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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA
División: Ciencias Biológicas y de la Salud Grado académico: Licenciatura Carrera: Biología Experimental Título del trabajo: Análisis de asociación de SNPs del gen FcRL3 en pacientes
pediátricos mexicanos con artritis reumatoide juvenil
Nombre del alumno: García Díaz Erika Cecilia Nombre del asesor: Dr. José Luis Gómez Olivares
Firma México D. F., a 31 de Mayo del 2007
“Análisis de asociación de SNPs del gen FcRL3
en pacientes pediátricos mexicanos con
artritis reumatoide juvenil”
T E S I N A
PARA OBTENER EL GRADO DE:
L I C E N C I A D A E N B I O L O G Í A E X P E R I M E N T A L
P R E S E N T A
Erika Cecilia García Díaz
Asesor externo: Asesor interno: M. en C. Julian Ramírez Bello Dr. José Luis Gómez Olivares
México D. F. Mayo 2007
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
IZTAPALAPA
i
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Genómica Enfermedades
Multifactoriales del Instituto Nacional de Medicina Genómica, (INMEGEN)
de la Secretaría de Salud (SS), en colaboración con los Hospitales Centro
Médico Nacional Siglo XXI, Hospital Infantil de México, Centro Médico la
Raza y el Instituto Nacional de Pediatría, bajo la dirección general de la Dra.
Lorena Orozco Orozco Investigadora del INMEGEN, además de la asesoría
del M. en C. Julian Ramírez Bello egresado de la Universidad Autónoma de
la Ciudad de México (UACM) y al Dr. José Luis Gómez Olivares, Profesor
de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa (UAMI).
ii
DEDICADO A:
Hola Mamá se que estás en el mejor lugar, pues antes de llegar, yo
estaba ahí. Lo que las dos no sabíamos es que cambiaríamos nuestro
lugar.
Muchas gracias por ser instrumento de Dios y permitirme vivir es uno
de los regalos que me diste.
Quiero darle gracias a Dios por permitirme ser tu hija, pues 9 meses
estuvimos muy unidas y aunque físicamente no te tengo siempre te
siento muy cerca de mí.
Te agradezco infinitamente y aunque te hayas ido demasiado pronto,
siempre fuiste el respaldo para seguir adelante con mis estudios
universitarios, a ti te debo gran parte de lo que soy en todos los
aspectos.
Gracias por haberme dado lo mejor de tu existencia: tu amor y
dedicación; y por ser un gran ejemplo de seguir adelante sin importar
las barreas que se tengan que librar. Gracias por estar hoy en mi
corazón.
Espero que algún día la vida y la muerte me permitan volver a verte
y así poder decirte cuanto de amo.
Con todo mi amor, tu hija Erika.
iii
AGRADECIMIENTOS Mucha gente cercana a mí participó de diferentes maneras en el proceso de
esta Investigación. En el aspecto académico fue indispensable el apoyo de mis
dos asesores de proyecto: el M en C. Julian Ramírez Bello y el Dr. José Luis
Gómez Olivares, quienes trataron por todos los medios de que la investigación
se concluyera de la mejor manera posible, así que todos los errores que el
lector encuentre a lo largo del manuscrito son mi responsabilidad.
En términos institucionales fue básico el apoyo del Instituto Nacional de
Medicina Genómica (INMEGEN) y de la Universidad Autónoma
Metropolitana-Iztapalapa.
A la llegada al INMEGEN, fui muy bien recibida por la Dra. Lorena Orozco, a
quien doy gracias por brindarme su tiempo y compartir conmigo su gran
experiencia.
En el trabajo de laboratorio, agradezco infinitamente a Julián, Emilio, Federico,
Humberto, Rafael, Yolanda, Guadalupe y Silvia que me proporcionaron su
ayuda de manera libre y desinteresada.
Mis cinco queridos hermanos Claudia, Chelo, Juan, Javier y Julio ayudaron a
que sostuviera el ánimo y la entereza durante mi larga estancia en la
Universidad. Con especial cariño agradezco mucho la presencia permanente
de mi hermana Claudia, quien estuvo conmigo de diferentes maneras a lo
iv
largo de todo este proceso. Mi otra hermana, Chelo, me acompañó también en
diversos aspectos.
A mis amigos que son la red básica e indispensable para la sobrevivencia
cotidiana dentro y fuera de la Universidad. En la estancia en la Universidad,
Carlos, Yolanda, Emilio, Ingrid, Gina, Humberto y Candy fueron mi segunda
familia.
El apoyo de todos ellos fue pieza clave en diferentes momentos para que
pudiera concluir ésta tesina de licenciatura.
A todos ustedes, un profundo y sincero agradecimiento por estar presentes y
ser parte de mi vida.
v
ÍNDICE
PÁGINA
DEDICATORIA ---------------------------------------------------------------
ii
AGRADECIMIENTOS -----------------------------------------------------
iii
ABREVIATURAS ------------------------------------------------------------
ix
LISTA DE FIGURAS --------------------------------------------------------
xiii
LISTA DE TABLAS ----------------------------------------------------------
xiv
1. INTRODUCCIÓN -------------------------------------------------------
1
1.1 Clasificación de la artritis reumatoide juvenil -------------
1
1.2 El Colegio Americano de Reumatología --------------------
2
1.3 Clasificación de Colegio Americano de Reumatología -------------------------------------------------------------
3
1.4 Características clínicas ---------------------------------------------
6
1.5 Etiología de la ARJ ------------------------------------------------
7
1.6 La artritis reumatoide como enfermedad autoinmune ----------------------------------------------------------------
8
1.7 Artritis reumatoide y autoinmunidad -----------------------
12
1.8 La ARJ como ejemplo de enfermedad compleja o multifactorial ------------------------------------------------
19
1.9 Componente genético en la ARJ -------------------------------
20
vi
1.10 Estudios que evidencian la participación de los factores genéticos en la ARJ ------------------------------------
22
1.11 Estrategias para el estudio de genes involucrados en enfermedades ---------------------------------------
24
1.12 Estudios de asociación alélica --------------------------------
25
1.13 Causas de asociación -------------------------------------------
27
1.14 El genoma humano y los estudios de asociación --------
28
1.15 Importancia de los SNPs en los estudios genéticos -----
29
2. ANTECEDENTES -------------------------------------------------------
30
2.1 Función del gen FcRL3 -------------------------------------------
30
2.2 Gen FcRL3 -----------------------------------------------------------
32
2.3 Epidemiología molecular del gen FcRL3 --------------------
33
3. JUSTIFICACIÓN --------------------------------------------------------
35
4. OBJETIVOS ---------------------------------------------------------------
38
4.1 Objetivo general ---------------------------------------------------
38
4.2 Objetivos particulares -------------------------------------------
38
5. MATERIAL Y MÉTODOS --------------------------------------------
39
5.1 Diseño de estudio -------------------------------------------------
39
5.2 Población de estudio ---------------------------------------------
39
vii
5.2.1 Criterios de inclusión ------------------------------------
39
5.2.2 Criterios de exclusión ------------------------------------
29
5.3 Extracción de sangre periférica de casos y controles -----------------------------------------------------------------
40
5.4 Cuantificación del DNA -----------------------------------------
42
5.5 Diluciones del DNA de los casos y controles y producción de las placas de PCR para discriminación alélica ----------------------------------------------------
43
5.6 Discriminación alélica con el método fluorescente de 5’ exonucleasa (TaqMan) -------------------------
45
5.7 Análisis estadístico ------------------------------------------------
47
5.8 QUANTO. Software para calcular el tamaño de la muestra y poder estadístico ------------------------------------
47
5.9 FINETTI: programa de análisis de equilibrio de Hardy-Weinberg -----------------------------------------------------
48
5.10 EPI INFO VERSIÓN 3.3.2 Y EPIDAT VERSIÓN 3.1: programas para análisis de asociación ------------------------------
48
6 RESULTADOS -----------------------------------------------------------
50
6.1 Número de pacientes y controles analizados en este estudio ------------------------------------------------------------
50
6.2 Análisis del equilibrio de Hardy-Weinberg ----------------
50
6.3 Análisis de los SNPs - 169 T/C, - 110 G/A, 358 C/G y 1381 G/A del gen FcRL3 ---------------------------------
51
viii
7 DISCUSIÓN ----------------------------------------------------------------
63
8 CONCLUSIONES --------------------------------------------------------
67
9 CONSIDERACIONES ÉTICAS, LEGALES Y SOCIALES -------------------------------------------------------------------
68
10 ANEXO 1 -------------------------------------------------------------------
72
10.1 Detección del producto de PCR -----------------------------
72
10.2 Sondas TaqMan --------------------------------------------------
72
10.3 Detección de SNPs con sondas TaqMan -------------------
75
11 BIBLIOGRAFÍA ---------------------------------------------------------
77
ix
ABREVIATURAS
1q23.1 Brazo largo del cromosoma 1, banda 23.1
a.a Aminoácido
ACJ Artritis crónica juvenil
ACR Colegio americano de reumatología
AIJ Artritis idiomática juvenil
ANA Anticuerpos antinucleares
AR Artritis reumatoide
ARJ Artritis reumatoide juvenil
CPA Célula presentadora de antígenos
CPH Complejo principal de histocompatibilidad
DC
Gemelos dicigotos
DNA Ácido desoxirribonucleico
EAs Enfermedades autoinmunes
EDTA Ácido etilen-diaminotetracético
et al. Colaboradores
EULAR Liga europea contra el reumatismo
Fc Fracción cristalizable
x
FcRL3 Gen que codifica para la proteína parecida al receptor 3 de la fracción cristalizable de las inmunoglobulinas
FR Factor reumatoide
HLA Antígeno leucocitario humano
IC Intervalo de confianza
IgM Inmunoglobulina subtipo M
ILs Interleucinas
ILAR Liga internacional contra el reumatismo
ITAM
Motivo activador del inmunorreceptor de tirosina
ITIM
Motivo inhibidor del inmunorreceptor de tirosina
IκBs Inhibidores κB
IMSS Instituto Mexicano del Seguro Social
INMEGEN Instituto Nacional de Medicina Genómica
INFβ Interferón beta
INFγ Interferón gamma
INP Instituto Nacional de Pediatría
MC Gemelos monocigotos
MgCl2 Cloruro de magnesio
MIF Factor inhibidor de la migración de macrófagos
xi
ml Mililitro
NCBI Centro Nacional de Información Biotecnológica
NF-κB Factor nuclear kappa B
ng Nanogramos
NK Células natural killer
OR Odds ratio
p Probabilidad
pb
Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
QR
Quencher o apagador
R
Reportero
RCB Receptores de células B
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
r.p.m. Revoluciones por minuto
RR Riesgo relativo
TCR Receptor de células T
TDT Prueba de desequilibrio de transmisión
TGF-β Factor de crecimiento transformante beta
xii
TNFα Factor de necrosis tumoral alfa
SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida
SNPs Polimorfismos de un solo nucleótido
STRs Repeticiones cortas en tandem
UTR Región no traducida
VNTRs Repeticiones en tandem de número variable
ºC Grados centígrados
X2 Chi-cuadrada
λs Riesgo de recurrencia em hermanos
µl Microlitro
xiii
LISTA DE FIGURAS PÁGINA
Figura 1. Imagen que muestra el subtipo poliarticular ----------------
4
Figura 2. Imagen de un paciente con ARJ subtipo poliarticular -----
5
Figura 3. Imagen que representa el subtipo sistémico -----------------
5
Figura 4. Modelo de auto-perpetuación de los linfocitos B autorreactivos -----------------------------------------------------------------
13
Figura 5. Papel de los linfocitos T autorreactivos en la génesis de la autoinmunidad -------------------------------------------------
15
Figura 6. Papel regulador de los linfocitos T NK en autoinmunidad ------------------------------------------------------------------
16
Figura 7. Medio ambiente donde interaccionan células y moléculas del sistema inmune ---------------------------------------------
18
Figura 8. Posible función de la proteína FcRL3 -------------------------
31
Figura 9. Ubicación y representación esquemática del gen FcRL3 -------------------------------------------------------------------------
32
Figura 10. Elaboración de placas --------------------------------------------
44
Figura 11. Elaboración de placas hijas -------------------------------------
44
Figura 12. Producción de señal fluorescente mediante sondas TaqMan ------------------------------------------------------------------
74
Figura 13. Diagrama que muestra los genotipos de un SNP --------- 76
xiv
LISTA DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Clasificación de los tres sistemas para la artritis crónica en niños ---------------------------------------------------------------
2
Tabla 2. Características clínicas de los subtipos de artritis de acuerdo a los criterios del ACR ----------------------------------------
6
Tabla 3. Características de enfermedades multifactoriales --------
20
Tabla 4. SNP -169T/C (rs7528684) análisis del alelo menor en pacientes y controles en diferentes estudios -----------------------
34
Tabla 5. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del SNP -169 T/C (rs7528684) del gen FcRL3-------------------------------------------------------------------
52
Tabla 6. Comparación genotípica y alélica del SNP -169 T/C (rs7528684) del gen FcRL3 estratificados por sexo femenino en pacientes con ARJ y Controles -----------------------------------------
53
Tabla 7. Comparación genotípica y alélica del SNP -169 T/C (rs7528684) del gen FcRL3 estratificados por sexo masculino en pacientes con ARJ y Controles -----------------------------------------
54
Tabla 8. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del SNP -110 G/A (rs11264799) del gen FcRL3 ------------------------------------------------------------------
55
Tabla 9. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del SNP 358 G/C (rs945635) del gen FcRL3 ------------------------------------------------------------------
56
xv
Tabla 10. Comparación genotípica y alélica del SNP 358 G/C (rs945635) del gen FcRL3 estratificados por sexo femenino en pacientes con ARJ y Controles -----------------------------------------
57
Tabla 11. Comparación genotípica y alélica del SNP 358 G/C (rs945635) del gen FcRL3 estratificados por sexo masculino en pacientes con ARJ y Controles -----------------------------------------
58
Tabla 12. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del SNP 1381 G/A (rs3761959) del gen FcRL3 ------------------------------------------------------------------
59
Tabla 13. Comparación genotípica y alélica del SNP 1381 G/A (rs3761959) del gen FcRL3 estratificados por sexo femenino en pacientes con ARJ y Controles -----------------------------------------
60
Tabla 14. Comparación genotípica y alélica del SNP 1381 G/A (rs3761959) del gen FcRL3 estratificados por sexo masculino en pacientes con ARJ y Controles -----------------------------------------
61
Tabla 15. Haplotipos del gen FcRL3 --------------------------------------
62
1
1. INTRODUCCIÓN
La artritis reumatoide juvenil (ARJ) es una enfermedad crónica de la infancia
que se caracteriza principalmente por inflamación persistente de las
articulaciones durante al menos seis semanas. Conforme la enfermedad
avanza se van destruyendo progresivamente debido a procesos inflamatorios,
esta enfermedad puede presentar un rango de variabilidad que puede ir desde
formas muy leves hasta muy graves, hasta llegar al grado de impedir el
movimiento, entre las características clínicas se acompaña de dolor, hinchazón
y rigidez (Goldring, 2003). Los datos más recientes indican que la ARJ tiene
una ocurrencia de 5 – 18 casos y una prevalencia de aproximadamente 30 –
150 casos por cada 100,000 niños menores a 16 años (Gare, 1999), esto es,
aproximadamente se afecta 1 por cada 1,000 niños (Wilkinson, et al. 2003;
Phelan, et al. 2006).
1.1 Clasificación de la artritis reumatoide juvenil
Actualmente existen tres sistemas para clasificar a la artritis crónica en niños
menores de 16 años con artritis reumatoide crónica: el Colegio Americano de
Reumatología (ARC) la define como ARJ (Brever, et al. 1977); la Asociación
Europea Contra el Reumatismo (EULAR) como artritis crónica juvenil (ACJ) y
la Asociación Internacional Contra el Reumatismo (ILAR) como artritis
idiopática juvenil (AIJ) (Tabla 1) (Petty, et al. 1998).
2
Tabla 1. Clasificación de los tres sistemas para la artritis crónica en niños. ACR (1977) ARJ EULAR (1978) ACJ ILAR (1997) AIJ
Sistémica Sistémica Sistémica
Poliarticular Poliarticular Poliarticular FR-negativo
JRA Poliarticular FR-positivo
Oligoarticular Oligoarticular Oligoarticular: persistente
Extendida
Psoriásica juvenil Psoriásica
Entesitis
Otras
Según diferentes consensos sobre la clasificación de la artritis crónica juvenil
es posible emplear cualquiera de las tres formas de clasificación de la artritis
infantil crónica.
1.2 El Colegio Americano de Reumatología
La propuesta del ACR es un excelente criterio de clasificación de la ARJ, éste
la define como artritis juvenil persistente en una o más articulaciones no
menor a seis semanas, los subtipos de la enfermedad son definidos por los
síntomas clínicos que se presentan en los primeros seis meses de evolución. El
curso clínico de la ARJ es definido por lo que pasa después de los primeros
seis meses de la enfermedad (Brever, et al. 1977).
3
1.3 Clasificación del Colegio Americano de Reumatología
Los tres principales subtipos de la ARJ están basados en los síntomas clínicos
de la enfermedad y se dividen: a) pauciarticular u oligoarticular, b)
poliarticular y c) sistémica. Algunos investigadores frecuentemente dividen a
los subtipos pauciarticular y poliarticular en dos subgrupos cada uno (ver
Tabla 2) (Schaller, 1997).
La base de datos de 800 enfermedades reumáticas en niños se encuentra en la
Universidad de UTA en la que se sugiere que el subtipo más común es el
oligoarticular o pauciarticular con aproximadamente el 55% de todos los
casos. Este subtipo es diagnosticado en pacientes que tienen menos de cinco
articulaciones inflamadas durante los primeros seis meses de evolución
(Figura 1). Los individuos afectados con este subtipo generalmente presentan
inflamación de las articulaciones grandes de las extremidades inferiores como
las rodillas o tobillos, un porcentaje importante de estos individuos sintetizan
anticuerpos contra componentes nucleares (ANA) y la mayoría de ellos
desarrollan uveítis, la cual es el principal problema clínico serio. El segundo
subtipo es el poliarticular y representa aproximadamente el 32% de todos los
casos, este subtipo se caracteriza por inflamación en más de cinco
articulaciones dentro de los primeros seis meses de evolución de la
enfermedad (Figura 2). Este subtipo incluye a pacientes con factor reumatoide
(FR) positivo y negativo, ambas formas afectan principalmente a niñas
(Prahalad, 2006; Weiss, et al. 2005).
4
Los pacientes seropositivos al FR frecuentemente desarrollan poliartritis
tempranamente, mientras que los pacientes con FR negativo generalmente
desarrollan la artritis tardíamente en la niñez y la adolescencia, los pacientes
seronegativos al FR tienen un pronóstico variable. Este subtipo no tiene una
gran asociación con el complejo principal de histocompatibilidad (CPH) o
antígeno leucocitario humano (HLA, human leucocyte antigen). El tercer
subtipo es el sistémico, este representa aproximadamente el 13% de los casos,
además se ha reportado que no está asociado con la edad, género o HLA, entre
las características clínicas que caracterizan a este subtipo se encuentran las
manifestaciones extraarticulares como los picos altos de fiebre,
linfoadenopatía, hepato y esplenomegalia, serositis (Figura 3) (Prahalad, 2006;
Weiss, et al. 2005).
Se ha encontrado que los porcentajes en los tres subtipos de la ARJ son muy
similares en niños en los Estados Unidos de Norteamérica (E.U.A.), Canadá y
Reino Unido (Cassidy, et al. 2002). En nuestro país no se conoce la prevalencia
de cada subtipo de la ARJ.
Figura 1. Imagen que muestra el subtipo poliarticular. Este paciente presenta inflamación en el tobillo de ambos pies.
5
Figura 2. Imagen de un paciente con ARJ subtipo poliarticular. Este subtipo presenta inflamación de varias articulaciones, algunas veces la inflamación se presenta en forma simétrica.
Figura 3. Imagen que representa el subtipo sistémico. Este subtipo se caracteriza por manifestaciones extraarticulares.
6
Tabla 2. Características clínicas de los subtipos de artritis de acuerdo a los criterios del ACR.
Pauciarticular afectación de 5 articulaciones o
menos durante los primeros seis meses
de edad
edad temprana usualmente niñas, alta incidencia de uveítis crónica, anticuerpos antinuclear (ANA)
positivos edad tardía usualmente niños
mayores de 8 años, alta incidencia de
sacrolitis HLA-B27 positivos
Poliarticular afectación de cinco articulaciones o más durante los primeros
seis meses de la enfermedad
factor reumatoide (-)
se presenta en las últimas etapas de la
niñez
factor reumatoide (+)
se presenta en las últimas etapas de la niñez, se parece a la AR de los adultos
Sistémica picos de fiebre alta manifestaciones extraarticulares
no aplicable
1.4 Características clínicas
La ARJ se caracteriza principalmente por inflamación crónica del
revestimiento sinovial de las articulaciones, dando como resultado
destrucción ósea y del cartílago, condiciones que se asocian causando dolor
articular, pérdida del movimiento, debilidad muscular y dificultad para
realizar actividades de la vida cotidiana. Esto último a su vez se asocia a
fatiga. Estos niños normalmente presentan niveles de actividad disminuida,
7
principalmente por el dolor y la fatiga, pero más por la creencia de que el
reposo mejora los síntomas de la enfermedad. Se ha demostrado que la
inactividad contribuye a un empeoramiento en el desgaste y debilidad
muscular que se manifiesta en la pérdida del límite de movimiento y fuerza de
los músculos que rodean a las articulaciones afectadas (Salazar, et al. 2002).
Los pacientes con ARJ sufren un retraso en el crecimiento que está asociado
con factores relacionados con la enfermedad, con la corticoterapia, con el
estado nutricional, con la densidad mineral ósea y con el comienzo precoz de
la enfermedad (García, et al. 2003).
1.5 Etiología de la ARJ
La etiología de esta enfermedad aún no está completamente entendida y se
desconoce mucho acerca de su origen. Existen evidencias que sugieren que la
patología probablemente involucra múltiples genes de susceptibilidad
característica común de muchas patologías autoinmunes, así como la
interacción de un individuo genéticamente predispuesto con los factores de
riesgo que se encuentran en el medio ambiente. (Phelan, et al. 2006; Weiss, et
al. 2005; Miterski, et al. 2004).
Entre los genes que se han involucrado en esta patología se encuentran varios
de los involucrados en los mecanismos de inmunidad e inflamación. Además
de la predisposición genética del individuo, existen algunas hipótesis que
8
sugieren la participación de niveles hormonales anormales, trauma articular,
infecciones virales o bacterianas para el desarrollo de la ARJ. Varios estudios
han implicado al virus de la rubéola o parvovirus como un agente causal de la
ARJ, debido a que el virus de la rubéola se mantiene de manera persistente en
los linfocitos y establece un foco de infección en la membrana sinovial
resultando en una inflamación crónica (Weiss, et al. 2005). Sin embargo, estos
resultados no se han podido reproducir en laboratorios de investigación
(Tucker, 1993).
1.6 La artritis reumatoide como enfermedad autoinmune
La ARJ es considerada una enfermedad autoinmune, debido a que el sistema
inmunológico del organismo no tiene un efecto protector contra los
microorganismos, antígenos, toxinas y algunas proteínas del propio
organismo que funcionan como antígenos y que tienen que ser degradadas, de
esta manera el sistema inmunológico produce daño al organismo provocado
por una falla en la selección inmunorreactiva de los linfocitos B y T.
En la ARJ ocurre una autorreactividad en contra algunas células de la
membrana sinovial de las articulaciones sinoviales ya que pierden la auto-
tolerancia contra algunas proteínas de las membranas sinoviales resultando en
un daño a las articulaciones. En la artritis reumatoide crónica se considera una
respuesta inmunológica mediada por linfocitos T autorreactivos (Panayi, et al.
9
2001), sin embargo en el caso de la participación de los linfocitos B aún es
debatida su participación aunque exista la presencia de auto-anticuerpos en el
líquido sinovial (Edwars, et al. 1999).
En condiciones normales las células presentadoras de antígenos profesionales
(CPA) como las células dendríticas pueden capturar a los antígenos,
procesarlos y presentarlos sobre su superficie. Las células dendríticas tienen la
capacidad de presentar antígenos tanto a las células T o a las B, esto es porque
tienen en su superficie tanto moléculas del CPH clase I o II, de esta manera
cuando la célula dendrítica presenta el péptido que va unido al CPH clase I
puede activar, diferenciar y proliferar a los linfocitos T citotóxicos CD 8+ los
cuales van a destruir a las células infectadas con virus o células donde se estén
sintetizando proteínas virales, proteínas bacterianas intracelulares, etc. Por
otra parte las células dendríticas sintetizan compuestos que actúan como
moléculas coestimuladoras que sirven también para estimular la activación,
maduración, diferenciación y proliferación de los linfocitos T CD 8+. De esta
manera los linfocitos T van a sintetizar varias moléculas como las interleucinas
(ILs), quimiocinas, entre otras, que están involucradas en procesos
inflamatorios e inmunológicos. La síntesis y liberación de estos compuestos
actúan en la activación de la respuesta inmune celular o Th1 que a su vez
actúa activando a los macrófagos, sinoviocitos, y osteoclastos (Wilkinson, et al.
2003).
10
La migración y acumulación de las células de T de memoria en la membrana
sinovial es un paso crítico en la patogénesis de la artritis crónica. Las
quimiocinas son una familia grande de pequeñas proteínas secretadas para
atraer y reclutar a los linfocitos en el control de procesos fisiológicos normales
y patológicos. La evaluación del tipo y de la distribución de quimiocinas y de
sus receptores en la membrana sinovial es por lo tanto crucial para los
mecanismos del reclutamiento de las células T en la membrana sinovial
(Gattorno, et al. 2004).
Las citocinas son moléculas de señalización que dirigen la defensa del
huésped, remodelación de tejidos, angiogénesis y el control de la neoplasia. La
mayoría son glucoproteínas o péptidos de bajo peso molecular e incluyen
interleucinas, interferones, algunos factores de crecimiento y otras moléculas
como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα). Cada citocina tiene múltiples
células blanco y múltiples acciones (pleiotrópicas), y diferentes citocinas
tienen acciones similares o traslapadas (redundancia) (Wilkinson, et al. 2003).
La influencia de las citocinas en la ARJ se pueden dividir en proinflamatorias,
tal como TNFα, IL-1β e IL-6, y anti-inflamatorias, tal como el receptor
antagonista de la IL-10 e IL-1. Las citocinas proinflamatorias se producen por
numerosos tipos celulares y tienen acciones tan diversas como la activación de
las células T, inducción de proteínas de fase aguda y vías involucradas con la
inflamación, estimulación de crecimiento, diferenciación celular y control de la
apoptosis (Wilkinson, et al. 2003).
11
El TNFα es uno de los mediadores primarios de la inflación aguda. Esta
proteína es una citocina secretada principalmente por los
monocitos/macrófagos. Esta citocina se ha encontrado en el líquido sinovial
de los pacientes con artritis, una vez en la membrana sinovial, esta molécula
tiene efectos pleiotrópicos, activando linfocitos, osteoclastos y fibroblastos
entre otras células inflamatorias. Específicamente, TNFα estimula a los
sinoviocitos, conduciendo a la inflamación sinovial y a la formación del
pannus (Phelan, et al. 2006).
El locus del TNFα está en la región del CPH (6p21.3), entre los genes del HLA
de la clase I y II. El TNFα desempeña una función en la patogénesis de la
autoinmunidad, como se ha evidenciado por las numerosas asociaciones
encontradas entres este locus y diferentes desordenes autoinmunes. Se ha
demostrado que es un mediador crítico de la autoinmunidad en la ARJ, ya que
inhibe la generación de células dendríticas, que son secretoras del interferón
alfa y beta (INFα/β) (Phelan, et al. 2006).
Los genes clase I del CPH codifican para las moléculas denominadas HLA-A,
HLA-B, HLA-C y HLA-E. Los genes de la clase II, también denominados
genes de respuesta inmunológica, codifican para las moléculas denominadas
HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP; además existen otros genes denominados DO
y DZ (Lavalle, 1989).
12
1.7 Artritis reumatoide y autoinmunidad
En el caso de la artritis reumatoide se han propuesto algunas hipótesis que
tratan de explicar el origen de esta enfermedad autoinmune. Una de ellas
propone que los linfocitos B autorreactivos pueden proporcionar señales para
activar, estimular y perpetuar la activación de los linfocitos T cooperadores
CD4+, una molécula importante en esta hipótesis es la IgM que representa al
FR, cuando el FR se une a un antígeno desconocido hay una interacción
antígeno-anticuerpo. La fracción cristalizable (Fc) del FR que es la región
conservada del anticuerpo se puede unir a un receptor específico para la
fracción cristalizable que se encuentra en las células B, esta interacción media
la endocitosis del antígeno desconocido en el citoplasma de la célula B,
entonces el antígeno es degradado y es presentado por el linfocito B mediante
el CPH clase II, además junto con moléculas coestimuladoras producidas por
los linfocitos B pueden disparar el proceso de activación, proliferación y
diferenciación de los linfocitos T CD4+, los cuales una vez activados sintetizan
una gran cantidad de citocinas y quimiocinas que ayudan a perpetuar la
activación de los linfocitos B autorreactivos (Figura 4). Otra hipótesis propone
que el FR puede interaccionar con proteínas del complemento como la C3d,
una vez que interacciona el FR/C3d, C3d puede unirse al receptor 2 del
complemento y estimular a los linfocitos B autorreactivos a que produzcan
moléculas coestimuladoras para la activación de los linfocitos T (Figura 4)
(Edwars, et al. 2006).
13
Figura 4. Modelo de auto-perpetuación de los linfocitos B autorreactivos. Posible papel de los autoanticuerpos (FR) mediada por células B autorreactivas en la génesis de la AR.
Shi y colaboradores (2006) han planteado otra hipótesis, en la cual los
linfocitos T asesinos naturales (Natural Killer o NK) y las células T
autorreactivas tienen un papel fundamental en el desarrollo de enfermedades
autoinmunes (Shi, et al. 2006). Dicha hipótesis propone varios mecanismos por
los cuales los linfocitos T NK pueden modular a los linfocitos T autorreactivos
tanto para estimular su activación como su inhibición.
14
Entre las propuestas que implican a las células NK como parte fundamental
en el desarrollo de la autoinmunidad, son las siguientes:
1) Las células NK pueden producir proteínas como citocinas y quimiocinas
que determinan la diferenciación de las células T CD4+ vírgenes a células tipo
Th1 o Th2 y de esta manera pueden influir en el desarrollo de la respuesta
inmune. Por ejemplo, el INFγ y otras citocinas pueden regular a los linfocitos
T CD4+ y diferenciarlos a células del tipo Th1, aquí se propone que las células
T autorreactivas ya existen.
2) Las células NK y las células presentadoras de antígenos (por ejemplo, las
células dendríticas) pueden sinergizar con la ayuda de moléculas
coestimuladoras sintetizadas por los linfocitos T NK y ayudar a la generación
de linfocitos T autorreactivos.
3) Los linfocitos NK pueden promover directamente la generación de
linfocitos T autorreactivos a través de moléculas coestimuladoras como OX40
o 2B4 (Figura 5) (Edwars, et al. 2006).
15
Figura 5. Papel de los linfocitos T autorreactivos en la génesis de la autoinmunidad. Hipótesis que proponen que los linfocitos T autorreactivos en interacción con los linfocitos NK pueden desencadenar una respuesta inmune.
Se ha propuesto también que los linfocitos T NK pueden inhibir a los linfocitos
T autorreactivos, los modelos experimentales han proporcionado cierta
evidencia en donde los linfocitos T NK tienen un papel supresor en varias
enfermedades autoinmunes, a pesar de existir estas evidencias, los
mecanismos que regulan estos eventos son poco claros, aunque existen
algunas evidencias que proponen los siguiente: 1) los linfocitos T NK pueden
lisar a las células dendríticas antólogas; 2) los linfocitos T NK pueden lisar a
las células T autólogas; 3) las células NK pueden la respuesta inmune mediada
por células T mediante la síntesis de TGF-β y 4) existen evidencias de que los
16
linfocitos en estado proliferativo se pueden unir a un gen supresor de tumor
p21 e inhibir su activación (Figura 6) (Edwars, et al. 2006).
Figura 6. Papel regulador de los linfocitos T NK en autoinmunidad. Mecanismos propuestos por los cuales las células T NK pueden inhibir la activación de los linfocitos T autorreactivos.
Actualmente se conoce bien acerca de las moléculas sintetizadas por las
células de la membrana sinovial inflamada que se encuentran en el líquido
sinovial de los individuos con artritis reumatoide juvenil (Figura 7) (Ladner, et
al. 2005). La membrana sinovial inflamada está compuesta por diferentes tipos
de células como linfocitos B y T, macrófagos, adipocitos, fibroblastos, entre
17
otros tipos celulares. Varias evidencias experimentales han sugerido que los
fibroblastos juegan un papel fundamental en la producción de diferentes
proteínas implicadas en la inflamación y destrucción del cartílago y el hueso.
Existen también evidencias de infiltración de linfocitos T, monocitos y
fibroblastos a la membrana sinovial, sin embargo su papel en la sinovitis es
controversial. Se ha observado que los fibroblastos en cultivo presentan
propiedades muy interesantes como una velocidad de proliferación, pérdida
de inhibición por contacto, expresión constitutiva de mRNA y proteínas, esas
observaciones cambian la visión de que los fibroblastos sólo mediaban la
reparación del tejido mediante señales suministradas por monolitos y
linfocitos (Ritchlin, 2000).
Por otro lado, se ha encontrado que también los linfocitos B juegan un papel
importante en el desarrollo de la artritis, ya que cuando se inyecta un
anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula de los linfocitos B (CD20)
se reduce la síntesis de IL-1β y INFγ, esto sugiere que las células B afectan la
función de los linfocitos T y macrófagos los cuales pueden generar una
respuesta inflamatoria en las articulaciones (Weyand, et al. 2005).
Además de las células implicadas en el desarrollo de la autoinmunidad,
algunas moléculas solubles como el TNF-α, IL-6, IL-1β y la proteína C reactiva
juegan un papel clave en la destrucción de las articulaciones. Por ejemplo, el
18
TNF-α y la IL-1β inducen la activación de enzimas que degradan la matriz
extracelular, tales como las metaloproteasas (Ladner, et al. 2005).
Figura 7. Medio ambiente donde interaccionan células y moléculas del sistema inmune. Las células de la membrana sinovial juegan un papel fundamental en la génesis de moléculas proinflamatorias, angiogénesis y degradación de la matriz extracelular.
19
1.8 La ARJ como ejemplo de enfermedad compleja o
multifactorial
La ARJ es una enfermedad compleja y de etiología multifactorial donde
intervienen tanto los factores genéticos como ambientales para su desarrollo.
Las enfermedades complejas a diferencia de las monogénicas o mendelianas
no dependen de un solo gen para que se desarrolle la enfermedad sino de
varios genes (poligénica) que de forma aditiva interactúan y pueden producir
ARJ, sólo que en estas enfermedades la contribución de cada alelo es
frecuentemente pequeño y difícil de detectar.
Frecuentemente, los genes específicos involucrados en la patología pueden
variar entre dos personas que presentan fenotipos similares, fenómeno
denominado heterogeneidad de locus. Un factor adicional de confusión en el
estudio de las enfermedades complejas es la expresividad variable. La
expresividad variable se refiere a las diferencias en la gravedad de la
enfermedad en diferentes individuos con el mismo genotipo. Por otro lado, los
factores ambientales son muy importantes para que se desarrolle la
enfermedad, de hecho en algunos casos pueden causar fenocopias de una
enfermedad. En el caso de las enfermedades complejas los genes involucrados
en la enfermedad se denominan genes de susceptibilidad más que genes
causales de enfermedad (Tabla 3) (Hirholt, et al. 2001; Zak, et al. 2002).
20
Tabla 3. Características de las enfermedades multifactoriales.
Influencia multifactorial Contribución genética y ambiental para el desarrollo de la enfermedad
Poligénica El efecto de muchos genes contribuyen a la enfermedad
Heterogeneidad genética Diferentes genes y diferentes alelos del mismo gen pueden contribuir al desarrollo de un mismo fenotipo
Heterogeneidad fenotípica Gran variedad de fenotipos clínicos
Variabilidad de la enfermedad La gravedad y por los tanto el subtipo de la enfermedad puede variar entre los individuos
1.9 Componente genético en la ARJ
Se han llevado a cabo diversos estudios, entre ellos, los realizados en familias
y gemelos que han sido de mucha importancia, ya que por medio de estos
estudios se ha identificado que la artritis reumatoide juvenil tiene un
componente genético. Estos estudios sugieren que el componente hereditario
es de suma importancia para el desarrollo de la enfermedad. La presencia de
alelos del HLA clase I y clase II, tales como HLA-DRB1*01 y *04 incrementan
el riesgo para adquirir la ARJ poliarticular. El locus HLA-A2 perteneciente a la
clase I se asocia con la artritis oligoarticular temprana en niñas, el HLA–
DRB1*08 y *11, DQA1 *04 y *05, y DQB1 *04 de clase II están asociados con la
ARJ oligoarticular, el HLA–DRB*08 confiere un incremento en el riesgo a
desarrollar a ARJ poliarticular con RF negativo, y HLA–DRB1 *11 confiere un
21
incremento de riesgo para ARJ sistémica, el HLAB1 *04 está asociado a AIJ
poliarticular RF positivo (Miterski, et al. 2004; Thomson, et al. 2002). Para el
inicio sistémico se han asociado con HLA-B8, HLABw35 y HLA-DR4
(Bukulmez, et al. 2005).
Además de los polimorfismos del gen HLA clase I y II se han encontrado
otros, por ejemplo en el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF),
citocina ubicua pleiotrópica, promotora de la fagocitosis y ha sido asociada
con la producción de citocinas inflamatorias como IL-1, IL-6 e IL-8. En el gen
de MIF se han encontrado 4 polimorfismos: una substitución de G/C en
región del promotor en la posición -173, un tetranucleótido repetido (CATT)n
que comienza en la posición -794, una sustitución de T/C en el intrón 1, y una
sustitución C/G en el intrón 2. Dos de los estos polimorfismos (-173G/C y La
repetición CATT) fueron encontrados por separado pueden alterar la
actividad transcripcional in vitro de MIF.
La asociación de los polimorfismos del gen de TNFα con la ARJ se ha
establecido con un gran riesgo en la enfermedad, se han encontrado tres loci
susceptibles dentro del locus de TNF (-1031C, -863A, y -857T). En
combinación del alelo DRB1*0405 de HLA con el alelo -857T de TNFα
aumentó la susceptibilidad (Phelan, et al. 2006).
Se han encontrado otros polimorfismos en otras citocinas como la IL-6, factor
regulador del interferón 1 (Cinek, et al. 2004), IL-10 e IL-4 asociados a la ARJ
22
(Crawley, et al. 1999), además de los polimorfismos en el gen de la tapasina,
uno en el exón 4 y tres en los intrones (Bukulmez, et al. 2005) y en el gen de la
IL-8 se han encontrado tres haplotipos S01, S02 y S03, integrado por 13
polimorfismos genéticos cubriendo dos regiones distintas del promotor
(Sugiura, et al. 2006).
Además de los polimorfismos ya mencionados anteriormente, se han
encontrado aún más en citocinas que han estado asociados con esta
enfermedad autoinmune, por lo que, se puede considerar que cualquier gen
que este implicado en cualquier vía de la respuesta inmunológica, podría
considerarse como candidato para analizarse en los estudios de asociación
alélica.
1.10 Estudios que evidencian la participación de los factores
genéticos en la ARJ
Los estudios en gemelos y en familias han sido muy importantes para
determinar el componente genético en la ARJ. Se ha demostrado una alta
concordancia de la enfermedad en los gemelos monocigotos (MC) comparado
con los gemelos dicigotos (DC), estos datos dan evidencias de una base
genética en la enfermedad (Prahalad, 2006). Se ha propuesto por diversos
estudios que la concordancia es gemelos MC es del 30 – 40% (Ansell, et al.
1969; Baum, et al. 1968), y se ha estimado que el riesgo que tiene un gemelo
MC es de 250- 400 veces más de probabilidad de desarrollar ARJ que cualquier
23
individuo de la población general. Dichos estudios en gemelos han
proporcionado evidencias fuertes de que los factores genéticos contribuyen a
la susceptibilidad da desarrollas ARJ.
En los Estados Unidos se ha estimado que existen aproximadamente 300
familias que tienen más de un hijo afectado con ARJ (Glass, et al. 1999). Se ha
observado que la ARJ en pares de hermanos afectados tiene una contribución
genética muy importante que influye en su desarrollo. En la base de datos de
los Estados Unidos se reporta en los pares de hermanos afectados una alta
concordancia en el sexo, subtipo y curso de la enfermedad (Moroldo, et al.
1997).
Auque los gemelos y los pares de hermanos con ARJ se han descrito
frecuentemente, familias con múltiples hijos afectados con ARJ sólo rara vez
han sido reportadas. Se ha calculado que el riesgo de recurrencia de un
individuo que tiene hermanos afectados es de 30 veces mayor que el de la
población general. (Savolainen, et al. 2000; Prahalad, et al. 2004).
Aunque no hay reportes de cálculo de heredabilidad en niños con ARJ, en
adultos se sabe que la heredabilidad es de aproximadamente el 60%, en otras
palabras es mayor el papel que juegan los factores genéticos en el desarrollo
de la artritis reumatoide (AR) que el que juega el medio ambiente (McGregor,
et al. 2000).
24
1.11 Estrategias para el estudio de genes involucrados en
enfermedades
Actualmente se encuentran disponibles una gran variedad de estrategias para
identificar los factores genéticos involucrados en las enfermedades
mendelianas y complejas. El análisis de ligamiento, y los estudios de
asociación son dos métodos analíticos complementarios utilizados para
detectar tanto las regiones genéticas específicas como genes que están
involucrados en el desarrollo de la enfermedad. Debido a que la ARJ es una
enfermedad compleja en la cual intervienen múltiples factores genéticos que
interactúan con los factores de riesgo que se encuentran en el medio ambiente,
los estudios de ligamiento poco pueden hacer en este tipo de análisis donde el
efecto genotípico y fenotípico de cada gen es pequeño y además aditivo.
Por otro lado, los estudios de asociación son los que ofrecen una excelente
herramienta metodológica para identificar alelos de susceptibilidad con poca
contribución genética a la enfermedad, pero cada uno de los genes candidatos
presentan una susceptibilidad en la etiología de la ARJ, y solo cuando la
interacción de los genes es aditiva, alcanzan y rebasan el umbral de
susceptibilidad es cuando se presenta la enfermedad. Los estudios de
asociación a diferencia de los de ligamiento generalmente no dan una
asociación causal, pero si contribuyen en la búsqueda de genes con poco efecto
genotípico de las enfermedades comunes, por lo tanto estos estudios dan un
riesgo relativo del alelo que esta siendo analizado con respecto a la
enfermedad. Los estudios de asociación son los que han identificado varios de
25
los genes que actualmente se han reportado estar involucrados en de dicha
patología infantil, aunque mucho de esto depende de la geografía y etnicidad
de cada población (Wyszynski, 1998).
1.12 Estudios de asociación alélica
A diferencia de los análisis de ligamiento, los cuales escanean todo el genoma
o una región grande del genoma, los estudios de asociación se emplean para
estudiar pequeñas regiones y/o segmentos del genoma. Este tipo de estudios
han dado resultados excelentes para identificar genes ubicados en las regiones
genómicas que han dado ligamiento en diversas enfermedades, con estos
estudios se pueden identificar regiones cromosómicas pequeñas, además de
genes de pequeño efecto en la enfermedad. Este tipo de diseño se puede
realizar en: a) casos y controles y b) basados en familias; padres e hijo afectado
o pares de hermanos afectados. En el primer caso se analizan enfermos (casos)
e individuos sanos (controles) no relacionados y se compara la frecuencia de
marcadores polimórficos en ambos individuos, si la frecuencia del alelo
específico del marcador se encuentra en mayor frecuencia en los casos que en
los controles, con un poder estadístico mayor a 0.8 entonces decimos que el
marcador está asociado a al enfermedad.
El hecho de que haya una asociación entre un marcador y una enfermedad
generalmente se toma como evidencia preliminar de ligamiento entre el
marcador y el locus que causa la enfermedad. Los estudios de casos y
26
controles pueden dar falsas asociaciones debido a la estratificación
poblacional, debido a que los estudios de asociación basados en familias
evitan estas falsas asociaciones, para este procedimiento se emplea la prueba
de desequilibrio de transmisión (TDT por sus siglas en ingles) para analizar el
desequilibrio de ligamiento entre una enfermedad compleja y un marcador
genético. Esta prueba originalmente se introdujo para hacer análisis de
ligamiento entre un marcador genético y un gen candidato en casos y
controles.
En el caso de que se encuentre que un alelo asociado a una patología, la
prueba de TDT es más efectiva que los estudios de ligamiento. Más aún esta
prueba se puede emplear en aquellos casos donde no existe evidencia previa o
preliminar de asociación, de esta manera puede detectar asociación si el
marcador alélico está ligado al locus que causa el fenotipo de la enfermedad.
Por lo tanto la prueba TDT no solo sirve para realizar estudios de ligamiento
sino también de asociación. La prueba se resume brevemente: utiliza los datos
de la familia en los cuales se cuenta con los genotipos de un marcador o
conjunto de marcadores alélicos del padre, madre y el caso índice y compara
la frecuencia la de transmisión del alelo específico con la frecuencia de los
alelos que no son transmitidos de los padres heterocigotos con el caso índice.
La principal ventaja de esta prueba es que los padres son tomados como
controles y de esta manera se eliminan los factores que pudieran alterar la
asociación, por ejemplo la asociación por estratificación poblacional. Esta
27
prueba es ideal para los estudios genéticos de las enfermedades complejas en
las cuales la ARJ está incluida (Baca, et al. 2004).
1.13 Causas de asociación
Se conoce que la asociación se puede deber por a:
a) Efecto directo del marcador alélico en estudio. En algunas
ocasiones el polimorfismo estudiado en ciertas enfermedades es la
causa directa de asociación por estar involucrado en la susceptibilidad
de la enfermedad.
b) Desequilibrio de ligamiento. La asociación puede ser debida no
al polimorfismo que se está estudiando sino a otro polimorfismo que
este cercano a él y sea el verdadero causante de la susceptibilidad.
c) Estratificación poblacional. Muchas poblaciones presentan
subgrupos que no se mezclan, esto puede condicionar a que tanto l a
enfermedad como algunos marcadores alélicos podrían ser más
comunes entre los individuos de los subgrupos. Cuando se presenta
este fenómeno los estudios pueden dar falsos positivos o falsos
negativos (Baca, et al. 2004).
28
1.14 El genoma humano y los estudios de asociación
Gracias a la secuenciación completa del genoma humano se pudo conocer la
distribución exacta de los genes en los cromosomas (Venter, et al. 2001),
también se conocieron cuales eran las variantes más comunes en el genoma.
Las dos variantes más comunes son los repetidos cortos en tándem (STRs) o
microsatélites y los polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs. De hecho
dos individuos cualquiera comparten el 99.9% de su genoma, el 0.01% restante
representa la variabilidad de cada individuo.
Los SNPs son una herramienta cada vez más importante para el estudio de la
estructura e historia de nuestro genoma (Brookes, 1999). El uso más común de
SNPs es para los estudios de asociación, que buscan una asociación estadística
entre los alelos y los fenotipos (generalmente enfermedades), para establecer
claramente a genes candidatos causantes de la susceptibilidad a desarrollar la
enfermedad (Riva, et al. 2004).
Los SNPs se han encontrado distribuidos a través de todo el genoma humano,
esto ha resultado en grandes avances en la determinación de marcadores
polimórficos en las enfermedades comunes, de hecho actualmente los SNPs
son los mejores marcadores para realizar análisis de asociación. Estos
polimorfismos son variaciones normales en el DNA que se transmiten de
forma mendeliana y se encuentran en la población con una frecuencia mayor
al 1 %, su distribución en el genoma es amplia y gracias a ellos se han
realizado mapas físicos de alta resolución (Sebastiani, et al. 2005; Riva, et al.
29
2002). Se estima que los SNPs se encuentran aproximadamente cada 500 bases
o menos lo cual lleva a que se proponga un número mayor a 7,7 millones
reportados por Riva, A (Riva, et al. 2004), de hecho se calcula que existen entre
10 y 20 millones de SNPs distribuidos a través de todo el genoma (Newton,
2005).
1.15 Importancia de los SNPs en los estudios genéticos
La importancia de los estudios genéticos con SNPs se debe a lo siguiente: a)
muchos los SNPs son heredados de forma mendeliana de una generación a
otra, de esta manera se puede estudiar la evolución de las especies y además
de las poblaciones (Riva, et al. 2002), b) los SNPs pueden ser los responsables
de causar enfermedades ya que pueden alterar de la secuencia de DNA en una
región codificante o reguladora, los SNPs no sinónimos han sido implicados
en diversas enfermedades porque pueden alterar la función de la proteína, su
estabilidad, los sitios de corte y empalme (splicing), etc. (Riva, et al. 2002;
Stitziel, et al. 2004), c) finalmente los SNPs se pueden emplear para los
estudios de ligamiento y asociación (Mayeux, 2005). Estos marcadores
presentan algunas características importantes como por ejemplo la mayoría de
ellos son bialélicos, son muy abundantes en el genoma, tienen baja tasa de
mutación, son fáciles de genotipar con medios automatizados y no se requiere
de una gran cantidad de DNA para su análisis (Zhang, et al. 2004).
30
2. ANTECENTES
2.1 Función del gen FcRL3
El gen FcRL3 codifica para la proteína parecida al receptor 3 de la fracción
cristalizable de las inmunoglobulinas. A pesar de que se desconoce la función
precisa de la proteína, la estructura molecular predicha sugiere que es una
proteína transmembranal que transmite señales a la célula a través de un
dominio citoplasmático que contiene un motivo activador del
inmunorreceptor de tirosina (ITAM) y un motivo inhibidor del
inmunorreceptor de tirosina (ITIM) (Davis, et al. 2002). Un estudio in vitro
mostró la unión de la syk tirosin cinasa y de la ZAP70 a la región del ITAM y
la tirosin fosfatasa SHP-1 y SHP-2 a la región ITIM (Xu, et al. 2001), esto
sustenta la función señalizadora propuesta de la FcRL3 (Figura 8).
En un estudio previo en el que se examinó una hibridación in situ de amígdala
humana, la FcRL3 fue expresada en el centro germinal, con una expresión alta
particularmente en la zona de luz (Millar, et al. 2002), esto sugirió que las
funciones predominantes de la FcRL3 están en los centrocitos. El hallazgo de
que la estimulación de la CD40 es importante en la formación del centro
germinal (Gray, et al. 1997), sobre regula la expresión de la FcRL3 en linfocitos
B; podría indicar que la FcRL3 es específicamente expresada en el centro
germinal de los centrocitos bajo la influencia de las señales de la molécula
CD40. En la zona de luz, los centrocitos sufren una selección clonal y una
maduración por afinidad, regulado por señales positivas y negativas de los
receptores del antígeno y de los co-receptores (Van, et al. 2001). La alta
31
expresión de la FcRL3 y un incremento en la producción de autoanticuerpos
en individuos con el genotipo de susceptibilidad a enfermedades, es
consistente de la influencia de la FcRL3 en el destino de los linfocitos B y en el
aumento de células autorreactivas del centro germinal.
Figura 8. Posible función de la proteína FcRL3. (a) aunque no se conoce el ligando, se sabe que es una molécula señalizadora por sus dominios ITAM e ITIM, (b) NF-κB, factor de transcripción sugerido uniéndose con mayor afinidad al alelo susceptible (C) del gen FcRL3 (Modificada de Kochi, et al. 2005).
(a)
(b)
32
2.2 Gen FcRL3
El gen FcRL3 se encuentra ubicado en el brazo largo y en la banda 23.1 del
cromosoma 1 (1q23.1), está compuesto por 16 exones y contiene 2797 bp
(www.ncbi.nlm.nih.gov). En este gen se han identificado 9 SNPs, cuatro de los
cuales se han asociado con la AR, estos SNPs son: fcrh3_3, fcrh3_4, fcrh3_4,
fcrh3_5 y fcrh3_6 localizados en la Posición -169, -110. +358 (5’ –UTR del exón
2) y +1381 (intrón 3; 204 y 859 pb de los extremos terminales 3’– y 5’- de los
exones circundantes) relativo al sitio de inicio de la trascripción,
respectivamente (Figura 9) (Kochi, et al. 2005).
Figura 9. Ubicación y representación esquemática del gen FcRL3.
En ninguno de los cuatro SNPs hubo cambio de aminoácido (a.a), por lo que
se evaluaron los efectos potenciales de factores de transcripción de unión a los
SNPs, de esta manera se pronosticó que el NF-κB se unía a la secuencia que
33
contiene el alelo susceptible a AR, el -169C con un puntaje mayor (equivalente
al núcleo 1000, el equivalente de la matriz 0.957) y para el alelo T susceptible
del puntaje decayó sustancialmente de la unión del NF-κB (equivalente al
núcleo 0.760, equivalente de la matriz 0.824). No fueron previstos los otros 3
SNPs para la unión de cualquier factor de transcripción con un alto puntaje, y
no fue prevista la sustitución de nucleótido para afectar la unión de cualquier
factor de regulación (Kochi, et al. 2005).
2.3 Epidemiología molecular del gen FcRL3
El gen FcRL3 se encuentra ubicado en una de las regiones implicadas en la
susceptibilidad para múltiples enfermedades autoinmunes. En este gen se
encontraron 4 SNP (-169 T/C, -110 G/A, 358 G/C y 1381 G/A) asociados a la
susceptibilidad de la AR en adultos en población japonesa. El alelo C del SNP
-169 mostró ser el alelo crítico para la regulación de la expresión del gen
FcRL3. Esto fue comprobado midiendo la actividad de la luciferasa en células
Raji, una línea celular del linfoma de Burkitt, que expresa FcRL3 y es derivado
del centro germinal de las células B. El alelo C del SNP -169 fue asociado a la
AR con una OR de 2.15; IC 1.58-2.93 y p de 0.00000085 (Kochi, et al. 2005).
A partir de esta publicación realizada por los japoneses, una serie de estudios
fueron efectuados en diversas poblaciones en donde no se encontró asociación
en población norteamericana, española y holandesa (Tabla 4) (Thabet, et al.
2006).
34
Tabla 4. SNP -169T/C (rs7528684) análisis del alelo menor en pacientes y controles en diferentes estudios.
35
3. JUSTIFICACIÓN
Las artritis crónicas de la infancia representan un verdadero problema de
salud pública con un alto costo socio-económico. La ARJ es el padecimiento
reumatológico crónico más frecuente en niños, tiene una incidencia que varía
de 1 a 22 casos por 100,000 niños y una prevalencia de 8 a 150 por 100,000.
Estudios a largo plazo han mostrado que los pacientes con ARJ
frecuentemente persisten con actividad de la enfermedad en la edad adulta,
por lo que esta enfermedad es causa común de discapacidad a corto y largo
plazo. En protocolos de seguimiento de la evolución de esta entidad de por lo
menos 10 años, se ha observado que del 31-55% de los pacientes con ARJ
tienen enfermedad activa. La persistencia de actividad es más comúnmente
detectada en pacientes con artritis poliarticular o de inicio oligoarticular que
evolucionan a la forma poliarticular, aunque estudios a largo plazo en
pacientes con ARJ de inicio sistémico han reportado actividad persistente en el
25-58% de los pacientes. La actividad persistente en los pacientes con ARJ ha
mostrado ser un importante factor de mal pronóstico. Estudios que han
evaluado la capacidad funcional en grandes cohortes de pacientes con ARJ
con seguimientos de 7 a 15 años, han mostrado que del 15-28% de ellos
presentan discapacidad funcional moderada a grave. En los últimos años se
han descrito un gran número de genes implicados en la susceptibilidad y
gravedad de las enfermedades autoinmunes (EAs), aunque se ha observado
que la participación de estos es diferente entre los diversos grupos étnicos y
poblaciones, por lo que la búsqueda de genes candidatos debe ser realizada
con detalle en cada uno de estos grupos. Por otro lado, es posible que el
36
componente genético sea mayor en aquellos individuos donde la enfermedad
se manifiesta a una edad más temprana, por lo que la población pediátrica
puede representar la muestra ideal para el estudio de los factores genéticos
implicados en la ARJ. El estudio de las artritis crónicas de la infancia se ha
dificultado por la ausencia de criterios de clasificación uniformes, la
heterogeneidad de la expresión clínica de la enfermedad y la dificultad para
reclutar un número suficiente de pacientes para estudios clínicos y genéticos.
En México no existen estudios encaminados a conocer la etiología de esta
enfermedad, lo que hace indispensable conocer los factores genéticos que
participan en su desarrollo para entender su patogénesis y mejorar las
estrategias preventivas de diagnóstico y tratamiento. Además en esta
enfermedad de etiología multifactorial existe una gran heterogeneidad
genética lo que hace es importante conocer cuales son los genes de
susceptibilidad o protección involucrados en el desarrollo de esta enfermedad
en nuestra población. Los estudios de casos y controles han identificado varios
genes de susceptibilidad para desarrollar esta enfermedad en diversas
poblaciones y han demostrado que el componente genético es importante para
conferir susceptibilidad o protección. Por esto es importante estudiar a los
diversos polimorfismos en diferentes genes candidatos y genes modificadores
de la enfermedad. Actualmente en nuestro país se están desarrollando
diversos trabajos de investigación en el cual se está investigando el papel de
varios genes en la susceptibilidad a desarrollar ARJ.
37
Por esta razón este proyecto es parte de una línea de investigación que
pretende identificar los genes asociados a la ARJ, así en este trabajo se
pretende analizar SNPs en un gen candidato importante en la respuesta
inmunológica e inflamatoria como los, - 169 T/C, - 110 G/A, 358 C/G y 1381
G/A del gen FcRL3.
38
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
• Determinar si los polimorfismos de un solo nucleótido localizados en
el gen FcRL3 están asociados a la susceptibilidad o protección de la ARJ
en muestras de pacientes pediátricos mexicanos.
4.2 Objetivos particulares
• Conocer las frecuencias genotípicas y alélicas de los SNPs - 169 T/C, -
110 G/A, 358 C/G y 1381 G/A del gen FcRL3 en población mexicana.
• Determinar si estos alelos se encuentran asociados a susceptibilidad o
protección con la ARJ en población mexicana.
• Contribuir en el conocimiento de la etiopatología de la enfermedad en
nuestra población.
39
5. MATERIAL Y MÉTODOS
5.1 Diseño de estudio
Se realizó un estudio de asociación (casos y controles), transversal,
prospectivo y observacional.
5.2 Población de estudio
Los pacientes diagnosticados clínicamente con ARJ fueron captados del
Hospital de Pediatría Centro Médico Nacional Siglo XXI (IMSS), del Instituto
Nacional de Pediatría (INP), del Hospital General Centro Médico “La Raza” y
del Hospital Infantil de México. Los controles fueron individuos sanos, libres
de enfermedad y sin antecedentes de algún tipo de inflación crónica o
cualquier otra enfermedad autoinmune, obtenidos del banco de sangre del
INP. A cada paciente se le extrajo el DNA a partir de sangre periférica.
5.2.1 Criterios de inclusión
Casos:
• Pacientes mexicanos menores de 16 años con diagnóstico clínico de ARJ
clasificados por el ARC.
Controles:
• Individuos sanos mayores de 18 años sin antecedentes de artritis o
cualquier otra enfermedad autoinmune.
40
5.2.2 Criterios de exclusión
Casos:
• Pacientes con diagnóstico de cualquier otra enfermedad crónica
inflamatoria o autoinmune, infecciones microbianas o que tengan artritis
con menos de 6 meses de diagnóstico.
Controles:
• Individuos con antecedentes de artritis reumatoide
• Individuos transfundidos en los últimos tres meses.
Por razones de seguridad, se excluyeron a los pacientes o controles con
enfermedades como SIDA, hepatitis u otra enfermedad infecto-contagiosa,
debido a que actualmente no contamos con la infraestructura necesaria para el
procesamiento de muestras contaminadas con agentes infecciosos altamente
virulentos.
5.3 Extracción de sangre periférica de casos y controles
A todos los pacientes y controles se les tomó una muestra de sangre por
venopunción. Se les extrajo de 5 – 10 ml de sangre periférica usando EDTA
como anticoagulante.
41
La extracción del DNA genómico fue a partir de los leucocitos totales por
medio del kit Maxi-Kit Quiagen y Gentra y se obtuvo a través del siguiente
procedimiento:
1. En un tubo Falcon se agregaron 5 ml de sangre periférica y 500 µl de
proteasa.
2. Al mismo tubo se le agregó 6 ml de Buffer AL (buffer de lisis)
teniendo cuidado de que no entre en contacto el buffer directamente
con la proteasa ya que la inactiva.
3. Se agitó suavemente durante 15 segundos y posteriormente se mezcló
vigorosamente en un vortex durante 1 minuto.
4. Se incubó a 70 °C por 10 minutos en un baño María.
5. Se le agregó 10 ml de etanol absoluto frío y se agitó suavemente
durante 15 segundos, posteriormente se agitó vigorosamente durante 1
minuto en un vortex.
6. Después la mitad del producto se pasó a una columna contenida en un
tubo Falcon nuevo de 50 ml y se centrifugó a 5000 r.p.m. durante 3
minutos.
42
7. Se desechó el filtrado y se vació a la columna el resto de producto que
quedo en el tubo Falcon original, nuevamente se volvió a centrifugar a
5000 r.p.m. durante 3 minutos.
8. Se desechó el filtrado y se agregaron 5 ml de buffer AW1 (buffer de
lavado) a la columna, posteriormente se centrifugó a 5000 r.p.m.
durante 1 minuto.
9. Se decantó el filtrado y se agregaron 5 ml del buffer AW2 (buffer de
lavado) a la columna, posteriormente se centrifugó a 5000 r.p.m.
durante 15 minutos.
10. Las columnas se pasaron a tubos nuevos (del kit) y el otro tubo se
desecha con el filtrado.
11. Al tubo nuevo se le agregaron 1000 µl de buffer AE (buffer de elusión
del DNA)
12. Finalmente se incubó el tubo durante 24 horas a temperatura ambiente
y se centrifugó a 5000 r.p.m. durante 2 minutos.
5.4 Cuantificación del DNA
Una vez que obtuvimos el DNA genómico de los casos y controles se procedió
43
a cuantificar el DNA total de cada caso y cada control. Para realizar este
procedimiento utilizamos el equipo automatizado nano-Drop, modelo ND-
1000 spectrophotometer.
La cuantificación del DNA se leyó a una longitud de onda de 280 nanómetros.
Los datos obtenidos de la cuantificación de cada muestra se diluyó, esta
diluciones fueron empleadas para sintetizar fragmentos genómicos y para
analizar diversos SNPs del gen de interés en estudio.
5.5 Diluciones del DNA de los casos y controles y producción
de las placas de PCR para discriminación alélica
Para realizar los experimentos de la discriminación alélica en el equipo de
Tiempo Real se realizaron diluciones del DNA de cada uno de los pacientes
con ARJ y de los individuos sanos. Para obtener resultados confiables se
homogenizaron las diluciones de los individuos que entraron a participar en
este estudio. Para obtener las diluciones y las placas se realizó lo siguiente:
1. Las diluciones para discriminación alélica en el equipo de Tiempo Real
se hicieron a una concentración de 5 ng/µl. Por lo que todas las
muestras se diluyeron con agua destilada libre de DNasas, proteasas,
etc (Gibco E.U.A.).
2. Posteriormente se hizo una placa maestra de 96 pozos con un volumen
44
de 100 ml a una concentración de 5 ng/µl cada pozo. 92 pozos
representan muestras de pacientes, mientras que 4 son controles
negativos (Figura 10).
Figura 10. Elaboración de placas. Placa maestra con 96 pozos, 92 representan muestras de pacientes y 4 representan los controles negativos.
3. A partir de esta placa maestra se tomaron 2 µl de cada pozo con una
pipeta multicanal colocaron en varias placas hijas para que el DNA se
evaporara (Figura 11).
Figura 11. Elaboración de placas hijas. Cada pozo contiene 2 µl de DNA, es decir 10 ng en total de DNA listo para evaporarse.
45
4. Luego el DNA liofilizado quedó listo para ser analizado con las
diferentes sondas TaqMan para los diferentes SNPs del gen candidato
que fue analizado en este estudio.
5.6 Discriminación alélica con el método fluorescente de 5’
exonucleasa (TaqMan). (Ver anexo 1)
Para obtener múltiples copias de la secuencia donde estaba el polimorfismo a
analizar del gen se requirió hacer una PCR convencional, para esto Applied
Biosystem sintetiza la sonda y envía en el mismo vial un par de primer’s que
flanquean el SNP a analizar (ver mezcla de reacción).
Condiciones de PCR
• pre-PCR
50ºC por 2 minutos
95ºC por 10 minutos
• PCR
2 temperaturas, 45 ciclos
95ºC durante 15 segundos
60ºC durante 1 minuto
4 ∞
46
1. La mezcla de reacción para la discriminación alélica para cada uno de
los pozos consistió en lo siguiente:
• 0.125 µl de sonda para analizar el SNP junto con el par de
primer’s específicos para cada SNP.
• 0.125 µl de mezcla de reacción (enzima, buffer, MgCl2)
• 0.375 µl de agua
2. A cada pozo de la placa de 96 se le agregaron 5 µl de mix
3. Las diferentes placas con el DNA liofilizado se analizaron para los
diferentes SNPs - 169 T/C, - 110 G/A, 358 C/G y 1381 G/A del gen
FcRL3.
4. Cada placa fue leída por un láser del equipo de Tiempo Real y los
datos escaneados fueron proporcionados por el software SDS 2.2
(Applied Biosystem E.U.A.).
5. Posteriormente se capturaron manualmente los datos de cada
individuo (casos y controles) para analizar las frecuencias alélicas y
genotípicas.
6. Finalmente se emplearon los programas bioestadísticas y
bioinformáticas Epi-info, Epidat y Finetti para calcular el equilibrio de
Hardy-Weinberg y los riesgos de cada SNP en la susceptibilidad o
47
protección en la enfermedad.
5.7 Análisis estadístico
La frecuencia de los SNPs analizados en una muestra de individuos
mexicanos sanos y con ARJ se reportó en porcentaje. Las pruebas de X2 y
exacta de Fisher se utilizaron para comparar las frecuencias alélicas entre los
pacientes y el grupo control. El riesgo relativo se determinó por razón de
momios. Este análisis se realizó mediante la prueba de X2.
5.8 QUANTO. Software para calcular el tamaño de la muestra
y poder estadístico
Antes de iniciar los estudios moleculares se calculó el tamaño de muestra
mínimo necesario para tener resultados que fueran óptimos para tener
diferencias estadísticamente significativas. El programa que empleamos para
alcanzar este objetivo fue el QUANTO (http://hydra.usc.edu/gxe). Este
software toma en cuenta diversos parámetros entre los que se encuentran: la
prevalencia de le enfermedad en la población, la frecuencia del SNP en la
población, el nivel de significancia estadística, el poder estadístico, modelo de
herencia de le enfermedad, OR (odds ratio), etc. El tamaño de la muestra
requerida con un modelo de herencia recesivo para este estudio de acuerdo el
número de los 350 controles fue de 122 individuos afectados con ARJ. Con este
48
número mínimo se esperan diferencias estadísticamente significativas (p <
0.05), además de un poder estadístico del 80%.
5.9 FINETTI: programa de análisis de equilibrio de Hardy-
Weinberg
El equilibrio de Hardy-Weinberg se analizó mediante el programa
bioinformático y bioestadístico FINETTI. El programa FINETTI es robusto
debido a que proporciona los resultados del equilibrio de Hardy-Weinberg en
base al cálculo de la X2 mediante tres valores de p. FINETTI proporciona
además valores de riesgo, nivel de significancia estadística, intervalo de
confianza (IC), X2, etc., para los estudios de casos y controles.
5.10 EPI INFO VERSIÓN 3.3.2 Y EPIDAT VERSIÓN 3.1:
programas para análisis de asociación
Para corroborar los resultados obtenidos del programa FINETTI del riesgo,
valores de significancia estadística p, intervalo de confianza y X2 se emplearon
dos programas bioinformáticos y bioestadísticas comunes para este tipo de
estudios, uno de ellos es Epi Info versión 3.3.2 y el programa para análisis
epidemiológicos de datos tabulados Epidat versión 3.1. de acuerdo a estos tres
programas se obtuvieron los resultados de los valores de la OR, IC, X2 y valor
49
de p y se concluyó si hubo diferencias estadísticamente significativas y
asociación alélica entre cada unos de los SNPs y la ARJ.
En los tres programas anteriores se calculó un intervalo de confianza, dado
que es un rango de valores (calculado en una muestra) en el cual se encuentra
el verdadero valor del parámetro, con una probabilidad determinada.
También los valores se consideraron estadísticamente significativos cuando el
valor de p fue < 0.05, lo que indica que los resultados tienen un 95% la
posibilidad de no ser producto del azar.
En los estudios de casos y controles la medida relativa que se utiliza es la OR,
siendo una buena estimación del riego relativo (RR), por lo que se interpreta
de forma similar a este. El IC indica los límites inferior y superior del OR. Al
igual que en el valor de p, se usa el IC de 95% y este nos permite tener una
confianza del 95% de que el valor de la población (parámetro) se halla dentro
del intervalo. Si el IC toca el número 1 o la unidad no hay significancia.
Cuando los intervalos de confianza no tocan el 1 y están por encima del 1,
además de ser significativos indica que existe una asociación causal, deletérea,
dañina o perjudicial. Si los intervalos de confianza no tocan el 1 y están por
debajo del 1 (antes del 1), además de ser significativo indica que existe una
asociación beneficiosa, buena o protectora. Para asegurarse que hay
significancia estadística el valor de p debe ser < 0.05.
50
6. RESULTADOS
6.1 Número de pacientes y controles analizados en este estudio
En este estudio de casos y controles se analizaron 133 pacientes menores de 16
años con diagnóstico clínico de ARJ, este grupo de pacientes pediátricos
incluyó a 73 individuos del sexo femenino y 60 del sexo masculino. También
se incluyeron 350 individuos sanos adultos, de los cuales 240 fueron mujeres y
100 hombres.
Los pacientes con ARJ fueron captados de varios Hospitales e Instituciones de
Salud Pública ubicados en la Ciudad de México, los cuales son centros
nacionales de referencia para captar pacientes de diversas partes de la
República Mexicana, entre los Hospitales e Instituciones de donde se
colectaron las muestras fueron del Centro Médico Nacional Siglo XXI del
IMSS, Hospital Infantil de México, Centro Médico la Raza y el Instituto
Nacional de Pediatría (INP), siendo el Hospital de Pediatría del Centro
Médico Nacional Siglo XXI el que más muestras de sangre aportó para este
estudio, y el INP el que menos aportó.
6.2 Análisis del equilibrio de Hardy-Weinberg
Tanto los casos como los controles estuvieron en equilibrio de Hardy-
Weinberg para cada uno de los 4 SNPs analizados del gen FcRL3, por lo tanto
51
se puede sugerir que no hay estratificación poblacional en nuestra muestra de
estudio.
6.3 Análisis de los SNPs - 169 T/C, - 110 G/A, 358 C/G y 1381
G/A del gen FcRL3
Las frecuencias genotípicas y alélicas de los SNPs - 169 T/C, 358 C/G y 1381
G/A mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los casos con
ARJ y los controles (Tablas 5, 9 y 12). Sin embargo el SNP - 110 G/A no mostró
diferencias estadísticamente significativas (Tabla 8).
Cuando las diferencias alélicas y genotípicas se estratificaron por sexo sólo se
encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando se estratificó el
sexo masculino (Tablas 7, 11 y 14), sin encontrar diferencias estadísticamente
significativas en el sexo femenino (Tablas 6, 10 y 13). De esta manera los alelos
de los SNPs - 169 T/C, 358 C/G y 1381 G/A que representa susceptibilidad
en población Japonesa, se encuentran asociados a la protección con la ARJ en
la población pediátrica analizada.
52
Tabla 5. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del SNP -169 T/C (rs7528684) del gen FcRL3.
Alelo n=266 (%) n=700 (%) OR (95% IC)
X2
p
Corrección Bonferroni
T 158 (59.4)
361 (51.6)
C 108 (40.6)
339 (48.4)
0.73 (0.54-0.97)
4.75 0.029 0.058
Genotipo
Casos n=133
(%)
Controles n=350
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p
Corrección Bonferroni
T/T
50 (37.6)
86 (24.6)
T/T vs C/C
0.6 (0.32-1.01)
3.7
0.055 0.1
T/C
58 (43.6)
189 (54.0)
T/T vs T/C
0.52 (0.33-0.83)
7.64
0.0057 0.01
C/C
25 (18.8)
75 (21.4)
T/T vs [T/C + C/C]
0.54 (0.35-0.83)
7.08
0.0044 0.0088
53
Tabla 6. Comparación genotípica y alélica del SNP -169 T/C (rs7528684) del gen FcRL3 estratificados por sexo femenino en pacientes con ARJ y Controles.
Alelo n=146 (%) n=480 (%) OR (95% IC)
X2
p
T 82 (56.2)
253 (52.7)
C 64 (43.8)
227 (47.3)
0.9 (0.6-1.26)
0.54 0.46
Genotipo
Casos n=73 (%)
Controles n=240
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p
T/T
23 (31.5)
58 (24.2)
T/T vs T/C
0.66 (0.36-1.21)
1.78
0.18
T/C
36 (49.3)
137 (57.1)
T/T vs C/C
0.78 (0.36-1.69)
0.38
0.53
C/C
14 (19.2)
45 (18.7)
T/T vs [T/C + C/C]
0.7 (0.39-1.23)
1.57
0.21
54
Tabla 7. Comparación genotípica y alélica del SNP -169 T/C (rs7528684) del gen FcRL3 estratificados por sexo masculino en pacientes con ARJ y Controles.
Genotipo
Casos n=60 (%)
Controles n=110
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p Corrección
Bonferroni
T/T
27 (45)
28 (25.5)
T/T vs T/C
0.44 (0.21-0.91)
5.02
0.025 0.05
T/C
22 (36.7)
52 (47.3)
T/T vs C/C
0.38 (0.16-0.91)
4.87
0.027 0.054
C/C
11 (18.3)
30 (27.3)
T/T vs [T/C + C/C]
0.42 (0.21-0.81)
6.78
0.0092 0.018
Alelo n=120 (%) n=220 (%) OR (95% IC)
X2 p Corrección Bonferroni
T 76 (63.3)
108 (49.1)
C 44 (36.7)
112 (50.9)
0.56 (0.35-0.88)
6.34 0.0117 0.023
55
Tabla 8. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del
SNP -110 G/A (rs11264799) del gen FcRL3.
Alelo n=266 (%)
n=700 (%)
OR (95% IC)
X2 p
G 208 (78.2)
538 (76.9)
A 58 (21.8)
162 (23.1)
0.97 (0.66-1.3)
0.2 0.65
Genotipo
Casos n=133
(%)
Controles n=350
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p
G/G
81 (60.9)
207 (59.1)
G/A vs A/A
0.81 (0.31-2.09)
0.2
0.66
G/A
46 (34.6)
124 (35.5)
G/A vs G/A
0.95 (0.62-1.45)
0.06
0.81
A/A
6 (4.5)
19 (5.4)
G/G vs [G/A + A/A]
0.93 (0.62-1.4)
0.12
0.72
56
Tabla 9. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del
SNP 358 G/C (rs945635) del gen FcRL3.
Genotipo
Casos n=133
(%)
Controles n=350 (%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p Corrección
Bonferroni
G/G
51 (38.3)
85 (24.3)
G/G vs C/C 0.55 (0.31-0.99)
4.12 0.042 0.084
G/C
57 (42.9)
190 (54.3)
G/G vs G/C 0.5 (0.32-0.79)
9.01 0.0026 0.0052
C/C
25 (18.8)
75 (21.4)
G/G vs [G/C + G/G]
0.51 (0.34-0.8)
9.42 0.0021 0.0042
Alelo n=266 (%) n=700 (%) OR (95% IC)
X2 p Corrección Bonferroni
G 159 (59.8)
360 (51.4)
C 107 (40.2)
340 (48.6)
0.73 (0.53-0.95)
5.4 0.02 0.04
57
Tabla 10. Comparación genotípica y alélica del SNP 358 G/C (rs945635) del gen FcRL3 estratificados por sexo femenino en pacientes con ARJ y Controles.
Genotipo
Casos n=73 (%)
Controles n=240
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p
G/G
23 (31.5)
58 (24.2)
G/G vs C/C
0.86 (0.4-1.84)
0.15
0.69
G/C
35 (48.0)
138 (57.5)
G/G vs G/C
0.64 (0.35-1.17)
2.09
1.15
C/C
15 (20.5)
44 (18.3)
G/G vs [G/C + C/C]
0.7 (0.39-1.23)
1.57
0.21
Alelo n=146 (%) n=480 (%) OR (95% IC)
X2 p
G 81 (55.5)
254 (52.9)
C 65 (44.5)
226 (47.1)
0.92 (0.62-1.31)
0.3 0.58
58
Tabla 11. Comparación genotípica y alélica del SNP 358 G/C (rs945635) del gen FcRL3
estratificados por sexo masculino en pacientes con ARJ y Controles.
Alelo n=120 (%) n=220 (%) OR (95% IC)
X2 p Corrección Bonferroni
G 159 (59.8)
360 (51.4)
C 107 (40.2)
340(48.6)
0.51 (0.31-0.79)
8.85 0.0029 0.0058
Genotipo
Casos n=60 (%)
Controles n=110
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p Corrección
Bonferroni
G/G
28 (46.7)
27 (24.5)
G/G vs C/C
0.31 (0.12-0.75)
6.91
0.0085 0.017
G/C
22 (36.7)
52 (47.3)
G/G vs G/C
0.41 (0.19-0.84)
4.87
0.014 0.028
C/C
11 (18.3)
30 (27.3)
G/G vs [G/C + C/C]
0.37 (0.19-0.72)
8.68
0.0032 0.0064
59
Tabla 12. Comparación genotípica y alélica entre pacientes con ARJ y Controles del
SNP 1381 G/A (rs3761959) del gen FcRL3.
Alelo n=266 (%) n=700 (%) OR (95% IC)
X2 p Corrección Bonferroni
G 163 (61.3)
362 (51.7)
A 103 (38.7)
338 (48.3)
0.67 (0.51-0.9)
7.11 0.0076 0.015
Genotipo
Casos n=133 (%)
Controles n=350 (%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p Corrección
Bonferroni
G/G
52 (39.1)
86 (24.6)
G/G vs A/A 0.5 (0.27-0.88)
5.71 0.016 0.032
G/A
59 (44.4)
190 (54.3)
G/G vs G/A 0.51 (0.32-0.81)
8.49 0.0035 0.007
A/A
22 (16.5)
74 (21.1)
G/G vs [G/A + A/A]
0.5 (0.33-0.77)
9.97 0.0016 0.0032
60
Tabla 13. Comparación genotípica y alélica del SNP 1381 G/A (rs3761959) del gen FcRL3 estratificados por sexo femenino en pacientes con ARJ y Controles.
Genotipo
Casos n=73 (%)
Controles n=240
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p
G/G
25 (34.3)
59 (24.6)
G/G vs A/A
0.71 (0.32-1.55)
0.73
0.39
G/A
35 (47.9)
138 (57.5)
G/G vs G/A
0.6 (0.33-1.08)
2.87
0.09
A/A
13 (17.8)
43 (17.9)
G/G vs [ G/A+ A/A]
0.62 (0.35-1.1)
2.66
0.1
Alelo n=146 (%) n=480 (%) OR (95% IC)
X2 p
G 85 (58.2)
256 (53.3)
A 61 (41.8)
224 (46.7)
0.82 (0.56-1.19)
1.08 0.29
61
Tabla 14. Comparación genotípica y alélica del SNP 1381 G/A (rs3761959) del gen FcRL3 estratificados por sexo masculino en pacientes con ARJ y Controles.
Alelo n=120 (%) n=220 (%) OR (95% IC)
X2 p Corrección Bonferroni
G 78 (65)
106 (48.2)
A 42 (35)
114(51.8)
0.5 (0.31-0.79)
8.85 0.0029 0.0058
Genotipo
Casos n=60 (%)
Controles n=110
(%)
Comparación genotipos
OR (95% IC)
X2
p Corrección
Bonferroni
G/G
27 (45)
27 (24.5)
G/G vs A/A
0.29 (0.11-0.72)
7.35
0.0066 0.013
G/A
24 (40)
52 (47.3)
G/G vs G/A
0.46 (0.22-0.95)
4.49
0.034 0.68
A/A
9 (15)
31 (28.2)
G/G vs [G/A + A/A]
0.39 (0.20-0.77)
7.49
0.0061 0.012
62
SNP Alelo de riesgo
Frecuencia ARJ
Frecuencia controles
X2 p OR (95% IC)
-169 T 0.594 0.516 4.75 0.0293 1.37 (1.02-1.85) -110 G 0.782 0.769 0.196 0.6577 1.08 (0.76-1.54) 358 G 0.598 0.514 5.4 0.0201 1.40 (1.04-1.89) 1381 G 0.613 0.517 7.106 0.0077 1.48 (1.10-1.99)
Haplotipo TGGG 0.582 0.476 8.641 0.0033 1.54 (1.15-2.07) CACA 0.205 0.221 0.284 0.5944 0.92 (0.64-1.31) CGCA 0.170 0.222 3.198 0.0737 0.71 (0.49-1.05) CGGG 0.008 0.038 5.91 0.0151 0.19 (0.03-0.82) TGCA 0.008 0.029 3.808 0.0510 0.24 (0.04-1.09)
Tabla 15. Haplotipos del gen FcRL3.
63
7. DISCUSIÓN La ARJ representa la principal causa de artropatía infantil en diversas
poblaciones (Phelan, et al. 2006). Esta enfermedad se caracteriza por una
respuesta inmune desregulada principalmente de tipo Th1, cuando se altera
ocasiona destrucción del cartílago y huesos (Goldring, 2003). Además, esta
enfermedad puede alterar otros órganos y sistemas.
La etiología de la ARJ aún no esta clara, aunque se ha propuesto la existencia
de factores genéticos y ambientales involucrados en su génesis (Weiss, et al.
2005). Algunas de estas propuestas actualmente no han podido ser replicadas
en los laboratorios de investigación, sin embargo los estudios de
heredabilidad proponen que el principal factor de riesgo para el desarrollo de
esta patología son los factores genéticos.
En este estudio se analizaron 4 SNPs del gen FcRL3, uno de ellos reportado
como alelo de susceptibilidad en población japonesa.
Las frecuencias genotípicas tanto en los casos como en los controles se
encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg, lo que disminuye la
posibilidad de que los resultados obtenidos en el presente trabajo sean el
reflejo de la endogamia, posibles errores de tipificación de los pacientes con
ARJ y controles, apareamiento no azaroso (estratificación poblacional), la
presencia de la mutación y la consecuencia de la migración de la población
analizada (Deng, et al. 2001; Nielsen, et al. 1998).
64
En un estudio previo en población japonesa se observó asociación de los
polimorfismos - 169 T/C, -110 G/A, localizados en la región promotora del
gen FcRL3, 358 C/G en la región 5’ UTR y 1381 G/A del intrón 3, con AR y
otras enfermedades autoinmunes. (Kochi, et al. 2005).
Kochi y colaboradores (2005) demostraron que el alelo C del SNP -169 T/C
incrementaba la expresión del gen FcRL3, lo que confería susceptibilidad a
pacientes con AR, ya que se vio una alta producción de autoanticuerpos en
individuos que tenían este alelo.
Al analizar el SNP -169 T/C del gen FcRL3, los resultados obtenidos
mostraron diferencias estadísticamente significativas tanto en las frecuencias
genotípicas como en las frecuencias alélicas. El OR al ser menor de 1 y la p
menor a 0.05 sugiere que el alelo C confiere protección a la población con ARJ,
difiriendo con los antes reportado en la población japonesa. Los genotipos de
casos y controles fueron estratificados por sexo; mujeres-mujeres, sin que estos
análisis mostraran diferencias estadísticamente significativas. Sin embargo,
cuando se estratificaron los genotipos de casos y controles por sexo; hombres-
hombres se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Las tablas
5, 6 y 7 muestran tanto el número como de casos y controles analizados, los
porcentajes, los valores de riesgo, IC, X2 y el valor de p el alelo de riesgo C del
SNP -169T/C del gen FcRL3 está asociado a la protección en la muestra
pediátrica analizada.
65
En el análisis del SNP -110 G/A, los resultados obtenidos no mostraron
diferencias estadísticamente significativas (Tabla 8). Los genotipos de casos y
controles fueron estratificados por sexo; mujeres-mujeres, hombres-hombres
sin que estos análisis mostraran diferencias estadísticamente significativas
(datos no mostrados).
En el análisis del SNP 358 G/C del gen FcRL3, los resultados obtenidos
mostraron diferencias estadísticamente significativas tanto en las frecuencias
genotípicas como en las frecuencias alélicas. El OR al ser menor de 1 y la p
menor a 0.05 sugiere que el alelo C confiere protección a la población con ARJ.
Los genotipos de casos y controles fueron estratificados por sexo; mujeres-
mujeres, sin que estos análisis mostraran diferencias estadísticamente
significativas. Sin embargo, cuando se estratificaron los genotipos de casos y
controles por sexo; hombres-hombres se encontraron diferencias
estadísticamente significativas (Tablas 9, 10 y 11), lo que indica que el alelo C
de este SNP confiere protección en la muestra pediátrica analizada.
Al analizar los resultados del SNP 1381 G/A del gen FcRL3, estos mostraron
diferencias estadísticamente significativas tanto en las frecuencias genotípicas
como en las frecuencias alélicas. Lo que sugiere que el alelo A confiere
protección a la población con ARJ. Los genotipos de casos y controles fueron
estratificados por sexo; mujeres-mujeres, sin que estos análisis mostraran
diferencias estadísticamente significativas. Sin embargo, cuando se
estratificaron los genotipos de casos y controles por sexo; hombres-hombres se
66
encontraron diferencias estadísticamente significativas (Tablas 12, 13 y 14), lo
que indica que el alelo A de este SNP confiere protección en la muestra
pediátrica analizada.
Después de que se analizaron los SNPs en forma individual y aislada se
analizó la construcción de haplotipos con los 4 SNPs - 169 T/C, - 110 G/A,
358 C/G y 1381 G/A del gen FcRL3. Como es bien sabido en muchos casos los
SNPs individuales no están asociados a la enfermedad, sin embargo, pueden
en muchos casos los haplotipos formados por estos pueden estar asociados
con la susceptibilidad o protección de la enfermedad (Haploview, 2005).
A pesar de lo mencionado anteriormente en la población pediátrica mexicana
el análisis por SNPs individuales tres de ellos confieren protección a la
población con ARJ, y al hacer el análisis de los haplotipos uno de ellos el
TGGG (Tabla 15) confiere susceptibilidad a la misma. Y aunque estos
resultados son controversiales, se ha sugerido en estos casos que el gen
analizado no esté participando de manera directa en la patogénesis de la
enfermedad, por lo que se propone que quizá otro gen puede ser el verdadero
causal de la enfermedad, lo que sugiere que el gen FcRL3 se encuentre en
desequilibrio de ligamiento con otro gen.
67
8. CONCLUSIONES Los resultados mostrados en este trabajo indican que el alelo C del SNP -169
T/C del gen FcRL3 se asocia con protección en la población pediátrica
mexicana con ARJ.
El haplotipo TGGG del gen FcRL3 está asociado con susceptibilidad a
desarrollar ARJ en nuestra población, contradictorio a lo reportado por los
japoneses, demostrando que este haplotipo no contiene ningún alelo que
participe en la etiología de la enfermedad. De esta manera sugerimos que para
entender la etiología de la ARJ es necesario estudiar otros genes que se
encuentren adyacentes al gen FcRL3.
Los cuatro alelos (TGGG) tienen alto desequilibrio de ligamiento
Estamos contribuyendo en la etiopatología de la enfermedad en nuestra
población.
68
9. CONSIDERACIONES ÉTICAS, LEGALES Y SOCIALES
La medicina genómica tiene un profundo impacto a nivel ético, legal y social.
Dentro de sus implicaciones se pueden señalar las consecuencias del
conocimiento del estado de portador de una enfermedad genética que se
desarrollará en el futuro y el debate sobre ideas eugenésicas y racistas, entre
otras.
El conocimiento obtenido de nuestros resultados ayudará a contribuir de
manera significativa a entender la etiopatología de la ARJ, con esto podremos
participar y apoyar a cumplir los objetivos de la medicina genómica, la cual en
un futuro permitirá desarrollar tests de diagnóstico genético que pueden
aplicarse a personas enfermas o a aquellas que todavía no han desarrollado la
ARJ (diagnóstico presintomático). También pueden aplicarse para el
diagnóstico antenatal y embrionario preimplantacional. En su aplicación el
consejo o asesoramiento genético tiene un rol esencial.
El consejo o asesoramiento genético es un proceso de comunicación que se
realiza en el ámbito del acto médico, el cual entrega información acerca de las
características de las afecciones genéticas, los riesgos de ocurrencia y de
recurrencia y los impactos familiares que ellas producen a él o a los individuos
afectados.
El consejo genético entregará la información en términos simples, al alcance de
las personas que la están recibiendo. Debe ser imparcial y objetiva, ya que
69
puede involucrar conductas reproductivas que son muy personales o
decisiones relacionadas con el futuro individual y familiar. Por ello, es
aconsejable la cooperación de grupos de soporte (grupos religiosos,
asociaciones de enfermos, por ejemplo).
En la medicina de la era genómica, el consejo genético plantea interrogantes
bioéticas de gran trascendencia que obligan a una reflexión desde múltiples
puntos de vista, tales como el antropológico, médico y social. Esta reflexión
debe realizarse a la brevedad para poder enfrentar el gran desarrollo de la
genética médica en la medicina genómica que ya se vislumbra. La perspectiva
bioética personalista representa un buen camino para enfrentar este desafío.
Uno de los marcos referenciales para esta discusión lo constituye la
Declaración Universal sobre el Genoma Humano y los Derechos Humanos
(UNESCO, París, 11 Noviembre de 1997): “Las investigaciones sobre el
genoma humano y sus aplicaciones abren inmensas perspectivas de
mejoramiento de la salud de los individuos y de toda la humanidad, pero
destacando que deben, al mismo tiempo, respetar plenamente la dignidad, la
libertad y los derechos de la persona humana, así como la prohibición de toda
forma de discriminación fundada en las características genéticas”.
El Consejo Genético, por su naturaleza de acto médico, tiene implicancias a
nivel bioético muy significativas que ameritan una reflexión, primero desde
una perspectiva bioética principalista y, luego, desde una perspectiva bioética
personalista.
70
La perspectiva bioética principalista se fundamenta en los principios básicos
de la autonomía, en donde los individuos poseen la capacidad de deliberar y
actuar en consecuencia. El sometimiento al consejo genético debe ser libre,
voluntario y sin coacción. El principio de autonomía se ve reflejado en el
consentimiento informado. Este incluye una información sobre los
procedimientos que se utilizarán y sus consecuencias. Se debe considerar la
opinión del interesado en cuanto a conocer o no el diagnóstico que se esté
tratando y los eventuales impactos psicológicos de ello. En el ámbito del
Consejo Genético a nivel prenatal, el médico debiera entregar toda la
información técnica o, si tiene objeción de conciencia por la eventualidad que
el diagnóstico prenatal conlleve a un aborto, debiera derivar al paciente a un
centro especializado.
El estudio genético sólo debe ofrecerse cuando no produzca daño psicológico,
no altere las relaciones familiares ni ponga en peligro la situación laboral o de
seguros médicos. El estudio genético sólo debe ofrecerse cuando se estima que
los beneficios del estudio sobrepasan los riesgos y que los resultados
mejorarán el bienestar del individuo. La relación médico-paciente es
fundamental para que este principio pueda tener lugar. Existe siempre un
conflicto entre el beneficio individual y el beneficio de terceros; entre el
derecho a la autonomía y la beneficencia.
Cuando se hace referencia al término información genética, se debe distinguir
entre el material genético propiamente dicho y la información genética. El
71
material genético —el genoma— se encuentra en nuestras células
determinando nuestra esencia como individuos, en tanto que la información
se obtiene al realizar una serie de técnicas o metodologías que permiten la
extracción de datos específicos que en su conjunto integran la información
genética. Esta información, además de descubrir datos esenciales del
individuo, puede revelar el estado de salud presente, y en determinados casos
hasta el futuro o, por lo menos, las predisposiciones a padecer ciertas
enfermedades. Puede involucrar no sólo a la persona sino también al grupo
familiar al que pertenece, y en ciertos casos la información permite descubrir
la identidad de delincuentes o víctimas o establecer lazos de filiación en los
casos de la prueba de paternidad. Esta información tan propia y valiosa para
el individuo merece un resguardo jurídico; se menciona ya un derecho a la
intimidad genética que puede ser definido como el derecho a determinar las
condiciones, límites y formas de recolección, tratamiento, utilización y
conservación de la información genética de una persona o grupo de
individuos. La Declaración sobre Derechos Humanos y Genoma Humano
expresa: “Artículo 7o. Se deberá proteger en las condiciones estipuladas por
ley la confidencialidad de los datos genéticos asociados con una persona
identificable, conservados o tratados con fines de investigación o cualquier
otra finalidad”.
La confidencialidad surge del secreto médico, presente siempre en la ética
médica desde el Juramento Hipocrático. La excepción corresponde cuando se
puede ocasionar daños a terceros o a la sociedad.
72
10. ANEXO 1. (García, 2006)
10.1 Detección del producto de PCR
El marcaje del producto en PCR puede conseguirse mediante el empleo de
sondas de DNA (TaqMan, molecular beacons, scorpions, etc) o mediante
reactivos de unión a la doble cadena de DNA (SYBR Green. E.U.A). A
continuación se describe el método de marcaje empleado en este trabajo.
10.2 Sondas TaqMan
Las sondas TaqMan son oligonucleótidos de entre 20-40 pb diseñadas para
que hibriden con una región interna del producto de PCR. Una sonda TaqMan
esta constituida por un marcador fluorescente en el extremo 5’ llamado
reporter (R) y un quencher (QR) en el extremo 3’ (Figura 12). Existen diversas
moléculas que pueden hacer de R y de QR, pero sólo son válidas aquellas
combinaciones en la que el espectro de emisión del R esté dentro del espectro
de absorción del QR. De esta forma, cuando la sonda es excitada con la
longitud de onda adecuada, la energía emitida por el R es absorbida por el QR
(a este fenómeno se le conoce como FRET, Transferencia de Energía
Fluorescente mediante Resonancia). La proximidad del R y del QR evita
cualquier tipo de emisión fluorescente mientras la sonda esté intacta.
Al comienzo de la reacción los primer’s hibridan en la región complementaria
al DNA y la Taq polimerasa se encarga de añadir nucleótidos desde los
73
extremos 3’ de los primer’s (cebadores), al mismo tiempo que la sonda
TaqMan ha hibridado en su región específica situada entre los primer’s. Una
vez que la Taq polimerasa alcanza el extremo 5’ de la sonda y gracias su
actividad 5’-exonucleasa, la sonda es fragmentada separando el R del QR con
la consiguiente producción de luz fluorescente cuando la muestra sea
excitada. En el caso de que la sonda no hibride perfectamente, la Taq
polimerasa libera la sonda sin fragmentarla y por lo tanto no se producirá
emisión de luz.
El empleo de sondas permite aumentar la especificidad obtenida previamente
por los primer’s evitando de este modo falsos positivos por amplificaciones
inespecíficas. Además facilita la identificación de mutaciones y permite el uso
de reacciones multiplex (realizar múltiples experimentos simultáneamente) al
poder utilizar varias sondas con fluoróforos distintos a la vez (FAM, VIC, TET,
HEX o JOE).
74
Figura 12. Producción de señal fluorescente mediante sondas TaqMan. [La Taq polimerasa (amarillo) añade nucleótidos a partir de los extremos 3’ de los primer’s. La sonda marcada con el reporter (verde) y el quencher (rojo) hibrida en una posición interna entre los primer’s. La Taq polimerasa avanza y cuando llega a la sonda la desplaza. La actividad 5’ exonucleasa de la Taq polierasa rompe la sonda. El R queda separado del QR dando lugar a la emisión de luz. La Taq polimerasa termina de amplificar la secuencia existente entre los cebadores].
75
Alternativamente se pueden emplear sondas TaqMan MGB. Éstas, permiten el
empleo de secuencias más cortas que las sondas TaqMan, lo que resulta muy
útil en ensayos de discriminación alélica donde una muestra se somete a
amplificación en presencia de dos sondas cuya secuencia se diferencia en una
sola base. Esto es posible gracias al empleo de un QR especial denominado
MGB, capaz de aumentar la Tm de la sonda.
10.3 Detección de SNPs con sondas Taqman
Una de las aplicaciones de la PCR es la detección SNPs. Para el caso de un
polimorfismo puntual con dos variantes, la muestra es sometida a la
amplificación de un fragmento de PCR en presencia de dos sondas marcadas
con fluoróforos diferentes y cuya secuencia se diferencia únicamente en la
base del polimorfismo en estudio. Al término de la reacción de PCR se lee la
fluorescencia existente en la muestra con los filtros de emisión específicos de
los dos fluorocromos usados de tal forma que la detección de una única señal
fluorescente indica homocigosis de uno u otro alelo mientras que dos señales
fluorescentes indican heterocigosis (Figura 13). El software del equipo ABI
Prism 7000 permite obtener gráficamente y de forma intuitiva el genotipo
final de las muestras (Figura 13). También podemos analizar los SNPs en base
a la curva de amplificación observando la fluorescencia
de cada una de las sondas.
76
Figura 13. Diagrama que muestra los genotipos de un SNP. Esta imagen muestra los genotipos de 92 individuos. Algunos individuos que tienen el genotipo C/C son detectados por la sonda Vic, mientras que otros son homocigotos para G/G son detectados por la sonda Fam. Por otro lado, también hay individuos que presentan ambos alelos, ellos representan al genotipo heterocigoto. Los cuadros en negro son los controles negativos.
77
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