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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA Iztapalapa
“Reproducción in vitro del garambullo, Myrtillocactus geometrizans (Mart.) Console”
T E S I N A
Que para obtener el grado de Especialización en Biotecnología
P R E S E N T A
Biólogo José Luis Gómez Juárez
Asesor Dr. Francisco Cruz Sosa
México D.F. Julio, 2004
El jurado designado por la División de Ciencias Biológicas y de la Salud de la Universidad Autónoma Metropolitana unidad Iztapalapa aprobó la comunicación idónea de los resultados que presento el alumno José Luis Gómez Juárez de la Especialización en Biotecnología. Asesor:
Dr. Francisco Cruz Sosa Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa
Lector:
Dr. Jorge Eduardo Morales Torres Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa
AGRADECIMIENTOS Al Dr. Francisco Cruz Sosa, por la oportunidad que me brindo para la realización de esta especialización, y por su constante apoyo y entusiasmo para la conclusión de la mismo. Al Dr. Jorge Eduardo Morales Torres por la revisión y crítica del trabajo original y sobre todo por compartir su experiencia con cactáceas. A los M. en C. Luis Antonio Nava Vargas y Raúl Viveros Calderón, por sus críticas constantes y su apoyo incondicional para la realización del trabajo experimental, y muy por encima de todo, por brindarme su amistad y confianza. Por su amistad y compañerismo que me mostraron durante el tiempo que trabajamos juntos les agradezco a Leonardo, Francisco, Elvia, Carlos, Rebeca y sobre todo a Lilia, que siempre me apoyo con el material de laboratorio. También agradezco infinitamente a mi familia, por el apoyo total que me dieron cuando decidí retomar mi desarrollo académico tanto en el aspecto económico como en el personal. Especialmente gracias papá por dejarme faltar tanto al trabajo.
RESUMEN La reproducción in vitro de cactáceas se ha desarrollado en México lentamente y sólo de manera reciente y en
algunas cuantas especies. Este trabajo es una contribución al desarrollo e implementación de protocolos de
cultivo de tejidos que permitan la reproducción de cactáceas para la recuperación de especies amenazadas y
para inclusive abastecer la gran demanda comercial por parte de coleccionistas a través del desarrollo de la
metodología para lograr la reproducción in vitro de Myrtillocactus geometrizans (Mart.) Console. Se
seleccionó esta especie porque se pueden conseguir las semillas de manera accesible y en gran cantidad, no se
encuentra bajo ninguna categoría en la norma 059, y porque tampoco existen datos sobre su reproducción in
vitro, por lo que se consideró una especie adecuada para el estudio. Como fuente de tejido se emplearon
plántulas obtenidas a partir de germinación de semillas. Las semillas se sometieron a 5 diferentes tratamientos
de desinfección y se colocaron en frascos de cultivo conteniendo medio Murashige y Skoog (MS) con 1.5 %
de sacarosa y solidificado con 0.2 % de phytagel, ajustando el pH a 5.7 manteniéndose los frascos a 27 ± 2 °C
con un fotoperíodo de 16/8 h luz/obscuridad con lámparas de luz de día a una intensidad de 1000 lux/m2.
También se evaluaron dos métodos de inducción de germinación. Una vez que las plántulas alcanzaron un
tamaño aproximado de entre 5 y 7 mm, se obtuvo de cada plántula un explante apical y uno basal,
utilizándose también plántulas completas para determinar si existía diferencia de numero de brotes respecto al
origen de los explantes. Estos explantes se sometieron a diferentes concentraciones de BA
(bencilaminopurina) y ANA (ácido naftalenacético) de acuerdo a la referencia de diversos trabajos. Se
registro numero de brotes obtenido por tratamiento. El enraizamiento posterior se consiguió subcultivando las
plántulas en un medio con diferentes hormonas, y cuando se desarrollaron raíces eficientes, se aclimataron en
un invernadero con condiciones especiales. Los resultados aquí encontrados así como los evaluados durante la
revisión bibliográfica sugieren que el uso de la biotecnología para la reproducción in vitro de cactáceas
requiere para cada especie de análisis adecuados para evaluar entre otras cosas el tipo y concentración de
reguladores y el método de aclimatación a utilizarse con el fin de hacer más eficiente el proceso de la
micropropagación.
INDICE
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 1 2. ANTECEDENTES ........................................................................................................................... 6 2.1 Cactáceas..................................................................................................................................... 6 2.2 Myrtillocactus geometrizans ...................................................................................................... 7 2.3 Micropropagación de cactáceas................................................................................................ 8 2.4 Reguladores de crecimiento en micropropagación de cactáceas....................................... 13 3. JUSTIFICACIÓN........................................................................................................................... 16 4. OBJETIVOS.................................................................................................................................. 17 4.1 OBJETIVO GENERAL................................................................................................................ 17 4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS....................................................................................................... 17 5. METODOLOGIA ........................................................................................................................... 19 5.1 Desinfección de semillas y germinación................................................................................ 19 5.2 Obtención de explantes............................................................................................................ 21 5.3 Inducción de formación de raíz ............................................................................................... 23 5.4 Aclimatación a invernadero ..................................................................................................... 24 6.- RESULTADOS Y DISCUSION.................................................................................................... 25 6.1 Desinfección y germinación..................................................................................................... 25 6.2 Explantes y generación de brotes........................................................................................... 29 6.5 Formación de raíz...................................................................................................................... 34 6.6 Aclimatación a invernadero ..................................................................................................... 36 7. RESUMEN DE LOS RESULTADOS ............................................................................................ 37 8. CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 39 9 LITERATURA CITADA.................................................................................................................. 40 ANEXOS ........................................................................................................................................... 46
1. INTRODUCCIÓN
La biotecnología es una rama de las ciencias que ha tenido un gran auge en las
últimas décadas. En el área vegetal la biotecnología se orienta a la superación de
los factores limitantes de la producción agrícola a través de la obtención de
variedades de plantas tolerantes a condiciones ambientales negativas como
sequías o suelos ácidos, plantas que realicen de forma más eficiente el proceso
fotosintético, la fijación de nitrógeno o la captación de elementos nutritivos e
inclusive se desarrolla la obtención de plantas más productivas o de mejor
contenido alimenticio. También se busca el desarrollo de plantas resistentes a
enfermedades y plagas o en su defecto la producción de insecticidas, herbicidas y
fungicidas más específicos y menos tóxicos. Algunas de las técnicas desarrolladas
y utilizadas para estos fines abarcan el cultivo de tejidos, fusión de protoplastos,
cultivo in vitro (literalmente en cristal) de meristemos, producción de nódulos e
ingeniería genética.
Por cultivo de tejidos se entiende comúnmente a la regeneración de plantas
completas a partir de una masa amorfa de células. Esta técnica consiste en cultivar
fragmentos vegetales denominados explantes, originados a partir de ápices de raíz
y tallo, primordios de hoja, flores, frutos inmaduros, órganos aislados, embriones,
ovarios, óvulos, anteras o polen, en forma aséptica y en medios que contienen
elementos nutritivos, vitaminas y factores de crecimiento (Hurtado y Merino,
1
2000).Generalmente se reconocen dos formas principales de regeneración de
plantas in vitro. Una consiste en la eliminación de la dominancia apical que resulta
en la aparición y multiplicación de brotes axilares y se conoce como
micropropagación. En la otra, llamada embriogénesis somática, se forman
embriones con un eje tallo-raíz a partir de células somáticas (Vasil 1994).
El término “cultivo de tejidos” tiene su origen en el cultivo de tejidos animales, y
diversos autores consideran que es un error aplicarlo al área vegetal ya que el
principal objetivo de la técnica es generar plántulas completas y no sólo tejidos
aislados, aunque el explante provenga de un determinado tipo de tejido,
sugiriéndose utilizar mejor “cultivo de plántulas” o “micropropagación” (Kyte y
Kleyn, 2003). Una definición de micropropagación que parece adecuada es la
adoptada por Arias A.A. (2001) de ... “producción de plantas a partir de porciones
muy pequeñas de tejido o células cultivadas asépticamente en tubo de ensayo o
en otro recipiente en que se controlan estrictamente las condiciones de ambiente y
nutrición”. De cualquier forma es importante entender que ya sea que lo llamemos
clonación, cultivo de tejidos, micropropagación o reproducción in vitro, el proceso
es el mismo, es decir, un método de reproducción vegetativa para multiplicar
plantas.
Este método o proceso implica cuatro fases básicas, desde la obtención del
explante hasta la transferencia de la nueva planta a condiciones de invernadero,
que son:
Fase I: Establecimiento del explante o iniciación
Fase II: Multiplicación
Fase III: Enraizamiento
Fase IV: Aclimatación
Estas fases pueden o no superponerse en ciertos casos, y los requerimientos de
cada fase varían ampliamente de especie a especie (Kyte y Kleyn, 2003)
Cultivo de embriones, cultivo de células y cultivo de callo son términos que a
menudo se incluyen en la amplia definición de cultivo de tejidos, aunque sean
reconocidos cada uno por su nombre. El cultivo de embriones puede entenderse
por el “rescate” de un embrión de una semilla provocando su desarrollo a plántula
y multiplicación en cultivo, o como embriogénesis somática, en donde se induce la
formación de embriones a partir de células somáticas (vegetativas o asexuales).
El cultivo de células como su nombre lo indica se refiere a las células, las cuales
se cultivan en medios sólidos como el agar, o líquidos, recibiendo entonces el
nombre de suspensión celular. El cultivo de callo es la multiplicación de una masa
desorganizada, no diferenciada o desarrollada de células (callo) generalmente en
medio sólido.
Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales se han empleado desde más de un
siglo, con los primeros trabajos como el de Sacks y Knops sobre una solución
conteniendo los principales nutrientes de las plantas superiores (ver anexo I). El
cultivo de tejidos vegetales es una herramienta importante en el estudio de la
naturaleza del crecimiento vegetal, de los efectos de las sustancias reguladoras del
crecimiento, para la obtención de material vegetativo de alta calidad genética y
fitosanitaria, el estudio de fenómenos morfogenéticos e inclusive para la
propagación masiva de especies de interés económico y biológico.
De forma general podemos agrupar a las aplicaciones de esta técnica en tres áreas
principales:
a) rápida micropropagación in vitro de plantas,
b) desarrollo in vitro de variedades mejoradas y
c) producción de metabolitos secundarios de interés económico para el cultivo de
células de plantas.
Las ventajas principales del cultivo in vitro de plantas son una rápida reproducción
y multiplicación de cultivos, la obtención de cultivos sanos, libres de virus y
agentes patógenos, la posibilidad de obtener material de siembra a lo largo de
todo el año, la posibilidad de reproducir especies de difícil reproducción o de
desarrollo y crecimiento lento, y por último el mejorar las condiciones de
almacenamiento, transporte y comercialización de germoplasma.
Algunas de las técnicas aplicadas son ya prácticamente de dominio público y tienen
además costos relativamente bajos. Este tipo de técnicas son usadas por cerca de
600 compañías en todo el mundo para producir más de 500 millones de unidades
de más de 50,000 variedades de plantas (Vasil, 1994). Como ejemplo puede
mencionarse que son usadas ampliamente para la producción de plantas
ornamentales o la vid, y con enorme potencial en plantas tropicales como la yuca,
el plátano, la papaya, etc. Un aspecto que es importante de destacar en el
desarrollo de la biotecnología agrícola, es que tanto los procesos como los
productos que se utilizan como insumos, están fuertemente condicionados por las
características ecológicas, climáticas y geográficas, así como por la diversidad
biológica y genética de cada área o región y por lo tanto, el desarrollo
biotecnológico tiene que ser llevado a cabo in situ.
De igual forma, es cada vez mayor el número de jardines botánicos que utilizan
técnicas de cultivo in vitro para propagar y conservar especies silvestres, debido a
las muchas ventajas que pueden ofrecer dichas técnicas sobre las técnicas
tradicionales de propagación, pudiendo obtener una gran cantidad de organismos
a partir de en algunos casos únicamente una yema o semilla (Fay M.F., 1994)
2. ANTECEDENTES
2.1 Cactáceas
La familia Cactaceae es endémica del continente americano, con una distribución
que va desde el norte de Canadá hasta la Patagonia Argentina, encontrándose
inclusive en las islas Galápagos y las Antillas. Esta familia comprende tres
subfamilias: Pereskioideae, Opuntioideae y Cactoideae (Bravo y Sheinvar, 1999).
México tiene dentro de su territorio a un gran número de especies de cactáceas,
de las cuales un alto porcentaje son endémicas. De las aproximadamente 2000
especies con que cuenta esta familia, alrededor de 54 géneros y 850 especies se
encuentran en nuestro país, de las cuales posiblemente más de 400 especies y un
25 % de los géneros son endémicos (Arias, 1997).
Además de su importancia ecológica en el mantenimiento de la estabilidad de los
ecosistemas de las regiones áridas y semiáridas del continente americano, las
cactáceas han sido ampliamente utilizadas desde épocas antiguas por los
habitantes de esas zonas como alimento, forraje, material de construcción, plantas
medicinales e inclusive de ornato (Bravo-Hollis y Sánchez-Mejorada, 1991).
La mayor parte de las cactáceas son de un desarrollo extremadamente lento en la
naturaleza, no se auto polinizan, presentan propagación vegetativa mínima o nula
y sus semillas son una fuente importantísima de alimento para roedores, aves e
insectos. A esto hay que sumarle las presiones ejercidas por la destrucción del
hábitat, plagas y sobrecolecta (Rodríguez-Garay y Rubluo, 1993) lo que ha
colocado a una gran parte de las especies de cactáceas mexicanas en las
categorías de amenazadas o en peligro de extinción de acuerdo a la legislación
vigente (Norma Oficial Mexicana NOM-ECOL-059-1994).
2.2 Myrtillocactus geometrizans
Es una cactácea columnar muy ramificada, de hasta 6 metros de altura (Fig. 1),
que florece en los meses de febrero a abril. Es de fruto oblongo, tipo baya, de 1 a
2 cm de diámetro, de color verde inicialmente (Fig. 2) que cambia a rojo púrpura
en la madurez. El género se encuentra representado en México por tres especies, y
es endémico al país. Actualmente ninguna de las especies se encuentran
catalogadas dentro de la norma 059-ECOL-2001. Dichas especies son:
Myrtillocactus cochal: endémico de Baja California Myrtillocactus schenkii: endémico de Puebla y Oaxaca Myrtillocactus geometrizans (Mart.) Console M. geome rizans se distribuye en los estados de Aguascalientes, Durango,
Guerrero, Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, México, Michoacán, Nuevo León, Oaxaca,
Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Tamaulipas, Veracruz y Zacatecas
t
Usos: El fruto se consume fresco, en mermeladas, licor, pasas. La flor en
ensaladas y fritas. La planta se usa como cerca e inclusive como contenedor de
forraje y mazorcas. Muy usado como porta-injerto para propagación de cactáceas
con fines ornamentales.
Se seleccionó esta especie porque se pueden conseguir las semillas de manera
accesible y en gran cantidad, no se encuentra bajo ninguna categoría en la norma
059, y porque tampoco existen datos sobre su reproducción in vitro, por lo que se
considero una especie adecuada para el estudio.
2.3 Micropropagación de cactáceas
Actualmente, en la reproducción de cactáceas se emplean dos tipos de métodos de
propagación: los empleados tradicionalmente que incluyen la germinación de
semillas, los injertos y la propagación por esquejes, y aquellos con desarrollo de
biotecnología, mediante la micropropagación o cultivo de tejidos bajo condiciones
in vitro. Las técnicas de cultivo de tejidos ofrecen una oportunidad para propagar
cactus raros mucho más rápido de lo que se puede hacer por los métodos
convencionales (Stuppy y Nagl, 1992, Brijmohan S.B., 1999). A pesar de su
versatilidad estas técnicas se han aplicado muy poco en cactáceas no obstante de
por ejemplo el alto valor ornamental de estas plantas sin mencionar el biológico.
(Fay y Gratton, 1992, Pérez C.J. et al., 1999),
Fig 1.- Myrtillocactus geometrizans en su hábitat
Fig 2.- Frutos inmaduros de M. geometrizans
Esto tal vez se deba a lo difícil que puede ser reproducir cactáceas, sobre todo si
se usan explantes de plantas adultas, ya que el área de meristemos se encuentra
bajo el tejido de la areola, y se puede dañar directamente al remover las espinas o
por contacto con los agentes desinfectantes después de la remoción de estas
(Gratton y Fay, 1990).
La micropropagación de cactáceas no obstante, ofrece amplias ventajas para la
producción masiva de especies en vías de extinción, así como el desarrollo de
plantas de alta calidad fitosanitaria (libres de patógenos). Por ejemplo, debido a
razones aún no bien identificadas, las cactáceas cultivadas in vitro tienen tasas de
crecimiento mucho más altas que las de plantas cultivadas de forma tradicional,
alcanzando en tan solo unos meses tallas que tardarían en alcanzar un año o más
en condiciones normales (Malda, Backhaus y Martín, 1999).
De igual forma, en un estudio sobre cultivos in vitro de más de 7 años de
antigüedad de Mammillaria san-angelensis no se detectaron variaciones de
cantidad y calidad del material genético, es decir, hubo estabilidad genética desde
el material original por lo que las nuevas plantas podían usarse para reintroducción
en su hábitat de forma segura desde los puntos de vista de genética y
conservación (Palomino et al., 1999)
La reproducción in vitro se aplica por dos vías principalmente: Morfogénesis y
Embriogénesis somática. En la primera se debe disponer de explantes, que
provienen de la germinación de semillas al natural o in vitro, que es lo más
recomendable cuando se trata de micropropagación con fines de conservación ya
que así se mantiene la diversidad genética, o también de tejido de plantas
adultas, que produciría estrictamente clones (Fay y Gratton, 1992). El objetivo es
la inducción de la generación de múltiples brotes en el explante, para lo cual, el
mismo se inocula en un medio de cultivo, agregando una citocinina. El
enraizamiento posterior se consigue subcultivando las plántulas en un medio libre
de hormonas, y cuando han desarrollado raíces eficientes, se aclimatan en un
invernadero con condiciones especiales (Fig. 3).
La embriogénesis somática se basa en la producción de un callo a partir de brotes
previamente producidos por la vía anterior, para lo cual se emplea en el medio de
cultivo una aplicación por 30 días de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). El callo
finalmente se transfiere a un medio sin hormonas y en estado de gel. Transcurrido
un tiempo (a partir de 8 semanas), si todo da resultado, pueden diferenciarse en la
estructura, las formas características de un embrión. Generalmente en las técnicas
de micropropagación de cactáceas se utilizan medios sólidos, aunque hay autores
que sugieren el uso de medios líquidos para evitar posibles dificultades en el
intercambio de agua y nutrientes (Ortiz-Montiel y Alcántara, 1997)
Fig 3. Ejemplo de micropropagación de cactáceas
2.4 Reguladores de crecimiento en micropropagación de cactáceas
Los reguladores de crecimiento, también denominados hormonas, influyen
directamente en el crecimiento y desarrollo de las plantas. La mayoría de ellos se
produce de manera natural, pero es necesario añadirlas a los medios de cultivo,
aunque de manera selectiva ya que cada especie responde de manera diferente a
cada tipo e inclusive concentración de estas sustancias. Actualmente se reconocen
cinco tipos básicos de sistemas químicos de reguladores del crecimiento divididos
en tres grupos principales:
Promotores del crecimiento: auxinas, citocininas y giberelinas
Inhibidores del crecimiento: ácido abscísico
Etileno
Para la micropropagación son de relevante importancia los promotores del
crecimiento, por lo que solo se analizarán estos dentro de este apartado, ya que el
ácido abscísico y el etileno son poco empleados.
Las auxinas y las giberelinas estimulan principalmente la elongación celular,
mientras que las citocininas estimulan la división celular. Las auxinas son
fitohormonas que influyen en el alargamiento celular, la formación de raíz,
suprimen la formación de brotes laterales, y se utilizan generalmente en los
medios de cultivo para micropropagación ya sea combinadas con citocininas
durante la etapa de multiplicación, o solas, durante la etapa de enraizamiento. Las
auxinas más utilizadas son:
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
Ácido Indolbutírico (AIB)
Ácido Indolacético (AIA)
Ácido Naftalenacético (ANA)
Las citocininas son reguladores del crecimiento que se requieren en los medios de
cultivo oara promover la división celular, multiplicación de brotes y proliferación de
yemas laterales. Ayudan a retardar el envejecimiento e influencian el transporte de
las auxinas. Generalmente se excluyen de los medios para enraizamiento. Las
citocininas más empleadas son:
Bencil-aminopurina (6-bencilaminopurina)(BA o BAP)
Cinetina (6-Furfuril-aminopurina)
Zeatina
Las giberelinas son sustancias que influyen en la elongación celular y alargamiento
del tallo. Hasta ahora se han identificado 34 tipos de giberelinas. Algunos de estos
tipos se presentan en los embriones, interviniendo en el proceso de la
germinación. El ácido giberélico se utiliza algunas veces como regulador del
crecimiento para suplementar a las auxinas y citocininas.
En el caso de las cactáceas se puede observar en el anexo II los principales
reguladores empleados en los diferentes estudios. Analizando de forma detallada
dicho anexo uno percibe de forma inmediata tal y como lo menciona Giusti P. et al.
(2002), que el interés en la micropropagación de cactáceas con fines
conservacionistas ha recibido mucha atención apenas en años recientes y lo más
importante, que las diferentes hormonas y concentraciones de las mismas
solamente en pocos casos son idénticas para más de una especie, lo que parece
apoyar la sugerencia de que cada especie de cactus puede requerir una
combinación particular de hormonas para su reproducción in vitro.
3. JUSTIFICACIÓN
A pesar de sus beneficios, la reproducción in vitro de cactáceas se ha desarrollado
en México muy poco y sólo de manera reciente y en algunas cuantas especies
(Sánchez Martínez, 1994). Es pues de radical importancia el continuar
desarrollando e implementando protocolos de cultivo de tejidos que permitan la
reproducción de cactáceas para la recuperación de especies amenazadas y para
inclusive abastecer la gran demanda comercial por parte de coleccionistas. Es
necesario también el que dichos protocolos se hagan de conocimiento y uso
general ya que por ejemplo, cuando se hace una revisión de los trabajos
publicados, no existe una metodología básica definida para la manipulación y
desinfección de semillas, algo elemental si se desea obtener material o explantes
de plántulas.
16
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Desarrollar la metodología para lograr la reproducción in vitro de Myrtillocactus
geometrizans (Mart.) Console.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Evaluar la efectividad de diferentes protocolos de desinfección de semillas
en M. geometrizans.
Establecer un protocolo adecuado para la manipulación de semillas usadas
en la reproducción in vitro de M. geomet izans r
Evaluar la efectividad de dos diferentes métodos de inducción de
germinación, la temperatura y el ácido giberélico en M. geometrizans
Determinar del porcentaje de germinación de semillas de M. geometrizans
en las condiciones sugeridas
Obtener explantes a partir de plántulas de M. geometrizans
Establecer la concentración adecuada de reguladores de crecimiento para la
inducción de brotes en los explantes obtenidos
17
Determinar si existe diferencia significativa en la obtención de brotes
respecto al origen del explante
Encontrar la concentración adecuada de reguladores de crecimiento para la
inducción de formación de raíz.
Establecer las condiciones de la adaptación de plantas a condiciones de
invernadero.
18
5. METODOLOGIA
5.1 Desinfección de semillas y germinación
Se procedió a la obtención de las semillas a partir de los frutos colectados en una
localidad ubicada en el municipio de Tula de Allende, Hidalgo, México, para lo cual
se abrieron los frutos y se colocaron en un colador, lavándose con agua a presión
para eliminar la pulpa aislando las semillas. las cuales fueron sometidas en dos
grupos a 5 diferentes condiciones de desinfección. Un grupo se sometió a
inmersión a 50 ° C por 5 min para inducir la germinación (Reyes, 1997) y el otro
grupo sin preinducción para usarse como testigo. Se prepararon tres frascos con
20 semillas cada uno por tratamiento en medio Murashige y Skoog (MS), siendo un
total de 600 semillas, y se colocaron en una incubadora a 27 ± 2 ° C, con un
fotoperíodo de 16 h. de luz, evaluándose la presencia de germinación y
contaminación diariamente.
Los tratamientos consistieron en:
Tratamiento No. 1: Villavicencio et. al. 1999.
a) Lavar las semillas en agua esterilizada y jabón por 5 min
b) Colocarlas en etanol al 70 % por 6 min
c) 20 min en hipoclorito de sodio concentración comercial (6%) + 3
gotas de tween 20 por cada 100 mL de solución.
d) d) Cinco enjuagues con agua destilada
19
Tratamiento No. 2: Martínez-Vázquez y Rubluo, 1989.
a) 20 min en hipoclorito de sodio concentración comercial (6%)
b) Enjuague tres veces con agua de lluvia
Tratamiento No. 3: Pérez-Molphe et al 1998.
a) Cinco enjuagues con extran 0.1 %
b) 1 min en etanol al 70 %.
c) 25 min en hipoclorito de sodio al 2%
d) 4 enjuagues con agua estéril
Tratamiento No. 4: Reyes-Santiago, 1997
a) 5 min en agua estéril con cloro comercial al 30 % (30mL de cloro en
70 de agua)
b) Lavar en una solución de 1 g de Captan en 100 mL de agua estéril
Tratamiento No. 5: Propuesto en este trabajo
a) Lavar las semillas por 5 min en extrán 0.1 %
b) 5 min en etanol 70 %
c) 10 min en una solución de 1 g de Captan en 100 mL de agua estéril.
d) 20 min en hipoclorito de sodio concentración comercial (6%) + 3
gotas de tween 20 por cada 100 mL de solución.
e) 5 enjuagues con agua esterilizada.
20
Al mismo tiempo se procedió a determinar la respuesta de inducción de
germinación de semillas de M. geometrizans por el ácido giberélico. Para esto se
prepararon por triplicado frascos conteniendo cada uno lotes de 20 semillas
evaluando las siguientes concentraciones (mg/L): 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5.0,
7.5, 10.0, 15.0 y 20.0 utilizando para ello un total de 660 semillas.
Por último, y una vez determinado el procedimiento más adecuado para
desinfección de semillas, se colocó un lote de estas a germinar en sustrato
esterilizado de tezontle fino, gravilla y tierra negra cernida en proporción 2:2:1
para determinar si existía diferencia entre la germinación in vitro y la germinación
en sustrato de uso común.
5.2 Obtención de explantes
Como fuente de explantes se utilizaron plántulas obtenidas a partir de la
germinación de las semillas. Una vez que las plántulas alcanzaron un tamaño
aproximado de entre 5 y 7 mm, se obtuvieron los explantes de acuerdo a una
modificación de la metodología Martínez-Vázquez y Rubluo (1989) obteniendo de
cada plántula un explante apical y uno basal (Fig 4). También se utilizaron
plántulas completas como testigo, todo esto con el fin de determinar si hay
diferencias en el numero de brotes obtenidos por tipo de explante. Se colocaron 4
explantes por frasco, o plántulas en su caso, con tres repeticiones por
concentración de benzilaminopurina (BA), siendo las concentraciones 0.0, 0.5, 1.0,
21
2.0 y 3.0 mg/L, todos con 0.1 mg/L de ácido indol acético (Tabla 1), obteniendo
un total de 180 sujetos experimentales.
Fig 4. Obtención de explantes de plántulas de M. Geometrizans
Todos los frascos contenían medio MS con 1.5 % de sacarosa y solidificado con
0.2 % de phytagel, ajustando el pH a 5.7 manteniéndose los frascos a 27 ± 2 °C
con un fotoperíodo de 16/8 h luz/obscuridad con lámparas de luz de día a una
intensidad de 1000 lux/m2. Los explantes se cambiaban a medio fresco cada
cuatro semanas.
CONCENTRACIÓN DE BA
(mg/L)
CONCENTRACIÓN DE AIA
(mg/L)
0.0 0.1
0.5 0.1
1.0 0.1
2.0 0.1
3.0 0.1
Tabla 1. Concentración de reguladores del crecimiento para inducción de brotes
22
5.3 Inducción de formación de raíz
Para la etapa de enraizamiento se colocaron brotes en medio MS. Para la inducción
de formación de raíz se utilizaron el AIA y el AIB que de acuerdo a la revisión
bibliográfica son los reguladores que mejores resultados han proporcionado en el
cultivo de cactáceas in vit o (anexo II), en las concentraciones mostradas en la
tabla 2.
r
Las concentraciones de 0.0 mg/L con y sin carbón activado son los testigos. La
concentración más alta se determinó en función a la concentración máxima
reportada en la literatura. Para cada concentración se elaboraron tres repeticiones
con 4 brotes en cada frasco, es decir 12 brotes evaluados por tratamiento,
teniendo un total de 172 plántulas en experimentación.
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO
INDOLACÉTICO
(mg/L)
CONCENTRACIÓN DE
ÁCIDO INDOLBUTÍRICO
(mg/L)
0.0 0.0
0.0 + carbón activado 0.0 + carbón activado
0.5 0.5
1.0 1.0
1.5 1.5
3.0 3.0
5.0 5.0
7.0 7.0
TABLA 2. Concentraciones utilizadas en la evaluación de ácido indolacético (AIA) y ácido indolbutírico (AIB) para la
inducción de formación de raíz en brotes de Myrtillocactus geometrizans generados in vitro.
23
5.4 Aclimatación a invernadero
Una vez que se obtuvo la formación de raíz en los brotes, se procedió a
aclimatarlos a condiciones de invernadero. Para esto se colocaron un total de 30
brotes en macetas individuales con una mezcla de tezontle-gravilla-tierra negra,
previamente esterilizada. Durante los primeros días la mezcla se humedeció a
saturación y para evitar una deshidratación de los brotes se cubrieron las macetas
con la mitad inferior de botellas de plástico transparente (Fig. 5) Se colocaron en
un invernadero a una intensidad luminosa de 60-70 % y una temperatura
promedio de 30 °C. Se revisaron diariamente y después de dos semanas se
comenzó a perforar la cubierta plástica con el fin de aclimatar las plantas a
condiciones más secas, hasta retirar por completo la cubierta. Se registro el
numero de plantas sobrevivientes. Para los análisis estadísticos de los resultados
se utilizaron los análisis de ANOVA, Tukey y Chi cuadrada por medio del programa
de computo SPSS versión 11.0 para Windows.
Fig. 5 Aclimatación de brotes a condiciones de invernadero: técnica para evitar la deshidratación
24
6.- RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Desinfección y germinación
En el lote testigo, al segundo día de haber sido colocadas las semillas
prácticamente el 50 % de ellas presento contaminación por hongos y bacterias.
Para el día 12 el total de las semillas presentaba contaminación, tanto en el
tratamiento con preinducción como con el normal. En el caso de los tratamientos
para la desinfección estos dieron buenos resultados, ya que solo en el tratamiento
4 con preinducción de la germinación hacia el día 14 se presento contaminación
por bacterias en 3 semillas (5%) (Gráfica 1). El análisis estadístico indica que no
hay diferencias significativas entre los diferentes métodos de desinfección
evaluados.
0102030405060708090
100
Sem
illas
con
tam
inad
as (%
)
Test Trat1 Trat2 Trat3 Trat4 Trat5
Con preinducción Sin preinducción
Gráfica 1.- Semillas contaminadas por tipo de tratamiento (%)
25
En cuanto a la germinación sin embargo, se encontraron diferencias significativas
tanto entre el tratamiento con preinducción y el testigo, como entre los diferentes
tratamientos de desinfección. En este caso, el tratamiento número 4 fue el que
presentó los porcentajes de germinación más altos tanto para preinducción (22%)
como para el tratamiento sin preinducción (40%)(Gráfica 2). También se
encontraron diferencias significativas respecto al total de semillas germinadas
entre el tratamiento con preinducción (8% de germinación) y el normal (17%).
Grá
En cuanto
encontraro
trabajadas
0
5
10
15
20
25
30
35
40
% d
e se
mill
as g
erm
inad
as
test trat1 trat2 trat3 trat4 trat5Tratamiento
Con preinducción Sin preinducción
fica 2.- Germinación de semillas por tipo de tratamiento de desinfección
a la evaluación del ácido giberélico como inductor de la germinación, se
n diferencias significativas entre las diferentes concentraciones
, siendo la de 7.5 mg/mL la que presento el porcentaje de germinación
26
más alto (87%) (Gráfica 3). También se observo una mayor velocidad de
germinación, pues mientras que con los tratamientos de preinducción y normal se
registro este fenómeno hasta el día 14, con el ácido giberélico se registro
germinación de semillas a partir del día 7. En el caso de las semillas colocadas en
sustrato de la forma tradicional, se registro a partir del día 14, con un 83 % de
germinación. Estas semillas fueron previamente desinfectadas con el tratamiento
4.
Pérez G.S. (1999) reporta un porcentaje de germinación superior al 80 % en un
período de 10 a 15 días. Este porcentaje no coincide con lo encontrado para los
diferentes métodos de desinfección, lo cual puede deberse a que las semillas
puedan su
observar l
cuando ha
0102030405060708090
Porc
enta
j
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0
Concentración (mg/L)
Gráfica 3.- Germinación de semillas de M. geometrizans en presencia de ácido giberélico (%)
frir algún daño o inactivación durante la aplicación de los mismos. Al
a gráfica 1 se puede ver que el porcentaje de germinación disminuye
y el tratamiento previo de germinación y el tratamiento de desinfección
27
incluye tiempos prolongados de exposición a los agentes desinfectantes. Así aún
cuando hipotéticamente cualquier método de desinfección puede brindar
resultados satisfactorios, puede haber métodos que afecten los porcentajes de
germinación. Esto es de radical importancia cuando se trabaja con pocas semillas o
cuando las mismas son sensibles a los desinfectantes empleados o a sus
concentraciones, por lo que lo más recomendable es emplear concentraciones
mínimas y tratamientos simples para disminuir la posibilidad de daños a las
semillas.
Los porcentajes de germinación obtenidos con el ácido giberélico, con el sustrato
tradicional y con lo reportado por Pérez G.S. (1999) son muy similares. Para los
dos primeros casos se utilizó como método de desinfección el tratamiento número
cuatro, que es el más sencillo lo cual puede reforzar la hipótesis de daño a la
semilla. No obstante, el porcentaje de germinación más alto para el tratamiento 4
sin preinducción por calor o por ácido gibérelico fue de 40 %, que es mucho más
bajo que el reportado en la literatura y que lo obtenido con el ácido giberélico y en
el sustrato tradicional. Las causas de esta situación son desconocidas, aunque se
puede pensar en necesidades específicas de la especie para germinación que se
ven cubiertas con el ácido giberélico o que se encuentran en el sustrato tradicional.
Mata et al. (2001) reportan una frecuencia máxima de germinación in vitro de 41.7
% para Turbinicarpus laui y sugieren que este porcentaje apoya lo sugerido por
otros autores sobre la presencia de una distribución discontinua del tiempo de
28
germinación en semillas de cactáceas interpretada como un mecanismo de
adaptación a condiciones adversas.
6.2 Explantes y generación de brotes
Se sometieron un total de 180 explantes a las cinco diferentes concentraciones. El
tipo de hormonas y la concentración se seleccionaron en función de la revisión de
diversos trabajos sobre el tema (Anexo II).
El número de brotes obtenidos de cada explante se presenta en las tablas 5 a la
9. La modificación a la técnica de Martínez-Vázquez y Rubluo (1989) consistió en
obtener únicamente dos explantes, apical y basal, mientras que en la técnica
original obtienen un apical y dos laterales.
ORIGEN DEL EXPLANTE Apical basal plántula
N 12 12 12 Media 0.0 0.0 0.0 Mínimo 0 0 0 Máximo 0.0 0.0 0.0 Suma 0 0 0
Desviación estándar 0.0 0.0 0.0
Tabla 5.- Número de brotes por tipo de explante en ausencia de BA y AIB (Testigo)
Para todas las concentraciones, excepto en la testigo (tabla 5), hubo diferencia
significativa respecto al número de brotes producidos por tipo de explante, siendo
los explantes de origen apical los que produjeron la mayor cantidad de brotes, con
29
un promedio máximo de 7.6 brotes por explante en la concentración de 0.5 mg/L
de BA (Gráfica 4) (Tabla 6).
Gráfica 4.-
Dentro de los ex
número de brote
BA (7.6, 6.0 y 7.2
brotes obtenidos
más pequeños y
evaluación estadí
012345678
0 0.5 1 2 3
Concentración de BA (mg/L)
Núm
ero
de b
rote
s
Apical Basal Plantula
Promedio de brotes por tipo de explante y concentración de BA
plantes de origen apical no hubo diferencia significativa en el
s producidos entre las concentraciones de 0.5, 1.0 y 2.0 mg/L de
brotes por explante respectivamente). En el análisis visual de los
se observó que los de la concentración de 2.0 mg/L tendían a ser
a presentar sobrehidratación, aunque no se realizó ninguna
stica al respecto.
30
ORIGEN DEL EXPLANTE Apical basal plántula
N 12 12 12 Media 7.6 1.0 0.5 Mínimo 2 0 0 Máximo 20 5 7 Suma 92 13 7
Desviación estándar 5.4 1.7 2.0
Tabla 6.- Número de brotes por tipo de explante en presencia de 0.5 mg/L de BA y 0.1 mg/L de AIB
ORIGEN DEL EXPLANTE Apical basal plántula
N 12 12 12 Media 6.0 2.2 0.3 Mínimo 2 0 0 Máximo 12 6 4 Suma 72 27 4
Desviación estándar 3.8 2.2 1.1
Tabla 7.- Número de brotes por tipo de explante en presencia de 1.0 mg/L de BA y 0.1 mg/L de AIB
En el caso de los explantes basales, la concentración que dio mejores resultados
fue la de 2.0 mg/L (tabla 8), con un promedio de 3.1 brotes por explante, y para
31
las plántulas completas fue la de 3.0 mg/L con un promedio de 2.1 brotes por
explante (tabla 9). No se desarrollaron brotes en los explantes sin concentración
de hormonas (testigo) independientemente del origen de los mismos. En un
promedio de los explantes obtenidos contabilizando todas las concentraciones
incluyendo las testigo (0 mg/L), los de origen apical produjeron 4.8 brotes por
explante, los de origen basal 1.6 y las plántulas completas 0.6.
ORIGEN DEL EXPLANTE apical basal plántula
N 12 12 12 Media 7.2 3.1 0 Mínimo 2 0 0 Máximo 17 8 0 Suma 87 38 0
Desviación estándar 5.5 2.8 0
Tabla 8.- Número de brotes por tipo de explante en presencia de 2.0 mg/L de BA y 0.1 mg/L de AIB
ORIGEN DEL EXPLANTE apical basal plántula
N 12 12 12 Media 3.0 1.7 2.1 Mínimo 0 0 0 Máximo 7 5 9 Suma 37 21 26
Desviación estándar 1.9 2.1 2.8
32
Tabla 9.- Número de brotes por tipo de explante en presencia de 3.0 mg/L de BA y 0.1 mg/L de AIB
Los resultados encontrados para diferentes especies en diversos estudios registran
valores promedio de brotes por explante que van de 0 hasta 128 (Rubluo et al.,
2002, Malda et al., 1999, Katja et al., 2003, Pérez Molphe et al., 1998, Pérez
Molphe y Dávila Figueroa 2002) dependiendo de la hormona empleada y de la
especie estudiada. No obstante prácticamente en ninguno de estos estudios se
hace referencia al origen del explante y de si hubo alguna diferencia significativa
respecto al mismo. Únicamente Villavicencio et al. (1999) indica que no
encontraron diferencias significativas entre los explantes de origen apical y basal
de Astrophytum myriostigma, registrando 4.0 y 4.3 brotes en promedio
respectivamente. Sin embargo las diferencias encontradas con Myrtillocactus
geometrizans en el presente trabajo sugieren que el origen del explante puede
afectar el número de brotes que se obtienen e inclusive la calidad de los mismos,
aunque de igual manera parece existir una diferencia de respuesta dependiendo
no únicamente del origen del explante, sino de la especie evaluada (Giusti et al.,
2002). En todo caso si se utilizan plántulas como en este estudio tal vez sea más
recomendable obtener explantes longitudinales en vez de transversales,
asegurando una distribución más homogénea en cada explante de los diferentes
tipos de meristemos que se encuentran en dichas plántulas, como en la
metodología utilizada por Mata et al. (2001) para la reproducción in vitro de
Turbinicarpus laui.
33
6.5 Formación de raíz
En la inducción de formación de raíz no se encontró diferencia significativa entre el
ácido indol acético y el ácido indol butírico, observándose el mayor número de
brotes en las concentraciones más altas de ambas hormonas (3.0, 5.0 y 7.0
mg/L).(Figs. 6 y 7). No obstante para ambas hormonas se registraron en la
concentración más alta brotes que en lugar de desarrollar raíz sufrieron un cambio
de color a amarillo y después de descompusieron (16 %). Aunque fue mayor el
numero de brotes con formación de raíz a concentraciones más altas, no hubo
diferencia significativa entre las diferentes concentraciones. Inclusive, en los
grupos testigo se registro la formación de raíz en el 33% de los brotes. Para la
concentración de 5 mg/L de AIA y de 7.0 de AIB se registro un 75 % de brotes
con formación de raíz (Tabla 6). Pérez Molphe et al. (1998) reporta porcentajes de
formación de raíz para 21 especies de cactus que van de 75 a 100 % utilizando las
mismas hormonas, solo que a concentraciones máximas de 1.0 mg/L.
No. de brotes con formación de raíz Concentración (mg/L) AIA AIB
0.0 + Carbón activado 3 4 0.0 4 4 0.5 4 3 1.0 5 4 1.5 6 5 3.0 7 7 5.0 9 8 7.0 8 9
34
Tabla 10.- Número de brotes con desarrollo de raíz por concentración y tipo de hormona
Fig. 6.- Formación de raíz con AIA
35
Fig. 7.- Formación de raíz con AIB 6.6 Aclimatación a invernadero
Del total de brotes colocados en condiciones de invernadero, 5 (16%) presentaron
deshidratación en los primeros dos días de la cual no se pudieron recuperar, 3 (10
%) presentaron el mismo fenómeno pero se recuperaron en forma satisfactoria, y
22 (73%) no presentaron cambios aparentes durante el proceso. Se ha reportado
que uno de los principales problemas que afecta a la aclimatación de la mayoría de
las especies de cactus propagadas in vitro es el “shock” hídrico o de desecación
que se presenta en el durante el primer día de aclimatación, que puede ser
superado por la naturaleza suculenta del cuerpo de la plántula (Malda et al.,
1999).
En total se considera que el 84 % de las nuevas plántulas se adaptaron
adecuadamente a las condiciones de invernadero. Los porcentajes de
sobrevivencia de las plántulas generadas in vitro para diferentes especies de
cactáceas reportados en la literatura varían del 50 al 100 % (Pérez Molphe et al.,
1998, Pérez Molphe y Dávila Figueroa 2002, Pérez C.J. et al., 1999, Pelah et al.,
2002). Probablemente estas variaciones se deban a la metodología empleada para
la aclimatación, así como a la cantidad de agua que contenga la plántula al inicio
del tratamiento, la cual puede variar en función de la especie o del tamaño de las
plántulas.
36
7. RESUMEN DE LOS RESULTADOS
Los diferentes métodos de desinfección de semillas reportados en la
literatura cumplen con su objetivo respecto a la eliminación de
contaminantes biológicos.
No obstante dependiendo del tiempo de exposición y de los agentes
desinfectantes empleados posiblemente la viabilidad de las semillas se
puede ver afectada.
El método de desinfección más adecuado en este trabajo considerando
también la germinación fue el tratamiento No. 4 propuesto por Reyes-
Santiago (1997).
El tratamiento No. 4 fue así mismo el que presentó los porcentajes de
germinación más altos tanto para preinducción (22%) como para el
tratamiento sin preinducción (40%) de entre todos los métodos de
desinfección empleados.
En cuanto a la evaluación del ácido giberélico como inductor de la
germinación, se encontraron diferencias significativas entre las diferentes
concentraciones trabajadas, siendo la de 7.5 mg/mL la que presento el
porcentaje de germinación más alto (87%).
37
Los explantes de origen apical son los que produjeron la mayor cantidad de
brotes, con un promedio máximo de 7.6 brotes por explante en la
concentración de 0.5 mg/L de BA
En los explantes basales, la concentración que dio mejores resultados fue la
de 2.0 mg/L, con un promedio de 3.1 brotes por explante, y para las
plántulas completas fue la de 3.0 mg/L con un promedio de 2.1 brotes por
explante
No se desarrollaron brotes en los explantes sin concentración de hormonas
(testigo) independientemente del origen de los mismos
No hubo diferencia significativa entre las diferentes concentraciones de
hormonas para inducir la formación de raíz.
Para la concentración de 5 mg/L de AIA y de 7.0 de AIB se registro un 75
% de brotes con formación de raíz
Inclusive en los tratamientos testigo se registro la formación de raíz en
algunos brotes
Se considera que el 84 % de las nuevas plántulas se adaptaron
adecuadamente a las condiciones de invernadero
38
8. CONCLUSIONES
En este trabajo se presenta la metodología para la reproducción in vitro de M. geometrizans.
Esta metodología puede ser una guía útil como herramienta para desarrollar sistemas de
reproducción in vitro de especies de cactáceas mexicanas que se encuentren con graves
problemas de conservación, que sean extremadamente lentas de crecimiento y/o de difícil
reproducción por métodos convencionales. En la revisión de la literatura no se encontró
ningún reporte de reproducción in vitro de M. geometrizans por lo que este trabajo se puede
considerar como una contribución y adición a la corta lista de especies estudiadas con este
enfoque.
Los resultados aquí encontrados así como los evaluados durante la revisión bibliográfica
sugieren que el uso de la biotecnología para la reproducción in vitro de cactáceas no es
únicamente el seguir un formulario, ya que cada especie requerirá de análisis adecuados
para evaluar entre otras cosas el tipo y concentración de reguladores y el método de
aclimatación a utilizarse con el fin de hacer más eficiente el proceso de la
micropropagación, la cual sin duda es una herramienta de comprobada eficacia para superar
problemas de propagación en cactáceas
9. LITERATURA CITADA
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44
ANEXO I. Cronología de algunas de las contribuciones sobre cultivo de tejidos.
(Resumido de Hurtado y Merino, 2000) Autor Año Contribución
Sacks Knops Haberlandt Haberlandt y Kotte
1860 1861 1898 1922
Prepararon una solución nutritiva conteniendo los principales nutrientes de las plantas superiores Realizó sin éxito un intento de cultivo de células aisladas de Erithrinium, Ornithogalum y Tradescantia (monocotiledóneas). Cultivaron ápices radiculares de chícharo y maíz en un medio enriquecido con sales orgánicas, glucosa, peptona, asparagina y varios aminoácidos.
45
White Went y Thimann Nobecourt y Gautheret Morel y Martin Skoog Skoog y Miller Murashige y Skoog Guha y Maheshwari Kameya y Ninata Dasgopta y colaboradores Maliga, Brenovits y Marlon Earle y langha Melchers, Sacristán y Holder Barlass y Sken
1934 1937 1939 1952 1955 1957 1962 1966 1970
Cultivo ápices de raíz de tomate (Licopersicum esculentum) en un medio líquido constituido de sales inorgánicas, extracto de levadura y sacarosa. Descubren la auxina AIA (Ácido indolacético) Reportan crecimiento indefinido en tejido de raíz observando la formación de callosidades. Primeros investigadores que logran obtener plantas libres de virus en dalia a partir de callos de meristemos apicales. Identifica la 6-fufurilaminopurina (cinetina) observando la capacidad de este regulador del crecimiento vegetal para iniciar la división celular. Usando combinaciones de auxinas y cinetina controlaron la formación de brotes y raíces en cultivos de callos de tabaco. Desarrollaron un medio nutritivo con el que lograron un crecimiento rápido en tejidos de tabaco; actualmente las sales inorgánicas de dicho medio se usan en el cultivo de tejidos de muchas especies. A partir del cultivo de anteras de Datura inoxia se obtuvieron las primeras plantas haploides. Realizaron el primer cultivo de polen de angiospermas, con polen maduro de varias especies de Brassica.
para
Utilizaron el cultivo in vitro de raíces de Sorghum vulgare
ANEXO I. Cronología de algunas de las contribuciones sobre cultivo de tejidos (cont.)
(Resumido de Hurtado y Merino, 2000)
ns
e
1970 1973 1974 1978 1978
propagar el nematodo Holoplolaimus indicus determinando la embriología y ciclo de vida de este. Reportaron la producción de plantas resistentes a estreptomicina a partir de callos haploides de tabaco. A partir de yemas apicales de crisantemo obtuvieron plantas completas de la variedad “Giant # 4 Indianapolis white” libres de virus. Obtuvieron híbridos somáticos de plantas por medio de la fusión de protoplastos de tomate (Lycopersicum esculentum Mill) y papa (Solanum tuberosum L.) Describieron un método para la propagación in vitro de vid a
46
Novak Kuthey y colaboradores Lakshmi, Vaidyanathan y Ramakrishnan
1980 1981 1982
partir de la fragmentación de yemas apicales. Discute algunos de los problemas de inestabilidad cromosómica en cultivo de tejidos vegetales. A partir del cultivo de tejidos de Catharanthus roseus llevaron a cabo la producción de diversos alcaloides. Hablan de la aplicación del cultivo de tejidos vegetales en el mejoramiento de árboles de importancia económica.
47
1 semillas
ESPECIE
Ariocarpus retususAstrophytum myrioAstrophytum myrioAstrophytum myrioCephalocereus senCephalocereus senCoryphanta clavataCoryphanta durangCoryphanta radianEchinocactus platyEchinocereus dubiEchinocereus pectEchinofossulocactFerocactus hamataFerocactus histrix Ferocactus latispinFerocactus pilosusMammillaria candiMammillaria carmMammillaria craigMammillaria formoMammillaria haageMammillaria obscuMammillaria prolifMammillaria san-aMammillaria sphacMammillaria uncinNyctocereus serpeSchlumbergera truStenocactus coptonTrichocereus spach
ANEXO II. Principales reguladores del crecimiento empleados en el cultivo de tejidos de cactáceas.
; 2 tejidos de plantas adultas; Ácido 2,4-D= Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético; AIA=Ácido indolacético; AIB= Ácido indolbutírico; ANA= Ácido naftalenacético; BA=benciladenina; K=Cinetina; N/E No efectuado o no especificado.
ORIGEN DE EXPLANTES
PERÍODO DE CRECIMIENTO PARA
EXPLANTE (SEMILLAS) TRATAMIENTO PARA PROLIFERACIÓN (mg/l) TRATAMIENTO PARA
ENRAIZAMIENTO (mg/l) FUENTE
1 4 MESES MS + 20 g/l sucrosa+ 20% v/v agua de coco Ejemplares injertados Stuppy and Nagl, 1992. stigma 2 1 BA + 0.01 ANA 1.0 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 stigma 1 4 MESES 1 K +0.1 AIB N/E Villavicencia et al 1999. stigma 2 5 AIA+ 0.5 K N/E Vyskot y Jara, 1984.
ilis 2 1 BA + 0.01 ANA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 ilis 1 y 2 N/E 4 K + 2 Ácido 2,4-D N/E Corona y Yañez, 1984 1 3-6 MESES 1 BA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 ensis 1 3-6 MESES 1 BA + 0.01 ANA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al.,1998
s 1 3-6 MESES 1 BA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 acanthus 1 3-6 MESES 1 BA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 us 1 3-6 MESES 1 BA + 0.01 ANA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 inatus 1 3-6 MESES 1 BA + 0.01 ANA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 us sp. 1 3-6 MESES 1 BA 1.0 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 canthus 1 3-6 MESES 1 BA + 0.1 ANA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998
1 3-6 MESES 1 BA + 0.01 ANA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 us 1 3-6 MESES 1 BA + 0.1 ANA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 1 3-6 MESES 1 BA + 0.1 ANA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 da 1 3-6 MESES 1 BA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al. enae 2 2 BAP + 1 ANA N/E Vyskot y Jara, 1984. ii 1 3-6 MESES 1 BA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al. sa 1 3-6 MESES 1 BA + 0.1 ANA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al. ana 1 N/E 1 – 2 BA N/E Martínez-Vázquez y Rubluo, 1989. ra 1 3-6 MESES 1 BA + 0.1 ANA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998
era 2 0.5 – 1 ANA + 0.5 BA N/E Vyskot y Jara, 1984. ngelensis 1 6 MESES 1 BA 0.1 BA + 0.01–0.1 ANA Martínez-Vázquez y Rubluo, 1989. elata 1 3-6 MESES 1 BA + 0.01 ANA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al. ata 1 3-6 MESES 1 BA 0.5 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al.
ntinus 2 2 BA 0.5 AIA Pérez Molphe Balch E. et. al. ncata 2 20 BA N/E Pérez, Flores y Ortiz, 1999. ogonus 1 3-6 MESES 1 BA 1.0 AIB Pérez Molphe Balch E. et. al., 1998 ianus 2 5 AIA+ 0.5 K N/E Vyskot y Jara, 1984.
48
ANEXO III.- Preparación de medio Murashige y Skoog (Mezcla de sales y vitaminas)
g/100 mL SOLUCIÓN A: NITRATOS Nitrato de amonio (NH4NO3) 16.5 Nitrato de potasio (KNO3) 19.0 SOLUCIÓN B: SULFATOS Sulfato de magnesio (MgSO4) 1.807 Sulfato de manganeso (MnSO4) 0.169 Sulfato de zinc (ZnSO4) 0.086 Sulfato cúprico (CuSO4) 0.00025 SOLUCION C : HALOGENOS Cloruro de calcio (CaCl2) 3.322 Yoduro de potasio (KI) 0.0083 Cloruro de cobalto (CoCl2) 0.00025 SOLUCION D Fosfato de potasio (KH2PO4) 1.7 Ácido bórico (H3BO3) 0.062 Molibdato de sodio (Na2MoO4) 0.0025 SOLUCION E Sulfato ferroso (FeSO4) 0.2784 Ácido etilendiamino tetracético (Na2EDTA) 0.3724 SOLUCION F: VITAMINAS Mioinositol 1.0 Ácido nicotínico 0.005 Piridoxina 0.005 Tiamina 0.001
Para preparar las soluciones se utiliza agua destilada o desionizada. En el caso de la
solución E se recomienda disolver por separado las sustancias (puede requerirse de calentar
ligeramente en ambos casos), después combinarlas y llevar al volumen final deseado.
49
ANEXO III.- Preparación de medio Murashige y Skoog (Mezcla de sales y vitaminas) (Continuación)
Para preparar 500 mL de medio se debe proceder de la siguiente manera:
Colocar 400 mL de agua destilada en un matraz.
Agregar 5 mL de las soluciones A-F. En el caso de preparar medio con hormonas
agregarlas en la concentración requerida.
Agregar 15 g de sacarosa mientras se agita
Agregar 1 g de phytagell o 4 de agar. Aforar a 500 mL
Ajustar el pH a 5.8
Calentar con agitación hasta que la solución se torne translúcida
Servir de 20 a 25 mL por frasco de tipo “alimento para bebe”
Tapar y esterilizar en autoclave por 15 min. a 15 psi, 121 oC
Dejar enfriar y guardar en refrigeración hasta su uso
Considerar una caducidad de un mes
50
ANEXO IV.- Resultados de la prueba de Tukey
Comparaciones Múltiples
Tukey HSD
-7.66667 * 1.62167 .000 -12.2403 -3.0930 -6.00000 * 1.62167 .004 -10.5736 -1.4264-7.25000 * 1.62167 .000 -11.8236 -2.6764-3.08333 1.62167 .329 -7.6570 1.49037.66667 * 1.62167 .000 3.0930 12.24031.66667 1.62167 .841 -2.9070 6.2403.41667 1.62167 .999 -4.1570 4.9903
4.58333 * 1.62167 .049 .0097 9.15706.00000 * 1.62167 .004 1.4264 10.5736
-1.66667 1.62167 .841 -6.2403 2.9070-1.25000 1.62167 .938 -5.8236 3.32362.91667 1.62167 .385 -1.6570 7.49037.25000 * 1.62167 .000 2.6764 11.8236-.41667 1.62167 .999 -4.9903 4.15701.25000 1.62167 .938 -3.3236 5.82364.16667 1.62167 .090 -.4070 8.74033.08333 1.62167 .329 -1.4903 7.6570
-4.58333 * 1.62167 .049 -9.1570 -.0097-2.91667 1.62167 .385 -7.4903 1.6570-4.16667 1.62167 .090 -8.7403 .4070-1.08333 .83681 .696 -3.4434 1.2767-2.25000 .83681 .069 -4.6101 .1101-3.16667 * .83681 .003 -5.5267 -.8066-1.75000 .83681 .239 -4.1101 .61011.08333 .83681 .696 -1.2767 3.4434
-1.16667 .83681 .634 -3.5267 1.1934-2.08333 .83681 .108 -4.4434 .2767 -.66667 .83681 .930 -3.0267 1.69342.25000 .83681 .069 -.1101 4.6101 1.16667 .83681 .634 -1.1934 3.5267-.91667 .83681 .808 -3.2767 1.4434.50000 .83681 .975 -1.8601 2.8601
3.16667 * .83681 .003 .8066 5.52672.08333 .83681 .108 -.2767 4.4434.91667 .83681 .808 -1.4434 3.2767
1.41667 .83681 .447 -.9434 3.77671.75000 .83681 .239 -.6101 4.1101.66667 .83681 .930 -1.6934 3.0267
-.50000 .83681 .975 -2.8601 1.8601-1.41667 .83681 .447 -3.7767 .9434-.58333 .66799 .905 -2.4673 1.3006-.33333 .66799 .987 -2.2173 1.5506.00000 .66799 1.000 -1.8840 1.8840
-2.16667 * .66799 .017 -4.0506 -.2827.58333 .66799 .905 -1.3006 2.4673.25000 .66799 .996 -1.6340 2.1340.58333 .66799 .905 -1.3006 2.4673
-1.58333 .66799 .139 -3.4673 .3006.33333 .66799 .987 -1.5506 2.2173
-.25000 .66799 .996 -2.1340 1.6340.33333 .66799 .987 -1.5506 2.2173
-1.83333 .66799 .060 -3.7173 .0506.00000 .66799 1.000 -1.8840 1.8840
-.58333 .66799 .905 -2.4673 1.3006-.33333 .66799 .987 -2.2173 1.5506
-2.16667 * .66799 .017 -4.0506 -.28272.16667 * .66799 .017 .2827 4.05061.58333 .66799 .139 -.3006 3.46731.83333 .66799 .060 -.0506 3.71732.16667 * .66799 .017 .2827 4.0506
(J) concentra.50 1.00 2.00 3.00 .00 1.00 2.00 3.00 .00 .50 2.00 3.00 .00 .50 1.00 3.00 .00 .50 1.00 2.00 .50 1.00 2.00 3.00 .00 1.00 2.00 3.00 .00 .50 2.00 3.00 .00 .50 1.00 3.00 .00 .50 1.00 2.00 .50 1.00 2.00 3.00 .00 1.00 2.00 3.00 .00 .50 2.00 3.00 .00 .50 1.00 3.00 .00 .50 1.00 2.00
(I) concentra .00
.50
1.00
2.00
3.00
.00
.50
1.00
2.00
3.00
.00
.50
1.00
2.00
3.00
Variable dependiente apical
basal
plantula
Diferenciade medias
(I-J) Std. Error Sig. Inferior Superior95% Intervalo de Confianza
Significante a 0 .05 . *.
51
