i

UJI DAYA INFEKTIVITAS Plasmodium berghei IRADIASI

PADA HATI DAN LIMPA MENCIT MENGGUNAKAN

METODE NESTED- POLYMERASE CHAIN REACTION

Skripsidisusun sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Sarjana Sain Biologi

Oleh

Ngaliyatun

4450408025

JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG2013

ii

PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi saya yang berjudul “Uji

Daya Infektivitas Plasmodium berghei Iradiasi Pada Hati dan Limpa Mencit Menggunakan

Metode Nested-Polymerase Chain Reaction” disusun berdasarkan hasil penelitian saya

dengan arahan dosen pembimbing. Sumber informasi atau kutipan yang berasal atau dikutip

dari karya yang diterbitkan telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar

Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Skripsi ini belum pernah diajukan untuk memperoleh

gelar dalam program sejenis di perguruan tinggi manapun.

Semarang, 19 September 2013

Ngaliyatun

4450408025

iii

PENGESAHAN

Skripsi yang berjudul

Uji daya infektivitas Plasmodium berghei Iradiasi Pada Hati dan Limpa

Mencit (Mus musculus) Menggunakan Metode Nested-Polymerase Chain Reaction

Disusun oleh

Nama : Ngaliyatun

NIM : 4450408025

telah dipertahankan dihadapan sidang panitia ujian skripsi FMIPA UNNES pada Tanggal

05 September 2013.

Panitia Sekretaris

Prof Dr. Wiyanto, M.Si. Andin Irsadi, S.Pd, M.Si. NIP. 196310121988031001 NIP.197403102000031001

Ketua Penguji

Dr. Drh. R. Susanti, MP.NIP. 197111071998022001

Anggota penguji/ Anggota penguji/

Pembimbing Utama Pembimbing Pendamping

Ir. Tuti Widianti, M.Biomed Dr. Mukh Syaifudin NIP. 195102071979032001 NIP.196506011989011001

iv

ABSTRAK

Ngaliyatun. 2013. Uji Daya Infektivitas Plasmodium berghei Iradiasi Pada Hati

dan Limpa Mencit Menggunakan Metode Nested-Polymerase Chain Reaction. Skripsi, Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Semarang. Ir.Tuti Widianti, M. Biomed dan Dr. Mukh Syaifudin

Plasmodium berghei adalah parasit jenis protozoa penyebab malaria pada rodensia yang ditularkan melalui gigitan nyamuk Anopheles betina yang terinfeksi parasit tersebut. Iradiasi dapat menyebabkan perubahan struktur protein, degradasi protein maupun perubahan konformasi DNA. Dosis iradiasi 150-175 Gy dapat menurunkan daya infeksi P.berghei pada mencit dengan ditunjukkan oleh periode prepaten yang panjang serta jumlah kematian mencit yang rendah. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi keberadaaan Plasmodium iradiasi pada hati dan limpa mencit (Mus musculus) menggunakan metode Nested Polymerase Chain Reaction (PCR).

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Bidang Biomedika PTKMR BATAN. Populasi penelitian adalah mencit strain Swiss Webster jantan. Sampel yang digunakan yaitu adalah mencit strain Swiss Webster jantan berumur ±2 bulan dengan berat badan sekitar 35 gram, diperoleh dari Pusat Penyakit Tropis, Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan Jakarta. Penelitian ini menggunakan P. berghei yang diiradiasi dosis 175 Gy tanpa booster, 175 Gy dengan booster, dan 0 Gy dan diinfeksikan ke dalam tubuh mencit. Setelah 2 bulan hati dan limpa mencit diambil dan dilakukan ekstraksi DNA. Hasil ekstraksi diamplifikasi menggunakan nested-PCR dengan dua pasang primer yaitu rPLU1 dan rPLU5 untuk amplifikasi pertama dan rPLU3 dan rPLU4 untuk amplifikasi kedua. Elektroforesis menggunakan gel agaros dilakukan untuk melihat ada tidaknya pita DNA spesifik yang berukuran sesuai dengan DNA target.

Hasil pemeriksaan DNA genom dari sampel hati dan limpa mencit menunjukkan kualitas cukup baik. Proses amplifikasi nested-1 tidak menunjukkan adanya pita berukuran 1640 bp baik pada sampel maupun pada kontrol positif. Amplifikasi nested-2 tidak menunjukkan adanya pita berukuran 240 bp pada sampel tetapi pada kontrol positif menunjukkan ukuran pita berukuran 240 bp.

Simpulan penelitian adalah P. berghei iradiasi tidak terdeteksi pada hati dan limpa mencit (Mus musculus) menggunakan metode nested-PCR. Hal ini berarti bahwa penggunakan iradiasi efektif melemahkan atau mencegah daya infektif parasit.

Kata Kunci: Iradiasi, nested-Polymerase Chain Reaction, Plasmodium berghei

v

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan

hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Daya

Infektifitas Plasmodium berghei Iradiasi Pada Hati dan Limpa Mencit (Mus

musculus) Pasca Booster Menggunakan Metode Nested-Polymerase Chain

Reaction.” ini.

Penyelesaian skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan semua pihak

yang terkait. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA).

2. Ketua Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Semarang.

3. Ibu Ir.Tuti Widianti, M.Biomed selaku dosen pembimbing utama dan Bapak Dr.

Mukh Syaifudin selaku dosen pembimbing pendamping yang selalu sabar

membimbing dan mengarahkan penulis dalam menyusun rancangan penelitian,

pelaksanaan penelitian dan penyusunan laporan hasil penelitian (skripsi) ini.

4. Ibu Dr. drh.R.Susanti, MP. selaku dosen penguji utama yang memberikan

masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

5. Bapak dan ibu tercinta, Martawintana dan Samini, yang selalu memberi

semangat, dukungan moral dan material tanpa mengenal lelah serta pamrih.

6. Teman-teman BIPANNES ’08 (Ferdi, Vicky, Nidaul, Yulia) yang mewarnai

hidup, menjadi penyemangat dan sumber inspirasi penulis.

7. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah

membantu penyusunan skripsi ini.

Tiada gading yang tak retak, skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena

itu saran dan kritik yang membangun penulis harapkan dari pembaca sekalian.

Semoga skripsi ini bermanfaat. Amin.

Semarang, September 2013

Penulis

vi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................ i

PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI ..................................................... ii

PENGESAHAN ........................................................................................ iii

ABSTRAK ................................................................................................ iv

KATA PENGANTAR ............................................................................. v

DAFTAR ISI ........................................................................................... vi

DAFTAR TABEL ................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... ix

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ x

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang .................................................................... 1B. Rumusan Masalah ............................................................... 3C. Penegasan Istilah .................................................................. 4D. Tujuan Penelitian.................................................................. 4E. Manfaat Penelitian................................................................ 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA dan HIPOTESIS

A. Tinjauan Pustaka .................................................................. 51. Siklus Hidup Plasmodium berghei................................ 5

a. Siklus aseksual ............................. .......................... 6 b. Siklus seksual ....................................................... 7

2. Iradiasi Sinar Gamma ................................... ............... 83. Analisa DNA dengan Teknik Nested-PCR .................. 10

a. Molekul DNA ....................................................... 10b. Teknik Nested-Polymerase Chain Reaction .......... 12

B. Hipotesis ............................................................................. 13

BAB III METODE PENELITIAN

A. Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................... 14B. Subyek Penelitian ................................................................ 14C. Variabel Penelitian............................................................... 14

vii

D. Rancangan Penelitian........................................................... 14E. Alat dan Bahan Penelitian .................................................... 16F. Prosedur Penelitian.............................................................. 17G. Data dan Metode Pengumpulan Data .................................... 20H. Analisa Data ......................................................................... 20

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN

A. Hasil ..................................................................................... 21B. Pembahasan.......................................................................... 24

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan .......................................................................... 31B. Saran .................................................................................... 31

DAFTAR PUSTAKA.................................................................................. 32

LAMPIRAN................................................................................................ 36

viii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Alat penelitian isolasi dan amplifikasi DNA ............................................ 16

2. Bahan Penelitian .................................................................................... 16

3. Hal amplifikasi DNA pada hati dan limpa mencit .................................. 20

4. Data elektroforegram hasil PCR nested-2 ................................................ 24

ix

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Siklus hidup Plasmodium sp ................................................................... 8

2. Gambaran skematis nested-PCR ............................................................. 11

3. Produk amplifikasi PCR nested-2 Plasmodium sp ................................... 12

4. Rancangan penelitian .............................................................................. 15

5. Elektroforegram genom DNA pada gel agaros 2% .................................. 21

6. Elektroforegram nested-1 pada gel agaros 2%.......................................... 22

7. Elektroforegram nested-2 pada gel agaros 2% ......................................... 23

x

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Alat penelitian ........................................................................................ 36

2. Dokumentasi penelitian............................................................................ 38

3. Surat ijin penelitian ................................................................................. 39

4. Surat persetujuan penelitian tugas akhir ................................................... 40

5. Surat undangan ujian skripsi .................................................................... 41

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar belakang

Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh parasit jenis protozoa

dari genus Plasmodium. Salah satunya adalah Plasmodium berghei yang

ditularkan melalui gigitan nyamuk Anopheles betina yang terinfeksi parasit

tersebut (Shi et al. 2007). P berghei mempunyai siklus hidup dan morfologi yang

sama dengan jenis Plasmodium falciparum yang menyebabkan malaria pada

manusia.

Sejauh ini, belum ada vaksin yang efektif mencegah malaria.

Penyebabnya antara lain adalah resistensi parasit terhadap obat anti malaria serta

siklus perkembangbiakan parasit yang rumit. Selain itu juga dipengaruhi oleh

vektor nyamuk Anopheles sp. yang resisten terhadap insektisida. Resistensi

Plasmodium terhadap klorokuin terjadi karena ada perubahan membran sel

parasit sehingga klorokuin akan dikeluarkan dari sel (Abeku 2007).

Plasmodium mempunyai 2 siklus hidup yaitu siklus seksual dan aseksual.

Plasmodium termasuk parasit obligat karena selalu membutuhkan hospes selama

siklus hidupnya. Siklus seksual membutuhkan tubuh nyamuk sebagai hospes

definitif sedangkan mamalia digunakan sebagai hospes intermediate selama

siklus aseksual. Siklus seksual dimulai pada saat nyamuk menelan darah yang

terinfeksi Plasmodium (Capurro et al. 2000). Volume darah sekitar 1-2 µl yang

ditelan nyamuk betina berisi 1-10 gametosit, 5-6 diantaranya akan menjadi

ookinet. Hanya 2 ookinet yang akan berhasil menjadi ookista dalam waktu 2-7

hari dan menghasilkan sekitar 16.000 sporozoit (Sinden 1999). Sporozoit

Plasmodium yang terbentuk akan diinfeksikan ke dalam tubuh hospes pada saat

nyamuk betina terinfeksi menggigit manusia.

Sporozoit yang diinfeksikan oleh nyamuk akan memasuki aliran darah.

Sebagian sporozoit akan difagosit oleh sel darah putih dan sebagian yang lain

menginfeksi sel hati. Sporozoit tersebut selanjutnya memperbanyak diri

2

membentuk skizon yang berisi merozoit. Skizon yang matang pecah kemudian

menginfeksi sel darah merah. Akibat aktivitas ini dapat menimbulkan anemia

bahkan menyebabkan kematian. Anemia disebabkan oleh merozoit yang

mengingesti sitoplasma eritrosit hospes dan mengubah hemoglobin menjadi

asam amino dan pigmen hemozoin. Pigmen yang dihasilkan oleh Plasmodium

menyebabkan perubahan pada hati dan limpa menjadi coklat kehitaman (Brown

1979).

Limpa merupakan salah satu organ yang penting dalam produksi limfosit.

Limpa pada penderita malaria berfungsi sebagai filter untuk menghancurkan

eritrosit yang terinfeksi Plasmodium. Plasmodium dan pigmen pada eritrosit

difagositosis secara aktif oleh makrofag limpa (Djanah 2007).

Diagnosa Plasmodium secara mikroskopis pada darah penderita malaria

di Pakistan, Iran, dan Afghanistan mempunyai tingkat infeksi 0-2,5% sedangkan

menggunakan nested-PCR tingkat infeksinya berturut-turut sebesar 6,5%, 22%,

dan 35% (Zakeri et al. 2010). Riset yang dilakukan oleh Ndao et al. (2004)

menunjukkan bahwa metode nested-PCR lebih akurat dibandingkan dengan

metode apusan darah dan deteksi antigen.

Penggunaan sinar gamma untuk melemahkan Plasmodium sebagai bahan

dasar vaksin telah banyak diteliti. Keefektifan sinar gamma dalam melemahkan

parasit telah dibuktikan dengan adanya imunitas protektif pada hewan coba

setelah diimunisasi sporozoit P.falciparum dan P.berghei iradiasi. Dosis radiasi

yang optimal dapat menghambat perkembangan parasit. Dosis radiasi optimal

untuk melemahkan P. falciparum stadium sporozoit adalah antara 150–200 Gy

(Hoffman et al. 2002). Dosis iradiasi 150-175 Gy dapat menurunkan daya infeksi

P.berghei pada mencit dengan ditunjukkan oleh periode prepaten yang panjang

serta jumlah kematian mencit yang rendah (Darlina & Tetriana 2008).

Berdasarkan respon imun yang diteliti yakni pengamatan makrofag pada

dosis 150 Gy belum menunjukkan efektivitas bahan vaksin. Berdasarkan

pemeriksaan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid menunjukkan bahwa

kandungan protein P.berghei semakin menurun dengan kenaikan dosis radiasi

3

(Tetriana et al. 2008). Perubahan protein dapat diakibatkan oleh denaturasi

protein, degradasi protein maupun perubahan konformasi asam

deoksiribonukleat (DNA).

Genom P. berghei berukuran 2,3-2,4 x107 pasang basa (pb) (Gardner et

al. 2002). Perubahan DNA dapat dideteksi menggunakan teknik polymerase

chain reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode invitro untuk

mengamplifikasi segmen DNA dari suatu kompleks DNA melalui suatu reaksi

enzimatik yang sederhana dengan menggunakan pasangan primer yang spesifik

melalui mekanisme perubahan suhu (Sulandari & Zein 2003).

Nested-PCR merupakan modifikasi dari PCR yang bertujuan mengurangi

kontaminasi produk PCR yang disebabkan oleh kesalahan amplifikasi primer.

Nested-PCR melibatkan dua pasang primer yang digunakan dalam dua proses

PCR yang berurutan. Set primer kedua digunakan untuk memperkuat DNA

target PCR nested-1 dan menghasilkan DNA target yang lebih pendek dari

produk PCR pertama (Neumaier et al. 1998). Teknik PCR merupakan metode

yang umum untuk mendeteksi resistensi Plasmodium secara lebih sensitif.

Sejumlah 13 sampel yang diteliti oleh Saiwichai et al. (2009) menggunakan

mikroskop menunjukkan hasil negatif, sedangkan 9 sampel diantaranya positif

terdeteksi Plasmodium menggunakan nested-PCR.

Selain keakuratan yang tinggi, sensitivitas dari metode nested- PCR juga

tinggi seperti penelitian Saiwichai et al. (2009) yang menggunakan pemeriksaan

darah segar untuk mendeteksi P. gallinaceum. Tingkat sensitivitas yang

didapatkan adalah sebesar 0.0000085% parasitemia atau 0,2 sel darah merah

terinfeksi/µl. Penelitian Iqbal et al. (1999) juga menunjukkan bahwa metode

PCR lebih sensitif dibandingkan pemeriksaan mikroskopis.

B. Rumusan masalah

Permasalahan dalam penelitian ini adalah sejauh mana daya infektivitas

Plasmodium berghei iradiasi pada hati dan limpa mencit yang dideteksi

menggunakan metode nested-PCR?

4

C. Penegasan istilah

Untuk menghindari salah pengertian dalam memahami isi skripsi ini, perlu

ada batasan-batasan terhadap beberapa istilah sebagai berikut :

1. Plasmodium berghei adalah protozoa penyebab malaria pada rodensia yang

digunakan sebagai model dalam penelitian.

2. Iradiasi merupakan teknik radiasi buatan dengan meradiasi bahan dengan

sinar radiasi dan yang digunakan adalah sinar gamma dosis 175 Gy dengan

laju dosis 380 Gy/jam. Sumber radiasi gamma yang digunakan adalah 60 Co.

3. Nested-PCR merupakan modifikasi dari PCR yang bertujuan mengurangi

kontaminasi produk PCR yang disebabkan oleh kesalahan amplifikasi primer.

Nested-PCR melibatkan dua pasang primer yang digunakan dalam dua proses

PCR yang berurutan. Set primer kedua digunakan untuk memperkuat DNA

target PCR nested-1 dan menghasilkan DNA target yang lebih pendek dari

produk PCR pertama (Neumaier et al. 1998).

D. Tujuan penelitian

Tujuan penelitian ini adalah mendeteksi daya infektivitas Plasmodium

berghei iradiasi pada hati dan limpa mencit menggunakan metode Nested-

Polymerase Chain Reaction (PCR).

E. Manfaat penelitian

Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini adalah :

1. Sebagai langkah untuk penelitian lebih lanjut tentang pembuatan vaksin

malaria melalui iradiasi parasit.

2. Menambah wawasan tentang deteksi parasit P. berghei yang diiradiasi

gamma.

5

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA & HIPOTESIS

A. Tinjauan Pustaka

Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh parasit jenis protozoa dari

genus Plasmodium. Terdapat 400 spesies Plasmodium, 12 diantaranya bersifat

patogen pada manusia. Siklus hidup Plasmodium melibatkan interaksi antara parasit,

vektor, dan mamalia. Plasmodium falciparum merupakan salah satu parasit dari

genus Plasmodium yang menginfeksi manusia sebagai hospes intermediate. P.

falciparum sering menyebabkan malaria otak dan menyebabkan kematian. Selain

menggunakan manusia sebagai hospes, Plasmodium menggunakan tubuh nyamuk

sebagai hospes definitive (vektor) salah satunya adalah nyamuk Anopheles gambiae

(Sandoz 1973).

Sejak urutan genom P. falciparum dan A. gambiae diketahui, upaya

mengendalikan malaria dari sisi parasit dan vektor secara molekuler sudah mulai

dilakukan (Kanzo &Zheng 2003). Sulitnya memahami interaksi antara parasit dengan

vektor dan mamalia dikarenakan keragaman spesies parasit dan vektor tersebut

(Sinden 2002).

1. Siklus Hidup Plasmodium berghei

P. berghei adalah hemoprotozoa yang menyebabkan penyakit malaria pada

rodensia, terutama rodensia kecil seperti mencit. P. berghei banyak digunakan dalam

penelitian malaria pada manusia. Hal ini disebabkan teknologi pembiakan secara

invitro dan pemurnian pada tahapan siklus hidup, dan pengetahuan genom telah

diketahui. P. berghei mempunyai ukuran genom yang paling mirip dengan genom P.

falciparum dibandingkan dengan jenis Plasmodium yang lain (Gardner et al. 2002).

Selain genom, kemiripan sifat biokimiawi dan siklus hidup P. berghei juga

digunakan sebagai pertimbangan yang kuat tentang penggunaan parasit tersebut

dalam penelitian malaria pada manusia. P. falciparum tidak digunakan dalam

penelitian karena parasit tersebut hidup di dalam tubuh manusia sedangkan model

6

yang digunakan dalam penelitian adalah mencit. Manusia tidak dapat digunakan

sebagai model dalam penelitian malaria dikarenakan alasan etika.

Secara umum siklus hidup Plasmodium mempunyai dua hospes yakni

manusia dan nyamuk Anopheles. Siklus aseksual berlangsung pada tubuh manusia

disebut fase skizogoni dan siklus seksual terjadi di dalam tubuh nyamuk disebut fase

sporogoni (Garnham 1965).

a. Siklus aseksual

Sporozoit merupakan tahapan parasit yang berasal dari kelenjar ludah

nyamuk Anopheles betina masuk ke dalam tubuh manusia melalui gigitan nyamuk

tersebut. Sporozoit selanjutnya memasuki sel-sel hati dan dimulailah stadium

eksoeritrositik dalam waktu tiga puluh menit. Sporozoit yang berada di sel hati

tumbuh menjadi skizon dan berkembang menjadi merozoit (10.000-30.000 merozoit,

tergantung spesiesnya). Sel hati akan pecah dan merozoit akan masuk aliran darah

(Kappe et al. 2003).

Penelitian Frevert et al. (2005) menunjukkan bahwa sporozoit P.berghei

secara aktif menyerang sel makrofag. Hal ini diperankan oleh tethers yaitu sporozoit

yang aktif menginvasi makrofag. Proses terbentuknya tethers terjadi saat invasi

sporozoit ke dalam sel-sel yang melapisi lumen sinusoid hati (Vandenberg et al.

1990).

Motilitas sporozoit berperan penting saat invasi sporozoit ke dalam sel-sel hati

inang (Vandenberg et al. 1990). Sporozoit masuk ke hati secara tiba-tiba mengikuti

lapisan sel sinusoidal. Parasit masuk melalui sel sinusoidal searah atau melawan

aliran darah menuju sel Kupffer dan melintasi ruang Disse. Sel Kupffer dapat

dideteksi menggunakan lisosom autoflourescensi berwarna orange. Sporozoit akan

mencapai hepatosit dalam waktu beberapa menit( Frevert et al. 2005).

Tahap perkembangan parasit di dalam hati menghasilkan bentuk parasit baru.

Parasit tersebut hidup di dalam sel darah merah dengan lingkungan seluler dan

molekuler yang berbeda (Mikolajczak et al. 2006). Parasit yang lemah atau mati

berbentuk sabit dan tidak menunjukkan gerakan sel. Tiga jam setelah infeksi sekitar

5x106 sporozoit, sekelompok hepatosit mengalami nekrosis yang akan diinfiltrasi

7

oleh sel inflamatori. Infeksi sporozoit pada hepatosit menyebabkan kerusakan

hepatosit dan ditandai oleh tingginya jumlah alanine aminotransferase di dalam

serum.

Plasmodium tidak hanya menyebabkan kerusakan pada hati tetapi juga

menyebabkan pembesaran limpa (Brown 1979). Limpa merupakan kelenjar tanpa

saluran yang berhubungan erat dengan sistem sirkulasi. Limpa mempunyai dua fungsi

yaitu membentuk respon imun dan melawan antigen yang berada di dalam darah.

Limpa akan membuang bahan partikel dan sel darah yang sudah tua atau rusak,

terutama eritrosit dari sirkulasi. Sistem sirkulasi darah pada limpa memiliki fungsi

penting terhadap rangsangan antigen dan ekstraksi hemoglobin serta zat besi.

Limpa berperan penting dalam mengatasi infeksi malaria (clearance).

Cytoadherence merupakan salah satu cara Plasmodium untuk menghindari clearance

limpa dan digunakan sebagai mekanisme pertahanan Plasmodium untuk menghindari

sirkulasi darah. Cytoadherence menyebabkan oklusi pembuluh darah limpa dan

kerusakan organ limpa (Mohanty et al. 2006).

b. Siklus seksual

Siklus seksual terjadi di dalam tubuh nyamuk nyamuk Anopheles betina

menghisap darah yang mengandung gametosit. Pada mikrogamet (jantan), sejumlah

6-8 inti sel akan bergerak ke tepi sel mikrogamet dan membentuk flagel atau filamen.

Pembuahan terjadi bila mikrogamet masuk ke dalam makrogamet sehingga terbentuk

zigot. Zigot berubah bentuk seperti cacing pendek disebut ookinet. Ookinet dapat

menembus lapisan epitel dan membran basal dinding lambung. Di tempat ini ookinet

akan berkembang menjadi ookista (Garnham 1965).

Riset yang dilakukan oleh Wijayanti et al. (1997) menunjukkan bahwa infeksi

P. berghei pada mencit Swiss dapat menyebabkan kematian pada hospes. Imunitas

hospes muncul karena adanya sistem pada mencit. Imunitas mencit yang lebih tinggi

menyebabkan penurunan angka mortalitas mencit dan jumlah parasitemia yang

rendah. Patogen pada manusia dideteksi oleh sel-sel dari sistem imun innate seperti

sel dendritik, sel Natural Killer( NK), basofil, eosinofil, dan sel Mast melalui pattern

recognition receptors (PRRs), seperti Toll-like receptors (TLRs) dan NOD-like

8

receptors (NLRs) (Takeuchi & Akira 2010). Interaksi antara hospes dan parasit ini

dapat mengurangi jumlah parasit dan merangsang sistem immune adaptive( sel B dan

sel T) yang akan mengenali dan mengikat antigen asing melalui ekspresi reseptor

pada permukaan sel ( Palm & Medzhitov 2009). Siklus hidup Plasmodium dapat

dilihat pada Gambar 1 berikut.

Gambar 1 Siklus hidup Plasmodium sp

Kematian sel terprogam (apoptosis) pada awal perkembangan Plasmodium di

dalam tubuh vektor digunakan untuk regulasi infeksi parasit. Hal ini akan

mempengaruhi kelangsungan hidup parasit. Zigot dan ookinet P.berghei yang sudah

mati ditunjukkan dengan peningkatan apoptosis sel di dalam lumen midgut. Infeksi

Plasmodium menginduksi terjadinya apoptosis pada sel-sel dari jaringan midgut dan

epitel folikuler (Hurd &Carter 2004).

2. Iradiasi sinar gamma

Radiasi adalah energi yang dipancarkan dalam bentuk partikel atau

gelombang. Iradiasi merupakan radiasi yang sengaja dilakukan oleh manusia untuk

tujuan tertentu. Radiasi pengion merupakan salah satu bentuk radiasi yang

menyebabkan munculnya partikel bermuatan listrik. Radiasi sinar-X, sinar gamma,

9

alfa, dan beta termasuk jenis radiasi pengion. Radiasi pengion berinteraksi dengan

sistem seluler melalui pengubahan struktur, fungsi, dan respon sel terhadap produk

seluler (Nikjoo 2003).

Radiasi sinar gamma pada sel mempunyai efek secara tidak langsung

(stokastik) maupun langsung (deterministik). Efek langsung dapat ditandai dengan

kematian sel ataupun pemutusan ikatan senyawa penyusun sel. Efek tidak langsung

terjadi karena sebagian besar penyusun sel adalah air. Radiasi gamma menyebabkan

air terhidrolisis menghasilkan radikal bebas yang akan merusak sel termasuk DNA

pada sel. Interaksi radiasi dengan DNA menyebabkan kerusakan DNA seperti single

strand break (SSB), double strand break (DSB), base damage (BD) dan lain-lain.

Kerusakan tingkat molekul disebabkan oleh deposisi energi, produksi ionisasi,

eksitasi oleh molekul yang berasal dari reaksi fisika dan spesies radikal, produk

molekul yang lain yang berasal dari reaksi kimia (Nikjoo 2003).

Sinar gamma sudah banyak dimanfaatkan dalam berbagai bidang penelitian.

Iradiasi sinar gamma dimanfaatkan dalam bidang pangan seperti menginaktivasi

bakteri patogen pada produk makanan (Gunes et al. 2011). Selain itu iradiasi sinar

gamma juga dimanfaatkan dalam bidang vaksin. Penelitian Sanakkalaya et al (2005)

menunjukkan bahwa iradiasi gamma dapat menurunkan kemampuan replikatif bakteri

yang bisa digunakan sebagai alternatif vaksin untuk menginduksi imunitas protektif

dari infeksi Brucella abortus. Sinar gamma juga dimanfaatkan dalam penelitian

bahan vaksin mastitis dengan cara diinaktivasi tanpa merusak protein secara

keseluruhan (Hermanto et al. 2008 ). Teknik radiasi pengion digunakan untuk

pembuatan vaksin malaria untuk mencegah infeksi P. berghei pada stadium eritrositik

(Tetriana et al. 2008). Hal ini disebabkan teknik iradiasi lebih menguntungkan

karena respon imun lebih kuat dan luas dalam inang setelah pemberian vaksin.

Pemanfaatan radiasi pengion dalam pembuatan vaksin malaria telah

dilakukan. Tujuan utamanya adalah menentuan dosis yang tepat untuk melemahkan

Plasmodium. Dosis radiasi gamma 150 Gy menyebabkan perubahan profil protein

yaitu hilangnya protein pada kisaran 15 kDa (Tetriana et al. 2008). Iradiasi dengan

dosis 150-200 Gy merupakan stadium paling efektif untuk melemahkan Plasmodium

10

pada stadium sporozoit. Hal ini dibuktikan oleh berkurangnya kemampuan infeksi

Plasmodium sampai ke sel-sel hati.

3. Analisis DNA dengan Teknik Nested-PCR

a. Molekul DNA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA di dalam sel berupa DNA mitokondria, DNA kloroplas dan DNA inti.

Keseluruhan DNA yang menyusun masing- masing komponen disebut DNA genom

(Muladno 2002).

P. berghei memiliki 14 kromosom. Secara analisis molekuler P. berghei sama

seperti Plasmodium yang menginfeksi manusia. P. berghei mempunyai genom

berukuran 2,3-2,4 x107 pb. DNA inti P. berghei mengandung (A+T) yang tinggi

sekitar 82% yang tersebar pada DNA koding dan DNA non-koding. Genom P.

berghei mengandung (G+C) sekitar 25-30 %. Plasmodium mempunyai sekitar 5300

gen yang mengkode berbagai protein yang berperan dalam metabolisme, transpor

materi organik, replikasi-perbaikan-rekombinasi DNA dan lain-lain. Selain itu parasit

mempunyai gen pengkode enzim sebagai biokatalis dan transport protein (Gardner et

al. 2002).

b. Teknik Nested-Polymerase Chain Reaction

Teknik PCR telah digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit infeksi

(Sulistyaningsih 2007). Nested-PCR merupakan metode amplifikasi sekuens DNA

yang spesifik secara invitro. Teknik ini menggunakan dua kali proses amplifikasi

dengan 2 pasang primer yang spesifik. Pasangan primer pertama berfungsi

menggandakan fragmen seperti PCR standar, sedangkan pasangan primer kedua

berfungsi untuk memperkuat suatu fragmen DNA produk PCR pertama. Keuntungan

dari nested PCR adalah jika terdapat kesalahan amplifikasi fragmen, maka akan

diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh sepasang primer pada nested-2.

Amplifikasi metode PCR memerlukan beberapa macam bahan yaitu: a)

primer, suatu oligonukleotida tunggal yang sekuensnya berkomplemen dengan

11

cetakan DNA dan panjangnya antara 18-30 basa, b) enzim Taq DNA polymerase, c)

dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA target, akuabides, dan buffer PCR yang di

dalamnya sudah terdapat garam magnesium (Sulandari & Zein 2003). Prinsip PCR

ada tiga, yaitu denaturasi yang berarti pemutusan untai ganda menjadi untai tunggal,

annealing yakni penempelan primer pada tempat yang spesifik dan elongasi yaitu

pemanjangan primer dengan bantuan enzim DNA polymerase membentuk untaian

DNA. Ilustrasi PCR dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2 Gambaran skematis nested-PCR( Pooe 2011)

Nested-PCR adalah teknik yang lebih akurat dibandingkan pemeriksaan

mikroskopis. Nurhayati et al. (2009) mengkaji tentang penggunakan mikroskop yang

selama ini menjadi standar emas (gold standar) dalam pemeriksaan Plasmodium yang

dinilai sekarang kurang akurat. Diagnosis parasit tidak cukup hanya mengandalkan

teknik mikroskopis saja dikarenakan perubahan morfologi dan munculnya berbagai

strain baru yang disebabkan obat anti-malaria yang digunakan secara tidak tepat

sehingga parasit menjadi resisten terhadap obat.

(a)

First PCR amplificationTarget gene sequence

(b)

(c)

Second PCR amplification

Whole genom

12

Berbagai jenis Plasmodium dapat dibedakan dalam beberapa tahap

perkembangannya. Plasmodium dapat dibedakan melalui bentuk skizon, trofozoit,

dan bentuk gametosit. Setiap Plasmodium mempunyai bentuk spesifik tetapi

pemeriksaan mikroskopis masih cukup sulit dan membutuhkan ketelitian yang tinggi.

Selain pemeriksaan mikroskopis juga digunakan metode immunokromatografi yang

lebih mudah, cepat dan ekonomis dibandingkan secara mikroskopis tetapi

keakuratannya masih kurang jika dibandingkan dengan PCR (Arum et al. 2006).

Contoh elektroforegram nested-2 dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3 Produk amplifikasi nested-2 Plasmodium sp dari sampel darah (Singh et al.1999)

Metode lain untuk mendeteksi protein atau asam nukleat telah dikembangkan.

Teknik dip-stick digunakan untuk mendeteksi secara immunoenzimatik protein yang

kaya histidin II yang spesifik pada P. falciparum. Selain itu deteksi berdasarkan

asam nukleat yakni hibridisasi DNA atau RNA berlabel yang sensivitasnya

ditingkatkan dengan PCR juga dikembangkan. Kelebihan menggunakan PCR adalah

dapat mendeteksi Plasmodium dalam tingkat infeksi ringan dengan hasil yang lebih

akurat (Saiwichai et al. 2009).

13

B. Hipotesis

Berdasarkan tinjauan pustaka dan permasalahan tersebut di atas, maka

hipotesisnya adalah bahwa iradiasi sinar gamma dapat menurunkan daya infektivitas

P. berghei pada tubuh mencit sehingga tidak terdeteksi saat diuji menggunakan

nested-Polymerase chain Reaction.

14

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Bidang

Biomedika, Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi (PTKMR),

Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Jl. Lebakbulus Raya No. 49 Pasar

Jum’at ,Jakarta Selatan, mulai bulan Mei sampai Agustus 2012.

B. Subyek Penelitian

Mencit yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit strain Swiss

Webster jantan. Sampel yang digunakan yaitu mencit strain Swiss Webster jantan

berumur ±2 bulan dengan berat badan sekitar 35 gram, diperoleh dari Pusat

Penyakit Tropis, Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan Jakarta.

C. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas: dosis radiasi dan nested-PCR.

2. Variabel Tergantung: daya infektivitas mencit

3. Variabel kendali: umur dan berat badan mencit.

D. Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental untuk menguji daya

infektivitas P. berghei iradiasi. Penelitian dilakukan dengan menggunakan dosis

radiasi 0 Gy dan 175 Gy. Dosis 175 Gy dapat menurunkan daya infeksi P.

berghei pada mencit. Hati dan limpa diambil dari mencit yang telah diinfeksi P.

berghei 0 Gy satu kali suntikan, dosis 175 Gy satu kali suntikan dan dosis 175 Gy

dua kali suntikan (booster). Suntikan kedua dilakukan untuk meningkatkan daya

imun mencit sehingga diharapkan P. berghei dapat dinetralisir oleh sistem imun

yang dipicu parasit iradiasi. Bagian organ yang diuji diambil dari 3 titik yang

berbeda dan dianggap sebagai 3 kali ulangan. Kontrol yang digunakan adalah

ekstrak DNA P. berghei yang didapatkan dari Laboratorium Malaria, Lembaga

Biologi Molekuler Eijkman Jakarta. Rancangan penelitian disajikan pada Gambar

4.

15

Gambar 4 Rancangan penelitian.

Tidak diiradiasi(0 Gy)Diiradiasi 175 Gy selama 30 menit

Setelah 2 minggu infeksi kedua (booster) 100µl isolat sporozoit ke tubuh mencit

Hatimencit

Limpamencit

Isolasi DNA

Organ diambil 2 bulan setelah infeksi

Infeksi 100µl isolatsporozoit ke dalam tubuh mencit

Organ diambil 2 bulan setelah booster

Organ diambil 2 bulan setelah infeksi

Nested PCR

Isolasi DNA

Nested PCR

penginfeksian P. berghei (±1x106 parasit inokulum stadium eritrositik) pada mencit secara intraperitoneal.

Setelah 2 hari diamati,pengamatan parasitemia diamati sampai didapatkan ±10% parasitemia

Penggigitan mencit terinfeksi oleh nyamuk Anopheles sp

Pemeliharaan nyamuk selama 14-16 hari

Isolasi sporozoit Isolasi sporozoit

Dilarutkan NaCl 0,9%Dilarutkan NaCl 0,9%

Infeksi 100µl isolat sporozoit ke dalam tubuh mencit

Infeksi 100µl isolat sporozoit ke dalam tubuh mencit

Hatimencit

Limpamencit

IsolasiDNA

Nested PCR

Isolasi DNA

Nested PCR

Hatimencit

Limpamencit

Isolasi DNA

Nested PCR

Isolasi DNA

Nested PCR

16

E. Alat dan Bahan Penelitian

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian berturut-turut disajikan pada

Tabel 1:

Tabel 1 Alat penelitian

No Uraian Alat1. Pengambilan sampel organ Alat bedah, pinset, plastik steril2. Penyimpanan sampel organ Freezer (-20°C)3. Isolasi DNA Latex glove, pisau silet, pinset, neraca

Ohaus Pioneer TM, microtube 1,5 ml, rak microtube, dry bath, microcentrifuge survall Legend MICRO 17 R, kotak sampel, tip kuning & biru, lemari pendingin Sharp(-20°C), inkubator dan vortex Labnet®, mikropipet Eppendorf, tabung QIAamp Mini Spin.

4. Elektroforesis hasil isolasi dan amplifikasi DNA

Rak microtube, well forming combs, horizontal elektroforesis Mupid ®-eXu, Gel docTM XR+ with Image LabTM software, Hot plate Cimarec®, tip kuning & putih, mikropipet Eppendorf .

5. Amplifikasi DNA GeneAmp® PCR System 9700 Applied Biosystem, microtube 0,2 µl, mikropipet Eppendorf, tip kuning& putih, microcentrifuge survall Legend MICRO 17 R, vortex.

Tabel 2 Bahan Penelitian

No Uraian Bahan1. Isolasi DNA Tissue Lysis Buffer, Proteinase K, Lysis

Buffer, Wash Buffer (1), Wash Buffer (2), Elution Buffer, Etanol Absolut, Etanol 80%, RNase, Tris-EDTA.

2. Elektroforesis hasil isolasi dan amplifikasi DNA

UltrapureTM Agarose InvitrogenTM , EtBr aMResco®, Bufer TBE 0,5X, loading buffer Invitrogen®, DNA ladder aMResco®, parafilm M®, shaker DRS-12

3. Amplifikasi DNA Primer (rPLU1, rPLU5, Primer rPLU3, rPLU4) Invitrogen®, dNTPs Applied Biosystem®, Enzim taq polymerase Applied Biosystem®, ddH2O, MgCl2 Applied Biosystem®,, Buffer A

17

F. Prosedur Penelitian

a. Perolehan sporozoit dan isolasinya.

Sporozoit diperoleh dengan terlebih dahulu melakukan penginfeksian

secara intraperitoneal P. berghei (±1x106 parasit inokulum stadium eritrositik)

pada mencit dan 2 hari kemudian diamati parasitemia dalam darah mencit setiap

hari dengan mengambil darah perifer dari ujung ekor. Setelah diperoleh

parasitemia ±10%, mencit terinfeksi diletakkan dalam kandang nyamuk

Anopheles sp. dan dibiarkan nyamuk mengigit mencit. Nyamuk yang

mengkonsumsi darah (terinfeksi) dipelihara selama 14-16 hari dalam kandang

khusus untuk memperoleh sporozoit. Nyamuk tersebut diiradiasi sinar gamma

dosis 0 dan 175 Gy selama 30 menit. Isolasi kelenjar ludah nyamuk yang

mengandung sporozoit dilakukan dengan membedah nyamuk menurut prosedur

standar. Isolat dilarutkan dalam NaCl 0,9%. Isolat kelenjar ludah kemudian

disuntikkan secara intravena pada 3 mencit sehat melalui ekornya sebanyak

100µl setiap kali penyuntikan. Untuk beberapa perlakukan, penyuntikan kelenjar

ludah mengandung sporozoit ini diulangi 2 minggu kemudian (booster).

b. Isolasi DNA hati dan limpa mencit.

Isolasi DNA dilakukan menggunakan kit QIAGEN. Sampel hati 25 mg

dan limpa 10 mg dipotong-potong menjadi bagian yang lebih kecil menggunakan

pinset. Sampel dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dan ditambahkan 180 µl

tissue lysis buffer. Selanjutnya sampel ditambahkan 20 µl Proteinase-K, divorteks,

dan diinkubasi pada suhu 56°C selama 1 jam sampai jaringan mengalami lisis.

Selama waktu inkubasi dilakukan 2-3 kali vorteks . Pengendapan pelet dilakukan

dengan cara disentrifus sebentar. Kemudian ditambahkan 4 µl RNA-se (100

mg/ml), divorteks 15 detik dan diinkubasi 2 menit pada suhu kamar. Kemudian

pada tabung ditambahkan 200 µl lysis buffer, lalu divorteks lagi selama 15 detik,

diinkubasi pada suhu 70°C selama 10 menit. Selanjutnya tabung ditambahkan 200

µl etanol absolut, divorteks lagi selama 15 detik, disentrifus sebentar kemudian

18

dipindahkan dengan hati-hati ke dalam tabung QIAamp Mini Spin dan disentrifus

pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke QIAamp Mini spin kolom

baru. Selanjutnya supernatan ditambahkan 500 µl buffer Wash buffer(1) tanpa

membasahi dinding, disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Hasilnya dipindahkan ke dalam pada tabung QIAamp Mini spin yang bersih.

Kemudian supernatan ditambahkan 500 µl wash buffer(2) tanpa membasahi

dinding, disentrifus pada kecepatan 14000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang

dihasilkan dipindahkan pada tabung QIAamp Mini spin yang bersih dan

disentrifus lagi pada kecepatan 14000 rpm selama 1 menit. Pada tahap ini sudah

didapatkan ekstrak DNA. Tabung QIAamp Mini spin ditempatkan pada tabung

1,5 ml kemudian ditambahkan 80 µl elution buffer dan diinkubasi pada suhu

ruang selama 5 menit, disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Ekstrak DNA yang sudah didapatkan kemudian disimpan pada suhu -20°C.

c. Amplifikasi DNA

Tahap PCR untuk deteksi Plasmodium menggunakan 2 kali PCR yakni

nested-1 dan nested-2. Nested-2 dilakukan setelah diketahui hasil PCR pada

nested-1. Primer yang digunakan untuk nested-1 adalah rPLU1 & rPLU5 dengan

ukuran panjang DNA target sebesar 1640 bp (Michael 2005) sedangkan primer

pada nested-2 adalah rPLU3 & rPLU4 dengan ukuran panjang DNA target

sebesar 240 bp (Singh et al.1999). Produk PCR adalah gen 50S ribosomal sub

unit L21.

PCR nested-1 menggunakan primer rPLU1 sebagai primer F dengan

panjang 24 basa dan urutan basa 5’-TCA AAG ATT AAG CCA TGC AAG

TGA-3’, sedangkan rPLU 5 sebagai primer R dengan panjang 21 basa dan urutan

basanya adalah 5’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TCC-3’. Pada Nested-2,

rPLU3 sebagai primer F mempunyai panjang 30 basa dengan urutan 5’-TTT TTA

TAA GGA TAA CTA CGG AAA AGC TGT-3’ sedangkan rPLU4 sebagai

19

primer R mempunyai panjang 30 basa dengan urutan 5’-TAC CCG TCA TAG

CCA TGT TAG GCC ATT ACC-3’.

Langkah awal adalah membuat larutan mix PCR dengan komposisi

sebagai berikut. Perbandingan distillated water adalah 17,75 µl; Buffer A

sebanyak 2,5µl ; MgCl2 1µl; dNTPs 0,5µl; primer F 0,25µl; primer R 0,25µl; Taq

polymerase 0,25µl.

Semua komponen yang sudah dicampur di dalam tabung kemudian

divorteks dan disentrifus sebentar. Setiap tabung PCR diisi campuran tersebut

sebanyak 22,5 µl. Sebanyak 3 µl ekstrak DNA dimasukkan ke dalam masing-

masing tabung PCR dan diberi label. Tabung divorteks sebentar agar tidak ada

komponen yang menempel pada dinding tabung. Kemudian semua tabung

dimasukkan ke dalam mesin PCR (GeneAmp® PCR System 9700 Applied

Biosystem) yang sudah dihidupkan terlebih dahulu.

Kondisi PCR yang digunakan adalah sebagai berikut.

Kondisi PCR untuk nested-1:

a) Pre denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit.

b) Siklus sebanyak 29 kali terdiri denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik,

annealing pada suhu 55°C selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72°C

selama 1 menit.

c) Post elongasi pada suhu 72°C selama 4 menit.

Kondisi untuk nested-2:

a) Pre denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit

b) Siklus sebanyak 30 kali terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik,

annealing pada suhu 62°C selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72°C

selama 1 menit

c) Post elongasi pada suhu 72°C selama 4 menit.

20

d. Elektroforesis gel agaros hasil isolasi dan amplifikasi DNA

Elektroforesis dilakukan pada ekstrak DNA dan sampel produk PCR.

menggunakan gel agaros 2%. Produk ekstraksi DNA dielektroforesis dengan

perbandingan sampel : loading buffer adalah 4: 2. Produk PCR dielektroforesis

dengan perbandingan sampel : loading buffer adalah 8: 3. Sampel yang sudah

dicampur dengan loading buffer dimasukkan ke dalam sumur gel agaros yang

direndam dalam TBE 0,5 X. Gel kemudian di-running selama 30 menit pada 50

Volt. Selanjutnya gel direndam dengan larutan yang mengandung ethidium

bromide (EtBr) selama 15 menit sambil digoyang menggunakan shaker dan

direndam dengan aquades sambil digoyang selama 10 menit. Visualisasi pita

dilakukan DNA menggunakan Gel Doc yang sudah dilengkapi software Image

Lab.

G. Data dan Metode Pengumpulan Data

Data dalam penelitian ini diperoleh berdasarkan hasil pengamatan

panjang fragmen pita-pita DNA produk PCR. Jika terdapat pita DNA spesifik

dari sampel yang teramplifikasi dan DNA target berukuran sesuai dengan primer

yang digunakan, maka sampel tersebut mengandung parasit P. berghei. Data

pada hati dan limpa yang didapatkan dimasukkan ke dalam Tabel 3.

Tabel 3 Hal amplifikasi DNA pada hati dan limpa mencit.

No DosisUlangan I Ulangan II Ulangan III Kontrol

positifKontrol negatif

Hati Limpa Hati Limpa Hati Limpa Hati Limpa Hati Limpa

1. 0 Gy2. 175 Gy3. 175Gy

booster

H. Analisa Data

Pita-pita DNA yang tampak pada gel hasil elektroforesis dibandingkan

dengan pita DNA pada kontrol positif dan dianalisis secara deskriptif kualitatif

untuk menentukan ada tidaknya P. berghei pada organ hati dan limpa.

21

BAB IVHASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian

Pengambilan sampel dilakukan pada 3 titik yang berbeda pada hati dan

limpa secara acak. Hal tersebut dianggap sebagai 3 kali ulangan isolasi DNA pada

masing-masing sampel. Sebelum dilakukan amplifikasi DNA dengan nested-PCR,

dilakukan pemeriksaan terhadap kandungan DNA genom pada semua sampel hasil

isolasi. Keberadaan/kandungan isolat DNA kemudian dicek menggunakan

elektroforesis gel agaros 2%. Elektroferogram hasil isolasi DNA disajikan pada

Gambar 5. Tampak bahwa isolasi DNA menggunakan kit dari hati dan limpa

berhasil dengan baik, kecuali H1 (Hati 0 Gy) (Gambar 5a).

(a)

(b)

Gambar 5. Elektroforegram genom DNA pada gel agarose 2%. H1, Hati 0 Gy; L1, Limpa 0 Gy; H2, Hati 175 Gy dengan booster; L2, Limpa 175 Gy dengan booster; H3, Hati 175 Gy tanpa booster; dan L3, 175 Gy tanpa booster.

Hasil isolasi DNA dari sampel hati dan limpa kemudian diamplifikasi

menggunakan nested-PCR. Metode ini telah banyak digunakan pada penelitian

22

penyebab penyakit infeksi seperti Plasmodium (Sulistyaningsih 2007). Nested-

PCR adalah jenis PCR yang menggunakan dua kali proses PCR. Hasil PCR

nested-1 dicek menggunakan elektroforesis gel agaros 2%. Hasil amplifikasi pada

nested-1 mempunyai ukuran DNA target yang lebih besar dari nested-2 yaitu

sebesar 1640 bp (Michael 2005). Gen targetnya adalah 50S ribosomal protein L21.

Amplifikasi PCR menggunakan ekstrak DNA P. berghei sebagai kontrol positif.

Salah satu sumur pada gel agaros hanya diisi dengan mix PCR sebagai kontrol

negatif yang bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kontaminan selama proses

amplifikasi berlangsung. Elektroforegram hasil PCR nested-1 disajikan pada

Gambar 6.

(a)

(b)

Gambar 6 Elektroforegram nested-1 pada gel agarose 2%. M. Marker, H1. Hati 0Gy, L1. Limpa 0 Gy, H2. Hati 175 Gy dengan booster, L2. Limpa 175 Gy dengan booster, H3. Hati 175 Gy tanpa booster, L3. 175 Gy tanpa booster, (K+) kontrol positif, (K-) kontrol negatif.

Data hasil PCR nested-1(Gambar 6) diketahui bahwa tidak ada DNA yang muncul

dan terdeteksi pada gel agarose. Hal ini disebabkan karena terlalu

rendah/sedikitnya hasil DNA yang diamplifikasi. Ukuran DNA ini sangat besar

yakni 1640 bp (base pair).

23

Hasil amplifikasi DNA yang diperoleh dari nested-1 selanjutnya

diamplifikasi dengan PCR nested-2. PCR nested-2 digunakan untuk memfokuskan

wilayah amplifikasi pada nested-1. DNA target pada PCR nested-2 mempunyai

ukuran yang lebih kecil daripada nested-1 yaitu sebesar 240 bp (Singh et al.1999).

Gen targetnya adalah 50S ribosomal protein L21. PCR nested-1 dan nested-2

mempunyai gen target sama yaitu 50S ribosomal protein L21 karena nested-PCR

adalah PCR bersarang yaitu daerah produk PCR nested-2 berada di dalam produk

PCR nested-1. Produk PCR nested-1 merupakan daerah genus Plasmodium

sedangkan produk PCR nested-2 adalah daerah spesies spesifik. Elektroforegram

hasil PCR nested-2 menggunakan gel agaros 2% disajikan pada Gambar 7 & Tabel

4.

(a) (b)

(c)

Gambar 7 Elektroforegram nested-2 pada gel agaros 2%. M. Marker, (a) H1. Hati 0Gy, L1. Limpa 0 Gy , (b) H2. Hati 175 Gy dengan booster, L2. Limpa 175 Gy dengan booster, (c) H3. Hati 175 Gy tanpa booster, L3. 175 Gy tanpa booster, (K+) kontrol positif, (K-) kontrol negatif.

240 bp

240

240 bp

24

Tabel 4. Data elektroforegram hasil PCR nested-2

Organ yang diambil Kode Sampel

Ada/tidaknya pita DNA(240bp)

Ada/tidaknya P. berghei

Hati 0 Gy H1 Tidak -H1 Tidak -H1 Tidak -

Limpa 0 Gy L1 Tidak -L1 Tidak -L1 Tidak -

Kontrol positif K+ Ada +Kontrol negatif K- Tidak -Hati 175 Gy tanpa booster H2 Tidak -

H2 Tidak -H2 Tidak -

Limpa 175Gy tanpa booster L2 Tidak -L2 Tidak -L2 Tidak -

Kontrol positif K+ Ada +Kontrol negatif K- Tidak -Marker M AdaHati 175 Gy dengan booster H3 Tidak -

H3 Tidak -H3 Tidak -

Limpa 175 Gy dengan booster L3 Tidak -L3 Tidak -L3 Tidak -

Kontrol positif K+ Ada +Kontrol negatif K- Tidak -Keterangan:(+) = ada pendaran pita DNA ; (-) = tidak ada pendaran pita DNA

B. Pembahasan

1. Pemeriksaan DNA genom

DNA diperiksa menggunakan teknik elektroforesis yang akan

menunjukkan pita DNA pada gel dalam larutan penyangga. Migrasi pita DNA

pada pH netral bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. Pita DNA

berukuran besar berjalan lebih lambat dibanding DNA berukuran kecil. Hasil

ekstrak DNA yang didapatkan mempunyai ukuran DNA yang besar karena

merupakan DNA genom sampel hati dan limpa mencit. Ukuran DNA genom yang

didapatkan tidak diukur sehingga tidak diketahui besarnya ukuran genom hati dan

limpa mencit. Selain ukuran DNA, kecepatan migrasi DNA dipengaruhi oleh

25

konsentrasi agarose, voltase, ethidium bromide dan komposisi larutan bufer

(Muladno 2002).

Pemeriksaan ini dilakukan untuk mengetahui kualitas DNA yang telah

disimpan sebelum dilakukan proses PCR. DNA berkualitas baik ditunjukkan oleh

pita yang kompak dan tidak terdapat smear. Smear merupakan DNA yang

terpotong-potong dan berukuran kecil. Smear juga dapat disebabkan oleh

kemurnian DNA hasil isolasi yang rendah. Hasil pemeriksaan DNA dalam

penelitian ini menunjukkan bahwa sebagian besar sampel terdapat smear. Salah

satu sampel hati 0 Gy tidak terdapat DNA sehingga isolasi DNA pada sampel

tersebut diulang kembali (Gambar 5). Kualitas DNA akan mempengaruhi DNA

target yang diinginkan.

Kualitas koleksi DNA yang baik dapat disebabkan adanya beberapa faktor,

antara lain penyimpanan DNA menggunakan buffer dan pada suhu dibawah -20oC.

Penyimpanan ekstrak DNA biasanya menggunakan elution buffer. Penyimpanan

DNA dalam jangka waktu yang lama dapat mempengaruhi kualitas DNA.

Penyimpanan pada suhu dingin atau kondisi beku lebih efektif untuk

mempertahankan DNA, seperti dinyatakan oleh Zetzsche dan Gemeinholzer

(2009) bahwa penyimpanan suhu -20 oC lebih baik dibandingkan suhu -4 oC.

2. Amplifikasi P. berghei iradiasi pada hati dan limpa mencit tahap nested-1

Nested-PCR merupakan proses amplifikasi ganda menggunakan dua

pasang primer. Tahapan nested-PCR terdiri dari nested-1 dan nested-2. Nested-1

menggunakan primer rPLU1 dan rPLU5 sedangkan nested-2 menggunakan

pasangan primer rPLU3 dan rPLU4. Primer ini merupakan titik awal dimulainya

penggandaan DNA dalam proses PCR hingga didapatkan segmen DNA dengan

ukuran 1640 bp untuk nested-1 dan 240 bp untuk nested-2.

Hasil amplifikasi nested-1 menunjukkan bahwa tidak ada pita yang muncul

pada sampel setelah dielektroforesis. Pita hanya tampak pada marker sedangkan

pada sampel dan kontrol positif tidak terdapat pendaran pita DNA target. Hal ini

disebabkan komposisi mix PCR yang kurang tepat. Konsentrasi primer yang

26

terlalu tinggi menyebabkan kesalahan penempelan sekuens DNA sehingga hasil

amplifikasi tidak sesuai dengan yang diharapkan. Sebaliknya apabila konsentrasi

primer yang digunakan terlalu rendah akan menyebabkan hasil amplifikasi yang

didapatkan sangat sedikit (Muladno 2002).

Komposisi pre-mix PCR yang digunakan antara nested-1 dan nested-2

mempunyai perbandingan yang sama, sedangkan DNA target antara keduanya

berbeda. Nested-1 mempunyai DNA target sebesar 1640bp sedangkan nested-2

sebesar 240bp. Kurangnya komponen (pereaksi PCR, khususnya enzim Taq) untuk

menyusun fragmen DNA berukuran 1640 bp menyebabkan tidak munculnya pita

pada kontrol positif. Kontrol negatif menunjukkan bahwa hasil PCR tidak

diperoleh pita sehingga dapat dipastikan tidak terjadi kontaminasi.

3. Amplifikasi DNA P. berghei iradiasi pada hati dan limpa tahap nested-2

Meskipun pada nested-1 tidak menunjukkan hasil amplifikasi baik untuk

sampel maupun kontrol positif, tetapi belum tentu pada nested-2 tidak muncul

produk gen target. Amplifikasi nested-2 tetap dilanjutkan menggunakan hasil PCR

nested-1 sebagai DNA cetakan.

Analisa data nested-2 (Tabel 4) menunjukkan bahwa sampel hati maupun

limpa tidak ada yang mengandung P. berghei. Dosis 0 Gy menunjukkan bahwa

pada hati dan limpa mencit tersebut tidak mengandung P. berghei. Hal ini

dimungkinkan karena isolat yang diinfeksikan ke dalam tubuh mencit tidak

mengandung P. berghei. Tidak semua tubuh nyamuk yang dibiakkan dilakukan

pemeriksaan ada tidaknya P. berghei di dalam tubuhnya tetapi hanya sebagian

nyamuk saja yang diperiksa. Selain itu, tidak diketahui secara pasti jumlah P.

berghei iradiasi yang diinfeksikan ke dalam tubuh nyamuk karena penginfeksian

dalam bentuk isolat tubuh nyamuk.

Dosis iradiasi 175 Gy diharapkan sifat infektif parasit sudah melemah

sehingga tidak dapat menembus hati. Iradiasi sinar gamma pada parasit

menyebabkan kerusakan materi genetik parasit. Hal ini menyebabkan daya

infektifnya berkurang walaupun masih dapat melakukan proses biokimia atau

27

biologi lainnya, demikian juga dengan dosis 175 Gy booster. Booster bertujuan

untuk meningkatkan daya imun mencit sehingga imunitasnya lebih tinggi

daripada tanpa booster. Hasil PCR nested-2 dosis 175 Gy baik hati maupun limpa

ternyata sesuai dengan yang diharapkan.

Sirkulasi darah merupakan tempat pertama P. berghei masuk ke dalam

tubuh hospes yaitu dalam bentuk sporozoit. Sel-sel dari sistem imun innate adalah

pertahanan tubuh pertama yang melawan mikroorganisme. Setelah terjadi

fagositosis, antigen akan diproses dan muncul peptida major histocompability

complex( MHC) (Schmidt 2011). Sebagian sporozoit yang lolos akan menuju ke

organ hati. Sporozoit masuk ke dalam lumen sinusoidal searah atau melawan

aliran darah. Sporozoit ini dapat menyerang sel Kupffer. Sel Kupffer adalah

makrofag yang ada di dalam hati. Jika berhasil melewati sel Kupffer sporozoit

akan melewati ruang Disse untuk menginfeksi hepatosit. Iradiasi yang diberikan

membuat sporozoit lemah sehingga sulit untuk melawan sel Kupffer (Frevert et al.

2005).

Selain hati, limpa digunakan untuk identifikasi adanya infeksi Plasmodium.

Limpa berfungsi melawan antigen yang berada di darah. Limpa akan membuang

bahan partikel asing dan sel darah yang tua atau rusak. Sel darah yang terinfeksi

akan dihancurkan oleh sistem imun di limpa. Plasmodium mempunyai sistem

pertahanan untuk menghindari sistem imun limpa. Plasmodium yang lolos dari

sistem imun limpa menyebabkan oklusi pembuluh darah di dalam limpa sehingga

limpa akan membesar (Mohanty et al. 2005).

Meskipun nested-1 pada kontrol positif tidak muncul pita DNA tetapi

setelah dilanjutkan nested-2 terdapat produk amplifikasi dengan ukuran sebesar

240 bp. Tidak terdeteksinya DNA ini dapat disebabkan oleh tidak adanya DNA

parasit dalam sampel. Proses lisis sel secara mekanik kurang maksimal karena

penghancuran jaringan dengan cara dijepit menggunakan pinset. Kemungkinan

tersebut dapat terjadi karena sampel dalam penelitian ini berupa organ yaitu hati

dan limpa yang mempunyai jumlah parasit lebih sedikit dibandingkan dengan

sampel darah, sedangkan pada kontrol positif sebagai DNA pada parasit P.

28

berghei murni dan bukan di dalam organ. Singh et al. (1999) menyatakan bahwa

kemampuan PCR untuk mendeteksi tingkat parasitemia yang sedikit lebih dapat

dipercaya daripada secara mikroskopis.

Kemampuan infeksi parasit juga dipengaruhi oleh cara infeksinya.

Vaughan et al. (1999) menyatakan bahwa tingkat infeksi gigitan alami nyamuk

lebih besar daripada melalui inokulasi intravena. Penelitian ini menggunakan

infeksi intravena sehingga kemampuan infeksinya lebih rendah dibandingkan

secara alami. Darah perifer merupakan tempat pertama masuknya P. berghei ke

dalam tubuh manusia. Parasit yang masuk ke peredaran darah sebagian akan

difagositosis oleh sel neutrofil. Jumlah sel parasit yang berhasil lolos dari

peredaran darah lebih sedikit karena dipengaruhi oleh kemampuan infeksius

parasit tersebut serta reaksi individual terhadap infeksi P. berghei tidak sama. Ada

berbagai faktor ang mempengaruhi, seperti variasi genetik, metabolisme, dan

sistem imun masing-masing hospes (Miller et al. 2002). Parasit yang berhasil

lolos akan memasuki organ hati untuk melanjutkan siklus hidupnya.

DNA P. berghei tidak diiradiasi ditemukan di dalam limpa 5 jam setelah

infeksi, tetapi dalam waktu 25 jam intensitasnya berkurang karena parasit ini telah

dihancurkan oleh sel-sel makrofag limpa (Ferreira et al. 1986). Limpa merupakan

tempat berkumpulnya limfosit-limfosit aktif yang masuk ke dalam darah. Limpa

memberikan reaksi yang cepat terhadap antigen yang dibawa oleh APC (Antigen

Presenting Cell) dalam darah. Limpa berfungsi sebagai organ aktivasi sistem

imun adaptif oleh sebab itu limpa merupakan filter imunogenik dari sistem

sirkulasi( Iskandar et al. 2006).

Pembesaran limpa merupakan petunjuk adanya infeksi Plasmodium. Selain

itu infeksi menyebabkan perubahan warna hati dan limpa menjadi coklat

kehitaman karena parasit mengeluarkan pigmen hemozoin. Hemozoin merupakan

produk detoksifikasi parasit yang dilepaskan ke dalam peredaran darah ketika

eritrosit terinfeksi sudah matang. Hemozoin digunakan oleh parasit untuk

menghambat fungsi monosit dan tidak bisa berdiferensiasi menjadi sel dendritik

(Schmidt 2011).Sampel yang digunakan baik hati maupun limpa dalam penelitian

29

ini tidak mengalami pembesaran ataupun perubahan warna menjadi gelap tetapi

masih berwarna merah seperti hati dan limpa normal. Sampel hati dengan tanpa

radiasi seharusnya mengalami hapatomegali dan splenomegali karena

kemampuan infeksi parasit lebih tinggi dibandingkan dengan parasit yang

diiradiasi (Darlina & D Tetriana, 2008).

Setiap penghancuran sel darah merah yang mengandung merozoit akan

merangsang reaksi humoral dan seluler. Ini menyebabkan fagositosis

Plasmodium, sel yang diinfeksi, pigmen, dan sisa sel-sel histiosit bebas dan

makrofag dari sistem retikulo-endoteal khususnya limpa akan semakin membesar.

Penimbunan pigmen oleh parasit selama pertumbuhan di eritrosit memberi warna

kelabu pada organ hati dan ginjal (Brown 1979), sedangkan pada sampel tidak

menunjukkan adanya perubahan warna pada hati dan limpa. Hal ini disebabkan

karena adanya sistem imun yang dimediasi oleh sel T yang dipicu oleh pemberian

parasit iradiasi.

Sel T adalah sel di dalam salah satu grup sel darah putih yang diketahui

sebagai limfosit dan memainkan peran utama pada kekebalan selular. Sel T

mampu membedakan jenis patogen dengan kemampuan berevolusi sepanjang

waktu demi peningkatan kekebalan setiap kali tubuh terpapar patogen. Sel T yang

telah disintesis dari kelenjar timus disebut sel T CD4+, akan terbawa oleh

sirkulasi darah hingga masuk ke dalam limpa dan bermigrasi ke dalam jaringan

limfatik, kemudian bermigrasi kembali ke dalam sirkulasi darah, hingga suatu

saat terjadi terstimulasi oleh antigen tertentu (Janeway et al. 2001). Sel ini

menyerang sel tubuh yang terinfeksi dan sel pathogen yang relatif besar secara

langsung.

Penggunaan sinar gamma untuk iradiasi parasit digunakan untuk

melemahkan daya infektivitas P. berghei di dalam siklus hidupnya dalam tubuh

mamalia (Syaifudin et al. 2008; Tetriana 2007). Iradiasi sinar gamma akan

mengurangi kemampuan Plasmodium untuk melanjutkan siklus hidupnya. Tidak

terdeteksinya Plasmodium pada hati dan limpa ini dapat disebabkan sel limfosit T

yang berperan dalam respon imun tubuh terhadap infeksi malaria. Setelah injeksi

30

parasit pasca iradiasi gamma, Plasmodium akan mengalir bersama darah dan akan

difagositosis oleh neutrofil. Neutrofil dapat memfagosit dan mempunyai lisosom

yang mengandung asam hidroksilase dan peroksidase untuk membunuh

mikroorganisme (Eales 1999). Kemampuan infeksi yang sudah dilemahkan atau

jumlah parasit yang sedikit menyebabkan parasit tidak mampu masuk ke dalam

sel-sel hati. Pada tahap ini siklus hidupnya terhenti sehingga tidak bisa terdeteksi

pada hati dan limpa.

31

31

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

A. SimpulanBerdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa

P. berghei iradiasi tidak ditemukan pada hati dan limpa mencit (Mus musculus)

menggunakan metode nested-PCR. Hal ini berarti bahwa iradiasi gamma efektif

untuk menurunkan daya infektif P. berghei .

B. SaranPenelitian tentang uji daya infektivitas P. berghei iradiasi menggunakan

nested-PCR perlu dilengkapi dengan pemeriksaan P. berghei iradiasi di dalam

tubuh nyamuk dan pengukuran jumlah sporozoit iradiasi yang diinfeksikan ke

dalam tubuh mencit. Cara lisis sel perlu menggunakan cara yang lebih maksimal

seperti penggerusan. Selain itu juga perlu dilengkapi dengan pengamatan

mikroskopis organ, apus darah untuk memastikan bahwa di dalam peredaran

darah terdapat parasit iradiasi yang diinginkan dan pengamatan serum untuk

deteksi kerusakan hati seperti serum alanine aminoransferase.

32

DAFTAR PUSTAKA

Abeku TA. 2007. Response to malaria epidemic in Africa. Emergencing Infections Diseases 13(5): 681-686.

Abraham EG & M Jacobs – Lorena. 2004. Mosquito midgut barries to malaria parasite development. Insect Biochem Mol Biol 34 (7): 667-671.

Anonim.2011.Definition of Nested PCR. on line at http://www.pcrstation.com/nested-pcr/ [diakses tanggal 20 April 2012].

Arum IL, AP Purwanto, S Arfi, H Tetrawindu, M Octora, Mulyanto, K Surayah & Amanukarti. 2006. Uji diagnostik Plasmodium malaria menggunakan metode imunkromatografi diperbandingkan dengan pemeriksaan mikroskopis. Indonesian Journal of clinical Pathology and Medical Laboratory 12(3): 118-122.

Brown HW. 1979. Dasar Patologi Klinis. Penterjemah: Bintari Rukmono, Hoedojo, Nani S. Djakaria, Siti Doemilah Soeprihatin, Sri S. Margono, Sri Oemijati, Srisasi Ganda husada & Wita Pribadi. Jakarta: Gramedia.

Capurro M, de LJ Coleman, BT Beerntsen, KM Myles, KE Olson, E Rocha, AU Krettli & AA James. 2000. Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 62: 427-433.

Darlina & D Tetriana. 2008. Daya infeksi Plasmodium berghei stadium eritrositik yang diirradiasi sinar gamma . on line at: www.batan.go.id[ diakses tanggal 20 April 2012].

Djanah SN. 2007. Jumlah dan aktivitas proliferasi limfosit lien mencit swiss jantan yang diinfeksi Plasmodium berghei akibat pemberian 5 dan 100 mg/kgbb/hari ekstrak etanol Phyllantus niruri. Kes Mas 1(1): 1-50.

Eales L. 1999. Immunology for lifescientist. Newyork: John Wiley & sons.

Ferreira A, Enea V, Morimoto T & Nussenzweig V. 1986. Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites measured with a DNA probe. Mol Biochem Parasitol19(2): 103-109.

Frevert U, E Sabine, Z Sergine, S Jorg, Ng Bruce, M Kai , L Leonard & H Yee. 2005. Intravital observation of Plasmodium berghei infection of the liver. PLoS Biology 3(6): 1034-1046.

Gardner MJ, N Hall, E Fung, O White, M Berriman, RW Hyman, JM Carlton, A Pain , KE Nelson, S Bowman, IT Paulsen, K James, JA Eisen, K Rutherford, SL Salzberg, A Craig, S Kyes, MS Chan, V Nene, SJ Shallom, B Suh, J Peterson, S Angiuoli, M Pertea, J Allen, J Selengut, D Haft, MW Mather, AB Vaidya, DM Martin, AH Fairlamb, MJ Fraunholz, DS Roos, SA Ralph, GI McFadden, LM Cummings, GM Subramanian, C Mungall, JC Venter, DJ Carucci, SL Hoffman, C Newbold, RW Davis, CM Fraser & B Barrell. 2002. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Natur

33

e 419(6906):498-511.Garnham PCC. 1965. The structure of early sporogenic stages of Plasmodium berghei. Ann Soc belge Med trop 45(3): 259-266.

Ghosh A, P Srinivasan, EG Abraham, H Fujioka & M Jacobs-Lorena. 2003. Molecular strategies to study Plasmodium- mosquito interactions. Trends Parasitol 19 (2): 94-101.

Gunes G, N Yilmaz & A Ozturk. 2011. Effects of irradiation dose and O2 and CO2 concentrations in packages on foodborne pathogenic bacteria and quality ofready-to-cook seasoned ground beef product (meatball) during refrigerated storage. The ScientificWorld Journal 20(12): 1-7.

Hermanto S, I Sugoro & Akmalia. 2008. Profil protein Escherichia coli hasil inaktivasi iradiasi gamma sebagai bahan vaksin mastitis. Depok: ProsidingSeminar Nasional Biokimia UI.

Hoffman SL, LML Goh, TC Luke, I Schneider, TP Le, DL Doolan, J Sachi, P de la Vega, M Dowler, C Paul, DM Gordon, JA Stoute, LWP Church, M Sedegah, DG Heppener, WR Ballou & TL Richie. 2002. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum Sporozoites. J Infect Diseases 185(8): 1155-1164.

Hurd H & V Carter. 2004. The role of programed cell death in Plasmodium-mosquito interactions. Int J Parasitol 34 (13-14): 1459-1472.

Iqbal J, S Ali, R H Parsotam & R Al-Owaish. 1999. Comparison of the optimal test with PCR for diagnosis of malaria in immigrants. Journal of Clinical Microbiology 37(11): 3644-3646.

Iskandar T, DT Subekti & EF Diani. 2006. Gambaran splenosit, limpa, dan kekebalan pada mencit galur BALB/C yang diberi allantoin dan diinfeksi Toxoplasma gondii. Dalam: Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner, Balai Penelitian Veteriner. Bogor.

Janeway CA, Jr P Travers, M Walport & MJ Shlomchik. 2001. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition, New York: Garland Science.

Kanzo K SM & L Zheng. 2003. The mosquito genome-a turning point?. Trends Parasitol 19 (8): 329-331.

Kappe SHI, K Kaiser & K Matuschewski. 2003. The Plasmodium sporozoite journey: a rite of passage. TRENDS in Parassitology 19(3): 135-143.

Leids Universitair Medisch Centrum. The genome of P. berghei. On line at: https://www.lumc.nl/con[ diakses tanggal 25 Januari 2013].

Michael JCR. 2005. Plasmodium sp infection in ex-captive Bornean orangutans (Pongo pygmaeus) housed at the orangutans care center and quarantine, Padang Panjang, Kalimantan Tengah, Indonesia. (Thesis). Departement of Archaeology, Simon Fraser University.

Mikolajczak SA & SH Kappe. 2006. A clash to conquer: The malaria parasite liver infection. Mol Microbiol 62(6): 1499-1506.

34

Miller LH, DI Baruch, K Marsh & OK Duombo. 2002. The pathogenic basis of malaria. Nature (415): 673-667.

Mohanty S, DK Patel, SS Pati & SK Mishra. 2006. Adjuvant therapy in cerebral malaria. Indian J Med Res 124(3): 245.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.

Neumaier M, A Braun & C Wagener. 1998. Fundamentals of quality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics. Clinical Chemistry44(1):12-26.

Nikjoo H. 2003. Radiation track and DNA damage. Iran J Radiat Res 1(1): 3 – 16.

Nurhayati S, D Tetriana, Darlina, T Rahardjo & M Syaifudin. 2009. Pemeriksaan Mikroskopis Plasmodium sp Sebagai Penunjang Pengembangan Vaksin Malaria Iradiasi. Jakarta. On line at http://www.batan.go.id/ptkmr [diakses tanggal 20 Januari 2012].

Palm NW & R Medzhitov. 2009. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol (227): 221–233

Pooe OJ. 2011. The detection of Plasmodium falciparum in human saliva samples (Disertasi). South Africa: Zululand University.

Saiwichai T, M Maneepak, P Songprakhon, P Harnyuttanakorn & S nithiuthai. 2009. Species – specific nested PCR for detecting Plasmodium gallinaceum infresh chicken blood. Top Mad Parasitol 32:75-81.

Sanakkayala N, A Sokolovska, J Gulani, HH Esch, N Sriranganathan, SM Boyle, GG Schurig & R Vemulapalli. 2005. Induction of antigen-specific Th1-Type Immune Responses by gamma-irradiated recombinant Brucella abortus RB51. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12( 12): 1429-1436.

Sandoz.1973. Atlas of haematology. Switzerland: Sandoz.

Schmidt KE. 2011. Analysis of parasite-specific T cells and cellular interactions in the spleen during Plasmodium berghei induced experimental cerebral malaria. (Disertasi). Germany: University of Bonn.

Shahabuddin M. 1998. Plasmodium ookinete development in the mosquito midgut: A case of reciprocal manipulation . Parasitology 116: 83-93.

Shi Q, MM Lynch, M Romero & JM Burns. 2007. Enhanced protection against malaria by chimeric merozoite surface protein vaccine. Infection and Immunity 75(3): 1349-1358.

Sinden RE. 1999. Plasmodium differentiation in the mosquito. Parassitologia 41 (1-3): 139-148.

. 2002. Molecular interactions between plasmodium and its insect vectors. Cell Microbiol 4 (11): 713-724.

35

Singh B, Bobogare A, Cox-Singh J, Snounou J, Abdullah MS & Rahman HA. 1999. A Genus- and species-specific nested Polymerase Chain Reaction malaria detection assay for epidemologic studies. The Amer Soc Tropical Med & Hyg 60(4): 687-692.

Sulandari S & MSA Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bogor :Bidang Zoologi LIPI.

Sulistyaningsih E. 2007. Polymerase Chain Reaction(PCR): Era baru diagnosis dan managemen penyakit infeksi. Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Jember 1(1): 16-25.

Syaifudin M, S Nurhayati & D Tetriana. 2008. Pengembangan vaksin malaria dengan radiasi pengion. Makalah disampaikan pada Seminar Nasional Sains dan Teknologi- II. Universitas Lampung. Lampung 17-18 November 2008.

Syaifudin M, D Tetriana, Darlina & S Nurhayati. 2009. Respon imun sebagai faktor penting dalam pengembangan vaksin malaria dengan iradiasi. Dalam: Prosiding Seminar Nasional Keselamatan, Kesehatan dan Lingkungan V. Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi radiasi-Badan Tenaga Nuklir Nasional. Depok, 14 Oktober 2009.

Takeuchi O & S Akira. (2010) Pattern recognition receptors and inflammation. Cell(140): 805–820.

Tetriana D, Darlina, Armanu & M Syaifudin 2008. Pengaruh radiasi gamma terhadapprofil protein Plasmodium berghei stadium eritrositik. Dalam: Prosiding Seminar Nasional Keselamatan, Kesehatan dan Lingkungan IV. Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi radiasi-Badan Tenaga Nuklir Nasional dan Fakultas Kesehatan Masyarakat- Universitas Indonesia. Depok, 27 Agustus 2008. Hlm 282-291.

Vandenberg JP , Chews & MJ Stewat. 1990. Plasmodium sporozoite interactions with macrophages in vitro: a ideomicroscopic analysis. J Protozool 37 (6): 528-536.

Vaughan JA, LF Scheller, RA Wirtz & AF Azad. 1999. Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials. Infect & Immun 67(8): 4285-4289.

Wijayanti MA, S Noerhajati, Supargiyo & EF Loeki. 1997. Pengaruh imunisasi mencit dengan stadium eritrositik terhadap infeksi Plasmodium berghei. Berkala Ilmu Kedokteran 29(2): 53-59.

Zakeri S, TN Sohalia, Z Ahmad & DD Navid. 2002. Detection of malaria parasites by Nested – PCR in South-Eastern Iran: Evidence of Highly Mixed Infection in Chahbahar District. Malaria Journal 1:2.

Zetzsche H & B Gemeinholzer. 2009. Workshop Long-term storage of DNA material. Online at http://b.gemeinholzer@bgbm.org. [diakses tanggal 30 Juni2011].

36

37

Lampiran 1. Alat Penelitian

Beberapa alat yang digunakan dalam penelitian disajikan dalam tabel berikut :

No Nama Alat Gambar

1 Neraca Ohaus®

2 Dry bath Aoseng

3 Horizontal elektroforesis

Mupid ®-eXu

4 microcentrifuge survall

Legend MICRO 17 R

38

5 GeldocTM XR+ with Image

LabTM software

6 GeneAmp® PCR System

9700 Applied Biosystem

Lampiran 2. Dokumentasi penelitian

1 2 3

4 5 6

7 8 9

Keterangan: 1) Sampel hati dan limpa, 2) proses vortex, 3) proses inkubasi menggunakan drybath, 4) sampel hasil isolasi, 5) proses pembuatan gel agaros, 6) proses pemasukan sampel ke dalam sumur, 7) proses elektroforesis, 8) shaking gel agaros menggunakan Ethidium Bromide sebagai pengkelat, 9) Visualisasi menggunakan gel doc dilengkapi seperangkat komputer dan software.

39

40

41