UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH BELIMBING WULUH ...repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/29289/1/RESKY... · BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi . L) TERHADAP. BIOFILM

UIN SYARIF HIDAYATULLAH

UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH

BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi L) TERHADAP

BIOFILM Pseudomonas aeruginosa SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Oleh

RESKY YULIANDARI

1111102000001

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH

UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH



SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana farmasi

Oleh

RESKY YULIANDARI

1111102000001

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA 2015

i UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah benar karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk,

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Resky Yuliandari

NIM : 1111102000001

Tanda tangan :

Tanggal : 24 Juni 2015

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK


Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi :UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH



P.aeruginosa merupakan bakteri oportunistik penyebab resistensi obat. Pembentukan

biofilm P.aeruginosa dapat menyebabkan masalah yang serius dalam bidang

kesehatan, khususnya terkait masalah infeksi. Penelitian sebelumnya menyatakan

bahwa belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) mengandung senyawa flavonoid yang

diketahui memiliki aktivitas antibiofilm. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk

mengetahui aktivitas antibiofilm sari buah belimbing wuluh terhadap pembentukan

biofilm P.aeruginosa secara in vitro yaitu pencegahan, penghambatan dan degradasi

biofilm dan mengetahui kondisi optimum dari aktivitas terseleksi. Penelitian ini

mengunakan metode Microtitter Plate Biofilm Assay. Sampel yang digunakan yaitu

P.aeruginosa pembentuk biofilm yang merupakan koleksi LIPI yang diisolasi dari

alat dispenser. Perlakuan berupa penambahan sari buah belimbing wuluh dengan seri

konsentrasi 0,5 %, 1%, 2%, 4%, 8%, kontrol negatif dan kontrol positif. Pengukuran

pembentukan biofilm dilakukan dengan menggunakan microplate reader dan

diperoleh data kuantitatif berupa nilai absorbansi atau Optical Density pada panjang

gelombang 595nm (OD595nm). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa sari buah

belimbing wuluh memiliki aktivitas antibiofilm yaitu pencegahan, penghambatan dan

degradasi biofilm P.aeruginosa secara in vitro mulai dari konsentrasi 0,5% (p<0,05).

Penghambatan pertumbuhan biofilm merupakan aktivitas terbaik yang kemudian

dioptimasi dengan menggunakan metode Response Surface Analysis (RSA). Terdapat

tiga faktor yang dioptimasi yaitu suhu, konsentrasi dan waktu inkubasi. Hasil

optimasi menunjukkan bahwa suhu yang optimal adalah 300C, konsentrasi 4,3% dan

waktu inkubasi 2,25.

Kata Kunci : biofilm, P.aeruginosa, belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L)

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT



Judul Skripsi :UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH



P.aeruginosa is a drug resistance opportunistic bacterium. Biofilm formation of

P.aeruginosa is able to cause serious health problems, especially infection diseases.

The previous study proved that a Averrhoa bilimbi L fruit juice is containing

flavonoid agent which is known to be antibiofilm effect. This study is conducted to

determine the in vitro antibiofilm activity of a Averrhoa bilimbi L fruit juice to

P.aeruginosa biofilm growth including three acivities preventive, inhibitory and

degradative of biofilm, and to determine the optimum condition of best selected

acivity. This study using Plate Biofilm Assay method. Sample of this study is

P.aeruginosa, the framer of biofilm an isolated LIPI collection of toll dispenser. The

treatments is addition of Averrhoa bilimbi L fruit juice with concentration of 0,5%,

1%, 2%, 4%, 8%, the negative control and the positive control. Quantification of

biofilm formation is measured by using microplate reader at 596 nm and its result is

absorbance value or Optical Density (OD595nm) as quantitative data. This study

showed that Averrhoa bilimbi L fruit juice has significant in vitro anibiofilm effect in

preventing, inhibitory and degradating of biofilm growth with starting concentration

0,5% (p<0,05). The biofilm inhibitory is the best activities which is optimized using

the Response Surface Analysis (RSA) method. This method optimized three factors

including temperature, concentration and the incubation period. The optimization

process result in optimal temperature 300C, concentration 4,3% and incubation period

2,25 days.

Keywords : biofilm, P.aeruginosa, Averrhoa bilimbi L

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’aalamiin, segala puji dan syukur penulis ucapkan

kehadirat ALLAH SWT yang telah melimpahkan rahmat dan ridho-Nya sehingga

penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi ini hingga selesai. Penulisan skripsi

yang berjudul “ UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH BELIMBING

WULUH (Averrhoa bilimbi L) TERHADAP BIOFILM Pseudomonas aeruginosa

SECARA IN VITRO” bertujuan untuk memenuhi persyaratan guna memperoleh

gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada kesempatan ini penulis menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan

dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini,

sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya

mengucapkan terima kasih dan penghargaan sebesar-besarnya kepada :

1. Prof.Dr. Atiek Soemiati,M.si.,Apt dan Novik Nurhidayat.P.hD selaku dosen

pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, waktu, tenaga, saran

dan dukungan dalam penelitian ini.

2. Dr.H. Arif Sumantri,SKM.,M.Kes Selaku dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Yardi,P.hD.,Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negri Syarif Hidayatullah Jakarta dan

pembimbing akademik kelas A farmasi 2011 yang telah banyak memberikan

perhatian dan bimbingan selama masa perkuliahan.

4. Drs. Umar Mansur,M.Sc.,Apt selaku mantan ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negri Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan banyak motivasi dan bantuan

selama menjabat sebagai ketua prodi.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

5. Seluruh dosen di Program Studi Farmasi Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah mengajar dan

mendidik saya selama masa perkuliahan.

6. Kedua orang tua, papa tercinta Drs.Rizal Efendi (Alm) dan mama tersayang

Surhana yang telah membesarkan dan mendidik anaknya dan selalu

memberikan kasih sayang dan doa yang tidak pernah putus serta dukungan

baik moril maupun materil. Tidak ada apapun dunia ini yang dapat membalas

semua kebaikan, cinta dan kasih saying yang telah kalian berikan kepada

anakmu, semoga ALLAH SWT selalu memberikan keberkahan, kesehatan,

keselamatan, perlindungan, cinta dan kasih sayang kepada orang tua hamba

tercinta. Terkhusus untuk papa tercinta, semoga ALLAH SWT selalu

melindungimu dan menempatkanmu di antara orang-orang beriman.

7. Adikku tersayang Muhammad Destian Arif, serta semua keluarga besar yang

berada di Lampung yang telah memberikan doa, semangat dan dukungan

sehingga penelitian ini berjalan dengan lancar.

8. Faritz Azhar.S.Far.,Apt atas segala pengertian, semangat, perhatian dan

bantuannya.

9. Teman seperjuangan Biofilmers dan Biosensores (Firda, Rika, Fattah, ka via,

ka Eka, ka Anom dan ka Afif) yang telah berjuang bersama dan memberikan

dukungan dan bantuan selama di LIPI.

10. Laboran di LIPI Cibinong Pak Acun, ka Lusi, ka Ana dan keluarga besar LIPI

Cibinong yang telah banyak sekali membantu penulis selama masa penelitian.

11. Laboran FKIK ka Lisna, ka Tiwi, ka Eris, ka Liken, mba Rani dan mas

Rahmadi yang telah membantu penulis selama masa penelitian dan perkulian.

12. Sahabat terbaik (Rida, Tiara, Cahya, Jeje, Devid, Inul, Aripin, Dini, Raihana,

Nikmah, Wafa, Tari, Mazay, Fitri serta teman kosan RDC (inten, ka Devi, ka

Isti, ka Santi, Nina, Vani, Pire, mba Elsa, mba Anis, Cumi, Nita, Noni, mba

Evi dan lain-lain) yang telah mendoakan dan memberikan dukungan kepada

penulis.

13. Teman-teman seperjuangan farmasi angkatan 2011 atas kebersamaan kita.

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

14. Serta pihak-pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah

memberikan dukungan hingga terwujudnya skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dri sempurna, namun penulis

berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan pada umumnya dan ilmu farmasi padakhususnya. Akhir kata, penulis

berharap ALLAH SWT berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah

membantu saya dalam penelitian ini.

Ciputat, Mei 2015

Penulis

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan dibawah ini :


NIM : 1111102000001


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK)

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya

ilmiah saya dengan judul :

UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH BELIMBING WULUH

(Averrhoa bilimbi L) TERHADAP BIOFILM Pseudomonas aeruginosa SECARA

IN VITRO.

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-undang Hak Cipta.

Demikian persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 24 Juni 2015

Yang menyatakan,

(Resky Yuliandari)

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN OSRISINILITAS ............................................ i

HALAMAN LEMBAR PERSETUJUAN ....................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... iii

ABSTRAK ........................................................................................................ iv

ABSTRACT ...................................................................................................... v

KATA PENGANTAR ....................................................................................... vi

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................. ix

DAFTAR ISI ...................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 3

1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................. 3

1.4 Hipotesis .............................................................................................. 3

1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Infeksi .................................................................................................. 5

2.2 Konsep Biofilm .................................................................................... 5

2.2.1 Definisi Biofilm ........................................................................... 5

2.2.2 Mekanisme Pembentukan Biofilm ............................................... 6

2.2.3 Komposisi dan Struktur Biofilm .................................................. 7

2.1.4 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Perlekatan Sel-Sel Bakteri

dalam Pembentukan Biofilm ................................................................. 8

2.2.5 Transfer Gen ............................................................................... 9

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.2.6 Quorum Sensing........................................................................... 9

2.2.7 Peran Biofilm Terhadap Mikroba ................................................ 10

2.2.8 Pemeriksaan Biofilm ................................................................... 11

2.2.9 Resistensi Biofilm Terhadap Antibiotik ..................................... 11

2.2.10 Kontrol Biofilm ......................................................................... 12

2.3 Bakteri Uji .......................................................................................... 13

2.3.1 Klasifikasi .................................................................................... 13

2.3.2 Karakteristik ................................................................................. 14

2.3.3 Resistensi Terhadap Antibiotik .................................................... 16

2.3.4 Gambaran Klinik .......................................................................... 17

2.3.5 Epidemiologi ................................................................................ 17

2.3.6 Pencegahan dan Pengobatan ........................................................ 18

2.4 Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L) .............................................. 19

2.4.1 Taksonomi.................................................................................... 19

2.4.2 Morfologi ..................................................................................... 19

2.4.3 Kandungan Kimia ........................................................................ 20

2.4.5 Khasiat dan Kegunaan ................................................................. 21

BAB III METODELOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu ............................................................................... 22

3.2 Alat dan Bahan .................................................................................... 22

3.2.1 Alat ............................................................................................... 22

3.2.1 Bahan ........................................................................................... 22

3.3 Prosedur Penelitian .............................................................................. 23

3.3.1 Identifikasi Belimbing Wuluh...................................................... 23

3.3.2 Karakterisasi Sampel dan Penyiapan Ekstrak Air Belimbing Wuluh

(Averrhoa bilimbi L) ................................................................................. 23

3.3.3 Uji Penapisan Fitokimia ............................................................... 24

3.3.4 Pembuatan Media Pseudomonas Isolation Agar (PIA) Padat dan

Heterotrof (HTR) Cair ............................................................................... 25

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.5 Inokulasi Bakteri Pada Media Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

Padat .......................................................................................................... 26

3.3.6 Karakterisasi Bakteri Pseudomonas aeruginosa ......................... 26

3.3.6 Pembuatan Suspensi Bakteri ........................................................ 26

3.3.7 Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Bakteri Pseduomonas

aeruginosa ................................................................................................. 27

3.3.7 Uji Aktivitas Antibiofilm Secara In Vitro .................................... 27

3.3.8 Analisa Data ................................................................................. 30

3.3.9 Optimasi Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm ........... 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian .................................................................................... 31

4.1.1 Determinasi ................................................................................. 31

4.1.2 Karakterisasi Sampel dan Proses Penyiapan Sampel .................. 31

4.1.3 Uji Penapisan Fitokimia .............................................................. 31

4.1.4 Hasil Karakterisasi Bakteri Pseudomoas aeruginosa .................. 32

4.1.5 Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Pseudomonas

aeruginosa .................................................................................................. 32

4.1.6 Uji Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Belimbing Wuluh terhadap

Biofilm Pseudomonas aeruginosa ............................................................. 33

4.1.7 Optimasi Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm

Pseudomonas aeruginosa .......................................................................... 35

4.2 Pembahasan .......................................................................................... 37

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan .......................................................................................... 46

5.2 Saran ..................................................................................................... 46

DAFTAR PUSTAKA

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Pembentukan Biofilm ..................................................................... 6

Gambar 2.2 Matriks Ekstraseluler Pada P.aeruginosa Dilihat dengan Mikroskop

Elektron .............................................................................................................. 8

Gambar 2.3 Pseudomonas aeruginosa Pada Pewarnaan Gram-negatif .............. 14

Gambar 2.4 Koloni Pseudomonas aeruginosa Pada Agar .................................. 15

Gambar 2.5 Hasil Uji Resistensi Antibiotik ....................................................... 16

Gambar 2.6 Pohon Belimbing Wuluh ............................................................... 19

Gambar 4.1 Koloni Pada Media Agar dan Pewarnaan Gram Bakteri Pseudomonas

aeruginosa ......................................................................................................... 32

Gambar 4.2 Grafik Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Pseudomonas

aeruginosa ......................................................................................................... 33

Gambar 4.3 Grafik Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Belimbing Wuluh Terhadap

Biofilm Pseudomonas aeruginosa ...................................................................... 33

Gambar 4.4 Grafik Contour Plot antara Fase Reduksi vs Suhu, Waktu ............ 36

Gambar 4.5 Grafik Contour Plot antara Fase Reduksi vs Suhu, Konsentrasi ....

............................................................................................................................. 36

Gambar 4.6 Hasil Analisis Optimized Plot ........................................................ 37

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Hasil Uji Penapisan Fitokimia Serbuk Buah Belimbing Wuluh Secara

Kualitatif ............................................................................................................ 31

Tabel 4.2 Hasil Uji Aktivitas Antibiofilm Sari Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa

bilimbi L) Terhadap Biofilm P.aeruginosa ........................................................ 34

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Alur Kerja Penelitian ...................................................................... 54

Lampiran 2 Hasil Determinasi Tanaman Belimbing Wuluh............................... 55

Lampiran 3 Alat dan Bahan Penelitian ............................................................. 56

Lampiran 4 Proses Penyiapan Sampel Belimbing Wuluh ................................ 58

Lampiran 5 Hasil Uji Penapisan Fitokimia ........................................................ 59

Lampiran 6 Proses Pembuatan Media Pseudomonas Isolation Agar (PIA) Padat

dan Media Heterotrof (HTR) Cair....................................................................... 60

Lampiran 7 Proses Inokulasi dan Pewarnaan Gram ......................................... 61

Lampiran 8 Hasil Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Pseudomonas

aeruginosa ......................................................................................................... 62

Lampiran 9 Desain Pengujian Aktivitas Antibiofilm pada Mikroplate .............. 63

Lampiran 10 Lampiran 11 Analisis Data Aktivitas Antibioilm Ekstrak Air

Belimbing Wuluh terhadap Biofilm ................................................................... 64

Lampiran 11 Hasil Rancangan Pengujian Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan

Biofilm Dengan Metode Response Surface Ana;ysis (RSA) ............................. 74

1 UIN Syarif Hidaytaullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Infeksi merupakan salah satu masalah serius dalam bidang

kesehatan yang terus berkembang di Indonesia. Bakteri merupakan salah

satu penyebab penyakit infeksi (Gibson, 1996). Sebagai pertahanan diri,

bakteri membentuk suatu lapisan lendir yang disebut dengan biofilm.

Biofilm merupakan bentuk struktural dari sekumpulan mikroorganisme

yang dilindungi oleh matrik ekstraseluler yang disebut Extracelluler

Polymeric Substance (EPS), dimana EPS merupakan produk yang

dihasilkan sendiri oleh mikroorganisme tersebut dan dapat melindungi dari

pengaruh buruk lingkungan (Prakash et al., 2003).

Biofilm saat ini dianggap sebagai mediator utama infeksi, dengan

perkiraan 80 % kejadian infeksi berkaitan dengan pembentukan biofilm

(Archer et al, 2011). Hal ini disebabkan pembentukan biofilm pada

mikroorganisme dapat meningkatkan toleransi terhadap antimikroba dan

disinfektan, sehingga biofilm berperan besar dalam terjadinya resistensi

dan penyakit kronis. Terapi antibiotik pada umumnya hanya akan

membunuh sel-sel yang bersifat planktonik, sedangkan bentuk bakteri

yang tersusun rapat dalam biofilm akan tetap hidup. Hal ini dikarenakan

antibiotik tidak dapat menembus lapisan biofilm (Mah dan Toole, 2001).

Berkembangnya resistensi oleh mikroorganisme target menjadi

masalah yang terus meningkat . Resistensi mikroba adalah keadaan dimana

mikroorganisme berubah sedemikian rupa sehingga menyebabkan obat-

obat yang dahulu digunakan untuk pengobatan infeksi menjadi tidak

efektif. Beberapa mikroba yang mendapat perhatian saat ini akibat sifat

resistensinya antara lain methicillin-resistant Staphylococcus aureus

(MRSA), vancomycin-resistant Enterococcus (VRE), penicillin-resistant

Streptococcus pneumoniae, multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa

dan masih banyak lagi (Smith, 2004).

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pada penelitian sebelumnya telah dibuktikan bahwa P.aeroginosa

telah resisten terhadap beberapa antibiotik. Dari 25 jenis antibiotik yang

digunakan, lebih dari 50% telah resisten (Rukmono, 2013). P.aeroginosa

merupakan bakteri oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada

mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Bakteri ini

dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, infeksi saluran pernafasan,

dermatitis, infeksi jaringan lunak, infeksi tulang dan sendi, infeksi saluran

pencernaan dan bermacam-macam infeksi sistemik, terutama pada

penderita luka bakar berat, kanker, dan penderita AIDS yang mengalami

penurunan system imun (Todar, 2004).

Kontrol biofilm sejauh ini dilakukan dengan tiga cara, yaitu secara

fisika, kimia dan biologi. Kontrol biofilm secara fisika dapat dilakukan

dengan cara peningkatan suhu. Sedangkan secara kimia dapat dilakukan

dengan penambahan zat kimia contohnya enzim berbasis deterjen.

Selanjutnya kontrol biofilm secara biologi dapat menggunakan

bakteriofage dan interaksi mikrobiologis ( Simoes et al., 2010). Masih

sangat dibutuhkan alternatif lain untuk mengatasi masalah biofilm,

terutama biofilm penyebab infeksi. Penggunaan bahan alam masih

menjadi prioritas utama, karena toksisitas rendah, mudah didapat dan

biaya murah.

Salah satu tanaman yang dapat dimanfaatkan untuk penelitian

biofilm yaitu belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L). Adapun kandungan

dari buah belimbing wuluh diketahui memiliki aktivitas antibakteri adalah

senyawa flavonoid (Hembing, 2008). Tidak menutup kemungkinan

belimbing wuluh juga memiliki aktivitas antibiofilm, karena ekstrak

tanaman yang mengandung flavonoid berpotensi dapat menghambat

intercellular adhesion genes icaA dan icaD yang menjadi salah satu faktor

pembentukan biofilm (Lee et al., 2013). Selain mengandung senyawa

flavonoid, buah belimbing wuluh juga diketahui mengandung senyawa

saponin triterpen (Fahrunnida dan Pratiwi, 2012). Menurut Katzung dalam

Hartini (2012) saponin merupakan senyawa yang memiliki tegangan

permukaan yang kuat yang berperan sebagai antimikroba dengan

3


mengganggu kestabilan membran sel bakteri yang menyebabkan lisis sel.

Hal ini disebabkan karena saponin yang merupakan senyawa semipolar

dapat larut dalam lipid dan air, sehingga senyawa ini akan terkonsentrasi

dalam membrane sel mikroba.

Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa buah belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi L) dapat menghambat pembentukan biofilm

Staphylococcus aureus (Loresta, 2012). Oleh karena itu, penulis tertarik

melakukan penelitian tentang uji antibiofilm sari buah belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi L) terhadap biofilm P.aeroginosa secara in vitro.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah ekstrak air belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) dapat

mencegah pertumbuhan biofilm P.aeroginosa secara in vitro ?


menghambat pertumbuhan biofilm P.aeroginosa secara in vitro ?


mendegradasi biofilm P.aeroginosa secara in vitro ?

Berapakah kondisi yang optimal (suhu, konsentrasi, waktu inkubasi)

pada aktivitas terseleksi ?

1.3 Tujuan Penelitian

Menguji aktivitas antibiofilm ekstrak air belimbing wuluh (Averrhoa

bilimbi L) dalam mencegah pertumbuhan biofilm P.aeroginosa secara

in vitro.


bilimbi L) dalam menghambat pertumbuhan biofilm P.aeroginosa

secara in vitro.


bilimbi L) dalam mendegradasi biofilm P.aeroginosa secara in vitro.

Mengetahui kondisi yang optimal (suhu, konsentrasi, waktu inkubasi)

pada aktivitas terseleksi.

4


1.4 Hipotesis

Ekstrak air belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) dapat mencegah

pertumbuhan biofilm P.aeroginosa secara in vitro.

Ekstrak air belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) dapat menghambat

pertumbuhan biofilm P.aeroginosa secara in vitro.

Ekstrak air belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) dapat

menghancurkan biofilm P.aeroginosa secara in vitro.

Kondisi optimal pada aktivitas terseleksi terletak pada level maksimal

dari ketiga faktor (suhu, konsentrasi, waktu inkubasi).

1.5 Manfaat Penelitian

Menjadi alernatif sebagai bahan alam yang memiliki aktivitas sebagai

antibiofilm terhadap pertumbuhan biofilm bakteri P.aeruginosa.

Menambah wawasan dan pengetahuan penulis dalam bidang

eksperimen tentang pemanfaatan sari buah belimbing wuluh (Averrhoa

bilimbi L) sebagai antibiofilm bakteri P.aeroginosa secara in vitro.

Menjadi referensi untuk mahasiswa farmasi di UIN Syarif Hidayatullah

khususnya yang ingin melakukan penelitian tentang aktivitas

antibiofilm dari tanaman lain atau bahan lain.

5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Infeksi

Infeksi merupakan salah satu masalah serius dalam bidang

kesehatan yang terus berkembang di Indonesia. Infeksi dapat disebabkan

oleh berbagai mikroorganisme seperti bakteri, virus, jamur dan protozoa

(Gibson, 1996). Penyakit yang disebabkan infeksi merupakan hasil

interaksi antara mikroorganisme dan sistem imun tubuh. Hasil interaksi ini

sangat bervariasi mulai dari tidak menimbulkan efek sama sekali sampai

dengan kematian. Hal tersebut tergantung jumlah dan virulensi

mikroorganisme, efek fisiologi dan anatomi yang terpengaruh, dan

efektivitas sistem imun tubuh (Todd et al., 2007).

Infeksi mikroba dapat dikontrol oleh antimikroba. Antimikroba

adalah obat yang digunakan untuk memberantas infeksi mikroba pada

manusia (Munaf, 1994). Namun, efektivitas antimikroba saat ini menurun

akibat resisten banyak obat (Donlan, 2003). Resistensi mikroba adalah

keadaan dimana mikroorganisme berubah sedemikian rupa sehingga

menyebabkan obat-obat yang dahulu digunakan untuk pengobatan infeksi

menjadi tidak efektif. Resistensi antibiotik terhadap mikroba menimbulkan

beberapa konsekuensi yang fatal. Penyakit infeksi yang disebabkan oleh

bakteri yang gagal berespon terhadap pengobatan mengakibatkan

perpanjangan penyakit, meningkatnya resiko kematian dan semakin

lamanya masa rawat inap di rumah sakit (Deshpande et al., 2011).

2.2 Biofilm

2.2.1 Definisi Biofilm

Biofilm merupakan bentuk struktural dari sekumpulan

mikroorganisme yang dilindungi oleh matrik ekstraseluler yang disebut

Extracelluler Polymeric Substance (EPS), dimana EPS merupakan produk

yang dihasilkan sendiri oleh mikroorganisme tersebut dan dapat

melindungi dari pengaruh buruk lingkungan (Prakash et al., 2003). Bakteri

6


di dalam biofilm mampu bertahan terhadap antibiotik, desinfektan, bahkan

mampu tahan terhadap sistem immunitas hospesnya. Di dalam lapisan

biofilm, mikroba cenderung tumbuh dan berkembang dengan pesat hingga

membentuk koloni terutama pada permukaan bahan yang lembab dan kaya

akan nutrisi (Tarver, 2009).

2.2.2 Mekanisme Pembentukan Biofilm

Gambar 2.1. Pembentukan biofilm (Kokare, 2009)

Habitat alami mikroorganisme terdiri dari dua, yaitu planktonic

(bebas) dan sesil (diam). Proses pembentukan biofilm terdiri dari lima

tahap. Pada tahap pertama, sel-sel bakteri yang hidup bebas (sel

planktonik) saling menempel pada permukaan (Prakash et al., 2003). Pada

tahap ini, proses perlekatan sel masih bersifat sementara, namun pada

tahap ini sel-sel bakteri telah menempel secara permanen akibat

terbentuknya material eksopolimer yang merupakan suatu senyawa perekat

yang lebih kuat.

Pada tahap ketiga yang disebut maturasi I ditandai dengan

terbentuknya mikrokoloni dan biofilm mulai terbentuk. Sementara pada

tahap keempat atau maturasi II, biofilm yang terbentuk semakin banyak

dan membentuk struktur tiga dimensi yang mengandung sel-sel

terselubung dalam beberapa kelompok yang saling terhubung satu sama

7


lainnya. Pada tahap terakhir, perkembangan struktur biofilm

mengakibatkan terjadinya dispersi sel sehingga sel-sel tersebut berpindah

dan membentuk biofilm yang baru. Sel-sel biofilm menggunakan sebagian

besar energi untuk membentuk eksopolisakarida yang dibutuhkan sel

sebagai nutrisi (Watnick and Kolter, 2000).

Pembentukan biofilm juga tergantung dari konsentrasi nutrisi yang

tersedia dan diatur oleh suatu zat kimia komplek yang dikeluarkan oleh sel

sebagai komunikasi antar sel. Sebagai contoh, ketika hidup bebas,

P.aeruginosa menghasilkan molekul signal dalam kadar yang rendah.

Tetapi ketika P.aeruginosa membentuk biofilm, maka konsentrasi molekul

signal akan meningkat dan menimbulkan perubahan aktifitas dari gen-gen,

salah satunya adalah gen yang mengatur sintesis dari alginat untuk

pembentukan matriks ekstraseluler (Donlan, 2002).

2.2.3 Komposisi dan Struktur Biofilm

Komponen utama biofilm terdiri dari sel-sel mikroorganisme

(15%) dan bahan matriks yang terdiri dari campuran komponen seperti

protein, asam nukleat, karbohidrat dan zat lainnya(85%). Eksopolisakarida

yang dihasilkan berbeda-beda komposisi dan sifat kimiawinya. Beberapa

merupakan makromolekul yang bersifat netral. Mayoritas bermuatan

karena adanya asam uronat, asam D-galakturonat, dan asam D-manuroniat

(Davey, 2000).

Ikatan eksopolisakarida pada biofilm bersifat kaku. Jumlah

eksopolisakarida yang dihasilkan oleh organisme berbeda-beda. Jumlah

eksopolisakarida akan meningkat seiring dengan bertambahnya usia

biofilm tersebut. Eksopolisakarida yang dihasilkan tergantung dari

kandungan nutrisi dan media pertumbuhan. Kekurangan nitrogen,

potassium dan fosfat juga dapat meningkatkan sintesis eksopolisakarida

(Donlan, 2002).

Biofilm adalah polimorfik dan dapat menyesuaikan struktur

terhadap perubahan jumlah nutrisi, yang telah ditunjukkan oleh percobaan

dengan konsentrasi glukosa yang berbeda. Ketika konsentrasi glukosa

8


tinggi, mikrokoloni tumbuh dengan cepat dan akibatnya ketebalan biofilm

meningkat secara signifikan. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan

bahwa perubahan struktur biofilm tergantung pada aliran.Pada aliran

laminar mikrokoloni bakteri menjadi bulat, dan dalam aliran turbulen

mereka berbentuk panjang ke arah hilir (Stoodley et al., 1998).

Gambar 2.2. Matriks ekstraseluler pada P.aeruginosa dilihat dengan mikroskop

elektron (Donlan, 2002).

2.2.4Faktor-faktor yang Mempengaruhi Perlekatan Sel-Sel Bakteri

dalam Pembentukan Biofilm (Costerton dan Stewart, 2001)

Efek substratum (permukaan)

Perlekatan terjadi lebih baik pada permukaan yang kasar, karena

akan menurunkan kekuatan aliran yang dapat melepaskan biofilm, dan

permukaan yang kasar mempunyai luas permukaan yang lebih besar. Hal

lain adalah mikroorganisme lebih baik melekat pada permukaan yang

hidrofobik seperti teflon dan plastik dibandingkan gelas atu logam.

Kondisi film

Permukaan yang terpapar oleh media cair akan segera ditutupi oleh

polimer-polimer dari medium dan menimbulkan modifikasi kimiawi yang

akan mempengaruhi pertumbuhan dan perluasan dari perlekatan

9


mikroorganisme pada permukaan tersebut. Contohnya yang terjadi pada

enamel gigi yang dilapisi oleh proteinaceous film yang disebut “acquired

pellicle” dimana sel-sel bakteri akan melekat pada enamel dalam beberapa

jam paparan.

Hidrodinamik

Semakin cepat aliran cairan yang terjadi maka semakin

mempercepat perlekatan sel pada permukaan karena sel-sel akan

bertubulensi dan berputar. Hal ini terbatas sampai kecepatan tidak

melepaskan perlekatan sel-sel dari permukaan.

Karakteristik media cairan

Seperti pH, suhu, jumlah zat gizi, kation dan adanya antimikroba

akan mempengaruhi perlekatan.

Keadaan permukaan sel bakteri

Permukaan sel yang hidrofobik, adanya fimbriae, flagel dan

polisakarida atau protein pada permukaan sel bakteri akan mempermudah

perlekatan, terutama bila terjadi kompetisi dalam suatu kumpulan

mikroorganisme.

2.2.5 Transfer Gen

Biofilm ternyata merupakan tempat yang ideal bagi pertukaran

DNA ekstrakromosal (plasmid). Tingkat konyugasi dalam biofilm lebih

tinggi dibandingkan pada sel-sel yang bebas. Konyugasi ini diperlukan

dalam pembentukan biofilm, Pilus konyugatif F (dikode oleh operontra

pada plasmid) berperan sebagai faktor adesi pada permukaan antar sel,

sehingga membentuk biofilm tiga dimensi pada E.coli. Karena plasmid

juga dapat membawa gen yang mengatur resistensi terhadap antibiotika

maka biofilm juga berperan dalam penyebaran resistensi bakteri terhadap

antibiotika.

2.2.6 Quorum Sensing

Quorum sensing merupakan suatu proses yang memungkinkan

bakteri dapat berkomunikasi dengan mensekresikan molekul sinyal yang

10


disebut autoinduser atau molekul sinyal seperti bahasa. Proses ini

memungkinkan suatu populasi bakteri dapat mengatur ekspresi gen

tertentu. Konsentrasi autoinduser di lingkungan sebanding dengan jumlah

bakteri yang ada. Dengan mendeteksi autoinduser, suatu bakteri mampu

mengetahui keberadaan bakteri lain di lingkungannya.

Molekul sinyal juga memperlihatkan peranannya dalam

pembentukan biofilm. Sebagai contoh adalah homoserin lakton yang

merupakan sinyal utama yang terdapat pada P. aeruginosa (Donlan, 2001).

2.2.7 Peran Biofilm terhadap Mikroba

Peran biofilm terhadap mikroba adalah sebagai berikut :

Perlindungan

Bakteri mengeluarkan zat ekstra-polimer yang sangat penting yang

dikenal sebagai eksopolisakarida. Matriks ini melindungi bakteri dari

lingkungan eksternal seperti radiasi UV, pergeseran pH, suhu, gerakan

osmotik, dan pengeringan tanpa mempengaruhi pasokan nutrisinya

(Nichols et al.,1988).

Nutrisi

Kegiatan metabolisme bakteri dalam biofilm berbeda dengan sel-

sel planktonik. Didalam biofilm, bakteri memiliki akses terbatas terhadap

nutrisi dan memiliki pasokan oksigen yang rendah. Mereka berkomunikasi

satu sama lain dengan saluran selular dan sinyal lingkungan (Decho ,1990;

Flemming ,1993).

Variasi genetik

Munculnya bakteri resisten menjadi perhatian besar karena

penggunaan yang luas antibiotik rekayasa genetika mikroorganisme dan

sebagainya. Bakteri yang berada di dalam biofilm akan berkonjugasi dan

kemungkinan akan terjadi transfer gen di antara populasi (Scink B,1997).

11


2.2.8 Pemeriksaan Biofilm

Pemeriksaan biofilm :

Mikroskop elektron dapat memeriksa biofilm pada alat-alat medik dan

pada infeksi manusia. Pada awalnya, mikroskop elektron ini merupakan

alat yang penting dalam mempelajari biofilm.

Concofocal Laser Scanning Microscope (CLSM) dengan fluoresen

antisera dan fluoresen in situ hibridisasi, sehingga organisme yang

spesifik dan untuk mengidentifikasi dalam komunitas campuran kuman.

2.2.9 Resistensi Biofilm terhadap Antibiotik (Lewis, 2001; Stewart dan

Costeron, 2001; Mah dan Toole, 2001)

Struktur dan fisiologik dasar dari biofilm membuat biofilm secara

alami resisten terhadap agen antimikroba seperti antibiotik, desinfektan,

dan germisida. Hal ini dapat dilihat dari adanya perbedaan yang besar

dalam hal kepekaan terhadap antibiotik pada sel biofilm dan

planktoniknya. Faktor-faktor yang diperkirakan bertanggung jawab

terhadap resistensi biofilm adalah :

Penurunan penetrasi dari antimikroba

Biofilm terbungkus dalam matriks eksopolimer yang dapat

menghambat difusi dari substansi dan mengikat antibiotik.

Penurunan tingkat pertumbuhan organisme dalam biofilm

Antimikroba lebih efektif dalam membunuh sel-sel yang tumbuh

dengan cepat. Beberapa antibiotik memerlukan secara mutlak sel-sel yang

tumbuh dalam mekanisme penghambatannya.

Ekspresi dari gen resistensi yang spesifik dari biofilm

Hal ini dapat terlihat pada resistensi biofilm bakteri P.aeruginosa,

dimana MDR (Multi Drug Resistan) memainkan peranan penting pada

konsentrasi antibiotik yang rendah. Beta-galaktosidase berperan dalam

respon P.aeruginosa terhadap imipenem dan pipeacilin.

Faktor-faktor resistensi diatas dapat berdiri sendiri atau dapat

merupakan gabungan dari semua faktor yang ada. Beberapa eksperimen

memperlihatkan adanya fraksi kecil sel persister yang lebih banyak lagi

12


daripada populasi sel planktonik. Persister ini biasanya dihancurkan oleh

sistem imun, dan menjadi masalah saat sistem imun tidak berfungsi.

Infeksi biofilm lebih kurang sama dengan infeksi sel planktonik tanpa

kehadiran sistem imun, eksopolimer dari biofilm melindungi sel dari

komponen sistem imun.

Pada awal aplikasi antibiotik yang bersifat bakterisidal akan terjadi

eradikasi hampir semua populasi, meninggalkan sedikit fraksi persister

yang bertahan. Jika konsentrasi antibiotik turun atau terapi dihentikan saat

gejala penyakit sudah hilang, maka persister akan membentuk biofilm

kembali. Dinamika ini menjelaskan adanya relaps pada infeksi biofilm dan

perlunya terapi yang lebih lama.

2.2.10 Kontrol biofilm

Kontrol biofilm dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut :

Fisika

Yaitu memanfaatkan suhu yang tinggi atau pemanasan. Sanitasi

dengan menggunakan air panas lebih menguntungkan karena air panas

mudah tersedia dan tidak beracun. Peralatan kecil seperti pisau, serta

bagian-bagian alat pengolahan pangan dapat direndam dalam air yang

dipanaskan suhu 80-1000C (Silitonga et al., 2012).

Kimia

Kontrol biofilm dilakukan dengan cara penambahan suatu zat

kimia. Sanitasi kimia dilakukan dengan menggunakan desinfektan. Tujuan

penggunaan desinfektan ialah untuk mereduksi jumlah mikroorganisme

patogen. Salah satu contoh adalah dengan penambahan suatu enzim

berbasis deterjen yang dikenal dengan bio-cleaners yang identik dengan

bahan kimia ramah lingkungan dan dapat digunakan untuk produk pangan.

Contoh lain desinfektan yang dapat digunakan untuk mengendalikan

biofilm adalah klorin (Augustin et al., 2004).

13


Biologi

Yaitu dengan menggunakan bakteriofaga. Pada dasarnya

bakteriofaga merupakan virus yang menginfeksi bakteri melalui jalur yang

spesifik serta bersifat non-toksik terhadap manusia, sehingga memiliki

potensi yang baik untuk dikembangkan sebagai bahan pengendali biofilm

mikroba pada produk pangan (Kudva et al., 1999).

Selain itu, kontrol biofilm juga dapat dilakukan dengan adanya

interaksi mikrobiologis. Banyak bakteri yang mampu mensintesis dan

mensekresikan biosurfaktan dengan sifat anti lekat yang kuat (Desai and

Banat, 1997; Rodriguez et al., 2004; Nitschke and Costa, 2007). Surfaktan

yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis mampu meluruhkan biofilm tanpa

mengganggu pertumbuhan sel serta mampu mencegah pembentukan

biofilm baru oleh Salmonella enterica, E. coli dan Proteus mirabilis

(Mireles et al., 2001)

2.3 Bakteri Uji (P.aeruginosa)

2.3.1 Klasifikasi

P.aeruginosa termasuk famili Pseudomonadaceae. P.aeruginosa

adalah patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada

mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Bakteri ini

dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, infeksi saluran pernafasan,

dermatitis, infeksi jaringan lunak, bakteremia, infeksi tulang dan sendi,

infeksi saluran pencernaan dan bermacam-macam infeksi sistemik,

terutama pada penderita luka bakar berat, kanker, dan penderita AIDS

yang mengalami penurunan sistem imun (Todar, 2004). P.aeruginosa

menyebabkan kontaminasi pada perlengkapan anestesi dan terapi

pernafasan, cairan intravena, bahkan air hasil proses penyulingan.

Endoskopi, termasuk bronkoskopi adalah alat-alat medik yang paling

sering dihubungkan dengan berjangkitnya infeksi nosokomial. (Todar,

2004; Srinivasa et al.,2003).

14


2.3.2 Karakteristik

P.aeruginosa adalah bakteri Gram-negatif berbentuk batang lurus

atau lengkung,berukuran sekitar 0,6 x 2 µm. Dapat ditemukan satu-satu,

berpasangan, dan kadang-kadang membentuk rantai pendek, tidak

mempunyai selubung (sheath), serta mempunyai flagel monotrika (flagel

tunggal pada kutub) sehingga selalu bergerak (Jawetzet al., 2001; Madigan

et al., 2003).

Gambar2.3.Pseudomonas aeruginosa pada pewarnaan Gram-negatif

(Todar,2004)

P.aeruginosa adalah aerob obligat yang tumbuh dengan mudah

pada banyak jenis pembiakan, karena memiliki kebutuhan nutrisi yang

sangat sederhana. Di laboratorium, medium paling sederhana untuk

pertumbuhannya terdiri dari asetat (untuk karbon) dan ammonium sulfat

(untuk nitrogen). Metabolisme bersifat respiratorik tetapi dapat tumbuh

tanpa O2 bila tersedia NO3 sebagai akseptor elektron. Kadang-kadang

berbau manis atau menyerupai anggur yang dihasilkan aminoasetofenon

(Todar, 2004; Jawetzet al., 2001).

P.aeruginosa tumbuh dengan baik pada suhu 37-420C.

Pertumbuhannya pada suhu 420C membantu membedakannya dari spesies

pseudomonas lain (Balows et al.,1991). P.aeruginosa dalam biakan dapat

menghasilkan berbagai jenis koloni sehingga memberi kesan biakan dari

campuran berbagai spesies bakteri. Tiap jenis koloni dapat mempunyai

15


aktivitas biokimia dan enzimatik berbeda serta pola kepekaan antimikroba

yang berbeda pula. Isolat dari tanah atau air mempunyai ciri koloni yang

kecil dan tidak rata. Pembiakan dari spesimen klinik biasanya

menghasilkan satu atau dua tipe koloni yang halus :

Koloni besar dan halus dengan permukaan rata dan meninggi

Koloni halus dan mukoid sebagai hasil produksi berlebihan dari

alginat.

Gambar 2.4. Koloni P.aeruginosa pada agar (Todar, 2004)

Alginat adalah suatu eksopolisakarida yang merupakan polimer

dari glucuronic acid dan mannuronic acid, berbentuk gel kental

disekeliling bakteri. Alginat memungkinkan bakteri-bakteri untuk

membentuk biofilm, yaitu kumpulan koloni sel-sel mikroba yang

menempel pada suatu permukaan misalnya kateter intravena, atau jaringan

paru. Alginat dapat melindungi bakteri dari pertahanan tubuh inang seperti

limfosit, fagosit, silia di saluran pernafasan, antibodi, dan komplemen.

P.aeruginosa membentuk biofilm untuk mambantu kelangsungan

hidupnya saat membentuk koloni pada paru-paru manusia (Todar, 2004;

Madigan et al.,2003; Salyers, 1994).

16


2.3.3 Resistensi terhadap Antibiotik

Gambar 2.5. Hasil uji resistensi antibiotic (Sumber : Rukmono, 2013)

Pada penelitian sebelumnya telah dibuktikan bahwa P.aeroginosa

telah resisten terhadap beberapa antibiotik. Jumlah antibiotik yang

digunakan 25 jenis. Gambar 2.5 memperlihatkan 14 jenis antibiotik

(nomor urut 1−14) didapatkan >50% spesimen telah resisten. Antibiotik

yang paling resisten adalah ampisilin, eritromisin, amoksisilin, sefurosim,

seftriason, gentamicin,tetrasiklin, sefadroksil, piperasilin, trimetroprim,

tobramisin, kotrimoksazol, nalidisid, sulfonamide kompleks.

Sementara 11 jenis antibiotik sebagian besar (<50%) masih sensitif

yaitu dari urutan kloramfenikol sampai meropenem. Adapun untuk

golongan sefalosforin, sebagian besar spesimen masih sensitif mulai dari

antibiotik yang paling sensitif, berturut-turut adalah meropenem,

klindamisin, amikasin, norfloksasin, siprofloksasin, ofloksasin, fosfomisin,

seftazidim, netilmisin, dan kanamisin (Rukmono, 2013).

17


2.3.4 Gambaran Klinik

P.aeruginosa menimbulkan infeksi pada luka dan luka bakar

tingkat II dan III dengan nanah hijau kebiruan disebabkan pigmen

piosianin, meningitis bila masuk lewat punksi lumbal, dan infeksi saluran

kemih bila masuk bersama kateter dan instrument lain atau dalam larutan

untuk irigasi. Keterlibatan saluran pernafasan, terutama dari respirator

yang terkontaminasi, menyebabkan pneumonia yang disertai nekrosis.

Bakteri ini sering ditemukan pada perenang dengan otitis eksterna ringan,

serta dapat menyebabkan otitis eksterna invasif (maligna) pada penderita

diabetes. Infeksi mata yang dengan cepat mengakibatkan kerusakan mata,

sering terjadi setelah cedera atau pembedahan. Pada bayi atau orang yang

lemah dapat menyerang aliran darah dan mengakibatkan sepsis yang fatal,

biasanya terjadi pada penderita leukemia atau limfoma yang mendapat

obat antineoplastik atau terapi radiasi, dan pada penderita dengan luka

bakar berat (Jawetz et al.,2001; Tortora et al.,2004).

Pada sebagian besar infeksi, gejala dan tanda-tandanya tidak

spesifik dan berkaitan dengan organ yang terlibat. Terkadang, verdoglobin

(suatu produk pemecah hemoglobin) atau pigmen yang berfluorosen dapat

dideteksi pada luka, luka bakar, atau urin dengan penyinaran fluorosen

ultraviolet. Nekrosis hemoragik pada kulit sering terjadi pada sepsis akibat

P.aeruginosa. Lesi yang disebut ektima gangrenosum ini dikelilingi oleh

eritema dan sering tidak berisi nanah. P.aeruginosa dapat dilihat pada

spesimen dari lesi ektima yang diberi pewarnaan Gram, dan biakannya

positif. Ektima gangrenosum tidak lazim pada bakteremia akibat

organisme lain (Jawetz et al.,2001).

2.3.5 Epidemiologi

P.aeruinosa terdapat di tanah dan air, dan pada 10% orang

merupakan flora normal di kolon. Dapat dijumpai pada daerah lembab

dikulit dan dapat membentuk koloni pada saluran pernafasan bagian atas

pasien-pasien rumah sakit (Jawetz, 2001). P.aeruginosa dapat dijumpai di

18


banyak tempat di rumah sakit. Disinfektan, alat bantu pernafasan,

makanan, saluran pembuangan air, dan kain pel merupakan beberapa

contoh reservoir.

Suatu penelitian di unit perawatan intensif neonates menyatakan

bahawa P.aeruginosa paling sering membentuk koloni disaluran

pernafasan dan saluran pencernaan. Hal ini terutama dijumpai pada bayi

prematur oleh karena pH lambung sering tinggi sehingga mendukung

pertumbuhan bakteri. Penyebaran terjadi dari pasien ke pasien lewat

tangan karyawan rumah sakit, melalui kontak langsung dengan reservoir,

atau lewat pencernaan makanan dan minuman yang telah terkontaminasi

(Todar, 2004; Foca et al.,2000).

P.aeruginosa menyebabkan kontaminasi pada perlengkapan

anastesi dan terapi pernafasan, cairan intravena, bahkan air hasil proses

penyulingan. Karena merupakan patogen nosokomial, maka metode untuk

mengendalikan infeksi ini mirip dengan metode untuk nosokomial lainnya

(Jawetz et al.,2001; Fiorillo et al.,2001).

2.3.6 Pencegahan dan Pengobatan

Pencegahan meliputi eliminasi sumber-sumber potensial bakteri

dan perawatan segera terhadap luka. Pembuangan secara hati-hati jaringan

mati pada penderita luka bakar, diikuti dengan penggunaan krim

antibakteri. Infeksi yang telah terbentuk sulit untuk diobati karena

P.aeruginosa sering resisten terhadap banyak antibiotik. Karena angka

keberhasilan suatu pengobatan cukup rendah, dan bakteri cepat

membentuk resistensi bila digunakan hanya satu jenis antimikroba, maka

pengobatan sebaiknya secara kombinasi (Jawetz et al.,2001; Balows et

al.,1991; Nester et al., 2004).

19


2.4 Belimbing wuluh (Avverhoa bilimbi L)

Gambar 2.6. Pohon belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L)

(Sumber : koleksi pribadi)

2.4.1 Taksonomi

Klasifikasi ilmiah tanaman belimbing wuluh adalah:

Kingdom : Plantae,

Subkingdom : Tracheobionta,

Superdivisio : Spermatophyta,

Divisio : Magnoliophyta,

Kelas : Magnoliopsida,

Sub-kelas : Rosidae,

Ordo : Geraniales,

Familia : Oxalidaceae,

Genus : Averrhoa,

Spesies : Averrhoa bilimbi L

2.4.2Morfologi

Belimbing wuluh disebut juga sebagai belimbing sayur yang

merupakan tumbuhan yang hidup pada ketinggian 5 hingga 500 meter

diatas permukaan laut. Ditanam sebagai pohon buah, kadang tumbuh liar.

Pohon belimbing bisa tumbuh dengan ketinggian mencapai 5-10 meter.

Batang utamanya pendek dan cabangnya rendah, batangnya bergelombang

20


(tidak rata). Daunnya majemuk, berselang-seling, panjang 30-60 cm dan

berkelompok di ujung cabang. Pada setiap daun terdapat 11 sampai 37

anak daun yang berselang-seling atau setengan berpasangan. Anak daun

berbentuk oval (Nugrahawati et al., 2009).

Buahnya memiliki rasa asam sering digunakan sebagai bumbu

masakan dan campuran ramuan jamu. Bunganya kecil, muncul langsung

dari batang dengan tangkai bunga berambut. Buah belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi L) berbentuk elips hingga seperti torpedo, dengan

panjang 4-10 cm. warna buah ketika muda hijau, dengan sisa kelopak

bunga menempel diujungnya. Jika masak buahnya berwarna kuning atau

kuning pucat. Daging buahnya berair dan sangat asam. Kulit buah berkilap

dan tipis. Bijinya kecil (6 mm), berbentuk pipih, dan berwarna coklat, serta

tertutup lendir (Nugrahawati et al., 2009).

2.4.3 Kandungan Kimia

Buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) mengandung banyak

vitamin C alami yang berguna sebagai penambah daya tahan tubuh dan

perlindungan terhadap sebagai penyakit. Belimbing wuluh mempunyai

kandungan unsur kimia yang disebut asam oksalat dan kalium.Hasil

pemeriksaan kandungan kimia buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L)

mengandung golongan senyawa oksalat, minyak menguap, fenol,

flavonoid, dan pektin (Parkesit dan Mario, 2009).

Ekstrak etanol dari buah belimbing menunjukkan uji positif pada

pengujian flavanoid dan terpenoid. Dari penelitian senyawa flavonoid

bersifat aktif sebagai antimikroba. Senyawa flavonoid merupakan salah

satu antimikroba yang bekerja dengan menganggu fungsi membran

sitoplasma (Samad, 2008; Parikesit, 2011). Ekstrak tanaman yang

mengandung flavonoid berpotensi dapat menghambat intercellular

adhesion genes icaA dan icaD yang menjadi salah satu faktor

pembentukan biofilm (Lee et al., 2013). Selain mengandung senyawa yang

telah disebutkan, buah belimbing wuluh juga diketahui mengandung

senyawa saponin triterpen (Fahrunnida dan Pratiwi, 2012). Menurut

21


Katzung dalam Hartini (2012) saponin merupakan senyawa yang memiliki

tegangan permukaan yang kuat yang berperan sebagai antimikroba dengan

mengganggu kestabilan membran sel bakteri yang menyebabkan lisis sel.

Hal ini disebabkan karena saponin yang merupakan senyawa semipolar

dapat larut dalam lipid dan air, sehingga senyawa ini akan terkonsentrasi

dalam membrane sel mikroba.

Kandungan gizi buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) per

100 gram adalah energi (23 kcal), protein (0.7 g), lemak (0.2 g),

karbohidrat (4.5 g), serat kasar (1.5 g), abu (0.3 g), kalsium (8 mg), fosfor

(11 mg), besi (0.4 mg), beta karoten (100ug), vitamin A (17ug), Thiamin

(0.01 mg), riboflavin (0.03 mg), niacin (0.3mg), vitamin C (18mg), kadar

air (94.3g) (Parkesit dan Mario, 2009).

2.4.4 Khasiat dan Kegunaan

Di kalangan masyarakat belimbing wuluh ternyata sangat popular,

bahkan melebihi belimbing manis. Perasan air buah belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi L) sangat baik untuk asupan kekurangan vitamin C.

banyak hasil penelitian yang menyebutkan potensi suatu tanaman dalam

mengobati penyakit tertentu ataupun sebagai antibakteri. Akan tetapi,

penggunaan bahan antimikroba kimia, di lingkungan masyarakat dalam

produk pangan lebih popular. Hal ini dikarenakan kegunannya sebagai

pengawet lebih efektif dan biayanya relatif murah (Parkesit, Mario 2009).

Ada yang memanfaatkan buah belimbing wuluh sebagai obat untuk

sariawan, sakit perut, gondongan, rematik, batuk rejan, gusi berdarah, sakit

gigi berlubang, memperbaiki fungsi pencernaan, untuk membersihkan

noda pada kain, menghilangkan bau amis, sebagai bahan kosmetik serta

mengkilapkan barang-barang yang terbuat dari kuningan (Parkesit, Mario

2009).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Penelitian dilaksanakan di Laboraturium Genetika dan Mikrobiologi

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong dan Laboratorium

PDR (Phamacy Drugs and Research Development) Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Waktu pelaksanaan penelitian 1-2 bulan dan dimulai pada bulan Maret

sampai dengan April 2015.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender

(Miyako), pisau , kain lap, kertas saring, cawan penguap, erlenmeyer

(Pyrex) , spatula, corong, cawan petri, jarum ose, bunsen, gelas ukur

(Pyrex), tabung reaksi (Pyrex), pipet tetes, rak, pipet mikro (Pipette Gilson)

, incubator (Sanyo MR 162), timbangan analitik (AND GF-02), autoklaf

(Hirayama), microwave (Sanyo), freezedryer, Laminar Air Flow (LAF),

vortex (Barnstead), microtitterplate flat-buttom polystyrene 96 well, iMark-

Biorad Microplate Reader.

3.2.2 Bahan Penelitian

Bahan uji : buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) yang

diperoleh dari kelurahan Cirendeu, Ciputat timur

RT 04 RW 09 Ciputat, Kota Tangerang Selatan,

Banten pada tanggal 8 Maret 2015.

Bakteri uji : kultur P.aeruginosa yang merupakan koleksi dari

Laboratorium Mikrobiologi Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong yang

diisolasi dari alat dispenser (Panasonic).

23


Bahan kimia : Amoniak 1%, larutan HCl, kloroform, pereaksi

Dragendroff, pereaksi Mayer, serbuk Mg, larutan

NaOH, FeCl3, eter, asam asetat, etanol 96%,

butanol, formaldehid 30%, natrium asetat,

petroleum eter, kristal violet 1 %, safranin, lugol,

NaCl fisiologis, aquades.

Bahan lainnya :Media Heterotrof (pepton, tripton, NaCl, K2HPO4,

glukosa), dan media Pseudomonas Isolation agar

(PIA) (komposisi : pepton, irgasan, cloruro di

magnesio, solfato di pottasio, agar), Biorem 1

(alkaline detergent) dan Biorem 10 (enzyme

cocktail).

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Identifikasi Belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L)

Dilakukan determinasi terhadap belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi

L) di Herbarium Bogoriense Lembaga Ilmu Pengethauan Indonesia-Kebun

Raya Bogor. Tujuannya adalah untuk memastikan klasifikasi dari tanaman

yang kita gunakan dalam penelitian.

3.3.2 Karakterisasi Sampel dan Penyiapan Ekstrak air Belimbing

wuluh (Averrhoa bilimbi L) (Prayogo et al., 2011)

1 kg buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) segar dicuci

terlebih dahulu sampai bersih kemudian diukur rerata panjang dan diameter

buahnya dan kemudian dipotong kecil-kecil, selanjutnya, potongan

belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) diblender sampai benar-benar

hancur. Hasil jus kemudian disaring dengan menggunakan kain lap bersih

dan kertas saring Whatman no.1. Hasil saringan sebanyak 50 ml ditampung

ke dalam erlenmeyer, kemudian diuapkan dengan alat freezedryer selama 27

jam untuk mendapatkan simplisia dari buah belimbing wuluh.

24


Tahap selanjutnya dilakukan menyiapkan larutan sari buah

belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) dengan berbagai seri konsentrasi.

Konsentrasi larutan ekstrak air belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) yang

digunakan pada penelitian ini adalah 0,5%, 1%, 2%, 4% dan 8%.

3.3.3 Uji Penapisan Fitokimia (Fransworth, 1966)

Penapisan fitokimia dilakukan pada serbuk buah belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi L). Tujuan dilakukan uji penapisan fitokimia adalah

untuk mengetahui kandungan apa saja yang terkandung di dalam buah

belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L).

Identifikasi Golongan Alkaloid

Metode yang pertama adalah dengan menggunakan plat KLT dan

reagen Dragendorff. Teteskan reagen Dragendorff pada sampel diatas plat

KLT. Bila terdapat noda naik dan berwarna merah atau oranye maka positif

mengandung alkaloid.

Identifikasi Golongan Flavonoid

1 gram sampel yang telah ditambahkan air sebanyak 5 ml dalam

tabung reaksi ditambahkan serbuk atau lempeng magnesium secukupnya

dan 1 mL HCl pekat, serta 5 mL anilin alkohol, dikocok dengan kuat lalu

dibiarkan hingga memisah. Jika terbentuk warna pada lapisan anilin alkohol

(lapisan atas) maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan

flavonoid.

Identifikasi Golongan Saponin

Sebanyak 1 gram serbuk dan tambahkan aquades 5 ml dalam

tabung reaksi dan dikocok secara vertikal selama 10 detik, kemudian

dibiarkan selama 10 menit. Jika dalam tabung reaksi terbentuk busa yang

stabil dan jika ditambahkan 1 tetes HCl 1% busa tetap stabil maka hal itu

menunjukkan adanya senyawa golongan saponin.

Identifikasi Golongan Steroid dan Triterpenoid

25


Serbuk secukupnya dimasukan dalam tabung reaksi dan dikocok

dengan sedikit eter. Lapisan eter diambil lalu diteteskan pada 2 lubang plat

tetes dan dibiarkan sampai mengering. Setelah mengering, ditambahkan 2

tetes asam asetat anhidrat dan satu tetes asam sulfat pekat.Apabila terbentuk

warna orange, merah atau kuning berarti positif triterpenoid.Tetapi apabila

terbentuk warna hijau berarti positif steroid.

Identifikasi Golongan Fenolik

Serbuk secukupnya dikocok dengan sedikit eter dalam tabung reaksi,

lalu lapisan eter diteteskan pada plat tetes.Lapisan eter kemudian

dikeringkan.Setelah mengering, diteteskan larutan FeCl3.Apabila terbentuk

warna ungu atau biru berarti positif fenolik.

Identifikasi Golongan Kuinon

Serbuk secukupnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 1 N. Apabila terbentuk warna

merah maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.

3.3.4 Pembuatan Media Pseudomonas Isolation Agar (PIA) padat dan

Heterotrof (HTR) cair

Tujuannya adalah untuk menyediakan nutrisi yang dibutuhkan oleh

bakteri. Pertama yaitu pembuatan media Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

padat. Sebanyak 4,5 gram Pseudomonas Isolation Agar (PIA) lalu

ditambahkan 100 ml aquades dan dipanaskan di microwave sampai

homogen, kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210 C

selama 30 menit dan didinginkan. Media Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

yang telah dingin, dituangkan ke dalam cawan petri sebanyak 20 ml dan

didiamkan selama 24 jam di dalam Laminar Air Flow (LAF) sambil

disterilisasi dengan sinar UV. Media selanjutnya yang dibuat adalah media

Heterotrof (HTR) cair. Sebanyak pepton 15 gram, K2HPO4 2,5 gram,

glukosa 2,5 gram, NaCl 5 gram dan tripton 3 gram dan dilarutkan dalam

aquades 1000 ml didalam erlenmeyer dan diaduk hingga homogen,

26


selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210 C selama 30

menit.

3.3.5 Inokulasi Bakteri pada Media Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

padat (Deby et al., 2012)

Inokulasi dilakukan untuk memindahkan dan meremajakan

bakteri.Teknik yang digunakan adalah Streak Plate. Jarum ose dipanaskan

terlebih dahulu sampai berpijar, lalu didinginkan, kemudian buka mulut

cawan yang berisi kultur bakteri P.aeruginosa dan bakteri diambil dengan

cara menggoreskan ose ke inokulum, lalu tutup mulut cawan dan panaskan

kembali. Ose digoreskan pada media Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

padat dengan metode gores kontinyu, kemudian tutup mulut cawan dan

panaskan kembali di api, selanjutnya diinkubasi pada suhu 370C selama 24

jam.

3.3.6 Karakterisasi bakteri Pseudomonas aeruginosa

Karakterisasi bakteri P.aeruginosa dilakukan dengan cara

pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram dilakukan dengan tujuan untuk

mengidentifikasi isolat bakteri yang akan digunakan dalam penelitian.

Bahan yang digunakan pada pewarnaan Gram adalah safranin, lugol, kristal

violet, etanol 70%, NaCl fisiologis. Goreskan sedikit isolat bakteri dengan

menggunakan ose dan diusapkan sedikit ke kaca objek, lalu tambahkan

sedikit NaCl fisiologis pada isolat untuk membuat suspensi bakteri.

Keringkan suspensi bakteri dan lakukan fiksasi di atas api bunsen, kemudian

tambahkan satu tetes kristal violet dan diamkan selama satu menit, bilas

dengan air keran lalu tambahkan satu tetes lugol dan diamkan selamat satu

menit dan kembali bilas dengan etanol 70%. Tambahkan satu tetes safranin

lalu bilas dengan air keran dan keringkan menggunakan mikroskop.

3.3.7 Pembuatan Suspensi Bakteri

27


Bakteri P.aeruginosa yang telah diremajakan di media

Pseudomonas Isolation Agar (PIA) padat diambil dengan jarum ose dan

dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi media heterotrof (HTR) cair 10

lalu dikocok-kocok sampai lepas. Tabung reaksi divortex selama 1 menit,

kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi

selama 24 jam, diukur nilai absorbansi pada panjang 600 nm menggunakan

spektrofotometri untuk mengetahui konsentrasi suspensi bakteri tersebut.

3.3.8 Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Bakteri P. aeruginosa

(Prasasti and Hertiani, 2010)

Uji pembentukan dan pertumbuhan biofilm bakteri P.aeruginosa

dilakukan untuk mengetahui berapakah waktu yang dibutuhkan

P.aeruginosa untuk membentuk biofilm yang paling baik. Uji pertumbuhan

biofilm P.aeruginosa dilakukan dengan metode Microtitter Plat Biofilm

Assay. Sebanyak 100 µL suspensi bakteri P.aeruginosa (OD 0,5) dan 100

µL media Heterotrof (HTR) cair dimasukkan ke dalam sumur microplate,

kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 1 hari, 2 hari, 3 hari dan 4 hari.

Setelah diinkubasi, cuci microplate dengan menggunakan air yang mengalir

sebanyak 3 kali dan keringkan, kemudian masukkan larutan kristal violet

1% sebanyak 200 µL dan didiamkan selama 15 menit. Setelah itu cuci

kembali microplate dengan air mengalir sebanyak 3 kali dan keringkan, lalu

masukkan etanol 96% sebanyak 200µL dan diamkan selama 15 menit,

kemudian dilakukan pembaca Optical Density (OD) biofilm P.aeruginosa

menggunakan alat iMark-Biorad Microplate Reader pada panjang

gelombang 595nm.

3.3.9 Uji Aktivitas Antibiofilm Secara In Vitro (Sandasi et al., 2010;

Prasasti dan Hertiani, 2010)

Pencegahan Pertumbuhan Biofilm

Pembentukan biofilm pada penelitian ini diuji secara in vitro

menggunakan metode Microtitterplate flat-buttom polystyrene 96 wells.

28


Pengujian dilakukan terhadap sari buah belimbing wuluh dengan variasi

konsentrasi 0,5%, 1%, 2%, 4% dan 8% b/v. Pada pengujian ini, kontrol

negatif yang digunakan adalah sumur microplate yang berisi suspensi

bakteri dan media Heterotrof (HTR) tanpa penambahan sari buah belimbing

wuluh, tetapi tidak digunakan kontrol positif sebagai pembanding. Sebanyak

200 µL sari buah belimbing wuluh terlebih dahulu dimasukkan pada tiap

sumur, kecuali pada sumur kontrol negatif dan didiamkan selama 60 menit,

kemudian buang sari buah belimbing wuluh yang ada didalam sumur

microplate. Tambahkan sebanyak 100 µL suspensi bakteri dan 100 µL

media Heterotrof (HTR) cair pada sumur microplate sampel dan kontrol

negatif, kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37oC.

Setelah masa inkubasi, microplate dicuci dengan menggunakan air

mengalir sebanyak tiga kali, kemudian ditambahkan 200 µL kristal violet

1% ke tiap sumur dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit.

Microplate dicuci kembali dengan menggunakan air mengalir sebanyak tiga

kali. Larutan etanol 96% sebanyak 200 µL ditambahkan ke tiap sumur dan

dilakukan inkubasi kembali pada suhu ruang selama 15 menit. Selanjutnya

dilakukan pembacaan Optical Density (OD) dengan menggunakan alat

iMark-Biorad Microplate Reader pada panjang gelombang 595nm.

Pengujian dilakukan secara triplo. Uji ini dilakukan untuk mengetahui

apakah sari buah belimbing wuluh dapat mencegah pertumbuhan biofilm

P.aeruginosa.

x 100%

Penghambatan Pertumbuhan Biofilm

Pembentukan biofilm pada penelitian ini diuji secara in vitro

menggunakan metode Microtitterplate flat-buttom polystyrene 96 wells.

Pengujian dilakukan terhadap sari buah belimbing wuluh dengan variasi

konsentrasi 0,5%, 1%, 2%, 4% dan 8% b/v. Pada pengujian ini, tidak

dilakukan penambahan sari buah belimbing wuluh terlebih dahulu seperti

pada pengujian pencegahan pertumbuhan biofilm, tetapi sari buah belimbing

wuluh ditambahkan bersamaan dengan suspensi bakteri dan media

29


Heterotrof (HTR) cair. Sebagaimana pada uji sebelumnya, kontrol negatif

yang digunakan adalah sumur microplate yang berisi suspensi bakteri dan

media Heterotrof (HTR) tanpa penambahan sari buah belimbing wuluh,

tetapi tidak digunakan kontrol positif sebagai pembanding. Tambahkan

media Heterotrof (HTR) cair sebanyak 60 µL,suspensi bakteri sebanyak 70

µL dan sari buah belimbing wuluh 70 µL pada masing-masing sumur,

kecuali sumur kontrol negatif, kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu

37oC. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci dan dilakukan prosedur

seperti pada uji sebelumnya. Pengujian ini dilakukan secara triplo. Uji ini

dilakukan untuk mengetahui apakah sari buah belimbing wuluh dapat

menghambat pertumbuhan biofilm P.aeruginosa.

x 100%

Degradasi Biofilm

Pengujian ini dilakukan sebagaimana pada uji pencegahan

pertumbuhan dan penghambatan pertumbuhan biofilm. Perbedaan dengan

uji sebelumnya adalah sari buah buah belimbing wuluh ditambahkan pada

saat biofilm telah terbentuk, dan pada uji ini digunakan kontrol negatif dan

kontrol positif sebagai pembanding. Pada pengujian ini, kontrol negatif yang

digunakan adalah sumur microplate yang berisi suspensi bakteri dan media

Heterotrof (HTR) tanpa penambahan sari buah belimbing wuluh kontrol

positif yang digunakan yaitu biorem 1 dan biorem 10. Sebanyak 100 µL

suspensi bakteri dan 100 µL media Heterotrof (HTR) cair dimasukkan

kedalam sumur microplate sampel, kontrol negatif dan kontrol posotif.

Microplate kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37oC. Setelah

diinkubasi, suspensi di dalam microplate dibuang kemudian dicuci dengan

menggunakan air sebanyak tiga kali, kemudian tambahkan sebanyak 200

µL sari buah belimbing wuluh dengan variasi konsentrasi 0,5%, 1%, 2%,

4% dan 8% b/v kecuali kontrol negatif, kemudian sebanyak 200 µL biorem

1 dan biorem 10 ditambahkan pada sumur microplate kontrol posotif.

Microplate didiamkan selama 60 menit, setelah itu microplate dicuci dan

30


dilakukan prosedur seperti pada uji sebelumnya. Pengujian dilakukan secara

triplo. Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah sari buah belimbing

wuluh dapat mendegradasi biofilm P.aeruginosa.

x100%

3.3.10 Analisis data

Data hasil pengujian aktivitas antibiofilm sari buah belimbing

wuluh (Averrhoa bilimbi L) terhadap pencegahan pertumbuhan,

penghambatan pertumbuhan dan degradasi biofilm P.aeruginosa dianalisis

secara statistik dengan menggunakan metode One Way Anova (analisa

varians satu arah) dengan program Statistical Product Service Solution

(SPSS 16). Tujuan dilakukan analisa statistik adalah untuk melihat apakah

sari buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) memperlihatkan perbedaan

yang signifikan sebagai antibiofilm P.aeruginosa. Setelah dianalisis, dipilih

salah satu aktivitas antibiofilm yang paling baik.

3.3.11 Optimasi Aktivitas Terseleksi (Bazeera et al., 2008)

Pada penelitian ini, optimasi aktivitas terseleksi dilakukan dengan

menggunakan metode Response Surface Analysis (RSA). Tujuannya adalah

untuk mengetahui konsentrasi ekstrak air belimbing wuluh, waktu inkubasi

dan suhu yang optimal. Optimasi dilakukan pada aktivitas yang telah

terseleksi pada uji sebelumnya menggunakan metode Response Surface

Analysis (RSA). Hal pertama yang harus dilakukan adalah membuat desain

rancangan pengujian, kemudian dilakukan uji aktivitas antibiofilm ekstrak

air belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L). Pengujian ini dilakukan

sebagaimana pada uji aktivitas antibiofilm yang telah dilakukan

sebelumnya, hanya saja konsentrasi ekstrak air belimbing wuluh, waktu

inkubasi dan suhu yang digunakan berbeda, yaitu sesuai hasil optimasi

sebelumnya. Data yang diperoleh kemudian dioptimasi dengan

menggunakan metode Response Surface Analysis (RSA).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Determinasi

Berdasarkan hasil determinasi pada tanggal 6 Mei 2015, menunjukkan

sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah jenis Averrhoa bilimbi L, suku

Oxalidaceae, belimbing wuluh/belimbing sayur (Lampiran 2).

4.1.2 Karakterisasi Sampel dan Proses Penyiapan Sampel

Hasil karakterisasi menunjukkan buah belimbing wuluh yang digunakan

dalam penelitian ini berwarna hijau dengan panjang sekitar 50-70 mm dan

diameter 10-20 mm, rasa asam. Dari hasil proses penyiapan sampel, sebanyak 1

kg buah belimbing wuluh segar dihancurkan dengan menggunakan blender dan

sebanyak 50 ml air belimbing wuluh di uapkan menggunakan Freeze dryer

selama 27 jam. Didapatkan simplisia berupa serbuk seberat 2 gram.

4.1.3 Uji Penapisan Fitokimia

Kandungan metabolit sekunder pada serbuk belimbing wuluh

diidentifikasi dengan cara penapisan fitokimia. Hasil penapisan fitokimia serbuk

belimbing wuluh dapat dilihat pada tabel 4.1.

Tabel 4.1. Hasil uji penapisan fitokimia serbuk buah belimbing wuluh secara

kualitatif

Golongan Hasil Keterangan

Alkaloid + Noda naik berwarna orange pada plat KLT

Flavonoid + Lapisan anilin alkohol berwarna kuning

Steroid - Orange

Triterpenoid + Orange

Fenolik - Kuning

Saponin + Berbusa

Kuinon - Putih

32

UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

4.1.5 Karakterisasi bakteri Pseudomonas aeruginosa

Hasil karakterisasi bakteri P.aeruginosa secara makroskopik dan

mikroskopik dapat dilihat pada gambar 4.1.

Gambar 4.1. Koloni pada media agar dan pewarnaan Gram bakteri P.aeruginosa

Hasil purifikasi pada media Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

menunjukkan bentuk koloni yang besar, halus dengan permukaan rata serta

berwarna kuning muda. Karakterisasi bakteri yang dilakukan dengan cara

pewarnaan Gram menunjukkan bahwa isolat yang digunakan merupakan bakteri

Gram negatif, berbentuk batang pendek, tidak berspora dan menghasilkan warna

merah.

4.1.6 Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm P.aeruginosa

Hasil uji pembentukan dan pertumbuhan biofilm bakteri P.aeruginosa

yang berupa nilai densitas biofilm (OD595nm) pada hari pertama sampai hari

keempat dapat dilihat pada gambar 4.2.

Dari data grafik, dapat dilihat pada waktu inkubasi hari ke tiga

menunjukkan pembentukan dan pertumbuhan biofilm P.aeruginosa yang paling

baik.

33


Gambar 4.2. Grafik pembentukan dan pertumbuhan biofilm P.aeruginosa

melalui metode Microtitter Plat Biofilm Assay (OD595nm)

4.1.7 Uji Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Belimbing Wuluh terhadap

Biofilm P.aerginosa

Terdapat tiga aktivitas antibiofilm yang diuji yaitu pencegahan

pertumbuhan biofilm, penghambatan pertumbuhan biofilm dan degradasi biofilm.

Hasil uji aktivitas antibiofilm ekstrak air belimbing wuluh terhadap biofilm

P.aeruginosa dapat dilihat pada grafik dan tabel berikut :

Gambar 4.3. Grafik aktivitas antibiofilm sari buah belimbing wuluh terhadap

biofilm P.aeruginosa (OD595nm)

0,108

0,490

0,717

0,186

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

1 2 3 4

De

nsi

tas

bio

film

(O

D59

5nm

)

Waktu Inkubasi (Hari)

a a

a

ab

b

ab

abc

bc

abc

ad

bcd

abcd

e

e

abcde

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Pencegahanpertumbuhan

Penghambatanpertumbuhan

Degradasi

Akt

ivit

as a

nti

bio

film

(%

)

Ekstrak0.5%Ekstrak1%Ekstrak2%Ekstrak4%Ekstrak8%

34


Tabel 4.2 Hasil uji aktivitas antibiofilm sari buah belimbing wuluh (Averrhoa

bilimbi L) terhadap biofilm P.aeruginosa

Aktivitas Sampel Densitas

biofilm 1

Densitas

biofilm 2

Densitas

biofilm 3

Rerata Presentase

(%)

Pencegahan

pertumbuhan

0.5% 0,54 0,59 0,59 0,57 26,55±4,18

1% 0,57 0,62 0,60 0,59 23,88±3,37

2% 0,59 0,57 0,61 0,59 24,39±2,16

4% 0,55 0,55 0,53 0,57 26,55±1,17

8% 0,48 0,48 0,50 0,48 37,86±1,58

Kontrol

Negatif

0,80 0,79 0,76 0,78 0

Penghambatan

pertumbuhan

0.5% 0,52 0,53 0,58 0,54 30,24±4,06

1% 0,15 0,19 0,22 0,19 75,73±5,03

2% 0,22 0,20 0,19 0,20 73,82±1,85

4% 0,25 0,28 0,18 0,24 69,50±6,93

8% 0,27 0,26 0,32 0,28 63,53±3,86

Kontrol

Negatif

0,80 0,79 0,76 0,78 0

Degradasi 0.5% 0,61 0,67 0,68 0,66 43,10±0,09

1% 0,58 0,60 0,67 0,61 46,63±1,18

2% 0,56 0,60 0,61 0,59 48,53±0,22

4% 0,56 0,57 0,60 0,58 49,82±4,07

8% 0,55 0,51 0,60 0,55 51,98±1,61

Kontrol

Positif

0,11 0,17 0,15 0,16 80,81±0,03

Kontrol

Negatif

1,16 0,78 0,69 0,88 0

Data yang telah diperoleh selanjutnya dilakukan uji persyaratan. Hasil uji

normalitas Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahwa data ketiga aktivitas

terdistribusi normal (p≥0,05). Setelah dilakukan uji normalitas, dilanjutkan uji

homogenitas Levene. Hasil uji homogenitas menghasilkan data yang homogen

(p≥0,05) untuk aktivitas pencegahan pertumbuhan dan penghambatan

pertumbuhan, tetapi data aktivitas degradasi tidak homogen sehingga tidak bisa

dilanjutkan dengan uji anova. Hasil uji data aktivitas pencegahan pertumbuhan

dan penghambatan pertumbuhan menunjukkan nilai signifikan 0,132 dan 0,267

(p≥0,05). Hasil uji anova yang dilakukan menunjukkan nilai signifikan 0,000

35


(p≤0,05), sehingga dilanjutkan dengan uji BNT jenis LSD dimana data yang

diperoleh menunjukkan hasil yang berbeda secara bermakna terhadap kontrol

negatif (p≤0,05). Dari hasil uji ini dapat disimpulkan bahwa ekstrak air belimbing

wuluh dapat mencegah pertumbuhan dan menghambat pertumbuhan biofilm

P.aeruginosa secara in vitro. Sedangkan aktivitas degradasi yang dianalisa dengan

metode kruskalwalis menunjukkan nilai signifikan 0,026 (p≤0,05), sehingga

dilanjutkan dengan uji BNT jenis LSD dimana data yang diperoleh menunjukkan

hasil yang berbeda secara bermakna terhadap kontrol negatif (p≤0,05). Dari hasil

uji ini dapat disimpulkan bahwa ekstrak air belimbing wuluh dapat mendegradasi

biofilm P.aeruginosa secara in vitro.

Grafik pada gambar 4.3 menunjukkan aktivitas pencegahan pertumbuhan

biofilm memiliki perbedaan yang signifikan antara konsentrasi sari buah 8% (e)

dengan konsentrasi 0,5%, 1%, 2% dan 4%. Antara konsentrasi 0,5% (a), 1% (ab)

dan 2% (abc) tidak memiliki perbedaan secara signifikan, tetapi konsentrasi 4%

(ad) memiliki perbedaan secara signifikan dengan konsentrasi 1% (ab) dan 2%

(abc). Pada aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm menunjukkan adanya

perbedaan yang signifikan antara konsentrasi sari buah 0,5% (a) dengan

konsentrasi 1% (b), 2% (bc), 4% (bcd) dan 8% (e). Antara konsentrasi 1% (b), 2%

(bc) dan 4% (bcd) tidak memiliki perbedaan secara signifikan, tetapi konsentrasi

8% (e) memiliki perbedaan secara signifikan dengan konsentrasi lainnya. Pada

aktivitas terakhir yaitu degradasi biofilm menunjukkan bahwa tidak terdapat

perbedaan yang signifikan antara kelima konsentrasi.

4.1.8 Optimasi Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm P.aeruginosa

Sebelum didapatkan hasil optimasi, terlebih dahulu didapatkan hasil

rancangan optimasi yaitu berupa 20 pasang variabel faktor yang akan duji

(Lampiran 11). Data yang dianalisis pada tahap ini merupakan densitas biofilm

P.aeruginosa pada panjang gelombang 595 nm. Grafik hasil optimasi uji aktivitas

penghambatan pertumbuhan biofilm P.aeruginosa oleh sari buah wuluh adalah

sebagai berikut :

36


waktu (Hari)

suh

u (

C)

3.02.52.01.51.0

50

45

40

35

30

25

konsentrasi (%) 4.25

Hold Values

>

–

–

–

–

–

< 20

20 30

30 40

40 50

50 60

60 70

70

%

Contour Plot of % vs suhu (C), waktu (Hari)

Gambar 4.4. Grafik Contour Plot antara presentase penghambatan vs suhu,

waktu

konsentrasi (%)

wa

ktu

(H

ari

)

87654321

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

suhu (C) 37.5

Hold Values

>

–

–

–

< 40

40 50

50 60

60 70

70

%

Contour Plot of % vs waktu (Hari), konsentrasi (%)

Gambar 4.5. Grafik Contour Plot antara presentase penghambatan vs waktu,

konsentrasi

37


Gambar 4.6. Hasil analisis Optimized Plot

4.2 Pembahasan

Pada penelitian ini, uji antibiofilm didasarkan pada pengaruh sari buah

belimbing wuluh terhadap pencegahan pertumbuhan, penghambatan pertumbuhan

dan degradasi biofilm P.aeruginosa secara in vitro. Tanaman yang digunakan

pada penelitian ini adalah belimbing wuluh jenis Averrhoa bilimbi L, suku

oxalidaceae yang telah dideterminasi. Buah belimbing wuluh segar yang

digunakan dikeringkan dengan menggunakan metode freezedryer. Tujuan

dilakukan proses freezedry adalah untuk mendapatkan sampel yang stabil, tidak

mudah rusak akibat mikroba dan kegiatan enzim yang mengakibatkan

pembusukan pada sari buah belimbing wuluh. Sebanyak 50 ml air buah belimbing

wuluh yang dikeringkan, menghasilkan serbuk simplisia belimbing wuluh

sebanyak 2 gram. Pengujian aktivitas antibiofilm belimbing wuluh terhadap

biofilm P.aeruginosa dilakukan terhadap berbagai seri konsentrasi dengan

menggunakan pelarut aquades yaitu 0,5%, 1%, 2%, 4% dan 8% b/v.

Berdasarkan hasil uji penapisan fitokimia terhadap serbuk belimbing

wuluh pada tabel 4.1 menunjukan bahwa buah belimbing wuluh positif

mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, saponin dan triterpenoid. Adanya

senyawa alkaloid ditandai dengan adanya noda naik berwarna orange pada plat

KLT saat diteteskan dengan menggunakan pereaksi Dragendroff. Sedangkan

38


senyawa flavonoid dan triterpenoid pada buah belimbing wuluh ditandai dengan

adanya lapisan anilin alkohol berwarna kuning dan terbentuknya warna orange

pada plat tetes. Senyawa saponin ditandai dengan terbentuknya busa pada tabung

reaksi setelah dilakukan pengocokan. Senyawa flavonoid pada belimbing wuluh

merupakan senyawa target yang diketahui mempunyai efek antibakteri (Hembing,

2008). Tidak menutup kemungkinan belimbing wuluh juga memiliki aktivitas

antibiofilm, karena ekstrak tanaman yang mengandung flavonoid berpotensi dapat

menghambat intercellular adhesion genes icaA dan icaD yang menjadi salah satu

faktor pembentukan biofilm (Lee et al., 2013).

Selain mengandung senyawa flavonoid, buah belimbing wuluh juga

diketahui mengandung senyawa saponin triterpen (Fahrunnida dan Pratiwi, 2012).

Menurut Katzung dalam Hartini (2012) saponin merupakan senyawa yang

memiliki tegangan permukaan yang kuat yang berperan sebagai antimikroba

dengan mengganggu kestabilan membran sel bakteri yang menyebabkan lisis sel.

Hal ini disebabkan karena saponin yang merupakan senyawa semipolar dapat larut

dalam lipid dan air, sehingga senyawa ini akan terkonsentrasi dalam membran sel

mikroba.

Isolat bakteri P.aeruginosa yang digunakan dalam penelitian ini

merupakan koleksi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang diisolasi

dari alat dispenser. Untuk mengetahui bahwa isolat yang digunakan adalah benar

P.aeruginosa, telah dilakukan karakterisasi terhadap bakteri P.aeruginosa. Dari

hasil karakterisasi pada gambar 4.1 menunjukkan koloni pada agar berbentuk

besar, halus dengan permukaan rata serta berwarna kuning muda. Dari hasil

pewarnaan Gram, dapat dilihat secara mikroskopik bahwa isolat yang digunakan

merupakan bakteri Gram negatif dan menghasilkan warna merah, berbentuk

batang dan tidak berspora. Hal ini disebabkan oleh dinding sel bakteri Gram

negatif mengandung hanya sedikit peptidoglikan dan adanya polisakarida pada

peptidoglikan, sehingga karbol kristal ungu yang diserap tidak terikat dengan kuat

dan menjadi luruh apabila dicuci dengan alkohol 96%. Jadi dapat disimpulkan

isolat yang digunakan benar merupakan P.aeruginosa (Lay, 1994).

P.aeruginosa adalah patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan

pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. P.aeruginosa

39


membentuk biofilm untuk mambantu kelangsungan hidupnya saat membentuk

koloni pada paru-paru manusia (Todar, 2004; Madigan et al.,2003; Salyers, 1994).

P.aeruginosa menyebabkan kontaminasi pada perlengkapan anastesi dan terapi

pernafasan, cairan intravena, bahkan air hasil proses penyulingan. Endoskopi,

termasuk bronkoskopi adalah alat-alat medik yang paling sering dihubungkan

dengan berjangkitnya infeksi nosokomial. (Todar,2004; Srinivasa et al.,2003).

Isolat P.aeruginosa diinokulasi dengan menggunakan media Pseudomonas

Isolation Agar (PIA) padat yaitu media spesifik untuk bakteri P.aeruginosa dan

diinkubasi pada suhu optimum yaitu 370C (Balows et al., 1991) selama 24 jam .

Proses inokulasi bertujuan untuk memindahkan dan meremajakan bakteri yang

akan digunakan, serta memastikan apakah isolat bakteri yang digunakan masih

hidup atau sudah mati. Setelah diinkubasi selama 24 jam, isolat P.aeruginosa

tumbuh sangat baik di dalam media agar. Isolat P.aeruginosa kemudian dibuat

dalam bentuk suspensi dengan menggunakan media Heterotrof (HTR) cair.

Sebanyak 10 ml media Heterotrof (HTR) cair dalam tabung reaksi ditambahkan

isolat P.aeruginosa yang telah diambil menggunakan ose, kemudian divortex

selama 1 menit agar homogen dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C.

Pada keesokan harinya, suspensi bakteri terlihat lebih keruh dari hari sebelumnya,

hal ini menandakan bakteri telah tumbuh dan konsentrasi bakteri di dalam media

lebih besar dibandingkan sebelumnya.

Suspensi bakteri yang telah diinkubasi selama 24 jam kemudian diukur

nilai absorbansi pada panjang gelombang 600 nm menggunakan alat spektrometer

(Thomas, 2006). Pengukuran nilai absorbansi dilakukan dengan tujuan

mengetahui konsentrasi bakteri P.aeruginosa yang terdapat di dalam media

Heterotrof (HTR) cair. Nilai absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi

suspensi bakteri. Pada penelitian ini, nilai absorbansi yang diinginkan adalah 0,5

karena menurut Thomas (2006) pada nilai absorbansi 0,3-0,7 merupakan fase log

bakteri P.aeruginosa, dimana fase log merupakan tahap dimana pertumbuhan

P.aeruginosa sangat baik. Setelah diukur dengan spektormeter, didapatkan nilai

absorbansi sebesar 1,0. Nilai absorbansi lebih besar dibandingkan yang telah

ditetapkan, oleh karena itu dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan

40


media sebanyak 10 ml, sehingga diperoleh nilai absorbansi bakteri P.aeruginosa

0,5.

Sebelum dilakukan uji aktivitas antibiofilm sari buah belimbing wuluh,

suspensi bakteri P.aeruginosa harus diuji pembentukan dan pertumbuhan biofilm

dengan menggunakan metode Microtitter Plate Biofilm Assay (OD595nm). Uji

pembentukan dan pertumbuhan biofilm dilakukan dengan tujuan mengetahui

berapakah waktu yang dibutuhkan bakteri P.aeruginosa untuk bisa membentuk

biofilm paling baik. Nilai absorbansi biofilm P.aeruginosa diukur pada panjang

gelombang 595 nm untuk mengetahui densitas biofilm yang terbentuk pada

dinding sumur microplate. Pada hari pertama, rata-rata densitas biofilm

P.aeruginosa 0.108, hari kedua mengalami kenaikan rata-rata densitas biofilm

yaitu sebesar 0.490, hari ketiga juga mengalami kenaikan rata-rata densitas

biofilm yang cukup signifikan yaitu 0.717, dan pada hari ke empat rata-rata

densitas biofilm mengalami penurunan yang sangat signifikan yaitu 0.186.

Pengujian tidak dilanjutkan untuk hari selanjutnya, karena pada hari keempat

telah terjadi penurunan nilai rata-rata densitas biofilm P.aeruginosa. Penurunan

nilai densitas biofilm pada hari keempat terjadi karena koloni biofilm pada hari

keempat sedang pada tahap akhir yang disebut dengan dispersi atau pelepasan

untuk menempel di sisi yang lain (Watnick dan Kolter, 2000), sehingga pada

tahap tersebut jumlah koloni biofilm yang menempel pada dinding sumur

berkurang dan sebelum menempel pada sisi dinding sumur lainnya, biofilm ikut

terbuang pada saat proses pencucian. Sehingga dapat disimpulkan waktu yang

dibutuhkan P.aeruginosa untuk bisa membentuk biofilm yang paling baik untuk

pengujian adalah tiga hari pada suhu 370C.

Setelah diketahui waktu optimal yang dibutuhkan bakteri P.aeruginosa

membentuk biofilm paling baik, kemudian dilakukan uji aktivitas antibiofilm sari

buah belimbing wuluh terhadap biofilm P.aeruginosa secara in vitro. Ada tiga

jenis aktivitas antibiofilm yang diuji pada penelitian ini yaitu pencegahan

pertumbuhan, penghambatan pertumbuhan dan degradasi biofilm P.aeruginosa.

Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Prasasti dan Hertiani (2010),

Sandasi et al (2009) dan Mansouri et al (2013) tentang ketiga aktivitas tersebut,

semuanya menggunakan waktu inkubasi selama 24 jam. Sedangkan pada

41


penelitian ini, waktu inkubasi yang digunakan adalah 3 hari (72 jam). Dasar

penggunaan waktu inkubasi 3 hari adalah hasil uji pembentukan dan pertumbuhan

biofilm yang telah dilakukan sebelumnya, dimana bakteri P.aeruginosa dapat

membentuk biofilm paling baik dalam waktu tiga hari. Grafik pada gambar 4.3

menunjukkan bahwa sari buah belimbing wuluh memiliki ketiga aktivitas

antibioflilm. Hal tersebut dibuktikan dengan adanya penurunan nilai rerata

densitas biofilm P.aeruginosa mulai dari pemberian sari buah dengan konsentrasi

0,5% sampai dengan 8% apabila dibandingkan dengan kontrol negatif.

Aktivitas pertama yang diuji adalah pencegahan pertumbuhan biofilm

P.aeruginosa. Pada pengujian aktivitas ini, kontrol negatif yang digunakan adalah

biofilm P.aeruginosa tanpa diberi perlakuan atau penambahan sari buah

belimbing wuluh, sedangkan kontrol positif tidak digunakan sebagai pembanding

karena tidak tersedianya sediaan sintetis yang mekanisme kerjanya sebagai

pencegah biofilm. Berdasarkan grafik pada gambar 4.3 dan tabel 4.2, sari buah

belimbing wuluh dapat mencegah pertumbuhan biofilm P.aeruginosa apabila

dibandingkan dengan kontrol negatif. Konsentrasi sari buah 8% memiliki aktivitas

pencegahan paling tinggi dibandingkan konsentrasi yang lain yaitu sebesar

37,86%.

Mekanisme pencegahan biofilm oleh sari buah belimbing wuluh adalah

seberapa banyak dan kuat sari buah belimbing wuluh dapat menempel pada

dinding sumur microplate untuk kemudian mencegah suspensi bakteri

P.aeruginosa untuk membentuk biofilm. Pada aktivitas ini, sari buah belimbing

wuluh dengan konsentrasi paling tinggi yaitu 8% tentunya memiliki kekeruhan

dan kekentalan sari buah yang paling tinggi pula, sehingga sari buah memiliki

kekuatan yang maksimal untuk menempel pada dinding sumur microplate, bahkan

setelah sari buah dibuang dari microplate. Selain itu, sari buah belimbing wuluh

dengan konsentrasi tinggi mengandung senyawa aktif yang lebih banyak

dibandingkan konsentrasi rendah. Hal inilah yang menyebabkan semakin

tingginya konsentrasi sari buah belimbing wuluh, maka semakin baik pula

aktivitas pencegahan pertumbuhan biofilmnya.

Aktivitas selanjutnya yang diuji adalah penghambatan pertumbuhan

biofilm P.aeruginosa. Sama halnya pada pengujian aktivitas pencegahan

42


pertumbuhan, kontrol negatif yang digunakan adalah biofilm P.aeruginosa tanpa

diberi perlakuan atau penambahan sari buah belimbing wuluh, sedangkan kontrol

positif tidak digunakan sebagai pembanding karena tidak tersedianya sediaan

sintetis yang mekanisme kerjanya sebagai pencegah biofilm. Berdasarkan grafik

pada gambar 4.3 dan tabel 4.3, sari buah belimbing wuluh dapat menghambat

pertumbuhan biofilm P.aeruginosa secara drastis apabila dibandingkan dengan

kontrol negatif. Konsentrasi sari buah 1% memiliki aktivitas penghambatan paling

tinggi dibandingkan konsentrasi yang lain yaitu sebesar 75,73%. Berbeda dengan

aktivitas pencegahan pertumbuhan, dimana konsentrasi paling tinggi yaitu 8%

dapat mencegah pertumbuhan biofilm paling baik, pada aktivitas ini justru

konsentrasi ekstrak 2% sampai 8% tidak menunjukkan hasil yang lebih baik

dibandingkan konsentrasi 1%.

Mekanisme penghambatan biofilm oleh sari buah belimbing wuluh adalah

tidak ditujukan untuk menempel pada dinding sumur microplate seperti pada

aktivitas pencegahan pertumbuhan. Teori lain oleh Aenderek (2005) yang

menyebutkan bahwa mekanisme penghambatan pertumbuhan biofilm dapat

dengan cara menembus dinding sel bakteri sehingga dapat menganggu sinyal-

sinyal komunikasi (Quorum sensing) antar bakteri yang berperan dalam

pembentukan biofilm atau menginaktivasi gen-gen pada bakteri yang memicu

sintesis EPS. Pada aktivitas ini, sari buah belimbing wuluh dengan konsentrasi

paling tinggi yaitu 8% yang memiliki kekeruhan dan kekentalan sari buah yang

tinggi, tentunya tidak dapat menembus sel bakteri secara maksimal dibandingkan

dengan sari buah konsentrasi rendah. Tetapi, pada konsentrasi 0,5% terjadi

penurunan kembali presentase penghambatan dibandingkan 1%. Hal ini diduga

karena konsentrasi sari buah yang terlalu kecil, sehingga walaupun dapat

menembus sel-sel bakteri tetapi senyawa aktif didalam sari buah tidak cukup

berperan dalam proses penghambatan pertumbuhan biofilm.

Aktivitas terakhir yang diuji adalah degradasi biofilm P.aeruginosa. Pada

pengujian aktivitas ini, kontrol negatif yang digunakan sama seperti uji

sebelumnya. Tetapi pada aktivitas ini kontrol positif digunakan sebagai

pembanding yaitu biorem 1 dan biorem 10. Biorem merupakan sediaan sintetis

yang mengandung senyawa enzim dan alkali yang dapat mendegradasi lapisan

43


biofilm yang terdiri dari polisakaria. Berdasarkan grafik pada gambar 4.3 dan

tabel 4.4, sari buah belimbing wuluh dapat mendegradasi biofilm P.aeruginosa

apabila dibandingkan dengan kontrol negatif. Apabila dibandingkan dengan

kontrol positif, aktivitas degradasi biofilmsari buah belimbing wuluh masih lebih

rendah dibandingkan dengan sediaan biorem 1 dan biorem 10. Konsentrasi sari

buah 8% memiliki aktivitas degradasi paling tinggi dibandingkan konsentrasi

yang lain yaitu sebesar 51,98%.

Mekanisme degradasi biofilm oleh sari buah belimbing wuluh adalah

untuk menempel pada biofilm yang telah terbentuk pada dinding sumur

microplate, kemudian menembus dan menghancurkan sel biofilm P.aeruginosa.

Pada aktivitas ini menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi ekstrak maka

semakin kecil rerata absorbansi biofilm. Konsentrasi ekstrak 8% memiliki

aktivitas degradasi paling baik. Tidak berbeda dengan penelitian sebelumnya oleh

Loresta (2012), yang menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak

daun kelor (Moringa oleifera), maka semakin baik aktivitas degradasi biofilm

yang dihasilkan.

Tahap selanjutnya yang dilakukan adalah optimasi aktivitas terseleksi.

Optimasi dilakukan pada aktivitas yang paling baik yang dihasilkan oleh ekstrak

air belimbing wuluh terhadap biofilm P.aeruginosa. Dari pengujian yang

dilakukan sebelumnya, menunjukkan bahwa aktivitas yang paling baik adalah

penghambatan pertumbuhan biofilm P.aeruginosa, dimana ekstrak air belimbing

wuluh dapat menghambat biofilm P.aeruginosa lebih dari 70%.

Optimasi dilakukan dengan menggunakan metode Response Surface

Analysis (RSA). Optimasi aktivitas terseleksi dilakukan terhadap 3 variabel yaitu

suhu, konsentrasi dan waktu inkubasi. Suhu yang diuji pada tahap ini adalah suhu

ruang (250C), suhu optimal pertumbuhan bakteri (37,5

0C) dan suhu panas (50

0C).

Konsetrasi yang diuji adalah konsentrasi hasil rancangan desain yang ditentukan

oleh Response Surface Analysis (RSA) yaitu 0,5%, 4,25%, 8%. Waktu inkubasi

yang diuji adalah 1 hari, 2 hari, 3 hari. Hal ini dilakukan untuk mengetahui

berapakah titik optimal dari setiap variabel dan apakah ada hubungan antara

variabel satu dengan yang lainnya. . Pada pengujian ini, yang digunakan sebagai

pembanding hanyalah kontrol negatif, sedangkan kontrol positif tidak digunakan

44


sebagai pembanding. Sebelum dioptimasi, terdapat 20 pasang dari ketiga variabel

faktor yang harus dilakukan uji aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm

P.aeruginosa (Lampiran 11). Pengujian dilakukan secara triplo.

Pengujian dilakukan dengan cara yang sama pada uji penghambatan

pertumbuhan biofilm sebelumnya. Hasil yang didapatkan setelah dilakukan uji

aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm adalah berupa nilai densitas biofilm

(OD595nm). Data densitas biofilm yang diperoleh kemudian dianalisis

menggunakan metode Response Surface Analysis (RSA) dan diperoleh hasil

berupa grafik yang menunjukkan suhu, konsentrasi dan waktu inkubasi yang

optimal. Grafik Contour Plot pada gambar 4.6 dan gambar 4.7 menunjukkan

hubungan antara fase reduksi vs suhu, konsentrasi dan waktu inkubasi. Pada hasil

tersebut terlihat beberapa lapisan warna dari warna biru tua sampai hijau tua.

Lapisan warna hijau tua menunjukkan suhu yang optimal adalah antara 25-400C,

waktu inkubasi yang optimal adalah 1,5-3 hari dan konsentrasi yang optimal

adalah antara 1-7%. Analisis dilakukan lebih lanjut untuk mengetahui optimized

plot. Setelah dilakukan analisis diketahui suhu paling optimal adalah 300C,

konsentrasi paling optimal adalah 4,3% dan waktu inkubasi paling optimal adalah

2,25 hari.

Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Mansouri et al (2013) tentang

pengaruh berbagai ekstrak tanaman terhadap pertumbuhan biofilm bakteri

P.aeruginosa, menunjukkan bahwa ekstrak tanaman manjakini (Quercus

infectoria) dapat menghambat biofilm semua strain bakteri dengan MIC 1000, dan

ekstrak tanaman murad (Myrtus communis) yang dapat menghambat biofilm

bakteri strain ATCC27853, PK60 dan PK112. Pemilihan tanaman pada penelitian

tersebut berdasarkan sifat penghambatan ekstrak terhadap alpha-glucosidase.

Meylita (2012) juga menyampaikan bahwa ekstrak buah belimbing wuluh dapat

menghambat pembentukan biofilm mulai dari konsentrasi 0.0078%. Penelitian

yang dilakukan oleh Loresta (2012) menyampaikan bahwa ekstrak etanol daun

kelor (Moringa oleifera) dapat menghambat pembentukan biofilm S.aureus mulai

dari pemberian ekstrak 0,5% sampai dengan 8%.

Pada penelitian ini, tidak dilakukan uji lebih lanjut untuk mengetahui

mekanisme aktivitas antibiofilm terhadap bioiflm P.aeruginosa. Proses

45


penghambatan pembentukan biofilm tidak hanya terkait oleh gen yang

mensintesis Polysacharide Intercellular Adhesion (PIA) saja, tetapi menurut yang

disampaikan Aendekerk (2005) penghambatan pembentukan biofilm juga

dipengaruhi oleh sistem Quorum Sensing (QS). Quorum sensing merupakan suatu

proses yang memungkinkan bakteri dapat berkomunikasi dengan mensekresikan

molekul sinyal yang disebut autoinduser atau molekul sinyal seperti bahasa.

Proses ini memungkinkan suatu populasi bakteri dapat mengatur ekspresi gen

tertentu. Konsentrasi autoinduser di lingkungan sebanding dengan jumlah bakteri

yang ada. Dengan mendeteksi autoinduser, suatu bakteri mampu mengetahui

keberadaan bakteri lain di lingkungannya. Molekul sinyal juga memperlihatkan

peranannya dalam pembentukan biofilm. Sebagai contoh adalah homoserin lakton

yang merupakan sinyal utama yang terdapat pada P.aeruginosa (Donlan, 2001).


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini diperoleh kesimpulan sebagai berikut :

1. Sari buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) dengan konsentrasi

0,5%, 1%, 2%, 4% dan 8% dapat memberikan perbedaan secara

bermakna dalam mencegah pertumbuhan, menghambat pertumbuhan

dan mendegradasi biofilm P.aeruginosa secara in vitro.

2. Sari buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) dengan konsentrasi

0,5%, 1%, 2%, 4% dan 8% menunjukkan aktivitas terbaik yaitu

penghambatan pertumbuhan biofilm P.aeruginosa secara in vitro.

3. Setelah aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm dioptimasi, suhu

yang optimal dalam pengujian adalah 300C, konsentrasi yang optimal

dalam pengujian adalah 4,3% dan waktu inkubasi yang optimal dalma

pengujian adalah 2,25 hari.

5.2 Saran

Adapun saran untuk penelitian lebih lanjut adalah :

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan konsentrasi yang sama

untuk mengetahui struktur senyawa yang bertanggung jawab terhadap

mekanisme aktivitas antibiofilm.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan

konsentrasi dan waktu inkubasi ekstrak air belimbing wuluh (Averrhoa

bilimbi L) mengenai aktivitas pencegahan pertumbuhan dan degradasi

biofilm P.aeruginosa.


DAFTAR PUSTAKA

Aendekerk, S, Diggle S, Song, Z, Hoiby, N, Cornelis, P, Williams Pand Camara, M.

2005. The MexGHI-OpmD multidrug efflux pump controls growth, antibiotic

susceptibility and virulence in Pseudomonas aeruginosa via 4-quinolone-

dependent cell-to-cell communication. Microbiology 151(4), 1113-1125.

Archer, N.K, M.J. Mazaitis, J.W. Costerton, J.G. Leid, M.E. Powers, M.E Shirtliff.

2011. Staphylococcus Aureus Biofilms Properties, Regulation and Roles in

Human Disease. Landes Bioscience. Virulence 2:5, 445-459.

Augustin M., Ali-Vehmas T., Atroshi F. 2004. Assessment of enzymatic cleaning

agents and disinfectants against bacterial biofilms. Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences 18: 55–64.

Balows, W. J. Hausler, Jr., K. L. Herrmann, H. D. Isenberg, H. J1991.Manual Of

Clinical Microbiology, 5th

Edition, American Society for Microbiology,

Washington DC : 429-30, 431, 439.

Bazeera A.M. 2008. Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization

in analytical chemistry: Elcevier B.V.

Costerton JW, Stewart PS. 2001. Battling Biofilm. Scientific American;61-67

Davey E M & Otoole A G. 2000. Mikrobial biofilm : From ecology to moleculer

genetics. Microbiol Mol Biol, 64. Page : 847-867.

Decho A W. 1990. Microbial exopolymer secretion in ocean environment: Their

role(s) In food web and marine process, Oceanogr Mar Biol Annu Rev, 28.

Page : 73-153

Desai J.D., Banat I.M. 1997. Microbial production of surfactants and their

commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews 61:

47–64.

48


Deshpande, J. D., Joshi, M. 2011. Antimicrobial Resistance: The Global Public

Health Challenge. International Journal of Student Research.Volume I. Issue

2.

Donlan R M & Costertoon J W. 2002. Biofilm : Survival mechanism of clinically

relevant microorganism. Clin Mikrobial rev, 15. Page :167-193

Donlan, R. M. 2002. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious

Diseases, vol. 8, no. 9. Page : 881–890.

Fahrunnida, Pratiwi Rarastoeti. 2012. Kandungan Saponin Buah, Daun dan tangkai

Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L).

Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemi Screening of Plants. Journal of

Pharmaceutical Sciences.

Fiorillo and Doglidoni A. 2001. The Pseudomonas aeruginossa hot-foot Syndrome, n

Engl J Med, Vol.345, No.5.

Flemming H C. 1993. Biofilm and environment protection. Water Sci technol, 27.

Page: 1-10.

Foca M,D., Jakob, K. R. N. B. S. N., Whitier, S., Latta, P. D., Factor, S. M.D., M. P.

H., Rubenstein, D. M. D. 2000. Endemic Pseudomonas aeruginosa Infection

In a Neonatal Intensive Care Unit, N Engl J Med, Vol.343, No.10.

Gibson, J.M. 1996. Mikrobiologi dan Patologi Modern untuk Perawat. diterjemahkan

oleh I.K.G. Soma Prasada, 11, 12. Jakarta : EGC Penerbit Buku Kedokteran

Hembing, W.2008. Ramuan Lengkap Herbal Taklukan Penyakit. Niaga Swadaya.

Jakarta.

Jawetz EE., Melnick, J.L., Adelberg, E.A.,2001. Medical Microbiology, 22nd

Edition. USA : McGraw-Hill Companies . page : 229-31.

Kudva I.T., Jelacic S., Tarr P.I., Youderian P., Hovde C. J. 1999. Biocontrol of

Escherichia coli O157 with O157-specific bacteriophages. Applied and

Environmental Microbiology 65: 3767–3773.

Kokare C.R., Chakrabortty S., Rhopade N.A. 2009. Biofilm : Importance and

Applications. Indian Journal of Biothecnology. Vol 8. Page 159-168

49


Lay, W.B. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo.

Lee, J-H., J.H. Park, H.S. Cho, S.W. Joo, M.H. Cho, J. Lee. 2013. Anti-biofilm

Activities of Quercetin and Tannic Acid Against Staphylococcus aureus.

Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. Vol 29, Issue

5.

Lewis K. 2001. Riddle Of Biofilm Resistance Antimicrob Agents Chemotherapy : 45,

999-1007.

Loresta S, Murwani S, Trisunuwati P. 2012. Efek Ektrak Etanol Daun Kelor

(Moringa oleifera) Terhadap Pembentukan Biofilm Staphylococcus aureus

secara In vitro : Universitas Brawijaya

Madigan M T, Martinko, J.M., Stahl, D.A. and Clark, D.P. 2003. Biology of

Microorganisms, 10 Edition. Southem Illinois University Carbondale,

Pearson Education, Inc. Upper Saddle River, NJ. Page : 370,633-637, 673-

745.

Mah TFC, O’Toole GA. 2001. Mechanism Of Biofilm Resistance To

Antimikrobiology Agent.Trends In Microbiology : 9 No 1

Mansouri Shahla, Safa Amin, Najar Sasan G, Najar Ahmad G. 2013. Inhibitory

Activity of Iranian Plant Extracts on Growth and Biofilm Formation by

Pseudomonas aeruginosa. Malaysian Journal of Microbiology, Vol 9(2), pp

176-183.

Miksusanti, Fitriya, Mafrinda Nike. 2011. Aktivitas Campuran Ekstrak Kulit Manggis

(Garcinia mangostana L.) dan Kayu Secang (Caesalpina sappan L.)

terhadap Bacillus Cereus : Jurnal Penelitian Sains . Volume 14 Nomer 3

Mireles J.R., Toguchi A., Harshey R.M. 2001. Salmonella enterica serovar

Typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities:

surfactin inhibits biofilm formation. Journal of Bacteriology 183: 5848–

5854.

Mpila A.Deby, Fatimawali,Wiyono I.Weny . 2010. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak

Etanol Daun (Coleus atropurpureus [L] Benth) Terhadap Staphylococcus

50


aureus Escherichia coli Dan Pseudomonas aeruginosa Secara In Vitro.

Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115.

Munaf, S., Chaidir, J. 1994. Obat Antimikroba. Jakarta: Farmakologi UNSRI.

Murray Thomas S, Kazmierczak Barbara I. 2006. FlhF Is Required for Swimming

and Swarming in Pseudomonas aeruginosa. Journal of bacteryology.

Volume 188, Nomor 19.

Nichols W. W.W., Dorrington, S.M., Slack, M.P.E., and Walmsley, H.L. 1988.

Inhibition of tobramycin diffusion by binding to alginate, Antimicrob agent

Cemother, 32. Page : 518-523

Nitschke M., Costa S.G.V.A.O. 2007. Biosurfactants in food industry. Trends in

Food Science and Technology 18: 252–259.

Nugrahawati D. 2009. Pemanfaatan buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L)

sebagai cairan akumulator secara alami dan ramah lingkungan. Surakata:

Universitas Sebelas Maret .

Parikesit, Mario. 2011. Khasiat dan manfaat belimbing wuluh. Surabaya : stomata.

Prakash B.M. Veeregowda and G. Krishnappa. 2003. Biofilms: A Survival Strategy of

Bacteri. Current Sci., 85: 1299-1307.

Prasasti D, Hertiani. T. 2010. Potensi Campuran Minyak Atsiri Rimpang temulawak

dan Daun Cengkeh sebagai Inhibitor Plak Gigi. The Journal of Indonesia

Medical Plant. Vol 3.

Prayogo, Rahardja B.S., Putri R.W. 2011. Uji Potensi Sari Buah Belimbing Wuluh

(Averrhoaa bilimbi L) dalam Menghambat Pertumbuhan Bakteri Aeromonas

Salmonicida Smithia secara in Vitro: Journal Ilmiah Perikanan dan

Kelautan.,Vol 3.No 2.

Rukmono P, Zuraida R.2013. Uji kepekaan antibiotik terhadap pseudomonas

aeroginosa penyebab sepsis neonatorum: Biostatistik Fakultas Kedokteran

Universitas Lampung. Vol. 14, No. 5

51


Rodrigues L.R., van der Mei H.C., Teixeira J.A., Oliveira R. 2004. Biosurfactant

from Lactococcus lactis 53 inhibits microbial adhesion on silicone rubber.

Applied Microbiology and Biotechnology 66: 306–311.

Salyers A A, Whitt D D. 1994. Bacterial Pathogenesis : a molecular approach,

American Society for Microbiology, Washington DC. Page : 265, 268

Samad S. 2008. Perbandingan efekantibakteri dari jus belimbing (averrhoa

cavambola) terhadap streptococcus mutans pada waktu kontak dengan

konsentrasi yang berbeda. Artikel Karya Tulis Ilmiah, Fakultas Kedokteran

Universitas Diponegoro Semarang..

Sandasi, Leonard C M, Viljoen A M. 2010. The In vitro antibiofilm activity of

selected culinary herb and medical plants againt listeria monocytogenes,

Letters in Applied Microbiology (50) . Page : 30-35

Scink B. 1997. Energetices of syntrpic cooperation in methanogenik degradation.

Microbial Mol Biol Rev, 61. Page : 262-280.

Shahriar M., I. Hossain, A.N. Mahar, S. Akhter, A. Haque, M.A Bhuiyan 2012.

Preliminary Phytochemical Screening, In-Vitro Antioxidant and Cytotoxic

Activity of Five Different Extracts of Moringa Oleifera Leaf. Journal of

Applied Pharmaceutical Science 02 (05). Page : 65-68.

Silitonga W.Yusnita, Jamilah I, Suryanto Dwi. 2012. Pengendalian Biofilm Bakteri

Oportunistik dengan Panas dan Klorin : Departemen Biologi Fakultas MIPA

Universitas Sumatera Utara.

Simoes M., Simoes L.C., Machado I., Pereira M.O., Vieira M.J. 2006. Control of

flow-generated biofilms using surfactants – evidence of resistance and

recovery. Food and Bioproducts Processing 84: 338–345.

Smith J.L, Fratamico P.M, Novak J.S. 2004. Quorum sensing: a primer for food

microbiologists. Journal of Food Protection 67: 1053-1070.

Srinivasan A, M.D., Linda L. Wolfenden, M.D., Xiaoyan Song, M.D., Karen Mackie,

R.N., ... N Engl J Med 2003. An Outbreak of Pseudomonas aeruginosa

52


Infections Associated with Flexible Bronchoseopes, N Engl J Med, vol.348,

No 3

Stewart PS, Costerton JW. 2001. Antibiotic Resistance Of Bacteria In Biofilm,

Review : 358

Stoodley P, Dodds I, De Beer D, Scoth HL, Boyle JD 1998 Influence of

hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol 85: 19S–

28S.

Tarver T. 2009. Biofilms A Thread to Food Safety. Page : 46-52 Available at:

http://www.ift.org Acessed Jan 05, 2010.

Todar K. 2004. Pseudomonas aeruginosa. University of Wisconsin-Madison

Departement of Bacteriology. Available at:

http://www.textbookofbacteriology.net/pseudomonas.htmi

Todd WTA. 2007. Principles of Infectious Disease. Dalam: Davidson’s Principles

and Practice of Medicine 20th Edition. Churchill Livingstone.

Vinoth. 2012. Phytochemical Analysis and Antibacterial Activity of Moringa Oleifera

Lam. International Journal of Research in Biological Sciences 2(3). Page :

98-102

Watnick P., Kolter R. 2000. Biofilm, city of microbes. Journal of Bacteriology 182.

Page : 2675-2679.

Zhao T, Doyle MP, Zhao P. 2004. Control of Listeria monocytogenes in a biofilm by

competitive-exclusion microorganisms. Applied and Environmental

Microbiology 70. Page : 3996–4003.

http://www.textbookofbacteriology.net/pseudomonas.htmi


LAMPIRAN

54


Lampiran 1. Alur kerja penelitian

Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L)

Persiapan sampel belimbing wuluh

Pseudomonas aeruginosa

Identifikasi Belimbing Wuluh

Inokulasi Pseudomonas aeruginosa

Analisis data dan

Pembacaan dengan Mikroplate reader

Karakterisasi bakteri Pseudomonas

aeruginosa

Pembuatan media PIA dan Heterotrof

Uji penapisan fitokimia

belimbing wuluh

Uji pencegahan

pertumbuhan biofilm

Uji degradasi

biofilm

Uji penghambatan

pertumbuhan biofilm

Pembuatan suspensi bakteri dan

pengukuran OD bakteri Pembuatan seri konsentrasi

(0,5%, 1%, 2%, 4%, 8%)

Uji pembentukan dan pertumbuhan

biofilm Pseudomonas aeruginosa

Optimasi aktivitas terseleksi

55


Lampiran 2. Hasil determinasi tanaman belimbing wuluh

56


Lampiran 3.Alat dan bahan penelitian

Blender

Timbangan analitik

Oven

Vortex

Autoklaf

Mikroskop

Mikropipet

Mikrowave

Spektrometri

Mikroplate reader

Inkubator

Kulkas

Panci dan kompor

Mikroplate

Mikropipet tube

LAF

57


Belimbing wuluh

Tripton

Pepton

NaCl

Glukosa

Media PIA

Etanol 96%

Kristal violet

Biorem 1 dan 10

K2HPO4

Bahan pewarnaan

Gram

CaCl2

58


Lampiran 4. Proses penyiapan sampel belimbing wuluh

Gambar Proses Kegiatan Keterangan

Buah belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi L) yang telah

dideterminasi di LIPI dicuci

sampai bersih. Buah belimbing

wuluh yang telah dicuci

kemudian dipotong kecil-kecil

menggunakan pisau

Potongan buah belimbing wuluh

dihancurkan dengan

menggunakan blender. Setelah

disaring menggunakan kain,

saring menggunakan kertas

saring Whatman No.1

Sebanyak 50 ml air belimbing

wuluh di keringkan dengan alat

freezedry. Didapatkan sampel

serbuk buah belimbing wuluh

seberat 2 gram.

Dibuat seri konsentrasi ektrak air

belimbing wuluh (0,5%, 1%,

2%, 4%, dan 8%).

59


Lampiran 5. Hasil uji penapisan fitokimia serbuk belimbing wuluh

(-) Alkaloid (+) Flavonoid

(+) Saponin

(+) Terpenoid (-) kuinon (-) Fenolik

60


Lampiran 6. Proses pembuatan media Pseudomonas Isolation Agar (PIA) padat

dan media Heterotrof (HTR) cair


Media Pseudomonas Isolation Agar

(PIA) dan media Heterotrof

ditimbang sesuai jumlah yang

diinginkan. Bahan yang telah

ditimbang kemudian dilarutkan

dengan menggunakan aquades di

dalam erlenmeyer.

Untuk media Pseudomonas Isolation

Agar (PIA) setelah dilarutkan

kemudian dihomogenkan dengan

menggunakan microwave sampai

homogen. Media Pseudomonas

Isolation Agar (PIA) dan Heterotrof

(HTR) di sterilisasi dengan

menggunakan autoklaf pada suhu

1210C.

Media Pseudomonas Isolation Agar

(PIA) yang telah dingin dituang ke

dalam petri disk. Media

Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

dan Heterotrof (HTR) diseterilisasi

dengan menggunakan sinar

ultraviolet.

61


Lampiran 7. Proses inokulasi dan pewarnaan Gram


Lakukan fiksasi sebelum membuka

petri disk agar tidak terjadi

kontaminasi. Ambil isolat

Pseudomonas aeruginosa dengan

cara menggoreskan ose pada koloni

yang memisah.

Goreskan ose pada media

Pseudomonas Isolation Agar (PIA)

dengan metode Streak Plate. Hasil

inokulasi Pseudomonas aeruginosa

pada media Pseudomonas Isolation

Agar (PIA).

Disiapkan reagen untuk pewarnaan

Gram yaitu safranin, lugol, etanol

70% dan Kristal violet. Goreskan

isolat Pseudomonas aeruginosa

dengan menggunakan ose pada kaca

objek, kemudian tambahkan NaCl

fisiologis beberapa tetes. Keringkan

kaca objek, lalu lakukan fiksasi

sebanyak lima kali.

(+) 1 tetes kristal violet dan

didiamkan 1 menit, lalu bilas dengan

air keran dan tambahkan lugol dan

didiamkan 1 menit, lalu bilas dengan

air keran. (+) safranin beberapa tetes

dan didiamkan 1 menit, bilas dengan

etanol, kemudian dikeringkan. Amati

dengan menggunakan mikroskop.

Hasil pewarnaan Gram Pseudomonas

aeruginosa, menunjukkan warna

kemerahan, berbentuk batang dan

tidak berspora.

62


Lampiran 8. Hasil uji pembentukan dan pertumbuhan biofilm Pseudomonas

aeruginosa

Densitas biofilm

(OD595nm) / Waktu

inkubasi (Hari)

Hari ke-1

Hari ke-2

Hari ke-3

Hari ke-

4

1

0,101 0,543 0,892 0,204

2

0,114 0,571 0,645 0,185

3

0,112 0,468 0,680 0,183

4

0,111 0,450 0,655 0,179

5

0,102 0,443 0,711 0,185

6

0,108 0,468 0,722 0,182

Rata-rata

0,108 0,490 0,717 0,186

63


Lampiran 9. Desain pengujian aktivitas antibiofilm pada microplate

Gambar Desain Pengujian Pada Microplate Keterangan

1 2

3

Pertumbuhan bakteri

planktonik dan biofilm

P.aeruginosa setelah

diinkubasi selama 3 hari

pada pengujian

degradasi.

1. Sampel ekstrak.

2. Kontrol positif

3. Kontrol negatif

1

1. Pemberian ekstrak air

belimbing wuluh selama

satu jam untuk pengujian

pencegahan pertumbuhan

biofilm P.aeruginosa.

1 2 3 4

Pemberian suspensi

bakteri P.aeruginosa

pada semua sumur

pengujian pencegahan

pertumbuhan dan

penghambatan

pertumbuhan biofilm.

1. Aquades

2. Kontrol negatif

3. Uji pencegahan

pertumbuhan

biofilm

4. Uji penghambatan

pertuimbuhan

biofilm

64


Lampiran 10. Analisis data aktivitas antibiofilm sari buah belimbing wuluh

terhadap biofilm

A.Pencegahan pertumbuhan biofilm

1. Uji normalitas dan homogenitas terhadap densitas biofilm

a. Uji normalitas Kolmogorov-Sminrnov

Tujuan : Untuk melihat distribusi data densitas biofilm

Hipotesis : Ho : Data densitas biofilm terdistribusi normal

Ha : Data densitas biofilm tidak terdistribusi normal

Pengambilan keputusan

Jika nilai signifikansi ≥0,05 maka Ho diterima

Jika nilai signifikansi ≤0,05 makan Ho ditolak

Tabel. Uji normalitas Kolmogorov-Smirnov

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Densitas biofilm

N 18

Normal Parametersa Mean .59922

Std. Deviation .096467

Most Extreme Differences Absolute .244

Positive .244

Negative -.125

Kolmogorov-Smirnov Z 1.035

Asymp. Sig. (2-tailed) .234

a. Test distribution is Normal.

Keputusan : Uji normalitas absorbansi biofilm seluruh kelompok terdistribusi

normal (p≥0,05)

b. Uji homogenitas Levene

Tujuan : Untuk melihat data densitas biofilm homogen atau tidak

65


Hipotesis : Ho : Data densitas biofilm homogen

Ha : Data densitas biofilm tidak homogen




Tabel. Uji homogenitas

Keputusan : Uji homogenitas densitas biofilm seluruh kelompok homogen

(p≥0,05) sehingga bisa dilanjutkan dengan uji Anova.

2. Uji analisis varians (ANOVA) satu arah terhadap densitas biofilm

Tujuan : Untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan data densitas biofilm

Hipotesis: Ho : Data densitas biofilm tidak berbeda secara bermakna

Ha : Data densitas biofilm berbeda secara bermakna




ANOVA

Densitas biofilm

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .153 5 .031 68.710 .000

Within Groups .005 12 .000

Total .158 17

Keputusan : Densitas biofilm berbeda secara bermakna (p≤0,05), lalu pengujian

dilanjutkan dengan uji BNT/LSD

Test of Homogeneity of Variances

Densitas biofilm

Levene Statistic df1 df2 Sig.

2.126 5 12 .132

66


3. Uji Beda Nyala Terkecil (BNT) terhadap densitas biofilm

Tujuan : Untuk menentukan data densitas biofilm kelompok mana yang

memberikan nilai yang berbeda secara bermakna dengan data densitas biofilm

kelompok lainnya.

Hipotesis : Ho : Data densitas biofilm tidak berbeda secara bermakna





Multiple Comparisons

Densitas biofilm

LSD

(I)

sampel

(J)

sampel

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

kontrol

negatif

0.5 .209667* .017223 .000 .17214 .24719

1 .188000* .017223 .000 .15047 .22553

2 .192000* .017223 .000 .15447 .22953

4 .243000* .017223 .000 .20547 .28053

8 .298000* .017223 .000 .26047 .33553

0.5 0 -.209667* .017223 .000 -.24719 -.17214

1 -.021667 .017223 .232 -.05919 .01586

2 -.017667 .017223 .325 -.05519 .01986

4 .033333 .017223 .077 -.00419 .07086

8 .088333* .017223 .000 .05081 .12586

1 0 -.188000* .017223 .000 -.22553 -.15047

0.5 .021667 .017223 .232 -.01586 .05919

2 .004000 .017223 .820 -.03353 .04153

4 .055000* .017223 .008 .01747 .09253

8 .110000* .017223 .000 .07247 .14753

2 0 -.192000* .017223 .000 -.22953 -.15447

0.5 .017667 .017223 .325 -.01986 .05519

1 -.004000 .017223 .820 -.04153 .03353

67


4 .051000* .017223 .012 .01347 .08853

8 .106000* .017223 .000 .06847 .14353

4 0 -.243000* .017223 .000 -.28053 -.20547

0.5 -.033333 .017223 .077 -.07086 .00419

1 -.055000* .017223 .008 -.09253 -.01747

2 -.051000* .017223 .012 -.08853 -.01347

8 .055000* .017223 .008 .01747 .09253

8 0 -.298000* .017223 .000 -.33553 -.26047

0.5 -.088333* .017223 .000 -.12586 -.05081

1 -.110000* .017223 .000 -.14753 -.07247

2 -.106000* .017223 .000 -.14353 -.06847

4 -.055000* .017223 .008 -.09253 -.01747

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

B. Penghambatan pertumbuhan biofilm











Densitas biofilm

N 18




Positive .266

Negative -.159

68






normal (p≥0,05)










Densitas biofilm


1.481 5 12 .267

Keputusan : Uji homogenitas densitas biofilm seluruh kelompok homogen

(p≥0,05) sehingga bisa dilanjutkan dengan uji Anova.

2. Uji analisis varians (ANOVA) satu arah terhadap densitas biofilm







69


ANOVA

Densitas biopfilm

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .867 5 .173 147.524 .000

Within Groups .014 12 .001

Total .881 17






kelompok lainnya.







Densitas biofilm

LSD

(I)

VAR00

001

(J)

VAR00

001

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.



0 0.5 .238667* .027985 .000 .17769 .29964

1 .596667* .027985 .000 .53569 .65764

2 .581667* .027985 .000 .52069 .64264

4 .547333* .027985 .000 .48636 .60831

8 .500667* .027985 .000 .43969 .56164

0.5 0 -.238667* .027985 .000 -.29964 -.17769

1 .358000* .027985 .000 .29702 .41898

2 .343000* .027985 .000 .28202 .40398

4 .308667* .027985 .000 .24769 .36964

70


8 .262000* .027985 .000 .20102 .32298

1 0 -.596667* .027985 .000 -.65764 -.53569

0.5 -.358000* .027985 .000 -.41898 -.29702

2 -.015000 .027985 .602 -.07598 .04598

4 -.049333 .027985 .103 -.11031 .01164

8 -.096000* .027985 .005 -.15698 -.03502

2 0 -.581667* .027985 .000 -.64264 -.52069

0.5 -.343000* .027985 .000 -.40398 -.28202

1 .015000 .027985 .602 -.04598 .07598

4 -.034333 .027985 .243 -.09531 .02664

8 -.081000* .027985 .013 -.14198 -.02002

4 0 -.547333* .027985 .000 -.60831 -.48636

0.5 -.308667* .027985 .000 -.36964 -.24769

1 .049333 .027985 .103 -.01164 .11031

2 .034333 .027985 .243 -.02664 .09531

8 -.046667 .027985 .121 -.10764 .01431

8 0 -.500667* .027985 .000 -.56164 -.43969

0.5 -.262000* .027985 .000 -.32298 -.20102

1 .096000* .027985 .005 .03502 .15698

2 .081000* .027985 .013 .02002 .14198

4 .046667 .027985 .121 -.01431 .10764


C. Degradasi biofilm









71




densitas_biofilm

N 18




Positive .261

Negative -.207





normal (p≥0,05)










densitas_biofilm


7.859 5 12 .002

Keputusan : Uji homogenitas densitas biofilm seluruh kelompok tidak homogen

(p≤0,05) sehingga tidak bisa dilanjutkan dengan uji Anova, maka dilanjutkan

dengan uji Kruskalwalis.

72


2. Uji analisis Kruskalwalis







Test Statisticsa,b

densitas_biofilm

Chi-Square 12.750

df 5

Asymp. Sig. .026

a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: sample






kelompok lainnya.







densitas_biofilm

LSD

(I)

sampel (J) sampel

Mean

Difference (I-J) Std. Error Sig.



73


kontrol

negatif

kons-0,5% .220667* .086479 .025 .03224 .40909

kons-1% .261333* .086479 .011 .07291 .44976

kons-2% .284000* .086479 .007 .09558 .47242

kons-4% .298667* .086479 .005 .11024 .48709

kons-8% .323333* .086479 .003 .13491 .51176

kons-

0,5%

kontrol negatif -.220667* .086479 .025 -.40909 -.03224

kons-1% .040667 .086479 .647 -.14776 .22909

kons-2% .063333 .086479 .478 -.12509 .25176

kons-4% .078000 .086479 .385 -.11042 .26642

kons-8% .102667 .086479 .258 -.08576 .29109

kons-1% kontrol negatif -.261333* .086479 .011 -.44976 -.07291

kons-0,5% -.040667 .086479 .647 -.22909 .14776

kons-2% .022667 .086479 .798 -.16576 .21109

kons-4% .037333 .086479 .674 -.15109 .22576

kons-8% .062000 .086479 .487 -.12642 .25042


kons-0,5% -.063333 .086479 .478 -.25176 .12509

kons-1% -.022667 .086479 .798 -.21109 .16576

kons-4% .014667 .086479 .868 -.17376 .20309

kons-8% .039333 .086479 .657 -.14909 .22776


kons-0,5% -.078000 .086479 .385 -.26642 .11042

kons-1% -.037333 .086479 .674 -.22576 .15109

kons-2% -.014667 .086479 .868 -.20309 .17376

kons-8% .024667 .086479 .780 -.16376 .21309


kons-0,5% -.102667 .086479 .258 -.29109 .08576

kons-1% -.062000 .086479 .487 -.25042 .12642

kons-2% -.039333 .086479 .657 -.22776 .14909

kons-4% -.024667 .086479 .780 -.21309 .16376


74


Lampiran 11. Hasil rancangan pengujian aktivitas penghambatan pertumbuhan

biofilm dengan metode Response Surface Analysis (RSA)

StdOrder RunOrder PtType Blocks suhu konsentrasi waktu %

17 1 0 1 37.5 4.25 2 69.90

1 2 1 1 25 0.5 1 0.00

9 3 -1 1 25 4.25 2 78.90

3 4 1 1 25 8 1 41.20

5 5 1 1 25 0.5 3 46.80

6 6 1 1 50 0.5 3 12.06

19 7 0 1 37.5 4.25 2 77.20

13 8 -1 1 37.5 4.25 1 73.70

11 9 -1 1 37.5 0.5 2 88.70

7 10 1 1 25 8 3 51.80

8 11 1 1 50 8 3 0.00

4 12 1 1 50 8 1 0.00

2 13 1 1 50 0.5 1 0.00

15 14 0 1 37.5 4.25 2 49.70

14 15 -1 1 37.5 4.25 3 79.80

18 16 0 1 37.5 4.25 2 69.90

12 17 -1 1 37.5 8 2 73.70

16 18 0 1 37.5 4.25 2 77.20

10 19 -1 1 50 4.25 2 50.60

20 20 0 1 37.5 4.25 2 49.70

Documents

UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM SARI BUAH BELIMBING WULUH ...repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/29289/1/RESKY... · BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi . L) TERHADAP. BIOFILM