Uleiuri Volatile

CAPITOLUL I1.1. Generaliti

Uleiurile volatile sunt produse izolate din plante sau organe ale acestora printr-un procedeu fizic care au o anumit volatilitate (mai mare sau mai mic) i posed un miros agreabil caracteristic sursei din care provin.

Sunt cunoscute i sub numele de uleiuri eterice sau eseniale, i de obicei denumirea lor este dat de numele popular al plantei din care se extrag.

Cea mai important caracteristic a acestor amestecuri, care confer de altfel i valoarea economic deosebit, o constituie mirosul specific. Acesta st la baza utilizrii lor n parfumerie, n produsele cosmetice i n industria alimentar. Multe uleiuri volatile au caliti terapeutice deosebite, o parte dintre acestea fiind cunoscute i folosite nc din antichitate.

1.1.1. RspndireUleiurile volatile sunt relativ rspndite n regnul vegetal, unele familii fiind foarte bogate n astfel de substane, att ca numr de specii ct i cantitativ.

De obicei, uleiurile volatile se gsesc n plante superioare (circa 50 de familii) aparinnd unor ordine ale angiospermelor (Asterales, Laurales, Magnoliales, Zimgiberales, etc.) sau gimnospermelor (Pinales), dar se cunosc i ciuperci productoare de lactone sesquiterpenice i de sesquiterpene volatile, sau alge care elaboreaz sesquiterpene halogenate.

Dei compuii terpenici sunt carecteristici regnului vegetal, s-au semnalat cteva monoterpene biosintetizate de bacteriile din sol, de insecte (probabil feromoni), precum i de unele sesquiterpene i diterpene de origine animal.

1.1.2. Localizare

Sinteza i acumularea de uleiuri volatile au loc fie n exteriorul plantei, n perii glandulari (Asteraceae, Geraniaceae, Laminaceae, etc.) i n papile, fie n interiorul plantei, n celulele secretorii, n spaiile intercelulare (n canalele secretorii), fie n pungi secretorii (Anacardiaceae, Rutaceae, Myrtaceae).

Uleiurile volatile se pot acumula n toate organele plantei, ns n cantiti diferite. Astfel le putem ntlni n: rdcini, frunze, flori, fructe, lemnul tulpinilor sau n scoar.

Coninutul n uleiuri volatile al plantelor se situeaz de cele mai multe ori sub 1%, rareori putnd atinge15% sau chiar mai mult, n produsul uscat al unor plante.

Denumirea de plante aromatice este atribuit acelor specii care conin o cantitate mai mare de ulei volatil (cel puin 0,1-0,2%), care au un miros suficient de perceptibil sau care se preteaz unei exploatri rentabile din punct de vedere economic.

n afar de acestea, mai sunt nsa i alte specii care, dei au miros caracteristic, conin totui substane terapeutice care intra n compoziia uleiurilor volatile.

1.1.3. Biosinteza uleiurilor volatileBiosinteza substanelor odorante are loc n frunze, unde se gsete cea mai mare parte a lor i rmne pana la nflorire.

La nflorire, uleiurile volatile migraz n flori, iar o parte se consum n procesul de fecundare. Dup fecundare acesta se acumuleaz n fructe i semine sau are loc o migrare n frunze, scoar i rdcin.

Pe parcursul maturizrii plantelor, compoziia uleiurilor volatile se modific: n plantele tinere acestea conin n principal hidrocarburi terpenice i compui cu molecul mai simpl, n timp ce organele de reproducere conin uleiuri eterice mai bogate n compui oxigenai.Dei rolul lor n organismul vegetal este parial cunoscut, uleiurile eterice au ntrebuinri multiple. Se cunosc mai mult de 3.000 de uleiuri volatile care sunt caracterizate fizico-chimic, dintre care circa 150 se produc pe scar industrial.

1.2. Compoziia chimic a uleiurilor volatileUleiurile volatile sunt amestecuri complexe (5000-7000 de constituieni chimici) n care predomin constituienii mono- i sesquitrpenici, dar conin i compui aromatici, frecvent derivai fenil propanici, iar foarte rar se ntlnesc diterpene.

Compuii terpenici pot fi hidrocarburi sau derivai oxigenai (oxizi, alcooli, aldehide, cetone, acizi) sau produi de reacie ai acestora (esteri, eteri).Compuii terpenici sunt substane de origine vegetal ce intr n compoziia natural a amestecurilor moleculare care conduc la formarea uleiurilor volatile (eseniale, eterice).

izopren Terpenii se clasific dup numrul de uniti izoprenoidice (uniti terpenoidice) n monoterpeni, sesquiterpeni, diterpeni, triterpeni, tetraterpeni i terpeni superiori.O unitate terpenoidic are formula general C5H8. Exemple de compusi terpenici :

Tipuri de terpene prezente n esene:( alcooli: geraniol, linalol;

( esteri: acetat de linalil;

( aldehide: citral, citronelal;

( cetone: menton, camfor, tuion;

( eteri - oxizi: eucaliptol (de remarcat faptul c anumii compui (timol, carvaacrol) cu toate c au o structur aromatic sunt de origine terpenic).

Uleiurile eseniale conin de asemenea i astfel de compui, a cror biogenez este divers de cea a terpenoidelor , ca compui aromatici derivai de fenilpropan. Biogeneza fenilpropanului - n urma fixrii unei molecule de acid piruvic, acidul shikimic duce la obinerea acidului prefenic, precursor al fenilalaninei, al tirozinei sau al altor compui C6-C3 (derivaii de fenilpropan); astfel fiind obinui diveri compui naturali, dintre care: unii prezint la nivelul catenei laterale o legtur etilenic: derivaii acidului i aldehidei cinamice; alii prezint grupri funcionale -OH sau OCH3 la nivelul nucleului aromatic; ali compui cu structura C6-C1 sunt n egal msur derivai din seria fenilpropanic, obinui prin degradare oxidativ a catenei laterale C3.

Compui derivai din Fenil-propan

Alcoolii monoterpenici exist de obicei liberi sau esterificai n uleiurile volatile. n ultima vreme au fost izolate o serie de monoterpenoide sau derivai fenil-propan i sub form heterozidic (glucozide ale eugenolului, nerolului, geranionului, acidului neric i acidul geranic).

Acizii organici - sunt compui alifatici, ciclici sau aromatici, care conin una sau mai multe grupe carboxilice. Sunt larg raspndite n regnul vegetal, att n stare libera ct i sub form de sruri i esteri.

Foarte frecvent ntlnii sunt acizii: oxalic, malic, citric, tartric, chimic, cafeic etc. Acidul oxalic formeaz cu ionii de calciu oxalatul de calciu, care se prezint sub form de incluziuni cristaline caracteristice din punct de vedere sistematic. Multi acizi organici se gsesc n combinaie cu alcaloizii. Produsele bogate n acizi organici sunt ntrebuinate pentru corectarea gustului neplcut al unor medicamente. Acizii organici contribuie la stabilizarea vitaminei C n produsele vegetale.

Exemple de acizi organici :

acidul acetic acidul citric acidul oxalicProdui de reacie ai terpenelorEsterii sunt derivai funcionali ai acizilor carboxilici, care provin prin eliminarea unei molecule de H2O, format din H-ul grupei -OH de la un alcool sau fenol i grupa -OH de la carboxilul unui acid.Cei doi radicali hidrocarbonati R si R' pot fi identici sau diferiti, alifatici sau aromatici.Esterii pot prezenta mai multe tipuri de izomerie, n funcie decomplexitatea moleculelor lor. Acizii carboxilici i esterii cu aceeai formul molecular i sunt izomeri de funciune. De exemplu, acetatul de metil i formiatul de etil au aceeai formul molecular (C3H502) cu acidul propanoic i sunt izomeri de funciune cu acesta.

CH3-CH2-COOH CH3-COO-CH3 H-COO-CH2-CH3 acid propanoic acetat de metil formiat de etil

Eterii sunt o clas de compui chimici organici care au n molecul o grup funcional eter - un atom de oxigen legat de doi radicali alchil. Un exemplu tipic este solventul i anestezicul dietil eter, denumit n mod simplu doar "eter", Formula general: (Ar)R-O-R(AR)

Exemple de eteri:Eteri simetrici : C2H5-O-C2H5 eter etilicEteri nesimetrici: CH3-O-C2H5 etil-metil eter; CH3-O-C6H5 feil-metil eterEteri ciclici:

n compoziia uleiurilor eseniale ntr n proporii mult mai mici i:

- acizi organici cu GM reduse(acid acetic, acid valerianic, acid izovalerianic);- cetone cu GM reduse;- cumarine volatile( bergapten).1.3. Proprietile uleiurilor volatileUleiurile volatile sunt soluii formate prin dizolvarea reciproc a numeroi compui diferii care pot fi lichizi sau solizi. Principalii componeni fac parte din clasa terpenoidelor i sunt hidrocarburi terpenice i derivaii lor oxigenai: alcooli, aldehide, cetone, fenoli, acizi, esteri i derivai ai acestora. n cantiti mici se gsesc i compui din aproape toate clasele: hidrocarburi alifatice (alcani, alchene i acetilene ) i aromatice, lactone, tropolone, cumarine, carotenoide, flavone, lignani, compui cu azot sau sulf. Ca i n cazul uleiurilor vegetale, compoziia unui ulei variaz n funcie de condiiile pedoclimatice locale, agrotehnic, tehnologia de extracie.1.3.1. Proprieti fizice

nsi compoziia variat i complex face ca proprietaile uleiurilor volatile s varieze n limite largi. La temperatura camerei marea majoritate sunt lichide cu vscozitate mic, ns exist i excepii. Acele uleiuri care conin mai multe componente cu puncte de topire ridicate (camfor, mentol, anetol ) se pot solidifica (primele 2 ) sau transforma n suspensii de solide n lichide (al treilea), ca urmare a cristalizrii acestor elemente. Componentele uleiurilor volatile distil ntre 150 0C i 300 0C.

Uleiurile au densiti ntre 0,80 i 1,10 g/cm3, majoritatea avnd ns densiti mai mici dect apa. Indicele de refracie variaz ntr-un interval cuprins ntre 1,4500-1,5600.

n marea lor majoritate sunt insolubile n ap sau au o solubilitate parial indus de prezena unor componente hidrofile. Sunt solubile n solveni organici (alcooli, hidrocarburi, cetone), n grsimi animale i uleiuri vegetale, solubilitatea fiind dependent de compoziie.

Sunt nemiscibile n ap, dar prin agitare i imprim acesteia o reacie slab acid, proprietate ce sta la baza obinerii apelor aromate. Sunt miscibile cu alcool concentrat, uneori chiar i cu cel diluat, cu solveni organici (eter, eter de petrol, cloroform).

1.3.2. Proprieti chimice

Proprietile chimice ale uleiurilor sunt suma proprietilor individuale ale componentelor, neexsistnd proprieti specifice amestecurilor respective. Cele mai multe reacioneaz cu bazele alcaline avnd loc reacii de neutralizare i /sau hidroliz. Sunt de obicei caracterizate prin indice de esterificare care se calculeaz ca diferena ntre indicele de saponificare i cel de aciditate.

Datorit prezenei n uleiurile volatile a unor compui nesaturai i a unor grupe oxidabile sunt sensibili la aciunea unor oxidant, sensibilitate care se accentueaz sub aciunea luminii i a energiei termice. Oxigenul din aer poate afecta ireversibil calitatea uleiurilor, printr-un mecanism similar auto - oxidrii uleiurilor vegetale.

Deoarece sunt uor degradabile n prezena aerului, luminii i cldurii se pstreaz n sticle brune, pline, nchise etan, ferite de lumina, cldur i umiditate excesiv. Degradrile ce se produc n timpul conservrii necorespunztoare sunt legate de activitatea unor atomi de carbon cu formarea unor carbocationi extrem de reactivi (terpenil, linalil, neril, geranil)

Pentru a prentmpina astfel de degradri se elimina parial sau total, un constituent sau un grup de constitueni (hidrocarburi). Se obin astfel uleiuri deterpenate, rectificate sau lipsite de anumii constitueni.1.4. Controlul calitii uleiurilor volatile

Controlul uleiurilor volatile const n determinarea caracterelor organoleptice (aspect, culoare, gust, miros) a miscibilitii n alcool etilic, a constantelor fizico-chimice i n analize cromatografice (Cromatografie pe strat subire = TLC, Cromatografie de lichide de nalt performan = HPLC, Cromatografie i spectrometrie de mas = GC/MS), pentru precizarea profilului cromatografic.

n esuturi, uleiul volatil poate fi evideniat prin colorarea cu sudan III (se coloreaz n portocaliu), tincture Alkanma (rou-portocaliu) sau acid osmic (brun), dar rezultatele sunt neconcludente, deoarece i ali constitueni (lipide, rezine) se coloreaz asemntor.

Pentru precizia proprietilor odorante ale uleiurilor volatile sau a plantelor aromatice n stare proaspt, s-au ncercat diverse metode pentru a determina, calitativ i cantitativ, fraciunea care impresioneaz analizatorul olfactiv (metoda olfactometric).

Aceasta const n identificarea i dozarea gaz-cromatografic a constituienilor unui ulei volatil, prin antrenare cu un gaz purttor (de exemplu azotul), la nceput i respectiv dup dou ore de funcionare a aparatului.

Diferena dintre cele doua cromatograme obinute reflect capacitatea de volatilizare i implicit de impresionare a organelor de sim.

Fiecare ulei volatil prezint anumite constante fizico-chimice specifice, cum ar fi : densitatea la 20 0C , puterea rotatorie specific, indicele de refracie la 20 0C, indicele de aciditate, indicele de esterificare, indice de saponificare, temperatura de inflamare.

Pentru identificarea constituenilor uleiului volatil se recomand cercetri cromatografice. Cromatografia pe strat subire ca faza mobil amestecuri de solveni (toluen, benzen, acetat de etil, cloroform, diclormetan, etc.) n diferite proporii, iar ca revelatori: anilina sulfuric (pentru derivaii fenil-propanici, fenoli, cetone i alcooli), anisaldehida sulfuric (pentru compuii carbonilici) etc.

Metodele moderne utilizeaz pentru determinarea structurii constituenilor uleiurilor volatile, gaz-cromatografia de lichide de nalta presiune (HPLC) combinat cu spectrometria de mas sau rezonana magnetic nuclear (RMN), protonic (RMP) dar i spectre Ramann. Ele permit precizarea profilului cromatografic al fiecrui ulei volatil studiat (stabilirea constituienilor din amestec i cantitile acestora).

Determinarea cantitii de ulei volatil dintr-un produs vegetal se poate realiza gravimetric (prin cntrirea uleiului volatil obinut printr-una din metodele amintite) sau volumetric (prin cntrirea uleiului volatil separat n aparatul Neo-Clevenger - metoda oficial). Dozarea constituienilor se realizeaz prin metode adecvate, n funcie de structura acestora.

Astfel, alcooli se determin prin indicele de acetil, esterii prin titrarea acizilor rezultai din hidroliza alcalin (saponificare), aldehidele se determina prin condensarea cu hidroxilamina clorhidric i tratarea acidului clorhidric eliberat, iar aldehida cinamic i fenolii prin transformarea n compui hidrofili cu reactivi adecvai (bisulfit de sodiu, hidroxid de sodiu) i msurarea diferenei fa de volumul final al uleiului volatil, la balonul Cassia.1.5. Utilizrile uleiurilor volatileProdusele de parfumerie i cosmetic au existat din cele mai vechi timpuri, istoria lor suprapunndu-se istoriei omenirii. Parfumul este un amestec de substane naturale i sintetice care dezvolt mirosuri plcute i care creeaz o stare de calm sau o stare de euforie. Mirosul este cel mai tulburtor dintre simuri, el pune n micare zone fiziologice strine de raiune , apeleaz la memoria afectiv dnd profunzime i intensitate secvenelor vizuale i auditive. Mirosul plcut este o prim cerin al noului cod al bunelor maniere. Parfumul are i rolul de a masca mirosul neplcut al corpului.

Exista o form de terapie a bolilor psihice i chiar fizice prin utilizarea parfumurilor aa cum exist i o form de terapie prin muzic.CAPITOLUL II 2.1. Metode de obinere i de prelucrare a uleiurilor volatileSepararea unei arome din mediul su natural este o problem dificil, deoarece aceasta trebuie izolat sau concentrat cu un minimum de pierderi, de modificri de compoziie si fr introducerea unor impuriti. Toate operaiile inadecvate se traduc prin degradarea compoziiei naturale.

Ca i uleiurile vegetale, uleiurile volatile se extrag din acele pri ale plantei n care sunt prezente cantiti mai mari:

- flori ( trandafiri, tuberoze, iasomie);- flori i frunze ( menta, geranium, violete);- fructe (coriandru, anason, fenicul);- semine ( nucoar, ambret);- coaja fructelor (portocal, lmai, bergamot);- rdcini (angelic, vetiver, ghimbir);- lemn sau scoar (cantal, cedru, scorioar);- boboci florali i muguri (cuioare, plop negru, coacz);- planta ntreag (salvie, cimbru, busuioc);- ace i ramuri (pin, chiparos, brad).n anumite cazuri substanele odorante se extrag din exudatele naturale sau patologice ale plantelor (rezine, balsamuri, oleogumirezine, gumirezine).2.2. Metode clasice de extracie a uleiurilor volatilen ordinea ponderii produciei, n prezent se folosesc urmtoarele procedee de extracie:

- antrenarea cu vapori;- extracia cu grsimi;- extracia cu solveni organici;- extracia cu fluide supercritice;- presarea;- absoria pe solide.Antrenarea cu vapori de ap

Antrenarea uleiului volatil este precedat de difuzia lui din celulele vegetale la suprafa. Uscarea duce la o evaporare parial a uleiului volatil ca urmare a evaporrii acestuia.n funcie de condiiile de lucru se cunosc patru variante de antrenare cu vapori de ap: la foc direct, n curent de vapori, cu abur sub presiune i la presiune redus.

Extracia

Extracia este operaia prin care unul sau mai muli componeni dintr-o faz (lichid sau solid) sunt trensferai ntr-o alt faz lichid nemiscibil (sau parial nemiscibil) adus n contact cu prima. Operaia se bazeaz pe diferena de solubilitate a acestor componeni ntr-un solvent corespunztor sau n doi solveni nemiscibili.

Extracia cu grsimi animale

Procedeul are la baza solubilitatea uleiurilor volatile n grsimi i afinitatea grsimilor pentru mirosuri.

Extracia cu grasimi animale restituie cel mai fidel mirosul florilor, extracia parfumurilor avnd loc fara alterarea compoziiei naturale.

Extracia cu grsimi animale se poate efectua la rece i este denumit enfleurage sau la cald ( maceraie ). Extracia cu solveni organici

Operaia consta n epuizarea materiei prime vegetale cu un solvent i apoi izolarea principiilor odorante sau aromatice prin evaporarea solventului prin distilare. n funcie de natura materiei prime, se disting trei categorii de extracte :

uleiuri concrete se obin din materii vegetale proaspete, n general flori; rezinoide (oleorezine) se extrag din materii vegetale deshidratate, rini, balsamuri, gumirezine, oleogumirezine i produse de origine animal; uleiuri absolute, concretele de pomade i tincturile rezult la extracia cu alcool etilic a concretelor i rezinoidelor respective a pomadelor de enfleurage i maceraie, respectiv a produselor de origine animal.

Extracia cu gaze lichefiate i lichide supercritice

n principiu nu exist diferene ntre extracia cu gaze lichefiate sau fluide supercritice i extracia clasic (cu solveni lichizi ), mecanismele implicate fiind aceleai.

Extracia prin presareProcedeul const n presarea mecanic, cu diferite dispozitive, a cojilor fructelor, dup ndeprtarea sucului. mpreun cu uleiul volatil sunt eliminate din coaj i alte substane: mucilagii, pectine, proteine, colorani liposolubili, apa. Uleiul volatil se separa prin decantare i se filtreaz.

DistilareaPrin distilare se nelege trecerea unei substane lichide n stare de vapoti, urmat apoi de condensarea vaporilor pentru a reveni n stare lichid. Operaia de disilare este folosit fie pentru identificarea unei substane pure, care distil la temperatur constant, fie pentru a purifica o substan de impuriti volatile, fie pentru a concntra componenii mai volatili din amestecul iniial.

Absoria pe materiale solide

Procedeul este cunoscut de mult vreme sub numele de enfleurage de pulberi, fiind aplicat pentru fabricarea pudrelor cosmetice. Parfumul se extrage din absorbant cu eter de petrol, care se alimenteaz n coloana cu un debit de 2-4/min/m2.2.3. Metode moderne utilizate n controlul uleiurilor volatileAvnd n vedere complexitatea compoziiei, cele mai des utilizate metode moderne pentru studiul uleiurilor volatile sunt gaz-cromatografia cuplat cu spectrometria de mas (GC-MS) i headspace-gaz-cromatografia (HS-GC).2.3.1. Analiza GC/MS a uleiurilor volatile de rozmarin

Rozmarinul, este o plant aromatic si medicinal, cunoscut nc din antichitate, care poate fi folosit att n stare proaspt ct si uscat. Rozmarinul conine o cantitate mare de ulei volatil care are proprieti tonice, colagoge, poate fi folosit ca antiseptic pulmonar, coleric, are proprieti stomahice, antidiuretice i antireumatice. De asemenea uleiul volatil de rozmarin este folosit n parfumerie, fitocosmetic, medicin, industria alimentar, a buturilor alcoolice dar i n agricultur.

Pentru evaluarea variabilitii compoziionale a uleiurilor volatile n funcie de stadiul vegetativ, s-au recoltat, la un interval de timp de ase luni, probe de rozmarin de vrste diferite iar extracia uleiului volatil s-a realizat prin hidrodistilare, dup cum urmeaz: o cantitate de 50 g de frunze verzi de rozmarin, respectiv uscate i mcinate au fost introduse mpreun cu 750 ml ap distilat n balonul de distilare al instalaiei de dozare a uleiurilor volatile din produse vegetale. n balonul de distilare au fost adugate i cteva bile de sticl n vederea omogenizrii fierberii.

Materialul vegetal a fost supus distilrii timp de 3h. La sfrsitul distilrii, uleiul volatil de rozmarin a fost colectat i msurat volumul obinut. Probele de ulei volatil au fost pstrate la frigider, n fiole bine nchise, pn n momentul analizei. Pentru ndeprtarea eventualelor urme de ap, n fiolele de pstrare a fost adugat sulfat de sodiu anhidru.

Pentru determinarea compoziiei uleiurilor volatile prin diferite metode gaz-cromatografice a fost preparat o soluie de 2% ulei volatil n hexan.

Analiza uleiului esenial de rozmarin prin GC-MS i HS/GC-MS s-a realizat cu ajutorul unui aparat echipat cu un autosampler.

Coloana utilizat pentru separarea constituenilor uleiurilor volatile a fost o coloan capilar cu diametrul intern de 0,25mm i grosimea filmului de 0,25m.

Pentru o separare i o identificare ct mai bun a constituenilor uleiurilor volatile, s-a recurs la optimizarea metodei de analiz. Principalul parametru de care depinde separarea compuilor din uleiurile volatile este programul de temperatur al coloanei cromatografice.

Prin urmare, au fost testate 5 programe de temperatur:

a) 50.0oC (2 min) la 250.0oC (10 min) cu 3oC/min;

b) 60oC (5 min) la 160oC cu 4oC/min la 240oC (1min) cu 15oC/min;

c) 60oC (1 min) la 180oC (15 min) cu 3oC/min;

d) 40oC (1 min) la 250oC (5 min) cu 4oC/min;

e) 60oC (10 min) la 220oC (10 min) cu 4oC/min la 240oC cu 1oC/min.

Ceilali parametrii ai metodei GC-MS au fost: temperatura injectorului 250.0oC; volumul de injectare 1.0L; presiunea 37,1 kPa; viteza liniar 32.4 cm/s; raportul de splitare 1:200; gaz purttor heliu; detector MS; temperatura sursei ionice 250.0oC; temperatura de interfa 250.0oC; intervalul de scanare 40-400u i viteza de scanare 769u/s, datele fiind obinute cu ajutorul softului aparatului.

Analiza HS/GC-MS a uleiurilor volatile de rozmarin

Tehnica headspace este utilizat pentru extracia compuilor volatili din diferite matrici biologice. Pentru o extracie ct mai eficient a compuilor de arom/volatili din rozmarin a fost necesar optimizarea urmtorilor parametrii: metoda, masa prob (g), temperatura de incubare (oC).Dup incubare, 250 L din faza de headspace a fiolei cu prob au fost introdui n injectorul gaz-cromatografului i analizai.Optimizarea metodei de analiz HS/GC-MS

Numrul de compui separai, respectiv identificai din proba de frunze uscate de rozmarin variaz n funcie de metoda de headspace utilizat. Prin compararea rezultatelor obinute cu metoda n care timpul de incubare a fost de 40 de minute i metoda n care timpul de incubare a fost de 30 de minute, se poate constata c mrirea timpului de incubare nu duce la o cretere a numrului de compui separai, n ambele cazuri fiind separat acelai numr de compui volatili, i n aproximativ aceeai concentraie (figura1).

Figura 1. Cromatograma HS/GC-MS pentru proba de frunze uscate de rozmarin incubate

la 60oC timp de 40 de minute, respectiv 30 de minute Un alt parametru variat a fost masa de prob supus incubrii. S-a constatat c pentru acelai timp i temperatur de incubare, se separ un numr mai mare de compui dac masa de prob este mai mic. Astfel, folosind metoda n care s-a analizat o prob de 1g, au fost separai 18 compui, n timp ce pentru o prob de 0,5g au fost separai 19 compui. Prin urmare, micornd masa de prob incubat, scade concentraia de -pinen din faza de headspace a fiolei, putnd fi astfel detectai compui minoritari precum -linaloolul.Cea mai mare influen asupra numrului de compui volatili separai o are ns temperatura de incubare (figura 2).

Temperatura de incubare, C

Figura 2. Influena temperaturii de incubare asupra numrului de compui separai

Din proba de rozmarin incubat la 30oC au fost separai i identificai 4 compui, i anume: -pinenul, camfenul, 3-octanona i eucaliptolul, ceea ce sugereaz faptul c aceti compui sunt constituenii cei mai volatili ai rozmarinului fiind responsabili de aroma i mirosul caracteristic perceput de om. La temperatura de incubare de 40oC ncep s se extrag n faza gazoas noi compui volatili, precum: -pinenul, -mircenul, o-cimenul i limonenul. Dac incubarea probelor de rozmarin se face la 60oC sunt extrai i -felandrenul, -terpinenul, -terpinen i camforul. n cazul incubrii probelor de frunze uscate de rozmarin la temperaturi de 95oC, 7 noi compui au fost separai fa de cazul n care probele au fost incubate la temperatura de 80oC, i anume: 1-octen-3-ol, alfa-terpineol, ylangen, cariofilen, alfacariofilen i doi compui neidentificai. Prin urmare, mrind temperatura de incubare, att timpul de incubare ct i masa de prob supus incubrii pot fi reduse considerabil.

Evaluarea statistic a datelor la analiza compuilor volatili din rozmarinDatele obinute n urma determinrii, cu ajutorul tehnicii GC-MS si HS/GC-MS, a compoziiei uleiurilor volatile de rozmarin, au fost analizate folosind metode de statistic multivariant, metode numerice de interpolare, sau analiza corespondenelor.

n figura 3 este reprezentat grafic variaia compoziiei uleiului volatil de rozmarin n funcie de vrst i de perioada de recoltare.

Figura 3. Variaia numrului de compui separai i a concentraiei acestora pentru

probele de ulei volatil de rozmarin analizate

Dup cum se poate observa, majoritatea compuilor separai au concentraia cuprins n intervalul 0-5%. De asemenea, concentraiile principalilor componeni ai uleiului volatil de rozmarin se pstreaz n aceleasi intervale: -pinen (30-35%), camfor (13-18%) i eucaliptol (7-11%), indiferent de vrsta plantei sau de perioada de recoltare a acesteia. Unele diferene n compoziia uleiului volatil de rozmarin apar ns la nivelul compuilor minoritari.

Avnd n vedere c recoltarea probelor de frunze de rozmarin, folosite pentru extracia uleiului volatil, s-a fcut la un interval de 6 luni , utiliznd metode numerice de interpolare i analiza corespondenelor s-a estimat compoziia chimic a uleiului volatil de rozmarin n lunile intermediare celor n care s-a fcut recoltarea, inndu-se cont de compoziia global a probelor de ulei volatil de rozmarin (figura 4).

Figura 4. Evoluia n timp a compoziie chimice a uleiului volatil de rozmarin extras

Astfel, n ceea ce privete compuii majoritari, pentru -pinen i camfor s-a constat o cretere a concentraiei odat cu vrsta, n timp ce pentru concentraia de eucaliptol s-a nregistrat o scdere. n decursul unui an, cantitatea cea mai mare de camfor s-a estimat a fi n lunile de primvar.

2.3.2. Studiul unor principii active din plante prin GC/MS

Plantele sunt tot mai mult studiate pentru efectul terapeutic benefic. Componentele lor bioactive sunt de o mare varietate i deosebit de importante pentru sntatea uman. Extractele de plante sunt folosite pentru efectul lor terapeutic, antiparazitar, antifungic i citostatic.

Speciile de ment cultivate sunt menta neagr i menta alb. Cea mai cultivat specie de ment este cea neagr, Mentha piperita officinalis rubescens camus. Aceast specie are o recolt de ulei voaltil mai mare dect menta alb. Rolul terapeutic al mentei s-a observat n efectul antispastic i antiinflamator, n tulburrile digestive, efect ce este

atribuit componentelor eseniale.

Substanele naturale bioactive din uleiul de ment demonstreaz inhibiia acetilcolinesterazei. Acidul citric cu mentol au un efect antiacneic i mentonele cu mentol au un efect antialergic. Alte utilizri ale compuilor din plante sunt n cosmetic i n industria alimentar, datorit proprietilor active ale componentelor lor i pentru activitile lor genotoxice.

Hibridul natural Mentha piperita (Labiatae), cunoscut i ca peppermint, crete n zonele temperate i este compus din Menta aquati/ Menta de ap i Menta Spicale/ Spearmint. Exist trei varieti de Mentha piperita L:

- varietatea vulgaris sole ( Mitcham), cea mai raspndit n lume;

- varietatea sylvestris sole (Ungaria);

- varietatea officinalis sole.

Materiale i metode

S-a utilizat microextracia lichid-lichid (LLE) din ceai medicinal, agitnd timp de 15 minute 1 gram plant cu 2 ml etanol i ap distilat (1:1 v/v ) ntr-o baie de ap la 45C. Dup rcire s-a efectuat o extracie (3:3:1 v/v/v) extract, ap distilat i solvent A (acetat de etil, clorur de metilen, hexan) ntr-o fiol de 2 ml cu capac. S-a agitat 2 minute, iar dup centrifugare s-a injectat 1 l din supranatant.

Metoda e precis i rapid pentru stabilirea componenilor activi ce caracterizeaz diferite genotipuri de plante. Puritatea soluiilor i solvenilor a fost testat prin GC/MS. Mentha piperita L eupiperita var. officinale fam. Rubescens camus , menta neagr i Mentha crispa L sin Mentha spicata au fost obinute de la Institutul Agronomic Cluj-Napoca. Extract hidroalcoolic: 1 gram plant uscat i zdrobit a fost amestecat cu 20 ml etanol i 20 ml ap distilat i lsat la macerat la temperatura camerei, timp de 2 zile.

Pentru experiment, s-au folosit florile i tulpinile, dup care o cantitate de 0,6 ml din macerat s-a amestecat cu 0,6 ml de ap distilat i 0,2 ml solvent A (acetat de etil:hexane:methylen choricle, 5:1:1 , v/v/v). Noul amestec a fost agitat 2 minute i 4l au fost injectai n cromatograf. Analiza GC i GC/MS a fost efectuat imediat dup extracie.

Componentele au fost identificate cu ajutorul spectrometriei de mas. Procedura de extracie a amestecului standard s-a realizat astfel: 30 l amestec standard s-au adugat n 0,9 ml soluie compus din etanol, ap distilat i solvent. Toate acestea au fost amestecate timp de 2 minute dup care a fost adugat 1 l 3-hepten-2-on la soluia obtinu, iar 1l a fost injectat folosind un injector cu autosampler. Extracia de amestec standard (n=4) a fost folosit pentru o ct mai mare precizie a procedurii de extracie. Mentha piperita a fost extras din frunze pe trei ci:

1 gram de plant uscat a fost introdus n 20 ml etanol, timp de 1 or la 45C, apoi 3 l au fost injectai n GC i analizat cu ajutorul GC/MS;

1 gram de plant uscat a fost introdus n 40 ml soluie (ap, etanol ) pentru 1 or la 45C; 0,9 ml extract, 0,9 ml ap distilat i 0,3 ml solvent A au fost amestecai, iar din acest amestec s-au prelevat 3 l pentru a fi analizai pic GC/MS;

1 gram plant uscat s-a introdus n 20 ml soluie clorur de metilen-aceton (1:1 v/v) la 45C timp de 1 or, dup care 3 l din soluia obinut au fost injectai i analizai prin GC/MS.

Mentha crispa L a fost extras din frunze n 40 ml etanol, ap distilat, fiind pstrat timp de 1 or la 4C, urmat de extracia cu solvent, precum n modul prezentat mai sus. Rezultate experimentale

Pentru analiz au fost folosite diferite tipuri de ment. Dintre acestea, cinci au fost cumprate uscate din pia: P1 de la un magazin privat de ierburi, P2 de la un magazin de stat de ierburi, P3 menta alb a fost culeas din pdure , P4 menta neagr a fost culeas din pdure i P5 - de la o grdina privat. P6 Mentha piperita L. piperita si P7 Mentha crispa L. au fost cultivate la Intitutul Agronomic Cluj-Napoca.

Identificarea compuiilor organici din plante este important deoarece separarea i cunoaterea structurii lor chimice constituie pasul esenial n explicarea aciunii lor terapeutice caracteristice. S-a observat c un ulei volatil are mai muli compui principali dintre care unul este caracteristic, compus de baz, care d savoarea i aroma uleiului.

2.3.3. Optimizarea metodei de extracie cu dioxid de carbon supercritic a uleiului esenial din seminele de Alpinia oxyphyllaAlpinia oxyphylla este o plant medicinal chinezeasc foarte important. Aceasta a fost utilizat drept vasodilator, analgezic, agent antimbtrnire, anticancer i antihipersensibilitate dar i pentru a preveni ulcerul grastric. Uleiul esenial de Alpinia oxyphylla a fost extras cu solvent sau prin distilare cu abur sau cu ap, iar compoziia chimic a acestuia a constat n: uleiuri volatile, terpene, flavone, taurin, vitamina B, vitamina C i microelemente (Mn, Zn, K, Na, Ca, Mg, P, Fe, Cu etc.).

n mod obinuit, uleiul esenial este extras din diferite plante prin extracie cu solvent organic sau prin distilare cu abur/cu ap; ultimele dou metode se efectueaz la temperaturi ridicate, care pot conduce la degradarea compuilor instabili termic i la formarea unor compui nedorii, n timp ce extracia cu solveni organici pune probmele n ceea ce privete reziduul ce rmne n ulei, care poate avea posibile efecte secundare asupra sntii umane.

Extracia cu dioxid de carbon supercritic (SC-CO2) reprezint o metod nou de extracie a uleiului esenial. La punctul critic (sau peste acesta) al dioxidului de carbon (temperatur de 31,3C i presiune de 7,4 MPa), acesta i schimb proprietile fizice de gaz, prelund proprietile fizice ale unui fluid. Principiul extraciei SC-CO2 se bazeaz pe puterea de dizolvare pe care dioxidul de carbon o posed. Spre deosebire de extracia cu abur, cea cu dioxid de carbon supercritic se realizeaz la temperaturi relativ joase i poate preveni degradarea termic a produilor. Finalizarea acestei metod const n depresurizarea sistemului, moment n care dioxidul de carbon devine gaz i se pierde imediat n atmosfer, motiv pentru care produii de extracie nu conin reziduuri de dioxid de carbon. Uleiurile eseniale extrase prin aceast metod pot fi bine separate, fiind considerate uleiuri de cea mai bun calitate.

Deoarece SC-CO2 este un solvent hidrofob, polaritatea acestuia poate fi modificat prin adugarea unor reactivi polari. Din acest motiv, metoda este potrivit pentru extracia terpenelor i a sesquiterpenelor, care reprezint compui hidrofili. Datorit toxicitii sczute, a efectului redus asupra mediului i a faptului c nu este inflamabil, dioxidul de carbon supercritic este considerat un solvent verde.

Materiale i metode

Sistemul de producere a fluidului supercritic a fost achiziionat de la Applied Separation Inc, dioxidul de carbon de la Yi-Zhan Gas Enterprise, iar Alpinia oxyphylla a fost cumprat de la Tian-Yi Chinese Herb Co. n cazul tuturor extraciilor efectuate, fluxul dioxidului de carbon a avut o valoare de 1L/min.

Seminele de Alpinia oxyphylla au fost mcinate cu ajutorul unui concasor la temperatura camerei, timp de 1 minut (de trei ori), iar mciniul rezultat a fost cernut cu o sit. S-au cntrit aproximativ 700 g particule(W1), care apoi au fost uscate la 121C timp de 24 h. Dup scurgerea acestui timp, particulele au fost din nou cntrite (W2), iar coninutul de ap (A) a fost calculat aplicnd urmtoarea formul:

A = (W1 W2) W3 (1)

Experiment preliminar

Particulele uscate de semine au fost introduse n sistem (temperatur controlat), iar extracia s-a desfurat conform manualului care a nsoit sistemul. Sistemul a fost alimentat cu un flux bine stabilit (1L/min) de dioxid de carbon sub form de gaz (din butelii). Pentru finalizarea extraciei, alimentarea cu dioxid de carbon a fost oprit, iar presiunea din vasul de extracie a fost eliberat manual.

Pentru acest experiment, temperatura i presiunea la care s-a realizat extracia au fost de: 40, 45 sau 50C, respectiv 10, 15, 20, 25, 30, 35 i 40 MPa; timpul de extracie a fost de 30 sau 60 minute. n total s-au efectuat 42 extracii, fiecare dintre acestea fiind repetat; uleiul esenial rezultat n urma fiecrei extracii a fost cntrit, iar randamentul a fost calculat cu urmtoarea formul:

(Y) = W3 (W2 x (1 A)) x 100 % (2)

unde Y este randamentul uleiului esenial, W3 reprezint masa uleiului esenial, W2 este masa pudrei de semine, iar A reprezint cantitatea de ap din pudra de semine uscate, calculat cu formula (1).

Condiiile optime de extracie

Pentru determinarea condiiilor optime, extraciile s-au efectuat la presiuni de 20, 30 i 40 MPa, la temperaturi de 45, 55 i 65C, timp de 1, 2, respectiv 3 ore.

Rezultate i discuii

nainte de a stabili condiiile optime de extracie, s-a efectuat un experiment preliminar pentru a cerceta efectele temperaturii, presiunii i ale timpului de extracie asupra randamentului de extracie a uleiului esenial de Alpinia oxyphylla. Extracia s-a realizat la 45C, la apte presiuni diferite (10, 15, 20, 25, 30, 35 i 40 MPa), timp de 30 min. Dup cum se poate observa n figura 5, presiunea a avut o influen major asupra randamentului.

Figura 5. Efectul presiunii asupra randamentului de extracie a uleiului esenial de Alpinia oxyphylla

Exceptnd extracia realizat la 40 MPa, n cazul celorlalte se poate observa o cretere a randamentului odat cu creterea presiunii pn la 30 MPa. Randamentul a sczut la extracia efectuat la 40 MPa dar, cu toate acestea, a fost de dou ori mai mare dect cel rezultat n urma extraciei la 10 MPa.

Se poate sesiza faptul c presiunea ridicat favorizeaz extracia; de asemenea, la presiune ridicat, randamentul de extracie crete odata cu creterea temperaturii. Pe msur ce presiunea a fost mrit de la 10 la 20 MPa, randamentul n ulei a crescut de la 0,64 la 0,89% la 40C si de la 0,35 la 1,22% la 50C.

n tabelul 1 sunt prezentate presiunea, temperatura i timpul de extracie pentru 15 determinri. Randamentele acestor determinri au fost calculate cu ajutorul formulei (2).Tabelul 1. Randamentele celor 15 uleiuri eseniale de Alpinia oxyphyllaNr. extracieTimp (h)Temperatur (C)Presiune (MPa)Randamentul uleiului esenial (%)

1365302,80

2345302,05

3165302,56

4145301,70

5355402,40

6355202,19

7155402,33

8155201,36

9265402,27

10265202,09

11245402,42

12245201,53

13255301,87

14255301,91

15255301,93

CONCLUZII- uleiurile volatile sunt produse izolate din plante sau organe ale acestora printr-un procedeu fizic care au o anumit volatilitate (mai mare sau mai mic) i posed un miros agreabil caracteristic sursei din care provin;- coninutul n uleiuri volatile al plantelor se situeaz de cele mai multe ori sub 1%, rareori putnd atinge15% sau chiar mai mult, n produsul uscat al unor plante;- biosinteza substanelor odorante are loc n frunze, unde se gsete cea mai mare parte a lor i rmne pana la nflorire;- uleiurile volatile sunt amestecuri complexe n care predomin constituienii mono- i sesquitrpenici;

- compuii terpenici sunt substane de origine vegetal ce intr n compoziia natural a amestecurilor moleculare care conduc la formarea uleiurilor volatile;

- la temperatura camerei marea majoritate a uleiurilor volatile sunt lichide cu vscozitate mic;

- datorit prezenei n uleiurile volatile a unor compui nesaturai i a unor grupe oxidabile uleiurile volatile sunt sensibile la aciunea unor oxidant;- pentru identificarea constituenilor uleiului volatil se recomand cercetri cromatografice;n raport cu obiectivele studiilor de fa se pot evidenia urmtoarele concluzii generale:

n analiza compuilor volatili din rozmarin s-au atins urmoatoarele obiective:- s-au optimizat ca i metode de analiz a compoziiei uleiurilor volatile din rozmarin, tehnicile GC-MS i HS/GC-MS;- componenii principali ai probelor de ulei volatil de rozmarin analizate cu metoda GC-MS optimizat sunt: -pinenul, camforul si eucaliptolul, urmai de camfen, 3- octanon, -mircen, limonen, borneol, o-cimen;- prin incubarea probelor de ulei volatil de rozmarin la 40oC s-au determinat principalii compui volatili responsabili de mirosul caracteristic rozmarinului perceput de om, i anume: -pinenul, camfenul, -pinenul, -mircenul, eucaliptolul, 3-octanona i camforul;- utiliznd metodele statistice avansate, s-a realizat o predicie a evoluiei chimice a uleiului volatil de rozmarin n funcie de vrst i perioada de recoltare;- n cadrul studiul efectuat pentru estimarea randamentului metodei de extracie cu dioxid de carbon supercritic a uleiului esenial din seminele de Alpinia oxyphylla, s- a urmrit dezvoltarea unui model i determinarea unor condiii optime de extracie;

- n urma acestui studiu, s-a observat faptul c presiunea aplicat reprezint cel mai importat parametru care influeneaz randamentul de extracie a uleiului;

-modelul dezvoltat i condiiile optime la care s-au efectuat extraciile, pot fi aplicate cu succes pentru obinerea pe scar larg a uleiului esenial din seminele de Alpinia oxyphylla.

BIBLIOGRAFIE

1. Gheorghe Boieru, Inginer Dumitru Puzdrea- Tehnologia uleiurilor vegetale; Editura Tehnica, Bucuresti.

2. E. Horoba, Gh. Cristian, L. Horoba - Tehnologii de valorificare a produselor naturale; Editura Corson, Iasi.

3. Atti-Santos, Ana Cristina, M. Rossato, G. Fernandez Pauletti, Luciana Duarte Rota, J. C. Rech, Marcia Regina Pansera, Fabiana Agostini, Luciana Atti-Serafini, P. Moyna, 2005, Physico-chemical evaluation of Rosmarinus officinalis L. essential oil, Brazilian Archives Biology Technol., 48 (6), 1035-1039;4. Bicchi, C., Chiara Cordero, Erica Liberto, Barbara Sgorbini, Patrizia Rubiolo, 2008, Headspace sampling of volatile fraction of vegetable matrices, 1184, 220-233;5. Jorge, Katia, L. C. Trugo, 2003, Discrimination of different hop varieties using headspace gas-chromatographic data, J. Braz. Chem. Soc., 14 (3), 411- 415;

6. Kovacevic, M., Milica Kac, 2002, Determination and verification of hop varieties by analysis of essential oils, Food Chem., 77, 489-494;

7. O.Cozar, 2010, Studii spectroscopice i teoretice pe sisteme moleuclare complexe de interes biomedical;8. Hen-Yi Ju, Kuo-Chuan Huang, Jiann-Hwa Chen, Yung-Chuan Liu, Chieh-Ming J. Chang, Chih-Chen Lee, Cheng Chang, Chwen-Jen Shieh, 2010, Optimization of the Extracion of Alpinia oxyphylla Essence oil in Supercritical Carbon Dioxide, J Am Chem Soc 87, 1063-1070;6