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Unidad9. Principios de Ingeniería GenéticaAplicaciones de Biología Molecular

• Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos nucleicos

• Generación de moléculas de DNA recombinante

• Ingeniería Genética

AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA) Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA)

(detergentes, proteasas, cambios de presión)

Separación del DNA del resto de los componentes celulares(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas,

solventes (fenol-cloroformo)

Repetir la extracción. Eliminación del fenol.

Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol

Disolver el DNA (Se concentra)

Análisis del DNA

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Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría

Espectro de absorción de DNA

Estimación de la concentración de A.N. por espectrofotometría

A260 = 1

50 µg/ml DNA dc

33 µg/ml DNA cs

40 µg/ml RNA

También se mide la relación de abs.

A260/ A280 => 1.8-2.0

ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Separación en geles de agarosa (1–4%)

Electroforesis horizontal.

Migran al ánodo

Tinción con bromuro de etidio

Intercala entre las bases del DNA

Forman complejos fluorescentes

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Herramientas para el análisis de DNA.Enzimas de restricción y sus sitios de corte

• Son purificadas de bacterias

•Las enzimas de restricción son endonucleasas

•Rompen en sitios específicos del DNA

•Reconocen secuencias palíndromicas específicas de 4; 6 o 8 pb

•Algunas generan extremos romos y otros extremos cohesivos en el DNA al que cortan

LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDOEXTREMOS COHESIVOS “STICKY”

DNA de un plásmido digerido con EcoRI

DNA genómico digerido con EcoRI

Extremos son compatibles

Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasa forma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas

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VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS

INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR)

Corte del DNA con enzimas de restricciónLigación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector

Plásmido

DNA de interés

Tratamiento con enzima de restricción

Fragmentos de DNA con extremos cohesivos compatibles

Mezclar los fragmentos en presencia de una DNA ligasa

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CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA

Una biblioteca de DNA genómicoes un conjunto de fragmentos de DNA de un organismo y empaquetados en vectores (plásmidos), que son mantenidos en células bacterianas.

Digestióncon enzimasde restricción

DNA fragmentadoy clonado en plásmidos

Introducción de los plásmidos en bacterias

TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA

DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN

DNA de doble hélice

Desnaturalización: se genera DNA de cadena sencilla

Renaturalización: se forma DNA duplex

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BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cDNA

Caja Petri con colonias de bacterias

Se hace una réplica de las colonias en la membrana

Lisis de las bacterias y desnaturalización del DNA con NaOH

Sonda: DNA de cadena sencilla marcado con 32P

Incubación con las sonda y

lavadoColonias con el plásmido de interés

Exposición a un film fotográfico. Detección de colonias con el plásmido de interés.

Membrana de nylon o nitrocelulosa

SÍNTESIS DE cDNA y construcción de una biblioteca de cDNA

Selección del tejido Extracción de RNAm

Hibridar con oligo-dT

Síntesis de cDNA con una transcriptasa

reversa

Síntesis de la segunda cadena de DNA

Eliminación del RNA

Las transcriptasas reversas son enzima virales. Sintetizan DNA usando RNA como molde

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Transferencia en Southern

Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Great Fountain Geyser,

Yellowstone. Manantial

Temperatura 55-80°C

Thermus aquaticus

TaqDNA Polimerasa

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El número de copias del fragmento de DNA aumenta exponencialmente

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La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones

• Detección de alelos mutantes caracterizados.• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.• Identificación de microorganismos patógenos.

– Caracterización de cepas del virus de la influenza

• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cDNA (Clonación de genes)

• Secuenciación de DNA• Generación de mutantes puntuales.• Estudiar la expresión génica.

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La era genómica. Secuenciación de DNA

La era genómica. Secuenciación de DNA

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SECUENCIACIÓN DE DNA

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Secuenciación de Genomas

Aplicaciones de Biología Molecular

Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción)

Diagnóstico genético. PCR

Producción de proteínas recombinantes en bacterias

Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas

Terapia génica

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Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción)

A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en la secuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base.

Estos cambios pueden generar la formación de un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón de corte de una enzima de restricción para cada individuo va a ser único.

Individuo 1 Individuo 2

Homocigoto Homocigoto

Este es el fundamento de pruebas de paternidad.

heterocigoto

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Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtener la “huella genética”

Se utiliza la técnica de Southern blot

Mancha de Sangre

El DNA se extrae de las células sanguíneas

Digestión del DNA con enzimas de restricción

Los fragmentos de DNA se separan por electroforesisSouthern blot

Sonda de DNA marcada se une específicamente

La membrana se lava y se revela para detectar bandas de

interacción DNA-DNA

El patrón de DNA se compara con el de

“sospechosos”