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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
UNIDAD DE INVESTIGACIÓN TITULACIÓN Y GRADUACIÓN
“POTENCIAL BIOSIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE
Schinus molle L. (Molle) FRENTE AL GLUCONATO DE
CLORHEXIDINA AL 0.12% SOBRE Streptococcus mutans,
PRINCIPAL AGENTE CARIOGÉNICO”.
ESTUDIO IN VITRO.
Proyecto de investigación como requisito previo a la obtención del
grado académico de Odontólogo
AUTORA: Daysi Maricela Rivadeneira Cajas
TUTORA: Patricia de Lourdes Álvarez Velasco
QUITO, ECUADOR
Junio, 2015
ii
DEDICATORIA
En primera instancia a Dios, por darme paciencia y
sabiduría para lograr este reto. Beatriz mi madre,
quien ha sido mi inspiración, mi guía y un ejemplo a
seguir como mujer emprendedora, quien ha estado en
aquellos momentos de angustia y debilidad ante las
circunstancias de mi vida, Leopoldino, mi padre, por
sus concejos, enseñanzas, su esfuerzo en el trabajo
diario para sostener nuestro hogar. A mis hermanos,
Alicia, Marco, Franklin, por sus palabras de aliento
y optimismo. A Jonathan, compañero, amigo y
confidente, por su apoyo y confianza en todo mi
trayecto académico.
A mi abuela, Aida que está en el cielo, quien enriqueció el
conocimiento de la medicina ancestral en mi familia.
Son la luz de mi vida.
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco de manera especial la colaboración de la Dra. Patricia de Lourdes Álvarez en
calidad de tutora, por el tiempo dedicado en la revisión de mí trabajo.
Mi perenne agradecimiento al Dr. Carlos Cerón, Biólogo, Docente y Director del
Herbario Alfredo Paredes QAP de la Universidad Central del Ecuador, que posee una
amplia trayectoria investigativa, quien revisó generosamente mi investigación,
compartiendo experiencias, expectativas, material bibliográfico en cuanto a las especies
nativas de nuestro país.
A la Dra. Blanca Naranjo, Docente de Fitoquímica de la carrera de Biotecnología de la
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, por abrirme las puertas de tan majestuoso
establecimiento, su colaboración y por compartir sus saberes tras la elaboración del
aceite esencial.
A su vez agradezco a la Dra. Rachide Acosta quien colaboró en la elaboración de las
pruebas diagnósticas de los cultivos bacterianos en el Laboratorio clínico y
bacteriológico de la Universidad Central del Ecuador.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, Daysi Maricela Rivadeneira Cajas, en calidad de autor del trabajo de investigación
de la tesis realizada sobre POTENCIAL BIOSIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE
Schinus molle L. (Molle) FRENTE AL GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL
0.12% SOBRE Streptococcus mutans, PRINCIPAL AGENTE CARIOGÉNICO
ESTUDIO IN VITRO. Por la presente autorizo a la Universidad Central del Ecuador,
hacer uso de los contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esa obra con
fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y además pertinentes de la ley de Propiedad Intelectual y su
reglamento.
Daysi M. Rivadeneira C.
C.I. 1720105913
v
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de tutor del Trabajo de Grado, presentado por la Señorita Daysi Maricela
Rivadeneira Cajas, para optar por el Título de Odontóloga, cuyo tema es POTENCIAL
BIOSIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Schinus molle L. (Molle) FRENTE AL
GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 0.12% SOBRE Streptococcus mutans,
PRINCIPAL AGENTE CARIOGÉNICO ESTUDIO IN VITRO. Considero que dicho
trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación
pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los veinte días del mes de Mayo 2015
Dra. Patricia de Lourdes Álvarez V.
CI.1713108783
vi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
CERTIFICADO DEL TRIBUNAL
“POTENCIAL BIOSIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Schinus molle L. (Molle)
FRENTE AL GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 0.12% SOBRE
Streptococcus mutans, PRINCIPAL AGENTE CARIOGÉNICO”. ESTUDIO IN
VITRO.
AUTOR: Daysi Maricela Rivadeneira Cajas
El presente trabajo de Investigación, luego de cumplir con todos los requerimientos
normativos, en nombre de la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR,
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA es aprobado; por lo tanto el jurado que se detalla
a continuación. Autoriza a la postulante presentación a efecto de la sustentación pública.
Quito, 15 de Junio del 2015
Dr. Ángel Washington Avilés Aguilar
PRESIDENTE DEL TRIBUNAL
Dr. Iván Ricardo García Merino Dr. Wilfrido Edesmin Palacios Paredes
MIEMBRO DEL TRIBUNAL MIEMBRO DEL TRIBUNAL
vii
ÍNDICE GENERAL
DECLARACIÓN ..................................................................................................................... ii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ..........................................................iv
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR .......................................................................... v
CERTIFICADO DEL TRIBUNAL ..........................................................................................vi
DEDICATORIA ...................................................................................................................... ii
AGRADECIMIENTO ............................................................................................................ iii
ÍNDICE GENERAL ...............................................................................................................vii
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................. x
ÍNDICE DE GRÁFICOS .........................................................................................................xi
ÍNDICE DE ANEXOS ............................................................................................................xii
RESUMEN ........................................................................................................................... xiii
ABSTRACT .......................................................................................................................... xiv
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 15
CAPÍTULO I .......................................................................................................................... 16
1. EL PROBLEMA ............................................................................................................. 16
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.................................................................... 16
1.2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 18
1.3 JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................... 19
1.4 HIPÓTESIS ............................................................................................................... 20
CAPÍTULO II ......................................................................................................................... 21
2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................ 21
2.1. CARIES DENTAL ....................................................................................................... 21
2.1.1 Etiología ................................................................................................................. 21
2.2 Streptococcus mutans .................................................................................................... 23
2.2.1 Supervivencia y patogenia....................................................................................... 24
2.2.2 Factores de virulencia ............................................................................................. 25
2.2.3 Tratamiento y prevención ........................................................................................ 26
2.3. GLUCONATO DE CLORHEXIDINA ......................................................................... 27
2.3.1 Composición ........................................................................................................... 27
2.3.2 Mecanismo de acción .............................................................................................. 28
2.3.3 Modalidad de uso .................................................................................................... 29
2.3.4. Efectos colaterales ................................................................................................. 30
2.4 PLANTAS MEDICINALES ......................................................................................... 30
2.4.1 Principio activo de las plantas medicinales .............................................................. 30
viii
2.4.2 ACEITES ESENCIALES ........................................................................................... 31
2.4.2.1 Generalidades ...................................................................................................... 31
2.4.2.2 Propiedades físicas ............................................................................................... 33
2.4.2.3 Composición química........................................................................................... 33
2.4.2.4 Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales................................................ 34
2.4.2.5 Mecanismo de acción del aceite esencial sobre los microorganismos ................... 34
2.4.2.6 Extracción de los aceites esenciales ...................................................................... 35
2.4.2.7 Extracción por hidrodestilación ........................................................................... 35
2.4.2.8 Hidrolatos ........................................................................................................... 36
2.5. Schinus molle L. (Molle) .............................................................................................. 36
2.5.1 Historia ................................................................................................................... 36
2.5.2 Descripción y etiología ......................................................................................... 36
2.5.3. Taxonomía ............................................................................................................. 37
2.5.4. Extención y distribución geográfica ....................................................................... 38
2.5.5. Composición química ............................................................................................ 38
2.5.6 Propiedades de Schinus molle................................................................................. 39
2.5.7 Propiedades terapéuticas de Schinus molle L. en el ecuador ..................................... 39
2.5.8 Actividad antibacteriana in vitro del aceite esencial de Schinus molle L. .................. 40
2.5.9. Contraindicaciones ................................................................................................. 41
CAPÍTULO III ....................................................................................................................... 42
3. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ................................................................ 42
3.1 TIPO Y DISEÑO DE LA INVESTIGACIÒN ............................................................ 42
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA ..................................................................................... 43
3.3CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN ......................................................... 44
3.4 VARIABLES ................................................................................................................ 44
3.4.1 Conceptualización de variables ............................................................................... 44
3.4.2 operacionalización de variables ............................................................................... 45
3.5 INSTRUMENTOS ....................................................................................................... 46
3.6 PROCEDIMIENTO ...................................................................................................... 47
3.6.1 Recolección de la muestra ....................................................................................... 47
3.6.2 Obtención del aceite esencial de Schinus Molle L. ................................................... 47
3.6.3 Rendimiento del aceite esencial (RAE) ................................................................... 51
3.6.4 Obtención de los microorganismos .......................................................................... 52
3.6.5 Reactivación de la cepa bacteriana .......................................................................... 52
3.6.6 Escoger el adecuado medio de cultivo ..................................................................... 53
3.6.7 Obtención del inóculo bacteriano ............................................................................ 53
ix
3.6.8 Selección de los discos de papel filtro ..................................................................... 55
3.6.9 Preparación de las sustancias en estudio .................................................................. 55
3.6.10 Inoculación de las sustancias en estudio ............................................................... 56
3.6.11 Medición del diámetro de los halos de inhibición de crecimiento bacteriano .......... 61
3.6.12 Evaluación de la efectividad antibacteriana ........................................................... 61
3.7 TÉCNICAS PARA EL PROCESAMIENTO DE DATOS Y ANÁLISIS DE
RESULTADOS .................................................................................................................. 61
3.8 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................................... 62
CAPÍTULO IV ....................................................................................................................... 63
4.1 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ............................................... 63
4.2 DATOS ESTADÍSTICOS ............................................................................................. 64
4.2.1 Media de halos de inhibición a las 24 horas de cada sustancia de estudio ................. 65
4.2.2 Media de halos de inhibicion a las 72 horas de cada sustancia de estudio ................. 66
4.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO........................................................................................... 67
4.3.1 Análisis por Kruskal-Wallis: comparación tres o más sustancias a las 24 y 72 horas.
........................................................................................................................................ 67
4.3.2 Estadísticos descriptivos del análisis de Kruskal-Wallis a las 24 horas .................... 68
4.3.3 Prueba Kruskal-Wallis de muestras independientes ................................................ 68
4.3.4 Prueba estadística dos a dos de las sustancias de estudio frente para la cepa de
Streptococcus mutans ATCC 25175................................................................................. 69
4.4 Estadísticos descriptivos del análisis de Kruskal-Wallis a las 72 horas .......................... 70
4.4.1 Prueba Kruskal -Wallis de muestras independientes a las 72 horas ......................... 71
4.4.2 Prueba estadística dos a dos de las sustancias de estudio frente para la cepa de
Streptococcus mutans ATCC 25175................................................................................. 72
4.5 Grado de sensibilidad según Duraffourd a las 24 y 72 horas de exposición ..................... 73
4.6 DISCUCIÓN ................................................................................................................. 75
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.................................................................... 79
5.1 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 79
5.2 RECOMENDACIONES................................................................................................ 80
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 81
ANEXOS................................................................................................................................ 86
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1:En las imágenes antes expuestas, se puede verificar hojas de Schinus molle L.
trozeadas. Figura 2: Peso en gramos por balanza digital de la muestra vegetal. ........................ 48
Figura 3 Balón de fondo plano con muestra de Schinus molle (Molle) en manta de
calentamiento. ......................................................................................................................... 48
Figura 4: En las figuras expuestas se observa Equipo de Hidrodestilación con trampa de Dean-
Stark. Figura 5: Probeta del equipo de hidrodestilado mostrando la separación de agua-aceite . 49
Figura 6: Equipo de hidrodestilado en funcionamiento ............................................................ 50
Figura 7: retiro del agua residual del hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle ......... 50
Figura 8 Aceite esencial de Schinus molle L. envasado herméticamente en frasco ámbar. ........ 50
Figura 9 : Cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 previa reactivación ............................. 52
Figura 10 : Medios de cultivo Agar sangre. ............................................................................. 53
Figura 11: Suspensión de Streptococcus mutans ajustada a la escala de 0.5 McFarland. ........... 54
Figura 12: Inoculación de cajas petri con Streptococcus mutans. ............................................. 54
Figura 13 : Discos de papel filtro de 6mm de diámetro. ........................................................... 55
Figura 14: Agua destilada, Clorhexidina al 0.12%, Tween 20, Figura 15: aceite esencial de
Schinus molle (Molle) ............................................................................................................. 56
Figura 16: Deposito de las sustancias en tubos de ensayo. Figura 17: Tubos de ensayo estéril y
rotulado. Elaborado por: Lab. Clínico y Bacteriológico UCE. .................................................. 56
Figura 18: Depósito de las sustancias con micropipeta en discos de papel filtro. ..................... 57
Figura 19: Discos de papel filtro embebidos en sustancias de estudio....................................... 57
Figura 20: Incubación de las cajas petri en jarra de anaerobios a 37oC. .................................... 58
Figura 21: Halos de inhibición de gluconato de clorhexidina al 0.12%, Aceite esencial de
Schinus molle (Molle) al 100%, 50% y residuo de hidrodestilado. ........................................... 58
Figura 22: Halo de inhibición producido por el Gluconato de clorhexidina al 0.12% ................ 59
Figura 23: Halo de inhibición del Aceite esencial de Schinus molle (Molle) al 100% a las 24
horas de exposición. ................................................................................................................ 59
Figura 24: Halo d inhibición del Aceite esencial de Schinus molle (Molle) al 50% .................. 59
Figura 25: Halo de inhibición del agua de residuo de hidrodestilado del aceite esencial de
Schinus molle (Molle) a las 24 horas de exposición. ............................................................... 60
Figura 26 : Halos de inhibición del Gluconato de clorhexidina al 0.12%, Aceite esencial de
Schinus molle (Molle) al 100%, 50% y residuo de hidrodestilado a las 72 horas de exposición.
Elaborado por: Lab. Clínico y Bacteriológico UCE. ................................................................ 60
Figura 27: Medición de los halos de inhibición con calibrador milimétrico. ............................. 61
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Datos estadísticos .......................................................................................... 64
Tabla 2: Discrepancia de inhibición entre las 24 y 72 horas de exposición de las
sustancias en estudio. .................................................................................................. 66
Tabla 3: Pruebas de normalidad Kolmogorov - Smirnov y Shapiro – Wilk de las
muestras en estudio obtenido de SPSS®...................................................................... 67
Tabla 4: Estadísticos descriptivos del Análisis de Kruskal-Wallis............................... 68
Tabla 5: Prueba dos a dos de las sustancias en estudio, exposición a las 24 horas. ....... 69
Tabla 6: Estadísticos descriptivos del Análisis de Kruskal-Wallis............................... 71
Tabla 7: Prueba dos a dos de las sustancias en estudio, exposición a las 24 horas. ....... 72
Tabla 8: Grado de sensibilidad según pautas de Duraffourd........................................ 73
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Media de halos de inhibición a las 24 horas ................................................ 65
Gráfico 2: Media de los halos de inhibición a las 72 horas........................................... 66
Gráfico 3: Prueba de Kruskal-Wallis entre las muestras en estudio .............................. 69
Gráfico 4: Comparaciones por parejas de sustancias en estudio ................................... 70
Gráfico 5: Prueba de Kruskal-Wallis entre las muestras en estudio .............................. 71
Gráfico 6: Comparaciones por parejas de sustancias en estudio ................................... 73
xii
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1 : Certificado de la elaboración del aceite esencial de Schinus molle en el
Laboratorio de Fitoquímica de la Carrera de Ingeniería en Biotecnología, de la
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE ................................................................. 87
ANEXO 2: Certificado de realización de pruebas diagnósticas bacteriológicas en el
Laboratorio Microbiológico de la Facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad
Central del Ecuador..................................................................................................... 88
ANEXO 3: Resultados de las pruebas microbiológicas empleadas en la presente
investigación, Laboratorio de análisis clínico y Bacteriológico de la Universidad Central
del Ecuador. ................................................................................................................ 89
xiii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
“POTENCIAL BIOSIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Schinus molle L. (Molle)
FRENTE AL GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 0.12% SOBRE Streptococcus
mutans, PRINCIPAL AGENTE CARIOGÉNICO”. ESTUDIO IN VITRO.
AUTORA: DAYSI MARICELA RIVADENEIRA CAJAS
TUTORA: PATRICIA DE LOURDES ÁLVARES V.
FECHA: 2015
RESUMEN
La presente investigación tuvo como objetivo la evaluación in vitro del aceite esencial
de la especie Schinus molle L. (Molle) por ser abundante en la región interandina de
nuestro país, muy utilizada por nuestros ancestros gracias a sus beneficios sobre
distintas patologías, en éste caso se mostró su efecto sobre cepas de Streptococcus
mutans (ATCC 25175). Estudio que se realizó con el método de difusión en disco, para
determinar la sensibilidad bacteriana a través de halos de inhibición, tanto a las 24 y 72
horas de exposición, para lo cual se utilizaron concentraciones del 100%, 50% y residuo
de hidrodestilado del aceite de Schinus molle, además de utilizar el gluconato de
clorhexidina como control positivo, agua destilada como control negativo, y comparar a
su vez el efecto antimicrobiano de dichas sustancias naturales con el gluconato de
clorhexidina al 0.12%. Los resultados mostraron que todas las concentraciones
utilizadas a demás del residuo del aceite de Schinus molle, provocaron efecto
antimicrobiano frente a la cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175), y de la
comparación realizada, el gluconato de clorhexidina produjo mayor inhibición, pero
disminuyó parcialmente su efecto a las 72horas, mientras que las concentraciones al
100% y 50% potencializaron su efecto en un 0.8% a las 72horas. Se concluye que existe
un efecto inhibidor positivo de alto rango por el aceite esencial de Schinus molle L.
(Molle) frente a cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175, y el gluconato de
clorhexidina es cualitativamente similar al aceite esencial de Schinus molle.
PALABRAS CLAVE: SCHINUS MOLLE, GLUCONATO DE CLORHEXIDINA,
STREPTOCOCCUS MUTANS.
xiv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTY OF DENTISTRY
DENTISTRY CAREER
“BIOSIDA POTENTIAL OF THE ESSENTIAL OIL Schinus molle L. (Molle) FRONT
TO CHLORHEXIDINE GLUCONATE 0.12% ON Streptococcus mutans HOME
CARIOGENIC AGENT”. STUDY IN VITRO.
AUTHOR: DAYSI MARICELA RIVADENEIRA CAJAS
TUTOR : PATRICIA DE LOURDES ÁLVAREZ V.
DATE: 2015
ABSTRACT
In this research the evaluation was conducted in vitro of the essential oil of the species
Schinus molle L. (Molle) for being abundant in the inter-region of our country, widely
used by our ancestors because of its benefits for different diseases, in this case its effect
was shown on Streptococcus mutans (ATCC 25175). This Study performed with disk
diffusion method to determine the bacterial susceptibility through inhibition halos, both
24 and 72 hours of exposure, for which concentrations of 100%, 50% and residue
hidrodestilado oil of Schinus molle were used , besides chlorhexidine gluconate used as
a positive control, distilled water as negative control, and compare the antimicrobial
effect of such natural substances with chlorhexidine gluconate 0.12%. The results
showed that all concentrations used and the oil residue Schinus molle had antimicrobial
effect against the strain of Streptococcus mutans (ATCC 25175), and the comparison
made , the chlorhexidine gluconate produced a greater inhibition, but it decreased
partially its effect to the 72 hours , while concentrations at 100% and 50% potentiate
their effect in 0.8% to the 72 hours. As a conclusion there is a positive senior inhibitory
effect by the essential oil of Schinus molle L. (Molle) against strains of Streptococcus
mutans ATCC 25175, and chlorhexidine gluconate is as qualitatively as the essential oil
of Schinus molle.
KEYWORDS: SCHINUS MOLLE, CHLORHEXIDINE GLUCONATE,
STREPTOCOCCUS MUTANS
15
INTRODUCCIÓN
La medicina ancestral en el área de la salud se ha perfeccionando a lo largo del
tiempo, e incrementó por el rigor científico de ensayos químicos, farmacológicos,
toxicológicos y clínicos, en busca de los principios activos para explicar en forma
racional el uso terapéutico de una planta y su empleo. Además a lo largo del siglo XX,
la química sintética logró grandes avances en la creación de compuestos, orgánicos o
inorgánicos, que pudieron inhibir la proliferación de bacterias. (Gonzales, 1998)
La caries dental considerada como una enfermedad infecciosa, crónica, transmisible
y multifactorial, siempre ha tenido alta prevalencia en la población infantil, adolescente
y adulta, por lo se formó como un problema de salud pública en diferentes países en los
cuales se estudió la transmisión, distribución, etiología e incidencia de Streptococcus
mutans, buscando una solución ante esta problemática se incrementó medidas de
precaución como: el cepillado dental, y uso de enjuagues bucales como complemento,
siendo en niños no considerado el uso de químicos a base de alcoholes pero si el uso de
enjuagues cuyos principios activos sean naturales (Graciano, 2012).
Sin embargo, como parte de un fenómeno de cambio de actitud hacia lo ecológico y
natural, se busca productos cuyo impacto sobre el ambiente sea menor, tenga un origen
natural y con pocas modificaciones industriales, que se fabrique a partir de insumos
locales, y que permita restituir a los pobladores parte de la ganancia, creciendo en la
industria farmacéutica (Arellano, 1998); (Gonzales, 1998).
Considerando lo antes mencionado, se llevará a cabo dar a conocer un posible
medicamento natural que se permita ser utilizado como alternativa en prevención de
enfermedades de la cavidad oral, comparándolo con medicamentos cuyas
contraindicaciones y efectos adversos son mayores. Teniendo en cuenta que los
medicamentos naturales son realmente puros y que podrían poseer los mismos
beneficios que los medicamentos químicamente formados.
16
CAPÍTULO I
1. EL PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La medicina natural hoy en día es considerada como una de las alternativas
terapéuticas en todo el mundo, principalmente en países subdesarrollados y en el área
rural, así como países cuyo desarrollo es más avanzado y cada día se encuentran en total
investigación para la producción de medicamentos alternos con mayores ventajas como:
el bajo costo, la materia prima en el que se basan, así como las desventajas que algunos
proporcionan.
La utilización empírica de las plantas, ha sido reconocida en múltiples culturas del
mundo y transmitidas a través de generaciones. Sin embargo el alta demanda de
productos naturales, y la creciente desconfianza hacia sus pares sintéticos, nos obliga a
proponer el uso de sustancias accesibles a zonas rurales pertenecientes a nuestro país.
Determinando que dichas sustancias permitirían ayudarnos a crecer en una industria
farmacéutica gracias a la materia prima que posee (Molinari, 2013).
Ecuador, país enriquecido por su diversidad vegetal, posee variedad de plantas
medicinales utilizadas por varias etnias, como la especie Schinus molle L. ya que se ha
utilizado como antimicrobiano, antifúngico, antiinflamatorio, entre otros. La costumbre
de su uso se ha perdido a través del tiempo, y su terapéutica se pretende rescatar a base
de la presente investigación, utilizando sus esencias como tratamiento alternativo para
preservar la salud oral.
“Los microorganismos de la cavidad oral son capaces de producir varias enfermedades,
a la vez poseen la capacidad de invadir tanto tejidos duros como blandos de la boca y
en peores condiciones diseminarse hacia todo el organismo” (Azaña, 2010, pág. 35). La
caries dental fue considerada como una de las enfermedades más prevalentes y un
problema de salud pública, donde se ha buscado soluciones para disminuir su índice de
prevalencia en todo el mundo. (OMS, 1987).
17
El Streptococcus mutans capaz de colonizar tempranamente en la boca del niño, se
ha considerado como agente cariogénico difícil de eliminar (Palomear, 2006). Para esto
su control resulta necesario utilizar métodos como colutorios, cabe mencionar que en
los últimos años ciertas sustancias químicas han ocasionado verdadera resistencia
bacteriana por el uso indiscriminado de las mismas.
Dentro de las sustancias antibacterianas se le ha considerado al gluconato de
clorhexidina como uno de los agentes químicos o antisépticos que permite controlar
patologías orales tanto de tejidos blandos cono duros de la cavidad oral, debido a su
efecto inhibidor presentándose a altas o bajas concentraciones en enjuagues bucales,
pastas dentales, gel y esprays (Rivera, 2011). Considerándolo al “0.12%” más utilizado
en colutorios dentales después del cepillado dental, como prevención ante enfermedades
del periodonto y caries dental, siendo uno de los antibacterianos más utilizados, se
adquiere desconociendo sus efectos adversos.
Estudios han revelado las distintas propiedades y beneficios que presentan las
plantas medicinales que han sido de uso tradicional, para separar aquellas con mejor
comportamiento biológico, que permitan la creación de drogas quimioterápicas a partir
de sus principios activos (Ibarra, 2014); (Rodriguez, 2009).
De acuerdo a lo mencionado nuestra investigación se plantea en formular: ¿En qué
proporción el aceite esencial de Schinus molle L. (Molle)1 ejerce actividad inhibitoria
sobre cepas de Streptococcus mutans, en comparación al gluconato de clorexidina al
0.12% ?
1Formato de nomenclatura botánica de la planta Schinus molle L. (Molle): Epíteto genérico, epíteto
específico, apellido del clasificador en letras itálicas y en paréntesis su nombre común.
18
1.2 OBJETIVOS:
1.2.1 Objetivo General:
Evaluar el potencial biosida “in vitro” que posee el aceite esencial de Schinus molle L.
frente al Gluconato de clorexidina al 0.12% sobre Streptococcus mutans principal
agente cariogénico.
1.2.2 Objetivos Específicos
Determinar el efecto antibacteriano cuantitativamente mediante la longitud del
halo de inhibición procedente del aceite esencial de Schinus molle L. a
concentraciones del 100%,50%, residuo de hidrodestilado del aceite esencial de
Schinus molle y gluconato de clorhexidina al 0.12% en cultivos bacterianos de
Streptococcus mutans a las 24 y 72 horas de exposición.
Establecer el grado de sensibilidad cualitativa del Streptococcus mutans ante las
concentraciones de 100%, 50% , y residuo de hidrodestilado del aceite esencial
de Schinus molle L. a las 24 y 72 horas de exposición
Relacionar la efectividad antimicrobiana del aceite esencial de Schinus molle L.
frente al Gluconato de clorexidina al 0.12% de 24 a 72 horas de exposición.
19
1.3 JUSTIFICACIÓN
A lo largo del siglo XX, la Bioquímica logró grandes avances en la creación de
compuestos, orgánicos o inorgánicos, que inhibieron la proliferación de bacterias, como
resultado de nuevos medicamentos para disminuir ciertas enfermedades que muchas
veces ocasionaban verdaderas epidemias (Arellano 1998).
En el área de Odontología se ha implementado sustancias naturales a los enjuagues
bucales para disminuir el grado de placa bacteriana, como parte de un fenómeno de
cambio de actitud hacia lo ecológico y natural, a su vez productos cuyo impacto sobre
el ambiente sea menor, tenga un origen natural y con pocas modificaciones industriales,
además de haber sido fabricado a partir de insumos locales (Villalbos, 2001).
Varios estudios se han realizado para disminuir la sintomatología de varias
enfermedades ante microorganismos que ocasionan infecciones, usando aceite esencial
de Schinus molle L. (Molle), especie nativa de la región interandina, que podría ser
utilizado en la industria dando apertura a mas investigaciones sobre dicha especie en el
área de salud. (Molinari, 2013).
Gracias a que nuestro país consta de una gama de climas separados por regiones, se
ha encontrado gran diversidad de flora y fauna, es así como la Región Interandina del
Ecuador, una de las cuatros regiones naturales que ofrece desde climas calientes,
templados y fríos, se encuentra enriquecida de variedad natural (Orozco, 2013). En las
zonas rurales anexas a la capital de nuestro país se ha podido encontrar gran cantidad de
individuos de la especie nativa Schinus molle L. cuyo conocimiento medicinal
odontológico llega de generación en generación gracias a su utilización por nuestros
ancestros (Gonzalez, 2009).
Schinus molle L. es utilizado en el área médica por sus propiedades medicinales, no
obstante el estudio en el área odontológica aún no se ha desarrollado completamente, es
así que gracias a esta investigación se plantea enriquecer y complementar las
propiedades antimicrobianas que ofrece esta especie natural, cuya utilización como
medicamento alternativo a bajo costo y fuera de efectos adversos proporcione una base
de tratamiento para enfermedades frecuentes de la cavidad oral y sus posibles usos en
los tratamientos preventivos.
20
1.4 HIPÓTESIS
El aceite esencial extraído de Schinus molle L. actúa como agente biosida ante
Streptococcus mutans.
El residuo de hidrodestilado del aceite esencial extraído de Schinus molle L. posee
efecto biosida ante Streptococcus mutans
El uso del aceite esencial de Schinus molle L., posee efecto biosida similar al Gluconato
de clorexidina al 0.12% ante Streptococcus mutans.
21
CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1. CARIES DENTAL
La caries dental ha sido nombrada como una de las enfermedades más prevalentes
en la población mundial según la Organización Mundial de la Salud, la cual inicia con la
erupción dentaria incluyendo un reblandecimiento del tejido duro de los dientes hasta la
formación de la cavidad cariosa (OMS, 1987). Considerando a su vez, que si no se
atiende oportunamente afecta a la salud de todo el organismo.
A la caries dental se le ha conocido como una enfermedad infecciosa, transmisible,
compleja, y multifactorial, en la que un amplio grupo de factores biológicos, socio-
económicos y culturales interactúan directa o indirectamente en el establecimiento y
desarrollo de los microorganismos cariogénicos incluidos en la comunidad microbiana
de la biopelícula dental, por lo tanto afecta a la estructura dura de las piezas dentales y
caracterizándose por la desintegración molecular, localizada y progresiva (Negroni,
2009). Por lo tanto cabe mencionar que la caries dental surge indudablemente del
desequilibrio de factores fisiológicos entre el mineral de las piezas dentarias y los
constituyentes de la biopelícula
2.1.1 Etiología
El desarrollo de la caries se relaciona a la vez a un proceso dinámico durante el cual
la estructura dentaria sufre una desmineralización progresiva, que va produciendo
lesiones ya que los aumentos periódicos de los ácidos orgánicos, como el ácido láctico
después de la ingestión de almidones y los azúcares habituales de la dieta sacarosa,
fructosa, glucosa y lactosa, provocan una desaturación de calcio y fosfato con la
consiguiente pérdida de minerales (Jensen, 1999).
Los microorganismos de la cavidad oral han desempeñado un papel relevante en la
inducción, la progresión y la perpetuación de varias enfermedades que tiene la
capacidad de invadir tanto tejidos duros como blandos de la boca provocando varias
patologías (Azaña, 2010).
22
La caries como enfermedad infecciosa y transmisible a la vez producida por la
concurrencia de bacterias específicas, también ha dependido de la resistencia del
huésped y un hábitat adecuado en la cavidad oral. La conjugación de estos factores
favorece a la acidificación local del medio que produce degradación de hidratos de
carbono de la dieta, a su vez seguida de la destrucción progresiva del material
mineralizado y proteico del diente (Palomear, 2006). A menos que este proceso sea
detenido por una terapia específica, puede llevar a la pérdida total de la pieza dentaria.
Para Crall, 2006, el padecimiento de mayor prevalencia y costo en el mundo, lo
constituyen las enfermedades cariosas ya que se calcula un “70%” en la población
mundial. Sin embargo, ésta prevalencia es mucho mayor en países menos desarrollados
y con mayor índice de pobreza. La Organización Mundial de la Salud (OMS)
actualmente menciona que el “60% al 90%” de los escolares de todo el mundo presenta
caries dental. Aun cuando la manifestación de este padecimiento es la disolución de la
estructura del diente, su naturaleza biológica es infecciosa (Portilla, 2010).
La presencia de microorganismos capaces de producir ácido suficiente para
descalcificar la estructura del diente se han considerado necesarios para este proceso,
por lo tanto eso implica al Streptococcus mutans como el principal y más virulento
microorganismo responsable de la caries dental (Palomear, 2006). Existen otros
microorganismos como Lactobacillus, Actinomyces y otros tipos de Streptococcus, que
también han participado, pero su rol es de menor importancia.
Varios estudios han proporcionado pruebas sobre el principal agente causante de
caries, donde mencionan al Streptococcus mutans, con su consiguiente colonización y
acumulación de placa en los dientes, es decir que cuanto mayor sea el nivel de
Streptococcus mutans, mayor es la acumulación de placa y mayor el riesgo de
desarrollar caries (Modesto, 2011). Convirtiéndose en el control de los niveles de
Streptococcus mutans como el objetivo principal en la prevención y el control de la
caries dental.
El aumento de S. salivarius a demás del S. mutans y Lactobacillus casei, han sido
responsables de producir una transformación de una placa básica “no cariogénica” en
23
una placa patogénica, capaces de producir caries dental, (Laurisch, 2000) considerando
que entre las bacterias responsables de producir caries se ha valorado al Streptococcus
mutans y Lactobacillus como productores de ácido láctico, difíciles de neutralizar por la
saliva y por ende productores de caries.
La alta prevalencia de caries que se ha presentado en el mundo entero ha afectado
del “95%” al “99%” de la población, situándola como principal causa de pérdida de
dientes, ya que de cada 10 personas, 9 presentan la enfermedad o las secuelas de esta,
que tiene su comienzo casi desde el principio de la vida y progresa con la edad de 26
años (Duque, 2003).
Cabe recalcar que la colonización temprana de Streptococcus mutans en los niños, a
primeras etapas de vida, ha sido a través de la saliva de los adultos, especialmente de
sus madres, considerándole una patología altamente transmisible (Palomear, 2006). Se
ha menciona la utilización de colutorios sintéticos o naturales que permitan reducir la
caries y placa bacteriana considerando los altos índices de prevalencia en la población
mundial, como una alternativa preventiva.
2.2 Streptococcus mutans
Los Streptococcus se encuentran dentro de la clase Bacilly clasificados como aerobios facultativos, gran
positivos de la familia Lactobacillales, constituyen el grupo más numeroso dentro de la cavidad bucal,
donde la mayoría de éste grupo son: Streptococcus de los
grupos salivarius, mutans, anginosus sanguinis y mitis.
(Negroni, 2009, pág. 238)
El Streptococo mutans ha sido descrito por Clarke en “1924”, a partir de la caries
de dentina. Su primer habitad ha sido en la superficie dentaria del hombre, pero también
se lo ha identificado en fauces. Su presencia en la biopelícula dental se ha visto
favorecida por el alto nivel de sacarosa de la dieta. (Negroni, 2009). Varios estudios han
demostrado que el S. mutans está relacionado íntimamente con la biopelícula de la placa
cariogénica y asociado con su comienzo; al mismo tiempo, en la saliva hay un aumento
significativo de estos microorganismos antes de la formación de la caries dental.
El Streptococcus mutans se ha presentado como habitante de la microbiota oral por
años y constituye la primera causa de caries dental, incluyéndolo entre otras infecciones
24
graves con Streptococcus del grupo viridans, tales como bacteriemia y endocarditis
(Spellerberg, 2007). Sin embargo, puede constituir un desafío diagnóstico debido a su
capacidad de presentarse como "bacilo grampositivo".
2.2.1 Supervivencia y patogenia
El lugar de residencia para el Streptococcus mutans es en la superficie del diente,
sin embargo no se ha presentado en la cavidad oral de infantes sino hasta la erupción del
primer diente temporal, aparentemente una dosis mínima de S. mutans puede ser
suficiente para implantarse en humanos, produciéndose así la transmisión por vía directa
entre madres e hijos, sin embargo cuando se ha comparado el material genético de dos
bacterias de la misma especie, se ha observado diferencias en el patrón de fragmentos
de ADN , cortados por enzimas específicas, reconociendo que las dos bacterias
provienen ya sea de diferentes fragmentos de ADN o del mismo (Fields, 1994).
El Streptococcus mutans ha sido mencionado como un coco gram positivo, que
primero coloniza la superficie de los dientes, después sintetiza una solución
polisacárida, que permite la adhesión de bacterias en las superficies dental, luego
fermenta la sacarosa para formar ácido láctico siendo muy efectivo para la
desmineralización de la estructura del diente (Estrada, 2006). En cuanto a la producción
de polisacáridos extracelulares a partir de la sacarosa se realizan por acción de dos
enzimas, la Glucosiltransferas (GTF) y la Fructosiltransferasa (FTF). La sacarosa como
disacárido formado por una molécula de glucosa y una de fructosa, en cuanto que la
Glucosiltransfrerasa puede ser capaz de sintetizar glucán a partir de la glucosa y la
Fructosiltransferasa, fructán a partir de la fructosa (Modesto, 2011).
La glucosa polimerizada principalmente sirve para formar una malla de glucano, a
partir de ésta conjuntamente con una gran población de S. mutans, otras bacterias y
residuos orgánicos forman la placa dental, que se adhiere tan firmemente a la superficie
de los dientes que la solución limpiadora habitual de la boca, la saliva, no puede
eliminarla. En segundo lugar, como producto final de la fermentación de la glucosa, el
S. mutans produce ácido láctico, que daña el esmalte dental desmineralizándolo
(Ingraham, 1998).
25
2.2.2 Factores de virulencia
Se ha considerado que la virulencia de un microorganismo, se refiere a la capacidad
de producir daño, es decir, generar una enfermedad, no obstante los factores de
virulencia han sido establecidos como condiciones o características específicas de cada
microbio que lo hacen patógeno.
En el caso del Streptococcus mutans, los más involucrados en la producción de caries
son:
ACIDOGÉNESIS: el estreptococo puede fermentar los azúcares de la dieta para
producir principalmente ácido láctico como producto final del metabolismo.
Esto hace que baje el pH y se desmineralice el esmalte dental. De esta manera se
alcanza el pH crítico de desmineralización 4,5-5,5 (Negroni, 2009), (Estrada,
2006).
ACIDURICIDAD: es la capacidad de producir ácido en un medio con pH bajo.
ACIDOFILICIDAD: el Estreptococo mutans puede resistir la acidez del medio,
gracias a su poder enzimático que le permite bombear protones (H +) fuera de la
célula (Estrada, 2006).
SÍNTESIS DE GLUCANOS Y FRUCTANOS: por medio de enzimas como
glucosil y fructosiltransferasas (GTF y FTF), se producen los polímeros glucano
y fructano, a partir de la sacarosa. Los glucanos insolubles pueden ayudar a la
célula a adherirse al diente y ser usados como reserva de nutrientes (Estrada,
2006).
SÍNTESIS DE POLISACÁRIDOS INTRACELULARES: como el glucagón,
sirven como reserva alimenticia y mantienen la producción de ácido durante
largos períodos aún en ausencia de consumo de azúcar (Estrada, 2006).
26
PRODUCCIÓN DE DEXTRANASA: además de movilizar reservas de energía,
esta enzima puede regular la actividad de las glucosiltranferasas removiendo
productos finales de glucano (Estrada, 2006).
2.2.3 Tratamiento y prevención
Considerando a la caries dental como un problema de salud pública no solo en
nuestro país, sino a nivel mundial, se han propuesto establecer controles oportunos para
disminuir y controlar los altos índices de placa bacteriana los cuales están íntimamente
relacionados con la caries dental (Moromi, 2009), cabe recalcar que en la cavidad
bucal existen más de 500 especies bacterianas, siendo el Streptococcus mutans el
microorganismo de mayor importancia en esta patología, para ello el control de los
microorganismos relacionados con placa bacteriana y caries dental han sido de vital
importancia, y uno de los mecanismos recomendados está el uso de antimicrobianos.
Se han dirigido esfuerzos para la búsqueda de métodos preventivos que sean
eficaces ante la caries dental y placa bacteriana, teniendo en cuenta la importancia de la
prevención oportuna en los problemas de la cavidad bucal, entre otras alternativas se ha
propuesto el flúor en sus diferentes formas, la aplicación de resinas y la eliminación
correcta de la placa, tanto por medios químicos como mecánicos (Duque, 2003).
Entre otros tratamientos tenemos la aplicación de sellantes en las fisuras de las
superficies oclusales de molares y premolares jóvenes, para proteger las piezas
dentarias. Estos han actuado como barrera al paso de los microorganismos y se han
recomendado principalmente para piezas definitivas, después de su erupción en boca
(Chasteen, 1986). Otras medidas están dirigidas a mejorar la calidad de la dieta,
disminuyendo el consumo de hidratos de carbono.
Los métodos químicos de prevención y tratamiento resultan verdaderamente
importantes, por lo tanto, en el mercado se han encontrado antisépticos que combaten
los gérmenes de la placa y caries dental, como es el caso de los bisguanídicos, fenoles,
fluoruros, agentes oxigenantes, detergentes, alcoholes inanimados. Los enjuagues
diarios por períodos de tiempo recomendados por el odontólogo, han reducido la
27
cantidad de placa bacteriana (Escobar, 1991). Cabe recalcar que estos colutorios no
deben usarse en niños sin la supervisión de un adulto, ya que pueden ser ingeridos, a
demás que muchos agentes químicos poseen reacciones adversas.
Últimamente los científicos han puesto su atención en la medicina natural, a partir
de plantas y sus propiedades antimicrobianas, comprobando una serie de propiedades de
compuestos como los polifenoles de los extractos, los cuales han combatido a bacterias
productoras de ácido láctico, de acuerdo a ello, la Sociedad Americana de
Microbiología 2004, mencionó que “los extractos de plantas naturales eliminan
bacterias por sus principios activos y pueden ser incluidas dentro de las alternativas de
higiene oral” (Moromi, 2009, pág. 24).
Se ha recomendado que los médicos pediatras y a los demás profesionales de la
salud que tienen contacto precoz con las madres embarazadas y mujeres con niños
pequeños estimulen e insistan en el cuidado de su salud oral como parte del cuidado de
su propia salud y la de sus hijos (Palomear, 2006), para ello a su vez se espera en un
futuro contar con vacunas que protejan contra las bacterias de la placa bacteriana y en
ese sentido existen nuevas líneas de investigación, lo cual resulta importante como
medio de interés en el área de salud publica en la población mundial (López, 2009).
2.3. GLUCONATO DE CLORHEXIDINA
Se le ha considerado al Gluconato de Clorhexidina como un fármaco antiséptico
derivado del clorofenilbiguanido (bis-biguanida), de carga positiva es decir catiónica,
con tiempo de acción prolongado, que posee un amplio espectro de acción sobre varios
microorganismos (Burgos, 2010).
2.3.1 Composición
Fardal y Tumbull en 1986 han considerado que la clorhexidina tiene una “base
fuerte dicatiónica a pH superior a 3,5 con dos cargas positivas en cada extremo del
puente de hexametileno”. Es esta naturaleza dicatiónica la que la hace extremadamente
interactiva con los aniones, lo que es relevante para su eficacia, seguridad, efectos
secundarios locales y dificultad para formularla en productos, además siendo una base,
28
la clorhexidina se mantiene más estable en forma de sal y la preparación más común es
la sal de digluconato por su alta solubilidad en agua (López, 2009).
Se ha propuesto que la clorhexidina se compone por cristales incoloros e inodoros
solubles en agua y de aquí su uso mediante la fórmula de sal hidrosoluble. Con pH
fisiológico la molécula de clorhexidina se disocia, de esta forma una molécula cargada
positivamente, así liberada será capaz de unirse a la pared bacteriana que posee carga
negativa, alterando de esta manera el equilibrio osmótico (Azofeifa, 2014).
2.3.2 Mecanismo de acción
Se ha preciado que la molécula de clorhexidina se une a las moléculas de carga
negativa, fundamentalmente a grupos fosfato en los LPS (Lipopolisacáridos de la
cápsula de bacterias Gramnegativas) y grupos COOH de las proteínas, impidiendo el
transporte de sustancias. En el caso del esmalte, se une a los iones de la hidroxiapatita.
Éste fármaco desestabiliza y penetra las membranas de las células bacterianas, precipita
el citoplasma e interfiere con la función de la membrana, inhibiendo la utilización de
oxígeno, lo que ocasiona una disminución de los niveles de ATP (Trifosfato de
Adenosina) y muerte celular (Burgos, 2010).
La clorhexidina actúa contra la pared celular de los microorganismos causando
alteraciones en la movilidad electroforética de todo el microorganismo, alterando la
integridad de la pared celular y facilitando la liberación de los componentes
intracelulares. “A bajas concentraciones es bacteriostático, las sustancias de bajo peso
molecular, (K y P) pasan a través de la membrana celular y a altas concentraciones es
bactericida, produce precipitación del citoplasma” (López, 2009, págs. 1,11)
A la clorhexidina se le ha atribuido el poder de actuar sobre la inhibición de la
formación de placa bacteriana uniéndose a los grupos ácidos aniónicos de las
glucoproteínas salivales, reduciendo así el grosor de la placa, para luego unirse a las
bacterias salivales interfiriendo de esta forma su adherencia al diente. Se ha considerado
que la clorhexidina tiene una acción antiinflamatoria por su poder detergente y
antioxidante. Además inhibe la capacidad que poseen las bacterias al momento de
29
activar el metabolismo oxidativo de los neutrófilos, impidiendo la enorme liberación
por éstos últimos de enzimas que participan en el proceso inflamatorio (Veksler, 1991).
Se ha mencionado que el proceso de inhibición de la formación de la placa
bacteriana comienza con la adhesión del gluconato de clorhexidina a las superficies
bucales, sin embargo, un exceso de sacarosa en el medio por la presencia de una
biopelícula madura y organizada disminuye el poder antimicrobiano del gluconato de
clorhexidina al no ser éste capaz de penetrar en las paredes celulares de las bacterias del
biofilm (Negroni, 2009). Cabe recalcar que a parte de la utilización del gluconato de
clorhexidina resulta importante la remoción y tratamiento mecánico de la placa
bacteriana.
2.3.3 Modalidad de uso
El gluconato de clorhexidina ha sido utilizado en el área odontológica en
prevención de infecciones en cirugía bucal (pre y postquirúrgicas), Quimioterapéutico
para prevención de caries dental, quimioterapia de apoyo al tratamiento periodontal,
como sustancia irrigadora durante tratamientos radiculares y como desinfectante de
cavidades antes de su obturación, utilizado en varias concentraciones (Burgos, 2010):
Barnices (Acetato de Clorhexidina): 1% y 10% para la prevención de caries y
sellado de los túbulos dentinarios. (Negroni, 2009)
Colutorios: se lo emplea en concentraciones del 0.12 al 0.2%, enjuagando la
boca durante medio minuto, 2 veces al día con 10-15 ml de solución. Para el
tratamiento de infecciones causadas por prótesis se recomienda lavar la
dentadura y sumergirla en la solución de Clorhexidina durante 15 minutos, dos
veces al día. No se recomienda el uso de la solución de Clorhexidina en niños.
Solución Irrigadora: se lo emplea al 2% para lavar conductos radiculares en
casos de tratamientos y retratamientos, ápices abiertos, alergia al hipoclorito de
sodio o como vehículo acuoso con hidróxido de calcio (en
estudio)
Dentífricos: se la utiliza en concentraciones del 0.02%, 0.12 al 0.2%; debido a
su carga positiva, no debería incorporarse a los dentífricos tradicionales, debido
a que interfiere con el Lauril Sulfato de Sodio, que es el detergente tradicional
30
de los dentífricos, y con el Mono Fluor Fosato de Sodio, ambos con
cargas eléctricas aniónicas (negativas); idealmente, un dentífrico a base de
Clorhexidina debe ser exclusivamente de Clorhexidina.
En aplicaciones tópicas como antiséptico quirúrgico de la cavidad bucal en
concentraciones del 2%
Gel: en concentraciones de 1% - 2%. (Burgos, 2010)
2.3.4. Efectos colaterales
El uso prolongado de la clorhexidina puede presentars coloraciones pardas amarillentas sobre la
superficie de dientes naturales, artificiales y restauraciones de composites, que parecen depender de la
concentración del producto y de la susceptibilidad del individuo. Sin embargo, la coloración no penetra la
superficie y puede eliminarse efectuando la profilaxis, a la vez las pigmentaciones aumentan cuando se
ingieren simultáneamente ciertos productos, como el café, té, vino tinto y también con el uso del tabaco
(Negroni, 2009, pag. 300).
De igual forma se ha visto la presencia de alteraciones transitorias del gusto,
descamación de la mucosa bucal, quemaduras, hipersensibilidad, alergias y aumento de
cálculo supragingival que parece tener composición distinta a la habitual (López, 2009).
Se ha propuesto que durante su administración se aumente la frecuencia de higiene
bucal.
El digluconato de clorhexidina fue confirmado como agente causal vía
intradérmica. Sin embargo, los autores no mencionan la incidencia de aparición de estas
reacciones. La recomendación referida es la de usar clorhexidina a la menor
concentración bactericida posible. (Báscones, 2003)
2.4 PLANTAS MEDICINALES
2.4.1 Principio activo de las plantas medicinales
Para, Thompson, 1981, le atribuye el valor medicinal de las plantas curativas, a la
presencia de una sustancia química o principio activo, que produce un efecto
fisiológico. Varios de los principios activos son complejos, desconociéndose aún su
naturaleza química; otros han sido purificados, sintetizados o imitados. Por lo general,
pertenecen a una de estas categorías: “aceites esenciales, alcaloides, glúcidos, taninos,
31
sapogeninas, fenoles, quinonas, terpenos, carotenoides, cumarinas, flavonoides, resinas”
(Azaña, 2010, pág. 38).
Se ha considerado que los principios activos de las plantas se absorben en general
con mayor facilidad que sus equivalentes inorgánicos, obtenidos por síntesis química
(Roger, 1999). Por tratarse de moléculas orgánicas es decir, que ya forman parte de un
organismo vivo que es la planta, atraviesan más fácilmente la mucosa intestinal que las
sustancias inorgánicas o minerales.
La acción terapéutica de la planta ha dependido de la combinación de todas las
sustancias activas, que se potencian y equilibran mutuamente. El conjunto de la planta
resulta más activo que sus componentes por separado (Bruneton, 2001). Se ha
considerado que un medicamento a base de una planta medicinal posee acción más
lenta pero más persistente, sin efecto de rebote ni resistencia. Se ha determinado que la
planta en su estado natural no crea adicción, al contrario que los medicamentos
sintéticos, cabe mencionar que en la actualidad el 25% de los medicamentos prescritos
contienen al menos una planta o alguna sustancia derivada de los vegetales. Esta
proporción va en aumento, a medida que se investigan y se conocen mejor las plantas
medicinales (Roger, 1999).
2.4.2 ACEITES ESENCIALES
2.4.2.1 Generalidades
Se ha preciado que los aceites esenciales son compuestos vegetales que debido a su
consistencia son muy volátiles y de olor intenso, incluyéndose dentro de este grupo
solamente aquellas especies de plantas medicinales que las contienen en
concentraciones elevadas, entre 0,1 y 10 %. (Phalow, 1979)
Los aceites esenciales han sido llamados así por ser constituyentes odoríferos o
aceites de una planta, la palabra esencial deriva del latin “quinta essentia”, que significa
quinto elemento, propuesto por Paracelso en 1526, quien pensaba que esta era el
elemento efectivo en una preparación médica. (García, 1988)
32
Según Elsa y Col, 2006, los aceites esenciales fueron los aditivos naturales que más
interés han generado por años en la industria de los alimentos ya que ofrecen una
alternativa antimicrobiana y antioxidante y logran garantizar la seguridad de los
alimentos en donde se adicionen sin riesgo de contaminar el entorno. Los estudios in
vitro e in situ reportados en frutas, hortalizas y lácticos, han indicado que se requieren
muy bajas concentraciones para lograr un efecto bioconservador (Lagos, 2012).
Por lo tanto se ha considerado que los aceites esenciales son aquellas sustancias
caracterizadas por su volatilidad, formadas por agrupaciones de un gran número de
compuestos químicos aromáticos, dichos compuestos están ampliamente distribuidos en
“coníferas (pino, abeto), mirtáceas (eucaliptus), rutáceas (Citrus spp), compuestas
(manzanilla), si bien las plantas con aceites esenciales se ubican principalmente en las
familias de las Labiadas (menta, lavanda, tomillo, espliego, romero) y las umbelíferas
(anís, hinojo)” (Azaña, 2010, pág. 41).
Los aceites esenciales líquidos a temperatura ambiente, y por su volatilidad, han
sido extraíbles por destilación en corriente de vapor de agua, aunque existen otros
métodos. (Orlando, 2004). En general se han considerado como los responsables del
olor de las plantas, además pueden encontrarse y obtenerse de diferentes órganos: raíz,
rizoma (jengibre), leño (alcanfor), hoja (eucaliptus), fruto (anís), sumidades floridas.
(Bruneton, 2001)
Normalmente los aceites esenciales, se extrajeron por años de diversas partes de las
plantas como flores, frutas, yemas, hojas, raíces, bulbos, semillas, cortezas, hierbas y
madera, considerándose importantes en la industria cosmética (perfumes y
aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica. “Son poco
solubles en etanol; son muy solubles en cloroformo y en aceites fijos o no volátiles
como el aceite de oliva, e insolubles en agua” (Lagos, 2012, pág. 16)
Se ha considerado clasificarlos químicamente en cuatro grupos: los terpenos o
hidratos de carbono de fórmula general (C5H8)n como el limoneno (I); derivados
oxigenados de los terpenos como el citral (II); compuestos aromáticos que contienen
una estructura benzoica como el eugenol (III) y compuestos que contienen azufre y/o
33
nitrógeno como los isotiocianatos y sólo azufre como el dialil disulfuro (IV) (Podlech,
1992).
2.4.2.2 Propiedades físicas
Color: Casi todos los aceites esenciales son incoloros en estado puro y frescos; ante la
exposición al aire adquieren diversos colores.
Olor: El olor de los aceites volátiles es muy variable es su propiedad más característica.
El olor de un aceite es muy sensible ante la exposición al aire.
Sabor: Son tan variables como sus olores. Algunos tan dulces, otros tienen sabores
suaves, picantes, ácidos, cáusticos o ardientes.
Densidad: La densidad de los aceites esenciales varía (entre 0.842 y 1.172 g/ml); casi
todos son más livianos que el agua.
Deterioro: La exposición a la luz y al aire deteriora la calidad y destruyen la fragancia
de los aceites esenciales. Se deben conservar en botellas de color ámbar bien llenas,
tapadas y colocadas en lugar fresco.
Solubilidad: Son solubles a solventes orgánicos como alcohol, el éter, el cloroformo, el
benceno y muchos otros (Lagos, 2012).
2.4.2.3 Composición química
“Están constituidos por muchas clases de compuestos químicos, algunos por un
solo componente en un alto porcentaje y otros por mezclas complejas de compuestos
cíclicos aromáticos, acíclicos, heterocíclicos y derivados oxigenados” (Azaña, 2010,
pág. 39).
En un aceite esencial se ha podido encontrar hidrocarburos alicíclicos y aromáticos, así
como sus derivados oxigenados; alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, sustancias
azufradas y nitrogenadas. Los compuestos más frecuentes derivan biológicamente del
ácido mevalónico; se les catalogan como monoterpenoides y sesquiterpenoides. Las
propiedades fisico-químicas de los aceites esenciales o esencias se han considerado
diversas, puesto que el grupo engloba muchas sustancias muy heterogéneas, de las que
en la esencia de una planta, prácticamente puede encontrarse sólo una o más de 30
compuestos (García, 1988)
Entre los constituyentes principales de los aceites esenciales nombramos:
34
• Hidrocarburos: Mirceno, cinemo, pineno, canfeno, felandreno, bineno, limoneno,
cariofileno, geranioleno, santaleno
• Alcoholes: Isoamílico, geraniol, linalol, citronelol, nerodinol, farsenol, terpinol,
mentol, borneol, bencílico, fenil-etílico
• Fenoles: Timol, carbacrol, eugenol, vainillina
• Aldehidos: Citral, citronelal, anisaldehido, benzaldehido, cinamadehido
• Cetonas: Alcanfor, carvona, mentona, piperitona, acetato fenona
• Eteres: Anetol, metil chavicol, eucaliptol, ascarodol
• Esteres: Salicilato de amilo, benzoato de metilo, acetato de terpinilo, acetato de
geranilo (Agapito, 2003).
2.4.2.4 Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales
Los aceites esenciales, compuestos extraídos de varios tipos de plantas y usados
para preservar alimentos y bebidas, han poseído un efecto inhibitorio sobre el desarrollo
de microorganismos (Azaña, 2010). En varios estudios se ha mencionado la actividad
antimicrobiana de varias especies vegetales en forma de extractos o hierbas aromáticas
que puedan inhibir la formación de patógenos.
Varios estudios han demostrado que las sustancias taninos (compuestos fenólicos) y
terpenos poseen la capacidad de ser astringentes, hemostáticos, antisépticos y
tonificantes (Roger, 1999). A su vez secan y curten la piel y mucosas, favoreciendo la
resolución de procesos inflamatorios y la cicatrización; (Azaña, 2010)
2.4.2.5 Mecanismo de acción del aceite esencial sobre los microorganismos
El mecanismo de acción de aceite esencial hacia los microorganismos resulta
complejo y aún no ha sido del todo entendido y explicado. El modo de acción de los
aceites esenciales también ha dependido del tipo de microorganismos (Azaña, 2010) el
cual ha estado principalmente relacionado con la estructura de la pared celular, la
membrana externa de los mismos, y de la fase del metabolismo intermedio de los
microorganismos inactivando enzimas de reacción (Cano, 2007).
35
2.4.2.6 Extracción de los aceites esenciales
Para obtener el aceite esencial, a lo largo de los años, se han usado diferentes
procesos, consideraba los siguientes métodos:
a) Extracción por expresión
b) Extracción por solución
- Con grasas sólidas y frías
- Con grasas líquidas y calientes
- Con solventes volátiles
c) Extracción por destilación
- Extracción por Hidrodestilación
- Extracción por arrastre de vapor (Motle, 1977).
2.4.2.7 Extracción por hidrodestilación
Esta técnica es una de las más simples y económicas para obtener el aceite esencial
de cualquier planta, entre otras ventajas tenemos el bajo costo y el manejo de la materia
prima para estudios biológicos resulta más eficiente.
La planta se coloca a nivel del agua destilada en un balón de fondo plano. El calentamiento se produce con vapor saturado que se provee de una fuente de calor
que compone el equipo, fluye la humedad y a presión baja, penetrando a través del
material vegetal. Los componentes se volatilizan, y condensan en un refrigerante,
siendo recogidos en un vaso de precipitación, donde se separa el agua del aceite por
diferencia de densidad (Lagos, 2012, pág. 23)
El reflujo o hidrodestilado con trampa de Dean-Stark ha sido creado por Dean W. y
Stark D. en “1920” para determinar el contenido de agua en el petróleo, permite hoy en
día la remoción del agua por decantación mientras procede la reacción, realizando un
reflujo continuo para la recuperación del aceite, (García, 1988) como lo hace la trampa
de Clevenger la cual se basa también en recoger el aceite esencial por diferencia de
densidades
Se ha utilizando el método de Dean-Stark para recolección de aceites esenciales,
donde la mezcla de la muestra vegetal y agua destilada se colocan en un balón, para
alcanzar la ebullición, luego el vapor asciende por el brazo de la trampa y se condensa,
36
el liquido se destila en la cámara principal de la trampa, que funciona como embudo, en
este sitio se separa una fase orgánica que contiene los reactivos y productos orgánicos y
otra acuosa, la fase acuosa se retira progresivamente a través de una llave inferior de la
trampa mientras que los otros productos se van llenando en la cámara hasta alcanzar el
brazo lateral, al final del proceso se puede retirar la parte orgánica u oleosa (Guarnizo,
2009).
2.4.2.8 Hidrolatos
Se ha considerado que los hidrolatos o residuos de hidrodestilado llamados
hidrosoles que en química significa dilución en agua, provenientes de latin hydro que
significa agua y sol que significa solución, considerándolo como un subproducto que
queda como residuo de la obtención del aceite esencial por el método de
hidrodestilación, a la vez como el vapor de agua condensado y recogido al final junto
con el aceite esencial (Peña, 2013), dicha característica resulta importante ya que puede
arrastrar varios compuestos orgánicos esenciales de la planta a demás de un 10% de
fracción del aceite esencial, se le puede llamar la fracción acuosa de la obtención del
aceite esencial, posee características aromáticas (Ramos, 2013).
2.5. Schinus molle L. (Molle)
2.5.1 Historia
El “molle” ha sido considerado como un árbol originario del Perú y extendido a
toda el área andina durante el período pre-hispánico (Ecuador a Chile y Bolivia).
Después de la Conquista, fue llevado por los españoles a Centroamérica y a México,
donde recibió, por eso, el nombre de "Perú" o de "Árbol del Perú". Posteriormente, a
fines del siglo XVIII, se introdujo en California, a partir de la Misión de San Luis Rey
en San Diego. Parece que, simultáneamente, llegó a Europa, ya que varios botánicos de
ese siglo lo mencionan en España. En la actualidad, existe en todo el trópico y su uso es
mencionado en el Mediterráneo, en África y en la India (Orozco, 2013).
2.5.2 Descripción y etiología
Se ha mencionado que Schinus corresponde al nombre del género de la planta, el
cual es de origen griego para designar al lentisco, un árbol similar al Schinus molle; fue
37
aplicado al pimentero falso, porque produce una resina olorosa muy similar a la del
lentisco. “Molle” fue un antiguo nombre genérico para esta planta, utilizado por el
científico francés Tournefort quien fue el primer botánico en dar a conocer el género de
las plantas, a demás deriva del nombre quechua mulli, no del latín molle “flojo”
(Cárdenas, 1989).
“Entre los nombres más comunes del Schinus molle encontramos: pirul, pirú, árbol
del Perú; molle, cuyash, huaribay; aymara, muelle, falso pimiento, pimiento, mullí,
aguaribay, árbol de la pimienta, Gualeguay, pimentero” (Orozco, 2013, pág. 27).
El Schinus molle a la vez fue llamado árbol siempre verde, de 10-12 m de altura de
ancha copa y ramaje colgante, de aspecto "llorón", muy ornamental. Tronco corto,
grueso, muy fisurado, con la corteza que se desprende en placas. La corteza exuda
resinas muy aromáticas. Hojas paripinnadas, de 25-30 cm de longitud dispuestas en
ramillas colgantes en zig-zag. Tienen de 14 a 30 folíolos de forma linear-lanceolada,
casi sin pecíolo, las flores vistosas, tienen tres etapas: muy jóvenes son verdosas,
juveniles son blanquecinas y viejas son rosado claro; están agrupadas en un racimo
terminal (Ojeda, 2008). Las inflorescencias muy ramificadas, largas y colgantes, con
flores pequeñas de color blanco verdoso, el fruto es una drupa carnosa de 0.6mm de
diámetro, rojizo a púrpura, agrupadas en infrutescencias grandes de hasta 30 cm, cada
fruto contiene una sola semilla negra similar a la pimienta (Aguiñada, 2012).
2.5.3. Taxonomía
Reino: Plantae
División: Magnoliiophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Sapindales
Familia: Anacardiaceae
Género: Schinus
Especie Schinus molle L. (Orozco, 2013), (Ayala, Nielsen & Bravo, 1980), (Tropicos,
2015).
38
2.5.4. Extención y distribución geográfica
Schinus molle L. se ha extendido por la región andina de Sudamérica,
principalmente Perú, aunque se ha encontrado de Ecuador a Chile y Bolivia. Vive en
los Andes Peruanos a altitudes de hasta 3,650 m. Ampliamente distribuido en México,
Centroamérica, sur de California y oeste de Texas- Estados Unidos (Ojeda, 2008).
En el Ecuador la distribución altitudinal de Schinus molle L. ha variado de 1500 a
3000 msnm. Teniendo gran capacidad de rebrote, a la vez progresa en terrenos secos y
rocosos gracias a sus raíces bien desarrolladas, que pueden llegar hasta 20 a 30 m de
profundidad para buscar agua, a demás requieren suelos arcillosos o arenosos, tolera
texturas pesadas, suelos muy compactados y pedregosos (Muñoz, 1999). Ésta especie ha
sido muy exigente en luz, ligeramente resistente a las heladas, resistente a las termitas y
a la sequía (Palacios, 2012).
El área de distribución en el Ecuador de Schinus molle L. principalmente ha sido en
la región interandina, constituida por 3 ramales montañosos: Cordillera Occidental,
Central y Oriental, las cuales forman nudos encerrando en su interior hoyas
caracterizadas por ser áreas secas (Ayala, Nielsen & Bravo, 1980). Ha crecido en
bosque natural o intervenido, en las provincias de Loja, Azuay, Chimborazo,
Tungurahua, Cotopaxi, Pichincha, Imbabura y Galápagos, creciendo en un tipo de
bosque pluvioestacional y bosque seco interandino. La especie S. terebinthifolius, solo
ha sido reconocida en el parque La Merced de la ciudad de Ibarra (Aguiñada, 2012),
(Ministerio de Ambiente Ecuador, 2012), (Palacios, 2012).
2.5.5. Composición química
El estudios fitoquímicos de Schinus molle L. han indicado que contiene taninos,
alcaloides, flavonoides, saponinas esteroidales, esteroles, terpenos y aceite esencial. “El
aceite esencial presente en las hojas contiene ácido behenico, bergamota,
bicyclogermacreno, borneno, cadineno, cadinol, calacoreno, calamenediol, calamaneno,
canfeno, carvacrol, ácido gálico, butirato de geraniol, limoneno, mirceno, ácido
linoleico, ácido palmítico, entre otros” (Gonzalez, 2009, pág. 32)
39
2.5.6 Propiedades de Schinus molle
Se le ha atribuido el poder antiséptico, propiedades antiespasmódicas y sedantes,
estimulan la secreción gástrica por lo que son digestivos, a demás de estimulación
uterina, antiinflamatorio en casos de cervicitis y vaginitis. (Gonzalez, 2009)
En la medicina actual su resina blanquecina ha sido usada en América del Sur como
goma de mascar, ya que se dice que fortalece las encías y sana las úlceras de la boca.
Además, la cocción de la corteza se usa como remedio en pies hinchados y como
purgante para animales domésticos; mezclada la corteza junto con las hojas, se utiliza
para combatir la hinchazón y dolor en el tratamiento de enfermedades venéreas. (Batis,
1999)
La emulsión de la goma se ha usado para tratar cataratas y manchas de las córneas
de los ojos. Además el fruto se utiliza para el tratamiento de la gonorrea y jarabe para la
bronquitis. Por otro lado las semillas se usan para adulterar la pimienta por su sabor
semejante llamándola “pimienta blanca” (Ayala, Nielsen & Bravo, 1980). El “molle” a
la vez se emplea en las llamadas “limpias” o “barridos”, para curar el mal de aire, susto
y espanto en algunas culturas (CONAFOR, 2012);.
En la industria textil las hojas, ramas, corteza y raíz se han empleado para el teñido
amarillo pálido de tejidos de lana. Por otro lado se considera que las semillas contienen
aceites de los cuales se obtiene un fijador que se emplea en la elaboración de perfumes,
lociones, talcos y desodorantes. Su ceniza rica en potasa se ha usado como blanqueador
de ropa. Además en la industria maderera esta especie se ha utilizado para fabricar
implementos de trabajo, tales como mangos de herramientas, estacas, enseres rurales y
fustes de sillas de montar. Además la resina se ha empleado en la fabricación de
barnices (Batis, 1999).
2.5.7 Propiedades terapéuticas de Schinus molle L. en el ecuador
El fruto procesado se ha empleado como antimicótico (Etnia no especificada-
Carchi). El jugo blanco extraído de la corteza se usa como purgante y aplicado
externamente, reduce la inflamación de tumores, en especial de los ojos (Kichwa de la
Sierra- Chimborazo). La infusión de la planta es ha utilizado para tratar la artritis y
40
prevenir el resfrío (Mestiza, Etnia no especificada-Chimborazo). La planta ha sido
empleada para tratar golpes (Etnia no especificada, Kichwa de la Sierra-Loja). Las hojas
se han utilizado en baños o infusión para trastornos menstruales y cólicos fracturas e
inflamaciones (Kichwa de la Sierra-Chimborazo). Las hojas en infusión, se han
manipulado para tratar dolores en el riñón (Etnia no especificada-Chimborazo) (de la
Torre et al. 2008).
Varios estudios han demostrado que el aceite esencial de las hojas frescas de
Schinus molle L. posee actividad antibacterial, antiviral, antifúngica y antimicrobial de
ahí sus usos en distintas áreas de la medicina, de igual manera en el área de odontología,
de las hojas se extrae un aceite aromatizante que se usa en enjuagues bucales y como
dentífrico en algunos países, (CONAFOR, 2012). En el Ecuador se ha usado por
distintas culturas y su uso prácticamente es de origen ancestral como: El jugo de las
ramas es purgante y se usa como purgante para las muelas (Etnia no especificada-
Azuay, Cañar). Las hojas y frutos machacados, calman el dolor de piernas y de muelas
(Etnia no especificada-Imbabura); (De la Torre et. al, 2008).
2.5.8 Actividad antibacteriana in vitro del aceite esencial de Schinus molle L.
Estudios reportados han demostrado que, el aceite esencial de Schinus molle L. posee
actividad antibacteriana contra cepas Gram (+), como: Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, además especies de la misma familia
Anacardiaceae de Schinus molle, mostraron efectos ante Streptococcus como: S. mitis,
S. sobrinus, S. sanguise, S. mutans. Schinus molle a la vez posee efectos
antimicrobianos sobre Gram (-) tales como: Escherichia coli, Enterobacter, Shigella
flexneri, Klebsiella pneumoniae y Proteus vulgaris. De igual manera, se ha evaluado las
propiedades antifúngicas frente a Cándida albicans y Aspergillus niger. Se puede añadir
estudios que han determinado el efecto citotóxico ante células tumorales. Cabe recalcar
que todas las investigaciones mencionadas han sido realizadas siguiendo las normas de
antibiogramas establecidas en la literatura, misma metodología que se toma en
consideración en el presente estudio. (Pauli, 2001); (Gonzalez, 2009); (Gualtieri, 2012);
(Molinari, 2013); (Carvalho, 2013); (Álvrez & Boquet 1996); (Cedamanos & Mejía,
2014)
41
2.5.9. Contraindicaciones
El aceite esencial de Schinus molle no ha presentado toxicidad en animales ni en los
seres humanos. Según una investigación realizada por Guba, 2008, los aceites esenciales
no han demostrado ser tóxicos o carcinógenos en los animales de experimentación
utilizados. (García, 1988)
En ocasiones, se ha producido reacción alérgica en la piel de algunas personas que
han consumido Schinus molle L. tanto de hojas o corteza en excesivas cantidades.
Además la ingesta de altas cantidades de los frutos pueden provocar náuseas, vómitos,
cefalea y diarrea, por ello la dosis que se maneja por vía oral a través de infusión
corriente, se ha considerado no tóxica (Orozco, 2013).
42
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1 TIPO Y DISEÑO DE LA INVESTIGACIÒN
De acuerdo a las características de la investigación y los objetivos planteados se
determina un estudio de tipo experimental, “in vitro”, transversal, prospectivo, analítico
y bibliográfico.
Es experimental debido a que se utilizó dos grupos experimentales representado por
discos de papel filtros embebidos con el aceite esencial de Schinus molle, y otro
representado por discos de filtro embebidos en Gluconato de clorexidina al 0.12%
In vitro debido a que el estudio se realizó bajo medios de cultivo que enriquecen el
crecimiento bacteriano, el cual se maneja en laboratorios.
Es transversal debido a que la observación de variables fue en un tiempo determinado
y delimitado.
Es prospectivo debido a que la recolección de datos depende de los hechos ocurridos.
Es analítico debido a que se desintegraron cada uno de los temas a tratar en la
investigación para obtener los objetivos planteados
Es bibliográfico ya que en esta investigación es importante basarnos en varios autores
de textos, libros y artículos que nos aporten información confiable.
43
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA
3.2.1 Universo
Conformado por cepas microbianos de Streptococcus mutans, proporcionada por el
Laboratorio clínico y microbiológico de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador.
3.2.2 Tamaño de la muestra
La selección de la muestra se realizó intencionalmente de una especie de
microorganismo puro: Streptococcus mutans ATCC 25175, empleada para evaluar el
potencial biosida del aceite esencial de Schinus molle L. a concentraciones del 100%,
50%, residuo de hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle y Gluconato de
clorexidina al 0.12%. Se realizó 20 repeticiones por cada sustancia con un tiempo de
exposición de 24 a 72 horas en el estudio, por lo tanto cabe mencionar que se utilizó la
siguiente fórmula para estudios de contraste de hipótesis, direccionada a la comparación
entre dos medias o proporciones (Fernández, 2010).
n = 2 1,960 1,645
1,23
0,22
n = 8,837
n =
40,00
0,22
n = Tamaño de la muestra
Z: Valores correspondientes al riesgo deseado
n1 =20
S2 : Varianza de la variable cuantitativa (grupo de control
observado)
n2 =20 s = 1,1
d: Valor mínimo de la diferencia que se desea detectar (datos
cuantitativos) d = 0,47
44
Los valores de Za y Zb frecuentemente utilizados:
(Fernández, 2010)
3.3CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN
3.3.1 Criterios de inclusiòn
Microorganismos sin contacto alguno de soluciones antimicrobianas.
Cepas microbianas puras de Streptococcus mutans ATCC 25175
3.3.2 Criterios de exclusión
Cultivos con deficiencia de manipulación
Cajas petri con defectos de fabricación
3.4 VARIABLES
3.4.1 Conceptualización de variables
Variable Independiente:
Aceite esencial de Schinus molle L. (Molle)
Gluconato de clorexidina al 0.12%
Residuo de Hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle L. (Molle)
45
Variable dependiente:
Streptococcus mutans
Variable interviniente:
Tiempo de exhibición
3.4.2 operacionalización de variables
VARIABLE INTERVINIENTE
VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIÓN INDICADOR ESCALA VALOR
Tiempo de
exhibición
Tiempo
determinado en
horas en las
cuales las
sustancias
antimicrobianas
producen su
efecto sobre los
microorganismos
Cuantitativa Directa Ordinal 24-72
horas
VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIÓ
N INDICADOR ESCALA VALOR
VARIABLE
INDEPENDIEN
TE
Potencial
fungicida y
biosida del aceite
esencial e
hidrolato de
Schinus Molle
“Molle”
Gluconato de
clorhexidina al
0.12%
La capacidad que
el aceite esencial
del Schinus Molle
tiene para
disminuir o
eliminar el
crecimiento de
microorganismos
desarrollados en
un medio
Cuantitativa
Diámetro de
halo de
inhibición en
milímetros
Cuantitativ
a De
razón
5-20mm
Cualitativa
Diámetro de
halo de
inhibición en
milímetros
según
Duraffourd
Cualitativa
Ordinal
Nula (-)
Sensible
(+)
Muy
sensible
(++)
Sumamente
sensible
(+++)
VARIABLE
DEPENDIENTE
Streptococcus
mutans
Especie de
microorganismos
que desempeña
preponderancia en
caries dental,
principal agente
criogénico
Cepas de
ATCC de
Streptococcus
mutans
Crecimiento
microbiano de
la cepa
Cualitativa
Nominal
SI
NO
46
3.5 INSTRUMENTOS
A. Materiales de Escritorio
Copias de documentos, artículos
Cuadernos, libreta de apuntes
Impresiones de archivos
Computador
Lapiceros
B. Material bibliográfico
Impresiones de archivos
Copias de documentos, artículos
C. Materiales de Laboratorio para extraer el Aceite esencial
Hojas de Schinus molle L.
Balanza digital
Balón de fondo plano
Soporte
Vaso de precipitación
Reflujo con trampa de Dean –Stark
Manta de calentamiento
Agua destilada
D. Material y equipos para la preparación de medios de cultivo
Probetas
Pipetas
Mechero de Bunsen
Tubos de ensayo
Refrigerador
Placas petri
Agar Sangre
Asas de siembra
Cepas de Streptococcus mutans
Halos de papel filtro
47
E. Otros
Gluconato de clorhexidina al 2%
Tween 20
Agua destilada
F. Infraestructura
Laboratorio de Fitoquímica de la carrera de Ingeniería en Biotecnología de la
Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE.
Laboratorio Clínico y microbiológico de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador
3.6 PROCEDIMIENTO
3.6.1 Recolección de la muestra
La muestra vegetal fue recolectada personalmente en el mes de Marzo del 2015, en
temporada cálida, un día antes de la elaboración del aceite, en la provincia de
Pichincha, capital Quito, sector Pomasqui. Se recolectó ramillas del árbol procurando
no dañar las hojas, obteniéndose alrededor de 1200gr. de muestra fresca comprobando
su buen estado, sin plagas y evitando aquellas que muestren signos de envejecimiento.
3.6.2 Obtención del aceite esencial de Schinus Molle L.
Una vez recolectada la especie se depuró la muestra eliminando frutos y flores,
limitándonos a la obtención de las ramillas con hojas. Se transportó la muestra al
Laboratorio de Fitoquímica de la carrera de Ingeniería en Biotecnología de la
Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE.
La obtención del aceite esencial se realizó bajo asesoría de la Dra. Blanca Naranjo,
Docente de Fitoquímica de la Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE. Se llevó a
cavo mediante el método de hidrodestilación con reflujo de vapores de condensación,
con trampa de Dean Stark, la cual permite recoger mayor cantidad de aceite en menor
tiempo según estudios de (Motle, 1977); (Guarnizo, 2009), donde se menciona que la
cantidad de aceite depende netamente de la planta independientemente de su peso,
sabiendo que ésta especie es rica en aceite se utilizó 140gr. solo de hojas, procediendo a
triturarlas y luego a verificar su peso (Figura No.1-2)
48
Figura No. 1 Figura No. 2
Fuente: Daysi Rivadeneira Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 1: En las imágenes antes expuestas, se puede verificar hojas de Schinus molle L.
Figura 2: Peso en gramos por balanza digital de la muestra vegetal trozeada.
La muestra se llevó dentro de un balón de fondo plano al cual se le agregó agua
destilada previamente caliente para acelerar el proceso, luego el balón de fondo plano
fue llevado a la manta de calentamiento de 110V, sin control de temperatura,
parámetros en los que se basó (Lagos, 2012) ya que fue la necesaria que permitió hervir
el agua con la muestra. (Figura No. 3)
Figura No. 3
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 3 Balón de fondo plano con muestra de Schinus molle (Molle) en manta de
calentamiento.
49
Los compuestos orgánicos volátiles de la planta fueron arrastrados por la corriente
de vapor de agua que se genera por la fuente de calor, luego dicha mezcla (vapor de
agua y aceite) se condensó mediante su paso por un refrigerante de vidrio, y luego se
separará el aceite del agua por diferencias de densidades como lo muestra (Guarnizo,
2009) (Figura No. 4-5). El agua residual que se va eliminando durante el proceso puede
arrastrar incluso algunos componentes solubles en agua, como lo demuestra (Peña,
2013) en estudios sobre hidrolatos por vapor de condensación ya que obtuvieron los
mismos beneficios antimicrobianos de sus aceites esenciales.
Figura No.4 Figura No.5 Fuente: Daysi Rivadeneira Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 4: En las figuras expuestas se observa Equipo de Hidrodestilación con trampa
de Dean-Stark. Figura 5: Probeta del equipo de hidrodestilado mostrando la separación
de agua-aceite
50
Una vez terminado el proceso de hidrodestilación por 2 horas, se retiró el agua
residual en un vaso de precipitación y se recuperó el aceite esencial como lo demuestra
(Guarnizo, 2009) con el uso de éste método. (Figura No. 6-7). Se obtuvo 2ml de aceite
esencial con 140mg de hojas depuradas de Schinus molle (Molle) por cada destilación,
almacenándose en un frasco ámbar en refrigeración hasta su respectivo uso,
características de conservación que nos sugiere (Lagos, 2012) para mantener el aceite en
perfecto estado hasta su uso. (Figura No. 8).
Figura No.6 Figura No.7
Fuente: Daysi Rivadeneira Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 6: Equipo de hidrodestilado en funcionamiento
Figura 7: Retiro del agua residual del hidrodestilado del aceite esencial de Schinus
molle
Figura No.8
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 8 Aceite esencial de Schinus molle L. envasado herméticamente en frasco
ámbar.
51
3.6.3 Rendimiento del aceite esencial (RAE)
Se determinó el porcentaje de rendimiento del aceite esencial para medir la
efectividad del procedimiento de síntesis, el cual se realizó mediante el método de
gravimetría-volumétrico, utilizando 140g. de la muestra en época cálida de Schinus
molle (Molle) y el volumen obtenido de 2ml, logrando obtener un rendimiento de
1.42% en época cálida, determinado por la siguiente fórmula utilizada en los estudios
de (Dellacassa, 2010), (Lagos, 2012), (Azaña, 2010) para determinar la eficacia del
aceite esencial.
Donde:
% RAE= Porcentaje de rendimiento del aceite esencial
Vol. AE = Volumen del aceite esencial
Pmuestra
= Peso de la muestra a destilar
% R (V/P) = 2 ml x 100
140g % RAE = 1.48
A finales del mes de marzo 2015, se pudo apreciar una época lluviosa, para
comparar su rendimiento se recolectó aceite esencial utilizando 42g de muestra y
obteniendo un volumen de 0.5ml, se obtuvo un rendimiento de 1.19%.
% R(V/P) = 0.5ml x 100
42 g
% RAE = 1.19
52
3.6.4 Obtención de los microorganismos
Se trabajaó con una cepa de bacteria estándar de Streptococcus mutnas (ATCC®
25175™) (American Type Culture Collection), producto diseñado solo para propósito
de estudio en investigaciones científicas in vitro, información proporcionada por el
Departamento de Salud y Servicios Humanos para el Control y Prevención de
Enfermedades y los Institutos Nacionales para la Salud EE.UU. (ATCC, 2014). La
bacteria fue adquirida a través del Laboratorio Clínico y Bacteriológico de la
Universidad Central del Ecuador.
3.6.5 Reactivación de la cepa bacteriana
La cepa bacteriana de Streptococcus mutans (ATCC® 25175™), vino en un vial al
cual previamente se lo rehidrató con 0.5ml de peptona, éste caldo se trasladó en su
totalidad a un tubo estéril, realizando a la vez diluciones del tubo madre a otro tubo
adicional agregando 0.5ml del caldo primario, (Figura No. 9). Se tomó algunas gotas de
la dilución para sembrarlas en agar sangre, el cual se incubó de 24-48 horas a 37°C, de
donde se tomó las colonias para la siembra en nuestro estudio, reglas determinadas para
la elaboración de antibiogramas por (Álvarez & Boquet, 1996) (ATCC, 2014).
Figura No.9
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 9 : Cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 previa reactivación
53
El Laboratorio Clínico y Bacteriológico de la Universidad Central del Ecuador
poseía la cepa bacteriana diluida ya en refrigeración de (2 - 8 °C) hasta su reactivación
siguiendo todas las instrucciones antes mencionadas por (Álvarez & Boquet, 1996).
3.6.6 Escoger el adecuado medio de cultivo
Para el crecimiento de Streptococcus se utilizó medios enriquecidos como el Agar
sangre, preparado previamente con un 5 por 100 de sangre de carnero, el cual es en
donde mejor se observa la actividad hemolítica de las especies y que en el esquema
constituye una característica de mayor importancia como se indica en la literatura de
(Álvarez & Boquet, 1996) Una vez escogido el medio previamente elaborado por el
laboratorio se procedió a rotular 20 cajas petri las cuales fueron utilizadas para la
siembra. (Figura No. 10).
Figura No. 10
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 10 : Medios de cultivo Agar sangre.
3.6.7 Obtención del inóculo bacteriano
Con la ayuda del hisopo se extrajo una colonia del cultivo de la cepa previamente
reactivada, la cual fue sumergidas en un tubo de ensayo con 5ml de suero fisiológico al
9%, posteriormente se agitó por 5 minutos, alcanzando una turbidez de (1X108 UFC/ml)
54
equivalente al tubo 0.5 de McFarland, turbidez establecida por visión directa,
establecida en los parámetros de (Álvarez & Boquet, 1996). (Figura No.11)
Figura No. 11 Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 11: Suspensión de Streptococcus mutans ajustada a la escala de 0.5 McFarland.
Debido a las sustancias volátiles con las que trabajamos se determinó primero
inocular, todas las cajas petri de Agar sangre con el germen, utilizando la técnica de
hisopado, es decir que con un hisopo se tomó cierta cantidad de bacterias y se procedió
a realizar el sembrío en tres direcciones como lo recomienda (Álvarez & Boquet,
1996). (Figura No. 12)
Figura No. 12 Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 12: Inoculación de cajas petri con Streptococcus mutans.
55
3.6.8 Selección de los discos de papel filtro
Se escogieron 80 discos de papel filtro previamente estériles, de 6mm de diámetro,
los cuales fueron manipulados mediante pinzas estériles, eliminando aquellos que
tuvieron signos de deterioro (Figura No. 13).
Figura No. 13 Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 13 : Discos de papel filtro de 6mm de diámetro.
3.6.9 Preparación de las sustancias en estudio
Se utilizó aceite esencial de Schinus molle (Molle) al 100%, 50% y agua de residuo
del hidrodestilado del aceite esencial. Se realizó las diluciones en agua destilada y
Tween 20 al 1% como agente disolvente del aceite mismo que fue utilizado por (
Cedamanos & Mejía, 2014) recomendada para disolver el aceite de Schinus molle y
trabajar con las mencionadas concentraciones. Se utilizó clorhexidina al 0.12% a la vez
utilizada como control positivo, y agua destilada como control negativo (Figura No.
14-15).
56
Figura No. 14 Figura No. 15 Fuente: Daysi Rivadeneira Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 14: Agua destilada, Clorhexidina al 0.12%, Tween 20, Figura 15: aceite
esencial de Schinus molle (Molle)
3.6.10 Inoculación de las sustancias en estudio
Se tomó con la pipeta, 1 ml de cada sustancia y se depositaron en tubos de ensayo
estériles, rotulados con el nombre de cada sustancia a utilizar para luego colocarlos en la
gradilla (Álvarez & Boquet, 1996). (Figura No. 16-17). Posteriormente se utilizó una
micropipeta para colocar 0.2ul de sustancia y colocarla en el disco de papel filtro,
procedimiento que se repitió en todos los discos con todas las sustancias a analizar
Figura No. 18. Se procedió a sembrar los discos de papel filtro en las cajas petri, según
la rotulación que corresponda en ella con cada sustancia. Figura No.19. Finalmente las
placas se llevaron a incubación a 37oC, ya que ( Cedamanos & Mejía, 2014) trabajó a
las 24 horas de exposición con el aceite de Schinus molle, en nuestra investigación se
trabajó a las 24 y 72 horas de exposición. (Figura No. 20-26).
Figura No. 16 Figura No. 17 Fuente: Daysi Rivadeneira Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 16: Deposito de las sustancias en tubos de ensayo. Figura 17: Tubos de ensayo
estéril y rotulado.
57
Figura No. 18
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 18: Depósito de las sustancias con micropipeta en discos de papel filtro.
Figura No. 19
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 19: Discos de papel filtro embebidos en sustancias de estudio.
58
Figura No. 20
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 20: Incubación de las cajas petri en jarra de anaerobios a 37oC.
Figura No. 21
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 21: Halos de inhibición de gluconato de clorhexidina al 0.12%, Aceite esencial
de Schinus molle (Molle) al 100%, 50% y residuo de hidrodestilado.
Elaborado por: Lab. Clínico y Bacteriológico UCE.
59
Figura No. 22
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 22: Halo de inhibición producido por el Gluconato de clorhexidina al 0.12%
Figura No. 23
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 23: Halo de inhibición del Aceite esencial de Schinus molle (Molle) al 100% a
las 24 horas de exposición.
Figura No. 24 Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 24: Halo d inhibición del Aceite esencial de Schinus molle (Molle) al 50%
A las 24 horas de exposición.
60
Figura No. 25 Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 25: Halo de inhibición del agua de residuo de hidrodestilado del aceite esencial
de Schinus molle (Molle) a las 24 horas de exposición.
Figura No. 18
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 26 : Halos de inhibición del Gluconato de clorhexidina al 0.12%, Aceite
esencial de Schinus molle (Molle) al 100%, 50% y residuo de hidrodestilado a las 72
horas de exposición.
61
3.6.11 Medición del diámetro de los halos de inhibición de crecimiento bacteriano
El diámetro de los halos de inhibición resulta ser un hecho importante, (Álvarez &
Boquet, 1996), así lo mencionan en su literatura ya que de eso depende nuestra
investigación, incluyendo el diámetro del disco embebido, el cual se midió con el
calibrador milimétrico y se registró los datos en la ficha de recolección de datos
correspondiente para la cepa, a las 24 y 72 horas.). Figura No. 27
Figura No. 27
Fuente: Daysi Rivadeneira
Figura 27: Medición de los halos de inhibición con calibrador milimétrico.
3.6.12 Evaluación de la efectividad antibacteriana
Para la interpretación de los resultados en la evaluación de tipo cuantitativa se tomó
como referencia los diámetros de halo de inhibición y para la interpretación de los
resultados en la evaluación de tipo cualitativa se tomó como referencia las pautas por
Duraffourd (1983).
3.7 TÉCNICAS PARA EL PROCESAMIENTO DE DATOS Y ANÁLISIS DE
RESULTADOS
Se efectuó una ficha de datos en donde se anotaron los resultados del método de
difusión en placas con discos de papel filtro. La recolección de los datos se realizó de
forma manual y visión directa.
62
Para la medición de los halos se utilizó una regla calibrada en milímetros. Se
verificó cada una de las fichas para evitar errores u omisiones en los datos que pudieran
perjudicar la investigación.
El diámetro de esta zona de inhibición fué directamente proporcional a la actividad
biosida del aceite esencial de Schinus molle (Molle), residuo de hidrodestilado y
Gluconato de clorhexidina al 0.12% sobre microorganismo estudiado.
Para la interpretación de los resultados en la evaluación de tipo cuantitativa se tomó
como referencia los diámetros de halo de inhibición y para la interpretación de los
resultados en la evaluación de tipo cualitativa se tomó como referencia las pautas por
Duraffourd (1983)
1. Nula (-) si fue inferior o igual a 8 mm
2. Sensible (Sensible =+) de 9 a 14 mm
3. Muy sensible (muy sensible = ++) de 15 a 19 mm
4. Sumamente sensible (S.S.= +++) si fue igual ó superior a 20 mm (Duraffourd 1983)
Se utilizó el programa SPSS® , programa estadístico que permitió obtener
referencias y cálculos estadísticos, utilizando estadística no paramétrica bajo pruebas de
normalidad Kolmogorov - Smirnov y Shapiro – Wilk, determinando el análisis de
Kruskal-Wallis, para comparar el efecto de varias sustancias empleadas en el estudio a
las 24 y 72 horas.
3.8 ASPECTOS ÉTICOS
Por ser una investigación in vitro se solicitó la autorización del jefe del servicio de
Laboratorio Clínico y microbiológico de la Universidad Central del Ecuador Facultad
de Ciencias Químicas para la elaboración del trabajo práctico de laboratorio en cuanto a
los cultivos microbianos
Se solicitó la autorización respectiva del jefe del Laboratorio de Fitoquímica de la
carrera de Ingeniería en Biotecnología de la Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE
para la obtención del aceite esencial y residuo de hidrodestilado.
63
CAPÍTULO IV
4.1 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Se realizó el estudio in vitro en la especie bacteriana: Streptococcus mutans ATCC
25175, de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Schinus molle L. (Molle),
Residuo de hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle L., gluconato de
clorhexidina y agua destilada trabajándose 20 repeticiones por cada sustancia a las 24 y
72 horas. Comprobándose sensibilidad de la bacteria mencionada.
Los resultados obtenidos en las diferentes pruebas realizadas a la planta en estudio
han sido agrupados en tablas y gráficos, para la mejor interpretación de los resultados
que se detallan a continuación. Se utilizó el diseño completamente aleatorio, debido a
que este es un diseño de simple distribución, siendo útil para métodos y técnicas de
laboratorio.
64
4.2 DATOS ESTADÍSTICOS
Evaluación de la susceptibilidad de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175
por método de difusión en placas con discos de papel filtro, impregnados en: Gluconato
de clorhexidina 0.12%, aceite esencial de Schinus molle 100%, Aceite esencial de
Schinus molle 50%, residuo de hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle,
agua destilada.
Tabla 1: Datos estadísticos
Fuente: Daysi Rivadeneira
En la Tabla No. 1, se presenta las medidas de los halos de inhibición ante las
sustancias empleadas en el estudio, frente a la cepa de Streptococcus mutans ATCC
25175, mediante el método de difusión en disco en milímetros, para efectos del trabajo
estadístico para cada grupo de sustancias se determino el valor de la media, desviación
típica y la distancia de cada dato con respecto a la repetición experimental.
65
4.2.1 Media de halos de inhibición a las 24 horas de cada sustancia de estudio
El siguiente gráfico describe la distribución de las medias de halos de inhibición en
base al efecto del gluconato de clorhexidina al 0.12%, Schinus molle al 100% - 50%,
residuo de hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle, agua destilada empleados
en el estudio frente a la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175. A las 24 horas.
Gráfico 1: Media de halos de inhibición a las 24 horas
Gráfico No.1 Fuente: Daysi Rivadeneira
El gráfico No. 1 muestra la media de los halos de inhibición producido por las
sustancias en estudio a las 24 horas frente a la cepa de Streptocuccus mutans ATCC
25175, provocando una tendencia superior de gluconato de clorhexidina al 0.12% con
una media de 16.80 mm, seguido del aceite esencial de Schinus molle al 50%
presnetando una media de 13.15 mm, Schinus molle al 100% con 12.50mm y residuo de
hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle con una media de 6.40mm
66
4.2.2 Media de halos de inhibicion a las 72 horas de cada sustancia de estudio
Gráfico 2: Media de los halos de inhibición a las 72 horas
Gráfico No.2 Fuente: Daysi Rivadeneira
Se muestra la media de los halos de inhibición producido por las sustancias en
estudio a las 72 horas frente a la cepa de Streptocuccus mutans ATCC 25175,
provocando una tendencia superior de gluconato de clorhexidina al 0.12% con una
media de 17.10mm, seguido del aceite esencial de Schinus molle al 50% presentando
una media de 13.25mm, Schinus molle al 100% con 12.60 mm y residuo de
hidrodestilado del aceite escencial de Schinus molle con una media de 6.40 mm.
En la Tabla No. 2 se observa la variación entre las sustancias expuestas a las 24 y
72 horas, existiendo un aumento de las medias del halo de inhibición a las 72 horas de
exposición del gluconato de clorhexidina 0.12% con incremento del 1,8%, Schinus
molle al 100% con incremento de inhibición de 0.8%, Schinus molle al 50% con
incremento del 0.8%, no existiendo aumento ni disminución en cuanto al residuo de
hidrodestilado.
Tabla 2: Discrepancia de inhibición entre las 24 y 72 horas de exposición de las
sustancias en estudio.
Tabla No.2 Fuente: Daysi Rivadeneira
67
4.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para la prueba de normalidad de datos inicialmente se verificó que las muestras
tomadas provengan de una población con distribución normal, esto se realiza con las
pruebas de Kolmogorov - Smirnov y Shapiro – Wilk, donde probamos: Ho (Hipótesis
inicial) donde la muestra proviene de una población con distribución Normal y Ha
(Hipótesis alterna) donde la muestra no proviene de una población con distribución
normal como se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 3: Pruebas de normalidad Kolmogorov - Smirnov y Shapiro – Wilk de las
muestras en estudio obtenido de SPSS®
Tabla No.3 Fuente: Daysi Rivadeneira
4.3.1 Análisis por Kruskal-Wallis: comparación tres o más sustancias a las 24 y 72
horas.
La Tabla No.3 muestra la prueba de Shapiro-Wilk, donde se tiene que los valores
de significancia son menores que 0,05 (95% de confiabilidad), por ello se rechaza Ho
para todas las muestras debido a que menciona que las muestras proceden de
poblaciones con la misma distribución de probabilidad (Medias similares), por lo tanto
se toma la Ha donde ninguna de las sustancias proviene de una población con
distribución normal, con esto se determinó realizar pruebas no paramétricas para
demostrar la igualdad de medias (promedios), una de estas pruebas es la Kruskal-Wallis,
prueba no paramétrica utilizada para la comparación de varias muestras.
68
4.3.2 Estadísticos descriptivos del análisis de Kruskal-Wallis a las 24 horas
La siguiente tabla obtenida del sistema SPSS® según análisis por análisis de
Kruskal-Wallis, describe los datos de mayor importancia e incidencia del estudio
realizado, muestra en relación al número de repeticiones de las pruebas (N) los valores
de máximos, mínimos, medias y desviación típica para cada sustancia de estudio y sus
concentraciones correspondientes a las 24 horas.
Tabla 4: Estadísticos descriptivos del Análisis de Kruskal-Wallis
Tabla No.4 Fuente: Daysi Rivadeneira
4.3.3 Prueba Kruskal-Wallis de muestras independientes
En la siguiente grafica se describe la relación existente entre cada sustancia de
estudio y las medias de los datos obtenidos de las medidas de los halos de inhibición en
milímetros de la prueba a las 24 horas, en donde podemos destacar la efectividad del
aceite esencial de Schinus molle tanto a las concentraciones del 100% y 50% , en donde
esta primera tiene tendencia a incrementar su poder de acción frente al agente
microbiano a lo largo del tiempo, y la segunda manteniéndose estable, con tendencia de
medias dispersas hacia el límite superior de la grafica, sin embargo a pesar de que la
clorhexidina presenta las medias más altas de halos de inhibición esta presenta una
tendencia a la baja en su poder de acción a través del tiempo. Gráfica No.3
69
Gráfico 3: Prueba de Kruskal-Wallis entre las muestras en estudio
Gráfico No.3 Fuente: Daysi Rivadeneira
4.3.4 Prueba estadística dos a dos de las sustancias de estudio frente para la cepa
de Streptococcus mutans ATCC 25175
Para determinar que sustancias son similares o diferentes entre sí, se utilizo la
prueba dos a dos, la misma que tiene como objetivo determinar estadísticamente la
comparación de los datos de cada muestra como se obtuvo en la tabla siguiente:
Tabla 5: Prueba dos a dos de las sustancias en estudio, exposición a las 24 horas.
Tabla No.5 Fuente: Daysi Rivadeneira
70
De la comparación de cada sustancia utilizada en el estudio el sistema SPSS®
arrojo valores de significancia inferiores a 1.00, siendo estadísticamente similares
algunas sustancias de estudio, por lo tanto de la prueba dos a dos se tiene que las
concentraciones del aceite esencial de Schinus molle 100% y el aceite esencial de
Schinus molle 50% son estadísticamente similares, sin embargo encontramos similitud
en bajo grado entre el residuo del hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle y
el aceite esencial de Schinus molle al 100% en rango de 0.004 de igual manera Schinus
molle al 50% y gluconato clorhexidina al 0.12% en un rango de 0.003 demostrándose lo
anterior con mayor claridad en la gráfica No. 4.
Gráfico 4: Comparaciones por parejas de sustancias en estudio
Gráfico No.4 Fuente: Daysi Rivadeneira
4.4 Estadísticos descriptivos del análisis de Kruskal-Wallis a las 72 horas
La siguiente tabla obtenida del sistema SPSS® según análisis por ANOVA de
Kruskal-Wallis, describe los datos de mayor importancia e incidencia del estudio
realizado, muestra en relación al número de repeticiones de las pruebas (N) los valores
de máximos, mínimos, medias y desviación típica para cada sustancia de estudio y sus
concentraciones correspondientes a las 72 horas.
71
Tabla 6: Estadísticos descriptivos del Análisis de Kruskal-Wallis
Tabla No. 6
Fuente: Daysi Rivadeneira
4.4.1 Prueba Kruskal -Wallis de muestras independientes a las 72 horas
En la siguiente grafica se describe la relación existente entre cada sustancia de
estudio y las medias de los datos obtenidos de las medidas de los halos de inhibición en
milímetros de la prueba a las 72 horas, en donde podemos destacar la efectividad del
aceite esencial de Schinus molle tanto a las concentraciones del 100% y 50% , en donde
esta primera tiende a incrementar su poder de acción frente al agente microbiano a lo
largo del tiempo, y la segunda manteniéndose estable, con tendencia de medias
dispersas hacia el límite superior de la grafica, sin embargo a pesar de que la
clorhexidina presenta las medias más altas de halos de inhibición esta presenta una
tendencia a la baja en su poder de acción con respecto a las 72 horas. Gráfica No.5
Gráfico 5: Prueba de Kruskal-Wallis entre las muestras en estudio
Gráfico No.5 Fuente: Daysi Rivadeneira
72
4.4.2 Prueba estadística dos a dos de las sustancias de estudio frente para la cepa
de Streptococcus mutans ATCC 25175
Para determinar que sustancias son similares o diferentes entre sí, se utilizo la
prueba dos a dos, la misma que tiene como objetivo determinar estadísticamente la
comparación de los datos de cada muestra a las 72 horas de exposición, como se obtuvo
en la tabla siguiente:
Tabla 7: Prueba dos a dos de las sustancias en estudio, exposición a las 24 horas.
Tabla No. 7 Fuente: Daysi Rivadeneira
De la comparación de cada sustancia utilizada en el estudio el sistema SPSS®
arrojo valores de significancia inferiores a 1.00, siendo estadísticamente similares
algunas sustancias de estudio, por lo tanto de la prueba dos a dos se tiene que las
concentraciones del aceite esencial de Schinus molle 100% y el aceite esencial de
Schinus molle 50% son estadísticamente similares, sin embargo encontramos similitud
en bajo grado entre el residuo del hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle y
el aceite esencial de Schinus molle al 100% en rango de 0.005 de igual manera Schinus
molle al 50% y gluconato clorhexidina al 0.12% en un rango de 0.001 demostrándose lo
anterior con mayor claridad en la gráfica No. 6.
73
Gráfico 6: Comparaciones por parejas de sustancias en estudio
Gráfico No.6 Fuente: Daysi Rivadeneira
4.5 Grado de sensibilidad según Duraffourd a las 24 y 72 horas de exposición
Determinación del grado de sensibilidad del Streptococcus mutans ATCC 25175
frente a las sustancias en estudio a distintas concentraciones, en 24 y 72 horas de
exposición.
Tabla No. 8 Fuente: Daysi Rivadeneira
Tabla 8: Grado de sensibilidad según pautas de Duraffourd
En la Tabla No. 8 se observa el análisis cualitativo según las pautas de Duraffourd
que indican el grado de sensibilidad de las sustancias empleadas según el tiempo de
exposición, donde se mostró que dentro de los rangos de sensibilidad de 9mm a 15 mm
(sensible y muy sensible), el aceite esencial del Schinus molle al 100%-50% y el
gluconato de clorhexidina al 0.12% no tienen una significativa diferencia, debido a que
74
se encuentran separadas por distancias de medias de halos de inhibición muy cortos.
Podemos concluir que el grado de sensibilidad entre las dos sustancias de estudio es
similar, en cuanto a sus características cualitativas.
75
4.6 DISCUCIÓN
En la presente investigación, se decidió recolectar la especie Schinus molle L.
(Molle) basándonos en estudios de (Ayala, Nielsen & Bravo, 1980) donde mostraron
que su uso puede ser un implemento en la productividad nacional debido a sus grandes
beneficios, la cual se encuentra con facilidad en el sector Pomasqui de la ciudad de
Quito, gracias a la información prestada de familias ancestrales nativas, se pudo saber
de los usos medicinales en dicho sector, comparándolos con estudios realizados por
(De la Torre et. al, 2008) donde se logró comprobar la coincidencia de efectos
medicinales utilizados por varias etnias en nuestro país.
Los estudios realizados por (García, 1988), (Agapito, 2003) determinan la
importancia del uso de plantas medicinales para los tratamientos de distintas patologías,
a su vez mencionan que de los componentes con mayor característica de efecto
antiinflamatorio, antimicrobiano y antifúngico son los aceites esenciales, corroborando
con estudios de (Pauli, 2001) donde se menciona que incluso pueden ser utilizados
como alternativa medicinal, igualmente el presente estudio fue orientado a la medicina
alternativa en el área de Odontología.
La actividad biosida del aceite esencial de Schinus molle ha sido probada en varios
microorganismos Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus
faecalis S. mitis, S. sobrinus, S. sanguise, Escherichia coli, Enterobacter, Shigella
flexneri, Klebsiella pneumoniae , hongos como Cándida albicans y Aspergillus niger
datos proporcionados por (Pauli, 2001), (Gonzalez, 2009), (Gualtieri, 2012), (Molinari,
2013) y (Carvalho, 2013); sin embargo, en esta investigación se comprobó los efectos
antimicrobianos sobre Streptococcus mutans, similar al estudio de ( Cedamanos &
Mejía, 2014) el cual fue realizado con la cepa de S. mutans ATCC 25175, obteniendo
efectos antimicrobianos positivos utilizando el aceite esencial de Schinus molle, dichos
resultados se comprobaron en éste estudio, por lo que se enriqueció el efecto
antimicrobiano de esta especie.
Al evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Schinus molle L. frente
a un microorganismo de especial interés en Odontología, el Streptococcus mutans, el
cual ha sido mencionado como principal factor de riesgo en la producción de caries,
76
según estudios por la Organización Mundial de la Salud, así como los de (Herazo,
1995), (Portilla, 2010), (Modesto, 2011), (Graciano, 2012) enfatizan la alta incidencia
de ésta enfermedad a nivel mundial, quienes a su vez buscan nuevos tratamientos
alternativos ante ésta especie microbiana, características que se enfocaron, puesto que
dimos a conocer una sustancia natural que puede enfrentarse a éste microorganismo.
Estudios realizados por (Guarnizo, 2009) muestran que la utilización del método de
hidrodestilado, para elaboración de aceites esenciales proporciona además de facilidad
de acceso, un control del volumen de extracción, en cuanto a la recuperación de
sustancias a partir de plantas, lo que se concierta con ésta investigación, ya que se
extrajo un aceite esencial con alto rendimiento, en poco tiempo, muy útil para pruebas
biológicas.
Una vez obtenido el aceite esencial de Schinus molle, se lo utilizó al 100% y en
dilución al 50% basándonos en parámetros del método de dilución de los aceites
esenciales por difusión en discos, donde se determinó que a menor concentración mejor
inhibición bacteriana debido a que cada dilución favorece la entrada del aceite esencial
al interior de cada microorganismo, proporcionando mejor efecto inhibidor, acción
comprobada por ( Cedamanos & Mejía, 2014) estudios realizados también con la
solución de Tween 20 como medio inerte y agente disolvente del aceite.
Debido a la alta demanda de medicamentos naturales ante sus pares sintéticos, se
comparó el efecto de un producto natural ante un producto elaborado químicamente, a la
vez comparar sus efectos, coincidiendo con la propuesta del estudio de (Molinari, 2013)
puesto que en éste estudio se consideró comparar nuestras sustancias naturales ante el
gluconato de clorhexidina al 0.12%, siendo uno de los antimicrobianos utilizados
directamente en algunos productos de aseo oral, como parte de prevención para la
enfermedad cariosa entre otras patologías orales, compartiendo estudios de (Báscones,
2003) quien menciona que todo producto químicamente elaborado posee propiedades
tanto favorables como desfavorables.
Determinando el interés de la especie Schinus molle y sus aplicaciones médicas se
compararon concentraciones del aceite esencial al 100%, 50%, residuo de
hidrodestilado del aceite esencial de Schinus molle, y gluconato de clorhexidina al
77
0.12%, éste último fue necesario para determinar un control positivo y una comparación
de su efecto en relación a las sustancias naturales, enfrentándolas a la cepa de
Streptococcus mutans ATCC 25175 por el método de difusión en disco, donde se
realizó veinte repeticiones por cada sustancia, considerando que el efecto
antimicrobiano debe evaluarse en un tiempo determinado, corroborando con el estudio
de ( Cedamanos & Mejía, 2014) donde se utilizó S. mutans ATCC 25175 a frente al
aceite esencial de Schinus molle, cuyo efecto fue de alto grado a concentraciones del
25% y 50% a las 24 horas, lo que se comprobó en nuestra investigación tanto a las 24 y
72 horas de exposición.
De los resultados obtenidos se apreció la evaluación antimicrobiana de las
sustancias naturales proporcionadas por Schinus molle ante Streptococcus mutans
ATCC 25175 donde las medias inhibitorias de concentración más altas a las 24 y 72
horas fueron por el gluconato de clorhexidina al 0.12% a 16.8mm y 17.10 mm
respectivamente, además se realizó un análisis individual de las repeticiones donde se
verifica una tendencia a la baja en relación al tiempo, seguida del aceite esencial de
Schinus molle al 50% con una media de inhibición a las 24 y 72 horas de 13.50mm y
13.25mm respectivamente, con un análisis de cada una de sus repeticiones donde
demostró ser la sustancia más estable y con menos variación a través del tiempo,
coincidiendo con el estudio de ( Cedamanos & Mejía, 2014) mientras que el aceite
esencial de Schinus molle al 100% con una media de inhibición a las 24 y 72 horas de
12.5 a 12.6mm respectivamente, con un análisis de cada una de sus repeticiones donde
se demostró tener mayor tendencia a incrementar su efecto a las 72 horas, confirmando
estudios realizados por (Báscones, 2003), (Modesto, 2011) quienes demostraron que el
gluconato de clorhexidina disminuye su efecto a las 72 horas de exposición.
Los estudios realizados por (Peña, 2013) demuestran que existe eficacia
antimicrobiana, por la utilización de hidrolatos o residuo de hidrodestilado de los aceites
esenciales de “romero” para industrias lácteas, de igual manera (Ramos, 2013) utilizó la
fracción acuosa o hidrolato del aceite esencial de “diente de león” para determinar
elementos del aceite esencial que fueron arrastrados durante la destilación, y probar su
efecto antimicrobiano, por lo tanto en éste investigación se realizó el estudio del
hidrolato de Schinus molle ante dicha especie bacteriana, donde se obtuvo resultados
positivos en una de las repeticiones de 14mm de halo de inhibición, con una media de
78
halos de inhibición de 6.4mm manteniendo su rango a las 24 y 72 horas de exposición,
con esto mencionamos que incluso el residuo que se obtiene de la extracción del aceite
proporcionó inhibición bacteriana frente a cepas de Streptococcus mutans.
79
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Se determinó el efecto antimicrobiano in vitro del aceite esencial de Schinus
molle y sus concentraciones del 100%, con una media de 12.5 a 12.6mm, del
50% con una media de 13.50mm y 13.25mm, y gluconato de clorhexidina al
0.12%, con una media de 16.8mm y 17.1mm, a las 24 y 72 horas de exposición
respectivamente.
Analizamos el estudio in vitro del residuo de hidrodestilado del aceite esencial
de Schinus molle, donde se verificó que incluso el residuo que deja el aceite
esencial posee efecto antimicrobiano ante cepas de Streptococcus mutans.
Establecimos el grado de sensibilidad de forma cualitativa para el Streptococcus
mutans por el método de difusión en disco según las pautas de Duraffourd, el
cual resultó estar en el rango sensible y muy sensible a concentración del 100%
y 50% demostrando alta potencia de efectividad del aceite esencial de Schinus
molle L.
Relacionamos la efectividad antimicrobiana del aceite esencial de Schinus molle
L. a concentraciones del 100%, 50%, residuo de hidrodestilado del aceite
esencial de Schinus molle L. frente al gluconato de clorhexidina al 0.12% en
cultivos bacterianos de Streptococcus mutans a las 24 y 72 horas de exposición,
donde el gluconato de clorhexidina al 0.12% a pesar de obtener porcentaje de
acción más elevado, obtuvo tendencia a disminuir el efecto a través del tiempo,
mientras que el aceite esencial de Schinus molle potencializó su efecto a las 72
horas de exposición sin tendencia a disminuirlo.
80
5.2 RECOMENDACIONES
Se recomienda la utilización de este estudio como base para futuras investigaciones
en cuanto a los componentes, concentraciones, pruebas biológicas que permitan
establecer el uso del los efectos antimicrobianos que posee Schinus molle, ante
productos químicamente formados.
Se debe valorar el uso que se ha dado a la especie vegetal Schinus molle, por
nuestros antepasados en el campo medicinal, por lo tanto se recomienda la utilización
de la misma para el tratamiento antimicrobiano en el área Odontológica desde una
perspectiva médica alternativa, enfocada principalmente a regiones rurales donde el uso
de medicamentos químicos es escaso, sea por condiciones geográficas o económicas.
Dada la tendencia actual del uso de productos naturales se recomienda realizar
estudios enfocados a la implementación de los principios activos de las plantas naturales
en productos del cuidado oral habitual, para disminuir la utilización de químicos
altamente tóxicos que a su vez causan resistencias bacterianas o alergias en los
individuos que los utilizan.
Se recomienda la utilización de agentes disolventes como Tween 20 para elaborar
diluciones del aceite esencial de Schinus molle debido a que colabora con una adecuada
penetración en la técnica de difusión en discos, proporcionando mayor efecto
antimicrobiano en medios de cultivo.
Para la extracción del aceite esencial de Schinus molle se recomienda utilizar hojas
frescas y en época seca, ya que nos proporcionará un mayor rendimiendo, necesario
para estudios biológicos.
Se recomienda la utilización del aceite esencial de Schinus molle como agente
antimicrobiano frente a otras bacterias causantes de otras patologías orales.
81
BIBLIOGRAFÍA
Agapito, T. (2003). Estudio de 110 plantas Medicinales. Lima, Perú: Isabel.
Aguiñada, M. (2012). Especies Forestales de los Bosques Secos Ecuador. Ecuador,
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Proyecto Evaluacion Forestal .
(Álvarez, M. & Boquet, E. (1996) Manual de Técnicas en Microbiología Clínica.
Madrid, España: Garsi.
Arellano, C. (1998). Educación ambiental y el cambio de actitud en la población ante la
conservación del medio ambiente. Revista de Ecología , 1, 98-101.
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86
ANEXOS
87
ANEXO 1 : Certificado de la elaboración del aceite esencial de Schinus molle en el
Laboratorio de Fitoquímica de la Carrera de Ingeniería en Biotecnología, de la
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
88
ANEXO 2: Certificado de realización de pruebas diagnósticas bacteriológicas en el
Laboratorio Microbiológico de la Facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad
Central del Ecuador
89
ANEXO 3: Resultados de las pruebas microbiológicas empleadas en la presente
investigación, Laboratorio de análisis clínico y Bacteriológico de la Universidad Central
del Ecuador.
