UNIVERSIDAD AUTóNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

/ DIVISIóN C. B. S

A'' INFORME FINAL DE ACTIVIDADES DEL SERVICIO SOCIAL.

/-, JACQUELINE CAMACHO PANTOJA

c _ _ - . . - - - . -,,- " 7 hoviembre 21 de 1990. -

R E S U M E N .

El contenido de este trabajo describe las actividades del Servicio Social realizado en el Laboratorio de Microbiología del Agua para Consumo Humano, incluyendo las actividades adicionales, que son las de manejo de información bibliográfica. Por estas razones inicio con aspectos importantes de las bacterias gue se manejaron en el laboratorio, como son definiciones de cada una de ellas, las características epidemiológicas, se consideró sólo la parte que comprende a infecciones por vía oral (consumo de agua contaminada) .

En cuanto a la parte técnica que fue lo que realicé durante el tiempo de prestación de Servicio Social, describo las técnicas aplicadas para el análisis de muestras de agua para beber, indicando en fundamento de cada una de ellas, especificando l o s medios de cultivo que se empleáron, la forma de actuación de estos, la preparación y la fórmula.

En base a las actividades anteriormente mencionadas me permito concluir que se cumplió en forma total con los objetivos inicialmente planteados. Se adquirió el conocimiento necesario en la aplicación de las técnicas empleadas en el Laboratorio de Microbiología.

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O B J E T I V O S :

- Preparación de material, medios de cultivo y reactivos.

- Determinación de bacterias indicadoras de calidad del agua.

- Determinación de bacterias patógenas y otras enterobacterias.

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I N T R O D U C C I ó N . Las aguas naturales poseen una población bacteriana autóctona que incluye una amplícima variedad de familias grupos y géneros. En muchas ocaciones esta flora nativa se ve aumentada con la adición de nuevos grupos que provienen del suelo, del aire y de las excretas de humanos y animales de sangre caliente; en estas excretas la variedad de bacterias es también muy amplia, y puede dividirse en dos grandes grupos: las no patógenas (flora intestinal normal) y las patógenas (flora intestinal que produce estados patológicos) (9) .

Dentro de la flora intestinal normal, la familia Enterobacteriaceae es la más numerosa, ya que incluye 15 géneros, 4 de ellos patógenos; le siguen los grupos bacteroides y bifidobacterium (que le imparten a las heces su tipico olor); las formas esféricas representadas por el grupo de los enterococcos; los lactobacilos y algunas especies de Clostridium . Entre la flora patógena se incluye los cuatro géneros de la familia Enterobacteriaceae: Salmonella, Shigella, Klebsiella algunas especies y Yersinia; la bacteria curvada Vibrio cholerae y en muy raras ocaciones micobacterias y corinebacterias (9).

Cuando se presentan las enfermedades gastrointestinales bacterianas (fiebre tifoidea, disenteria, gastroenteritis, cólera) los agentes etiológicos son expulsados en las heces en grandes cantidades. Las heces usualmente se mezclan con las aguas residuales domésticas que son descargadas en cuerpos de agua (lagos, presas, ríos ) , estos ploblemas de salud se presentan ya que estas aguas sólo reciben tratamiento primario (por insolación generalmente) que aunque resulte esta agua clara (libre de materia orgánica) no significa que ésta haya sido potabilizada, y que posteriormente sean utilizados como fuente de abastecimiento. Si la defecación es al aire libre las heces pueden ser arrastradas por la lluvia hasta algún cauce o penetrar por infiltración a las aguas subterráneas que alimenten pozos de abastecimiento. En cualquier caso, el hecho importante en que las enfermedades gastrointestinales pueden diseminarse através de las aguas de abastecimiento público, sobre todo si no se les da un tratamiento antes de llegar al consumidor (9).

Esto nos da idea de la importancia que tiene la detección e identificación de las bacterias patógenas que pueden estar presentes en el agua para consumo humano. Sin embargo, a pesar de todos los adelantos en materia de técnicas de análisis y medios de cultivo, aún no se ha logrado simplificar la metodología para la recuperación, aislamiento e identificación de las bacterias patógenas, básicamente porque requieren para su desarrollo medios artificiales bastante complejos, y para su identificación deben

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aplicarse pruebas bioquímicas que requieren de mucho tiempo para obtener resultados ( 9 y 4 ) , además de la dificultad que ha significado, lograr seleccionar y estandarizar bacterias o grupo de bacterias adecuados para utilizarlos como indicadores de la presencia de las patógenas que se pudieran encontrar en el agua para consumo humano, es decir, bacterias indicadoras de cantaminación fecal. Por estas rezones se han hecho estudios para detarminar las características ideales de un indicador bacteriológico de calidad de agua y así poder realizar estudios a los diferentes grupos de bacterias de origen intestinal ( 9 )

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A N T E C E D E N T E S . Los grupos que tradicionalmente se consideran como indicadores bacteriológicos son los siguientes: COLIFORMES, que incluyen a tres géneros de la familia Enterobacteriaceaey el grupo de los ESTEROCOCOS formado por cinco especies del género Streptococcus (9).

Características de un indicador bacteriano de calidad de agua. Para que una bacteria o grupo de bacterias pueda considerarse como indicador, debe reunir ciertas características: - Debe estar presente siempre que estén los patógenos - Su densidad debe estar asociada con la contaminación fecal - Debe sobrevivir en el agua más tiempo que los patógenos, pero su desaparición debe ser inmediatamente posterior a la de aquellos

- No debe multiplicarse en el agua - Debe estar ausente en aguas bacteriológicamente potables - No debe ser patógeno para el hombre ni animales domésticos - Las técnicas para su análisis deben ser sencillas, rápidas aplicables en cualquier tipo de aguas, y no deben presentar interferencias por otras bacterias ( 9 ) .

GRUPOS INDICADORES.

COLIFORMES. Dentro de este grupo quedaron comprendidos los géneros Escherichia, Klebsiella y Enterobacter, que se diferenciaban del resto de las enterobacterias en fermentar la lactosa rápidamente a 35OC, y que se suponía que eran habitantes exclusivos del tracto intestinal. Sin embargo, por investigaciones posteriores, se encontró que algunas especies de otros géneros también eran saprófitos de vida libre, por lo que fueron reubicados y reclasificados, de manara que en la actualidad el género Escherichia tiene una sola especie E. coli, se distinguen de Klebsiella y Enterobacter en sus propiedades de fermentar la lactosa también a 44.5'C, y en tener como habitat Único el tracto intestinal. De esta manera el grupo de los coliformes se divide en dos, los coliformes totales y los coliformes fecales (9).

Coliformes Totales. Bacilos cortos, Gramnegativos, no esporulados, que fermenta la lactosa con producción de acidez y gas, en 24-48 hrs., a 35OC (Escherichia, Klebsiella y Enterobacter) ( 9 ) .

Coliformes Fecales. Bacilos cortos, Gramnegativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de acidez y gas, en 24-48 hrs., a 35OC y a 44.5OC (Escherichia y algunas especies de Klebsiella) ( 9 ) .

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Ventajas y desventajas de l o s coliformes como indicadores. Ventajas. - Su presencia es indicio de la posible presencia

de bacterias patógenas. - Su densidad es medida proporcional aproximada de la contaminación fecal. - Se eliminan en las heces en mucho mayor número que los patógenos. - Persisten más tiempo en el agua que los patógenos y desaparecen inmediatamente después que ellos. - En general no son patógenos para el hombre y pueden determinarse cuantitativamente por procedimientos sencillos y en relativamente corto tiempo ( 9 ) .

Desventajas. - Su ausencia no necesariamente evidencia potabilidad bacteriológica, puesto que hay algunos patógenos (Clustridium y Pseudomonas) que pueden estar presentes cuando no hay coliformes.

- Algunas capas se reproducen en el agua contaminada. - Algunas bacterias pueden interferir con las pruebas - Algunas cepas de E. coli y de Klebsiella son

(Pseudomona) . patógenas para el hombre ( 9 ) .

Epidemiología.

E. coli es la especie predominante en el intestino grueso. Las enfermedades causadas más frecuentemente por E. coli son las infecciones de vías urinarias. Los organismos pasan posiblemente del tubo digestivo a las vías urinarias y los riñones pos vía hematógena, linfática y por vía ascendente. Esta última es la seguida más frecuentemente, produciéndose la migración de los gérmenes desde la uretra através de la vejiga hacia los uréteres y riñones. Las vías urinarias normales se hallan relativamente libres de bacterias, pero la baciluria asintomática es frecuente de un modo especial entre las mujeres. cuando el ngmero de bacterias contadas en la orina es superior a 100 000/cm , existe habitualmente infección urinaria. Esta aparece más frecuentemente en niños ( en la primera infancia ) , en mujeres embarazadas y en pacientes con lesiones obstructivas, y enfermedades neurológicas que afectan a las vías urinarias. Actúan como factores desencadenantes la caracterización y otras formas de instrumentación ureteral ( 3 y 4 ) .

Ciertas cepas de E. coli de distintos tipos antigénicos causan brotes de gastroenteritis aguda y, en ocasiones, de meningitis. Las cepas que producen diarrea infantil son muy resistentes ( 3 ) .

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Como E. coli es un habitante natural de las vías digestivas humanas, su presencia en el agua de consumo indica habitualmente contaminación fecal.

De entre los gérmenes del grupo Klebsiela, el patógeno más importante par a el hombre es Klesibella pneumoniae (bacilo de Fredlander) .

K. pneumoniae se encuentra en la nariz, boca y tubo digestivo de individuos sanos, y frecuentemente se halla como invasor secundario en los pulmones de pacientes con bronquiectasias y otras enfermedades pulmonares crónicas ( 3 ) .

ESTREPTOCOCOS. Las diferentes variedades de estreptococos se distinguen por sus caracteres morfológicos, de cultivo y bioquímicos y por reacciones serológicas ( 4 ) .

Lancefield, clasificó los estreptococos en grupos serológicos y en tipos dentro de algunos de los grupos, definiendo los grupos A a O , según su propia técnica que se funda en la presencia de un hidrato de carbono, específico de grupo en el soma de la célula ( 3 Y 4 ) -

El actual sistema de clasificación de los estreptococos se basa en criterios morfológicos e inmunológicos. Según su acción hemolíticas en las placas de agar-sangre, todos los estreptococos se acostumbra dividir en tres grandes categorias, designadas como: alfa (a) , beta (B) y gamma ( x ) ( 3 )

Los etreptococos x no producen hemólisis en la suprficie ni en la profundidad del agar. streptococcus faecalis es una especie típicamente no hemolítica. - Ciertas cepas de S. faecalis clasificadas como no hemolíticas

( x ) después de 24 hrs. de incubación, pueden mostrar hemólisis ar si se incuban durante 24 a 48 horas más.

- Los estreptococos anaerobios son generalmente no hemolíticos.

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exclusivos del tracto intestinal, además de tener propiedades bioquímicas que las diferencian de las demás especies de este género. Por convención se les denominó Estreptococos Fecales (9).

Son Cocos, Grampositivos, que se agregan en cadenas cortas o pares, que crecen en presencia de 7.5% de NaC1, O. 05% de NaN3 y 40% de sales biliaes, a 35OC, pero que resisten a la temperatura de 45OC, de forma esferoidal de 0.5 a 1 micras de diámetro, la mayoría anaerobios facultativos, aunque algunas cepas son anaerobias (3, 9 y 4).

Ventajas y desventajas de l o s estreptococos como indicadores. Ventajas. - Su presencia indica contaminación por desechos fecales - Indica una contaminación reciente, porque sobreviven

menos tiempo en el agua que los coliformes - Sobreviven más tiempo en aguas con elevadas concentraciones de electrolitos, por lo que se puede aplicar como indices en aguas saladas

- Desarrollan resistencia a la cloración, por lo qoe pueden utilizarse como indices de aguas doradas.

- Su densidad en relación con la de coliformes fecales, es indicio del origen humano o animal de la contaminación fecal :

CF/EF = > 4 origen humano CF/EF = < O. 7 origen animal

Desventajas: - Se encuentran en menor proporción que los coliformes

- Su ausencia no necesariamente evidencia potabilidad bacteriológica, puesto que hay algunos patógenos que pueden estar presentes cuando no hay estreptococos (9) .

Epidemiología.

La frecuencia de las infecciones estreptocócicas varían ampliamente en las distintas áreas geográficas, y parece estar relacionada con el clima. Las enfermedades estreptocócicas abundan en los lugares fríos y relativamente secos, y aparecen más amenudo en invierno y primavera (3) .

Los organismos que pertenecen a este grupo no hemolítico son generalmente de baja patogenicidad para el hombre, y de modo parecido a l o s estreptococos hemolíticos a , porque son agentes causales de endocarditis bacteriana subaguda. S. faecalis, a menudodenominado enterococo a causa de la frecuencia con que se

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encuentra en las vías digestivas del hombre, es un microorganismo extraordinariamente resistente , capaz de crecer en condiciones letales para otras especies bacterianas. Además, muchas cepas encontradas en la clínica son muy resistentes a los medicamentos antimicrobianos, haciendo especialmente difícil el tratamiento de endocarditis por enterococos ( 3 ) .

Todas las variedades antes mencionadas son anaerobios facultativos. También existen estreptococos anaerobios estrictos que pueden causar enfermedades en el hombre. Son habitualmente no hemolíticos y más pequeños que otros estreptococos ( 3 ) .

Hasta aquí se han descrito l o s grupos indicadores estándares de la calidad bacteriológica de agua que se usan en pruebas de rutina para el análisis de ésta. Aunque ya se cuenta con l o s antes mencionados, su utilización presenta algunas limitaciones, por lo que se sigue investigando para encontrar otros posibles indicadores que pudieran resultar de mayor aplicación y utilidad. Por estas razones se esta estudiando la posibilidad de incluir otros indicadores patógenos de mayor presición, denominados indicadores no estandarizados. La determinación de bacterias indicadoras de contaminación fecal como son l o s coliformes y estreptococos, aunque es de gran importancia, no siempre refleja fielmente la calidad microbiológica del agua. Así, bajo ciertas condiciones, es posible el aislamiento de microorganismos patógenos del agua, aún cuando los números de bacterias indicadoras son bajos, o incluso en ausencia de éstas. Los motivos y circunstacias que determinan esta situación no son claras pero no se debe asumir que las pruebas de bacterias indicadoras no son confiables o que incluso deben ser reemplazadas por análisis rutinarios de microorganismos patógenos, ya que estas pruebas han demostrado su gran importancia a través de mucho tiempo (2).

SALMONELLAE. El género Salmonella comprende una gran variedad de especies patógenas para el hombre o animales y habitualmente para para ambos, presentan una compleja estructura antigénica ( 3 y 7).

Son cortos, regordetes, bastoncillos Gramm-positivos, de 0 . 4 - 0 . 6 micras de ancho y todas las especies con excepción de S, pullorum y S. gallinarum, activamente móviles. Son no esporógenos y en pocas excepciones no tienen cápsula. No producen ureasa, no utilizan al malonato de sodio, la lisina, arginina y ornitina son descarboxilados. La sacarosa, salicina, raffinose y lactosa no son fermentados (7 y 4 ) .

El tracto intestinal del hombre y animales son el habitat natural

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de varias especies de salmonella. Salmonellae es frecuentemente escontrada en aguas de albañal, ríos, lagos y aguas de mar, esto es dudoso si salmonella puede vivir en ambientes no naturales (7).

Ventajas y desventajas de Salmonella como indicador del agua. Ventajas: - La confirmación de su presencia, nos la información

más completa acerca del tipo y grado de contaminación del agua.

- Su tiempo de persistencia con respecto a otras enterobacterias en aguas para consumo humano, residuales, tierras irrigadascon aguas residuales y en los vegetales así producidos, dependiendo de los factores ecológicos de la zona.

- Su relación directa con las fuentes de contaminación de áreas específicas. - Con su detección se puede llegar a evitar epidemias que ; en años recientes, han sido atribuidas Salmonella.

- La dependencia de ciertos factores ecológicos, como la temperatura, no permite que su densidad tenga una relación directa con la del grupo coliforme.

- En la actualidad método utilizado para la cuantificación de Salmonella se esta utilizando en algunoslaboratorios a pesar las limitaciones en los métodos usados.

- La recuperación de estos microorganismos patógenos en el agua, proporcionan un estímulo para desarrollar investigaciones y métodos microbiológicos de mayor sensibilidad y rapidez como el propuesto por P.M Phirke.

Desventajas: - Los procedimientos para su diferenciación son generalmente más complejos que los requeridos para la determinación de Coliformes. - Generalmente se encuentran en poca cantidad, por lo que se requiere de grandes volúmenes de muestra para su aislamiento ( 8 ) .

Epidemiología.

En el hombre se dan tres formas de salmonelosis clínicamente diferentes: fiebres entéricas, septicemias y gastr0entiriti.S aguda.

El prototipo de la fiebre entérica es la producida por s. tyfhosa. La fiebre tifoidea, contraída por la ingestión de alimentos 0 aguas contaminadas empieza, en general, de modo insidioso, tras un

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período de incubación de 7 a 14 días, con malestar, anorexia y cefalea, seguido de fiebre. Esta última aumenta durante la primera semana, la postración puede ser importante, y aunque en general no hay diarrea, son frecuentes la distensión y el dolor abdominal sordo. Durante l o s útimos períodos de la enfermedad pueden producirse hemorragias intestinales graves o perforación del intestino y causar peritonitis ( 3 y 4 ) .

Los organismos ingeridos se multiplican en las vías digestivas, y algunos de ellos penetran en los linfáticos intestinales y viajan a través del conducto torácico hacia la corriente sanguínea, produciendo septicamia Al mismo tiempo, los que permanecen en el intestino siguen multiplicándose y eliminándose por las heces. La bilis es un buen medio de cultivo para S. typhosa, en las vías biliares existe en general un crecimiento abundante, originándo un flujo continuo de organismos hacia el intestino delgado. Su capacidad de persistir en las vías biliares puede determinar la aparición del estado de portador en el que se continúan eliminando bacilos por las heces ( 3 , 4 y 7).

Las fiebres entéricas producidas por otras salrnonelas distintas de S. typhosa (fiebres paratifoideas) son, en general, más benignas y tienen un período de incubación más corto (3).

En la gastroentiritis, la enfermedad quede confinada fundamentalmente al tubo digestivo. Son consecuencia del consumo de alimentos y agua contaminadas ( 3 ) .

Tras una salmonelosis, l o s organismos pueden permanecer en el huésped y originar un estado de portador más o menos permanente. En la fiebre tifoidea, aproxomadamente el 3 % de los enfermos se vuelven portadores 6y sigyen eliminando indefinidamente S typhosa en cantidades de 10 a 10 gérmenes por gramo de heces ( 3 ) .

Medios de control. La transmisión de la fiebre tifoidea de hombre a hombre son: 1) La organización de métodos adecuados de higiene personal. 2) La pasteurización de la leche. 3 ) El mantenimiento de las aguas de consumo no contaminadas. 4) La rigurosa exclusión de portadores crónicos como manipuladores de alimentos y agua ( 3 ) .

La erradicación de Salmonella en el hombre su control en el hombre no es muy factible

es difícil debido a que , ya que la eliminación

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del reservorio animal es imposible. El porcentaje de infección en los animales domésticos y salvajes alcanza desde el 1 a más del 40% ( 3 ) .

M E T O D O L O G Í A .

TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA. La técnica de filtro de membrana se aplica prioritariamente para el análisis de agua para consumo humano. En el análisis de aguas que sólo hayan tenido tratamiento primario o para aguas residuales, de albañal, etc., que presentan altos indices de turbidez como sucede en este tipo de agua, causada por la alta incidencia de materia orgánica e inorgánica, debido a ello la técnica no es recomendable El volúmen establecido o recomendable para el análisis de agua para consumo humano es de 100 ml. el cual puede ser distribuido en 4 ó 5 partes (membranas).

Las técnicas que a continuación se describen fuerón las que se realizaron en el Laboratorio de Microbiología del Agua para Comsumo Humanodurante el tiempo de servicio social, técnicas que se aplicaron a muestras de agua de la zona de estudio Pujal-Coy ( Cd. Mante, Tamaulipasy Tamuín S.L.P.).

Material. - Cajas de Petri de 60 x 15 mm. o de 50 x 12 mm., estas peuden ser de vidrio de borosilicato o de plástico que cierren herméticamente, se esterilizaron por un espacio de 2 hrs. en la campana de flujo laminar - Membranas de 0 . 4 5 micras

- Equipo de Millipore, este se esterilizó por calor en seco durante 2 hrs.

- Riel para equipo de Millipore - Bomba de vacío - Matraz Kitazato de 2 Its. - Cojinetes absorventes de 4 8 mm. de diámetro - Probetas de 25 ml. - Pinzas de punta redondeada

Medios de cultivo. Los medios de cultivo utilizados en esta técnica fueron l o s siguientes:

- Caldo Sulfito-Bismuto - Agar KF Streptoccócico - Caldo m-Endo - Caldo mFc

para Salmonellla typhi para estrptoccocos para coliformes totales para coloformes fecales

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Método.

I. Coliformes Totales 1. Montar el equipo de Millipore dentro de la campana de flujo laminar 2. Conectar el equipo Millipore a la bomba de vacío 3. Colocar sobre en porta filtro la membrana, poner sobre ésta el recipiente asegurándolos con los forceps. 4. Vaciar la muestra de 25 ml. filtrándola mediante vacío parcial 5. Enjuagar la membrana y embudo con 20-30 m1 de agua de dilución fosfatada estéril y filtrar 6. Preparar caja Petri depositando un coj inete por cada caja agregando 2.5 m1 de caldo mENDO 7 .Tomar la membrana del porta filtro con pinzas estériles y se deposita sobre el cojinete de la caja de Petri evitando dejar burbujas de aire 8. Incubarlas por 24 hrs a 35 +- 2OC. Las colonias típicas coliformes totales son de color rosa con centro verde metálico.

11. Coliformes Fecales Proseguir de la misma forma que en el caso de los coliformes totales del paso 1-7, sólo que en el paso 6 el medio de cultivo empleado es mFc 8 . Incubar l a s cajas en baño maría a 45OC, por un tiempo de 24 hrs. Las colonias típicas coliformes fecales son de color azul.

111. Estreptococos Fecales Repetir del paso 1-5 de la misma manera que en los dos casos anteriores 6 . Vertir en cada caja de Petri 5 m1 de agar KF Estreptocócicco y dejar que se solidifique 7. Tomar la membrana con pinzas estériles y depositarla sobre el agar, sin dejar burbujas de aire 8 . Incubarlas a 4 5 +- 2OC por 24 hrs. Las colonias típicas de estreptococos son de color rosa obscuro a rojas.

I V . Salmonella A ) Método Repetir de paso 1-7 como en el cas de coliformes totales, sólo que el medio de cultivo empleado para salmonella es caldo m-Sulfito Bismuto 8. Incubar a 35OC por 2 4 hrs. Las colonias típicas de salmonella son de color café con centro negro.

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B) Resultados. En los tres casos anteriores la interpretación es la misma. Las colonias se observan y cuentan en contador Quebec o contador de colonias,aplicando la siguiente fórmula:

Colonias/100 ml.= colonias contadas x 100 ml. de la muestra filtrada

La coloración de las colonias de los distintos organismos se puede diferenciar perfectamente lo que evita cualquier confusión de identificación. Además de que el crecimiento de las colonias de los distintos organismos va ha depender de hayamos realizado bien la técnica para que tengamos un buen crecimiento de las colonias y de esta manera tengamos facilidad en el conteo de las mismas.

El aislamiento en medios de cultivo selectivo y el correr las pruebas bioquímicas son útiles para confirmar los resultados ya obtenidos con la técnica de filtro de membrana. ( 8 ) .

C ) Aislamiento de las colonias típicas. Elegir las colonias típicas de Salmonella (las colonias que se escojan para el aislamiento deberán ser las más pequeñas y que no esten muy junto a otras colonias), serán resembradas en tubos de ensaye que contengan agar T S I , para la cual se emplea una asa bacteriológica, se siembra por estriado en el pico de la flauta. Incubándose durante 2 4 hrs. a una temperatura de 35OC para posteriormente realizar las pruebas bioquímicas ( 8 ) .

En esta etapa puede reportarse en número de organismos por volúmen de muestrasiempre y cuando las colonias contadas sean típicas. En caso de que se tenga duda acerca de las mismas se realizó la identificación mediante pruebas bioquímicas.

PRUEBAS BIOQUIMÍCAS Son de gran utilidad para la identificación y diferenciación de distintos géneros y especies de enterobacteriáceas que se encuentran en el agua, en base a la presencia o ausencia de las mismas pudiendo de esta manera estimar la calidad de agua de las muestras que se estan analizando.

Primera serie de prueba bioquímica Caldo urea. Los cultivos urea positivos deben descartarse inmediatamente, y para los cultivos urea negativos deben hacerse las segundas series bioquímicas. En el caso de la urea se mantiene en color inicial del medio.

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Segunda serie de prueba bioquímica. Se realizaron las siguientes pruebas.

Prueba del Citrato. Fundamento. Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo, provocando alcalinidad.

Medios empleados: Medio de Citrato de Simmons.

Inoculación: Inóculo liviano, únicamente en el pico de flauta.

Incubación: 35OC durante 24 a 48 hrs.

Interpretación de resultados. 1) Prueba positiva: crecimiento con un color intenso en el pico de la flauta. 2 ) Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (verde) .

Prueba de las Descarboxilasas (lisina-ornitina) Fundamento. Medir la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. Las pruebas de la descarboxilasa se emplean fundamentalmente para determinar grupos bacerianos entre las enterobacteriaceae.

Medios empleados: Agar LIA.

Inoculación: Estriado sobre el pico de flauta y picadura central de forma vertical.

Incubación: 35'C, durante no menos de 24 hrs.

Interpretación de resultados. Cualquier aminoácido da los mismos resultados en color: ejemplo, la lisina-descarbixilasa. 1) Prueba positiva: púpura turbio (producido por la cadaverina) 2) Prueba negativa: color amarillo claro y brillante (solamente fermentación de glucosa).

Prueba de Acido Sulfhídrico Fundamento. Determinar si se ha liberado ácido sulfhídrico por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.

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Medios empleados: Medio SIM.

Inoculación: Por picadura con asa bacteriológica a lo largo de la columna del medio.

Incubación: 35 OC, durante 18 a 24 hrs.

Interpretación de resultados. 1) Prueba positiva: se observa ennegrecimiento del medio. Ya sea siguiendo la línea de inoculación o en toda la capa superficial. 2) Prueba negativa: no se observa ennegrecimiento.

Prueba del Indol. Fundamento. Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la molécula triptofano.

Reactivos empleados: Reacción del Indol de Ehrlich Reacción del Indol de Kovac's Agar SIM

Método de utilización: Reactivo de Ehrlich y Reactivo de Kovac's. a) Agregar 5 gotas de losreactivos directamente a un tubo incubado 24 a 48 hrs; agitar suavemente el tubo.

Interpretación para ambos reactivos reactivos. 1) Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica 2) Prueba negativa: no se produce color en la capa alcohólica; toma el color del rectivo del color de Kovacs o de Ehrlich (amarillo) 3 ) Variable (+-): un color anaranjado en la superficie del medio debido a desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser un precursor de la formación del indol.

Prueba de la Motilidad Fundamento. Determinar si un organismo en móvil o inmóvil.

Medios empleados: Agar SIM

Inoculación: Por picadura con asa bacteriológica de forma vertical

Incubación: 35OC de 18 a 24 hrs.

Interpretación de resultados: A) Prueba positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunde en el medio provocando turbiedad. B) Prueba negativa: sin motilidad, el medio se mantiene incoloro y claro.

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Prueba con Agar Hierro Triple Azúcar

Fundamento. Determinar la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico.

La producción de ácido sulfhídrico y/o las formas de fermentación son generalmente características de los grupos, géneros o especies bacterianos específicos, sobre todo entre las Enterobacteriaceae. 1) Acido/ácido, con/sin gas 2 ) Acido/ácido, SH2

3 ) Alcalino/ácido, con/sin gas 4) Alcalino/ácido, gas, SH2

5) Alcalino/alcalino o alcalino sin cambio

Medio empleado: Agar TSI.

Inoculación: Por estriado en la superficie del pico de la flauta y por picadura a lo largo del agar con inóculo denso.

Incubación: 35OC , durante 18 a 2 4 hrs.

Interpretación de resultados. A) Utilización del hidrato de carbono.

1) Fermentación de la glucosa solamente. a) En pico de flauta. Reacción alcalina. Color rojo. b) Capa profunda. Reacción ácida. Color amarillo.

a) Pico de flauta. Reacción ácida. Color amarillo b) Capa profunda. Reacción ácida. Color amarillo.

a) Pico de flauta . Reacción alcalina. Color rojo. b) Capa profunda.

2 ) Fermentación de glucosa y lactosa.

3 ) No fermentación de glucosa ni de lactosa (no entéricos).

1. Organismo aeróbico 2. Organismo facultativo

4) No fermenta ni la glucosa ni la lactosa; muy común. a) Pico de flauta.

1. Crecimiento solamente 2 . No hay cambio de color

1. No hay crecimiento 2 . No hay cambio de color

b) Capa profunda.

B) Producción de gas. 1) Aerogénico. a) Produccuón de gases: COZ y Hz.

b) Se manifiesta por lo siguiente: 1. Una sóla burbuja de gas 2. Burbujas en el medio 3 . Desdoblamiento del medio 4 . Desplazamiento completo del medio del fondo del tubo,

dejando una área clara 5. Ligera muesca del medio en el costado del tubo.

2 ) Anaerogénicos: no hay producción de gases

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Producción de ácido sulfhídrico: la presencia de un precipitado negro (sulfur0 ferroso) se manifiesta por: 1) Un color negro distribuido por toda la capa profunda y que

2) Un anillo negro cerca de la parte superior de la capa

3) Un precipitado negro distribuido por la capa profunda, pero

enmascara la acidez

profunda

que no oculta totalmente la acidez.

Prueba del Malonato Fundamento. Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad. Ayuda a la diferenciación entre géneros.

Medio empleado: Caldo Malonato

Inoculación: Inóculo poco denso.

Incubación: 35OC; durante 24 a 48 hrs., observar si se produce crecimiento al término de cada periódo.

Interpretación de resultados: A) Prueba positiva: color azul claro a azul de Prusia intenso a todo el medio. B) Prueba negativa: no se observa cambio de color (verde).

Prueba del Rojo de Metilo Fundamento:Comprobar la capacidad de un organismo para producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Medio de cultivo: Caldo MR-VP , reactivo indicador de pH de rojo de metilo.

Inoculación: Inóculo poco denso.

Incubación: 3OoC, de 3 a 5 días. Agregar el indicador del pH de rojo metilo directamente a una alícuota incubada antes de intentar la interpretación.

Interpretación de resultados: A) Prueba RM positiva: el cultivo es lo suficientemente ácido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un definido color rojo (pH: 4 . 4 ) en la superficie del medio B) Prueba rojo de metilo negativa: color amarillo (pH: 6 ) en la superficie del medio C) Reacción retardada: color anaranjado. Continuar la incubación hasta 4 días y repatir la prueba.

Reacción de Voges-Proskauer

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Fundamento: Determinar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, el acetil metilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa. Ayudar a la diferenciación entre géneros.

Medios utilizados: Caldo MR-VP Reactivos: a-naftol al 5%

hidróxido de potasio al 40%

Inoculación: Inóculo poco denso con asa bacteriológica

Incubación: 35OC de 24 a 48 hrs: puede necesitar una incubación más prolongada hasta de 10 días Antes de intentar la interpretación agregar directamente los reactivos en el orden siguiente: primero 0.6 m1 de una solución de a-naftol al 5% y 0.2 m1 de una solución de KOH al 40%. Posteriormente agitar suavemente el tubo para exponer elmedio al oxígeno atmosf6rico a fin de oxidar la acetoína y obtener una reacción de color.

Interpretación de resultados: A) Reacción VP positiva: color rojo rosado en la, superficie del medio (presencia de acetoína) B) Reacción VP negativa: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color del reactivo). Puede formar un color cobrizo, pero aún así la reacción es negativa (debido a la acción de los reactivos al mezclarse) ( 5 ) .

TÉCNICA DE TUBOS MULTIPLES. Se basa en la propiedad que tienen los coliformes en fermentar la lactosa a ciertas temperaturas y los estreptococos de crecer en medios específicos. Esta prueba conforma un método estandarizado para la determinación de la densidad de bacterias indicadoras de contaminación. Se utilizan series de tubos de medios de cultivo selectivo que son inoculados con dilusiones de una muestra dada de agua. La densidad de bacterias en la muestra de agua, se extrapola, se calcula por medio de fórmulas de probabilidad que estiman el número más probable de bacterias para inducir a combinaciones de resultados (de turbidez o formación de gas). Ya sean positivos o negativos.

Medios de cultivo. - Azida dextrosa para estreptococos (prueba presuntiva) - Caldo EVA para estreptococos (prue. confirmativa) - Caldo lactosado (CL) para coliformes totales (P. P) - Caldo BVB para coliformes totales (P. C) - Caldo EC para coliformes fecales

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Determinación de coliformes totoles. Se utilizan series de tubos con dispositivos de Durham (tubos de fermentación) que incluyen por lo menos tres cantidades diferentes de muestra, que pueden ser 10, 1 y 0.1 ml., o bien 1 ml. de cada una de las diluciones preparadas como se indicará más adelante; por cada cantidad de dilución debe haber series de 3 ó 5 tubos. La prueba realizada en el laboratorio del CIECCA estuvo constituida de dos partes: la prueba presuntiva y la prueba confirmativa.

Prueba presuntiva. Se inocula una serie de tubos de fermentación que contengan caldo lactosado ( C L ) o caldo lauryl-triptosa ( C L T ) , con cantidades apropiadas de la muestra o diluciones (en el laboratorio del CIECCA inoluculó 9 ml. del caldo + 1 ml. de la muestra o de dilución que sumaron en total 10 ml. por tubo) ; mezclar con cuidado e incubar a 35 +- O . 5OC ( 9 ) . Se examinan los tubos a las 2 4 hrs, se agitan suavemente cada tubo y observar pequeñas burbujas de gas y/o desplazamiento del medio dentro del tubo de Durham. Los tubos que presenten formación de gas se consideran positivos: los tubos negativos se reincuban otras 2 4 hrs ( 9 ) .

La formación de gas dentro de 4 8 hrs. constituye una prueba presuntiva positiva y da un indicio de la presencia de coliformes. La ausencia de gas al final de 4 8 hrs. indicará una prueba negativa, es decir, la ausencia de coliformes y por lo tanto el análisis quedará concluído ( 9 ) .

Prueba confirmativa. Los tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran con una asa de siembra (esterilizada por flameado) en tubos de fermentación que contengan caldo lactosa bilis verde brillante (CLBVB) y se incuban a 35.5 C ( 9 ) .

Se examinan l o s tubos a las 2 4 hrs.. Los tubos que presenten formación de gas se consideran positivos; los negativos se reincuban otras 2 4 hrs. ( 9 ) .

La formación de gas dentro de 4 8 hrs. constituye una prueba confirmativa de la presencia de coliformes. La ausencia de gas al final de las 4 8 hrs. indicará la ausencia del grupo coliforme, y por lo tanto el análisis quedará concluido (9).

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La formacióm de gas dentro de 48 hrs. constituye una prueba confirmativa de la presencia de coliformes, quedándo concluido el análisis.

Determinación de coliformes fecales. Dado que los coliformes fecales son una fracción de los totales, su determinación se continúa de la prueba presuntiva para coliformes totales.

Con el asa de siembra transferir inóculos de cada uno de los tubos positivos (24 y 48 hrs. ) de CL, a tubos de fermentación con medio EC , mezclar con cuidado e incubar en baño maría a 4 4 . 5 +- 0 . 2 C. Se axamina cada tubo a las 24 hrs. y considerar como positivos los que presenten formación de gas. Los negativos se desechan. Expresandose los resultados como NMP/lOO ml.

Determinación de estreptococos fecales. En este Caso se utilizan series de tubos sin dispositivo de Durham. La técnica consiste en la prueba presuntiva y confirmativa.

Prueba presuntiva. Transferir directamente la muestra (10, 1 y O . 1 ml. ) ó 1 ml. de las diluciones apropiadas, a tubos de ensaye que contengan caldo Azida dextrosa, mezclar e incubar a 35 +- 0.5 C durante 24-48 hrs.. La presencia de turbiedad en el medio se considera prueba positiva.

Prueba confirmativa. De los tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran de una a tres asadas a tubos que contengan caldo EVA y se incuban a 35+-0.5 C durante 24-48 hrs..Se consideran positivos aquellos tubos que presentan turbiedad y/o un botón o precipitado compacto púrpura en el fondo. Los resultados se reportan como NMP/lOO m1 (2 Y 9 ) .

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~-

A P É N D I C E A

MEDIOS DE CULTIVO. Medios de cultivo utilizados en la Técnica de Filtro de Membrana. - Caldo m-Bismuto-Sulfito Caldo selectivo para aislamiento y diferenciación de Salmonella typhi y otras Salmonellas. Composición (g/litro) Extracto de carne..................5.0 g Peptona de carne...................lO.O g D(+)-Glucosa ....................... 5.0 g di-Sodio hidrogenofosfato .......... 4 . 0 g Hierro (11) sulfato................3.0 g Verde brillante .................... 0.025 g Indicador bismuto sulfito.. ........ 8 .0 g

Preparación: Disolver 63 g/litro de agua destilada calentandolo durante unos 30 min. en baño maría o a calor fluente. No esterilizar en autoclave. pH 7.6 +- 0.1. Forma de actuación. El verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente a l o s gérmenes de acompañamiento. Las colonias de Salmonellas H2S-positivas presentan ennegrecimiento debido al sulfur0 de hierro. La reducción de los iones bismuto a bismuto metálico produce brillo metálico alrededor de las correspondientes colonias.

Agar KF Estreptococcos Para demostración de enterococos en agua. Composición (g/litro) Proteosa-peptona..................lO.O g

Sodio cloruro .....................5.0 g Sodio glicerofosfato..............lO.O g Maltosa.. .........................20.0 g Lactosa ...........................l.O g Sodio azida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 4 g Púrpura de bromo cresol...........0.015 g Agar-agar .........................15.0 g

Estracto de levadura .............. 10.0 g

Forma de actuación. La maltosa y la lactosa se utilizan por la mayoría de l o s enterococos, con producción de ácido, y por lo tanto, favorecen su crecimiento, en tanto que las especies indeseables de gérmenes resultan notablemente reprimida por el sodio-azida. La producción de ácidos se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del indicador púrpura de bromocresol. Los

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enterococos reducen TTC dando un formación rojo y aparecen, por 10 tanto, las colonias rojas.

Caldo m END0 Para demostración y enumareción de bacterias coliformes totales. Composición (g/litro) Triptosa ........................ 10.0 g Peptona de carne................5.0 g Peptona de caseína..............5.0 g f%)4&10 Estracto de levadura............l.5 g Sodio cloruro...................5.0 g di-Potasio hidrogenofosfato ..... 4.375 g Potasio dihidrogenofosfato ...... 1.375 g Sodio desoxicolato .............. 0.1 g Sodio laurilsulfato ............. 0.05 g Fucsina básica .................. 1.05 g Sodio sulfito. .................. 2.1 g

Lactosa. ........................ 12.5 g

Preparación: Disolver 48 g/litro. No esterilizar en autoclave.

Forma de actuación. Una base nutritiva múltiple ofrece suficiente posibilidad de desarrollo a las bacterias coliformes lactosa-positivas, en tanto que los gérmenes de acompañamiento resultan inhibidos en su crecimiento por el laurilsulfato y el desoxicolato. Las colonias lactosa-positivas se presentan de color rojo por la liberación de fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, permitiendo, además, que las colonias de E. coli presenten brillo metálico.

Caldo mFc Agar selectivo para coliformes fecales. Composición (g/litro) Triptosa a biosato .......................lO.O g

Estracto de levadura. ....................3.0 g NaC1 .....................................5.0 g Lactosa ..................................12.5 g Sales biliares ...........................1.5 g Azul de anilina ..........................O.l g Agua destilada ...........................l litro

Proteosa peptona num. 3 o polipeptona .... 5.0 g

El agua debe contener 10 m1 de ácido rosólico al 1% en NaOH 0.2 N. Calentar a ebullición, retirar del calor y enfriar a menos de 45 C. No debe esterilizarse en autoclave. El pH final debe ser 7.4.

Medios utilizados para las Pruebas Bioquímicas Caldo UREA

Medio de cultivo de diferenciación para demostración de

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microorganismos que utilizan urea. Composición (g/litro)

Potasio dihidrogenofosfato............9.1 g di-Sodio hidrogenofosfato.............9.5 g Urea ..................................20.0 g Rojo de fenol .........................O.Ol g

Preparación: Disolver 39 g/litro (calentando a 60° C, como máximo) . Esterilizar por filtración o, tras distribución a razón de 1 ml. por tubo, esterilizar en marmita de vapor durante 5 min.. No esterilizar al autoclave. pH 6 . 8 +- 0.1.

Extracto de levadura .................. 0.1 g

Agar CITRATO Agar de ensayo, totalmente sintético, para identificación de microorganismos, especialmente de enterobacterias, basado en el empleo de citrato como única fuente de carbono. Composición (g/litro) Amonio dihidrogenofosfato .............. 1.0 g di-potasio dihidrogenofosfoto..........l.O g Sodio cloruro .......................... 5.0 g Sodio citrato ..........................2.0 g Magnesio sulfato .......................0.2 g Azul de bromotimol .....................0.08 g Agar-agar.. ............................12.0 g

Preparación: Disover 22 g/litro, esterilizar al autoclave y preparar tubo inclinados, o bien, verter en placas.

Agar TSI Para identificación de Enterobacteriáceae. Composición (g/litro) Peptona de caseína .................... 15.0 g Peptona de carne......................5.0 g Estracto de carne.....................3.0 g

Sodio cloruro .........................5.0 g Lactosa ...............................lO.O g Sacarosa ..............................lO.O g

Amonio y hierro(III)citrato...........O.5 g Sodio tiosulfato ......................0.3 g Rojo de fenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 0 2 4 g Agar-agar .............................12.0 g

Preparación: Disolver 65 g/litro, distribuir en tubos y esterilizar al autoclave. Dejar solidificar en posición inclinada, de forma que, en una columna de unos 3 cm de altura, se forme una superficie oblicua, elíptica, de unos 5 cm de diámetro mayor. pH 7 . 4 +- 0.1 .

Estracto de levadura. ................. 3.0 g

D(+)-Glucosa ..........................l.O g

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Agar L I A

Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina-descarboxilasa (LD) y de la producción de ácido sulfhídrico para la identificación de Enterobacteriáceae, sobre todo de salmonella. Composición (g/litro) Peptona de carne........................5.0 g Estracto de levadura....................3.0 g D(+)-Glucosa ............................ 1.0 g

Sodio tiosulfato ........................ 0.04 g

Púrpura de bromocresol.. ................ 0.02 g Agar-agar. .............................. 12.5 g

L-Lisina monoclorhidrato ................ 10.0 g Amonio y hierro(II1)citrato ............. 0.5 g

Preparación: Disolver 32 g/litro, distribuir en tobos y esterilizar en autoclave. Dejar enfriar en posición inclinada. pH 6 . 7 +- 0.1 .

Caldo Malonato Medio de cultivo de ensayo, para demostración del consumo de malonato y de la desaminación de la fenilalanina en forma combinada. Composición (g/litro) Extracto de levadura....................l.O g Amonio sulfato..........................2.0 g di-Potasio dihidrogenofosfato ........... 0.6 g Sodio cloruro...........................2.0 g Sodio malonato..... ..................... 3.0 g L-Fenilalanina .......................... 1.0 g Azul de bromotimol ...................... 0.025 g

Preparación: Disolver 10 g/litro, distribuir en tubos y esterilizarlos en autoclave (10 min. a 115 C ) . pH 6 . 6 +- 0.1 .

Caldo Glucosa Para cultivo, determinación del número de gérmenes y multiplicación de diversos microorganismos. Composición (g/litro) Peptona de caseina ..................... 10.0 g Sodio cloruro .......................... 5.0 g D(+)-Glucosa ...........................5.0 g

Preparación: Disolver 20 g/litro, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave. pH 7.3 +- 0.1 .

Medio de cultivo SIM

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Medio de cultivo de ensayo, para comprobar la formación de sulfuro, la producción de indol y la motilidad, en el marco del diagnóstico de enterobacteriáceas. Composición (g/litro) Peptona de caseina.....................20.0 g Peptona de carne.......................6.6 g Amonio y hierro(II1)citrato ............ 0.2 g Sodio tiosulfato.......................O.2 g Agar-agar .............................. 3.0 g

Preparación: Disolver 30 g/litro, distribuir en tubos y esterilizar al autoclave.

Caldo MR-VP Medio de cultivo de ensayo para la realización de la prueba del Rojo de Metilo y el ensayo de Voges y Proskauer, para la diferenciación bioquímica dentro del grupo Coli-Aerogenes, sobre todo. Composición (g/litro) Peptona de carne...................7.0 g D(+)-Glucosa ....................... 5.0 g di-Potasio hidrogenofosfato ........ 5.0 g

Preparación de la solución indicadora de Rojo de metilo: Disolver 0.04 g de Rojo de metilo en 60 m1 de etanol absoluto, y ajustarel pH a 5.0 aproximadamente. La solución debera presentar un color anaranjado.

Reactivo de EHRLICH y Reactivo de KOVAC'S. A) Reacción del indol de Ehrlich Ingredientes: p-dimetilaminobenzaldehído ................... 2.0 g Alcohol etílico (absoluto) ................... 190.0 m1 HC1 (concentrado) ............................ 40.0 ml.

B)Reacción del indol de Kovac's Ingredientes: Alcohol amílico o isamílico. ................. 150.0 m1 p-dimetilaminobenzaldehído ................... 10.0 g HCL (concentrado) ............................ 50.0 ml.

Reactivo del pH de Rojo de Metilo Método de Preparación. A) Diosolver 0.1 g de rojo de metilo en 300 m1 de alcohol etílico de 95 B) Agregar 200 m1 de agua destilada a la mezcla de alcohol indicador (5 y 6).

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A P É N D I C E B Medios de cultivo utilizados para la técnica de Tubos Múltiples. Caldo LACTOSADO Medio de cultivo, exento de sustancias inhibidoras, para ensayos previos sobre bacterias, coliformes. composición (g/litro) Peptona de gelatina ................. 5.0 g Estracto de carne...................3.0 g Lactosa.............................5.0 g

Preparación: Disolver 13 g/litro, distribuir en tubos de ensayo provistos de tubos DURHAM, y esterilizar en autoclave. pH 6 . 9 +- 0.1. Forma de actuación. La utilización de lactosa se demuestra por la producción de gas.

Caldo BRILA

Caldo selectivo para la enumeración de coliformes. composición (g/litro) Peptona de carne........................lO.O g Lactosa .................................lO.O g Bilis de buey desecada .................. 20.0 g Verde brillante ........................ 0.0133 g

Preparación: Disolver 40 g/litro, distribuirlo en tubos de ensavo W e contengan campana de Durham, y esterilizar en autoclave. ;H 7.2 +- 0.1. Forma de actuación. La bilis y el verde brillante inhiben notablemente el crecimiento de la flora indeseable de acompañamiento, incluso Clostridios degradadores de la lactosa . a) La fermentación de la lactosa con formación de gas, que es un indicativo de la presencia de E. coli, se demuestra mediante tubos de Durham. Los restantes coliformes crecen también, por supuesto, pero sin producir gas, por regla general, en este medio.

Caldo EC Para demostración selectiva de coliformes y de E . coli. Composición (g/litro) Peptona de caseína .................. 20.0 g Lactosa .............................5.0 g Mezcla de sales biliares ............ 1.5 g Sodio cloruro .......................5.0 g di-Potasio hidrogenofosfato ......... 4 . 0 g Potasio dihidrogenofosfato .......... 1.5 g Preparación: Disolver 37 g/litro, o bien, 74 g/litro, distribuir en tubos provistos de campanas de Durham, y esterilizar en autoclave. pH 6.9 +- 0.1.

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Forma de actuación. En tanto que el contenido en lactosa favorece a las bacterias lactosa-positivas, especialmente coliformes y E. coli, las sales biliares inhiben notablemente el crecimiento de gérmenes Gramm-positivos o de especies microbianas no adaptadas al medio ambiente intestinal. Los gérmenes lactosa-positivos onsumen lactosa con producción de gas.

CALDO AZIDA DEXTROZA Composición (g/litro) Extracto de carne..................4.5 g Triptona o polipeptona ............. 15.0 g Glucosa.................. .......... 7.5 g NaC1...........,,..................7.5 g Azida de sodio ..................... 0.2 g Agua destilada ..................... 1 litro

Caldo EVA

Medio para estreptococos. Composición (g/litro) Triptona ......................... 20.0 g Glucosa..........................5.0 g NaC1.............................5.0 g Fosfato di-básico de potasio ..... 2.7 g Fosfato monobásico de potasio .... 2.7 g Azida de sodio. .................. 0.4 g Violeta de etilo ................. 0.00083 g Agua destilada ................... 1 litro Preparación: Disolver los ingredientes y distribuir volúmenes de 8 a 10 ml. en tubos de ensaye sin dispositivo de DURHAM, tapar y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min.. pH después de la esterilización debe ser 7.0 (1 y 6 ) .

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C O N C L U S I ó N Y D I S C U S I ó N . Al término de las actividades realizadas en el laboratorio conclúyo lo siguiente:

1.

2.

3 .

4 .

5.

De acuerdo con los conocimientos adquiridos tanto teóricos como práctico d e las técnicas aplicadas en el Laboratorio de Microbiología del Agua para Consumo Humano, logrando corroborar los siguientes aspectos mencionados por diferentes autores:

a) La importancia de realizar estudios sobre microbiología del agua para consumo humano, para evitar problemas de salud pública como son la epidémias.

I.

11.

111.

IV . V.

La

En cuanto a las técnicas de indicadores bacteriológicos. La técnica de filtro de membrana es mucho más práctica, comparándola con la técnica de tubos multiples, en cuanto al tiempo y al material utilizado así como de la cantidad de medio de cultivo y reactivos que se requieren (aclarando que la técnica de tubos múltiples ha demostrado su importancia y validez durante mucho tiempo, como para intentar sustituirla por la de filtro de membrana. La prueba de tubos múltiples tiene una ventaja, que se puede aplicar a cualquier tipo de agua, lo que no sucede con la técnica de filtro de membrana, ya que ésta solo es empleada para agua potable, se puede utilizar con excepciones. Los resultados por filtro de membrana son obtenidos en menor tiempo comparados con los obtenidos en la técnica de tubos múltiples. Muestras muy grandes de agua pueden ser analizadas rutinariamente por filtro de membrana, simpre y cuando se lleve a cabo las dilusiones apropiadas de evaluación. Los resultados numéricos por filtro de membrana tienen mayor presición que los de la técnica de tubos múltiples.

importancia de incluir a los indicadores Patóaenos. además de los indicadores estándares para evaluar en-fo&a más precisa la calidad del agua es debido a que con la cuantificación de los mismos en todo tipo de agua (principalmente en agua para consumo humano) nos indica con mayor presición el origen y grado de la contaminación del cuerpo de agua incluso ayuda a evitar riesgos potenciales para la salud pública, por lo que se puede realizaruna mejor evaluación de la calidad del agua. Las pruebas bioquímicas son de gran utilidad e importancia como análisis cualitativo más no como análisis cuantitativo. El conocimiento y la forma de empleo de los diferentes medios de cultivo utilizados para l o s análisis microbiológicos son imprescindibles ya que nos ayudan al cultivo de colonias y diferenciación de géneros y especies de bacterias patógenas y no patógenas. Se cumplió con todos los objetivos del programa.

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B I B L I O G R A F Í A . 1. APHFA. 1985. Standar Methods. For the Examination of Water

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9. SECRETARÍA DE AGRICULTURA Y RECURSOS HIDRÁULICOS. 1985. Manual de Microbiología del agua. 3a. Ed., ler. volúmen. México D.F. 286 pp.

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