UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD

CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MACHALA2019

DA SILVA ALVES PALOMABIOQUÍMICA FARMACÉUTICA

JAEN SERRANO LORENA MISHELBIOQUÍMICA FARMACÉUTICA

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIASMETANOGÉNICAS DE SEDIMENTOS URBANOS DEL ESTERO EL

MACHO MEDIANTE UN ENFOQUE DE ECOSALUD.

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LASALUD

CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MACHALA2019

DA SILVA ALVES PALOMABIOQUÍMICA FARMACÉUTICA

JAEN SERRANO LORENA MISHELBIOQUÍMICA FARMACÉUTICA

Aislamiento y caracterización de bacterias metanogénicas desedimentos Urbanos del Estero El Macho mediante un enfoque de

ecosalud.

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LASALUD

CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MACHALA2019

DA SILVA ALVES PALOMABIOQUÍMICA FARMACÉUTICA

JAEN SERRANO LORENA MISHELBIOQUÍMICA FARMACÉUTICA

Aislamiento y caracterización de bacterias metanogénicas de sedimentos Urbanos delEstero El Macho mediante un enfoque de ecosalud.

MACHALA, 11 DE FEBRERO DE 2019

ROMERO BONILLA HUGO ITALO

TRABAJO TITULACIÓNTRABAJO EXPERIMENTAL

Urkund Analysis Result Analysed Document: DA SILVA ALVES PALOMA_JAEN SERRANO LORENA

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U R K N DU

DEDICATORIA

A mi familia, quienes han sido siempre la base fundamental para mi crecimiento

profesional y han sido mi soporte en todos los momentos de mi vida, mi madre que ha

batallado toda su vida con valor, para mantenerme junto a ella de pie frente a la vida y

me ha orientado a ser mejor cada día y a corregir mis errores de la mejor manera. A mi

esposo, quien se ha convertido en mi pilar, y me empuja siempre hacia el camino del

éxito. Dedico este trabajo a Dios, que me da sabiduría y fortaleza para conseguir todo lo

que me propongo y a enfrentar con valentía todos los obstáculos que se me presente.

Paloma Da Silva

A Dios porque gracias a él tengo la vida, la protección y la fortaleza de salir adelante.

Todo es por su misericordia y su bondad que bendice mi vida y la de toda mi familia. A

mis padres que son mi guía y modelo a seguir en este camino hacia mi desarrollo

profesional, su apoyo y amor infinito siempre me han ayudado a alcanzar mis metas.

Querida madre sin tu esfuerzo, apoyo y amor, nunca hubiera llegado tan lejos, contigo a

mi lado, puedo lograr todo lo que me proponga. A mi hija amada Emily, el regalo más

lindo que me ha dado Dios, eres mi motivación y fortaleza, todo es para ti y quiero

brindarte un ejemplo de lucha hacia el éxito. A mi esposo que es mi apoyo incondicional,

por tu amor y comprensión en todo momento alcanzaremos todos los objetivos por los

que luchamos juntos.

Lorena Mishel Jaen Serrano

AGRADECIMIENTOS

A Dios, que me levanta y me mantiene de pie día a día. A mis padres, quienes han sido

mis impulsores y mi guía a lo largo de toda mi vida en cada paso que doy. Mi hermana,

quien me ha ayudado en cualquier cosa que haya necesitado. A mi amado esposo, que

lucha conmigo en cada batalla y es mi apoyo incondicional en toda mi vida. A nuestro

tutor que nos ha direccionado en la elaboración de este trabajo y estuvo ahí disponible en

cada inconveniente que presentamos.

Paloma Da Silva

A Dios por su misericordia porque me da la sabiduría de llegar a la meta, si tengo su

protección venceré cualquier obstáculo.

A toda mi familia por el apoyo infinito que me da la fuerza para perseverar cada día y ser

una persona con valores íntegros. A mi esposo y mi hija amada Emily por su motivación

y amor, sé que juntos somos fuertes.

A mi tutor Dr. Hugo Romero por motivarme a incursionar en nuevas fronteras de

aprendizaje, darle gracias infinitas por estar pendiente en todo momento, dándome sus

consejos y compartir risas y vivencias.

Lorena Mishel Jaen Serrano

RESUMEN

Las bacterias metanogénicas son microorganismos productores de metano, que necesitan

condiciones anaeróbicas para su metabolismo energético, su supervivencia depende de

las vías acetoclástica, metilotrópica o hidrogenotróficas, utilizan el dióxido de carbono,

sustratos de metilo y acetato que son esenciales para la codigestión anóxica de la materia

orgánica. El incremento de la población en la ciudad de Machala ha sido un factor

primordial para los altos índices de contaminación ambiental. Las descargas continuas de

aguas residuales, la sobreproducción de desechos orgánicos, los residuos del sector

bananero y el asentamiento a sus alrededores han ocasionado que este Estero se integre

de compuestos orgánicos e inorgánicos peligrosos y de una amplia carga bacteriana que

constituye un cuerpo de agua con lodos activados. El impacto de esta situación se

evidencia cuando estos residuos tóxicos llegan a los océanos ocasionando daños en los

ecosistemas y son perjudiciales para la salud de la población. La biotecnología es una

herramienta en el tratamiento de sedimentos activos, proceso en el cual se utilizan

bacterias metanogénicas que actúan estabilizando los lodos contaminados mediante la

reducción de patógenos, malos olores y condiciones de putrefacción. El objetivo del

presente trabajo de investigación fue aislar y caracterizar bacterias metanogénicas

mediante métodos microbiológicos en muestras del sedimento para evaluar el potencial

de oxidación anaeróbica de metano en el Estero El Macho de la ciudad de Machala. Se

realizó el aislamiento de las bacterias metanógenas de los géneros Methanococcus y

Methanobacterium mediante los medios de cultivo Standman-Barker y Barker-Taha

respectivamente. La siembra se realizó en medio sólido y líquido y se cuantificaron las

células viables estableciendo métodos de recuento de UFC (Unidades formadoras de

colonias) en placa y por el método NMP (Número más probable). La identificación

fenotípica se realizó con coloración de Gram y mediante la observación microscópica se

determinó las características morfológicas de cada especie. Además, se aplicaron pruebas

bioquímicas comparadas con valores referenciales de las cepas Methanococcus Deltae y

Methanobacterium Ruminantium, en las cuales se utilizaron los medios TSI agar (Hierro

triple azúcar), SIM medio (Sulfuro, indol y motilidad), citrato de Simmons y urea. Las

reacciones bioquímicas establecidas fueron: fermentación de la glucosa, sacarosa y

lactosa, producción de gas, presencia del sulfuro de hidrógeno, oxidación del triptófano,

movilidad, cambios de pH, reacciones enzimáticas y cambios de coloración en los

medios. Por otro lado, se armaron sistemas de biorreactores con materia orgánica

lignocelulosica (cáscara de arveja) más las cepas aisladas, en los cuales se generó biogás,

después de cada semana de codigestión anaerobia se efectuó la medición de gas metano

y dióxido de carbono por cromatografía gaseosa. Los resultados muestran el crecimiento

de bacterias de géneros Methanococcus y Methanobacterium, y se identificaron que los

dominios morfológicos de estas bacterias son estreptobacilos y cocáceas respectivamente.

Además, se definió que estas bacterias fermentan azúcares, generan gas sulfhídrico, son

móviles y producen turbidez en los medios de cultivo. El biorreactor que produjo mayor

cantidad de metano fue el que está constituido por ambas cepas de metanógenos

generando un 9% de gas metano a las tres semanas de digestión anaerobia. Las bacterias

del género Methanobacterium se encontraban en mayor cantidad que las del género

Methanococcus en medios sólidos y caldos, así como producen mayor cantidad de biogás.

PALABRAS CLAVES

Arqueas, Methanococcus, Methanobacterium, Biogás, Ecosalud.

ABSTRACT

Methanogenic bacteria are methane-producing microorganisms, which need anaerobic

conditions for their energy metabolism, their survival depends on the acetoclastic,

methylotropic or hydrogenotrophic pathways, they use carbon dioxide, methyl and

acetate substrates that are essential for the anoxic codigestion of the organic material. The

increase in population in Machala City has been a major factor in the high levels of

environmental pollution. The continuous discharges of wastewater, the overproduction of

organic waste, the waste from the banana sector and the settlement of its surroundings

have caused this Estero to be integrated with dangerous organic and inorganic compounds

and a large bacterial load that constitutes a body of water with muds activated. The impact

of this situation is evidenced when these toxic waste reach the oceans causing damage to

ecosystems and are harmful to the health of the population. Biotechnology is a tool in the

treatment of active sediments, a process in which methanogenic bacteria are used to

stabilize contaminated sludge by reducing pathogens, bad odors and putrefaction

conditions. The objective of this research work was to isolate and characterize

methanogenic bacteria by means of microbiological methods in sediment samples to

evaluate the anaerobic methane oxidation potential in El Macho Estuary in Machala City.

The methanogenic bacteria of the genus Methanococcus and Methanobacterium were

isolated by means of the culture media Stadtman-Barker and Barker-Taha respectively.

Seeding was carried out in solid and liquid medium and viable cells were quantified by

establishing methods for counting CFU (Colony Forming Units) in plaque and by the

NMP method (most probable number). The phenotypic identification was performed with

Gram stain and by microscopic observation the morphological characteristics of each

species was determined. In addition, biochemical tests were applied compared with

reference values of the strains Methanococcus Deltae and Methanobacterium

Ruminantium, in which TSI agar (triple sugar iron), medium SIM (Sulfur, indole and

motility), Simmons citrate and urea media were used. The established biochemical

reactions were: fermentation of glucose, sucrose and lactose, gas production, presence of

hydrogen sulfide, oxidation of tryptophan, mobility, pH changes, enzymatic reactions and

changes of coloration in the media. On the other hand, systems of bioreactors with

lignocellulosic organic matter (pea skin) plus isolated strains were assembled, in which

biogas was generated, after each week of anaerobic codigestion the measurement of

methane gas and carbon dioxide was made by chromatography gas. The results show the

growth of bacteria of the genus Methanococcus and Methanobacterium, and it was

identified that the morphological domains of these bacteria are streptobacilli and

cetaceans respectively. It was also defined that these bacteria ferment sugars, generate

hydrogen sulfide gas, are mobile and produce turbidity in the culture media. The

bioreactor that produced the greatest amount of methane was the one is constituted by

both strains of methanogens generating a 9% methane gas to the three weeks of anaerobic

digestion. The bacteria of the genus Methanobacterium were in greater quantity than those

of the genus Methanococcus in solid media and broths, as well as produce more biogas.

KEYWORDS

Archaea, Methanococcus, Methanobacterium, Biogas, Ecohealth.

ÍNDICE

Pág.

INTRODUCCIÓN 15

PROBLEMA GENERAL 18

PROBLEMAS ESPECÍFICOS 18

OBJETIVOS 19

Objetivo General 19

Objetivos Específicos 19

VARIABLES 19

Variables Independientes 19

Variables Dependientes 19

HIPÓTESIS 20

CAPITULO I 21

1. MARCO REFERENCIAL 21

1.1. Contaminación de agua y sedimentos 21

1.2. Digestión Anaerobia 22

1.2.1. Fases microbiológicas del proceso anaerobio 23

1.2.2. Factores indispensables para la Digestión Anaerobia 24

1.3. Arqueas Metanogénicas 24

1.3.1. Taxonomía de Bacterias Metanogénicas 25

1.4. Aplicaciones Biotecnológicas de microorganismos Metanogénicos 27

1.4.1. Biogás 27

1.5. Metano, Dióxido de carbono, Sulfuro de hidrógeno y los riesgos para el ser

humano y el ecosistema 28

1.6. Métodos de aislamiento y caracterización de metanógenos 29

1.7. Cromatografía Gaseosa 30

CAPÍTULO II 32

2. MATERIALES Y MÉTODOS 32

2.5. Toma de muestra 36

2.6. Aislamiento de Microorganismos Metanógenos 36

2.6.2. Inoculación de la muestra 38

2.7. Observación Macroscópica de los Medios de Cultivo 40

2.7.2. Observación en agar 40

2.8. Identificación Fenotípica 40

2.8.1. Tinción de Gram 41

2.8.1.1. Observación Microscópica 42

2.8.2. Pruebas Bioquímicas 42

2.8.2.1. SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio 42

2.8.2.2. TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar 43

2.8.2.3. Citrato de Simmons Agar 45

2.8.2.4. Caldo de Urea 46

2.9. Medición de la Producción de Gas Metano 47

2.10. Análisis Estadístico de los Resultados. 49

CAPÍTULO III 50

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50

CAPÍTULO IV 73

4. CONCLUSIONES 73

CAPÍTULO V 74

5. RECOMENDACIONES 74

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75

ANEXOS 82

ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Coordenadas Geográficas de los Sitios de Muestreo .................................................... 32

Tabla 2. Materiales, equipos y reactivos de Laboratorio ............................................................ 35

Tabla 3. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Baker-Taha para aislar

bacterias del género Methanobacterium ...................................................................................... 37

Tabla 4. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Standman-Barker para

aislar bacterias del género Methanococcus. ................................................................................ 38

Tabla 5. Morfología de las Metanobacterias en Tinción de Gram .............................................. 42

Tabla 6. Fórmula de SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio aproximada por litro de agua

destilada ...................................................................................................................................... 42

Tabla 7. Fórmula de TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar aproximada para un litro de agua

destilada. ..................................................................................................................................... 43

Tabla 8. Fórmula de Agar citrato de Simmons aproximada por litro de agua destilada ............. 45

Tabla 9. Fórmula de Caldo de Urea aproximada por litro de agua destilada .............................. 46

Tabla 10. Composición de los reactores de producción de biogás. ............................................. 48

Tabla 11. Protocolo de medición de producción de biogás ......................................................... 48

Tabla 12. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Medio sólido. ...... 52

Tabla 13. Recuento de UFC/mL de metanobacterias en Placa ................................................... 53

Tabla 14. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Caldo. ................. 54

Tabla 15. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable ...................... 56

Tabla 16. Resultados Prácticos del SIM Medio - Methanococcus Aisladas ............................... 62

Tabla 17. Resultados Prácticos del Agar Citrato De Simmons ................................................... 63

Tabla 18. Resultados Prácticos del Agar TSI .............................................................................. 64

Tabla 19. Resultados Prácticos de Caldo de Urea. ...................................................................... 65

Tabla 20. Contenido de CH4 y CO2 obtenido de la muestra Patrón ............................................ 66

Tabla 21. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la primera semana de

producción de biogás .................................................................................................................. 67

Tabla 22. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la segunda semana de

producción de biogás .................................................................................................................. 69

Tabla 23. Producción de biogás en la tercera semana de codigestión anaerobia ........................ 70

Tabla 24. Recuento de Colonias en Agar mediante el conteo manual en placas. ....................... 93

Tabla 25. Recuento de Colonias en Caldo mediante la técnica del Número más Probable. ....... 94

Tabla 26. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio Agar

Standman-Barker conteo en placas teñidas ................................................................................. 95

Tabla 27. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en el

medio Agar Standman-Barker..................................................................................................... 96

Tabla 28. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio Agar Barker

conteo-Taha en placas teñidas. .................................................................................................... 97

Tabla 29. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en el

medio Barker-Taha ..................................................................................................................... 98

Tabla 30. Resultados cuantitativos y semicuantitativos de bacterias metanogénicas en todos los

campos de observación de la tinción de Gram. ........................................................................... 99

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Digestión Anaerobia ........................................................................................ 22

Figura 2. Fases del Proceso de la Digestión Anaerobia .................................................. 24

Figura 3. Clasificación de las bacterias metanogénicas según su orden. ........................ 26

Figura 4. Punto de Muestreo N° 1. ................................................................................. 33

Figura 5. Punto de Muestreo N° 2, descarga de agua residual. ...................................... 33

Figura 6. Punto de Muestreo N° 2. ................................................................................. 34

Figura 7. Punto de Muestreo N° 3 .................................................................................. 34

Figura 8. Punto de Muestreo N°4. .................................................................................. 35

Figura 9. Sistema de Biorreactores de generación de Biogás ......................................... 47

Figura 10. Medio Barker-Taha sin inóculo ..................................................................... 50

Figura 11. Medio Barker-Taha con crecimiento bacteriano. .......................................... 51

Figura 12. Medio Standman-Barker sin inóculo. ............................................................ 51

Figura 13. Morfología colonial en el medio Standman-Barker ...................................... 52

Figura 14. Recuento de UFC/mL de metanobacterias. ................................................... 53

Figura 15. Medio Barker-Taha en caldo sin inóculo. ..................................................... 54

Figura 16. Medio Barker-Taha en caldo, producción de gas en tubo Durham. .............. 54

Figura 17. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo. ............................................. 55

Figura 18. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo. ............................................. 55

Figura 19. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable ........ 56

Figura 20. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram

aisladas en medio sólido ................................................................................................. 57

Figura 21. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram

aisladas en caldo. ............................................................................................................ 57

Figura 22. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en

el medio Agar Barker-Taha ............................................................................................ 58

Figura 23. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram aisladas

en medio Sólido .............................................................................................................. 59

Figura 24. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram aisladas

en caldo. .......................................................................................................................... 59

Figura 25. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en

el medio Agar Standman-Barker. ................................................................................... 60

Figura 26. Género de predominio en placas teñidas. ...................................................... 61

Figura 27. Presencia de H2S, turbidez del medio y cepas móviles, sin cambio de color

ante el reactivo Kovac`s respectivamente. ...................................................................... 62

Figura 28. Índice de Alcalinidad, viraje azul .................................................................. 63

Figura 29. Reacciones de fermentación de azúcares. Ennegrecimiento del medio

indicativo de H2S. Presencia de gases ............................................................................ 64

Figura 30. Resultado Positivo en caldo ureasa. .............................................................. 65

Figura 31. Patrón de una mezcla gaseosa de CH4 y CO2. ............................................... 66

Figura 32. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

Methanococcus y Methanobacterium en la primera semana. ......................................... 68

Figura 33. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

Methanococcus y Methanobacterium en la segunda semana. ........................................ 69

Figura 34. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos donde

se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 15 días. .................................. 70

Figura 35. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

Methanococcus y Methanobacterium en la tercera semana. ........................................... 71

Figura 36. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos donde

se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 20 días. .................................. 71

ÍNDICE DE ANEXOS

Pág.

Anexo A. Toma de muestra de sedimento en Estero El Macho ..................................... 82

Anexo B. Agares para la Identificación fenotípica ......................................................... 83

Anexo C. Dispensación de agares MB y MC. ................................................................ 84

Anexo D. Almacenado de muestras inoculadas en jarra de anaerobiosis por extinción

vela. Atmósfera libre de O2. ........................................................................................... 85

Anexo E. Dispensación de agar TSI, Agar SIM medio, Citrato de Simmons agar y Urea

para la realización de pruebas bioquímicas. ................................................................... 86

Anexo F. Proceso de tinción de Gram. ........................................................................... 87

Anexo G. Armado de biorreactores para la producción de gas metano. ........................ 88

Anexo H. Observación Microscópica ............................................................................. 89

Anexo I. Cromatógrafo de Gases FULI .......................................................................... 90

Anexo J. Autoclave ......................................................................................................... 91

Anexo K. Microscopio OLYMPUS................................................................................ 92

Anexo L. Tabulaciones de los resultados de análisis microbiológicos. .......................... 93

Anexo M. Tabla del número más probable (NMP) ...................................................... 100

Anexo N. Tabla de Limites de descarga a un cuerpo de agua marina. ......................... 101

15

INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas, el incremento poblacional, la urbanización y el accionar negativo

del ser humano en la naturaleza, provocan elevados índices de contaminación que alteran

el medio ambiente produciendo el agotamiento futuro de los recursos naturales. El agua

es fuente de vida, nuestra tierra está formada por cuerpos de agua entre ellos los esteros

que son superficies pantanosas de gran caudal que desemboca en las zonas costeras, por

ello son gran preocupación debido a la contaminación que existe por ser ecosistemas de

amplia susceptibilidad y fragilidad, encontrándose entre las principales causas de

polución las descargas de aguas residuales y la falta de tratamiento para sedimentos

activos. 1

El medio ambiente tiene la capacidad de autodepuración ante la pequeña carga natural de

contaminantes, pero debido a los incrementos inmanejables, la naturaleza no puede

controlar estas amenazas de destrucción de ciclo continuo. La Ecosalud nos manifiesta

entre sus principios el saneamiento ecológico sostenible para el ser humano, actualmente

se utilizan procesos biotecnológicos para la conservación del medio ambiente. Estos

procesos utilizan microorganismos de reproducción anaeróbica que en sistemas

conocidos como biorreactores donde se produce aprovechamiento de los residuos

orgánicos para la producción de fuentes energéticas como el biogás. “2”, “3”

La digestión anaeróbica trata de un conjunto de reacciones de tipo óxido-reducción que,

con la ayuda de enzimas complejas, llegan a tener la capacidad de degradar algunos

compuestos. Este proceso se realiza comúnmente en residuos, mineralizan el material

orgánico que se encuentran sin oxígeno. 4

El proceso bioquímico de la digestión anaeróbica comprende cuatro etapas; hidrólisis,

acidogénesis, acetogénesis y metanogénesis. En la primera lo que sucede es la hidrólisis

de los compuestos de alto peso molecular, donde se digieren algunos elementos como son

los lípidos y las proteínas. 5

En la segunda etapa, la acidogénesis, es la que transforma los compuestos antes

mencionados en ácidos grasos volátiles. En la siguiente etapa, se transforman estos en

16

ácido acético y la última que es nuestro objeto de estudio, las bacterias metanogénicas

transforman estas moléculas en metano y dióxido de carbono. 6

Las arqueas metanógenas son bacterias que producen metano en medios anóxicos como

el sedimento de ríos, humedales y lagos debido a que los organismos micobiontes hacen

que la materia orgánica sea despolimerizada para que después estos monómeros se

fermentan a CO2, algunos alcoholes de cadena corta de ácidos grasos que posteriormente

van a ser reducidos por otros microorganismos sintrófilos hasta H2, CO2 y acetato. 7 Estas

son muy importantes en la degradación de la materia orgánica, siendo su producto final,

el metano. 8

Los microorganismos metanógenos se pueden diferenciar a las diversas especies por su

morfología; debido a que se encuentran en forma de cocos filamentosos, formando

cadenas, racimos o tétradas comúnmente se distinguen las Methanococaceas y

Methanosarcinas; bacilos cortos o largos observadas en el género Methanobacterium,

estas diversas especies pueden definirse como Gram negativos o positivos según su

afinidad específica por el mordiente. “9”,“14”

Teniendo en cuenta la importancia de estos microorganismos en los procesos en el

tratamiento de sedimentos residuales, este estudio se basa en la caracterización del

sedimento urbano del Estero el Macho de la ciudad de Machala.

17

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la ciudad de Machala en los años 90 se dio un significativo incremento en la población

y migración en busca de ofertas de trabajo. La necesidad de vivienda para nuevos

pobladores causó que la ciudad se expanda con invasiones en los alrededores del estero

lo que hoy en día es la fuente de mayor contaminación. 10

En la ciudad de Machala las aguas residuales urbanas son descargadas directamente a los

esteros el Macho y Huayla que la rodean. Por ello es fundamental controlar el impacto

ambiental que constituyen esta agresión a los mares y océanos, así como es un peligro

latente para la salud de los seres humanos.

En nuestro país hay escasas plantas de tratamiento de aguas residuales. Lo cual no es

ajeno a la ciudad de Machala, donde no se tratan sus lodos activados, siendo de gran

importancia los estudios que se realicen enfocados a la evaluación biológica y ecológica

de entornos con agua negras con grandes porcentajes de toxicidad y peligrosidad.

La composición residual de este Estero se puede evidenciar debido a la coloración

negruzca verdosa, que es índice de ser un canal de aguas contaminadas en donde se

pueden encontrar compuestos orgánicos e inorgánicos, así como una amplia carga

bacteriana con diferentes tipos de bacterias.

La falta de tratamiento de los lodos activados en El Estero el Macho es evidente debido a

los fuertes malos olores producidos por gases como el sulfhídrico, y otros que están

presentes en pequeñas concentraciones como el amoniaco, compuestos órgano sulfurados

como los tiofenos, sulfuros de dimetilo, algunos mercaptanos de bajo peso molecular,

fenoles y aminas como la cadaverina o la putrescina. Estos gases no solamente son causa

de fatiga nasal, sino que provocan en elevadas concentraciones, daños a nivel respiratorio

y nervioso en los seres humanos. 11

El metano y dióxido de carbono también son generados en este Estero gracias a la

existencia de grandes cantidades de residuos orgánicos presentes en el sedimento, los

mismos que proveen a las bacterias anaerobias compuestos carbonados, alcohólicos,

18

ácidos orgánicos y otras moléculas más pequeñas para la producción de estos gases, los

cuales son emitidos hacia la atmósfera terrestre ocasionando el efecto invernadero, que

ha producido un sin número de alteraciones en la naturaleza que en el futuro impedirán

la supervivencia del ser humano. 12

Por todo lo antes mencionado es importante la caracterización del sedimento del Estero

el Macho, debido a que se identifica bacterias anaerobias metanogénicas, antes no

estudiadas, proporcionando evidencia científica para el tratamiento residual con métodos

microbiológicos y biotecnológicos que lograrán mitigar el problema mediante el

aprovechamiento de residuos orgánicos presentes en nuestra ciudad.

PROBLEMA GENERAL

¿Es posible caracterizar bacterias metanogénicas mediante métodos microbiológicos en

muestras del sedimento para evaluar el potencial de oxidación anaeróbica de metano en

el Estero El Macho de la ciudad de Machala?

PROBLEMAS ESPECÍFICOS

¿Se puede aislar bacterias metanogénicas del sedimento del Estero El Macho a

través de medios de cultivo mediante la incubación en anaerobiosis?

¿Es posible Identificar por microscopia óptica la morfología fenotípica de

bacterias metanogénicas encontradas en el estero El Macho?

¿Es posible caracterizar metabólicamente mediante pruebas bioquímicas a las

bacterias metanogénicas?

¿Se puede determinar CH4 y CO2 por cromatografía gaseosa?

19

OBJETIVOS

Objetivo General

Caracterizar bacterias metanogénicas mediante métodos microbiológicos en muestras del

sedimento para evaluar el potencial de oxidación anaeróbica de metano en el Estero El

Macho de la ciudad de Machala.

Objetivos Específicos

● Aislar bacterias metanogénicas del sedimento del Estero El Macho a través de

medios de cultivo mediante la incubación en anaerobiosis.

● Identificar por microscopia óptica la morfología fenotípica de bacterias

metanogénicas encontradas en el estero El Macho.

● Definir mediante pruebas bioquímicas las características metabólicas de las

bacterias metanogénicas.

● Determinar por Cromatografía gaseosa la producción de gas metano mediante

codigestión anaerobia de las bacterias metanogénicas aisladas con biomasa

lignocelulosica.

VARIABLES

Variables Independientes

● Bacteria aislada

Variables Dependientes

● Característica morfología

● Concentración de gas metano generado

● Actividad metabólica

20

HIPÓTESIS

Los lugares de muestreo de sedimento del Estero el Macho influyen en el tipo de bacteria

metanogénicas aislada y en las características del gas metano obtenido mediante digestión

anaerobia.

21

CAPITULO I

1. MARCO REFERENCIAL

1.1. Contaminación de agua y sedimentos

La calidad de agua es uno de los aspectos más importantes en la actualidad ya que es el

principal recurso utilizado por la humanidad en casi todas las actividades diarias. No solo

su consumo, sino estar rodeada de ella también es un factor que puede ser causante de

riesgos o beneficios tanto para la salud humana como para el medio ambiente en el que

vivimos. El estero El Macho es un canal de gran extensión, en donde la actividad

antropogénica está en constante desarrollo. 13

Los sedimentos son aglomeraciones de tierra o arcilla que se encuentran en el fondo del

agua, acumuladas por producto del propio suelo o también por el proceso de

descomposición que sufren las plantas o material orgánico. El Estero El Macho, no tiene

tratamiento de aguas residuales, por ello es notorio que la materia orgánica sea arrastrada

por la corriente, produciendo residuos peligrosos que generan modificaciones

ambientales que el propio ser humano provoca. 13

En el sedimento, se concentran los microorganismos metanogénicos, donde aprovecha la

descomposición orgánica para subsistir en su medio anaerobio desprendiendo algunos

tipos de gases, pero en mayor proporción el metano y el dióxido de carbono. La desventaja

de estos gases es que se concentran en la atmósfera ocasionando así el efecto invernadero

en el medio ambiente, arrojando radiaciones en varias direcciones y provocando un

aumento de temperatura. 14

Si bien es cierto, el efecto invernadero es parte importante para el mantenimiento de la

temperatura atmosférica, pero el ser humano cada día realiza actividades que no son

propias de la naturaleza, contaminando y ocasionando más riesgos y efectos negativos

para la salud de la tierra y del mismo.

Un tratamiento de sedimentos urbanos para mejorar la salud en general, provocaría una

gran diferencia en el sector del Estero El Macho, aprovechando estos gases para beneficio

22

de las actividades humanitarias y reduciendo el riesgo de contaminación al medio

ambiente. 15

1.2. Digestión Anaerobia

La digestión anaerobia es un proceso en el cual la materia orgánica se degrada en carencia

de oxígeno, generando una aleación de gases producto de la fermentación microbiana. 16

El producto más importante de la digestión anaerobia es el biogás el cual está compuesto

por un conjunto de gases entre ellos el de mayor relevancia es el metano en una

aproximación de 50-70. 17 Otro importante es el dióxido de carbono en una proporción de

30-50, además existen algunas cantidades de otros gases como el hidrógeno, oxígeno,

nitrógeno y sulfuro de hidrógeno dependiendo de la materia orgánica de material

fácilmente biodegradable y del proceso de descomposición. “3”,“17”

La digestión anaeróbica actualmente se usa como un proceso de tratamiento residual en

donde se logra recuperar energía, así como controlar la contaminación ambiental. 18

Figura 1. Digestión Anaerobia

Fuente: Autores

23

1.2.1. Fases microbiológicas del proceso anaerobio

En el fondo del Estero El Macho, existen sedimentos acuosos, donde participan bacterias

anaeróbicas que se nutren de los residuos orgánicos produciendo varios tipos de gases.

Estas bacterias pasan por un proceso que genera el gas metano y CO2, que son los gases

que se encuentran en mayor abundancia como producto, este proceso de digestión

anaerobia consiste en 4 etapas: 19

Hidrólisis: Es la primera etapa que ocurre para que se desencadene el proceso de la

digestión anaerobia. Aquí participan algunas enzimas secretadas por bacterias hidrolíticas

encargadas de llevar a cabo el proceso de digestión de compuestos como lípidos,

polisacáridos, proteínas, entre otros, ya que las paredes de estos microorganismos no

permiten su descomposición. 19

La hidrólisis de los compuestos polisacáridos ocurre en pocas horas, ya los lípidos y las

proteínas demoran días. Y estos compuestos dan como resultados los azúcares, alcoholes,

ácidos, polipéptidos, los cuales ya son aptos para cruzar la pared celular de bacterias

fermentativas para dar el siguiente paso. 19

Acidogénesis: Luego de haber pasado por la etapa de la hidrólisis, el producto que queda

es asimilado por las bacterias acidogénicas, que son características de poseer un

crecimiento rápido, estas transforman a dichos azúcares, alcoholes, polipéptidos y ácidos

en ácidos grasos volátiles, alcoholes, cetonas, hidrógeno y otros más. “19”,“20”

Acetogénesis: Posteriormente, se acerca la etapa de la acetogénesis, bacterias que utilizan

hidrógeno, llegan al acetato a partir de hidrógeno y CO2, aquí ocurre la transformación

de los ácidos grasos volátiles en ácido acético. Esta etapa de la respiración anaeróbica

solamente va a ocurrir siempre y cuando el medio presenta concentraciones bajas del

producto generado, es decir, cuando existen otros microorganismos que lo consumen. 19

Metanogénesis: La metanogénesis es la fase donde termina la digestión anaerobia. A

partir de dos rutas metabólicas se forma el metano; es el primer lugar en donde se

producen bacterias que crecen con el sustrato acetato que son nombradas bacterias

acetoclásticas y la otra es la de los microorganismos que se alimentan con hidrógeno y

dióxido de carbono como sustrato a esta se denomina hidrogenotrófica. “19”,”21”

24

Figura 2. Fases del Proceso de la Digestión Anaerobia

1.2.2. Factores indispensables para la Digestión Anaerobia

Para que se lleve a cabo de manera correcta la digestión anaeróbica en el ciclo

metanogénico, es necesario la presencia de algunos factores condicionantes, como en es

en este caso los principales, la materia orgánica y la temperatura, para este estudio, las

principales bacterias involucradas son Methanobacterium y Methanococcus que se

reproducen en temperaturas de entre 30 y 46°C. Además, existen otros factores químicos

que influyen también en este proceso, como son el nitrógeno, el fósforo, el pH (grado

alcalino), la presencia de ácidos grasos volátiles y el medio anóxico fundamental para el

desarrollo de estas bacterias. 22

1.3. Arqueas Metanogénicas

Las arqueas metanogénicas tienen un estilo de vida estrictamente de tipo anaeróbico, no

necesitan oxígeno para subsistir. Estas son los únicos microorganismos distribuidos en el

medio ambiente que consiguen sobrevivir tomando la energía a partir de hidrógeno y

25

metano. Además de existir en el agua y en la tierra, estas bacterias metanogenas son

pobladoras del rumen. “23”,”24”

Las bacterias metanogénicas se nutren mediante tres vías que son:

● Metanógenos hidrogenotróficos: Por medio de esta vía, las bacterias crecen en

presencia de hidrógeno molecular quien dona los electrones y el dióxido de

carbono quien los acepta. 25

● Metanógenos acetoclásticos: En esta vía, ocurre el rompimiento del acetato en

metilo y carbonilo y reduce el metilo a metano oxidando el carbonilo a dióxido de

carbono. 25

● Metanógenos metilotrópicos: Viven en compuestos metilados. 26

1.3.1. Taxonomía de Bacterias Metanogénicas

Existen alrededor de ochenta y tres especies de estas bacterias, que, a su vez se subdividen

en tres grandes grupos. El primero, que contiene la mayor cantidad de especies, alrededor

de sesenta y uno, los metanógenos hidrogenotróficos que oxida el hidrógeno y reducen el

CO2 para formar así el gas metano. El segundo grupo son los metilotrofos que, para el

mismo fin, utilizan compuestos de metilo y por último los metanógenos acetotróficos que

utilizan al acetato. 27

Dentro de la clasificación taxonómica, las metanobacterias comprenden familias, la

primera que son denominadas Methanobacteriaceae que a su vez consta de cuatro

géneros distintivos morfológicamente, algunas de ellas son termofílicas (que resisten a

temperaturas extremadamente elevadas) y otras son alcalófilas (referente a

microorganismos que sobreviven a ambientes con pH de 8,5 a 11) ejemplo de ello son las

metanobacterias subterráneas. Todas las especies de metanobacterias pueden crecer en

hidrógeno y CO2, pero existen otros tipos de metanobacterias que pueden crecer en

formiato como son las M. formicicum, M. subterranium, M. thermoflexum, entre otras. El

género Methathermobacter forma parte de esta familia, el cual incluye tres especies

llamadas methanothermobacter thermoautotrophicus, Methanothermobacter Wolfeii, y

methanothermobacter marburgensis. Existen especies que sobreviven en el ganado

bovino como la M. ruminantium y otras que prevalecen en el tracto gastrointestinal de

animales y humanos y también en el fondo de las aguas residuales. Las M. Oralis

encontradas en la placa subgingival de seres humanos. En esta familia encontramos el

género Methanosphaera, que son Gram positivos aislados de las heces de humanos. 27

26

Figura 3. Clasificación de las bacterias metanogénicas según su orden.

Otra familia se conforma por las Methanothermaceae y Methanocaldococcaceae que son

las encontradas en manantiales volcánicos con una temperatura de ochenta grados

centígrados, adicional a estos también existen en esta familia los methanocorpusculaceae

que contiene un sólo género llamado Methanocorpusculum. Los Methanococcales son

los existentes en ambientes marinos y costeros. En ella está el género Methanococcus en

el cual han incluido nuevas especies que son las M. Fervens y M. Vulcanius. Los

methanomicrobiales que comprenden nueve géneros más. Se crea el género

Methanolacinia para incluir a los Methanomicrobium Paynteri, aislados de sedimentos

marinos. Finalmente, en la tercera familia está la Methanospirilaceae y además existen

las Methanosarcinaceae que son metanobacterias de vías acetotróficas. “27”,“28”

Las bacterias metanogénicas son microorganismo que disminuye el nivel de hidrógeno

en la producción de CH4, siendo parte de microbiota presente en la fermentación de los

alimentos con bacterias sacarolíticas que consumen los seres humanos. Debido a esto se

sugiere que estas bacterias colonias el tracto gastrointestinal promoviendo enfermedades

digestivas como el cáncer, obesidad y enfermedades inflamatorias en el intestino. Según

Jeroen está comprobado que las arqueas están presentes durante la etapa escolar, lo que

27

indica que la colonización de estas bacterias se da durante la infancia produciendo

problemas en la salud a largo plazo en la adultez de los seres humanos. 29

1.4. Aplicaciones Biotecnológicas de microorganismos Metanogénicos

1.4.1. Biogás

El biogás es una de las armas del futuro, será la fuente de energía utilizada para los años

siguientes, ya que es no contaminante y además reutiliza la materia orgánica que hace

daño al planeta. Siendo la forma más ingeniosa de obtención de energía. El biogás es

producido por el producto de la digestión anaeróbica, básicamente del gas metano y

dióxido de carbono, pero además de estos, el biogás contiene amoniaco, nitrógeno,

oxígeno, hidrógeno, monóxido de carbono y sulfuro de hidrógeno en pequeñas

cantidades. En Europa ya se utilizan sistemas de generación a gran escala de biogás, para

ser aprovechado como combustible mayoritariamente, y su uso sigue creciendo en

algunos países del mundo. 30

Los estudios tecnológicos de este tipo de gas ecológico siguen avanzando con el pasar de

los años, y se sabe que para su utilización a niveles industriales se necesita gran inversión

económica, para proteger al medio ambiente aprovechando residuos peligrosos. 31

El objetivo de esta tecnología, es sustituir además el gas de cocina por éste, aunque se

tendría que tener un valor elevado de concentración de metano para obtener el éxito. Si

se aumenta la presión utilizada en el biogás, a una menor concentración de metano, sería

la mejor forma de suministro de gas natural. Por ejemplo, el gas de cocina utiliza una

presión de 20 mbar, esta debería ser aumentada a 100 mbar con el gas metano. Con la

reutilización de la materia orgánica descompuesta, podemos no solo evitar la

contaminación ambiental, sino también utilizarla a nuestro favor. 32

La metanogénesis en sí, es la producción biológica del gas metano. Un gas que provoca

el efecto invernadero, sabemos que hoy en día se ha triplicado su concentración de este

gas en la atmósfera. Las metanobacterias se encuentran en abundancia en los lodos

residuales, su tratamiento ayudaría a reducir la producción de estas bacterias y por ende

el desprendimiento de este gas hacia la atmósfera pudiendo ser utilizado en otros

beneficios no contaminantes. 33

Si bien es cierto, la inversión para el tratamiento de lodos residuales es enorme, sin

embargo, es necesario tanto para el mejoramiento del medio ambiente, como para la

28

calidad de vida de los habitantes que rodean el sector del estero El Macho, ya que tendrían

un ambiente con mejor visibilidad y el Estero no llegaría a desprender malos olores como

lo es hoy en día, ni existiría ningún peligro contaminante para niños y adultos que deben

frecuentar esa ruta. 34

1.5. Metano, Dióxido de carbono, Sulfuro de hidrógeno y los riesgos para el

ser humano y el ecosistema

El calentamiento global es producto de las emisiones en altas concentraciones de gases

de efecto invernadero producto de las actividades del hombre, entre estos gases los

principales son el CH4 y CO2; los cuales ocasionan cambios desequilibrados de

temperatura de los océanos y del aire, provocando modificaciones geográficas como el

derretimiento de los polos y junto a ello la elevación del nivel del mar y todo tipo de

desastres naturales. “4”,”12”

Los patrones climáticos con altos índices de alteración, producen enfermedades en los

seres humanos, efectos directos como los cambios fisiológicos por frío o calor. Asimismo,

indirectamente la dinámica de enfermedades contagiosas derivadas de poblaciones de

vectores epidemiológicos emerge de zonas erradicadas por su incremento reproductivo.

Todo esto antes mencionado junto con la decadencia de recursos naturales impedirá la

supervivencia de la población a nivel mundial. 12

El H2S un gas de alta toxicidad para las personas, con un olor característico putrefacto,

que en concentraciones bajas de 0.3-0.0005 ppm en el aire. Este gas puede ser encontrado

en aguas termales, aguas estancadas, esteros y lagunas. Además, también es parte de

sistemas de alcantarillas municipales y plantas de tratamiento de lodos y aguas negras.

En nuestro organismo se puede encontrar cuando las bacterias del tracto digestivo cuando

se produce la digestión de alimentos de origen proteico. 35

El H2S en concentraciones entre los 0.00011-0.00033 ppm se han producido riesgos en la

salud presentándose en las personas expuestas afecciones a nivel respiratorio y nervioso.

Así mismo se producen daños a nivel de la mucosa respiratoria como nariz y garganta e

irritación de ojos. En concentraciones de 500 ppm se ha presentado en personas expuestas,

dificultad respiratoria incluyendo paro cardiorrespiratorio, cansancio y alteraciones

motoras. “35”,”36”

29

El dióxido de carbono se encuentra todo el tiempo en la atmósfera en su proporción

normal de 250-350 partes por millón, siendo así parte de la respiración, pero este gas en

altas concentraciones produce efectos negativos tanto para la salud como para el medio

ambiente. En cantidades bajas, de más o menos mil a dos mil partes por millón ya

contamos con una menor calidad de aire, en cambio ya con una concentración mayor a

dos mil, se empiezan a tener reacciones como mareos, pérdida de concentración,

problemas en la respiración y dolores de cabeza, y así a medida que se aumenta la

concentración de dióxido de carbono en la atmósfera se van incrementando los efectos

negativos para el ser humano como la asfixia. Este gas es uno de los principales causantes

del efecto invernadero, por ende, el calentamiento global, gracias a las actividades que

realiza el ser humano a diario, la liberación de CO2 es cada vez mayor, ya sea con el uso

de la gasolina, petróleo, entre otros, que contribuyen a una mayor contaminación hacia el

medio en el que vivimos. 12

1.6. Métodos de aislamiento y caracterización de Metanógenos

Existen algunos métodos accesibles para lograr el aislamiento y caracterización de las

bacterias metanogénicas, como es el aislamiento de colonias en cajas Petri donde se

aplican medios de cultivo como el medio fosfato buffer, normalmente utilizado por la

ventaja de que no es tóxico. También es utilizado el medio agar Barker-Taha para la

identificación de metanógenos del género Methanobacterium y el medio Standman-

Barker en el aislamiento de metanógenos del género Methanococcus. Por otro lado,

también se aplica la caracterización con otros medios de cultivo como el agar nutritivo,

el medio SPS en que se utiliza al Clostridium spp., como cepa de referencia debido a que

esta especie pertenece a la familia de las bacterias anaerobias estrictas. 37

En estos medios de cultivo existen también técnicas distintas que se pueden aplicar, como

es la siembra por inoculación, donde se toma la muestra y se la disuelve con un asa en el

medio, la siembra por estría que es donde se obtiene un medio sólido y se realiza una

estría en zig zag en el medio con cuidado por lo que se puede romper el medio, y la

siembra por picadura, donde se toma el asa con la muestra y se realizan algunas picaduras

al medio.

Además de los medios de cultivo también existe el método del número más probable

(NMP) que se trata de inocular las muestras en medios de cultivo en estado líquido,

previamente diluida en varias concentraciones y luego llevarlas a incubadora para la

30

observación del crecimiento de estas bacterias, se nota un cambio a color turbio o

presencia de un anillo para la confirmación de crecimiento. 38

La realización de pruebas bioquímicas es aplicada para la caracterización de las bacterias

metanogénicas, en donde se pueden aplicar los medios: TSI, glucosa, SIM medio, citrato,

triptófano, urea y fructosa. El medio ureasa se utiliza para la determinación de la

capacidad de una bacteria para separar la urea logrando la formación de dos moléculas de

NH3 por acción enzimática de la ureasa que produce una coloración rojiza en el medio.

La enzima ureasa es relevante para descomponer compuestos inorgánicos. 39

El SIM medio es un medio utilizado para la diferenciación de bacterias verificando la

producción de indol, producción de sulfuro de hidrógeno y la movilidad. El aminoácido

triptófano es parte de muchas peptonas, al ser oxidado produce la formación de indol que

se produce se conjuga con el reactivo Kovac’s formando una coloración roja. El tiosulfato

de sodio y el sulfato de amonio ferroso son parte importante como indicadores de H2S,

provocando un precipitado negro. 37

El agar de hierro triple azúcar (TSI) es un medio diferencial de bacilos gramnegativos en

base a la fermentación de carbohidratos y producción de H2S, el agar está formado por 3

azúcares dextrosa, sacarosa y lactosa; también rojo fenol como indicador de la

fermentación y el sulfato de amonio ferroso para la verificación de gas de H2S. 40

El medio citrato de Simmons agar es un medio de cultivo donde el citrato de sodio es la

única fuente de carbono y el monofosfato de amonio es la única fuente de nitrógeno,

indispensables para el desarrollo de las bacterias, las sales de fosfato conforman un buffer,

el cofactor enzimático es el magnesio. El indicador de pH es el Azul de Bromotimol, y el

componente que mantiene el balance de osmosis es el cloruro de sodio. 41

1.7. Cromatografía Gaseosa

Esta es una de las técnicas más avanzadas y más eficaces de separación de mezclas de

gases, en donde estos serán conducidos en dos fases, una móvil y una estacionaria, dos

fuerzas que atraerán los componentes a separar, los que sean más afines con la fase móvil

(donde se utiliza un gas inerte llamado gas portador), correrán a un sentido definido

rápidamente, y los que se mueven más despacio son los que serán adheridos a la fase

estacionaria que sucede debido a fenómenos de desorción y adsorción. 42

La cromatografía de gases contiene un alto grado de sensibilidad, pudiendo detectar de la

más mínima cantidad de gas involucrado. Generalmente, existen parámetros límites para

31

la separación de gases, como la temperatura que debe ser de máximo 400°C y los

compuestos deben tener un peso molecular menor a mil. Este proceso consta de un

sistema de repartición en donde la muestra inyectada a elevadas temperaturas atraviesa la

columna en donde los separarán y serán conducidos a un equipo de detección y arrojará

la columna resultante con las cantidades y gases contenidos. 43

32

CAPÍTULO II

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Unidad de estudio

El estero El Macho se encuentra situado en la ciudad de Machala al Norte con una

longitud de 6.5 Km y aproximadamente 27 m de ancho, la corriente del mismo tiene una

dirección Este-Oeste; el estero inicia en el Grupo Bolívar recorriendo la circunvalación

Norte siguiendo por la vía Ferroviaria cruzando por la Cdla. Acacias hasta la Cdla. 24 de

Septiembre y Rayito de Luz. 10

Según el Instituto Geográfico Militar este territorio posee un clima tropical megatérmico

seco, en el cual su periodo de máxima temperatura se encuentra en la temporada invernal

(marzo-abril), registrando temperaturas de 34°C; mientras que los periodos de menor

temperatura (agosto-octubre) varían de 21 a 26 °C. 10

2.2. Tipo de Estudio

El estudio es de tipo experimental.

2.3. Muestra

La selección del sitio de toma de muestra se priorizo por las comunidades expuestas, la

incidencia de descargas de aguas servidas y las fuentes contaminantes proximales al

Estero. La muestra es el Sedimento del Estero el Macho. La localización de cada punto

de muestra se detalla a continuación

Tabla 1. Coordenadas Geográficas de los Sitios de Muestreo

PUNTOS DE MUESTREO X Y

P1 3°15'34.0"S 79°55'29.1"W

P2 3°15'25.6"S 79°55'55.3"W

P3 79°56'19.5"W 79°56'19.5"W

P4 3°14'41.6"S 79°57'10.4"W

Fuente: Autores

33

2.3.1. Punto de Muestreo N° 1.

El muestreo se realizó en el sector de la Finca Bananera El Cornejo en el Barrio Rayito

de Luz en la conocida vía Limón de la Parroquia Providencia, Figura 4 donde existe gran

tráfico vehicular y efluentes de la producción bananera como pesticidas y residuos de

materia orgánica.

Figura 4. Punto de Muestreo N° 1.

Fuente: Autores

2.3.2. Punto de Muestreo N° 2.

Aproximadamente a 200 m del Colegio El Oro, entre las parroquias Jubones y la

Providencia, Figura 5 frente a la Planta de Asfalto de Machala se encuentra una fuente de

descarga de agua residual.

Figura 5. Punto de Muestreo N° 2, descarga de agua residual.

Fuente: Autores

34

Figura 6. Punto de Muestreo N° 2.

Fuente: Autores

2.3.3. Punto de Muestreo N° 3.

En los Vergeles Sector D por la antigua vía limón frente a la empresa cervecera Dica C

Ltda., fue el punto de recolección, Figura 7 en donde existen algunos tubos de descargas

de agua residual, así como mucha contaminación por parte de los habitantes del sector.

Figura 7. Punto de Muestreo N° 3

.

Fuente: Autores

2.3.4. Punto de Muestreo N°4.

En la vía la primavera a unos 500 m de redondel del burro está el puente de entrada del

sector los Sauces I, Figura 8 hay un gran asentamiento poblacional junto con numerosos

sitios de descargas de aguas servidas, además se observan lavadoras de carros y talleres

mecánicos por los alrededores.

35

Figura 8. Punto de Muestreo N°4.

Fuente: Autores

2.4. Materiales, Equipos y Reactivos de Laboratorio

Tabla 2. Materiales, equipos y reactivos de Laboratorio

EQUIPOS MATERIALES SUSTANCIAS MEDIOS DE

CULTIVO

● Microscopio

Óptico

Marca

OLYMPUS

BX53

● Estufa

● Incubadora

Marca

Memmert

● Mechero

● Cromatógraf

o de gases

Marca FULI

9790II

● Balanza

Analítica

Marca

RADWAG

modelo AS

● Guantes

● Mascarillas

● Zapatones

● Mandil

● Tubos de

Ensayo

● Tapones de

caucho

● 2 erlenmeyer de

1000 mL

● Cajas Petri

● Portaobjetos

● Hisopos

● Asa

bacteriológica

● Pipetas

Graduadas

● Micropipetas

● Vaso de

precipitación de

● Agua destilada

● Aceite de

inmersión

● Alcohol industrial

● Alcohol potable

● Suero fisiológico

● Agar Barker-Taha

● Agar Stadtman-

Barker

● Agar Base

REACTIVOS

● Cristal Violeta

● Solución de

Yodo

● Alcohol-cetona

● Safranina

MATERIA

LIGNOCELULÓSICA

● Cáscara de arveja

36

220.X2 serie

498176

● Cocineta

● PHmetro

● Contador de

colonias

manual

● Autoclave

marca

Memmert

250 mL,1000

mL

● Tubos Durham

● Gradilla de

Tinción

● Espátula

● Algodón

● Papel Aluminio

● Papel periódico

● Jabón liquido

● Puntas para

Micropipetas

● Equipos de

venoclisis

● Bolsa de Suero

Fisiológico de

100 mL

● Tijeras

● Fósforos

● Cinta maskin

Fuente: Autores

2.5. Toma de muestra

La zona de estudio se dividió en 4 sitios de muestreo. El muestreo de sedimento se realizó

en envases estériles de polipropileno de alta transparencia con tapa de polietileno de cierre

hermético de 150 mL de volumen; aproximadamente en la mitad del estero con un

muestreador tipo pala a unos 80 cm debajo del espejo de agua, luego de la recolección se

almaceno los envases con muestras en bolsas con cierre hermético de plástico para evitar

contaminación cruzada, para posteriormente ser transportadas en refrigeración al

laboratorio. Debido a que se realizó un estudio microbiológico las muestras fueron

trasladadas en una hielera a una temperatura de menos 10 °C, no exceder el análisis en un

tiempo de 48 horas después de la recolección. Durante el muestreo se determinaron las

coordenadas geográficas de cada punto de muestra.

2.6. Aislamiento de Microorganismos Metanógenos

Para el aislamiento microbiológico de las bacterias metanogénicas se utilizaron los agares

selectivos Standman-Barker para Methanococcus y Baker-Taha para Methanobacterium,

37

estos agares especializados están compuestos por un conjunto de sustratos que usan estas

bacterias como fuente de energía en las condiciones adecuadas de temperatura para su

metabolismo y reproducción en anaerobiosis. 37

2.6.1. Preparación de los Medios de Cultivo Barker-Taha Methanobacterium y

Stadtman-Barker para Methanococcus

Los medios de cultivo requieren de esterilización, por lo cual se preparan los agares

siguiendo la composición que se muestra en la tabla 3 y 4; en el medio MB se incorporan

las mezclas de sulfuro de sodio 0.1g en 10 mL de agua destilada y carbonato de sodio

0.50 g en 10 mL de agua destilada. 37

Para la pre-reducción de los medios de cultivo se realizó por 2 horas utilizando la jarra de

anaerobiosis por extinción con vela para obtener la atmósfera libre de O2, para el control

de la esterilidad de los medios se incubó un blanco de cada medio.

Tabla 3. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Baker-Taha

para aislar bacterias del género Methanobacterium

REACTIVO CANTIDAD

Etanol 10 ml

Fosfato dipotásico 5g

Sulfato de magnesio 7(H2O) 0.1g

Sulfato de amonio 0.3g

Sulfato ferroso 7(H2O) 0.02g

Autolisado de levadura 5 ml

Carbonato de calcio 100g

Agua destilada 1000ml

Fuente: Autores

38

Tabla 4. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Standman-

Barker para aislar bacterias del género Methanococcus.

REACTIVO CANTIDAD

Formiato de Sodio 15 g

Sulfato de amonio 1 g

Cloruro de calcio 0.01g

Cloruro de magnesio 0.01g

Cloruro férrico 0.02g

Sulfato de magnesio 0.01 g

Molibdato de sodio 0.001g

Fosfato dipotásico 2g

Rojo de fenol 0.003 g

Azul de metileno 0.002 g

Tioglicolato de sodio 0.5 g

Fuente: Autores

2.6.2. Inoculación de la muestra

2.6.2.1. Medio sólido agar MC y MB

Los medios de cultivos fueron inoculados con 1 mL de muestra, en siembra de superficie,

fueron incubados en condiciones estrictas de temperatura de 37°C en anaerobiosis, los

indicios de crecimiento bacteriano se verifican en un periodo de 24 a 48 horas y a los 15

días de la siembra se verifica la reproducción de metanógenos por turbidez del medio.

Además, se observan las características morfológicas macroscópicas de las colonias como

forma y tamaño para luego proceder a la verificación microscópica mediante la tinción

de Gram. 37

39

Técnica de siembra por agotamiento de estría continua

1. Encender el mechero de alcohol.

2. Destapar la caja Petri cerca del mechero y flamear el asa hasta que torne de color

rojo vivo, dejarla enfriar antes de proceder a tomar la muestra con la punta del asa

de platino.

3. Estriar el agar con el asa impregnada de muestra en un cuarto de superficie, las

estrías deben ser varias y en forma de zigzag, se debe jalar la primera estría inicial

y luego proceder con un estriado de lado a lado sin tocar las otras estrías jalando

la cola final de la última estría y al final deben ser menos estrías y estar más

distantes una de la otra.

4. Después del estriado, flamear el asa nuevamente.

5. Tapar la caja Petri cerca del mechero y sellar para la incubación evitando que se

pueda contaminar con otros microorganismos. 45

6. Rotular los datos necesarios para la identificación de cada muestra, voltear las

cajas y depositarlas en un frasco para proceder a incubar en atmósfera anaerobia

por un tiempo de 15 días.

2.6.2.2. Medio líquido en caldo MC y MB

En la siembra de Metanógenos en caldo se inoculó con 1 mL de muestra introduciendo la

carga bacteriana con un asa calibrada depositando en el caldo las colonias en las

diluciones de caldo de forma vertical sin tocar los bordes del tubo de ensayo, después de

la siembra se procede a colocar un tubo Durham para determinar la producción de gas de

las bacterias en estudio.

Para el aislamiento en caldo se utilizaron diluciones seriadas en 0.1 mL, 1 mL y 10 mL

utilizando el método del NMP (Número más probable) en donde se evalúa

cuantitativamente las densidades de población bacteriana presente. 44

Técnica de NMP

1. Se rotulan tres tubos para las diluciones de 0.1 mL, 1 mL y 10 mL

2. Se homogenizan las muestras para optimizar resultados

3. Se colocan 9 mL del caldo Standman-Barker o Baker-Taha en cada tubo, tres

tubos para cada dilución.

40

4. Colocar tubos Durham para observar la producción de gas.

5. Incubar en anaerobiosis por un tiempo de 24 a 48 horas en una temperatura de 35-

45°C.

6. El crecimiento bacteriano se considera mediante la observación de tubos de

resultado positivo verificando la turbidez, coloración y la producción de gases

7. Se tabulan los resultados con los tubos positivos y se procede a ver la población

estimada en las tablas. 44

Los resultados se tabulan según el valor estimado de la población bacteriana mediante la

observación de tubos positivos, utilizando las tablas de NMP. El número más probable

que resulta de las tablas es dato para la aplicación de la siguiente formula. La tabla de

NMP se encuentra en el Anexo M. 44

NMP resultante de la Tabla x Factor de dilucion intermedio(10)

volumen de muestra = UFC/100 mL

2.7. Observación Macroscópica de los Medios de Cultivo

2.7.1. Observación en caldo

1. Visualización de la turbidez del medio

2. Formación de película o velo en la parte superficial.

3. Producción de gas en los tubos Durham depositados dentro de los medios.

4. Presencia de sedimento.

2.7.2. Observación en agar

Las UFC (unidades formadoras de colonia) se forman por un grupo de bacterias de una

misma especie, las colonias suelen identificarse según la textura, por la forma de la

colonia, el diámetro y la coloración, dependiendo al medio de cultivo donde fueron

sembradas, también depende de las condiciones de control de incubación y de la especie

en reproducción. 45

2.8. Identificación Fenotípica

En la identificación Fenotípica las bacterias aisladas fueron teñidas mediante la

coloración de Gram y también se realizaron pruebas bioquímicas para definir mediante la

actividad metabólica la confirmación de ser parte de la familia metanogénica, para esto

41

se utilizaron las siguientes cepas: ATTC 35294, cepas de la especie Methanococcus deltae

y ATTC 35063, cepa de la especie Methanobacterium ruminantium. 37

2.8.1. Tinción de Gram

1. Preparar la extensión: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, con un asa

bacteriológica colocar una colonia aislada del medio de cultivo.

2. Suspensión de pico máximo: Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de suero

fisiológico y después con el asa bacteriológica colocar una colonia pura de agar

MB y en otro tubo replicando el procedimiento del agar MC; sembrar por un

tiempo de 24 horas en la incubadora en anaerobiosis.

3. Colocar con la micropipeta 10 μL de la suspensión bacteriana en un portaobjetos

4. Secar al aire y luego se fija la placa pasándola por el mechero varias veces.

5. Colocar varias gotas de cristal violeta encima de la muestra fijada durante un

tiempo de 40 a 60 segundos para intensificar el color y luego enjuagar enseguida

con agua del grifo.

6. Agregar varias gotas de una solución de yodo permitiendo la formación del

complejo cristal violeta-yodo lo cual permite que se sature el péptidoglicano que

es parte de la pared celular de la bacteria; luego de esto enjuagar con agua después

de un tiempo de 30-60 segundos.

7. Luego se agrega alcohol acetona y lavar después de 5 segundos; este reactivo es

un decolorante que se encarga disolver lípidos de la pared Gram negativa, la

mezcla alcohol-acetona deshidrata la pared bacteriana y elimina la membrana

externa bacteriana Gram negativa debido a su solubilidad ante un solvente

orgánico.

8. Agregar safranina por un tiempo de 20 segundos y enjuagar enseguida, este es un

colorante de contratinción que tiñe bacterias que no quedaron en el complejo

cristal violeta-yodo.

9. Dejar secar al ambiente, luego colocar una gota de aceite de inmersión y observar

en el microscopio. 45

42

2.8.1.1. Observación Microscópica

Tabla 5. Morfología de las Metanobacterias en Tinción de Gram

Género Morfología

Methanobacteriaceae Bacilos largos o cortos, Gram positivos, no

móviles, contienen pseudomureina

Methanococcaceae Cocos irregulares, Gram negativos

Fuente: Autores

2.8.2. Pruebas Bioquímicas

Las pruebas bioquímicas fueron realizadas con las colonias aisladas de los agares MB y

MC para el análisis de los sustratos que se encargan de la degradación y fuente de energía

que utiliza cada bacteria, mediante los indicadores que posee cada medio de cultivo.

La caracterización fenotípica de las bacterias aisladas se evaluó con las siguientes

pruebas: Sim medio, TSI agar, citrato de Simmons, prueba de indol, caldo de urea. 37

2.8.2.1. SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio

Tabla 6. Fórmula de SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio aproximada por litro

de agua destilada

COMPOSICIÓN g/L

Digerido Pancreático de caseína 20 g

Digerido Péptico de tejido animal 6.1 g

Agar 3.5 g

Sulfato ferroso de amonio 0.2 g

Tiosulfato sódico 0.2 g

pH: 7.3 ± 0.2 at 25°C

Fuente: Autores

43

Preparación

1. En un litro de agua destilada suspender 30 g de polvo mezclando hasta lograr

disolver.

2. Calentar agitando con frecuencia y dejar que hierva durante un minuto

3. dispensar aproximadamente 4 ml del medio en tubos de ensayo y esterilizar en la

autoclave por 15 minutos a una temperatura de 121°C

4. Dejar que se solidifique en una posición vertical, destapar los tubos y enfriando

antes de usar los medios

5. Siembra: Mediante punción profunda sembrar una colonia pura con una aguja de

inoculación, en el centro del tubo abarcando dos tercios del medio de cultivo

comenzando desde la superficie.

6. Incubación: En anaerobiosis incubar por 24 horas a una temperatura de 37 °C,

después de este tiempo de incubación se debe agregar de 3 a 5 gotas del reactivo

de Kovac’s o Erlich.

Interpretación de los Resultados:

● Cepas móviles: Enturbiamiento alrededor del sitio de la punción, extendiéndose

sobre la línea de siembra.

● Cepas inmóviles: Solamente se visualiza el crecimiento en la línea de la

inoculación.

● Cepas H2S positivas: Ennegrecimiento en todo el medio de cultivo o en la línea

de la siembra.

● Cepas H2S negativas: No ocurre cambio de color del medio.

● Indol Positivo: Coloración roja en la superficie después de colocar el reactivo de

Kovac´s.

● Indol negativo: No ocurre el cambio de la coloración del medio.

2.8.2.2. TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar

Tabla 7. Fórmula de TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar aproximada para un litro

de agua destilada.

COMPOSICIÓN g/L

Extracto de carne 3 g

44

Tabla 8. (Continuación)

COMPOSICIÓN g/L

Digerido de Peptona de tejido animal 5 g

Tiosulfato de sodio 0.3 g

Extracto de levadura 3 g

Dextrosa 1 g

Sacarosa 10 g

Lactosa 10 g

Sulfato de hierro 0.2 g

Digerido pancreático de caseína 15 g

Cloruro de sodio 5 g

Agar 12 g

Rojo Fenol 0.024 g

pH 7.4 ± 0.2 35 ± 2°C

Fuente: Autores

Preparación

1. En un litro de agua destilada suspender 62 g de polvo, mezclando hasta disolver

2. Hervir durante un minuto, calentando con agitación hasta disolver todo el polvo.

3. En tubos de ensayo dispensar y autoclavar durante 15 minutos a una temperatura

de 121°C

4. Dejar enfriar los tubos en posición inclinada para lograr picos de flauta profundos

5. Siembra: La inoculación se realiza en la superficie del pico de flauta, se coge una

colonia aislada con asa bacteriológica y se realiza un estriado.

6. Incubación: En anaerobiosis durante 24 horas a una temperatura de 35 a 37°C. 40

Interpretación de Resultados

● K/A (Pico alcalino-Fondo ácido) Pico rojo/ Fondo amarillo: Se produce la

fermentación de la glucosa por la bacteria.

● A/A (Pico ácido-Fondo ácido) Pico amarillo/ Fondo amarillo: Se produce la

fermentación de la lactosa, sacarosa y glucosa.

45

● K/K (Pico alcalino-Fondo alcalino) Pico rojo/ Fondo rojo: La bacteria no

fermenta azúcares.

● Producción de H2S: Precipitado Negro, oscurecimiento del medio.

● Producción de Gas: Se presentan burbujas, desplazamiento del medio del fondo

o ruptura del medio quedando espacios. 40

2.8.2.3. Citrato de Simmons Agar

Tabla 8. Fórmula de Agar citrato de Simmons aproximada por litro de agua

destilada

COMPOSICIÓN g/L

Citrato de sodio 2 g

Cloruro de sodio 5 g

COMPOSICIÓN g/L

Monofosfato de amonio 0.2 g

Fosfato dipotásico 1 g

Sulfato de magnesio 0.2 g

Azul de Bromotimol 0.08 g

Agar 15 g

pH 6.9 ± 0.2 35 ± 2°C

Fuente: Autores

Preparación

1. En un litro de agua destilada suspender 23 g del polvo del medio

2. Mezclar hasta disolver y llevar a ebullición para lograr disolver por completo

3. Dispensar en los tubos de ensayo y autoclavar 15 minutos a 121°C

4. Dejar enfriar en posición inclinada para formar el pico de flauta

5. Siembra: Se debe inocular la superficie del medio en el pico de flauta con un asa

bacteriológica cogiendo una colonia aislada, realizando estriado superficial y en

el extremo punción

6. Incubación: Recomendado a una temperatura de 35° C en 48 horas en

anaerobiosis. 41

46

Interpretación de Resultados

Positivo: Si el medio cambio de coloración azul, significa alcalinidad.

Negativo: Permanece con una coloración verde no hay crecimiento de bacterias.41

2.8.2.4. Caldo de Urea

Tabla 9. Fórmula de Caldo de Urea aproximada por litro de agua destilada

COMPOSICIÓN g/L

Peptona 1 g

Glucosa 1 g

Cloruro de sodio 5 g

Fosfato de disodio 1.2 g

Fosfato dipotásico 0.8 g

Rojo de Fenol 0.08 g

Agar 15 g

pH 6.8 ± 0.2 35 ± 2°C

Fuente: Autores

Preparación

1. En 95 mL de agua destilada suspender 2.4 g de polvo del medio

2. Calentar con frecuencia hasta hervir para disolver por completo.

3. En tubos de ensayo dispensar el caldo y autoclavar en un tiempo de 20 minutos a

115 °C

4. Dejar que se enfríe en forma de pendiente.

5. Siembra: Inocular una colonia aislada en el medio con una aguja bacteriológica

6. Incubación: En anaerobiosis en un tiempo de 18 a 24 horas de 35 a 37°C. 46

Interpretación de Resultados

● Positivo: Coloración Rosada en la superficie.

● Negativo: Medio mantiene su color amarillo. 46

47

2.9. Medición de la Producción de Gas Metano

Armado de los Biorreactores

La determinación de la producción de biogás se realizó armando cinco biorreactores con

las bacterias aisladas más el sedimento estableciendo diferentes sustratos para cada

biorreactor. 47

Se dispuso de cinco tubos de 30 mL de capacidad, estos constan cada uno de una

alargadera de silicón que sale del tapón de corcho cerrando el biorreactor y una salida con

aguja de jeringa que se conecta a un extremo de la bolsa de propileno de solución salina

de 100 mL limpia y seca en donde se recolecta el gas producido por las bacterias; el otro

extremo de la bolsa recolectora se encuentra sellada para evitar la pérdida de gas. 47

La cáscara de arveja es un residuo útil en biorreactores para la producción de biogás

mediante la codigestión anaerobia con bacterias metanogénicas las cuales utilizan esta

materia orgánica lignocelulosica como fuente de carbono para su metabolismo. 48

Figura 9. Sistema de Biorreactores de generación de Biogás

Fuente: Autores

48

Los Biorreactores se establecieron en las siguientes relaciones:

Tabla 10. Composición de los reactores de producción de biogás.

REACTOR COMPOSICIÓN

Reactor MB I-II 10 g de cáscara de arveja + cepas aisladas

del género Methanobacterium

Reactor MCI-II 10 g de cáscara de arveja + cepas aisladas

del género Methanococcus

Reactor MC-MB 10 g de cáscara de arveja +bacteria aislada

del género Methanococcus + cepas aisladas

del género Methanobacterium

Fuente: Autores

2.9.2. Monitoreo de la Producción de Biogás

Se realizó el seguimiento de producción de biogás de las bacterias con la materia

lignocelulosica tres veces en la semana de la obtención del gas, y se midió tres veces el

volumen generado en cada semana de recolección utilizando las bolsas de propileno

estériles.

Tabla 11. Protocolo de medición de producción de biogás

Semana de medición de

gas

Días de codigestión

anaerobia

Reactor

Primera semana 7 días MB y MC

Segunda semana 15 días MB, MC y MC-MB

Tercera semana 20 días MB, MC y MC-MB

Fuente: Autores

49

2.9.3. Determinación de la concentración de Biogás producido en el biorreactor por

materia lignocelulosica y bacterias metanogénicas aisladas.

La medición del gas producido fue realizada en el laboratorio de Electroanalítica y

Bioenergía de la Universidad Técnica de Machala, por medio del cromatógrafo de gases

marca FULI 9790II.

En el análisis de la composición del biogás se utilizó el hidrógeno como gas portador, a

una temperatura de 250° C en el horno e inyector y el detector de ionización de llama

(FID) a una temperatura de 350°C.

Se realizó una curva de calibración con Metano y Dióxido de Carbono siendo estos

patrones referenciales. Las lecturas del volumen del gas generado se realizaron por

triplicado.

2.10. Análisis Estadístico de los Resultados.

El análisis cuantitativo de resultados se realizó en el software de Excel 2018.

50

CAPÍTULO III

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los medios de diferenciación para bacterias metanogénicas Barker-Taha

(Methanobacterium) y Standman-Barker (Methanococcus) en caldo y en agar indicaron

el crecimiento positivo bacteriano en el aislamiento debido a que estos agares contienen

los sustratos de nutrición que requieren este tipo de bacterias para su metabolismo y

reproducción en las condiciones controladas de anaerobiosis.

El aislamiento microbiológico sugiere que las bacterias aisladas tienen las características

similares a la morfología colonial de arqueas metanógenas descrita en la literatura;

mediante la observación macroscópica.49 El Agar MB sin inóculo es un medio amarillento

pálido (figura 10) y el MC es un medio verde (figura 12).

Luego de 15 días con una incubación en jarra de anaerobiosis por extinción con vela se

observó los cambios en el proceso de aislamiento obteniéndose las siguientes

características evidenciadas en la Tabla 12.

Figura 10. Medio Barker-Taha sin inóculo

Fuente: Autores

En la figura 11 del Agar MB se presentan colonias con formas irregulares y tamaños

variados con una superficie rugosa de bordes enteros que al reflejo de la luz brillan,

poseen un aspecto húmedo denotando una elevación convexa; el color de las colonias en

este medio en los primeros días fue blanco debido a la precipitación del carbonato de

sodio y al final del aislamiento se produce el oscurecimiento del medio por la presencia

de H2S y otros gases, por lo antes mencionado las colonias adquieren una coloración café.

51

Figura 11. Medio Barker-Taha con crecimiento bacteriano.

Fuente: Autores

En la figura 13 del Agar MC se observó la presencia de colonias irregulares y puntiformes

pequeñas con superficie lisa de elevación plana y consistencia cremosa, también poseen

bordes filamentosos irregulares que provocan al reflejo de la luz un aspecto brillante

translúcido, características representadas en la tabla 12. La coloración de las colonias a

los 6 días de siembra fue de color blanquecina lechosa y al cumplir los 15 días de

incubación tomaron un color amarillo pálido.

Figura 12. Medio Standman-Barker sin inóculo.

Fuente: Autores

52

Figura 13. Morfología colonial en el medio Standman-Barker

Fuente: Autores

Tabla 12. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Medio

sólido.

Agar MB Características Agar MC Características

Tamaño Grandes Tamaño Pequeña

Forma Irregular Forma Irregular-

Puntiforme

Luz Transmitida Translúcida Luz

Transmitida

Translúcido

Luz Reflejada Brillante Luz

Reflejada

Brillante

Superficie Rugoso Superficie Lisa

Borde Entero Borde Filamentoso-

Irregular

Aspecto Húmedo Aspecto Húmedo

Color Blanco-café Color Blanco-amarillo

pálido

Elevación Convexo Elevación plana

Consistencia Pegajosa Consistencia Cremosa

Fuente: Autores

53

El recuento de colonias en placa se indica en la Tabla 13, se muestra el promedio de

crecimiento bacteriano de 730 UFC/mL para el género Methanococcus y 896,25 UFC/mL

para el género Methanobacterium, demostrando en la Figura 14 que entre los dos géneros

existe un mayor crecimiento por parte del género Methanobacterium. Los resultados se

presentan en la Tabla 24 del Anexo L.

Tabla 13. Recuento de UFC/mL de metanobacterias en Placa

GÉNERO BACTERIANO RECUENTO TOTAL

UFC/mL

Methanococcus 730 UFC/ml

Methanobacterium 896,25 UFC/ml

UFC: Unidad Formadora de Colonia

Fuente: Autores

Figura 14. Recuento de UFC/mL de metanobacterias.

Fuente: Autores

La evaluación del crecimiento bacteriano también se realizó en caldo, donde se pudo

verificar la presencia de bacterias metanogénicas, en la figura 16 del Caldo MB la

presencia de sedimento, producción de gas y turbidez del medio cambiante su coloración

de amarillo claro a amarillo pardo, resultados de la tabla 14, que fueron obtenidos de la

siembra en las mismas condiciones de incubación.

54

Tabla 14. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Caldo.

MB Resultado MC Resultado

Sedimento Positivo Sedimento Positivo

Producción de

Gas

Positivo Producción de

Gas

Positivo

Película Negativo Película Positivo

Turbidez Positivo Turbidez Positivo

Fuente: Autores

Figura 15. Medio Barker-Taha en caldo sin inóculo.

Fuente: Autores

Figura 16. Medio Barker-Taha en caldo, producción de gas en tubo Durham.

Fuente: Autores

55

En la figura 18 del Caldo MC se observó la presencia de una película o velo superficial,

sedimento, producción de gas mediante la observación de espacio vacío en los tubos

Durham y la turbidez del medio mediante las variantes de coloración representada en la

tabla 14 a los 10 días de incubación en atmósfera de anaerobiosis.

Figura 17. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo.

Fuente: Autores

Figura 18. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo.

Fuente: Autores

En la figura 15 y 17 se muestran los caldos del medio Standman-Barker y Barker-Taha

donde se evidencias las características antes de la siembra. El recuento de colonias en

Caldo, se realizó con la técnica del número más probable en donde se obtuvo el

crecimiento óptimo de metanógenos, las cepas Methanococcus presentaron 6730 UFC en

100 mL de medio inoculado y las cepas Methanobacterium 7800 UFC en 100 mL,

56

mismos valores representados en la tabla 15 y Figura 19. Los resultados del análisis

también se presentan en la tabla 25 del Anexo L.

Figura 19. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable

Fuente: Autores

Tabla 15. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable

GÉNERO BACTERIANO Índice del NMP por

100 mL

Methanococcus 6730 UFC/100mL

Methanobacterium 7800 UFC/100mL

UFC: Unidad Formadora de Colonia

Fuente: Autores

La evaluación macroscópica de la morfología colonial en los agares y en caldo permitió

comprobar el óptimo crecimiento bacteriano de metanógenos en las muestras analizadas

del sedimento del Estero el Macho de la ciudad de Machala. También se corrobora que

las bacterias metanogénicas utilizan CO2, H2, formiato y acetato para su codigestión

anaerobia. Las metanobacterias desprenden un olor característico putrefacto, producto del

gas sulfhídrico, el cual se hallaba presente en formas de burbujas en cajas y tubos.

6000 6500 7000 7500 8000

Methanococcus

Methanobacterium

Recuento de UFC/ mL de bacterias Metanogenicas en Caldo por NMP(Numero mas probable) por 100 mL

57

La fenotipificación se identificó por microscopía óptica, con tinción de Gram se logró

reconocer las características morfológicas de las bacterias metanogénicas. Se observó en

el caldo MB la presencia de estreptobacilos, diplobacilos y bacilos Gram positivos.

Mientras que, en la identificación de medio sólido, después de haber realizado una

suspensión (pico máximo de concentración de una cepa), se observó el crecimiento de

bacilos y estreptobacilos Gram positivos que no habían podido ser observados en

muestras directas.

Figura 20. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram

aisladas en medio sólido

Fuente: Autores

Figura 21. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram

aisladas en caldo.

Fuente: Autores

58

En las figuras 20 y 21 se pueden observar morfologías bacilares en medio sólido y en caldo

del género Methanobacterium, las cuales contienen pseudomureina y no son móviles. El

análisis del conteo en placas de observación microscópica, por sitio de muestreo, generó

un 68 % en frecuencia relativa de estreptobacilos en medio sólido, indicando entre todos

los sectores estudiados que las cepas que fueron aisladas de la muestra que proviene del

Barrio los Sauces I se encontraba con mayor cantidad de bacterias.

Así mismo, se contabilizó un 74% en frecuencia relativa de estreptobacilos en caldo,

muestra que provino del muestreo cerca de la planta de Asfalto en el Barrio Rayito de Luz,

indicando de la misma manera que esta muestra contenía mayor cantidad de bacterias que

las otras en estudio.

En la figura 22 se pueden apreciar los resultados de la cuantificación microscópica en

donde se reflejan las muestras con predominios bacterianos en caldo y agar del medio

Barker-Taha para el género Methanobacterium, mismos valores que se encuentran

tabulados en las tablas 28 y 29 del anexo L.

Figura 22. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de

Gram en el medio Agar Barker-Taha.

Fuente: Autores

En el Caldo MC también se observó la presencia de estos microorganismos productores

de CH4, en donde se produjo el crecimiento de estreptococos, diplococos y cocos Gram

negativos y en agar estableciendo una suspensión (pico máximo de concentración de una

59

cepa pura), se obtuvieron cocos y estreptococos con característica Gram negativa en todas

las muestras.

Figura 23. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram

aisladas en medio Sólido

Fuente: Autores

Figura 24. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram

aisladas en caldo.

Fuente: Autores

En las figuras 23 y 24 se pueden observar morfologías cocáceas en medio sólido y en caldo

del género Methanococcus, las cuales son motiles. El análisis del conteo en placas teñidas,

generó un 67 % en frecuencia relativa cocos en medio sólido entre todas las muestras

analizadas, bacterias que fueron aisladas de la muestra que proviene del Barrio los Sauces

I. Así mismo, se produjo un 60 % en frecuencia relativa de cocos en caldo, predominando

las bacterias de la muestra que provino del mismo sector antes mencionado. Además, en la

60

Figura 25 se pueden apreciar los resultados de la cuantificación microscópica del medio

Standman-Barker para el género Methanococcus, mismos valores que se encuentran

tabulados en las Tablas 26 y 27 del Anexo L.

Figura 25. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de

Gram en el medio Agar Standman-Barker.

Fuente: Autores

Generalmente las bacterias del género Methanobacterium suelen observarse en formas de

bacilos largos o cortos y las del género Methanococcus en forma de cocos irregulares

según lo que data la literatura. Sin embargo, la variación morfológica de las bacterias

aisladas puede ser a causa de la difícil adaptación y reproducción de estos

microorganismos in vitro.

El análisis de la identificación fenotípica según el recuento microscópico de la morfología

bacteriana sugiere que el predominio morfológico de las bacterias aisladas en el Estero el

Macho es el tipo cocáceas Gram negativas para el medio MC sólido y caldo, bacterias del

género Methanococcus. Así como estreptobacilar Gram Positivos para el medio MB

sólido y en caldo en el género Methanobacterium evidenciado en el conteo en placa,

obteniendo un promedio de todas las muestras en cada género. El análisis se presenta en

la tabla 30 del Anexo L.

La cuantificación general de las bacterias en el campo microscópico en cada muestra,

reporta altos índices de presencia de estos microorganismos en todas las muestras, pero

61

las del sector Rayito de Luz, planta de asfalto y en el sector Sauces I son las que contienen

mayores índices de carga metanogénica en el sedimento del estero El Macho.

Figura 26. Género de predominio en placas teñidas.

Fuente: Autores

Según la experimentación se puede ratificar que estas bacterias no colonizan solas en sus

entornos naturales, sino que su supervivencia depende del metabolismo simbiótico de

otras, las cuales les proporcionan nutrientes indispensables para la producción de energía,

convicción que se refleja al evaluar la coloración de Gram en muestras en directo de los

medios sólidos se reportan características morfológicas diferentes a lo reportado en la

literatura sobre microorganismos metanogénicos.

Los resultados de pruebas bioquímicas para la identificación fenotípica fueron

comparados con valores referenciales de las cepas Methanococcus deltae y

Methanobacterium ruminantium.

En la tabla 19 se muestran los resultados obtenidos del SIM Medio en donde se evalúa la

presencia de sulfuro de hidrógeno en las cepas aisladas de los géneros Methanobacterium

y Methanococcus, así como se demuestra que estas son móviles y no rompen el indol del

triptófano debido a que no se muestra la coloración roja en la superficie.

62

Tabla 16. Resultados Prácticos del SIM Medio - Methanococcus Aisladas

MUESTRAS

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

SH2 MOVILIDAD INDOL

Cepa de referencia Methanococcus deltae + + -

Cepa de referencia Methanobacterium

ruminantium

+ + -

Methanococcus Muestra I + + -

Muestra II + + -

Methanobacterium Muestra I + + -

Muestra II + + -

Fuente: Autores

Figura 27. Presencia de H2S, turbidez del medio y cepas móviles, sin cambio de

color ante el reactivo Kovac`s respectivamente.

Fuente: Autores

En la Tabla 17 se manifiesta que las cepas aisladas en ambos géneros de bacterias

metanogénicas desdobla el citrato de sodio a piruvato y oxalacetato que en medio alcalino

dan origen a ácidos orgánicos que son usados como fuentes de carbono, el color azul es

indicativo del citrato permeasa.

63

Tabla 17. Resultados Prácticos del Agar Citrato De Simmons

Muestra

PRUEBAS

BIOQUÍMICAS

VERDE AZUL

Cepa de referencia Methanococcus deltae - +

Cepa de referencia Methanobacterium ruminantium - +

Methanobacterium Muestra I - +

Muestra II - +

Methanococcus Muestra I - +

Muestra II - +

Fuente: Autores

Figura 28. Índice de Alcalinidad, viraje azul

Fuente: Autores

En la tabla 18 se describe la reacción de la muestra ante el agar Hierro Triple azúcar,

donde se produjo la acidificación del medio donde se confirma la fermentación de

glucosa, razón por la cual se produjo un color rojo en el pico y en el fondo amarillo en las

muestras del género Methanobacterium. En cuanto al género Methanococcus también se

produjo la misma reacción que indica la fermentación de glucosa siendo el resultado K/A,

pico alcalino-fondo acido. La producción de gas es positiva para Methanobacterium y

Methanococcus ya que se observa un espacio producido en el tubo y la presencia de SH2

64

ya que la muestra se volvió de color negro por lo que se produjo una reducción de sales

de hierro en ambas muestras de ambos géneros. Ilustración de resultados en la Figura 29,

Tabla 18.

Tabla 18. Resultados Prácticos del Agar TSI

MUESTRA PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Pico/Fondo Producción

de Gas

H2S

Cepa de referencia Methanococcus deltae

ATTC 35294

K/A + +

Cepa de referencia Methanobacterium

ruminantium ATTC 35063.

K/A + +

Methanobacterium Muestra I K/A + +

Muestra II K/A + +

Methanococcus Muestra I K/A + +

Muestra II K/A + +

Fuente: Autores

Figura 29. Reacciones de fermentación de azúcares. Ennegrecimiento del medio

indicativo de H2S. Presencia de gases

Fuente: Autores

65

La tabla 19 indica el estudio en caldo de urea, para el género Methanobacterium y

Methanococcus muestras I y II respectivamente, mantuvieron una coloración rosada en

la superficie lo cual es positiva, siendo esta bacteria capaz de romper la urea, quien

participa en el proceso de descomposición inorgánica. Resultado plasmado en la Figura

30.

Tabla 19. Resultados Prácticos de Caldo de Urea.

Muestra

PRUEBAS

BIOQUÍMICAS

Caldo de Urea

Cepa de referencia Methanococcus deltae ATTC

35294

+

Cepa de referencia Methanobacterium ruminantium

ATTC 35063.

+

Methanobacterium Muestra I +

Muestra II +

Methanococcus Muestra I +

Muestra II +

Fuente: Autores

Figura 30. Resultado Positivo en caldo ureasa.

Fuente: Autores

66

En el análisis cromatográfico de la composición del biogás producido por las bacterias

aisladas del género Methanococcus y Methanobacterium se evalúo la capacidad de estas

bacterias para generar metano y dióxido de carbono. Para lo cual, a través de un patrón

de una mezcla gaseosa de 5187 ppm de CH4 y 1025 ppm de CO2 presentado en la Figura

30, se estableció que, los tiempos de retención se encontraron entre los 4.50 min para CH4

y entre 10.58 min para CO2 respectivamente. Tabla 20.

Una vez obtenido los tiempos de retención de los gases antes mencionados se procedió a

cuantificar la composición del biogás obtenido a partir de los biorreactores preparados

con las cepas metanógenas aisladas.

Tabla 20. Contenido de CH4 y CO2 obtenido de la muestra Patrón

SEÑAL COMPONENTE TIEMPO DE

RETENCIÓN

CONTENIDO ÁREA DE

PICO (𝝁𝑽/𝒔)

AREA

(%)

4 CH4 4.50 40.47 36089.8 40.47

5 CO2 10.58 35.64 31818.3 35.64

Fuente: Autores

Figura 31. Patrón de una mezcla gaseosa de CH4 y CO2.

Fuente: Autores

67

Se muestra en las figuras A y B los cromatogramas del Biogás obtenido del Reactor I de

bacterias Metanogénicas del género Methanococcus. Indicándose en la Tabla 21 que en

los tiempos de retención del Reactor MC son 4.41 minutos para CH4 y de 10.55 minutos

para CO2, en los cuales hay una concentración de 0.20 % de CH4 y 22.87% para CO2

generados en la primera semana de digestión anaerobia. El pico de la figura 31 A

representa el pico verde de la figura 32 B.

Tabla 21. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la primera

semana de producción de biogás

TRATAMIENTO C%

CH4

ÁREA DE

PICO

(µV/s)

CH4

C%

CO2

ÁREA

DE

PICO

(µV/s)

CO2

DÍAS

DE

Co-A

TR

CH4

TR

CO2

Methanococcus 0,2 3325.4 22.87 377633.4 7 4.41 10.55

Methanobacterium 0,63 3325.4 28.10 347999.5 7 4.40 10.49

*C= concentración * TR=Tiempo de Retención * Co-A= Cogestión Anaerobia

Fuente: Autores

También se visualiza en la figura 32 los cromatograma del Biogás obtenido del Reactor I

de bacterias Metanogénicas del género Methanobacterium, Figuras C y D, que indican

entre los 4.40 minutos para CH4 y de 10.49 minutos para CO2 las concentraciones de 0.63

% de y 28.10% para CH4 y CO2 respectivamente, generados en la primera semana de

digestión anaerobia. Según la tabla se interpretó que las muestras analizadas del Reactor

MB pertenecientes al género Methanobacterium tienen mayor contenido de gas metano

comparando el resultado de los cromatogramas de la figura 32, B y D.

68

Figura 32. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

Methanococcus y Methanobacterium en la primera semana.

Fuente: Autores

En la segunda semana de producción de gas se obtuvo en el Reactor MC, las

concentraciones de 2.11 % y 10.97 % para CH4 y CO2 respectivamente, y en el Reactor

MB concentraciones de 2.57% para CH4 y 15.73 para CO2 generados en los tiempos de

retención establecidos según el patrón antes mencionado. Los valores de los resultados se

encuentran plasmados en la tabla 22. Además, se estima que el género

Methanobacteriaceae continúa generando mayor cantidad de CH4 demostrado según el

cromatogramas de la figura 33 H.

69

Figura 33. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

Methanococcus y Methanobacterium en la segunda semana.

Fuente: Autores

Tabla 22. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la segunda

semana de producción de biogás

TRATAMIENTO C%

CH4

TR

CH4

ÁREA

DE

PICO

(µV/s)

CH4

C %

CO2

ÁREA

DE

PICO

(µV/s)

CO2

TR

CO2

DÍAS

DE

Co-A

Methanococcus 2,11 4.91 4011,9 10,97 24020,7 10.90 15

Methanobacterium 2,57 4.90 2019,2 15,73 12339,1 10.95 15

Methanococcus-

Methanobacterium 5,08 4.42 14061,5 72,44 11478,5 10.56 15

*C= concentración * TR=Tiempo de Retención * Co-A= Cogestión Anaerobia

Fuente: Autores

70

Figura 34. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

donde se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 15 días.

Fuente: Autores

En la tercera semana de producción de biogás se obtuvo en el Reactor MC, las

concentraciones de 3.81 % y 24.33 % para CH4 y CO2 respectivamente, figura 35 K y L.

En el Reactor MB concentraciones de 7.64 % para CH4 y 70.84 para CO2 generados en

los tiempos de retención establecidos según el patrón antes mencionado. Figura 34 M y

N. Los valores están representados en la tabla 23.

Tabla 23. Producción de biogás en la tercera semana de codigestión anaerobia

TRATAMIENTO C%

CH4

TR

CH4

ÁREA

DE

PICO

(µV/s)

CH4

C%

CO2

TR

CO2

ÁREA

DE

PICO

(µV/s)

CO2

DÍAS

DE

Co-A

Methanococcus 3,81 4.50 56349,2 24,33 10.50 359472

,1

20

Methanobacterium 7,64 4.44 25401,4 70,84 10.83 235304

,1

20

Methanococcus-

Methanobacterium

9,03 4.47 10071,5 29,35 10.60 32699,

4

20

*C= concentración * TR=Tiempo de Retención * Co-A= Cogestión Anaerobia

Fuente: Autores

71

Figura 35. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

Methanococcus y Methanobacterium en la tercera semana.

Fuente: Autores

Figura 36. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos

donde se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 20 días.

Fuente: Autores

72

Los resultados cromatográficos del biogás producido establecen la relación bacterias

aisladas/ materia orgánica lignocelulosica, producción de metano, donde se puede

interpretar que entre mayor sea el tiempo de codigestión anaerobia y temperatura mayor

será la cantidad de biogás producido, lo cual se demuestra en la concentración obtenida

en la última semana de medición.

También podemos interpretar que el área de pico de dióxido de carbono es mayor que la

de metano indicando así, que la concentracion de CO2 es mayor para ambos géneros en

el proceso de codigestion anaeróbica de metanógenos aislados según los cromatogramas

analizados.

Las mediciones de CO2 indicaron que las bacterias metanogénicas también producen

grandes cantidades de este gas, según los cromatogramas analizados, con el tiempo de

retención del patrón, se demuestra que de la misma manera que en Metano, las bacterias

del genero Methanobacterium generan grandes porcentajes de CO2.

Además, se definió que el Reactor en donde se encontraban inoculadas las cepas de ambos

géneros, produjo mejores resultados de CH4 con un 9.03 % en la tercera semana de

producción evidenciados en la tabla 23.

Las bacterias del género Methanobacterium muestran mayor productividad de metano

según nuestra investigación, además esto se corrobora con los resultados obtenidos de

Mauerhofer y Reischl que establecen la producción de un 97% de metano biológico a

partir de esta especie. 50

Según el Anexo 1 de la Normativa INEN del Libro VI donde se establece la Norma de

Calidad Ambiental de descargas de efluentes del recurso Agua, del Texto Unificado de la

segunda Legislación del Ministerio de Ambiente, se puede evidenciar que no existe

parámetro de calidad que especifiqué el control de las bacterias metanogénicas.51 En los

límites máximos permisibles para descargas a un cuerpo de agua marina como es el Estero

el Macho, solamente se establecen los indicadores de bacterias coliformes fecales y DBO.

52 La Demanda Bioquímica de Oxígeno enmarca una estimación del consumo de oxígeno

de una población de microorganismo. Los lodos activados poseen una composición

bacteriana diversa, dentro de la cual pueden existir bacterias, hongos y protozoarios, por

lo antes mencionado es necesario establecer un parámetro que controle estos

microorganismos patógenos de alta peligrosidad para el medio ambiente y la salud

poblacional.53

73

CAPÍTULO IV

4. CONCLUSIONES

En esta investigación se aisló bacterias metanogénicas pertenecientes a los

géneros Methanobacterium spp., y Methanococcus spp., evidenciado en el

crecimiento bacteriano en los medios de cultivo selectivos, Baker-Taha y

Standman-Barker. Se confirmó que estos microorganismos son de crecimiento

lento debido a que su proliferación se dio en 15 días.

La identificación de las especies se dio con un porcentaje de fiabilidad de 95% a

partir del reconocimiento morfológico microscópico de estreptobacilos para el

género Metanobacterium y cocos para el género Methanococcus.

La fenotipificación mediante pruebas bioquímicas se confirmó según las cepas

referenciales en SIM medio, Caldo de urea, Citrato de Simmons y Hierro triple

Azúcar, presentando resultados positivos en ambos géneros de bacterias

metanogenas.

La producción de metano en biorreactores fue de 9 % a escala piloto, a partir de

10g de cáscara de arveja más el inóculo de las dos especies en estudio en conjunto.

La especie que dio índices de mayor crecimiento fue la del género

Methanobacteriaceae en medio y caldo de cultivo, así como en recuento

morfológico en placa. Además, fue la cepa que rindió la mayor producción de gas

metano en los biorreactores.

74

CAPÍTULO V

5. RECOMENDACIONES

● Consideramos que para el reconocimiento morfológico sería más factible el

conteo de bacterias metanogénicas por medio de un microscopio de lámpara de

alta precisión de mercurio epifluorescente con el acoplamiento de cámaras de

Newbauer donde se utiliza la capacidad de estos microorganismos metanógenos

hidrogenotróficos de ser autoflorecientes bajo una luz de 420nm de longitud de

onda, debido a que estos poseen la coenzima 420F que produce esta diferencia

metabólica actuando como un fluoróforo.

● Para mejorar los rendimientos de producción de biogás, es recomendable

aumentar la materia lignocelulosica tras la medición en cada semana de

producción, aumentando la codigestión y por ende el contenido de CH4 y CO2.

● Difundir los resultados obtenidos de la investigación para que se realicen más

estudios sobre metanógenos anaerobios que pudieran habitar el Estero para que a

nivel local, se tomen acciones diligentes que colaboren al tratamiento de estos

lodos activados que tienen alta peligrosidad y toxicidad para el ser humano y el

medio ambiente.

75

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ANEXOS

EVIDENCIA FOTOGRÁFICA

Anexo A. Toma de muestra de sedimento en Estero El Macho

Fuente: Autores

83

Anexo B. Agares para la Identificación fenotípica

Fuente: Autores

84

Anexo C. Dispensación de agares MB y MC.

Fuente: Autores

85

Anexo D. Almacenado de muestras inoculadas en jarra de anaerobiosis por

extinción vela. Atmósfera libre de O2.

Fuente: Autores

86

Anexo E. Dispensación de agar TSI, Agar SIM medio, Citrato de Simmons agar y

Urea para la realización de pruebas bioquímicas.

Fuente: Autores

87

Anexo F. Proceso de tinción de Gram.

Fuente: Autores

88

Anexo G. Armado de biorreactores para la producción de gas metano.

Fuente: Autores

89

Anexo H. Observación Microscópica

Fuente: Autores

90

Anexo I. Cromatógrafo de Gases FULI

Fuente: Autores

91

Anexo J. Autoclave

Fuente: Autores

92

Anexo K. Microscopio OLYMPUS.

Fuente: Autores

93

Anexo L. Tabulaciones de los resultados de análisis microbiológicos.

Tabla 24. Recuento de Colonias en Agar mediante el conteo manual en placas.

GÉNERO

BACTERIANO

N° DE MUESTRA

RECUENTO DE

COLONIAS

1.1 1.2 1.3 TOTAL

UFC/mL

Methanococcus Muestra 1: Sector de la

Finca Bananera

506 465 687 553

Muestra 2: Frente a la

Planta de Asfalto de

Machala

968 1000 756 908

Muestra 3: Vergeles

Sector D

600 425 501 509

Muestra 4: Sauces I 869 1000 986 952

valor incontable = estimado 1000 P= 730

Methanobacterium Muestra 1: Sector de la

Finca Bananera

798 801 799 799

Muestra 2: Frente a la

Planta de Asfalto de

Machala

1000 1000 1000 1000

Muestra 3: Vergeles

Sector D

782 897 678 786

Muestra 4: Sauces I 1000 1000 1000 1000

valor incontable = estimado 10000 P= 896

*P=Promedio

Fuente: Autores

94

Tabla 25. Recuento de Colonias en Caldo mediante la técnica del Número más

Probable.

N° de muestra

Tubos con reacciones

positivas

Límite de

confiabilidad de

95% NMP

3

tubos

con

10

mL

3

tubo

s con

1 mL

3

tubo

s

con

0,1m

L

Índice

del NMP

por 100

mL

Inferior Superior

Muestra 1: Sector de

la Finca Bananera

3 3 1 460 90 2000

Muestra 2: Frente a la

Planta de Asfalto de

Machala

3 3 2 1100 180 4100

Muestra 3: Vergeles

Sector D

3 3 1 460 90 2000

Muestra 4: Sauces I 3 3 2 1100 180 4100

Methanoccoccus PROMEDIO 780

Muestra 1: Sector de

la Finca Bananera

3 3 1 460 90 2000

Muestra 2: Frente a la

Planta de Asfalto de

Machala

3 3 2 1100 180 4100

Muestra 3: Vergeles

Sector D

3 3 1 460 90 2000

Muestra 4: Sauces I 3 3 3 >1100 420 ----

Methanobacterium PROMEDIO 673

Fuente: Autores

95

Tabla 26. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio

Agar Standman-Barker conteo en placas teñidas

N° de

muestra

Morfolo

gía

Microscó

pica

SÓLIDO CALDO Promedio

Morfológico Total

Conteo total

en placa

Conteo total

en placas

1.1 1.2 1.3 1.1 1.2 1.3 SÓLIDO CALDO

Muestra 1:

Sector de la

Finca Bananera

El Cornejo

Cocos 43 39 52 68 46 50 45 55

Diplococos 0 0 0 18 25 17 0 20

Estreptococos 52 44 38 21 19 35 45 25

Total 90 100

Muestra 2:

Frente a la

Planta de

Asfalto de

Machala

Cocos 98 92 86 77 83 65 92 75

Diplococos 0 0 0 20 17 26 0 21

Estreptococo

s

66 74 52 33 40 32

64 35

Total 156 131

Muestra 3: Vergeles

Sector D

Cocos 46 69 50 50 51 49 55 50

Diplococos 0 0 0 16 18 20 0 18

Estreptococo

s

41 46 45 35 30 25

44 30

Total 99 98

Muestra 4:

Sauces I

Cocos 97 99 98 92 88 90 98 90

Diplococos 0 0 0 42 40 38 0 40

Estreptococo

s

46 50 48 19 16 25

48 20

Total 146 150

Fuente: Autores

96

Tabla 27. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de

Gram en el medio Agar Standman-Barker

N° de

muestra

Morfología

Microscópica

Frecuencia en

placas teñidas

Frecuencia Relativa

Decimal Porcentaje

SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO

Muestra 1:

Sector de la

Finca

Bananera El

Cornejo

Cocos 85 60 0,57 0,48 57% 48%

Diplococos 0 40 0,00 0,32 0% 32%

Estreptococos 65 25 0,43 0,2 43% 20%

Total 150 125 1 1 100% 100

Muestra 2:

Frente a la

Planta de

Asfalto de

Machala

Cocos 62 65 0,58 0,59 58% 59%

Diplococos 0 21 0,00 0,19 0% 19%

Estreptococos 45 25 0,42 0,23 42% 23%

Total 107 111 1 1 100% 100%

Muestra 3:

Vergeles

Sector D

Cocos 65 65 0,60 0,58 60% 58%

Diplococos 0 18 0,00 0,16 0% 16%

Estreptococos 44 30 0,40 0,27 40% 27%

Total 109 113 1 1 100% 100%

Muestra 4:

Sauces I

Cocos 98 90 0,67 0,60 67% 60%

Diplococos 0 40 0,00 0,27 0% 27%

Estreptococos 48 20 0,33 0,13 33% 13%

Total 146 150 1 1 100% 100%

Fuente: Autores

97

Tabla 28. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio

Agar Barker conteo-Taha en placas teñidas.

N° de

muestra

Morfología

Microscópica

SÓLIDO CALDO Promedio

Morfológico Total

Conteo total en

placa

Conteo total en

placas

1.1 1.2 1.3 1.1 1.2 1.3 SÓLIDO CALDO

Muestra 1:

Sector de la

Finca

Bananera El

Cornejo

Estreptobacilos 63 71 62 78 56 70 65 68

Diplobacilos 0 0 0 1 3 2 0 2

Bacilos 52 48 55 49 40 42 52 44

Total 117 114

Muestra 2:

Frente a la

Planta de

Asfalto de

Machala

Estreptobacilos 77 68 83 98 97 99 76 98

Diplobacilos 0 0 0 16 10 19 0 15

Bacilos 51 50 58 19 18 23 53 20

Total 129 133

Muestra 3:

Vergeles

Sector D

Estreptobacilos 67 71 63 39 50 49 67 46

Diplobacilos 0 0 0 1 3 2 0 2

Bacilos 51 47 58 35 34 27 52 32

Total 119 80

Muestra 4:

Sauces I

Estreptobacilos 97 99 95 85 73 82 97 80

Diplobacilos 0 0 0 2 1 3 0 2

Bacilos 45 43 47 59 46 51 45 52

Total 142 134

Fuente: Autores

98

Tabla 29. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de

Gram en el medio Barker-Taha

N° de

muestra

Morfología

Microscópica

Frecuencia en placas

teñidas

Frecuencia Relativa

Decimal Porcentaje

SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO

Muestra 1:

Sector de la

Finca

Bananera

El Cornejo

Estreptobacilos 65 68 0,56 0,60 56% 60%

Diplobacilos 0 2 0,00 0,02 0% 2%

Bacilos 52 44 0,44 0,39 44% 39%

Total 117 114 1 1 100% 100%

Muestra 2:

Frente a la

Planta de

Asfalto de

Machala

Estreptobacilos 76 98 0,59 0,74 59% 74%

Diplobacilos 0 15 0,00 0,11 0% 11%

Bacilos 53 20 0,41 0,15 41% 15%

Total 129 133 1 1 100% 100%

Muestra 3:

Vergeles

Sector D

Estreptobacilos 67 46 0,56 0,58 56% 58%

Diplobacilos 0 2 0,00 0,03 0% 3%

Bacilos 52 32 0,44 0,40 44% 40%

Total 119 80 1 1 100% 100%

Muestra 4:

Sauces I

Estreptobacilos 97 80 0,68 0,60 68% 60%

Diplobacilos 0 2 0 0,01 0% 1%

Bacilos 45 52 0,31 0,39 32% 39%

Total 142 134 1 1 100% 100%

Fuente: Autores

99

Tabla 30. Resultados cuantitativos y semicuantitativos de bacterias metanogénicas

en todos los campos de observación de la tinción de Gram.

GÉNERO

BACTERI

ANO

N° DE

MUESTRA

SÓLIDO CALDO

GRAM SC PTC GRAM SC PTC

Met

han

oco

ccu

s

Muestra 1:

Sector de la

Finca Bananera

- +++ 90 - +++ 100

Muestra 2:

Planta de

Asfalto de

Machala

- Campo

lleno

156 - Campo

lleno

131

Muestra 3:

Vergeles Sector

D

- +++ 99 - +++ 98

Muestra 4:

Sauces I

- Campo

lleno

146 - Campo

lleno

150

Met

han

obact

erIu

m

Muestra 1:

Sector de la

Finca Bananera

+ +++ 117 + +++ 114

Muestra 2:

Frente a la

Planta de

Asfalto de

Machala

+ Campo

lleno

129 + Campo

lleno

133

Muestra 3:

Vergeles Sector

D

+ +++ 119 + +++ 80

Muestra 4:

Sauces I

+ Campo

lleno

142 + Campo

lleno

134

* SC=SEMI- CUANTIFICACIÓN

*PTC= PROMEDIO DE TODOS LOS CAMPOS

Fuente: Autores

100

Anexo M. Tabla del número más probable (NMP)

Fuente: Norma Mexicana NMX-AA-42-1987

101

Anexo N. Tabla de Limites de descarga a un cuerpo de agua marina.

Fuente: Anexo 1 del Libro del Texto Unificado de Legislación Secundaria del Ministerio

del Ambiente: Norma de Calidad Ambiental y de Descarga de Efluentes al Recurso Agua