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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN Y GRADUACIÓN
“EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
BOTONCILLO (Acmella repens) EN DIFERENTES CONCENTRACIONES
SOBRE LA CEPA DE Porphyromona gingivalis ATCC® 33277™”
Proyecto de Investigación como Requisito previo para la Obtención del Grado
Académico de Odontóloga
AUTORA:
ANDREA LIZBETH CHAMORRO BENALCÁZAR
TUTORA:
DRA. MARIELA CUMANDÁ BALSECA IBARRA
QUITO-ECUADOR
FEBRERO, 2016
ii
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios, por su amor infinito, Quién sostuvo su mano extendida
señalándome el camino correcto para llegar hasta este punto tan importante de mi vida
profesional.
A mis padres Nancy y Ramiro por su cariño, esfuerzo y apoyo incondicional durante
toda mi carrera, quienes hicieron posible cumplir mis metas y sueños. A mi hermano
Jonathan, por su apoyo, alegría y motivación constante.
iii
AGRADECIMIENTO
A los docentes de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador,
por haber sido parte de mi formación profesional y personal.
A mi tutora, Dra. Mariela Balseca por sus conocimientos, experiencia, paciencia y
entrega en la orientación y elaboración de este trabajo.
Al Dr. Juan Viteri, profesor de Microbiología de la Facultad de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador y a la Lic. Yolanda Andrade, ayudante del laboratorio
de Microbiología, de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador
por los conocimientos y guía que me brindaron en la elaboración de la parte
experimental de mi proyecto.
A mis amigos y compañeros por su amistad y apoyo.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, ANDREA LIZBETH CHAMORRO BENALCÁZAR, con C.I. 1720918000, en
calidad de autora de la tesis realizada sobre: “EFECTO ANTIBACTERIANO IN
VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE BOTONCILLO (Acmella repens)
EN DIFERENTES CONCENTRACIONES SOBRE LA CEPA DE Porphyromonas
gingivalis ATCC® 33277™”.
Por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso
de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contienen esta obra,
con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad a lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes a la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
Quito, 02 de febrero del 2016
……………………………………………………….
ANDREA LIZBETH CHAMORRO BENALCÁZAR
C.I. 1720918000
v
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
vi
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA ............................................................................................................... ii
AGRADECIMIENTO ..................................................................................................... iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ............................................... iv
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR ................................................................ v
ÍNDICE DE TABLAS ..................................................................................................... xi
ÍNDICE DE GRÁFICOS ............................................................................................... xii
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. xiii
ÍNDICE DE ANEXOS .................................................................................................. xiv
RESUMEN ..................................................................................................................... xv
ABSTRACT .................................................................................................................. xvi
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
CAPITULO I .................................................................................................................... 3
EL PROBLEMA .............................................................................................................. 3
1.1. Planteamiento del problema ............................................................................................... 3
1.1.1. Formulación de la pregunta de investigación .................................................................. 4
1.2. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN ................................................................. 4
1.2.1. Objetivo general .............................................................................................................. 4
1.2.2. Objetivos específicos....................................................................................................... 4
1.3 JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 4
1.4 HIPÓTESIS ................................................................................................................ 6
CAPÍTULO II ................................................................................................................... 7
MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 7
2. ENFERMEDAD PERIODONTAL .............................................................................. 7
2.1. Definición .......................................................................................................................... 7
2.1.2 Etiopatogenia .................................................................................................................... 7
2.1.3. Biofilm de la placa dental subgingival ............................................................................ 8
2.1.4. Periodontitis crónica ........................................................................................................ 9
2.2. Porphyromona gingivalis .......................................................................................... 9
2.2.1. Descripción Morfológica................................................................................................. 9
2.2.2. Nutrición ....................................................................................................................... 10
2.2.3. Factores de virulencia.................................................................................................... 10
viii
2.2.3.1 La cápsula ................................................................................................................ 10
2.2.3.2 Endotoxina .............................................................................................................. 10
2.2.3.3 Vesículas de membrana externa .............................................................................. 11
2.2.3.4 Hemaglutininas........................................................................................................ 11
2.2.3.5 Fimbrias ................................................................................................................... 11
2.2.3.6 Proteínas cisteinproteasas ........................................................................................ 12
2.2.3.7 Proteinasas no cisteinproteasas ............................................................................... 12
2.2.3.8 Inductor de metaloproteinas de la matriz ................................................................ 13
2.3. USO DE ANTISÉPTICOS CONVENCIONALES EN PERIODONCIA .............. 13
2.3.1 Clorhexidina ................................................................................................................... 13
2.3.2 Composición .................................................................................................................. 13
2.3.3 Mecanismo de acción ..................................................................................................... 14
2.3.4 Concentraciones ............................................................................................................. 14
2.3.5 Presentaciones ................................................................................................................ 15
2.3.6 Reacciones adversas ....................................................................................................... 15
2.4. FITOTERAPIA ....................................................................................................... 15
2.4.1. Extractos vegetales ........................................................................................................ 16
2.4.1.1 Extracto etanólico ........................................................................................................ 16
2.4.2. Botoncillo ...................................................................................................................... 16
2.4.3. Nombres comunes ......................................................................................................... 17
2.4.4. Descripción botánica ..................................................................................................... 17
2.4.5. Origen y hábitat ............................................................................................................. 18
2.4.6. Usos etnomedicinales .................................................................................................... 18
2.4.7. Propiedades Medicinales ............................................................................................... 19
2.4.7.1. Antimicótico ........................................................................................................... 19
2.4.7.2. Antimicrobiano ....................................................................................................... 20
2.4.7.3. Antiséptico ............................................................................................................. 20
2.4.7.4 Propiedades odontálgicas ........................................................................................ 20
2.4.7.5. Expectorante ........................................................................................................... 21
2.4.7.6. Suplemento alimentario .......................................................................................... 21
2.4.7.7. Antirreumático ....................................................................................................... 21
2.4.7.8. Diurético ................................................................................................................. 21
2.4.7.9. Analgésico y Antiinflamatorio ............................................................................... 21
2.4.7.10. Anestésico ............................................................................................................ 22
2.4.8. Características químicas ................................................................................................ 22
ix
2.4.8.1. Alcaloides ............................................................................................................... 23
2.4.8.2 Flavonoides ............................................................................................................. 23
2.4.8.3 Glucósidos ............................................................................................................... 23
2.4.8.4 Taninos .................................................................................................................... 23
2.4.8.5 Triterpenoides y Esteroides: .................................................................................... 23
2.4.9. Mecanismo de acción .................................................................................................... 23
CAPÍTULO III ............................................................................................................... 25
METODOLOGÍA ........................................................................................................... 25
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN ................................................................................... 25
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA ................................................................................... 25
3.2.1 Tipo de muestreo ........................................................................................................ 25
3.2.2 Unidad de muestra ...................................................................................................... 25
3.2.3 Calculo de la muestra .................................................................................................... 26
3.3.1. Criterios de inclusión ................................................................................................ 27
3.3.2. Criterios de exclusión ................................................................................................ 27
3.4 Variables ........................................................................................................................... 27
3.4.1 CONCEPTUALIZACIÓN DE LAS VARIABLES ................................................... 27
3.4.2. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES .................................................... 30
3.5 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 31
3.5.1 Recursos materiales ........................................................................................................ 31
3.5.2 Infraestructura ............................................................................................................ 31
3.5.3 Materiales ................................................................................................................... 31
3.6 PROCEDIMIENTO Y TÉCNICAS ......................................................................... 32
3.6.1 Obtención del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) ................................. 32
3.6.2 Cepa bacteriana para el estudio ...................................................................................... 33
3.6.3 Reactivación de la cepa bacteriana ................................................................................. 34
3.6.4 Estandarización de la cepa bacteriana ............................................................................ 34
3.6.5 Determinación de la CMI ............................................................................................... 35
3.6.6 Colocación de los extractos en los discos blancos ......................................................... 36
3.6.7 Cultivo de la cepa de Porphyromona gingivalis ATCC® 33277™ .............................. 37
3.6.8 Evaluación del efecto antibacteriano del extracto frente a la cepa de Porphyromonas
gingivalis. ................................................................................................................................ 38
3.6.9 Eliminación y manejo de desechos ................................................................................ 38
3.7. ASPECTOS ÉTICOS .............................................................................................. 39
x
CAPÍTULO IV ............................................................................................................... 40
ANALISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS .............................................. 40
4.1 Recolección de los datos ................................................................................................... 40
4.1.1 Medición de los halos de inhibición ........................................................................... 40
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................................. 43
DISCUSIÓN ................................................................................................................... 48
CAPÍTULO V ................................................................................................................ 49
CONCLUSIONES .......................................................................................................... 49
RECOMENDACIONES ................................................................................................ 50
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Crecimiento bacteriano (turbidez) en los tubos de caldo BHI......................... 41
Tabla 2. Medidas de los halos de inhibición que tuvieron los extractos en diferentes
concentraciones y las sustancias control, sobre la cepa de Porphyromonas gingivalis. . 43
Tabla 3. Comparación de los extractos etanólicos de Botoncillo por parejas. .............. 45
xii
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Fórmula molecular spilanthol 22
Gráfico 2. Concentraciones extractos 28
Gráfico 3. Fórmula molecular Clorhexidina 29
Gráfico 4. Ausencia de crecimiento bacteriano y presencia de crecimiento bacteriano 42
Gráfico 5. Resultados de la prueba de Kruskal-Wallis 44
Gráfico 6. Rangos del extracto de Botoncillo al 100% y Clorhexidina al 0,12% 46
Gráfico 7. Resultado de las prueba de U Mann Whitney 47
Gráfico 8. Media de los halos de inhibición de los extractos y sustancias de control 47
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Botoncillo en estado silvestre ........................................................................ 17
Figura 2. Flor de Botoncillo en estado silvestre ............................................................ 18
Figura 3. Material e instrumental para el estudio .......................................................... 32
Figura 4. Extractos etanólicos de Botoncillo al 25%, 50% y 100% .............................. 33
Figura 5. Cepa microbiológica de Porphyromona gingivalis ATCC 33277 ................. 34
Figura 6. Estandarización de la cepa ............................................................................. 35
Figura 7. A) Colocación de los extractos en los tubos con caldo BHI. B) Tubos con
extractos para ser incubados. C) Resultados de la prueba de turbidez ........................... 36
Figura 8. A) Colocación de 20ml de los extractos en los discos blanco con la
micropipeta. B) Extractos colocados en el disco ............................................................ 36
Figura 9. A) Sembrado de la cepa bacteriana en las placas de agar. B) Colocación de las
placas Petri en la jarra de anaerobiosis ........................................................................... 37
Figura 10. A) Ajuste de la temperatura de la incubadora a 35°. B) Colocación de los
medios de cultivo en la incubadora. ............................................................................... 37
Figura 11. Medición de los halos de inhibición ............................................................ 38
Figura 12. Autoclave ..................................................................................................... 39
Figura 13. Halos de inhibición a los 7 días de incubación ............................................ 40
xiv
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Solicitud de autorización de ingreso al laboratorio de mi microbiología de la
Facultad de Odontología de la U.C.E. ............................................................................ 54
Anexo 2. Certificado otorgado por el centro de biología de la U.C.E. de identificación
taxonómica de la planta. ................................................................................................. 55
Anexo 3. Certificado de autenticidad de la cepa microbiológica ................................... 56
xv
RESUMEN
La enfermedad periodontal es de alta prevalencia en el adulto a nivel mundial, de
etiología multifactorial, siendo el factor etiológico primario el agente microbiano. Uno
de los agentes más relevantes es la Porphyromona gingivalis, bacilo anaerobio estricto,
Gram negativo. En la Odontología actual la búsqueda de nuevas alternativas de
tratamientos antibacterianos se ha incrementado debido al desarrollo de resistencia
bacteriana y reacciones adversas que producen los mismos. El propósito de este estudio
in vitro fue determinar el efecto antibacteriano del extracto etanólico de Botoncillo
(Acmella repens) en diferentes concentraciones sobre la cepa de Porphyromona
gingivalis mediante el test de difusión en Agar. La obtención de los extractos se realizó
mediante la técnica de percolación utilizando etanol como solvente, los extractos se
concentraron al 25%, 50% y 100%. Se colocaron los discos blancos estériles embebidos
en 20ul de cada extracto, tomando como control positivo Clorhexidina al 0,12% y suero
fisiológico como control negativo. Se procedió a la medición de los halos a los 7 días,
observándose un efecto antibacteriano para el extracto etanólico de Botoncillo al 100%.
Los resultados obtenidos fueron analizados con la pruebas de Kruskal-Wallis y U Mann
Whitney con las que se puede concluir que existieron discrepancias significativas por
grupo de estudio, el extracto etanólico de Botoncillo al 100% presenta valores de
inhibición, y los valores más altos de inhibición son para Clorhexidina al 0,12%.
PALABRAS CLAVES: EFECTO ANTIBACTERIANO, PORPHYROMONAS
GINGIVALIS, EXTRACTO DE BOTONCILLO, ENFERMEDAD PERIODONTAL.
xvi
ABSTRACT
Periodontal disease is highly prevalent in adults worldwide, of multifactorial etiology,
being the primary etiological factor the microbial agent. One of the most important is
the Porphyromona gingivalis, a strict anaerobic Bacillus, Gram negative. In the current
Dentistry the search for new alternatives of antibacterial treatments has increased due to
the development of bacterial resistance and adverse reactions that produce them. The
purpose of this in vitro study was to determine the antibacterial effect of ethanolic
extract of Buttonwood (Acmella repens) in different concentrations on the strain of
Porphyromona gingivalis using the Agar diffusion test. The extracts was performed
using the technique of percolation and ethanol as solvent, the extracts were concentrated
at 25%, 50% and 100%. The sterile white disks were embedded with 20ul in each
extract, taking as positive control chlorhexidine 0.12% and normal saline as a negative
control. It was to the measurement of the halos 7 days, observing an antibacterial effect
to the ethanolic extract of Buttonwood 100%. The results obtained were analyzed with
the test of Kruskal-Wallis and Mann Whitney U with which it can be concluded that
existed significant discrepancies by study group, the ethanolic extract of Buttonwood
100% presents inhibition values, and the values most high of inhibition are for
chlorhexidine 0.12%.
KEY WORDS: ANTIBACTERIAL EFFECT, PORPHYROMONAS GINGIVALIS,
EXTRACT OF BUTTONWOOD, PERIODONTAL DISEASE
1
INTRODUCCIÓN
La periodontitis es una de las principales patologías de tipo infeccioso que
involucran a todas las estructuras que rodean al diente. La enfermedad periodontal tiene
una alta prevalencia en la población adulta (Raghavendra, Koregol, & Bhola, 2009).
Tanto el inicio como la progresión de la periodontitis resulta de la interacción compleja
entre las bacterias que llegan a colonizar el surco gingivo ‒ dentinario y la respuesta
inmuno ‒ inflamatoria del huésped susceptible (Del Río, 2006).
Desde el pasado siglo se tienen múltiples evidencias sobre la etiología de la
periodontits, existen más de 700 especies que han sido aisladas de las bolsas
periodontales de cavidad bucal, pero solo unas 20 son consideradas posibles patógenos
periodontales importantes. El grupo de bacilos anaerobios Gram Negativos relacionados
mayormente con la etiología de enfermedad periodontal, comprende a los Géneros
Porphyromonas, Prevotella, Bacteroides y Fusobacterium, que son ubicados dentro de la
familia Bacteroidaceae (Guilarte & Perrone, 2005).
Van Winkelhoff (1988); Marhs (2000); Liebana (2002) citados por (Guilarte &
Perrone, 2005) refieren que Porphyromona gingivalis se destaca como una bacteria
periodonto patogénica y está asociada tanto al inicio como a la progresión de la
periodontitis crónica, por estar relacionada a numerosos factores de virulencia.
El tratamiento y/o prevención de la periodontitis incluyen métodos tradicionales
como son la remoción mecánica de la placa supra y subgingival, el uso de agentes
antimicrobianos y la eliminación de factores de riesgo (Gordon & Walker, 1993).
Sin embargo siendo la periodontitis una patología crónica y frente a la aparición
de cepas resistentes a los diferentes antibióticos que se usan comúnmente se plantea el
desafío de buscar nuevas alternativas de antibioticoterapía para evitar reacciones
adversas y posibles contraindicaciones. Estas nuevas alternativas son tanto sustancias
químicas sintetizadas en laboratorio así como productos provenientes de la naturaleza,
revalorizando el uso de las plantas que tenemos en nuestro medio (Del Río, 2006).
2
El botoncillo (Acmella repens), es una planta utilizada de diversas maneras en la
Sierra ecuatoriana desde hace muchos años atrás como analgésico, antipirético,
antiinflamatorio y anestésico en el tratamiento de distintas de enfermedades
bucofaríngeas como caries, infecciones micoticas, gingivitis, enfermedad periodontal
(Acosta, 1992).
Según Hernández (citado por (Sulca, 2010)) al análisis bioquímico el botoncillo
(Acmella repens) es una especie vegetal que indica presencia de principios activos tales
como alcaloides, terpenos, flavonoides, fenoles, quinonas, esteroides estos son
identificados como metabolitos secundarios y son compuestos con actividad
antimicrobiana.
Es así que con la finalidad de recuperar el conocimiento ancestral sobre el uso
de plantas medicinales y encontrar nuevas alternativas para aquellas poblaciones rurales
de la sierra ecuatoriana que no tienen acceso a programas de salud oral completos, se
hace el presente estudio in vitro para determinar el efecto antimicrobiano que poseen las
sustancias activas del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) sobre cepas de
Porphyromona gingivalis, causante principal de enfermedad periodontal.
3
CAPITULO I
EL PROBLEMA
1.1. Planteamiento del problema
El uso de agentes de acción antimicrobiana se considera un complemento
importante tanto en la prevención como el control de enfermedad periodontal pero
actualmente uno de los problemas que afectan los tratamientos odontológicos es la
resistencia bacteriana y los efectos secundarios causados por el uso indiscriminado de
antibióticos, por lo que se busca la manera de encontrar nuevas alternativas
(Montenegro, 2014) (Del Río, 2006).
La enfermedad periodontal afecta a todo el conjunto de estructuras que rodean al
diente y se ha reconocido que la Porphyromona gingivalis es el microorganismo
periodonto patógeno más común y agresivo en periodontitis en la población adulta
(Socransky & Haffajee, 2003). Además de tener una alta prevalencia existen al
momento pocos estudios en el país sobre fitoterapia y microbiología de anaerobios
estrictos. Por lo que el presente estudio in vitro de este extracto etanólico busca
determinar si presenta propiedades antibacterianas en la Porphyromona gingivalis.
Los pobladores de la región sierra del país utilizan para aliviar sus dolencias y
molestias a nivel bucal Botoncillo (Acmella repens) de manera empírica (Sulca, 2010).
Investigaciones y recopilaciones bibliográficas atribuyen a esta planta un sin número de
propiedades. Más no existen datos de dosis para cada enfermedad, ni especificidad de
microrganismos a nivel de cavidad oral que son combatidos.
Estudios científicos han evidenciado que los flavonoides, taninos y alcaloides
encontrados en especies vegetales como el botoncillo (Acmella repens) actúan
deteriorando los sistemas enzimáticos que intervienen en la producción de energía y en
la síntesis de componentes estructurales afectando de esta manera la actividad celular
(Chiriboga, 2007).
4
1.1.1. Formulación de la pregunta de investigación
¿Cuál será el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Botoncillo
(acmella repens) en diferentes concentraciones sobre la cepa de Porphyromonas
gingivalis?
1.2. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
1.2.1. Objetivo general
Determinar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de
Botoncillo (Acmella repens) en diferentes concentraciones sobre la cepa de
Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™.
1.2.2. Objetivos específicos
Establecer la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico
de Botoncillo (Acmella repens) sobre el crecimiento de Porphyromonas
gingivalis ATCC® 33277™.
Evaluar cuál de las diferentes concentraciones del extracto etanólico de
Botoncillo (Acmella repens) presenta mayor efecto antibacteriano sobre la
cepa de Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™.
Comparar el efecto antibacteriano del extracto etanólico de Botoncillo
(Acmella repens) vs Clorhexidina al 0,12 sobre la cepa de Porphyromonas
gingivalis ATCC® 33277™.
1.3 JUSTIFICACIÓN
La enfermedad periodontal es una enfermedad infecciosa de etiología bacteriana
común en el ser humano, siendo Porphyromonas gingivalis el microrganismo más
importante encontrado en periodontitis (Socransky & Haffajee, 2003).
5
Por ello el control de microorganismos con la ayuda de coadyuvantes de los
métodos mecánicos tales como sustancias antimicrobianas y/o antisépticas que
disminuyan la carga bacteriana de la cavidad oral es de mucha importancia. Estas
sustancias han creado resistencia bacteriana y reacciones adversas como pigmentación
dentaria y perdida de sensibilidad en la lengua tanto por la administración inadecuada
como el uso prolongado de los mismos (Basconez, Mudarra, & Perea, 2002). Por lo que
se busca el empleo de sustancias de origen natural.
Mencionan (Naranjo & Coba, 2003) que la fitoterapia y la medicina natural
últimamente ha recibido mucha importancia por parte de los investigadores de distintas
áreas, estas muestran que sustancias activas como son opioides, terpenos, taninos,
flavonoides encontradas en especies vegetales actúan de manera bactericida sobre
ciertos microorganismos Gram negativos como es el caso de Porphyromonas gingivalis,
este estudio permitirá corroborarlo.
También mencionan (Naranjo & Coba, 2003) que en el Ecuador la flora medicinal ha
sido estudiada desde hace tiempo, pero de una manera empírica. Muchos de los usos
medicinales de las plantas que se han documentado no registran una enfermedad
diagnosticada sino que hacen referencia únicamente a síntomas.
Según Arias (2002) la situación de la salud oral en el Ecuador y en especial en las
zonas urbano-marginales y rurales difiere de manera notable con los países
desarrollados, ya sea por falta de recursos humanos, económicos y de programas de
salud que hagan una completa cobertura.
El presente proyecto de investigación está enfocado determinar la acción inhibitoria del
extracto etanólico de botoncillo (Acmella repens) sobre la cepa Porphyromonas
gingivalis ATCC® 33277™ para que sirva de precedente para posteriores estudios y
poderlo emplear en diferentes productos, en pacientes y en aquellas personas de escasos
recursos económicos del país que no tienen acceso a la salud oral integral.
6
1.4 HIPÓTESIS
Ha1 A mayor concentración del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens)
el efecto antibacteriano in vitro sobre las cepas de Porphyromonas gingivalis será
evidente.
Ho1 A mayor concentración del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens)
el efecto antibacteriano in vitro sobre las cepas de Porphyromonas gingivalis no
será evidente.
Ha2 A mayor concentración del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens)
el efecto antibacteriano in vitro sobre las cepas de Porphyromonas gingivalis será
mejor comparando con el Clorhexidina al 0,12%.
Ho2 A mayor concentración del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens)
el efecto antibacteriano in vitro sobre las cepas de Porphyromonas gingivalis no
será mejor comparando con el Clorhexidina al 0,12%.
7
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2. ENFERMEDAD PERIODONTAL
2.1. Definición
La enfermedad periodontal es una enfermedad infecciosa-inflamatoria, de
etiología multifactorial que afecta a la estructura del periodonto (ligamento periodontal,
cemento y hueso alveolar) en diferentes grados (Botero & Bedoya, 2010).
Existen principalmente dos patologías que son: la gingivitis, que es una
respuesta inflamatoria del tejido gingival frente a la acumulación de placa bacteriana, y
periodontitis, que corresponde a una patología infecciosa de tipo específica, con
características inflamatorias que afectan a los tejidos de soporte dentario (Socransky &
Haffajee, 2003).
La enfermedad periodontal es de alta prevalencia en la población adulta y
cuando no es tratada a tiempo es la principal causa de pérdida de piezas dentarias,
también es considerada como factor de riesgo para la diabetes, enfermedades
cardiovasculares, parto prematuro y bajo peso al nacer por haber una alteración de la
microbiota subgingival, y cambios en la respuesta inmune del húesped (Gamonal, 1998)
(Beck, Offenbacher, Williams, Gibbs, & Garcia, 1998) (Raghavendra, Koregol, &
Bhola, 2009).
Tanto el inicio como la progresión de la enfermedad periodontal es el resultado
de una compleja interacción entre las bacterias que colonizan el surco gingival y la
respuesta inmuno-inflamatoria del huésped susceptible (Del Río, 2006).
2.1.2 Etiopatogenia
Las opiniones en los últimos años sobre la etiología de las enfermedades
periodontales no han estado del todo claras, pese al avance y evolución de la ciencia. Se
8
sabe que las enfermedades periodontales son producto de una interacción de un factor
etiológico primario necesario, pero no suficiente, como es un agente microbiano único
o múltiple, un huésped susceptible y factores ambientales que influyen sobre ambos
(Rioboo & Bascones, 2005).
Varios estudios realizados han demostrado que las enfermedades periodontales
son de tipo infeccioso, siendo los microorganismos localizados en la región del surco
gingivo - dentario o placa subgingival el principal agente etiológico de la enfermedad
periodontal (Socransky & Haffajee, 2003).
2.1.3. Biofilm de la placa dental subgingival
Según (Carranza & Newman, 1997) la placa subgingival localizada en las
bolsas periodontales o dentro del surco gingival, está constituida de manera especial por
microorganismos Gram negativos, anaerobios. La enfermedad periodontal ha sido
asociada a una microbiota subgingival variada y numerosa que de acuerdo a la hipótesis
de placa específica de las más de 700 especies solo unas 20 son consideradas patógenas
(Moore & Moore, 1994).
Del mismo modo que en la placa supragingival, la especie que predomina en la
placa subgingival es Actinomyces. Al avanzar del medio supragingival al subgingival
hay una disminución significativa de Actinomyces y un aumento de T. Forsythensi, P.
gingivalis y T. denticola (Socransky & Haffajee, 2003).
Menciona (Theilade, 1986) que toda la placa bacteriana puede contribuir al
potencial patógeno de la flora subgingival en mayor o menor grado, por su capacidad de
colonizar y eludir las defensas del húesped y provocar inflamación y daño en el tejido.
La mayor virulencia de la flora subgingival parece debida a la aparición de una
ecología de la placa desfavorable para el huésped, pero favorable al crecimiento de
bacterias con potencial patógeno.
9
2.1.4. Periodontitis crónica
Según (Ramos A. , 2012) la gravedad y prevalencia de la periodontitis crónica
aumentan con la edad y están en relación directa con la presencia de placa y cálculo,
pero no tiene predilección por ningún género.
Las especies de microorganismos que están involucrados son: Porphyromonas
gingivalis, T. Forsythensi y Prevotella intermedia; en menor número de casos se
encuentra Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum spp,
Selenomonas noxia, Peptostreptococos micros y Treponema dentícola.
La microbiota no habitual encontrada en la cavidad oral comprende a
Acinetobacter spp, Pseudomonas aureginosa, Enterobacter cloacae, Klebsiella
pneumoniae, Estaphylococos aureus, Estaphylococos epidermidis, Enterococos spp, e
incluso Cándida albicans.
2.2. Porphyromona gingivalis
Menciona (Ramos A. , 2012) que dentro de los microorganismos presentes en la
placa subgingival, el predominante es Porphyromona gingivalis un bacilo Gram
negativo, anaerobio estricto que aprovecha las condiciones que le da el huésped para
generar mayor daño.
2.2.1. Descripción Morfológica
Manifiesta (Guilarte & Perrone, 2005) que es el segundo periodonto patógeno
que sigue siendo estudiado con intensidad, anteriormente fueron ubicadas dentro del
género Bacteroides, P. gingivalis es el microorganismo más patógeno dentro del grupo
de Bacilos Anaerobios Gram Negativos, relacionado al gran número de factores de
virulencia que esta bacteria posee.
Además menciona (Ramos, Moromi, & Martínez, 2011) que P. gingivalis es un
bacilo Gram negativo pequeño pleomórfico o (cocobacilos), no móvil, anaerobio
estricto, asacarolítico es decir que carecen de metabolismo fermentativo, no es
10
esporulado y no presenta flagelos, forma colonias lisas de coloración verdosas, pardas o
negras debido a la hemina que almacena en la superficie celular. Las células de la
Porphyromonas gingivalis tienen un diámetro de 0.5 - 0.8 μm por 1.0 - 3.5 μm de largo.
La Porphyromonas gingivalis es generalmente hallada en pacientes jóvenes con
gingivitis, y pacientes adultos con periodontitis, mediante métodos inmunológicos y de
biología molecular (PCR).
2.2.2. Nutrición
Mencionan (Ramos, Moromi, & Martínez, 2011) que Porphyromona gingivalis, es
considerado un colonizador secundario, anaerobio estricto, comensal del surco gingival
por lo que coloniza sitios en donde la tensión de oxígeno es baja, pero en los cuales hay
sustratos abundantes de nitrógeno. El medioambiente ideal para esta especie es el
ecosistema subgingival, ya que, el potencial redox es bajo (y más bajo aun en bolsas
periodontales), y posee nutrientes endógenos ricos en péptidos y aminoácidos.
Requiere de hierro para crecer, pero cuando hay ausencia de hierro en el
ecosistema de poros de la bacteria utiliza hemina.
2.2.3. Factores de virulencia
2.2.3.1 La cápsula: Desempeña un papel importante dentro de la evasión del sistema
inmunológico, al ser un gen codificante de epimerasa epsC. Media la adherencia inte-
especies y reduce la respuesta pro-inflamatoria. Las cepas encapsuladas de P. gingivalis
son más resistentes a la fagocitosis, a la degradación y, generan más baja inducción de
la vía interna del complemento. Las cepas no encapsuladas causan abscesos localizados
no invasivos, mientras que las cepas capsuladas son invasivas. (Ramos, Moromi, &
Martínez, 2011) (Orrego, Parra, Salgado, Muñoz, & Fandiño, 2015).
2.2.3.2 Endotoxina: (LPS) Se encuentra en la membrana externa, compuesta por el
lípido A. Interrumpiendo en la homeostasis inmunológica del huésped. Son
considerados un potente factor virulento porque inducen alteraciones y destrucción del
tejido periodontal que incluye pérdida de inserción, degradación del colágeno y pérdida
11
de hueso alveolar. Además, los LPS pueden migrar a otros tejidos a través de la
circulación y ocasionar otras patologías como ateroesclerosis, nacimientos pretérmino,
alteraciones respiratorias y cardiovasculares. (Ramos, Moromi, & Martínez, 2011)
(Orrego, Parra, Salgado, Muñoz, & Fandiño, 2015).
2.2.3.3 Vesículas de membrana externa: Tienen un diámetro que varía entre 30 y 100
nm; sirven como puente de coagregación y son un importante factor en la colonización
en la cavidad oral. Se encuentran en la parte más externa de la bacteria encerrados a
manera de saco, dentro de ellas encontramos enzimas como: proteasas, fosfatasa
alcalina, lipopolisacaridos, hemolisinas.
Cuando las vesículas de la membrana externa son secretadas ingresan a las
células epiteliales del hospedero a través de endocitosis, las proteasas gingipain
encontradas en las vesículas degradan al receptor de transferrina asi como también a las
moléculas de señalización relacionadas con integrinas como paxilina y con quinasa de
adhesión focal. Estos procesos degradativos provocan bajos niveles de transferrina
intracelular y generan migración de la migración celular. Siendo las vesículas potentes
factores de virulencia. (Ramos, Moromi, & Martínez, 2011) (Orrego, Parra, Salgado,
Muñoz, & Fandiño, 2015).
2.2.3.4 Hemaglutininas: Favorecen la colonización por medio de la unión bacteriana a
los receptores oligosacáridos de las células humanas, al ser proteínas que son
codificadas por el gen hag. (Ramos, Moromi, & Martínez, 2011).
2.2.3.5 Fimbrias: Mencionan (Orrego, Parra, Salgado, Muñoz, & Fandiño, 2015) que
las fimbrias que posee P. gingivalis son apéndices filamentosos adhesivos de naturaleza
proteica, siendo FimA el principal componente de las fimbrias, esta proteína media la
adherencia a componentes de las matriz extracelular, a otras células bacterianas e
incluso a células de la inmunidad innata. Las proteínas FimB, FimC y FimE, con pesos
moleculares de 50, 80 y 60 kDa respectivamente y constituyen el 1% de los
componentes de la fimbria.
(Ramos, Moromi, & Martínez, 2011) asimismo mencionan que dentro de sus
características, destaca la capacidad de poder unirse a moléculas, sustratos y células
12
tales como: lactoferrina, fibronectina y fibrinógeno. Asimismo posee propiedades de
inducción de citoquinas y quimiotaxis.
2.2.3.6 Proteínas cisteinproteasas: Provocan daño al huésped, al degradar diferentes
tipos de colágeno, de modo que proporcionan nutrientes que facilitan el crecimiento
bacteriano. El 85% de actividad proteolítica que produce la P. gingivalis y el 100% de
la actividad de tipo tripsina se debe a la proteína denominada gingipaina.
Las serín y cisteín proteasas, las dos principales clases de proteasas, degradan
caseína, gelatina, fibronectina, lisozima, colágeno tipo I, II, III, y IV, factores del
complemento C3, C4, C5, C5a, albúmina, hemopepsina, haptoglobina, transferrina,
alfa-1-antitripsina, alfa–2–antiplasmina, alfa–2– microglobulina y antitrombina (20, 21)
y, también, degradan inmunoglobulinas del hospedero.
En general, las proteasas de P. gingivalis cumplen las siguientes funciones: hidrolizan
proteínas para proporcionar aminoácidos a la bacteria, neutralizan el sistema inmune del
hospedero, degradan el tejido de soporte periodontal, activan pro-colagenasas del
hospedero, median la adhesión a eritrocitos y a otras células, favorecen la adherencia,
pueden modificar los receptores para las bacterias en superficies orales y modular así la
fijación de otras bacterias y su colonización en sitios subgingivales. (Orrego, Parra,
Salgado, Muñoz, & Fandiño, 2015)
También menciona (Frohlich, y otros, 2013) que la gingipaina es considerada
como el principal contribuyente del potencial patógeno de P. gingivalis. La gingipaina
coadyuva a la virulencia de la bacteria en diferentes maneras tales como la mejora de la
permeabilidad vascular, genera fluido crevicular proveyendo de factores esenciales para
el crecimiento de la bacteria, activa el sistema de coagulación y sistema calicreina-
quinina, degradación de fibrinógeno, fibronectina y unión de células epiteliales.
2.2.3.7 Proteinasas no cisteinproteasas: Dentro de las cuales están: proteasa,
colagenasa, hemaglutinina y periodontaina. Podemos destacar a la periodontaina como
la encargada de degradar proteínas desnaturalizadas y los polipeptidos (Ramos,
Moromi, & Martínez, 2011).
13
2.2.3.8 Inductor de metaloproteinas de la matriz: Metaloproteinasas encargadas de
degradar gran parte de moléculas de la matriz extarcelular como: fibronectina, laminina
y el colágeno. Es importante mencionar que no son producidas por P. gingivalis pero si
induce para que sea producida por los leucocitos, macrófagos y fibroblastos. P.
gingivalis actua a nivel de los inhibidores tisulares de metaloproteinasas tipo I
inactivandolos, lo que se relaciona con la eliminación de la fibronectina y el colágeno
tipo I (Ramos, Moromi, & Martínez, 2011).
2.3. USO DE ANTISÉPTICOS CONVENCIONALES EN PERIODONCIA
Tanto como para la eliminación y control de la enfermedad periodontal crónica y
otras formas de periodontitis el tratamiento se basa en la remoción del biofilm supra y
subgingival, la fisioterapia, la motivación del paciente y el control del índice de higiene
oral. Asimismo como coadyuvante del tratamiento podemos emplear antisépticos y
antimicrobianos tanto sistémicos como locales (Del Río, 2006).
2.3.1 Clorhexidina
(Torres, Díaz, & Acosta, 2009) Afirman que en la década de los 40 mientras se
realizaban investigaciones sobre la malaria por Imperial Chemical Industries en
Inglaterra, científicos desarrollaron compuestos denominados polibiguanidas, que
demostraron un alto espectro antibacteriano. Se empezó a usar desde 1954.
Fue utilizado en Odontología para desinfección de la boca y Endodoncia, los
estudios realizados por Löe y Schiott en 1970 introdujeron a la Clorhexidina en la
Periodoncia.
Según (Basconez, Mudarra, & Perea, 2002) es considerado un antiséptico de
segunda generación, y amplio espectro. Tiene una amplia utilización al ser el agente
más efectivo para el control de la periodontitis. El mecanismo de acción se basa en la
reducción de la película adquirida y del crecimiento bacteriano.
2.3.2 Composición
14
También mencionan (Torres, Díaz, & Acosta, 2009) que es una base dicatónica,
con un pH superior a 3,5 en cada extremo del puente de hexametileno tiene dos cargas
positivas lo que la hace muy interactiva con los aniones. Es esta naturaleza dicatiónica
la que la hace extremadamente interactiva con los aniones, lo que es relevante para su
eficacia, seguridad, efectos secundarios locales y dificultad para formularla en
productos. Aunque es una base, la clorhexidina se mantiene más estable en forma de sal
y la preparación más común es la sal de digluconato por su alta solubilidad en agua.
2.3.3 Mecanismo de acción
(Torres, Díaz, & Acosta, 2009) mencionan que actúa contra la pared celular de
los microorganismos causando alteraciones en la movilidad electroforética de todo el
microorganismo, la membrana plasmática resulta extruida ya que se pierde el equilibrio
osmótico, se forman vesículas y se precipita el citoplasma. Estas precipitaciones inhiben
la reparación de la pared celular y causan la muerte de las bacterias. La principal
característica de la capacidad bactericida es la unión a las proteínas a través de los
grupos carboxilos y otras moléculas con similares grupos, lo cual inhibe las funciones
biológicas relacionadas.
En las bacterias Gram (-), la clorhexidina afecta a la membrana exterior
permitiendo la liberación de enzimas periplasmicas. La membrana interna de estos
microorganismos no es destruida, pero si es impedida la absorción de pequeñas
moléculas.
Una de las principales ventajas que posee la clorhexidina es la sustantividad es
decir la capacidad que tiene este agente antiséptico de unirse a distintas localizaciones
de la boca, para liberarse lentamente de forma activa manteniendo niveles terapéuticos
hasta 24 horas después de haberse aplicado.
2.3.4 Concentraciones
(Torres, Díaz, & Acosta, 2009) afirman también que se presenta en dos
concentraciones al 0,12% y al 0,2%. Se recomienda administrar 10ml cuando es una
concentración al 0,2 y de 15ml cuando es al 0,12%. Esto es debido a la dosis total de
15
clorhexidina, ya que 10ml al 0,2 % libera 20mg, y 15ml al 0,12% libera 18mg,
observándose que los resultados con ambas concentraciones son igual de efectivas.
2.3.5 Presentaciones
(Torres, Díaz, & Acosta, 2009) mencionan además que las presentaciones más
usadas son: Colutorios. En dos concentraciones 0,12% y 0,2%. Gel. Al 0,2 % o al
0,12% para aplicación en localizaciones concretas.
2.3.6 Reacciones adversas
Decoloración a nivel de las piezas dentarias.
Alteraciones en el sentido del gusto.
Pigmentaciones dentarias y/o en restauraciones.
Irritación de la lengua. (Basconez, Mudarra, & Perea, 2002)
2.4. FITOTERAPIA
Menciona (Montenegro, 2014) que a través del desarrollo de la tecnología de la
industria farmacéutica, se ha formado un gran interés por parte de investigadores por
encontrar en distintas sustancias naturales efectos antimicrobianos. Los fármacos que
se derivan a base de productos naturales tienen una gran ventaja en comparación a los
tratamientos de origen químico. Las plantas poseen principios activos equilibrados
biológicamente por sustancias complementarias que se potencian, de forma tal que no
se acumulan en el organismo y sus efectos indeseables están limitados.
Según la OMS, 2007 aproximadamente el 25% de los fármacos que se
comercializan en la actualidad tienen un origen vegetal y un 25% poseen componentes
vegetales químicamente modificados (Del Río, 2006).
En la Odontología el gran crecimiento de la fitoterapia tanto en programas
preventivos como curativos ha motivado la investigación, con el fin de corroborar la
16
actividad antimicrobiana de diferentes derivados de especies vegetales y a la vez
disminuir la incidencia de enfermedad periodontal y caries (Montenegro, 2014).
2.4.1. Extractos vegetales
Mencionan (Lizcano & Vergara, 2008) a un extracto como un concentrado de
una combinación compleja, que se lo puede obtener mediante procesos físicos y
químicos de una fuente natural como plantas secas o frescas con solventes apropiados
como son agua, etanol y éter. Los extractos están constituidos por una serie de
compuestos químicos y microbiológicos conocidos como metabolitos primarios y
secundarios, que se los puede emplear de diferentes maneras.
A los principios activos de las plantas se los conocen como metabolitos
secundarios, que son compuestos que poseen una estructura química compleja,
distribución restringida y características específicas, mientras que los metabolitos
primarios están distribuidos universalmente y participan en la actividad celular.
2.4.1.1 Extracto etanólico
Un extracto etanólico es caracterizado por tener un olor característico, se lo
obtiene a partir de las partes desecadas de una especie vegetal, a través de procesos de
percolación o maceración en contacto con etanol, seguido de un proceso físico para la
eliminación de dicho solvente.
La percolación se la realiza en envases llamados (percoladores) que poseen dispositivos
de carga y descarga, obteniendo la totalidad de los componentes activos y permite
conocer la concentración exactas de los mismos (Lizcano & Vergara, 2008).
2.4.2. Botoncillo
Nombre científico: Acmella repens (Walter Rich).
Clasificación científica:
Familia: Asteraceae
Género: Acmella
17
Especie: repens (Cerón, 2003)
Figura 1. Botoncillo en estado silvestre
Fuente: Autora
2.4.3. Nombres comunes
De acuerdo a la región donde se encuentra la planta se le han asignado distintos
nombres, como son: Botoncillo, sésa, botón de oro, chisacá, guaca, risaca, quemadera,
yuyo, quemado (Valdivia & Párraga, 2011).
2.4.4. Descripción botánica
Hojas: Verdes oscuras, pequeñas y ovaladas con peciolos entre 0,8 y 4cm de
largo y entre 0,4 y 1,9 de ancho.
Flores: Amarillas, parecidas a botones, con receptáculos bastante convexos.
Tamaño: Hierba baja, alcanza una altura máxima de 30 cm, crece en lugares
húmedos.
Las hojas, flores y ramas son picantes al masticarlas y adormecen la mucosa
bucal (Acosta, 1992).
18
Figura 2. Flor de Botoncillo en estado silvestre Fuente: Autora
2.4.5. Origen y hábitat
(Valdivia & Párraga, 2011) (Dubey, Maity, & Singh, 2013) afirman que
Acmella repens, es una planta silvestre, se caracteriza por ser una hierba rastrera o
postrada que crece en las partes húmedas de la región interandina del Ecuador, Perú y
Colombia, y en los trópicos y subtrópicos de la India, aunque también tolera climas
secos. Crece en todo tipo de suelos y viven usualmente cerca de acequias, canales de
riego, pastizales, caminos y potreros. Se lo puede encontrar desde los 300 hasta 3400
msnm.
2.4.6. Usos etnomedicinales
(Sulca, 2010) Manifiesta: “Las hojas y las flores de botoncillo (Acmella repens)
se mastican para endurecer y blanquear los dientes, y mantener sanas las encías”.
(Dubey, Maity, & Singh, 2013) mecionan al Botoncillo como una importante
planta medicinal conocida como la “planta del dolor de muela” que se asocia a la
disminución del dolor dental, así como al incremento de saliva.
Considerada una planta caliente, se usa la infusión de la planta para aliviar el
dolor de muelas, de boca y garganta. Las hojas y flores masticadas de la planta se usan
para tratar heridas infectadas en la boca.
19
(Acosta, 1992) menciona que las hojas y flores son un buen dentífrico si se las
mastica bien. Puede ser útil para las enfermedades de la piel en aplicaciones externas
como ungüento utilizadas en estado fresco.
También mencionan (Valdivia & Párraga, 2011) que con la infusión fría de las
flores y hojas se hacen gárgaras para aliviar el dolor dental. Las flores hervidas en
infusión se toman como analgésico para el dolor estomacal y para tratar la diarrea.
Masticar las hojas y flores de la planta previene la gingivitis, periodontitis y caries.
De igual manera (Dubey, Maity, & Singh, 2013) manifiestan que esta planta es
usada tradicionalmente para el dolor dental, dolor de garganta, infecciones de las encías,
enfermedades periodontales, parálisis de la lengua, usada también para la estomatitis.
En la India las cabezas de las flores se usan en los niños para la tartamudez.
Por otra parte (Acosta, 1992) mencionó que la solución amarga y prolongada es
usada para curar o combatir la diabetes. Se aprecia que las ulceras y heridas bucales en
diabéticos cicatrizan con mayor rapidez. Se usan las ramillas machacadas y cocidas
como una bebida para curar enfermedades hepáticas.
2.4.7. Propiedades Medicinales
2.4.7.1. Antimicótico
(Dubey, Maity, & Singh, 2013) enunciaron que diferentes concentraciones del
extracto de Botoncillo en algunos tipos de hongos tales como spergillus niger,
Aspergillus parasiticus, Fusarium oxysporum, Fusarium moniliformi y Candida
albicans mostraron un gran halo de inhibición en pruebas in vitro. (García, 1975)
mencionado por (Valdivia & Párraga, 2011) sostiene que el extracto alcohólico de
Botoncillo, muestras resultados favorables para el tratamiento de micosis como el pie de
atleta, y de virus como herpes simple y herpes zoster, al ser aplicado en las zonas
afectadas un máximo de tres veces al día.
20
2.4.7.2. Antimicrobiano
Estudios realizos in vitro muestran que Botoncillo tiene efecto antibacteriano
fuerte contra patógenos como Escherichia coli, Klebsiella neumoniae, Proteus vulgaris,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella gallinarium y Albus aureus. Asi como también
para Candida albicans, hongo responsable de la candidiasis (Valdivia & Párraga,
2011).
2.4.7.3. Antiséptico
(Valdivia & Párraga, 2011) afirman que el sphilantol encontrado en el
Botoncillo es un alcaloide antiséptico, estimulante a nivel del sistema inmune, eficaz
contra parásitos de la sangre como el Plasmodium ya que inhibe la producción
proinflamatoria del mediador de los niveles transcriptivos y de traslocación, además
encontramos thymol un derivado fenólico que tiene propiedades antisépticas y
desinfectantes importantes, controla los ácaros, previene la formación de moho, mata
esporas fúngicas, tratamiento de infecciones de tiña, infecciones de la piel y heridas
pequeñas.
2.4.7.4 Propiedades odontálgicas
(Valdivia & Párraga, 2011) (Dubey, Maity, & Singh, 2013) refieren que colocar
la inflorescencia en la cavidad dental afectada alivia el dolor, los enjuagues bucales
elaborados con las flores curan las afecciones bucales, de manera especial las aftas.
En el caso de las aftas bucales se nota una disminución marcada del dolor, al
desaparecer la acción del extracto no regresa la intensidad inicial; el eritema disminuye
a las 24 horas; a las 36 horas pierde su acción necrótica, aumenta la tolerancia a
estímulos mecánicos. El periodo evolutivo se reduce al 50%.
(Coelho, 1992) mencionado en (Valdivia & Párraga, 2011) afirman que el
spilanthol encontrado, por sus propiedades sobre la mucosa bucal es utilizada en la
elaboración dentífricos en una proporción del 0,001.
21
2.4.7.5. Expectorante
Las hojas de Acmella repens, son utilizadas en la elaboración de jarabes
antitusígenos para combatir la bronquitis, la gripe, la tos, la tuberculosis y el asma
(Valdivia & Párraga, 2011).
2.4.7.6. Suplemento alimentario
Los estudios muestran que presenta aminoácidos, responsables de la formación
de proteínas. La planta presenta ß-caryophyllene, mismo que es un aditivo alimenticio
aprobado por la FDA para el consumo diario, conocido como el primer cannabinoid
dietético (Valdivia & Párraga, 2011).
2.4.7.7. Antirreumático
Al presentar propiedades antiinflamatorias y analgésicas se utiliza el triturado de
la planta para el reumatismo, obteniendo un alivio temporal significativo del dolor, al
ser aplicados en personas de la tercera edad (Valdivia & Párraga, 2011).
2.4.7.8. Diurético
Se ha demostrado que tiene una acción diurética potente usando las flores
frescas en una sola toma, con una efectividad igual a la furosemida, en ambos casos se
incrementan los niveles de K+ y Na
+ con una rápida y larga duración (Dubey, Maity, &
Singh, 2013).
2.4.7.9. Analgésico y Antiinflamatorio
Presenta una potente acción analgésica y antiinflamatoria, atribuida a la
presencia de flavonoides que son inhibidores de prostaglandinas en etapas agudas
posteriores al proceso de inflamación y la percepción del dolor. (Valdivia & Párraga,
2011).
22
2.4.7.10. Anestésico
Mediante procesos de separación de cromatografía en columna se determinó un
líquido viscoso de color amarillo con clara acción anestésica sobre la mucosa oral. Fue
probado de dos diferentes maneras, intercutánea en conejillos de indias y en el plexo de
ranas, determinando una acción muy potente (Valdivia & Párraga, 2011) (Dubey,
Maity, & Singh, 2013).
2.4.8. Características químicas
(Dubey, Maity, & Singh, 2013) mencionan que resulta necesario explorar los
componentes fitoquímicos de una planta medicinal para establecer una relación entre su
química y farmacología. Se han llevado a cabo varios estudios sobre el Botoncillo, para
determinar los componentes químicos que este posee.
El principal componente estudiado es el Spilanthol, que le da a la planta el sabor
picante o punzante y otorga propiedades anestésicas, encontrado principalmente en las
flores y las partes aéreas. La fórmula molecular del Spilanthol fue determinada como
(2E,6Z,8E)-N isobutylamida 2,6,8-decatrienamida.
Gráfico 1. Fórmula molecular spilanthol
Fuente: (Dubey, Maity, & Singh, 2013)
Estudios realizados en el Perú por la Universidad Nacional Daniel Alcides
Carrión permitieron identificar la presencia de aminoácidos, alcaloides, flavonoides,
esteroides y triterpenoides además de principios activos específicos como Spilanthol, ß-
caryophyllene, thymol, germacrene, limoneno y ˠ-cadideno. Atribuyendo a la planta
propiedades alimenticias y medicinales con potencial farmacológico que motivan a una
investigación más especializada (Valdivia & Párraga, 2011).
23
2.4.8.1. Alcaloides: Tienen la capacidad de inhibir en los ácidos nucleicos la
biosíntesis, son compuestos orgánicos utilizados en enfermedades en el sistema
respiratorio y nervioso, además de presentar efectos antimicrobianos. Es utilizado en
las poblaciones aborígenes como anestésico local (Lizcano & Vergara, 2008).
2.4.8.2 Flavonoides: Compuestos encontrados en las hojas de las plantas, que presentan
acción antialérgica, anticancerígena, antitrombótica, analgésica, antimicrobiana, además
de proteger la mucosa gástrica y el hígado. (Ramos A. , 2012).
2.4.8.3 Glucósidos: Por acción hidrolítica dan glucosa y otro tipo de sustancias. Pueden
ser utilizados en dosis pequeñas en medicina (Sulca, 2010).
2.4.8.4 Taninos: Considerados compuestos hidrosolubles, hidrofenólicos de áspero y
amargo sabor. Prescritos en la medicina por su acción hemostática, astringente,
tonificante y antiséptica. La función antibacteriana es producida al privar a los
microorganismos de su medio apropiado para el desarrollo (Montenegro, 2014).
2.4.8.5 Triterpenoides y Esteroides: Se ha demostrado que estas sustancias tienen una
acción biológica variada como es antitumoral, analgésica, antiséptica, citotóxica,
antiséptica y antibacteriana, dentro de los terpenos que contiene la planta se encuentra el
ß-caryophyllene con fórmula C15H24 se une de manera selectiva al type-2 del receptor
de cannabinoid (CB2) y ejerce efectos antiinflamatorios singinificativos en ratones
(Sulca, 2010) (Valdivia & Párraga, 2011).
2.4.9. Mecanismo de acción
(Castro, Torres, Núñez, & Gonzalez, 2013) afirman que las bacterias Gram
negativas son más complejas que las Gram positivas, tanto estructuralmente como
químicamente. La estructura de la pared celular de las bacterias Gram negativas
contiene dos capas externas de membranas citoplasmáticas. Inmediatamente después de
la membrana citoplasmática hay una delgada capa de peptidoglicano. El área
comprendida entre la superficie externa de la membrana citoplasmática y la superficie
interna es conocida como espacio periplasmico. Este espacio contiene gran cantidad de
24
enzimas hidrolíticas involucradas en el metabolismo celular. En los microorganismos
Gram negativos los factores de virulencia son encontrados en este espacio.
Más de 10000 metabolitos secundarios se han aislado con acción antibacteriana
y antiséptica importante de especies vegetales. El mecanismo de acción bacteriana del
Botoncillo no está del todo clara pero se hace referencia a que actúa principalmente en
la perturbación o la desintegración de las estructuras de las células, destrucción o
inactivación de material genético y coagulación del contenido celular.
25
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
Prospectivo: Los resultados obtenidos se obtuvieron luego de realizado el
ensayo.
Comparativo: Porque se comparó los grupos de estudio y se a establecieron
relaciones o diferencias.
Experimental In vitro: Para evaluar el efecto inhibitorio del extracto
etanólico del Botoncillo ante la cepa de Porphyromona gingivalis ATCC®
33277™ se manipuló en el laboratorio las variables para el presente estudio.
Analítico: Porque se analizó las propiedades antibacterianas que presenta la
especie vegetal a ser utilizada.
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA
Población: 28 cajas Petri inoculadas de Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™.
Muestra: 24 cajas Petri inoculadas de Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™.
3.2.1 Tipo de muestreo:
La metodología usada en la presente investigación es no probabilística por
conveniencia, debido a que antes de incluir a las cepas en el presente estudio, se
determinó si cumplía con los criterios de inclusión.
3.2.2 Unidad de muestra
Se utilizó cepas de Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™ identificadas
previamente por laboratorios Microbiologics e importadas por Medibac – Inc S.A.
26
3.2.3 Calculo de la muestra:
q = 1 – p
Población Finita
Cuando se conoce cuántos elementos tiene la
población
Parámetros Valores
N = Universo 26
Z = nivel de confianza 1,96
e = error de estimación 0,05
p = probabilidad a favor 0,5
q = probabilidad en contra 0,5
n = tamaño de la muestra 24,35
3,8416 x 0,5 x 0,5 x 26
26 x 0,0025
+ 3,8416 x 0,5 x 0,5
3,8416 x 0,25 x 26
0,065
+ 0,9604
24,9704
1,0254
n = 24,35
n = 24
n =
n =
n =
qpZeN
NqpZn
***
***22
2
27
El resultado del cálculo de la muestra en el presente estudio indica que se emplearan
24 cajas Petri, para que los resultados tengan un 95% de confianza y un 5% de margen
de error.
De manera que se colocaron 3 discos blancos embebidos de cada extracto y 2 discos
blancos de las sustancias control en las cajas Petri, y se realizaron 24 repeticiones, con
un total de 72 ensayos del grupo experimental.
3.3 Criterios de Inclusión y Exclusión
3.3.1. Criterios de inclusión
Extractos etanólicos de Botoncillo (Acmella repens) al 25%, 50% y
100%.
Cajas Petri con agar sangre de cordero inoculadas con Porphyromona
gingivalis ATCC® 33277™ que no hayan sufrido contaminaciones.
3.3.2. Criterios de exclusión
Cajas Petri con agar sangre de cordero inoculadas con Porphyromona gingivalis
ATCC® 33277™ que hayan sufrido contaminaciones y alteraciones durante el
procedimiento.
3.4 Variables
3.4.1 CONCEPTUALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
3.4.1.1 Variables independientes:
Extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) en diferentes
concentraciones: preparado de Botoncillo (Acmella repens), planta silvestre con
propiedades medicinales y caracterizada por tener una inflorescencia amarilla en
28
forma de botón, elaborado en el Departamento de Ofertas Servicios y Productos
(OSP) de la Facultad de Química de la Universidad Central del Ecuador,
mediante el método de percolación, utilizando como solvente etanol. Con las
siguientes concentraciones al 25%, 50% y 100% (Roldan, 2015).
Gráfico 2. Concentraciones extractos
Fuente: Ing. Bq. Roldan Darwin
3.4.1.2 Variables dependientes:
Efecto antibacteriano del extracto etanólico de Bontocillo (acmella repens)
sobre Porphyromonas gingivalis: Capacidad de inhibir o limitar el crecimiento y
desarrollo de la bacteria Porphyromonas gingivalis (Winn, y otros, 2008).
3.4.1.3 Variables de control
Control positivo: Clorhexidina 0.12%.
Compuesto químico sintético de acción bactericida, y amplio espectro
perteneciente al grupo de las biguanidas, considerada medicamento esencial por
la OMS. (Torres, Díaz, & Acosta, 2009)
25%
• 25% extracto etanólico
• 75% agua estéril
50%
• 50% extracto etanólico
• 50% agua estéril
100%
• 100% extracto etanólico
(75grs planta - 150ml etanol)
29
Gráfico 3. Fórmula molecular Clorhexidina
Fuente: (Basconez, Mudarra, & Perea, 2002)
Control negativo: Suero fisiológico
Conocido también como solución salina normal, es una solución estéril que
contiene cloruro de sodio al 0,9%.
30
3.4.2. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
Variable
independiente
Definición
operacional
Indicadores Tipo de
variable
Escalas
Extracto etanólico
de botoncillo
(Acmella repens) en
diferentes
concentraciones.
Obtener la solución
por percolación en
tres concentraciones.
Concentraciones
al 25%, 50% y
100%.
Ordinal Ordinal
Variable
dependiente
Definición
operacional
Indicadores Tipo de
variable
Escalas
Efecto
antibacteriano del
extracto etanólico
de botoncillo
(Acmella repens)
sobre
Porphyromona
gingivalis
Capacidad que limita
el crecimiento y
desarrollo de
Porphyromona
gingivalis. Dato que
se obtiene mediante la
observación de las
placas Petri y
medición en mm.
Halos de
inhibición.
Milímetros (mm)
S. Nula
< 8mm
S. límite
9-14mm
S. sensible
≥ 20mm
Nominal Nominal
Variables de
control
Definición
operacional
Indicadores Tipo de
variable
Escalas
Clorhexidina al
0,12% (control
positivo)
Capacidad que limita
el crecimiento y
desarrollo de
Porphyromona
gingivalis. Dato que
se obtiene mediante la
observación de las
placas Petri y
medición en mm.
Halos de
inhibición.
Concentración de
Clorhexidina al
0,12%. (mm)
S. Nula
< 8mm
S. límite
9-14mm
S. sensible
≥ 20mm
Nominal Nominal
Suero fisiológico
(control negativo)
Suero fisiológico
embebido en los
discos blanco que
actúa como sustancia
control.
Halos de
inhibición. Suero
fisiológico. (mm)
S. Nula
< 8mm
S. límite
9-14mm
S. sensible
≥ 20mm
Nominal Nominal
31
3.5 MATERIALES Y MÉTODOS
3.5.1 Recursos materiales
3.5.2 Infraestructura
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología de la Universidad
Central del Ecuador.
Laboratorio del Departamento de Ofertas Servicios y Productos (OSP) de la
Facultad de Química de la Universidad Central del Ecuador.
3.5.3 Materiales
Materiales de laboratorio para la creación de un ambiente de anaerobiosis:
Jarra de anaerobiosis (anaerojar 2.5lts-Oxoid)
Sobres generadores de anaerobiosis (anaerogen 2.5 lts).
Materiales de laboratorio para el cultivo de la muestra:
24 cajas Petri de agar sangre de cordero más hemina
10 tubos de ensayo con caldo BHI.
Materiales para la prueba de efecto antibacteriano:
Extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) al 25%, 50% y 100%.
Clorhexidina al 0,12 % (LIRA)
Suero fisiológico (Medi quin)
Discos blanco (CT998)
Estufa
Incubadora (Incucell)
Micropipeta digital de 10ul (Accumax PRO)
Mechero
Pinzas
Guantes
Mascarillas
32
Hisopos estériles
Campos estériles.
Material para la recolección de los datos:
Fichas con las lecturas de los halos de inhibición y registros de la CMI.
Figura 3. Material e instrumental para el estudio Fuente: Autora
3.6 PROCEDIMIENTO Y TÉCNICAS
3.6.1 Obtención del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens)
Fueron recolectadas plantas sanas sin síntomas de infecciones que no tengan
insectos, y ningún tipo de parásitos. Las muestras de la especie vegetal en estado
fresco, limpias y secas fueron enviadas al departamento de Ofertas Servicios y
Productos (OSP) de la Facultad de Química de la Universidad Central del Ecuador para
la preparación del extracto etanólico.
33
Mediante el método de percolación fueron elaborados extractos con las hojas y
flores del Botoncillo, a concentraciones de 25%, 50% y 100% y almacenadas en frascos
ámbar bajo refrigeración.
Figura 4. Extractos etanólicos de Botoncillo al 25%, 50% y 100% Fuente: Departamento de Ofertas Servicios y Productos de la U.C.E
3.6.2 Cepa bacteriana para el estudio
Se utilizó una cepa bacteriana ATCC® 33277™ (American Type Culture
Collection) de Porphyromonas gingivalis.
34
Figura 5. Cepa microbiológica de Porphyromona gingivalis ATCC 33277 Fuente: Autora
3.6.3 Reactivación de la cepa bacteriana
Se procedió a viabilizar la cepa bacteriana sembrando los cristales liofilizados
contenidos en el empaque Kwik-Stik, en caldo de tripticasa soya, el tubo fue llevado a
la jarra de anaerobiosis, para ser incubado a 35° por 7 días, comprobando mediante la
turbidez la re activación de la cepa.
3.6.4 Estandarización de la cepa bacteriana
Se diluyo la cepa incubada en un tubo de ensayo con 2ml de agua bidestilada,
hasta obtener una solución de Mc Farland 0,5.
35
Figura 6. Estandarización de la cepa Fuente: Autora
3.6.5 Determinación de la CMI
Se procedió a colocar 10ul de la solución obtenida de la estandarización de la
cepa bacteriana mediante la micropipeta en los tubos que contenían caldo BHI
debidamente rotulados, y 20 ul de cada uno de los extractos etanólicos de Botoncillo,
como control positivo Clorhexidina al 0,12% y como control negativo suero fisiológico,
se los llevo a la jarra de anaerobiosis y a la incubadora a 35° por 5 días, para determinar
mediante la turbidez y mediante esta la CMI.
36
Figura 7. A) Colocación de los extractos en los tubos con caldo BHI. B) Tubos con
extractos para ser incubados. C) Resultados de la prueba de turbidez Fuente: Autora
3.6.6 Colocación de los extractos en los discos blancos
Se aplicó las soluciones de los extractos de Botoncillo con concentraciones de
25%, 50% y 100% cada una en un disco blanco (CT998), mediante una micropipeta
digital de 10 ul.
Figura 8. A) Colocación de 20ml de los extractos en los discos blanco con la
micropipeta digital. B) Extractos colocados en el disco Fuente: Autora
37
3.6.7 Cultivo de la cepa de Porphyromona gingivalis ATCC® 33277™
Mediante un hisopo estéril se procedió a sembrar de manera uniforme en placas
de agar sangre de cordero y hemina mediante la técnica de diseminación, se colocaron
además los discos embebidos de los extractos discos blanco (CT998) en las placas de
agar sangre de cordero a una distancia no menor de 15mm entre sí y a 1,5 cm del borde
de la placa, luego fueron colocadas las placas en una jarra hermética con un generador
de anaerobiosis por 7 días a 35°.
Figura 9. A) Sembrado de la cepa bacteriana en las placas de agar. B) Colocación de las
placas Petri en la jarra de anaerobiosis Fuente: Autora
Figura 10. A) Ajuste de la temperatura de la incubadora a 35°. B) Colocación de los
medios de cultivo en la incubadora. Fuente: Autora
38
3.6.8 Evaluación del efecto antibacteriano del extracto frente a la cepa de
Porphyromonas gingivalis.
Se recolectaron los datos midiendo el halo de inhibición con una regla
milimetrada sobre la superficie de la placa Petri.
Figura 11. Medición de los halos de inhibición Fuente: Autora
3.6.9 Eliminación y manejo de desechos
Los residuos patológicos que se generaron en el presente anteproyecto se los
clasifico como Tipo A.2 ya que son microrganismos y medios de cultivo provenientes
de un laboratorio de investigación. Estos residuos y el material utilizado fueron
desinfectados mediante el uso de agentes químicos (glutaraldehído, hipoclorito de
sodio) y autoclave, previo a su eliminación como residuos patógenos en una bolsa roja
debidamente rotulada.
39
Figura 12. Autoclave
Fuente: Autora
3.7. ASPECTOS ÉTICOS
Al ser un estudio realizado en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Odontología de la Universidad Central del Ecuador con condiciones controladas, donde
no existe compromiso con seres vivos, únicamente con cepas biológicas que crecen en
un ambiente de anaerobiosis estricta y con materiales e instrumental de laboratorio, no
fue necesario un consentimiento informado.
40
CAPÍTULO IV
ANALISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
4.1 Recolección de los datos
4.1.1 Medición de los halos de inhibición
Se registraron los datos de los halos de forma manual, en fichas, mediante la ayuda de
una regla milimetrada, al cabo de los 7 días. Se midieron los halos formados alrededor
del disco, siendo esta zona directamente proporcional a las concentraciones del extracto.
Los datos obtenidos de la medición de los halos de inhibición, y turbidez se registraron
y organizaron en Microsoft Excel y se pueden observar en las tablas 1 y 2.
Figura 13. Halos de inhibición a los 7 días de incubación
Fuente: Autora
Clorhexidina
Extracto 100%
Extracto 25%
Extracto 50%
Suero Fisológico
41
EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIBACTERIANO DEL BOTONCILLO
(Acmella repens) SOBRE LA CEPA DE Porphyromona gingivalis TEST DE
DILUCIÓN EN CALDOS BHI
CONCENTRACIONES TUBOS CALDO BHI RESULTADO
Extracto de Botoncillo 25% 1 (-) 0
2 (+) 1
Extracto de Botoncillo 50% 3 (-) 0
4 (+) 1
Extracto de Botoncillo 100% 5 (-) 0
6 (-) 0
Clorhexidina 0,12% 7 (-) 0
8 (-) 0
Suero Fisiológico 9 (+) 1
10 (+) 1
Tabla 1. Crecimiento bacteriano (turbidez) en los tubos de caldo BHI. Crecimiento
bacteriano (+). Ausencia de crecimiento bacteriano (-)
Fuente: Autora
En el resultado de la Tabla 1 se observa que para el tubo 1 con extracto
etanólico de Botoncillo al 25% no hubo crecimiento bacteriano, mientras que para el
tubo 2 hubo crecimiento bacteriano. Para el tubo 3 con extracto etanólico de Botoncillo
al 50% hubo crecimiento bacteriano, mientras que para el tubo 4 no hubo crecimiento
bacteriano. Para los tubos 5 y 6 con extracto etanólico de Botoncillo al 100% no hubo
crecimiento bacteriano. Se observa que no hubo crecimiento bacteriano de la bacteria P.
gingivalis en los tubos 7 y 8 con Clorhexidina (control positivo). En los tubos 9 y 10
con suero fisiológico, (control negativo) hubo crecimiento de la bacteria P. gingivalis.
42
Gráfico 4. Ausencia de crecimiento bacteriano: 0. Presencia de crecimiento bacteriano:
1.
Fuente: Ing. Jaime Molina
El Gráfico 1. podemos observar que se representa con 0 la ausencia de crecimiento
bacteriano, mientras que 1 indica la presencia de crecimiento bacteriano para las
concentraciones de 25%, 50% y 100% de extracto etanólico, así como para las
sustancias empleadas como control positivo y negativo.
0
1
0
1
0 0 0 0
1 1
Extr
acto
de
Bo
ton
cillo
25
%
Extr
acto
de
Bo
ton
cillo
50
%
Extr
acto
de
Bo
ton
cillo
10
0%
Clo
rhe
xid
ina
Co
ntr
ol +
Sue
ro F
isio
lógi
coC
on
tro
l -
Crecimiento bacteriano
43
EVALUACIÓN DE EL EFECTO ANTIBACTERIANO DEL BOTONCILLO
(Acmella repens) SOBRE LA CEPA DE Porphyromona gingivalis TEST DE
DIFUSIÓN EN AGAR
N°
PLACA
AGAR
EXTRACTOS
BOTONCILLO
CONTROL + CONTROL -
25% 50% 100% Clorhexidina
0,12%
Suero
Fisiológico
1 0mm 0mm 12mm 26mm 0mm
2 0mm 0mm 11mm 27mm 0mm
3 0mm 0mm 12mm 25mm 0mm
4 0mm 0mm 10mm 26mm 0mm
5 0mm 0mm 11mm 24mm 0mm
6 0mm 0mm 11mm 27mm 0mm
7 0mm 0mm 10mm 27mm 0mm
8 0mm 0mm 10mm 26mm 0mm
9 0mm 0mm 9mm 27mm 0mm
10 0mm 0mm 12mm 28mm 0mm
11 0mm 0mm 10mm 26mm 0mm
12 0mm 0mm 11mm 24mm 0mm
13 0mm 0mm 12mm 26mm 0mm
14 0mm 0mm 10mm 28mm 0mm
15 0mm 0mm 9mm 28mm 0mm
16 0mm 0mm 11mm 28mm 0mm
17 0mm 0mm 10mm 26mm 0mm
18 0mm 0mm 12mm 27mm 0mm
19 0mm 0mm 10mm 27mm 0mm
20 0mm 0mm 10mm 26mm 0mm
21 0mm 0mm 10mm 29mm 0mm
22 0mm 0mm 11mm 26mm 0mm
23 0mm 0mm 12mm 26mm 0mm
24 0mm 0mm 9mm 26mm 0mm
Tabla 2. Medidas de los halos de inhibición que tuvieron los extractos en diferentes
concentraciones y las sustancias control, sobre la cepa de Porphyromonas gingivalis.
Fuente: Autora
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Estadística no paramétrica: Son procedimientos estadísticos para pruebas de hipótesis
que no requieren de la suposición de la normalidad de la población de la cual fue
extraída la muestra y se pueden aplicar a datos de tipo cuantitativo y cualitativo. Para
44
cuando se compara tres o más muestras se utilizan por lo general prueba de Kruskal
Wallis y cuando se tiene dos muestras se utiliza la prueba de U Mann Whitney.
Prueba de Kruskal-Wallis: Comparación entre las tres concentraciones de los
extractos etanólicos de Botoncillo, Clorhexidina al 0,12% y Suero fisiológico.
Ho (hipótesis nula): Las muestras proceden de poblaciones con la misma distribución
de probabilidad (Medias similares)
Ha: (hipótesis alternativa): Existen diferencias respecto a la tendencia central de las
poblaciones.
Gráfico 5. Resultados de la prueba de Kruskal-Wallis Fuente: Ing. Jaime Molina
De la Prueba de Kruskal-Wallis Sig. asintót. (p) = 0,000 es menor a 0,05 (95% de
confiabilidad), se acepta la Ha, debido a que existen diferencias respecto a la tendencia
central de las poblaciones. No todas las medias de las muestras son similares.
Para determinar cuáles son similares o diferentes se hace la prueba dos a dos:
45
Tabla 3. Comparación de los extractos etanólicos de Botoncillo por parejas. Fuente: Ing. Jaime Molina
De la prueba dos a dos se tiene que los valores de la muestra de Clorhexidina al
0,12% son los más altos, esto excepto con la muestra del extracto etanólico de
Botoncillo al 100% que aparentan ser similares. Para verificar si son similares estos dos
valores se realiza nuevamente la prueba entre la Clorhexidina al 0,12% y el extracto
etanólico de Botoncillo al 100%.
46
Prueba de U Mann Whitney: Comparación entre Extracto etanólico de botoncillo
al 100% y la Clorhexidina al 0,12%.
Ho: (hipótesis nula): Las muestras proceden de poblaciones con la misma distribución
de probabilidad (Medias similares)
Ha (hipótesis alternativa): Existen diferencias respecto a la tendencia central de las
poblaciones.
Gráfico 6. Rangos del extracto de Botoncillo al 100% y Clorhexidina al 0,12%
Fuente: Ing. Jaime Molina
En el gráfico de barras bidireccional, la frecuencia representa el valor de los
halos de inhibición de las dos sustancias que tuvieron efecto antibacteriano, que son el
extracto etanólico de Botoncillo al 100%. Demostrando que el halo de 12mm se repite 6
veces, 11mm se repite 6 veces, 10mm se repite 9 veces y 9mm se repite 3 veces,
mientras que Clorhexidina al 0,12% muestra halos de 24mm en 3 veces, 26mm se repite
10 veces, 27mm 6 veces, 28mm se repite 4 veces y 29mm se repite una vez.
47
Gráfico 7. Resultado de las prueba de U Mann Whitney Fuente: Ing. Jaime Molina
De la Prueba de U Mann Whitney Sig. asintót. (p)= 0,000 es menor a 0,05 (95% de
confiabilidad), es decir se acepta la Ha, puesto que existen diferencias respeto a la
tendencia central de las poblaciones. Las muestras son diferentes, se tiene valores de
inhibición más altos en la Clorhexidina al 0,12% que en el extracto etanólico de
Botoncillo al 100%.
Gráfico 8. Media de los halos de inhibición de los extractos y sustancias de control Fuente: Ing. Jaime Molina
0,0 0,0
10,6
26,5
0,0
Extracto deBotoncillo 25%
Extracto deBotoncillo 50%
Extracto deBotoncillo 100
%
Clorhexidina SueroFisiológico
Media Extractos, Clorhexidina y suero fisiológico
48
Se observa en el Gráfico 6 que la media de inhibición para el extracto etanólico de
Botoncillo al 25% es 0, para el extracto etanólico de Botoncillo al 50% es 0, para el
extracto etanólico de Botoncillo al 100% es de 10,6. Para el control positivo
Clorhexidina 0,12% es 26,5%. Y para el control negativo suero fisiológico es 0.
DISCUSIÓN
Este proyecto de investigación permitió determinar in vitro que el extracto
etanólico de Botoncillo, posee actividad antibacteriana sobre la cepa de Porphyromonas
gingivalis mediante el Test de difusión en Agar con discos y con la prueba de dilución
en medio líquido. Se determinó en este último estudio que la concentración mínima
inhibitoria (CMI) fue el extracto etanólico al 100%.
Los resultados obtenidos de este proyecto de investigación, no se pueden
comparar con resultados de otras investigaciones a nivel de bacterias periodonto
patógenas orales, pues no existen trabajos con Porphyromonas gingivalis en los que se
haya empleado el extracto de Botoncillo.
Estudios in vitro realizados por otros investigadores (Valdivia & Párraga, 2011)
indican que la acción antibacteriana del Botoncillo a nivel de patógenos comunes, como
Escherichia coli, Klebsiella pnumoniae, Proteus vulgaris da buenos resultados, siendo
estos microorganismos Gram negativos y anaerobios facultativos, concordando con los
resultados obtenidos para la Porphyromona gingivalis que es una bacteria Gram
negativa, anaerobia estricta.
Un estudio in vitro realizado en la India por (Sathyaprasad & Chandra, 2015)
utilizando como medicación intraconducto en concentraciones de 2%, 5% y 10% de
Botoncillo con éter de petróleo como solvente, mostro mejor actividad antibacteriana
frente a Enterococcus faecalis comparada con Hidróxido de Calcio (CaOH)2. Mientras
que en nuestro estudio pesé a que se mostró que el extracto etanólico Botoncillo
presenta actividad antibacteriana al igual que dicho estudio, no fue mejor comparada
con la sustancia estándar o control positivo que es Clorhexidina 0,12 (LIRA®) y la
única concentración con efecto antibacteriano fue al 100%.
49
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación se puede concluir
que:
1. El extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens), tiene la propiedad de
inhibir el crecimiento bacteriano in vitro de la bacteria Porphyromona
gingivalis.
2. Se determinó que la concentración mímina inhibitoria (CMI) del extracto
etanólico de Botoncillo (Acmella repens) capaz de inhibir el crecimiento
bacteriano fue al 100%.
3. El extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) al 100% es la
concentración más adecuada para la inhibición de Porphyromona gingivalis.
4. La clorhexidina al 0,12% (LIRA®) tiene mejor efecto antibacteriano que el
extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) sobre el crecimiento de
Porphyromona gingivalis.
50
RECOMENDACIONES
Realizar estudios posteriores aplicando el extracto de Botoncillo (Acmella
repens) con otras bacterias patógenas orales y/o periodontales, aisladas de
pacientes.
Realizar estudios microbiológicos con otro tipo de extractos (oleoso, acuoso,
hidro alcohólico) y/o solventes (agua, etanol, alcohol, éter) del Botoncillo
(Acmella repens).
Evaluar los posibles efectos secundarios que pueda presentar in vivo los
extractos elaborados a base de Botoncillo (Acmella repens), después de realizar
ensayos clínicos con el mismo.
Analizar en posteriores estudios cual es el principio activo que ejerce el efecto
antibacteriano en el extracto de Botoncillo (Acmella repens).
Levantar un estudio microbiológico de las bacterias patógenas periodontales
presentes en pacientes ecuatorianos.
51
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54
ANEXOS
Anexo 1. Solicitud de autorización de ingreso al laboratorio de mi microbiología de
la Facultad de Odontología de la U.C.E.
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Anexo 2. Certificado otorgado por el centro de biología de la U.C.E. de
identificación taxonómica de la planta.
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Anexo 3. Certificado de autenticidad de la cepa microbiológica
