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UM NOVO MÉTODO ANALÍTICO PARA A DETERMINAÇÃO DO
TEOR DE LIGNINA EM PRODUTOS VEGETAIS.
Pesquisadores responsáveis:
Romualdo S. Fukushima Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo, Pirassununga, SP, Brasil, Bolsista do CNPq, [email protected]
Ronald D. Hatfield
U.S. Dairy Forage Research Center, U.S. Department of Agriculture,
Agricultural Research Service, Madison, Wisconsin, USA.
Equipe técnica: Adriana Paula Fuzeto Aluna de Mestrado em Nutrição Animal pela FMVZ/USP
Carolina Barbosa Bacha Aluna de Mestrado em Nutrição Animal pela FMVZ/USP Ana Carolina R. Port Bolsista de IC na FMVZ/USP
Pesquisas financiadas pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo (FAPESP)
2
RESUMO
A oferta de forragens verdes em pastagens tropicais sofre diretamente das
conseqüências das variações sazonais do clima. A produção de massa verde é
substancialmente menor na época da seca, que vai dos meses de junho a setembro.
Neste período, na maior parte do Brasil agro-pastoril, o bovino de corte geralmente
perde peso e a vaca de leite produz menos leite. Uma consulta à Bolsa de
Mercadorias e Futuros (BM&F) confirma elevação dos preços dos "commodities"
carne e leite, devido à menor oferta destes produtos, durante a entressafra. Nesta
época do ano, as chuvas são mais escassas e o capim do pasto está seco, velho e de
baixo valor nutritivo. Plantas forrageiras em avançado estádio de maturidade
comportam-se como resíduos da agroindústria, tais como as palhadas de trigo,
centeio, arroz, o bagaço da cana de açúcar, etc. Elas tem em comum, altas
concentrações de lignina.
A lignina é um complexo polímero fenólico e um dos componentes da parede
celular dos vegetais, ao lado dos carboidratos estruturais celulose e hemicelulose. A
lignina não é digerida pelas enzimas dos animais herbívoros e ainda interfere
negativamente na degradação microbiana dos carboidratos estruturais, reduzindo a
energia alimentar disponível para os fins zootécnicos.
O capim maduro, as palhadas de cereais e o bagaço da cana são ricos em
carboidratos estruturais, mas de baixa digestibilidade e de pequeno consumo
voluntário. Com o progressivo aumento da população mundial, que necessariamente
deveria fazer paralelo na mesma grandeza com oferta de alimentos para consumo
humano, a quantidade de cereais fornecida aos animais terá de ser reduzida no
futuro (FAO, 1994). Portanto, animais ruminantes terão que depender mais e mais de
volumosos grosseiros, mesmo porque a terra disponível para pastagens também
está se tornando escassa. Estes volumosos grosseiros ainda assim são importantes
3
fontes energéticas, uma vez que contém pelo menos 70% de carboidratos, que são
inaproveitados devido ao alto teor de lignina.
Em outras palavras, aproveitamento de resíduos agrícolas pelos animais
ruminantes, necessariamente esbarra na lignina. Portanto, antes de se pensar em
qualquer mecanismo para a melhoria do valor nutritivo de um volumoso grosseiro
(por exemplo, tratamento alcalino) é de vital importância a quantificação do real teor
de lignina.
Os procedimentos analíticos atualmente mais empregados para a
quantificação do conteúdo de lignina são a lignina detergente ácido (LDA), lignina
permanganato de potássio (Lper) e lignina Klason (LK). Entretanto, estes métodos
são questionáveis quanto às suas reais acurácias. Este manuscrito pretende oferecer
uma visão global dos principais métodos analíticos empregados para quantificar a
concentração de lignina em plantas forrageiras e outros produtos vegetais. A
presente apresentação dá um especial enfoque ao nosso recém-desenvolvido
método espectrofotométrico de determinação da lignina, denominado de lignina
brometo de acetila (LBA).
Além disso, abordarmos alguns aspectos ligados ao tema lignina do sistema
"Cornell Net Carbohydrate and Protein System" (CNCPS), que vem sendo
amplamente empregado para a estimativa da energia disponível nos alimentos. Os
alimentos utilizados na alimentação de ruminantes devem ser fracionados para
adequada caracterização dos mesmos. No caso dos carboidratos, estas frações são a
A, B1, B2 e C, respectivamente, fração solúvel, de degradação ruminal rápida, de
degradação mais lenta e porção indigerível da parede celular. Nas equações da
CNCPS, um dos componentes das frações B2 e C, é a lignina, e usualmente é
empregada a LDA com base na FDN, corrigida por um fator numérico igual a 2,4.
Entretanto, não há respaldo científico que sustente esta operação. Existem duas
4
possíveis razões: a metodologia LDA propriamente dita, falha na sua concepção e o
fator 2,4, uma constante um tanto quanto empírica. Portanto, nas equações para
estimar as frações de carboidratos pelo sistema CNCPS, sugerimos a possibilidade
de se empregar a LBA como uma alternativa ao "LDA x 2,4" nas frações B2 e C.
Temos algumas evidências que respaldam esta hipótese; entretanto, são necessários
mais dados experimentais.
Palavras chave: bovinos, lignina, método analítico, parede celular, plantas
forrageiras.
HISTÓRICO
O principal enfoque desta linha de pesquisa é o desenvolvimento de um novo
método analítico para a determinação do conteúdo de lignina em produtos vegetais.
Esse método é espectrofotométrico na sua essência e baseia-se na solubilização da
lignina em uma solução de brometo de acetila, daí o seu nome – lignina solúvel em
brometo de acetila (LSBA), e posterior leitura a 280 nm em um espectrofotômetro.
Pesquisas correlatas ao presente projeto de pesquisa são:
1) Modification of a colorimetric analysis for lignin and its use in studying the
inhibitory effects of lignin on forage digestion by ruminal microorganisms, The
Ohio State University, Tese Ph.D., 1985-1989, Bolsa de Doutorado no Exterior –
CNPq;
2) Projeto lignina - efeito da lignina sobre a digestibilidade da parede celular de
plantas forrageiras, CNPq, 1991-1993;
3) Aperfeiçoamento e emprego do método colorimétrico lignina solúvel em brometo
de acetila usando como padrão a lignina extraída da própria planta forrageira,
5
FAPESP, 1995-1997;
4) Determinação quantitativa da lignina e sua relação com a digestibilidade in vitro
da aveia forrageira (Avena sativa), FAPESP, 1999-2001 (colaborador);
5) Utilization of Acetyl Bromide Lignin as Standard to Determine Lignin
Concentration in Forage Species”, United States Department of Agriculture –
Dairy Forage Research Center, Madison, Wisconsin, EUA – Pós-doutorado no
Exterior, FAPESP, 1999-2001.
6) Validação de um novo método analítico para quantificar o teor de lignina em
alguns materiais ligno-celulósicos (forrageiras; sub-produtos agroindustriais;
madeiras e outros produtos vegetais) pertencentes a importantes segmentos do
agro-negócio. FAPESP (Processo número 02/05854-3 – em andamento).
INTRODUÇÃO
As plantas forrageiras e a lignina
A porção fibrosa (parede celular) das plantas forrageiras fornece energia para
os animais ruminantes. Entretanto, utilização desta fonte de energia será inadequada
se substancial porção for excretada nas fezes.
A lignina é um complexo polímero fenólico, encontrada integralmente como
componente da parede celular e não pode ser digerida pelas enzimas dos animais
mamíferos (Van Soest, 1994) (Figura 1).
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Figura 1 – A parede celular de plantas forrageiras.
É geralmente considerado que a lignina e a respectiva ligação covalente com
os polissacarídeos da parede celular, é o principal obstáculo ao ataque enzimático da
fibra (Jung et al., 1996). Observe-se pela figura abaixo (Figura 2), que estas ligações
são do tipo éster, típicas em gramíneas, mas não em leguminosas. Estas ligações
são susceptíveis à hidrólise alcalina. Por esta razão, é que tratamentos alcalinos
(hidróxido de sódio, amônia, etc.) são mais eficazes em gramíneas, mas não em
leguminosas.
7
Figura 2 – A ligação covalente entre lignina e
carboidrato da parede celular.
A lignina é um complexo polímero fenólico, formado pela união covalente de
vários monômeros fenólicos. Estas ligações são do tipo éter (C – C e C – O),
resistentes a vários agentes hidrolíticos, inclusive a vários sistemas enzimáticos.
Uma possível configuração deste polímero é representada na Figura 3. Essa malha
funciona como uma substância cimentante dos carboidratos da parede celular,
dificultando a digestão dos mesmos.
8
Figura 3 – Configuração espacial da lignina.
Os compostos fenólicos que constituem os blocos construtivos da lignina são
os núcleos guaiacílico, siringílico e p-coumarílico (Figura 4). A distribuição e
proporção destes monômeros obedece à origem filogenética de cada vegetal. Por
exemplo, as madeiras duras possuem núcleos guaiacílicos e siringílicos na lignina,
enquanto que as madeiras moles são quase que exclusivamente formadas de
núcleos guaiacílicos. Por outro lado, as gramíneas possuem uma certa quantidade
de unidades p-coumarílicas.
Figura 4 – Os blocos constitutivos da lignina.
9
Figura 5 – Comportamento “diferenciado” da digestibilidade.
Entretanto, os exatos mecanismos desta ação inibitória não estão
completamente elucidados; veja-se o exemplo de gramíneas, que muito embora
apresentem menores concentrações de lignina que as leguminosas, aparentemente
a lignina de gramíneas inibe mais acentuadamente a digestão (Mowat et al., 1969)
(Figura 5).
Outro exemplo reside na constatação que forrageiras jovens, contendo baixas
concentrações de lignina, um pequeno acréscimo na concentração de lignina
acarreta em significativo efeito negativo na digestibilidade, enquanto que forrageiras
maduras, com altos teores de lignina, um subsequente aumento na concentração de
lignina, mostram pequenos decréscimos na digestibilidade (Jung & Vogel, 1986). É
por esta razão que se considera que a curva de inibição da lignina é quadrática,
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obedecendo a lei da “surface limiting law” proposta por CONRAD et al. (1984)
(Figura 6).
Figura 6 – A relação entre concentração de lignina e
digestibilidade é quadrática.
Usualmente constata-se forte correlação negativa entre estádio de maturidade
e digestibilidade da matéria seca para a maioria das plantas forrageiras; à medida
que as forrageiras amadurecem, aumenta o teor de parede celular em função
primordialmente do engrossamento da parede celular e ao decréscimo da relação
folha:caule (Buxton et al., 1996), bem como maiores concentrações de lignina na
fração caule em relação à fração folha (Hatfield et al., 1994) (Figura 7). Corrobora
com essa constatação, a observação de que a parede celular da fração caule
apresentou valor de digestibilidade in vitro inferior à fração folha (Fukushima &
Savioli, 2001), se bem que é necessário também levar-se em conta a observação de
que a lignina presente no caule é possivelmente diferente daquela presente na folha
11
(Savioli & Fukushima, 2000). Não apenas a concentração de lignina aumenta com a
maturidade, mas também existem indícios de que ocorrem modificações estruturais
na molécula da lignina (Fukushima & Dehority, 2000).
Figura 7 – O efeito da maturidade na digestibilidade.
Os mecanismos pelos quais a lignina inibe a digestão dos carboidratos da
parede celular, ainda não estão elucidados. Uma das teorias, diz respeito à ligação
covalente entre carboidrato e lignina (figura mostrada acima), onde a configuração
espacial da lignina interferiria na ação enzimática. Uma prova que favorece esta
teoria é que palhadas e outros alimentos volumosos grosseiros apresentam
melhoria na digestibilidade quando tratados com álcalis. Outra teoria diz que a
lignina inibe a digestão dos carboidratos estruturais da parede celular por agir como
uma barreira física à ação das enzimas microbianas. A lignina age como uma
substância cimentante destes carboidratos, e ela própria sendo indigestível, acaba
eventualmente por inibir a digestão da parede celular. Algumas evidências
experimentais foram apresentadas por Dehority & Johnson (1961), que moeram
capim timothy bem maduro em 4 granulometrias: moínho laboratorial normal,
12
partículas de 1 mm e moinho de bolas por 6, 24 e 72 horas. A Figura 8 mostra
claramente que o tamanho de partícula influenciou substancialmente a taxa e a
extensão de digestão do capim. A explicação mais plausível residiria no fato de que
ao se reduzir o tamanho particular, aumentar-se-ia a área de exposição à ação
microbiana. A hipótese da lignina atuar como uma barreira física à digestão da
parede celular, condiz com esta observação experimental.
Figura 8 – Efeito do tamanho de partícula na digestão.
Estes mesmos AA. apresentaram outra evidência experimental ao
fermentarem por duas vezes seguidas o capim timothy. Na primeira fermentação, o
capim foi moído de maneira convencional. Na segunda fermentação, o resíduo
sólido foi dividido em duas partes: uma metade foi submetida à segunda fementação
13
sem qualquer alteração enquanto que a outra metade foi moída em moinho de
bolas. A Figura 9 mostra o drástico aumento na digestibilidade da celulose, quando
foi mecanicamente removida a lignina.
Figura 9 – A segunda fermentação de capim timothy.
Os métodos analíticos para determinar o teor de lignina
O conteúdo de lignina pode ser útil na estimativa da digestão da fibra (Akin et
al., 1977; Jung & Vogel, 1986); entretanto, qualquer estimador de digestibilidade
precisa ser quimicamente determinado com aceitáveis níveis de precisão e acurácia
(FAICHNEY, 1975). Os métodos da lignina em detergente ácido (LDA) preconizado
por Van Soest (1963), o da lignina permanganato de potássio (LPer) de Van Soest &
Wine (1968) e o tradicional método da lignina Klason (Theander & Westerlund, 1986),
todos eles de natureza gravimétrica, podem nem sempre refletir o real valor da
lignina. Por exemplo, o método LDA tipicamente subestima os teores de lignina
devido à parcial solubilização da mesma na solução de detergente ácido durante a
14
preparação da fibra em detergente ácido (FDA) (Kondo et al., 1987). Apesar dos
métodos LDA e Klason basearem-se essencialmente na hidrólise ácida (solução de
ácido sulfúrico a 72%) dos componentes da parede celular, exceto a lignina, estes
tem produzidos resultados conflitantes para as mesmas amostras de plantas
forrageiras (Hatfield et al., 1994). A perda de lignina solúvel no método LDA é
substancial, particularmente em gramíneas, chegando até a 50% (Lowry et al., 1994).
Essa perda, no entanto, tem sido menor no método LK; uma das razões é o tipo de
material pré-extraído que é usado, como por exemplo, a fibra em detergente neutro
(Sewalt et al., 1996) e a preparação de parede celular bruta (Hatfield et al., 1994). O
método LDA emprega a FDA. Entretanto, a LK padece do problema de apresentar-se
contaminado por proteína; enquanto que a lignina de madeiras é essencialmente
livre de proteína, nas plantas forrageiras, particularmente as leguminosas, esse
problema pode assumir dimensões sérias (Van Soest, 1994). Também valores de
LDA e Klason podem ser erroneamente determinados em função da presença de
contaminantes insolúveis, por exemplo, a cutina (Fukushima, 1989).
O conteúdo de lignina determinado pelo método LPer geralmente é mais
elevado do que o obtido pela LDA (Traxler et al., 1998). Entretanto, contrariamente
ao que é imputado ao método LDA, deve-se considerar que os teores de LPer podem
estar artificialmente elevados, uma vez que outros componentes da parede celular
(celulose, hemicelulose e pectina) podem ser atacados pela solução de
permanganato de potássio, particularmente nas gramíneas imaturas (Van Soest &
Wine, 1968). Além disso, parte da hemicelulose e alguns tecidos do mesófilo de
Festuca sp. foram oxidados pela solução de permanganato (Barton II & Akin, 1977).
O fato que gramíneas e leguminosas mostraram diferentes regressões entre LDA e
digestibilidade (Tomlin et al., 1965; Kondo et al., 1987) e que distintas equações para
a estimativa da FDN indigerível foram obtidas quando se empregaram os dois dos
15
mais comuns métodos para lignina (LDA e LPer), fortemente sugere que algum
problema analítico esteja presente em algum dos métodos, ou em ambos
(Fukushima & Hatfield, no prelo).
Estes métodos, embora relativamente fáceis, nem sempre fornecem dados
seguros sobre o real teor de lignina. Um método alternativo para quantificar lignina
foi proposto por Morrison (1972a,b), que é baseado na solubilização da lignina numa
solução a 25% de brometo de acetila em ácido acético glacial, o método da lignina
solúvel em brometo de acetila (LSBA). A determinação da concentração de lignina é
baseada na leitura da densidade óptica a 280 nm. Entretanto existe um entrave que é
a ausência de um padrão de referência, pois todo método espectrofotométrico
pressupõe a existência de um padrão (Fengel & Wegener, 1984). E o método em
pauta vinha carecendo de um padrão de referência confiável para desenvolver as
curvas de calibração, com as quais as leituras de absorbância pudessem ser
comparadas. Diversos materiais já foram empregados como padrões: Indulina
(Chesson, 1981), lignina “kraft” (Brillovet & Riochet, 1983), guaiacol (Sharma et al.,
1986), ácido ferúlico (Al-Ani & Smith, 1988) e lignina nativa (Fukushima et al., 1991).
Iiyama & Wallis (1990) desenvolveram o coeficiente específico de absorção de 20,0 g-
1.litro.cm-1 baseados em espectroscopia infra-vermelho e produtos de oxidação pelo
nitrobenzeno de amostras isoladas de lignina. Desafortunadamente este amplo leque
de padrões levou a sérios questionamentos quanto à exequibilidade e confiabilidade
do método espectrofotométrico.
Fukushima & Dehority (2000) desenvolveram um padrão de referência, obtido
através da extração da lignina do material vegetal com o reagente brometo de
acetila; curvas-padrão foram desenvolvidas para cada tipo de lignina isolada bem
como espectrogramas no intervalo de 220 a 320 nm. Ambas técnicas grafométricas
permitiram algumas análises quanto ao aspecto qualitativo das ligninas isoladas. Por
16
exemplo, pela análise de espectrogramas de ligninas provenientes de plantas jovens
ou maduras, esses AA. concluíram pela existência de diferenças entre elas,
possivelmente pela diferenciada deposição de monômeros fenólicos à medida que a
planta amadurece. Por outro lado, análises das curvas-padrão provenientes de
lignina da fração caule ou folha, também revelaram a existência de diferenças na
absorção da luz ultra-violeta entre as ligninas, possivelmente devido a diferenças na
composição fenólica entre as ligninas (Savioli & Fukushima, 2000). Estes efeitos da
maturidade ou parte vegetal, refletidos nas ligninas, podem ter decisivo efeito na
digestibilidade da planta forrageira.
Muito embora tenha sido exequível o emprego dessa forma de lignina,
Fukushima & Hatfield (2001) demonstraram que a lignina extraída com solução ácida
de dioxano (LDiox) continha menores teores de contaminantes, particularmente de
carboidratos; esta lignina empregada como padrão de referência nas leituras
espectrofotométricas, resultou em concentrações de lignina mais consistentes entre
si. Um dos escopos da nossa linha de pesquisa é investigar a nossa proposta de que
o método analítico LSBA é o que melhor estaria estimando a real concentração de
lignina nas plantas forrageiras.
A Tabela 1 mostra resultados de lignina determinados pelos 4 métodos: LK,
LDA, LPer e LSBA (Fukushima & Hatfield, no prelo).
Tabela 1 – Resultados de quatro métodos analíticos para lignina.
Nome ADL (%) PerL (%) LK (%) ABSL (%)
Setaria M 7,25 8,09 13,53 15,13
Setaria M, perfilhos 6,16 6,58 12,60 14,25
Palhada de trigo (caule) 8,91 12,20 18,42 21,74
Palhada de trigo (folha) 10,34 7,43 14,15 17,50
17
Palhada de aveia (caule) 8,33 11,14 17,11 20,54
Palhada de aveia (folha) 10,69 7,13 13,80 14,73
Alfalfa Y 8,36 13,46 12,30 11,60
Alfalfa M 9,06 15,37 13,88 11,14
Alfafa M, 30 cm inferior 9,25 15,75 14,48 11,92
Alfalfa M, 30 cm superior 5,93 9,53 11,14 7,49
Trevo vermelho M 4,17 11,55 7,12 8,32
Bromegrass M, nativo 4,56 6,70 13,01 14,27
Pinheiro 24,55 25,53 24,97 32,48
Álamo 6,95 19,05 15,86 21,11
Milho M 2,48 4,52 7,67 8,91
Bromegrass J 2,85 5,60 10,22 12,35
Bromegrass M1 3,04 6,41 10,04 12,98
Bromegrass M2 3,65 6,98 10,98 14,61
Observe as diferenças nas concentrações de lignina para uma mesma
amostra. Regra geral, os maiores valores foram registrados para o método LSBA,
ficando os menores valores para a LDA. Como já descrito anteriormente por vários
autores, o método LDA fornece teores menores de lignina, particularmente para as
gramíneas imaturas (a Tabela 1 mostra estes valores sublinhados).
É aceito sem restrições a observação de que o caule, regra geral, apresenta
concentrações mais elevadas de lignina do que o tecido foliar, justamente por ser
uma estrutura de sustentação. Na Tabela 1, estão os resultados das determinações
dos teores de lignina em caule e folha das palhadas (em azul). Enquanto que os
métodos LPer, LK e LSBA foram coerentes com esta observação, os dados de LDA
foram claramente em direção oposta. A digestibilidade in vitro, tanto da matéria seca
como da parede celular, das folhas foi maior que a do caule, concordando com os
18
dados de LPer, LK e LSBA. As folhas caracteristicamente possuem uma malha de
lignina que é proporcionalmente mais abundante nos monômeros guaiacílicos do
que os caules, enquanto que estes seriam mais ricos nos núcleos siringílicos.
Hatfield et al. (1994) reportaram que ligninas ricas em unidades siringílicas seriam
mais susceptíveis ao ataque ácido. Como resultado, os tecidos ricos em unidades
guaiacílicas seriam mais preservados, o que explica os altos valores de LDA para as
folhas das palhadas.
No caso particular do álamo (uma madeira), o valor de LDA de 6,95 (versus
19,05 para a LPer, 15,86 para a LK e 21,11 para a LSBA) está claramente
subestimado. Fukushima & Hatfield (no prelo) reportaram que os produtos da
oxidação pelo nitrobenzeno da lignina do álamo são predominantemente formados
pelos núcleos siringílicos que, conforme visto acima, é mais susceptível ao ataque
do ácido sulfúrico, o que explicaria o baixo conteúdo de LDA do álamo. A segunda
mais rica lignina em núcleo siringílico, foi a lignina do milho, que ironicamente
mostrou o menor conteúdo de LDA (Tabela 1).
Outra evidência a mostrar que ligninas siringílicas são mais hidrolisadas pelo
H2SO4 do que as ligninas guaiacílicas: o valor da LDA do pinheiro, que tem uma
lignina do tipo guaiacílico, foi similar aos valores de LPer e LK. O teor de LSBA foi
mais elevado.
Para todas amostras de gramíneas e as duas de madeira, os teores de LSBA
foram mais elevados do que a LK. À exceção do trevo vermelho, essa constatação
seguiu a direção oposta nas leguminosas: os valores de LK foram mais elevados do
que a LSBA. Como já mencionado anteriormente, o método da LK padece da
contaminação protéica.
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Tabela 2 – Resultados de quatro métodos analíticos para lignina.
Nome ADL (%) PerL (%) LK (%) ABSL (%)
Setaria M 7,25 8,09 13,53 15,13
Setaria M, perfilhos 6,16 6,58 12,60 14,25
Palhada de trigo (caule) 8,91 12,20 18,42 21,74
Palhada de trigo (folha) 10,34 7,43 14,15 17,50
Palhada de aveia (caule) 8,33 11,14 17,11 20,54
Palhada de aveia (folha) 10,69 7,13 13,80 14,73
Alfalfa Y 8,36 13,46 12,30 11,60
Alfalfa M 9,06 15,37 13,88 11,14
Alfafa M, 30 cm inferior 9,25 15,75 14,48 11,92
Alfalfa M, 30 cm superior 5,93 9,53 11,14 7,49
Trevo vermelho M 4,17 11,55 7,12 8,32
Bromegrass M, nativo 4,56 6,70 13,01 14,27
Pinheiro 24,55 25,53 24,97 32,48
Álamo 6,95 19,05 15,86 21,11
Milho M 2,48 4,52 7,67 8,91
Bromegrass J 2,85 5,60 10,22 12,35
Bromegrass M1 3,04 6,41 10,04 12,98
Bromegrass M2 3,65 6,98 10,98 14,61
Esse problema é particularmente sério para as leguminosas, como parece ser
o presente caso. O reagente cetil trimetilamonio brometo é incluido na solução de
detergente ácido especificamente para a remoção de proteína no método LDA (Van
Soest, 1963), enquanto que o método LK não contempla um passo de remoção
protéica. Foi reportado que o conteúdo de nitrogênio nos resíduos de LK foi quase
sempre maior do que nos resíduos de LDA (Hatfield et al., 1994).
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Para todas amostras de gramíneas e as duas de madeira, os teores de LSBA
foram mais elevados do que a LPer. Essa constatação seguiu a direção oposta nas
leguminosas: os valores de LPer foram mais elevados do que a LSBA. Como já
mencionado anteriormente, o método da LPer pode estar artificialmente inflacionado
uma vez que o KMnO4 pode oxidar outros componentes da parede celular,
particularmente a pectina. Fukushima & Hatfield (2001) e Fukushima & Hatfield (no
prelo) observaram que a parede celular de leguminosas é particularmente rica em
substâncias pécticas, os quais poderiam contribuir para a superestimação dos
valores de LPer.
Por outro lado, deve-se levar em conta a possibilidade de que os valores de
LSBA possam estar artificialmente elevados, uma vez que regra geral, este método
forneceu as mais concentrações de lignina. Diversos compostos fenólicos podem
contribuir com a densidade óptica e que são facilmente removidos pelo tratamento
com o H2SO
4 (Fahey et al., 1979). Exemplos destes compostos fenólicos são os ácidos
cinâmicos éster ligados (Morrison & Stewart, 1995). Após tratamento com hidróxido
de sódio de algumas ligninas extraídas de gramíneas, foram detectados típicos picos
de uma mistura de ácidos p-coumárico e ferúlico entre 250 e 350 nm; estes picos não
estiveram presentes quando as amostras de lignina foram provenientes de
leguminosas ou do pinheiro (Fukushima & Hatfield, 2003).
A presença destes ácidos cinâmicos poderia ser uma das explicações do
porquê os coeficientes de extinção para as gramíneas foram mais elevados do que
para as leguminosas ou o pinheiro; entretanto, a lignina do álamo também mostrou
elevado valor do coeficiente de extinção, apesar de não possuir ácidos cinâmicos
éster ligados na sua estrutura (Fukushima & Hatfield, no prelo). Remoção destes
ácidos antes da confecção da curva padrão pode ser uma opção para verificar
melhoria na quantificação da concentração de lignina em gramíneas, se for aceito o
21
conceito de que ácidos cinâmicos éster ligados à molécula de lignina não são partes
integrantes da mesma (Morrison & Stewart, 1995).
Também outros compostos que não a lignina, tais como os taninos,
flavonóides e aminoácidos aromáticos, se não removidos durante a preparação da
parede celular, podem ser solubilizados na solução de brometo de acetila e
contribuir com a densidade óptica (Morrison, 1972; Van Soest, 1994).
A acurácia com que a lignina é quantificada também assume grande
relevância quando o assunto é estimativa do valor energético de plantas forrageiras.
Menores estimativas de FDN indigestível foram obtidas quando o método LDA foi
empregado ao invés de LPer, possivelmente porque os valores de LDA foram cerca
de 76% da LPer (Traxler et al., 1998).
Qual o método analítico de escolha para quantificar o teor de lignina em produtos
vegetais?
Com tantas opções analíticas para estimar o conteúdo de lignina, e ainda
fornecendo diferentes valores numéricos para uma mesma amostra, a questão óbvia
que se apresenta é: “qual o método analítico de escolha para quantificar o teor de
lignina em produtos vegetais?”. Nenhum desses métodos é dominante; portanto, a
escolha do método analítico é do arbítrio do pesquisador executando as análises
químicas (Traxler et al., 1998). Mas não responde à essa importante questão: “qual
desses procedimentos é o que reflete o real conteúdo de lignina?” Não é uma
pergunta com fácil resposta; para tentar responder, pelo menos em parte a esta
questão, outros procedimentos analíticos são necessários. Por exemplo, pode-se
lançar mão da análise quantitativa dos ácidos/aldeídos fenólicos individuais após a
oxidação alcalina pelo nitrobenzeno da lignina (Billa et al., 1996; Lam et al., 1990);
entretanto, este procedimento resulta em apenas parte dos monômeros que fazem
22
parte da estrutura da lignina, exigindo correções matemáticas para estimar o total de
fenóis que compõem a lignina (Iiyama & Lam, 1990). Fukushima & Hatfield (2001)
quando oxidaram a lignina dioxana com nitrobenzeno, também não obtiveram a
totalidade da lignina medida através da somatória dos seus constituintes individuais.
Outro procedimento que objetiva a partição da macromolécula, também não a
hidroliza na totalidade dos seus blocos constitutivos (Lu & Ralph, 1997; Lu & Ralph,
1998). A ressonância magnética nuclear (RMN) é um instrumento analítico dos mais
valiosos, fornecendo informações detalhadas e específicas sobre os componentes
moleculares da lignina, e possíveis substâncias contaminantes (Ralph et al., 1994;
Fukushima & Hatfield, 2003); entretanto, a técnica da RMN é de caráter qualitativo,
ficando desta maneira limitado o seu emprego quando se deseja avaliação
quantitativa do teor de lignina em produtos vegetais.
Possivelmente as melhores ferramentas coadjuvantes para auxiliar na
determinação de um método analítico adequado, sejam os ensaios de digestibilidade
(tanto in vivo, in vitro ou in situ) através da correlação estatística (regressão) entre as
variáveis teor de lignina medida pelos métodos analíticos e o valor obtido após
fermentação por um determinado número de horas do produto vegetal com fluido
ruminal (Tomlin et al., 1965; Smith et al., 1972; Jung et al., 1996; Traxler et al., 1998;
Fukushima & Dehority, 2000). Nos nossos projetos de pesquisa, temos empregado a
digestibilidade in vitro, devido ao elevado número de amostras, ser de fácil execução
e expressar com grande fidelidade os fenômenos observados nos experimentos de
digestibilidade in vivo (Reinhart & Sunvold, 1996).
Como é do conhecimento geral, a lignina é obstáculo à degradação enzimática
dos carboidratos estruturais da parede celular e essa relação é essencialmente linear
e negativa (Mertens, 1987). O grau de correlação existente entre a digestibilidade e o
parâmetro sendo medido é muitas vezes empregado para avaliar procedimentos
23
analíticos; se bem que o grau de correlação seja muitas vezes um critério
insatisfatório, este índice reflete a praticidade de se obter a estimativa mais acurada
do valor nutritivo a partir de dados da composição bromatológica (Van Soest &
Robertson, 1980). Entretanto, o grau de correlação para ser uma medida de valor,
exige que a determinação química de um dado nutriente seja pelo menos satisfatória
(Fonnesbeck, 1976). A correlação tem sido empregada objetivando obter subsídios
que possam dar sustentação a um método analítico mais adequado para a
estimativa quantitativa da concentração de lignina (Fukushima & Dehority, 2000;
Fukushima & Savioli, 2001; Schmidt et al., no prelo).
Uma comparação entre os métodos LDA, LPer, lignina Klason e LSBA,
mostrou ser a LSBA o procedimento analítico que consistentemente produziu altas
correlações com a digestibilidade in vitro tanto da matéria seca como da parede
celular; e foi o único método a mostrar a maior significância para todos os grupos
vegetais estudados (Fukushima & Hatfield, no prelo) (Tabela 3).
Tabela 3 – Correlação entre método analítico e digestibilidade in vitro.
IVDMD IVCWD
Method
all samples all samples
but wood
only
roughages
all samples all samples
but wood
only
roughages
Acid detergent
lignin
-0.66**** -0.60*** -0.22NS
-0.49** -0.21NS
-0.30NS
Permanganate
lignin
-0.54*** -0.09NS
-0.21NS
-0.50** -0.12NS
-0.19NS
Klason lignin
-0.84**** -0.81**** -0.38NS
-0.78**** -0.69**** -0.63*
Acetyl bromide
soluble lignin
-0.79**** -0.89**** -0.89**** -0.74**** -0.79**** -0.85****
a IVDMD – in vitro dry matter digestibility; IVCWD - in vitro cell wall digestibility.
* = P 0.1; ** = P 0.01; *** = P 0.001; **** = P 0.0001
24
As frações de carboidratos e o CNCPS
Como os animais ruminantes dependem essencialmente das plantas
forrageiras na sua alimentação, estas precisam ser avaliadas quanto ao seu valor
nutritivo. O sistema de Weende foi um marco histórico, tendo sido utilizado por
aproximadamente um século na quantificação de proteína e energia dos alimentos.
Entretanto, como apresentava diversas falhas, houve a necessidade de substituição
por um procedimento mais eficaz. O sistema “Cornell Net Carbohydrate and Protein
System” (CNCPS) vem sendo amplamente empregado para a estimativa das frações
protéicas e de carboidratos dos alimentos e se utiliza de equações que estimam a
digestão e a passagem dessas frações, considerando a dinâmica da fermentação
ruminal (Sniffen et al., 1992; Russel et al., 1992; Fox et al., 1992). Os alimentos
utilizados na alimentação de ruminantes devem ser fracionados para adequada
caracterização dos mesmos. No caso dos carboidratos, estas frações são a fração A -
solúvel (constituída de açúcares de rápida degradação no rúmen), fração B1 - de
degradação ruminal rápida (composta basicamente por amido e pectina), fração B2 -
de degradação mais lenta (porção digerível da parede celular) e fração C - porção
indigerível da parede celular (lignina e FDN indigerível) (Sniffen et al., 1992).
Essas frações de carboidratos (na base dos carboidratos totais - %CHO) podem
ser obtidas utilizando-se das equações propostas por Sniffen et al. (1992):
A (%CHO) = [100 – Amido (%CNE)] [100 – B2 (%CHO) – C (%CHO)] / 100,
onde %CNE é na base da MS.
B1 (%CHO) = Amido (%CNE) [100 - B
2 (%CHO) – C (%CHO)] / 100,
B2 (%CHO) = 100 [FDNc (%MS) – PIDN (%PB) 0,01 PB (%MS) – FDNcp
25
(%MS) 0,01 Lignina (%FDNcp) 2,4] / CHO (%MS),
onde FDNc é FDN isenta de cinzas e FDNcp é FDN isenta de cinzas e proteína.
Esta correção de cinzas e/ou proteína mostrou-se necessária (Ribeiro et al.,
2001). PIDN é a proteína insolúvel na solução de detergente neutro.
C (%CHO) = 100 [FDNcp (%MS) 0,01 Lignina (%FDNcp) 2,4] / CHO
(%MS), onde CHO (%MS) = 100 – PB (%MS) – EE (%MS) – MM (%MS).
Nas equações da CNCPS, um dos componentes das frações B2 e C é a lignina,
usualmente a lignina em detergente ácido (LDA), corrigida por um fator numérico
equivalente a 2,4. A equação original foi desenvolvida por Chandler (1980): U = 2,4
(Lig / FDN), onde U é a FDN indigerível. Esta equação foi incorporada ao modelo
CNCPS e no nível 2 do NRC de gado de corte (National Research Council, 1996).
Entretanto, esta operação não tem tido respaldo generalizado. Existem duas
possíveis razões: a metodologia “LDA” propriamente dita, falha na sua concepção e
o fator 2,4, uma constante e um tanto quanto empírico. De acordo com a “surface
limiting law” proposta por Conrad et al. (1984), a inibição da lignina na
digestibilidade da FDN segue uma curva quadrática, ou seja, planta com baixo teor
de lignina, um pequeno acréscimo na lignina tem substancial efeito negativo na
digestibilidade enquanto que a planta madura, com alto teor de lignina, um
subsequente aumento, mostra pequeno efeito na digestibilidade. Logo, uma
constante, como é o caso do fator 2,4 não pode explicar suficientemente a inibição.
Corrobora com isso, o achado de Malafaia et al. (1998) que, ao estimar a fração C,
obtiveram um fator diferente (3,03), devido ao acréscimo no percentual de lignina
quando a amostra era incubada por mais tempo. Traxler et al. (1998) também
reportaram um outro valor numérico, igual a 3,2.
26
Devido às estas constatações, um outro objetivo de nossa linha de pesquisa é
investigar se a substituição daquela constante um tanto quanto empírica (LDA 2,4)
por um dado mais concreto, que é o valor numérico proveniente da LSBA, não
resultará em estimativas das frações B2 e C mais consistentes. Assim, as equações
para as estimativas das frações B2 e C ficariam:
B2 (%CHO) = 100 [FDNc (%MS) – PIDN (%PB) 0,01 PB (%MS) – FDNcp
(%MS) 0,01 LSBA] / CHO (%MS),
C (%CHO) = 100 [FDNcp (%MS) 0,01 LSBA] / CHO (%MS), onde CHO
(%MS) = 100 – PB (%MS) – EE (%MS) – MM (%MS).
Em termos práticos, a fração C é o resíduo indigerível, como porcentagem da
MS, que sobra no tubo de ensaio após as 144 horas de digestão (96 h de
fermentação + 48 h de digestão protéica). Portanto, é fácil verificar a validade do
modelo matemático de Cornell, no que diz respeito à equação para cálculo da fração
C (se com a equação de Chandler ou nossa proposta de LSBA). Caso se comprove a
validade da equação C, com quaisquer das duas hipóteses, ficará também muito fácil
comprovar a validade da equação da fração B2 dos carboidratos. Restariam portanto,
apenas as equações que estimam as frações A e B1. Malafaia et al. (1998)
propuseram a caracterização dos carboidratos não-estruturais como sendo o
somatório das frações A e B1, fundamentados na praticidade do cálculo de rações
para ruminantes e no aspecto analítico, uma vez que as metodologias de
determinação do amido não resultam em valores verossímeis e não apresentam boa
repetibilidade.
A importância da correta avaliação da fração B2 dos carboidratos diz respeito
27
diretamente ao teor de FDN. Alimentos volumosos, com mais altos teores de FDN,
possuem maior proporção da fração B2, que por fornecer energia mais lentamente
no rúmen, pode afetar a eficiência da síntese microbiana e o desempenho animal
(Ribeiro et al., 2001). Além disso, o consumo pode ser limitado pela elevada fração
indigerível, a fração C dessas forrageiras (Malafaia et al., 1998).
Entretanto, ainda não justificamos a propositura da substituição do elemento
LDA 2,4 pela LSBA. A Tabela 4 mostra os valores de LDA, LSBA e a razão entre eles
para todas as amostras estudadas.
Tabela 4 – Teores de lignina pelos métodos LDA e LSBA, e a razão entre as mesmas.
Nome ADL (%) ABSL (%) ABSL / ADL
Setaria M 7,25 15,13 2,09
Setaria M, perfilhos 6,16 14,25 2,31
Palhada de trigo (caule) 8,91 21,74 2,44
Palhada de trigo (folha) 10,34 17,50 1,69
Palhada de aveia (caule) 8,33 20,54 2,47
Palhada de aveia (folha) 10,69 14,73 1,38
Alfalfa Y 8,36 11,60 1,39
Alfalfa M 9,06 11,14 1,23
Alfafa M, 30 cm inferior 9,25 11,92 1,29
Alfalfa M, 30 cm superior 5,93 7,49 1,26
Trevo vermelho M 4,17 8,32 1,99
Pinheiro 24,55 32,48 1,32
Álamo 6,95 21,11 3,04
Bromegrass M, nativo 4,56 14,27 3,13
Milho M 2,48 8,91 3,59
28
Bromegrass J 2,85 12,35 4,33
Bromegrass M1 3,04 12,98 4,27
Bromegrass M2 3,65 14,61 4,00
Média 2,40
É interessante que a média das razões tenha sido exatamente 2,40. Vale
ressaltar que foram justamente nas gramíneas (os principais alvos de críticos ao
método LDA), onde se verificaram as maiores diferenças. Outra observação
interessante é que as razões flutuaram, isto é, não foram valores constantes e desta
maneira, seguiriam a “surface limiting law” proposta por Conrad et al. (1984).
Se partirmos da premissa que a LSBA está quantificando o teor de lignina com
maior acurácia do que a LDA, certos “dogmas” emitidos no passado e referendados
pelos mais diversos autores, tais como “gramíneas muito embora apresentem
menores concentrações de lignina que as leguminosas, aparentemente a lignina de
gramíneas inibe mais acentuadamente a digestão (Mowat et al., 1969)”, os gráficos
apresentados na Figura 10 deverão ser vistos de uma maneira completamente
diferentes.
29
Figura 10 – Comportamento “diferenciado” da digestibilidade.
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