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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA
TESIS
POLISACÁRIDOS OBTENIDOS A PARTIR DE MACROALGAS DEL
GÉNERO Codium Y SU EVALUACIÓN COMO ANTICOAGULANTES
ALTERNATIVOS.
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
BIÓLOGA MARINA
PRESENTA:
ARACELI RODRÍGUEZ CUAUTLE
DIRECTOR:
DR. JESÚS IVÁN MURILLO ÁLVAREZ
LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, NOVIEMBRE DE 2013.
i
RESUMEN
Las algas verdes pertenecientes al género Codium sintetizan polisacáridos
con actividad anticoagulante, por lo que se reconocen como una fuente de
fármacos alternativos para el tratamiento de enfermedades vasculares. En el
presente estudio se evaluó el potencial anticoagulante de cuatro especies del
género Codium recolectadas en las costas de Baja California Sur, México. Para
ello, se obtuvieron extractos acuosos a dos diferentes temperaturas (25°C y 80°C).
Así mismo, se estudió la relación entre la estructura y la actividad biológica. Los
extractos fueron sometidos a los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo
de tromboplastina parcial activada (TTPA). De los cuales Codium simulans a 80°C
fue el que mostró mayor efecto. Por otra parte, las muestras de 25°C fueron
fraccionadas por medio de cromatografía de intercambio iónico para obtener
fracciones libres de impurezas y así evaluar su actividad anticoagulante. De estas
fracciones, la fracción de C. simulans eluída con NaCl al 0.5 M aumentó
considerablemente el tiempo de coagulación del plasma sanguíneo (270 s).
También se analizó la composición de estos polisacáridos por medio de
espectroscopia de infrarrojo. Con los datos obtenidos a partir de los ensayos
realizados se concluye que las cuatro especies aun perteneciendo al mismo
género presentan diferencia entre su actividad y estructura, sin embargo cabe
destacar a la especie Codium simulans y sus fracciones de polisacáridos ya que
es la que mostró el mayor potencial como fármaco anticoagulante.
Palabras clave: Actividad anticoagulante, algas verdes, polisacáridos sulfatados,
ensayos biológicos, Codium.
ii
AGRADECIMIENTOS
Y aquí bastaba con solo escribir la palabra: Gracias, sin embargo será
enunciada repetidamente hasta desgastarla, esa palabra conocida y utilizada por
todos pero pocas ocasiones dirigida con un peso y profundidad como ahora para
las personas que hicieron posible este trabajo…
Agradezco al director de tesis Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez por su
paciencia, por guiarme y aceptarme en el desarrollo de este trabajo. Al Dr.
Mauricio Muñoz por su apoyo en todo momento… ¡Gracias por compartir un poco
de su conocimiento! Del mismo modo, agradezco al comité revisor Dr. Rafael
Riosmena Rodríguez, al Dr. Juan Manuel López Vivas y al Dr. Ricardo Yabur
Pacheco por su disponibilidad, comentarios y aportaciones para este trabajo.
Agradezco principalmente a mis padres, hermana y hermano por su apoyo,
comprensión, por mejorar cada momento…por todo, que sin ustedes esto no
hubiera sido posible. También agradezco a esos pequeños y a todos los
integrantes de mi pequeña gran familia a ustedes que estuvieron en los momentos
inesperados. ¡Gracias!
A la M. en C. Elizabeth Rodríguez Montesinos y M. en C. Dora Luz Arvizu
Higuera, por su paciencia y principalmente por su apoyo en la obtención de
sangre.
Agradezco a los que me proporcionaron de su valiosa sangre sí a ustedes
donadores “voluntarios”. A quien donó más de una ocasión, doblemente gracias.
También a ustedes que intentaron donar y se salvaron por cualquier motivo que
frecuentemente fueron eso problemas técnicos que nunca podían faltar.
Agradezco a ustedes compañeros que forman y formaron parte del
Laboratorio de Química de Algas de CICIMAR-IPN, por su apoyo y ayuda
proporcionada.
Agradezco a las personas que están y estuvieron acompañándome en este
camino, gracias por compartir su conocimiento, ayuda y su apoyo cuando esto
salía bien o mal, por empujarme a seguir…Gracias por todo.
¡Gracias!
iii
ÍNDICE
Resumen i
Agradecimientos ii
Índice iii
Lista de tablas v
Lista de figuras v
1. Introducción 1
1.1. Polisacáridos sulfatados: generalidades y aplicaciones 2
2. Antecedentes 5
2.1. Fármacos anticoagulantes 6
2.2 Mecanismo de la coagulación sanguínea 7
2.3. Estudios de la actividad anticoagulante de polisacáridos
sulfatados a partir de algas
9
3. Distribución y descripción del género Codium
3.1. Taxonomía de los organismos
16
19
4. Justificación 21
5. Objetivo 23
5.1. Objetivos particulares 23
6. Material y métodos 23
iv
6.1. Obtención de muestras 23
6.2. Obtención de extractos crudos a temperatura de 25°C 25
6.3. Obtención de extractos crudos a temperatura de 80°C 26
6.4. Fraccionamiento de los extractos crudos por intercambio iónico 29
6.5. Ensayos de actividad anticoagulante 30
6.6. Purificación de extractos por tamizado molecular 32
6.7. Análisis del contenido de azúcares por el método de Dubios 32
6.8. Espectroscopia de infrarrojo 32
6.9. Procesamiento de datos 34
7. Resultados 34
8. Discusión 49
9. Conclusiones 55
10. Recomendaciones 56
11. Literatura citada 57
v
LISTA DE TABLAS
Tabla I. Rendimiento porcentual de los extractos crudos obtenidos a temperatura
de 27°C y 80°C.…………………………………………………............................... 34
Tabla II. Rendimiento porcentual de las fracciones obtenidas por el método de
cromatografía de intercambio iónico a partir de los extractos acuosos a 27°C de C.
cuneatum (06-011-60), C. amplivesciculatum (06-012-60), C. simulans (06-010-60)
y C. fragile (10-002-60)……………..…………………………………………………. 36
Tabla III. Coeficiente de coagulación en los ensayos de coagulación en relación
con el tiempo control de las muestras obtenidas (27°C y 80°C) a partir de
extractos de las algas C. cuneatum (06-011), C. amplivesciculatum (06-012), C.
simulans (06-010) y C. fragile (10-002)….…..…………...………..………………... 45
Tabla IV. Coeficiente de coagulación en los ensayos de coagulación en relación
con el tiempo control de las fracciones………………………………………………. 46
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fotografías de las algas: A) Codium fragile (Guiry y Guiry, 2013), B)
Codium simulans (Tomada por Rafael Riosmena-Rodríguez) y C) Codium
amplivesciculatum (Norris, 2010)…………………………………………………….. 20
Figura 2. Zona de recolecta de algas: Isla Santa Margarita en Bahía Magdalena y
San Cristóbal en Bahía Tortugas, Baja California Sur,
México………………………………………………………………………………….. 25
Figura 3. Esquema del proceso de obtención de los extractos a partir de Codium
vi
spp. a temperatura de 27°C….…………………………………………………………27
Figura 4. Esquema del proceso de obtención de los extractos a partir de Codium
spp. a temperatura de 80°C…………………………………………………………... 29
Figura 5. Efecto de los extractos crudos obtenidos a 27°C y 80ºC en el ensayo
de tiempo de protrombina.…………………………………………………………….. 37
Figura 6. Efecto de los extractos crudos obtenidos a 27°C y 80°C en el ensayo de
tiempo de tromboplastina parcial activada…………………………………………... 38
Figura 7. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio
iónico en el ensayo de tiempo de protrombina……………………………………….39
Figura 8. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio
iónico en el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada…………………39
Figura 9. Relación entre la concentración y el efecto de la actividad anticoagulante
de los extractos y fracciones en el ensayo de tiempo de
protrombina………………………………………………………………………........... 39
Figura 10. Relación entre la concentración y el efecto de la actividad
anticoagulante de los extractos y fracciones en el ensayo de tiempo de
tromboplastina parcial activada............................................................................. 41
Figura 11. Perfil de fraccionamiento del extracto C. simulans en columna de
tamizado molecular determinado por concentración relativa de azucares
totales.................................................................................................................... 42
Figura 12. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de tamizado
molecular en el ensayo de tiempo de protrombina……………………...………….. 43
vii
Figura 13. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de tamizado
molecular en el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada………….. 43
Figura 14. Relación entre la concentración y el efecto de la actividad
anticoagulante de las fracciones activas obtenidas por cromatografía de tamizado
molecular en el ensayo de tiempo de protrombina………………………………… 44
Figura 15. Relación entre la concentración y el efecto de la actividad
anticoagulante de la fraccione activa obtenida por cromatografía de tamizado
molecular en el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada.………..... 44
Figura 16. Espectro de infrarrojo correspondiente a los extractos obtenidos a
25°C a partir de las cuatro especies de algas verdes……………………………. 47
Figura 17. Espectro de infrarrojo correspondiente a los extractos obtenidos a
80°C de las cuatro especies de algas verdes ………………………………………. 48
Figura 18. Espectro de infrarrojo correspondiente a las fracciones obtenidas por
intercambio iónico………………………………………………………………………. 48
Figura 19. Espectro de IR correspondiente a las fracciones obtenidas en el
método de tamizado molecular……………………………………………………….. 49
Figura 20. Espectro de IR correspondiente a las fracciones con mayor y menor
actividad…………………………………………………………………………………. 55
1
1. INTRODUCCIÓN
Las algas marinas son un grupo de organismos muy diversos que
constituyen una fuente importante de recursos naturales debido a que han sido
utilizadas durante años como alimento humano, forraje, fertilizantes y como
componentes en la industria farmacéutica (Robledo, 1998). Estos organismos son
considerados un reservorio potencial de nuevas sustancias con diversidad
estructural. Por lo tanto existe el interés de extraer compuestos a partir de las
algas Chlorophyta, Ochrophyta y Rhodophyta. Sin embargo, los últimos dos
grupos han sido mayormente estudiadas basándose en su composición química y
su aplicación en la industria como ficocoloides, los cuales se obtienen a partir de
algas rojas (agar, carragenina) y de algas cafés (alginatos) (Farias et al., 2000).
Las algas pertenecientes al grupo Chlorophyta presentan polisacáridos
bioactivos, tales como algunos glucoronoxilorhamnanos,
glucoxilorhamnagalactanos y xyloarabinogalactanos (Lee et al., 1998; Hayakawa
et al., 2000). Existen estudios particularmente de las especies pertenecientes al
género Codium (Stackhouse 1797) donde destacan el potencial de algunos
polisacáridos sulfatados capaces de interferir en la cascada de coagulación
sanguínea (Matsubara et al. 2000; 2001 y Choi et al., 2013).
Los polisacáridos sulfatados en diversos estudios se describen con
importantes actividades biológicas y con potencial aplicación médica, tales como:
antimicrobiana, antitumoral, antiviral, antiinflamatoria, antioxidante, antitrombótica
y anticoagulante (Baker, 1984; Mayer et al., 2011), siendo estas dos últimas
2
actualmente las de mayor interés. Esto se debe principalmente a la iniciativa de
encontrar alternativas para combatir o tratar las enfermedades cardiovasculares
que han ido en aumento. Dichas enfermedades son tratadas aplicando fármacos
como la heparina. No obstante se ha registrado que puede generar
complicaciones en la coagulación, los cuales afectan gravemente la salud humana
debido a que se asocian a trastornos de deficiencia de calcio como la
osteoporosis, trombocitopenia y hemorragias (Liu et al., 2009; Gurgel et al., 2011).
Con lo anteriormente descrito, en el presente estudio se efectuó la
extracción de los polisacáridos sulfatados de cuatro especies de algas verdes
pertenecientes al género Codium, para evaluar su actividad anticoagulante,
determinar su estructura y con esto generar información sobre su potencial
aplicación en la farmacéutica.
1.1. Polisacáridos sulfatados: generalidades y algunas aplicaciones
Las algas marinas están constituidas por un alto contenido de polisacáridos
que están conformados por diferentes monómeros, generalmente con grupos
sulfatos, los polisacáridos constituyen una clase de macromoléculas biológicas
con una diversidad estructural (Talarico, 2008; Batista González et al., 2009;
Muñoz-Ochoa et al., 2009).
Con respecto a los polisacáridos presentes en las macroalgas, las
Rhodophytas o algas rojas producen grandes cantidades de polisacáridos en su
pared celular, la mayoría galactanos, son polisacáridos formados por monómeros
de galactosa. Estos galactanos sulfatados son aplicados principalmente como
3
productos gelificantes, espesamiento o utilizados por sus propiedades de
retención de agua en la industria alimentaria (Rocha de Souza et al., 2007;
Talarico, 2008). En las algas rojas se han reportado galactanos como
carragenanos y agares, las principales fuentes comerciales para la producción de
carragenanos son las siguientes especies: Chondrus Stackhouse 1797, Eucheuma
J. Agardh 1847 y otras más (Mascheck y Baker, 2008). Mientras que para la
producción de agar existen dos fuentes principales: Gelidium J. V. Lamouroux
1813 y Gracilaria Greville 1830, la demanda es elevada por lo que tienen otras
fuentes de materia prima para la producción de agar (Shanmugam y Mody, 2000;
Rocha de Souza et al., 2007).
Las Ochrophytas o algas pardas, producen polisacáridos llamados
fucoidanos o fucanos. Estos son productos metabólicos de fucosa que se
encuentran exclusivamente en las algas cafés e invertebrados. Los fucanos
además de fucosa pueden contener diferentes proporciones de galactosa, ácido
glucurónico, manosa y xilosa (Rocha de Souza et al., 2007). Los principales
géneros de los que se obtienen los fucoidanos son: Laminaria J. V. Lamouroux,
1813, Fucus Linnaeus 1753, Ecklonia Hornemann 1828, Eisenia Areschoug 1876,
Hizikia Okamura 1932, Sargassum C. Agardh 1820, Padina Adanson 1763 y
Dyctiota (Shanmugam y Mody, 2000; Rocha et al., 2007; Amsler, 2008).
Las Chlorophytas o algas verdes son las que sintetizan polisacáridos
sulfatados que están conformados por azúcares tales como ramnosa, arabinosa,
galactosa y mezcla de ellos, así mismo forman complejos como
4
arabinogalactanos, galactoramnomananos, entre otros. Sin embargo cabe
mencionar que los polisacáridos de las algas verdes son los menos estudiados
(Shanmugam y Mody, 2000; McClintock y Baker, 2001). No obstante como ya se
ha mencionado existen registros sobre la actividad biológica de los polisacáridos
sulfatados de macroalgas en general, que hasta ahora están por utilizar en la
producción de nuevos compuestos farmacéuticos antitumorales, antivirales,
antifúngicas, antihelmínticas, antiinflamatorias, analgésicas e inmunoreguladoras
(Shanmugam y Mody, 2000; Guangling et al., 2011).
Por otra parte, se conocen otras fuentes naturales de polisacáridos
sulfatados que son en gran variedad de tejidos vegetales y animales. En los
tejidos de vertebrados, a estos polisacáridos sulfatados se les denomina
glucosaminoglucanos, un ejemplo es la heparina que se obtiene del pulmón de
bovino y en la mucosa intestinal porcina, poseen diferentes estructuras químicas y
distinta actividad biológica (Téllez de Peralta, 1998; Mendoza Patiño, 2008)
La heparina es miembro de una familia de productos especiales llamados
glucosaminoglicanos. Este producto es considerado el fármaco anticoagulante
más importante para la prevención y el tratamiento de la trombosis venosa,
embolia pulmonar, tratamiento de la trombosis arterial en pacientes con infarto
agudo de miocardio y en la prevención de la re-trombosis después de la
trombolisis. Además, se utiliza en la hemodiálisis. Sin embargo, se tienen registros
que la heparina posee varios efectos secundarios, tales como derivar en
5
trombocitopenia, alta susceptibilidad de sufrir hemorragia y el riesgo de
contaminación por partículas virales (Gurgel et al., 2011).
En resumen, la fuente más importante para la obtención de ficocoloides son
las algas rojas y pardas, debido a su amplio uso en la industria cosmética, de
alimentos y su aplicación farmacéutica, sin embargo las algas verdes y sus
compuestos han sido poco extraídos consecuentemente poco estudiados
(Shanmugam y Mody, 2000). No obstante, en algunos estudios se ha reportado
actividad biológica de algunas, los cuales reportan que las algas verdes pueden
presentar una actividad similar a la heparina (Matsubara et al., 2000). Por lo tanto,
en el presente trabajo se pretende evaluar la estructura y actividad anticoagulante
de los polisacáridos sulfatados obtenidos a partir de cuatro especies de algas
verdes pertenecientes al género Codium (Figura 1).
2. ANTECEDENTES
2.1. Fármacos anticoagulantes
Los fármacos anticoagulantes intervienen bloqueando la coagulación o bien
de la agregación de las plaquetas. Son utilizados para romper el trombo
(trombólisis), para prevenir la formación de un nuevo coagulo o el engrosamiento
del coágulo existente. Los anticoagulantes son sustancias de distinta naturaleza
química relacionadas por su efecto biológico. Los cuales se dividen como
anticoagulantes de acción directa: son aquellos que por sí solos son capaces de
inhibir la cascada de coagulación. Como por ejemplo los inhibidores directos de
6
trombina (hirudina, argatroban). Otros son los anticoagulantes de acción indirecta:
son aquellos que interactúan con otras proteínas o actúan en otras vías
metabólicas, alterando el funcionamiento de la cascada de la coagulación. Por
ejemplo inhibidores mediados por antitrombina III (heparinas no fraccionadas,
heparinas de bajo peso molecular, danaparoide sódico); inhibidores de la síntesis
de factores de coagulación (derivados del dicumarol) (Trejo, 2004).
Los anticoagulantes más utilizados son orales y las heparinas. Estos
anticoagulantes actúan sobre la síntesis hepática de factores, entre los cuales se
encuentran los fármacos derivados de la cumarina, los más consumidos son:
dicumarol, dicumarona y warfarina. Con respecto a las heparinas existen dos
tipos: la heparina estándar o no fraccionada (HNF) está conformada por una
mezcla heterogénea de cadenas de polisacáridos de longitud variable con un peso
molecular que oscila entre 6,000 y 40,000 daltons. La heparina de bajo peso
molecular (HBPM) es el resultado de la fragmentación de HNF por diferentes
métodos para obtener productos con pesos moleculares bajos y homogéneos. Las
cuales impiden que actúen los factores y así alargar el tiempo de coagulación.
Esta heparina de bajo peso molecular es administrada mediante inyección
subcutánea (Trejo, 2004).
2.2. Mecanismo de la coagulación sanguínea
De manera general, la coagulación o hemostasia es el proceso integrado
por varios mecanismos biológicos que tiene por objetivo evitar la hemorragia al
presentarse lesiones en los vasos sanguíneos preservando así la fluidez de la
7
sangre. La hemostasia se desarrolla de la siguiente manera, al existir una lesión
vascular, el vaso sanguíneo se contrae para disminuir el paso de sangre a través
de él, en seguida, las plaquetas circulantes se adhieren y agregan al colágeno del
endotelio del vaso dañado, liberando adenosin difosfato (ADP), trombina y
serotonina, cuya función es reforzar la agregación de las plaquetas, hasta llegar a
la formación de un trombo plaquetario, el cual detiene momentáneamente la
pérdida de sangre y que es substituido por la formación de fibrina, posteriormente
se inicia la reparación del sitio dañado (Martínez-Murillo, 2006; Guyton y Hall,
2006).
La hemostasia se desarrolla a través de una serie de reacciones por
factores en cascada, como se describe a continuación (Martínez-Murillo, 2006).
En la sangre y en los tejidos existen sustancias importantes que causan o
afectan a la coagulación sanguínea: unas actúan estimulando la coagulación
llamadas procoagulantes, y otras que inhiben la coagulación, llamadas
anticoagulantes. Más específicamente la coagulación se desarrolla por medio de
la cascada de activación de zimógenos. La formación del coágulo implica la
interacción de dos tipos de vías enzimáticas las cuales se les denomina vía
intrínseca y vía extrínseca. La coagulación se desarrolla por la interrelación de las
dos vías, ya que ambas vías son una serie de proteínas plasmáticas llamadas
factores de coagulación sanguínea, que desempeñan una función en común que
es la coagulación sanguínea (Díaz y Almagro, 2001; Guyton y Hall, 2006; Berg et
al., 2008).
8
En la cascada de coagulación, a los factores de la coagulación se les
asigna un número romano y el subfijo (a) que significa que el factor se encuentra
en su forma activa. En el sistema extrínseco la tromboplastina tisular (factor III)
juega un importante papel, y solamente cuatro factores adicionales son
requeridos: el VII (proconvertina), el X (factor Stuart), el V (proacelerina) y el
calcio. En esta vía de la coagulación, no hay participación de los factores XII, XI,
IX y VIII. El factor X es activado directamente por la tromboplastina tisular, el factor
VII y el calcio, y luego participa en la misma secuencia de reacciones que
conducen a la formación de fibrina tal como se encuentra en el sistema intrínseco.
Para iniciar la formación de protrombina se empieza con un traumatismo en la
pared vascular, el cual se libera el factor tisular o tromboplastina tisular, así mismo
actúan en conjunto en presencia de iones de calcio para formar el factor X
activado. Posteriormente el factor X ya activado se combina con fosfolipidos
tisulares y con el factor V forman el complejo llamado activador de la protrombina
(Guyton y Hall, 2006).
Para la activación en cascada de los diferentes factores de la coagulación,
el plasma contiene los elementos necesarios como los factores que se activan por
el contacto con la piel, complejos antígeno/anticuerpo, colágeno, por lo tanto en la
vía intrínseca, una vez que el factor XII (Factor de Hageman) es estimulado, el
factor XIIa convierte al factor XI (antecedente tromboplastínico del plasma) en su
forma activa, una vez que el factor IX es activado, interacciona con el factor VIII
(factor antihemofílico) en presencia de iones de calcio y de fosfolípidos para
9
formar un complejo capaz de activar al factor X (factor Stuart). Los fosfolipidos
requeridos son suministrados por las plaquetas. La reacción es bloqueada por lo
heparina, un polisacárido sulfatado, el cual forma un complejo inactivo con el
factor IX activado. El factor X activado interacciona con el factor V (proacelcrina)
en presencia de iones de calcio y fosfolípidos y producen un complejo con
capacidad para activar la protrombina (Cuellar y Falabella, 2004; Guyton y Hall,
2006).
2.3. Estudios de la actividad anticoagulante de polisacáridos sulfatados algales
Los primeros estudios acerca de las propiedades anticoagulantes de
polisacáridos obtenidos a partir de las algas marinas se reportaron desde los años
30’s por Chargaff et al. (1936) en el cual reportan que Iridaea laminarioides Bory
de Saint-Vincent 1828 contenían sustancias que podían inhibir la coagulación
sanguínea. Posterior a este reporte se informó de una actividad similar de las
algas Grateloupia indica Børgesen 1932 y Grateloupia filicina (J.V.Lamouroux) C.
Agardh 1822. No obstante, los estudios sobre la química de productos naturales
de algas fueron iniciados desde 1950 (Faulkner, 2000; Shanmugam y Mody,
2000).
Sin embargo es hasta los años setenta cuando se da el desarrollo de más
investigaciones ya que adquieren mayor importancia los productos naturales
marinos, debido al interés de la investigación y a la necesidad de encontrar
moléculas nuevas que tengan una aplicación en el campo de la industria
farmacéutica para combatir enfermedades (Hernández y Hernández, 2005).
10
Durante la década de 1980 y 1990, los compuestos con actividades
biológicas fueron descubiertos en organismos marinos como en las algas marinas
(Mayer y Lehmann, 2000). De acuerdo con Ireland et al. (1993) las algas fueron
fuente de aproximadamente el 35% de las sustancias químicas descubiertas en el
periodo comprendido entre 1977 y 1987, seguida de las esponjas 29% y cnidarios
22% (Smit, 2004).
A través de los años se han realizado estudios sobre actividad
anticoagulante asociada a los extractos de los diferentes grupos de algas
Chlorophytas, Ochrophytas y Rodophytas, de estas dos últimas se tienen más
reportes relacionados con dicha actividad, así mismo se ha reportado que las
Rhodophytas presentan mayor actividad anticoagulante (Shanmugan y Mody
2000, Shanmugan et al., 2002).
Para las Chlorophytas (algas verdes) también se tienen registros en los que
se describe que presentan actividad anticoagulante. Más específicamente para el
género Codium también se ha registrado actividad, en las cuales se hace
referencia que existe una eficiencia en el efecto de actividad anticoagulante entre
las especies pertenecientes a este género, en diferentes localidades, con diferente
temperatura o modo de extracción. Como en el caso de Deacon-Smith et al.
(1985) analizaron la actividad anticoagulante de los extractos crudos acuosos de
Codium fragile ssp. tomentosoides (van Goor) P.C. Silva 1955, demostrando
actividad anti-trombina asociada con un factor no identificado del plasma (Rogers
et al., 1990). Sin embargo Jurd et al. (1995), extrajeron y purificaron un
11
proteoglucano a partir de Codium fragile ssp. atlanticum (A.D.Cotton) P. C. Silva
1955, por cromatografía de intercambio iónico, donde la actividad anticoagulante
fue representativa al aumentar su concentración en los ensayos de tiempo de
trombina (TT), tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y tiempo de
protrombina (TP), ya que el proteoglucano presentó una mayor actividad en los
tres ensayos a concentraciones de 125 µg mL-1, en este estudio se comprobó que
la actividad observada era debido a la antitrombina III y el cofactor II (Jurd et al.,
1995).
Por su parte, Siddhanta et al. (1999) aislaron polisacáridos sulfatados tipo
arabinano y arabinogalactanos a partir de Codium dwarkense Børgesen 1947. Los
productos fueron probados como anticoagulantes demostrando que existe una
mayor concentración de polisacáridos con gran potencial anticoagulante en los
gametangios, los cuales presentaron la mayor actividad, con un coeficiente de
coagulación de 3.75 a 750 µg mL-1. No obstante esta investigación se enfoca en la
composición de los polisacáridos sulfatados aislados a partir de C. dwarkense, los
cuales incluían que existe un alto contenido de azúcar 39.2%, 26% de sulfatos,
6.84% de proteínas y 2.34% de ácidos urónicos.
Shanmugam y Mody (2000) en la India realizaron un análisis de actividad
anticoagulante de las tres divisiones de algas marinas, resultando que Codium
spp. y Udotea spp. mostraron un gran potencial. Así mismo, relacionaron que el
grado de sulfatación y la estructura molecular de los polisacáridos provenientes de
las algas eran determinantes para la actividad anticoagulante. En este estudio
12
encontraron el mecanismo de acción de los polisacáridos sulfatados de las algas
verdes, ya que inhiben la trombina.
Shanmugam et al. (2001) evaluaron la actividad anticoagulante de
diferentes especies de Chlorophytas: Caulerpa, Cladophora, Bryopsis, Boodle,
Chaetomorpha, Ulva, Enteromorpha y Valaniopsis. Concluyen que los extractos
más activos fueron los que presentaban polisacáridos sulfatados de alto peso
molecular, alto contenido de azucares y sulfato, bajo contenido proteico y ácido
uronico.
Shanmugam et al. (2002) recolectaron algas marinas de la familia
Codiaceae en las costas de la India para el estudio del contenido de polisacáridos
sulfatados y su actividad anticoagulante. Este estudio concluye que los extractos
de agua fría a partir de Codium dwarkense y C. tomentosum mostraron una alta
actividad anticoagulante.
Existen investigaciones de algas verdes que solo hacen referencia a la
presencia de actividad biológica como Matsubara et al. (2000) que aislaron un
polisacáridos sulfatados de Codium pugniforme Okamura 1915 quien mostró
inhibir las polimerización de la fibrina. Así mismo, en el año 2003, analizaron un
galactano altamente sulfatado de Codium cylindricum Holmes 1896, resultando
como antiangiogénico ya que inhibe la formación de vasos sanguíneos. Ghosh et
al. (2004) reportaron que Caulerpa racemosa (Forsskål) J. Agardh 1873 contiene
productos especiales con las actividades anticoagulantes y antivirales. Mao et al.
(2006) realizaron una caracterización química de los polisacáridos de Ulva
13
conglobata Kjellman 1897 recolectadas en tres lugares diferentes de China, no
obstante con respecto a la actividad anticoagulante solo concluyen que los
polisacáridos de U. conglobata pueden conducir al desarrollo de nuevos agentes
antitrombóticos.
Athukorala et al. (2007) realizaron un estudio en el que examinaron la
actividad anticoagulante de algas pardas y verdes recolectadas en la Isla Jeju en
Corea, en este estudio reportan a las algas que resultaron con mayor actividad
anticoagulante: Monostroma nitidum Wittrock 1866, Codium fragile (Suringar)
Hariot 1889, Laminaria ochotensis Miyabe in Okamura 1902, Hizikia fusiformis
(Harvey) Okamura 1932, Sargassum horneri (Turner) C. Agardh 1820, Sargassum
siliquastrum (Mertens ex Turner) C. Agardh 1820 y Myagropsis myagroides
(Mertens ex Turner) Fensholt 1955, en el análisis se destaca que C. fragile mostró
una mayor actividad anticoagulante con respecto a las otras algas.
Ciancia et al. (2007) analizaron las características químicas y los efectos
sobre la hemostasia de los polisacáridos sulfatados obtenidos a partir de Codium
fragile (Suringar) Hariot 1889 y Codium vermilara (Olivi) Delle Chiaje 1829. En el
cual se encontró que C. vermilaria contiene mayor grado de sulfatación y un mayor
contenido de arabinosa, concluyen que por tal motivo resultó ser más activa.
Zhang et al. (2008) extrajeron polisacáridos sulfatados de Monostroma
latissimum Wittrock 1866 en agua caliente, purificándolos por intercambio iónico y
además por cromatografía de exclusión de tamaño, con lo cual obtuvieron
fracciones con diferente peso molecular. De tal manera que los resultados
14
indicaron que el tamaño molecular tuvo un efecto importante sobre la actividad
anticoagulante de los polisacáridos sulfatados obtenidos de M. latissimum.
Fernández et al. (2010) obtuvieron extractos obtenidos a temperatura
ambiente de C. vermilara (Olivi) Delle Chiaje 1829, se encontraban constituidos
por diferentes cantidades de galactanos y arabinanos sulfatados o por
arabinogalactanos sulfatados, evaluaron a dichos polisacáridos sulfatados como
podrían ejercer su actividad anticoagulante por mecanismos diferentes, con lo cual
demostraron que existen interacciones con distintas proteínas involucradas en el
proceso de coagulación.
Rodrigues et al. (2011) evaluaron características moleculares de un
polisacáridos sulfatado con propiedades anticoagulantes aislados a partir de
Caulerpa cupressoides (Chlorophyta). Los polisacáridos fueron extraídos por
digestión proteolítica, seguido por cromatografía de intercambio iónico. Las
fracciones obtenidas se analizaron para distribución de masa molecular, analizado
por electroforesis en gel de agarosa al 0.5% y su composición química. Obtuvieron
tres fracciones de polisacáridos sulfatados, de las cuales solo la fracción II fue
activa con un alto contenido de sulfato, sin embargo las fracciones aisladas de C.
cupressoides (Tokida) K. L. Vinogradova 1979 fue menos activa que la heparina.
Las propiedades biológicas de las algas marinas son un precedente
importante para la búsqueda de nuevos compuesto ya que recientemente estos
han sido reportados como anticoagulantes, antioxidantes, antitumorales,
antiinflamatorios, antivirales, antiprotozoarios y antibacteriales (Blunt et al., 2006;
15
Patel, 2012). Con lo descrito anteriormente, existen ciertas investigaciones que se
basan solo en una prospección de la actividad biológica de diversos organismos
marinos, por lo que algunos de los reportes describen algunos compuestos de
algas verdes con propiedad antitrombosis y anticoagulante a partir de Monostroma
nitidum (Albuquerque et al., 2004), Codium vermilaria (Mao et al., 2006),
Monostroma latissimum (Mao et al., 2009; Li et al., 2012) y Codium fragile (Jurd et
al., 1995).
Los estudios realizados en México, son pocos, sin embargo se encontró
que De Lara Isassi y Álvarez-Hernández (1994), realizaron extractos acuosos
provenientes de 32 especies de algas recolectadas en los siguientes sitios:
Oaxaca, Guerrero, Tamaulipas y Quintana Roo. A los extractos se les sometió a
ensayos de actividad anticoagulante, resultando que los extractos de Codium
giraffa P. C. Silva 1979, Halimeda discoidea Decaisne 1842 y Sargassum hystrix J.
Agardh 1847 mostraron mayor actividad.
De Lara Isassi et al. (2004) reportaron 49 especies de macroalgas
recolectadas en diversas localidades del Golfo de México y el Caribe mexicano
para identificar su actividad en la vía intrínseca y extrínseca de coagulación de la
sangre. Solo 4 de las 49 especies resultaron con actividad semejante a la
heparina, cabe destacar que el estudio incluyó a Codium simplex DeNotaris, el
cual mostró un prolongado tiempo de coagulación TP y TTPa.
En cuanto a los estudios efectuados en la localidad de Baja California Sur,
México, Muñoz-Ochoa et al. (2009) realizaron un estudio de polisacáridos algales
16
con actividad anticoagulante y encontraron que el 22% de los extractos probados
presentaron actividad en el ensayo de TP y un 70% en el TTPa, entre ellas
Codium cuneatum, Codium brandegii y Codium amplivesciculatum (Muñoz et al.,
2009).
Finalmente, el estudio más reciente fue realizado por Guerrera-Rivas et al.
(2011) en el cual buscaron nuevos compuestos de macroalgas de la costa del
Pacífico del Noreste Mexicano. Las especies de algas que analizaron la actividad
anticoagulante fueron Egregia menziesii (Turner) Areschoug 1876, Ulva
nematoidea, Porphyra perforata J. Agardh 1883, Silvetia compressa y Codium
fragile (Suringar) Hariot 1889, recolectadas en las costas de Ensenada, Baja
California. En dicho trabajo registraron a U. neumatoidea con un índice alto para
TTPA de 1.8 y para los extractos acuosos a 80°C E. menziesii fue el que mostró
un alto potencial para TTPA con un índice de 1.4. Sin embargo describen a C.
fragile con poca actividad.
3. Distribución y descripción del género Codium
El género Codium fue descrito por Stackhouse en 1797, cuenta con cerca
de 120 especies, de las cuales aproximadamente la mitad son distintivas sin
embargo el resto conforma agrupamientos o complejos de intricada variación
morfológica (Pedroche et al., 2002; Guiry y Guiry, 2013). Codium es un género de
algas verdes cenocíticas, su condición multinucleada y la ausencia de paredes
celulares le han conferido, en algunos casos, el ser considerado el organismo más
grande formado de una sola célula (Pedroche et al., 2002). Estos organismos se
17
caracterizan morfológicamente por ser de talo esponjoso, por su coloración que
incluye numerosos tipos de color verde oscuro con una variedad morfológica de
forma cilíndrica o de forma aplanada, irregularmente, puede desarrollar talos
largos desde pocos centímetros hasta 10 m de longitud (Codium
amplivesciculatum) (Figura 1), también pueden ser cortos, simples, ramificados
dicotómicamente o talos irregulares y globulares, se adjuntan a continuación por
una masa esponjosa de filamentos rizoides (Pedroche et al., 2002; Norris, 2010;
Guiry y Guiry, 2013).
Por lo general estos organismos se desarrollan sobre sustratos, como rocas
o conchas, estas algas se encuentran desde la zona intermareal hasta
profundidades de 200 m. Se considera que son de distribución mundial, a
excepción de las latitudes polares; sin embargo el mayor número de especies de
Codium se encuentra en la zona subtropical en las regiones templadas (Pedroche
et al., 2002; Ciancia et al., 2007).
Ahora bien, las especies evaluadas en el presente trabajo presentan
distribución en las costas del Pacífico de México, sin embargo para Codium fragile
existen registros que mencionan su distribución a lo largo de la costa del Pacífico
desde Alaska hasta la Península de Baja California, sin embargo otros reportes
consideran a C. fragile como especie invasora (Acleto y Zúñiga, 1998; Boraso,
2004; Ciancia et al., 2007; Norris, 2010; Guiry y Guiry, 2013).
Para Codium cuneatum existen reportes desde la Isla Santa Cruz,
California, Estados Unidos de América a Bahía de Los Ángeles en el Golfo de
18
California, México. La distribución de Codium amplivesicualtum se registra para el
Golfo de California: en Puerto Refugio, en Isla Ángel de la guarda a Punta Arena
(Norte de Cabo Pulmo), para la costa del Pacífico: se encuentra en Bahía de San
Quintín a Bahía Magdalena, Isla Cedros; en Isla Guadalupe hasta Islas de
Revillagigedo; al igual que desde Nayarit a Jalisco. Finalmente la distribución
Codium simulans Setchell y N. L. Gardner, 1924. En el Golfo de California va
desde Puerto Peñasco a Cabeza Ballena y para la costa del Pacífico: es desde
Isla Santa Cruz (Canal de Islas de California) a Guerrero; Isla Guadalupe; Isla
Clarión (Islas Revillagigedo; Norris, 2010).
Con respecto a la reproducción, los gametangios se desarrollan como
ramas de los utrículos, que pueden ser de color oscuro o pálido. Los gametangios
se separan del resto de los talos por paredes transversales (septos), por lo que el
talo puede persistir después de la descarga de gametos (Graham y Wilcox, 2000).
Los gametos de Codium no se forman a expensas de una parte vegetativa
cualquiera de la planta, sino en órganos especiales que nacen lateralmente de las
extremidades dilatadas de los filamentos y que son los gametocistos. Todos
parecidos por su forma y tamaño, estos gametocistos se diferencian por su
contenido. Unos contienen pequeñas células biflageladas en las que se observa,
además del núcleo, sólo dos o tres cloroplastos; otros contienen células con mayor
volumen provistas de numerosos plastos igualmente biflagelados. Los gametos
pequeños son gametos masculinos; los grandes los gametos femeninos, que
están desprovistos de estigma. Los individuos de Codium no presentan más que
19
gametocistos masculinos o femeninos, pero a veces los dos sexos pueden estar
reunidos en el mismo individuo. La fecundación se efectúa por copulación entre
los gametos de sexo opuesto se realiza una fusión; el zigoto formado se redondea
y se desarrolla para dar directamente un nuevo Codium; la planta ya formada
siempre será un organismo diploide, mientras que los gametos serán la parte
haploide, la meiosis se lleva a cabo cuando se forman los gametos masculinos y
femeninos y no cuando se fusionan (Des Abbayes, 1989; Graham y Wilcox, 2000;
Lee, 2008).
3.1. Taxonomía de los organismos
Reino Plantae
Phylum Chlorophyta
Clase Chlorophyceae
Orden Bryopsidales
Familia Codiaceae
Género Codium Stackhouse, 1797
Especie
Codium fragile (Suringar) Hariot, 1889
Codium cuneatum Setchell y Gardner, 1924
Codium simulans Setchell y Gardner, 1924
Codium amplivesciculatum Setchell y Gardner,
1924.
(Dreckmann, 1998; Pedroche et al., 2002; Norris, 2010; Guiry y Guiry, 2013)
20
Figura 1. Fotografías de las algas: A) Codium fragile (Guiry y Guiry, 2013),
B) Codium amplivesiculatum (Norris, 2010) y C) Codium simulans (Tomada
por Rafael Riosmena-Rodríguez).
A)
B) C)
21
4. JUSTIFICACIÓN
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son un problema de salud que
afecta a muchas personas. Estas ECV afectan principalmente al corazón y se
encuentran asociadas a enfermedades de los vasos sanguíneos, siendo las más
comunes: cardiopatías coronarias, enfermedades cerebrovasculares, arteriopatías
periféricas, hipertensión arterial, cardiopatías reumáticas, lesiones del miocardio,
trombosis venosas profundas, embolias pulmonares, malformaciones del corazón
y coágulos de sangre en las venas de las piernas que pueden desprender
émbolos que se alojan en los vasos del corazón y los pulmones. Cabe destacar
que la primer causa de muerte en México es la diabetes, responsable del 14.6%
de las defunciones, la cual también da origen a enfermedades cardio y
cerebrovasculares (Anónimo, 2009).
De acuerdo al reporte de la Organización Mundial de la Salud (OMS) cada
año mueren más personas por ECV que por cualquier otra causa, por lo que son
causantes del 30% de las muertes a nivel mundial, lo cual las posiciona como una
de las principales causas de muerte. En el 2005, 17.5 millones de fallecimientos
fueron atribuidos a estas enfermedades. Los pronósticos en esta área no son
alentadores ya que se prevé que para unos años el número de muertes asociadas
a la ECV incrementará a 20 millones. El 80% de los decesos atribuidos a estas
causas se presentan en países de ingresos medios y bajos (Anónimo, 2009).
En muchos de los casos, la heparina se utiliza para el tratamiento de esas
enfermedades. Se trata de un polisacárido sulfatado aislado a partir de intestinos
22
de cerdo o pulmones de bovinos. A pesar de su alta eficacia, la heparina puede
producir efectos negativos sobre los pacientes, tales como el riesgo de hemorragia
(Mourão y Pereira, 1999 y Nader et al., 2001). Por lo tanto para el descubrimiento
de anticoagulantes se han realizado investigaciones de la actividad anticoagulante
de los polisacáridos y glucosaminoglucanos de diversas fuentes tales como:
ascidias, pepinos de mar, equinodermos, tunicados y algas (Cavalcante et al.,
2000).
En México las enfermedades del corazón, isquémicas del corazón y la
cerebrovasculares son la principal causa de muerte, situación que es recurrente
desde hace varios años. En el 2001 a nivel nacional se registraron 25,165 muertes
asociadas a enfermedades cerebrovasculares en la población nacional de las
cuales 9,876 fueron de derechohabiente del IMSS, para el 2003 se observó un
decremento en las muertes de derechohabientes registrándose un total de 7,201
(Anónimo, 2003).
Debido al incremento de las muertes por estas enfermedades, es
trascendental y necesaria la búsqueda de nuevas alternativas que permitan
combatir estas enfermedades, por lo que al existir una amplia diversidad de
especies de algas resultan ser un potencial recurso para ser utilizado con fines
medicinales, de tal manera que es necesario evaluar la actividad anticoagulante
de las algas marinas así mismo es esencial centrarse en las especies que han
recibido poca atención como es el caso de las algas verdes marinas como el
género Codium que han sido reportadas como una fuente importante de
23
polisacáridos sulfatados y como resultado determinar la actividad biológica de las
diferentes especies pertenecientes a este género, así mismo generar información
sobre una especie a convertirse en un potencial anticoagulante.
5. OBJETIVO GENERAL
Determinar la relación estructura/actividad anticoagulante de los polisacáridos
sulfatados aislados a partir de cuatro especies pertenecientes al género Codium.
5.1. OBJETIVOS PARTICULARES
Obtener extractos de Codium cuneatum, Codium fragile, Codium simulans y
Codium amplivesciculatum.
Determinar la actividad anticoagulante in vitro de los extractos y fracciones
obtenidas a partir de las algas, por medio de los ensayos TP y TTPA en
plasma sanguíneo.
Purificar los extractos con mayor actividad anticoagulante por medio de
tamizado molecular y cuantificar la concentración de azúcares, así como
también determinar su actividad biológica.
Analizar la composición química de los extractos mediante espectroscopia
de infrarrojo.
6. MATERIAL Y MÉTODOS
6.1. Obtención de Muestras
Para realizar este estudio en junio de 2006 fueron recolectadas las siguientes
algas: Codium cuneatum, Codium amplivesiculatim y Codium simulans, en Isla
Santa Margarita de Bahía Magdalena, Baja California Sur, México (Figura 2), en
24
un sustrato arenoso-rocoso, a una profundidad entre 1 y 2 metros. Esta isla se
encuentra ubicada frente al litoral Oeste de Baja California Sur, en los 24º 31’
latitud Norte y los 112º 00’ longitud Oeste.
La muestra de Codium fragile fue recolectada en el mes de enero de 2010
en la localidad puerto pesquero San Cristóbal, ubicado aproximadamente a 50 km
al sureste del poblado Bahía Tortugas, Baja California Sur, México (Figura 2),
entre los 27º 26' de latitud Norte, y los 114° 33' de longitud Oeste. En este sitio
predomina el sustrato rocoso y se recolectó a la profundidad de 1 o 2 metros.
Las algas recolectadas se transportaron al Laboratorio de Química de Algas
Marinas del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del IPN, donde fueron
lavadas con agua para eliminar cualquier material o sedimento asociado. Se
secaron colocándolas directo al sol y fueron almacenadas en bolsas etiquetadas
con su clave correspondiente: Codium simulans (06-010), Codium cuneatum (06-
011), Codium amplivesciculatum (06-012) y Codium fragile (10-002). Las muestras
se mantuvieron en refrigeración a -20ºC hasta el momento de su uso.
La identificación taxonómica de las cuatro especies fue realizada por el Dr.
Rafael Riosmena Rodríguez en la Universidad Autónoma de Baja California Sur.
25
Figura 2. Zonas de recolecta: Isla Santa Margarita en Bahía Magdalena y San Cristóbal en Bahía
Tortugas, Baja California Sur, México.
6.2. Obtención de extractos crudos a temperatura de 25ºC
Se utilizaron 100 g de cada muestra de alga seca y se cortaron en trozos de
aproximadamente un centímetro. Para realizar la extracción cada muestra de alga
se colocó en un vaso de precipitado, previamente etiquetado con su clave
correspondiente. Se agregó 0.8 L de agua destilada a temperatura de 25ºC con
agitación constante por 2 hrs. Al término de las 2 hrs., se realizó una filtración
simple. El extracto acuoso se colocó en un vaso de precipitado y se mantuvo en
26
refrigeración (El tejido algal remanente se mantuvo en refrigeración para utilizarse
posteriormente en la obtención de extractos a temperatura de 80ºC). El tejido algal
se sometió a extracción tres veces más, en cada ciclo se le agregó .45 L de agua
destilada con el mismo tiempo de agitación y realizando la filtración simple (Figura
3).
Los extractos acuosos que se obtuvieron de las filtraciones, se
centrifugaron por 20 min a máxima velocidad 2500 rpm, para eliminar sedimentos
y restos del tejido algal. El sobrenadante fue precipitado con 2 volúmenes de
etanol al 100%, se mantuvo en reposo por 12 hrs. El material precipitado obtenido
fue recuperado por centrifugación, se colocó en una caja de Petri y fue secado a
una temperatura de 50 °C en una estufa eléctrica (MAPSA Mod.334) a 50°C.
El extracto de cada alga totalmente seco se colocó en un vial previamente
pesado y etiquetado con su clave correspondiente: Codium simulans (06-010-60),
Codium cuneatum (06-011-60), Codium amplivisiculatum (06-012-60) y Codium
fragile (10-002-60), los extractos secos se almacenaron en refrigeración para
posteriormente realizar una segunda extracción.
6.3. Obtención de extractos crudos a temperatura de 80ºC
Al tejido algal remanente almacenado se le añadió 0.6 L de agua destilada a
80°C, con agitación constante por 2 hrs, al concluir el tiempo el extracto se filtró
con una tela de algodón para remover el tejido algal (Figura 4). Se realizó tres
veces el mismo procedimiento y para cada muestra. Cada extracto se clarificó con
ayuda de una centrifuga por 20 minutos a máxima velocidad.
27
100 g de Alga
Figura 3. Esquema del proceso de obtención de los extractos de cada muestra de Codium ssp. a
temperatura de 27°C.
Extracción con agitación constante 2hrs a 27°C
Tejido Filtrado
Tejido Filtrado
Tejido Filtrado 2 80°C (pág. 29)
Insoluble Sobrenadante
Precipitación, centrifugación
Sobrenadante Precipitado Sólido-seco
Segunda Extracción, Re suspendió en H2O
Centrifugación
Insoluble Sobrenadante
Precipitación,
centrifugación
Sobrenadante Precipitado Solido-seco
28
Las soluciones clarificadas se precipitaron agregando el doble de su
volumen de etanol, se dejaron reposar por 12 hrs en refrigeración. Posteriormente
se separó el material precipitado y se colocó en la centrifuga por 20 min a máxima
velocidad. El material obtenido se colocó en una estufa a 50ºC. Al quedar
completamente seco se colocó en un vial previamente pesado y etiquetado.
Los extractos obtenidos a temperatura de 80ºC se etiquetaron con su clave
correspondiente de la siguiente manera: Codium simulans (06-010-61), Codium
cuneatum (06-011-61), Codium amplivisiculatum (06-012-61) y Codium fragile (10-
002-61).
Se realizó una segunda extracción a los extractos crudos, cada uno de los
sólidos secos obtenidos a 25ºC y 80ºC se re-suspendieron en 0.3 L de agua
destilada con agitación contante para diluir el sólido. Se clarificó en una centrifuga
y después se agregó 2 volúmenes de etanol, para precipitar. El material del
precipitado se colocó en una estufa a una temperatura de 50ºC para obtener los
sólidos secos. Para cada procedimiento se registró el peso de cada extracto
completamente seco y se mantuvieron en refrigeración, hasta el momento de su
uso.
29
Figura 4. Esquema del proceso de obtención de los extractos de cada muestra de Codium ssp. a
temperatura de 80°C.
Extracción con agitación constante 2hrs a 80°C
Filtración
Tejido Filtrado
Filtración
Filtrado Tejido Se desechó
Insoluble Sobrenadante
Sobrenadante Precipitado Sólido-seco
Segunda Extracción, Re suspendió en H2O a 80°C
Centrifugación
Insoluble Sobrenadante
Precipitación-
centrifugación
Sobrenadante Precipitado Solido-seco
Precipitación,
Centrifugación
2 Tejido 2
30
6.4. Fraccionamiento de los extractos crudos por intercambio iónico
Para realizar el fraccionamiento de cada extracto, se disolvió 3.2 g de cada
extracto en 0.2 L de agua destilada con agitación constante por 2hrs. Los 3.2 g de
extracto de alga se colocaron en una columna de cromatografía empacada con 32
g de dietilaminoetil-celulosa Whatman (DEAE-celulosa), suspendida en 150 mL de
agua destilada, para la columna se utilizó 0.4 L de solución acuosa de cloruro de
sodio (NaCl) como eluyente a gradiente de concentración (0.5, 1.0 y 2.0 M). Las
fracciones se recabaron en matraces Erlenmeyer. Al obtener todas las fracciones
fueron precipitadas con 2 volúmenes de etanol, el precipitado obtenido se dejó
reposar por 12 horas a -20°C. Posteriormente se recuperó el material precipitado y
se secó en un horno a 50ºC. Cada extracto seco se colocó en su vial
correspondiente, previamente etiquetado.
6.5. Ensayos de actividad anticoagulante
Para realizar los bioensayos de actividad anticoagulante se procedió a
preparar soluciones stock de cada uno de los extractos crudos y fracciones,
primeramente se colocaron 10 mg de cada extracto en un vial previamente
etiquetado para cada muestra, se añadió 1mL de agua destilada con agitación
constante y posteriormente se utilizó un sonicador (BRANSON 1210) para esparcir
las partículas del extracto y obtener una mezcla completamente disuelta.
Para los ensayos de actividad anticoagulante in vitro se realizaron pruebas
de tiempo de protrombina (TP) y de tiempo de tromboplastina parcial activada
(TTPA). En estos ensayos se utilizó plasma sanguíneo humano de donantes
31
sanos. La sangre se obtuvo por venopunción y se mezcló con una solución de
citrato de sodio al 3.5% en proporción de 9 a 1 (v/v). Posteriormente se centrifugo
a 1700 x g por 10 min para remover el paquete celular y obtener el plasma, el cual
se mantuvo en refrigeración a -18ºC hasta el momento de realizar el ensayo.
El ensayo (TP) se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se
colocó 10 µL de extracto y 100µL de plasma citrado, se mezclaron
cuidadosamente y se incubó a 37ºC por un min, después del tiempo de incubación
se agregaron 200 µL del reactivo TriniCLOT PT Excel que es un reactivo de
tromboplastina tisular que se utiliza en el análisis para la determinación del tiempo
de protrombina (previamente incubado por 1 min a 37ºC). Al momento de agregar
el reactivo se activó el cronometro, para medir el tiempo de formación de coagulo.
Para el ensayo tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) se realizó
bajo las instrucciones indicadas por el fabricante del reactivo TriniCLOT
Automated APPT. Primeramente se incubó un volumen suficiente de cloruro de
calcio al 0.025 M/L a 37ºC. Después se colocó 0.1 mL de plasma y se añadió 0.1
mL del reactivo APTT, esta mezcla se incubó por 5 min. Al término de la
incubación inmediatamente se agregó 0.1 mL de la solución de CaCl2 al 0.025 M.
Simultáneamente se accionó el cronometro para medir el tiempo de la formación
del coagulo.
Los bioensayos se realizaron a cada extracto por duplicado. Se llevó registro
de los segundos transcurridos hasta la formación del coagulo, para cada ensayo.
32
Con los datos obtenidos y replicas correspondientes en cada bioensayo, se realizó
un promedio de tiempo de coagulación y desviación estándar (Tabla I).
6.6. Purificación de extractos por tamizado molecular
Se realizó cromatografía en columna empacada con gel Sephadex G75,
para purificar 0.422 g de la fracción 06-010-60 con NaCl al 0.5 M la cual se
disolvió en 0.015 L de agua destilada y fue estabilizada con agua destilada.
Posteriormente la muestra fue colocada en la columna y se utilizó agua destilada
como eluyente. El flujo de la columna se recabo en tubos de ensaye previamente
enumerados. Finalmente, a cada uno de los tubos se les analizó el contenido de
azucares totales.
6.7. Análisis del contenido de azucares totales por el método Dubois
Se realizó el ensayo de fenol y ácido sulfúrico para la cuantificación de
azucares totales por el método Dubois et al. (1956) posteriormente los tubos de
ensaye se colocaron 10 min en oscuridad y se colocaron en un espectrómetro a
una transmitancia 490 nm. Al obtener la lectura, se analizaron y se decidió unir los
tubos de transmitancia similar, posteriormente se precipitó agregando 5
volúmenes de etanol al 100% y se dejaron reposar por 24 hrs. Posteriormente
cada precipitado se concentró a presión reducida en un rotavapor (Yamato
RE500) a temperatura de 40ºC y a una presión de 25 rpm.
El concentrado seco se colocó en un vial previamente pesado y etiquetado
con su clave correspondiente. A las fracciones del tamizado molecular se les
33
realizó los bioensayos de actividad anticoagulante, los datos fueron registrados
para posteriormente comparar y determinar cuál es la fracción más activa.
6.8. Espectroscopia de infrarrojo (IR)
Los espectros de IR se realizaron a todos los extractos y fracciones
obtenidos de cada especie. Estas muestras completamente secas y pulverizadas
se colocaron en el espectrofotómetro de infrarrojo (FTIR-Modelo Spectrum Two™
PerkinElmer), los espectros se registraron entre 4000 y 250 cm-1. Primeramente se
realizó una corrección del ruido de fondo. Posteriormente, para asegurar un buen
contacto entre la muestra y el cristal de diamante se utilizó el aditamento tipo
prensa, el cual siempre se mantuvo fijo para ejercer la presión necesaria.
Al obtener los espectros obtenidos se les corrigió la línea base y se
normalizaron utilizando el software Spectrum de Perkin-Elmer. Los espectros de
infrarrojo se registraron y analizaron con espectros existentes en literatura sobre
Codium o de algas verdes.
6.9. Procesamiento de datos
Con los datos obtenidos de los bioensayos realizados a cada uno de los
extractos, se realizaron los análisis estadísticos correspondientes, primeramente
se realizaron los análisis a priori de los datos de coagulación esto para conocer si
cumplían con los supuestos de normalidad y homocedasticidad, una vez obtenido
se procedió a realizar análisis de varianza para determinar diferencias
estadísticamente significativas entre los tiempos de coagulación de todos los
extractos con respecto al tiempo control de coagulación para cada ensayo, y
34
finalmente se realizó prueba Tukey para obtener la diferencia estadística entre los
tiempos de coagulación de cada especie.
7. RESULTADOS
Obtención de Extractos crudos de Codium
De los extractos obtenidos a temperatura de 25°C el extracto de Codium
amplivesciculatum fue el que resultó con mayor rendimiento en la extracción,
mientras que C. fragile presentó menor cantidad. Sin embargo en la extracción del
tejido algal remanente a temperatura de 80°C, la especie con mayor rendimiento
fue C. simulans y de menor cantidad fue C. fragile (Tabla I).
Tabla I. Rendimiento porcentual de los extractos crudos obtenidos a temperatura
de 25°C y 80°C
Alga Rendimiento de
extracción a 25°C en
gramos
Rendimiento de
extracción a 80°C en
gramos
C. cuneatum 20.97 0.68
C. simulans 18.80 2.29
C. amplivesciculatum 22.21 0.68
C. fragile 4.005 0.64
Fraccionamiento de los extractos crudos por intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico permitió la separación o purificación
de polisacáridos ácidos basándose en la retención de los grupos cargados
35
negativamente por parte de grupos catiónicos que se encuentran unidos
covalentemente a un soporte (Matsuhiro, 1995). La técnica de purificación por
medio de cromatografía por intercambio iónico se llevó a cabo para los 4 extractos
crudos obtenidos con mayor cantidad, los cuales fueron los extractos a 27°C.
Cabe mencionar que está técnica no se realizó a los extractos de 80°C debido al
escaso material obtenido de cada muestra, por lo tanto se decidió solo evaluar su
actividad anticoagulante.
Para la cromatografía de intercambio iónico, se obtuvo un total de 9
fracciones a diferentes concentraciones de NaCl. Al precipitar las fracciones,
algunas mostraron mayor o menor cantidad de material, sin embargo en algunas
muestras no se observó ningún material precipitado, como se muestra en la Tabla
II donde se describe la cantidad obtenida de las fracciones recabadas por
cromatografía de intercambio iónico empacada con DEAE-celulosa utilizando NaCl
en gradiente como eluyente.
36
Tabla II. Rendimiento porcentual de las fracciones obtenidas por el método de
cromatografía de intercambio iónico a partir de los extractos acuosos a 27°C de C.
cuneatum (06-011-60), C. amplivesciculatum (06-012-60), C. simulans (06-010-60)
y C. fragile (10-002-60).
Eluyente
Clave y rendimiento de las fracciones en gramos
06-011-60 06-012-60 06-010-60 10-002-60
H2O destilada 0.91 0.65 0.18 0.05
NaCl al 0.5M 0.075 0.09 0.80 0.53
NaCl al 1M NP NP NP 0.66
NaCl al 2M NP NP NP NP
*NP= No presentó material precipitado
7.3. Ensayos de actividad anticoagulante
En los ensayos de actividad anticoagulante realizados a todos los extractos
y fracciones obtenidas, se observó que cada extracto mostró un efecto diferente
sobre el tiempo de coagulación para TP, observándose un aumento del tiempo de
coagulación en comparación con el ensayo control. El extracto que resultó con un
tiempo menor al control (13.5 s) en la formación del coagulo para el ensayo TP fue
el extracto de C. fragile con un tiempo de 12 s, sin embargo para este mismo
ensayo el extracto que aumentó el tiempo de la formación del coagulo en el
plasma fue el obtenido a partir de C. simulans a 80°C (06-010-61) el cual mostró
un tiempo de 85.5 segundos (Figura 5).
37
Figura 5. Efecto de los extractos crudos obtenidos a 25°C y 80ºC en el ensayo de tiempo de
protrombina.
Lo obtenido para el ensayo TTPA, un tiempo control de 37 segundos,
posteriormente al someter cada una de las muestras a este bioensayo el extracto
con mayor efecto fue C. simulans retardando la coagulación del plasma a 83.4
segundos y para este ensayo C. fragile resultó el extracto con menor actividad con
un tiempo de 38 segundos (Figura 6). En los ensayos de actividad anticoagulante
(TP y TTPA) para las fracciones obtenidas por intercambio iónico, se observó en el
ensayo de TP que las fracciones mostraron un aumento en el tiempo de
coagulación, destacando la fracción de Codium simulans con NaCl al 0.5 M ya que
mostró mayor efecto con un tiempo de coagulación de 269.5 s (Figura 7). Para el
ensayo TTPA, la fracción que mostró mayor efecto fue nuevamente la fracción de
C. simulans con NaCl al 0.5 M, retardando la coagulación a los 200 segundos, la
cual solo mostró la formación de micro-fibras en el plasma contenido en el tubo de
ensayo (Figura 8).
0 20 40 60 80 100
06-010-60
06-011-60
06-012-60
10-002-60
06-010-61
06-011-61
10-002-61
06-012-61
Control
Tiempo de coagulación (TP en segundos)
Ex
trac
tos
cru
do
s
38
Figura 6. Efecto de los extractos crudos obtenidos a 25°C y 80°C en el ensayo de tiempo de
tromboplastina parcial activada.
Al observar los resultados de los ensayos de actividad anticoagulante de las
muestras, se eligieron a los extractos y fracciones de mayor actividad en los
ensayos, esto para evaluar la relación entre su concentración y el efecto de la
muestra en cada ensayo, la cual consistió en preparar las muestras a menores
concentraciones, con el fin de observar la mínima concentración necesaria para
inhibir la coagulación.
0 20 40 60 80 100
control
06-010-60
06-011-60
06-012-60
10-002-60
06-010-61
06-011-61
10-002-61
06-012-61
Tiempo de coagulación (TTPA en segundos)
Ex
trac
tos
cru
do
s
39
Figura 7. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio iónico en el ensayo
de tiempo de protrombina.
Figura 8. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio iónico en el ensayo
de tiempo de tromboplastina parcial activada.
La fracción de C. simulans con NaCl al 0.5 M a una concentración 322.58
mg/µl en la celda, mostró un aumento en el efecto del tiempo de coagulación en el
0 50 100 150 200 250 300
F10-002-60-0.5 M
F10-002-60-H2O
F10-002-60-1M
F06-010-60-H2O
F06-010-60-0.5 M
F06-011-60-H2O
F06-011-60-0.5M
F06-012-60-H2O
F06-012-60-0.5M
Control
Tiempo de Coagulación ( TP en segundos)
Fra
cc
ion
es
0 50 100 150 200
F10-002-60-0.5 M
F10-002-60-H2O
F10-002-60-1M
F06-010-60-H2O
F06-010-60-0.5 M
F06-011-60-H2O
F06-011-60-0.5M
F06-012-60-H2O
F06-012-60-0.5M
Control
Tiempo de coagulacion (TTPA en segundos)
Fra
cc
ion
es
40
ensayo de TP, mientras que a una concentración de 10.16 mg/µl el extracto sigue
mostrando un efecto retardando el tiempo de formación del coagulo (Figura 9).
Al realizar la comparación de los extractos de mayor actividad con el tiempo
de coagulación del fármaco heparina, se observó que el tiempo de coagulación
sigue siendo mayor con el fármaco heparina que con los extractos algales.
Figura 9. Relación entre la concentración y el efecto (dosis-efecto) de la actividad anticoagulante
de los extractos y fracciones en el ensayo de tiempo de protrombina.
Con los extractos secos y fracciones que mostraron mayor actividad
también se evaluó la relación entre la concentración y el efecto de la muestra
activa para el bioensayo de actividad anticoagulante TTPA, esto con el fin de
conocer la concentración mínima a la que el extracto refleja algún efecto sobre el
tiempo de coagulación en la vía intrínseca. En la cual, se obtuvo que la fracción de
C. simulans 06-010-60 con NaCl al 0.5 M tiende a incrementar el doble tiempo de
coagulación en el ensayo de TTPA con la concentración de 161.29 μg/mL en la
celda de reacción (Figura 10), sin embargo a una mínima concentración de 20.16
0
50
100
150
200
250
0 100 200 300 400Tie
mp
o d
e c
oa
gu
lac
ion
(s
)
Concentración (μg/mL)
Fracción 06-010-60 conNaClExtracto 06-010-60
Extracto 06-010-61
41
μg/mL sigue observándose un mínimo efecto, ya que el tiempo de coagulación
sanguínea sobrepasa el tiempo control de 37 segundos.
Figura 10. Relación entre la concentración y el efecto de la actividad anticoagulante de los
extractos y fracciones en el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada.
7.4. Purificación de extractos por cromatografía de tamizado molecular
El extracto más activo C. simulans fue fraccionado por el método en
columna de tamizado molecular por medio de filtración de gel sobre Sephadex G-
75 utilizando agua destilada como eluyente. El perfil de fraccionamiento mediante
la concentración relativa de azucares totales. Como se puede observar, se
recabaron un total de 75 tubos de ensayo conteniendo alrededor de 15 mL en
cada tubo. Posteriormente se unieron los tubos con transmitancia similar que en
total se obtuvieron 14 fracciones (Figura 11).
0
50
100
150
200
250
0 100 200 300 400
Tie
mp
o d
e c
oag
ula
ció
n
(s)
Concentración del extracto µg mL -1
06-010-60
Fracción 06-010-60con NaCl al 0.5M
06-010-61
42
Al evaluar la actividad anticoagulante (TP y TTPA) de las fracciones
obtenidas por el método de tamizado molecular, para el ensayo de TP se obtuvo la
fracción cinco como la muestra con mayor actividad, debido a que mostró un
tiempo de coagulación de 257 s (Figura 12). Para el ensayo TTPA la fracción que
mostró mayor efecto fue la fracción cuatro con un tiempo de coagulación de 213 s
(Figura 13).
Posteriormente al evaluar la relación entre la concentración y el efecto del
extracto sobre el tiempo de coagulación, se observó la concentración mínima para
retrasar la formación del coagulo, dicho tiempo igualó al de coagulación control a
una concentración mínima de 19.55 μg/mL en la celda, sin embargo con una
concentración 78.22 μg/mL se observa el doble del tiempo control (Figura 14 y
Figura 15).
Figura 11. Perfil de fraccionamiento del extracto C. simulans en columna de tamizado molecular
determinado por concentración relativa de azucares totales.
43
Figura 12. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de tamizado molecular en el
ensayo de tiempo de protrombina.
Figura 13. Efecto de las fracciones obtenidas por cromatografía de tamizado molecular en el
ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada.
0 50 100 150 200 250 300
1
2
3
4
5
6
7
8
Tiempo de coagulación (TP en segundos)
Frac
cio
ne
s
0 50 100 150 200 250
1
2
3
4
5
6
7
8
Tiempo de coagulación (TTPA en segundos)
Fra
ccio
ne
s
44
Figura 14. Relación entre la concentración y el efecto de la actividad anticoagulante de las
fracciones activas obtenidas por cromatografía de tamizado molecular en el ensayo de tiempo de
protrombina
Figura 15. Relación entre la concentración y el efecto de la actividad anticoagulante de la
fraccione activa obtenida por cromatografía de tamizado molecular en el ensayo de tiempo de
tromboplastina parcial activada.
Al obtener los resultados de coagulación se procedió a calcular el coeficiente
de coagulación, el cual se define como la relación entre el tiempo de coagulación
0
50
100
150
200
250
300
0 100 200 300 400
Tie
mp
o d
e c
oa
gu
lac
ión
(s
)
Concentración de la muestra
Fraccion 5
Fracción 4
Control: 12s
0102030405060708090
100
0 100 200 300 400
Tie
mp
o d
e c
oag
ula
ció
n (
s)
Concentración de la muestra
Control: 35 s
45
de cada muestra de alga ensayada entre el tiempo control para cada uno de los
ensayos como se muestra en la Tabla III. Sin embargo la fracción a partir de C.
simulans con NaCl al 0.5 y la fracción 5 obtenida por sephadex gel fueron las que
mostraron un alto coeficiente de coagulación.
Tabla III. Coeficiente de coagulación en los ensayos de coagulación en relación
con el tiempo control de las muestras obtenidas (27°C y 80°C) a partir de
extractos de las algas C. cuneatum (06-011), C. amplivesciculatum (06-012), C.
simulans (06-010) y C.fragile (10-002).
Alga Temperatura de
extracción Concentración TP TTPA
06-012-61 80°C 322.58 2.4 1.08
10-002-61 80°C 335.48 2.48 1.04
06-011-61 80°C 325.80 2.88 1.17
06-010-61 80°C 329.03 6.33 2.28
10-002-60 27°C 335.48 0.8 1.46
06-012-60 27°C 332.25 1.4 1.5
06-011-60 27°C 329.03 1.1 1.46
06-010-60 27°C 322.58 2.59 1.75
46
Tabla IV. Coeficiente de coagulación en los ensayos de coagulación en relación
con el tiempo control de las fracciones.
Alga Fracción Concentración
(mg mL-1) TP TTPA
C. cuneatum Fracción con H2O dest. 322.58 1.04 1.00
Fracción con NaCl 0.5 M 329.03 3.26 1.23
C. amplivesciculatum Fracción con H2O dest. 338.70 1.59 1.00
Fracción con NaCl 0.5 M 322.58 2.48 1.22
C. simulans Fracción con H2O 348.38 1.07 0.78
Fracción con NaCl 0.5 M 335.48 19.96 5.05
C. fragile
Fracción con H2O 348.38 1.07 1.12
Fracción con NaCl 0.5 M 338.70 1.48 1.01
Fracción con NaCl 1 M 348.38 1.04 1.16
Espectroscopia de infrarrojo (IR)
La espectroscopia de infrarrojo (IR) de los extractos crudos y de las
fracciones de cromatografía de intercambio iónico de cada especie (Figuras 16,
17, 18 y 19) y fracciones del tamizado molecular (Figura 20) reveló la presencia
del grupo sulfato situados en las bandas de 820 a 1260 cm-1 que son derivados de
una vibración de la banda de C-O-S de sulfato en posición axial y una vibración
estrecha de sulfato, respectivamente. Las bandas en las absorbancias a 1220 cm-1
se atribuyen a la flexión de S = O los cuales fueron más claros en las fracciones
47
con Sephadex, por lo que se evidencia residuos de sulfato, sin embargo la zona
correspondiente a la “huella dactilar” de los polisacáridos es muy similar en todos
los espectros.
Los espectros de las muestras se encuentran dentro del intervalo 4000-400
cm-1 donde se muestran los rasgos característicos de los polisacáridos sulfatados,
los cuales mostraron un estiramiento en las señales de 3412 cm-1 que son
vibraciones del estiramiento de O-H y las señales 1100, 1091, 1088, 1078 son
vibraciones del grupo C-O (Zhang et al., 2008; Fernández, 2010), sin embargo
también se encontraron bandas de absorbancia más delgadas en 1020,1052 y
1190 cm-1, que corresponden a C-O-C, C-OH y C-C.
Figura 16. Espectro de infrarrojo correspondiente a los extractos obtenidos a 25°C a partir de
las cuatro especies de algas verdes
48
Figura 17. Espectro de infrarrojo correspondiente a los extractos obtenidos a 80°C de las cuatro
especies de algas verdes
Figura 18. Espectro de infrarrojo correspondiente a las fracciones obtenidas por intercambio
iónico.
49
Procesamiento de datos
Al analizar los datos obtenidos con la prueba de Kolmogorov-Smirnov y
Bartlett se obtuvieron datos normales y homogéneos, respectivamente.
Posteriormente al realizar el análisis de varianza, el cual se utilizó para encontrar
el efecto de cada extracto en el tiempo de coagulación con respecto al tiempo
control. Se encontró que los tiempos de coagulación de los extractos a diferentes
temperaturas (27°C y 80°C) de las cuatro especies pertenecientes al género
Codium son diferentes al tiempo control con una P<0.05, resultando extracto de la
especie C. simulans a 80°C y las fracciones obtenidas por intercambio iónico la
más eficiente al retardar con mayor tiempo la formación del coagulo en TP y
también en TTPA.
Figura 19. Espectro de IR correspondiente a las fracciones obtenidas en el método de tamizado
molecular
50
La fracción 4 obtenida por tamizado molecular fue la que mostró una
diferencia verdaderamente significativa con una P<0.05 entre los tiempos de
coagulación de todas las muestras sometidas a estos bioensayos. Los extractos y
fracciones de la especie C. fragile mostraron un menor efecto para TP, sin
embargo para TTPA se mostró con una actividad dentro del promedio de C.
cuneatum y C. amplivesciculatum.
8. DISCUSIÓN
Existen reportes de la actividad anticoagulante de extractos crudos y
fracciones purificadas obtenidas a partir de Chlorophytas de las cuales incluyen al
género Codium (Shanmugam et al., 2002; Ciancia et al., 2010), así como en el
presente estudio en el cual se evaluó la eficacia anticoagulante de cuatro extractos
obtenidos a partir de C. simulans, C. amplivesciculatum, C. cuneatum y C. fragile a
diferente temperatura (27°C y 80ºC), los cuales mostraron poca actividad en los
ensayos de coagulación (TP y TTPA). De estos extractos, C. simulans a 80°C
mostró actividad aumentando 6.5 veces el tiempo control (13 s) para el ensayo TP.
Aun con el bajo efecto mostrado por los extractos crudos a temperatura de
25ºC no se descartó su actividad biológica, de tal manera que se decidió
fraccionar estas muestras por medio de técnicas de cromatografía, con el fin de
obtener muestras libres de impurezas. Con lo cual, se obtuvo una fracción activa
de C. simulans por cromatografía de intercambio iónico con NaCl al 0.5 M quien
mostró efecto retardando la formación del coagulo con un tiempo de 269.5 s a una
concentración de 335 µg mL-1. Dada la alta actividad, la fracción fue purificada por
51
cromatografía de tamizado molecular, de la cual se obtuvo la fracción cinco quien
mostró efecto con un tiempo de 257 s.
Por lo tanto, de acuerdo con los resultados obtenidos, la actividad biológica
específicamente de la especie C. simulans es prometedora, debido a que el efecto
anticoagulante es superior con respecto a las distintas algas reportadas del género
Codium. Como en lo reportado por Shanmugam et al. (2000), los extractos fueron
obtenidos de diferentes partes de Codium dwarkense Børgesen 1947, los cuales
fueron sometidos al ensayo de TP, reportaron que los extractos provenientes del
gametangio fueron los más activos, con un coeficiente de coagulación 3.75 a la
concentración de 750 µg mL-1. Concluyen que la actividad se debía a la mayor
cantidad de polisacáridos sulfatados, concentrados en los gametangios. Sin
embargo en el presente estudio no fue posible definir en qué fase del ciclo de vida
fue encontrada al momento de extraer. No obstante, la fracción de C. simulans a
una concentración de 335 µg mL-1 presentó un coeficiente de coagulación de
19.96 unidades.
Consecuentemente, se observó un efecto anticoagulante a partir de C.
simulans, de tal forma que resultó directamente proporcional a la concentración en
ambos ensayos, es decir, el extracto inhibe la formación del coagulo con mayor
tiempo en la celda de reacción. Esto se puede constatar con lo reportado por Jurd
et al., (1995) en dicho trabajo se obtuvo y purificó un proteoglucano a partir de
Codium fragile ssp. atlanticum por cromatografía de intercambio iónico, donde la
actividad anticoagulante fue representativa al aumentar su concentración en los
52
ensayos de tiempo de trombina (TT), TTPA y TP, ya que el proteoglucano
presentó una relación mayor a 10 a la concentración de 125 µg mL-1. Los
resultados obtenidos en el presente estudio el extracto de C. fragile con respecto
al tiempo de coagulación mencionado en la literatura, resultó con menor actividad.
No obstante, la fracción de C. simulans (06-010-60 con NaCl al 0.5 M) resultó con
mayor efecto, la cual presentó una relación de 19.96 a la concentración de 335 µg
mL-1 para el ensayo TP.
Por otra parte, Athukorala et al., (2007) realizaron un estudio en el que
examinaron la actividad anticoagulante de extractos a partir de algas verdes y
pardas recolectadas en la Isla Jeju en Corea, en este estudio reportan a dichas
algas con actividad anticoagulante, entre ellas destacan al extracto de C. fragile
obtenido a 70ºC, la cual mostró un tiempo de 250 s para el ensayo de TTPA. Sin
embargo comparando los resultados con el presente trabajo, el extracto crudo de
C. fragile mostró un menor tiempo de coagulación (12 s), esta diferencia se puede
atribuir al método de extracción, debido a que Athukorala et al. (2007) realizó una
extracción enzimática a partir del alga, con dicha extracción obtuvo un mayor
efecto. Sin embargo al fraccionar el extracto en el presente trabajo se observó un
aumento del efecto anticoagulante con un tiempo de 35.75 s, no obstante no
sobrepasa el tiempo de la muestra anteriormente mencionada.
Existen reportes de otras especies de algas verdes las cuales ejercen su
acción anticoagulante a través de los polisacáridos sulfatados (Church et al. 1989),
por mencionar alguno, Zhang et al., (2008) extrajeron polisacáridos a partir del
53
alga verde Monostroma latissimum en agua caliente y purificado por cromatografía
de intercambio iónico y por exclusión de tamaño. La actividad anticoagulante de
los polisacáridos sulfatados fue evaluada en los ensayos de tiempo de TTPA, TT y
TP, usando plasma humano. Obtuvieron un tiempo de coagulación de 200 s a una
concentración de 200 µg/mL para TTPA y para TT un tiempo de 100 s a la
concentración de 200 µg/mL. Con sus resultados indican que el tamaño molecular
tiene un importante efecto sobre la actividad anticoagulante de los polisacáridos
obtenidos a partir de M. latissimum. Sin embargo, en el presente trabajo se obtuvo
que la fracción de C. simulans a esa concentración tiene un tiempo de coagulación
de 190.8 s. No obstante a una mayor concentración (335 µg mL-1) aumenta su
efecto con un tiempo de 269.4 s.
Con respecto a lo reportado en la literatura sobre las especies de Codium
evaluadas en México, se encontró a De Lara Isassi et al., (2004) reportaron 49
especies de macroalgas recolectadas en diversas localidades del Golfo de México
y el Caribe mexicano para identificar su actividad en la vía intrínseca y extrínseca
de coagulación de la sangre. Solo 4 de las 49 especies resultaron con actividad
semejante a la heparina, cabe destacar que el estudio incluyó a Codium simplex,
el cual mostró un tiempo de coagulación para TT de 42 s y para TP de 24s. Sin
embargo en el presente trabajo se obtuvo un mayor tiempo de coagulación la cual
fue a partir de la especie Codium simulans con 257 s.
Por su parte, Muñoz-Ochoa et al., (2009) reporta a las algas pertenecientes
al género Codium con alta actividad anticoagulante, específicamente a las
54
especies: Codium amplivesciculatum, Codium brandegeeii y Codium cuneatum,
sin embargo en el presente trabajo se evaluó la efectividad anticoagulante de las
especies C. cuneatum y C. amplivesciculatum, con lo cual se corroboro su
actividad, no obstante como ya se ha mencionado anteriormente la especie C.
simulans en este estudio resulto con mayor actividad.
Otro estudio realizado en México es el de Guerra- Rivas et al., (2011) en el
cual evaluaron el efecto anticoagulante de diferentes extractos provenientes de
macroalgas recolectadas en las costas de Ensenada, Baja California, entre los
cuales obtuvo el extracto etanólico a partir de C. fragile. Fue quien mostró menor
tiempo de coagulación en los bioensayos TP y TTPA, así también realizaron
extractos acuosos en agua fría y también a 70ºC; el efecto anticoagulante fue
diferencial ya que el extracto acuoso en agua fría inhibió por mayor tiempo la
formación del coagulo en el ensayo de TTPA por 28.85 s. Para el ensayo TP quien
mostró mayor tiempo fue el extracto a 80ºC con un tiempo de 8.68 s a una
concentración de 20µ mL-1. Con lo anterior, concluyen que los metabolitos con
efecto anticoagulante pueden ser obtenidos a bajas y altas temperaturas. No
obstante en el presente trabajo, el extracto de C. fragile a temperatura de 25ºC no
mostró efecto, sin embargo el extracto a 80ºC evaluado mostró un mayor efecto
con un tiempo de 33.5 s para TP y no hubo efecto en el ensayo de TTPA. Por lo
tanto, se observó que si existe una diferencia en la actividad debido al método de
extracción ya sea por la temperatura y por el disolvente empleado.
55
Con respecto a la caracterización química, se obtuvo el espectro de
infrarrojo de las fracciones activas obtenidas por intercambio iónico y tamizado
molecular de C. simulans se puede apreciar las bandas de absorción atribuidas a
la presencia de grupos sulfato situados en las bandas de 838 a 1260 cm-1que son
derivados de una vibración de la banda de C-O-S de sulfato en posición axial y
una vibración estrecha de sulfato, respectivamente. Las bandas en las
absorbancias a 1240 cm-1 se atribuyen a la flexión de S = O. Sin embargo, el
espectro de infrarrojo de la especie C. fragile con menor actividad no reveló la
presencia de dichas bandas pertenecientes al grupo sulfato (Figura 20).
Por otro lado lo observado en los espectros se puede constatar con lo
reportado por Estévez et al., (2009) ya que realizó un análisis de la composición
química de la pared celular de Codium en el cual también menciona que está
compuesta por heteropolisacaridos y por grupos sulfatos (Estévez et al., 2009).
Figura 20. Espectro de IR correspondiente a las fracciones con mayor y menor actividad
56
Así mismo, lo obtenido en los espectros de infrarrojo en este trabajo son similares
con lo descrito para algunas algas verdes como en lo reportado para Monostroma
(Zhang et al., 2008, Mao et al., 2009), Caulerpa racemosa (Ghosh et al., 2004),
Ulva conglobata (Mao et al., 2006) Enteromorpha linza (Qi et al., 2012), Codium
spp. y Udotea spp, ya que coinciden que las algas verdes mostraron un gran
potencial, así mismo que el grado de sulfatación y la estructura molecular de los
polisacáridos provenientes de las algas eran esenciales para la actividad
anticoagulante (Shanmugam y Mody, 2000).
Por lo tanto, la actividad biológica de los polisacáridos sulfatados, depende
de condiciones específicas de biosíntesis, estas condiciones están relacionadas
directamente con las necesidades fisiológicas particulares de las algas (Matsubara
et al., 2000). De manera que la actividad anticoagulante es dependiente en gran
medida de la composición de azúcares, contenido de sulfato, posición de sulfato y
el peso molecular del compuesto (Shanmugam y Mody, 2000). Además la
actividad se puede atribuir a la composición de los polisacáridos de las algas ya
que varía según la especie, el procedimiento de extracción, las condiciones
climáticas (Silva et al., 2005) y diferentes técnicas se han utilizado para extraer
compuestos anticoagulantes a partir de algas marinas (Shanmugam y Mody,
2000).
9. CONCLUSIONES
Los extractos y fracciones obtenidos a partir de las especies del género
Codium mostraron actividad anticoagulante. Sin embargo, la fracción de Codium
57
simulans (06-010-60 con NaCl al 0.5 M) mostró un mayor efecto retardando con
mayor tiempo la formación del coagulo en el plasma sanguíneo. Por lo tanto
Codium simulans posee un potencial como fuente de polisacáridos con actividad
anticoagulante. Se concluye que la actividad anticoagulante de las fracciones es
proporcional a la concentración del extracto así mismo existe una relación con la
presencia de grupos sulfatos con lo observado en los espectros.
Con respecto a la comparación con la heparina, la actividad anticoagulante
del extracto más activo no sobrepaso el tiempo del fármaco. Sin embargo no se
descarta su actividad debido a que la mayor parte de extractos y fracciones
doblaron el tiempo control de coagulación.
10. RECOMENDACIONES
Se recomienda ampliar el presente estudio integrando un análisis de la
variación estacional y además del ciclo de vida, ya que varios autores mencionan
que estos son parámetros que influyen principalmente en la producción de
polisacáridos. Así mismo, se platea dar seguimiento a la purificación de los
extractos crudos y fracciones, para posteriormente realizar ensayos de
coagulación con muestras más pura así mismo con esto sea posible identificar y
caracterizar la conformación estructural del compuesto que actúa sobre la cascada
de coagulación.
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