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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MAESTRIA EN EPIDEMIOLOGÍA Y SALUD PÚBLICA VETERINARIA
Análisis filogenético del Gusano Barrenador del ganado en regiones tropicales y
subtropicales del Ecuador
Trabajo de titulación (modalidad Proyecto de Investigación) previo a la obtención del
Título de Magíster en Epidemiología y Salud Pública Veterinaria
AUTOR: Lagos Recalde Johana Paola
TUTOR: Richar Iván Rodríguez Hidalgo PH.D.
Quito, 2019
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Johana Paola Lagos Recalde, en calidad de autor y titular de los derechos morales y
patrimoniales del trabajo de titulación, Análisis filogenético del Gusano Barrenador del
ganado en regiones tropicales y subtropicales del Ecuador, modalidad Proyecto de
Investigación, de conformidad con el artículo 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA
ECONOMIA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTO, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo
a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no
exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos.
Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa
citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador que se realice la digitalización y
publicación de este trabajo de Titulación en el Repositorio Virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad
de toda responsabilidad.
Firma:
Nombres y apellidos: Johana Paola Lagos Recalde
CC: 1720147881
Dirección electrónica: [email protected]
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por JOHANA PAOLA LAGOS
RECALDE, para optar por el del Título de Magister en Epidemiología y Salud Pública
Veterinaria, cuyo título es: ANÁLISIS FILOGENÉTICO DEL GUSANO BARRENADOR DEL
GANADO EN REGIONES TROPICALES Y SUBTROPICALES DEL ECUADOR, considero
que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la
presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 30 días del mes de septiembre del 2019
Richar Ivan Rodríguez Hidalgo PH.D.
DOCENTE- TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CEDULA 1712051786
iv
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL
“Análisis filogenético del Gusano Barrenador del Ganado en regiones tropicales y
subtropicales del Ecuador”.
El tribunal constituido por:
MSc. Javier Vargas presidente del tribunal; PhD. Christian Vinueza, PhD. Alfonso Molina,
miembros del tribunal; PhD. Richar Rodríguez, como tutor.
Luego de receptar el Trabajo de Titulación, modalidad proyecto de investigación para la
obtención del Título de Magíster en Epidemiología y Salud Pública Veterinaria, presentado
por Johana Paola Lagos Recalde, MVZ con el título de “Análisis Filogenético del Gusano
Barrenador del Ganado en regiones tropicales y subtropicales del Ecuador”.
Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO
En la ciudad de Quito, a los 22 días de Octubre de 2019
Para constancia de lo actuado firman:
MSc. Javier Vargas Presidente de tribunal
PhD. Christian Vinueza Miembro del tribunal
PhD. Alfonso Molina Miembro del tribunal
PhD. Richar Rodríguez Tutor
v
AUTORÍA DE RESPONSABILIDAD
Yo, Johana Paola Lagos Recalde, con cédula de identidad N° 1720147881, declaro que
este trabajo de titulación “Análisis filogenético del Gusano Barrenador del Ganado en
regiones tropicales y subtropicales del Ecuador” ha sido desarrollado considerando los
métodos de investigación existentes, así como también se ha respetado los derechos
intelectuales de terceros considerándose en las citas bibliográficas.
Consecuentemente declaro que este trabajo es de mi autoría, en virtud de ello me declaro
responsable del contenido, veracidad y alcance de la investigación mencionada.
Quito, 30 de septiembre de 2019
Johana Paola Lagos Recalde
CC. 1720147881
vi
DEDICATORIA
A mi madre Carlota que con su amor, paciencia y sacrificio me ha permitido cumplir un
sueño más y ha sabido enseñarme que en la vida nada me detiene para ser feliz, a pesar
de las adversidades que se puedan presentar. Sin ella a mi lado, nada de esto hubiese sido
posible.
A mi hijo Damian por ser mi inspiración y alegrar cada día de mi vida con su sonrisa,
también por comprender las veces que no he podido estar a su lado mientras realizaba mis
estudios.
A mi compañero de vida Edwin, por apoyarme en cada meta que me planteo, por su amor y
comprensión.
vii
AGRADECIMIENTOS
A mi familia por apoyarme incondicionalmente en cada etapa de mis estudios.
A la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
quienes me formaron como profesional y cuyas aulas me permitieron cumplir metas
profesionales.
Al Dr. Richar Rodríguez por su tiempo y por haberme permitido formar parte del proyecto
“Epidemiologia molecular de parásitos y microorganismos de interés zoonósico: Gusano
Barrenador del Ganado y Garrapatas” y a la vez por ser tutor de esta investigación.
Al Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis por permitirme realizar mi
investigación en sus laboratorios.
A todo el equipo que forma parte del proyecto “Epidemiologia molecular de parásitos y
microorganismos de interés zoonósico: Gusano Barrenador del Ganado y Garrapatas” que
contribuyeron de forma directa o indirecta en la realización de esta investigación.
Al Ing. Luis Cartuche, Director de Desarrollo Pecuario del Ministerio de Agricultura y
Ganadería, por su ayuda con la logística en las diferentes provincias de país.
Al Dr. Francisco Flores, por guiarme con sus conocimientos para la realización de los
análisis bioinformáticos que forman parte de esta investigación.
viii
TABLA DE CONTENIDO
Contenido Pág.
DERECHOS DE AUTOR ......................................................................................................... ii
APROBACIÓN DEL TUTOR ................................................................................................... iii
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL ............................................................................................. iv
AUTORÍA DE RESPONSABILIDAD ........................................................................................ v
DEDICATORIA ....................................................................................................................... vi
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................ vii
TABLA DE CONTENIDO ....................................................................................................... viii
LISTA DE TABLAS ................................................................................................................. xii
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. xiii
LISTA DE ANEXOS ............................................................................................................... xiv
LISTA DE ABREVIACIONES ................................................................................................ xv
RESUMEN ............................................................................................................................. xvi
ABSTRACT .......................................................................................................................... xvii
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 4
2.1 Objetivo General ............................................................................................................ 4
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 4
HIPOTESIS ............................................................................................................................. 4
CAPITULO I. ............................................................................................................................ 5
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 5
3.1 Antecedentes ................................................................................................................. 5
ix
3.2 Generalidades ................................................................................................................ 6
3.3 Cochliomyia hominivorax ............................................................................................... 6
3.4 Tratamiento para GBG ................................................................................................... 8
3.5 Distribución Geográfica .................................................................................................. 8
3.6 Epidemiología del Gusano Barrenador del Ganado ...................................................... 8
3.7 Técnicas de diagnóstico de Cochliomyia hominivorax ................................................ 10
3.7.1 Identificación morfológica ...................................................................................... 10
3.7.2 Identificación mediante herramientas moleculares ............................................... 10
3.8 Impacto Económico Cochliomyia hominivorax ............................................................ 10
3.9 Erradicación de Cochliomyia hominivorax ................................................................... 11
3.10 Estudios moleculares aplicados en Cochliomyia hominivorax .................................. 12
3.11 Uso de marcadores mitocondriales ........................................................................... 13
3. 12 Filogenética ............................................................................................................... 14
CAPITULO II. ......................................................................................................................... 15
4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................ 15
4.1 Diseño del estudio ....................................................................................................... 15
4.2 Población y área de estudio ......................................................................................... 15
4.3 Análisis de datos .......................................................................................................... 16
4.4 Metodología ................................................................................................................. 17
4.4.1Fase de campo ....................................................................................................... 17
4.4.2 Fase de laboratorio: Unidad de Entomología Aplicada (UEA) .............................. 18
4.4.2.1 Identificación morfológica de larvas y huevos de Cochliomyia hominivorax ...... 18
4.4.2.2 Identificación morfológica de moscas adultas .................................................... 19
x
4.4.3 Fase de laboratorio: Biología Molecular ................................................................ 20
4.4.3.1 Extracción y Cuantificación de ADN ................................................................... 20
4.4.3.2 Amplificación de ADN (PCR) .............................................................................. 22
4.4.3.3 Electroforesis ...................................................................................................... 24
4.4.3.4 Secuenciación .................................................................................................... 24
CAPITULO III. ........................................................................................................................ 25
5. RESULTADOS .................................................................................................................. 25
5.1 Distribución Geográfica de Cochliomyia hominivorax ................................................. 25
5.2 Identificación morfológica de especímenes colectados ............................................... 26
5.3 Biología Molecular ....................................................................................................... 27
5.4 Análisis filogenético ..................................................................................................... 29
5.4.1 Filogenia con citocromo oxidasa subunidad I (COI) .............................................. 29
5.4.2 Filogenia con 12S ARN ......................................................................................... 32
5.4.3 Filogenia genes en conjunto ................................................................................. 34
CAPITULO IV. ....................................................................................................................... 37
6. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 37
6.1 Discusión General ........................................................................................................ 37
6.2 Distribución Geográfica ................................................................................................ 38
6.3 Identificación Morfológica ............................................................................................ 39
6.4 Análisis filogenético ..................................................................................................... 40
CAPITULO V. ........................................................................................................................ 45
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................... 45
7.1 Conclusiones ............................................................................................................... 45
xi
7.2 Recomendaciones ....................................................................................................... 46
8. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 47
9. ANEXOS ............................................................................................................................ 58
xii
LISTA DE TABLAS
Contenido Pág.
Tabla 1 Secuencias de cebadores utilizados en este estudio .............................................. 22
Tabla 2 Componentes utilizados para la preparación del master mix del gen coi ............... 23
Tabla 3 Componentes utilizados para la preparación del master mix para el gen 12s arnr . 23
Tabla 4 Resultados de la identificación morfológica y molecular de las muestras colectadas
en cada provincia del ecuador ............................................................................................... 27
xiii
LISTA DE FIGURAS
Contenido Pág.
Figura 1. Distribución de Cochliomyia hominivorax, C. macellaria y otras moscas en
Ecuador ................................................................................................................................. 25
Figura 2. (A) Larva de C. hominivorax, (B) Adulto de C. hominivorax .................................. 27
Figura 3. Secuencias amplificadas con gen COI de los especímenes utilizados en este
estudio ................................................................................................................................... 29
Figura 4. Secuencias amplificadas con gen 12S ARN de los especímenes utilizados en este
estudio. .................................................................................................................................. 29
Figura 5. Árbol consenso de COI con el método bayesiano, se muestran valores de PPB en
cada rama. ............................................................................................................................. 30
Figura 6. Árbol consenso de COI con el método de máxima verosimilitud, se muestran
valores de bootstrap en cada rama. ...................................................................................... 31
Figura 7. Árbol consenso de 12S con el método de máxima bayesiano, se muestran valores
de bootstrap en cada rama. ................................................................................................... 32
Figura 8. Árbol consenso de 12S con el método de máxima verosimilitud, se muestran
valores de bootstrap en cada rama. ...................................................................................... 33
Figura 9. Árbol consenso de genes en conjunto, con el método bayesiano, se muestran
valores PPB en cada rama. ................................................................................................... 35
Figura 10. Árbol consenso de genes en conjunto con el método de máxima verosimilitud, se
muestran valores de bootstrap en cada rama. ...................................................................... 36
xiv
LISTA DE ANEXOS
Contenido Pág.
Anexo 1. Detalle de muestras colectadas por provincia ...................................................... 58
Anexo 2. Claves dicotómicas ............................................................................................... 61
xv
LISTA DE ABREVIACIONES
ADNmt: ADN mitocondrial
GBG: Gusano Barrenador del Ganado
MCMC: Markov Chain Monte Carlo
TIE: Técnica del Insecto Estéril
COPEG: Comisión Panamá Estados Unidos para la Erradicación y Prevención del GBG
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
xvi
TÍTULO: Análisis filogenético del Gusano Barrenador del ganado en regiones tropicales y
subtropicales del Ecuador
Autora: Johana Paola Lagos Recalde
Tutor: Richar Iván Rodríguez Hidalgo PH.D.
RESUMEN
El gusano barrenador del ganado (GBG), es la forma larvaria de la mosca Cochliomyia hominivorax propia del continente Americano. Hasta la fecha la mosca del GBG permanece endémico en Sur America excepto Chile y algunas Islas del Caribe. El Ecuador como parte del proyecto regional del control y erradicación del GBG de América, necesita actualizar su información epidemiológica y genética del GBG. Es por esto que, este estudio tiene como objetivo determinar la variabilidad genética de Gusano Barrenador del Ganado en zonas tropicales y subtropicales del Ecuador en base a una identificación morfológica y molecular mediante la construcción de árboles filogenéticos. En total, se identificaron 29 moscas de las cuales, el 10,3% (3/29) correspondieron a Cochliomyia hominivorax, el 62% (18/29) se identificó como Cochliomyia macellaria, el 3,44% (1/29) identificada como Dermatobia hominis y el 24,13% (7/29) de las moscas fueron identificadas como moscas de diferentes especies (Dasyphora sp, Ravinia pernix e Hydrotaea aenescens). De igual manera se identificaron 690 larvas provenientes de 52 miasis resultando el 90.15% como Cochliomyia hominivorax y dos muestras de huevos el 100% (2/2) correspondiente a Cochliomyia hominivorax. Posteriormente se realizaron los análisis moleculares mediante el uso de dos marcadores mitocondriales: COI subunidad I y 12S ARN. Las secuencias fueron utilizadas para la elaboración de seis árboles filogenéticos, mediante el método bayesiano y método de máxima verosimilitud, mostrando topologias con tres clados definidos correspondientes a las agrupaciones de Cochliomyia hominivorax, Cochliomyia macellaria y el grupo externo conformado por otros dípteros que fueron colectados en este estudio. En conclusión, los resultados muestran poca variabilidad genética entre las muestras colectadas en diferente región y/o provincia.
PALABRAS CLAVES: COCHLIOMYIA HOMINIVORAX / ECUADOR / VARIABILIDAD
GENÉTICA / COI / 12S ARN
xvii
TITLE: Phylogenetic Analysis ot the Cattle Screwworm in tropical and subtropical regions of
Ecuador
Author: Johana Paola Lagos Recalde
Tutor: Richar Iván Rodríguez Hidalgo PH.D.
ABSTRACT
The cattle Screwworm (GBG) is the larval form of the fly Cochliomyia hominivorax specific to the American continent. Up to the present date the fly GBG remains endemic in South America, except for Chile and some Caribbean Islands. Ecuador as part of the regional project for the control and eradication of the GBG in America requires updating its epidemiological and genetic information. Whereby, the present study intends to determinate the genetic variability of the cattle screwworm in tropical and subtropical areas of Ecuador based on a morphological and molecular identification through the construction of phylogenetic trees. 29 flies were identified from which 10.3% (3/29) corresponds to Cochliomyia hominivorax, 62% (18/29) was identified as Cochliomyia macellaria, 3.44% (1/29) identified as Dermatobia hominis and 24.13% (7/9) were identified as flies from different species (Dasyphora sp, Ravinia pernix e Hydrotaea aenescens). Similarly 690 larvae coming from 52 myiasis were identified and 90.15% correspond to Cochliomyia hominivorax and two eggs samples from which 100% (2/2) correspond to Cochliomyia hominivorax. Subsequently, molecular analyses were carried out by means ot two mitocondrial markers COI subunit I and 12S ARN. Sequences were used to develop six phylogenetic trees through the Bayesian method and method of maximum likelihood, showing topologies with three defined clades corresponding to the group of Cochliomyia hominivorax, Cochliomyia macellaria and external group made up by other diptera collected in this study. In conclusion, the findings show low genetic variability among the samples collected in different region and or province.
KEY WORDS: COCHLIOMYIA HOMINIVORAX / ECUADOR / GENETIC VARIABILITY /
COI / 12S ARN
1
1. INTRODUCCIÓN
El gusano barrenador del ganado (GBG), es la forma larvaria de la mosca Cochliomyia
hominivorax (Coquerel,1858); el cual, es un parásito obligado de los animales de sangre
caliente. La forma larvaria de la mosca se alimenta de tejidos vivos, ocasionando miasis
múltiple, traumática o Cochliomyiasis (Espinoza & Garay, 2009; Rodríguez, Olivares,
Sánchez, & García, 2016). La parasitosis es de declaración obligatoria por ser una de la
enfermedades transfronterizas en las Américas (FAO, 1993; OIE, 2013).
La mosca es originaria de América y estuvo distribuida desde sur de Estados Unidos hasta
el norte de Argentina (Espinoza & Garay, 2009; FAO, 1993), especialmente en zonas
tropicales y subtropicales donde existen las condiciones óptimas para su desarrollo. Gracias
al programa de control y erradicación del GBG, la mosca Cochliomyia hominivorax ha sido
erradicada desde los EEUU hasta la frontera Colombo-Panameña (FAO, 2011); sin
embargo, el GBG continúa siendo endémico en Sudamérica y algunas islas del Caribe
(Sánchez, Calderón, Mora, & Troyo, 2014). Por su naturaleza de enfermedad transfronteriza
y por las grandes pérdidas económicas que ocasiona, en el año 2011 la Organización de las
Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de
Sanidad Animal (OIE), mediante el Programa Global para el Control Progresivo de las
Enfermedades Transfronterizas de los Animales (GF-TADs), en colaboración con otras
instituciones conocedoras de esta parasitosis, desarrollaron una hoja de ruta para el control
y la erradicación de la mosca en todo el continente americano, hasta el año 2030 (GF-
TADs, 2007; FAO,2011). No obstante, el Organismo Internacional de Energía Atómica
(OIEA), presentó el proyecto “Fortalecimiento de las Capacidades Regionales para la
Prevención y Control Progresivo del GBG”, donde consideran actualizar la hoja de ruta
elaborada por la FAO. Este proyecto contempla cinco etapas, las cuales incluyen diferentes
actividades, que ayudaran a controlar esta parasitosis hasta lograr su erradicación en cada
país endémico (OIEA, 2018).
2
Si bien es cierto, la mosca del GBG afecta a todos los animales de sangre caliente, los
bovinos han sido los más estudiados (De la Ossa et al., 2009; Forero, Cortés, & Villamil,
2007a), debido a las importantes pérdidas económicas que produce a la ganadería y su
afectación al comercio internacional y a la inocuidad de los alimentos (Rodríguez et al.,
2016). Varios estudios han reportado cuantiosas pérdidas económicas a consecuencia de
los daños que provoca a los animales (Dupuis et al., 2018; Forero et al., 2007a; Grisi et al.,
2014). Estas pérdidas podrían alcanzar los 3.600 millones de dólares aproximadamente en
América del Sur (Forero, Cortés, & Villamil, 2008). Otras especies animales también son
afectadas como los perros, porcinos, ovinos, equinos, felinos y aves domésticas (Coronado
& Kowalski, 2009; Junquera, 2018; Pérez & Villa, 2017; Rodríguez et al., 2016), y el hombre
de manera accidental (De la Ossa et al., 2009; Dominguez, Cueva, & Cusco, 2016;
Visciarelli, García, Salomón, & Jofré, 2003).
Desde 1958, inicio el programa de erradicación creado por el Departamento de Agricultura
de Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés), utilizando el método del insecto estéril,
logrando la erradicación de la parasitosis desde los EEUU hasta Panamá (Forero, Cortés, &
Villamil, 2007b; COPEG, 2014). Sin embargo, en Jamaica, no se obtuvieron los resultados
esperados debido a falta de estudios sobre la ecología y la dinámica poblacional del GBG y
otros factores, como la logística en el país (Dyck et al., 2005; FAO, 2003).
En el Ecuador, se ha reportado, la presencia de las miasis en un 18.4% en la costa, 43.7%
en el oriente basado en una encuesta epidemiológica realizada en fincas del Ecuador (Miño,
Vinueza, & Falconí, 2005). Desde el 2012, el Instituto de Investigación en Salud Pública y
Zoonosis - CIZ ha reportado la presencia de GBG realizando diferentes estudios de
presencia de la mosca en diferentes localidades del país; así mismo, se realizaron estudios
de identificación morfológica y molecular de la mosca (Carrillo, 2015; Jervis, 2014; Morales,
2016; Tapia, 2016; Morejón, 2015).
Carrillo (2015), realizó un estudio para determinar la variabilidad genética de las moscas
C. hominivorax en las localidades Mindo y San Miguel de los Bancos utilizando dos genes
mitocondriales: COI subunidad I y 12S ARN. Esta investigación permite inferir que la mosca
3
del GBG demuestran varios patrones de adaptación medioambiental probablemente
relacionados con su variabilidad genética. Es por esto que, el fin del estudio es determinar
los patrones de variabilidad genética en Ecuador, país megadiverso en especies y nichos
ecológicos. Esta información podría ayudar a entender la epidemiología del GBG y los
procesos de adaptabilidad en función de los nichos ecológicos; de esta manera se podría
ayudar a mejorar el programa de erradicación de la mosca del GBG, adaptándolo a las
condiciones locales de cada uno de los nichos ecológicos.
4
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
• Determinar la variabilidad genética de especímenes de Cochliomyia hominivorax y
su relación con aspectos geográficos y ambientales principalmente de la regiones
tropicales y subtropicales del Ecuador mediante el uso de los genes mitocondriales
COI y 12S ARNr
2.2 Objetivos Específicos
• Identificar morfológicamente los especímenes de Cochliomyia hominivorax
colectados en las regiones tropicales y subtropicales de la Costa, Sierra y Oriente
Ecuatoriano, mediante el uso de claves dicotómicas
• Analizar la relación filogenética de especímenes de Cochliomyia hominivorax en las
diferentes localidades del Ecuador mediante el uso de herramientas bioinformáticas.
HIPOTESIS
Ho: No existe variabilidad genética de Cochliomyia hominivorax en las regiones
tropicales y subtropicales del Ecuador.
H1: Existe variabilidad genética de Cochliomyia hominivorax en las regiones tropicales y
subtropicales del Ecuador.
5
CAPITULO I.
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3.1 Antecedentes
La mosca del GBG es un ectoparásito que causa las miasis múltiples y traumáticas en
zonas tropicales y subtropicales del continente americano. No obstante, en un estudio de
caso, la mosca fue reportada en una persona, en la comunidad rural de Tunipamba,
perteneciente al cantón Cotacachi de la provincia de Imbabura a 2.418 m.s.n.m. en
Ecuador, sugiriendo la posible adaptación de la mosca a otras condiciones diferentes a las
tropicales (Dominguez et al., 2016). La mosca ha sido erradicada desde los EEUU hasta la
frontera Colombo-Panameña y hasta el momento, sigue siendo endémica en América del
Sur, excepto Chile, y en algunos países del Caribe. Esta mosca, a lo largo de la historia ha
causado pérdidas económicas en la ganadería bovina ocasionadas por la disminución de
parámetros productivos, estrés, los costos para prevención y control, tratamiento del
ganado e infecciones secundarias pueden llegar a ser altos, sin considerar la muerte de los
animales (Rodríguez, Rojas, Álvarez, & Parra, 2011).
Varios estudios realizados en diferentes países, sobre la caracterización morfológica y
variabilidad genética de C. hominivorax, con el objetivo de conocer que tan aisladas se
encuentran estas poblaciones genéticamente (Carvalho, Torres, Paniago, & Azeredo-Espin,
2009; Fresia et al., 2007; Griffiths, Evans, & Stevens, 2009; Lyra, Klaczko, & Azedero-Espin,
2009). Por otro lado, en el Ecuador Miño et al. (2005), realizaron una encuesta
epidemiológica para determinar la presencia de la mosca en el país. Posteriormente, Lyra
(2008) y McDonagh et al. (2009) reportaron la presencia de larvas y moscas colectadas en
Napo, Guayas y Esmeraldas, las cuales se identificaron como C. hominivorax mediante
técnicas de biología molecular. Arteaga et al. (2012), pusieron en evidencia la presencia de
larvas de GBG basándose en características morfológicas de los huevos y de larvas en
instar tres. El Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis – (CIZ) de la
Universidad Central del Ecuador, ha desarrollado varios estudios tendientes a identificar la
mosca, determinar su distribución y riesgo y actualizar la información epidemiológica de la
6
mosca en el país; es así que, los estudios realizados permiten conocer la situación actual
de la mosca en Ecuador (Carrillo, 2015; Jervis, 2014; Morales, 2016; Tapia, 2016; Morejón,
2015).
3.2 Generalidades
Las moscas de la familia Calliphoridae, son dípteros, pertenecen al suborden Brachycera
(McAlpine, 1989) y al género Cochliomyia, que incluyen 4 especies: Cochliomyia
hominivorax (Coquerel 1858), Cochliomyia macellaria (Fabrícius 1775), Cochliomyia aldrichi
(Del Ponte 1938) y Cochliomyia minima (Shannon 1926) (FAO, 1993). De las 4 especies se
considera de gran importancia a C. hominivorax, debido a su impacto en la Salud Pública y
a las pérdidas económicas que produce (Forero et al., 2007a). Por otro lado, C. macellaria
está asociada a miasis secundarias en tejidos vivos, pudiendo llegar a confundirse con C.
hominivorax (FAO, 1993).
Taxonomía de Cochliomyia hominivorax (COPEG, 2016; Vargas, 1991).
Reino: Animal
Phylum: Arthropoda
Clase: Insecta
Orden: Diptera
Suborden: Brachycera
Familia: Calliphoridae
Género: Cochliomyia
Especie: C. hominivorax
3.3 Cochliomyia hominivorax
La mosca Cochliomyia hominivorax, en su forma larvaria conocida como Gusano
barrenador del Ganado del Nuevo Mundo, fue descrita por el Dr. Charles Coquerel en 1858,
quien en la Guyana Francesa identificó larvas en los orificios nasales de cinco hombres
prisioneros (Touré, 1994). El Dr. Coquerel al encontrar la existencia de esta mosca la
7
reportó como Lucilia hominivorax que significa, la devoradora de hombres. Con el tiempo, la
larva fue conocida con varios nombres científicos: Calliphora infestans, Calliphora
antropophaga, Cochliomyia americana, hasta llegar a su nombre oficial actual Cochliomyia
hominivorax (Forero et al., 2008).
El nombre de Gusano Barrenador se debe a la forma en la que las larvas penetran
profundamente en las heridas, formando túneles o bolsillos en los tejidos de los que se
alimentan (Hendrix, Wohl, Bloom, Ostrowski, & Benefield, 1998). Por tal motivo a esta
infestación se le da el nombre de cochliomiasis que proviene del latin, Cochlio= en forma de
espiral o tornillo y Myia= mosca (FAO, 1993; Phillips, Welch, & Kramer, 2001). Los síntomas
y signos causados por esta parasitosis en los animales son: pérdida de peso, heridas con
olor fétido, decaimiento, se separan del rebaño (Vargas-Terán & Novy, 2000). Los animales
pueden morir por infección secundaria en 1 a 2 semanas si no se administra tratamiento
(CDFA, 2000). La presencia de las larvas ubicadas de manera profunda en los tejidos, es el
signo más característico, adicionalmente se ver puede observar secreciones de las heridas;
así como también, la presencia de huevos en las heridas en forma de empalizada (Drugeri,
2004).
El Ciclo de vida de C. hominivorax inicia cuando la mosca hembra pone huevos en heridas
frescas. La hembra coloca aproximadamente 200 a 500 huevos, los cuales eclosionan 12
horas después obteniendo así larvas en “instar” o estadio uno (Berkebile, Chirico, &
Leopold, 2000; Mangan & Welch, 1990). El ciclo de vida, en condiciones normales, es 21
días y en condiciones adversas su periodo puede prolongarse por 2 a 3 meses
dependiendo de la temperatura y humedad (CFSPH, 2007).
Las hembras adultas se aparean una sola vez; mientras que, los machos se aparean varias
veces. Los adultos alcanzan su madurez sexual 2 a 4 días de haberse convertido en
moscas (Petraccia, 1993). Las hembras pueden vivir hasta 30 días, durante este tiempo
pueden realizar hasta 10 ovoposiciones, a partir del quinto día está lista para ovipositar; se
alimenta de proteínas que encuentra en las heridas de los animales antes o después de su
oviposición y de néctar de las flores y agua. Por otro lado, el macho puede vivir 14 días,
8
alcanzando su madurez sexual a las 24 horas de emerger y se alimenta de néctar de las
flores (FAO, 1993). En caso de no encontrar alimento, una mosca puede viajar de 10 a 20
Km en climas tropicales o 290 km en ambientes áridos (Vargas, 1991).
3.4 Tratamiento para GBG
Para tratar las gusaneras primero se debe extraer todas las larvas posibles, posteriormente
se puede aplicar tratamientos mediante productos conocidos como antimiásicos, que matan
a las larvas y aceleran la cicatrización; los cuales viene en diferentes presentaciones y
pueden contener larvicidas, desinfectantes y cicatrizantes (Junquera, 2018).
3.5 Distribución Geográfica
La mosca C. hominivorax pertenece a regiones tropicales y subtropicales de América, por
siglos estuvo presente en el centro y sureste de los EE.UU, México, Centroamérica, las
islas del Caribe y en Sudamérica hasta Uruguay y Argentina (Graham, 1985). Actualmente,
la parasitosis está presente en forma endémica en casi todos los países de América del
Sur, con excepción de Chile y en algunos países del Caribe (Cuba, República Dominicana,
Haití, Trinidad-Tobago y Jamaica) (Robinson, Vreysen, Hendrichs, & Feldmann, 2009;
Rodríguez et al., 2011). Fuera del continente americano, el gusano barrenador del ganado
fue introducido accidentalmente en Libia en 1988, logrando ser erradicado en 1991 (Ortiz,
2005).
3.6 Epidemiología del Gusano Barrenador del Ganado
La parasitosis causada por GBG es endémica en América del Sur y alguna islas del Caribe;
teniendo predilección por climas tropicales y subtropicales (Iñiguez & Quezada, 2014). Esta
infestación es de declaración obligatoria y se encuentra en la lista B de la Oficina
Internacional de Epizootias (Rodríguez et al., 2016).
Pese a que cualquier animal de sangre caliente puede infestarse por GBG, estudios indican
que los casos de miasis por GBG se presentan con mayor frecuencia en el ganado, debido
a actividades de manejo (castración, descorne, lastimados con alambres de púas, picaduras
9
de garrapatas entre otros), que permite a la mosca la ovoposición en tejidos vivos de una
herida (Forero et al., 2007b; Moya-Borja, 2003). Por otro lado, en los humanos las miasis
por GBG se presentan en personas que viven en areas rurales, que realizan actividades de
manejo de animales o que puedan tener algún tipo de enfermedad que causa discapacidad
impidiendo el cuidado de heridas , atrayendo a la mosca para que realice su ovoposición
(Dominguez et al., 2016; Gomez et al., 2003).
En el Ecuador, en el año 2005, se realizó una investigación por el Servicio Ecuatoriano de
Sanidad Agropecuaria (SESA), actualmente Agrocalidad, sobre la presencia de miasis en
ganaderías del Ecuador mediante una encuesta epidemiológica en 1255 predios ,
reportaron gusaneras el 42% de las fincas encuestadas (Miño et al., 2005). En el año 2012
se realizó un estudio en la provincia de Manabí para conocer el comportamiento de la
mosca C. hominivorax y su relación con otros agentes causantes de miasis, en donde se
encontró que las larvas de dicha mosca afectaron al 73.4% de bovinos, 13.7% porcinos, el
8.8% de ovinos, el 5.3% de equinos, el 1.8% de caprinos y el 0.4% de caninos; además se
encontró miasis secundaria asociada a C. macellaria, en bovinos, porcinos y ovinos
(Arteaga, Rodríguez, & Olivares, 2012).
Según Jervis (2014), en su estudio confirmó mediante claves dicotómicas, la presencia de
52 moscas que corresponden a C. hominivorax y 23 moscas correspondientes a C.
macellaria. Del mismo modo Carrillo (2015), en su estudio “Identificación morfológica y
molecular de Cochliomyia spp. de la colección científica del CIZ”, identificó morfológica y
molecularmente C. hominivorax y C. macellaria, estos insectos provenían de diferentes
zonas geográficas del Ecuador, este trabajo dio la pauta para sospechar que pueden existir
variabilidad genética de C. hominivorax.
Según Morejón (2016), en su estudio reportó la presencia de 7 hembras de C. hominivorax
y 127 especímenes de C. macellaria, adicionalmente en este estudio se obtuvo una
prevalencia aparente de miasis traumática del 66,25%, siendo la especie bovina las más
afectada, con un 14, 62%.
10
En el año 2016, en la tesis titulada “Prevalencia e Incidencia de Cochliomyia hominivorax en
el cantón San Miguel de los Bancos” presentado por Tapia (2016), en el Instituto de
Investigación en Salud Pública y Zoonosis-CIZ de la Universidad Central del Ecuador,
realizó el seguimiento de los casos de miasis traumática causada por C. hominivorax, en
110 predios de este cantón durante un año.
3.7 Técnicas de diagnóstico de Cochliomyia hominivorax
3.7.1 Identificación morfológica
El diagnóstico de Cochliomyia hominivorax se realiza en un laboratorio con un
estereoscopio tanto para moscas adultas como larvas. Es importante establecer un
diagnóstico diferencial con Cochliomyia macellaria por su parecido pudiendo confundir a
estas dos especies (OIE,1992). Del mismo modo, las larvas se las identifica mediante el uso
de claves dicotómicas. El estadio larvario L3 permite obtener las mejores estructuras
anatómicas para su diferenciación e identificación (FAO, 1993). Las principales estructuras
observables son los dos troncos traqueales fuertemente pigmentados entre el segmento
nueve hasta el segmento doce; además, las lavas aumentan de tamaño y cambian su
coloración de blanco a rosado, en cada segmento se observa espinas y los espiráculos se
los ve en la cara del último segmento, conjuntamente con el peritrema abierto (OIE, 2013a).
3.7.2 Identificación mediante herramientas moleculares
Las técnicas de biología molecular son usadas con mayor frecuencia en Entomología
(Vergel, Jaramillo, Castro, Vallejo, & Guhl, 2003). Para identificar C. hominivorax se han
aplicado técnicas como el uso de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mediante
el uso de pequeñas cantidades de ADN (Gil, 2016). Del mismo modo estudios mediante la
técnica de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs) en ADN
mitocondrial, han dado buenos resultados en la identificación.
3.8 Impacto Económico Cochliomyia hominivorax
Varios investigadores describen al GBG como causante de grandes pérdidas económicas
en las ganaderías (Forero et al., 2007a; Grisi et al., 2014; Skoda, Figarola, Pornkulwat, &
Foster, 2013), debido a los daños que causan en los tejidos u órganos de los animales,
11
incluso pudiendo provocarles la muerte (Thomas, 1987). A pesar que GBG pueden afectar a
distindas especies de animales domésticos y silvestres es más común que afecte al ganado
bovino debido a las prácticas de manejo que se realiza en estos animales y por ser una
población grande en relación a las otras especies (Moya-Borja, 2003; Snow, Whitten,
Salinas, Ferrer, & Sudlow, 1985).
Las pérdidas económicas anuales por tratamiento y control de las miasis traumáticas oscila
entre 4,82 a 10,71 dólares por animal en varios países de Sudamérica, sin tomar en cuenta
la muerte de los animales (Forero et al., 2007a). En Estados Unidos la pérdidas por GBG
fueron de 1.065 millones de dólares, en América Central 43 millones de dólares, en Brasil
de 336.6 millones de dólares al año, en el Caribe 128 millones de dólares y en América del
sur 3.600 millones de dólares (Grisi et al., 2014; Parra, Rojas, & Gómez, 2011).
3.9 Erradicación de Cochliomyia hominivorax
Con la aplicación de la Técnica del Insecto Estéril (TIE), se ha logrado erradicar y controlar
a la mosca del GBG desde el sur de los Estados Unidos hasta la frontera Colombo-
Panameña (COPEG, 2016; Vargas-Terán, Hofmann, & Tweddle, 2005). A pesar que la
Técnica del Insecto Estéril para erradicar GBG fue un éxito en varios países excepto
Jamaica (Vreysen, Hendrichs, & Enkerlin, 2006).
En América del Sur y algunos países del Caribe, se continúa con la lucha para poder
erradicar y controlar GBG; es por eso que el Organismo Internacional de Energía Atómica
(OIEA) creo el proyecto “Fortalecimiento de las Capacidades Regionales para la Prevención
y Control Progresivo del GBG”, con el fin de actualizar la hoja de ruta creada por la FAO,
para así controlar y suprimir GBG en lugares en donde continúa siendo endémico. Es así
que en el año 2016 el Departamento de Agricultura de EE. UU. (por sus siglas en inglés
USDA) y la COPEG iniciaron con la investigación de producir machos transgénicos de GBG
para el control y erradicación de esta parasitosis; Panamá continua con las pruebas de
laboratorio y ha considerado implementar la aplicación de pruebas de campo con este tipo
de mosca (OIEA, 2018).
12
3.10 Estudios moleculares aplicados en Cochliomyia hominivorax
Se han utilizado técnicas moleculares como la PCR de ADN polimórfico amplificado
aleatoriamente (RAPD-PCR), para la identificación de etapas larvarias de GBG. Skoda et
al. (2013) en su estudio seleccionaron 40 cebadores decaméricos, de los cuales solo nueve
pudieron diferenciar cada una de las fases del ciclo de C. hominivorax. Tres “primers”
distintos mostraron polimorfismos para las muestras procedentes de varios países de
América Central; permitiendo así manifestar que la técnica RAPD-PCR puede llegar a ser
bastante útil en los programas de vigilancia para GBG. Otra investigación mediante la
técnica PCR real time, comparó entre géneros Cochliomyia y Chrysomya con el fin de
validar tres genes en tres especies: C. hominivorax, C. macellaria y Chrysomya albiceps,
permitiendo comparar estas especies y así utilizar como genes de referencia para
Califóridos (Cardoso, Matiolli, Azeredo-Espin, & Torres, 2014).
Mastrangelo et al. (2012), en su estudio, utilizaron tres marcadores de ADN mitocondrial
(ADNmt) y ocho microsatélites nucleares para poder determinar la diversidad genética de
GBG en toda la Amazonía de Brasil. Por otro lado, Christen et al. (2015), mediante PCR con
dos primers: CR92A1 y J1A2, lograron diferenciar entre C. hominivorax, C. macellaria y
ocho especies de la familia Calliphoridae. En el mismo sentido, Fresia et al. (2007) realizó la
técnica de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), para determinar la
variabilidad genética de 240 individuos de GBG en cuatro localidades de Uruguay.
Continuado con sus investigaciones Fresia et al. (2011), utilizaron marcadores
mitocondriales para evidenciar variabilidad genética de GBG, mediante su distribución
espacial en varios lugares del Caribe y América del sur, colectando de 4 a 18 individuos de
GBG de 38 lugares diferentes.
La reacción en cadena de la polimerasa del polimorfismo de longitud del fragmento
amplificado (AFLP–PCR), permite la diferenciación de especies mediante la amplificación
específica de fragmentos de restricción. Se ha utilizado esta técnica para detectar la
13
similitudes y diferenciar 10 poblaciones de C. hominivorax provenientes de México,
Panamá, Jamaica y Costa Rica (Alamalakala, Skoda, & Foster, 2009).
3.11 Uso de marcadores mitocondriales
El ADN mitocondrial (ADNmt), es una molécula circular de ADN ubicada dentro de las
mitocondrias de las células animales que no posee histonas en su estructura, obteniendo de
esta forma ciertas características genéticas, como la predominancia de herencia materna, la
falta de recombinación y un alta tasa de mutación; este ADN tiene una estructura menos
compleja que el ADN nuclear (Coral, Salamanca, & Buentello, 1995; Fresia et al., 2007;
Lanteriy & Confalonieri, 2003). Puesto que, este genoma mitocondrial posee información
para la codificación de proteínas, genes de transferencia, ARN ribosomal y secuencias
reguladoras es utilizado para diversos estudios filogenéticos (Boore & Brown, 2000).
Lessinger et al. (2000), en su investigación indicaron que el ADNmt contiene 13 genes
codificantes de proteínas, 2 genes ARN ribosomal (ARNr), 22 genes de transferencia
(ARNt) y una significativa región no codificante, con un tamaño de 16 kb, lo que le da la
característica de un genoma con forma circular sólido.
El marcador universal usado en animales es el gen citocromo oxidasa (COI), es de tipo
mitocondrial y corresponde a la subunidad más importante del complejo citocromo C
oxidasa (complejo proteico transmembrana), su uso es común para análisis de filogenia, el
cual puede indicar si existe variación de la secuencia entre especies del mismo género
(Hebert, Ratnasingham, & De Waard, 2003;).
Investigaciones realizadas en varias especies animales, incluidos los insectos han
corroborado que el gen COI muestra una variación interespecífica bastante adecuada para
realizar identificación molecular en las diferentes especies animales (Borisenko, Lim,
Hanner, & Hebert, 2008; Hebert, Cywinska, & Ball, 2003; Ward, Zemlak, Innes, Last, &
Hebert, 2005).
Por otro lado, la subunidad 12S del ARN ribosomal (12S) se lo encuentra en los ribosomas
mitocondriales y el gen que lo codifica está formado de 819 a 975 pares de bases (pb), es
14
eficiente para discriminación genética entre especies (Vences, Thomas, Van der Meijden,
Chiari, & Vieites, 2005).
3. 12 Filogenética
La filogenética o filogenia es parte de la Biología la cual se encarga específicamente de
estudiar el origen, de donde proceden y se desarrollan las diversas poblaciones existentes.
El primer paso es establecer la morfología para poder encontrar perecido genético (Castillo-
Céron & Goyenechea, 2007). En el caso de filogenética molecular se encarga de estudiar
las mutaciones en ADN, ARN o proteínas de una población de especímenes con el objetivo
de inferir su historia evolutiva por medio de árboles filogenéticos (Valcárcel, 2011).
Un árbol filogenético está formado de ramas y nodos. Las ramas y sus ramificaciones
representan a los ancestros y los nodos indican si existe relación entre el ancestro y su
descendiente (Abascal & Irisarri, 2016).
15
CAPITULO II.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Diseño del estudio
Este estudio fue de tipo observacional transversal descriptivo con fases de campo y
laboratorio. Se basa en buscar la frecuencia y distribución de eventos epidemiológicos, ya
sea el factor causal, en una población, durante tiempo y lugar determinados (Jaramillo &
Martínez, 2010).
El tipo de muestreo para esta investigación es a conveniencia, no probabilístico; el cual
permite incluir aquellos casos que se pueda colectar en las zonas de estudio. Esto,
fundamentado en la logística, conveniente accesibilidad y proximidad de los sujetos para el
investigador (Otzen & Manterola, 2017).
La fase de campo se realizó en diferentes meses tratando de encontrar el mayor número de
muestras de GBG en 15 provincias del Ecuador; el estudio se realizó entre febrero del 2018
a febrero del 2019. El procesamiento de las muestras se realizó en los laboratorios del
Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis y el trabajo fue divido en dos etapas.
En la primera etapa, se realizó la identificación morfológica de los especímenes colectados,
en la Unidad de Entomología Aplicada (UEA). Posteriormente se realizó la etapa de biología
molecular que incluye la extracción del ADN y obtención de amplicones de ADN del
espécimen en estudio.
4.2 Población y área de estudio
Para este trabajo se colectaron un total de 690 larvas de 52 miasis y se capturaron 29
moscas adultas y 2 muestras de huevos, en 15 provincias del Ecuador, sin considerar el
hospedador afectado. Del total de muestras que forman parte de este estudio, diecisiete
muestras forman parte de la colección de insectos del CIZ: 5 muestras (58 larvas) en
humanos y 12 muestras (126 larvas) muestras colectadas en la provincia de Pichincha en
perros, bovinos y cerdos (Datos no publicados).
La unidad muestral fue una población de larvas, huevos y adultos en 15 provincias
(Manabí, Guayas, Esmeraldas, El Oro, Los Ríos, Santo Domingo de los Tsáchilas, Santa
16
Elena, Bolívar, Pichincha, Pastaza, Morona Santiago, Napo, Sucumbíos, Orellana y Zamora
Chinchipe) (ver Anexo 1).
4.3 Análisis de datos
El mapa de distribución de C. hominivorax se realizó en software QuantumGis versión 3.2.3
(QGIS). Previamente se realizó una base de datos con las coordenadas obtenidas en cada
lugar donde se realizó la colecta de especímenes, posteriormente se elaboró el mapa en el
software (QGIS), realizando las respectivas ediciones del mapa.
En cuanto los análisis de biología molecular, los amplicones fueron enviados a la empresa
MACROGEN (Corea del Sur), para su secuenciación. Una vez que se obtuvo las muestras
ya secuenciadas, mediante el programa Geneious Prime® 2019.1.1, se evaluó la calidad de
los cromatogramas de cada una de las secuencias de los dos genes empleados, con el
objetivo de hacer un ensamblaje de cada secuencia y así poder obtener una secuencia
consenso de buena calidad, libre de ruido y ambigüedades. Posteriormente se realizó un
alineamiento múltiple con las secuencias consenso de buena calidad, con el programa de
alineamientos múltiples Clustal W; de esta manera se puedo obtener alineamientos
homólogos entre las secuencias. Las secuencias consenso dieron una longitud de 327 pb
para el gen 12S y 484 pb para el gen citocromo oxidasa subunidad I (COI). Del mismo
modo, se verificó la identidad de las secuencias al analizar en línea con el BLAST
determinando la homología con secuencias registradas en su base de datos.
El Software MEGA v6.0 (Tamura et al., 2013), ayudo a identificar el mejor modelo de
evolución para cada uno de los genes; siendo TN93+G y T92+G los mejores modelos que
se adaptaron para los genes 12s y COI respectivamente. Posteriormente se procedió a la
elaboración de árboles filogenéticos mediante los métodos de análisis bayesiano y máxima
de verosimilitud. Para la elaboración del árbol filogenético bayesiano se utilizó el programa
BEASTv 1.8.4 (Drummond & Bouckaert, 2016). La extensión del mismo programa
TreeAnottator v1.8.4 eliminó la cantidad de árboles elaborados al inicio del análisis, y así
poder obtener un árbol consenso. Posteriormente, se procedió a observar el árbol consenso
17
en el programa FigTree v1.4.3 (Rambaut, 2014).
El árbol mediante el método de máxima verosimilitud de genes en conjunto fue elaborado
en el programa “on line” CIPRES (Miller et al, 2010).
El análisis bayesiano tomó en cuenta parámetros como: modelo de sustitución que fue el
TN93, modelo de heterogeneidad fue Gamma con 4 categorías y reloj molecular estricto. En
el caso de Markov Chain Monte Carlo (MCMC) el largo de cadena fue 10000000,
adicionalmente se realizó burnin o calentamiento para descartar los árboles que muestran
topologías con probabilidades posteriores bajas, eliminando el 10% de árboles. Finalmente
se obtuvo el árbol consenso
Es importante mencionar que en los análisis filogenéticos se incluyen secuencias de
referencia de cada una de las especies consideradas en este estudio, obtenidas del
genbank, para el gen COI son las siguientes accesiones: MG089004.1 JQ246701.1
HM185574.1 KR067542.1 MF511743.1 MH401830.1 MF097391.1 GQ409354.1
Para el gen 12S ARN las siguientes accesiones: KM669713.1 FM866409.1
DQ656958.1 AY463155.1 KY977434.1 KT272854.1 KT272853.1 KM676414.1
4.4 Metodología
A continuación, se detalla los diferentes protocolos, materiales y reactivos para las fases de
campo y laboratorio.
4.4.1Fase de campo
Materiales
• Etanol al 100%
• Tubos tapa roja
• Pinzas
18
• GPS (Garmin)
• Guantes de examinación
• Lápices
• Frascos de orina
• Medicamentos para curar miasis (cipermetrina 0,4% - organofosforado + piretroide)
• Botas de caucho
• Overol
Georreferenciación
En los lugares donde se realizaron la colecta de larvas, huevos y se capturaron moscas, se
registraron las coordenadas mediante un GPS (Garmin), para posteriormente elaborar un
mapa de distribución de C. hominivorax en el Ecuador, el programa utilizado para la
elaboración del mapa fue Q GIS 3.2.3.
Colecta de muestras de larvas de Cochliomyia hominivorax
Protocolo
1. Identificar el tipo de miasis (múltiple y profunda).
2. Utilizar guantes y pinzas para extraer las larvas, tener cuidado de no romperlas.
3. Se deben recolectar las larvas de la herida y depositarlas en un frasco de orina o
tubo de tapa roja con etanol al 100%, para transportarlos al laboratorio.
4. Etiquetar la muestra
5. Una vez que se han extraído las larvas, se procede a curar la herida
4.4.2 Fase de laboratorio: Unidad de Entomología Aplicada (UEA)
4.4.2.1 Identificación morfológica de larvas y huevos de Cochliomyia hominivorax
Materiales
• Estereomicroscopio (Leica EZ4W)
• Pinzas entomológicas
19
• Cajas petri
Para la identificación, se utilizaron claves dicotómicas recomendadas por la (FAO, 1993) y
actualizadas por (Carrillo, 2015) (ver Anexo 2). Los especímenes se observaron mediante
un estereoscopio del laboratorio de Entomología del CIZ.
En las larvas colectadas, se tomó en cuenta características como: Dos troncos traqueales
dorsales fuertemente pigmentados, que van del segmento 9 al 12, espiráculos anteriores
que pueden tener de 9 a 11 branquias, espiráculos posteriores pigmentados con peritrema
abierto y espinas en cada anillo con una o dos puntas. Estas características se pueden
apreciar de mejor manera en larvas de instar dos o tres, las larvas en instar uno son muy
pequeñas lo hace que su identificación sea más compleja.
En el caso de los huevos, se colectaron pequeñas masas blancas ubicadas en los bordes
de heridas frescas y dispuestas en forma de tejas, ya en el laboratorio las características
observadas fueron: huevos de color blanco, redondeados en la parte posterior y aplanados
en la parte inferior, dispuestos en forma de masa, sutura dorsal extendida a lo largo del
huevecillo la cual se abre en la parte anterior del huevo rodeando por completo el micropilo
4.4.2.2 Identificación morfológica de moscas adultas
Los especímenes de Cochliomyia sp. fueron identificados por claves dicotómicas
recomendadas por (FAO, 1993) (ver Anexo 2). En el caso de adultos se observó en el
cuerpo de cada insecto, coloración azul o verde azulada, tres bandas longitudinales oscuras
sobre el tórax, la basicosta en el caso de las hembras es de color negro o marrón. Si bien
es cierto, estas características pueden ayudar a identificar C. hominivorax, pero no dan un
diagnóstico confirmatorio, ya que C. macellaria posee características similares que puede
crear confusión. Posterior a su identificación se procedió a cortar el tórax de cada mosca
para realizar la extracción de ADN.
20
4.4.3 Fase de laboratorio: Biología Molecular
Los protocolos y materiales se detallan a continuación:
4.4.3.1 Extracción y Cuantificación de ADN
Para la extracción de ADN se utilizó el kit comercial DNeasy® Blood & Tissue Handbook
(Qiagen).
Materiales
• Cabina de bioseguridad (LABCONCO, PURIFIED® CLASS I SAFETY
ENCLOSURE).
• Micro – Tijeras entomológicas
• Micro mortero a batería (Kontes, Vineland, NJ).
• Centrífuga (Force Micro 1624).
• Pipetas calibradas (Med Plus).
• Vórtex (Labnet Vx 100).
• Shaking Micro Incubator (Provocell TM)
• Tubos de 1.5ml (Axygen®)
• NanoDrop 2000(Thermo Scientific)
Reactivos
• Proteinasa K
• Buffer ATL
• Buffer de hidratación (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% SDS,
200mM sacarosa)
• Buffer AL
• Buffer AW1
• Buffer AW2
• Buffer AE
21
Procedimiento
Hidratación
1. Agregar 50µL de Buffer de hidratación a las muestras
Preparación
1. Centrifugar a 13000rpm*10min y descartar el sobrenadante
2. Añadir 180µL de Buffer ATL, homogenizar
3. Agregar 20µL de proteinasa K y mezclar con vortex
4. Incubar a 56ºC hasta llegar a lisis completa ( 1 a 2 horas aproximadamente), vortex
de manera ocasional.
5. Vortex durante 15 segundos y pasar a protocolo general del Kit
Protocolo general del kit
1. Añadir 200µl de Buffer AL, vortex por un par de segundos e incubar a 65ºC por 20
minutos
2. Añadir 200µL de etanol (96-100%), vortex para mezclar
3. Transferir toda la mezcla dentro de una columna previamente colocada en un tubo
colector de 2ml, centrifugar a 8000rpm por un minuto, descartar el líquido y el tubo
colector
4. Colocar la columna en un nuevo tubo colector de 2ml. Añadir 500µl de buffer AW1,
centrifugar a 8000rpm por 1minuto, descartar el líquido y el tubo colector
5. Colocar la columna en un nuevo tubo colector de 2ml. Añadir 500µl de buffer AW2,
centrifugar a 14000rpm por 3minutos, descartar el líquido y el tubo colector
6. Transferir la columna a un microtubo de 1.5-2ml
7. Eluir el ADN añadiendo 100µl de Buffer AE al centro de la membrana de la columna
e incubar a temperatura ambiente por 1minuto, centrifugar a 8000rpm por 1minuto
22
Cuantificación
1. Se tomo 2µl de cada muestra, para ser cuantificada en el equipo Nanodrop
posteriormente se almacenaron las muestras a -20°C, hasta su amplificación.
4.4.3.2 Amplificación de ADN (PCR)
La amplificación de ADN se realizó por medio de la reacción en cadena de la polimerasa
simple (PCR). Los cebadores y el protocolo de amplificación se tomaron de Arrivillaga et al.
(2003) y Simon et al. (1994) con las modificaciones que fueron adaptadas por Echeverria et
al. (2015).
Tabla 1
Secuencias de cebadores utilizados en este estudio
Gen Cebadores Secuencia Pb
COI CIJ1632 CIN2191
5' - TGATCAAATTTATAAT- 3' 5' -GGTAAAATTAAAATATAAACTTC- 3'
≈540pb
12S 12SBI 12SAI
5' -TACTATGTTACGACTTAT- 3' 5' -AAACTAGGATTAGATACCC- 3' ≈400pb
(Arrivillaga et al.,2003; Simon et al., 1994).
Materiales
• Tubos de 1.5ml (Axygen®)
• Tubos de 0.2ml (Bioplastics)
• Cabina de seguridad (LABCONCO, PURIFIED® CLASS I SAFETY ENCLOSURE).
• Vortex (HEIDOLPH, Reax top)
• Juego de Pipetas calibradas (BioPette)
• Termociclador Biorad (C1000 Touch Thermal Cycler)
Reactivos
• Ultra-PURE Distilled Water DNAse, RNAse Free (Invitrogen®)
• Cebadores CIJ1632, CIN2191, 12SBI, 12SAI (tabla x)
• Buffer 10X abm ™
23
• MgSo4 25um abm ™
• dNTP Mix abm ™
• HotStart DNA Polymerase abm ™
Procedimiento
• Se realizaron los cálculos para un volumen de reacción final de 30 µl/tubo de máster
mix, tomando en cuenta que por cada reacción se debía incluir un control positivo y
control negativo. Los componentes del máster mix fueron añadidos en el siguiente
orden como se puede observar en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2
Componentes utilizados para la preparación del master mix del gen COI
Componente Concentración final
1Rx [µl]
Agua 12.58 Buffer 10X abm ™ 1X 3 MgSo4 25um abm ™ 4Mm 4.8 dNTP Mix abm ™ 0.2mM 0.6 Cebador C1N2191 0.6uM 1.8 Cebador C1J1632 0.6uM 1.8 HotStart DNA Polymerase abm ™ 0.07uM 0.42
Tabla 3
Componentes utilizados para la preparación del master mix para el gen 12S ARNr
Componente Concentración final 1X [µl]
Agua 14.41 Buffer 10X abm ™ 1X 3 MgSo4 25um abm ™ 4mM 4.8 dNTP Mix abm ™ 0.2nM 0.6 Cebador 12SAI 0.3uM 0.9 Cebador 12SBI 0.3uM 0.9 HotStart DNA Polymerase abm ™ 0.065uM 0.39
24
1. En tubos de 0.2ml, se colocó 25µl de master mix
2. Posteriormente a cada tubo se le agregó 5µl de muestra de ADN. Para el control
positivo se agregó 5µl de una muestra del estudio de Carrillo (2015), que presentó
amplicones adecuados para los dos fragmentos.
3. Ya en el termociclador se amplificaron las muestras para el gen COI, las condiciones
de amplificación fueron: Desnaturalización inicial a 95°C durante 3 minutos, 35 ciclos
de 95°C durante 30 segundos, 45°C un minuto y 72°C por un minuto y una extensión
final de 72°C por 7 minutos.
4. En el caso del fragmento de 12S ARNr, las condiciones fueron las siguientes:
Desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, 35 ciclos de 95°C durante 30
segundos, 48°C un minuto y 72°C un minuto y una extensión final de 72°C por 10
minutos.
4.4.3.3 Electroforesis
1. Para observar las bandas, se preparó un gel con agarosa al 2% (w/v) TBE 0.5X, se
utilizó SYBR® SAFE como intercalante de ADN.
2. Antes de colocar las muestras en el gel, se adiciono 5ul de colorante Blue/Orange
loading dye 2x.
3. Ya con el colorante, las muestras se colocaron en los pocillos del gel y
posteriormente, se observó y foto documentó las bandas que dieron una reacción
positiva.
4.4.3.4 Secuenciación
Para el trabajo de secuenciación de los amplicones a ser analizados, fueron enviadas a
MACROGEN en Corea del Sur. Para esto se enviaron 30µl de cada muestra, una vez
obtenidos los resultados de la secuenciación, se procedió a revisar la calidad de las
secuencias, para posteriormente obtener la secuencia consenso de cada muestra.
25
CAPITULO III.
5. RESULTADOS
5.1 Distribución Geográfica de Cochliomyia hominivorax
En la Figura 1, se representa la distribución de muestras colectadas y su clasificación. Las
muestras de C. hominivorax se distribuyeron en el 31.91% (15/48), 40.42% (19/48) y
26.65% (12/48) en la región de la Costa, Oriente y Sierra, respectivamente. En el caso de
C. macellaria el 5.26% (1/18) en la Costa y el 94.73% (17/18) en el Oriente, siendo la
provincia de Zamora Chinchipe, donde se colectaron el mayor número de muestras. De
igual manera, se colectaron y capturaron otro tipo de moscas y larvas causantes de miasis
secundarias entre las cuales se encuentran Lucilia sericata 20% (2/10), Dasyphora sp 50%
(5/10), Hydrotaea aenescens 10% (1/10), Dermatobia hominis 10% (1/10) y Ravinia pernix
10% (1/10) distribuidas en la Costa y Oriente. Las muestras de humanos no se muestran en
este resultado.
Figura 1. Distribución de Cochliomyia hominivorax, C. macellaria y otras moscas en Ecuador .
26
5.2 Identificación morfológica de especímenes colectados
La identificación morfológica fue realizada a todos los especímenes, huevos, larvas y
adultos, en la Figura 2, se pueden observar ejemplos de especímenes colectados de C.
hominivorax. En total, se capturaron manualmente 29 moscas; de las cuales, el 10,3%
(3/29) correspondieron a C. hominivorax procedentes de Morona Santiago, Pichincha y
Zamora Chinchipe, el 62% (18/29) se identificó como C. macellaria provenientes de la
provincias de Zamora Chinchipe y Los Ríos, el 3,44% (1/29) correspondiente a Dermatobia
hominis proveniente de la provincia de Morona Santiago, el 24,13% (7/29) de las moscas
fueron identificadas como moscas de diferentes especies (Dasyphora sp, Ravinia pernix e
Hydrotaea aenescens), provenientes de la província de Zamora Chinchipe.
De la misma forma, se identificaron 690 larvas correspondientes a 52 miasis colectadas de
diferentes localidades y 2 muestras de huevos. De las 52 miasis, el 90.15% de las larvas
(622/690), fueron identificadas como GBG y el 9.85% (68/690) mostraban características
morfológicas diferentes y corresponden a las especies Lucilia sericata, 4 miasis (53 larvas)
e Hydrotaea aenescens, una miasis (15 larvas). En el caso de los huevos colectados se
observaron características como: huevos de color blanco, redondeados en la parte
posterior y aplanados en la parte inferior, sutura dorsal extendida a lo largo del huevecillo la
cual se abre en la parte anterior del huevo rodeando por completo el micropilo,
características que corresponden a C. hominivorax el 100% (2/2).
27
Figura 2. (A) Larva de C. hominivorax, (B) Adulto de C. hominivorax .
5.3 Biología Molecular
Posterior a realizar la identificación morfológica se procedió a realizar los análisis de
identificación molecular. En la tabla 4 se detallan los códigos y resultados de la
identificación morfológica y molecular.
Tabla 4
Resultados de la identificación morfológica y molecular de las muestras colectadas en cada provincia del Ecuador.
Código Tesis Provincia Identificación morfológica
Identificación molecular
COI 12S S1-S2-S3-S4 Sucumbíos C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax N1-N2-N3-N4 Napo C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax MS1-MS2 Morona
Santiago C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax
B Bolívar C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax Sto1-Sto2-Sto3 Santo
Domingo C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax
P1-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9-P10-P11-P12
Pichincha C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax
P2 Pichincha C. hominivorax - - Ls1 Guayas Lucilia sericata Lucilia sericata Lucilia sericata Ls2 Guayas Lucilia sericata Lucilia sericata Lucilia sericata Ptz1-Ptz3 Pastaza C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax G1-G2 Guayas C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax SE Santa Elena C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax Ha1 Guayas - Hydrotaea Hydrotaea aenescens
28
aenescens MH1-MH2-MH3-MH4-MH5
- C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax
Ls3 Pichincha Lucilia sericata C. hominivorax C. hominivorax Ls4 Pichincha Lucilia sericata C. hominivorax C. hominivorax Ls5 Guayas Lucilia sericata C. hominivorax C. hominivorax Dh Morona
Santiago Dermatobia hominis Dermatobia
hominis Dermatobia hominis
LR1 Los Ríos C. hominivorax C. macellaria C. hominivorax LR2 Los Ríos C. macellaria C. macellaria C. macellaria LR3-LR4-LR5 Los Ríos C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax O1-O2-O3 Orellana C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax M Manabí C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax ZCH1-ZCH2-ZCH13-ZCH16
Zamora Chinchipe
C. macellaria C. macellaria C. macellaria
ZCH3-ZCH4-ZCH5-ZCH6-ZCH7
Zamora Chinchipe
C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax
D1-D2-D3-D4 Zamora Chinchipe
Dasyphora sp Dasyphora sp Dasyphora sp
ZCH8-ZCH9-ZCH10-ZCH11-ZCH12-ZCH14
Zamora Chinchipe
C. macellaria C. macellaria C. macellaria
ZCH15-ZCH16-ZCH17-ZCH18-ZCH19-ZCH20
Zamora Chinchipe
C. macellaria C. macellaria C. macellaria
Rp Zamora Chinchipe
Ravinia pernix Ravinia pernix Ravinia pernix
Ha2 Zamora Chinchipe
- Hydrotaea aenescens
Hydrotaea aenescens
EO1-EO2-EO3 El Oro C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax ES Esmeraldas C. hominivorax C. hominivorax C. hominivorax S(Sucumbíos), N(Napo), MS Morona, B(Bolívar), Sto(Santo Domingo), P(Pichincha), Ls(Lucilia sericata, Ptz(Pastaza), SE(Santa Elena), Ha(Hydrotaea aenescens), MH(Miasis humano), Dh(Dermatobia hominis), LR(Los Rios), O(Orellana), M(Manabí), ZCH(Zamora Chinchipe), D (Dasyphora), Rp(Ravinia pernix), EO(El Oro).
De las 83 muestras analizadas, realizadas la extracción, amplificación de ADN y enviadas a
secuenciación, solo 64 y 79 muestras presentaron cromatogramas de buena calidad para el
gen COI y 12S ARN respectivamente. Estas secuencias de calidad fueron utilizadas para
realizar los análisis filogenéticos. En las Figuras 2 y 3, se pueden observar las muestras
positivas al correr el gel de agarosa con cada uno de los genes
29
Figura 3. Secuencias amplificadas con gen COI de los especímenes utilizados en este estudio
.
Figura 4. Secuencias amplificadas con gen 12S ARN de los especímenes utilizados en este estudio.
5.4 Análisis filogenético
Los códigos que se observan en cada árbol filogenético se los describen en la Tabla 4.
5.4.1 Filogenia con citocromo oxidasa subunidad I (COI)
Método Bayesiano
En la Figura 5, se muestra el árbol consenso con tres grupos bien definidos; el grupo de
C. macellaria, C. hominivorax y el grupo externo que corresponde a dípteros de
diferentes especies. Los valores de probabilidades posteriores bayesianas (PPB) para el
clado externo I es = 1, PPB= 0.98 para el clado II y para el clado III los valores de PPB=
0.5, que indica que carece de valor de soporte; en cuanto a los clados internos los
valores de PPB son superiores a 0.90. La mayoría de las secuencias tiene
comportamiento monofilético de acuerdo a su morfología, a excepción una secuencia
30
LR 1, la cual fue identificada morfológicamente como C. hominivorax, pero se observa
en el grupo de C. macellaria.
Cabe mencionar que la topología de este árbol bayesiano muestra una subagrupación
identificada morfológicamente como C. hominivorax, agrupada de forma distante a las
referencias de la mosca del GBG obtenidas del genbank.
Figura 5. Árbol consenso de COI con el método bayesiano, se muestran valores de PPB en
cada rama. No se muestran valores < 0.5%.
Método Máxima verosimilitud
El análisis de máxima verosimilitud para el gen COI, arrojó un árbol consenso con
los siguientes parámetros: Valor más alto de verosimilitud log= -1992.31, basado en
el modelo Tamura-Nei, y modelo evolutivo de distribución Gamma de tipo discreta
H aenescens-genbank Ha 1 S 1 BR-genbank ZCH 16 P 6 N 3 ZCH 2 MS 2 Ptz 3 S 4 MH 4 B SE Sto 2 MH 5 LR 5 P 3 CB-genbank IH2 MH 1 O 2 O 1 Sto 1 ZCH 9 ZCH12 ZCH 19 Cm-genbank ZCH 7 ZCH14 ZCH18 ZCH 4 ZCH 20 ZCH 17 ZCH 10 ZCH 8 ZCH 6 ZCH15 ZCH 5 LR 1 LR 2 EO 3 ZCH 3 ZCH 11 P 11 LR 3 ZCH 13 N 4 P 8 P 12 LR 4 P 10 S 3 G 1 EO 1 ZCH 1 Ls 2 Ls 1 Lsericata-genbank Ls 4 Ls 3 Ls 5 Rp Ravinia pernix-genbank Dasyphora sp-genbank Ha 2 D 2 D 3 D 1 D 4 Dh D hominis-genbank
0.02
Cochliomyia hominivorax
Cochliomyia macellaria
Cochliomyia hominivorax
Grupo externo
Grupo externo
0.98
1I
II
III 0.5
1 1
1
1 1
1
1
1
1
0.9
0.98
31
con 4 categorías (+G=0.7087), en el caso de los bootstrap fue de 1000
replicaciones.
En la Figura 6, se observa el árbol consenso que coincide con árbol bayesiano
formado tres grupos definidos y un subgrupo. Los valores de bootstrap en la clados
externos I y II tienen valores superiores a 90%. La agrupación de secuencias que
forman el clado interno que indica una posible subespecie diferente a C.
hominivorax tiene un soporte de bootstrap de 100%, lo que difiere del análisis
bayesiano que el valor de soporte es bajo.
Figura 6. Árbol consenso de COI con el método de máxima verosimilitud, se muestran valores de
bootstrap en cada rama. No se muestran valores < 70% .
Ptz 3 ZCH 2 P 6 O 2 O 1 MS 2 LR 5 MH 5 MHI MH 1 N 3 CB-genbank
S 4 CP-gengank
Sto 1 B MH 4 SE Sto 2 ZCH 16
P 3 S 1 LR 4
P 10 ZCH 1 P 8 ZCH13 N 4 P 12
LR 3 P 11
S 3 EO 1
G 1 ZCH 11
LR 2 ZCH 6
Cm-genbank El Oro2 LR 1 ZCH 3 ZCH 4 ZCH 5 ZCH 7 ZCH 8 ZCH 9 ZCH 10 ZCH12 ZCH 14 ZCH 15 ZCH 19 Zamora Ch18 ZCH 20 ZCH 17
Ls 5 L sericata-genbank Ls 4 Ls 3
Ls 1 Ls 2
Ravinia pernix-genbank Rp
D hominis-genbank Dh
Dasyphora sp-gengank D 4
D 1 D 2 D 3 Ha 2
Hydrotaea aenescens-genbank Ha 1
100
100
100
77
100
99
87
92
78
100 91
84
99
81
0.02
Cochliomyia hominivorax
Cochliomyia macellaria
Grupo Externo
I
II
III
32
5.4.2 Filogenia con 12S ARN
Método Bayesiano
La Figura 7, muestra la topología de árbol consenso, que identifica los tres grupos antes
mencionados sin evidencia de la formación del subgrupo de la especie diferente a C.
hominivorax; al igual que con el gen COI las secuencias muestran un comportamiento
monofilético; sin embargo, la secuencia de nombre LR 1 paso a formar parte del grupo de
C. hominivorax. Los valores de PPB en los clados externos I, II, III, IV son superiores a
0,99.
Figura 7. Árbol consenso de 12S con el método de máxima bayesiano, se muestran valores de
bootstrap en cada rama. No se muestran valores < 70%.
Dasyphora sp-genbank D 2 Ha 2 D 3 D 4 D 1 Ravinia pernix-genbank Rp EO 2 MH 4 ZCH 16 MH1 N 1 S 2 P 7 B N 2 O1 N 3 P 1 ZCH 1 G 2 P 10 ZCH 2 LR 4 LR 3 P 8 Sto 3 P 4 M IH 2 P 11 O 3 ZCH 13 LR 5 Ptz 2 S 4 P 3 P 12 SE P 5 CB-genbank LR 1 N 4 PTZ 3 Sto 1 CP-genbank MH 5 P 6 G 1 S 3 MS 2 O 2 EO 1 S 1 Ptz 1 Sto 2 MS 1 ZCH 17 ZCH15 ZCH 14 ZCH 7 EO 3 LR 2 ZCH 9 ZCH 3 ZCH 8 ZCH 5 ZCH 10 Zamora Ch18 Zamora Ch4 ZCH 6 Cm-genbank ZCH 20 ZCH 11 ZCH 12 ZCH 19 Ls 3 L sericata- genbank Ls 4 Ls 5 Ls 1 Ls 2 Ha 1 H aenescens-genbank D hominis-genbank Dh
0.01
Grupo externo
Grupo externo
1
1
1
1
1 1
1
1
0.99
0.98
0.77
I
II
III
IV
Cochliomyia hominivorax
Cochliomyia macellaria
33
Método Máxima Verosimilitud
El análisis de máxima verosimilitud con el gen 12S se obtuvieron los siguientes parámetros:
valor más alto de verosimilitud log= -625.94, modelo evolutivo de distribución Gamma con 4
categorías(+G=0.0635) y bootstrap de 1000 replicaciones. El árbol consenso Figura 8 solo
tiene los clados externos I y II con valores de soporte adecuados superiores a 0.95. Las
topologías de los dos árboles no evidencian variabilidad genética muy marcada de C.
hominivorax.
Figura 8. Árbol consenso de 12S con el método de máxima verosimilitud, se muestran valores de
bootstrap en cada rama. No se muestran valores < 70%.
Z 16 Z 13 N 2 N 1 Sto 2 Sto 1 SE S 4 S 3 S1 S 2 P 11 P 10 P 6 P 5 Ptz 3 Ptz 2 Ptz 1 O 3 O 2 O 1
N 4 MS 2 M MS 1 LR 5 LR 1 P 12 P 3 MH 4 MH 5 MHI MH 1 CP-genbank CB-gengank B EO 2 EO 1 G 1
N 3 P 1 G 2 LR 3 LR 4 P 4 P 10 P 8 Sto 3 Z 2 Z 1
Z 19 Cm-genbank EO 2 LR 2 ZCH 3 ZCH 4 ZCH 5 ZCH 11 ZCH 6 ZCH 7 ZCH 8 ZCH 9 ZCH 10 ZCH 12 ZCH 14 ZCH 15 ZCH 18 ZCH 20 ZCH 17
Ls 1 Ls 2
L. sericata-genbank Ls 5
Ls 3 Ls 4
Ravinia pernix-genbank Rp
Dasyphora sp-genbank D 1 D 2 D 3 D 4 Ha 2 Hydrotaea aenescens-gengank
Ha 1 D hominis-genbank Dh 100
95
98
99 74
85
78
89
0.02
Cochliomyia hominivorax
Cochliomyia macellaria
Grupo Externo
I
II
III
IV
34
5.4.3 Filogenia genes en conjunto
Método Bayesiano
El árbol consenso de genes combinados para el análisis bayesiano utilizó 64 secuencias de
buena calidad, estableciendo los mismos parámetros antes mencionados. Como se puede
observar en la Figura 9, se muestra un árbol consenso con tres grupos bien definidos; el
grupo de C. macellaria, C. hominivorax y el grupo externo. Los valores de soporte para los
clados externos I y II es PPB= 1, no así el clado III que solo tiene PPB=0.72; los subclados
internos en los cuales se encuentran los grupos de C. macellaria, C. hominivorax y el grupo
externo tiene valores PPB= 1.
La topología de este árbol consenso de genes combinados difieren con la topología de los
árboles consenso de los genes 12S y COI; sin embargo, se observa que el gen COI
predomina en esta topología de árbol combinado, ya que se puede observar el pequeño
grupo de C. hominivorax que se infiere como especie diferente, alejado de las muestras de
referencia.
35
Figura 9. Árbol consenso de genes en conjunto, con el método bayesiano, se muestran valores PPB
en cada rama. No se muestran valores < 0.7%.
Método Máxima Verosimilitud
En cuanto al árbol combinado mediante máxima verosimilitud se elaboró en el portal on line
CIPRES Science Gateway V. 3.3 (Miller et al, 2010), mediante la extensión RAxML,
obteniendo de esta manera el mejor árbol con distribución Gamma (0.10808), bootstrap de
1000 replicaciones y valor más alto de verosimilitud log= 0.1000000000. En la Figura 10, se
observa que los clados I, II, III, IV presentan valores de soporte superior a 92, además se
observa los clados internos con valores superiores a 90, converge con la topología del árbol
bayesiano.
LR 1 LR 2 ZCH 3 EO 3 ZCH 11 ZCH 15 ZCH 5 ZCH 14 ZCH 7 Cm-genbank ZCH 10 ZCH 17 ZCH 20 ZCH 12 ZCH 4 ZCH 18 ZCH 9 ZCH 6 ZCH 19 ZCH 8 G 1 EO 1 P 10 LR 4 P 8 P 12 N 4 ZCH 13 P 11 LR 3 S 3 ZCH 1 S 1 S 4 Sto 2 B MH 4 SE O 2 O 1 P 3 LR 5 CB genbank MH 1 MHI MH 5 BR genbank MS 2 Ptz 3 ZCH 16 P 6 N 3 ZCH 2 Sto 1 L sericata-genbank Ls 3 Ls 4 Ls 5 Ls 1 Ls 2 Hydrotaea aenescens-genbank Ha 1 Rp Ravinia pernix-genbank Ha 2 D 2 D 3 D 1 D 4 Dasyphora sp-genbank D hominis-genbank Dh
0.02
1
0.77 1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
0.72
0.83
0.99
0.98
Grupo externo
Cochliomyia macellaria
Cochliomyia hominivorax
I
II
III
IV
V
36
Figura 10. Árbol consenso de genes en conjunto con el método de máxima verosimilitud, se
muestran valores de bootstrap en cada rama. No se muestran valores < 90%.
Dasyphora sp-genbank a Ha 2 D 3 D 2 D 4
Ls 1 Ls 2
L sericata-genbank Ls 4 Ls 3 Ls 5
LR 4 P 8
EO 1 N 4 P 12
G 1 ZCH 13 LR 3 P 11 S 3
ZCH 1 P 10
BR-genbank N 3 ZCH 2 LR 5 O 1 O 2 MH 5 CB-genbank MH 1 IH P 3 Sto 2
Sto 1 SE MH 4 B ZCH 16
S 1 Ptz 3 P 6 S 4
MS 2 ZCH 4 ZCH 14 ZCH 8 ZCH 12 ZCH 17 ZCH18 ZCH 20 ZCH 10 ZCH 15 ZCH 5 Cm-genbank ZCH 7 ZCH 9 ZCH 6 ZCH 19 ZCH 11 LR 2 EO 2 ZCH 3 LR 1
Hydrotaea aenescens-genbank Ha 1
Ravinia pernix-genbank Rp
D hominis-genbank D hominis
100
92
100
99
100
97
95
86
100
100
97
100
100
0.05
II
I
III
IV
Cochliomyia hominivorax
Cochliomyia macellaria
Grupo Externo
Grupo Externo
37
CAPITULO IV.
6. DISCUSIÓN
6.1 Discusión General
La mosca del gusano barrenador del ganado es una parasitosis que afecta a los animales
de sangre caliente y que causa pérdidas económicas afectando al mercado internacional al
ser considerada como una enfermedad transfronteriza. Es por esto que, desde los años 50
del siglo pasado, la mosca de GBG, por su comportamiento biológico, ha sido considerada
como una parasitosis potencialmente erradicable; hasta la fecha ha sido eliminada en
Centro y Norte América (FAO, 1993; Forero et al., 2008; OIEA, 2018). Desde el año 2012,
varios estudios han sido realizados en el Ecuador que evidencian la presencia de C.
hominivorax logrando profundizar en aspectos epidemiológicos, biológicos y genéticos de la
mosca del GBG (Carrillo, 2015; Jervis, 2014; Morales, 2016; Morejón, 2015; Tapia, 2016).
El Proyecto “Fortalecimiento de las Capacidades Regionales para la Prevención y Control
Progresivo del GBG”, liderado por la OIEA ha propuesto una hoja de ruta para el estudio
eco-epidemiológico en zonas endémicas de América y algunas islas del Caribe. Dentro de
este proyecto el objetivo más relevante es el estudio poblacional de C. hominivorax
(genética de poblaciones) para identificar poblaciones similares o no y que permitan facilitar
y/o adaptar la implementación del programa de erradicación de la mosca GBG en el
continente americano. Hasta el momento, Fresia et al. (2011), han establecido que en
América existen cuatro poblaciones definidas, los grupos: (1) Cuba (CG); (2) República
Dominicana (DRG), (3) como parte del Caribe y en América del Sur, Jamaica, Trinidad y
Tobago, Colombia, Ecuador y Venezuela, definido como norte de la región amazónica (NAG
- North Amazon Group) y (4) sur de la región amazónica conformado por Uruguay,
Argentina, Paraguay y Brasil (SAG - South Amazon Group). No obstante, aún queda por
investigar el flujo génico de esta mosca en Colombia, Ecuador y Perú en el lado de costa
38
del Pacífico. Según Fresia et al. (2014), hipotetizaron a la cordillera de los Andes, como
barrera natural para la migración de moscas desde la Amazonia a la costa del Pacifico y
viceversa. No obstante, en este estudio, se evidencian especímenes de GBG en la
cordillera de los Andes, en alturas promedio de 2.800 m.s.n.m en la provincia de Pichincha
y con condiciones climáticas (humedad 50% a 60%, temperatura entre 12°C y 18°C,
precipitación 165 mm) adversas a las condiciones ideales de vida de la mosca (CFSPH,
2007). La OIE y la OMS reconocen esta parasitosis como una enfermedad transfronteriza,
afectando la inocuidad de alimentos, salud humana y ambiental es por eso que, es
necesario conocer la eco-epidemiologia, genética del GBG para poder establecer un
programa de control que incluye la liberación del moscas machos estériles en zonas
endémicas. (FAO, 1993; OIE, 2013a; OIEA, 2018).
Del mismo modo, en investigaciones previas realizadas por el CIZ ya se ha observado
algunas incoherencias genéticas en las secuenciaciones del COI y 12S ARN (datos no
publicados) que han permitido hipotetizar la presencia de una nueva especie, subespecie o
un grupo poblacional diferente.
6.2 Distribución Geográfica
La literatura científica ha reportado que las condiciones ideales de supervivencia de la
mosca es: Temperatura entre 20°C y 30°C y Humedad entre 70% y 80% (CFSPH, 2007);
las cuales, se encuentran en zonas tropicales y subtropicales del continente americano. Sin
embargo, en el Ecuador, en este estudio, se demostró la presencia de miasis en perros,
cerdos, bovinos y humanos a alturas promedio a los 2.800 m.s.n.m y en las estribaciones
interandinas con condiciones de tipo subtropical. La provincia de Pichincha, en especial la
ciudad de Quito ha demostrado el mayor número de casos de C. hominivorax en perros
locales sin evidencia de haberse movilizado a zonas tropicales o subtropicales endémicas
para el GBG (datos no publicados). La presencia de la mosca de GBG en estas regiones
con condiciones diferentes hace pensar que la mosca se adapta a nuevos territorios y que
39
podría presentar dificultades a los programas de erradicación de la mosca GBG en Sur
América.
6.3 Identificación Morfológica
La identificación morfológica de huevos y larvas no generó ninguna dificultad y estuvo en
concordancia con lo reportado por Carrillo ( 2015) y otras descripciones realizadas en
países como Brasil, Venezuela y Uruguay (Carzola & Morales, 2017; Fresia et al., 2007;
Lyra, 2008); sin embargo, la identificación morfológica en moscas adultas de C. hominivorax
y C. macellaria se dificulta debido a que estas especies son cripticas. Para confirmar su
diagnóstico es necesario la aplicación de estudios de biología molecular. Las características
morfológicas del género Cochiomyia son diferenciables con otro tipo de moscas causantes
de miasis secundarias como larvas de Lucilia sericata e Hidrotaea aenescens y otras
moscas (Dasyphora sp, Dermatobia hominis y Ravinia pernix); por lo que no hubo dificultad
en el diagnóstico.
Un caso de miasis en la provincia de Los Ríos, cuyo diagnóstico morfológico fue C.
hominivorax, presentó resultados ambiguos con los análisis filogenéticos en el gen COI, en
el que se reportó como C. macellaria. Muy probablemente, este resultado sea producto de
un error de manejo de la muestra.
Varios estudios han reportado que la identificación morfológica es suficiente para identificar
GBG a nivel de larva, especialmente L3 (Rodríguez et al., 2016; Figarola et al.,2001). Sin
embargo, a la observación las moscas C. hominivorax y C. macellaria son similares y
poseen características que puede confundir entre estas dos especies (FAO,1993). Según
Arteaga et al. (2012), la putrefacción en la superficie de las heridas podría permitir la
ovoposición de moscas de C. macellaria en zonas tropicales e incluso otros dípteros (miasis
secundaria), en el momento de la recolección de larvas podrían mezclarse confundiendo el
diagnóstico; es por esto que, se sugiere se realice la observación microscópica en todos los
especímenes colectados. Del mismo modo, Morales (2011), en su investigación, mencionó
a C. macellaria como referente en la entomología forense; por lo cual, la mosca de C.
40
macellaria se alimenta de tejido necrótico y donde realiza su reproducción y ciclo evolutivo,
facilitando el diagnóstico forense de un cadáver.
Si bien es cierto las claves dicotómicas son herramientas útiles para identificación de
estructuras en insectos; sin embargo, existen ciertas características en adultos del género
Cochliomyia, como la basicosta, que sirve para diferenciar hembras entre C. hominivorax y
C. macellaria, no sirve para diferenciar machos entre estas especies, haciendo difícil una
correcta identificación morfológica (GilArriortua, Saloña, Cainé, Pinheiro, & Pancorbo,
2013). Adicionalmente la coloración de los adultos entre especies es un tanto similar lo cual
puede crear confusión, es por esto que resulta indispensable confirmar la identificación
mediante técnicas moleculares. (Azeredo-Espin & Lessinger, 2006; Saigusa, Takamiya, &
Aoki, 2005; Wells, Goff, Tomberlin, & Kurahashi, 2002).
6.4 Análisis filogenético
Los Resultados de filogenia de este estudio identifican tres grupos diferenciales, C.
hominivorax y C. macellaria y otro tipo de especímenes. Varios trabajos realizados por
Fresia et al. (2007); Fresia et al. (2013); Fresia et al. (2011) y Mc Donagh et al. (2009), en
genes mitocondriales han obtenido resultados similares a los reportados por este estudio.
La aplicación de marcadores mitocondriales para estudios de diferenciación interespecífica
o intraespecífica, puede resultar útil, ya que no se encuentran sometidos a procesos de
recombinación como sucede como los marcadores nucleares, además de su alta tasa de
mutación y por su herencia materna (Cardoso, Palencia, & Lizasu, 2011). En este estudio
se realizaron seis arboles filogenéticos consensos mediante método bayesiano y el método
de máxima verosimilitud.
Al analizar los árboles filogenéticos, los resultados indicaron que los especímenes de C.
hominivorax, que provienen de la Costa, Sierra y Oriente Ecuatoriano tienen una afinidad
entre si a pesar de pertenecer a distintos lugares geográficos, esto concuerda con el estudio
realizado por McDonagh et al. (2009), quienes hicieron referencia a la similitud genética
evolutiva de especímenes de C. hominivorax provenientes de distintos lugares geográficos
de la República Dominicana.
41
En las topologías de análisis bayesiano y máxima verosimilitud, con gen COI y 12S ARN se
puede diferenciar claramente C. hominivorax, C macellaria y otros insectos (Lucilia sericata,
Dasyphora sp, Hydrotaea aenescens, Dermatobia hominis y Ravinia pernix). Con gen COI,
sin embargo, se observa un subgrupo identificado morfológicamente como C. hominivorax,
el cual se dispone en el árbol de forma alejada a las secuencias de referencias de C.
hominivorax obtenidas del genbank, infiriendo que se puede tratar de otra subespecie o un
híbrido; este resultado se debe a la rápida evolución del gen, lo que permite una adecuada
identificación molecular, lo que concuerda con lo reportado por McDonagh et al. (2009), que
indicaron que COI tiene un mayor grado de diferenciación debido a su rápida evolución.
Adicionalmente, cabe indicar que la secuencia proveniente de la Provincia de Los Ríos
“LR1” fue identificada morfológicamente como C. hominivorax y en base al análisis
filogenético 12S ARN; sin embargo, al análisis filogenético utilizando el gen COI, se la
observa en el clado de C. macellaria. Estudios indican que este fenómeno se debe al
número de muestras con taxa emparentados, haciendo que disminuya la confiabilidad de
gen COI para identificar una especie, pudiendo existir solapamiento entre la variación inter e
intraespecífica (Meyer & Paulay, 2005; Moritz & Ciceroc, 2004). En particular, los hallazgos
encontrados no son confirmatorios y dan lugar a muchas hipótesis que deberán ser
resueltas en futuros estudios como los propuestos en la hoja de ruta del proyecto
“Fortalecimiento de las Capacidades Regionales para la Prevención y Control Progresivo
del GBG”. Esta característica ya fue evidenciada por Carrillo (2015), quien reportó que el
uso de marcadores mitocondriales es adecuado para identificación molecular; sin embargo,
dejan ciertas hipótesis de que tan relacionadas se encuentran las especies de Cochliomyia.
Las relaciones de los genes de acuerdo a la localidad se manifiestan en los árboles
filogenéticos mediante la formación de subclados con muestras de C. hominivorax. En el
primer subclado se agrupan de forma cercana muestras provenientes de las provincias de
Zamora Chinchipe, Orellana, Santa Elena, Santo Domingo, Pichincha; en otro clado se
puede evidenciar muestras provenientes de las provincias de Napo, Sucumbíos, Los Ríos,
42
Pichincha, Guayas. De manera, que es importante señalar que a pesar de que las
provincias pertenecen a distintas regiones ecuatorianas, se puede ver la relación
filogenética entre sí, lo que hace suponer que la cordillera de los Andes no parecería
comportarse como una barrera natural en la distribución de la mosca del GBG. Muy
probablemente, este flujo genético se deba a la movilización de los animales, ya sea por
trashumancia y/o por comercialización de animales dentro de un territorio. De igual manera,
no se descarta la posibilidad que la mosca viaje varios kilómetros por medio de áreas
boscosas y ríos que puedan tener conexión entre provincias y entre regiones, como ejemplo
el Río Blanco, el cual nace en las faldas del volcán Pichincha y recorre por el noroccidente
de la provincia de Pichincha uniéndose al Río Guayllabamba para desaguar y formar parte
del río Esmeraldas llegando de así a la provincia de Esmeraldas (Orellana, 2015). En el
estudio realizado por Tapia (2016), en el cantón San Miguel de los Bancos, hipotetizaron
geográficamente el desplazamiento de la mosca 290 km en dos semanas de acuerdo a lo
reportado por Hightower et al.(1965), pudiendo llegar a las provincias de Manabí,
Esmeraldas y Los Ríos.
Varios estudios hipotetizan que la cordillera de los Andes actúa como barrera natural
geográfica (Fresia et al., 2014; Toledo, 2007), sin embargo en este estudio se obtuvieron
muestras de C. hominivorax en la provincia de Pichincha, que se encontraban a una altura
de 2.800 m.s.n.m dejando como hipótesis de cómo se movilizan estas moscas a esa altura,
es importante señalar que se deben realizar estudios tendientes a develar esta hipótesis.
Por otro lado, al combinar los dos genes en al análisis bayesiano se observa la formación
del subgrupo de C. hominivorax pero con valores de probabilidades posteriores bayesianas
no lo suficientemente fuertes para inferir que se trata de otra especie, de igual forma en el
análisis de máxima verosimilitud el valor de bootstrap para el clado externo donde se ubican
los grupos de C. hominivorax es de 81%, indicando la falta de robustez para inferir que se
trate de otra especie diferente a C. hominivorax. La combinación de los genes es
indispensable para verificar la variación genética de una especie; sin embargo, en este
estudio solo fueron incorporando dos genes. En el estudio de Caterino et al. (2000), quienes
43
reportaron que para inferir variabilidad genética de una especie es necesario realizar
análisis con mayor número de genes mitocondriales. Los análisis filogenéticos de los seis
arboles son congruentes de forma parcial, por lo que se tiene claro que lo genes tienen
historias de evolución diferentes, COI recupera a C. hominivorax como parafilética y C.
macellaria con un comportamiento monofilético; sin embargo, no resuelve si el subgrupo de
C. hominivorax es de una especie diferente. En el estudio de (Yusseff-Vanegas &
Agnarsson, 2016), reportan a C. hominivorax como monofilético con gen COI, identificando
la fuerte relación entre especímenes de Cochliomyia sp. Por otro lado, el gen 12S recupera
a C. hominivorax y C. macellaria como monofiléticas.
Se puede decir que el resultado más importante de este estudio es la baja variabilidad
genética que se evidencia. En este contexto la hoja de ruta sugiere hacer análisis de
distribución de poblaciones, para entender como es la dinámica y genética de la mosca del
GBG en países endémicos de América del sur (OIEA, 2018). En el estudio de Fresia et al.
(2011), definieron 4 poblaciones de C. hominivorax; para América del Sur y algunas Islas
del Caribe están definidos los grupos NAG (Jamaica, Trinidad y Tobago, Colombia,
Ecuador y Venezuela) y SAG (Uruguay, Argentina, Paraguay y Brasil), a pesar que estas
poblaciones no comparten haplotipos, se manifiesta baja variabilidad entre algunas
poblaciones de estos grupos, sugiriendo que estas poblaciones de moscas de los grupos
mencionados se separaron recientemente. Varios estudios, mencionan que, para evidenciar
variabilidad genética en forma más amplia, se requiere establecer una estructura filo
geográfica, tomando como referencia aspectos temporales y ecológicos, para de esta forma
obtener respuestas de la divergencia existente de C. hominivorax (Fresia et al., 2011; Fresia
et al., 2013; Toledo, 2007). Es por eso que resulta indispensable establecer estudios en los
que se tome en cuenta la estructura geográfica del país, en donde se analice si la cordillera
de los Andes, la selva amazónica y los ríos puedan actuar como barreras geográficas o
faciliten el flujo de especímenes de un lugar a otro (Fresia et al., 2014). Todos estos
aspectos ayudarían a entender cuál es la distribución genética de C. hominivorax en las
44
diferentes localidades de Ecuador, en forma ecológica y así poder establecer programas de
control y erradicación. En tal sentido, en el estudio realizado por Lyra et al., (2009),
reportaron que el aislamiento geográfico puede ser causa de la diferenciación de
poblaciones de C. hominivorax y que en cada región se debe realizar estudios de
poblaciones genéticas para conocer cuál es la diversidad genética y de esta manera poder
utilizar la TIE acorde a la situación ambiental y geográfica de cada país.
45
CAPITULO V.
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
7.1 Conclusiones
• Mediante el uso de claves dicotómicas se logró identificar morfológicamente
especímenes de C. Hominivorax en 15 provincias del Ecuador. En el caso de las
moscas se identificó el 10,3% (3/29) correspondieron a C. hominivorax, el 62%
(18/29) se identificó como C. macellaria. De igual manera se identificaron 690 larvas
provenientes de 52 miasis resultando el 90.15% como C. hominivorax y las dos
muestras de huevos el 100% (2/2) identificados como C. hominivorax; sin embargo,
existen ciertas características que pueden confundir entre especies para lo cual es
indispensable confirmar mediante métodos moleculares.
• Los análisis filogenéticos realizados con los marcadores mitocondriales COI y 12S
ARN, identifican claramente las especies de C. hominivorax y C. macellaria,
provenientes de las diferentes localidades del Ecuador, aportando información útil de
la evolución de la especies.
46
7.2 Recomendaciones
• Se requiere realizar estudios con mayor número de marcadores moleculares y
mayor polimorfismo, para poder evidenciar la variabilidad genética de GBG.
• Plantear estudios de filogeografía que complementen a la filogenia realizada en este
estudio, para así poder determinar la relación geográfica y ambiental de C.
hominivorax.
• Realizar un muestreo más amplio por localidad, con el mayor número de
especímenes de C. hominivorax, tomando en cuenta la cordillera de los Andes y la
presencia de ríos, los cuales pueden ser barreras geográficas. De forma se pueda
establecer un programa de control y erradicación de GBG en el Ecuador.
47
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58
9. ANEXOS
Anexo 1. Detalle de muestras colectadas por provincia
N° Código de
tubo Código Tesis
Provincia Localidad Número de muestras Altitud m.s.n.m
Hospedero
Larvas Huevos
Adulto
1 S001 S1 Sucumbíos Gonzalo Pizarro
9 490 Bovino
2 S002 S2 Sucumbíos Putumayo 7 229 Bovino 3 S3 S3 Sucumbíos LagoAgrio 4 30 Bovino 4 S4 S4 Sucumbíos LagoAgrio 8 30 Bovino 5 T001 N1 Napo Tena 14 1.010 Bovino 6 T002 N2 Napo Tena 20 1.020 Bovino 7 CH003 N3 Napo El Chaco 11 1.508 Bovino 8 M MS1 Morona
Santiago Macas 1 604 Bovino
9 B_001 B Bolivar Echeandia 30 883 Bovino 10 STO002 Sto2 Santo
Domingo Valle hermoso
16 307 Bovino
11 Et_B P1 Pichincha Sangolqui 5 2.748 Bovino 12 Fl_C - Pichincha Sangolqui 1 2.748 Bovino 13 Est01 Ls1 Guayas - 15 Ave 14 Est02 Ls2 Guayas 8 Ave 15 PTZ_001 Ptz1 Pastaza Santa
Clara 14 595 Bovino
16 PTZ003 Ptz3 Pastaza Puyo 20 950 Canino 17 PTZ_002 Ptz2 Pastaza Puyo 19 950 Canino 18 G_001 G1 Guayas Juján 25 9 Bovino 19 G_002 G2 Guayas Alfredo
Baquerizo 18 9 Bovino
20 STO_001 Sto1 Santo Domingo
Valle hermoso
49 307 Canino
21 STO_003 Sto3 Santo Domingo
Santo Domingo de los Tsáchilas
3 600 Bovino
22 STE_001 SE Santa Elena La Libertad
10 43 Canino
23 I_001 P3 Pichincha Sangolqui 1 2.748 Bovino 24 N_004 N4 Napo Archidona 13 Bovino 25 Jujan Ha1 Guayas - 15 Bovino 26 H1 MH1 - - 10 Humano 27 H2 MH2 - - 12 Humano 28 H3 MHI - - 12 Humano 29 H4 MH4 - - 14 Humano 30 H5 MH5 - - 10 Humano
59
31 Q1 Ls3 Pichincha Quito 15 2.790 Canino 32 Q2 P4 Pichincha Quito 12 2.770 Canino 33 Q3 P5 Pichincha Quito 10 2.750 Canino 34 Q4 P6 Pichincha Quito 13 2.765 Canino 35 QEC P7 Pichincha Quito 14 2.730 Canino 36 QP Ls4 Pichincha Quito 15 2.790 Canino 37 QS P8 Pichincha Quito 10 2.724 Canino 38 QB P9 Pichincha Quito 10 2.776 Canino 39 QO P10 Pichincha Quito 13 2.755 Canino 40 QC P11 Pichincha Quito 13 2770 Canino 41 IASA P12 Pichincha Sangolqui 15 2748 Bovino 42 Gallo Ls5 Guayas - 1 Ave 43 MNC Dh Morona
Santiago Macas 1 Bovino
44 MC MS2 Morona Santiago
Macas 1 Bovino
45 LR1_larva LR1 Los Ríos Valencia 15 72 Bovino 46 LR1_mosc
a LR2 Los Ríos Valencia 1 72 Bovino
47 LR3 LR3 Los Ríos Valencia 8 73 Bovino 48 LR4 LR4 Los Ríos Palenque 1 73 Canino 49 LR5 LR5 Los Ríos Palenque 18 72 Bovino 50 O1 O1 Orellana Francisco
de Orellana
4 215 Canino
51 O2 O2 Orellana Francisco de Orellana
4 300 Canino
52 O3 O3 Orellana El Coca 7 309 Canino 53 Ma1 M Manabí Chone 5 215 Bovino 54 Z1 ZCH1 Zamora
Chinchipe Zamora 1 922 Bovino
55 Z01 ZCH2 Zamora Chinchipe
Zamora 1 1.307 Bovino
56 Z2 ZCH3 Zamora Chinchipe
Yantzaza 1 1.307 Bovino
57 Z2,2 ZCH4 Zamora Chinchipe
Yantzaza 1 1.204 Bovino
58 Z3 ZCH5 Zamora Chinchipe
Yantzaza 1 1.204 Bovino
59 Z3,2 ZCH6 Zamora Chinchipe
Yantzaza 1 1.204 Bovino
60 Z3.1 D1 Zamora Chinchipe
Yantzaza 1 1.204 Bovino
61 Z3.3 ZCH7 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 1.204 Bovino
62 Z3.4 ZCH8 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 1.204 Bovino
63 Z3.5 ZCH9 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 1.204 Bovino
64 Z3,6 D2 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 1.204 Bovino
65 Z3.7 ZCH10 Zamora San Carlos 1 1.204 Bovino
60
Chinchipe 66 Z3.8 D3 Zamora
Chinchipe San Carlos 1 922 Bovino
67 Z3.11 ZCH11 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 1.204 Bovino
68 Z4 ZCH12 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 1020 Bovino
69 Z5 ZCH13 Zamora Chinchipe
San Carlos 20 1 920 Bovino
70 Z5.2 ZCH14 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 920 Bovino
71 Z5,4 ZCH15 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 920 Bovino
72 Z5,3 D4 Zamora Chinchipe
San Carlos 1 920 Bovino
73 Z5,5 Rp Zamora Chinchipe
San Carlos 1 920 Bovino
74 Z7 ZCH16 Zamora Chinchipe
Centinela del Cóndor
18 858 Canino
75 Zgato ZCH17 Zamora Chinchipe
Centinela del Cóndor
1 840 Felino
76 Z8,2 ZCH18 Zamora Chinchipe
Centinela del Cóndor
1 910 Bovino
77 Z8 ZCH19 Zamora Chinchipe
Centinela del Cóndor
1 840 Bovino
78 Z9 ZCH20 Zamora Chinchipe
Centinela del Cóndor
1 840 Bovino
79 Z9,1 Ha2 Zamora Chinchipe
Centinela del Cóndor
1 858 Bovino
80 EO1 EO1 El Oro Machala 8 75 Bovino 81 EO2 EO2 El Oro Machala 19 70 Porcino 82 EO3 EO3 El Oro Santa
Rosa 15 70 Porcino
83 Es1 ES Esmeraldas 16 50 Bovino TOTAL 690 2 29
61
Anexo 2.
Claves dicotómicas
Identificación de huevos mediante claves dicotómicas (FAO, 1993)
El huevo de C. hominivorax (Fig. 4) mide 1,04 mm de largo y 0,22 mm de ancho
aproximadamente. Es de color blanco cremoso brillante. No es sensiblemente curvo, sino
cilíndrico e igualmente redondeado en ambos extremos, aunque la zona que rodea el
micrópilo está un poco aplastada. La sutura dorsal se extiende del micrópilo casi hasta el
extremo posterior y tiene lados prácticamente paralelos pero que divergen en, ambos
extremos particularmente en el anterior, donde se separan para rodear casi completamente
el micrópilo. Visto con gran aumento, el corion de C. hominivorax tiene una apariencia
reticulada o de encaje. Los huevos se depositan en una masa característica, todos
orientados en una misma dirección (Fig. 5).
Los huevos de Cochliomyia macellaria pueden distinguirse de los de Cochliomyia
hominivorax por una sutura dorsal más estrecha que rodea en menos de la mitad al
micrópilo.
Fig. 4 C. hominivorax - superficie dorsal y extremo anterior del huevo (m, micrópilo; d,
sutura dorsal)
62
Fig. 5 C. hominivorax orientación típica de los huevos en la masa de huevos.
Identificación de larvas
La larva del primer estadio
La larva del primer instar de C. hominivorax tiene la forma típica del gusano (Fig.
6). Al salir del huevo mide en promedio 1,2 mm de largo y 0,23 mm de ancho, y
cuando se ha desarrollado completamente unos 3,6 mm y 0,57 mm, varia según
su alimentación.
Figura 6. C. hominivorax - larva del primer estadio, aspecto dorsal.
63
Figura 7. C. hominivorax - esqueleto cefalofaríngeo de la larva del primer estadio (h,
ganchitos orales)
Larva en segundo estadio
La larva en segundo instar mide 3,5 mm de largo y 0,6 mm de ancho, en el
momento de la muda, a 6,3-7,4 mm de largo y 1,5 mm de ancho, en el momento
en que ha completado su desarrollo (Fig. 8) . El cuerpo posee espinas oscuras
de 55 m de largo, que suelen tener una, dos y hasta tres puntas. La parte
posterior del segmento 11 está rodeado de una estrecha banda de espinas más
pequeñas que apuntan hacia adelante. En el margen posterior del segmento 10
hay filas ventrales y laterales irregulares de espinas y unas pocas espinas
dispersas que se extienden por el dorso, pero sin rodear el segmento.
Figura 8. C. hominivorax - larva del segundo estadio, aspecto dorsal
64
Figura 9. Esqueleto cefalofaríngeo de larva de la segunda etapa de Cochliomyia:
a - C. hominivorax; b - C. macellaria (según Laake et al.,1936).
Larvas del tercer estadio
En el tercer estadio la larva es un gusano de 6 -17 mm de largo y de 1,6-3,5 mm
de ancho. Tiene color blanco cremoso, pero previo a pupar adquiere un color
rosado.
Figura10. C. hominivorax larva del tercer estadio, aspecto dorsal(a, espiráculos
anteriores; m, gancho oral; l, zona lateral fusiforme; s, espinas; 1-12
segmentos)
65
Figura 11. Aspecto dorsal de los segmentos posteriores de Cochlíomyia sp: a -
C. hominivorax, mostrando la pigmentación de los troncos traqueales dorsales; b
- C. macellaria, mostrando la ausencia de pigmentación.
Figura 12. Esqueleto cefalofaríngeo: a - C. hominivorax; b – C. macellaria (según
Laake et al., 1936).
Identificación adultos (FAO,1993)
66
Cochliomyia hominivorax: Placas frontorbitales de la cabeza con pelos negros;
setas postgenales (de color amarillo dorado; basicosta oscura en la hembra;
cuerpo normalmente de color negro azulado intenso, con reflejos parciales verdes
o violetas, 8 a 10 mm
Cochliomyia macellaria: Placas frontorbitales de la cabeza con pelos pálidos;
setas postgenales de color amarillo claro; basicosta amarilla en la hembra; cuerpo
normalmente verde metálico intenso, 6-9 mm
Figura 13. Cabeza de mosca Califórida típica (f, placa frontoorbital; p, postgena)
Figura 14. C. hominivorax adulta con las tres listas longitudinales oscuras del
t6rax (f, fémur; ta, tarso; ti, tibia).
67
