,263 0,270 0,280 0,271 -

Ekstrak 0,625% 0,133 0,144 0,146 0,141 47,970

g. Pada suhu 500C dan waktu kontak 30

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,370 0,436 0,375 0,393 -

Ekstrak 0,25% 0,112 0,132 0,128 0,124 68,447

Ekstrak 1% 0,150 0,179 0,199 0,176 55,216

90


h. Pada suhu 500C dan waktu kontak 60 menit

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,451 0,390 0,387 0,409 -

Ekstrak 0,25% 0,128 0,138 0,132 0,132 67,563

i. Pada suhu 500C dan waktu kontak 90 menit

Perlakuan

Densitas optik

% Penghambatan

1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,301 0,300 0,333 -

Ekstrak 0,25% 0,101 0,112 0,098 0,103 66,666

Ekstrak 1% 0,076 0,12 0,139 0,111 64,094

Lampiran 21. Hasil Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm Kondisi optimal

Kondisi optimal : Pada suhu 50oC, konsentrasi 0,25%, waktu kontak 48 menit

Tabel 21.1. Data uji aktivitas penghambatan biofilm kondisi optimal

Perlakuan Densitas Optik

%

Penghancuran 1 2 3

Rata-

Rata

Kontrol (-) 0,894 0,913 0,86 0,889

Ekstrak 0,25% 0,329 0,290 0,291 0,236 65,879

DMSO 9,8% 0,91 0,868 0,816 0,864 2,737

Kontrol (+) 0,200 0,215 0,236 0,217 75,590

91


Lampiran 22. Hasil Uji Statistik Aktivitas Penghancuran Kondisi Optimal

Biofilm



biofilm pada kondisi optimal.

Hipotesis :

Ho : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm pada kondisi optimal

terdistribusi normal

Ha : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm pada kondisi optimal

tidak terdistribusi normal





Densitas optik

N 12



Most Extreme

Differences

Absolute .277

Positive .270

Negative -.277



Kesimpulan : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm pada kondisi

optimal terdistribusi normal (p ≥ 0,05)


Tujuan : untuk melihat homogenitas dari data densitas optik penghancuran biofilm

pada kondisi optimal

Hipotesis :


bervariasi homogen


tidak bervariasi homogen

92







.922 3 8 .473

Kesimpulan : Data densitas optik penghancuran biofilm pada kondisi optimal

bervariasi homogen (p ≥ 0,05).


Tujuan : Untuk melihat data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm pada

kondisi optimal antar konsentrasi terdapat perbedaan secara bermakna atau

tidak.

Hipotesa :


biofilm tidak berbeda secara signifikan


biofilm berbeda secara signifikan





Sum of


Between Groups 1.153 3 .384 408.867 .000


Total 1.160 11

Kesimpulan : Data densitas optik aktivitas penghancuran biofilm pada kondisi

optimal berbeda secara bermakna (p ≤ 0,05), sehingga dapat

dilanjutkan ke uji post hoc.

93


d. Uji Post Hoc


Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error Sig.

95% Confidence

Interval

Lower

Bound

Upper

Bound

Kontrol Negatif Minyak Atsiri 0.25% .585667* .025032 .000 .52794 .64339

DMSO 9.8% .024333 .025032 .359 -.03339 .08206

Kontrol Positif .672000* .025032 .000 .61428 .72972

Minyak Atsiri

0.25%

Kontrol Negatif -.585667* .025032 .000 -.64339 -.52794

DMSO 9.8% -.561333* .025032 .000 -.61906 -.50361

Kontrol Positif .086333* .025032 .009 .02861 .14406

DMSO 9.8% Kontrol Negatif -.024333 .025032 .359 -.08206 .03339

Minyak Atsiri 0.25% .561333* .025032 .000 .50361 .61906

Kontrol Positif .647667* .025032 .000 .58994 .70539

Kontrol Positif Kontrol Negatif -.672000* .025032 .000 -.72972 -.61428

Minyak Atsiri 0.25% -.086333* .025032 .009 -.14406 -.02861

DMSO 9.8% -.647667* .025032 .000 -.70539 -.58994

Kesimpulan : Data densitas optik penghancuran biofilm berbeda secara signifikan (p ≥

0,05).

Documents

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... · Sekitar 99% bakteri berada dalam bentuk biofilmnya dan hanya 1 % dalam bentuk