19.1.2016

1

FERMENTACIJAFERMENTACIJA

Bakterije mlečne kiseline

ULOGA STARTERA U PROCESIMA FERMENTACIJE

UVODUVOD

BAKTERIJE MLEČNE KISELINE – „HALLMARK“ industrije mlekaKomercijalni značaj „dairy fermentation industry“ – druga  po redu proizvodnja (nakon proizvodnje alkoholnih  pića)Ključnu ulogu imaju  prvenstveno rodovi Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, PediococcusVeliki istraživački napor naučne zajednice ka spoznaji fiziologije, biohemizma i genetičkog „make up“  BMK u odnosu na industrijski (TEHNOLOŠKI) VAŽNA SVOJSTVA: produkcija mlečne kiseline, proteoliza proteina mleka (kazein),  osetljivost na bakteriofage, kao i druga svojstva koja determinišu ultimativni kvalitet finalnih proizvoda ‐ produkcija egzopolisaharida, metabolizam citrata –produkcija aromogenih jedinjenja, sinteza bakteriocina

OVA SVOJSTVA su „PLASMID‐BORNE“

UVODUVOD

„GENE‐CLONING SYSTEM“ ‐ stabilna i kontrolisana ekspresija svih „dairying‐relevant genes“ po njihovoj inserciji u hromozom bakterijskog domaćinaTokom zadnjih 25 godina

PROMENE – snažno i definisa‐no tržište – automatizacija i racionalizacija industrije mleka; potrošač osetljiv  na mnoga „HEALTH and ENVIRONMENTAL ISSUES“, uz zahtev većeg i bolje Informisanog izbora – OPTIMIZACI‐JA FERMENTACIJE kroz starter kulturestabilnih performansi

19.1.2016

2

UVODUVOD

Izuzetna finansijska pomoć EU kroz sponzorisanje  tzv. „LONG‐TERM RESEARCH“ kroz nekoliko sukcesivnih programa pod kapom BIOTECHNOLOGY PROGRAMME – 56 laboratorija iz 42 istraživačke institucije participirale u integrisanom „STARLAB projektu“

1. Cell engineering of L. lactis2. LAB with modified proteolytic properties in milk fermentation3. Control of bacteriophage development in LAB4. The molecular biology and genetics of thermophilic LAB5. LAB as cell factories for the production and delivery of mucosal 

immunogens6. Carbon catabolite control in food grade lactobacilli 

LAB INDUSTRIAL PLATFORM

POTRAGAPOTRAGA

KONVENCIONALNE METODE POBOLJŠANJA – vremenski duge „screening“ protokole u cilju selekcije sojeva ili mutanata postojećih sojeva koji ispoljavaju nova i/ili poboljšana svojstva

Praktična aplikacija – upotreba BACTERIOPHAGE INSENSITIVE MUTANTS (BIM) u industriji siraI dalje opstaje  i koristi se za povećanje „GENETIČKOG POOL‐a“ starter kultura (zamerke: duge, zahtevne proceedure i teško za predvideti kako će se selekcionisani sojevi pokazati u komercijalnoj praksi)

Kasne 1980. – te – aplikacija rekombinantne DNA tehnologije; modifikacija sojeva na veoma precizan način i generisanje „custom‐designed“ kultura sa specijalizovanim funkcijama

“PROBIOTIC ACTIVE SUBSTANCE” ‐ Naidu,Bidlack and Clemens, 1999 – celularni kompleks BMK

19.1.2016

3

ZAŠTO?ZAŠTO?

Najstariji način konzervisanja hrane – PRINCIP PROBE I POGREŠKE –kiselokoagulišući sirevi – preteča svih ostalih vrsta sirevaMikrobna fermentacija hrane – 6000 BCPrvobitni cilj konzervisanje: mikrobna konverzija UH do kiseline i/ili alkohola; potrošnja kiseonika,  produkcija antimikrobnih sastojaka –supresija rasta MO kvara

MIKROBIOLOŠKA STABILNOST PROIZVODA plus DODATNI KVALITET

WHY FERMENTED PRODUCTS ? WHY FERMENTED PRODUCTS ?

Nutritivna vrednost – probavljivost/svarljivost, sadržaj esencijalnih nutrijenata

Predigestija proteina, UH – bolja tolerancija jogurta kod laktoza intolerantnih osobaFermentisana mleka – izvor biološki aktivnih komponenti – BMK (probiotici), njihovi metabolički produkti, ili komponente koje nastaju po digestiji proteina mleka aktivnošću indogenih enzima mleka : peptidi sa opoidnom, antikancerogenom, antihipertenzivnom, imunomodulatornom aktivnošću

Represija patogena i MO kvara: sniženje pH na osnovu produkcije organskih kiselina, kompeticija za hranjive materije, snižavanje redoks potencijala, produkcija specifičnih inhibitornih jedinjenja ‐ bakteriocini

StatistikaStatistika

Bulletin No. 35 IDF – 22 kg po glavi stanovnika (prosečna godišnja potrošnja fermentisanih proizvoda u Evropi)

8,5 biliona kg fermentisanog mleka/godini108 CFU/g – 8,5 x 1020 BMK4 x 10‐12 g – 3400 tone ćelija BMK godišnje u Evropi (fermentisana mleka)

19.1.2016

4

SLED TEHNOLOŠKIH POSTUPAKA U PROIZVODNJIFERMENTISANIH PROIZVODA

DefinicijaDefinicija

Starter kultura – mikrobni preparat; sadrži veliki broj ćelija najmanje jedne vrste MO; sa namerom se dodaje termički obrađenom  supstratu kako bi dobili fermentisani proizvod i to ubrzavanjem i kontrolisanjem procesa fermentacije (metabolička aktivnost)

Proizvodnja fermentisanih proizvoda – BIOPROCESIRANJESpontane fermentacije – aktivnost autohtonih sojeva poreklom iz sirovine i okruženja ‐ početak tradicionalne biotehnologije

ПРАВИЛНИК О КВАЛИТЕТУ ПРОИЗВОДА ОД МЛЕКА И СТАРТЕР КУЛТУРА (Објављен у „Службеном гласнику Републике Србије”, број 33 од 18. маја 2010. године)

Члан 72. Стартер културе су културе једног или више сојева, једне врсте или више

сојева, две или више врста микроорганизама, које својом активношћу усмеравају технолошки процес производње ферментисаних производа од млека и истовремено им дају одређена сензорска својства. Постоје два типа стартер култура, и то: мезофилни и термофилни.

Члан 73. Стартер културе могу бити течне, лиофилизоване или смрзнуте.

4) да 1 g лиофилизоване културе намењене за директну ферментацију од млека и производа од млека садржи најмање 3 х1010 живих ћелија (cfu|g);

5) да 1 g дубоко смрзнуте културе намењене за директну ферментацију млека и производа од млека садржи најмање 9 х109 живих ћелија (cfu|g).

ПРАВИЛНИК О КВАЛИТЕТУ ПРОИЗВОДА ОД МЛЕКА И СТАРТЕР КУЛТУРА 

(Објављен у „Службеном гласнику Републике Србије”, број 33 од 18. маја 2010. године) 

ПРАВИЛНИК О КВАЛИТЕТУ ПРОИЗВОДА ОД МЛЕКА И СТАРТЕР КУЛТУРА 

(Објављен у „Службеном гласнику Републике Србије”, број 33 од 18. маја 2010. године) 

19.1.2016

5

PODELAPODELA

SELEKCIONISANE I PRECIZNO DEFINISANE predvidljiva iponovljiva stopa acidifikacije, i razvijanja specifičnih senzornihkarakteristika – KONTROLA PROCESA FERMENTACIJE IDOBIJANJE PROIZVODA STANDARDNOG KVALITETA; mono imešovite kulture, mezofilne i termofilne, 2 tipa bakterija –producenti kiseline i producenti aromatičnih materija

NEDEFINISANE, TRADICIONALNE KULTUREprirodne, “wild‐type” BMK; iniciraju proces u odsustvukomercijalnih startera; neponovljivost ukusa kod tradicionalnihproizvoda – NSBMK – ne predstavljaju deo starter flore, ali se uvelikoj biomasi uspostavljaju tokom perioda zrenja, kaosekundarna flora

HistorijaHistorija

Zemlja 4,5 biliona godina stara, BMK 3 biliona godina populacija BMK se progresivno širi pojavom sisara pre 65 miliona 

godinauzgajanje stoke – pre 8000 godina – praksa proizvodnja fermentisane 

hraneprvi slikovni zapis na steli iz doba Ptolomeja u Starom Egiptu

Biblija – patrijarh Avram – pred tri anđela iznosi grušano mleko (Genesis VIII)

Dostupnost genomskih sekvenci BMK baca novo svetlo na evoluciju ovih MO kroz mleko kao supstrat (mikrosredinu – habitat – ekosistem);  gubitak i inaktivacija gena PLUS horizontalni transfer gena  PLUS metabolička simplifikacija

19.1.2016

6

HistorijaHistorija

Homer – Odiseja – prvi proizvođač sira Polyfemus – (Aristotel, Varro, Columella)Rimske legije – instrumental širenja tehnologije izrade sireva

CASEALE –zasebne prostorije u rimskim kućamaSrednji vek – manastiri, veliki feudalni posjedi

Doba Renesanse – sir nije zdrav, popularnost se vraća početkom 19. vekasistematska upotreba starter kultura – sredinom XX stoleća /Christian Hansen

fermentacija sa selekcionisanim intestinalnim MO – 1935. Shirota Institute for Research on Protective Bacteria

industrijska primena probiotskih MO – posle 1990. godine

BMKBMK

Grupa Gram pozitivnih, nesporogenih MO funkcionalno povezanih na osnovu sposobnosti da produkuju mlečnu kiselinu tokom homo‐ili heterofermentacije; fakultativno anaerobni sa fermentativnim metabolizmom

Katalaza negativni /u retkim slučajevima aktivnost pseudokatalaze

Morfološki oblici koka, štapića, kokobacili, hemoorganotrofi

Slabo proteolitični i lipolitični, kompleksni nutritivni zahtevi (purinske i pirimidinske baze, AK, vit B grupe)

Rod Oblik Katalaza Redukcija nitrata

Fermentacija Sadašnji rodovi

Betabacterium štapić ‐ ‐ hetero LactobacillusWeisella

Thermobacterium štapić ‐ ‐ homo Lactobacillus

Streptobacterium štapić ‐ ‐ homo, hetero LactobacillusCarnobacterium

Streptococcus koka ‐ ‐ homo StreptococcusEnterococcusLactococcusVagococcus

Betacoccus koka ‐ ‐ hetero LeuconostocOenococcusWeisella

Microbacterium štapić + + homo Brochothrix

Tetracoccus koka + + homo PediococcusTetragenococcus

Ključ za diferencijaciju BMK i komparacija sa sadašnjom taksonomijom

19.1.2016

7

Glavne filogenetske grupe BMKGlavne filogenetske grupe BMK

BMKBMK

Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus, by Broadbent

Lb. casei, by Broadbent

S. thermophilus, by Broadbent

Pediococcus spp.Leuconostoc spp.

Enterococcus faecalis

Mezofili (5oC – 45oC); pH 4,0‐4,5 (pH 9,6; pH 3,2)

211/19/2016

Industrijska primena BMKIndustrijska primena BMK

Starter kulture, pomoćne starter kultureZaštitne kultureProbiotici‐funkcionalna hranaGRAS status (“Generally Recognised As Safe”); FOOD GRADE organismsQPS koncept (“Qualified Presumption of Safety”) (Evropa)

19.1.2016

8

221/19/2016

Mehanizmi antagonizma BMKMehanizmi antagonizma BMK

Antagonizam ‐ inhibicija drugih (MO kvara ili patogenih vrsta) organizama putem kompeticije za  hranjive materije, ili produkcijom metabolita sa antimikrobnim delovanjem

Mikrobna interferencija ‐ efikasni nespecifični mehanizam kontrole uobičajen za sve populacije i sredine (niše) uključujući i namirnice; inhibicija rasta određenih MO od strane drugih članova habitata i to na osnovu kompeticije za hranjive materije, ostvarivanja nepovoljne sredine te kompeticije za adheziona mesta

231/19/2016

Metabolički produkti BMK sa antimikrobnim svojstvima

Metabolički produkti BMK sa antimikrobnim svojstvima

Produkt Glavni target organizmi

Organske kiselineMlečna kiselinaSirćetna kiselina

Truležne i Gram negativne bakterije, pojedine plesniTruležne bakterije, klostridije, pojedini kvasci i plesni

Hidrogen peroksid Patogeni i MO kvara posebno u namirnicama bogatim na sadržaju belančevina

EnzimiLaktoperoksidaza sistem sa H2O2

Lizozim (tehnologija rekombinantne DNK)Patogeni i MO kvara (mleko i proizvodi od mleka)Nepoželjni Gram pozitivni MO

Metaboliti male molekulske mase Reuterin (3‐OH‐propionaldehid)DiacetilMasne kiseline

Široki spektar bakterija, kvasci i plesniGram negativne bakterijeRazličite bakterije

Bakteriocininizin Pojedine BMK i Gram pozitivne bakterije, posebno 

sporogeni MO

STARTERISTARTERI

19.1.2016

9

KOMPONENTE STARTERA KOMPONENTE STARTERA 

Mozzarella sir – S. thermophilus, Lb. delbruecki, ili Lb. helveticusŠvajcarski sirevi – S. thermophilus, Lb. helveticus,Propionibacterium shermani

JOGURTNA KULTURA MODEL UDRUŽENOG RASTA ‐ PROTOKOOPERACIJA, METABIOZA

JOGURTNA KULTURA MODEL UDRUŽENOG RASTA ‐ PROTOKOOPERACIJA, METABIOZA

ACIDIFIKACIJA

RAZVIJANJE UKUSA

RAZVIJANJE TEKSTURE –produkcija egzopolisaharida

“Screening” testovi – pogodnost BMK kao startera“Screening” testovi – pogodnost BMK kao startera

Stopa acidifikacije

Promovisanje teksture/

arome

Proteolitičkaaktivnost

Kompatibilnostsa drugim sojevima

Rezistencija na bakteriofage,

Stabilnost tehnoloških

karakteristika

Posebni atributi

19.1.2016

10

GENERALNI KRITERIJUMI ZA STARTER KULTUREGENERALNI KRITERIJUMI ZA STARTER KULTURE

1. BEZBEDNOST

1.1. Starter organizam ne posjeduje aktivnost patogena i/ili toksičnu aktivnost1.2. Nisu nosioci prenosivih gena koji kodiraju svojstvo rezistencije na ANT

2. TEHNOLOŠKA EFIKASNOST

2.1. Starter MO dominiraju nad popratnom mikroflorom2.2. Starter MO ispoljavaju potrebnu metaboličku aktivnost

3. EKONOMSKI ASPEKT

3.1. Propagacija kultura mora biti isplativa sa ekonomske tačke gledišta3.2. Mogućnost konzervisanja postupcima zamrzavanja ili sušenje zamrzavanjem uz mali (zanemarljiv) gubitak aktivnosti3.3. Važna biotehnološka svojstva su stabilna pod definisanim uslovima skladištenjau periodu od nekoliko meseci3.4. Upotreba kultura što je moguće jednostavnija

GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK ‐homofermentacija

GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK ‐homofermentacija

GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK ‐heterofermentacija

GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK ‐heterofermentacija

19.1.2016

11

PEP / zavisni PTS sistemPEP / zavisni PTS sistem

LAKTOZA PERMEAZA/β GALAKTOZIDAZA SISTEMLAKTOZA PERMEAZA/β GALAKTOZIDAZA SISTEM

PROTEOLITIČKi SISTEM LAKTOKOKAPROTEOLITIČKi SISTEM LAKTOKOKA

19.1.2016

12

PEPTIDAZE BMKPEPTIDAZE BMK

METABOLIZAM CITRATA BMKMETABOLIZAM CITRATA BMK

BAKTERIOCINIBAKTERIOCINI

Heterogena grupa antimikrobnih proteina i peptida koji deluju antagonistički primarno prema blisko srodnim vrstama MOKlasifikacija (Klaenhammer, 1988)Klasa I (lantibiotici; mali, termostabilni, sadrže neuobičajene AK)Klasa II: IIa‐pediocinu‐slični bakteriocini sa antilisterija efektom; IIb‐dvokomponentni bakteriocini; IIc‐ostali bakteriocini Klasa III‐veliki (>30kDa) termolabilni proteiniKlasa IV‐kompleksni bakteriocini koji sadrže ugljenohidratnu i/ili lipidnu komponentu

19.1.2016

13

371/19/2016

381/19/2016

In vitro ispitivanje produkcije bakteriocina 

MEHANIZMI BORBE PROTIV BAKTERIOFAGAMEHANIZMI BORBE PROTIV BAKTERIOFAGA

TEHNOLOŠKE MERE•Primena startera sa sojevima 

neosetljivim na fage, odnosno koji nisu homologni

•Aseptični sistemi propagacije•Primena fag‐inhibitornih medija

•Rotacija startera•Kondicioniranje vazduha

•Izbegavanje generisanja aerosola•Čišćenje/hlorisanje

•CIP sistem•Segragacija starter soba od 

proizvodne opreme• Odgovarajući dizajn postrojenja

SELEKCIJA izlaganje 

koktelu bakteriofagaGENETSKI INŽENJERING

19.1.2016

14

INDUSTRIJSKA APLIKACIJA BMKINDUSTRIJSKA APLIKACIJA BMK

Lactococcus spp. (mleko)Lactobacillus spp. (mleko, meso, povrće, žitarice)Leuconostoc spp. (povrće, mleko)Pediococcus spp. (povrće, meso)Oenococcus oeni (vino)Streptococcus thermophilus (mleko)

Probiotski efekat, proizvodnja industrijskih hemikalija i bioloških produkata – biopolimeri, enzimi, etanol i mlečna kiselina; oralni nosači za digestivne enzime i antigene u sastavu vakcinaDeterminacija sekvenci genoma reprezentativne kolekcije BMKPrvi kompletni genom – L. lactis subsp. lactis IL403

Lactococcus spp.Lactococcus spp.

Prethodna Lancefield grupa N streptokoka

7 vrsta, 2 subvrste i 1 biovarLc. lactis – 2 subvrste i 1 biovar – Lc. lactis subsp. lactis; Lc. lactis subsp. cremoris; Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis

Habitat – zelene biljke; prirodni habitat za Lc. lactis subsp. cremoris nije potvrđen

Fosfoenolpiruvat‐ fosfotransferaza sistem (PEP‐PTS) – omogućava uspešno preuzimanje i fermentaciju La – prepoznatljiv habitat danas za većinu laktokoka čine proizvodi od mleka

19.1.2016

15

Lactococcus spp.   cont.‘Lactococcus spp.   cont.‘

Homofermentativni, mikroaerofilni, Gram pozitivni, rast pri 10oC, ali ne i pri 45oC, produkuju L (+) mlečnu kiselinuMorfologija: ovoidne ćelije, pojedinačno, u parovima ili lancima – nemoguće razlikovati od Leuconostoc, Streptococcus i Enterococcus spp.

Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis – posjeduje citrat permeazu – mogućnost iskorištavanja citrata i produkcije diacetila – svojstvo kodirano genima lociranim na plazmidu – nestabilna karakteristika – varijetet Lc.lactis subsp. lactis

Lactococcus spp.   cont.‘Lactococcus spp.   cont.‘

Lactococcus spp.   cont.‘Lactococcus spp.   cont.‘

19.1.2016

16

Lactococcus spp.   cont.‘Lactococcus spp.   cont.‘

Lactococcus spp.   cont.‘Lactococcus spp.   cont.‘

Važna biotehnološka svojstva – katabolizam La, produkcija proteinaza irezistencija na bakteriofage, ali i druge karakteristike – metabolizamsaharoze, galaktoze, manoze, glukoze, utilizacija citrata, DNA restrikcija imodifikacija, produkcija bakteriocina, rezistencija na anorganske ione –kodirana genima lokalizovanim na plazmidimaSpontani gubitak plazmida – učestale kultivacije u mleku ili promenauslova kultivacije ‐ genetski nestabilne karakteristike

Veoma zahtevni po pitanju hranjivih materija – proteini, peptidi,specifične AK, derivati nukleinskih kiselina, vit

Lactococcus spp.   cont.‘ [proteolitička aktivnost]Lactococcus spp.   cont.‘ [proteolitička aktivnost]

Koncentracija izoleucina, leucina, valina, histidina, metionina <1mg/L – 2%konačne gustine ćelija – zavisne od vlastititog proteolitičkog sistemaProteinaze ćelijskog zida, ekstracelularne peptidaze, Opp transportni sistem, transportni sistem za peptide (di‐ i tripeptide) i AK i intracelularne peptidaze

Ključni enzim – proteinaze (PI ili PIII tip proteinaza – PrtP) raskidanje više od 40% peptidnih veza u više od 100 različitih oligopeptida

Divlji sojevi laktokoka →1‐4 AK za rast; veća aktivnost konvertaza AK

19.1.2016

17

Lactococcus spp.   cont.‘ [glikolitička aktivnost]Lactococcus spp.   cont.‘ [glikolitička aktivnost]

Lac plazmid – geni koji kodiraju katabolizam La – simultani katabolizam GLU i GALLa se preuzima putem fosfoenol piruvat (PEP) zavisnog fosfotransferaza sistema (PEP‐PTS)GAL se katabolizuje putem TAGATOZA puta simultano tokom katabolizma GLU u okviru Embden‐Mayerhof‐ovog ciklusasa završnim produktom piruvatom, koji se potom redukuje aktivnošću laktat dehidrogenaza do laktata

Lactococcus spp.   cont.‘ [metabolizam citrata]Lactococcus spp.   cont.‘ [metabolizam citrata]

Ključni enzim CitP – metaboliziranje citrata do aromogenih komponenti: diacetil, acetoin, 2,3 butandiol, octena kiselina i CO2

Bakteriocini laktokoka – mali termostabilni proteini sa inhibitornom aktivnošću ka blisko srodnim bakterijamaNIZIN – komercijalna upotreba, širi antimikrobni spektar, uključujući i L. monocytogenes; lantibiotik1988. US FDA – odobrena upotreba nizina u prevenciji kasnog nadimanja sira uzrokovanog klostridijama

Lactobacillus spp.Lactobacillus spp.

Gram pozitivni, nesporogeni štapići ili kokobacili

Striktno fermentativni, aerotolerantni ili anaerobni, acidofilni, kompleksni hranidbeni zahtevi (UH, AK, peptidi, esteri MK, soli, derivati nukleinskih kiselina, vitamini)

Homofermentativni (>85% mlečna kiselina) ili heterofermentativni (mlečna kiselina, ugljen dioksid, etanol, i/ili octena kiselina u ekvimolarnim količinama)

19.1.2016

18

Lactobacillus spp.Lactobacillus spp.

Beijerinck, 1901.Orla‐Jensen, 1919. – Thermobacterium, Streptobacterium, BetabacteriumBergey‘s Manual of Systematic Bacteriology (Kandler and Weiss, 1986)

(phenotype‐ based nomenclatura)

1. Obligatno homofermentativni2. Fakultativno heterofermentativni3. Obligatno heterofermentativni

(phylogeny‐based nomenclatura)1. Lactobacillus delbrueckii grupa2. Lactobacillus casei/Pediococcus grupa3. Leuconostoc grupa

Lactobacillus spp.Lactobacillus spp.

16S rRNA sekvenca gena – diverzitet roda2005. godine→12 novih vrsta (www.bacterio.cict.fr)

Taksonomske promene kontinuirano traju44 vrste i 11 subvrsta u 1986.88 vrsta i 15 subvrsta u 2003.125 vrsta i 27 subvrsta u decembru 2005.174 ivrsta i 27 subvrsta  2013.

Primena molekularnih metoda – genus‐ i species specifični prajmeri –genomi nekoliko laktobacila u potpunosti sekvencionisani: Lactobacillus acidophilus NCFM; Lactobacillus brevis ATCC367; Lactobacillus gasseriATCC3323; Lactobacillus johnsonii NCC533; Lb. plantarumWCFS1

Lactobacillus spp.Lactobacillus spp.

19.1.2016

19

Streptococcus thermophilus, Leuconostoc spp.Streptococcus thermophilus, Leuconostoc spp.

Genetički sličan Streptococcus salivarius

Razlikovanje od ostalih streptokoka i laktokoka – rezistencija na visoke temperature, sposobnost rasta pri 52oC, fermentacija ograničenog broja UH; proteolitički malo aktivan, iako poseduje brojne proteolitičke enzime

Leuc. mesenteroides subsp. cremoris i Leuc. lactisMezofilne heterofermentativne kokeNe hidrolizuje arginin; zahtevaju vit B grupe za rastMetabolizuju citrat; u kombinaciji sa laktokokama u procesima kada je poželjna produkcija diacetila i CO2

Enterococcus spp.Enterococcus spp.

Lancefield‐ova grupa D (fekalne) streptokokeRevizija roda 1984. Schleifer i Killper‐Balz; gram pozitivne koke, u parovima, katalaza negativne, homofermentativni metabolizam; L+ izomer mlečne kiseline

Pro et Contra: indikatori fekalne kontaminacije; sirevi mediteranskog područja – prisutni u značajnom broju; probiotici kod ljudi i životinja – E. faecium SF68, E. faecium PR88; “rasejavači “ gena rezistencije na ANT

Zastupljenost enterokoka u sirevimaZastupljenost enterokoka u sirevima

104-106 CFU/g

19.1.2016

20

Bifidobacterium spp.Bifidobacterium spp.

Familija Actinomycetaceae; enzim fruktoza 6‐fosfat fosfoketolaza; visok G+C sadržaj u DNA (55‐57 mol%) – filogenetski pripadaju actinomyces subdiviziji BMKTaksonomija i nomenklatura u razvoju‐ polifazni pristup u diferenciranju vrstaPrirodni habitat – intestinalni trakt ljudi i životinjaB. bifidum, B. longum i B. animalisProbiotici

TRADICIONALNE STRATEGIJE GENETIČKOG POBOLJŠANJAMUTACIJA I SELEKCIJA

METODE PRIRODNOG TRANSFERA GENATRANSDUKCIJA, KONJUGACIJA, TRANSFORMACIJA, ELEKTROPORACIJA

GENETSKI INŽENJERING      TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK

GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERAGENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA

GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA ‐ PRIMERIGENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA ‐ PRIMERI

NA FAGE REZISTENTNI TRANSKONJUGATI – VISOKO EFIKASNI U SITUACIJAMA “PHAGE CRISIS”60 kb konjugativni plazmid pMRC01 – kodira genetičke determinante za lacticin 3147 (BMK, Staphylococcus, Clostridium, Listeria)Ekspresija Bacillus subtilis proteaze – Lactococcus spp. Cheddar sirmutant soj laktokokoka – termoinducibilni profag – indukcija faga sa lizom startera i oslobađanje intracelularnih enzimaMetabolički inženjering – Lac‐ derivati Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus; ekspresija gena odgovornih za produkciju egzopolisaharida u sojeve laktokoka; izmenjeni metabolički fluks u cilju povećane produkcije diacetilaGenetičke delecije u cilju poboljšanja probiotskih svojstava – delecija D‐laktat dehidrogenaze (ldhL) gena kod L. johnsoni

19.1.2016

21

KEFIR 109 laktokoka, 107‐108 Leuconostoc spp., 107‐108 termofilnih laktobacila, 104‐105 kvasaca,104‐105 bakterija sirćetne kiseline; od filamentoznih plesni Geotrichum candidum

NIKOLAJ BALANDOV

IRINA SAKHAROVA i BEK‐MIRZA BACHOROV