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i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
“EFECTO ANTIMICROBIANO DE Psidium guajava (GUAYABA) SOBRE
CEPAS DE Streptococcus mutans. ESTUDIO IN VITRO”
Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del Título de
Odontóloga
Autor: Paola Vanessa Suárez Salgado
Tutor: Dra. Patricia Álvarez
Quito, octubre 2017.
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo Paola Vanessa Suárez Salgado, en calidad de autor y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de titulación, “EFECTO ANTIMICROBIANO
DE Psidium guajava (GUAYABA) SOBRE CEPAS DE Streptococcus mutans.
ESTUDIO IN VITRO”, modalidad presencial, de conformidad con el Art. 114 del
CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,
CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la Universidad Central del
Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de
la obra, con fines estrictamente académicos. Conservamos a mi/nuestro favor todos los
derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo/autorizamos a la Universidad Central del Ecuador para que realice
la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El (los) autor (es) declara (n) que la obra objeto de la presente autorización es original
en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la
responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y
liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
Firma: ________________________________
Nombres y Apellidos: Paola Vanessa Suárez Salgado
CC. 1724570161
Dirección electrónica: [email protected]
iii
APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR PARTE DEL TUTOR
Yo, PATRICIA ÁLVAREZ, en calidad de tutor del trabajo de titulación “EFECTO
ANTIMICROBIANO DE Psidium guajava (guayaba) SOBRE CEPAS DE
Streptococcus mutans. ESTUDIO IN VITRO”., elaborado por la estudiante, PAOLA
VANESSA SUÁREZ SALGADO, en calidad de autor del trabajo de investigación:
“EFECTO ANTIMICROBIANO DE Psidium guajava (guayaba) SOBRE CEPAS
DE Streptococcus mutans. ESTUDIO IN VITRO”., estudiante de la Carrera de
ODONTOLOGÍA, Facultad de ODONTOLOGÍA, de la Universidad Central del
Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo
metodológico, en el campo epistemológico y ha superado el control anti plagio, para
ser sometido a la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo que
lo APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea habilitado para continuar con el
proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 14 días del mes de febrero del año 2017
--------------------------------------------------
Firma
Dra. Patricia Álvarez
C.C. N°1713108783
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dra. Freire Andrade Alicia del Carmen, Dra. Caicedo
Breedy María Fernanda, Dr. Viteri Moya Juan Alberto.
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del
título de Odontóloga, presentado por la señora Paola Vanessa Suárez Salgado.
Con el título:
“EFECTO ANTIMICROBIANO DE Psidium guajava (GUAYABA) SOBRE
CEPAS DE Streptococcus mutans. ESTUDIO IN VITRO”
Emite el siguiente veredicto: (aprobado/reprobado)____________________________
Fecha: _______________________
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre y Apellido Calificación Firma
Presidente Dra. Freire Andrade Alicia del Carmen __________ _______________
Vocal 1 Dra. Caicedo Breedy María Fernanda __________ _______________
Vocal 2 Dr. Viteri Moya Juan Alberto. __________ _______________
v
DEDICATORIA
A mis queridos padres Paulo y Laura, porque día a día se han esforzado por darnos lo
mejor a mí y a mis hermanos. Gracias por comprenderme en mis momentos más
difíciles, apoyarme y cuidarme todos estos años, ahora es mi turno de cuidarlos con el
mismo amor, respeto y paciencia.
A mis hermanos menores Paulo y Richard, que les he enseñado con mi ejemplo que a
pesar de las adversidades jamás renuncien sus sueños y convicciones.
A mi querido esposo, amigo y confidente Justin Grabenbauer, gracias por tu apoyo
hasta en mis momentos más difíciles, este camino no hubiera sido lo mismo sin ti, te
amo.
Y por supuesto, a mi adorado, leal y mejor amigo Bruno.
Paola Suárez
vi
AGRADECIMIENTO
A mi familia por su compresión y cariño, gracias por ayudarme a culminar esta gran
meta.
A mi querida tutora Dra. Patricia Álvarez, por compartir sus conocimientos, por
guiarme y contribuir a concluir esta etapa en mi vida, es una excelente profesional y
ser humano.
A mi querida Dra. Rachide Acosta por su amabilidad y paciencia al realizar el estudio
microbiológico.
Paola Suárez
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
DERECHOS DE AUTOR ............................................................................................. ii APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR PARTE DEL TUTOR ...... iii DEDICATORIA ........................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ................................................................................................. vi ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................. ix
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................ ix
ÍNDICE DE GRAFICOS .............................................................................................. x
ÍNDICE DE ANEXOS .................................................................................................. x
RESUMEN ................................................................................................................. xii ABSTRACT .............................................................................................................. xiii CAPÍTULO I ................................................................................................................ 1
1 EL PROBLEMA .................................................................................................... 1
1.1 Planteamiento del problema ............................................................................. 1
1.2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 2
1.2.2 Objetivo general ............................................................................................ 2
1.2.3 Objetivos específicos ..................................................................................... 2
1.3 JUSTIFICACIÓN ............................................................................................... 3
1.4 HIPÓTESIS .................................................................................................... 4
CAPÍTULO II ............................................................................................................... 5
2 MARCO TEÓRICO .............................................................................................. 5
2.1 Prevención ....................................................................................................... 5
2.2 Biofilm ............................................................................................................ 7
2.3 Streptococcus mutans ..................................................................................... 10
2.4 Psidium guajava ............................................................................................ 12
2.4.4 Propiedades terapéuticas ............................................................................ 14
2.5 Clorhexidina ................................................................................................. 18
CAPÍTULO III ........................................................................................................... 21
3. METODOLOGÍA .............................................................................................. 21
3.1 Tipo de diseño de la investigación .................................................................... 21
viii
3.2 Población de estudio y muestra. .................................................................... 21
3.3 Criterios de inclusión .................................................................................... 22
3.4 Criterios de exclusión .................................................................................... 22
3.5 Criterios de eliminación ................................................................................ 22
3.6 Operacionalización de las variables ............................................................... 23
3.7 Procedimiento ............................................................................................... 24
3.8 Aspectos bioéticos. ........................................................................................ 35
CAPÍTULO IV ........................................................................................................... 36
4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ............................ 36
4.1 Resultados:.................................................................................................... 36
4.2 Análisis estadístico ........................................................................................ 37
4.3 DISCUSIÓN ................................................................................................. 43
CAPÍTULO V ............................................................................................................ 45
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES: ............................................... 45
5.2 CONCLUSIONES: ....................................................................................... 45
5.2 RECOMENDACIONES ............................................................................... 46
6. BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................. 47
7. ANEXOS ............................................................................................................ 49
ix
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Usos etnomedicinales de el árbol de Psidium guajava ................................... 14
Tabla 2 Resultados del test antibacterial. .................................................................... 36
Tabla 3 Prueba de normalidad ................................................................................... 38
Tabla 4 Pruebas estadísticas ....................................................................................... 39
Tabla 5 Estadísticas de los datos de las muestras…………………………………..….42
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Niveles de prevención de Leavell y Clark ...................................................... 5
Figura 2 Concepto actual de los niveles de prevención ................................................. 7
Figura 3 Hojas de Psidium guajava…………………..……………………………….24
Figura 4 Aparato de agitación continua ..................................................................... 25
Figura 5 Dilusión del extracto de Psidium guajava………………………..........……….26
Figura 6 Extracto de Psidium guajava 12,5%, 25%, 50% .......................................... 27
Figura 7 Extracto en cámara de radiación ultravioleta………………………….…….27
Figura 8 Rehidratación de S.mutans ... ………………………………………………..28
Figura 9 Colocación de TSB en tubo de ensayo con S.mutans .................................... 28
Figura 10 Hisopado ................................................................................................... 29
Figura 11 Incubación en estufa……………………………... ………………..…..…...29
Figura 12 Crecimiento de colonias puras de S.mutans ................................................ 30
Figura 13 Turbidez 0,5 escala de Mac. Falard ………………………………………..30
Figura 14 Rotulación de cajas petri ............................................................................ 31
Figura 15 Sembrado de S.mutans ............................................................................... 30
Figura 16 Depósito de 20ul de las sustancias…………………………………………33
Figura 17 15 cajas petri con los discos. .................................................................... 332
Figura 18 15 cajas peti en jarra de Gaspack…………………………………………..34
Figura 19 Cajas petri en estufa ................................................................................... 33
Figura 20 Cajas petri tras incubación de 48 horas……….…………………………..34
x
ÍNDICE DE GRAFICOS
Gráfico 1 Resultados del efecto antibacterial de Psidium guajava .............................. 37
Gráfico 2 Prueba de kruskal- walls. ............................................................................ 40
Gráfico 3 Comparación de las sustancias. ................................................................... 41
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXOS 1. Solicitud para la realización del estudio en el Laboratorio Clínico y
Bacteriológico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del
Ecuador ...................................................................................................................... 49
ANEXOS 2 . Protocolo de manejo de desechos infecciosos, Laboratorio de Química de
la Facultad de Ingeniería Química de Universidad Central del Ecuador. ...................... 50
ANEXOS 3 Factura de la obtención de la cepa Streptococcus mutans ATCC 25175. .. 51
ANEXOS 4 Certificado de autenticidad de la cepa de Streptococcus mutans ............... 52
ANEXOS 5 Certificado del manejo de los desechos utilizados en la realización de la
presente tesis. .............................................................................................................. 53
ANEXOS 6 Certificado de participación del autor en la realización de la tesis junto a
Dra. Rachide Acosta. .................................................................................................. 54
ANEXOS 7 Certificado de atotizacion de uso de las instalaciones para el depósito de los
desechos producidos por el material utilizado en la presente tesis. ............................... 55
ANEXOS 8 Resultados del test antibacterial. .............................................................. 56
xi
ANEXOS 9 Certificado de la obtención de los extractos de hoja Psidium guajava ...... 57
ANEXOS 10 Certificado del análisis estadístico. ........................................................ 58
ANEXOS 11 Certificado de aprobación de finalización del proyecto por parte del tutor.
................................................................................................................................... 59
ANEXOS 12. Certificado aprobación del Comité de Ética de la Universidad Central del
Ecuador. ..................................................................................................................... 60
ANEXOS 13. Certificado de la traducción. ................................................................. 61
xii
“Efecto antimicrobiano de Psidium guajava (guayaba) sobre cepas de Streptococcus
mutans. Estudio in vitro”
RESUMEN
Psidium guajava ha sido utilizada por nuestros ancestros empíricamente para controlar
el mal aliento y la gingivitis. La finalidad del estudio fue evaluar el efecto
antimicrobiano del extracto acuoso de las hojas de Psidium guajava al 12,5%, 25%,
50%. Se activó y sembró a Streptococcus mutans en 15 cajas petri, se colocó 5 discos
de papel filtro en cada una de las caja petri con cada una de las 5 diferentes sustancias:
extracto de hoja de Psidium guajava al 12,5%, 25% y 50%, el control negativo: agua
destilada estéril y el control positivo: clorhexidina al 0,12%. Las 15 cajas fueron
incubadas por 48 horas. Se valoró la efectividad de las propiedades antimicrobianas
midiendo halos de inhibición. Los resultados indican que el efecto antimicrobiano de los
extractos de P.guajava y agua destilada estéril es nulo ya que no se produjeron halos de
inhibición mientras que S.mutans fue sumamente sensible al control positivo
clorhexidina al 0,12% ya que produjo halos de inhibición entre 20mm a 22mm.
Términos Descriptivos: antimicrobiano, in vitro, Psidium guajava, Streptococcus
mutans.
xiii
“Antimicrobial effect of the Psidium guajava (guava) over the strains of
Streptococcus mutans. In vitro study”
Author: Suárez Salgado Paola Vanessa
Tutor: Dra. Patricia Álvarez
ABSTRACT
Psidium guajava has been used by our ancestors to control the bad breath and gingivitis.
The purpose of this study was to assess the antimicrobial effect of the aqueous extract of
the leaves of Psidium guajava at 12.5%, 25%, 50%.The Streptococcus mutans was
activated and planted in 15 petry dishes, each with 5 different filter papers with different
substances: extract of the leave of Psidium guajava at 12.5%, 25% y 50%, the negative
control, sterile distilled water, and the positive control, chlorhexidine at 0.12%. all 15
dishes were incubated for 48 hours. The antimicrobial effect was assessed measuring
the inhibition halos. The results show that the effect of the extracts of P.guajava and the
distilled water is non-existent, as these did not produce inhibition halos; however it was
seen taht the S.mutans was extremely sensitive to chlorhexidine at 0.12%, as halos of 22
and 22mm were produced.
KEY WORDS: PSIDIUM GUAJAVA / STREPTOCOCCUS MUTANS /
ANTIMICROBIAL / IN VITRO.
1
CAPÍTULO I
1. EL PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema
La caries es una enfermedad multifactorial que afecta a la mayoría de la población,
produciendo dolor, molestias, limitaciones, disminución de la capacidad social,
discapacidad funcional, reduciendo la calidad de vida de la población. El Streptococcus
mutans es una de las principales bacterias relacionadas con la caries dental, sabemos
que es susceptible a antibióticos como penicilina, eritromicina, o sustancias como la
clorhexidina, lastimosamente no están al alcance de toda la población y pueden producir
efectos no deseados cuando su uso es indiscriminado. (1)
Varios estudios científicos previos confirman que los extractos etanólicos, metanólicos,
de las hojas de Psidium guajava tienen actividad anti-cariogénica sobre Streptococcus
mutans, así como propiedades antifúngicas sobre Candida albicans. (2) El efecto
antibacteriano de Psidium guajava es un mecanismo de anti- adherencia que involucra a
la unión de la bacteria a la superficie dental. (3) Por su potencial antibacterial los
extractos de Psidium guajava podrían ser utilizados para crear nuevos productos
farmacéuticos e industriales. (4)
Es necesario investigar si el efecto antibacteriano es estrictamente producido por los
componentes activos de los extractos de las hojas Psidium guajava o si el efecto
antibacterial es producido por el solvente que se utilice. Sería beneficioso poder
aprovechar el potencial bioactivo de extractos de Psidium guajava ecuatoriana si estos
tienen efecto antibacteriano al realizar extractos acuosos, ya que son sencillos de
obtener, no requieren de sofisticada maquinaria, son ecoamigables y están disponibles
para todos los niveles socio económicos. Es preciso evaluar científicamente si el efecto
antibacteriano atribuido por nuestros ancestros es un efecto placebo o efecto
antibacteriano propiamente dicho.
2
1.1.1 Formulación del problema: Por lo cual, la principal intención de este estudio es resolver la siguiente pregunta:
¿Cuál es el efecto del extracto de las hojas de Psidium guajava sobre cepas de
Streptococcus mutans?
1.2 OBJETIVOS
1.2.2 Objetivo general Evaluar el efecto antimicrobiano de Psidium guajava sobre cepas de
Streptococcus mutans ATCC 25175.
1.2.3 Objetivos específicos
Medir los halos de inhibición producidos por los extractos de hojas de Psidium
guajava al 12.5%, 25%, 50%, sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.
Comparar la susceptibilidad de Streptococcus mutans a los extractos acuosos de
Psidium guajava, el control positivo clorhexidina al 0.12% y el control negativo
agua destilada estéril.
3
1.3 JUSTIFICACIÓN
Mejorar y mantener la salud oral es una prioridad ya que esta influye en todo el
organismo. En Ecuador, así como en la mayoría de países en vías de desarrollo muchas
personas viven en condiciones de pobreza y no tienen acceso a métodos de preservación
y prevención de la salud oral.
El uso de sustancias de origen natural es una manera económica, asequible como
coadyuvante en la prevención y control de caries, es necesaria la búsqueda de nuevas
sustancias naturales beneficiosas para la salud bucal, más aún cuando nuestro país es
uno de los lugares más biodiversos del planeta. (2)
El propósito del presente estudio es dar un aporte científico a la comunidad partiendo
del conocimiento empírico de nuestros ancestros que dominaban las propiedades
antibacteriales y antifúngicas de cada una de las partes del árbol de Psidium guajava.
Uno de los mayores beneficios del uso extractos acuosos de Psidium guajava en el caso
de que tengan capacidad antibacterial, sería que el extracto podría ser usado por toda la
familia ya que no posee efectos adversos si lo usamos constantemente como otras
sustancias.
El proyecto tiene como principal inquietud investigar si los extractos acuosos de las
hojas de Psidium guajava inhiben el crecimiento de Streptococcus mutans, si su efecto
es igual, mayor o menor del grupo control positivo que es clorhexidina al 0.12%
4
1.4 HIPÓTESIS
Hipótesis de investigación H1: Psidium guajava tendría efecto antimicrobiano
sobre cepas de Streptococcus mutans.
Hipótesis nula H0: Psidium guajava no tendría efecto antimicrobiano sobre
cepas de Streptococcus mutans.
5
CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Prevención
Según OMS, la prevención abarca no solo medidas encaminadas a prevenir la aparición
de la enfermedad sino también a detener su progresión y consecuencias. (1) Prevención
es cualquier medida que permita reducir la probabilidad de aparición de una afección o
enfermedad, interrumpir o aminorar su progresión. (5) El propósito de la prevención es
evitar que ocurra la enfermedad, actuando cuando la enfermedad no se ha desarrollado,
es decir, se debe actuar en el periodo prepatogénico. (5)
La historia natural de la enfermedad es el curso que sigue la enfermedad a lo largo del
tiempo en ausencia de tratamiento. (5) Leavell y Clark 1983, dividen a la historia
natural de enfermedad en tres periodos: prepatogénico o de susceptibilidad, periodo
patogénico y el periodo de resultados. Cada periodo de la historia natural de la
enfermedad le corresponde un nivel de prevención según el momento de aplicación. (6)
Figura 1: Niveles de prevención Leavell y Clark
Fuente: Leavell y Clark, 1983. (6)
6
Según Barrancos 2006, las actividades preventivas se clasifican en tres niveles:
2.1.1 Prevención primaria:
Son todas las medidas para asegurar que la enfermedad no se manifieste. Desde el punto
de vista costo-beneficio más efectivas y baratas, ya que eliminan la necesitad de
tratamiento. La prevención primaria disminuye la ocurrencia de enfermedades y
afecciones, desde el punto de vista epidemiológico pretende reducir su incidencia. (1)
2.1.2 Prevención secundaria:
Su objetivo es detener el proceso de la enfermedad cuando esta ha aparecido y reducir o
eliminar sus efectos sobre el organismo. Estas medidas están basadas en diagnóstico y
tratamiento de la enfermedad lo más precoz posible. (1)
2.1.3 Prevención terciaria:
Se instaura una vez que ha fracasado la prevención secundaria. Sus objetivos son dos:
en primer lugar, reducir o incluso eliminar las limitaciones causadas por la enfermedad
y, por otra parte, poner en marcha las estrategias necesarias para que se produzca una
recurrencia de la enfermedad. (1)
Concepto actual de la prevención le da más importancia a las condiciones ambientales
en las que se desarrolla un individuo como influyentes decisivos, es por eso que la
prevención debe ser enfocada a mejorar los aspectos socio económico, social, mejorar
políticas sanitarias, condiciones ambientales y de esta manera favorecer los
comportamientos individuales. (7)
7
Figura 2: Concepto actual de los niveles de prevención
Fuente: Sheilham, 2003. (7)
2.2 Biofilm
Biolifm o biopelícula es una capa delgada, que baña las superficies del esmalte cuyo
grosor varia de 1 a 2 um, se forma después de dos horas en una superficie limpia, se le
denomina película temprana cuando este carece de microorganismos y su composición
son proteínas y glucoproteínas. Una vez establecida la película adquirida por falta de
higiene oral adecuada se depositan las primeras bacterias específicas. (8)
Con el transcurrir del tiempo sufre modificaciones y se transforma en película tardía en
donde se encuentran componentes de la saliva, productos bacterianos y exudado
gingival. (8) La etapa de colonización secundaria y maduración dependerá de la
sacarosa, en presencia de sacarosa S. mutans sintetiza polisacáridos llamados mutanos
que son adhesivos extracelulares. (1)
Las condiciones acidogénicas aumentan facilitando el desarrollo de microrganismos
como Veillonella y Lactobacillus. El mutano producido por S. mutans permite la
maduración bacteriología y estructural. Los microorganismos presentes necesitan
8
energía para subsistir la cual es tomada de los carbohidratos provenientes de la dieta. El
metabolismo de los mismos produce ácidos que desmineralizan los cristales de
hidroxiapatita del esmalte dando inicio al proceso carioso. (1)
2.2.1 Caries
La caries es una enfermedad multifactorial que afecta a los tejidos calcificados del
diente, provocada por ácidos que resultan de la acción de los microrganismos sobre los
carbohidratos. (1) La caries dental es una alteración persistente en la cavidad oral,
debido a que los agentes etiológicos que favorecen la desmineralización predominan
sobre los que favorecen la remineralización. (9)
La caries dental es una enfermedad compleja y transmisible, en la que intervienen
factores biológicos, socioeconómicos y culturales, los que facilitan el establecimiento y
desarrollo de microorganismos cariogénicos que conforman la biopelícula dental. (3)
2.2.2 Etiología
Se produce por la secuencia de procesos de destrucción localizados en los tejidos duros
dentarios, los mismos que evolucionan en forma progresiva e irreversible, empieza en la
superficie del diente y luego avanza en profundidad. (10) La placa dental es un
prerrequisito indispensable para dar origen a la caries dental. La teoría quimioparasitaria
refiere que la caries inicia a partir de la acción de ácidos principalmente ácido láctico,
producido por los microorganismos bucales como consecuencia de la fermentación de
los carbohidratos de la dieta. (11)
Existen tres factores que intervienen en la formación de caries dental que representan la
triada de Keyes: un factor que está representado por el “microorganismo” que frente a
un factor “sustrato” consigue afectar a un tercer factor “hospedero” en este caso el
(diente). (10) Se necesita que transcurra un periodo considerable para la formación de
procesos cariosos, por lo que el tiempo forma parte de dichos factores de riesgo. (10)
9
Existen otros factores adicionales: edad, salud general, grado de instrucción de los
padres especialmente la madre, nivel socioeconómico, experiencia pasada de caries,
grupo epidemiológico y variables de comportamiento. (12)
Según Negroni 2009, los principales microorganismos relacionados con la caries dental
son aquellos que participan en:
a) El desarrollo inicial de la enfermedad: numerosos estudios han demostrado
que S. mutans está relacionado con la biopelícula cariogénica desde el inicio, al
transcurrir del tiempo hay un aumento significativo de S. sobrinus en la saliva
que es la segunda especie en importancia. (10)
b) La progresión de las lesiones establecidas: se incluyen Lactobacilos spp.
Actinomyces spp y otros microorganismos capaces de sobrevivir y proliferar en
medios ácidos. Generalmente los microorganismos se ven favorecidos por las
condiciones promovidas por Streptococcus mutans. (10)
c) Otros estreptococos: S. salivarius, S. mitis, S. anginosus, S. gordonii, S. oralis,
S. sanguis, se consideran como estreptococos no mutans con baja capacidad de
descender el pH. (10)
d) Lactobacillus: se los consideran como invasores secundarios, aprovechan las
condiciones ácidas y la retentividad de la lesión cariosa, ya que tiene poca
afinidad sobre superficies dentarias lisas. (10)
e) Especies Actinomyces: tienen la capacidad de formar levanos que favorecen la
nutrición de las bacterias más no adherencia. (10)
10
2.3 Streptococcus mutans
Es una bacteria Gram positiva, anaerobia facultativa que coloniza inicialmente la saliva
y forma parte de la placa bacteriana. Streptococcus mutans se caracteriza por ser
acidófilo, acidogénico y acidúrico, además tiene la capacidad de generar polisacáridos
extracelulares y por ende favorecer la adhesión del mismo a las piezas dentales. (13)
Es un microorganismo que forma parte permanente de la cavidad oral posterior a la
erupción dental, debido a que específicamente se requiere de tejido duro no descamativo
para su colonización. La vía de transmisión en niños es la saliva de sus madres, estas
evidencias provienen de varios estudios en los que muestran un patrón idéntico el ADN
cromosomal en las bacterias de los niños y sus madres. (10)
2.3.1 Estructura
De acuerdo a las especies pueden distinguirse, además del ADN cromosómico,
citoplasma, otros elementos de gran interés son:
a) Ácidos teicóicos y lipoteicóicos: Intervienen en procesos de adhesión. (12)
b) Carbohidratos de la pared celular: Intervienen en procesos de adhesión. (12)
c) Proteínas de la pared celular: Estos cumplen varias funciones como la
adhesión, actividad enzimática, algunas se portan como adhesinas fijándose a
superficies blandas, también puede actuar como elementos receptores de
glucanos y también tienen acción fagocitaria. (12)
d) Fimbrias: Intervienen en la adhesión, agregación y congregación. (12)
e) Capa mucosa: Es de gran importancia en los procesos de adhesión. (12)
2.3.2 Mecanismo de Virulencia
Produce ácido láctico, propiónico, acético y fórmico al metabolizar la sacarosa, glucosa
y fructosa. Los ácidos que circulan por la placa dental hasta el esmalte poroso, disuelven
el mineral del esmalte, tomando calcio y fósforo del esmalte, este proceso es
denominado como desmineralización. (14)
11
Acidogénesis: metabolizan rápidamente los azúcares por la vía glicólica, hasta
alcanzar un pH crítico de 4,5 - 5,5. (10)
Acidofilia: produce la acidificación del biofilm, producto de la fermentación de
azúcares y puede sobrevivir en condiciones de estrés a las cuales se adapta. (10)
Síntesis de polisacáridos extracelulares: producen y segregan 3 tipos de
enzimas denominadas glucosiltransferasas. (10)
Síntesis de polisacáridos intratracelulares: la célula almacena glucógeno que
ante la falta de ingreso de azúcar por vía exógena es decir la dieta, puede
metabolizarse por la acción de la glucogenofosforilasa, ante un incremento de
productos intermediarios de la glucólisis. (10)
Síntesis de proteínas, lecitinas que ligan el glucano: S. mutans produce 4
distintos grupos de Glucan-binding proteins o Gbps, que son importantes para el
acumulo de S. mutans. Mantienen la estructura de la pared celular e influencia la
habilidad de los genotipos de S. mutans para desarrollarse en biofilm de bajo
estrés osmótico. (10)
Adhesinas: participan en el proceso de adherencia. (10)
Proteína asociada a la pared celular: permite la adhesión a las caras libres de
las piezas dentarias y participar en la adherencia dependiente de la sacarosa.
Bacterocinas: S. mutans produce diversas bacterocinas, mutacinas, que
participan en el proceso de competición bacteriana. (10)
2.3.3 Medios de cultivo
El Streptococcus mutans se desarrolla en medios de cultivo que contienen sacarosa.
(10) Las colonias de S. mutans emiten un exudado acuoso en la superficie de este
medio. Puede adquirir una apariencia opaca, rugosa, blanca.Los medios de cultivos
12
idóneos para el crecimiento del Streptococcus mutans, necesitan albúmina acompañada
de suero de sangre. Después que se aclimate a estas sustancias puede desarrollarse en
agar común. En medios de cultivo sólidos se presentarán formando colonias pequeñas,
redondeadas, ligeramente convexas y opacas, son como pequeñas cadenas cortas. (15)
En medios de cultivos líquidos el aspecto que presentaran es granuloso, formándose
grupos que tienden a depositarse en el fondo de los tubos, al ser sometidos al medio
ambiente subsisten de 3 a 5 días y en caldo de cultivo perduran 8 días. (15)
2.4 Psidium guajava
2.4.1 Antecedentes
El árbol de guayabo es originario del Caribe, las hojas de este árbol se usan con fines
medicinales desde épocas muy remotas, actualmente se utiliza en lugares como China,
India, Filipinas, África central y América latina, el principal uso de Psidium guajava es
como remedio antidiarréico, así como otros padecimientos como cólicos menstruales,
flatulencia, inflamación abdominal. (16)
Nuestros antepasados la usaban para curar úlceras e infecciones en la piel. Fue
introducida a la medicina formal en el siglo XX, cuando se comenzaron a realizar
estudios de sus propiedades antibacterianas, los mismos que concluyeron que la
elaboración del té, se realiza colocando de 1 a 2 gramos de hojas frescas o secas en
250ml o 300 ml de agua caliente, se debe cernir y se endulza con miel o azúcar se
administra 3 a 4 veces al día durante tres días. Es bien aceptado por los pacientes porque
carece de toxicidad o efectos adversos como otros antibióticos. (16)
2.4.2 Descripción botánica
Su nombre científico es Psidium guajava, pertenece a la familia: Myrtaceae, subfamilia:
Myrtoideae, género: Psidium, especie: guajava. (17) Psidium Guajava es un árbol de 5
a 7 metros de altura, tronco grisáceo-café, corteza lisa, escamosa de color rojizo. (17)
13
Ramas: las ramas son cuadrangulares de color pardo-verdoso con hojas de
forma desde elíptica hasta bolonga 4-12 cm de largo y 3-5 cm de ancho, el
peciolo es corto. (17)
Flores: forman cimas o son solitarias, pétalos 2 a 3 cm de longitud, color
blanco, perfumadas, de cáliz verdoso, filamentos blancos con antenas de color
amarillo. (17)
Fruto: es globuloso de color amarillo, cremoso, con numerosas semillas duras y
pequeñas, como piedrecillas, color rosado amarillento, el futo puede tener 4 a 10
cm florece en mayo y septiembre. (17)
Hábitat: Suelos poco drenados y calizos. (17)
2.4.3 Composición química
Dentro de los compuestos asociados a sus efectos terapéuticos se encuentran:
Vitaminas
Taninos
Flavonoides: quercetina y guaijaverin, la quercetina es conocida por sus efectos
espasmolítico, antioxidantes, antimicrobianos e anti-inflamatorios y guaijaverin
por su efecto antibacteriano.
Aceites esenciales
Alcoholes
Acidos sesquiterpénicas triterpenoides
Compuestos fenólicos
Isoflavonoides, ácido gálico, catequina, epicatequina, rutina, naringenina,
kaempferol, a los cuales se les han adjudicado efectos hepatoprotectores,
antioxidantes, anti-inflamatorios, antiespasmódicos, anticancerígenos,
antimicrobianos, anti-hiperglucémicos y analgésicos. (16)
14
2.4.4 Propiedades terapéuticas País Usos ethnomedicinales
Amazonía
Disentería, trastornos menstruales, dolor de estómago y vértigo. (18)
Brasil
Anorexia, cólera, diarrea, problemas digestivos, disentería, insuficiencia
gástrica, mucosas inflamadas, laringitis, úlceras en la boca, problemas de
la piel, dolor de garganta y secreción vaginal (18)
Cuba
Disminuye el frío corporal, disentería y dispepsia (18)
Ghana
Tos, diarrea, disentería, dolor de dientes. (18)
Haití
Disentería, epilepsia, picazón, úlceras en la piel, dolor de garganta, dolor
de estómago, heridas, antisépticas y astringentes. (18)
India
Anorexia, enfermedades cerebrales, convulsiones, epilepsia, nefritis. (18)
México
Sordera, diarrea, picazón, sarna, dolor de estómago, hinchazón, úlceras,
gusanos, heridas. (18)
Perú
Conjuntivitis, tos, diarrea, problemas digestivos, disentería, edema, gota,
hemorragias, gastroenteritis, gastritis, problemas pulmonares, síndrome
premenstrual, vértigo, vómitos. (18)
Tabla 1 Usos etnomedicinales de el árbol de Psidium guajava
Fuente: Araujo, 2015. (18)
15
2.4.5 Efecto de sobre la motilidad intestinal
El extracto metanólico inhibe la secreción intestinal de acetilcolina en el intestino
aislado de cobayos este mecanismo propone explicar el efecto antidiarreico. En China el
año 2000 (Wei) investigó la recuperación en los pacientes tras tres días de tratamiento
con té de hojas de guayaba, la misma que fue más rápida en hasta en un 87%, en
comparación con los pacientes del grupo control que fue 58%. (19)
2.4.6 Efecto antioxidante
La quercentina tiene potencial farmacológico con patologías relacionadas con el estrés,
varios estudios señalan que capta radicales libres, inhibe la peroxidación lipídica y
oxidación en la membrana mitocondrial. (19)
2.4.7 Efecto antimicrobiano de Psidium guajava
El efecto antimicrobiano se da gracias a la presencia de flavonoides en la composición
química de Psidium guajava, se cree que sus componentes tienen efecto sinérgico en
comparación a cada uno de ellos por separado. Existen dos grupos de flavonoides en
esta planta, los derivados de la quercetina y derivados de la morina; la acción de los dos
flavonoides tiene potente actividad antimicrobiana sobre Salmonella enteritidis,
Bacilluscereus, Staphylococcusaureus y Escherichiacoli. (19)
Los polifenoles presentes en las hojas de Psidium guajava son los responsables de la
actividad anticariogénica para que estos tengan efecto la concentración mínima
inhibitoria debe ser de 4mg/ml. (20)
La placa dental es un factor etiológico principal para la enfermedad periodontal, la
quercetina que se encuentra en las hojas de Psidium guajava ha mostrado excelentes
resultados antibacteriales frente a patógenos causantes de enfermedad periodontal:
Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Fusobacterium nucleatum. La quercentina ha mostrado actividad
16
antibacteriana sobre Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis y Actinomyces. La
acción antibacteriana que realiza la quercentina probablemente es la interrupción de la
membrana celular y la inactivación de proteínas intracelulares. El guajaverin de las
hojas de Psidium guajava tiene doble efecto bacteriostático inhibiendo el crecimiento de
mutans y Staphylococcus aureus. (21)
Fathilah y Zubaidah 2003, sugieren que el efecto anti-cariogénico de Psidium guajava
es un mecanismo de anti- adherencia que podría involucrar a la unión hidrófoba entre la
bacteria, la saliva y los componentes los que cubren a la superficie dental. (3)
Gonzales y col. 2005, describen que los polifenoles que se encuentran en Psidium
guajava por sus propiedades de astringencia inhiben la adhesión de S.mutans. En su
estudio evaluaron la actividad antimicrobiana de varios extractos de Psidium guajava
y Psidium guineense, sobre Streptococcus mutans, aislada de un paciente y
Escherichia coli. A partir de 300 gramos de hojas y cáscara de Psidium guajava y de
Psidium guineense se obtuvieron extractos etanólicos crudos con la técnica de
maceración en frío, al finalizar el estudio concluyeron que los extractos etanólicos
tienen hasta 71% de actividad antibacterial contra S. mutas y los halos de inhibición
producidos por este tipo de extracto fueron de 13mm. (16)
Prabu 2005, realizó una investigación utilizando extracto de hojas jóvenes de Psidium
guajava con metanol como solvente, efectivamente demostró actividad antimicrobiana
con la CMI de 4mg/ml. (22)
Calixto 2006, señala que es beneficioso masticar las hojas de Psidium guajava porque
actúa como analgésico dental y mejora el aliento ya que es un antibiótico natural.
Además expresa que tradicionalmente usamos muchas plantas medicinales y que la
mayoría no tiene respaldo científico es por esta razón que recomienda la investigación
de las mismas. La preparación de los extractos debe ser lo más cercana posible a la
forma tradicional. Se debe realizar la desecación de las hojas o frutos en estufa o al aire
libre, la temperatura no debe exceder los 37ªC para conservar los aceites esenciales
siguiendo métodos farmacéuticos como: maceración, infusión, decocción. Además
17
aconseja que al preparar los extractos acuosos o hidroalcohólicos de plantas
medicinales se debe realizar en concentraciones entre 30 y 80%. (19)
Zubaidah y col. 2006, en su informe final al estudiar las propiedades cariogénicas de
S.mutans, compararon los extractos crudos se Psidium guajava y extractos metanólicos
de Psidium guajava, concluyeron que los dos extractos reducen la síntesis de glucano
hasta en un 50%. En el presente estudio se encontró una gran diferencia antibacerial
entre los extractos crudos y metanólicos en concentraciones entre 5-15mg/ml ya que los
extractos metanólicos de Psidium guajava produjeron más halos de inhibición al
compararlos con extractos crudos. (23)
Saraya y col. 2008, elaboraron tabletas masticables de extracto crudo de Psidium
guajava en varias concentraciones 8%, 16%, 32% añadiendo ingredientes extras como
manitol, aerosil, mentol, entre otros. Todas las tabletas mostraron actividad
antibacteriana contra Streptococcus mutans por lo que los autores recomiendan la
creación de caramelos masticables, pasta e hilo dental con estos extractos. El conteo de
colonias alrededor de la tableta masticable al 32% fue cero en 2 a 3 horas, los autores
recomiendan realizar concentraciones menores a 32% ya que el sabor de la tableta fue
demasiado fuerte. (23)
Braga y col 2014, ejecutaron un estudio en el que muestran la actividad antibacterial de
los extractos etanólicos de Psidium guajava, al culminar su estudio concluyeron que la
CMI es 250ug/ml. (24)
Viral y col. 2014, efectuaron una investigación para comparar la eficacia de Punica
granatum, Nelumbo nucifera, Psidium guajava y Coffea Canephora sobre patógenos
orales realizando concentraciones de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% de cada uno de ellos. La
eficacia fue medida utilizando el método de difusión en agar sobre las bacterias:
Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia y Candida albicans. Las 4 extractos tuvieron efecto antibacterial sobre
Streptococcus mutas y Streptococcus mitis, pero efecto máximo fue causado por el
extracto de granada y flor de loto. El extracto de guayaba, flor de loto y café fue eficaz
18
sobre Prevotella intermedia, y solo el extracto de café fue eficaz sobre Porphyromonas
gingivalis. (26)
Shyla H y col. 2011, realizaron un estudio utilizando extractos de hojas de Psidium
guajava provenientes de India empleando solventes como: metanol, etanol, etil acetato
y hexano. En el presente estudio los 4 extractos presentaron efecto antibacteriano sobre
S.mutans y Candida albicans. (2)
Garode y Waghode 2014, estudiaron el potencial bioactivo de los componentes de los
extractos de hoja de Psidium guajava, en busca de una sustancia que permita excelentes
resultados como la cloherxidina pero que no pigmente los dientes con su uso
prolongado. En su investigación comprobaron que el extracto de las hojas de Psidium
guajava más etanol al 95%, tiene resultados antibacterianos similares a la corhexidina
y que la CMI fue 2.5 mg/ml. De esta manera Psidium guajava podría ser utilizada para
crear nuevos productos farmacéuticos e industriales. (4)
Pralhad y col.2015, probaron la actividad anti-caries de los extractos etanólicos y
acuosos de Psidium guajava contra L. acidophilus. La concentración de los extractos
fue de 5% y 20% respectivamente. Los extractos etanólicos produjeron 11.2 mm y
14.1mm de halos de inhibición mientras que los extractos acuosos produjeron 1.6mm y
5.1mm de halos de inhibición. Los investigadores le atribuyen esta propiedad por la
presencia de flavonoides en su composición química y recomiendan realizar un estudio
in vivo. (25)
2.5 Clorhexidina
Es una sustancia antibacterial que a bajas concentraciones es bacteriostático, es uno de
los agentes antibacterianos más utilizados por su efectividad. Según Rojas y Fernández
2009, un producto ideal para el control de placa debe cumplir las siguientes
propiedades:
Amplio espectro antibacteriano
Alta sustantividad
Estabilidad química en su almacenamiento
19
No causar reacciones adversas en la mucosa
No producir resistencia (26)
La clorhexidina es un fármaco derivado del clorofenilbiguanido, es conocida por
presentar características como la propiedad de “alta sustantividad”, la cual le permite
unirse a la hidroxiapatita del esmalte, a la película adquirida y a las proteínas salivales y
se va liberando paulatinamente durante 8 a 12 horas por esta razón impide la
colonización de las bacterias durante periodos prolongados de tiempo. (29)
Se considera a la clorhexidina es un agente antibacteriano de segunda generación. Es
considerada como un antiséptico tópico potente con muy poca posibilidad de absorción
que tiene acción antibacterial sobre bacterias Gram positivas y Gram negativas. (29)
Así mismo, presenta efecto antibacterial contra bacterias anaerobias facultativas y
aerobias, en menor medida contra hongos y levaduras. Baja actividad contra
microorganismos en forma de esporas. (30) Streptococcus mutans es altamente sensible
a la clorhexidina, con el uso de esta sustancia se logra la reducción significativa de
procesos cariosos. (31)
Actualmente es el agente antiplaca más eficaz disponible para el público, no tiene
toxicidad sistémica en su uso oral y no produce resistencia bacteriana, ni
sobreinfección. (30)
2.5.1 Mecanismo de Acción
El efecto antimicrobiano de la Clorhexidina se da ya que se une con fuerza a la
membrana plasmática bacteriana y en baja concentraciones, esto da como resultado un
aumento de la permeabilidad con pérdida de componentes intracelulares, incluido
potasio. En altas concentraciones causa la precipitación del citoplasma bacteriano y
produce la muerte celular. En la cavidad bucal actúa por más de 12 horas. (30)
La clorhexidina actúa contra la pared celular de los microorganismos ocasionando la
separación de las moléculas por medio del proceso conocido como electroforesis,
20
modificando la integridad de la pared celular y logrando así la liberación de los
componentes intracelulares. (33)
2.5.2 Formas de administración de la Clorhexidina
La clorhexidina tiene varias presentaciones para su aplicación clínica: colutorios, geles
dentífricos, gel tópico y spray. Los geles dentífricos se usan de preferencia junto con los
colutorios. (26)
La clorhexidina en forma de gel tópico y spray, es utilizada cuando existen lesiones localizadas en la encía. Así mismo, se puede administrar clorhexidina a través de dispositivos de liberación lenta como los chips de clorhexidina los cuales son poco usados. (26)
2.5.3 Efectos adversos
Los efectos colaterales principalmente son problemas estéticos. Lindhe menciona la
idea de Arweiler y cool. 2006. “si no hay mancha no sirve”, ya que antiguamente se
evaluaba el uso de la clorhexidina por la tinción de los dientes. (30) El uso prolongado
de clorhexidina produce pigmentación marrón de los dientes, de algunos materiales de
restauración y de las mucosas sobre todo del dorso de la lengua. (34) Otro efecto
colateral puede ser la alteración del gusto, en grado variable lo que limita su aceptación
en los pacientes y su empleo a largo plazo en Odontología preventiva. (30)
21
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1 Tipo de diseño de la investigación
Experimental (in vitro): Las variables fueron sometidas a experimentación en
condiciones controladas, y posteriormente se escribieron las causas por las que se
producen estos resultados.
3.2 Población de estudio y muestra. Se realizó la incubación de Streptococcus mutans en 15 cajas Petri, la variable de la
respuesta corresponderá a el tamaño de los halos de inhibición producidos con las
diferentes concentraciones de Psidium guajava al 12,5%, 25%, 50%, clorhexidina y el
control negativo agua destilada estéril.
Población de estudio:
El cálculo de la muestra se realizó con la siguiente fórmula:
Tabla 3: cálculo de la muestra
Fuente: investigación
Elaborador: autor
n= tamaño de la muestra.
Z= valores correspondientes al riesgo deseado.
s= varianza de la variable cuantitava (grupo de control observado)
22
s= 1.75
d= valor mínimo de la diferencia que de desea redactar (datos cuantitativos)
d=2.30
3.3 Criterios de inclusión
Cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175, no contaminadas
Extracto acuoso de hojas de Psidium guajava al 12,5%, 25%, 50% estéril
3.4 Criterios de exclusión
Cajas petri en donde no haya crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175
3.5 Criterios de eliminación Muestras contaminadas
23
3.6 Operacionalización de las variables T
IPO
Variable
Definición
Dimensión
Indicadores
Categórico
Escala de
Medición
Clasificación
IND
EPE
ND
IEN
TE
Extracto de
Psidium
guajava
(guayaba)
Psidium
guajava es
un árbol de 5
a 7 metros
de altura,
tronco
grisáceo-
café, corteza
lisa,
escamosa de
color rojizo.
(17)
Porcentajes
Concentración
del extracto
de Psidium
guajava
12,5%
25%
50%.
Concentración
de la
Clorhexidina
0.12%
Agua destilada
estéril
Nominal
1
2
3
Nominal
4
Nominal
5
Cuantitativa
DE
PEN
DIE
NT
E
Inhibición de
Streptococcus
mutans
Milímetro de
los halos de
inhibición
alrededor de
los discos en
los cultivos
de
Streptococcu
s Mutans
(2).
Milímetros
Diámetro de
halo de
inhibición en
milímetros
mm según
Duraffaurd:
Nula (-) ≤
8mm
Sensible (+) =
9-14 mm
Muy
sensible(++) =
15-19mm
Sumamente
sensible (+++)
≥ 20mm
Ordinal
Cuantitativa
Tabla 2 : Operazonalización de las variables
24
3.7 Procedimiento
3.7.1 Preparación de los extractos acuosos de hojas de Psidium guajava.
Se recolectaron las hojas del árbol de Psidium guajava ecuatoriano, las cuales fueron
donaciones de huertos familiares de Zámbiza, las hojas fueron mantenidas en bolsas de
plástico.Para obtener el extracto previamente se lavó las hojas con agua corriente, se
desinfectó y secó con papel absorbente. La cantidad de hojas de Psidium guajava
utilizadas en el presente estudio fue de 300 gramos de hojas desecadas al aire libre a no
más de 37ºC para conservar los aceites esenciales por 24 horas. (19) (16)
Figura 3: Hojas de Psidium guajava
Fuente: investigación
Elaboración: autor
Se utilizó en una proporción de 1: 2, 1 parte de planta y 2 partes de solución extractora
que fue agua. La planta junto con la solución extractora fue colocada en un recipiente de
vidrio ámbar, se sometió a maceración con agitación controlada por 72 horas en el
aparato de agitación continua. Maceración es un proceso mediante el cual la solución
extrae los principios activos presentes en la planta la cual al estar en contacto continuo
con la solución extractora (agua) logra que se produzca el fenómeno de difusión de los
activos de la planta hacia el solvente, hasta que se alcance un equilibrio entre la
25
solución extractora y los componentes activos de las hojas de Psidium guajava, este
equilibrio se logra entre las 60 y 72 horas de extracción. (19)
Figura 4: aparato de agitación continua
Fuente: investigación
Elaboración: autor
Una vez obtenido el extracto se sometió a calentamiento por 30 minutos a temperatura
de alrededor de 50°C para concentrar el extracto; se lo filtro y luego lo dejamos en
reposo. Se procedió a realizar las diluciones correspondientes del extracto concentrado.
Fórmula:
10ml de extracto concentrado de Psidium guajava + 10 ml de agua destilada estéril = 20 ml de extracto de Psidium guajava al 50%.
5ml de extracto concentrado de Psidium guajava + 15 ml de agua destilada estéril = 20 ml de extracto de Psidium guajava al 25%.
2.5ml de extracto concentrado de Psidium guajava + 17,5 ml de agua destilada estéril = 20 ml de extracto de Psidium guajava al 12,5 %.
26
Figura 5: Dilución del extracto de hojas de Psidium guajava
Fuente: investigación
Elaborador: autor
Los extractos en sus diferentes concentraciones: 12,5%, 25%, 50% fueron colocados en
frascos de vidrio oscuro y para garantizar que obtuvimos las concentraciones deseadas
realizamos la siguiente fórmula:
Figura 6: Extractos de Psidium guayaba al 12,5%, 25%, 50%.
Fuente: investigación
Elaboración: autor
20ml 100% 2,5 X = 12 5%
20ml 100% 5ml X = 25%
20ml 100% 10ml X = 50%
27
Los extractos de Psidium guajava fueron sometidos a irradiación con el fin de eliminar
la contaminación bacteriana. El proceso se lo realizó en cámara de radiación ultravioleta
por 1 hora, para ser utilizados en el laboratorio de microbiología posteriormente.
Figura 7: Extracto en cámara de radiación ultravioleta
Fuente: investigación
Elaboración: autor
Los extractos se realizaron bajo la responsabilidad técnica del personal Bioquímico
Farmacéutico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del
Ecuador controlando los parámetros de calidad que estos productos requieren. (33) Ver
anexo-9
3.7.2 Activación de las Cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175
El microorganismo Streptococcus mutans ATCC 25175, fue adquirido en “Medibac”
importador de insumos de laboratorio clínico en la ciudad de Quito, en estado
liofilizado y mantenido a bajas temperaturas. Ver Anexo 3-4.
28
La activación de las cepas de Streptococcus mutans se realizó de acuerdo a las
instrucciones del fabricante una semana antes del test microbiológico en el Laboratorio
Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central
del Ecuador. Ver Anexo-1
El microorganismo fue colocado en un tubo de ensayo, en el tubo de ensayo se colocó
un 1ml de caldo de cultivo TSB (Tryptip Soy Broth), la suspensión fue pipeteada en 4
ml de caldo de TSB para rehidratar y nutrir al microorganismo. (2) (34)
Las condiciones de incubación fueron a temperatura de 35°C y atmósfera anaerobia
durante 48 horas. (34) (2)
Figura 5: rehidratación de Figura 6: Colocación de TSB S. mutans tubo de ensayo con S. mutans.
Fuente: investigación Fuente: investigación
Elaboración: autor Elaboración: autor
29
Figura 7: Hisopado
Fuente: investigación
Elaboración: autor
Figura11: incubación en estufa +/- 35-2°C
Fuente: investigación
Elaboración: autor
30
A las 48 horas de incubación se encontró el crecimiento de colonias puras, fue necesario
diluir la suspensión en agua destilada estéril, la dilución se realizó hasta alcanzar la
turbidez de 0,5 en la escala de Mc. Falard. La confirmación de la turbidez se realizó
comparando visualmente entre la solución obtenida y una solución sulfato de bario
previamente elaborada al 0,5 en escala de Mc. Falard (1,5x108UFC/ml). (14)
Figura12: Crecimiento de colonias puras de S. mutans.
Fuente: investigación
Elaboración: autor
Figura13: Turbidez 0,5 escala de Mac. Falard
Fuente: investigación
31
Elaboración: autor
3.7.3 Siembra y Test antibacterial utilizando el método de difusión en agar (Kirby-Bauer)
Se realizó la rotulación de las cajas petri enumerando cada una de las cajas en su parte
posterior con los números del 1 al 15, se colocaron las siguientes iniciales para
identificar a los discos posteriormente:
1. G1: extracto de Psidium guajava al 12,5%
2. G2: extracto de Psidium guajava al 25%
3. G3: extracto de Psidium guajava al 50%
4. C: Clorhexidina 0.12% (control positivo)
5. A: agua destilada estéril (control negativo)
3.7.4 Siembra y Test antibacterial utilizando el método de difusión en agar (Kirby-Bauer)
Figura14: rotulación cajas petri
Fuente: investigación
Elaboración: autor
32
Se colocaron las 15 cajas petri estériles dentro de la cámara de flujo laminar,
Streptococcus mutans fue sembrado en las cajas petri enriquecidas con agar sangre de
cordero 5%, realizando un hisopado en tres direcciones y los bordes para obtener una
uniforme distribución de la bacteria en toda la superficie de la caja petri. (34)
Figura15: Sembrado de S. mutans
Fuente: investigación
Elaboración: autor
El efecto antimicrobiano de los extractos de la hoja Psidium guajava fueron evaluados
utilizando el método de difusión en agar, en el que determinamos la susceptibilidad que
tiene Streptococcus mutans a los extractos de Psidium guajava de la siguiente manera:
Los discos de papel filtro estériles de 6mm fueron previamente impregnados con cada
una de las 5 sustancias utilizando puntas desechables estériles, la cantidad depositada en
cada una fue 20ul (microlitros) calibrados con una micropipeta, con las diferentes
concentraciones: Extracto de hoja de guayaba al 12,5% 25%, 50%, el control positivo
clorhexidina al 0.12% y el control negativo agua destilada estéril, tomando los discos
con una pinza estéril. (2)
33
Figura16: depósito de 20ul de cada una de Figura17: 15 cajas Petri con los diferentes sustancias. discos.
Fuente: investigación Fuente: investigación
Elaboración: autor Elaboración: autor
Las 15 cajas petri sembradas fueron colocadas en la Jarra de Gaspack o jarra de
anaerobiosis. Las cajas petri fueron incubadas en la estufa a 35+/-2 °C y una atmósfera
de CO2 al 5%. A las 48 horas se midieron los halos de inhibición alrededor de los
discos con ayuda de una regla en mm. (2)
34
Figura18: cajas petri en Jarra de Figura 19: cajas petri en estufa
Gaspack o Jarra de anaerobiosis. Fuente: investigación
Fuente: investigación Elaboración: autor
Elaboración: autor
Figura20: caja petri tras incubacion de 48 horas.
Fuente: investigación
Elaboración: autor
35
El manejo de desechos se realizará de acuerdo al protocolo del Laboratorio Clínico y
Bacteriológico de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del
Ecuador. Ver Anexo-2
3.8 Aspectos bioéticos.
La investigación no tiene riesgo ya que es un estudio in vitro, no se utilizó ninguna
sustancia que sea peligrosa para la salud o integridad de las personas. Se dio a conocer
al Comité de Investigación de la Facultad de Odontología. El estudio fue sometido a
revisión y aprobación del Comité de Ética de la Universidad Central del Ecuador.
Se solicitaron los certificados de realización del estudio Laboratorio Clínico y
Bacteriológico de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del
Ecuador (Ver anexos 5,6,7)
36
CAPÍTULO IV
4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
4.1 Resultados:
En la muestra en estudio se usó 15 cajas petri, para que la prueba tenga 95% de
confianza y 0,5% de margen de error, se colocó 5 discos de papel filtro impregnado con
cada una de las 5 sustancias, los halos de inhibición se midieron con ayuda de una regla
en mm, y los resultados se detallan en la siguiente tabla: Ver anexo 8
Tabla 2 Resultados del test antibacterial.
EXTRACTO DE GUAYABA CLORHEXIDINA AGUA
50% 25% 12,5% 0,12%
REPETICIÓN HALOS DE INHIBICIÓN (mm)
1 6 6 6 22 6
2 6 6 6 20 6
3 6 6 6 20 6
4 6 6 6 22 6
5 6 6 6 20 6
6 6 6 6 22 6
7 6 6 6 22 6
8 6 6 6 20 6
9 6 6 6 20 6
10 6 6 6 20 6
11 6 6 6 22 6
12 6 6 6 20 6
13 6 6 6 20 6
14 6 6 6 20 6
15 6 6 6 22 6
Elaborador: autor
Fuente: investigación
37
Gráfico 1 Resultados del efecto antibacterial de Psidium guajava.
Elaborador: autor
Fuente: Investigación
4.2 Análisis estadístico
Los datos de los resultados fueron analizados en el programa estadístico SPSS.
Prueba de Normalidad:
Se debe verificar que las muestras tomadas provienen de una población con distribución
Normal, esto se realiza con las pruebas de Ko:lmogorov - Smirnov o con la prueba de
Shapiro - Wilk (menor a 20 datos).
Si las muestras provienen de poblaciones con distribución normal entonces se realizan
pruebas paramétricas (media, desviación estándar): T student, ANOVA.
Si las muestras No provienen de poblaciones con distribución normal entonces se
realizan pruebas no paramétricas (orden, signos): Mann Whitney, Kruskal Wallis,
Wilcoxon
Hipótesis a demostrar:
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
22 20 20 22 20 22 22 20 20 20 22 20 20 20 22
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Resultados del Efecto Antibacterial de Psidium guajava
EXTRACTO DE GUAYABA (50%) EXTRACTO DE GUAYABA (25%)
EXTRACTO DE GUAYABA (12,5%) CHLORHEXIDINA (0,12%)
AGUA
38
Ho (Hipótesis inicial): La muestra proviene de una población con distribución
Normal
Ha (Hipótesis alterna): La muestra NO proviene de una población con
distribución Normal
Advertencias
GUAYABA_50 es constante.
GUAYABA_25 es constante
GUAYABA_12,5 es constante.
AGUA.
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico Gl Sig.
CLORHEXIDINA_0
12 0,385 15 0,000 0,630 15 0,000
Tabla 4Prueba de normalidad
Fuente: investigación
Elaborador: autor
Prácticamente la mayoría de muestras de las sustancias son constantes y no tienen
variabilidad, la CLORHEXIDINA 0,12% que es la única que varía tiene en la prueba de
Normalidad un valor de significación 0.000, el mismo que es menor que 0.05 (95% de
confiabilidad), por tanto, luego para la comparación estadística se utilizan pruebas de
Hipótesis no paramétricas: Kruskal Wallis
39
Tabla 4 Estadísticas de los datos de las muestras:
Descriptivos
HALOS_mm
N Media
Desviació
n
estándar
Error
Estánda
r
95% del intervalo de
confianza para la
media
Míni
mo
Máxi
mo
Límite
inferior
Límite
superior
GUAYABA 50% 15 6,00 0,000 0,000 6,00 6,00 6 6
GUAYABA 25% 15 6,00 0,000 0,000 6,00 6,00 6 6
GUAYABA
12,5% 15 6,00 0,000 0,000 6,00 6,00 6 6
CLORHEXIDIN
A 0,12% 15 20,80 1,014 0,262 20,24 21,36 20 22
AGUA 15 6,00 ,000 0,000 6,00 6,00 6 6
Total
75 8,96 5,976 0,690 7,59 10,33 6 22
Fuente: investigación
Elaborador: autor
40
Pruebas no paramétricas: Kruskal Wallis
Ho: (hipótesis nula) Las muestras proceden de poblaciones con la misma
distribución de probabilidad (similar tendencia central)
Ha: (hipótesis alternativa) Existen diferencias respecto a la tendencia central de
las poblaciones y puede ser direccional o no.
Gráfico 2 Prueba de kruskal- walls.
Elaborador: autor
Fuente: investigación
Elaborador: autor
41
Fuente: investigación
De la Prueba de Kruskal-Wallis Sig. asintótica. = 0,000 (p) este valor es menor a 0,05
(95% de confiabilidad), luego existen diferencias respecto a la tendencia central de las
poblaciones. No todas son similares, luego para verificar cuales son similares se hacen
pruebas dos a dos:
Gráfico 3 Comparación de las sustancias.
Elaborador: autor
Fuente: investigación
42
Tabla 5: Pruebas estadísticas Fuente: investigación
Elaborador: autor
Con las pruebas dos a dos se verifica que NO son similares entre:
La CLORHEXIDINA 0,12% no es similar a GUAYABA 50%, GUAYABA 25%,
GUAYABA 12,5% y AGUA, esto es la CLORHEXIDINA 0,12% está muy por encima
de todas las muestras. Todas las concentraciones de GUAYABA son similares al efecto
que produce el agua destilada estéril.
Se acepta la hipótesis nula, Psidium guajava no tiene efecto antimicrobiano sobre
cepas de Streptococcus mutans.
43
4.3 DISCUSIÓN La aplicación de la fitoterapia en Odontología se ha ido incrementando en los últimos
años, cada vez es más común preferir usar sustancias de origen natural. En Ecuador, así
como en varios países usamos tradicionalmente varias plantas medicinales, muchas de
ellas no tienen respaldo científico es por esta razón que es necesaria la investigación de
las mismas. El propósito de la investigación fue evaluar el efecto de Psidium guajava
sobre Streptococcus mutans ya que ancestralmente le han atribuido propiedades
antibacteriales y antimicóticas, varios autores recomiendan masticar hojas de Psidium
guajava para prevenir el mal aliento, caries y enfermedad periodontal. (19) (2)
Los grupos de estudio en la investigación fueron extractos acuosos de Psidium guajava
en concentraciones al 12,5%, 25%, 50%, preparados siguiendo las recomendaciones de
Calixto 2006, que encomienda realizar la preparación lo más cercana posible a la
forma tradicional, siguiendo métodos como: maceración, infusión, decocción, etc.
Además aconseja realizar los extractos acuosos o hidroalcohólicos de plantas
medicinales en concentraciones entre 30% y 80%. (19) Varios estudios previos
utilizando extractos acuosos de Psidium guajava en diferentes concentraciones
orientan a que existe un efecto antibacterial sobre S.mutans. (19) (23) (24) (26)
Los resultados de la presente investigación no coinciden con los estudios previos ya
que en el presente estudio los extractos acuosos de Psidium guajava en concentraciones
al 12,5%, 25%, 50%, no produjeron halos de inhibición en comparación con los 20 mm
a 22 mm de halos de inhibición producidos por el control positivo que fue clorhexidina
al 0,12% donde la susceptibilidad de Streptococcus mutans fue evidente. Por lo tanto,
se acepta la hipótesis nula que establece que Psidium guajava no tiene efecto
antimicrobiano sobre Streptococcus mutans..
Uno de los hallazgos más interesantes de este estudio fue que al incrementar la
concentración de extracto de Psidium guajava al 50% no se obtuvo un mayor efecto
antibacterial al contrario los azúcares presentes en los compuestos del extracto
favorecieron el crecimiento de Streptococcus mutans, no se evidencio desarrollo de
S.mutans alrededor de los discos impregnados con concentraciones de 12,5% y 25%.
44
Una de las limitaciones del estudio fue que no se incorporaron a los extractos solventes
como metanol, etanol, hexano, cloroformo, etc, que en varias investigaciones previas
han demostrado tener efecto antibacteriano excelente sobre S.mutans, una de ellas
comparables con la eficacia de la cloherxidina. (16) (22) (23) (4) (25) Este tipo de
extractos puede ser aprovechado en la creación de nuevos productos industriales o
farmacéuticos pero no pueden ser usados en la cavidad oral por ser citotóxicos. (4)
Es imprescindible mencionar que los solventes como metanol, etanol, cloroformo, etc,
tienen efecto antibacteriano por sí mismos, es necesario diferenciar quien produce el
efecto antibacteriano si el solvente o los componentes activos de Psidium guajava o si a
su vez podría ser que según el solvente se obtiene diferentes componentes activos de la
hoja de Psidium guajava. Otra de las debilidades del estudio fue que no se incorporaron
métodos químicos sofisticados, se prefirió utilizar métodos tradicionales para así poder
buscar una explicación científica al efecto antibacteriano atribuido ancestralmente a
Psidium guajava.
No todas las sustancias naturales producen efectos antibacterianos. Es necesario
continuar investigando los efectos de Psidium guajava ecuatoriana sobre patógenos
orales, incorporar cada una de sus partes, realizar los extractos de una forma diferente,
utilizar brotes jóvenes de hojas o frutos, incorporar métodos más sofisticados, así como
mayores concentraciones en los extractos. Es nuestra obligación como Odontólogos
motivar, educar a nuestros pacientes para que no se reemplace las terapias de
Odontología restauradora y preventiva por tradiciones del folclore popular que no tienen
evidencia científica.
45
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
5.2 CONCLUSIONES:
Los extractos acuosos de las hojas de Psidium guajava ecuatoriana de la zona
de Zámbiza, en las concentraciones 12,5%, 25%, 50%, no tienen efecto
antibacteriano sobre cepas de Streptococcus mutans.
La susceptibilidad de Streptococcus mutans al control positivo clorhexidina al
0,12%, fue evidente ya que los halos de inhibición fueron de 20mm a 22mm,
mientras que la susceptibilidad de Streptococcus mutans utilizando extractos
acuosos de Psidium guajava en concentraciones de 12,5%, 25%, 50% y agua
destilada estéril fue nula ya que no se produjeron halos de inhibición.
46
5.2 RECOMENDACIONES
Se debería continuar con el estudio del efecto antimicrobiano de los extractos de
Psidium guajava en mayores concentraciones ya que podría tener mayor número
de compuestos activos.
Se recomienda realizar un recuento de colonias para comprobar el efecto anti-
adherente que producirían los extractos de Psidium guajava sobre cepas de
Streptococcus mutans.
Sería beneficioso estudiar el efecto antibacteriano de cada una las partes del
árbol de Psidium guajava: semillas, fruto, hojas, etc. Así mismo, incorporar
métodos más actuales y sofisticados para la obtención de extractos.
Es recomendable incorporar otros patógenos de la cavidad oral para el estudio de
los de los efectos antibacterianos de Psidium guajava.
47
6. BIBLIOGRAFÍA
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48
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49
7. ANEXOS
1. Solicitud para la realización del estudio en el Laboratorio Clínico y
Bacteriológico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del
Ecuador
50
2 . Protocolo de manejo de desechos infecciosos, Laboratorio de Química de la Facultad de Ingeniería Química de Universidad Central del Ecuador.
51
3. Factura de la obtención de la cepa Streptococcus mutans ATCC 25175.
52
4. Certificado de autenticidad de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175
53
5. Certificado del manejo de los desechos utilizados en la realización de la
presente tesis.
54
6. Certificado de participación del autor en la realización de la tesis junto a Dra.
Rachide Acosta.
55
7. Certificado de atotizacion de uso de las instalaciones para el depósito de los
desechos producidos por el material utilizado en la presente tesis.
56
8. Resultados del test antibacterial.
57
9. Certificado de la obtención de los extractos de hoja de Psidium guajava.
58
10. Certificado del análisis estadístico.
59
11. Certificado de aprobación de finalización del proyecto por parte del tutor.
60
61
12. Certificado aprobación del Comité de Ética de la Universidad Central del
Ecuador.
62
13. Certificado de la traducción
