ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜİmmobilizasyon yöntemleri çeşitli şekillerde sınıflandırılmakla beraber Şekil 1.1’de verildiği gibi sınıflandırmak

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Fadile YENER

PEKTİNAZ ENZİMİNİN FARKLI İKİ DESTEK ÜZERİNE İMMOBİLİZASYONU VE KARAKTERİZASYONU

KİMYA ANABİLİM DALI

ADANA, 2007

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ


Fadile YENER



Bu tez ..../...../2007Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir.

İmza............……… İmza...................…. ….. İmza.................…………. Doç..Dr.Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof.Dr.S.Seyhan TÜKEL Prof.Dr.Nuray ŞAHAN DANIŞMAN ÜYE ÜYE

Bu tez Enstitümüz Kimya Anabilim Dalında hazırlanmıştır.

Kod No: Prof. Dr Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü

Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar ve Projeler (BAP) Birimi tarafından Desteklenmiştir.

Proje No: FEF.2006.YL.70

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

I

ÖZ


Fadile YENER

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ


Danışman : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ

Yıl : 2007 Sayfa: 47 Jüri : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof. Dr. S.Seyhan TÜKEL Prof. Dr. Nuray ŞAHAN Pektinaz enzimi alginat ve florisil üzerine immobilize edilmiştir. Belirlenen

optimum koşullarda serbest ve alginat üzerine immobilize edilen Pektinaz için

maksimum aktivite sırasıyla 69,4 ve 20,7 U/mg protein olarak ölçülmüştür. Km

değerleri sırasıyla 8,04 ve 0,36 mg/ml olarak belirlenmiştir. İmmobilize Pektinaz’ın

tekrar kullanılabilirliği kesikli reaktör modelinde araştırılmış ve 20 kullanımdan

sonra immobilize Pektinaz’ın başlangıç aktivitesinin % 94’ünü koruduğu

belirlenmiştir. Serbest ve immobilize Pektinaz’ın farklı sıcaklıklarda belirlenen

termal kararlılıkları karşılaştırılmıştır. Serbest Pektinaz’ın 5oC ve 25oC’de 5 hafta

depolanma süresi sonunda kalan aktivitesi sırasıyla başlangıç aktivitesinin % 57 ve

% 64’üdür. Bununla birlikte immobilize enzim 5oC ve 25oC’de 5 hafta depolanma

süresi sonunda sırasıyla başlangıç aktivitesinin % 75 ve % 76’sını korumuştur.

Florisil destek üzerine yapılan immobilizasyonda, denenen koşullarda enzimin

desteğe bağlandığı, bağlandıktan sonra aktivite göstermediği gözlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: Pektik enzimler, exopoligalakturonaz, alginat, immobilizasyon, florisil.


II

ABSTRACT

MSc THESIS

Fadile YENER

DEPARTMENT OF CHEMISTRY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Year : 2007 Pages: 47 Jury :Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof. Dr. S.Seyhan TÜKEL Prof. Dr. Nuray ŞAHAN

Pectinase enzyme was immobilized onto alginate and florisil. Maximum

activity of free pectinase and immobilized pectinase onto alginate were measured as

69,4 and 20,7 U/mg protein respectively, at predetermined optimum conditions. The

KM values for free and immobilized pectinase were determined as 8,04 and 0,36

mg/ml,respectively. Reusability of the immobilized pectinase was investigated in a

batch type reactor. After 20 reuses, the residual activity of immobilized pectinase

was about % 94 of its initial activity. Thermal stabilities of free and immobilized

pectinase determined at different temperatures were compared. The residual activity

for immobilized pectinase stored at 5oC and 25oC for five weeks were 57 % and 64

% of its initial activity, respectively. However, the immobilized enzyme protected 75

% and 76 % of its original activity at 5oC and 25oC, respectively for five weeks. In

the immobilization onto the florisil support, it was observed that the enzyme was

bound to the support however, no activity was observed.

Keywords: Pectic enzymes, exopolygalacturonase, alginate, immobilization,

florisil.

IMMOBILIZATION OF PECTINASE ONTO TWO DIFFERENT SUPPORTS AND THEIR CHARACTERIZATION

III

TEŞEKKÜR

Yüksek Lisans Tezinin yönetiminde ve oluşumunda aynı zamanda tez

çalışmam süresince her türlü desteğini gördüğüm, sabır ve anlayışından dolayı

değerli Danışmanım Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ’e,

Çalışmalarımda benden yardım ve desteklerini esirgemeyen hocalarım Prof.

Dr. S.Seyhan TÜKEL’e ve Yrd. Doç. Dr. Ramazan BİLGİN’e,

Çalışmalarım süresince her türlü yardım ve manevi desteklerini gördüğüm

Özlem ALPTEKİN, Dilek ALAGÖZ, Deniz YILDIRIM, Özlem YILDIRIM’a ve

aynı laboratuarı paylaştığım arkadaşlarıma,

Şu an çalışmakta olduğum Adli Tıp Anabilim Dalında bana her türlü yardım

ve desteği gösteren Nebile DAĞLIOĞLU ve Dilek AKÜNAL’a,

Karşılaştığım her zorlukta hep yanımda olan, varlığıyla bu sürecin

kolaylaşmasını sağlayan, çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen, hayatımı

paylaşmaya karar verdiğim Ümit YALDIZ’a,

Benden maddi, manevi desteklerini esirgemeyen, beni büyük bir ilgi ve

sevgiyle bugünlere getiren babam Abdullah YENER, annem Nursel YENER’e ve

hayatımı anlamlı hale getiren kardeşlerime teşekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ…………………………………………………………………………………..I

ABSTRACT………………………………………………………………………..II

TEŞEKKÜR……………………………………………………………………….III

İÇİNDEKİLER……………………………………………………………………IV

ÇİZELGELER DİZİNİ …………..………………………………………………VI

ŞEKİLLER DİZİNİ…..…………………………………………………………..VII

SİMGELER VE KISALTMALAR ..…………………………………………...VIII

1.GİRİŞ……………………………………………………………………………...1 1.1. Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri…………………………………………...3

1.1.1.Çözünmez Formda İmmobilizasyon Yöntemleri………………………...3

1.1.1.1. Bağlama………………………………………………………...4

1.1.1.2. Tutuklama………………………………………………………5

1.1.2. Çözünür Formda İmmobilizasyon………………………………………7

1.1.3. İmmobilize Edilen Enzimden Beklenilen Özellikler................................7

1.2. Pektin (Pektik bileşikler)....................................................................................8

1.2.1. Pektinin Endüstriyel Önemi...................................................................13

1.3. PektolitikEnzimler….....………………………………………...................... 13

1.3.1. Pektolitik Enzimlerin Genel Özellikleri.................................................13

1.3.2. Endüstride Pektolitik Enzimlerin Kullanılması .....................................16

1.4. Alginat…………………………………………………………...................... 17

1.5. Florisil...............................................................................................................18

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR……………………………………………………… 19

3.MATERYAL VE METOD……………………………………………………....22

3.1. Materyal……………………………………………………………………..22

3.2. Metod…..........................................................................................................22

3.2.1. Protein Tayini.........................................................................................22

3.2.2. Pektinaz’ın Alginat Destek Üzerine İmmobilizasyonu..........................23

3.2.3. Pektinaz’ın Florisil Destek Üzerine İmmobilizasyonu..........................23

V

3.2.4. Serbest veya İmmobilize Pektinaz’ın Aktivitesinin Belirlenmesi.........24

3.2.5. Galakturonik Asit Tayini.......................................................................25

3.2.6. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Karakterizasyonu............................26

3.2.6.1. Serbest ve immobilize Enzimlerin Optimum pH’larının

Belirlenmesi..............................................................................26

3.2.6.2. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Optimum Tampon

Derişimlerinin Belirlenmesi.....................................................26

3.2.6.3. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Optimum Sıcaklıklarının

Belirlenmesi..............................................................................26

3.2.6.4. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin KM ve Vmax Değerlerinin

Belirlenmesi..............................................................................27

3.2.6.5. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Termal Kararlılıklarının

Belirlenmesi..............................................................................27

3.2.6.6. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Depolama

Kararlılıklarının Belirlenmesi...................................................27

3.2.6.7. İmmobilize Pektinaz’ın Tekrar Kullanım Kararlılığının

Belirlenmesi..............................................................................27

4.BULGULAR VE TARTIŞMA……………………………………………..........28

4.1.Bulgular.................................................................................................................28

4.1.1. Serbest ve İmmobilize Pektinaz’ın Karakterizasyonu.............................28

4.1.2. Pektinaz’ın Florisile İmmobilizasyonu....................................................36

4.2. Tartışma...............................................................................................................37

4.2.1.Pektinaz’ın Alginat Destek Üzerine İmmobilizasyonu ve

Karakterizasyonu......................................................................................37

4.2.2. Pektinaz’ın Florisil Destek Üzerine İmmobilizasyonu ..........................40

5.SONUÇLAR VE ÖNERİLER..............................................................................41

5.1.Sonuçlar............................................................................................................41

5.2. Öneriler............................................................................................................42

KAYNAKLAR..........................................................................................................44

ÖZGEÇMİŞ................................................................................................................47

VI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA

Çizelge 1.1. Meyve pektin içeriği.............................................................................8

Çizelge 1.2. Pektik bileşikler ve özellikleri.............................................................10

Çizelge 1.3. Pektik enzimlerin sınıflandırılması.....................................................14

Çizelge 4.1. Serbest ve immobilize Pektinaz’ın kinetik parametreleri...................32

Çizelge 4.2. Pektinaz’ın florisile immobilizasyonu................................................36

VII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Enzim immobilizasyon yöntemleri……………………………....... 3

Şekil 1.2. Enzimin polimerler arasında tutuklanması………...…………....... 6

Şekil 1.3. Düşük ve yüksek esterleşme dereceli pektin…………………....... 9

Şekil 1.4. Pektin molekülünde düz ve saçaklı bölgeleri gösteren model......... 11

Şekil 1.5. Pektin molekülü............................................................................... 12

Şekil 1.6. Poligalakturonaz enziminin etki mekanizması................................ 15

Şekil 1.7. Pektat-liyaz enziminin etki mekanizması........................................ 15

Şekil 1.8. Pektin-liyaz enziminin etki mekanizması........................................ 16

Şekil 1.9. Pektinesteraz enzimin etki mekanizması......................................... 16

Şekil 4.1. Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin pH’ya bağlı olarak

değişimi…………………………………………………………... 28

Şekil 4.2. Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin tampon derişimine

bağlı olarak değişimi……………………………………..……… 29

Şekil 4.3. Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin sıcaklığa bağlı

olarak değişimi……………………………………….………….. 30

Şekil 4.4. Serbest Pektinaz’ın Arrhenius grafiği…………………………… 30

Şekil 4.5. İmmobilize Pektinaz’ın Arrhenius grafiği……………………… 31

Şekil 4.6. Serbest Pektinaz için Lineweaver-burk grafiği…………………... 31

Şekil 4.7. İmmobilize Pektinaz için Lineweaver-burk grafiği……………… 32

Şekil 4.8. Serbest Pektinaz enziminin termal kararlılık grafiği…………….. 33

Şekil 4.9. İmmobilize Pektinaz enziminin termal kararlılık grafiği……….... 34

Şekil 4.10. Serbest Pektinaz enziminin depolama kararlılığı………………… 34

Şekil 4.11. İmmobilize Pektinaz enziminin depolama kararlılığı……………. 35

Şekil 4.12. İmmobilize Pektinaz’ın tekrar kullanım kararlılığı………………... 36

VIII

SİMGELER ve KISALTMALAR KM : Michaelis-Menten hız sabiti (mg/ml) Vmax : Maksimum hız (µmol.dk-1.mg protein-1) Ea : Aktivasyon enerjisi (J mol-1) Vmax / KM : Katalitik etkinlik U : Ünite V : Tepkime hız sabiti (µmol.dk-1.mg protein-1) [S] : Subsrat derişimi DNSA : Dinitrosalisilik asit

1.GİRİŞ Fadile YENER

1

1.GİRİŞ

Enzimler, canlı hücrelerde oluşan ve organizmadaki tüm reaksiyonların çok

yumuşak koşullarda gerçekleşmesini sağlayan ve bunları regüle eden biyolojik

katalizatörlerdir. Enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar katalizlenmemiş karşıtlarına

göre 107-1016 kez daha hızlı gerçekleşirler. Enzimler son derece özgün olup

birbirinin aşağı yukarı aynısı olan enantiomerleri bile ayırt edebilirler.

Enzimlerin kimyasal katalizörlere göre üstünlüklerini incelediğimizde;

enzimler ileri derecede substrat spesifikliğine sahip olmaları nedeniyle, istenmeyen

yan ürünlerin oluşumunu engeller. Enzimlerin katalizlediği reaksiyonlarda verim %

100’dür. Stereospesifik reaksiyonları enzimler katalizleyebilirler. Enzimler ılımlı

koşullarda ( pH 7.0, oda sıcaklığı) çalıştığı için reaksiyon maliyetini düşürürler ve

çevresel sorunlar yaratmazlar. Yeterli koşulların sağlanması koşuluyla etkilerini

doğal ortamlarının dışında da gösterebiliyor olmaları, enzimlerden pek çok alanda

yararlanabilme imkanı vermektedir. Enzimlerden başlıca endüstriyel, tıbbi, bilimsel

ve analitik amaçlı olmak üzere üç farklı alanda yararlanılmaktadır. Her bir alanda

kullanılan enzimlerin fiyatları beklenen özelliklerine göre birkaç dolardan birkaç

bin dolara kadar değişebilmektedir.

Enzimler canlılar tarafından üretildiklerinden endüstriyel veya analitik amaçlı

kullanımları için doku, kan, mikroorganizma gibi canlı veya canlı kökenli

kaynaklardan saflaştırılırlar. Enzim üretiminde hammadde olarak canlıların kullanımı

ekonomik açıdan sınırlayıcı bir durum olsa da bu sorun mikrobiyal kaynaklar

sayesinde büyük ölçüde çözülmüş görünmektedir. Bununla birlikte enzimlerin

mikrobiyal kaynaklardan saflaştırılması oldukça masraflı bir iştir. Endüstriyel

uygulamalarda serbest enzimin aktivitesini kaybetmeden geri kazanılması çok

zordur. Serbest enzim, reaksiyon ortamından istenilen anda uzaklaştırılamadığından

reaksiyonun kontrolü çok güçtür. Reaksiyonun istenilen anda durdurulması için

inhibitör katılması düşünülebilir. Ancak serbest enzim tarafından kirletilmiş olan

reaksiyon ürünlerine böylece yeni bir kirlilik unsuru eklenmiş olacaktır. Ürün veya

ürünlerin bu kirlilik unsurlarından arıtılması maliyeti çok arttırmaktadır. Katalizör

olarak kullanılan serbest enzimi reaksiyon ortamından aktivitesini yitirmeden


2

çıkarabilmek olanaksız olduğundan enzimin yeniden kullanılması da söz konusu

değildir. Bu ise enzimlerin spesifik ama o ölçüde pahalı katalizör olmaları nedeniyle

maliyeti yükselten önemli bir etmendir. Ayrıca serbest enzimler sürekli üretim

sistemlerine de uygulanamazlar. Bu nedenle saflaştırılan enzimlerden olabildiğince

faydalanmak için immobilizasyon teknikleri geliştirilmiştir.

Enzimler, suda çözünmeyen bir taşıtıcıya fiziksel veya kimyasal olarak

bağlanarak, suda çözünmeyen ürün veren bir kopolimerizasyona enzim

molekülünün monomer olarak katılmasıyla ve suda çözünmeyen mikrokapsüllerde

tutuklamakla immobilize edilirler (Telefoncu, 1997).

İmmobilize enzimin serbest enzime göre üstünlükleri;

Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifüjleme

v.b.) ve ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem yaratmaz.

Çevre koşullarına ( pH, sıcaklık v.s.) karşı daha dayanıklıdır.

Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir.

Sürekli işlemlere uygulanabilir.

Doğal enzime kıyasla daha kararlıdır.

Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir.

Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur.

Bazı durumlarda serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir.

Enzimin kendi kendini parçalama olasılığı azalır.


3

1.1.Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri

İmmobilizasyon yöntemleri çeşitli şekillerde sınıflandırılmakla beraber Şekil

1.1’de verildiği gibi sınıflandırmak mümkündür (Telefoncu, 1997).

Şekil 1.1. Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri (Telefoncu, 1997).

1.1.1. Çözünmez Formda İmmobilizasyon Yöntemleri

Çözünmez formda immobilizasyon yöntemleri bağlama ve tutuklama olarak

ikiye ayrılmaktadır.


4

1.1.1.1.Bağlama

Bağlama yöntemi; çapraz bağlama, enzim kopolimerizasyonu ve taşıyıcıya

bağlama olmak üzere üç gruba ayrılmaktadır.

Çapraz bağlama; Küçük moleküllü iki veya çoklu fonksiyonel grupları olan

reaktifler enzim molekülleri arasında çapraz bağlar yapmaktadırlar. En çok

kullanılan çapraz bağlama reaktifleri; glutaraldehit, klorformat ve karbonilimidazol,

heterosiklik halojenürler, bioksiranlar, divinilsülfonlar, p-benzokinon, geçiş metal

iyonları ve epiklorohidrinlerdir.

Enzim kopolimerizasyonu; Enzimler bir kopolimerizasyon reaksiyonunda

monomerlerden biri gibi davranarak matrikse bağlanmaktadır. Yöntem polimer

matrikse tutuklanmaya benzemekle birlikte enzim kaçışının önlenmesi gibi üstünlüğü

vardır.

Taşıyıcıya bağlama; Adsorpsiyon, iyonik bağlama, şelat bağlama, kovalent

bağlama ve biyospesifik bağlama olarak beş gruba ayrılmaktadır. Bir protein olan

enzim molekülünün yapısından yararlanılır. Molekül yüzeyindeki fonksiyonel

gruplar, iyonik gruplar ve hidrofobik bölgeler bu bağlamada rol alırlar. Enzim

immobilizasyonunda doğal veya sentetik birçok organik ve inorganik materyal

kullanılmaktadır. Taşıyıcı membran, suda çözünmeyen katı veya polimer olabilir.

Enzim immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcıda aranan nitelikler şunlardır:

Hidrofilik karakter,

Suda çözünmeme,

Gözenekli yapı,

Mekanik stabilite uygun partikül formu,

Kimyasal ve termal stabilite,

Kovalent bağlamada kullanılacak taşıyıcıların yumuşak koşullarda

reaksiyon verebilen fonksiyonel grupları taşıması,


5

Mikroorganizmalara karşı dirençlilik,

Ucuzluk,

Zehirsizlik,

Rejenere olabilme.

Enzim immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcılar reaktif değillerse

yardımcı bir reaktif ile aktifleştirilmesi gerekir. İmmobilizasyon çok yumuşak

koşullarda (oda sıcaklığı, nötral pH vb.) gerçekleştirilmelidir.

Taşıyıcı suda çözünmemeli ancak büyük ölçüde hidrofobik karakterli de

olmamalı, suda ıslanabilmeli, ayrıca mekanik kararlı olmalıdır. Bu tür taşıyıcıların

seçiminde enzim-taşıyıcı bağının aktivite için zorunlu gruplar üzerinden olmaması

yanında taşıyıcının enzim tarafından parçalanmaması, mikroorganizma üremesine

olanak vermemesi, pH ve çözücülere karşı dayanıklı olması gibi özellikler taşımasına

dikkat edilmelidir..

1.1.1.2. Tutuklama Yöntemleri

Tutuklama yönteminde, enzim molekülü belirli bir mekanda durmaya

zorlanmaktadır. Enzim bulunduğu çevreden dışarıya çıkamaz. Bu işlem polimer

matriks içindeki kafeslerde gerçekleştirilebileceği gibi yarı geçirgen membranlar

içinde mikrokapsülleme ve miseller ile de gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi, kovalent

bağlama ve çapraz bağlama ile immobilizasyondan ayıran en önemli özellik enzim

molekülünün fiziksel veya kimyasal olarak herhangi bir taşıyıcıya bağlanmamış

olmasıdır. Tutuklama yöntemi; polimer matrikste tutuklama, mikrokapsülleme,

lipozom tekniği olmak üzere üçe ayrılır.

Polimer matrikste tutuklama yöntemi, yüksek derecede çapraz bağlı bir

polimerin enzim çözeltisi içinde oluşturulması temeline dayanır (Şekil 1.2).

Polimerleşme sonucu enzim molekülleri çapraz bağ ağları arasında tutuklanmakta ve

böylece ana çözeltiye geçmeleri engellenmektedir. Bu amaçla en çok kullanılan

polimer N,N’-metilenbisakrilamid ile çapraz bağlanmış poliakrilamiddir.


6

Şekil 1.2. Enzimin polimerler arasında tutuklanması

Mikrokapsülleme yöntemi, enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran

içinde tutuklanması esasına dayanır. Mikrokapsüllerin büyüklüğü 1-100 µ arasında

değişmektedir. Yarıgeçirgen membranın gözenek çapları; substrat moleküllerinin

kapsül içine girişine ve ürün moleküllerinin dışarı çıkışına olanak verecek bir

büyüklükte olmalıdır. Substrat molekülleri ne kadar küçükse bu yöntem ile

immobilize edilmiş enzimin verimliliği o ölçüde yüksek olacaktır.

Lipozom tekniği, sıvı-yüzey yapıcı membran temeline dayanır. Yöntemin en

önemli üstünlüğü; süreksiz, dönüşümlü ve tamamen fiziksel oluşudur. Aynı anda bir

adımda birçok enzimin immobilizasyonuna olanak sağlar ve oldukça büyük bir

kontakt yüzeyine sahiptir. Önemli sakıncaları ise; substrat ve ürünün membranda

geçişinin çözünürlüğe bağımlı olması, işlem sırasında enzimin inaktive olması ve sıvı

olan membrandan enzimin kaçma olasılığıdır.


7

1.1.2. Çözünür Formda İmmobilizasyon

Çözünür formda immobilizasyon yöntemi enzimin herhangi bir taşıyıcıyla

fiziksel veya kimyasal etkileşiminden çok yarı geçirgen bir zarla çevrelendiği ve

enzime geniş bir hareket alanının sağlandığı bir yöntemdir. Enzim taşıyıcıya

herhangi bir bölgesinden bağlanmadığı için moleküler geometrisi, esnekliği ve

dolayısıyla katalitik etkinliği değişmemektedir. Fakat substratın membrandan geçip

enzime ulaşmasında kısıtlamalara rastlanmaktadır. Bu nedenle küçük moleküllü

substrata sahip olan enzimlerin bu yöntemle immobilize edilmesi tercih edilebilir.

1.1.3. İmmobilize Edilen Enzimden Beklenilen Özellikler

Kullanılan immobilizasyon tekniği ne olursa olsun immobilize edilen

enzimden beklenilen özellikler şunlardır:

Yüksek kararlılık

Tekrar kullanılabilirlik

Sürekli üretime olanak vermesi

Reaksiyon kontrolüne olanak vermesi

Yüksek saflık

Yüksek ürün yüzdesi

Ekonomik olması


8

1.2.Pektin (Pektik Bileşikler)

Meyve ve sebzelerin teknolojik açıdan en önemli polisakkaritleri pektindir.Bu

ürünlerde pektin miktarı % 0.5-% 1.0 düzeyindedir. Metilasyon derecesi, moleküler

ağırlık ve pektin içeriği meyve çeşidine göre farklılık gösterir (Çizelge 1.1).

Çizelge 1.1. Meyve pektin içeriği (Aehle, W., 2004)

Meyve Pektin, % Metilasyon, %

Elma 0.5-1.6 80-92

Kuşüzümü 1.0-1.2 50-80

Üzüm 0.1-0.4 50-65

Portakal kabuğu 3.5-5.5 65

Armut 0.7-0.9 50-70

Ananas 0.04-0.1 22-40

Çilek 0.5-0.7 20-60

Pektin, gerçekte özellikleri birbirine benzeyen ve pektik maddeler adı verilen

bir madde grubu içinde yer alır. Ancak çoğu zaman bu maddelerin tümü için de

pektin sözcüğü kullanılabilmektedir. Pektik maddeler grubunda yer alan bileşikler

Çizelge 1.2’de verilmektedir.

Bir heteropolisakkarit olan pektin, α-D-galakturonik asit moleküllerinin α-

1,4-glikozidik bağlarla birbirlerine göre bağlanmasıyla oluşan poligalakturonik asit

zinciridir. Galakturonik asit ünitelerinden bir kısmı metanol ile esterleşmiş haldedir.

Pektin molekülünde bulunan metanol ile esterleşmiş galakturonik asit miktarının %

50’nin altında ve üstünde olmasına göre düşük ve yüksek esterleşme dereceli pektin

şeklinde değerlendirme yapılmaktadır (Acar ve Gökmen, 2004).


9

Yüksek esterleşme dereceli pektin (%75)

OCOOCH3

H

H

H

H

OHO

OH

H

H OH

HOH

COOCH3

O

OH

HHO

H

H

H

OHO

OH

H OH

HOH

COOCH3OH

HH

COOH

H O

Düşük esterleşme dereceli pektin (%25)

O

O

H

H

OH

H OH

COOH

OH

H

O

OCOOCH3

H

H

H

OH

OH

O

HO

H

H

H

OH

OH

H

COOH

O

H OH

HOHH O

COOH

OH

Şekil 1.3. Düşük ve yüksek esterleşme dereceli pektin (Acar ve Gökmen, 2004)

Pektinin esterleşme oranı kaynağına göre değişim göstermektedir. Örneğin

elma pektininde esterleşmiş karboksil gruplarının oranı % 95.3 iken vişne pektininde

% 55.4’dür.


10

Çizelge 1.2. Pektik bileşikler ve özellikleri (Ekşi, 1988)

Bileşik adı Özelliği

Pektik asit

(poligalakturonik asit)

Esteleşmemiş galakturonik asit birimlerinden oluşan

zincir. Asit formda suda çözünmez, kısmen

nötralizasyondan sonra suda çözünür ve Ca ile jel

oluşturur.

Pektat Pektik asitin nötral veya asidik tuzudur.Çok az sayıda

metoksil grubu içerir. (Na-pektat suda çözünmekte,ancak

Ca-pektat suda çözünmemektedir.)

Pektin Kısmen ve tümüyle metil alkolde esterleşmiş (metilize

olmuş) poligalakturonik asittir. Metoksil grubu sayısı

(esterleşme derecesi) ve polimerizasyon derecesine bağlı

olarak özellikleri değişmektedir.

Pektinat Düşük ve yüksek esterleşme oranı içeren pektinin

tuzudur.Molekülde metoksil gruplarıda bulunur.

Protopektin Pektin zincirleri, esterleşmemiş –COOH grupları

üzerinden birbirine metal iyonu (Mg, Ca) ile

bağlanmıştır.Kısıtlı sayıda fosforik asit üzerinden ester

köprüsü de içeren doğal pektin olup, suda çözünmez.

Pektin türevleri Ana valenslerine asetil vb. gibi özel grupların bağlandığı

pektindir.

Pektin molekülünde doğrusal poligalakturonik asit ana zincirinde α-1,2-

glikozidik bağlarla bağlanmış ramnoz molekülleri yer almaktadır. Ramnoz

moleküllerinin pektin molekülü içinde dağılımı muntazam değildir. Bu nedenle bu

konuda yapılan çalışmalarda, pektin molekülünde düz (smooth) ve saçaklı (hairy)

bölgelerin varlığından söz edilmektedir (Şekil 1.4).Bazı araştırmacılara göre pektin

bitkide bulunduğu yere bağlı olarak orta lamel pektini veya primer hücre duvarı

pektini olarak da sınıflandırılmaktadır (Acar ve Gökmen, 2004; Bonnin ve ark.,

2002).


11

Şekil 1.4. Pektin molekülünde düz (smooth) ve saçaklı (hairy) bölgeleri gösteren model (Acar ve Gökmen, 2004).

Pektin molekülünde yer alan ramnoz moleküllerine galaktan gibi nötral

şekerler ya uzun yan zincirler halinde ya da monomerler halinde bağlanmışlardır

(Şekil 1.5).


12

OO

OO O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

GUA GUA

GUA

GUA GUA GUA GUA GUA

GUA GUA

RAM

RAMRAM

RAM

RAM

Galaktan

Galaktan

Şekil 1.5. Pektin molekülü (Acar, 2004)

Pektik maddeler, bitki duvarlarında oluşan yapısal polisakkaritlerdir.Bu

maddeler büyük oranda anhidrogalakturonik asit birimlerinden oluşan karmaşık,

kolloidal karbonhidrat türevlerinden meydana gelen yüksek su tutma kapasiteli

polisakkaritlerdir. Bu durumda pektik maddeleri oluşturan birim, poligalakturonik

asit olup, düz bir zincir yapmak üzere birbirleriyle α -1,4 bağı yapmışlardır. 30000

– 300000 Da moleküler ağırlıklı heteropolisakkaritlerdir. Pektik maddeler pektinik

asit, pektin, pektik asit ve bunların tuzlarını içeren bir grup maddeye verilen genel

addır (Willatns ve ark., 2001).

Pektin selüloz ve hemiselüloz gibi yüksek bitkilerin hücre duvarında bulunan

bir polisakkarittir. Pektinin yapısında poligalakturonik asit, rhamnogalakturonik asit,

galaktanlar ve arabinogalaktanlar vardır (Celestino ve ark., 2006). Pektinler pektik

maddeler, protopektinler ve pektik asitler olarak sınıflandırılırlar. Pektik maddeler,

tamamen veya bir kısmı esterleşmiş poligalakturonik asitleri içerirler. Tamamen

esterleşmiş poligalakturonik asitler teorik olarak % 16.3 metoksil grubu içerirler.

Protopektinler selüloz, xylan ve glukomannan gibi düğer hücre duvarı maddelerine

kimyasal ve fiziksel olarak bağlı suda çözünmez pektinlerdir. Pektik asitler, çok az

esterleşmiş veya hiç esterleşmemiş poligalakturonik asitlerdir. Bunlar şekerlerle,


13

asitlerle veya divalent iyonlarla katı jel formuna getirilebilirler. Meyve ve sebzelerin

yapıları pektik maddelerin özellikleri ve içerikleriyle düzenlenir.

1.2.1. Pektinin Endüstriyel Önemi

Pektin gıda endüstrisinde reçel ve marmelat üretiminde jelleşmeyi sağlamak

amacıyla kullanılmaktadır. Pektin ( E 440) bir gıda katkı maddesidir, Meyve ve

sebze teknolojisinde berrak meyve suyu üretiminde önemli bir yere sahiptir. Meyve

suyu üretiminde mayşe enzimasyonu uygulansa bile pres suyu, kolloidal olarak

çözünen pektin içerir. Pektin koruyucu özelliğinden dolayı, diğer bileşikleri de

meyve ham suyu içinde askıda tutmaktadır. Bu nedenle berrak meyve suyu üretimi

için öncelikle pektik bileşiklerin enzimatik yolla degredasyonu gereklidir (Ekşi,

1988).

Pektin endüstriyel olarak elma ve turunçgil meyveleri posasından elde edilir.

Ham maddedeki protopektin asit ekstraksiyonu ile çözünür hale getirilir ve daha

sonra izopropil alkol ile çözünür pektin sulu çözeltiden ayrılır. Pektin ticarette sıvı

veya kurutulmuş toz halde bulunur (Acar ve Gökmen, 2004).

1.3. Pektolitik Enzimler

1.3.1.Pektolitik Enzimlerin Genel Özellikleri

Pektolitik enzimler galakturonik asidin doğal polimeri olan pektinleri

parçalarlar. Bu enzimlerin üretimi daha çok yüzey kültür tekniği ile katı besiyerlerde

gerçekleştirilir. Üretimde A. niger, A. oryzae, A. wentii, A. flavus, Rhizopus

liquefaciens ve Penicillum türleri kullanılır. Pektolitik enzimlerin biyosentezi

indüksiyon veya katabolik represyon mekanizması ile kontrol edilir (Telefoncu,

1997).

Pektik enzimler, genelde polisakkaritleri parçalayan zincir kırıcı enzimler

olarak bilinmektedirler. Bitki hücrelerinin orta lamelinin ve primer hücre duvarının

yapısını oluşturan pektik asit ve pektini parçalayan bu enzimler bakteri, mantar,


14

böcek, nematod ve protozoada bulunmaktadırlar. Bitkisel kaynaklı pektik enzimler

oldukça yüksek molekül ağırlıklı pektik asitleri tercih ederler ve pektatların

indirgeyici olmayan uçlarına atak yaparak monogalakturonat oluştururlar. Oligo ve

digalakturonatları da parçalarlar. Substratlarını tek zincir etki mekanizmasına göre

ürüne çevirirler. Kalsiyum (Ca++) iyonu varlığında sitimüle olurlar. Pektatların

tamamen hidrolize olmamasının nedeni, substratların yapılarındaki düzensizlik

nedeniyle olduğu şeklinde yorumlanmaktadır.

Pektik maddelere etki eden ve kısaca pektik enzimler denilen grupta da çok

sayıda enzim yer almaktadır (Sunnotel ve Nigam, 2002). Pektik enzimleri, pektin

molekülünün galakturonan omurgasına olan etkilerine göre pektinesterazlar (ester

bağını hidrolize edici enzimler) ve depolimerazlar (zincir kırıcı enzimler) olarak iki

sınıfa ayırarak incelemek olasıdır (Aksöz ve ark., 1985).

Depolimerazlar, pektik maddeler üzerinde iki farklı mekanizmayla çalışırlar.

Birincisi, glikozidik bağları hidroliz eden hidrolitik reaksiyon. İkincisi, glikozidik

bağları su katılması olmaksızın kıran trans-eliminasyon reaksiyonu.

Depolimerazların bu sınıfı liyazlar olarak adlandırılır. Bu farklı kırılma reaksiyonları

pektinazların sınıflandırılmasında kullanılır (Soares ve ark., 1999).

Çizelge 1.3. Pektik enzimlerin sınıflandırılması

EC numarası Kırma noktası Hidrolazlar Endopoligalakturonaz 3.2.1.15 Zinciri arasından rastgele Exopoligalakturonaz 3.2.1.67 Zincirin sonundan Liyazlar Pektat-liyaz 4.2.2.2 Zinciri arasından rastgele Pektin-liyaz 4.2.2.10 Zinciri arasından rastgele Esteraz Pektin-esteraz 3.1.1.11 Deesterifikasyon


15

Endopoligalakturonazlar (Endo-PG; 3.2.1.15), mantar, bakteri, maya gibi

birçok mikroorganizmada ve bitkilerde bulunur. Poligalakturonaz için en iyi subsrat

pektik asitlerdir. Pektik asitler endopoligalakturonaz tarafından hidrolizle

depolimerize olurlar. Pektik asitlerdeki serbest karboksil ucuna yakın glikozidik bağı

kırarlar. Pektat çözeltisinin viskozitesindeki hızlı azalma PG aktivitesinin bir

göstergesidir. Birkaç bağın kırılması bile viskozitede % 50 azalmaya neden olur.

Subsratın esterifikasyon derecesinin düşmesiyle PG aktivitesi düşer.

Exopoligalakturonazlar (Exo-PG, EC 3.2.1.67), yüksek bitkilerde,

mantarlarda, bakterilerde ve bazı böceklerin bağırsak sistemlerinde bulunurlar.

Yüksek moleküllü pektik asit zincirini sonundan kırarlar. Hidroliz ile

depolimerizasyon sonunda monomerler açığa çıkarırlar.

Şekil 1.6. Poligalakturonaz enziminin etki mekanizması

Pektat-liyazlar (PATE; EC 4.2.2.2 ), bazı bakteri ve patojenik mantarlar

tarafından üretilirler. Serbest karboksil ucuna yakın glikozidik bağını eliminasyon

tepkimesiyle kırarlar. Pektat-liyazlar için en iyi subsratlar düşük metoksilli pektinler

veya tamamen deesterifiye olmuş pektik asitlerdir. Enzimin aktif olması için Ca+2

iyonuna ihtiyacı vardır.

Şekil 1.7. Pektat-liyaz enziminin etki mekanizması

O

OH

OH

OH

COOH

O

O

OH

OH

COOH

O

O

OH

OHOH

COOH

O

OH

OH

COOH

O

Pektat-liyaz

O

OH

OH

OH

COOH

O

O

OH

OH

OH

COOH

O

O

OH

OH

OH

COOH

O

OH

OH

COOH

O

OH

+ H2O

Poligalakturonaz


16

Pektin –liyazlar (PTE; EC 4.2.2.10 ), yüksek bitkilerde bulunmazlar ama bazı

mantarlarda bulunurlar. Depolimerazların bu türleri, ticari enzimlerin önemli

elemanlarıdır. Özellikle pratik uygulamalarda önemlidir. Yüksek dereceli esterleşmiş

poligalakturonik asitleri depolimerize ederler. Pektin liyazlar glikozidik bağını

kırdıklarında metilenmiş galakturonik asit artıkları açığa çıkar. En iyi subsratları

fazla esterleşmiş pektinlerdir ve Ca +2 iyonu tarafından aktif hale getirilirler.

Şekil 1.8. Pektin-liyaz enzimininin etki mekanizması

Pektin-esterazlar (PE; EC 3.1.1.11), yüksek bitkilerde, çeşitli mantarlarda,

bazı maya ve bakterilerde bulunurlar. Pektinleri enzimatik bir şekilde deesterifike

ederler. Deesterifikasyon sonunda metanolün ayrılmasıyla düşük esterli pektinlere ve

pektik asitlere dönüşürler.Pektin zincirinde tercih ettiği kırma noktası, serbest

karboksil ucuna yakın esterli galakturonik asit artıklarıdır.

Şekil 1.9. Pektin-esteraz enzimininin etki mekanizması 1.3.2. Endüstride Pektolitik Enzimlerin Kullanılması

Pektinazlar 60 yıldan daha fazla süredir gıda ve meyve suyu üretiminde

kullanılmaktadır. Ticari pektinaz üretiminde kullanılan asıl mikroorganizma

A.niger’dir. Pektinazlar elma, armut, üzüm, turunçgiller, kuru erik gibi meyve

sularının domates suyu gibi sebze sularının hazırlanmasında kullanılmaktadır.

O

OH

OH

OH

COOCH3

O

O

OH

OH

O

O

OH

OHOH

COOCH3

O

OH

OH

COOCH3

O

COOCH3

Pektin-liyaz

O

OH

OH

OH

COOCH3

O

O

OH

OH

O

COOCH3

O

OH

OH

COOH

O

O

OH

OH

COOH

OHOCH3

+ H20

Pektin-esteraz


17

Yüksek poligalakturonaz aktivitesine sahip pektik enzimlerin kullanımı ile meyve

sularındaki bulanıklığın kararlı hale gelmesi başarılmıştır.

Pektin parçalayan enzimler gıda endüstrisinde özellikle meyve sularının

berraklaştırılmasında, meyve suyu üretiminde filtrasyonu kolaylaştırıp verimin

artırılmasında, C vitamini sentezi için çıkış maddesi olan galakturonik asit eldesinde,

şarap endüstrisinde, yağların ekstraksiyonunda, pigmentlerin ve selüloz fiberlerin

hazırlanmasında, kahve ve çay fermantasyonunda fonksiyonel gıda maddeleri olarak

oligosakkaritlerin üretiminde yeni uygulamalar için kullanılmaktadırlar (Telefoncu,

1997; Phutela ve ark., 2005; Patil ve ark., 2006; Botella ve ark., 2007).

1.4.Alginat

Alginat deniz yosunlarında bulunan bir polisakkarit olup, aralarında β (1-4)

glikozidik bağları olan D-manuronik (M) asit ve α (1-4) glikozidik bağları olan L-

guluronik asit (G)'ten meydana gelen organik bir bileşiktir (Sardar ve Gupta, 1998).

Endüstriyel olarak üretildiği mikroorganizmalar şunlardır:

§ Laminaria hyperborea

§ Macrocystis pyrifera

§ Ascophyllum nodosum

§ L.digitata, vb.

Alginat molekülünün bileşimi elde edildiği organizmaya ve dokuya göre

farklılıklar gösterir. Alginat iki ve üç değerlikli katyonlar ile reaksiyona girerek jel

oluşturur. Katyonlar (Ca+2, Sr+2, Ba+2, Al+3, Fe+3 gibi) moleküldeki guluronik asitleri

birbirlerine bağlayarak jel olşumuna sebep olurlar.

2 Na (Alginate) + Ca++ Ca (Alginate)2 + 2 Na+

İyonik bağlı jel 0-100oC arasındaki sıcaklıklarda kararlıdır. Bu nedenle

ısıtmak jeli sıvılaştırmaz. Yüksek sodyum veya potasyum içeren bir çözeltiyle

muamele edilirse kolaylıkla çözünür.


18

Jel oluşturma özellikleri alginat molekülünün kompozisyon ve sırasına

bağlıdır. G bloklarının uzunluğu jel formasyonunun başlıca yapısal durumunu

belirler. Eğer molekülde G miktarı fazla ise sert ve kırılgan bir jel oluşur, eğer M

miktarı fazla ise daha yumuşak ve elastik jel oluşumu gözlenir.Genellikle hücrelerin

immobilizasyonunda kullanılan bu metod enzimler için kullanıldığında, bazı özel

tekniklerin kullanılması gereklidir. Alginat ile bead, kapsül ve fiber oluşturularak

enzim veya hücre immobilize edilebilir.

Hiçbir toksik etkisi olmadığından alginat, gıda, ilaç, tekstil, kağıt

endüstrisinde geniş kullanım alanına sahiptir (Smidsrod ve ark., 1990).

1.5.Florisil

Florisil (magnezyum silikat) yüksek mekanik dayanıklılığa sahip, organik

çözücülere dayanıklı, mikrobiyal saldırılara karşı dirençli inorganik desteklerdir.

Pektinaz enziminin alginat ve florisil destek üzerine immobilizasyonu,

immobilize enzimlerin karakterizasyonu (optimum pH, optimum sıcaklık, termal

kararlılık, depolama kararlılığı, tekrar kullanılabilirliği); immobilize enzimlerin

kinetik parametrelerinin (aktivasyon enerjisi, Km, Vmax, katalitik etkinliği)

belirlenmesi ve bu parametrelerin serbest Pektinaz ile kıyaslanması bu çalışmanın

temelini oluşturmaktadır.

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fadile YENER

19

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Roy ve ark., 2003 Aspergillus niger’den saflaştırılan Pektinaz enzimini

kovalent olmayan bir şekilde alginat üzerine immobilize etmişlerdir. Substrat olarak

kitini kullanmışlar, immobilize enzimin serbest enzime göre % 56 aktivite

gösterdiğini bildirmişlerdir. İmmobilize enzim serbest enzimle karşılaştırıldığında

optimum sıcaklığın değişmeden kaldığını optimum pH’nın ise geniş bir aralık

gösterdiğini rapor etmişlerdir. Alginat üzerine immobilize edilen Pektinaz’ın termal

kararlılığını 55 ve 65oC olarak bulmuşlardır. Serbest ve immobilize enzimin kinetik

parametrelerini çalışmışlar, Vmax değerinin değişmediğini KM değerinin

immobilizasyonla yükseldiğini göstermişlerdir. İmmobilize enzimin KM ve Vmax

değerlerini sırasıyla 6 mg ml-1 ve 3.4 nmol min-1 olarak bulmuşlardır. İmmobilize

enzimin ilk kullanımdan sonra aktivitesinin % 55 azaldığını göstermişler ve bu

azalmanın sebeplerini incelemişlerdir.

Ortega ve ark., 2004 Üç farklı ticari Pektinaz enzim kompleksindeki

(Rapidase C80, Pectinase CCM and Pectinex 3XL) poligalakturonaz aktivitesinin

termal inaktivasyonunu ve kinetik özelliklerini incelemişlerdir. Bütün örneklerde PG

aktivitesinin Michaelis-Menten kinetikleri ve onların katalitik etkinlikleri

incelemişlerdir. Pectinex 3XL için optimum pH’yı 4.7, diğer ikisi için optimum

pH’yı 4.0 olarak hesaplamışlardır. Rapidase C80, Pectinase CCM, Pectinex 3 XL

için aktivasyon enerjilerini sırasıyla 26.5, 45.6, 4.2 kj mol-1 hesaplamışlar ve termal

inaktivasyon eğrilerinin 40-60oC arasında doğrusal olmadığını rapor etmişlerdir.

Ayrıca enzim komplekslerinin serbest enerji (∆G#), entalpi (∆H#) ve entropi (∆S#)

gibi termodinamik aktivasyon parametrelerini hesaplamışlardır. En yüksek katalitik

etkinliği (Vmax/KM) 44.4 değeri ile Rapidase C80 gösterdiği için üç enzim kompleksi

arasındaki en etkin enzimin Rapidase C80 olduğunu belirlemişlerdir.

Sardar ve Gupta, 2005 Domatesten saflaştırdıkları Pektinaz’ı Concanavalin

A bağlı agaroza immobilize etmişlerdir. İmmobilize ve serbest enzimin katalitik

etkinliğini(Vmax/KM) sırasıyla 0.4 ve 0.3 olarak bulmuşlar ve immobilize enzimin

katalitik etkinliğinin daha yüksek olduğunu rapor etmişlerdir. İmmobilize enzimin


20

termal kararlılığının 50oC ve depolama kararlılığının 4oC’de yüksek olduğunu rapor

etmişlerdir. İmmobilize enzimi aktivitesi kaybolmadan 3 kez kullanabilmişlerdir.

Busto ve ark., 2006 Meyve suyu üretiminde kullanılan ticari pektinazlardan

pektinliyazı alginat boncuklar üzerine immobilize etmişler ve optimum koşulları 0,17

g alginat ml-1, % 1,2 enzim konsantrasyonu ve pH 3,6 asetik- HCl/glisin –HCl veya

pH 6,4 tris HCl / imidazol tamponu olarak belirlemişlerdir. İmmobilizasyonun

maksimum %’ sini (%10,6) Rapidase C 80 ile belirlemişlerdir. Serbest ve immobilize

enzimin optimum pH ve sıcaklık değerlerini 7,2 ve 55oC olarak bulmuşlardır.

İmmobilizasyonla termal kararlılığın özellikle 40oC ’de önemli şekilde

değişmediğini göstermişlerdir. Yüksek esterli pektinin viskozitesindeki azalmayı

serbest enzim için 1,09’dan 0,70 mm2 sn -1 ve immobilize enzim için 1,09’dan 0,72

mm2sn -1 olarak bulmuşlardır. Ayrıca enzimin 4 kez kullanılabileceğini ve viskozite

azalmasındaki verim kaybını sadece % 9,2 olarak belirlemişlerdir.

Aslan ve Tanrıseven, 2007 Aspergillus aculeatus’dan elde edilen ticari

enzim kompleksi Pectinex Ultra SP-L’yi Eupergit C üzerine immobilize etmişler ve

galaktooligosakkaritleri elde etmek için kullanmışlardır. İmmobilizasyonu % 100

bağlanma yüzdesi ve serbest enzimden % 24 daha yüksek GOS

(galaktooligosakkarit) verimi ile sonuçlandırmışlardır. Optimum koşulların

immobilizasyondan çok etkilenmediğini göstermişler, optimum pH ve optimum

sıcaklığı her iki enzim için sırasıyla 4.0-5.0 ve 55-60oC olarak hesaplamışlardır.

Serbest ve immobilize enzimi kullanarak % 30’luk laktoz çözeltisinden üretilen GOS

miktarını reaksiyon karışımındaki toplam şekerin sırasıyla % 12.8 ve % 15.8’i olarak

belirlemişlerdir. İmmobilize enzim 20 gün boyunca azalma olmaksızın aktivite

gösterdiği ve immobilizasyon yüzdesi yüksek olduğu için immobilize Pectinex Ultra

SP-L’nin galaktooligosakkaritlerin üretimi için kullanılabileceğini bildirmişlerdir.

Li ve ark., 2007 Pektinaz enzimini gluteraldehit kullanılarak sodyum alginat

destek üzerine kovalent bir şekilde immobilize etmişler ve aktivitesinin % 66’nı

koruduğunu bildirmişlerdir. İmmobilizasyondan sonra aktivite için en uygun pH

değerinin 3’den 3.5’a değiştiğini fakat optimum sıcaklığın değişmeden 40oC’de

kaldığını göstermişlerdir. İmmobilize enzimin serbest enzime göre daha yüksek

termal kararlılığa ve tekrar kullanılabilirliğe sahip olduğunu, 11 kullanımdan sonra


21

ilk aktivitesinin % 80’nini koruduğunu rapor etmişlerdir. Farklı substrat

değişimlerinde Vmax ve KM değerlerini çalışmışlar, Vmax değerini serbest enzim için

0,5 µmol/mg dk, immobilize enzim için 0,4µmol/mg dk bulmuşlardır. KM değerini

ise serbest enzim için 0,7 mg ml-1, immobilize enzim için 0,6 mg ml-1 olarak

bulmuşlardır.

Lei ve Bi., 2007b Pektinaz enzimini ATRP (atom transfer radikal

polimerizasyonu) kullanılarak sentezlenen gözenek boyutu belirli PS-b-PAA

(polisitiren-b-poliakrilik asit) kopolimeri üzerine immobilize etmişlerdir. Polimer

üzerindeki karboksil gruplarının enzim immobilizasyonu için çok basit, hafif ve

zaman tasarruflu bir süreç sunduğunu göstermişlerdir. İmmobilize pektinazın bazı

özelliklerini ( pH, termal kararlılık, sıcaklık, depolama kararlılığı) çalışmışlar,

bunlardan optimum pH’yı 6,0 optimum sıcaklığı 65 oC olarak bulmuşlardır. Serbest

ve immobilize enzimin aktivitelerini farklı substrat derişimlerinde ölçmüşler ve KM

ve Vmax değerlerinin değişmediğini görmüşlerdir. Bunun sonucunda immobilize

enzimin serbest enzimle benzer hızda çalıştığını göstermişlerdir. Fakat immobilize

enzimin KM değerinin, serbest enziminkine göre daha yüksek olduğunu ortaya

çıkarmışlardır.

Lei ve ark., 2007a Pektinazı SiO2 üzerine daha önceden adsorbe edilmiş

kitozan yüzeyine immobilize etmeye çalışmışlardır. Kitozanın enzim

immobilizasyonu için uygun bir destek olduğunu ve gluteraldehit gibi reaktiflerle

kolay bir şekilde karşı bağ yaparak jel haline gelebildiğini bunun içinde iyi bir destek

olduğunu belirtmişlerdir. Glutaraldehitle aktifleştirilmiş silika kaplı kitozan destek

olarak kullanıldığında immobilize enzimin termal ve pH denaturasyonuna karşı daha

dirençli olduğunu belirtmişlerdir. Bu immobilize enzimin aktivitesini kaybetmeden

geniş bir pH aralığında (3-4.5) uygulanabileceğini göstermişlerdir. Bu partiküller

üzerine adsorbe edilen immobilize enzimin aktivitesini Michaelis-Menten

parametreleriyle analiz etmişlerdir. KM değerlerini serbest ve immobilize enzim için

sırasıyla 8.28 g pektin ml-1 ve 10.03 g pektin ml-1 olarak bulmuşlardır. KM

değerindeki ufak değişimin sebebini destek ve polimer zincirlerinin üç boyutlu

yapısıyla oluşan difüzyon etkileri olarak açıklamışlardır.

3.MATERYAL VE METOD Fadile YENER

22

3.MATERYAL VE METOD 3.1.Materyal

Araştırmada kullanılan tüm reaktifler analitik saflıkta olup Merck veya

Sigma, St. Louis, MO. Firmasından sağlanmıştır.Araştırmada kullanılan kimyasallar,

araç ve gereçler şunlardır:

Kimyasallar: Pektinaz (Novenzymes), alginat, galakturonik asit, sodyum

hidroksit, sodyum karbonat, sodyum potasyum tartarat, 3,5-dinitrosalisilik asit, fenol,

sodyum sülfit, florosil (60-100 mesh), glutaraldehit, 3-aminopropil trietoksisilan,

nitrik asit, aseton, bakır (II) sülfat, folin-ciocalteu çözeltisi, sodyum klorür, fosforik

asit, asetik asit, sitrik asit, sığır serum albumin (BSA).

Araç ve gereçler: UV- Vis spektrofotometre (ATI UNICAM), pH metre

(HANNA 8417), magnetik karıştırıcı, inkübatör (ES 500), santrifüj, analitik terazi,

otomatik pipet, girdap karıştırıcı, termostatlı çalkalayıcı su banyosu, kriyostat.

3.2.Metod

3.2.1.Protein Tayini

Protein tayini Lowry (1951) yöntemiyle yapılmıştır. Bunun için içerikleri

bildirilen A, B ve C çözeltileri hazırlanmıştır.

1) Çözelti A: 20 g Na2CO3 ve 4 g NaOH saf suda birlikte çözülüp son hacim 1 L’ye

tamamlanarak hazırlanmıştır.

2) Çözelti B: 0,5 g CuSO4.5H2O, % 1’lik sodyum sitrat çözeltisinde çözülüp son

hacim aynı çözelti ile 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır.

3) Çözelti C: 50 mL A çözeltisi ile 1 mL B çözeltisi karıştırılarak hazırlanmıştır.

(Kullanılacağı zaman hazırlanmasına dikkat edilmiştir).

4) Folin-Ciocalteu çözeltisi: Folin-Ciocalteu saf su ile 1:2 oranında seyreltilerek

hazırlanmıştır.


23

5) Standart protein çözeltisi:100 mL’de 14 mg sığır albümini olacak şekilde 0,9’luk

NaCl çözeltisi ile hazırlanmıştır.

6) Standart protein eğrisinin çizimi: 8 adet deney tüpü alınarak tüplere sırasıyla 0,

50, 100, 125, 250, 500, 750 ve 1000 µL olacak şekilde standart protein

çözeltisinden konulmuştur. Her tüp içeriğinin hacmi su ile 1 mL’ye

tamamlanmış, her tüpe 5 mL C çözeltisi ilave edilmiştir. 10 dakika oda

sıcaklığında bekletildikten sonra her tüpe 1:2 oranında seyreltilmiş Folin-

Ciocalteu çözeltisinden 0,5 mL eklenmiştir. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilip

tüp içeriklerinin absorbansları köre karşı 750 nm’de okunmuştur, bu değerler

derişime karşı grafiğe geçirilmiştir. Örneklerin protein içerikleri aynı yöntemle

standart protein eğrisi kullanılarak değerlendirilmiştir.

3.2.2.Pektinaz’ın Alginat Destek Üzerine İmmobilizasyonu

Enzimlerin immobilizasyonunda Mondal ve ark.(2003), tarafından önerilen

yöntem kullanılmıştır.30 µl enzim çözeltisi (3,75 mg/ml) pH 5,0 sodyum asetat

tamponu ile 1 ml’ye tamamlanmıştır.Sonra % 2’lik 2 ml alginat çözeltisi eklenmiş

ve son hacim asetat tamponu ile 4 ml’ye tamamlanmıştır. Reaksiyon karışımı 3M

asetik asitle pH 3,8’e getirilmiştir.25oC’de bir saat bekletildikten sonra 2M CaCl2

çözeltisinden 400 µl eklenmiş ve 20 dakika sonunda santrifüj edilmiştir.

İmmobilizasyon işleminden sonra immobilize enzim saf su ile süzüntüde protein

kalmayıncaya kadar asetat tamponu ile yıkanmıştır.Toplam süzüntüde protein tayini

yapılarak g destek başına tutuklanan mg enzim miktarı hesaplanmıştır.Protein tayini

Lowry metoduna göre yapılmıştır.

3.2.3.Pektinaz’ın Florisil Destek Üzerine İmmobilizasyonu

Pektinaz’ın immobilizasyonunda önce florisil destek yüzeyinin aktifleştirilmesi

gerekmektedir (Tükel ve Alptekin, 2004). Bu nedenle 3- aminopropiltrietoksisilan

kullanılarak desteğin alkilamin türevi oluşturulmuştur. Alkilamin türevinin

hazırlanmasında (silanlama) Weetall, H.H. (1976) tarafından literatürde bildirilen

yöntem kullanılmıştır. Destek materyali %5 (v/v)’lik nitrik asit ile 80-90 ºC’de 60


24

dakika yıkanmış ve takiben su ile yıkanıp 120 ºC’de kurutulmuştur. Kurutulmuş

desteğin 1 gramı hacimce % 4’lük 3- aminopropiltrietoksisilanın aseton

içerisindeki çözeltisine eklenerek 45 oC’de 24 saat bekletilmiştir. Saf su ile

yıkanarak 115 oC’de etüvde 1 gece kurutulmuştur.1 g silanlanmış desteğe 25 ml %

2,5 (v/v)`luk glutaraldehitin 50 mM pH 7,0 fosfat tamponundaki çözeltisi eklenmiş

120 dakika beklendikten sonra, reaksiyona girmemiş glutaraldehit saf su ile

yıkanarak uzaklaştırılmış ve 60 oC’de 1 sa kurutulmuştur.Bu basamaktan sonra

enzim destek üzerine doğruda immobilize edilmeye çalışılmıştır ( Costa ve ark.,

2001).

3.2.4.Serbest veya İmmobilize Pektinaz’ın Aktivitesinin Belirlenmesi

Pektinaz’ın aktivite tayini için Debing ve ark.(2006), önerdiği yöntem

kullanılmıştır. Pektinaz enzim kompleksinde exopoligalakturonaz aktivitesi

ölçülmüştür. Serbest enzim için 50oC’de 10 dakika bekletilen reaksiyon karışımında

pektinin hidrolizi sonucu oluşan galakturonik asit miktarı Dinitrosalisilik asit

(DNSA) yöntemi ile belirlenmiştir.

DNSA yöntemi ilk kez Sumner ve ark. (1921) tarafından geliştirilmiştir.

Yöntem bir indirgen şekerin 3,5-Dinitrosalisilik asit ile yükseltgenmesi esasına

dayanmaktadır.

Bu çalışmada kullanılan DNSA reaktifinin bileşimi (w/v) olarak aşağıda

verilmiştir (Wang ve ark., 1997).

% 1 DNSA

% 0,2 Fenol

% 0,05 Sodyum Sülfit

% 1 Sodyum Hidroksit

% 30 Sodyum-Potasyum Tartarat

DNSA yöntemi ile galakturonik asit tayini yapmak için 300 µl galakturonik

asit çözeltisi ile 300 µl DNSA reaktifi bir tüpte karıştırılır, kaynar su banyosunda 15

dakika tutulur.Tüm tüpler aynı anda kaynar su banyosundan alındıktan sonra buz


25

banyosunda 2-3 dakika soğutulur. Çözelti üzerine 4,4 ml damıtık su eklenerek

seyreltilir ve girdap karıştırıcı ile karıştırıldıktan sonra spektrofotometrede 530

nm’de okunur.

Exopoligalakturonaz aktivitesini belirlemek için 0,2 mg/ml derişimindeki

serbest Pektinaz’ın 50 µl’si 250 µl % 1’lik pektin çözeltisi ile 50oC’de 10 dk

etkileştirilmiştir.Reaksiyonu durdurmak için ortama 300 µl DNSA reaktifi

eklenmiştir.Açığa çıkan galakturonik asit miktarı belirli galakturonik asit

derişimlerine karşı 530 nm’de absorbans değerlerinin grafiğe geçirilmesiyle elde

edilen standart galakturonik asit eğrisinden yararlanılarak bulunmuştur.Enzimin

aktivitesi µmol galakturonik asit dk-1 mg-1 protein olarak hesaplanmıştır.

İmmobilize Pektinaz aktivitesinin ölçümünde, immobilize Pektinaz içeren 0,2

g destek % 1’lik pektin çözeltisinin 250 µl’si ile 45 oC’de 10 dk etkileştirilmiş ve

reaksiyon DNSA reaktifi ile durdurulmuştur.Açığa çıkan galakturonik asit miktarı

standart eğriden yararlanılarak bulunmuştur.Enzimin aktivitesi µmol galakturonik

asit dk-1 g-1destek olarak hesaplanmıştır.

3.2.5.Galakturonik Asit Tayini

Standart galakturonik asit eğrisinin çizimi: 6 adet deney tüpüne sırasıyla 0,5,

1, 2, 3, 4 v 5 mM derişimlerde olacak şekilde 300 µl galakturonik asit çözeltisi ve

kör için ise 300 µl saf su konulmuştur. Her bir tüpe DNSA reaktifinden 300µl

eklendikten sonra 15 dakika kaynar su banyosunda bekletilmiştir.Bu sürenin sonunda

2-3 dakika buz içerisinde bekletilen tüplere 4,4 ml saf su eklenerek seyreltilmiş ve

tüplerin absorbansları 530 nm’de okunmuştur.Bu değerler derişime karşı grafiğe

geçirilmiştir.Örneklerin galakturonik asit içerikleri aynı yöntemle standart

galakturonik asit grafiği kullanılarak değerlendirilmiştir (Debing, J., 2006).


26

3.2.6 Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Karakterizasyonu.

3.2.6.1. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Optimum pH'larının Belirlenmesi

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın aktivitesi farklı pH'larda (3.5, 4, 4.5, 5.0

asetat, 6.0 sitrat) sırasıyla 50 mM ve 25 mM tampon içinde hazırlanmış % 1’lik

pektin çözeltisi kullanılarak belirlenmiştir. 10 dakika sonunda oluşan galakturonik

asit miktarı ölçülerek aktiviteler hesaplanmış ve sonuçlar % maksimum aktivite

olarak pH'ya karşı grafiğe geçirilmiştir.

3.2.6.2. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Optimum Tampon Derişimlerinin

Belirlenmesi

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın aktiviteleri daha önce belirlenmiş olan

optimum pH'larda ve farklı tampon derişimlerinde (5, 10, 25, 50, 75, 100 mM)

hazırlanmış substrat çözeltileri kullanılarak ölçülmüştür.

3.2.6.3. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Optimum Sıcaklıklarının

Belirlenmesi

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın aktiviteleri daha önce belirlenmiş olan

optimum pH ve tampon derişimleri için farklı sıcaklıklarda (35, 40, 45, 50, 60, 70°C)

belirlenmiştir.

Her enzim örneği için aktivitenin sıcaklıkla arttığı ve azaldığı bölgeler için

Arrhenius grafiği çizilmiş ve elde edilen iki doğrunun ortak çözümü ile enzimin

denatüre olmaya başladığı sıcaklık belirlenmiştir. Aktivitenin sıcaklıkla arttığı bölge

için elde edilen grafiğin eğimi yardımıyla enzimin aktivasyon enerjisi hesaplanmıştır.


27

3.2.6.4. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin KM ve Vmax Değerlerinin Belirlenmesi

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın aktiviteleri optimum şartlarda farklı

substrat derişimlerinde ölçülmüş ve Lineweaver-Burk grafiği yardımıyla KM ve Vmax

değerleri belirlenmiştir. Ayrıca serbest ve immobilize Pektinaz enzimi için katalitik

etkinlik parametresi olarak belirlenen Vmax/Km değerleri hesaplanmıştır.

3.2.6.5. Serbest ve İmmobilize Enzimlerin Termal Kararlılıklarının Belirlenmesi

Serbest ve immobilize Pektinaz 4 farklı sıcaklıkta (serbest enzim için; 5, 25,

50, 60°C ve immobilize enzim için; 5, 25, 45, 60oC) 18 saat süreyle inkübe edilmiş

ve belirli aralıklarla (başlangıç, 1, 3, 7 ve 18 saat) kalan aktiviteleri belirlenmiştir.

3.2.6.6. Serbest ve İmmobilize Pektinaz’ın Depolama Kararlılıklarının

Belirlenmesi

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın başlangıç aktiviteleri belirlendikten sonra

4oC ve oda sıcaklığında (25oC) ağzı kapalı şişelerde bekletilmiş ve bu enzimlerin

kalan aktiviteleri 5 hafta boyunca belirli zaman ararlıklarla ölçülmüştür.

3.2.6.7. İmmobilize Pektinaz’ın Tekrar Kullanım Kararlılığının Belirlenmesi

İmmobilize enzimin tekrar kullanım kararlılığı belirlenirken kesikli ve

karıştırmalı kolon reaktör kullanılmıştır.

1 g immobilize enzim bulunan kolona 1 ml % 1’lik pektin çözeltisi eklenmiş

ve 10 dakika sonunda alttaki musluğun açılması ile kolan boşaltılmıştır. Enzim

aktivitesi oluşan galakturonik asit miktarı ölçülerek hesaplanmıştır. Kolon

boşaltıldıktan sonra tekrar 1 ml subsrat çözeltisi eklenerek aynı şekilde aktivite

belirlenmiş ve bu işlem 24 kez tekrarlanmıştır. Kalan aktivite ilk kullanımdaki

aktivitenin %’si olarak hesaplanmıştır.

4.BULGULAR VE TARTIŞMA Fadile YENER

28

4.BULGULAR ve TARTIŞMA

4.1.Bulgular

4.1.1.Serbest ve İmmobilize Pektinaz’ın Karakterizasyonu

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın farklı pH’daki aktiviteleri % maksimum

aktivite olarak Şekil 4.1’de verilmektedir.

0

20

40

60

80

100

120

3 4 5 6 7

pH

% M

aksim

um A

ktiv

ite

Şekil 4.1.Serbest ve İmmobilize Pektinaz aktivitesinin pH’ya bağlı olarak değişimi

(•):İmmobilize Pektinaz, (ο):Serbest Pektinaz Şekil 4.1’de görüldüğü gibi serbest ve immobilize Pektinaz’ın her ikisi de en

yüksek aktiviteyi pH 5.0’da göstermektedir.

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın pH 5.0’da hazırlanmış olan farklı

derişimlerdeki tampon çözeltileri kullanılarak aktiviteleri belirlenmiş ve sonuçlar %

maksimum aktivite olarak Şekil 4.2’de gösterilmektedir.


29

0

20

40

60

80

100

120

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Tampon Derişimi(mM)

% A

ktiv

ite

Şekil 4.2.Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin tampon derişimine bağlı olarak değişimi (o):İmmobilize Pektinaz, (•):Serbest Pektinaz

Şekil 4.2’de görüldüğü gibi serbest enzimin en yüksek aktiviteyi gösterdiği

tampon derişimi 50 mM olarak belirlenirken immobilize enzim için bu değer 25 mM

olarak bulunmuştur.

Serbest ve immobilize Pektinaz’ın aktivitesi farklı sıcaklıklarda ölçülmüş,

aktivitenin sıcaklığa bağlı olarak değişimi % maksimum aktivite olarak Şekil 4.3’de

gösterilmiştir. Serbest Pektinaz’ın maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık 50°C olarak

belirlenirken immobilize Pektinaz’ın maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık 45°C

olarak bulunmuştur.


30

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80

Sıcaklık(oC)

% M

aksim

um A

ktiv

ite

Şekil 4.3.Serbest ve immobilize Pektinaz aktivitesinin sıcaklığa bağlı olarak değişimi

(•):İmmobilize Pektinaz, (o):Serbest Pektinaz

Serbest Pektinaz’ın sıcaklığa bağlı olarak değişen aktivite değerleri Arrhenius

bağıntısına göre grafiğe geçirildiğinde Şekil 4.4 elde edilmiştir. Grafikte aktivitenin

arttığı ve azaldığı bölgeler ayrı ayrı değerlendirilmiştir.

Aktivitenin sıcaklıkla arttığı doğrunun eğimini kullanarak serbest

Pektinaz’ın aktivasyon enerjisi 32 J mol-1K-1 olarak hesaplanmıştır. Her iki doğrunun

ortak çözümü ile enzimin denaturasyona başladığı sıcaklık 50,1 oC olarak

belirlenmiştir.

y = -3,8466x + 15,622

y = 5.884x - 14.492

2

2.5

3

3.5

4

2.8 2.9 3 3.1 3.2 3.3

1/T (K-1)x10-3

ln V

(U m

g PG

-1)

Şekil 4.4. Serbest Pektinaz’ın Arrhenius grafiği


31

Aynı şekilde immobilize Pektinaz için çizilen Arrhenius grafiğinin eğiminden

yararlanarak serbest Pektinaz’ın aktivasyon enerji 29 J mol-1 K-1 ve denaturasyon

sıcaklığı 44,3 oC olarak hesaplanmıştır.

y = -3,4959x + 13,477

y = 2,8222x - 6,4351

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

2.85 2.9 2.95 3 3.05 3.1 3.15 3.2 3.25 3.3

1/T (K-1)x10-3

ln V

(U m

g PG

-1)

Şekil 4.5. İmmobilize Pektinaz’ın Arrhenius grafiği

Serbest Pektinaz için 50 mM, pH 5.0 asetat tamponu içerisinde hazırlanan

farklı substrat derişimleri kullanılarak 50oC’de belirlenen aktivite değerleri ile elde

edilen Lineweaver-Burk grafiği Şekil 4.6’da gösterilmektedir.

y = 0.1158x + 0.0144R2 = 0.9945

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 2 4 6 8 10 12

1/S (mM)x10-3

1/V

(mg

gal U

-1)x

10-4

Şekil 4.6.Serbest Pektinaz için Lineweaver-burk grafiği


32

İmmobilize Pektinaz için önceden belirlenmiş optimum koşullarda hazırlanan

farklı substrat derişimlerinde, belirlenen aktivite değerleri kullanılarak elde edilen

Lineweaver-Burk grafiği Şekil 4.7’de gösterilmektedir.

y = 0.0178x + 0.0484R2 = 0.9981

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 2 4 6 8 10 12

1/S (mM)x10-3

1/V

(mg

Gal

U-1)x

10-4

Şekil 4.7. İmmobilize Pektinaz için Lineweaver-Burk grafiği

Serbest ve immobilize Pektinaz için KM, Vmax ve Vmax/Km değerleri her bir

enzim için çizilen Lineweaver-Burk grafiğinden hesaplanarak bulunmuştur.Bu

sonuçlar Çizelge 4.1’de gösterilmektedir.

Çizelge 4.1. Serbest ve immobilize Pektinaz’ın kinetik parametreleri

Serbest Pektinaz İmmobilize Pektinaz

KM (mg/ml) 8,04 0.37

Vmax (µmolgalakturonik

asit/mg protein.dk)

69,4 20,7

Vmax / KM 8.63 55.9

Çizelgede 4.1’de görüldüğü gibi immobilize Pektinaz’ın KM ve Vmax

değerlerinin ikiside azalmıştır. Buna göre katalitik etkinlik olarak tanımlanan Vmax /

KM değerinin serbest enzim için 8,63 iken, immobilize enzim için bu değer 55,9


33

olarak hesaplanmıştır. İmmobilize enzimin katalitik etkinliği serbest enzime göre

yaklaşık 6.5 kat artmıştır.

Şekil 4.8 ve 4.9’da sırasıyla serbest ve immobilize Pektinaz için termal

kararlılık grafikleri verilmektedir.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

İnkübasyon süresi (saat)

Kal

an A

ktiv

ite (%

)

Şekil 4.8.Serbest Pektinaz enziminin termal kararlılık grafiği.(▲):5oC, (□):25oC,

(■):50oC, (∆):60oC

Serbest Pektinaz’ın farklı inkübasyon süreleri sonunda kalan aktivitelerini

gösteren Şekil 4.8 incelendiğinde 5oC’de 16 saat inkübe edilen enzimin termal

kararlılığı yüksek olup inkübasyon sonunda kalan aktivitesi yaklaşık % 81’dir.16 saat

sonunda 25 ve 50oC’de inkübe edilen serbest Pektinaz enzimi başlangıç

aktivitelerinin sırasıyla % 75 ve % 68’ini korurken, 60oC’de 16 saat sonunda

başlangıç aktivitesinin % 19’nu koruduğu belirlenmiştir.

İmmobilize Pektinaz’ın termal kararlılığını veren Şekil 4.9 incelendiğinde,

immobilize enzimin termal kararlılığının serbest enzime göre çok farklı olmadığı

gözlenmektedir. İmmobilize Pektinaz’ın 5oC’de 16 saat inkübasyonu sonunda kalan

aktivitesi yaklaşık % 83 iken, 60oC’de 16 saat inkübasyonu sonunda kalan aktivitesi

% 27’dir.


34

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

İnkübasyon süresi (saat)

Kal

an A

ktiv

ite (%

)

Şekil 4.9. İmmobilize Pektinaz enziminin termal kararlılık grafiği.(▲):5oC,

(□):25oC, (■):45oC, (∆):60oC. Serbest Pektinaz’ın 5oC ve oda sıcaklığındaki (25oC) depolama kararlılığı

Şekil 4.10’da gösterilmektedir.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

Zaman (Gün)

Kal

an A

ktiv

ite %

Şekil 4.10. Serbest Pektinaz’ın Depolama Kararlılığı. (□):5oC, (■):25oC


35

Şekil 4.10’da görüldüğü gibi serbest Pektinaz enzimi 5oC ve 25oC

sıcaklıklarında 5 hafta depolanmıştır.Depolanan serbest enzim her iki sıcaklıkta da

benzer bir aktivite değişimi göstermektedir. 5oC ve 25oC’de depolanan iki enzimde

ikinci haftanın sonunda başlangıç aktivitelerinin % 92 ‘sini korumaktadırlar.

Şekil 4.11’de immobilize Pektinaz’ın 5oC ve 25oC depolama kararlılıkları

gösterilmektedir.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

Zaman (Gün)

Kal

an A

ktiv

ite %

Şekil 4.11. İmmobilize Pektinaz’ın Depolama Kararlılığı. (□):5oC, (■):25oC

Şekil 4.11’de görüldüğü gibi serbest enzim 5 hafta boyunca 5oC ve 25oC

sıcaklıklarında depolanmıştır. 5 hafta boyunca depolanan immobilize enzim yine

benzer bir aktive göstermiş 5 inci haftanın sonunda 5oC’de başlangıç aktivitesinin %

75’ini, 25oC’de ise % 76’sını korumuştur.


36

İmmobilize Pektinaz’ın kullanım sayısına bağlı olarak aktivitesindeki

değişimi Şekil 4.12’de görülmektedir.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25

kulanım sayısı

Kal

an a

ktiv

ite (%

)

Şekil 4.12. İmmobilize Pektinaz’ın tekrar kullanım kararlılığı

İmmobilize Pektinaz, 20 kullanımdan sonra başlangıç aktivitesinin % 94’ünü

koruyabilmektedir.

4.1.2. Pektinaz’ın Florisile İmmobilizasyonu

Pektinaz enzimi yaklaşık % 72 bağlanma yüzdesiyle florisil destek üzerine

bağlanabilmiştir. Fakat aktivite ölçümlerinden hiçbir sonuç alınamamıştır.

Çizelge 4.2. Pektinaz’ın Florisile İmmobilizasyonu

Enzim derişimi

(mg/ml)

Bağlanan protein

(mg protein)

% Bağlanma Aktivite

1 0.72 72 -

2 1.51 75 -

3 2.17 72 -

5 3.15 70 -

10 6.07 70 -


37

4.2. Tartışma

4.2.1.Pektinaz’ın Alginat Destek Üzerine İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu

Pektinaz’ ın alginat desteğe immobilizasyonunda Mondal ve Gupta (2003)

tarafından belirlenen yöntem kullanılmıştır. Pektinaz’ ın standart koşullar altında

alginat üzerine immobilizasyonu sonucunda başlangıçta ortamda bulunan protein

miktarının % 83’ ünün bağlandığı hesaplanmıştır. Enzim tutuklama yöntemi ile

alginat desteğe immobilize edilmiştir. İmmobilize enzimin aktivitesi substrat olarak

pektin kullanılarak Miller, (1959) tarafından belirlenen ve birçok araştırmacı

tarafından da kullanılan yöntem ile belirlenmiştir (Roy ve ark., 2003; Sardar ve ark.,

2005; Debing ve ark., 2006; Lei ve ark., 2007). Alginat kalsiyum iyonları varlığında

jel formuna dönüşmekte ve kalsiyum-alginat jeller oluşmaktadır. Ca-alginat jeller

genellikle tüm hücreyi ya da enzimlerin tutuklanması için kullanılmaktadırlar.

Alginat geri dönüştürülebilir şekilde çözülür-çözülmez bir polimerdir.Bu polimer

Ca+2 iyonları ile çöktürülebilir ve diyaliz ile veya EDTA’nın eklenmesiyle geri

çözülebilir (Roy ve ark., 2003). Şimdiye kadar Pektinaz’ı naylon, iyon-değiştirici

reçine, deri ve kitin gibi çeşitli desteklere immobilize etmişlerdir. Alginat da son

zamanlarda geniş bir şekilde uygulama alanı bulan, enzimi jel halinde tutuklama

yöntemi ile immobilize edebilen bir destek ortamıdır (Li ve ark., 2007).

Roy ve ark., (2003), kitini hidroliz etmek için alginata immobilize edilmiş

Pektinaz kompleksini kullanmışlardır. Kovalent bağlarla yapılan immobilizasyon ile

kıyaslama yapmışlardır. Alginatın toksik etkisinin bulunmaması ve ekonomik

olmasından dolayı kitin hidrolizi için kolaylıkla kullanılabileceğini rapor etmişlerdir.

Alginat destek üzerine immobilize edilen Pektinaz’ın aktivitesi ve serbest

Pektinaz’ın aktivitesi farklı ortam pH’ larında ölçülmüş olup immobilizasyon

sonucunda immobilize Pektinaz’ ın optimum pH değerinin serbest Pektinaz’ ın

optimum pH’sına göre değişmediği, 5.0 olarak kaldığı belirlenmiştir (Şekil 4.1).

Literatürde immobilize ve serbest Pektinaz’ın pH değerinin 4.0 ile 5.0

arasında olduğu bildirilmektedir. Ancak farklı desteklere değişik yöntemlerle

immobilize edilmiş olan Pektinaz enzimi için pH 3.0-5.0 aralığında değişen farklı


38

optimum pH değerleri rapor edilmiştir (Li ve ark., 2007). Optimum pH‘daki bu

kaymaların büyüklüğü ve yönü enzimin immobilize edildiği desteğin özelliklerine,

desteğin aktifleştirilmesi için kullanılan metoda ve immobilizasyon yöntemine bağlı

olarak değişmektedir.

Enzimatik reaksiyonlarda reaksiyon ortamında bulunan iyonlar enzim

stabilizasyonunun sağlanmasında önemli rol oynamaktadır. Düşük iyon derişimine

sahip tampon çözeltiler enzim stabilizasyonunu sağlamada yetersiz kalırken yüksek

tampon derişimi de enzimle substrat derişimini azaltacağı için aktivitenin düşmesine

neden olabilmektedir. Ancak Pektinaz enziminin aktivitesi tampon derişiminden

reaksiyon ürününün galakturonik asit olması nedeniyle de tampon çözeltilerin

tamponlama kapasitesi önem kazanmaktadır. Şekil 4.2 ‘de serbest Pektinaz

aktivitesinin tampon derişiminden fazla etkilenmediği, immobilize Pektinaz

enziminin ise tampon derişiminden etkilendiği görülmektedir. Literatürde Pektinaz

aktivitesi üzerine iyonik gücün etkisi araştırılmamıştır. % maksimum aktivite-

sıcaklık grafiğine göre serbest enzimin immobilize enzimle farklı sıcaklıklarda

optimum gösterdiği görülmektedir. Serbest enzim 50oC’ de optimum sıcaklık

gösterirken immobilize enzim 45oC’ de göstermektedir. Bu sonuçlar serbest enzim

için literatürdeki enzimlerle benzer sonuçlar göstermektedir. (Chellegetti ve ark.,

2002; Silva ve ark., 2005; Barense ve ark., 2001).

Aktivasyon ile ilgili bulgulara göre immobilize enzimin katalizlediği

reaksiyonun aktivasyon enerjisi (Ea) 29 Jmol-1K-1 ve serbest enzimin katalizlediği

reaksiyonun aktivasyon enerjisi 32 Jmol-1K-1 olarak hesaplanmıştır.İmmobilize

enzimin denaturasyona uğradığı sıcaklık 44,3oC olarak hesaplanmıştır.Aktivasyon

enerjisi ile ilgili araştırmaya pek rastlanmamıştır.

Serbest Pektinaz’ ın alginat desteğe immobilizasyonu sonucu hem KM hem de

Vmax değerlerinin azaldığı görülmektedir (Çizelge 4.1). İmmobilizasyon işlemi

sonunda enzimin desteğe bağlanma miktarının yüksek olmasına rağmen (yaklaşık

%83) immobilize Pektinaz’ ın aktivitesinin daha düşük görülmesi desteğe tutuklanan

enzim molekülünün hareketinin kısıtlanmış olmasına ve üç boyutlu yapısında

oluşabilecek değişime bağlanabilir. Bunun dışında destek çevresinde proteinlerin üst

üste birikerek difüzyon problemlerinin görülmesi söylenebilir.


39

Literatürde enzimin katalitik etkinliğinin bir ölçüsü olarak Vmax / KM değeri

kullanılmıştır. Vmax/KM değerinin endüstriyel uygulamalarda en etkili enzimin seçimi

için kullanışlı bir parametre olduğunu rapor etmişlerdir (Roy, 2003; Ortega, 2004;

Sardar, 2005).

Bulgularımızda serbest enzim için Vmax / KM değeri 8,6 immobilize enzim

için Vmax / KM değeri 55,9 olarak bulunmuştur. İmmobilize enzim serbest enzimle

karşılaştırıldığında daha yüksek katalitik etkinlik göstermiştir.Yani immobilize

enzim daha fazla poligalakturonik asit hidroliz etmiştir. Sardar ve ark., (2005),

Pektinaz’ı Con-A bağlı agaroz desteğe immobilize ettiklerinde immobilize enzim

serbest enzime göre yaklaşık 1.3 kat daha yüksek katalitik etkinlik göstermiştir.

Ortega ve ark., (2004), üç farklı ticari Pektinaz enzim kompleksindeki (Rapidase

C80, Pectinase CCM, Pectinex 3XL) poligalakturonaz aktivitesinin kinetik

özelliklerini karşılaştırmışlardır. 44,4 değeri ile en yüksek Vmax/KM değerini gösteren

Rapidase C80’ni en etkili enzim kompleksi olarak rapor etmişlerdir.

Enzimin kararlılığı verimliliğini etkileyen faktörlerden bir tanesidir. Enzimler

solüsyonları içinde depolanmaları süresince çok kararlı değillerdir ve zamanla

aktivitelerini kaybederler. Belirli zaman aralıklarında enzim aktivitelerinin

ölçülmesiyle depolama kararlılıkları belirlenir. Serbest ve immobilize enzimin 5oC

ve 25oC’ de depolama kararlılıklarının yüksek olduğu Şekil 4.10 ve Şekil 4.11’ de

görülmektedir.

Şekil 4.8 ve 4.9 immobilize ve serbest Pektinaz’ ın farklı sıcaklıklardaki

inkübasyon süresi ile kalan aktivite miktarları arasındaki ilişkiyi göstermektedir.

5oC’de 16 saat inkübe edilen enzimin termal kararlılığı yüksek olup inkübasyon

sonunda kalan aktivitesi yaklaşık % 81’dir.16 saat sonunda 25 ve 50oC’de inkübe

edilen serbest Pektinaz enzimi başlangıç aktivitelerinin sırasıyla % 75 ve % 68’ini

korurken, 60oC’de 16 saat sonunda başlangıç aktivitesinin % 19’nu korumaktadır.

İmmobilize Pektinaz’ın termal kararlılığını veren Şekil 4.9 incelendiğinde,

immobilize enzimin termal kararlılığının serbest enzime göre çok farklı olmadığı

gözlenmektedir. İmmobilize Pektinaz’ın 5oC’de 16 saat inkübasyonu sonunda kalan

aktivitesi yaklaşık % 83 iken, 60oC’de 16 saat inkübasyonu sonunda kalan aktivitesi

% 27’dir.


40

İmmobilize enzimlerin tekrar tekrar kullanılabilmesı enzimin endüstride

kullanılması açısından önemli bir faktördür. Artan kararlılık immobilize enzimi

serbest enzimden daha avantajlı hale getirmektedir (Lei ve ark., 2007c). Pektinaz’ın

tekrar kullanımını gösteren grafik Şekil 4.12’de verilmektedir. Optimum koşullarda

20 kullanımdan sonra kalan aktivite başlangıç aktivitesinin % 94’üdür.Literatürde

Concanavalin A’ ya bağlı agaroz’a immobilize edilmiş Pektinaz’ın aktivitesini

kaybetmeksizin 3 kez tekrar kullanılabildiği bildirilmektedir (Sardar ve ark., 2005) .

4.2.2. Pektinaz’ın Florisil Desteğe İmmobilizasyonu

Pektinaz enzimi gluteraldehitle aktifleştirilmiş florisil destek üzerine yaklaşık

% 72 bağlanma yüzdesiyle bağlanmıştır. Fakat enzim bağlandıktan sonra aktivitesini

kaybetmiş yani inaktif hale gelmiştir. Enzimin aktivite göstermemesi amino grubu

üzerinden olan bağlanma bölgesinin enzimin aktif bölgesi olduğunu

düşündürmektedir.

5.SONUÇLAR ve ÖNERİLER Fadile YENER

41

5.SONUÇLAR 5.1.Sonuçlar 1. Serbest ve immobilize Pektinaz’ın en yüksek aktivite gösterdikleri pH değerleri

5.0 olarak belirlenmiş olup immobilizasyon işleminin enzimlerin % aktivite- pH

profilini etkilemediği belirlenmiştir.

2.İmmobilize Pektinaz’ın optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 45ºC olarak

belirlenmiştir.

3. İmmobilize Pektinaz için Vmax değeri 69,4 µmolgalakturonikasit dk-1 mg protein -1

bulunurken, KM değeri 8,04 olarak bulunmuştur. Katalitik etkinlik olarak verilen

Vmax/KM değeri serbest enzime göre çok daha büyük olduğu belirlenmiştir.

4. İmmobilize Pektinaz için hem oda sıcaklığında hem de 5°C’de belirlenen

depolama kararlılıklarına göre immobilize enzimin 5°C’deki depolama

kararlılığının daha yüksek olduğu saptanmıştır

5. İmmobilize Pektinaz, 20 kullanım sonunda başlangıç aktivitesinin % 94’ünü

korumuştur.

6. İmmobilize Pektinaz, farklı sıcaklıklardaki farklı inkübasyon süreleri sonunda

kalan aktiviteleri incelendiğinde, 5°C’de 16 saat inkübasyon sonunda başlangıç

aktivitesinin % 83’ünü koruduğu belirlenmiştir.

7. Florisil üzerine immobilize edilen Pektinaz’ın çeşitli denemeler sonucunda pektini

hidroliz etmemesini, enzim molekülünün desteğe aktif bölgesinden bağlanmış

olmasına ve bağlanan enzim molekülünün konformasyonunda oluşabilecek

değişikliklere bağlayabiliriz. Bu nedenle florisil Pektinaz immobilizasyonu için

uygun bir destek değildir diyebiliriz.

5.SONUÇLAR ve ÖNERİLER Fadile YENER

42

5.2. Öneriler

1. Kompleks bir enzim olan Pektinaz’ın poligalakturonaz aktivitesi dışındaki

aktiviteleride farklı çalışma koşullarında ölçülüp kıyaslama yapılabilir.

2. Pektinaz için uygun bir yöntem olan tutuklama yöntemi daha farklı

polimerlerle denenebilir.

3. Serbest veya immobilize Pektinaz’ın farklı pH ve derişimlerdeki tampon

çözeltileri içerisindeki depolama kararlılıkları araştırılabilir.

4. Florisil destek kullanılarak yapılan immobilizasyon işleminin ortam koşulları

değiştirilerek(pH gibi) immobilizasyon işlemi tekrarlanabilir.

5. Florisille başarılı olamayan kovalent bağlı immobilizasyonu kıyaslayabilmek

için yine bağlanma ile immobilize olabilecek destekler araştırılıp

uygulanabilirlikleri incelenebilir.

6. Pektinaz enzimi immobilizasyon için daha sık kullanılan polisakkarit destek

ortamlarına değişik ara kollar bağlanarak immobilizasyon yapılabilir.

43

KAYNAKLAR

ACAR, J., GÖKMEN, V., 2004. Meyve ve Sebze İşleme Teknolojisi. Cilt 1-Meyve

ve Sebze Suları Üretimi, 674 s.

AEHLE, W., 2004. Enzyme in Industry. Production and Applications. 484 s.

AKSÖZ, E., AKSÖZ, N., 1985. Pektik Enzimler (derleme).Biyokimya

Dergisi,10:38-51.

ASLAN, Y., TANRISEVEN, A., 2007. Immobilization of Pectinex Ultra SP-L to

Produce Galactooligosaccharides. Journal of Molecular Catalysis, 45:73-77.

BARENSE, R.I., CHELLEGATTI, M.A.S.C., FONSECA, M.J., SAID, S., 2001.

Partıal Purification and Characterization of Exopolygalacturonase II and III

of Penicillum Frequentans. Brazilian Journal of Microbiology, 32:327-330.

BONNIN, E., GOFF, A.L., KORNER, R., VIGOROUX, R., ROEPSTORFF, P.,

THİBAULT, J.-F., 2001. Hydrolysis of Pectins with Different Degrees and

Patterns of Methylation by Endopolygalacturonase of Fusarium moniliforme.

Biochimica et Biophysica acta, 1596:83-94.

BOTELLA, C., DIAZ, A., ORY, I., WEBB, C., BLANDINO, A., 2006. Xylanase

and Pectinase Production by Aspergillus awamori on Grape Pomace in Solid

State Fermentation. Process Biochemistry, 42:98-101.

BUSTO, M.D., TRAMONTIN, K.E.G., ORTEGA, N., MATEOS, M.P., 2006.

Preparation and Properties of an Immobilized Pectinlyase for the Treatment

of Fruit Juices. Bioresoure Technology, 97:1477-1483.

CHELLEGATTI, M.A., SAID, S., 2002. Purification and partial characterization of

exopolygalacturonase I from Penicillum frequentans. Microbiological

Research, 157:19-24.

CESTINO, S.M.C., FREITAS, S.M., MEDRANO, F.J., SOUSA, M.V., FILHO,

E.X.F., 2006.Purification and Characterization of a Novel Pectinase from

Acrophialophora nainiana with Emphasis on Its Physicochemical Properties.

Journal of Biotechnology, 123:33-42.

44

COSTA, S.A., TZANOV, T., PAAR, A., GUDELJ, M., GUBITZ, G.M., PAULO,

A.C., 2001. Immobilization of Bacillus SF on Alumina for the Treatment of

Textile Bleacing Effluents. Enzyme and Microbial Technology, 28:815-819.

DEBING, J., PEIJUN, L., STAGNITTI, F., XIANZHE, X., LI, L., 2006. Pectinase

Production by Solid Fermentation form Aspergillus niger by a New

Prescription Experiment. Ecotoxicology and Environmental Safety, 64:244-

250.

EKŞİ, A., 1988. Meyve Suyu Durultma Tekniği, Gıda Teknolojisi Derneği Yayın

no:9, 127s.

LEI, Z., BI, S., 2007a. The silica-coated chitosan particle from a layer-by-layer

approach for pectinase immobilization. Enzyme and Microbial Technology,

40:1442-1447.

LEI, Z., BI, S., 2007b. Preparation and Properties of Immobilized Pectinase onto the

Amphiphilic PS-b-PAA Diblock Copolymers. Journal of Biotechonology,

128:112-119.

LEI, Z., BI, S., HU, B., YANG, H., 2007c. Combined Magnetic and Chemical

Covalent Immobilization of Pectinase on Composites Membranes Improves

Stability and Activity. Food Chemistry,(baskıda).

LI, T., W, N., LI, S., ZHAO, Q., GUO, M., ZHANG, C., 2007. Optimization of

Covalent Immobilization of Pectinase on Sodium Alginate Support.

Biotechnol Lett, 29:1413-1416.

LOWRY, O.H., ROSENBROUGH, N.J., FARR, A.L., RANDALL, R.J., 1951.

Protein Measurement with Folin Phenol Reagent.Journal of Biological

Chemistry, 193:265-275.

MILLER, G.L., 1959. Use of Dinitrosalicyclic Acid Reagent for Determination of

Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 31:426-428.

MONDAL, K., MEHTA, P., GUPTA, M.N., 2004. Affinity Precipitation of

Aspergillus niger Pectinase by Microwave-treated Alginate. Protein

Expression and Purification, 33:104-109.

45

ORTEGA, N., DIEGO, S., MATEOS, M.P., BUSTO, M.D., 2004. Kinetic properties

and thermal behaviour of polygalacturonase used in fruit juice clarification.

Food Chemistry 88:209-217.

PATIL, S.R., DAYANAND, A., 2006. Exploration of Regional Agrowastes for the

Production of Pectinase by Aspergillus niger. Food Technol. Biotechnol.

44.289-292.

PHUTELA, U., DHUNA, V., SANDHU, S., CHADHA, B.S., 2005. Pectinase and

Polygalacturonase Production by a Thermophilic Aspergillus fumigatus

Isolated from Decomposting Orange Peels. Brazilian Journal of

Microbiology, 36:63-69.

ROY, I., SARDAR, M., GUPTA, M.N., 2003. Evaluation of Smart Bioconjugate of

Pectinase for Chitin Hydrolysis. Biochemical Engineering Journal, 16:329-

335.

ROY, I., SARDAR, M., GUPTA, M.N., 2003. Hydrolysis of Chitin by Pectinex.

Enzyme and Microbial Technology, 32:582-588.

SARDAR, M., GUPTA, M.N., 1998. Alginate Beads as an Affinity Material for

Alpha Amylases. Bioseparation, 7:159-165.

SARDAR, M., GUPTA, M.N., 2005. Immobilization of Tomato Pectinase on Con A-

Seralose 4B by Bioaffinity Latering. Enzyme and Microbial Technology,

37:355-359.

SILVA, D., TOKUIOSHI, K., MARTINS, E.S., SILVA, R.D., GOMES, E., 2005.

Production of Pectinase by Solid-State Fermentation with Penicillium

Viridicatum RFC3. Process Biochemistry, 40:2885-2889.

SMIDSROD, O., SKJAK, B.G., 1990. Alginate as Immobilization Matrix for Cells.

Trends Biotechnol., 8:71-78.

SOARES, M.M.C.N., SILVA, R., GOMES, E., 1999. Screening of Bacterial Strains

for Pectinolytic Activity: Characterization of the Polygalacturonase

Produced by Bacillus sp. Revista de Microbiologia, 30:299-303.

SUMNER, J.B., 1921.Dinitrosalicyclic acid:A reagent for the estimation of sugar in

normal and diabetic urine. J.Biol.Chem. 47:5-9.

46

SUNNOTEL, O., NIGAM, P., 2002. Pectinolytic Activity of Bacteria Isolated from

Soil Two Fungal Strains During Submerged Fermentation. World Journal of

Microbiology and Biotechnology, 18:835-839.

TELEFONCU, A., 1997. Enzimoloji.Yüksek Lisans Yazokulu. 21-27 Eylül 1997.

Kuşadası, Aydın, Türkiye.446 s.

TUKEL, S.S., ALPTEKIN, O., 2004. Immobilization Kinetics of Catalase onto

Magnesium Silicate. Process Biochemistry, 39:2149-2155.

WANG, G., MICHAILIDES, T.J., BOSTOCK, R.M., 1997. Improved Detection of

Polygalacturonase Activity Due to Mucor piriformis with a Modified

Dinitrosalicylic Acid Reagent. Techniques, 87:161-163.

WEETHALL, H.H., 1976. Covalent Coupling Methods for Inorganic Support

Metarials. Methods of Enzmology, 44:134-148.

Willants, W.G., Mc-Cartney, L., Mackie, W., Knox, J.P., 2001. Pectin: cell biology

and structural prospects for functional analysis. Plant Molecular Biology, 47:

1-27.

47

ÖZGEÇMİŞ

1982 yılında Gaziantep’de doğdum.İlk ve orta öğrenimimi Adana’da

tamamladıktan sonra 2000 yılında Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi

Kimya Bölümünde üniversite eğitimime başladım ve 2004 yılında mezun olduktan

sonra aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünde

Yüksek Lisans eğitimime başladım.

Documents

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜİmmobilizasyon yöntemleri çeşitli şekillerde sınıflandırılmakla beraber Şekil 1.1’de verildiği gibi sınıflandırmak