Uji Mutagen

Embed Size (px)

DESCRIPTION

uji mutagen

Citation preview

UJI MUTAGEN(AMES TEST)Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy ITBPendahuluan

Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawakarsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV, polutan industri, pestisida, food additives dan produktobacco

Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin harisemakin banyak digunakan, menjadi perhatian utamapeneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadapkemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkanoleh senyawa tersebut.

Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker karenamereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan mutasi, yang dapat mengubah susunan DNAMUTAGEN

Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapatmeningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi (perubahan) dapat mempengaruhireproduksi sel, bahkan kadangkala menyebabkankerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidakterkendali

Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawakimia mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll.

Mutagenesis adalah proses pembentukan mutasiBeda MUTAGEN dan KARSINOGENKarsinogenmenyebabkan KANKERMutagenmenyebabkan MUTASI, tidak selalu menyebabkanKANKERKlasifikasi senyawa karsinogen menurutaktivitasnya dalam tahapan karsinogenesis

Initiating agent (incomplete carcinogen) : Senyawa kimia yang hanya menginisiasi sel

Promoting agent : senyawa yang menyebabkan ekspansi sel yang terinisiasi

Progressor agent : senyawa yang dapatmengubah sel yang terinisiasi atau sel yang ada dalam tahap promosi menjadi sel yang berpotensi menjadi sel kanker

Karsinogen lengkap (complete carcinogen) : senyawa yang mampu menginduksi kankerdari sel normal, biasanya memiliki sifatinisiasi, promosi dan progessorEpidemiologi karsinogenesis

epidemiologi adalah studi tentangdistribusi dan determinan penyakitmelalui observasi terhadap eksperimenyang terkontrol.

Observasi atau pengamatan termasuk :

pengamatan episodik

pengamatan retrospektif

pengamatan prospektifHubungan faktor karsinogenik dengan kanker yang terjadi Penyebab senyawakarsinogenKemungkinan kanker yang dapat terjadiBukti karsinogenitasMinuman beralkoholEsophagus, hati, orofaring, laring CukupaflatoksinHaticukupMakanan (lemak, protein, kalori) Payudara, kolon, endometrium, kemih cukupmerokokMulut, faring, laring, paru-paru, esophagus, kemihcukupSenyawa pengalkilKemih, leukemiacukupSenyawa arsenKulit, haticukupKloramfenikolleukemiaterbatasEstrogen premonopauseSel haticukupEstrogen postmonopauseEndometriumTerbatasPenyebab kematian karena kanker

Makanan : 35%

Rokok : 30%

Infeksi : 10%

Perilaku seksual : 7%

Pekerjaan : 4%

Faktor geofisik : 3%

Alkohol : 3%

Polusi : 2%

Produk industri < 1%

Zat penambah makanan < 1%Uji senyawa karsinogen

Uji jangka pendek(short-term test) : dikembangkan untuk mengidentifikasi senyawakarsinogenik yang berpotensi atas dasarkapasitasnya untuk menginduksi mutasi padaDNA di dalam sel secara in-vitro atau in-vivo. Contoh test : Ames test. Pada Ames test, digunakan mikrobaSalmonella typhimurium. Selain ujimutasi bakteri, ada pula uji mutasi selmamalia secara in-vitro, uji mutasi gen secarain-vivo menggunakan mencit, uji kerusakanDNA secara in-vitro.

Uji jangka menengah: uji kronis 1 tahun : Ujimenggunakan 50 ekor tikus

Uji jangka panjang: uji kronis 2 tahun : Multi stage models pada perkembangan neoplastiAMES Test Ames test adalah uji untuk menentukan apakahsuatu senyawa adalah mutagen. Nama test inidiambil dari nama penemunya yaituBruce Ames. Bruce Ames dkk pada tahun 1970an menemukansuatu metode uji dengan menggunakan bakterikhusus yang sangat sensitif terhadap senyawa2 mutagen Penggunaan Ames test adalah berdasarkanasumsi bahwa setiap senyawa yang bersifatmutagenik terhadap bakteri yang digunakan, dapat berubah menjadi karsinogen yang dapatmenyebabkan kanker The Food and Drug Administration (FDA) USA saat ini menggunakan metode ygdikembangkan Ames untuk menapissenyawa2 kimia secara cepat dan murah Walaupun demikian, pada kenyataannya, beberapa senyawa yang menyebabkankanker pada hewan percobaan (misalnyadioksin) tidak menunjukkan positif padaAmes test (atau kebalikannya)Ames test sangat murah dan mudah, sehingga banyak yang beranggapanbahwa test ini tidaklah validBakteri yang digunakan : GalurmutanSalmonella typhimuriumMengapa menggunakan galur mutan?

Biakan induk (Wild-type) dariSalmonella typhimuriumdapat tumbuh dalam media tanpapenambahan asam amino. Hal ini dimungkinkankarena mereka membuat asam amino merekasendiri dengan jalur biosintesis yang berbeda2

Pada mutanSalmonella typhimurium, tidakdapat tumbuh tanpa asam amino histidin karenamutasi ditujukan pada gen yang mengkode salahsatu dari 9 enzim yang digunakan pada jalurbiosintesis histidin. Oleh karena itu, mutan Ames hanya akantumbuh bila ada histidin di dalam medium pertumbuhan karena mutan tersebut tidakdapat mensintesis sendiri histidin tersebut. Mutan ini adalah mutan auxotroph yang disebut mutanhistidine-dependentor his -(baca : hiss-minus)

Mutan auxotroph yang berinteraksidengan senyawa sample , berubahmenjadi prototroph

Mutan prototroph dapat tumbuh baikdalam media tanpa histidinContoh Ames test untuk uji kualitatif

Suatu suspensi biakanSalmonella typhimuriumgalur histidine-requiring (his) ditumbuhkandalam pelat agar yang mengandung campuran rat liver enzymes yang tidak mengandunghistidin

Sebuah filter paper di impregnasidengan 10g 2-aminofluorene, suatu karsinogen. Efek mutageniksenyawa ini dapat menyebabkanbakteri tersebut memperolehkembali kemampuannya untuktumbuh walaupun di dalam media tidak ada histidinnya. Hal inimenyebabkan tumbuhnya kolonibakteri disekitar disk filter paper. Mengapa medium untuk Ames test ditambahkan ekstrak hati (liver extract)?

Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen atau karsinogen, tetapi dapat berubah menjadimutagen atau karsinogen setelah dimetabolismedi dalam tubuh (hati)

Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, sedangkanmanusia adalah eukaryot, oleh karena itu perluditambahkan campuran enzim2 hati organismeeukaryot (dalam hal ini hati tikus)Bagaimana menghitung hasilAmes test ?

Jumlah koloni bakteri yang tumbuhmerupakanukuranaktivitasmutagenik(potensi) dari senyawa yang digunakan

Angka ini biasanya merepresentasikanjumlah revertants (bakteri yang termutasi) per mikrogram of mutagen atau per gram sampel yang mengandungmutagenKoreksi terhadap hasil Ames test

Pada umumnya mutasi spontan terjadi pada awalpembiakan bakteri dalam medium yang tidakmengandung histidin

Hal ini perlu diperhitungkan sebelum mengujisenyawa kimia yang dianalisis.

Pada awal pengujian ditumbuhkan 108 selbakteri, maka setelah beberapa waktu dihitungjumlah bakteri yang tumbuh, dan angka inidigunakan untuk pengurangan jumlah bakteriyang memang termutasi oleh senyawa kimia.

Dengan cawan petri terpisah, baru dilakukan ujimutagen dengan menggunakan senyawa kimiayang diuji di dalam media yang ditambahkancampuran enzim hati tikus