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UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE EESSTTAADDUUAALL DDEE SSAANNTTAA CCRRUUZZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA E
BIOTECNOLOGIA DE MICRORGANISMOS
ANÁLISE DA DIVERSIDADE BACTERIANA ASSOCIADA ÀS
ESPONJAS Amphimedon viridins E Cliona varians
FLAMÉLIA CARLA SILVA OLIVEIRA
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL
MAIO DE 2010
Livros Grátis
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FLAMÉLIA CARLA SILVA OLIVEIRA
ANÁLISE DA DIVERSIDADE BACTERIANA ASSOCIADA ÀS
ESPONJAS Amphimedon viridins E Cliona varians
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como pré-requisito para obtenção do título de mestre em Biologia e Biotecnologia de Microrganismos
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL
MAIO DE 2010
FLAMÉLIA CARLA SILVA OLIVEIRA
ANÁLISE DA DIVERSIDADE BACTERIANA ASSOCIADA ÀS
ESPONJAS Amphimedon viridins E Cliona varians
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como pré-requisito para obtenção do título de mestre em Biologia e Biotecnologia de Microrganismos
Aprovada em 28 de maio de 2010
Prof. Dr Juliano Cury Prof. Drª Rachel Rezende Passos UFRJ UESC
Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo UESC – orientador
ii
OLIVEIRA, Flamélia Carla Silva Análise da diversidade bacteriana associada às esponjas Amphimedon viridis e Cliona varians/ Flamélia Carla Silva Oliveira – Ilhéus, Bahia: UESC, 2010.
Orientador: Júlio Cezar de Mattos Cascardo Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Biologia e Biotecnologia de Microrganismos. Inclui bibliografia
1. 2.
CDD
iii
A minha família.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me deu forças e serenidade para persistir diante das dificuldades
e para cumprir esta jornada.
A todos meus familiares, em especial minha mãe, irmã e cunhado pelos
cuidados e por acreditarem e incentivarem meu crescimento intelectual e sucesso
pessoal.
A Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de Pós-graduação em
Biologia e Biotecnologia de Microrganismos pela oportunidade.
Ao meu orientador Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo, que me deu
oportunidade de trabalhar na pesquisa científica, acreditando em meu potencial.
Agradeço também pela orientação, confiança, disponibilidade neste nosso desafio.
Ao co-orientador Dr. João Carlos Teixeira Dias pela importante contribuição
no desenvolvimento deste trabalho, como também pelo estímulo e sugestões.
Aos professores do Mestrado em Biologia e Biotecnologia de Microrganismo
da UESC, pelos ensinamentos em especial Carla Cristina Romano e Ana Paula
Trovatti Uetanabaro pelo incentivo e atenção.
A Profª Drª Erminda da Conceição Guerreiro Couto pela ajuda na escolha das
esponjas.
As alunas do programa PPGSA Fênix Lavigne, Débora Daltro, Cybelle
Menolli, e a Ricardo Nick do PPGBM pela ajuda na coleta das esponjas.
Ao Gileno Jr e Sanderson Tassi por todo o conhecimento passado, dedicação
e incentivo para o seguimento deste trabalho, o meu muitíssimo obrigado.
A todos os colegas do PPGBBM pela troca de experiências, ajuda, convívio e
descontração. Em especial Leonardo Souza pelas constantes parcerias e Flávia
Rúbia pela amizade.
Ao colega e amigo Samuel Carvalho por todo o apoio, cuidado e por estar
sempre ao meu lado, o mais que obrigada.
Aos meus colegas do Laboratório de Genômica Elizabeth Amélia, parceria na
metagenômica, Daiana Brito, Auriângela pelas sugestões, Robson pelo
v
seqüenciamento das placas do DNA e Cristiano Vilela pela ajuda nas análises de
Bioinformática.
Ao pessoal do NBCGIB pela atenção e uso dos computadores.
Aos colegas do PPGBM que me ajudaram na solidificação dos conhecimentos
de Biologia Molecular.
A Drª Rachel Passos pelo apoio recebido, sugestões e críticas construtivas.
A Cacilda (Cacá) que me alimentou com tanto carinho.
Ás secretarias do Programa de Pós-graduação (Silvana e Rose), pela
eficiência e disponibilidade.
A minha amiga-irmã Istael pela convivência, paciência e por incentivar a
minha busca pelo crescimento profissional e pessoal.
A todos meus colegas de trabalho, pela disponibilidade e incentivo para que
continuasse trabalhando e estudando em especial, Bernadete Cruz e Cristiana
Almeida.
E aos que nesse momento passaram pelo lapso de memória, saibam que
expresso minha gratidão por estarem direta e indiretamente ligados ao
desenvolvimento deste trabalho.
vi
“Quero viver ao lado de gente humana, muito humana; que sabe rir de seus
tropeços, não se encanta com triunfos, não se considera eleita antes da hora, não
foge de sua mortalidade, defende a dignidade dos marginalizados,
e deseja tão somente andar ao lado do que é justo.
Caminhar perto de coisas e pessoas de verdade, desfrutar desse amor
absolutamente sem fraudes, nunca será perda de tempo. O essencial faz a vida
valer à pena.”
(Rubem Alves)
vii
ÍNDICE
EXTRATO ................................................................................................ ix
ABSTRACT .............................................................................................. x
LISTA DE FIGURAS E TABELAS .......................................................... xi
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1
1.1 As esponjas ....................................................................................... 1
1.2 Esponjas marinhas Amphimedon viridins e Cliona varians ................ 2
1.3 Microrganismos associados a esponjas ............................................. 4
1.4 Principais grupos bacterianos presentes em esponjas ...................... 6
1.5 Métodos para explorar a diversidade molecular dos microrganismos associados às esponjas ...................................................................... 7
1.6 A metagenômica e a biotecnologia ..................................................... 9
2. OBJETIVOS ............................................................................................ 10
3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................... 11
3.1 Coleta das esponjas ........................................................................... 11
3.2 Extração de DNA ................................................................................ 11
3.2.1 Método direto ................................................................................... 11
3.2.2 Método indireto ................................................................................. 12
3.3 Amplificação do gene 16S rDNA ........................................................ 13
3.4 Clonagem do DNA .............................................................................. 14
3.4.1 Ligação do 16S rDNA ao vetor ......................................................... 14
3.4.2 Transformação bacteriana ............................................................... 14
3.4.3 Validação da biblioteca de clones de 16S rDNA .............................. 15
3.5 Extração de DNA plasmidial ............................................................... 16
3.6 Sequenciamento e análise de bioinformática ..................................... 17
viii
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 18
4.1 Extração de DNA ................................................................................ 18
4.2 Construção da biblioteca de 16S rDNA .............................................. 20
4.3 Sequenciamento e Análise de Bioinformática .................................... 21
6. CONCLUSÕES ....................................................................................... 32
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 33
ix
EXTRATO
OLIVEIRA, Flamélia Carla Silva. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, maio
de 2010. Análise da diversidade bacteriana associada às esponjas
Amphimedon viridins e Cliona varians. Orientador: Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos
Cascardo; Co-orientador: Prof. Dr. João Carlos Teixeira Dias.
As esponjas (filo Porífera) são animais filtradores que abrigam diversas e
abundantes comunidades procarióticas que ocupam cerca de 40% de sua biomassa.
Bactérias associadas a esponjas produzem uma grande diversidade de metabólitos
secundários, que representam um importante recurso natural, motivo pelo qual tem
sido alvo de estudos para fins farmacológicos, em especial antitumorais, antivirais e
antibióticos. Este trabalho mostra as primeiras descrições da diversidade bacteriana
associada a duas espécies de esponjas, Amphimedon viridins e Cliona varians
abundantes em recifes de corais de Coroa Vermelha, Porto Seguro, Bahia, Brasil.
Utilizando métodos moleculares independentes de cultivo (metagenômica),o DNA
total foi extraído utilizando métodos: “direto” e “indireto”. Os genes 16S rDNA da
comunidade bacteriana total associadas às esponjas foram amplificados por PCR,
clonados, sequenciados e analisados utilizando o classificador Ribossomal
Database Project II (RDP) de sequências 16S de bactérias. A biblioteca de 16S
rDNA de ambas as esponjas revelaram diversas bactérias representadas por três
filos para Amphimedon viridins com dominância de Proteobacteria
(Alfaproteobacteria 91%) e oito filos para a esponja Cliona varians com a maioria
dos clones inseridos no filo Proteobacteria (gammaproteobacteria, 74%). Para fins
comparativos foi utilizada a mesma metodologia para construção de uma biblioteca
de 16S rDNA da esponja Cliona varians com aspecto atípico (lesões), com
predominância do filo Epsilonproteobacteria 48% relacionadas com o gênero
Arcobacter.
Palavras-chave: Amphimedon viridins, Cliona varians, diversidade bacteriana, 16S
rDNA, metagenômica
x
ABSTRACT
OLIVEIRA, Flamélia Carla Silva. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
maio de 2010. Bacterial diversity analysis associated with sponge
Amphimedon viridins and Cliona varians. Advisor: Prof. Dr. Júlio Cezar de
Mattos Cascardo; Committee member: Prof. Dr. João Carlos Teixeira Dias.
The sponges (phylum Porifera) are filter feeders that harbor diverse and
abundant prokaryotic communities that occupy about 40% biomass. Bacteria
associated with sponges produce a wide diversity of secondary metabolites,
which represent an important natural resource, which are has been targeted for
pharmacological studies, especially antitumor, antiviral and antibiotic. This
research shows the first bacterial diversity descriptions associated with two
species of sponges Cliona varians and Amphimedon viridins are abundant in
coral reefs of Coroa Vermelha, Porto Seguro, Bahia, Brazil. Using molecular
independent cultivation methods (metagenomics), total DNA was extracted by
“direct” and “indirect” method. The 16S rDNA genes from total bacterial
community associated with sponges were amplified by PCR, cloned, sequenced
and analyzed using the classifier Ribosomal Database Project II (RDP) from
sequence 16S bacteria. The 16S rDNA library of both sponges revealed several
bacterial represented by three phyla to Amphimedon viridins dominated by
Proteobacteria (Alfaproteobacteria 91%) and eight phyla for the sponge Cliona
varians with most of the clones included in the phylum Proteobacteria
(Gammaproteobacteria, 74% ). For comparative purposes we used the same
methodology for building a 16S rDNA library of the sponge Cliona varians with
the atypical appearance (lesions), with predominance of the phylum
Epsilonproteobacteria 48% related to the genus Arcobacter.
Keywords: Amphimedon viridins, Cliona varians, bacterial diversity, 16S rDNA,
metagenomics.
xi
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esponja Amphimedon viridins .............................................. 3
Figura 2 Esponja Cliona varians ........................................................ 4
Figura 3 Gel de eletroforese 1% demonstrando DNA extraído pelo método direto (A) e indireto (B) ............................................ 19
Figura 4 Amplificação de PCR do 16S rDNA das bactérias associadas as
esponjas Amphimedon viridins e Cliona varians ................... 20
Figura 5 Eletroforese em gel de agarose 1,0%, com bandas que confirmam a extração de DNA plasmidial (miniprep) de alguns clones da biblioteca de 16S rDNA ................................................ 21
Figura 6 Distribuição dos clones entre os diferentes grupos filogenéticos nas esponjas Cliona varians e Amphimedon viridins 22
Figura 7 Distribuição das classes de Proteobacteria isoladas das esponjas Cliona varians e Amphimedon viridins .......................... 23
Figura 8 Distribuição em ordens dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Amphimedon viridins ....................................................... 25
Figura 9 Distribuição em ordens dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Cliona varians .................................................................. 25
Figura 10 Distribuição em família dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Amphimedon viridins ....................................................... 26
Figura 11 Distribuição em família dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Cliona varians ................................................................. 26
Figura 12 Filo da esponja Cliona varians e Cliona varians –SULFATO ....... 28
Figura 13 Distribuição das proteobactérias dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Cliona varians e Cliona varians- Sulfato ........ 28
Figura 14: Árvore filogenética geradas pelo método de Neighbor-joining a a partir das sequências de Proteobacteria obtidas da esponja Amphimedon viridins ..................................................................... 29
Figura 15 Árvore filogenética geradas pelo método de Neighbor-joining a partir das sequências de Proteobacteria obtidas da esponja Cliona varians ............................................................................... 30
Figura 16 Árvore filogenética obtida pelo método de Neighbor-joining a partir das sequências dos filos obtidas da esponja Cliona varians – SULFATO ...................................................................... 31
xii
Tabela 1 Possíveis gêneros encontrados na biblioteca de 16S rDNA esponja Amphimedon viridins e Cliona varians ............................ 27
1
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 As Esponjas
As esponjas (filo porífera) são animais invertebrados primitivos com registros
fósseis que datam aproximadamente 600 milhões de anos. Este grupo apresenta
uma alta diversidade com aproximadamente 9.000 espécies descritas em três
classes: Calcarea, Hexactinellida e Demospongiae (HOOPER e VAN SOEST, 2002).
A maioria das esponjas é marinha (98%) e habitam os oceanos tropicais,
temperados e regiões polares, com algumas espécies encontradas em água doce
(TAYLOR et al., 2007).
Como o nome Porífera sugere, o corpo da esponja é poroso, multicelular,
apresenta uma morfologia simples e um baixo grau de organização, sem a formação
de tecidos verdadeiros (RUPPERT et al., 2005). As esponjas possuem uma enorme
diversidade de formas e cores que é o resultado de pigmentos celulares ou de
endossimbiontes (TRAKUR e MÜLLER, 2004). São geralmente sustentadas por um
esqueleto constituído por espículas silicosas ou calcárias (esponjas coralinas) ou por
fibras de espongina, uma proteína do tipo do colágeno (esponjas córneas)
(RUPPERT et al., 2005). Podem atingir dimensões consideráveis (1 m ou mais de
altura) especialmente em águas tropicais (HENTSCHEL et al., 2002).
Todas as esponjas são animais bentônicos sésseis, especializados na
alimentação por filtração, processo que se caracteriza pelo bombeamento da água
através de um sistema de canais internos, também chamado de “sistema aquífero”.
O canal do sistema é incorporado em uma matriz extracelular de colágeno
(mesohilo), que preenche o espaço entre o interior das células ciliadas externas
(ectoderma) e as células que revestem o interior dos canais (pinacoderme)
(RUPPERT et al., 2005). A água entra pelos poros que estão localizados no espaço
exterior, atravessa o corpo pelo sistema de canais e com a ação de células
flageladas chamadas coanócitos, onde ocorre a separação das partículas
2
alimentares suspensas da água, retirando os nutrientes e outros metabólitos
(GERNET et al., 2005).
Em geral, essas partículas filtradas variam em tamanho de menos de 1 a 50
µm e incluem o plâncton unicelular, como dinoflagelados, bactérias, vírus e material
orgânico dissolvido. As bactérias são retiradas da coluna de água por fagocitose
(HENTSCHEL et al., 2002). A passagem da água é também usada para efetuar as
trocas gasosas, excreção e a liberação de espermatozóides e larvas (GIAMATE,
2007).
Além de uma população transitória de bactérias da água do mar que são
utilizadas como fonte de alimento, as esponjas abrigam uma microbiota diversificada
que pode residir permanentemente em uma estreita interação. Estima-se que em
algumas espécies, 40 % da biomassa devem ser atribuídas às bactérias, que em
quantidade excede a da água do mar por 2 – 3 ordens de magnitude (HENTSCHEL
et al., 2002).
1.2 Esponjas marinhas Amphimedon viridins e Cliona varians
A espécie Amphimedon viridins (figura 1) (Classe Demospongiae, ordem
Haplosclerida, família Niphatidae), identificada em 1864 por Duchassaing &
Michelloti, é endêmica em algumas regiões no Brasil, podendo ser encontrada no
Sudeste (São Paulo, Rio de Janeiro) e parte do Nordeste (Bahia, Alagoas,
Pernambuco), como também fora do Brasil, no Caribe, Flórida e Carolina do Norte
(EUA) (MURICY, 1999). Apresenta a cor externa verde, consistência macia,
quebradiça, com um muco colante, com até 8 cm de altura e 20 x 20 cm de lado.
São encontradas em profundidades de 1 a 8 m, sob pedras, ou expostas à luz
(MURICY, 1999). Produz as halitoxinas e amphitoxinas, compostos com atividades
antimicrobianas, hemolíticas, ictiotóxicas, neurotóxicas e antitumorais (KELMAN et
al., 2001; MAYER e HAMANN., 2002).
3
A espécie Cliona varians (figura 2) (Classe Demospongiae, ordem
Hadromerida, família Clionaidae) foi identificada também por Duchassaing &
Michelloti em 1864, possui cor marrom esverdeada na parte externa e a interna
entre cinza e o beje. Superfície regular, lisa, consistência firme, porém quebradiça.
Forma perfurante com 0,5 – 1,5 cm de espessura e até 150 X 50 cm de largura.
Encontrada no Golfo do México, Caribe e Brasil (Pernambuco, Fernando de
Noronhas, Alagoas, Atol das Rocas, Bahia, Espírito Santo e Rio Grande do Norte)
(MURICY, 1999). Esta espécie perfurante atua no processo de erosão de substratos
carbonáticos em recifes de corais e produz uma lectina, denominada CyL, com
atividade antibiótica contra bactérias Gram positivas e Leishmania chagasi (MOURA,
et al., 2006).
Figura 1. Esponja Amphimedon viridins. (Foto Eduardo Hajdu, 1998). Disponível em: <www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/...aviridis.htm> acesso em: outubro de 2009.
4
.
1.3 Microrganismos associados a esponjas
Diversos organismos podem abrigar-se nas esponjas como: archaeas,
bactérias heterotróficas, cianobactérias, algas, fungos, dinoflagelados e diatomáceas
(LEE et al., 2001). Muitas esponjas marinhas e de água doce hospedam
endossimbiontes fotossintéticos em seus tecidos e logram um benefício nutricional
dessa fotossíntese. O excesso de produtos fotossintéticos, na forma de glicerol e um
composto fosforilado, são utilizados pela esponja (GIAMATE, 2007).
Estudar as comunidades microbianas associadas com as esponjas é uma
importante ferramenta para o conhecimento da diversidade de microrganismos, uma
vez que, o habitat simbiótico pode conter uma grande diversidade procariótica
(AMANN et al., 1995).
Vacelet e Donadey (1977) sugerem três tipos de associações microbianas
em esponjas: (i) populações abundantes de microrganismos específicos no mesohilo
da esponja, (ii) pequenas populações de bactérias específicas no meio intracelular, e
(iii) populações inespecíficas semelhantes às bactérias da água do mar circundante.
Figura 2. Esponja Cliona varians (Foto F. Moraes). Disponível em: <www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/...cvarians> acesso em: outubro de 2009.
5
Webster e colaboradores (2001) sugerem várias possibilidades sobre o
processo de simbiose entre microrganismos e esponjas. O simbionte específico
pode ser absorvido seletivamente, crescendo mais rapidamente do que qualquer
outro microrganismo, ou o adquirem através de transmissão vertical pelos estágios
reprodutivos como embriões e larvas. Desta forma, estes podem ter co-evoluído com
os seus hospedeiros e passar à geração seguinte (ENTICKNAP et al., 2006). A
aquisição do simbionte pode se dar através da rota de alimentação, onde eles
resistem ao processo digestivo (raramente parecem ser digeridos) e assim se
instalam com sucesso. Lectinas também podem estar envolvidas no reconhecimento
dessa interação. Provavelmente, devido a estas características, alguns simbiontes
parecem habitar esponjas específicas, mas outras não (TAYLOR, et al., 2004).
Algumas esponjas são conhecidas por serem associadas com grande
quantidade de microrganismos, sendo denominadas “bacteriosponges” ou “esponjas
com alta abundância de microrganismos”, com densidades entre 108 e 1010 bactéria
por grama de peso úmido (HENSTCHEL et al., 2006). Já outras contêm uma
pequena quantidade de microrganismos dentro de seus tecidos (TAYLOR et al.;
GROZDANOV e HENTSCHEL, 2007).
Os microrganismos simbióticos parecem ter um habitat específico dentro da
esponja, localizando-se tanto intra como extra-celularmente. Podem estar presentes,
de forma extracelular, nas camadas externas da esponja como exosimbionte, ou
dentro do mesohilo como endosimbionte. Já quando habita o interior das células da
esponja ou núcleos, a simbiose é considerada intracelular e intranuclear,
respectivamente (LEE et al., 2001 e GIAMATE, 2007).
A quantidade de microrganismos simbiontes residentes em esponjas varia
entre as espécies (TAYLOR et al., 2007). As superfícies expostas à luz são,
tipicamente, povoadas por bactérias fotossintéticas, enquanto que os espaços
internos de esponjas marinhas são mais ricos em nutrientes, do que o sedimento e a
água do mar, oferecendo alimento e um habitat para seus simbiontes com misturas
de bactérias heterotróficas e autotróficas (LEE et al., 2001 e KENNEDY et al., 2007).
Por outro lado, microrganismos simbiontes ajudam no processo nutricional das
esponjas, quer por digestão intracelular ou por translocação de metabólitos,
incluindo a fixação de nitrogênio, nitrificação e fotossíntese. Além disso, estabilizam
6
o esqueleto da esponja e participam no sistema de defesa química do hospedeiro
contra predadores com produção de compostos resultantes do metabolismo
secundário (LEE et al., 2001).
Segundo Taylor e colaboradores (2004), estamos começando a reconhecer
os padrões de distribuição de simbiontes. Esponjas contêm uma mistura de
microrganismos generalistas (intimamente relacionados com os grupos de bactérias
que são encontradas somente em esponjas) e especialistas (encontrados em
múltiplos hospedeiros e água do mar e que as comunidades de microrganismos
associados são bastante estáveis no espaço e no tempo) (HENTSCHEL et al.,
2002).
Compostos naturais com potencial bioativo e novas estruturas moleculares
podem ser produzidos por esponjas marinhas e seus microrganismos associados. A
produção de metabolitos secundários pode ser relatada para os microrganismos
simbiontes, somente se a sua síntese for demonstrada em culturas isoladas
(GIAMATE, 2007). Entretanto, é possível que estes compostos sejam também
sintetizados em paralelo com o hospedeiro, o que gera uma limitação para a sua
identificação. Sem o isolamento por cultivo dessas bactérias, dados taxonômicos
derivados da biologia molecular podem contribuir para o conhecimento evolucionário
destes simbiontes (TAYLOR et al., 2007), assim como, fornecer informações sobre
a bioquímica destes microrganismos e ajudar na busca de novos produtos naturais,
podendo sua biossíntese ter potencial para desenvolver produtos biotecnológicos
(LEE et al.,2001).
1.4 Principais grupos bacterianos presentes em esponjas
A diversidade de microrganismos presentes em esponjas, foram identificados
a apartir de bibliotecas de genes de 16S rRNA e, ou isolados de bandas de gel de
eletroforese de gradiente de desnaturação (DGGE). São reconhecidos 14 filos
bacterianos que são: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi,
Cyanobacteria, Deinococcus- Thermus, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Nitrospira,
7
Planctomycetes, Proteobacteria (Alpha, beta, delta e gammaproteobacteria,
Spirochaetes e Verrucomicrobia (HENTSCHEL et al 2002; ENTICKNAP et al., 2006
TAYLOR et al., 2007)
Além disso, um candidato a filo esponja específico “Poribacteria” também foi
relatado em diversas esponjas (FIESELER et al., 2004). Membros de vários filos
bacterianos como: Actinobacteria, Bacteroidetes, Cianobactérias, Firmicutes,
Planctomycetes, Proteobacteria e Verrucomicrobia também foram isolados em
cultura pura a partir de esponjas marinhas, que parecem ser mais abundantes que
os microrganismos simbiontes de esponjas de água doce (TAYLOR et al., 2007).
Somente as sequências de Actinobacteria, Chloroflexi e Alpha e Beta
proteobacteria, foram identificados da biblioteca de 16S rDNA construída a partir da
esponja de água doce Spongilla lacustris (GERNERT et al., 2005), sendo que muitas
dessas seqüencias eram muito semelhantes as do habitat da água, sugerindo que
eles podem não representar simbiontes verdadeiros.
1.5 Métodos para explorar a diversidade dos microrganismos
associados às esponjas
Os primeiros trabalhos que exploraram comunidades simbiontes usaram
microscopia de tecidos de esponja (VACELET e DONADEY, 1977) e posteriormente,
técnicas cultiváveis que recuperam em torno de 10% do número total de espécies
microbianas que ocupam a esponja (HILL et al., 2006).
O cultivo de microrganismos associados às esponjas marinhas tem sido
limitado pela dificuldade de crescimento desses organismos em meios de cultura
definidos em laboratório. Esta técnica identificava poucos indivíduos porque o meio
de cultura é, em maior ou menor grau, seletivo para um ou outro grupo de
microrganismos, visto que, não representam as condições encontradas em
ambientes naturais, isolando apenas uma pequena quantidade da comunidade total
de bactérias associadas às esponjas (WEBSTER et al., 2001). Por outro lado, as
8
contagens de células por microscopia refletem apenas uma avaliação quantitativa da
população microbiana, sendo pouco informativas sobre a diversidade dos
organismos (VACELET e DONADEY, 1977).
Pace e colaboradores (1986), foram os primeiros a sugerirem o uso do gene
16S rDNA como um marcador molecular para o estudo de populações microbianas
em amostras ambientais, independente do seu cultivo. O gene 16S rDNA é
amplamente utilizado em estudos de avaliação da diversidade em amostras
ambientais. O RNA Ribossomal 16S, está presente em todas as bactérias,
apresentando estrutura com alternância entre regiões conservadas e regiões
variáveis e, além disso, tem um tamanho suficiente para realização de análises de
inferência filogenética e um grande número de sequências já se encontra
disponíveis em bases de dados de acesso livre (MUYZER, 2000). O 16S rRNA
possui também 9 regiões variáveis, alternadas com regiões conservadas,
denominadas de V1 a V9. Áreas variáveis podem ser usadas para estudar as
relações evolutivas entre dois organismos muito próximos, já as áreas conservadas
podem ser usadas para revelar relações antigas entre duas moléculas (WOESE et
al.,1983).
Estudos baseados em genes 16S rDNA permitiram uma descrição
filogenética detalhada dos microrganismos associados com as esponjas,
possibilitando, através da genômica ambiental, começar a conhecer suas
propriedades metabólicas e fisiológicas (GROZDANOV e HENTSCHEL, 2007).
Nos últimos anos, muitos estudos têm explorado a diversidade de bactérias
simbiontes em esponjas, usando abordagens de técnicas independentes de cultivo
oferecidas pelas técnicas de biologia molecular (FIESELER et al., 2004; LI et al.,
2007; KENNEDY et al., 2008).
A eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE), seqüenciamento da
região 16S rDNA e Hibridização in situ fluorescente (FISH) tem revelado a grande
diversidade de bactéria não cultiváveis (FRIEDRICH et al., 1999.; WANG, 2006). O
crescente interesse em estudar estas associações resultou também em um aumento
de bibliotecas com sequências de 16 rRNA obtidos a partir de esponjas (WEBSTER
et al., 2001, TAYLOR et al., 2007).
9
1.6 A metagenômica e a biotecnologia
O dilema da incapacidade para cultivar a vasta maioria dos microrganismos
presentes na maioria dos nichos microbianos (AMANN et al., 1995) forçou cientistas
a desenvolverem métodos para explorar os genomas de bactérias por biotenologia
sem cultivo prévio. O termo “metagenômica” foi usado pela primeira vez por Jo
Handelsnam em 1998, e significa análise genômica da comunidade de um
determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo (HANDELSMAN,
2004). O que tem sido particularmente útil para análise de procariotos não
cultiváveis em meios de cultura tradicionais e que representam até 99% de
organismos em alguns ambientes (SCHLOSS e HANDELSMAN, 2003).
A metagenômica envolve construção de bibliotecas genômicas através da
lise, extração e clonagem de DNA de alto peso molecular (HANDELSMAN, 2004)..
Metagenomas de microrganismos associados às esponjas marinhas tem sido
utilizado com sucesso na identificação de genes alvos envolvidos na síntese de
produtos naturais (KENNEDY et al., 2008). Essa técnica possibilita acessar
informações em nível de filogenia, como também isolar e clonar novos genes
responsáveis pelas mais diversas funções, explorando o potencial biotecnológico de
microrganismos (PIEL et al., 2004).
10
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Analisar a diversidade bacteriana associada às esponjas Amphimedon viridins
e Cliona varians com abordagem metagenômica.
2.2 Específicos
Testar e padronizar protocolo para extração de DNA bacteriano associados às
esponjas Amphimedon viridins e Cliona varians.
Construir uma biblioteca para genes 16S rDNA para bactérias associadas às
esponjas Amphimedon viridins e Cliona varians.
Estimar a filogenia das bactérias associadas às esponjas Amphimedon
viridins e Cliona varians através de estudos de bioinformática e análises
filogenéticas.
11
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta das esponjas
Esponjas das espécies Amphidemon viridins e Cliona varians foram coletadas do
Recife de Corais de Coroa Vermelha (16º19.955’S, 38º59.997’W), em Porto Seguro -
Bahia, em outubro de 2008. Em seguida, foram colocadas em sacos plásticos
estéreis, transportadas sob refrigeração de 2 a 8 ºC para o laboratório de
Biotecnologia Microbiana da Universidade Estadual de Santa Cruz em até 24 h e
armazenada a -80 ºC. Em relação à espécie Cliona varians foram coletadas
esponjas com aspecto típico (cor marrom esverdeada na parte externa e
acinzentada na parte interna) e com aspecto atípico (lesões), aqui denominada de
Cliona varias – SULFATO (Devido à provável presença de bactérias redutoras de
sulfato, indicado pelo cheiro forte de enxofre que estas lesões apresentavam). A
identificação taxonômica das espécies de esponjas foi realizada pelo grupo de
pesquisa em Poríferos, da Universidade Federal da Bahia.
3.2 Extração de DNA
3.2.1 Método direto (lise direta das células microbianas junto com as células da
esponja (KENNEDY et al., 2008 – modificado).
Para extração do DNA 3 g de esponja foram pesados e macerados em
nitrogênio líquido, com auxílio de grau e pistilo. O macerado foi misturado em 5 mL
de tampão de lise (EDTA 100 mM, Tris –HCL 100mM, CTAB 1%, SDS 2% e NaCl
1,5 M) pH 8,0 a 65 °C por 30 min em seguida a mistura foi centrifugada por 5 min a
5000 g. Então o sobrenadante foi descartado e adicionado o mesmo volume de
solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1) por 2 vezes. Ao
sobrenadante foi acrescentado 70% do volume final de álcool isoamílico e 10% de
acetato de sódio a 3 mM para precipitação por 16 h a -20 °C. Após, foi centrifugado
12
5 min a 13.400 g, o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado duas vezes
com etanol a 70%. Em seguida, o DNA foi ressuspendido em 50 µL de água ultra-
pura autoclavada. A quantidade e qualidade do DNA extraído foram avaliadas por
espectrofotometria (gene quant ®) na razão 260/280 e por eletroforese em gel de
agarose a 1% corado com brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta.
3.2.2 Método indireto (Separação das células microbianas da esponja, para
posterior isolamento do DNA procariótico) – (Shirmer, 2005).
Para esta extração, 20 g de esponja foram cortados em pequenos pedaços de
1 cm³ e adicionados a 20 mL de tampão salina fosfato com 10 mM EDTA (PBSE), na
proporção de 1mL/g de esponja. A enzima Colagenase (Roche Applied Sciense) 500
µg/mL foi adicionado e agitado levemente, até dissolução completa do tecido da
esponja. A suspensão foi filtrada em papel de filtro (poros de 45 µm) utilizando
kitasato e bomba de vácuo. Em seguida, o filtrado foi centrifugado por 6 min (500 g a
4 °C) para retirada de restos celulares. O sobrenadante foi centrifugado por 20 min
(8.800 g a 4°C), e o precipitado ressuspendido em 1 mL de tampão PBSE e
adicionado a um tubo contendo 2 ml de solução 15% Percoll (GE Healthacare) em
PBSE. Depois foi centrifugada por 10 min (750 g a 4 °C) e cuidadosamente foi
removida, a camada acima da solução de percoll (partícula de silica (15-30 nm) para
separar células por gradiente de centrifugação) e procedeu-se a lavagem por duas
vezes com PBSE. O precipitado foi ressuspendido em 0,5 mL de tampão (Nacl 0,5
M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0.
Ao precipitado de células bacterianas foi adicionada Lisozima (Sigma) 30 µL
(50 mg/ ml) e incubado a 37 ºC por 1 h. Em seguida, foi adicionado proteinase K
(Fermentas) 0,5 mg/mL - 1% SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) e incubada a 50 °C por
2 h. Após lise o DNA foi extraído com fenol/ clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1,
pH 7,3) na proporção 1/1 por 2 vezes. O sobrenadante foi retirado e acrescentado
70% do volume final de álcool isoamílico e 10% de acetato de sódio a 3 mM para
precipitação por 16 h a -20 °C. Após, foi centrifugada por 5 min a 13.400 g, o
sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado duas vezes com etanol a 70%.
Em seguida, o DNA foi ressuspendido em 50 µL de água ultra-pura autoclavada. A
13
quantidade e qualidade do DNA extraído foram avaliadas por espectrofotometria
(gene quant ®) na razão 260/280 e por eletroforese em gel de agarose a 1% corado
com brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta.
3.3 Amplificação do gene 16S rDNA
O gene 16S rDNA foi amplificado por PCR (Reação em cadeia da Polimerase)
utilizando um conjunto de primers universais 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-
3’) e 1525R (5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’) para o domínio Bactéria, com
amplificação de um fragmento de DNA de aproximadamente 1500 pares de bases. A
amplificação foi realizada utilizando as seguintes condições: (i) temperatura inicial de
desnaturação 94 ºC por 5 minutos; (ii) 34 ciclos de amplificação à 94 ºC por 1
minuto; 55 ºC por 1 minuto; 72 ºC por 3 minutos e (iii) temperatura de extensão final
de 72 ºC por 15 minutos. A reação de amplificação foi preparada em solução
contendo as seguintes concentrações de reagentes: 2,5 µL de tampão 10X de
reação para a Taq DNA polimerase (100 mM Tris-HCL, 500 mM KCL, 0,8%)
concentração final de 1X; 3,7 mM de cloreto de magnésio, 0,4 pmol/µL de
deoxinucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP), 0,4 pmol/µL de cada iniciador,
0,4mM de BSA (Albumina Soro Bovina), 3 unidades de enzima Taq DNA polimerase
(Fermentas), e água ultra pura estéril para volume final de 25 µL. Como controle
positivo foi utilizado 10 ng de DNA genômico de Escherichia coli. Os produtos
amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1%, corados com brometo de
etídio e visualizados em luz ultravioleta.
14
3.4 Clonagem do DNA
3.4.1 Ligação do 16S rDNA ao vetor
Os fragmentos de DNA amplificados com primers para o 16S rDNA foram
purificados com o Kit GFX PCR (Amersham Biosciences) e ligados em plasmídeo
utilizando o kit pGEM-T Easy vector (Promega). Foram utilizados controles positivo
(DNA com concentração conhecida) e negativo (sem DNA) da reação de ligação de
acordo com as instruções do fabricante. A proporção de inserto/vetor utilizada na
reação de ligação foi de 3:1. Após a ligação foi incubada inicialmente por 1h a 22 ºC,
seguido de uma incubação overnight a 4ºC. Em seguida, a reação de ligação foi
precipitada com acetado de sódio 3 M, glicogênio (20 mg/mL) e etanol 100% para a
retirada de sais, que podem interferir no processo de eletro- transformação em
Escherichia coli.
3.4.2 Transformação bacteriana
Após a ligação, foi feito o procedimento de eletro-transformação, utilizando 20
µL das células de E. coli DH10β eletrocompetentes (Invitrogen) e 4 µL da reação de
ligação. A amostra foi submetida à eletroporação utilizando o eletroporador
GenePulser II (Biorad), seguindo as instruções do fabricante. À suspensão celular de
E. coli foi adicionado 1 mL de meio LB (Luria-Bertani) e incubado sob agitação a 37
ºC por 1 hora. As células transformadas foram plaqueadas em meio LB, acrescido
de ágar (15 g L-1), contendo o antibiótico ampicilina (100 µg/mL-1), IPTG (Isopropyl β-
D-1-thiogalactopyranoside) 200 µg/mL-1 e X-gal (5-bromo-4-cloro-3indolil-β-
Dgalactopiranosideo) 20 µg/mL-1. Para seleção visual direta (coloração branca/azul)
das colônias. Em seguida as placas foram incubadas a 37 ºC por 16 h e
armazenadas a 2 a 8 ºC até o repique das colônias transformantes. Os clones
transformantes (colônias brancas) foram transferidos cuidadosamente, com auxílio
15
de dois catadores, para novas placas de Petri com ágar LB (Luria-Bertani), contendo
ampicilina, IPTG e X-GAL nas mesmas concentrações utilizadas anteriormente. As
biblioteca de 16S rDNA foram estocadas em placas de polietileno de 96 poços, os
clones foram crescidos em 70 µL de meio LB líquido, com ampicilina a 100 µg/ml -1
incubadas a 37 ºC sob agitação por 14 h. Após, foram adicionados 70 µL de glicerol
estéril a 16% às culturas. As placas foram seladas, identificadas e estocadas a -80
ºC.
3.4.3 Validação da biblioteca de clones de 16S rDNA
A confirmação dos insertos de 16S rDNA nos clones da biblioteca foi
realizada utilizando uma amplificação por PCR com os primers M13F (5’ - GTA AAA
CGA CGG CCA GT – 3’) e M13R (5’ - CAG GAA ACA GCT ATG AC - 3’)
complementares aos sítios de clonagem do vetor pGEM-T Easy. A amplificação foi
realizada utilizando as seguintes condições: (i) temperatura inicial de desnaturação
94 ºC por 4 minutos; (ii) 29 ciclos de amplificação a 94 ºC por 30 segundos; 52 ºC
por 30 segundos minuto; 72 ºC por 2 minutos e (iii) extensão final de 72 ºC por 2
minutos. Como controle positivo, foi utilizado uma colônia transformada de E. coli
com inserto de 16S rDNA clonado em pGEM-T Easy Vector. A reação de
amplificação foi preparada em solução contendo as seguintes concentrações de
reagentes: 2,5 µL de tampão 10X da reação para a Taq DNA polimerase (100 mM
Tris-HCL, 500 mM KCL, 0,8%) concentração final de 1X; 3,7 mM de cloreto de
magnésio, 0,4 pmol/µL de deoxinucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP), 0,4
pmol/µL de cada iniciador, 0,4mM de BSA (Albumina Soro Bovina), 3 U de enzima
Taq DNA polimerase (Fermentas), e água ultra pura estéril para volume final de 25
µL.
16
3.5 Extração de DNA plasmidial
As placas contendo os clones a serem preparados para extração de DNA
plasmidial para sequenciamento foram retiradas do ultra-freezer e deixadas
descongelar em gelo por aproximadamente 20 min. Para crescimento bacteriano
foram utilizados placas de 96 poços com capacidade de 2 mL. Em cada poço da
placa foi colocado 1,2 mL de meio LB, contendo 100 µg/mL de ampicilina. Os clones
foram inoculados com o auxílio de repicador de 96 pinos e a placa selada com
adesivo, perfurado em cada poço para permitir aeração. As culturas foram
incubadas por 18 h em estufa a 37 ºC em um agitador horizontal ajustado a 180 g.
A placa contendo os clones foi centrifugada por 10 min (4000 g a 4 ºC), para
sedimentar as células. O sobrenadante foi descartado invertendo o meio de cultura
em um recipiente para posterior autoclavagem e, ainda invertida, foi colocada sobre
papel absorvente por 5 min. Em seguida, foram adicionados 200 µl de solução I -
GET (Glicose 20%, EDTA 0,01M pH 8,0 e Tris HCl 0,026 M pH 7,4) e as células
foram ressuspendidas por agitação com a placa completamente selada. As placas
foram centrifugadas por 10 min (4000 g a 4 ºC) e o sobrenadante foi descartado. Em
seguida, foram adicionados 60 µL da solução I - GET em cada poço. Então 60 µL da
suspensão de células foram transferidas para uma microplaca (polipropileno) de 96
poços com capacidade para 250 µL e fundo U contendo 5 µL de RNAse 10 mg/mL.
A cada poço da placa foram adicionados 60 µL de solução II (SDS 1 % e NaOH 0,2
mol/L) preparada na hora do uso. As placas foram seladas, misturadas por inversão
rápida por 60 vezes e incubadas a temperatura ambiente por 10 min. A seguir,
acrescentou a cada poço 60 µL de solução KoAc 3 mol/L, com pH 5,2, gelado e
misturou por inversão rápida 60 vezes. A placa então foi incubada sem selo em
estufa a 90 ºC por 30 min.
Após esse tempo, a placa foi resfriada em banho de gelo por 10 min e
centrifugada mais 15 min (4000 g a 4 ºC). O sobrenadante foi então coletado e
transferido 60 µL para uma placa Millipore de 96 poços, fixada sobre uma placa de
fundo “V” de 250 µL e o conjunto centrifugado (sem o adesivo) por 10 min (4000 g a
4 ºC). Ao filtrado que passou para a microplaca, adicionou-se 60 µL de isopropanol e
17
em seguida centrifugou 45 min (4000 g a 4 ºC). O precipitado de DNA foi então
lavado com 150 µL de etanol 70% e secado em estufa por 8 min a 65 ºC, sem selo.
Por fim, o DNA foi ressuspendido em 30 µL de água ultra-pura.
3.6 Sequenciamento e análise por bioinformática
As sequências nucleotídicas dos clones de genes 16S rDNA foram geradas
pelo sequenciador automático (Megabace 1000TM, Amersham Bioscience), cuja
reação de amplificação de sequenciamento foi realizada com o primer M13 F (5’-
GTAAAACGACGGCCAGT-3’) para volume final de 5 µL foram usados 2,0 µL de
pré-mix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing kit Megabace DNA
Analysis Systems)®, 0,3 µL primers M13 F (concentração final 3,7 pmol/µL) e 2,7 µL
de DNA (concentração de 200 ng/µL). Na reação foram utilizadas as seguintes
condições: 39 ciclos de 95 ºC por 10 segundos, 50 ºC por 15 segundos e 60 ºC por 1
minuto e 20 segundos.
Antes de submeter às sequências a análises filogenéticas foram removidas as
sequências do vetor utilizando o programa SeqMan (versão 7.0), alinhadas pelo
método múltiplo global e editadas para a mesma região do 16S rDNA utilizando o
programa CLUSTAL W (versão 2.0). Em seguida as sequências foram submetidas
ao banco de dados público Naive Bayesian rRNA classifier of the Ribossomal
Database Project II (http://rdp.cme.msu.edu), que analisa sequências de
aproximadamente 500 bases, com eficiência maior que 99,2 % para filo; 98,4 % para
classe; 96,6 % para ordem; 93 % para família e 87,7 % para gênero usando um
limiar de coeficiente de confiança de 80 %. As informações geradas por este
classificador foram submetidas ao programa MEGA (versão 4.1) para gerar árvores
filogenéticas pelo método de Neighbor-joining.
18
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Extração de DNA
Pelo método de extração direta das esponjas Amphimedon viridins, Cliona
varians e Cliona varians-SULFATO, foram obtidos 376, 494 e 283 ng/µL
respectivamente e grau de pureza na razão 260/280 igual a 1,7 (Figura 3A). Pelo
método indireto, usado apenas para a esponja Amphimedon viridians a
concentração do DNA foi de 63 ng/µL, com razão 260/280 de 1,7 (Figura 3B).
Ambos os métodos de extração de DNA foram eficientes para as esponjas
estudadas. Com o método direto foi extraído o DNA total para construção das
bibliotecas 16S rDNA, por ser mais indicado para estudo de diversidade total, por
acessar o DNA das bactérias em simbiose extracelular, intracelular e intranuclear
(Lee et al.; 2001). Kennedy et al.; (2008) avaliaram a diversidade de
microrganismos associados a esponjas Haliclona simulans em bibliotecas 16S
rDNA construídas de DNA da extração direta e indireta, observando que houve
maior número de filos (7) nas bibliotecas feitas a partir de DNA total (método
direto) contra 5 filos obtidos pela extração indireta.
O método indireto acessa bactérias em endo e exosimbiose extracelular,
devido à separação previa das células da esponja antes da extração do DNA das
bactérias e, portanto, são mais indicados em estudos de identificação de
compostos secundários de interesse biotecnológico (JUAN et al., 2006; OUYANG
et al, 2009) . Schirmer et al.; (2005) construíram biblioteca metagenômica e
encontraram diversos genes policetidios sintetase em microrganismos
associados a espoja marinha Discodernia dissoluta, utilizando somente o método
direto de extração de DNA. Este mesmo método foi aplicado nos estudos de Kim
e Fuerst (2006) para avaliar a diversidade de policetidios sintetase de bactérias
associadas a esponjas marinhas Pseudoceratina Clavata. Wegley et al.; (2007)
19
também utilizaram o método indireto de extração de DNA de bactérias para
analisar a comunidade microbiana associada com coral Porites astreoides.
A enzima colagenase B foi usada na extração indireta, pois as esponjas em
estudo são da classe Demospongiae cujo esqueleto é constituído de espongina,
estrutura semelhante ao colágeno. A colagenase facilita a dissociação das
células das esponjas para melhor acessar as células das bactérias que estavam
a elas aderidas, segundo protocolo de Schirmer et al (2005). Portando no
presente trabalho o uso da colagenase foi essencial na obtenção de células
bacterianas que interfere diretamente na quantidade e qualidade do DNA a ser
extraído.
Outro aspecto relevante na extração indireta foi o uso do Percoll (gradiente de
centrifugação), responsável por separar as células bacterianas das células de
esponja (SCHIRMER et al.; 2005, WEGLEY et al.; 2007).
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1%. A) da esquerda para a direita: DNA da esponja Cliona varians pelo método direto (5 µL); marcador (250-10000 pb) Fermentas (2 µL); B) da esquerda para a direita: marcador (250-10000 pb) Fermentas (2 µL); DNA da esponja Amphimedon viridins pelo método indireto (5 µL).
A B
20
4.2 Construção da biblioteca de 16S rDNA
Utilizando DNA extraído pelo método direto, os produtos de PCR foram
utilizados para construir bibliotecas de genes 16S rDNA das esponjas Amphimedon
viridins, Cliona varians e Cliona varians - SULFATO, utilizando os primers
27F/1525R com aproximadamente 1.500 pb (figura 4). Os fragmentos foram
cortados do gel e purificados para garantir que somente as amplificações de
interesse fossem utilizadas na etapa de clonagem e êxito na construção das
bibliotecas.
A extração do DNA plasmidial, que contêm o inserto correspondente ao gene
16S rDNA, apresentou padrão homogêneo e com pureza de duas bandas
correspondente ao DNA plasmidial (figura 5).
Figura 4. Amplificação de PCR do 16S rDNA das bactérias associadas as esponjas. 1: Marcador (250 -10000 pb) Fermentas; 2: Amphimedon viridins; 3: Cliona varians; C+: Controle positivo amostra de DNA de Escherichia coli e C-: controle negativo.
21
4.3 Sequenciamento e Análise de Bioinformática
Foram sequenciados 288 clones de cada biblioteca das esponjas
Amphimedon viridins e Cliona varians e 96 da esponja Cliona varians -SULFATO. Os
dados de bioinformática, obtidos via sequenciamento, foram analisados para um
total de 137 sequências da esponja Amphimedon viridins, 102 da Cliona varians e 51
da Cliona varians–SULFATO, com tamanhos superior a 200 pb. As demais
sequências foram descartadas por não apresentar tamanho e qualidade suficientes
para realizar predições de hierarquia taxonômica com alta confiança. O número de
sequências válidas não compromete a analise da diversidade bacteriana e é
compatível ou superior com a maioria das bibliotecas 16S rDNA encontradas em
estudos dessa natureza Hentschel et al.; (2002). Turquer et al.; (2008) estudando
esponjas marinhas do litoral do Rio de Janeiro, obteve 262 sequências dos 384
clones das 4 bibliotecas construídas.
100% das sequências obtidas para ambas às espécies foram classificadas
como sendo de bactérias. Considerando os filos do domínio Bacteria, a esponja
Amphimedon viridins apresentou 92% de Proteobactérias, 7% de Actinobacteria e
apenas 1% de Firmicutes, com representatividade para 3 filos (Figura 6).
Figura 5. Eletroforese em gel de agarose 1,%, com bandas que confirmam a extração de DNA plasmidial (miniprep) de alguns clones da biblioteca de 16S rDNA.
22
Em relação à esponja da espécie Cliona varians a diversidade foi maior,
totalizando oito filos incluindo: Proteobactéria (87%), Firmicutes (6%), Actinobacteria
(1%) Bacterodeites (2%) e Planctomycetes, Bacteroidetes, Espiroqueta,
Actinobacteria com apenas 1% e Chlammydiae, 1 % (figura 6).
Figura 6. Distribuição dos clones entre os diferentes grupos filogenéticos nas
esponjas Amphimedon viridins e Cliona varians
A comunidade microbiana associada à esponja Mycale armata de águas do
Havaí foi explorada por análises de DGGE e relatada com representantes de oito
filos (WANG et al., 2008). A mesma quantidade de filos encontrados para a esponja
Cliona varians neste estudo. Sendo que dos oito filos encontrados para ambas as
esponjas, quatro foram similares: Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes e
Firmicutes.
A presença de Actinobacteria em ambas as bibliotecas, mostra que estudos
baseados em cultura para essa classe de bactéria pode ser desenvolvido,
aumentando a possibilidade de encontrar isolados bacterianos, principalmente com
atividades antimicrobianas. Kennedy et al (2009), isolaram Actinobacterias da
23
esponja Haliclona simulans, com atividade antimicrobiana contra bactéria Gram
positiva e Gram negativa, como também a presença de genes para os Policetideos
sintetases.
Embora não realizada, neste estudo, a análise de diversidade bacteriana da
água do mar para comparação com as bactérias encontradas na esponja, foi
observada diferença relevante na distribuição dos grupos de bactérias, com
predomínio de alfaproteobacteria para a esponja Cliona varians e de
gammaproteobacteria para a esponja Amphimedon viridins.
O Filótipo de maior abundância para ambas as bibliotecas foi de
proteobactéria. As proteobactérias distribuíram-se nas seguintes classes para as
esponjas: Cliona varians e Amphimedon viridins, respectivamente:
alphaproteobacteria (91% e 26%), Gammaproteobacteria (8% e 74%),
Deltaproteobactéria somente encontrada na Cliona varians (1%) (figura 7).
Apesar de estarem localizadas em regiões geográficas distantes, esponjas do
gênero Amphimedon, deste estudo e do mar vermelho, apresentaram o mesmo perfil
de dominância para gammaproteobactéria (RADWAN et al., 2009).
Figura 7. Distribuição das classes de Proteobacteria das esponjas Cliona varians e Amphimedon viridins.
24
A esponja Amphimedon viridins apresentou predomínio de
Gammaproteobacteria e Cliona Varians da classe Alfaproteobacteria, que foi
também encontrada com abundncia na esponja Rhopaloeides odorabile (41%)
(WEBSTER, et al., 2001) e com amostras de esponja da Antártica (WEBSTER, et
al., 2004).
Um fator que sugere adaptação das bactérias a ambientes complexos como
as esponjas Amphimedon viridins e Cliona varians, foi a similaridade observada
entre as sequências 16S rDNA geradas neste estudo com sequências de esponja
depositadas no banco de dados analisado (LI, et al., 2007; HARDOIM et al., 2009;
WANG et al., 2008; KENNEDY et al., 2008).
As técnicas utilizadas neste trabalho, incluindo sequenciamento e
reconstrução filogenética, foram úteis para discriminar e inferir sobre a diversidade
bacteriana em diferentes níveis taxonômicos, incluindo Filo, Classes, Ordem, família
e gêneros, cuja distribuição dos táxons é demonstrada nos gráficos (Figuras 8 - 11)
e Tabela 1 para ambas as espécies de esponja.
Na distribuição em ordens dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja,
Amphimedon viridins, 25% foi representado por Chromatiales. Estas são grupos de
bactérias púrpuras sulfurosas, são geralmente fotossintéticas, sendo encontradas
em ambientes com baixa concentração de oxigênio (KENNEDY et al., 2008).
25
Figura 9. Distribuição em ordens dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Cliona varians
Figura 8. Distribuição em ordens dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Amphimedon viridins
26
Figura 10. Distribuição em família dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Amphimedon viridins
Figura 11. Distribuição em família dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Cliona varians
27
Adicionalmente as sequências obtidas das esponjas Cliona varians e Cliona
varians-SULFATO foram comparadas para avaliar a diversidade bacteriana em
tecidos destas esponjas classificadas como típico e atípico
Methylobacter 17% Labrenzia 41%
Thioalkalivibrio 9% Sinorhizobium 7%
Rhodobacteracea* 10% Caulobacter 7%
Sedimenticola 12% Azospirillum 5%
Lamia 6% Martelella 4%
Thiocapsa 5% Mycoplasma 6%
Não Classificada 10% Ochrobactrum 3%
Paracoccus 7% Salicola 3%
Silicibacter 2% Bacteroidetes 4%
Sinorhizobium 2% Methylobacterium 2%
Loktanella 2% Kaistia 1%
Methylocaldum 2% Bdellovibrio 1%
Shewanela 3% Coriobacteria 1%
Talassobacter 2% Photobacterium 1%
Alkalilimnicola 2% Serratia 1%
Roseovarius 1% Sphingopyxis 1%
Cobetia 1% Rhizobium 1%
Salinicola 1% Psychrobacter 1%
Halomonas 1% Pectobacterium 1%
Pseudomonas 1% Nitrobacter 1%
Granulosicoccus 1% Slackia 1%
Roseobacter 1% Não classificada 7%
Bermanella 1%
Chromatiaceae* 1%
Amphimedon viridans Cliona varians
Tabela 1. Possíveis gêneros encontrados na biblioteca de 16S rDNA esponja Amphimedon viridins e Cliona varians.
28
Em ambos as bibliotecas de 16S rDNA das esponjas Cliona varians e Cliona
varians-SULFATO a distribuição de filos foi dominante para proteobacteria (figura
12). Dentro das proteobacteria foi bastante significativo a predominância da classe
de epsilonproteobacteria (48%) na esponja Cliona varians-SULFATO, e na esponja
Cliona varians não foi encontrado nenhum representante desta classe (figura 13).
Com o aumento da classe de epsilonproteobacteria, as alfaproteobacteria,
que estavam presentes em 91%, caiu significativamente para 8%, mostrando um
desequilíbrio da microbiota simbionte.
Figura 12. Filo da esponja Cliona varians e Cliona varians –SULFATO
Figura 13. Distribuição das Proteobacterias dos clones de 16S rDNA obtidos da esponja Cliona varians e Cliona varians- Sulfato.
29
Shewanella CP000507 n= 1
Shewanella FJ589035 n =1
Shewanella AF005250 n= 1
Halomonas AJ306891 n =1
Cobetia AJ551115 n =1
Pseudomonas Y11150 n =1
Bermanella AY136131 n= 1
Granulosicoccus FJ535355 n =1
Sedimenticola X84979 n =3
Sedimenticola AY590681 n=13
Methylobacter AF152597 n= 3
Methylobacter AB453957 n= 21
Thiocapsa DQ498828 n= 6
Alkalilimnicola CP000453 n =2
Ectothiorhodospira X93482 n= 1
Ectothiorhodospira AM902494 n= 3
Ectothiorhodospira EU252492 n =1
Thioalkalivibrio CP001339 n= 8
Thioalkalivibrio AF126545 n= 3
Thioalkalivibrio AY360060 n =1
Acidithiobacillus AF329205 n= 2
Methylocaldum EU275144 n= 1
Methylocaldum EU275146 n =1
Sinorhizobium AF364837 n= 1
Sinorhizobium AF364836 n =1
Roseobacter CP000362 n =1
Loktanella FJ195992 n= 2
Roseovarius AB302377 n=1
Thalassobacter FN377714 n =2
Silicibacter AF098491 n= 3
Paracoccus AB006899 n= 1
Paracoccus AB025188 n= 1
Paracoccus AJ012068 n= 1
Paracoccus CP000489 n= 1
Paracoccus AM900779 n= 2
Paracoccus AB185958 n=3
Collinsella AJ245919 n= 1
Brachybacterium EU686684 n= 1
100
99
100
100
100
95
94
60
99
72
99
100
100
100
100
97 100
100
99
100
100
99
86
49
96
81
81
60
49
82
99
0.02
Figura14. Árvore filogenética gerada pelo método de Neighbor-joining a partir das sequências de Proteobacteria obtidas da esponja Amphimedon viridins. Foi feita utilizando sequência de 16S rDNA > 1.000 pb e 1.000 repetições recuperadas do GenBank que apresentaram maior similaridade com as sequências identificadas neste trabalho.
30
Sinorhizobium AF364838 n 3
Sinorhizobium AF364836 n= 2
Sinorhizobium AF364837 n= 3
Rhizobium AY904729 n =1
no classified AB246807 n= 3
Ochrobactrum DQ133574 n =2
Ochrobactrum DQ305288 n =1
Martelella EU440957 n= 2
Martelella EU440955 n= 2
unclas Rhodobacteraceae GU12565 n =2
Labrenzia AY345422 n =22
Labrenzia AY307927 n =2
Labrenzia AY584527 n= 16
Labrenzia AJ889009 n= 1
Kaistia AY039817 n= 2
Sphingopyxis AJ620194 n= 1
Methylobacterium GU294320 n= 1
Methylobacterium GU294329 n =1
Nitrobacter L35506 n= 1
no classified AB231940 n =1
unclas Methylocystaceae AB23194 n =1
Caulobacter GQ483460 n =7
Azospirillum AY118222 n =1
Azospirillum DQ288689 n= 1
Azospirillum AY118225 n =2
Azospirillum AY958234 n =1
Mesonia EU440974 n =1
Bdellovibrio AY294216 n= 1
no classified AF211146 n= 1
no classified AY946266 n =1
Psychrobacter GQ327988 n =1
Photobacterium AJ842346 n =1
Pectobacterium AF373203 n =1
Serratia AM157437 n= 1
Slackia AF101240 n= 1
unclas Acetobacteraceae AP01112 n=3
67 100
100
100
100
80 100
100 100
99
99
99
99
97
95
84
85
5
69
72
78
47
64
96
99
Figura 15. Árvore filogenética gerada pelo método de Neighbor-joining a partir das sequências de Proteobacteria obtidas da esponja Cliona varians. Foi feita utilizando sequência de 16S rDNA > 1.000 pb e 1.000 repetições recuperadas do GenBank que apresentaram maior similaridade com as sequências identificadas neste trabalho.
31
no classified AM157648 n=1
no classified GU136582 n= 2
Parabacteroides EU136681n=1
Anaerophaga AJ418048 n=1
no classified AJ431254 n=1
Zunongwangia DQ993340 n=1
Polaribacter DQ481463 n=1
no classified AB298736 n=1
Dyadobacter GQ131577 1
Mycoplasma CP001047 n = 4
Fusibacter AF050099 n=1
Pediococcus AY956789 n=1
no classified EU886968 1
Methylobacterium GU294320 n=2
Methylobacterium GU294329 n= 1
Labrenzia AY584527 n=1
Labrenzia AY345422 n=1
Sinorhizobium AF364837 n=1
Sinorhizobium AF364838 n= 2
Desulfovibrio AB353727 n= 2
Desulfomicrobium CP001629 n=1
Marinobacterium AB021367 n=1
Marinobacterium FJ716699 n=3
Ralstonia AY479983 n1
unclassified Xanthomonadaceae AF442739 n=1
unclassified Xanthomonadaceae AY247064 n=1
Arcobacter AB496655 n=1
Arcobacter GU362098 n=11
Arcobacter AJ271654 n=2
Arcobacter AJ271653 n=1
Arcobacter AJ271655 n= 1
Salinicola DQ270716 n=1
unclassified Acetobacteraceae AP011121 2
100 64
100
100
100
100
100
99 77
80
98
100
100
100
100
92
95
81 75
86
70
50
100
94
100
97
Clostridia
Betaproteobacteria
Bacilli
Favobacteria
Mollicutes
Epsilonproteobacteria
Alplaproteobacteria
Deltaproteobacteria
Bacteroidia
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Figura 16. Árvore filogenética geradas pelo método de Neighbor-joining a partir das sequências dos filos obtidas da esponja Cliona varians - SULFATO. Foi feita utilizando sequência de 16S rDNA > 1.000 pb e 1.000 repetições recuperadas do GenBank que apresentaram maior similaridade com as sequências identificadas neste trabalho.
32
5. CONCLUSÕES
1. Os protocolos testados foram eficientes pra extração de DNA de bactérias
associadas às esponjas Amphimedon viridans, Cliona varians
2. Com a amplificação de primers universais 16S – rDNA foi possível montar
biblioteca metagenômica de bactérias associadas às esponjas Amphimedon
viridans, Cliona varians e Cliona varians – SULFATO.
3. O filo Proteobacteria foi predominante na esponja Amphimedon viridans e o
filo gammaproteobactéria na esponja Cliona varians
4. Uma grande diversidade pode ser sugerida em relação à quantidade de
gêneros encontrados na esponja Amphimedon viridans e Cliona varians
5. Estudos futuros possibilitarão identificar genes e produtos com aplicações
biotecnológicas das bactérias associadas às esponjas Amphimedon viridins e
Cliona varians.
33
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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