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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Influencia del tamaño de partícula y la humedad en la estimación rápida del tiempo
de vida útil del ácido acetil salicílico mediante tratamientos no isotermales empleando
calorimetría diferencial de barrido
Proyecto de investigación previo a la obtención del título de Químico Farmacéutico
Autor: Sinche Coyago Darwin Augusto
Tutor: Santamaría Aguirre Javier Rodrigo
DMQ, JULIO 2018
iii
DEDICATORIA
A Cristina Coyago, la persona más importante en mi vida.
iv
AGRADECIMIENTOS
Eternos agradecimientos a todos quienes conformaron mi vida universitaria, tanto a amigos,
como el Tutor, Tribunal, Universidad Central del Ecuador, Facultad Ciencias Químicas.
v
vi
vii
viii
INDICE Resumen ......................................................................................................................................... xiv
Abstract ........................................................................................................................................... xv
Introducción ................................................................................................................................... xvi
Capítulo I. El Problema ................................................................................................................. 17
Planteamiento del problema ............................................................................................. 17
Formulación del problema................................................................................................ 17
Objetivos ............................................................................................................................. 18
Objetivo general. ............................................................................................................................. 18
Objetivos específicos. ...................................................................................................................... 18
Justificación e Importancia .............................................................................................. 18
Capítulo II. Marco Referencial...................................................................................................... 20
Antecedentes de la investigación ...................................................................................... 20
Fundamentación teórica ................................................................................................... 21
Estabilidad.......................................................................................................................... 21
Estudios de estabilidad ...................................................................................................... 22
Tiempo de vida útil ............................................................................................................ 22
Fecha de caducidad ........................................................................................................... 22
Métodos de ajuste a un modelo ........................................................................................ 22
Estudios de estabilidad acelerada. ..................................................................................... 23
Estudios de estabilidad a tiempo real (largo plazo). .......................................................... 23
Métodos por isoconversión ............................................................................................... 23
Método estándar de isoconversión. .................................................................................... 23
Método de Friedman. ......................................................................................................... 24
Ozawa Flyn y Wall. ............................................................................................................. 24
Método de Kissinger .......................................................................................................... 24
Efecto de la humedad ........................................................................................................ 25
Combinación del Efecto de la Temperatura y la Humedad Relativa ........................... 26
Calculo de vida útil experimental mínima (Hipérbolas de confianza). ........................ 27
Estabilidad del estado sólido............................................................................................. 28
Enfoque de isoconversion (tiempo hasta el límite de especificación). ............................. 29
ix
Ecuación de Arrhenius ajustada a la humedad. ............................................................... 29
Enfoque de no isotermal..................................................................................................... 29
Ácido acetil salicílico. ........................................................................................................ 30
Características. ................................................................................................................... 30
Ácido salicílico ................................................................................................................... 31
Características. ................................................................................................................... 32
Hidrólisis del ácido acetil salicílico ................................................................................................ 32
Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) ................................................................................. 32
Hipótesis: ............................................................................................................................ 33
Hipótesis de trabajo, Hi. ................................................................................................................. 33
Hipótesis nula, Ho. .......................................................................................................................... 33
Sistema de Variables....................................................................................................................... 33
Capítulo III. Metodología de Investigación .................................................................................. 34
Diseño de la Investigación ................................................................................................. 34
Paradigma de la Investigación. ........................................................................................ 34
Nivel de Investigación........................................................................................................ 34
Tipo de Investigación. ....................................................................................................... 34
Métodos y Materiales ........................................................................................................ 35
Diseño Experimental ......................................................................................................... 36
Matriz de Operacionalización de Variables .................................................................... 37
Procedimientos ................................................................................................................... 37
Cuantificación de ácido acetil salicílico y ácido salicílico mediante HPLC. .............................. 38
Proceso de tamizaje para la obtención de diferentes tamaños de partícula. ............................. 39
Preparación de las muestras a diferentes condiciones de humedad. .......................................... 39
Determinación de parámetros cinéticos de degradación del ASA en DSC. ............................... 40
Determinación de forma y tamaño de cristales de ASA por microscopía. ................................ 40
Técnicas de Procesamiento de Datos ............................................................................... 40
Tratamiento isotermal. ................................................................................................................... 41
Cálculo de la vida útil experimental mínima (Hipérbolas de confianza). ..................................... 41
Efecto de la temperatura y humedad............................................................................................... 41
Tratamiento no isotermal. .............................................................................................................. 42
Ecuación de Kissinger. .................................................................................................................... 42
x
Anova Simple. ................................................................................................................................. 42
Pruebas de rango múltiples. ........................................................................................................... 43
Método DMS (diferencia mínima significativa). ............................................................................ 43
Método Duncan. .............................................................................................................................. 43
Método Tukey. .................................................................................................................................. 44
Capítulo IV. Análisis y Discusión de Resultados ......................................................................... 45
Etapa 1. Caracterización de la materia prima. ................................................................................. 45
Etapa 2. Tratamiento isotermal. ....................................................................................................... 46
Etapa 3. Tratamiento no-isotermal. ................................................................................................. 56
Relación del tamaño de partícula y humedad relativa con el tiempo de vida útil. ........................ 61
Capítulo V. Conclusiones y Recomendaciones ............................................................................. 64
xi
INDICE DE ANEXOS
ANEXO A. Árbol de problemas .................................................................................................... 70
ANEXO B. Categorización de Variables ...................................................................................... 71
ANEXO C. Instrumento de recolección de datos ......................................................................... 72
ANEXO D. Comparación de pendientes....................................................................................... 73
ANEXO E. Diagrama del procedimiento ..................................................................................... 74
xii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estudio de estabilidad de Largo Plazo (INVIMA, 2016) .................................................. 28
Figura 2.Curvas DSC para ASA y SA determinadas a 10°C/min. Fuente: : (Arteaga, Castillo,
Alcocer, & Santamaría, 2018) .......................................................................................................... 31
Figura 3. Productos de degradación del ASA. Fuente (Salgado, Torres, & Treeminio, 2014) ........ 32
Figura 4. Identificación por Infrarrojo de ASA. Fuente: (Sinche, 2018) .......................................... 45
Figura 5. Número de tamiz en función del porcentaje ...................................................................... 47
Figura 6. Contenido de ASA para cada tratamiento isotermal. ........................................................ 49
Figura 7. Contenido de SA para cada tratamiento isotermal. ......................................................... 49 Figura 8. Isotermas de sorción de vapor de agua para muestra de aspirina (Hancock & Zografi,
1996) ................................................................................................................................................. 50
Figura 9. Hipérbola de confianza ASA 43%. ................................................................................... 51
Figura 10. Hipérbola de confianza ASA 63%. ................................................................................. 52
Figura 11. Hipérbola de confianza SA 19%. .................................................................................... 52
Figura 12. Hipérbola de confianza SA 43%. .................................................................................... 53
Figura 13. Hipérbola de confianza SA 63%. .................................................................................... 53
Figura 14. Histograma del tiempo de vida útil del SA por el método de isconversión .................... 55 Figura 15. Gráfica de Kissinger para el primer paso de descomposición del ASA (Humedades
relativas) ........................................................................................................................................... 57 Figura 16. Gráfica de Kissinger para el primer paso de descomposición del ASA (Tamaños de
partícula) ........................................................................................................................................... 58
Figura 17. Diagrama de Arrhenius para muestras de ASA de diferentes tamaños de partícula y
diferentes condiciones de humedad relativa. .................................................................................... 60
Figura 18. Representación gráfica de la ecuación cuadrática a) vista frontal b) vista superior ........ 62
xiii
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Protocolo para ensayo de estabilidad acelerada de formas farmacéuticas sólidas ............. 27
Tabla 2. Características fisico-químicas del ASA ........................................................................... 31
Tabla 3. Sistemas de variables de acuerdo con su etapa .................................................................. 33
Tabla 4. Materiales y métodos ......................................................................................................... 35
Tabla 5. Diseño experimental del proyecto ..................................................................................... 36
Tabla 6. Diseño experimental del proyecto ..................................................................................... 37
Tabla 7. Descripción de la dimensión e indicador de las variables ................................................ 37
Tabla 8. Descripción del sistema HPLC ......................................................................................... 39
Tabla 9. Estadísticos descriptivos .................................................................................................... 41
Tabla 10. Valoración y Contenido de agua ...................................................................................... 46
Tabla 11. Dimensiones de los cristales de ASA .............................................................................. 46
Tabla 12. Distribución de cristales en base a su tamaño .................................................................. 47
Tabla 13. Valoración de ASA y SA a diferentes humedades y tiempos. ......................................... 48
Tabla 14. Tiempo de vida útil de ASA y SA ................................................................................... 54
Tabla 15. Resultados estadísticos de isoconversión de SA. ............................................................. 55
Tabla 16. Temperatura de degradación (Tm) del ASA, sometido a diferentes tratamientos
isotermales ........................................................................................................................................ 56
Tabla 17. Temperatura de degradación del ASA de diferentes tamaños de partícula. .................... 56
Tabla 18. Parámetros cinéticos del ASA con respecto a la humedad relativa. ................................ 58
Tabla 19. Parámetros cinéticos del ASA con respecto al tamaño de partícula. ............................... 59
Tabla 20. Comparación del area superficial especifica con investigaciones anteriores. ................. 59
Tabla 21.Parámetros isocinéticos .................................................................................................... 61
Tabla 22. Comparación de temperatura de degradación a velocidad de calentamiento isocinético. 61
Tabla 23. Comparación de la vida útil del SA (muestra 250-315 ) por tratamientos isotermales. . 62
Tabla 24. Categorización de variables ............................................................................................. 71
Tabla 25. Recolección de la temperatura máxima ........................................................................... 72
Tabla 26. Pendientes de la variable humedad .................................................................................. 73
Tabla 27. Pendientes de la variable tamaño de partícula ................................................................. 73
xiv
INFLUENCIA DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA Y LA HUMEDAD EN LA
ESTIMACIÓN RÁPIDA DEL TIEMPO DE VIDA ÚTIL DEL ÁCIDO ACETIL
SALICÍLICO MEDIANTE TRATAMIENTOS NO ISOTERMALES EMPLEANDO
CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO
Autor: Sinche Coyago Darwin Augusto
Tutor: Santamaría Aguirre Javier Rodrigo
Resumen
Para determinar la estabilidad de principios activos, se deben tomar en cuenta factores que
afectan a la vida útil del ácido acetil salicílico como son la humedad y el tamaño de partícula.
Debido a esto en el presente proyecto se determinará la influencia del tamaño de partícula y la
humedad en la estimación del periodo de vida útil del ácido acetil salicílico mediante
tratamientos no isotermales empleando calorimetría diferencial de barrido, y por
tratamientos isotermales con el método como hipérbolas de confianza y la ecuación del
efecto de la humedad y la temperatura. Como primera etapa se realizó la caracterización de
la materia prima, la cual cumplió con las especificaciones USP; la segunda etapa fue el
tratamiento isotermal en donde se determinaron los tiempos de vida útil para el ASA y SA,
la tercera etapa fue el tratamiento no isotemal en donde se calcularon los parámetros
cinéticos como energía de activación y factor preexponencial para estimar el tiempo de vida
útil del ASA. La influencia del tamaño de partícula y la humedad relativa en la vida útil del
ácido acetil salicílico puede representarse como una ecuación cuadrática. El incremento en
la vida útil se ve favorecido en cristales de alrededor de 200 um, almacenados a humedades
de entre 35 y 45 %.
Palabras Clave
TRATAMIENTOS NO ISOTERMALES, TRATAMIENTOS ISOTERMALES,
ASPIRINA, HUMEDAD, TAMAÑO DE PARTÍCULA, VIDA ÚTIL.
xv
RAPID SHELF LIFE ESTIMATION OF ACETYL SALICYLIC ACID BY NON
ISOTHERMAL TREATMENTS USING DIFFERENTIAL SCANNING
CALORIMETRY. INFLUENCE OF PARTICLE SIZE AND RELATIVE HUMIDITY
Author: Sinche Coyago Darwin Augusto
Tutor: Santamaría Aguirre Javier Rodrigo
Abstract
To determine the proportion of active ingredients must be taken into account the factors that
affect the shelf life of acetylsalicylic acid, such as humidity and particle size. This project
will study the influence of the size of particle and relative humidity in the estimation of the
shelf life of acetylsalicylic acid by means of non-isothermal treatments using differential
scanning calorimetry; and by means of isothermal treatments with the method as confidence
hyperbolas and the equation of the effect of humidity and temperature. As a first stage, the
characterization of the raw material was carried out, which complied with the USP
specifications; the second stage was the isothermal treatment where the life times for the
ASA and SA were determined, the third stage was the non-isothermal treatment where the
kinetic parameters were calculated as activation energy and preexponential factor to estimate
the shelf life of the ASA. The influence of particle size and relative humidity on the shelf
life of acetylsalicylic acid can be represented as a quadratic equation. The increase in the
shelf life is favored in crystals of around 200 um, stored at humidities between 35 and 45%.
Keywords
NON ISOTERMAL TREATMENTS, ISOTERMAL TREATMENTS, ASPIRIN,
RELATIVE HUMIDITY, PARTICLE SIZE, SHELF LIFE.
xvi
Introducción
La estabilidad de las materias primas es crucial para garantizar su calidad, seguridad
y eficacia durante el tiempo de almacenamiento, con el objetivo de que pueda formar parte
de un medicamento apto para el paciente. En investigaciones anteriores ya se han realizado
ensayos de estabilidad de materias primas mediante tratamientos no isotermales, los
resultados sugieren que tanto el tamaño de partícula como la humedad relativa a la que están
expuestas durante su almacenamiento pueden influenciar en su tiempo de vida útil. En este
estudio se sometieron muestras de ASA a condiciones isotermales, a diferentes humedades,
seguido de tratamientos no isotermales en DSC, con el fin de estimar el periodo de vida útil
de las fracciones de ASA a partir de los datos cinéticos calculados.
En el presente proyecto se exponen los capítulos siguientes:
Capítulo I. El Problema, que contiene el planteamiento del problema, su formulación y
justificación, así como los objetivos, tanto el general como los específicos.
Capítulo II. Marco Referencial, donde se detallan los antecedentes de la investigación y la
fundamentación teórica, además de la descripción de las hipótesis y del sistema de variables.
Capítulo III. Metodología de Investigación, aquí se establece el diseño de la investigación
que contiene el paradigma, el nivel y los tipos de investigación empleados; a su vez se
describen los métodos, materiales y procedimientos, así como el diseño experimental, la
matriz de operacionalización de variables y el análisis estadístico.
Capítulo IV. Análisis y Discusión de resultados en donde se muestra los datos obtenidos y
los tratamientos realizados para cumplir con los objetivos propuestos
Capítulo V. Donde consta de las conclusiones y recomendaciones
17
Capítulo I. El Problema
Planteamiento del problema
Según la ICH, el propósito de un estudio de estabilidad es proporcionar la evidencia de cómo
varía la calidad de una sustancia medicamentosa a lo largo del tiempo bajo la influencia de
una serie de factores ambientales tales como la temperatura, humedad relativa y la luz, y
definir las condiciones recomendadas de almacenamiento, periodos de reensayo y semivida
(Anca, 2015)
Sin embargo, puede existir una limitante al generalizar los métodos tradicionales de análisis
de estabilidad a sistemas heterogéneos por motivo a que en una forma farmacéutica sólida
pueden coexistir varios componentes, y estos se encuentran en diversos estados cristalinos y
amorfos, en partículas de diverso tamaño y formas. Esta heterogeneidad produce una
dificultad, que las reacciones de degradación puedan ser representadas por un único modelo
de cinética de reacción, de orden cero, primero, segundo o tercero. (Alcocer, 2016)
La principal ruta de degradación para el ácido acetilsalicílico es la hidrólisis, en donde
representa uno de los tipos más comunes de inestabilidad de principios activos. La hidrólisis
de ésteres es catalizada ya sea por el ion hidrógeno o el ion hidróxido, aunque la catálisis es
importante desde el punto de vista de la estabilidad del principio activo, depende del
compuesto específico y del pH de la solución en la que se encuentra. (Salgado, Torres, &
Treeminio, 2014)
Las partículas con mayor superficie expuesta por unidad de volumen tienen una mayor
reactividad favoreciendo al proceso de degradación y disminuyendo por tanto su vida útil.
Mientras que, a menor superficie reactiva, se expresaría una vida útil mayor debido a que el
proceso de descomposición que toma lugar desde la superficie del sólido se atenúa. (Arteaga,
Castillo, Alcocer, & Santamaría, 2018)
Por tanto en el siguiente proyecto se buscó la relación entre el tamaño de partícula y la
humedad relativa con respecto a la vida útil del ácido acetil salicílico cristalino producido en
DanQuímica, con el fin contribuir a mejorar los procedimientos productivos.
Formulación del problema
Cuál es la relación entre el tamaño de partícula de la Aspirina y la humedad relativa a la que
está expuesta durante su almacenamiento, con su tiempo de vida útil
18
Objetivos
Objetivo general.
Determinar la influencia del tamaño de partícula y la humedad en la vida útil del
ácido acetil salicílico mediante tratamientos no isotermales empleando calorimetría
diferencial de barrido.
Objetivos específicos.
Caracterizar por HPLC, y seleccionar un lote de la materia prima proveniente de
DanQuimica que cumpla con las especificaciones de la USP.
Fraccionar mediante tamizaje una muestra de la materia prima a fin de obtener un
determinado rango de tamaño de partícula.
Determinar los parámetros cinéticos de degradación, energía de activación y factor
pre-exponencial mediante la aplicación de condiciones isotermales a diferente
humedad relativa 19%, 43%,63%.
Determinar los parámetros cinéticos de degradación, energía de activación y factor
pre-exponencial mediante la aplicación del método de Kissinger.
Estimar el periodo de vida útil de las fracciones de ASA a partir de los datos cinéticos
previamente calculados.
Justificación e Importancia
En el desarrollo de formas de dosificación farmacéutica, uno de los retos persistentes
es garantizar una estabilidad aceptable. Mientras que la estabilidad clásica consiste en la
capacidad de soportar la pérdida de un químico debido a la degradación, el término
"estabilidad" se refiere frecuentemente al tiempo de almacenamiento permitido antes de que
cualquier producto de degradación alcance llegue a su límite de especificación y pueda
representar un riesgo para el paciente (Kenneth &Roger, 2004)
No se encontraron muchos estudios con respecto a la influencia del tamaño de
partícula del ASA y la humedad relativa a la que está expuesto, con su vida útil,
constituyéndose en una pregunta de investigación válida y con aplicación industrial, a fin de
expandir el conocimiento.
Debido a que la síntesis de este principio activo es realizada por la única industria
nacional que sintetiza fármacos, todo aporte que contribuya a la optimización del proceso,
redunda en beneficios para la Empresa Nacional, los investigadores y la sociedad en general
pues se propende a fortalecer la industria nacional y disminuir la dependencia tecnológica.
19
El presente trabajo representa la continuación de las tres investigaciones que sobre
este tema se ha realizado en la Facultad de Ciencias Químicas, rubricando el hecho de que
el conocimiento se va generando a pequeños pasos, pero direccionados a una meta definida.
20
Capítulo II. Marco Referencial
Antecedentes de la investigación
Los estudios en donde se realizan investigaciones sobre la influencia de la humedad y el
tamaño de partícula son de mucha importancia debido a que proporcionan información ya
sea para nuevas investigaciones, o mejorar los procesos de síntesis del ácido acetil salicílico.
A continuación, se detallan algunas investigaciones relacionadas con la influencia de sus
propiedades y estabilidad del ácido acetil salicílico y sus productos de degradación.
Arteaga & otros, en la tesis de pregrado, (2018): “Drug shelf life estimation by non-
isothermal treatments in DSC: specific Surface área effect”, realiza estudios de estabilidad
en tres diferentes lotes de ácido acetil salicílico con edad diferente obteniendo similares
tiempos de vida útil del lote más nuevo con el de mayor edad, en contraste con el lote de
edad intermedia que posee un mayor tiempo de vida útil, lo que podría explicarse por la
diferente área superficial y por tanto reactividad de sus partículas.
Alcocer, (2016) en “Isoconversión, un Método Efectivo en la Estimación del Tiempo de
Vida Útil de Formas Farmacéuticas Sólidas”, basa su revisión en el hecho de poder
diferenciar entre la cinética de reacción de los sistemas heterogéneos, como la existente en
una forma farmacéutica sólida, y la de los sistemas homogéneos, encontradas en algunas
formas farmacéuticas líquidas. La heterogeneidad dificulta la representación de las
reacciones de degradación por un único modelo de cinética de reacción. En este contexto,
surgen métodos basados en la medición de la transformación de las sustancias por
isoconversión.
Campanella en (2011) “Kinetic investigation and predictive model for the isothermal
degradation time in two commercial acetylsalicylic acid-based pharmaceutical tablet
formulations”, se centró en el análisis cinético de la descomposición térmica de ASA puro,
utilizando dos métodos cinéticos libres de calentamiento múltiple conocidos: Kissinger y
Ozawa-Flynn-y Wall. El conocimiento de los parámetros de Arrhenius relacionados con este
proceso permite calcular los valores de tiempo de vida media (extrapolados a 25 ◦C) en
porcentajes fijos de producto degradado para ASA puro. Po último, la novedad de este
estudio fueron los resultados de mediciones isotérmicas a largo plazo, consistentes con
mediciones a corto plazo no isotérmicas, en donde se utilizó un modelo predictivo para la
estimación de los tiempos de degradación isotérmica, demostrando la confiabilidad de
tiempos de vida media extrapolados.
21
Li, Zhan, Tao en “Evaluation of the Stability of Aspirin in Solid State by the Programmed
Humidifying and Non-isothermal Experiments” (2008), observa la influencia de la humedad
y el calor en la estabilidad de la aspirina que se investigó mediante un solo par de
experimentos, uno con control de humedad programado y el otro no isotérmico, en lugar de
muchos estudios isotérmicos estándar, cada uno a humedad relativa constante. Dado que los
experimentos programados de humidificación no isotermal ahorran tiempo, trabajo y
materiales, se sugiere que el nuevo método experimental se pueda utilizar para investigar la
estabilidad de fármacos inestables a la humedad y al calor, en lugar de muchos experimentos
isotermos clásicos a humedad constante.
En la actualidad, el método estándar utilizado para el análisis de estabilidad de un producto
farmacéutico de estado sólido es HPLC. La concentración cualquier compuesto secundario
producido se determina en función del tiempo de almacenamiento. El método tiene ciertos
inconvenientes, ya que a menudo debido a su sensibilidad a pequeños cambios en la
concentración, requiere de su validación y análisis de la muestra y se basa en la disolución
del producto sólido. Este último inconveniente puede causar distorsiones en un ensayo como
resultado de la rápida aceleración de la descomposición cuando un compuesto está en un
estado solvatado (Phipps & Mackin, 2000)
El DSC es una técnica que permite medir la respuesta física, por ejemplo, de fusión o
cristalización, o química, descomposición u oxidación, de una muestra a una determinada
temperatura; por lo tanto, por motivo su utilización puede ser cualitativa y cuantitativamente
para caracterizar cambios en la energía asociados con eventos térmicos proporcionando
información sobre el mecanismo, la cinética y la termodinámica de la reacción. (Arteaga,
Castillo, Alcocer, & Santamaría, 2018)
Fundamentación teórica
Estabilidad
Es la capacidad de un producto farmacéutico para mantener sus propiedades
químicas, físicas, microbiológicas y biofarmacéuticas dentro de límites especificados, a lo
largo de su tiempo de almacenamiento. (Lidiette & Lorena, 2004)
Es la característica de un medicamento contenido en un envase de determinado
material para conservar durante el tiempo de almacenamiento y uso las propiedades físicas,
22
químicas, fisicoquímicas, microbiológicas y biológicas entre los límites especificados.
(Lidiette & Lorena, 2004)
Estudios de estabilidad
Es una serie de pruebas diseñadas para determinar la información sobre la estabilidad
de un producto farmacéutico con el objetivo de definir su período de validez y el período de
utilización en condiciones determinadas de envasado y almacenamiento. (WHO, 1996)
Tiempo de vida útil
Es el período de tiempo durante el cual se espera que un medicamento, si se almacena
de manera óptima cumpla con la especificación, como lo determinan los estudios de
estabilidad en varios lotes del producto. La vida útil se utiliza para edefinir la fecha de
caducidad del lote (WHO, 1996).
Fecha de caducidad
Es la fecha en la que un producto no cumple con las especificaciones establecidas en
la Farmacopea o es el periodo máximo en el que el consumidor puede utilizar el producto
(WHO, 1996).
Métodos de ajuste a un modelo
Son métodos que involucran la utilización de diferentes modelos de curvas de
temperatura para el estudio de los datos experimentales, el modelo que proporcione el mejor
ajuste estadístico es usado para la determinación de la energía de activación y el factor
preexponencial o de frecuencia (Heydari, Rahman, & Gupta, 2015).
23
Estudios de estabilidad acelerada.
Son estudios propuestos para aumentar la degradación química y el cambio físico de
un medicamento mediante la utilización de condiciones de almacenamiento exageradas. La
obtención de los datos puede usarse para evaluar efectos químicos a más largo plazo en
condiciones no aceleradas y para evaluar el impacto de excursiones a corto plazo fuera de
las condiciones de almacenamiento de la etiqueta, como podría ocurrir durante el envío.
(WHO, 1996).
Estudios de estabilidad a tiempo real (largo plazo).
Son estudios sobre las propiedades físicas, químicas, biológicas, biofarmacéuticas y
microbiológicas de un producto farmacéutico, durante y después de la vida útil y los períodos
de almacenamiento de las muestras en las condiciones de almacenamiento previstas en el
mercado. Los resultados se utilizan para definir y confirmar la vida útil proyectada y así
recomendar condiciones de almacenamiento (WHO, 1996).
Métodos por isoconversión
La isoconversión es un método de evaluación creada por Kujirai y Akahira en 1925,
los cuales estudiaron la degradación de materiales de aislamiento mediante condiciones
isotérmicas, permitiendo el cálculo de la energía de activación en función de la pérdida de
masa; en 1948 Dakin propuso varios modelos cinéticos en la degradación de materiales
complejos; en los años 50, se produjo una instrumentación que logró el estudio de materiales
en condiciones no isotérmales (Alcocer, 2016).
Método estándar de isoconversión.
En este método se usa el logaritmo de la relación exponencial entre la degradación y
el tiempo de la Ecuación de Arrhenius, para datos de un proceso isotérmico, de la función
g(α), el cual expresa el grado de conversión (Khawan, 2006).
𝑙𝑛𝑔(∝) = 𝑙𝑛𝐴 −𝐸
𝑅𝑇+ ln 𝑡
(1)
24
Método de Friedman.
Este es un modelo diferencial, en donde se usa el logaritmo presentada en la ecuación
2 (Khawan, 2006):
𝑙𝑛 (𝑑 ∝
𝑑𝑡) = 𝑙𝑛𝐴𝑓(∝) −
𝐸
𝑅𝑇
(2)
Ozawa Flyn y Wall.
Se aplica a datos de un proceso no isotérmico. Utilizando la siguiente ecuación
(Criado, 2008).:
𝑙𝑜𝑔𝑔(∝) = 𝑙𝑜𝑔𝐴𝐸
𝑅𝛽+ ln 𝑝(𝑥)
(3)
Donde
p(x) es la función integral de Arrhenius
x es igual a E/RT y β=dT/dt
Método de Kissinger
El método de Kissinger es uno de los enfoques más populares para el cálculo de
parámetros cinéticos por medio del análisis térmico. El enfoque de desplazamiento del pico
de Kissinger se aplica fácilmente con calorímetros de escaneo disponibles comúnmente, es
aplicable a tamaños de muestras muy pequeños, y rinde rápida y fácilmente los parámetros
cinéticos (E y A) asociados con pruebas de por vida, seguridad y transporte (Blaine &
Kissinger, 2012).
El método de Kissinger se basa en una serie de experimentos en los que pequeñas
cantidades de muestras en miligramos se los somete diferentes velocidades de calentamiento
registrando el pico exotérmico de la reacción. La temperatura máxima exotérmica (Tm), que
se toma como un punto de conversión constante, se lo determina a cada velocidad de
calentamiento.
𝑙𝑛 (𝛽
𝑇𝑚2) = 𝑙𝑛 (
𝐴𝑅
𝐸𝑎) −
𝐸𝑎
𝑅𝑇𝑚 (4)
25
Se realiza una gráfico de ln(β/ T2 m) versus (1/Tm) y se realiza el ajuste obteniendo
una línea recta a los datos. La pendiente es igual a -Ea/R mientras que la intersección es
ln(AR / Ea) donde Ea es la energía de activación, A el factor preexponencial de Arrhenius y
R es la constante de los gases (= 8.314 J/molK). Suponiendo una orden de reacción de primer
orden (n = 1). (Blaine & Kissinger, 2012)
Estos parámetros cinéticos son usados para el cálculo de la estabilidad denominado
vida media (tD), siendo este el tiempo necesario para que el porcentaje de degradación (D)
sea del 50 % a una temperatura dada (Heydari, Rahman, & Gupta, 2015)
𝑔(𝐷) = 𝐴 𝑒−𝐸𝑎
𝑅𝑇 𝑡 ∴ 𝑔(𝐷) = −𝑙𝑛 (1 −𝐷
100) (5)
𝑡𝐷 =−𝑙𝑛(1−
𝐷
100)
𝐴𝑒−𝐸𝑎𝑅𝑇
(6)
T=Temperatura de referencia (298,15K)
Los parámetros termodinámicos de activación como cambios en la entropía (ΔS),
entalpia (ΔH) y energía libre (ΔG) se pueden determinar a partir de los parámetros cinéticos,
(Arteaga, Castillo, Alcocer, & Santamaría, 2018) así:
𝐴 𝑒−𝐸𝑎
𝑅𝑇 =𝑘𝐵 𝑇
ℎ 𝑒
−∆𝐺
𝑅𝑇
∆𝐺 = 𝑅𝑇 𝑙𝑛 (𝑘𝐵 𝑇
ℎ 𝐴) + 𝐸𝑎 (7)
kB
h
Constante de Boltzmann,
1.3806 x 10−23 J/K
Constante de Plank,
6.626 x 10-34 J s
∆𝐻 = 𝐸𝑎 − 𝑅𝑇 (8)
∆𝐺 = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆
∆𝑆 =∆𝐻−∆𝐺
𝑇 (9)
Efecto de la humedad
La humedad tiene un efecto significativo sobre la estabilidad del principio activo
incluso si no existiera el involucramiento de moléculas de agua. Conforme incrementa la
temperatura, el contenido de agua en la atmósfera para un determinado valor de humedad
relativa, aumenta, sin embargo, la humedad relativa (%HR) es la responsable de la actividad
del agua (Huynh, 2009). Uno de los principales efectos del valor de humedad relativa, es la
26
pérdida o adición de moléculas de agua de hidratación en las formas cristalinas del principio
activo; en algunos la transformación del API al estado amorfo puede ser por la pérdida de
agua de hidratación, y esto puede producir una inestabilidad más alta que las formas
cristalinas (Alcocer, 2016).
Para una determinada temperatura, el efecto de la humedad sobre la constante cinética
puede representarse mediante la siguiente ecuación:
ln 𝑘 = 𝐵(%𝐻𝑅) + 𝐶
(10)
Esta es la ecuación de sensibilidad a la humedad. Donde B y C son constantes. El valor de
B, oscila entre 0.00 a 0.09. (Huynh, 2009).
Combinación del Efecto de la Temperatura y la Humedad Relativa
La combinación de las ecuaciones de Arrhenius y la de sensibilidad a la humedad
genera una ecuación que considera los efectos de la temperatura y la humedad sobre la
estabilidad del principio activo. (Alcocer, 2016)
ln 𝑘 = 𝑙𝑛𝐴 −𝐸
𝑅𝑇+ 𝐵(%𝐻𝑅)
(11)
Esta ecuación establece que la razón de degradación, o constante cinética, depende
de la Temperatura y de la Humedad Relativa.
Por motivo a que la ecuación posee tres constantes A, E y B; y tiene dos variables
independientes, el número mínimo de experimentos que se necesitan para resolver la
ecuación es tres, siendo necesario aumentar el número de puntos para mejorar la precisión
de las mediciones. En la mayoría de los estudios de dos a tres semanas pueden ser adecuados
para determinar la vida útil de un producto en condiciones ambientales. Para iniciar un
proceso de estudio, se realiza un protocolo base como se muestra en la tabla 1. (Alcocer,
2016)
27
Tabla 1. Protocolo para ensayo de estabilidad acelerada de formas farmacéuticas sólidas
T °C %RH Días
(muestras 1) α1 exp.
Días
(muestras 2) α2 exp.
50 75 4 a1 14 a1´
60 5 14 a2 21 a2´
60 40 4 a3 21 a3´
70 5 4 a4 21 a4´
70 75 1/3 a5 2 a5´
80 40 1/3 a6 4 a6´
Tomado de (Alcocer, 2016)
Donde α1 exp y α2 exp, son los valores experimentales de degradación, que se
esperan obtener en las condiciones de temperatura y humedad dentro de un determinado
tiempo (Alcocer, 2016).
Las mediciones obtenidas pueden ser utilizadas para determinar el tiempo de
isoconversión en cada condición. Como primer punto, se puede trazar una línea por medio
de los datos para encontrar el intercepto con la especificación límite. Segundo, los dos puntos
más cercanos al límite de la especificación, pueden ser utilizados para interpolar o extrapolar
el tiempo de llegada a la especificación, Tercer, el único punto que se encuentra más cerca a
la especificación puede ser utilizado para estimar k= α/t (Alcocer, 2016).
Para estimar la relación entre las variables con la degradación, se pueden utilizar dos
metodologías, 1) transformar la ecuación de Arrhenius a la forma lineal y determinar las
constantes mediante regresión por mínimos cuadrados 2) realizar un ajuste por mínimos
cuadrados en la forma exponencial (Alcocer, 2016).
Calculo de vida útil experimental mínima (Hipérbolas de confianza).
Los estudios de estabilidad para establecer vida útil, fundamentados en los datos de
un solo lote se clasifican como “estudios de estabilidad concomitantes”. Una aproximación
aceptable para la estimación de la vida útil en referencia a las propiedades del principio
activo que se esperan decrementen con el tiempo, es determinar el tiempo al que el límite
28
inferior del 95% de confianza de una distribución de una cola trazado para la curva de
descomposición promedio, intersecta el límite de la menor especificación aceptable, en el
que para la mayoría de casos es un valor de 90% de la concentració. (INVIMA, 2016)
Carstensen y Nelson proponen una aproximación aceptable para determinar la vida
útil y el límite inferior del 95% de confianza, ilustrado en la figura 1. La vida útil se estima
sobre la base de una curva llamada "límite de predicción". En el ejemplo que se muestra en
la figura 1, el valor del límite de especificación se supone es del 90% de la concentración.
Sin embargo, si se usa la curva del límite de predicción indicado por Carstensen y Nelson,
el intercepto de esta paralela sobre la curva nos mostraría un tiempo de vida útil inferior a
cuatro años. (INVIMA, 2016)
Figura 1. Estudio de estabilidad de Largo Plazo (INVIMA, 2016)
Estabilidad del estado sólido.
Comúnmente se realizan estudios de estabilidad en condiciones aceleradas para
estimar la vida útil de los medicamentos sin esperar a que se produzca la degradación
completa en tiempo real. Sin embargo, los modelos cinéticos químicos utilizados para
describir los sistemas de estado sólido (muestras heterogéneas) son complejos. Los ejemplos
típicos son: modelos de difusión, modelos de frontera de fase, modelos de nucleación y
crecimiento.
29
La determinación del modelo exacto puede ser difícil en sistemas heterogéneos debido a la
irreproducibilidad de los datos de velocidad. Para esto se usan diferentes enfoques. (Hertzler
& John, 2017)
Enfoque de isoconversion (tiempo hasta el límite de especificación).
El objetivo es diseñar un estudio de tal forma que, en cada condición de temperatura
y humedad, nos otorgue información sobre cuánto tiempo se necesita para lograr cierta
degradación fraccional (por ejemplo, 0.2%). Entonces se puede ignorar "cómo" llegó la
impureza al nivel del límite de especificación para la estimación de los parámetros cinéticos
que se utilizarán en el modelado posterior. (Hertzler & John, 2017)
Ecuación de Arrhenius ajustada a la humedad.
Si no ocurren cambios físicos en la forma de dosificación, se debe aplicar el modelo
de Arrhenius para las velocidades de reacción química.
Entonces es puede definir un rango de valores de temperatura (T) y humedad (H) dentro de
los cuales el modelo de Arrhenius extendido predice de mejor manera la vida útil:
𝑘𝑇,𝐻 = 𝐴 𝑒𝑥𝑝 (−𝐸
𝑅𝑇+ 𝐵𝐻) (12)
donde H es la humedad relativa de equilibrio y B es una constante, de susceptibilidad a la
humedad (Hertzler & John, 2017).
Enfoque de no isotermal.
Los recientes desarrollos en los estudios sobre la estabilidad de los medicamentos
han puesto la necesidad de predicciones confiables y rápidas. Hoy en día, los investigadores
han mostrado un mayor interés en los inconvenientes sobre la interacción fármaco-
excipiente.
30
Los hallazgos de diferentes investigadores han sugerido la calorimetría diferencial de
barrido (DSC) para la determinación de la incompatibilidad fármaco-excipiente. El método
de exploración múltiple a diferentes velocidades de calentamiento mediante el uso de
procedimientos de cálculo de isoconversión se ha definido recientemente para estudios
cinéticos de estado sólido. Los métodos que se han utilizado ampliamente para estudiar la
energía de activación son (Ghaderi & Nemati, 2017):
Friedman (FR)
Kissinger-Akahira-Sunose (KAS)
Flynn-Wall-Ozawa (FWO)
Ácido acetil salicílico.
El ácido acetilsalicílico todavía es el analgésico, antipirético y antiinflamatorio más
utilizado y es la norma de referencia para comparar y evaluar a los demás (Goodman &
Gilman, 2012).
Características.
Es un fármaco que pertenece a la familia de los Salicilatos.
La aspirina es un derivado del ácido salicílico, con el que se ha conseguido aumento
de la efectividad analgésica disminuyendo los efectos irritantes sobre el aparato
digestivo.
Está formado por agujas blancas cristalinas.
Posee cristales alargados, con sabor ligeramente amargo, y color blanquecino; por
otra parte, se funden a 132ºC siendo insolubles en agua.
Es estable en aire seco, pero con la humedad se descompone lentamente en ácido
salicílico y en ácido acético.
La molécula de Aspirina contiene 9 átomos de carbono, 4 de oxígeno y 8 de
hidrógeno.
Sus efectos analgésicos, antipiréticos y antiinflamatorios se deben a las asociaciones
de las porciones acetilo y salicilato de la molécula intacta, como también a la acción
del metabolito activo salicilato.
Soluble en 300 partes de agua destilada, en 7 partes de alcohol, en 17 partes de
cloroformo, en 20 partes de éter y en soluciones concentradas de acetato de amonio.
31
En las soluciones concentradas de hidróxidos y de carbonatos alcalinos es soluble
con descomposición (Martínez, Barrios, Peláez, & López, 2016).
Tabla 2. Características fisico-químicas del ASA
Ácido acetil salicílico
Peso Molecular 180,16 g/mol
Punto de Ebullición 140°C
Punto de Fusión 136 °C
Densidad 1,40 g/cm3
Absorción UV 229 nm
Tomado de (Martínez, Barrios, Peláez, & López, 2016)
Figura 2.Curvas DSC para ASA y SA determinadas a 10°C/min. Fuente: : (Arteaga, Castillo, Alcocer, & Santamaría,
2018)
Ácido salicílico
Sólido, blanco y cristalino, de fórmula C6H4(OH)COOH. Es un compuesto
fenólico derivado del ácido benzoico involucrado en el metabolismo secundario de
plantas, además se ha identificado que el ácido benzoico y el ácido ortocumárico son
32
precursores o intermediarios del ácido salicílico. Los compuestos salicílicos
medicinales son empleados como queratolítico, antimicótico y antiséptico (Ramírez,
2012).
Características.
Sólido incoloro que suele cristalizar en forma de agujas.
Posee buena solubilidad en etanol y éter.
Industrialmente se obtiene a partir del dióxido de carbono y fenóxido de sodio.
El ácido salicílico es el aditivo clave en muchos productos para el cuidado de la piel
diseñados para tratar acné, psoriasis, callosidades (el endurecimiento de la piel por
presión persistente) y las verrugas (Martínez, Barrios, Peláez, & López, 2016).
Hidrólisis del ácido acetil salicílico
La hidrólisis de ésteres como la aspirina representa uno de los tipos más comunes de
inestabilidad de drogas. La hidrólisis de ésteres es catalizada ya sea por el ion hidrógeno o
el ion hidróxido, aunque la catálisis que es importante desde el punto de vista de la
estabilidad de la droga depende del compuesto específico y del pH de la solución. (Salgado,
Torres, & Treeminio, 2014)
El proceso hidrolítico de la aspirina a ácido salicílico y ácido acético fue estudiado por
Edwards:
Figura 3. Productos de degradación del ASA. Fuente (Salgado, Torres, & Treeminio, 2014)
Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)
En la técnica de Calorimetría Diferencial de Barrido se dispone de dos cápsulas. Una
de ellas contiene la muestra a analizar y la otra está generalmente se encuentra vacía
(cápsula de referencia). Se usan calefactores individuales para cada cápsula y un sistema
de control comprueba si se producen diferencias de temperatura entre la muestra y la
referencia. Cuando tiene lugar un proceso exotérmico o endotérmico, el instrumento
33
compensa la energía necesaria para mantener la misma temperatura en ambas cápsulas.
Generalmente, puede decirse que todas las transformaciones o reacciones donde se
produce un cambio de energía pueden medirse por DSC. Entre las diversas utilidades de
la técnica de DSC podemos destacar las siguientes (Suriñach, Baro, Bordas, &
Clavaguera, 1992):
Medidas de capacidad calorífica aparente (fenómenos de relajación estructural).
Determinación de temperaturas características de transformación o de transición
tales como: transición vítrea, transición ferro-paramagnética, cristalización,
transformaciones polimórficas, fusión, ebullición, sublimación, descomposición,
isomerización, etc.
Estabilidad térmica de los materiales.
Cinética de cristalización de los materiales.
Hipótesis:
Hipótesis de trabajo, Hi.
El tamaño y la humedad residual de las partículas de ASA afectan su tiempo de vida
útil.
Hipótesis nula, Ho.
El tamaño de partícula y la humedad que poseen estas, no afectan en el tiempo de
vida útil del ácido acetil salicílico.
Sistema de Variables
En el siguiente cuadro se detallan las variables dependientes e independientes.
Tabla 3. Sistemas de variables de acuerdo con su etapa
Etapa Variable independiente Variable dependiente
Caracterización por HPLC Tamaño de partícula Porcentaje de ASA y SA.
Tamizaje Luz de malla Tamaños de partícula
Tratamiento isotermal Humedad relativa Porcentaje de ASA y SA a
tiempo constante.
Tratamiento no Isotermal
Tamaño de partícula
Humedad relativa
Velocidad de
Calentamiento, β
Temperatura del primer paso
de degradación del ASA, Tm
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
34
Capítulo III. Metodología de Investigación
Diseño de la Investigación
Paradigma de la Investigación.
La “Influencia del tamaño de partícula y la humedad en la estimación rápida del
tiempo de vida útil del ácido acetil salicílico mediante tratamientos no isotermales
empleando calorimetría diferencial de barrido” constituirá una investigación cuantitativa
debido que se determinará la temperatura de primer paso de degradación de diferentes
tamaños y sometidos a diferentes condiciones de humedad en función de la variación de la
velocidad de calentamiento, a fin de obtener los siguientes parámetros cinéticos, como son
energía de activación y factor preexponencial, con el propósito de estimar el tiempo de vida
útil y compararlos entre sí.
Nivel de Investigación.
Para la presente investigación se tomará un nivel de investigación predictivo debido
a que con los datos obtenidos mediante el tratamiento a diferentes variaciones de temperatura
se logra anticipar situaciones futuras, es decir, con la obtención de los parámetros cinéticos
del proceso de degradación obtenidos se logrará estimar el tiempo de vida útil de ácido acetil
salicílico.
Tipo de Investigación.
El tipo de investigación fue de tipo experimental, debido a que se llevará a cabo en
los laboratorios de Tecnología Farmacéutica, Nanoestructuras y OSP; siguiendo procesos
validados para la obtención de datos para su posterior análisis.
35
Métodos y Materiales
Tabla 4. Materiales y métodos
Método Materiales Equipos
Cromatografía líquida de alta eficacia,
HPLC
Columna Zorbax Eclipse XDB - C8
Balón aforado 10, 25, 250, 1000 ml
Pipeta volumétrica 1 ml
Pipeta graduada 1, 10 ml
Micropipeta 100 – 1000 ul
Vasos de precipitación 50, 100, 250
ml
Probeta 100ml
Cajas Petri
Equipo de filtración al vacío
Jeringuillas 5 ml
Filtros de membrana PTFE 0.45 um
Filtros para jeringuilla PTFE 0.22
um
Espátula
HPLC Dionex Ultimate 3000
Balanza analítica Mettler
Toledo Modelo ML 204/01
Potenciómetro WTW inoLab
pH 720
Balanza halógena Mettler
Toledo Modelo HX 204
Ultrasonido
Reactivos
Fosfato monobásico de potasio 99.5%
Ácido fosfórico 85%
Acetonitrilo HPLC
Agua tipo I
Estándares secundarios Dan Química C. A.:
Ácido acetil salicílico y Ácido salicílico
Estándar ASA USP:
Materia prima Dan Química C.A.:
Ácido acetil salicílico USP, Lotes: LE7689.
Método Materiales Equipos
Calorimetría diferencial de barrido,
DSC
Tzero cápsulas de aluminio no
herméticas
Pinzas
Portaobjetos
TA DSC Q2000 – 1705
Tzero prensa para cápsulas
Microscopio invertido
AMScope con cámara
Reactivos
Estándar Indio 100%
Nitrógeno Ultra Puro Grado 5.0
Método Materiales Equipos
Tamizaje Tamiz 750um
Tamiz 500um
Tamiz 315um
Tamiz 250um
Tamiz 200um
Tamiz 160um
Balanza analítica
Scientech SA210
36
Reactivos
Materia prima Dan Química C.A.:
Ácido acetil salicílico USP, Lotes: LE7689
Método Materiales Equipos
Acondicionamiento humedades Cajas Petri plásticas
Balanza analítica Scientech
SA210
Estufa D-63450 Heraeus T12
Estufa Memmert 854
Schwabach
Reactivos
Carbonato de potasio
Cloruro de sodio
Sílica gel
Materia prima Dan Química C.A.:
Ácido acetil salicílico USP, Lotes: LE7689
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
Diseño Experimental
El diseño utilizado se realizó para que cada muestra de ASA de diferente tamaño, y
sometidas a diferentes condiciones de humedad relativa, sean tratadas a tres diferentes
velocidades de calentamiento utilizando Calorimetría diferencial de barrido (DSC); lo datos
obtenidos mediante la interpretación de los termogramas son las temperaturas de
degradación (Tm), para el posterior cálculo de la Ea y A, mediante el uso de la ecuación de
Kissinger.
Tabla 5. Diseño experimental del proyecto
Materia Prima Temperatura Humedad
relativa
Velocidad de calentamiento β
(°C/min)
5 10 20
MPT1
30°C 19% n=3 n=3 n=3
30°C 43% n=3 n=3 n=3
30°C 63% n=3 n=3 n=3
MPT1= Materia prima tamaño uno.
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
37
Tabla 6. Diseño experimental del proyecto
Materia Prima Temperatura Humedad
relativa
Velocidad de calentamiento β
(°C/min)
5 10 20
MPT1 Ambiental Ambiental n=3 n=3 n=3
MPT2 Ambiental Ambiental n=3 n=3 n=3
MPT3 Ambiental Ambiental n=3 n=3 n=3
MPT1= Materia prima tamaño uno; MPT2= Materia prima tamaño dos; MPT3= Materia prima tamaño
tres
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
Matriz de Operacionalización de Variables
Tabla 7. Descripción de la dimensión e indicador de las variables
Etapa Variable independiente Dimensión Indicador
Caracterización
por HPLC
Tamaño de
partícula
Longitud Micrómetros, um
Tamizaje Luz de malla Longitud Micrómetros, um
Tratamiento
isotermal
Humedad
relativa
Humedad %
Tratamiento no
Isotermal
Tamaño de
partícula
Humedad
relativa
Velocidad de
Calentamiento,
β
Longitud
Humedad
Velocidad de
Calentamiento, β
Micrómetros
%
°C/min
Etapa Variable dependiente Dimensión Indicador
Caracterización
por HPLC
Porcentaje de ASA y
SA.
Concentración %ASA, %SA
Tamizaje Tamaños de partícula Longitud Micrómetros, um
Tratamiento
isotermal
Porcentaje de ASA y
SA a tiempo constante.
Concentración %ASA, %SA
Tratamiento no
Isotermal
Temperatura del primer
paso de degradación
del ASA, Tm
Temperatura, Tm °C
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
Procedimientos
El método HPLC descrito a continuación fue tomado de un estudio de pregrado (Arteaga,
Castillo, Alcocer, & Santamaría, 2018), al igual que el método para el DSC.
38
Cuantificación de ácido acetil salicílico y ácido salicílico mediante HPLC.
Preparación de buffer KH2PO4, pH 2.25.
Se preparó una solución 20 mM de KH2PO4 disolviendo 2.40 g de reactivo en 1 litro
de agua tipo I; para ajustar el pH a 2.25, se utilizó ácido fosfórico al 85% de pureza.
Preparación de la fase móvil.
Para la fase móvil se mezcló buffer KH2PO4 de pH 2.25 con acetonitrilo HPLC en
proporción 75:25 filtrando al vacío, utilizando una membrana PTFE de 0.45 um.
Preparación de estándar de ácido acetil salicílico.
Se pesó 32.5 mg de estándar secundario de ácido acetil salicílico en un balón aforado
de 10 ml, se adicionó 0.5 ml de acetonitrilo y se agitó hasta disolver; finalmente se aforó con
fase móvil.
Preparación de estándar de ácido salicílico.
Se pesó 10.8 mg de estándar secundario de ácido salicílico en un balón aforado de 25
ml, se adicionó 0.5 ml de acetonitrilo, se agitó hasta disolver y se aforó con fase móvil.
Preparación de estándar combinado ASA / SA.
Se transfirió 1 ml de solución estándar de ASA a un balón aforado de 10 ml, después
se adicionó 0.225 ml de solución estándar de ácido salicílico y se aforó con fase móvil.
Concentración Ácido acetil salicílico: 0.325 mg/ml
Concentración Ácido salicílico: 0.00975 mg/ml
Preparación de las muestras.
Se pesó 32.5 mg de muestra ASA en un balón aforado de 10 ml, adicionar 0.5 ml de
acetonitrilo, se agitó durante 1 minuto y se aforó con fase móvil. Se tomó una alícuota de 1
ml de la solución preparada y se diluyó a 10 ml en un balón aforado. Tanto las muestras
39
como los estándares se prepararon por duplicado y se filtraron a través de un filtro PTFE de
0.22 um, antes de ser inyectadas.
Concentración muestras: 0.325 mg/ml
Análisis de estándares y muestras en el sistema cromatográfico.
El orden de inyección y el número de repeticiones tanto para los estándares como
para las muestras se realizó de acuerdo con la Aptitud del Sistema descrita en el método
⟨621⟩ Cromatografía de la USP 39; las características del método HPLC se describen en la
Tabla 7.
Tabla 8. Descripción del sistema HPLC
Columna Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6mm ID x 5cm x 3.5um
Temperatura columna 30°C
Fase móvil Buffer KH2PO4 pH 2.25 : Acetonitrilo (75:25)
Método isocrático
Flujo 0.8 ml/min
Tiempo de corrida 7 minutos
Detector DAD, 235 nm
Volumen de inyección 10 ul
Temperatura muestras 5°C
Método de cuantificación Área mínima
Tiempos de retención ASA: 2.40 minutos
SA: 3.50 minutos
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
Proceso de tamizaje para la obtención de diferentes tamaños de partícula.
Se utilizó tamices de diferentes siendo estos de 750 um, 500 um, 315 um, 250 um,
200 um, 160 um, en el cual se procedió con un tamizaje manual durante 30 minutos, de los
cuales se seleccionaron tres tamaños de partículas, los cuales fueron los cristales de tamaño
250 -315 um, 200 -250 um, 160 -200 um.
Preparación de las muestras a diferentes condiciones de humedad.
Del proceso de tamizaje se escogió un tamaño de partícula, al cual se lo sometió a la
misma condición de temperatura (30°C) y a diferentes condiciones de humedad: 19%, 43%,
63%, para lo cual se introdujeron en desecadores que contienen sílica gel, solución
40
sobresaturada de carbonato de potasio y cloruro de sodio respectivamente, a continuación,
se los colocaron en una estufa durante 31 días.
Determinación de parámetros cinéticos de degradación del ASA en DSC.
Calibración de constante de celda y temperatura.
En el software del DSC, se seleccionó el modo de calibración que incluye la prueba
de constante de celda y temperatura empleando estándar de indio y cápsulas de aluminio;
para este fin se preparó dos cápsulas, la primera se pesó y cerró conteniendo
aproximadamente 7 mg de estándar de indio y la segunda cápsula, vacía y cerrada, se pesó
para usarla como referencia. Las dos cápsulas se colocaron sobre la plataforma del
calorímetro y se calentaron desde 90 hasta 300°C a una velocidad de 10°C/min empleando
atmósfera de nitrógeno a un flujo de 25 ml/min.
Determinación de Tm de degradación del ASA mediante tratamiento no isotermal.
En función a los tratamientos especificados en el diseño experimental, las cápsulas
de aluminio se pesaron y cerraron conteniendo aproximadamente 5 mg de muestra de ASA,
cada cápsula se sometió a su respectiva velocidad de calentamiento, 5, 10 y 20 °C/min, desde
90 hasta 300°C empleando atmósfera de nitrógeno a un flujo de 25 ml/min. Del termograma
obtenido, se determinaron los valores de Tm a partir del punto máximo del pico de
degradación.
Determinación de forma y tamaño de cristales de ASA por microscopía.
Los cristales de ASA de los distintos lotes se colocaron en portaobjetos y se
observaron en el microscopio invertido con el lente 4x; utilizando el software AMScope para
medir la longitud de los lados de cada cristal y registrar su forma.
Técnicas de Procesamiento de Datos
Se emplearon parámetros estadísticos de medida de tendencia central y dispersión
para describir cada conjunto de datos de temperatura (Tm) generado a partir del diseño
experimental respectivo.
41
Tabla 9. Estadísticos descriptivos
Estadístico descriptivo Medida Definición Fórmula
Medida de tendencia
central
Media
Promedio aritmético de todos los
datos.
�̅� =∑ 𝑥𝑖
𝑛𝑖=1
𝑛
Medida de dispersión Desviación
estándar
Raíz cuadrada de la varianza
(promedio de los cuadrados de las
desviaciones con respecto a la
media aritmética).
𝜎 =∑ (𝑥𝑖 − �̅�)2𝑛
𝑖=1
𝑛 − 1
Coeficiente de
variación
Cociente entre la desviación
estándar y la media.
𝐶𝑉 =𝜎
�̅� 100
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
Tratamiento isotermal.
Cálculo de la vida útil experimental mínima (Hipérbolas de confianza).
Se calculó la línea de regresión a partir de todos los pares de valores, por el método
de los mínimos cuadrados. Para cada valor YR el punto correspondiente YC sobre la curva
de límite de confianza inferior, se puede calcular utilizando la siguiente ecuación:
(INVIMA, 2016)
𝑌𝑐 = 𝐴 + 𝐵(𝑥 − �̅�) ± 𝑡∝,𝑔𝑙 × √∑(𝑌𝑅−𝑦)2
𝑛−2× √1 +
1
𝑛+
(𝑥−�̅�)2
∑(𝑥−�̅�)2 (13)
y = Concentración remanente obtenida al tiempo x
YR = Punto correspondiente sobre la línea de regresión en el tiempo x.
A = Intercepto de la recta de regresión
�̅� = Tiempo.
B = Pendiente de la línea de regresión.
n = Número de parejas de valores (x, y)
t = Valor de la distribución de estudent para (n-2) grados de libertad y una probabilidad
P=95% (de una sola cola).
Efecto de la temperatura y humedad.
De los datos obtenidos de la cuantificación de HPLC, se realizó una regresión
lineal múltiple, se obtiene un ajuste de lnK en función de 1/T y %HR, para lo cual se
realizó una aproximación que es el método Monte Carlo, que proporciona variaciones
42
a cada temperatura y humedad relativa, dentro de cierto rango, y realiza un ajuste de
mínimos cuadrados con todas las combinaciones posibles (Huynh, 2009). En la
aplicación de la simulación con el método Monte Carlo, se asume una distribución
Normal y su desviación estándar. El software realiza 5000 simulaciones
experimentales, con el fin de construir límites de confianza para la degradación y
obtener datos de tiempo de vida útil. (Alcocer, 2016)
ln 𝑘 = 𝑙𝑛𝐴 −𝐸
𝑅𝑇+ 𝐵(%𝐻𝑅) (11)
Tratamiento no isotermal.
Ecuación de Kissinger.
Del ajuste de los datos de velocidad y Tm a la forma de la ecuación (4) y de la gráfica
resultante 1 𝑇𝑚⁄ versus 𝑙𝑛 (𝛽 𝑇𝑚2⁄ ), se obtuvieron los parámetros cinéticos de Arrhenius; de la
pendiente, 𝑏 = −𝐸𝑎 𝑅⁄ , se calculó la energía de activación y reemplazando este valor en el
intercepto, 𝑎 = 𝑙𝑛 (AR 𝐸𝑎⁄ ), el factor preexponencial.
𝑙𝑛 (𝛽
𝑇𝑚2) = 𝑙𝑛 (
𝐴𝑅
𝐸𝑎) −
𝐸𝑎
𝑅𝑇𝑚 (4)
Anova Simple.
Mediante ANOVA simple se determinaron si la variable respuesta energía de
activación, depende o no del grupo (factor) a partir del cual fue calculada, fracciones de
materia prima; esto a través de la aplicación de una prueba de hipótesis basada en el valor
del estadístico p.
𝐻0 : 𝜇1 = 𝜇2 = ⋯ = 𝜇𝑖
𝐻1 : 𝑎𝑙𝑔𝑢𝑛𝑎 𝜇𝑖 𝑒𝑠 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑖𝑛𝑡𝑎
μi → Media correspondiente
a cada nivel del factor
Donde, aceptar 𝐻0 implica que en todos los casos la media (𝜇𝑖) es la misma
independientemente del valor del factor; mientras que, si esta se rechaza, esto no implica que
todas las 𝜇𝑖 sean distintas entre sí, sino que alguna o algunas de ellas son diferentes de las
demás y por lo tanto el factor introducido explica las diferencias observadas entre los valores
de la variable respuesta, Ea.
43
Pruebas de rango múltiples.
Después de que se rechaza la hipótesis nula en un análisis de varianza, es necesario
ir a detalle y ver cuales tratamientos son diferentes. A continuación, veremos tres estrategias
distintas para ir a ese detalle (Gutiérrez, 2008).
Método DMS (diferencia mínima significativa).
Es la menos estricta de todas las pruebas y se la emplea en los siguientes casos cuando
se comparan dos medias de tratamientos que tiene igual número de repeticiones; dos medias
de tratamiento con diferente número de repeticiones; o cuando se desea realizar la
comparación múltiple entre todos los tratamientos con igual número de repeticiones por
tratamiento (Barragán, 2014).
𝐷𝑀𝑆 = (𝑔. 𝑙. 𝑒. 𝑒)(𝛼)(𝑆𝑑̅̅̅̅ ) (14)
Donde:
g.l.e.e. = grados de libertad del error experimental
𝛼 = Nivel de significancia, que puede ser al 5% y 1% tomado de la tabla t.
𝑆𝑑̅̅̅̅ = Error estándar de la diferencia de dos medias =√2𝐶𝑀𝐸𝐸
𝑟
CMEE =Cuadrado medio del error experimental
r = número de repeticiones por tratamiento
Método Duncan.
Esta prueba declara como significativas a las medias de los tratamientos cuando los
valores de las deferencias son pequeños por lo que no se la considera como muy estricta.
Esta prueba no tiene un valor tabular único y estos están de acuerdo con el número de
tratamientos involucrados en el estudio se la utiliza cuando se tiene más de dos tratamientos
(Barragán, 2014).
𝑉. 𝐷. = (𝑝 𝑓)(𝛼)(𝑆𝑥̅̅̅̅ ) (15)
Dónde:
p = número de tratamientos desde 2 hasta n.
44
f = grados de libertad del error experimental
𝛼 = Nivel de significancia, que puede ser al 5% y 1% tomado de la tabla
Duncan.
𝑆𝑥̅̅ ̅ = Error estándar de la media =√𝐶𝑀𝐸𝐸
𝑟
CMEE =Cuadrado medio del error experimental
r = número de repeticiones
Método Tukey.
Se la considera como una prueba estricta, debido a que para declarar como
significativas a las medias de los tratamientos necesita calores más grandes, esta prueba es
peleada cuando se tiene experimental con más de dos tratamientos (Barragán, 2014).
𝑉. 𝑇. = (𝑝 𝑓)(𝛼)(𝑆𝑥̅̅̅̅ ) (16)
Donde:
p = número de tratamientos desde 2 hasta n.
f = grados de libertad del error
𝛼 = Nivel de significancia, al 5% tomado de la tabla de Tukey.
𝑆𝑥̅̅ ̅ = Error estándar las medias =√𝐶𝑀𝐸𝐸
𝑟
CMEE =Cuadrado medio del error
r = número de repeticiones por tratamiento
45
Capítulo IV. Análisis y Discusión de Resultados
Etapa 1. Caracterización de la materia prima.
Para confirmar la identidad y pureza de la materia proveniente del DanQuímica, se
realizaron diferentes procedimientos entre los que incluyen, Identificación por Infrarrojo,
Valoración mediante HPLC y contenido de agua.
Figura 4. Identificación por Infrarrojo de ASA. Fuente: (Sinche, 2018)
Como criterio para la identificación de un principio activo mediante el método de
infrarrojo es el de obtener un factor de correlación mayor a 0.9800, en el cual para el ASA
utilizado se obtuvo un valor de 0.9897 como se observa en la figura 4, lo cual corrobora que
46
el principio utilizado en el presente proyecto de investigación es efectivamente ácido acetil
salicílico, y se prosiguió con los ensayos de caracterización.
El principal producto de degradación del ASA es el ácido salicílico y por tanto es
necesario la cuantificación de estos dos activos, para esto se siguió una metodología validada
por estudios anteriores, descrito en “Drug shelf life estimation by non-isothermal treatments
in DSC: specific Surface área effect” por (Arteaga, Castillo, Alcocer, & Santamaría, 2018),
en el cual se utiliza una columna C8 4.6 mm ID x 5 cm x 3.5um, cumpliendo con los criterios
de eficiencia, selectividad, resolución y de simetría establecidos en la Farmacopea
Estadounidense USP39.
El lote de ASA usado fue el LE7689 el cual fue comparado frente a un estándar USP
de una potencia al 100%, el cuál fue previamente secado a condiciones que establece la USP
39. Los resultados obtenidos para el lote del ASA utilizado, se muestra en la taba 10.
Tabla 10. Valoración y Contenido de agua
Lote % ASA % SA %Humedad
LE7689 99,4 0,048 0,2
ASA1 100% - 0,0
SA2 2,256 98,8693 0,40 1Ácido acetilsalicílico Estándar USP 2Ácido salicílico Lote:B16D080PUR Dato tomado de Arteaga(2018)
Etapa 2. Tratamiento isotermal.
Para fraccionar mediante tamizaje la materia prima a fin de obtener un determinado
rango de tamaño de partícula, se realizó la medición de 50 cristales en un microscopio
invertido utilizando el programa AMScope, los resultados se muestran en la tabla 11.
Tabla 11. Dimensiones de los cristales de ASA
Muestra Lote n4 a1, um b2, um A3, mm2
ASA LE7689 50 1141,17 330,88 0,417
1 largo del cristal, 2 ancho del cristal, 3 área de cristal, 4 número de cristales medidos.
En función de los resultados anteriores se seleccionaron los tamices con los cuales
realizar la distribución del tamaño de partícula, cuyos resultados se muestran en la tabla 12
47
Tabla 12. Distribución de cristales en base a su tamaño
Tamiz
(mm) PESO (g)
PORCENTAJE
(%)
Base 0,9555 1,10
0,160 1,9523 2,24
0,200 5,2727 6,04
0,250 15,4832 17,75
0,315 62,2172 71,32
0,500 0,7049 0,81
0,750 0,6500 0,75
87,2358 100,00
En la figura 5 se muestra los porcentajes obtenidos de cada fracción, en donde se
puede observar que existe mayor porcentaje de cristales en la fracción que va en un rango de
315 – 500 um, sin embargo, no se toma en cuenta esta fracción para la realización del
proyecto, debido a que es un rango muy amplio y no se aseguraría la homogeneidad de
tamaño de partícula que se requiere; por ello se optó por tomar las siguientes tres fracciones
con mayor porcentaje. Las columnas de color verde fueron las fracciones seleccionadas para
el proyecto.
Figura 5. Número de tamiz en función del porcentaje
Las tres fracciones fueron almacenadas por separado hasta la etapa no isotermal. La
fracción 250 – 315 um se sometió, en condiciones isotermales, a tres Humedades relativas:
19%, 43% y 63%.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
Base 0,160 0,200 0,250 0,315 0,500 0,750
PO
RC
ENTA
JE, %
TAMIZ, MM
ASA
48
Durante el tratamiento isotermal, se cuantificó, por duplicado, ASA y SA por método
HPLC descrito, a los tiempos 0, 11 y 31 días, en la tabla 13 se muestra el promedio de los
datos obtenidos.
Tabla 13. Valoración de ASA y SA a diferentes humedades y tiempos.
Tiempo
Humedad
19% 43% 63%
ASA
0 99,4 99,4 99,4
11 99,6 98,8 98,4
31 98,7 98,3 98,0
SA
0 0,048 0,048 0,048
11 0,074 0,080 0,079
31 0,226 0,237 0,237
Los resultados obtenidos para ASA muestran que, excepto para la condición 19% de
Hr, el contenido disminuye a medida que transcurre el tiempo. El resultado anómalo para el
tiempo 11 días de la condición antes mencionada, podría deberse a una posible disminución
en la humedad residual del sólido por la baja humedad relativa a la que estuvo sometido.
En la Figura 6, se puede observar más claramente que el comportamiento del
contenido del ASA es diferente para cada condición de humedad residual.
49
Figura 6. Contenido de ASA para cada tratamiento isotermal.
Para determinar si los datos obtenidos presentan diferencias estadísticamente
significativas se realizó un ANOVA simple; con un nivel de confianza del 95%, el valor p
fue de 0,3072 y 0,6995 (p ≥ 0,05) para los días 11 y 31 respectivamente, lo que implica que
los datos corresponden a un mismo conjunto para cada tiempo, es decir, no existe diferencia
entre ellos.
La Figura 7 muestra el contenido de SA durante el tiempo del estudio.
Figura 7. Contenido de SA para cada tratamiento isotermal.
97,8
98,0
98,2
98,4
98,6
98,8
99,0
99,2
99,4
99,6
99,8
0 5 10 15 20 25 30 35
% A
SA
Tiempo, días
ASA
19%
43%
63%
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0 5 10 15 20 25 30 35
% S
A
Tiempo, días
SA
19%
43%
63%
50
A un nivel de confianza del 95%, el valor p fue de 0,8283 y 0,5836 (p ≥ 0,05), para
los días 11 y 31 respectivamente, al igual que los resultados anteriores indican que tampoco
existen diferencias significativas entre las tres condiciones, es decir, que el incremento en la
degradación de SA es independiente de las condiciones de humedad relativa a la que fueron
expuestas.
Las Isotermas presentadas en la figura 8 publicada en el trabajo “Effects of Solid-
State Processing on Water Vapor Sorption by Aspirin” (Hancock & Zografi, 1996), muestran
que la humedad residual de la Aspirina, casi no presenta variación en humedades relativas
entre 0 y 80%; lo que podría explicar que no hayan diferencias estadísticamente
significativas en los valores de ASA y SA obtenidos a las tres humedades relativas antes
descritas.
Figura 8. Isotermas de sorción de vapor de agua para muestra de aspirina (Hancock & Zografi, 1996)
Cálculo de la vida útil experimental mínima (hipérbolas de confianza).
Como menciona el Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos
(INVIMA, 2016) : “No es aceptable determinar el período de vida útil permitido, utilizando el
punto de intersección sobre la línea obtenida por el método de los mínimos cuadrados y el límite de
la especificación en estudio. Este procedimiento puede tanto sobreestimar como subestimar el
51
período de vida útil; por motivo que, solo se puede tener el 50% de confianza de que el promedio de
vida útil del lote está dentro de las especificaciones cuando llegue a su fecha de expiración.”
De acuerdo con las recomendaciones para el diseño de estudio de estabilidad de largo
plazo que plantea la autoridad sanitaria de Colombia, el cálculo del tiempo de vida útil
permitido en base a los datos de un lote individual; se determinó mediante la ecuación 13.
Para poder aplicar dicha ecuación se transformó, mediante el logaritmo natural, la
variable dependiente de las condiciones 63% para ASA y 19, 43 y 63% para SA. La regresión
lineal con tales valores generó las siguientes gráficas.
En la Figura 9, no se necesitó realizar dicha transformación debido a que los
resultados obtenidos tienen una tendencia lineal, y al realizar el cálculo respectivo de las
hipérbolas de confianza se obtuvo un tiempo de vida útil de 84,8 días.
Figura 9. Hipérbola de confianza ASA 43%.
Para la figura 10, se realizó la linealización mediante el uso de logaritmo natural (Ln)
en el eje Y, logrando un resultado de tiempo de vida útil de 99,6 días.
y = -0,034x + 99,308R² = 0,9772
94,0
95,0
96,0
97,0
98,0
99,0
100,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
%A
SA
Tiempo, días
ASA 43%
Linealización
Hiperbola
Especificación
Lineal (Linealización)
52
Figura 10. Hipérbola de confianza ASA 63%.
A continuación, se presenta las hipérbolas de confianza para el ácido salicílico a las
diferentes humedades relativas. En el gráfico 11 se observa que existe una intersección entre
la hipérbola de confianza y la línea de especificación, consiguiendo un resultado de 32,1 días
para el tiempo vida útil.
Figura 11. Hipérbola de confianza SA 19%.
y = -0,0004x + 4,5966R² = 0,8114
4,5500
4,5550
4,5600
4,5650
4,5700
4,5750
4,5800
4,5850
4,5900
4,5950
4,6000
4,6050
0 5 10 15 20 25 30 35
Ln %
ASA
Tiempo, días
ASA 63%
Linealización
Hiperbola
Especificación
y = 0,0508x - 3,0893R² = 0,9935
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Ln %
SA
Tiempo, días
SA 19%
Linealización
Hiperbola
53
En la figura 12, se puede observar que no existe intersección entre la hipérbola de
confianza y la línea de especificación, siendo necesario extrapolar los datos para conseguir
un tiempo de vida útil, el resultado en esta ocasión fue de 46,9 días.
Figura 12. Hipérbola de confianza SA 43%.
Del mismo modo que la figura anterior en la figura 13, es necesario extrapolar,
obteniendo así un tiempo de vida útil de 43,2 días.
Figura 13. Hipérbola de confianza SA 63%.
y = 0,052x - 3,0638R² = 0,9987
-3,50000
-3,00000
-2,50000
-2,00000
-1,50000
-1,00000
-0,50000
0,00000
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Ln %
SA
Tiempo, días
SA43%
Linealización
Hiperbola
Especificación
Lineal (Linealización)
y = 0,052x - 3,0688R² = 0,998
-3,5000
-3,0000
-2,5000
-2,0000
-1,5000
-1,0000
-0,5000
0,0000
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Ln %
SA
Tiempo, días
SA 63%
Linealización
Hiperbola
54
La Tabla 14 resume los resultados de las dos substancias a las tres condiciones.
Tabla 14. Tiempo de vida útil de ASA y SA
%HR Tiempo
(días)
ASA 43 84,8
63 99,6
SA
19 32,1
43 46,9
63 43,2
El motivo por el que no aparecen los resultados de ASA expuesto a una humedad
relativa del 19%, fue su comportamiento anómalo al día 11 del almacenamiento, como se
explicó anteriormente, existe una posible disminución de la humedad residual con un
incremento aparente de la concentración.
Como puede visualizarse, los tiempos de vida útil calculados con los datos de ASA
son más del doble de los obtenidos con el SA. Los incrementos de la substancia de
degradación son más evidentes que los decrementos del ASA durante el estudio. Para
métodos isotermales se debe privilegiar el monitoreo de las substancias de degradación.
Efecto de la temperatura y humedad.
Debido al objetivo principal del proyecto de investigación se realizó la estimación de
tiempo de vida útil por el método de isoconversión, mediante la combinación del efecto de
la temperatura y humedad relativa aplicando la ecuación 11, originada de las ecuaciones de
Arrhenius y de sensibilidad a la humedad, en donde se establece que la razón de degradación,
o constante cinética, depende de la Temperatura y de la Humedad Relativa (Alcocer, 2016).
Con los resultados obtenidos de la valoración de ASA se realizó una regresión lineal
múltiple de acuerdo a la ecuación (11), determinando sus constantes. Los valores de las
constantes están asociadas a un valor de imprecisión proveniente de las mediciones (Alcocer,
2016), por lo que se utiliza el método de Monte Carlo, el cual consiste en 5000 simulaciones
al azar de los parámetros Temperatura y Humedad residual, estos resultados se los representa
en un histograma en la figura 14.
55
Figura 14. Histograma del tiempo de vida útil del SA por el método de isconversión
A partir de los datos de la simulación se realizó el cálculo estadístico, determinando
un tiempo de vida útil de 41,01 días para el SA, mostrado en la tabla 15.
Tabla 15. Resultados estadísticos de isoconversión de SA.
SA
Media 41,01
Error típico 0,01
Mediana 41,01
Moda 41,21
Desviación estándar 0,67
Varianza de la muestra 0,45
Curtosis -0,54
Coeficiente de asimetría 0,09
Rango 3,12
Mínimo 39,49
Máximo 42,61
Suma 205046,08
Cuenta 5000
Los valores obtenidos para la media aritmética, el número central (mediana), y el
número con mayor frecuencia (moda) de la simulación de Monte Carlo son similares, esto
genera una mínima desviación estándar y por ende una dispersión muy baja.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
39
,5
39
,6
39
,8
39
,9
40
,0
40
,2
40
,3
40
,4
40
,6
40
,7
40
,8
41
,0
41
,1
41
,2
41
,4
41
,5
41
,6
41
,8
41
,9
42
,0
42
,2
42
,3
42
,4
42
,6
Fre
cue
nci
a
Tiempo, Días
Histograma
Frecuencia
% acumulado
56
Etapa 3. Tratamiento no-isotermal.
Para el cálculo de los parámetros cinéticos, la energía de activación y el factor
preexponencial, el método de Kissinger es uno de las más populares, basándose en el
desplazamiento del pico en los termogramas a diferentes velocidades de calentamiento (β)
utilizando Calorimetría diferencial de barrido (DSC) (Blaine & Kissinger, 2012).
Las muestras sometidas a tratamiento no isotermal fueron las tres fracciones de
diferentes tamaños de partícula, y la fracción de mayor tamaño, sometida previamente a
diferentes tratamientos isotermales; el propósito del tratamiento no isotermal es la obtención
de las temperaturas de degradación a tres diferentes velocidades de calentamiento (5, 10 y
20 °C/min), para el posterior cálculo de los parámetros cinéticos, dichas temperaturas se
muestran en las tablas 16 y 17.
Tabla 16. Temperatura de degradación (Tm) del ASA, sometido a diferentes tratamientos isotermales
B
°C/min
19% 43% 63%
Tm
(°C)
SD
(°C)
CV
(%)
Tm
(°C)
SD
(°C)
CV
(%)
Tm
(°C)
SD
(°C)
CV
(%)
5 171,67 1,72 1,005 171,59 1,72 1,005 170,34 2,13 1,249
10 181,24 0,59 0,323 184,49 0,59 0,318 179,15 3,06 1,708
20 193,67 2,08 1,074 190,22 2,08 1,093 191,49 2,79 1,457
Tabla 17. Temperatura de degradación del ASA de diferentes tamaños de partícula.
B
°C/min
160-200 um 200-250 um 250-315 um
Tm
(°C)
SD
(°C)
CV
(%)
Tm
(°C)
SD
(°C)
CV
(%)
Tm
(°C)
SD
(°C)
CV
(%)
5 171,14 2,00 1,167 174,11 1,78 1,020 168,68 0,81 0,478
10 178,50 0,52 0,294 179,61 1,63 0,908 178,65 1,39 0,775
20 190,12 1,83 0,964 187,99 1,45 0,770 188,28 4,76 2,527
Los Tm mostrados en las tablas son los promedios de tres determinaciones, para
evaluar la dispersión de los resultados se calculan la desviación estándar (SD) y el coeficiente
de variación porcentual (CV). Por otra parte, se puede observar que a medida que se duplica
la velocidad de calentamiento, Tm aumenta en aproximadamente 10°C, esto coincide con
los resultados obtenidos en investigaciones previas dentro de la misma línea investigativa
(Arteaga, Castillo, Alcocer, & Santamaría, 2018) “Drug shelf life estimation by non-
isothermal treatments in DSC: specific Surface area effect”.
57
Una vez ajustado los datos utilizando la ecuación 4, se obtiene la figura 15 y 16. En
donde se observa las distribuciones de los datos empleados en el cálculo de regresión y las
líneas de tendencia de cada muestra con diferente tamaño de partícula y de diferentes
condiciones de humedad relativa.
En la figura 15 se observar el grafico de Kissinger de muestras de ASA a diferente condición
de humedad relativa.
Figura 15. Gráfica de Kissinger para el primer paso de descomposición del ASA (Humedades relativas)
Se puede apreciar que la pendiente de la muestra de ASA sometida a una condición
de 43% de humedad relativa es diferente a las pendientes de 19% y 63%. Para confirmar o
negar dicha observación se realizó un ensayo de t, determinando que todas las pendientes
son similares, puesto que los valores de t calculado fueron menores al valor del t tabulado
(ANEXO D).
En la figura 16, existe una pendiente más pronunciada para el rango de tamaño de
200-250 um, en comparación con las otras dos pendientes; a pesar de ello el ensayo t indicó
que todas las pendientes son similares (ANEXO D).
-10,80
-10,60
-10,40
-10,20
-10,00
-9,80
-9,60
-9,40
-9,20
-9,00
2,12 2,14 2,16 2,18 2,20 2,22 2,24 2,26 2,28
Ln(B
/Tm
2 )
1000/T K-1
19%
43%
63%
58
Figura 16. Gráfica de Kissinger para el primer paso de descomposición del ASA (Tamaños de partícula)
Mediante la ecuación 4 podemos observar que la pendiente está relacionada con la
energía de activación, y por ende va a afectar directamente a los tiempos de vida útil. En la
tabla 18 se observa los resultados de las energías de activación y los tiempos de vida útil de
las muestras sometidas a diferentes condiciones de humedad relativa.
Tabla 18. Parámetros cinéticos del ASA con respecto a la humedad relativa.
19% 43% 63%
Energía de activación KJ/mol 98,05 113,39 102,35
Factor preexponencial min-1 1,03x1011 6,80x1012 3,81x1011
Velocidad de degradación 25°C min-1 6,84x10-7 9,27x10-8 4,47x10-7
Tiempo de vida útil teórico1, t95 días 27,0 180,6 40,2
Tiempo de vida útil remanente2, t95 días 23,7 158,4 35,4
Coef. De correlación 0,9957 0,9426 0,9919
1 Considerando que la potencia del ASA es el 100% 2 Considerando la potencia real del ASA.
Para el ASA a una humedad de 43% se necesitarían 5,28 meses para que la potencia
del principio activo baje a 95%, esto debido a que tiene los valores más altos de Ea y A, a
diferencia del ASA a humedades de 19% y 63%, en los cuales se necesitaría un tiempo de
0,79 y 1,18 meses, respectivamente.
En la tabla 19 se observa los resultados de las energías de activación y tiempos de
vida útil de las muestras de ASA de diferente tamaño de partícula.
-10,80
-10,60
-10,40
-10,20
-10,00
-9,80
-9,60
-9,40
-9,20
-9,00
2,14 2,16 2,18 2,20 2,22 2,24 2,26 2,28
Ln(B
/Tm
2 )
1000/T K-1
250-315
200-250
160-200
59
Tabla 19. Parámetros cinéticos del ASA con respecto al tamaño de partícula.
160-200 um 200-250um 250-315 um
Energía de activación KJ/mol 115,70 161,62 112,47
Factor preexponencial min-1 1,50x1013 3,86x1020 6,82x1012
Velocidad de degradación 25°C min-1 8,02x10-8 1,86x10-8 1,34x10-7
Tiempo de vida útil teórico1, t95 días 444,0 1917,0 265,2
Tiempo de vida útil remanente2, t95 días 390,0 1680,0 232,5
Coef. De correlación 0,9844 0,9865 0,9994
1 Considerando que la potencia del ASA es el 100% 2 Considerando la potencia real del ASA.
Para el ASA a un tamaño de partícula de 200-250 um se necesitarían 56 meses para
que la potencia del principio activo se reduzca a un 95%, diferencia notoria con los tamaños
de partícula de 250-315 y 160-200 um, en los cuales se necesitarían 7,75 y 13 meses,
respectivamente.
Los coeficientes de correlación para cada tratamiento ya sea el de las muestras
sometidas a diferentes condiciones de humedad relativa o las muestras con tamaño de
partícula diferente, son muy cercanos a uno, lo que nos indica que existe un buen ajuste a la
ecuación de Kissinger.
Con fines comparativos, en la tabla 20 se muestran las dimensiones de los cristales
de ASA de un estudio anterior (Arteaga, 2018) y los del lote seleccionado para el presente
estudio.
Tabla 20. Comparación del area superficial especifica con investigaciones anteriores.
Lote n1 a2, um b3, um c4, um c/a c/b a/b A5,
mm2
V6,
mm3
SSA7,
mm2/mm3
MP 28 7510 77 306,47 284,63 1357,67 4,43 4,77 1,08 1,88 0,139 15,99 ± 4,27
ASA9 7689 50 425,14 283,42 1141,17 2,7 4,1 1,5 2,00 0,169 14,87 ± 4,92 1 Número de cristales usados en la medición, 2 Ancho, 3 Espesor, 4 Largo, 5 Área, 6 Volumen, 7 Área superficial
específica, 8 Datos tomados de Arteaga 2018, 9 Datos del presente estudio.
Los datos de las dimensiones presentadas fueron realizados antes del proceso de
tamizaje, es decir, tal cual como llegaron del proveedor, por lo que puede ser comparable
con la materia prima de estudios anteriores, y se puede observar que existe una semejanza
en el área superficial específica.
60
Parámetros isocinéticos
Para comparar todas las muestras estudiadas, se elaboró el diagrama de Arrhenius en
la figura 17, en el cual se puede observar un punto en donde todas las rectas coinciden, tanto
las muestras de ASA de diferente tamaño de partícula, como las de diferentes condiciones
de humedad relativa. Este punto es denominado punto isocinético (Khawan, 2006).
Figura 17. Diagrama de Arrhenius para muestras de ASA de diferentes tamaños de partícula y diferentes
condiciones de humedad relativa.
El punto isocinético como menciona (Arteaga, Castillo, Alcocer, & Santamaría,
2018) “Representa la temperatura a la cual la constante de velocidad de degradación es la
misma para todas las muestras”, para este estudio se obtuvo un valor de Tiso= 173,94 °C, de
igual forma mediante la ecuación 4, se realizó el cálculo de una velocidad de calentamiento
isocinético, βiso= 6,26 ± 0,78 °C/min y una constante de degradación isocinética, Kiso=
0,4365 ± 0,0612 min-1, estos valores no difieren significativamente de los obtenidos en
estudios anteriores, tal como se observa en la tabla 21.
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
0,0015 0,0017 0,0019 0,0021 0,0023 0,0025 0,0027 0,0029 0,0031 0,0033 0,0035
LnK
min
-1
1/T K-1
1/T vs LnK
250-315 um
200-250 um
160-200 um
19%
43%
63%
61
Tabla 21.Parámetros isocinéticos
Parámetros cinéticos (Sinche, 2018) (Arteaga, 2018)
Temperatura isocinética Tiso (°C) 173,94 177,67
Velocidad de calentamiento isocinético βiso (°C/min) 6,26 ± 0,78 7,17 ± 0,88
Constante de degradación isocinético Kiso (min-1) 0,4365 ± 0,0612 0,4659 ± 0,2474
Una vez encontrada la velocidad de calentamiento isocinético se realizó corridas a
dicha velocidad, a diferentes muestras obteniendo una relación de temperatura de
degradación de 0,99, como se muestra en la tabla 22.
Tabla 22. Comparación de temperatura de degradación a velocidad de calentamiento isocinético.
ASA
Velocidad de
calentamiento Tratamientos Tm Promedio
Porcentaje
del error
(%)
Relación
6,26 °C/min
63% Hr 159,66
160,71
0,64 0,99 161,76
200 -250 um 163,28
161,74 160,2
La estrecha relación de las temperaturas de degradación podría indicar que este punto
isocinético es una característica físico-química propia del ácido acetilsalicílico, o al menos
de la molécula sintetizada por el mismo fabricante.
Relación del tamaño de partícula y humedad relativa con el tiempo de vida útil.
Para explicar de mejor manera la influencia de la humedad y el tamaño de partícula
en el tiempo de vida útil, fue necesario realizar una regresión cuadrática, con la que
obtuvimos la ecuación 17.
𝑡95 = −0,0116%𝐻𝑅2 − 0,0230∅2 + 0,9609%𝐻𝑅 + 9,3378∅ − 913,262 (17)
En los gráficos 18 a y b, podemos observar que para obtener un mayor tiempo de
vida útil se debería mantener el proceso y el almacenamiento del producto en un rango de
humedad entre 35 - 45 %, y el tamaño de partícula debería ser alrededor de 200 um.
62
a)
b)
Figura 18. Representación gráfica de la ecuación cuadrática a) vista frontal b) vista superior
Los tiempos de vida útil del SA para el tratamiento isotermal se resumen en la tabla 23:
Tabla 23. Comparación de la vida útil del SA (muestra 250-315 ) por tratamientos isotermales.
Método
Humedad Relativa
(%)
19 43 63
Hipérbolas de
confianza 32,1 46,9 43,2
Isoconversión 41,01
63
Los valores obtenidos mediante hipérbolas de confianza son similares a los del
método de Isoconversión. Si bien el tiempo de análisis es similar, la Isoconversión es más
económica pues solo requiere de la valoración al inicio y al final del estudio.
Se podrían también comparar la vida útil de la fracción 250 – 315, sometida a 43%
Hr durante un mes, calculada por el método de Kissinger y por hipérbolas de confianza. En
el primer caso, el valor obtenido fue de 158,4 días, en el segundo 84,8 días.
Si bien el tiempo requerido para aplicar el método de Kissinger es más corto,
aproximadamente dos semanas, los datos generados son el doble que el estimado por
Hipérbolas de confianza.
64
Capítulo V. Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones
La caracterización del ácido acetil salicílico por HPLC determinó un contenido de ASA del
99,4%, y de su producto de degradación (SA) 0,048%; la identificación por Infrarrojo nos
arrojó un factor de correlación de 0,9897 con respecto al estándar USP; y una humedad
residual de 0,2%, cumpliendo con las especificaciones de la USP39.
Luego del proceso de tamizaje se seleccionaron tres fracciones de diferentes tamaños de
partícula: 160-200 um, 200–250 um, 250-315 um; de ellas la muestra seleccionada para ser
sometida a las diferentes humedades relativas en el tratamiento isotermal fueron las de mayor
tamaño (250-315 um), pues estaba presente en mayor porcentaje relativo.
El tiempo de vida útil calculado para el tratamiento isotermal, por hipérbolas de confianza,
muestra que la condición 63% Hr es la mejor para disminuir la degradación de ASA; sin
embargo, considerando el incremento del producto de degradación, la mejor condición fue
43%. Para el establecimiento de las condiciones de almacenamiento se considera este último
valor puesto que el producto de degradación alcanza en menor tiempo el límite de
especificación en comparación con la degradación del activo; teniendo el producto de
degradación implicaciones con la seguridad, mientras que el contenido de activo con la
eficacia.
Por el método de Isoconversión, que considera la influencia de la Temperatura y la Humedad
en el incremento de la substancia de degradación, el tiempo de vida útil calculado para la
fracción 250 – 315 um fue de 41,01 días, similares a los obtenidos por el método de
hipérbolas de confianza.
Los tiempos de vida útil calculados para el tratamiento no isotermal con la ecuación de
Kissinger, indica que las condiciones de 43% Hr y un tamaño de partícula de 200-250 um
son las mejores disminuir la velocidad de degradación del principio activo.
Aplicando la velocidad de calentamiento, β iso, a muestras dispares se obtiene una
superposición de las temperaturas de degradación, Tm; esto sugiere que el punto isocinético
podría ser una característica físico-química propia de la molécula de ácido acetilsalicílico, o
del producto sintetizado por este fabricante en particular. Se deben realizar más estudios para
confirmar lo antes mencionado.
La influencia del tamaño de partícula y la humedad relativa en la vida útil del ácido acetil
salicílico puede representarse como una ecuación cuadrática (ecuación 17). El incremento
65
en la vida útil se ve favorecido en cristales de alrededor de 200 um, almacenados a
humedades de entre 35 y 45 %, coincidiendo con lo determinado en el tratamiento isotermal:
43% Hr.
66
Recomendaciones
Para posteriores estudios en DSC se deberá incrementar el número de
determinaciones a cada velocidad de calentamiento, a fin de disminuir la dispersión
de los resultados y tener datos más precisos para las Energías de activación.
Para los cálculos de vida útil en los métodos de isoconversión y de hipérbolas de
confianza se debe considerar el incremento del producto de degradación en lugar del
decremento de principio activo; si el método analítico es lo suficientemente sensible,
los cambios en el contenido del producto de degradación se evidencian más
rápidamente que los de la degradación del activo.
Con la finalidad de confirmar el significado real del Punto Isocinético, se debe
determinar este parámetro en Aspirina proveniente de diferentes fabricantes.
67
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70
ANEXOS
ANEXO A. Árbol de problemas
Se desconoce la relación entre el tamaño de partícula del ASA y la
humedad relativa a la que está expuesto durante su almacenamiento con el
tiempo de vida útil
Un gran rango de tamaños de partícula y la influencia de la humedad relativa
que posee el ácido acetil salicílico dan como resultado una variabilidad en el
tiempo de vida útil.
La superficie expuesta de la
partícula tiene relación con su
reactividad.
En la obtención del ASA por
síntesis existe un gran rango de
tamaños de partícula
El efecto de la humedad
relativa en el ASA es una
degradación por hidrólisis.
71
ANEXO B. Categorización de Variables
Tabla 24. Categorización de variables
Variables Dimensión Indicador
Tamaño de cristal Longitud nm 250-315
200-250
160-200
Contenido de ASA y SA Concentración %ASA 90-110
%SA 0-5
Velocidad de calentamiento
del DSC
Velocidad de calentamiento,
β
°C/min 5
10
20
Humedad Concentración %HR 19
43
63
Temperatura de primer paso
de degradación del ASA
Temperatura, Tm °C °C
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
72
ANEXO C. Instrumento de recolección de datos
Tabla 25. Recolección de la temperatura máxima
Materia Prima Temperatura Humedad
relativa
Velocidad de calentamiento β (°C/min)
5 10 20
MPT3
30°C 19% 169,68 172,54 172,78 181,28 181,81 180,64 194,63 191,28 195,09
30°C 43% 171,44 169,69 173,63 182,34 184,23 186,89 191,40 190,13 189,14
30°C 63% 169,21 169,01 172,79 180,24 175,69 181,51 194,68 189,49 190,31
MPT1 Ambiental Ambiental 173,00 169,03 171,39 177,90 178,87 178,73 188,02 190,97 191,38
MPT2 Ambiental Ambiental 176,14 173,37 172,83 181,49 178,57 178,77 189,66 187,21 187,10
MPT3 Ambiental Ambiental 169,58 168,03 168,42 178,67 177,25 180,02 193,60 186,81 184,43
Nota: Elaborado por Sinche, D. (2018)
MPT1: 160 – 200 um
MPT2: 200 – 250 um
MPT3: 250 – 315 um
73
ANEXO D. Comparación de pendientes
Tabla 26. Pendientes de la variable humedad
Ensayo F F calc F tab Ensayo t T calc T tab
19% vs 43% 4,48 647,8 Varianzas
Homogéneas
19% vs 43% 0,29 2,78 Pendientes
iguales
63% vs 43% 13,56 647,8 Varianzas
Homogéneas
63% vs 43% 0,10 2,78 Pendientes
iguales
63% vs 19% 3,03 647,8 Varianzas
Homogéneas
63% vs 19% 0,06 2,78 Pendientes
iguales
Tabla 27. Pendientes de la variable tamaño de partícula
Ensayo F F calc F tab Ensayo t T calc T tab
315 um vs 250um 184,6 647,8 Varianzas
Homogéneas
315 um vs 250um 1,07 2,78 Pendientes
iguales
160 um vs 250um 383,5 647,8 Varianzas
Homogéneas
160 um vs 250um 0,65 2,78 Pendientes
iguales
160 um vs 315 um 2,07 647,8 Varianzas
Homogéneas
160 um vs 315 um 0,07 2,78 Pendientes
iguales
74
ANEXO E. Diagrama del procedimiento
CARACTERIZACIÓN
TAMIZAJE
Fracción 1
160-200 um
Fracción 2
200-250 um
Fracción 3
250-315 um
Humedad 1
19%
Humedad 2
43%
Humedad 3
63%
β 3 20 °C/min
β 2 10 °C/min
β 1 5 °C/min
Etapa 1. Caracterización
Etap
a 2
.
Trat
amie
nto
iso
term
al
Etap
a 3
. Tra
tam
ien
to n
o
iso
term
al
Estimación del tiempo de vida útil
