UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20309442-S42687-Atika...i UNIVERSITAS INDONESIA UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq

i

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq. DENGAN METODE DPPH DAN IDENTIFIKASI

GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF

SKRIPSI

ATIKA BENDRA 0806364441

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI EKSTENSI FARMASI

DEPOK JULI 2012

Uji aktivitas..., Atika Bendra, FMIPA UI, 2012

ii

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq. DENGAN METODE DPPH DAN IDENTIFIKASI

GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ATIKA BENDRA 0806364441

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI EKSTENSI FARMASI

DEPOK JULI 2012





vi

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kepada

Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunianya sehingga penulis

dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka

memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada

Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Indonesia. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan, dukungan, dan

bimbingan dari berbagai pihak, sangatlah sulit untuk menyelesaikan skripsi ini.

Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

(1) Ibu Dr. Katrin, M.S. selaku pembimbing yang telah menyediakan waktu,

pikiran, tenaga, dan ilmu untuk membimbing penulis selama proses

penelitian hingga penyusunan skripsi ini.

(2) Ibu Dr. Dra. Nelly Dhevita Leswara, M.Sc., Apt selaku pembimbing

akademis yang telah membimbing saya selama mengikuti perkuliahan di

Farmasi FMIPA UI.

(3) Ibu Dra. Azizahwati, M.S., selaku ketua Program Ekstensi Departemen

Farmasi FMIPA UI.

(4) Ibu Prof. Dr. Yahdiana Harahap, Apt., M.S., selaku ketua Departemen

Farmasi FMIPA UI.

(5) Seluruh staf dan dewan pengajar Departemen Farmasi FMIPA UI atas

bantuan dan bimbingannya selama mengikuti perkuliahan.

(6) Papa, mama, dan adik tercinta, serta keluarga besar H. Muhammad Zen

dan Mukhtar Jalal, yang selalu melimpahkan kasih sayang, dukungan,

harapan, semangat dan do’a.

(7) Teman-teman mahasiswa Program Sarjana Ekstensi, Reguler, dan Paralel

Departemen Farmasi FMIPA UI atas bantuan dan kerjasamanya selama

penyusunan skripsi ini.

(8) Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang telah

membantu dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini.


vii

Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan mereka dengan balasan yang

berlipat ganda. Akhir kata, saya berharap semoga skripsi ini membawa manfaat

bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

2012



ix

ABSTRAK

Nama : Atika Bendra Program Studi : Ekstensi farmasi Judul : Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premna

oblongata Miq. dengan Metode DPPH dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia Dari Fraksi Teraktif

Antioksidan adalah senyawa yang mampu menghilangkan dan menahan pembentukan radikal bebas dalam tubuh. Radikal bebas adalah molekul yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya sehingga sangat reaktif untuk mendapatkan pasangan elektron dengan mengikat sel-sel tubuh. Apabila hal tersebut terjadi secara terus menerus, ini dapat menyebabkan kerusakan dan kematian sel. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dua macam, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan sintetik dikhawatirkan dapat memberi efek samping yang berbahaya bagi kesehatan manusia karena bersifat karsinogenik. Kekhawatiran akan adanya kemungkinan efek samping dari antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif. Indonesia memiliki keanekaragaman tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan alami. Pada penelitian ini, dilakukan uji aktivitas antioksidan dari fraksi ekstrak daun cincau perdu (Premna oblongata Miq.). Pengujian dilakukan dengan metode 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH). Daun Premna oblongata Miq. diekstraksi dengan n-heksan, etil asetat, dan metanol. Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi difraksinasi dengan kromotografi kolom dipercepat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak yang paling aktif adalah ekstrak metanol dengan nilai IC50 sebesar 20.01 µg/ml. Selanjutnya ekstrak teraktif difraksinasi dengan kromotografi kolom dipercepat, dan didapatkan 6 fraksi gabungan. Hasil penggabungan fraksi masing-masing diuji aktifitas antioksidannya, dan diperoleh fraksi 5 sebagai fraksi teraktif dengan nilai IC50 sebesar 23.51 µg/ml. Golongan senyawa pada fraksi teraktif adalah flavonoid, glikon, saponin, dan tanin. Kata Kunci : DPPH., Premna oblongata Miq., Cincau perdu xv + 63 halaman : 14 gambar; 5 tabel; 13 lampiran Daftar Acuan : 31 ( 1958-2011)


x

ABSTRACT

Name : Atika Bendra Study Program : Ekstensi farmasi Title : Antioxidant Activity Test of Extract of Premna

oblongata Miq. Leaf with the DPPH method and Identification of Chemical Compounds Type of the most active Faction

Antioxidants are compounds which can remove and resist free radical formation in the body. Free radical are unstable molecules which is caused by its unpaired free electron in the outer electron orbital which make it reactively bind body cells to gain the electron pair. if this continuously happens, the cells will be damaged and can cause death cells. For its sources, antioxidants are categorized as natural and synthetic antioxidants. Synthetic antioxidants’s carcinogenicity is faired to give harmful side effects to human healthy, which causes natural antioxidants become chosen alternative as antioxidant sources. Indonesia has many kinds of plants which can be used as antioxidant sources. This study is focused on antioxidant activity of Cincau Perdu leaves extract (Premna oblongata Miq.) by 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay. Premna oblongata Miq. leaves is extracted using n-hexane, ethyl acetate and methanol. The IC50 value of ethanol extract as the most active fraction was 20.01 µg/mL. The extract which had the highest antioxidant activity were fractinated by accelerated column chromatography and were earned 6 combination factions. The antioxidant activity of combination fractions were tested by DPPH assay and known having 5 active fractions whose the lowest IC50 value was 23.51 µg/mL. The compounds of the active fractions were flavonoid, glikon, saponin and tanin.

Keywords : DPPH., Premna oblongata Miq., Cincau Perdu xv + 63 pages : 14 pictures; 5 table; 13 attachments Refference : 31 ( 1958-2011)


xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ..................................................................................... ii SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME ................................... iii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ v KATA PENGANTAR .................................................................................... vi HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... viii ABSTRAK……………. ................................................................................. ix ABSTRACT……….. ...................................................................................... x DAFTAR ISI………………………………………………………………. .. xi DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xiii DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................ 1

1.1. Latar Belakang .................................................................................... 1 1.2. Tujuan Penelitian ................................................................................ 3 1.3. Manfaat Penelitian .............................................................................. 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 4 2.1. Premna oblongata Miq. .................................................................... 4 2.2. Simplisia ........................................................................................... 5 2.3. Ekstrak .............................................................................................. 5 2.4. Ekstraksi ............................................................................................ 5 2.5. Kromotografi ..................................................................................... 8 2.6. Kromotografi Lapis tipis ................................................................... 8 2.7. Kromotografi Kolom ........................................................................ 8 2.8. Kromotografi Cair Vakum ................................................................ 9 2.9. Antioksidan ....................................................................................... 10 2.10. Uji Aktivitas Antioksidan ................................................................. 11

BAB 3. METODE PENELITIAN ................................................................ 14 3.1. Lokasi dan Waktu Penelitan ............................................................. 14 3.2. Alat ................................................................................................... 14 3.3. Bahan ................................................................................................ 14 3.4. Cara Kerja ......................................................................................... 15


xii

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 23

4.1 Penyiapan Simplisia .......................................................................... 23 4.2 Ekstraksi ............................................................................................ 24 4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak .................................................... 24 4.4 Pemisahan Ekstrak ............................................................................ 25 4.5 Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Aktif ............................................. 26 4.6 Penapisan Fitokimia Fraksi Teraktif ................................................. 27

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 30

5.1 Kesimpulan ...................................................................................... 30 5.2 Saran ............................................................................................... 30

DAFTAR ACUAN ........................................................................................ 31


xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Premna oblongata Miq. ........................................................... 33 Gambar 2.2 Reaksi antioksidan dengan radikal DPPH…………………... 12 Gambar 3.1 Penguap vakum putar (Rotary evaporator Buchi) ................... 34 Gambar 3.2 Spektrofotometer UV-Vis ......................................................... 34 Gambar 4.1 Ekstrak Hasil Ekstraksi ............................................................ 35 Gambar 4.2 Hasil Uji Kualitatif Fraksi Ekstrak Gabungan ......................... 36 Gambar 4.3 Spektrum serapan larutan DPPH .............................................. 37 Gambar 4.4 Identifikasi golongan senyawa alkaloid fraksi 5 ...................... 38 Gambar 4.5 Identifikasi golongan senyawa flavonoid fraksi 5 ................... 39 Gambar 4.6 Identifikasi golongan senyawa glikon fraksi 5 ........................ 40 Gambar 4.7 Identifikasi golongan senyawa antrakinon fraksi 5 .................. 41 Gambar 4.8 Identifikasi golongan senyawa saponin fraksi 5....................... 42 Gambar 4.9 Identifikasi golongan senyawa tanin fraksi 5 ........................... 43 Gambar 4.10 Identifikasi golongan senyawa terpen fraksi 5 ......................... 44


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Data Rendemen Ekstrak Daun Premna Oblongata Miq. .................. 45 Tabel 4.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premna Oblongata Miq .................................................................................................... 46 Tabel 4.3 Berat Fraksi Ekstrak Hasil Fraksinasi Kolom Dipercepat ............. 47 Tabel 4.4 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-Fraksi Ekstrak Metanol

Premna Oblongata Miq. ................................................................ 48 Tabel 4.5. Identifikasi golongan kimia fraksi teraktif ..................................... 50


xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil determinasi sampel Premna oblongata Miq. .................. 51 Lampiran 2. Skema ekstraksi dan fraksinasi sampel Premna oblongata Miq .......................................................................................... 52 Lampiran 3. Kurva hubungan konsentrasi kuersetin dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 53 Lampiran 4. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak heksan dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 54 Lampiran 5. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 55 Lampiran 6. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak metanol dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 56 Lampiran 7. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 1 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 57 Lampiran 8. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 2 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 58 Lampiran 9. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 3 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 59 Lampiran 10. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 4 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 60 Lampiran 11. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 5 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 61 Lampiran 12. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 6 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 62 Lampiran 13. Sertifikat Analisis DPPH .......................................................... 63


1

Universitas Indonesia

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Akhir-akhir ini dunia kesehatan banyak membahas tentang radikal bebas

dan antioksidan. Hal ini terjadi karena sebagian besar penyakit diawali oleh

adanya reaksi oksidasi yang berlebihan didalam tubuh. Reaksi oksidasi dapat

terjadi setiap saat. Reaksi ini mencetuskan terbentuknya radikal bebas yang sangat

aktif, yang dapat merusak struktur dan fungsi sel.

Radikal bebas adalah suatu senyawa atom atau molekul yang mengandung

satu atau lebih elektron tidak berpasangan. Adanya elektron yang tidak

berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan,

dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada disekitarnya.

Radikal bebas sangat berbahaya dikarenakan tingginya reaktivitasnya yang

mengakibatkan terbentuknya senyawa radikal baru. Bila senyawa radikal baru

tersebut bertemu dengan molekul lain, maka akan terbentuk radikal baru lagi dan

seterusnya hingga terjadi reaksi berantai.

Radikal bebas dapat mengganggu integritas sel dan dapat bereaksi dengan

komponen-komponen sel, baik komponen struktural meliputi molekul-molekul

penyusun membran maupun komponen fungsional meliputi protein, enzim-enzim,

dan DNA (Hidajat, 2005). Radikal bebas dapat dijumpai pada lingkungan,

beberapa logam misalnya besi dan tembaga, asap rokok, polusi udara, obat, bahan

beracun, makanan dalam kemasan, bahan aditif, dan sinar ultraviolet matahari

yang menyebabkan radiasi. Reaktifitas radikal bebas itu dapat dihambat oleh

sistem antioksidan yang merupakan bagian dari sistem kekebalan tubuh (Winarsi,

2007).

Antioksidan adalah molekul yang mampu menghambat oksidasi molekul

yang dapat menghasilkan radikal bebas (Rajnarayana, Ajitha, Gopireddy, dan

Giriprasad, 2011). Antioksidan telah secara luas digunakan untuk melindungi

makanan dari degradasi oksidatif. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dua

macam, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik (buatan). Antioksidan


2


sintetik yang paling sering digunakan adalah Propil Galat (PG), Butylated

Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluene (BHT) dan Tert-

butylhydroquinone (TBHQ). Antioksidan sintetik ini dikhawatirkan dapat

memberi efek samping yang berbahaya bagi kesehatan manusia karena bersifat

karsinogenik. Berbagai studi mengenai BHA dan BHT menunjukkan bahwa

komponen ini dapat menimbulkan tumor pada hewan percobaan pada

penggunakan dalam jangka panjang (Andarwulan, Wijaya, dan Cahyono, 1996).

Kekhawatiran akan adanya kemungkinan efek samping dari antioksidan

sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif. Antioksidan alami

mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan senyawa oksigen

reaktif, menghambat terjadinya penyakit degeneratif serta mampu menghambat

peroksidasi lipid pada makanan (Sunarni, 2005). Antioksidan alami perlu

dikembangkan untuk memperoleh antioksidan yang lebih aman dikonsumsi.

Di Indonesia terdapat empat jenis tanaman cincau, yaitu cincau hijau

(Cyclea barbata), Cincau Perdu (Premna oblongata Miq.), cincau minyak

(Stephania hermandifolia), dan cincau hitam (Mesona palustris). Cincau yang

banyak dimanfaatkan oleh masyarakat adalah cincau hijau, cincau perdu, dan

cincau hitam (Pitojo dan Sumiati, 2005). Berdasarkan yang telah ada, diketahui

bahwa tanaman cincau hijau (Cyclea barbata) mengandung alkaloid 0,98% dan

fenol total 2,21%. Alkaloid bisbenzilisokuinolin dari akar cincau hijau

mempunyai aktifitas sitotoksik, sangat potensial sebagai kemoprotektif serta

bersifat sebagai antioksidan (Zakaria, 1996). Penelitian lainnya menunjukkan

bahwa daun cincau perdu (Premna oblongata Miq.) memiliki kandungan klorofil

tertinggi dibandingkan pegagan (Centella asitica), daun katuk (Saurpus

androgynus Merr), dan daun murbei (Morus alba L) (Nurdin, Kusharto, Tanziha,

dan Januwati, 2009).

Pada penelitian ini, dilakukan uji aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi

Premna oblongata Miq. serta identifikasi golongan senyawa kimia dari fraksi

teraktif. Aktivitas antioksidan Premna oblongata Miq. diuji dengan

menggunakan metode DPPH (1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil). Metode DPPH

memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.


3


DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna

ungu gelap (Molyneux, 2004).

Penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan baru mengenai

cincau perdu (Premna oblongata Miq.) sebagai sumber antioksidan alami yang

baru, dan memberi nilai tambah bagi cincau perdu yang telah banyak dikonsumsi

masyarakat sebagai bahan pangan.

1.2 Tujuan Penelitian

a. Mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak daun Premna oblongata Miq.

b. Mengetahui golongan senyawa kimia dari fraksi paling aktif daun Premna

oblongata Miq.

1.3 Manfaat Penelitian

Hasil uji aktivitas antioksidan pada Premna oblongata Miq. diharapkan

dapat menambah informasi dan mendukung penggunaan Premna oblongata Miq.

sebagai antioksidan.


4


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Premna oblongata Miq.

2.1.1 Klasifikasi (Backer dan Brink, 1965)

Tumbuhan Premna oblongata Miq. secara taksonomi memiliki klasifikasi

ilmiah sebagai berikut :

Kerajaan : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Magnoliopsida

Bangsa : Lamiales

Suku : Verbenaceae

Marga : Premna

Jenis : Premna oblongata Miq.

Sinonim : Premna oblongifolia Merr.

2.1.2 Morfologi

Tanaman cincau perdu ( Premna oblongata Miq.) adalah tanaman asli

Indonesia dan mempunyai nama lain diantaranya Camcao, Juju, Kepleng (Jawa),

Camcauh, dan Tahulu (Sunda). Tumbuhan ini berkembang subur di dataran rendah

sampai daerah dengan ketinggian 800 meter diatas permukaan laut. Tanaman ini

tumbuh menyebar di daerah Jawa Barat (sekitar Gunung Salak, Batujajar,

Ciampea, dan Ciomas), Jawa Tengah (Gunung Ungaran, Gunung Ijen), Sulawesi,

Bali, Lombok, dan Sumbawa. Tanaman cincau sering ditemukan tumbuh sebagai

tanaman liar, tetapi ada juga yang sengaja dibudidayakan di pekarangan rumah.

Batang Premna oblongata Miq. tidak menjalar atau merambat seperti

Cyclea barbata, melainkan tegak seperti batang tanaman pada umumnya. Daun

berbentuk bulat telur, panjang daun lebih dari 1,5 kali lebarnya dengan tulang

daun agak besar (Backer dan Brink, 1965). Daun Premna oblongata Miq. secara

tradisional dimanfaatkan sebagai pembuat makanan sejenis agar-agar yang banyak


5


dijual sebagai bahan pengisi minuman es cincau yang berkhasiat sebagai penyejuk

perut, menurunkan panas dan menanggulangi gangguan pencernaan (Pitojo, 2008).

Gambar 2.1.

2.2 Simplisia (Departeman Kesehatan RI, 1995)

Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang

belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa

bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi tiga, yaitu simplisia

nabati, simplisia hewani, dan simplisia pelikan (mineral).

Simplisia nabati adalah simplisia yang berupa tanaman utuh, bagian

tanaman atau eksudat tanaman. Simplisia hewani adalah simplisia yang dapat

berupa hewan utuh atau zat-zat berguna yang dihasilkan oleh hewan dan belum

berupa bahan kimia murni, misalnya minyak ikan dan madu. Simplisia pelikan

atau mineral adalah simplisia berupa bahan pelikan atau mineral yang belum

diolah atau telah diolah dengan cara sederhana dan belum berupa bahan kimia

murni, contoh serbuk seng dan serbuk tembaga.

2.3 Ekstrak (Farmakope Indonesia, 1995)

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan. Sebagian besar ekstrak dibuat dengan mengekstraksi bahan baku obat

secara perkolasi. Seluruh perkolat biasanya dipekatkan dengan cara destilasi

dengan pengurangan tekanan, agar bahan utama obat sesedikit mungkin terkena

panas.

2.4. Ekstraksi (Parameter Standar, 2000)

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak terlarut dengan pelarut cair. Simplisia

yang diekstraksi mengandung berbagai senyawa aktif yang dapat larut dan


6


senyawa aktif yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-

lain.

Untuk mengekstraksi bahan alam, terdapat sejumlah metode menggunakan

pelarut organik atau pelarut yang mengandung air yang dapat diterapkan. Pada

ekstraksi cair-padat bahan tanaman mengalami kontak dengan pelarut. Proses

keseluruhannya bersifat dinamis dan dapat disederhanakan kedalam beberapa

tahap. Pada tahap pertama misalnya pelarut harus berdifusi kedalam sel, pada

tahap selanjutnya pelarut harus dapat melarutkan metabolit tanaman dan akhirnya

harus berdifusi keluar sel meningkatkan jumlah metabolit yang terekstraksi.

Beberapa metode yang sering digunakan dalam ekstraksi bahan alam antara lain :

2.4.1 Cara Dingin

a. Maserasi

Merupakan metode yang sederhana, tetapi masih digunakan secara luas.

Prosedurnya dilakukan dengan merendam bahan tanaman (simplisia) dalam

pelarut yang sesuai dalam wadah tertutup pada suhu kamar. Metode ini sesuai

baik untuk ekstraksi pendahuluan maupun untuk jumlah besar. Pengadukan

sesekali ataupun secara konstan (dengan menggunakan alat pengocok mekanik

untuk menjamin kehomogenan) dapat meningkatkan kecepatan ekstraksi. Proses

ekstraksi dapat dihentikan ketika tercapai keseimbangan antara konsentrasi

metabolit dalam ekstrak dan dalam bahan tanaman. Setelah ekstraksi, residu

bahan tanaman (maserat), harus dipisahkan dari pelarut. Hal ini melibatkan proses

pemisahan kasar dengan cara dekantasi, biasanya diikuti dengan tahap

penyaringan. Sentrifugasi mungkin diperlukan jika serbuk terlalu halus untuk

disaring. Untuk memastikan ekstraksi yang menyeluruh, umumnya dilakukan

maserasi pendahuluan, yang diikuti pemisahan dan penambahan pelarut baru

(fresh solvent) ke maserat. Hal ini bisa dilakukan secara periodik dengan semua

filtrat dikumpulkan.

Kelebihan maserasi adalah peralatan yang digunakan sederhana, dan

efektif untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan panas karena dilakukan pada

temperatur kamar, sehingga tidak menyebabkan degradasi senyawa-senyawa yang

tidak tahan panas. Kelemahan dari maserasi adalah prosesnya memakan waktu

yang cukup lama dan dapat berlangsung beberapa jam sampai beberapa minggu.


7


Ekstraksi secara menyeluruh juga dapat menghabiskan sejumlah besar volume

pelarut dan dapat berpotensi hilangnya metabolit. Selain itu, beberapa senyawa

tidak terekstraksi secara efisien jika kurang terlarut dalam temperatur kamar.

b. Perkolasi

Pada perkolasi, serbuk tanaman direndam dalam pelarut pada sebuah alat

perkolator. Perkolasi cukup sesuai baik untuk ekstraksi pendahuluan maupun

dalan jumlah besar. Seperti pada maserasi, untuk mengekstrak secara menyeluruh

dilakukan dengan penambahan pelarut yang baru (fresh solvent) dan semua

ekstrak dikumpulkan. Untuk meyakinkan perkolasi sudah sempurna, perkolat

dapat diuji adanya metabolit dengan reagen spesifik.

2.4.2 Cara Panas

a. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu baru

yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi secara

kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

b. Refluks

Ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu

tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin

balik. Kekurangan yang utama dari metode ini adalah terdegradasinya komponen

yang tidak tahan panas.

c. Digesti

Adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur

yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan

pada temperatur 400-500C.

d. Infusa

Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih), temperatur terukur (960-

980C) selama waktu tertentu (15-20 menit).

e. Dekok

Dekok adalah infusa pada waktu yang lebih lama dan temperatur sampai

titik didih air.


8


g. Fraksinasi

Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan memisahkan

golongan utama kandungan yang satu dari golongan utama yang lain. Pemisahan

jumlah dan jenis senyawa menjadi fraksi yang berbeda yang tergantung pada jenis

simplisia. Senyawa-senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar,

begitu pula senyawa yang bersifat non polar akan masuk ke pelarut non polar

(Harborne, 1987).

2.5 Kromatografi

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut di antara dua

fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Fase gerak

membawa zat terlarut melalui media hingga terpisah dari zat terlarut lainnya, yang

terelusi lebih awal atau lebih akhir. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif,

maka teknik ini disebut kromatografi penjerapan (adsorption chromatography),

sementara bila berupa zat cair, maka disebut dengan kromatografi pembagian

(partition chromatoghraphy) (Harmita, 2006).

2.6 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis adalah suatu metode pemisahan fitokimia yang

didasarkan atas penjerapan, partisi atau gabungannya. Metode ini digunakan untuk

pemisahan senyawa secara cepat dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk

halus yang dilapiskan serba rata pada lempeng kaca (Harmita, 2006; Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, 1979).

2.7 Kromatografi Kolom (Departeman Kesehatan Republik Indonesia,

1979)

2.7.1 Kromotografi Kolom Adsorbsi

Pada kromotografi kolom adsorpsi, zat penjerap dalam keadaan kering

atau sebagai bubur, dimampatkan ke dalam tabung kromatografi kaca atau kuarsa

dengan ukuran tertentu dan mempunyai lubang pengalir keluar dengan ukuran

tertentu. Zat yang akan diuji dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut kemudian


9


dituangkan ke dalam kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam zat penjerap. Zat

berkhasiat diadsorpsi dari larutan secara sempurna oleh bahan penjerap berupa

pita sempit pada puncak kolom. Dengan penambahan pelarut lebih lanjut melalui

kolom, dengan atau tanpa tekanan udara, masing-masing zat bergerak turun dalam

kolom dengan kecepatan tertentu, sehingga terjadi pemisahan dan diperoleh

kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi oleh sejumlah variabel,

misalnya daya adsorpsi zat penjerap, ukuran partikel dan luas permukaan, sifat

dan polaritas pelarut, tekanan yang digunakan dan suhu sistem kromatografi.

2.7.2 Kromatografi Kolom Partisi

Pada kromatografi partisi, zat yang dipisahkan terbagi antara dua cairan

yang tidak saling bercampur. Salah satu cairan, yaitu fase diam, umumnya

diadsorpsikan pada penyangga padat, karena itu mempunyai area permukaan yang

sangat luas terhadap pelarut yang mengalir atau fase gerak. Hal ini menyebabkan

diperolehnya pemisahan yang baik yang tidak dapat dicapai dengan cara

penyarian cairan-cairan yang biasa. Kromatografi partisi dilakukan dengan cara

yang serupa dengan kromatografi adsorbsi, yaitu campuran yang telah dilarutkan

dalarn sedikit pelarut, ditambahkan pada permukaan kolom dan elusi dilakukan

dengan pelarut yang mengalir.

2.8 Kromatografi Cair Vakum (Kromatografi Kolom Dipercepat)

Kromatografi cair-vakum merupakan kromatografi kolom yang dikemas

kering biasanya dengan penjerap kromatografi lapis tipis 10-4 µg pada kondisi

vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya

berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum

agar diperoleh kerapatan maksimum. Setelah diperoleh kerapatan yang

maksimum, kemudian vakum dihentikan dan pelarut yang kepolarannya rendah

dituangkan kedalam permukaan penjerap lalu divakum lagi. Alat yang digunakan

terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa

vakum serta wadah penampung fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah

sampel yang lebih banyak dari pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap

ekonomis dalam sisi biaya (Johnson, 1991).


10


Salah satu cara pemisahan kromatografi cair vakum adalah kromatografi

kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan

terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa

vakum serta wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi

2,5cm, kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk, dilarutkan dalam

pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut

ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran ini

digerus sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam corong G-3

kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kertas saring.

Elusi diawali dengan pelarut non polar dilanjutkan dengan kombinasi pelarut

dengan polaritas meningkat. Jumlah pelarut yang digunakan setiap kali elusi

adalah sebagai berikut untuk bobot ekstrak sampai lima gram diperlukan 25 ml

pelarut, untuk 10-30 g ekstrak diperlukan 50 ml pelarut. Dalam hal ini, diameter

corong dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan ekstrak dipermukaan kolom

setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut dituangkan ke permukaan kolom

kemudian dihisapkan pompa vakum. Ekstrak ditampung dalam wadah terpisah

sehingga menghasilkan sejumlah fraksi (Soediro, 1986).

2.9 Antioksidan

Antioksidan adalah senyawa yang mampu menghilangkan, membersihkan,

dan menahan pembentukan oksigen reaktif atau radikal bebas dalam tubuh.

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil karena memiliki

elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya sehingga sangat reaktif

untuk mendapatkan pasangan elektron dengan mengikat sel-sel tubuh. Apabila hal

tersebut terjadi secara terus menerus dapat menyebabkan kerusakan dan kematian

sel (Lautan, 1997). Antioksidan ditujukan untuk mencegah dan mengobati

penyakit seperti aterosklerosis, stroke, diabetes, alzheimer, dan kanker (Aqil,

Ahmad dan Mehmood, 2006).

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau

reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul yang kecil, tetapi mampu

mengaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara mencegah terbentuknya


11


radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi

oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang reaktif.

Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dalam dua kelompok yaitu

antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami) dan antioksidan

sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia). Sedangkan

berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi tiga

kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier.

Antioksidan primer disebut juga sebagai antioksidan enzimatis.

Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase, katalase, dan glutation

peroksidase. Enzim-enzim ini menghambat pembentukan radikal bebas dengan

cara memutus reaksi berantai (polimerisasi), dan mengubahnya menjadi produk

yang lebih stabil. Antioksidan kelompok ini disebut juga chain-breaking-

antioxidant (Winarsi, 2007).

Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau non-

enzimatis. Cara kerja sistem antioksidan non-enzimatis yaitu dengan cara

memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas. Akibatnya radikal bebas

tidak bereaksi dengan komponen seluler. Contoh antioksidan sekunder ialah

vitamin E, vitamin C, flavonoid, asam urat, bilirubin, dan albumin (Lampe, 1999).

Antioksidan tersier contohnya enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida

reduktase yang berperan dalam perbaikan biomolekul yang dirusak oleh radikal

bebas. Kerusakan DNA yang terinduksi senyawa radikal bebas dicirikan oleh

rusaknya single dan double stand, baik gugus basa maupun non-basa. Perbaikan

kerusakan basa dalam DNA yang diinduksi senyawa oksigen reaktif terjadi

melalui perbaikan jalur eksisi basa. Pada umumnya, eksisi basa terjadi dengan

cara memusnahkan basa yang rusak, yang dilakukan oleh DNA glikosilase

(Winarsi, 2007).

2.10 Uji Aktivitas Antioksidan

Beberapa metode uji untuk menentukan aktivitas antioksidan antara lain:

2.10.1 Uji DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan sering

digunakan untuk menilai aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau eksrtak


12


bahan alam. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau

radikal hidrogen pada DPPH akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH.

Prinsip uji DPPH adalah penghilangan warna untuk mengukur kapasitas

antioksidan yang langsung menjangkau radikal DPPH dengan pemantauan

absorbansi pada panjang gelombang 517 nm menggunakan spektrofotometer.

Radikal DPPH dengan nitrogen organik terpusat adalah radikal bebas stabil

dengan warna ungu gelap yang ketika direduksi menjadi bentuk nonradikal oleh

antioksidan menjadi warna kuning (Yu, 2008).

1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazin

(radikal bebas) (nonradikal)

Gambar 2.2 Reaksi antioksidan dengan radikal DPPH

[Sumber : Molineux, 2004]

2.10.2 Uji ABTS

Prinsip uji ABTS adalah penghilangan warna kation ABTS untuk

mengukur kapasitas antioksidan yang langsung bereaksi dengan radikal kation

ABTS. ABTS adalah suatu radikal dengan pusat nitrogen yang mempunyai

karakteristik warna biru-hijau, yang bila tereduksi oleh antioksidan akan berubah

menjadi bentuk nonradikal, dari berwarna menjadi tidak berwarna. Kemampuan

aktivitas antioksidan secara spektrofotometer pada panjang gelombang 734.

Hasilnya dibandingkan dengan standar yakni senyawa trolox (Yu, 2008).

2.10.3 Uji Penghambatan Radikal Superoksida

Uji ini mengukur kemampuan antioksidan menggunakan medan molekular

nitroblue tetrazolium (NBT), dalam meredam radikal superoksida yang dihasilkan

sistem enzimatik hipoxantin-xantin oksidase (HPX-XOD). NBT memiliki warna

kuning yang melalui reduksi oleh radikal superoksida membentuk formazan yang

berwarna biru, dan terukur pada panjang gelombang 560 nm dengan

+ R‐H + R•


13


spektrofotometer. Kemampuan ekstrak untuk penghambatan warna hingga 50%

diukur dalam EC50 (Yu, 2008).

2.10.4 Uji Kapasitas Serapan Radikal Oksigen atau Oxygen Radical Absorbance

Capacity (ORAC)

Uji ini dilakukan dengan menggunakan trolox (analog vitamin E) sebagai

standar untuk menentukan trolox ekuivalen (TE). Nilai ORAC kemudian dihitung

dari TE dan dinyatakan sebagai satuan atau nilai ORAC. Semakin tinggi nilai

ORAC, semakin besar kekuatan nilai antioksidannya. Uji ini berdasarkan

pembentukan radikal bebas menggunakan AAPH (2,2-azobis-2-amido propane

dihydrochloride) dan pengukuran dari fluoresensi dengan adanya penghambat

radikal. Penelitian terbaru telah melaporkan assay ORAC dengan otomatisasi.

Pada uji ini β-phycoerythrin (β-PE) digunakan sebagai target radikal bebas,

AAPH sebagai penghasil radikal peroksil dan trolox sebagai kontrol standar.

Setelah penambahan AAPH ke larutan uji, fluoresensi direkam dan aktivitas

antioksidan dinyatakan sebagai trolox ekuivalen (TE) (Bank dan Lenoble, 2002).

2.10.5 Uji Kapasitas Penghambatan Radikal Hidroksil atau Hydroxyl Radical

Scavenging Capacity (HOSC).

Pada metode HOSC, radikal hidroksi yang terbentuk oleh oksidasi dibuat

bereaksi dengan dimetil sulfoksida (DMSO) untuk menghasilkan formaldehid.

Formaldehid membentuk warna kuning intensif dengan pereaksi nash (ammonium

asetat 2 M). Intensitas dari warna kuning yang terbentuk diukur pada panjang

gelombang 412 nm dengan spektrofotometer. Trolox dijadikan sebagai standar di

mana hasil dinyatakan sebagai ekuivalen mikromol trolox per unit sampel (Yu,

2008).


14


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fitokimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia Depok, selama

kurang lebih lima bulan, dari bulan Januari hingga Mei 2012.

3.2 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender, peralatan maserasi

(IKA Labortechnik KS501D), cawan penguap, penguap vakum putar (rotary

evaporator Buchi) (Gambar 3.1), kolom kromatografi vakum, labu erlenmeyer,

tabung reaksi, vial, botol, labu takar, gelas ukur, penampung berbagai ukuran,

pipet volume, pipet mikro (Eppendorf), pipet tetes (Pyrex), corong Buchner

(Jangkar), spektrofotometer UV-VIS (Gambar 3.2), kuvet, plat tetes, gelas arloji,

rak tabung reaksi, batang pengaduk, spatel, sendok tanduk, timbangan analitik

(ACIS), bejana kromatografi, kertas saring, peralatan kolom kromatografi vakum,

vortex-mixer (VM-2000), inkubator 37˚C (Memmert) dan lemari pendingin.

3.3 Bahan

3.3.1 Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun cincau perdu

(Premna oblongata Miq.) yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan

Aromatik (BALITTRO) dan dideterminasi di Herbarium Bogorinese (LIPI),

Cibinong.

3.3.2 Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah n-heksan, etil

asetat, dan metanol teknis yang telah didestilasi; metanol p.a; lempeng KLT;

butanol; asam asetat; aqua; H2SO4 10 % sebagai penampak noda pada KLT; silika

gel (70-230 mesh, E. Merck 1.07734); asam klorida p.a (Merck); asam sulfat p.a


15


(Merck); benzene p.a (Merck); asam asetat anhidrat; asam borat; asam oksalat;

besi (III) klorida; etanol 96 %; natrium hidroksida; serbuk magnesium; serbuk

seng; gelatin; natrium klorida; Mayer LP; Dragendorff LP; Bouchardat LP;

Molisch LP; DPPH (Sigma-Aldrich). Bahan pembanding adalah Kuersetin

(Sigma-Aldrich).

3.4 Cara Kerja

3.4.1 Penyiapan bahan

Tanaman yang digunakan adalah daun Premna oblongata Miq.. Sebanyak

10 kg Premna oblongata Miq. yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat

dikeringkan selama kurang lebih 5 hari dan diserbukkan dengan mesin penggiling

(blender) sehingga menghasilkan 1 kg serbuk simplisia.

3.4.2 Pembuatan ekstrak

Maserasi dilakukan pada serbuk simplisia menggunakan pelarut dengan

kepolaran yang meningkat mulai dari n-heksan, etil asetat dan metanol. Maserasi

dilakukan sampai filtrat terlihat hampir tidak berwarna (dilakukan pengulangan

maserasi sampai lima kali) lalu filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan

dievaporasi dengan rotary evaporator (pada suhu 50oC) sehingga diperoleh

ekstrak n-heksan kental yang masih dapat dituang, lalu ekstrak dikeringkan pada

suhu kamar. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang. Ampas yang sudah

dikeringkan, dimaserasi berturut-turut dengan pelarut etil asetat dan metanol.

Dengan prosedur dan perlakuan yang sama akan diperoleh ekstrak etil asetat dan

metanol. Proses maserasi menggunakan kurang lebih 5 liter pelarut dengan

pengocokan selama 6 jam dan didiamkan selama 18 jam setelah pengocokan.

3.4.3 Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Secara KLT

Masing-masing 50 mg ekstrak dilarutkan dalam metanol 50 ml. Masing-

masing ekstrak tersebut ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254 yang telah

dielusi dengan fase gerak tertentu, sebanyak 5 µl pada titik awal penotolan.

Penotolan dilakukan secara terpisah dengan jarak lebih kurang 1,5 cm antara zat

yang diperiksa. Untuk menentukan bercak yang mempunyai aktivitas antioksidan,


16


pereaksi semprot yang digunakan adalah larutan DPPH konsentrasi 100 µg/ml.

Semprot lempeng yang yang telah ditotolkan dengan larutan DPPH, lalu diamkan

beberapa saat. Senyawa aktif penangkal radikal bebas akan menunjukkan bercak

berwarna kuning pucat dengan latar belakang ungu (Isnindar, Setyowati, dan

Wahyuono).

3.4.4 Uji aktivitas antioksidan ekstrak

Sejumlah masing-masing ekstrak dari daun Premna oblongata Miq.

(ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol) dilarutkan dalam metanol p.a dengan

konsentrasi 1000 µg/mL sebagai larutan induk kemudian dibuat dalam berbagai

konsentrasi (1; 5; 10; 25; 50; dan 100 µg/mL) untuk masing-masing ekstrak yang

diperoleh, selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dalam tiap tabung

reaksi ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH dalam 2,0 mL metanol kemudian

diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit selanjutnya serapan diukur pada

panjang gelombang 517 nm. Sebagai pembanding digunakan kuersetin

(konsentrasi 1; 2; 3; 4; 5; dan 6 µg/mL). Nilai IC50 dihitung masing-masing

dengan menggunakan rumus persamaan regresi (Blois, 1958).

3.4.4.1 Optimasi Panjang Gelombang DPPH

Larutan DPPH yang akan digunakan dibuat dengan cara menimbang

seksama lebih kurang 10 mg DPPH ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a

dalam labu ukur 100,0 ml dan dicukupkan dengan metanol p.a hingga tanda batas,

kocok sampai homogen sehingga didapat larutan DPPH 100 µg/ml. Larutan

DPPH disimpan dalam wadah yang dilindungi dari cahaya dengan cara

melapisinya dengan kertas aluminium. Untuk setiap pengujian, larutan DPPH

harus dibuat baru. Larutan ini ditentukan spektrum serapannya menggunakan

spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200 nm hingga 800 nm serta

ditentukan panjang gelombang optimumnya.

3.4.4.2 Pembuatan Larutan Blanko

Pembuatan larutan blanko dilakukan dengan cara memipet 1,0 ml metanol

p.a dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1,0 ml larutan DPPH


17


100 μg/ml, lalu ditambahkan 2,0 ml metanol dikocok hingga homogen dan

diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit.

3.4.4.3 Pembuatan Larutan Kuersetin Sebagai Pembanding

a) Pembuatan larutan induk kuersetin konsentrasi 200 µg/mL

Sejumlah 10 mg kuersetin ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a dalam

labu ukur 50,0 ml dan dicukupkan dengan metanol p.a hingga tanda batas,

dikocok sampai homogen sehingga didapat larutan induk kuersetin 200 µg/ml.

b) Pembuatan larutan kuersetin konsentrasi 1; 2; 3; 4; 5; dan 6 µg/mL

Dipipet 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125; dan 0,15 mL larutan induk kuersetin

masing-masing kedalam 6 labu ukur 5 mL. Pada masing-masing labu ukur

dicukupkan volumenya dengan metanol p.a sampai tanda batas. Selanjutnya

dipipet 1,0 mL masing-masing ke dalam 6 tabung reaksi. Pada masing-masing

tabung ditambah dengan 1,0 mL DPPH kemudian ditambahkan lagi 2,0 mL

metanol p.a dikocok hingga homogen kemudian diinkubasi pada suhu kamar

selama 30 menit. Serapan dari larutan tersebut diukur pada panjang

gelombang 517 nm.

3.4.4.4 Pengukuran Serapan Sampel

a) Pembuatan larutan induk sampel konsentrasi 1000 µg/mL

Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dalam 25,0 mL metanol

p.a, dicukupkan hingga tanda batas kemudian dikocok dan dilarutkan hingga

homogen.

b) Pembuatan larutan seri bahan uji konsentrasi 1; 5; 10; 25; 50; dan 100 µg/mL

Dipipet 0,005; 0,025; 0,05; 0,125; 0,25; dan 0,5 mL larutan induk kuersetin

masing-masing kedalam 6 labu ukur 5 mL. Pada masing-masing labu ukur

dicukupkan volumenya dengan metanol p.a sampai tanda batas. Selanjutnya

dipipet 1,0 mL masing-masing ke dalam 6 tabung reaksi. Pada masing-masing

tabung ditambah dengan 1,0 mL DPPH kemudian ditambahkan lagi 2,0 mL

metanol p.a dikocok hingga homogen kemudian diinkubasi pada suhu kamar

selama 30 menit. Serapan dari larutan tersebut diukur pada panjang

gelombang 517 nm.


3.4.4.5 Pe

Pe

konsentras

Se

dilanjutka

(%). Aktiv

IC50 yaitu

Nilai IC50

3.4.5 Pe

Pa

kimia den

flavonoid,

3.4.5.1 Ide

1. Bebera

dan as

penang

diguna

beriku

a) La

Ma

b) La

Bo

nghitungan

rsentase in

si larutan sa

telah didap

an dengan p

dimana x

vitas antiok

konsentras

0 didapatkan

napisan Fito

ada ekstrak

ngan beber

, glikosida,

entifikasi al

apa miligra

sam klorida

gas air. Sel

akan sebag

ut:

arutan perco

ayer LP, ha

arutan perco

ouchardat L

n

nhibisi (IC5

ampel dapat

patkan pers

penghitunga

x adalah kon

ksidan dinya

si sampel ya

n dari nilai

okimia

dan fraksi

rapa pereak

antrakuinon

lkaloid

am ekstrak k

a 2 N (9:1

lanjutnya d

gai larutan

obaan diam

asil positif d

obaan diam

P, hasil pos

50) terhadap

t dihitung d

sentase inhi

an secara reg

nsentrasi (µ

atakan deng

ang dapat m

x setelah m

i yang dipe

ksi kimia

n, saponin, t

kental dilar

), kemudia

didinginkan

percobaan

mbil 1 ml ke

dengan terbe

mbil 1 ml ke

sitif dengan

p radikal D

engan rumu

ibisi dari m

gresi linier

µg/mL) dan

gan Inhibiti

meredam rad

mengganti y

eroleh iden

antara lain

tannin dan t

rutkan dalam

an dipanask

dan disarin

yang sela

emudian dit

entuknya en

emudian dit

terbentukny

Unive

DPPH dari

us:

masing-mas

menggunak

y adalah pr

on Concent

dikal DPPH

dengan 50.

ntifikasi go

n untuk pe

terpen.

m 10 ml ca

kan selama

ng. Filtrat y

anjutnya dil

tambahkan

ndapan putih

tambahkan

ya endapan

ersitas Indo

masing-m

sing konsen

kan persam

resentase in

tration 50%

H sebanyak

longan sen

ereaksi alk

ampuran aqu

2 menit di

yang didap

lakukan se

2 tetes per

h.

2 tetes per

n coklat hita

18

onesia

masing

ntrasi,

maan y

hibisi

% atau

50%.

nyawa

aloid,

uades

i atas

patkan

ebagai

reaksi

reaksi

m.


19


c) Larutan percobaan diambil 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes pereaksi

Dragendorf LP, hasil positif dengan terbentuknya endapan jingga coklat.

(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).

2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda Dragendorf LP.

Fraksi teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada

lempeng KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid,

Water) 4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot

menggunakan penampak noda Dragendorf LP. Hasil positif akan

menunjukkan warna jingga-coklat (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984).

3.4.5.2 Identifikasi flavonoid

1. Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 10 ml metanol dan 5 ml petroleum

eter, dikocok dan didiamkan. Diambil lapisan metanol, diuapkan pada suhu

40˚C. Sisa larutan ditambahkan 5 ml etil asetat P, disaring, selanjutnya

dilakukan sebagai berikut:

a) Larutan uji diambil 1 ml, diuapkan, lalu sisanya dilarutkan dalam 1-2 ml

etanol (95%), kemudian ditambahkan 0,5 gram serbuk seng P dan 2 ml

asam klorida 2 N dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan

10 tetes asam klorida P, jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna

merah intensif, menunjukkan adanya flavonoid (glikosida-3-flavonol).

b) Larutan uji diambil 1 ml, diuapkan, lalu sisanya dilarutkan dalam 1 ml

etanol (95%), kemudian ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium P dan 10

tetes asam klorida P. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu

menunjukkan adanya flavonoid. Jika warna kuning jingga menunjukkan

adanya flavon, kalkon, dan auron.

c) Larutan uji diambil 1 ml, diuapkan, lalu sisanya dibasahkan dengan aseton,

kemudian ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan serbuk halus

asam oksalat P, dipanaskan hati-hati di atas penangas air. Sisa yang

didapatkan dicampur dengan 10 ml dietil eter P. Diamati dengan sinar

ultraviolet 366 nm, larutan berfluoresensi kuning intensif menunjukkan

adanya flavonoid (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).


20


2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda AlCl3. Fraksi

teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada lempeng

KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid, Water)

4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot menggunakan

penampak noda AlCl3. Hasil positif akan menunjukkan warna kuning pada

sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm (Wagner, Bladt, dan Zgainski,

1984).

3.4.5.3 Identifikasi glikon

Ekstrak yang diuji ditambahkan 15 ml asam klorida 10 % LP, direfluks

selama 10 menit, dinginkan kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh disari

sebanyak tiga kali masing-masing dengan 5 ml eter P. Lapisan eter dipisahkan dan

dikumpulkan. Kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat anhidrat P, disaring dan

diuapkan pada suhu tidak lebih dari 500C, kemudian ditambahkan dengan 2 ml

metanol dan diuapkan. Hasil penguapan dilarutkan dengan 1 ml aquades dan 8

tetes Mollisch LP. Kemudian tambahkan dengan hati-hati 1 ml asam sulfat P.

Hasil positif ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas cairan

(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).

3.4.5.4 Identifikasi antrakinon

1. Ekstrak yang diperoleh ditambahkan 5 ml asam sulfat 2N, panaskan sebentar,

dinginkan. Tambahkan 10 ml benzen P, kocok, diamkan. Pisahkan lapisan

benzen, saring. Kocok lapisan benzen dengan 1 sampai 2 natrium hidroksida

2N, diamkan, lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzene tidak

berwarna.

2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda KOH. Fraksi

teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada lempeng

KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid, Water)

4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot menggunakan

penampak noda KOH. Hasil positif akan menunjukkan warna merah pada

cahaya tampak atau flourosensi kuning di bawah sinar UV dengan panjang

gelombang 366 nm (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984)


21


3.4.5.5 Identifikasi saponin

1. Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 10 mL aquadest panas, didinginkan

kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Hasil positif ditunjukkan dengan

terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10

cm dan pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang

(Departemen Kesehatan RI, 1995).

2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda anisaldehid-asam

sulfat. Fraksi teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada

lempeng KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid,

Water) 4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot

menggunakan penampak noda larutan anisaldehid-asam sulfat. Hasil positif

akan menunjukkan warna biru, biru-ungu, atau kekuningan pada cahaya

tampak setelah dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5-10 menit (Wagner,

Bladt, dan Zgainski, 1984).

3.4.5.6 Identifikasi tanin

1. Beberapa miligram ekstrak kental dilarutkan dalam 5 ml air suling panas dan

diaduk. Setelah dingin disentrifugasi dan bagian cairan didekantasi dan diberi

larutan natrium klorida 10%, kemudian disaring. Filtrat sebanyak masing-

masing 1 ml dikerjakan sebagai berikut:

a. Filtrat ditambahkan ditambahkan 2 tetes larutan besi (III) klorida 1%, hasil

positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau violet.

b. Filtrat ditambahkan ditambahkan 3 ml larutan gelatin 10%, hasil positif

ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih.

c. Filtrat ditambahkan ditambahkan 3 ml larutan natrium klorida-gelatin

(larutan gelatin 1% dalam larutan natrium klorida 10%), hasil positif

ditunjukkan dengan terbentuknya endapan (Farnsworth, 1966).

2. Identifikasi tanin untuk fraksi dilakukan dengan menggunakan KLT, dengan

eluen butanol-asam asetat glasial-aquades (40:10:50) dan menggunakan

penyemprot larutan FeCl3 10%. Hasil positif akan menunjukkan warna hijau-

kehitaman (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984).


22


3.4.5.7 Identifikasi Terpen

1. 1 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 5 mL eter kemudian diuapkan di dalam

cawan penguap. Ke dalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat,

kemudian 1 tetes asam sulfat pekat akan terbentuk warna merah-hijau atau

violet-biru (Farnsworth, 1966).

2. Identifikasi terpenoid/sterol untuk fraksi dilakukan dengan menggunakan

KLT, dengan eluen benzen-etil asetat (90:10) dan menggunakan penyemprot

anisaldehid-asam sulfat. Hasil positif akan menunjukkan warna biru kuat,

hijau, merah, atau coklat pada cahaya tampak setelah dipanaskan pada suhu

100˚C selama 5-10 menit

3.4.6 Pemisahan Ekstrak Aktif

Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan paling kuat dilanjutkan

dengan pemisahan menggunakan kromatografi kolom. Selanjutnya dilakukan uji

aktivitas antioksidan, sehingga didapatkan fraksi yang memiliki aktivitas

antioksidan teraktif. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 H Merck dan

fase gerak yang digunakan adalah kombinasi beberapa pelarut terdistalasi.


23


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan Simplisia

Bagian tanaman yang digunakan adalah daun Premna oblongata Miq.

yang diperoleh dari kebun Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik

(BALITTRO) Bogor, Cimanggu, dan telah dideterminasi di Herbarium

Bogoriense (LIPI), Cibinong, Bogor. Hasil determinasi dapat dilihat pada

Lampiran 1.

Pada penelitian ini digunakan simplisia berupa daun Premna oblongata

Miq. yang dipetik pada usia enam bulan setelah penanaman. Sebanyak 10 kg daun

Premna oblongata Miq. selanjutnya dilakukan proses sortasi, pencucian,

perajangan, pengeringan, penghalusan dan penyaringan sehingga diperoleh 1 kg

serbuk kering daun Premna oblongata Miq. Sortasi dan pencucian bertujuan

untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing lainnya yang

menempel pada tanaman dengan menggunakan air bersih. Daun selanjutnya

dirajang untuk mempermudah proses pengeringan. Pengeringan dilakukan

bertujuan untuk mengurangi kadar air sehingga simplisia yang diperoleh tidak

mudah rusak oleh adanya pertumbuhan jamur dan dapat disimpan dalam waktu

yang lebih lama. Pengeringan dilakukan di tempat terbuka, pada tampah yang

ditutupi oleh kain hitam dan terlindung dari sinar matahari secara langsung.

Pengeringan dilakukan dari jam 07.00 pagi sampai jam 12.00 siang.

Setelah dilakukan pengeringan, rajangan digiling dan diayak dengan

ayakan 40 mesh agar derajat kehalusan serbuk simplisia seragam. Penghalusan

dan penyaringan ditujukan untuk memperoleh serbuk yang homogen dan untuk

mempermudah proses penarikan zat aktif pada saat ekstraksi. Serbuk yang telah

kering selanjutnya disimpan dalam wadah bersih, kering dan terlindung dari

cahaya untuk mencegah kerusakan dan mutu simplisia tetap terjaga.

Setelah didapatkan serbuk simplisia, dilakukan maserasi untuk

mendapatkan ekstrak n-heksan, etil asetat dan methanol. Setelah itu dilakukan

penapisan fitokimia dan uji antioksidan dengan metode DPPH. Ekstrak dengan


24


antioksidan terbesar difraksinasi untuk mendapatkan fraksi-fraksi. Pada fraksi-

fraksi yang didapat dilakukan uji aktivitas antioksidan untuk mendapatkan fraksi

aktif. Setelah itu dilakukan pemeriksaan kandungan kimia untuk mengetahui

golongan senyawa dari fraksi yang teraktif.

4.2 Ekstraksi

Serbuk kering daun Premna oblongata Miq diekstraksi dengan metode

maserasi dengan pelarut yang kepolarannya meningkat yaitu n-heksan, etil asetat,

dan metanol. Dipilih metode ini karena menggunakan peralatan sederhana

sehingga sangat mudah dilakukan dan metode maserasi tidak merusak kandungan

senyawa kimia tanaman yang tidak tahan panas.

Sebanyak kurang lebih 1 kg Serbuk kering daun Premna oblongata Miq.

dimaserasi dengan pelarut dengan kepolaran meningkat mulai dari n-heksan, etil

asetat dan selanjutnya metanol sebanyak 5 kali untuk memperoleh filtrat dari

masing-masing ekstrak yang masih dapat dituang. Dipilih pelarut dengan

kepolaran meningkat dimaksudkan untuk memisahkan senyawa metabolit

sekunder berdasarkan kepolarannya, sehingga diharapkan memudahkan penapisan

fitokimia. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar vakum pada

suhu lebih kurang 500C kemudian diuapkan diatas waterbath pada suhu <500C

sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan metanol. Masing-

masing ekstrak ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat simplisia

awal. Dari hasil ekstraksi diperoleh ekstrak yang berwarna hijau pekat (Gambar

4.1). Ekstrak Premna oblongata Miq. yang diperoleh dari 1 kg (1000 g) simplisia

adalah seberat 20,55 g yang setara dengan 2.05% untuk ekstrak heksan, 23,75 g

yang setara dengan 2.37% untuk ekstrak etil asetat, dan 140,48 g yang setara

dengan 14.04% untuk ekstrak metanol. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada

Tabel 4.1.

4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak

Pada masing-masing ekstrak kental yang diperoleh, dilakukan pengujian

aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH menggunakan

spektrofotometer uv-vis. DPPH adalah senyawa radikal bebas berwarna ungu.


25


Apabila DPPH direaksikan dengan senyawa peredam radikal bebas misalnya

flavonoid, intensitas warna ungu akan berkurang dan bila senyawa peredam

radikal bebas yang bereaksi jumlahnya besar, maka DPPH dapat berubah warna

menjadi kuning. Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang

diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang

gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal bebas

menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan

penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil

(Sunarni, 2005).

Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak didahului dengan uji kualitatif

menggunakan kertas kromatografi dan pereaksi semprot DPPH. Hal ini bertujuan

untuk memperkirakan ekstrak mana yang memiliki aktivitas antioksidan. Larutan

sampel dari tiap ekstrak dan larutan standar kuersetin dengan konsentrasi 1000

µg/ml ditotolkan pada kertas kromatografi, kemudian disemprot dengan larutan

DPPH dengan konsentrasi 100 µg/ml. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas

antioksidan secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer uv-vis.

Hasil uji aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun

Premna oblongata Miq. memiliki memiliki aktivitas antioksidan paling kuat. Hal

ini ditunjukkan dengan nilai IC50 ekstrak methanol yakni 20,01 µg/mL, diikuti

dengan estrak etil asetat 63.17 µg/mL, dan ekstrak heksan 68.93µg/mL. Oleh

sebab itu, ekstrak metanol dipilih untuk dilakukan pemisahan lebih lanjut karena

IC50 paling rendah dibanding ekstrak metanol dan n-heksan yaitu 20,01 µg/mL.

Kuersetin yang digunakan sebagai pembanding memiliki IC50 1,565 µg/mL. Data

dapat dilihat pada Tabel 4.2.

4.4 Pemisahan Ekstrak

Pemisahan ekstrak dilakukan pada ekstrak yang memiliki aktivitas

antioksidan terkuat yakni metanol dengan IC50 20,01 µg/mL. Pemisahan

dilakukan terhadap 25 g ekstrak metanol menggunakan kromatografi kolom

dipercepat yang menggunakan bantuan vakum untuk menggerakkan eluen.

Metode kromatografi kolom dipercepat digunakan karena lebih efisien dalam

pemisahan dibandingkan kromatografi kolom gravitasi. Kromatografi kolom


26


dipercepat pertama kali diperkenalkan oleh para ilmuwan dari Australia untuk

mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan untuk pemisahan menggunakan kolom

kromatografi klasik. Pada dasarnya metode ini adalah kromatografi lapis tipis

preparatif yang berbentuk kolom. Aliran fase gerak dalam metode ini diaktifkan

dengan bantuan kondisi vakum.

Pada pemisahan ekstrak ini digunakan campuran pelarut n-heksan-etil

asetat sebagai fase gerak dengan perbandingan 200:0, 180:20, 160:40, 140:60,

120:80, 100:100, 80:120, 60:140, 40:160, 20:180, 0:200, dan campuran etil asetat-

metanol dengan perbandingan 200:0, 180:20, 170:30, 160:40, 150:50, 140:60,

120:80, 100:100, 80:120, 60:140, 40:160, 20:180, 0:200. Setiap 200 mL eluat

ditampung sehingga diperoleh 21 fraksi lalu dilanjutkan dengan kromatografi

lapis tipis (KLT). Dari 21 fraksi hasil pemisahan dengan kromotografi kolom

dipercepat, diperoleh 6 fraksi gabungan yang memiliki pola kromatogram sama.

Fraksi 4 menjadi fraksi 1, fraksi 5 menjadi fraksi 2, fraksi 6-7 digabung menjadi

fraksi 3, fraksi 8-13 digabung menjadi fraksi 4, fraksi 14-18 digabung menjadi

fraksi 5, fraksi 19-21 digabung menjadi fraksi 6. Berat masing-masing fraksi dapat

dilihat pada Tabel 4.3.

4.5 Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Aktif

Sama halnya dengan pengujian aktivitas antioksidan pada ekstrak,

pengujian aktivitas antioksidan pada fraksi juga didahului dengan uji kualitatif

menggunakan kertas kromatografi dan pereaksi semprot DPPH. Masing-masing

hasil penggabungan fraksi dan larutan standar kuersetin dengan konsentrasi 1000

µg/ml ditotolkan pada kertas kromatografi. Selanjutnya kertas kromatografi

disemprot dengan larutan DPPH konsentrasi 100 µg/ml. Hasil uji kualitatif ini

menunjukkan keenam fraksi menimbulkan bercak berwarna kuning dengan latar

belakang ungu dengan intensitas yang berbeda. Fraksi 5 menunjukkan intensitas

perubahan warna dari ungu menjadi kuning paling mirip dengan blanko kuersetin

(Gambar 4.2.).

Dengan metode yang sama pada pengujian ekstrak yakni metode DPPH

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm,

masing-masing fraksi tersebut dilakukan uji aktivitas antioksidan dan diperoleh


27


fraksi 5 yang memiliki aktivitas antioksidan paling aktif dengan nilai IC50 sebesar

23.51 µg/mL. Data dapat dilihat pada table 4.4.

4.6 Penapisan Fitokimia Fraksi Teraktif

Pada fraksi teraktif yaitu fraksi ke 5 dilakukan identifikasi golongan

senyawa kimia dengan dengan pereaksi kimia dan kromatografi lapis tipis.

Prosedur identifikasi golongan senyawa kimia dengan pereaksi kimia pada fraksi

teraktif sama dengan identifikasi golongan senyawa kimia dengan pereaksi kimia

pada ekstrak. Dari hasil identifikasi golongan senyawa kimia dengan pereaksi

kimia pada fraksi didapatkan hasil positif pada senyawa flavonoid, glikosida,

tanin dan saponin.

Identifikasi golongan senyawa kimia fraksi dengan kromatografi lapis tipis

dilakukan menggunakan kontrol positif tanaman pembanding yang sudah terbukti

memiliki kandungan senyawa kimia Alkaloid, terpenoid, flavonoid, tannin,

saponin dan antrakuinon. Identifikasi senyawa kimia menggunakan eluen BAW

(Butanol, Acetic acid, Water) dengan alasan setelah dicoba berbagai macam

kombinasi eluen, eluen ini yang memberikan pemisahan paling baik pada fraksi 5.

4.6.1 Identifikasi alkaloid

Identifikasi alkaloid dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.4), yaitu :

a) Uji Mayer LP, tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya

endapan putih.

b) Uji Bouchardat LP, tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya

endapan coklat hitam.

c) Uji Dragendorf LP, tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya

endapan jingga coklat.

d) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda Dragendorf LP tidak

memberikan hasil positif karena tidak terbentuknya bercak jingga-coklat yang

dibandingkan dengan standar piperin.


28


4.6.2 Identifikasi flavonoid

Identifikasi flavonoid dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.5), yaitu :

a) Larutan uji yang ditambahkan serbuk seng dan asam klorida encer

memberikan hasil positif dengan terbentuknya warna merah intensif.

b) Larutan uji yang ditambahkan serbuk magnesium dan asam klorida pekat

memberikan hasil positif dengan terbentuknya warna kuning.

c) Larutan uji yang ditambahkan asam borat dan asam oksalat memberikan hasil

positif dengan adanya fluoresensi kuning intensif.

d) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda AlCl3 memberikan

hasil positif karena terbentuknya bercak berfluoresensi kuning yang

dibandingkan dengan standar kuersetin.

4.6.3 Identifikasi glikon

Ekstrak yang ditambahkan asam klorida, disari dengan eter, ditambahkan

natrium sulfat anhidrat P, uapkan, ditambahkan metanol, uapkan, larutkan dengan

aquades dan Mollisch LP, dan ditambahkan asam sulfat memberikan hasil positif

dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas cairan (Gambar 4.6).

4.6.4 Identifikasi antrakinon

Identifikasi antrakinon dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.7), yaitu:

a) Ekstrak yang ditambahkan asam sulfat, ditambahkan benzene, lapisan benzen

dikocok dengan natrium hidroksida tidak memberikan hasil positif dengan

tidak terbentuknya lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzene

yang tidak berwarna.

b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda KOH memberikan

hasil negatif karena tidak terbentuknya bercak merah yang dibandingkan

dengan standar Rhei radix.


29


4.6.5 Identifikasi saponin

Identifikasi saponin dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.8), yaitu :

a) Ekstrak yang ditambahkan aquadest panas, didinginkan kemudian dikocok

kuat-kuat selama 10 detik memberikan hasil positif dengan terbentuknya buih

yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan pada

penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang.

b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda anisaldehid-asam sulfat

memberikan hasil positif dengan terbentuknya bercak warna ungu yang

dibandingkan dengan standar Liquiritiae radix.

4.6.6 Identifikasi tanin

Identifikasi tanin dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.9), yaitu :

a) Larutan uji yang ditambahkan larutan besi (III) klorida, memberikan hasil

positif dengan terbentuknya warna hijau.

b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda FeCl3 memberikan

hasil positif dengan terbentuknya bercak warna hijau-kehitaman yang

dibandingkan dengan standar Psidii folium.

4.6.7 Identifikasi Terpen

Identifikasi terpen dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.10), yaitu :

a) Larutan uji yang ditambahkan asam asetat anhidrat, dan asam sulfat pekat

tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya warna merah-hijau

atau violet-biru.

b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda anisaldehid-asam sulfat

tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya bercak warna biru

yang dibandingkan dengan standar Caryophili Flos. Hasil penapisan

selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.5.


30


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan sebagai

berikut :

a. Hasil uji antioksidan dari ketiga ekstrak yang diuji menunjukkan ekstrak

metanol memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dengan IC50 20.01 µg/mL,

diikuti oleh ekstrak etil asetat dengan IC50 63.17 µg/mL, dan ekstrak heksan

dengan IC50 68.93 µg/mL.

b. Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbesar adalah fraksi 5 dengan

nilai IC50 sebesar 23.51 µg/mL, yang mengandung senyawa golongan

flavonoid, glikon, tannin, dan saponin.

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menemukan senyawa-

senyawa murni dari daun Premna oblongata Miq. dengan metode uji antioksidan

lainnya.


31


DAFTAR ACUAN

Andarwaulan, N., Wijaya, H., dan Cahyono, D.T. (1996). Aktivitas Antioksidan dari Daun Sirih (Piper betle L). Teknologi dan Industri Pangan VII, 29-30.

Arulpriya, P., Lalitha, P., dan Hemalatha, S. (2010). in vitro Antioxidant Testing of The Extracts Of Samanea saman (Jacq.)Merr. Der Chemica Sinica, (2), 73-79.

Aqil, F., Ahmad, I., dan Mehmood, Z. (2006). Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal Plants. Turk J Biol, 177-183.

Bank, G., dan Lenoble, R. (2002). Oxygen Radical Absorbency Capacity, Standardizing the Way We Look at Antioxidants. Nutraceutical World September, 42-45.

Backer, C.A., dan Brink., R.C.B.V.D. (1965). Flora of Java Vol II. 602-603. N.V.P. Noordhoff-Groningen-The Netherlands.

Blois, M.S. (1958). Antioxidant Determinations By The Use Of A Stable Free Radical Nature, 181, 1199- 1200.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat Cetakan Pertama. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Evans, W.C. (2002). Trease and Evans Pharmacognosy 15th Ed. London: W.B. Saunders.

Farnsworth, N.R. (1966). Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of Pharmaceutical Sciences 55 (3), 226-276.

Harborne, J.B. (1987). Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Mengekstraksi Tumbuhan (Kosasih Padmawinata & Iwang Soediro, Penerjemah.). Bandung: Penerbit ITB.

Harmita. (2006). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok : Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia.

Hidajat, B. (2005). Penggunaan Antioksidan pada Anak. Kapita Selekta Ilmu Kesehatan Anak.


32


Isnindar., Setyowat, E.P., dan Wahyuono, S. (2011). Aktivitas Antioksidan Daun Kesemek (Diospyros kaki L.F) Dengan Metode DPPH (2,2-Difenil-Pikrilhidrazin). Majalah Obat tradisional.

Johnson, E. (1991). Dasar Kromatografi Cair. Bandung : Penerbit ITB.

Lampe, J.W. (1999). Health Effects of Vegetables and Fruit: Assesing Mechanisms of Action in Human Experimental Studies. The American Jurnal of Clinical Nutrition.

Lautan, J. (1997). Radikal Bebas Pada Eritrosit dan Leukosit, Cermin Dunia Kedokteran. (116), 49-52.

Molineux, P. (2004). The Use of The Stable Free Radical Diphenyl Picrylhydrazil (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklankarin J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219.

Nurdin., Kusharto, C.M., Tanziha, I., dan Januwati, M. (2009). Kandungan Klorofil Berbagai Jenis Daun Tanaman dan Cu-Turunan Klorofil Serta Karakteristik Fisiko-Kimianya. Jurnal Gizi dan Pengan.

Pitojo, S. (2008). Khasiat Cincau Perdu. Yogyakarta: Kanisius.

Pitojo, S., dan Sumiati. (2005). Cincau: Cara Pembuatan dan Variasi Olahan. Agromedia Pustaka, Jakarta.

Rahman, A., et all. In vitro antibacterial properties of essential oil and organic extracts of Premna integrifolia Linn. Arabian Journal of Chemistry.

Rajnarayana, K., Ajitha M., Gopireddy G., dan Giriprasad, V. (2011). Comperative Antioxidant Potential Of Some Fruits And Vegetabkesusing DPPH Method. International Journal Of Pharmacy & Technology.

Soediro, I., dkk (1986). Kromatografi Cepat Sebagai Cara Fraksinasi Ekstrak Tanaman. Acta Pharmaceutica Indonesia.

Sutamihardja, R.T.M., Citroreksoko, P.S., Ossia, F., dan S.E. Wardoyo. (2006). Isolasi dan Identifikasi Senyawa Fenol Dari Daun Salam (Syzgium polanthum, Wight Walpers) Sebagai Senyawa Antibakteri. Jurnal Nusa Kimia, 6 (1), 48-60.

Sunarni, T. (2005). Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae. Jurnal Farmasi Indonesia 2, (2),53-61.

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., dan Kaur, H. (2011). Phytochemical screening and extraction : A review. International Pharmaceutical Sciencia, 1(1), 98-106.

Winarsi, H. (2007). Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Kanisius.


33


Wagner, H., Blandt, S., dan Zgalnski. (1984). Plant Drug Analysis. New York : Springer-Verlag, 7-304.

Yu, L. (2008). Wheat Antioxidants. United States Of America: Wiley.

Yadav, D., Tiwari, N., dan Gupta, M.M. (2010). Diterpenoids from Premna integrifolia. Phytochem. Lett. 3, 143–147.

Zakaria, F.R. (1996). Sintesis Senyawa Radikal dan Elektrofil Dalam Oleh Komponen Pangan : Reaksi Biomolekuler, Dampak Terhadap Kesehatan dan Penangkalan. Prosiding Seminar. Bogor: Pusat Studi Pangan dan Gizi IPB.


GAMBAR


33

Gambar 2.1 Premna oblongata Miq.

[Sumber : Koleksi Penulis]


34

Gambar 3.1 Penguap vakum putar (Rotary evaporator Buchi)

Gambar 3.2 Spektrofotometer UV-Vis


35

(a)

(b)

(c)

Keterangan : a. Ekstrak heksan b. Ekstrak etil asetat c. Ekstrak metanol

Gambar 4.1 Ekstrak Hasil Ekstraksi


36

I II III IV V VI

(a)

I II III IV V VI

(b)

Keterangan:

a. Fraksi I hingga fraksi VI serta kuersetin sebelum disemprot DPPH b. Fraksi I hingga fraksi VI serta kuersetin sesudah disemprot DPPH

Gambar 4.2 Hasil Uji Kualitatif Fraksi Ekstrak Gabungan

Kuersetin

Kuersetin


37

Keterangan :

Serapan Blanko DPPH = 0.6237

Gambar 4.3 Spektrum serapan larutan DPPH


38

(a) (b) (A) (B) (C) (D)

Keterangan: A. Identifikasi menggunakan pereaksi kimia Mayer LP B. Identifikasi menggunakan pereaksi kimia Bouchardat C. Identifikasi menggunakan pereaksi kimia Dragendorf LP D. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.4 Identifikasi golongan senyawa alkaloid fraksi 5


39

(a) (b) (A) (B) (C) (D) Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan serbuk seng dan asam klorida encer B. Identifikasi dengan penambahan serbuk magnesium dan asam klorida pekat C. Identifikasi dengan penambahan asam borat dan asam oksalat D. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.5 Identifikasi golongan senyawa flavonoid fraksi 5


40

Gambar 4.6 Identifikasi golongan senyawa glikon fraksi 5


41

(a) (b) (A) (B) Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan asam sulfat, benzene, dan lapisan benzen dikocok dengan

natrium hidroksida B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.7. Identifikasi golongan senyawa antrakinon fraksi 5


42

(a) (b) (A) (B) Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan aquadest panas, dinginkan, kemudian kocok kuat-kuat

selama 10 detik B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.8 Identifikasi golongan senyawa saponin fraksi 5


43

(a) (b) (A) (B) Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan larutan besi (III) klorida B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.9 Identifikasi golongan senyawa tanin fraksi 5


44

(a) (b)

Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan asam asetat anhidrat, dan asam sulfat pekat B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.10 Identifikasi golongan senyawa terpen fraksi 5


TABEL


45

Tabel 4.1 Data Rendemen Ekstrak Daun Premna Oblongata Miq.

No. Ekstrak Bobot Ekstrak

(g)

Rendemen

Esktrak

(%)

1. Ekstrak Heksan 20,55 2.05

2. Ekstrak Etil Asetat 23,75 2.37

3. Ekstrak Metanol 140,48 14.04


46

Tabel 4.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premna Oblongata

Miq.

Sampel Konsentrasi (μg/ml)

Absorbansi % Inhibisi Persamaan

linier IC50

(μg/ml) Blanko

Sampel uji

Kuersetin

1

0.675

0.647 3.86

y = 38.54x - 10.35

R² = 0.920 1.565

2 0.626 6.98 3 0.541 19.61 4 0.535 20.51 5 0.432 34.91 6 0.307 54.38

Ekstrak Heksan

1

0.675

0.575 14.56

y = 0.4911x + 16.147

R² = 0.9134 68.93

5 0.551 16.03 10 0.539 18.12 25 0.522 20.22 50 0.51 24.21 100 0.49 27.19

Ekstrak Etil

Asetat

5

0.673

0.629 6.5

y = 0.679x + 7.053

R² = 0.978 63.17

10 0.612 9.06 25 0.589 12.48 50 0.578 15.9 100 0.514 23.62

Ekstrak Metanol

1

0.673

0.595 11.58

y = 1.963x + 10.71

R² = 0.9992 20.01

5 0.584 13.22 10 0.574 14.71 25 0.517 23.17 50 0.432 35.8 100 0.272 59.58


47

Tabel 4.3 Berat Fraksi Ekstrak Hasil Fraksinasi Kolom Dipercepat

No. Fraksi Ekstrak Berat Fraksi (mg)

1. Fraksi I 242.6

2. Fraksi II 526

3. Fraksi III 773.6

4. Fraksi IV 1500.1

5. Fraksi V 4640.9

6. Fraksi VI 2819


48

Tabel 4.4. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-Fraksi Ekstrak Metanol

Premna Oblongata Miq.



linier IC50

(μg/ml) Blanko

Sampel uji

Fraksi 1

100

0.6237

0.5168 17.13

y = 0.0925x + 14.865

R² = 0.9572 379.83

150 0.5113 18.01 200 0.4974 20.25 250 0.4956 20.53 300 0.491 21.27 350 0.4789 23.21

Fraksi 2

100

0.6237

0.5447 12.66

y = 0.1864x + 7.483

R² = 0.9305 228.09

150 0.5312 14.82 200 0.5193 16.73 250 0.5116 17.97 300 0.4988 20.02 350 0.464 25.6

Fraksi 3

100

0.6237

0.5364 13.99

y = 0.0915x + 11.148

R² = 0.9047 424.61

150 0.5341 14.36 200 0.5255 15.74 250 0.5221 16.28 300 0.5164 17.2 350 0.4978 20.18

Fraksi 4

10

0.6237

0.5785 7.24

y = 1.2663x + 2.7891

R² = 0.9916 37.28

25 0.5669 9.1 50 0.5062 18.83 75 0.462 25.92 90 0.4227 32.22 100 0.4102 34.23

Fraksi 5

10

0.6237

0.5647 9.45

y = 2.066x + 1.4145

R² = 0.9811 23.51

25 0.5546 11.07 50 0.457 26.72 75 0.3789 39.29 90 0.3041 51.24 100 0.3025 51.49


49



linier IC50

(μg/ml) Blanko

Sampel uji

Fraksi 6

10

0.6237

0.5929 4.93

y = 1.2271x + 2.026

R² = 0.996 39.09

25 0.5577 10.58 50 0.4719 16.13 75 0.4651 25.42 90 0.4385 29.69 100 0.4192 32.78


50

Tabel 4.5. Identifikasi golongan kimia fraksi teraktif

Kandungan Kimia Pereaksi Kimia Hasil

Alkaloid

Mayer -

Dragendorf -

Bouchardat -

Tanin

FeCl3 +

Gelatin 10 % -

NaCl-gelatin -

Flavonoid

Serbuk Zn + HCl 2N + HCL pekat P +

serbuk Mg + HCl pekat P +

Serbuk as. Borat + serbuk as.oksalat +

Terpen Asam asetat anhidrat + H2SO4 p (2:1) -

Saponin Air panas +

Glikon Molish LP +

Antrakuinon Benzen P + NH4OH -


LAMPIRAN


51

Lampiran 1. Hasil determinasi sampel Premna oblongata Miq.


52

Lampiran 2. Skema ekstraksi dan fraksinasi sampel Premna oblongata Miq.

Disortasi, dikeringkan selama ± 5 hari

Dirajang, dihaluskan dengan blender dan disaring

Maserasi dengan n-heksan.

Saring, Evaporasi, Uapkan diatas waterbath suhu <500C

Maserasi dengan etil asetat

Saring, Evaporasi

Uapkan diatas waterbath suhu <500C

Maserasi dengan metanol

Saring, Evaporasi

Uapkan diatas waterbath

Fraksinasi

Uji aktivitas antioksidan

Pemeriksaan kandungan kimia

± 10 Kg Daun basah Premna oblongata Miq.

± 1 kg serbuk kering daun Premna oblongata Miq.

Residu Ekstrak n-heksan

Residu Ekstrak etil asetat

Ekstrak metanol Penapisan Fitokimia dan Uji aktivitas antioksidan

metode DPPH

Residu

Ekstrak dengan aktivitas antioksidan terbesar

Fraksi-fraksi

Golongan senyawa dari fraksi yang teraktif

Fraksi aktif


53

Lampiran 3. Kurva hubungan konsentrasi kuersetin dalam berbagai

konsentrasi dengan % peredaman DPPH

y = 38,54x ‐ 10,35R² = 0,920

‐10

0

10

20

30

40

50

60

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

% In

hibisi

Konsentrasi Dalam Tabung µg/mL


54

Lampiran 4. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak heksan dalam berbagai


y = 0,491x + 16,14R² = 0,913

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25 30

% In

hibisi



55

Lampiran 5. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dalam berbagai


y = 0,679x + 7,053R² = 0,978

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25 30

% In

hibisi



56

Lampiran 6. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak metanol dalam berbagai


y = 1,963x + 10,71R² = 0,999

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30

% In

hibisi



57

Lampiran 7. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 1 dalam berbagai


y = 0,092x + 14,86R² = 0,957

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100

% In

hibisi



58



y = 0,186x + 7,483R² = 0,930

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100

% In

hibisi



59



y = 0,091x + 11,14R² = 0,904

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100

% In

hibisi



60

Lampiran 10. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 4 dalam

berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH

y = 1,266x + 2,789R² = 0,991

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 5 10 15 20 25 30

%^ Inhibisi

Konsentras Dalam Tabung µg/mL


61



y = 2,066x + 1,414R² = 0,981

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30

% In

hibisi



62



y = 1,227x + 2,026R² = 0,996

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25 30

% In

hibisi



63

Lampiran 13. Sertifikat Analisis DPPH


Documents

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20309442-S42687-Atika...i UNIVERSITAS INDONESIA UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq