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1
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES.
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
RECEPTOR DE PROGESTERONA: ISOFORMAS Y GENES
REGULADOS DIFERENCIALMENTE COMO HERRAMIENTA
PREDICTIVA DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON
ANTIPROGESTÁGENOS
Autor: María May
Director: Dra. Claudia Lanari
Codirector: Dr. Alfredo Molinolo
Consejero de estudios: Dr. Carlos Davio
Lugar: Instituto de Biología y Medicina Experimental (IByME)
Lugar y Año: Ciudad de Buenos Aires, 2015
2
Agradecimientos
A mi Tía-Aia que hizo el trabajo previo
A Pato, Ine y Nacho que son la luz de mi vida
A mis viejos que están siempre presentes y tan orgullosos de todos mis logros
A todos los que no están pero están
En especial y de todo corazón a Claudia por ser tan generosa y paciente
A todo el grupo Lanari- Novaro por los mates compartidos, el trabajo diario y la buena
predisposición de siempre.
A Martín Abba por su ayuda con el manejo de bases de datos y al análisis de los RNAseq.
A Claudio Núñez por el procesamiento y ayuda técnica de cortes, coloraciones y armado de
TMAs.
A toda la gente del IByME, incluyendo guardia, mantenimiento, lavadero, bioterio y limpieza,
que de alguna u otra manera también hicieron posible este trabajo
AL CONICET y a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, por su apoyo a
través de las becas y los proyectos financiados.
3
“Always two there are, no more, no less. A
master and an apprentice.”
– Yoda
4
Publicaciones
Parte de los resultados presentados en este trabajo de tesis han sido presentados en
formato poster en los siguientes congresos internacionales:
“PRA isoform as a predictive marker of antiprogestin therapy in breast cancer:
A tissue culture method to evaluate drug responsiveness”. May M., Rojas P.,
Sequeira G., Martínez Vázquez P., González P., Gass H., Lanari C. San Antonio
Breast Cancer Symposium, San Antonio, Texas, US, diciembre de 2013.
“Progesterone receptor isoform ratio defines the molecular signature of
luminal breast cancers and their antiprogestin responsiveness”. May M., Rojas
P., Sequeira G., Elia A., Martínez Vázquez P., González P., Abba M., Molinolo
A., Hewitt S., Perou CM., Gass H., Lanari C. (Merit award; Conquer Cancer
Foundation) American Society of Clinical Oncology, Annual Meeting, Chicago,
US, mayo de 2015.
LX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC) realizado en
forma conjunta con la Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS), en la ciudad de Mar del
Plata entre los días 18 y 21 de Noviembre del corriente.
Premio Cossio al mejor trabajo en investigación clínica:
Las isoformas del receptor de progesterona como marcador pronóstico del
riesgo de recurrencia en cáncer de mama. María May, Martín Abba, Paola
Rojas, Gonzalo Sequeira, Andrés Elías, Michelle Álvarez, Alfredo Molinolo,
Stephen Hewiitt, Charles Perou, Paula Martínez, Pedro Gonzalez, Hugo Gass y
Claudia Lanari.
El manuscrito correspondiente a esta tesis se encuentra en redacción.
5
Durante la realización de esta tesis realicé el siguiente trabajo no incluido en los
resultados de la tesis doctoral:
2015 - María May , Paula Martinez , Pedro Gonzalez , J Mosto , Hugo Gass , Claudia
Lanari and Alfredo A. Molinolo “Nuclear staining of fgfr-2/ stat-5 and runx-2 in
mucinous breast cancer: a possible role for fgf pathway” Exp Mol Pathol. 2015, Nov 6.
pii: S0014-4800(15)00214-2. doi: 10.1016/j.yexmp.2015.11.003.
Asimismo, durante el desarrollo de mi carrera de doctorado he colaborado con
diversos proyectos de investigación, parte de los cuales han dado lugar a las siguientes
publicaciones:
1. 2013 - Ana Sahores, Guillermina M. Luque, Victoria Wargon, María May, Alfredo
Molinolo, Damasia Becu-Villalobos, Claudia Lanari, Caroline A. Lamb, “Novel, low cost,
highly effective, handmade steroid pellets for experimental studies”, Plos One, May
15, 2013 DOI: 10.1371/journal.pone.0064049.
2. 2014 - Sabrina Copsel, Ariana Bruzzone, Maria May, Julien Beyrath, Victoria Wargon,
Jeannette Cany, Frans GM Russel, Carina Shayo, Carlos Davio “Multidrug resistance
protein 4/ ATP binding cassette transporter 4: a new potential therapeutic target for
acute myeloid leukemia”. Oncotarget 2014 Oct; 5(19): 9308–9321.
3. 2014 - Gonzalo Sequeira,*, Silvia I Vanzulli,*, Paola Rojas, Caroline Lamb, Lucas
Colombo, María May, Alfredo Molinolo and Claudia Lanari. “The effectiveness of nano
chemotherapeutic particles combined with mifepristone depends on the PR isoform
ratio in preclinical models of breast cancer”. Oncotarget. 2014 May 30;5(10):3246-60.
4. 2014 - Victoria Wargon*, Marina Riggio*, Sebastián Giulianelli, Gonzalo Sequeira,
Paola Rojas, María May, María Laura Polo, María Alicia Gorostiaga, Alfredo Molinolo,
Virginia Novaro and Claudia Lanari. “Progestin and antiprogestin responsiveness in
breast cancer is driven by the PRA/PRB ratio via AIB1 or SMRT recruitment to the
CCND1 and MYC promoters”.Int J Cancer. 2014, Nov 1. doi:10.1002/ijc.29304.
5. 2015 - M. L. Polo1, M. Riggio1, M. May1, M. J. Rodríguez1, M. C. Perrone1, M. Stallings-
Mann2, D. L. Kaen3, M.H. Frost4, M.P. Goetz4, J.C. Boughey5, C. Lanari1, D.C. Radisky2
6
and V.Novaro1 “Activation of PI3K/Akt/mTOR signaling in the tumor stroma drives
endocrine therapy-dependent breast tumor regression” Oncotarget, May 16 2015.
7
Resumen
8
El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos alfa (RE y
receptores de progesterona (RP). Los mismos se clasifican como tumores de tipo luminal; y son
tumores que a priori serán respondedores a la terapia hormonal. A pesar de que en la gran
mayoría de los casos existe expresión de ambos receptores hormonales, la única terapia
hormonal disponible para este gran grupo de tumores, se dirige exclusivamente al RE. En la
actualidad el RP se utiliza como marcador secundario de la funcionalidad del RE
El rol de los progestágenos en el cáncer de mama ha sido menos estudiado que el de los
estrógenos, sin embargo numerosos datos bibliográficos y antecedentes de nuestro
laboratorio, sostienen que existe un rol para la progesterona en la inducción y mantenimiento
del fenotipo neoplásico en la glándula mamaria. La importancia de estos datos se puso en
evidencia en los resultados obtenidos en dos importantes estudios, The Women’s Health
Initiative trials y The Million Women Study, que mostraron que la inclusión de progestágenos
en los esquemas de terapia de reemplazo hormonal causó un incremento de neoplasias
mamarias en mujeres menopáusicas.
La progesterona actúa sobre sus células blanco activando al RP. Este receptor presenta
dos isoformas denominadas RPA y RPB, que son estructuralmente muy similares y están
codificadas por un mismo gen pero difieren en el sitio de inicio de la transcripción. El gold
standard para determinar el perfil de isoformas de una muestra es el Western Blot (WB) ya
que ambas isoformas se diferencian por el peso molecular, lo que hace necesario contar con
tejido fresco y una estructura técnica adecuada. Es importante resaltar que, la similitud
estructural de ambas isoformas hace difícil contar con anticuerpos específicos que distingan a
una de otra.
En nuestro laboratorio, hemos demostrado, tanto en un modelo murino de carcinomas
mamarios de tipo luminal, como en líneas celulares humanas de similares características, que
existe una correlación entre una alta expresión del RPA y la respuesta al tratamiento con
antiprogestágenos, específicamente la mifepristona (MFP). Por otra parte, hemos observado
que cuando predomina RPB la respuesta a la misma droga puede llegar a ser de tipo
estimulatoria.
En este escenario planteamos la hipótesis de que los carcinomas mamarios humanos
que posean similares características al modelo experimental, y que además expresen mayores
niveles de RPA que RPB, serían los que se beneficien la adición del tratamiento con
antiprogestágenos. El objetivo general de esta tesis es validar a la isoforma A del RP como
marcador predictivo de dicho tratamiento, y en segundo lugar, diseñar un algoritmo de
9
expresión diferencial, que nos permita predecir la isoforma predominante a partir de muestras
parafinadas.
Para el primer objetivo, pusimos a punto un método de cultivo ex-vivo donde
cuantificamos la respuesta de los tumores frente al tratamiento con MFP y su correlación con
su perfil de isoformas cuantificado por WB. Se midieron los índices de proliferación con ki-67
en la misma muestra tumoral, tanto en condiciones control como en condiciones de
tratamiento, durante 48 hs. De esta manera pudimos comprobar, sobre muestras de
pacientes, que el 100% de los tumores con predominio de la RPA inhiben su proliferación
frente al tratamiento con antiprogestágenos.
Para el segundo objetivo nos basamos en resultados obtenidos de secuenciación de
RNAm de pacientes catalogadas según su perfil de isoformas, y seleccionamos un listado de
genes candidatos regulados de forma diferencial por RPA o RPB. Haciendo uso de tissue
microarrays construidos a partir de muestras parafinadas de pacientes catalogadas según su
perfil de isoformas, estamos analizando dichos genes para poder construir, en un futuro, una
herramienta predictiva de la isoforma predominante en cada muestra. La meta final de esta
segunda parte, consiste en universalizar y hacer posible la determinación de la isoforma
predominante en hospitales de baja complejidad y recursos limitados, utilizando la
inmunohistoquímica sobre muestras parafinadas de pacientes.
Con los resultados de la secuenciación del RNAm de 9 pacientes catalogadas según su
perfil de isoformas, realizamos un análisis de expresión génica sobre una plataforma comercial
destinada a predecir riesgo de recurrencia y subtipo molecular de cáncer de mama. Los
resultados de este análisis arrojaron una concordancia muy significativa entre la isoforma
predominante y el perfil molecular, considerando a las muestras RPA como luminales A y a las
RPB como luminales B. En línea con esto último, las pacientes RPA o luminal A tuvieron una
predicción de un moderado riesgo a la recurrencia, y las pacientes RPB o luminal B, en cambio
presentaron un alto riesgo.
Por último analizamos aquellos factores pronósticos de uso clínico diario, como
tamaño tumoral, status axilar, expresión de receptores y ki-67 entre otros, para definir un
perfil clínico que acompañe al perfil de isoformas. En conjunto, la evaluación de estos
parámetros nos sugiere que las pacientes con predominio de RPA se acompañan de buen
pronóstico, validando el resultado del análisis de expresión génica utilizando una plataforma
comercial.
10
En conclusión, los resultados de esta tesis proponen a la relación de isoformas A y B
del RP como un marcador predictivo de la sensibilidad al tratamiento con antiprogestágenos, y
pronóstico en carcinomas de tipo luminal.
11
Índice
Agradecimientos……………………………………………………………..…………2
Publicaciones………………………………………………………………………….….4
Resumen……………………………………………………………………………………7
Índice……………………………………………………………………………………….11
Abreviaturas…………………………………………………………………………….13
Marco teórico………………………………………………………………………….15
Introduccion…………………………………………………………………………….16
1. El cáncer de mama. Generalidades clínicas y factores de riesgo. Cáncer de mama
hereditario y esporádico.
2. Opciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer de mama.
3. Clasificación del cáncer de mama. Factores pronósticos y predictivos clásicos.
4. La progesterona, su receptor y sus isoformas.
5. Genes diferencialmente regulados por las isoformas.
6. Isoformas en la clínica
7. Uso de antiprogestágenos en el tratamiento. Aplicabilidad en cáncer de mama.
Hipótesis de trabajo y objetivos……………………………………………….38
Materiales y Métodos………………………………………………………………40
1. Pacientes
2. Técnicas
3. Análisis estadístico
4. Criterios
Resultados……………………………………………………………………………….55
1 Análisis clínico de la población.
a. Factores de Riesgo
b. Enfermedad Actual
12
2 Análisis histológico de la población.
a. Subtipos Histológicos
b. Score pronóstico de Nottingham
3 Análisis de factores pronósticos RE, RP, HER-2 y ki-67 (IHQ).
4 Clasificación de las pacientes según su proporción de isoformas de RP
(WB).correlaciones entre isoformas de RP y factores pronósticos.
a. Correlación entre WB y factores pronósticos clínicos e histopatológicos
b. Evolución de las isoformas en las recurrencias o metástasis
5 Análisis de la correlación existente entre la proporción de isoformas del RP y la
respuesta ex vivo de carcinomas mamarios tratados con MFP.
a. Métodos para evaluar respuesta ( breve explicación)
b. Análisis clínico e histopatológico de pacientes evaluados.
c. Correlación entre índice de ki-67 y WB: Respuesta a MFP
6 Selección y análisis de la expresión diferencial de genes regulados por una u otra
isoforma.
7 Análisis gen por gen. Selección de genes candidatos y validación en nuestra población
estudiada.
8 Desarrollo de un algoritmo diagnóstico predictivo de la isoforma predominante.
Discusión…………………………………………………………………………….…105
Conclusiones………………………………………………………………………….111
Perspectivas futuras………………………………………………………….……113
Referencias…………………………………………………………………………….115
13
Abreviaturas
ACO: Anti conceptivos orales
BRCA: BReast CAncer type 1 - 2 suceptibility protein
CK: Citoqueratina
CM: Cáncer de mama
CMTN: Cáncer de mama Triple Negativo
CO: Cáncer de ovario
E: Estrógenos
EGF: Factor de crecimiento epidérmico
H&E: Hemotoxilina y Eosina
HER-2: Receptor del factor de crecimiento epidérmico de tipo 2
IA: Inhibidores de Aromatasa
IARC: International Agency for Research in Cancer
IF: Inmunofluorescencia
IHQ: Inmunohistoquímica
ILV: Invasion Linfovascular
LKB1: Liver kinase B1
MA: Acetato de Megestrol
MFP: Mifepristona
MPA: Acetato de medroxiprogesterona
NPI: Nottingham Prognostic Index
Pg: Progesterona
PTEN: phosphatase and tensin homolog
RA: Receptor de Andrógenos
14
RE: Receptor de estrógenos
RG: Receptor de glucocorticoides
RP: Receptor de progesterona
SNC: Sistema nervioso central
SPRM: Moduladores selectivos del receptor de progesterona
TAM: Tamoxifeno
THR: Terapia de reemplazo hormonal
TKI: Inhibidor de tirosina kinasa
TP53: Tumor protein 53
TZM: Trastuzumab
VEGF: Factor de crecimiento vascular y endotelial
15
Marco Teórico
El cáncer de mama es la neoplasia de mayor incidencia a nivel mundial, y la de mayor
mortalidad en países de bajos recursos como el nuestro. De la totalidad de los tumores
diagnosticados, aproximadamente un 75% se clasifican como tumores de tipo luminal de la
clasificación más comúnmente utilizada en la clínica, y eso implica la expresión de receptores
hormonales (receptor de estrógenos o RE y progesterona o RP).
Actualmente, la terapia para este gran grupo de tumores está exclusivamente dirigida
contra el RE; y al RP se lo utiliza como un marcador secundario de la funcionalidad de RE. En
nuestro laboratorio trabajamos con el RP y creemos que posee tanto un rol predictivo como
pronóstico.
El RP tiene dos isoformas: RPA y RPB que son estructuralmente muy semejantes, razón
por la cual no es posible el desarrollo de anticuerpos específicos. Por otra parte, a nivel
funcional, las isoformas presentan funciones muy diferentes. En la glándula mamaria normal
las isoformas se expresan en cantidades semejantes o equimolares, pero desde muy temprano
en el proceso carcinogénico, existe una desregulación de esta proporción, dando como
resultado el predominio de RPA o RPB.
En el laboratorio demostramos, en modelos experimentales con diferente expresión
de la proporción de isoformas, que dependiendo cuál de ellas sea la predominante el tumor
será susceptible de recibir terapia dirigida contra el RP (antiprogestágenos)
En este trabajo nos propusimos validar la hipótesis de que los tumores con predominio
de RPA son aquellos que van a responder frente al tratamiento con antiprogestágenos, y en
segundo lugar, caracterizar clínica y molecularmente a este grupo de pacientes.
16
Introducción
17
El cáncer es un problema de salud mundial. En la medida en que otras causas de
mortalidad son controladas y la población envejece, las enfermedades neoplásicas aparecen
entre las más importantes causales de muerte y discapacidad en el mundo. El cáncer de mama
(CM) es la neoplasia más diagnosticada y la primera causa de muerte en el sexo femenino a
nivel mundial. Se estima que se producen alrededor de 1.7 millones de casos nuevos por año,
que implican más de 521.900 muertes1. Aunque habitualmente se asume que esta patología es
esencialmente un problema de las regiones industrializadas, más de la mitad de estos decesos
ocurren en países de bajos o medianos ingresos2. La mortalidad por CM varía ampliamente de
región en región. Para los países del continente americano oscila entre un 9,7 por 100.000,
para Ecuador, y un 24,1 por 100.000 para Uruguay3. La República Argentina tiene la segunda
tasa de mortalidad en el continente (21,8 por 100.000), lo que se traduce en alrededor de
5.400 muertes por año (http://www.msal.gov.ar/inc).
Cáncer de mama: Generalidades clínicas y factores de riesgo
El CM es considerado en la actualidad una entidad multifactorial que aparece como
resultado de la interacción de diversos factores ambientales que actúan sobre individuos con
grados variables de susceptibilidad. Este fenómeno se traduce epidemiológica y clínicamente
en poblaciones donde los individuos pueden ser categorizados en diferentes estratos de riesgo
para desarrollar la enfermedad. Una correcta caracterización de los casos a lo largo de esta
línea de susceptibilidad variable, permite determinar con mayor precisión este riesgo, para
luego adecuar las estrategias preventivas correspondientes.
18
Se identifican dos grandes grupos de pacientes si consideramos a los agentes causales
de la enfermedad: por un lado, aquellas pacientes con carcinomas mamarios hereditarios
causados por mutaciones germinales en BRCA-1 Y BRCA-24, y por el otro están aquellas
pacientes con carcinomas mamarios esporádicos. Para este último grupo de pacientes, que
representa un 95% del total, se han identificado algunos factores de riesgo como: 1) la historia
familiar5, 2) la exposición a hormonas endógenas6 (larga vida reproductiva, baja paridad) o
exógenas (terapia hormonal de reemplazo)78, 3) el sobrepeso9, 4) la ingesta moderada de
alcohol10, y 5) el sedentarismo6. La modificación de estos factores requiere de un largo proceso
y sus efectos tardarán en evidenciarse varias décadas, por lo tanto, los esfuerzos para lograr el
control de la enfermedad, en un término más corto, deben centrarse en la detección precoz y
la implementación de tratamientos pertinentes. La tasa de curación de esta enfermedad,
depende principalmente del avance de la enfermedad al momento del diagnóstico (tamaño
tumoral y presencia de enfermedad a distancia). La tasa de curación para los tumores menores
de 2 cm supera el 80%. Asimismo, el diagnóstico de tumores más pequeños, potencialmente,
permite aplicar tratamientos menos agresivos (cirugías conservadoras y tratamientos
sistémicos menos tóxicos).
Carcinoma mamario hereditario
Comparado con los CM esporádicos, los casos familiares y hereditarios suelen
presentar características clínicas de sospecha, que deben ser tomadas en cuenta como
parámetro que propicie una evaluación más profunda del caso. Además de las características
en relación a la patología mamaria en sí, existen otras pautas de sospecha particulares que
dependen del síndrome involucrado y es necesario tenerlas en cuenta para la evaluación del
riesgo de los pacientes. En la tabla i.1 se enumeran las características de los carcinomas y de
los síndromes que deben ser evaluados para pensar en un componente hereditario (tomado
de: Pautas para la Detección y Estudio de Casos con Alto Riesgo de Cáncer de Mama Heredo-
Familiar, INC, 2015).
Características generales de Cáncer de Mama hereditario
CM antes de los 50 años
CM bilateral o multicéntrico (sincrónico o metacrónico)
CM en el hombre
19
CM en etnia de riesgo (ej.: judía askenazi, etc.)
Dos o más casos de CM en familiares cercanos (1er y 2ndo)
CM y otro tumor primario en el mismo individuo
CM triple negativo (CMTN) antes de los 60 años específicas de síndrome (asociadas a otros
tumores)
Características Específicas de síndrome (asociadas a otros tumores)
Familias con CM y cáncer de ovario (CO) o carcinoma de trompa o carcinoma peritoneal
primario independientemente de la edad de aparición
Familias con CM, cáncer de endometrio y/o carcinoma tiroideo
Familias con CM y tumores pediátricos como por ej. sarcomas, leucemias y tumores del
sistema nervioso central (SNC)
Familias con CM y afección gastrointestinal como por ej. pólipos hamartomatosos, cáncer
gástrico difuso, cáncer de colon, etc.
Tabla i.1: Características clínicas de sospecha para carcinomas mamarios de tipo hereditario.
*Ref. Familiares 1er grado: padres, hermanos, hijos / Familiares 2ndo grado: tíos, abuelos,
nietos y sobrinos.
Entre el 5-10% de los casos de CM son hereditarios y su aparición está asociada a la
herencia de un algún gen mutado, deficitario en su función. Los genes más comúnmente
mutados son BRCA-1 (55- 85%) o BRCA-2 (35-60%), y en menor medida de TP53 (<1%;
Síndrome de Li-Fraumeni), de PTEN (<1%; enfermedad de Cowden) o de LKB1 (síndrome de
Peutz-Jeghers). Los riesgos a los que están expuestos estos individuos son mayores que para el
CM familiar, alcanzando valores que pueden superar el 80% a lo largo de la vida, según el
síndrome y el gen involucrado. Los individuos de la familia que no heredan la mutación
responsable del síndrome, presentan un riesgo similar al de la población general.
Tradicionalmente, la decisión de estudiar las mutaciones en BRCA estuvo basada en
“predecir” el riesgo futuro de padecer carcinoma mamario contra lateral o CO. Sin embargo,
recientemente, la aparición de tratamientos novedosos como los inhibidores de PARP
(polimerasa poli ADP ribosa)11 ha incrementado la búsqueda de mutaciones en estos genes de
reparación siendo frecuentes sobre todo, en CMTN, representando hasta un 11% la frecuencia
de mutaciones. Desde el año 2009, se recomienda el estudio de BCRA-1 en aquellas mujeres
20
en mujeres con CMTN de aparición temprana (<40 años), aún en ausencia de historia familiar
de CM o CO 12,13 .
Carcinoma mamario esporádico
Los CM de tipo esporádico representan la gran mayoría de los casos, para los cuales se
conocen múltiples factores de riesgo (resumidos en la tabla i.2).
Factores Reproductivos
EDAD DE LA PRIMERA MENSTRUACIÓN (temprana): Antes de los 12 años.
EDAD DE LA MENOPAUSIA (tardía): Después de los 55 años.
La menarca precoz, antes de los 12 años de edad, se asocia a un leve aumento del riesgo
relativo de CM. La menopausia tardía, después de los 55 años de edad, tiene un riesgo relativo
igual a 2 con relación a mujeres con edad de menopausia antes de los 45 años. Resumiendo,
las mujeres que tienen 40 o más años de actividad menstrual tienen el doble de riesgo de
desarrollar CM que aquellas con 30 o menos años de ciclos menstruales, lo que indica que el
tiempo de exposición de la mama a esteroides ováricos influye en el riesgo de cáncer 14–16.
EDAD AL PRIMER PARTO
Las mujeres nulíparas presentan mayor riesgo que las que han tenido al menos un parto.
El aumento de riesgo con la edad creciente al primer parto (mayor a 35 años), es aplicable a las
mujeres sin antecedentes familiares. El efecto protector del embarazo temprano se podría
explicar por la diferenciación del epitelio mamario 17,18.
LACTANCIA
Se reduce en un 4% el riesgo de padecer CM, por cada 12 meses de lactancia. Una posible
explicación a esta reducción de riesgo es atribuida a la amenorrea de lactancia con la
consecuente disminución del número de ciclos menstruales y con ello la disminución de la
exposición de la mama a los esteroides ováricos19.
Factores Hormonales Exógenos
ANTICONCEPTIVOS ORALES (ACO)
Con respecto al uso de ACO, hubo un gran estudio colaborativo en 199620, con más de 53.000
mujeres donde se mostró un pequeño pero significativo aumento del riesgo de CM. La
International Agency for Research in Cancer (IARC) retoma la evaluación del riesgo de las
21
usuarias a ACO en 2007, concluyendo que las formulaciones combinadas incrementan en
riesgo con una significancia borderline7. Ambos trabajos postulan que el riesgo es constante y
mantenido e independiente del tiempo de uso de la píldora, de otros factores de riesgo para
CM y del tipo de formulación anticonceptiva, y que al suspender la píldora, el riesgo de CM
desciende paulatinamente. Sólo 10 años después de la discontinuación, el riesgo se iguala al de
las mujeres que nunca emplearon el método. Sin embargo, un estudio multicéntrico posterior
de más de 1.000 mujeres confirma los resultados del estudio de Oxford pero sólo para las
formulaciones anticonceptivas empleadas hasta el año 1975. Con las formulaciones actuales
no se aprecia aumento del riesgo de CM, ni siquiera para las portadoras de mutaciones BRCA-1
y 221,22.
TERAPIA DE REEMPLAZO HORMONAL (TRH)
La combinación de estrógenos conjugados con acetato de medroxiprogesterona (MPA)
produjo un aumento del riesgo de cáncer de mama de 26% que resultó estadísticamente
significativo 23,24 (Ver: rol de los progestágenos en CM).
Factores Dietarios y de Estilo de vida
SOBREPESO Y OBESIDAD
Clásicamente se ha descrito que la obesidad en mujeres postmenopáusicas aumenta el riesgo
de CM debido a que aumenta la aromatización de andrógenos, lo que conlleva a un aumento
de los estrógenos endógenos. Cabe aclarar que la conversión extraglandular de esteroides a
estrógenos tiene lugar primariamente en el tejido adiposo y está catalizada por el complejo
enzimático aromatasa/ citocromo P45025.Existen estudios que señalan correlación entre
aumento del consumo de grasas en la dieta con aumento de la incidencia de cáncer de
mama9,22.
ALCOHOL
La reducción del consumo de alcohol en las mujeres con una ingesta elevada (3 o más tragos
por día) reduce el riesgo posterior de desarrollar CM6 10.
ACTIVIDAD FÍSICA
El ejercicio físico recreativo regular reduce el riesgo de CM, especialmente en la
posmenopausia. Esto es debido a que evita el aumento de peso y por consiguiente la
disminución en los niveles de estrógenos26.
TABAQUISMO
22
Con respecto al consumo de tabaco, hay evidencia consistente de que el riesgo se incrementa
de forma moderada, más aún, la exposición pasiva al humo del tabaco también incrementa el
riesgo 27
Factores Relacionados con Procedimientos Médicos
ALTA DENSIDAD MAMOGRÁFICA
ALTA DENSIDAD MINERAL ÓSEA
RADIACIÓN TORÁCICA DE ALTA DOSIS
El antecedente de irradiación terapéutica del tórax (por ejemplo, en enfermedad de Hodgkin),
especialmente si ocurrió en la adolescencia, aumenta marcadamente el riesgo de desarrollar
cáncer de mama en el futuro.
BIOPSIAS PREVIAS DE MAMA28
Con diagnóstico de lesiones benignas, y aún más con diagnóstico de hiperplasia atípica (HDA) y
carcinoma lobulillar in situ (CLIS)29 30. Estas dos lesiones comprenden a un espectro de
proliferaciones del epitelio mamario, tanto en el ducto como en el lobulillo, que aún no han
adquirido características de invasividad del tejido adyacente.
Tabla i.2: Características clínicas de sospecha para carcinomas mamarios de tipo esporádico.
Opciones terapéuticas para el tratamiento del CM
(http://www.cancer.gov/espanol/pdq/tratamiento).
Hay diferentes tratamientos disponibles para las pacientes de CM. Se utilizan 5 tipos de
tratamiento estándar:
1. Cirugía
La mayoría de las pacientes con CM se someten a cirugía a fin de extirpar la masa tumoral
visible, siendo siempre esta opción la primera elección y la que ofrece mayores posibilidades
de curación. Dichas posibilidades se encuentra directamente asociadas al estadio clínico en el
que se encuentra la paciente al momento del diagnóstico.
La tendencia quirúrgica actual abarca procedimientos quirúrgicos “conservadores”, donde
se conserva la mama. Sin embargo, en los casos donde no es posible la conservación de la
23
misma, se realizan cirugías radicales, que incluyen en ocasiones al músculo pectoral y a otros
músculos de la pared torácica.
Es importante tener en cuenta que se puede administrar quimioterapia antes de la cirugía.
El tratamiento administrado antes de la cirugía se llama terapia neoadyuvante y tiene como
objetivo reducir el tamaño del tumor y la cantidad de tejido que es necesario extirpar durante
la cirugía.
Incluso si el médico extirpa todo el tumor visible en el momento de la cirugía, algunas
pacientes pueden recibir radioterapia, quimioterapia o terapia con hormonas después de la
cirugía para destruir cualquier célula neoplásica remanente. El tratamiento administrado
después de la cirugía para disminuir el riesgo de recidiva se denomina terapia adyuvante.
2. Radioterapia
La radioterapia es un tratamiento basado en rayos X de alta energía u otros tipos
de radiación para destruir células neoplásicas malignas remanentes. Hay dos tipos de
radioterapia: externa o interna. La forma en que se administra la radioterapia depende del tipo
y el estadio del cáncer que se está tratando.
3. Quimioterapia
La quimioterapia es un tratamiento donde se utilizan drogas para interrumpir el
crecimiento de las células tumorales. Hay dos tipos de quimioterapia: aquella que se
administra en forma sistémica y se distribuye en el torrente sanguíneo, y la quimioterapia
local, donde la droga es administrada directamente en la cavidad u órgano afectado.
4. Terapia endocrina del CM
La terapia endocrina para el CM incluye a una gran variedad de drogas que bloquean y/o
modulan diferentes tipos de hormonas. La glándula mamaria es un tejido que expresa en
condiciones normales, receptores de estrógenos (RE), de progesterona (RP)31, de andrógenos
(RA)32 33y de glucocorticoides (RG). En diferentes proporciones, todas estas hormonas están
implicadas de alguna manera en los procesos funcionales y evolutivos de la mama, y cuando
sufren desregulación, también tienen un rol en el proceso carcinogénico. En el caso de los
glucocorticoides, por medio de su receptor regulan la respuesta inflamatoria e inmunitaria, así
como también la proliferación y la apoptosis 34.
24
Terapias hormonales dirigidas contra los estrógenos
De las opciones terapéuticas disponibles en la clínica, aquellas dirigidas contra los
estrógenos son las más comúnmente utilizadas. En líneas generales hay dos estrategias
posibles, por un lado, modular o bloquear al receptor de dicha hormona; y por otro, bloquear
su producción endógena. Para ello se utilizan inhibidores de la aromatasa, (IA) inhibiendo a la
enzima cuya función es la de aromatizar los andrógenos, convirtiendo la testosterona en
estrógenos.
Con respecto al RE, cabe destacar que existen dos isoformas, REα y REβ, las cuales se
expresan a partir de distintos genes ubicados en los cromosomas 6 y 14 respectivamente. Su
expresión es tejido específica y una vez que se unen al ADN en secuencias denominadas
elementos de respuestas a estrógenos (ERE), activan la transcripción de sus genes blanco35. Es
bien conocida la función de REα en la progresión tumoral, y las estrategias de bloqueo están
dirigidas a bloquear esta isoforma. Se dispone de dos clases de drogas: los moduladores
selectivos del RE (SERMs) como el Tamoxifeno (TAM) y el Raloxifeno, y los antiestrógenos
puros como el Fulvestrant.
Con respecto a los IA, contamos con tres drogas: Anastrazol, Letrozol y Exemestano.
Estos agentes se utilizan en varios escenarios clínicos, abarcando desde la quimioprevención
hasta la adyuvancia en enfermedad temprana y metastásica36.
5. Terapia dirigida
La terapia dirigida37 es un tipo de tratamiento que identifica y ataca células tumorales
específicas sin dañar las células normales. Basados en características moleculares específicas
del CM, como lo son por ejemplo, las mutaciones en BRCA-1/ BRCA-2, la sobreexpresión del
factor de crecimiento epidérmico de tipo 2 (HER-2) y la activación de factores de crecimiento
vascular/ epitelial (VEGF- EGFR) se han desarrollado variedad de agentes específicos para
mejorar y aumentar la eficacia terapéutica.
Dentro de la variedad de terapias dirigidas en CM, fuera del tratamiento contra los
estrógenos, la primera droga en ser aprobada fue el Trastuzumab (TMZ) en 1998 38. Esta droga
es un anticuerpo monoclonal que está dirigido contra el HER-2, y actualmente se la ha
combinado con emtansina (un potente quimioterápico disruptor de microtúbulos) con el
objetivo de guiar a la droga quimioterápica a su sitio específico de acción39. Existe otro
abordaje que inhibe la dimerización del HER-2, y de esta manera previene la señalización
25
mediada por esta molécula; esta droga también es un anticuerpo monoclonal y se denomina
Pertuzumab40.
Por otro lado, existen abordajes terapéuticos que combinan la inhibición del HER-1 y HER-
2. Estas drogas tienen como mecanismo de acción inhibir el dominio activo de las tirosina
quinasas (TK) de estos receptores y de esta manera evitar la fosforilación y consecuente
activación de la vía. El único inhibidor de TK (TKI) aprobado actualmente es el Lapatinib41.
Otro agente recientemente aprobado es el Everolimus, un inhibidor de m-TOR, efector de
una vía de señalización implicada en proliferación, migración e invasión. Esta droga se usa en
combinación con IA, y ha mostrado mejoras en la progresión libre de enfermedad y en la
sobrevida total42.
Otros agentes en vías de aprobación incluyen inhibidores de PARP (poli- ADP-ribosa) para
pacientes BRCA-1/BRCA-2, inhibidores de HDAC (histona deacetilasa) o inhibidores de ciclinas
dependientes de quinasa (CDK), entre otros43.
Todas estas drogas han mejorado notablemente la sobrevida de la gran mayoría de las
pacientes que padecen esta enfermedad, sin embargo, tienen dos mayores problemas: por un
lado su altísimo costo y por el otro, la falta de biomarcadores que seleccionen a las pacientes
que serán beneficiadas con cada una de estas estrategias44.
Clasificación del CM. Factores pronósticos y predictivos clásicos
Se han realizado considerables avances en lo que se refiere a alteraciones moleculares que
contribuyen al desarrollo del CM. Sin embargo, excepto por la evaluación del RE, RP y HER-2,
muy poco de esta información tiene significado real en términos de manejo clínico. Todo el
resto de la información clínicamente relevante se obtiene a través de un examen
histopatológico cuidadoso. Los factores pronósticos recomendados por la CAP (College of
American Pathologists) para los reportes de anatomía patológica, y requeridos por los
cirujanos incluyen: 1) tamaño tumoral, 2) estado de los ganglios axilares, 3) tipo y grado
histológico (índice pronóstico de Nottingham; NPI), 4) estado de los receptores hormonales, 5)
compromiso de piel y pared torácica, y 6) invasión linfovascular45.
1) Tamaño tumoral (TT): el TT está casi proporcionalmente relacionado con la
probabilidad de tener metástasis ganglionar y es un factor pronóstico independiente y
26
considerado de los más importantes. A este respecto, la AJCC (American Joint
Committee on Cancer) indica que el tamaño patológico debe ser cuidadosamente
medido y solamente se considera al componente invasivo de los tumores. Existen
algunas situaciones particularmente importantes al momento de informar el TT:
Focos de microinvasión: se denomina microinvasión a la presencia de células
tumorales por debajo de la membrana basal, con focos no mayores a 0,1 cm.
Varios estudios han mostrado que las lesiones in situ y estas lesiones micro-
invasoras poseen la misma implicancia pronostica.
Tumores pequeños (T1a y T1b): existe una especial dificultad relacionada con
los tumores pequeños por varias razones, entre las que se encuentran sobre
todo el muestreo subóptimo.
2) Estado de los ganglios axilares: es el factor pronóstico independiente más importante
para los pacientes con esta enfermedad. Tanto la sobrevida total (OS: del inglés overall
survival) como el tiempo a la recurrencia (ROR: del inglés risk of recurrence)
disminuyen proporcionalmente al número de ganglios positivos 46.
3) Tipo y grado histológico: el grado histológico se correlaciona con la supervivencia
independientemente del estado de los ganglios axilares o del tamaño tumoral 47. El
sistema de gradación más utilizado es la versión modificada de Scarff- Bloom-
Richardson realizada por Nottingham (NPI), que utiliza un score del 1 al 3, teniendo en
cuenta la formación de túbulos, pleomorfismo nuclear e índice mitótico. Dada la
información pronóstica que proporciona el NPI, ha sido incorporada en varios
algoritmos (como por ejemplo Adyuvant Online)48 y guías como St. Gallen49 para
determinar el uso de quimioterapia. Este índice no tiene costos extra y agrega
importante información sobre el comportamiento biológico intrínseco del tumor 50. En
cuanto a los subtipos histológicos, sabemos que el 80% de los tumores se clasifican en
ductales y lobulillares, y en ambos casos se aplica esta gradación. Por otro lado,
algunos subtipos como el tubular, el mucinoso, el adenoide quístico y el cribiforme
invasor son clásicamente de buen pronóstico.
4) El estado de los receptores hormonales (REyRP representan tanto un factor
pronóstico del outcome clínico (sobrevida total y tiempo libre de recurrencia), como
predictivo de la respuesta a una terapia específica (dirigida contra los estrógenos). Está
ampliamente demostrado que el método de inmunohistoquímica (IHQ) es el más
confiable para realizar la detección, y el punto de corte para avalar el tratamiento
antiestrogénico es el 1% 49,51. En el caso del RP, su rol aún no está enteramente
explorado, por ahora los datos bibliográficos apuntan a proponerlo como una
27
marcador secundario de respuesta al tratamiento antiestrogénico52.Los tumores que
expresan ambos receptores (REyRPtienen mejor pronóstico que aquellos que sólo
expresan RESin embargo, está bien documentado que existe variación en la
respuesta de los pacientes al tratamiento, a pesar de que expresen similares niveles de
receptores hormonales54,55. Por otro lado, la expresión de RP tiene valor pronóstico
per se, pero no tendría un valor predictivo frente a la elección del tratamiento con
TAM o con inhibidores de la aromatasa56.
5) Compromiso de piel y pared torácica: en estos casos el sólo compromiso de la pared
torácica o la piel conllevan a un estadio pT4b que confiere un muy mal pronóstico sin
importar el tamaño del tumor primario o el estado de la axila. La presentación clínica
de dicho compromiso es fácilmente evidente y se traduce en alteraciones locales como
la piel de naranja o la retracción del pezón, y estos hallazgos se generan por una
invasión directa del carcinoma sobre la dermis o una masiva invasión de los linfáticos
dérmicos. Es importante destacar que el carcinoma inflamatorio (clasificado como
pT4b) requiere tanto la presentación clínica antes mencionada como la
documentación histológica del mismo.
6) Invasión linfo-vascular (ILV): Cuando se identifican embolias tumorales, las mismas se
ubican dentro de “canales vasculares” de paredes muy finas; si estas estructuras son
linfáticos, capilares o vénulas no puede ser determinado y parece no tener
importancia pronóstica. Este es el motivo por el cual se denomina en conjunto como
invasión linfovascular. Hay muchos estudios donde se documenta y correlaciona la
presencia de ILV extratumoral con compromiso de ganglios linfáticos, indicando un
peor pronóstico para pacientes con axila negativa al momento del diagnóstico inicial 57
58. El diagnóstico de ILV debe ser cautelosamente analizado siempre por fuera del área
tumoral invasiva, ya que los artefactos de retracción suelen generar falsos positivos.
Por otro lado, los estudios de IHQ realizados para poner de manifiesto células
endoteliales suele resultar tanto en falsos positivos como negativos 57.
Clasificación del CM
Tradicionalmente la clasificación utilizada para las lesiones de mama es aquella
realizada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre las características
histopatológicas de las lesiones. La última actualización fue realizada en el año 2012, y a pesar
de los avances realizados sobre la biología de la enfermedad aún no se logra un consenso en la
clasificación molecular del CM. Esta clasificación se focaliza en la morfología clásica de los
tumores a la luz del microscopio óptico, e incorpora datos moleculares y genéticos que ayudan
28
a la estratificación de las lesiones. Sin embargo, en la actualidad se ha incorporado lo que
llamamos “clasificación molecular” del CM. La misma fue descripta por Perou y Sorlie en el año
2000, a partir de microarrays de DNA de 65 especímenes de carcinomas mamarios 59 60 61.
Esta forma de clasificación basada en patrones de expresión génica, no solamente
agrupó tumores con características similares sino que también aportó valiosa información de
la biología tumoral. Como por ejemplo, la variación en las tasas de proliferación y en vías de
señalización específicas. Originalmente la clasificación se basó en la expresión de
citoqueratinas (CK) de expresión luminal (CK8, 18, 19 y cadherina-P) o de expresión basal
mioepitelial (CK5, 6, 14 y 17, además de cadherina-E). En la práctica estas CK tienen una gran
concordancia con la expresión de receptores hormonales, aquellos clínicamente catalogados
como RE+ se caracterizaron por contener un alto porcentaje de genes expresados en células
epiteliales de tipo luminal. Estos resultados fueron validados utilizando IHQ para CK luminales
8-18 62. Otro gran grupo de tumores se agrupó bajo la denominación de basal-like por expresar
genes relacionados a CK basales (CK 5/6) y ser RE (-); y un tercer grupo, en general también RE
(-), se lo identificó por la sobre-expresión del HER-2. El cluster de genes más notorio que
diferencia los grupos es el correspondiente a proliferación, y obviamente incluye genes como
Ki-67 y PCNA.
A partir del trabajo de Perou y col, la expresión de receptores hormonales, podemos
agrupar a los tumores en tres grandes grupos con muy diferentes implicancias pronósticas y de
tratamiento: los tumores LUMINALES (RERP, los BASALES [REHER-2 (-)]y los HER-2 59.
A continuación, se generaron múltiples plataformas genéticas orientadas a predecir el
pronóstico de las pacientes, y con el objetivo específico de ayudar en la decisión terapéutica
adyuvante. De la variedad de plataformas disponibles, las más utilizadas son: 1) el
MammaPrint Score, utiliza RNAm de 70 genes y estratifica a las pacientes en bajo o alto riesgo
de recurrencia; 2) Oncotype dx Assay, es la plataforma más ampliamente utilizada, en este
caso se basa en 16 genes relacionados al cáncer y 5 genes housekeeping y estratifica a las
pacientes en tres grupos de riesgo; y por último 3) PAM50/risk of recurrence, que utiliza
similares tecnologías y genes pero incorpora, además del riesgo de recurrencia, al subtipo
molecular del CM 63.
29
La progesterona, su receptor y sus isoformas.
La progesterona (Pg) es una hormona esteroidea sintetizada a partir de colesterol, que
tiene importantes funciones en la fisiología sexual y reproductiva de las mujeres, jugando un
rol central en órganos como útero, ovarios, glándula mamaria y sistema nervioso central. Se
conocen múltiples vías de señalización celular reguladas por Pg64. Todas estas funciones son
bien conocidas y nos dan una idea de la importancia de esta hormona y su complejidad de
funciones 65. Dependiendo de la etapa reproductiva en la que se encuentra la mujer, las
terapias que contienen progestágenos se utilizan, ya sea en la formulación de ACO (edad fértil)
o en la TRH combinada (postmenopausia). A su vez, son agentes que se utilizan
frecuentemente para patologías ginecológicas de muy frecuente presentación como: síndrome
premenstrual, irregularidades menstruales por alteraciones en la ovulación o por anovulación;
mastopatías benignas, mastodinias y esterilidad de causa hormonal 6667.
Si nos focalizamos en las acciones de la Pg en la fisiología de la glándula mamaria,
sabemos que regula la expansión del componente epitelial durante el ciclo menstrual 68, y es la
hormona responsable del edema estromal y la vacuolización presente en las células
mioepiteliales durante la fase lútea 69. Durante el embarazo, se incrementa y se prolonga aún
más este efecto, y hacia el final del mismo, la caída abrupta en los niveles de esta hormona
facilita el parto y permite la lactancia 70.
Rol de los progestágenos en el cáncer de mama
El CM se origina en el epitelio ductal, y dicho epitelio es dependiente de la función de
las hormonas ováricas, estrógenos (E) y Pg, para su completo desarrollo. Es bien conocido, por
un lado, el rol protector de una corta vida reproductiva (menos ciclos endógenos de E y Pg)71, y
por otro, que las mujeres ooforectomizadas tienen un riesgo reducido de padecer esta
enfermedad72 (ver Factores de riesgo). De hecho, la manipulación endocrina para inhibir a los E
es la primera elección de tratamiento para mujeres con tumores RE+54.
Con respecto a la Pg o a sus análogos sintéticos, la bibliografía no es concluyente con
respecto a si posee un rol pro o anti proliferativo. Por un lado, durante la década del 70, se
introdujo el uso de altas dosis de progestágenos sintéticos, como el MPA en el tratamiento del
CM metastásico, observando remisiones objetivas de hasta un 30% de la masa tumoral total73.
En la actualidad, existen evidencias, por ejemplo, de que la administración de una inyección de
Pg antes de la cirugía para CM, puede proporcionar beneficio clínico74.Más aún, en 2014,
30
concluyó un estudio de fase II donde se trataron pacientes postmenopaúsicas con CM con un
progestágeno sintético (Acetato de Megestrol o MA). Estas pacientes, en su evolución, habían
progresado a los IA no esteroideos (NSAI).En este estudio, los autores demostraron que el MA
podría ser un tratamiento razonable, en cuanto a costo y efectividad75. Por último, es
interesante destacar el uso de altas dosis de MPA en los tumores sin expresión de receptores
hormonales, haciendo uso de sus acciones sobre el RG y el RA.
Contrariamente a estos trabajos donde se propone el uso de progestágenos en el
tratamiento del CM, hubo dos grandes estudios clínicos casi en simultáneo (Women´s Health
Iniatiative; WHI y Million Women Study; MWS) donde se evidenció la asociación positiva entre
el uso de progestágenos, en el contexto de la TRH y el incremento del riesgo de padecer CM.
El WHI (en Estados Unidos) fue diseñado como un ensayo de prevención primaria de
los eventos cardiovasculares asociados a TRH. Entre 1993 y 1998 se reclutaron 16.600 mujeres
postmenopáusicas de entre 50 y 79 años, a las cuales se planeó hacerles seguimiento clínico
durante 8.5 años. Sin embargo, luego de 5.2 años de seguimiento se decidió interrumpir el
ensayo porque las pacientes que recibían TRH combinada (E y MPA) habían superado
ampliamente los límites permitidos de aparición de CM23.
El MWS (en Reino Unido) reclutó 1.000.000 de pacientes entre 1996 y 2001, de entre
50 y 64 años. La mitad de estas pacientes era usuaria de TRH y la otra mitad recibía placebo. El
estudio fue diseñado para evaluar los efectos de este tipo de terapia sobre el riesgo de cáncer
y resultó que al igual que el WHI, éste incrementa de forma significativa en usuarias de TRH
combinada comparada contra placebo o contra formulaciones únicamente basadas en E. El
Reino Unido estima que en la última década hubo unos 20.000 CM por sobre lo estimado,
15.000 de ellos asociados al uso de TRH combinada24.
Receptor de Progesterona
Al igual que los E, la Pg ejerce sus efectos mediante receptores nucleares específicos,
que se expresan exclusivamente en una proporción de entre 20 y 40% en las células luminales
de la mama76. Existe evidencia, además, que sugiere que aquellas células con receptores
positivos no son las que proliferan directamente a la señalización hormonal, sino que ejercen
una influencia paracrina en las restantes células que no poseen dicho receptor77. Actualmente,
la presencia del RP en las muestras de pacientes con CM, se utiliza para predecir la
funcionalidad de los RE y, por lo tanto, predecir la respuesta a la terapia endocrina78.
31
El RP se encuentra constituido por dos isoformas, la A y la B (RPA y RPB) las cuales se
expresan a partir de un único gen pero con distintos promotores79. La RPA pesa 94 kDa y está
incluida dentro de RPB, que tiene un peso molecular de 115-120 kDa en humanos. Las dos
isoformas son idénticas excepto que RPA carece de 164 aminoacidos presentes en el extremo
N- terminal de RPB. Esta región única que posee RPB contiene un dominio de activación
trascripcional llamado AF-380 (figura i1). Cuando se analiza la actividad trascripcional de ambas
isoformas individualmente, se observa que RPA es casi siempre dominante inhibitoria sobre la
actividad de PRB. Sin embargo, esta situación no es fisiológica, ya que siempre ambas
isoformas están siempre presentes, tanto en condiciones normales como tumorales 81. Por
otro lado, RPA puede regular además de a RPB, a otros receptores nucleares tales como
receptores de mineralocorticoides, RG, RA y RE 828384.
Figura i1: Esquema ilustrando las isoformas de RP. LBD o sitio de unión del ligando (del inglés,
ligand binding domain), DBD o sitio de unión al DNA (del Inglés DNA binding domain), H o
bisagra (del inglés hinge). Se puede apreciar el mayor tamaño de la isoforma B con respecto a
la A constituido por el segmento BUS.
En condiciones normales RPA y RPB se expresan en los mismos tipos celulares y en
idéntica proporción, siendo su relación cercana a uno 81. Sin embargo, en algunas
circunstancias y tipos celulares predomina una isoforma sobre la otra. Un ejemplo de esta
situación, es el estroma uterino donde predomina la isoforma A 85.
LBD RPB
933 DBD H
1
LBD RPA
933 DBD H
165
32
El desbalance en la proporción de isoformas y su relación con la progresión tumoral
Se han encontrado variaciones en la proporción de isoformas en múltiples situaciones
que preceden a la aparición de cáncer: por ejemplo, del análisis de tejido mamario normal de
mujeres portadoras de mutaciones en los genes BCRA (conocida por conllevar un incremento
del 30% del riesgo de padecer la enfermedad) se ha encontrado que la RPB casi desaparece8687.
Otro ejemplo son las lesiones pre-malignas, como la hiperplasia ductal atípica, donde también
se altera esta proporción 86. Lo que sí está claro es que el desbalance en la proporción de
isoformas es un evento temprano en la carcinogénesis 81.
Los carcinomas mamarios invasores presentan una variedad de proporciones de
isoformas de RP. En la gran mayoría de los casos, los tumores continúan expresando ambas
isoformas con predominio de la RPA con mayor frecuencia. El primer reporte de la distribución
de isoformas en los tumores lo realizó el grupo de Christine Clarke en 1995 65, y en los
sucesivos trabajos de diferentes grupos los resultados fueron similares77 87 89. Con respecto a la
razón por la cual se genera este desbalance, aún no está claro, pero uno de los mecanismos
involucrados podría ser el silenciamiento por metilación del promotor de RPA90 88.
Genes diferencialmente regulados por las isoformas
Es bien conocido que cada una de las isoformas del RP regula un set diferente de
genes. Existen aproximaciones experimentales en diferentes modelos de CM de donde
obtuvimos una primera selección de genes que serán analizados en la tesis. El primer trabajo
fue publicado por el grupo de Horwitz de la Universidad de Colorado sobre microarrays de
expresión génica de células T47D-Y (clon de células T47D sin expresión de RP) transfectadas
con una u otra isoforma de RP (T47D-YA y T47D-YB). Observaron que, de un total de 94 genes
regulados por Pg, 65 estaban regulados exclusivamente por la RPB, 4 estaban regulados por
RPA y 25 estaban regulados por ambas 91. En cuanto a las funciones de estos genes
diferenciales, se encuentran varios con funciones relacionadas a adhesión celular (HEF-1,
ITGA2, por ejemplo), ciclo celular y apoptosis (BCL- XL/S, NDRG1), factores de transcripción
(STAT5a, C/EBP), entre otros. Otro trabajo posterior analiza la expresión diferencial de genes
en un modelo donde ambas isoformas están presentes, a diferencia del abordaje
anteriormente citado. Los autores observan que solo un porcentaje reducido de estos genes
(n=18) fueron regulados de forma diferencial en células con ambas isoformas presentes 92.
33
Es interesante destacar que el balance de las isoformas no sólo es esencial en la
glándula mamaria. Por ejemplo, hay un trabajo publicado en un modelo de células epiteliales
uterinas que asocia la diferente proporción de isoformas con una expresión diferencial de
MUC-1 93, sugiriendo que esta proteína podría ser un biomarcador a tener en cuenta.
Isoformas en la clínica
Hay en la bibliografía 6 trabajos publicados donde se estudian las isoformas del RP en
pacientes y su relación con parámetros clínicos. El método para determinar del perfil de
isoformas, y los puntos de corte para categorizar a las pacientes difiere en todos estos
trabajos, y las conclusiones que se desprenden de los mismos son dispares. Sin embargo, toda
la evidencia experimental y clínica, sugiere que el perfil de isoformas del RP podría tener
implicancia en la decisión terapéutica (rol predictivo) además de un valioso rol pronóstico.
Los primeros análisis en pacientes fueron realizados por el grupo de Clarke y col.65
donde se testearon 202 muestras de pacientes PR+. Las conclusiones de este trabajo fueron
meramente descriptivas: encontraron que la mayoría de las pacientes presentan una
proporción similar de ambas isoformas, y que de las restantes, un gran número de pacientes
tiene disminuida la RPB resultando en un incremento proporcional de la RPA.
En un siguiente trabajo realizado por un grupo alemán años más tarde 89, se analizaron
las isoformas y su correlación con parámetros clínicos y patológicos. Al igual que en el trabajo
de Clarke mencionado anteriormente, encontraron un claro predominio de pacientes con más
isoforma A que B. Con respecto a los parámetros clínicos, no hubo correlaciones destacables, si
bien hallaron una asociación positiva entre un mayor grado de agresividad tumoral y la RPA.
Es importante destacar que el número de pacientes utilizados en este estudio fue muy escaso
(n=53).
Otro trabajo posterior, analizó las isoformas con RT-PCR, ya que se codifican de
diferentes RNAm94. La expresión de ambas isoformas fue detectada en los 6 carcinomas
invasores evaluados. En este trabajo también se buscaron correlaciones con parámetros
clínicos, aunque todas ellas fueron negativas. En nuestra experiencia, resultados preliminares
realizados sobre 50 muestras pareadas (RNAm y WB), no mostraron correlación entre los
niveles de RNAm y proteína para RPA o RPB (Resultado del Dr. Gonzalo Sequeira -no
publicado- (figura i2).
34
Figura i2: Representación gráfica de tipo “DotPlot” relacionando en cada muestra (n=50) la
proporción de isoformas de RP por WB (eje X) y por qPCR (eje Y). El análisis estadístico arroja
un p= 0.62, lo que nos indica falta de correlación entre ambas técnicas. Resultado no publicado
(Dr. Gonzalo Sequeira).
En 2004 el grupo de Horwitz y Fuqua analizó por primera vez, la relación entre la
proporción de isoformas y la respuesta a terapia endocrina con TAM. En este trabajo se
estudiaron 297 pacientes en estadio II (ganglio axilar positivo) y encontraron que las pacientes
con predominio de expresión de la isoforma A tenían dos veces mayor probabilidad de recaer
durante su tratamiento con TAM78, sugiriendo que esta isoforma sería marcadora de mal
pronóstico. Otro grupo, en un trabajo posterior, sobre 500 pacientes tratadas con TAM vs. 500
pacientes sin tratamiento sistémico (sólo sometidas a cirugía) , observó que la metilación de
RPA, o sea su silenciamiento, se correlaciona con un peor pronóstico 88, resultado contrario a
lo postulado por Horwitz en 2004.
El trabajo publicado recientemente por el grupo de Clarke y col.95analiza la expresión
de las isoformas por inmunofluorescencia (IF) en muestras de tejidos incluidos en parafina,
obtenidas en su mayoría del estudio TransATAC (The translational arm of the Arimidex,
Tamoxifen Alone or in Combination). Los autores concluyen, en este caso, que las isoformas
PCRq
WB
RA
TIO
0 10 20 300
1
2
3
4
5 Relación WB/qPCR
35
tienen un rol predictivo de la respuesta al tratamiento antiestrogénico de elección. Sostienen
que la RPA predice una pobre respuesta al tratamiento con TAM95.
Queda claro de lo expuesto anteriormente que los resultados clínicos son muy
dispares, así como también lo son las maneras de determinar el perfil de isoformas en cada
paciente. En ciertos casos los valores surgen del WB, en otros del RNAm y en este último
estudio publicado en 2015, la determinación de las isoformas es por IF. Los puntos de corte
para categorizar a las pacientes y las posibles maneras de determinar la proporción de
isoformas serán discutidos más adelante.
Uso clínico de los antiprogestágenos
Tipos de antiprogestágenos
Hay tres tipos de antagonistas esteroideos, y todos ellos compiten por el sitio ligando
específico. Los antagonistas de tipo I previenen la unión al DNA e inhiben la fosforilación de RP
(un ejemplo es la Onapristona). Los de tipo II, como la mifepristona (MFP, RU-486) promueven
la unión al DNA y promueven la fosforilación de RP pudiendo actuar como agonistas
progestacionales en determinadas condiciones. Los de tipo III promueven la unión al DNA,
reclutan correpresores e inducen la fosforilación de RP, un ejemplo de este tipo de antagonista
es el Lonaprisan96. En conjunto todos estos agentes se denominan “moduladores selectivos del
RP” o SPRMs.
36
Figura i3: Mecanismos de acción de la Pg y SPRMs, tomada de: Los moduladores selectivos
de los receptores de la progesterona en la medicina de la reproducción: farmacología,
eficacia clínica y seguridad, PhillipeBouchard97.
Uso de antiprogestágenos en enfermedades no neoplásicas
En Estados Unidos hace 15 años se aprobó el uso de MFP como agente abortivo en
forma conjunta con Misoprostol66 y hace 3 años para el tratamiento del síndrome de
Cushing98. MFP muestra una alta afinidad por el RP y por el RG99, es por este motivo que se
usa para esta enfermedad con altos niveles de glucocorticoides circulantes. Las dosis en este
caso son superiores a 300 mg diarios y se administran por vía oral sin mostrar efectos tóxicos
adicionales a los inducidos por su efecto endócrino100.
Además de estas indicaciones se conoce la actividad inhibitoria de los SPRMs sobre la
proliferación endometrial y el crecimiento de leiomiomas, por este motivo se utilizan como
herramienta para el tratamiento de la endometriosis y miomas uterinos101.
Uso de antiprogestágenos en cáncer de mama
Nuestra evidencia experimental
Nuestro Laboratorio se ha focalizado en los últimos años en estudiar el papel
jerárquico de los RP en el desarrollo del CM, basado principalmente en observaciones
realizadas en un modelo experimental murino de carcinomas mamarios inducidos por la
administración continua de MPA. Este modelo tumoral se asemeja en muchos aspectos a la
mayoría de las neoplasias mamarias que se desarrollan en humanos: son de histología ductal,
expresan altos niveles de REα y RP, y poseen capacidad metastásica102.
En este modelo hemos demostrado que, tanto el bloqueo de la expresión génica del
RP103, así como su inhibición farmacológica usando diferentes inhibidores, pueden inducir la
regresión tumoral 104. Observamos que las variantes tumorales, con resistencia adquirida y con
resistencia constitutiva a la MFP, expresan mayor nivel de RPB que de RPA a diferencia de sus
variantes respondedoras, que muestran el patrón opuesto 105. Por otra parte, ya se había
demostrado anteriormente que la MFP puede actuar como agonista de la progesterona al
37
activar a RPB y resultados de nuestro laboratorio muestran que la MFP no es inhibitoria en
células con mayor proporción de RPB que RPA80. Recientemente el grupo de Tellería y col.
postuló que la MFP sería un tratamiento oncológico favorable para distintas neoplasias
independientemente de la expresión de RP106. Contrario a esta postura, nuestro laboratorio
sostiene que es importante determinar el perfil de isoformas de RP para asegurar una
respuesta inhibitoria de los antiprogestágenos. El patrón de expresión de RPA/RPB sería un
marcador predictivo para elegir aquellos tumores que responderían eficientemente a esta
terapia.
Evidencia clínica
Hasta el año 2000, fueron 5 los estudios en pacientes con cáncer de mama metastásico
(avanzado) donde utilizaron la MFP u Onapristona. En un principio, las pacientes reclutadas
podían o no tener expresión del RP, en trabajos posteriores el único criterio de selección fue la
presencia de RP (+). En 3 de ellos las drogas fueron utilizadas en segunda o tercera línea, y en
dos se aplicaron como drogas de primera línea. En todos los estudios se observaron respuestas
parciales que variaron entre un 10 y 56%, pero sobretodo se observó una estabilización de la
enfermedad. El estudio llevado a cabo por Robertson y col. en el año 1999, utilizando a la
Onapristona como agente de primera línea, mostró una respuesta que en conjunto alcanzó al
67% de las pacientes, sin embargo, la toxicidad hepática fue la razón principal por la cual se
detuvo el ensayo 107. El grupo de Robertson continúo los ensayos con Lonaprisan (antagonista
del RP de tipo III) como terapia de segunda línea en mujeres con las mismas características
arriba mencionadas. El objetivo primario de este último estudio no fue alcanzado ya que la
droga mostró una eficacia limitada 96. Varios factores clínicos y moleculares pueden haber sido
la causa de la falla en estos estudios. Por sobre todas las cosas, creemos que tanto las
condiciones clínicas de las pacientes (todas ellas con enfermedad muy avanzada y múltiples
sitios de metástasis) así como la inexistencia de selección de subpoblaciones sensibles al
tratamiento propuesto, han sido dos de los mayores obstáculos para demostrar la eficacia de
este abordaje novedoso.
38
Hipótesis de trabajo y Objetivos
39
Hipótesis de trabajo
En concordancia con los estudios preclínicos, sólo aquellos carcinomas mamarios con
mayor expresión de RPA que RPB, responden al tratamiento con antiprogestágenos. El patrón
de expresión de RPA/RPB sería un marcador predictivo para elegir las pacientes que respondan
eficientemente a la terapia con anti progestágenos.
Objetivo general
El objetivo general de esta tesis fue investigar si las muestras de cáncer de mama con
mayor expresión de la RPA que RPB responden al tratamiento con el antiprogestágeno MFP en
cultivos ex- vivo y caracterizar a las pacientes en su perfil clínico y molecular.
Objetivos particulares
1. Caracterizar y conocer la cohorte de pacientes con carcinomas mamarios del Hospital
de Pacheco en cuanto a sus factores de riesgo y sus características clínicas e
histopatológicas.
2. Clasificar a las pacientes según su perfil de isoformas del RP en RPA, equimolares y
RPB. Estudiar la correlación existente entre el perfil de isoformas y factores
pronósticos clínicos e histopatológicos.
3. Estudiar la respuesta ex vivo a la MFP de carcinomas mamarios catalogados por su
relación de isoformas de RP.
4. Conocer el perfil molecular de las pacientes RPA o RPB
5. Diseñar un algoritmo de expresión, basado en la técnica de IHQ, que nos permita
discriminar a las pacientes RPA de las RPB
40
Materiales y Métodos
41
1. Pacientes
La totalidad de este trabajo de tesis fue realizada sobre muestras humanas. Se incluyeron
un total de 282 pacientes con cáncer de mama, de las cuales se obtuvieron muestras de tejido
tumoral y ganglios o recurrencias en aquellos casos donde fue posible. Todos los pacientes
fueron atendidos en el Servicio de Mastología del Hospital Provincial Magdalena V. de
Martinez, Gral Pacheco, Tigre, entre los años 2007 y 2015.
Los pacientes fueron seleccionados de acuerdo a los siguientes criterios:
Criterios de inclusión:
ser paciente mayor de 18 años
tener confirmación histológica de cáncer de mama y presentarse en cualquier estadio
de la enfermedad.
Criterios de exclusión:
Tumores de estirpe NO- epitelial
Recolección de datos de las Historias Clínicas: Se cargaron los datos de las historias clínicas
(H.C.) en un archivo de Microsoft Excell confeccionado para tal fin. Los datos de las historias
clínicas incluyeron: fecha de cirugía, edad, antecedentes familiares de 1er o 2ndo grado de
cáncer de mama u ovario, comorbilidades (diabetes mellitus, hipertensión arterial, úlcera,
cardiopatía, alergias, traumatismos, operaciones), hábitos (tabaquismo, alcoholismo), fecha de
menarca, fecha de última menstruación, paridad, edad al 1er parto, meses de lactancia,
enfermedades mamarias preexistentes, cirugía mamaria previa, mamografía (bi-Rads),
localización, diagnóstico histopatológico, subtipo, grado histológico, grado nuclear, índice
mitótico, índice combinado de Nottingham (NPI), invasión linfática, vascular y perineural,
necrosis, número de ganglios resecados, número de ganglios positivos, estadío TNM-UICC
(primary Tumor, regional lymph Node, distant Metastasis), radioterapia adyuvante,
quimioterapia (adyuvante, primera, segunda y tercera línea), fecha de último control,
seguimiento (vive, perdido, fallecido), fechas de la primera, segunda o tercera progresión de la
enfermedad y sitio metastásico, niveles de expresión de RE, RP, HER-2 y ki-67.
El presente trabajo de investigación se encuentra enmarcado dentro del Código de
Nüremberg promulgado en 1947, la Declaración Universal de los Derechos Humanos de 1948,
la Declaración de Helsinki de 1964 promulgada por la Asociación Médica Mundial, la Propuesta
de Normas Éticas Internacionales para las investigaciones biomédicas con sujetos humanos de
42
1982, las Normas Internacionales publicadas en las Guías de Ética Internacional para Estudios
Epidemiológicos publicadas por el Council for International Organizations of Medical Sciences
(CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1991, actualizadas
en el 2000, 2002 y 2008 (CIOMS Ginebra, Suiza), y también contemplado tanto en la
disposición Nº 5330/97 de ANMAT de Argentina (Capítulo II), como en la Ley 11.041 de la
Provincia de Buenos Aires.
Para la realización del presente trabajo se obtuvo el consentimiento informado de todos
los pacientes. La evaluación respecto al “Riesgo” (Ley 11.044. Título 2, Aspectos Éticos de la
Investigación en Seres Humanos, Art. 6) que implicó la realización de esta Tesis doctoral fue
considerada por el Comité de Ética e Investigación del Hospital Provincial Magdalena V. de
Martínez, como de “Riesgo Mínimo” para el paciente. Respetando las disposiciones de dicha
institución, se incluyó este aspecto en el texto de conformidad del paciente. A su vez, el
estudio fue aprobado por el Comité de ética del Instituto de Biología y Medicina Experimental
(IByME) que fue el lugar dónde se desarrollaron las determinaciones de las pacientes.
Se utilizó para la estadificación de los pacientes los criterios del American Joint
Committee on Cancer (AJCC Cancer Staging Manual 8th ed, 2014).
La clasificación histopatológica se realizó siguiendo los criterios de la OMS en su
versión más actualizada (2014).
La sobrevida global (SG) fue medida a partir de la fecha del diagnóstico hasta la fecha
de último control o fallecimiento del paciente.
El tiempo libre de progresión (TLP) de la enfermedad fue medido desde la fecha de
diagnóstico hasta la fecha de la primera progresión tumoral.
Procesamiento de las muestras:
Condiciones y traslado de las muestras:
Al menos un día antes de la cirugía programada por el equipo quirúrgico del Hospital de
Pacheco, se prepararon un frasco caramelo con medio de cultivo (DMEM-F12; Sigma 2906) y
un tubo eppendorf vacío, ambos debidamente rotulados. El día de la cirugía, se transportaron
ambos contenedores al interior del quirófano y después de tener la confirmación del
diagnóstico por congelación, se separaron dos porciones del tumor: una de ellas se colocó
inmediatamente en el medio de cultivo y la otra en el tubo eppendorf que fue, a su vez,
colocado en un telgopor con hielo seco para su congelación y conservación a -70°C. En estas
43
condiciones se trasladaron ambas muestras al laboratorio, donde en primer lugar se
ingresaron a la base de datos dándole un número correlativo y, en adelante, la muestra será
identificada sólo con este número.
Preparación de las muestras para extracción de proteínas, RNA y DNA:
Para preparar los extractos proteicos y separarlos en sus fracciones nuclear y
citoplasmática, el fragmento de tejido se colocó en un mortero y en forma manual se
pulverizó con el agregado de nitrógeno líquido. Una vez que la totalidad del tejido se pulverizó,
se dividió en tres porciones debidamente rotuladas:
Fracción para DNA: Se le agregó un buffer de lisis y digestión (100 mM NaCl, 10
mM Tris-Cl pH 8, 25 mM EDTA pH 8, 0,5% SDS y 0,1 mg/ml proteinasa K) y se
incubó a 50ºC durante 12-18 hs. Luego se realizó la extracción del DNA con fenol-
cloroformo-isoamílico. Se purificó con ½ volumen de acetato de amonio (7.5 M) y
2 volúmenes de etanol 100%., se precipitó por centrifugación y se lavó con etanol
70%. Finalmente el DNA se resuspendío en agua hexa destilada.
Fracción para RNA: Se colocó en TRIZOL- reagent, de Ambion, Life Technologies y
se realizó la extracción según indicaciones del proveedor. El RNA final se
resuspendió en agua-DEPC.
Fracción para la extracción de proteínas: Esta fracción se procesó para separar las
fracciones nuclear y citoplasmática con un Kit destinado para tal fin (Thermo
Scientific: NE- PER Nuclear and cytoplasmic Extraction Reagents). Los extractos
fueron inmediatamente congelados a - 70ºC previa determinación de la
concentración proteica por el Método de Lowry (ver Apéndice).
Preparación de las muestras para inclusión en parafina:
Los tejidos fueron fijados en formol neutro al 10% (1 parte de formaldehido puro 40% y 9
partes de PBS 1x), luego deshidratados mediante el pasaje por alcoholes en graduación
creciente (70º, 80º, 96º, 100º) a temperatura ambiente. Posteriormente, fueron aclarados
impregnándolos en xilol para embeberlos en parafina líquida y colocarlos en estufa a 60ºC
durante 1-3 hs. Por último se procedió a la inclusión definitiva y la formación del bloque
histológico. Cada uno fue rotulado y almacenado a temperatura ambiente. Las muestras
44
embebidas en parafina fueron cortadas por el mismo operador con un espesor de 3-4
micrones. Una vez obtenido el corte histológico se lo colocó en estufa para su secado durante
1h.
Anticuerpos utilizados: Se emplearon los anticuerpos monoclonales cuyos datos se
resumen en la Tabla m&m 1
# Marca
N° Catalogo Recaptura Dilución Secundario
1 MUC-2 Santa Cruz Biotech sc-15334 citrato pH6, 50min a 95° 1:200 Conejo
2 CRISP-3 Proteintech 14847-1-AP citrato pH6, 50min a 95° 1:250 Conejo
3 FGF-10 Santa Cruz Biotech sc-7917 citrato pH6, 50min a 95° 1:100 Conejo
4 AR Cell Sinaling 5153P citrato pH6, 50min a 95° 1:250 Conejo
5 GR Santa Cruz Biotech M-20 citrato pH6, 50min a 95° 1:150 Conejo
6 BCL-XL Santa Cruz Biotech sc-634 citrato pH6, 50min a 95° 1:200 Conejo
7 HER-2 DAKO A0485 citrato pH6, 50min a 95° 1:1000 Conejo
8 KI67 Abcam ab- 15580 citrato pH6, 50min a 95° 1:750 Conejo
9 CK5 DAKO D5/16 B4 Citrato pH6, 50min a 95° 1:100 Conejo
10 RE DAKO ep-1 citrato pH6, 50min a 95° RTU Conejo
11 RP DAKO PgR 636 citrato pH6, 50min a 95° RTU Ratón
12 CK6a Covance PRB-169p citrato pH6, 50min a 95° 1:500 Conejo
13 STAT-5 Santa Cruz Biotech c-17 citrato pH6, 50min a 95° 1:100 Conejo
14 pSTAT-5a Epitomics (Abcam) 1289-1 citrato pH6, 50min a 95° 1:100 Conejo
Tabla m&m1: Anticuerpos utilizados y sus especificaciones técnicas*RTU: ready to use.
2. Técnicas
La IHQ es una técnica que permite ver en forma directa la distribución celular de una
molécula, utilizando anticuerpos u otros ligandos marcados. Entre los diversos tipos de
marcación se encuentran la radioactiva, la fluorescente y la enzimática. Esta última es
preferida sobre las anteriores debido a su sencillez y al menor riesgo que implica la no
utilización de material radioactivo. Las enzimas más frecuentemente utilizadas son la
peroxidasa y la fosfatasa alcalina que, al reaccionar con un sustrato no visible generan
un producto insoluble y visible. Una vez establecida, esta reacción puede ser detectada
por medio de la microscopía de luz convencional. Por lo general, se emplea un sistema
de detección en sandwich en el que un primer anticuerpo específico (generalmente un
anticuerpo monoclonal) reconoce al antígeno buscado y es a su vez reconocido por un
segundo anticuerpo conjugado que transporta la enzima. La ventaja de este sistema
45
reside en la practicidad de no tener que marcar cada uno de los anticuerpos
específicos y, por otra parte, existe la posibilidad de que se amplifique la señal
lográndose una mayor sensibilidad. La principal desventaja radica en que muchas
células pueden presentar actividad enzimática endógena, generándose falsas
reacciones positivas. Sin embargo, esta actividad puede ser inhibida y, conjuntamente,
se pueden establecer controles rigurosos en los que se omite el anticuerpo específico
o el conjugado a la enzima. Por otra parte, la conformación de los epitopes puede ser
modificada por el procedimiento empleado en la fijación por lo que es deseable aplicar
métodos de “recuperación antigénica” a fin de lograr una conformación natural de los
mismos. El empleo de temperaturas extremas, variaciones de pH y soluciones capaces
de secuestrar iones de calcio son ampliamente utilizadas con tal fin. En nuestro
estudio empleamos la técnica de IHQ indirecta como método de detección antigénica;
la misma fue realizada siempre por el mismo operador.
IHQ simple y doble:
Los cortes incluidos en parafina, cortados y montados sobre portaobjetos, fueron
desparafinados en xileno durante 30 min, e hidratados en una serie de alcoholes
decrecientes: 100%, 96% y70% dos pasajes de 10 min cada uno. Seguidamente, se
incubaron los cortes en etanol 70° con 10% de H2O2durante 25 min para inactivar la
actividad endógena de la peroxidasa endógena. Se descartó la solución de bloqueo y se
realizaron 3 lavados de 10 min con H2O2.
A continuación, las muestras se incubaron en buffer de recaptura (especialmente
seleccionado para cada anticuerpo, ver tabla m&m 1) durante 50 min a una temperatura
de 90° en baño térmico. Una vez finalizado el tiempo de recaptura, se dejaron enfriar los
cortes en el mismo buffer por 15 min a T° ambiente. Posteriormente se procedió a lavar
los cortes: en el caso de utilizar la enzima peroxidasa para la reacción los lavados
subsiguientes fueron con PBS1x, en cambio si la reacción enzimática utilizada fue con la
fosfatasa alcalina, los lavados posteriores fueron en todos los casos con TBS1x. La razón de
esta modificación es que el PBS es sustrato de la peroxidasa y limita su actividad. Una vez
finalizados los 3 lavados de 10 minutos, se incubaron los cortes con BSA 2,5% a T°
ambiente, en cámara húmeda durante al menos 30 min. Se descartó el suero y sin lavar los
restos del mismo, los cortes se incubaron con al anticuerpo seleccionado en la dilución
correspondiente (ver tabla m&m 1) en cámara húmeda durante toda la noche a 4 ºC.
46
Al día siguiente, se descartaron los anticuerpos y se realizaron 3 lavados en
PBS1x/TBS1x de 10 min cada uno. Luego se incubaron con anticuerpo secundario
biotinilado específico para el isotipo del anticuerpo en una dilución de 1:400, durante 60
min en cámara húmeda. A continuación se preparó el ABC (Complejo avidina- biotina) en
BSA 2.5%, y se realizaron 3 lavados en PBS1x/TBS1x de 10 min cada uno. El complejo
Avidina- Biotina se aplicó sobre los cortes pasados los 30 min de preparado, y luego se
incubaron los cortes durante 30 min en cámara húmeda a T° ambiente. Por último se
realizaron los 3 últimos lavados en PBS1x/TBS1x para luego revelar la reacción con
Diaminobencidina (DAB) que produce un precipitado marrón.
Cada anticuerpo fue expuesto a la DAB durante una cantidad de tiempo específica.
Una vez finalizada la exposición a DAB los cortes se contrastaron con hematoxilina durante
5 a 10 segundos. A continuación, se procedió a la deshidratación en la secuencia de
alcoholes de forma creciente y finalmente xilol. Finalmente, las muestras fueron montadas
en un medio sintético y cubiertas con un cubreobjeto.
En los casos donde quisimos poner de manifiesto dos anticuerpos en la misma muestra
(figura m&m3: CK en rojo y KI-67 en negro), se repitió el mismo procedimiento utilizando
en primera instancia un ABC unido a Peroxidasa y en segunda instancia unido a fosfatasa
alcalina. Por otro lado, se utilizaron cromógenos diferentes para poder diferenciar cada
anticuerpo.
Figura m&m3: micrografía
ejemplificando una doble
marcación: carcinoma de mama
GH3 marcando con rojo CK5 en el
citoplasma y con negro KI-67 en
determinados núcleos; barra:
400m.
47
WB:
Los extractos proteicos se separaron en un gel de poliacrilamida discontinuo utilizando el
sistema de buffers discontinuos de Laemmli108. Previo a la separación, las proteínas se
diluyeron en solución desnaturalizante (cracking buffer, ver Apéndice) y se incubaron a 100ºC
durante 5 min. En cada gel se sembraron las muestras correspondientes (100 µg de
proteína/calle) junto con un marcador de pesos moleculares conocidos. La separación se
realizó durante 20 min a 20 mA/gel hasta que las muestras pasaran el gel concentrador, y por
aproximadamente 120 min a 25 mA/gel, en el gel separador. Concluida la electroforesis, las
proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante 1 h a 100 V. A
continuación, las membranas se bloquearon en solución de bloqueo (ver Apéndice) durante al
menos 1 h. Al terminar el bloqueo, las membranas se lavaron con TBS-T (ver Apéndice) y luego
se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes, a 4°C, ON, en agitación. Al día
siguiente, el anticuerpo primario se lavó con TBS-T, y se agregó el anticuerpo secundario
conjugado con la enzima peroxidasa. Las bandas inmunoreactivas se revelaron mediante el
agregado de un sustrato que genera una señal quimioluminiscente al ser modificado por la
enzima peroxidasa. Para visualizar la señal, las membranas se expusieron a una placa
radiográfica. Finalmente, las placas se escanearon utilizando un escáner digital, y las bandas se
cuantificaron utilizando el programa ImageJ. Como control positivo se utilizaron extractos
proteicos de la línea celular humana T47D.
Cultivo tisular (Chopper):
Debido a la baja efectividad obtenida con los cultivos primarios (eficiencia del 11%) se
implementó una técnica basada en la incubación de lonjas de tejido fresco utilizando un
dispositivo denominado Chopper (Vibratome VT1200; Ted Pella, Inc, USA). El equipo consta de
un brazo metálico que sujeta una cuchilla que cae sobre el fragmento de tejido fresco. El
equipo permite controlar la velocidad y el grosor de los cortes tomando contacto directo con
el tejido lo menos posible para evitar cualquier tipo de contaminación. Este dispositivo se
coloca en campana de seguridad biológica y se desinfecta antes de su uso con alcohol 70%. Las
muestras a procesar llegan a T° ambiente en medio de cultivo estéril. La misma se coloca sobre
papel Whatman estéril adherido a la platina del Chopper y se corta en lonjas de
aproximadamente 100 µm de espesor. Estos fragmentos de tejido se colocan en una placa de
Petri con medio DMEM/F12 donde se separan y luego se trasladan a una placa de 6 hoyos que
contiene una cámara con filtro en cada hoyo (PICM3050; Millipore, Millerica, MA). Las cámaras
con filtros permiten el contacto de las láminas de tejido con el medio de cultivo, y a la vez
48
mantienen la óptima oxigenación de las mismas, impidiendo al mismo tiempo la adherencia de
las láminas al pocillo. Se incuban el mismo número de cortes en cada uno de los hoyos. En
nuestro caso, el objetivo de estos experimentos fue evaluar el efecto de la MFP 10nM sobre la
proliferación de los tumores con distinta expresión de isoformas de RP. En todos los casos las
incubaciones se realizaron en presencia de 10% de SFB durante 48 hs en estufa gaseada a 37º
C. Finalmente las muestras se fijaron en formaldehido neutro 10% para luego ser embebidas
en parafina y cortadas en láminas de 3-4 μm de espesor para poder realizar el análisis de H&E
y la posterior IHQ.
Criterios para considerar muestra con conteo exitoso
Para considerar a una muestra con material suficiente para el recuento de células ki-67
positivas, en primera instancia y basándonos en la H&E, tuvimos que tener al menos 5
fragmentos de tejido con células viables en cada uno de los escenarios (MFP o CONTROL). La
cantidad mínima de células viables en cada fragmento superó en todos los casos las 50 células.
En caso de no llegar a este número mínimo, se procedió a realizar un desgaste seriado de la
totalidad del taco de parafina para obtener células diferentes en el mismo fragmento
(utilizando el plano Z). Con este método nos aseguramos una cantidad más o menos
homogénea de células evaluadas en todos los casos. Cabe destacar que la celularidad de la
muestra difiere ampliamente de tumor a tumor, por lo que nos fue dificultosa la obtención de
material suficiente en aquellos casos donde las muestras fueron altamente desmoplásicas
(mucha cantidad de tejido estromal denso y poca celularidad epitelial).
Análisis estadístico y bioinformático del transcriptoma (RNAseq)
El RNA fue aislado y purificado usando TRIZOL (Life Technologies) como fue previamente
descripto. La concentración e integridad del RNA fue medida con el sistema Agilent 2100
Bioanalyzer. Solamente aquellas muestras con índice de integridad RIN (RNA integrity values)
superior a 8 fueron consideradas para su posterior análisis por secuencación con la plataforma
Illumina HiSeq2000 (Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina).
Los archivos FASTQ de las lecturas apareadas de cada tumor fueron analizados con el
programa FASTQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) para efectuar
los análisis de control de calidad de las lecturas generadas en cada muestra. Posteriormente, el
alineamiento de las lecturas y la cuantificación de los niveles de expresión para cada gen del
genoma fue realizado mediante el empleo del programa RSEM (RNA-Seq by Expectation-
49
Maximization) (http://deweylab.github.io/RSEM/)109. El alineador de secuencias cortas
implementado fue el Bowtie empleando como genoma de referencia humano la versión hg19.
El análisis estadístico de los perfiles de expresión génica se realizó con el algoritmo EBseq
implementado en la plataforma R/Bioconductor (https://www.bioconductor.org/).
Brevemente, el test Ebseq identifica genes diferencialmente expresados (FC>±2; FDR<0.05) en
base a niveles de expresión estimados por la metodología de RSEM mediante el empleo de un
método empírico Bayesiano basado en la distribución binomial negativa 110. Las visualizaciones
con mapas de calor fueron generadas con el programa MultiExperiment Viewer software (MeV
v4.9) (http://www.tm4.org/mev.html) 111. La clasificación de los carcinomas en los subtipos
intrínsecos fue realizada mediante el empleo del Bioclasificador predictivo basado en el
modelo PAM50 en el lenguaje de análisis R112. El análisis de enriquecimiento funcional de los
genes diferencialmente expresados fue realizado con las aplicaciones ClueGo y CluPedia en la
plataforma Cytoscape (http://www.cytoscape.org/). El análisis comparativo de los perfiles de
expresión identificados en los carcinomas PRA vs. PRB fue analizado en carcinomas ductales
infiltrantes provistos por el proyecto TCGA-BRCA (TCGA 2012113). Los perfiles de expresión y la
información clinicoplatológica asociada fue descargada desde CancerBrowser
(https://genome-cancer.soe.ucsc.edu/) y cBioPortal (http://www.cbioportal.org/)
respectivamente. El análisis e integración de dichos datos fue realizado en R/Bioconductor.
TMA
Con el objetivo de procesar y evaluar diferentes anticuerpos en múltiples pacientes a la
misma vez, contamos con la construcción de Arrays de tejido (del inglés Tissue MicroArray).
Para dicho fin utilizamos un kit (EZ-TMATMManual Tissue Microarray Kit) compuesto de un
bloque pre fabricado de parafina con 24 hoyos de 3mm cada uno y dos agujas para realizar
tomas de 3mm sobre los tacos parafinados originales de cada paciente seleccionada (figura
m&m 1).
Para la construcción del TMA, en primer lugar, seleccionamos a las muestras con un
criterio de selección: la proporción de Isoformas del RP. A continuación tomamos todos los
tacos parafinados originales y sus respectivos cortes coloreados con H&E, para seleccionar el
área de interés (3mm). Una vez marcada dicha área sobre el corte H&E, se identifica la misma
área en el taco de parafina y se procede a tomar la muestra con la aguja provista.
Seguidamente se deposita cada muestra en su respectivo hoyo. Es de buena práctica colocar
50
en alguno de los extremos algún tejido diferente para poder identificar el orden de las
muestras.
Una vez finalizada la selección, se derrite la parafina del taco y de los cilindros en estufa a
60°C hasta obtener un taco homogéneo. Luego se obtienen los cortes coloreados y en blanco
para proceder a realizar las técnicas planificadas.
3. Análisis estadístico
Tamaño de la muestra: el tamaño muestral requerido para detectar un 50% de
diferencia en la sensibilidad a MFP entre grupos RP+ fue de 19 pacientes por grupo.
Consideramos RPA+ a todos los valores ≥1.2 y RPB+ a todos los valores ≤ a 0.83. Los errores de
tipo I y II fueron de 5 y 10%, respectivamente. Para este punto contamos con la colaboración
del Dr. José M. Belizán (Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria; IECS). Para comparar las
Figura m&m1: Construcción de TMAs, A)
Kit utilizado, B) imagen del TMA construido
en NIH- USA en colaboración con el Dr.
Alfredo Molinolo.
51
medias ± DS de la cuantificación de Ki-67 en los cultivos, o de la cuantificación de IHQ de tissue
arrays, se utilizaron tests no paramétricos (Mann Whitney).
Las muestras pareadas se analizaron con T de Student, y Chi2 para la comparación
entre grupos en las variables de la Tabla clínica.
4. Criterios
Definición de pacientes RP (+) o RP (-):
Con el objetivo de caracterizar en forma precisa a los pacientes según su RP, fijamos los
siguientes criterios a tomar en cuenta frente a discordancias entre las dos técnicas utilizadas
(WB o IHQ), y frente a discordancias encontradas entre las determinaciones de IHQ realizadas
en el ámbito hospitalario y en el laboratorio.
En cuanto a la reproducibilidad de los valores hallados en la IHQ en los dos escenarios
(laboratorio y hospital), es importante destacar que el tamaño de los fragmentos de tejido
destinados para el hospital o el laboratorio no tienen las mismas dimensiones. Tampoco son
seleccionados bajo microscopio para tener certeza de que la porción que se destina a la
investigación posee celularidad suficiente para la realización de las técnicas planteadas. Es
decir, recibimos tejido del mismo paciente pero de áreas distintas. Cabe aclarar que en orden
de importancia, el diagnóstico clínico y las pruebas complementarias priman por sobre los
objetivos de nuestra investigación, por ende, el tamaño de fragmento tisular que llega al
laboratorio es muy pequeño. Al respecto, cuando realizamos a doble ciego las determinaciones
de los receptores hormonales, de HER-2 y de ki-67 tenemos un 5.2% de discordancia. Creemos
que la razón es la antes mencionada, aparte de que está bien documentado en la bibliografía
que los tumores poseen poblaciones biológicamente heterogéneas114 115. En los casos donde la
discordancia “cambiaría” la conducta terapéutica (positivo vs negativo); o cuando los valores
informados se incluyen dentro de intervalos muy diferentes, por ejemplo 90% vs 5%, la IHQ se
repite en el ámbito del laboratorio. En los casos donde se define la positividad del caso, y la
repetición de la técnica sigue siendo discordante, se toman en cuenta también los valores de
WB. Para simplificar y concluir, contamos con 3 determinaciones distintas para el RP: la IHQ de
hospital, la IHQ del laboratorio y el WB. La paciente será considerada RP (+) si dos de tres
valores son positivos.
52
Definición de valores de corte para WB: Criterio utilizado para la caracterización de las
pacientes según la isoforma de RP
Para clasificar a las pacientes RP+ según la proporción de isoforma predominante,
tomamos un criterio interno de nuestro laboratorio ya que no existe al día de hoy un criterio
aceptado. A priori catalogamos como RPA a aquellas pacientes con proporciones mayores o
iguales a 1,2 y RPB a proporciones menores o iguales a 0,83. Con respecto a los valores
comprendidos entre estos dos (1,2 a 0,83) consideramos que son pacientes que poseen
similares cantidades de isoformas del RP, por lo tanto las catalogamos como equimolares
(EQUI). Un cuarto grupo de pacientes corresponden a las RP (-), que representan una minoría
pero que igualmente fueron testeadas en su sensibilidad a MFP.
El análisis del valor obtenido por WB de todas las muestras se realizó en forma separada y
comparativa de la fracción nuclear y la citosólica. En líneas generales los valores de ambas
fracciones fueron coincidentes, en cuyo caso se tomaron en cuenta los valores nucleares; sólo
en una minoría de casos se tomó el valor del citosol como el valor de referencia (aclarado en
todos los casos.
Método de cuantificación de ki-67
Para objetivizar el marcador de proliferación ki-67 se cuantificó la totalidad de las células
tumorales con o sin marca positiva y la totalidad de las células tumorales marcadas. De esta
manera obtuvimos un porcentaje de marcación positiva. Es importante aclarar, que en los
casos donde la celularidad total fue menor a 50 células, tomamos la precaución de realizar una
segunda y hasta tercera determinación en desgastes seriados.
Método de cuantificación de marcadores de IHQ (criterio general)
Para cada uno de los anticuerpos confeccionamos un score de marca contemplando dos
parámetros: la intensidad de marca (0, 1, 2 y 3) y el porcentaje de células marcadas (0 a 100).
En todos los casos consignamos la localización celular y subcelular de la marca, diferenciando
en primera instancia si la marca se ubica en el espacio extracelular (Figura m&m2, A) o en el
interior de la célula (Figura m&m2, B). Con respecto a la localización dentro de la célula,
distinguimos la presencia de marca de membrana (presente débil o fuerte/ ausente, Figura
m&m2, B.1), citoplasmática (intensidades y de características homogénea o localizada, Figura
53
m&m2, B.2) y/o nuclear (Figura m&m2, B.3). De cada una de las localizaciones antes
mencionadas se obtiene un score multiplicando la intensidad y el porcentaje. Del producto de
estos parámetros se obtiene un score que va de 0 a 300. En la figura m&m2 se muestran
ejemplos de cada situación 116.
Figura m&m 2: Ejemplos de expresión diferencial según localización, intensidad y porcentaje
de células marcadas. A1) marca en el espacio extracelular, A2) marca extra e intracelular
(vacuolas citoplasmáticas), B1) marca de membrana parcial o incompleta, B2) marca de
membrana completa, C1) marca citoplasmática débil, C2 der) marca citoplasmática
1 2
3
A
B
C
D
E
54
heterogénea, C2 izq) marca citoplasmática homogénea, C3) marca citoplasmática intensa, D1)
marca nuclear de bajo porcentaje –aprox. 20%, D2) marca nuclear moderada- alta, D3) Marca
nuclear del 100% de la celularidad, E1) marca mixta con predominio de marcación
citoplasmática y E2) marca mixta con predominio de marcación nuclear. Barra: 50m.
55
Resultados
56
Descripción clínica de la población estudiada
Iniciamos el análisis clínico117 con un dato muy básico como es la edad de las pacientes,
que describe la población en estudio en su totalidad. Para la distribución por edades (Tabla
1.1), con un rango de 24- 96 y una media de 61 años, hallamos un 3,6 % de pacientes muy
jóvenes (<35 años), y un 22% de pacientes premenopáusicas. Como es de esperar, la mayoría
de la población se concentra en la porción de pacientes postmenopáusicas (definida como
mayores de 51 años a los efectos de una descripción aproximada).
GRUPO ETARIO FREC. ABSOLUTA %
<35 AÑOS 9 3,629
35- 50 AÑOS 54 21,77
51- 65 AÑOS 87 35,08
>65 AÑOS 98 39,52
total 248 100
Tabla 1.1: Distribución de pacientes según grupo etario.
Los datos de las historias clínicas se agruparon en dos categorías:
1. Factores de Riesgo:118
Para el análisis de los factores de riesgo, tomamos en cuenta 5 parámetros que se
encuentran extensamente estudiados y de los que se conoce su asociación positiva con
esta patología. En la Tabla 1.2 se muestra la frecuencia de cada uno de los factores de
riesgo. Cabe destacar que más de la mitad (63%) de la población posee algún factor de
riesgo asociado, y el 14% del total está representado por los antecedentes familiares.
57
FACTOR DE RIESGO FREC. ABSOLUTA %
ANTECEDENTES FAMILIARES
MADRE- HERMANAS O HIJAS 25 8,865
PRIMA- TÍA- ABUELA 15 5,319
MENARCA < 12 AÑOS O MENOPAUSIA >55AÑOS 81 28,72
NULIPARIDAD O PRIMOPARICIÓN > 30 AÑOS 24 8,511
MASTOPATÍAS CRÓNICAS (>6 MESES) 3 1,064
ANTECENDENTES PERSONALES
CÁNCER DE MAMA 27 9,574
CÁNCER DE OVARIO 2 0,709
CÁNCER DE ENDOMETRIO 2 0,709
Total 179 63,48
Tabla 1.2: Distribución de pacientes según factores de riesgo asociados tomando como
número total de pacientes las 179 que respondieron al cuestionario.
Los factores de riesgo varían dependiendo en gran medida de factores
socioeconómicos. En este caso particular, que los pacientes provienen de un hospital
público del conurbano bonaerense sabemos que estamos frente a un segmento
poblacional donde la mayoría tiene bajos recursos económicos y limitado acceso a la
educación. Es importante hacer este tipo de aclaración ya que algunos de estos
parámetros, como es la nuliparidad o la primoparición>30 años, representa sólo un 8%.
2. Enfermedad Actual:
Cuando hablamos de enfermedad actual se tienen en cuenta todos los estudios
complementarios y consultas realizadas y vinculadas al diagnóstico. Por protocolo, todas
las pacientes se estadifican con el sistema T.N.M (Tumor, Node, Metastasis) 119 120 y según
este parámetro se toma la conducta quirúrgica pertinente. El sistema T.N.M incluye los
datos de tamaño tumoral (T), presencia y cantidad de ganglios axilares positivos (N) y
presencia de enfermedad a distancia (M). Luego de la cirugía, se vuelve a estadificar a la
paciente teniendo en cuenta los resultados de la anatomía patológica; se confirma el
tamaño tumoral (pT) y la presencia y número de ganglios positivos (pN). Es importante
destacar que el T.N.M clínico se basa en el diagnóstico semiológico y en las imágenes, que
poseen ciertos falsos positivos, es por esta razón que se realiza el T.N.M patológico luego
58
de la cirugía. En la Tabla 1.3 se muestra la distribución de nuestras pacientes según su
Estadio.
Podemos observar que aproximadamente un 42% de las pacientes se presenta a la
consulta con enfermedad avanzada, es decir con un estadio IIB o mayor. Estas pacientes se
presentan con tumores > de 5cm (T3) o ya tienen comprometidos los ganglios (N1 o N2).
Por otro lado, aproximadamente un 2% de las pacientes presentan recurrencias (recuadro
aparte) a las cuales no les corresponde el estadio clínico aquí presentado.
De lo analizado hasta acá, podemos decir que en nuestra población de estudio hay un
alto porcentaje de pacientes jóvenes (<50%), que consultan por primera vez con
enfermedad avanzada. Por otro lado, son pacientes de bajos recursos económicos y
limitado nivel educativo, lo cual hace difícil el seguimiento periódico y los controles
pautados.
DEFINICIÓN
ESTADIO T N M
FREC. ABSOLUTA
%
0 Carcinoma in situ 0 0 0 0,00
IA 1* 0 0 63 29,03
IB 0 - 1 1mi** 0 0 0,00
IIA 0 1 0 1 0,46
1 1 0 26 11,98
2 0 0 28 12,90
25,35
IIB 2 1 0 37 17,05
3 0 0 0 0,00
17,05
IIIA 0 2 0 0 0,00
1 2 0 1 0,46
2 2 0 1 0,46
3 1 0 17 7,83
3 2 0 0 0,00
8,76
IIIB 4 0 0 3 1,38
4 1 0 21 9,68
4 2 0 0 0,00
11,06
59
IIIC Cualquier T 3 0 0 0,00
IV Cualquier T Cualquier N 1 5 2,30
RECURRENCIAS NC*** 14 6,45
TOTAL 217 100,00
Tabla 1.3: Distribución de pacientes según su estadio clínico (Criterios clínicos basados en el
sistema T.N.M para la estadificación de pacientes. Tomado de la última actualización de AJCC
7ma edición); *: incluye carcinomas microinvasores, **:micrometástasis ganglionar y *** no
corresponde
60
2. Análisis histopatológico de la población estudiada
Recibimos un fragmento de tejido tumoral de cada una de las pacientes que incluye en
parafina como se detalla en Materiales y Métodos. De la observación de cortes coloreados con
la H&E se obtiene el diagnóstico final del subtipo tumoral121 37 (Figura 2.1) y la gradación
histológica, que se basa en el grado de formación de estructuras tubulares, la atipia nuclear y
el número de mitosis 47. De la misma se desprenden 3 categorías, que constituyen un índice
pronóstico per se: el índice de Nottingham o NPI (Nottingham Prognostic Index).El NPI se
divide en 3 categorías: bien diferenciado (3, 4, y 5; Figura 2.2), moderadamente diferenciado
(6 y 7) y pobremente diferenciado (8 y 9; Figura 2.3).
Figura 2.1
Figura 2.2
a
fe g h
i j k l
dcb
Figura 2.1: Panel de 12 micrografías que ejemplifican la heterogeneidad tumoral. Se muestra la
diversidad que existe en la disposición espacial de la masa tumoral, la variación en la calidad y
cantidad de estroma y en el grado de diferenciación. a) IC NST, b) CLI, c) IC NST con patrón
cribiforme, d) carcinoma mucinoso, e) CI NST, f) CI NST, g) CI con patrón micropapilar, h)
Carcinoma Ductal in situ –DCIS, i) carcinoma papilar, j) IC NST, k) CLI y l) IC NST. Tinción de
rutina: H&E. Barra: m.
61
Figura 2.3
a cb
a cb
Figura 2.3: Panel con 3 ejemplos diferentes considerados de alto grado. En a) se observan
nidos sólidos de células tumorales sin diferenciación GH3, moderado grado nuclear GN2 y alto
índice mitótico GM3 –las figuras mitóticas se marcan con flechas verdes; el score total es igual
a 8, en b) estamos frente a un tumor de tipo micropapilar que no presenta diferenciación
ductal GH3, con alto grado nuclear GN3 –se muestran con la barra tres o más tamaños
dispares- y moderado índice mitótico GM3; el score total es igual a 9, y en c) se observa un
carcinoma con moderado grado de diferenciación GH2, alto grado nuclear GN3 y alto índice
mitótico GM3; score total igual a 8. Tinción: H&E; barra: m.
Figura 2.2: Panel con 3 ejemplos diferentes de carcinomas considerados de bajo grado. En a)
se observa un conjunto de ductos tumorales bien diferenciados GH1, moderado grado nuclear
GN2 y bajo índice mitótico GM1; el score total es igual a 4, en b) estamos frente a un tumor
bien diferenciado GH1, de bajo grado nuclear GN1 y bajo índice mitótico GM1; el score total es
igual a 3, y en c) se observa un carcinoma mucinoso con bajo grado de diferenciación GH3 –
ausencia de ductos bien constituidos-, bajo grado nuclear GN1 y bajo índice mitótico GM1;
score total igual a 5. Tinción: H&E; barra: 50m.
62
1. Distribución de las pacientes según subtipo histológico y NPI: La mayoría de los
tumores y lesiones precursoras se originan en la unidad terminal ducto-lobulillar. Por otro
lado, se han asociado ciertos subtipos especiales, como por ejemplo el carcinoma tubular, a
cierto comportamiento biológico vinculado con el pronóstico. En este ejemplo la esperanza de
vida de las pacientes portadoras de esta variedad tumoral, es similar a la esperanza de vida de
ser portadora de patología mamaria benigna50.
A pesar de esta evidencia, clasificamos a nuestra población según las guías de la
Organización Mundial de la Salud (WHO, actualizada por última vez en 2012). En concordancia
con la bibliografía, en nuestra población predominan los carcinomas infiltrantes NST – no
special type representando un 80% del total, y siguen muy por debajo de ellos, los carcinomas
lobulillares (CLI) representados aproximadamente por un 10%122. (Tabla 2.1 y Figura 2.1)
CATEGORIA FREC.
ABSOLUTA %
LESIONES PRECURSORAS DCIS 8 3,0075
LESIONES INVASORAS CI NST 210 78,947
LOBULILLAR 28 10,526
MUCINOSO 8 3,0075
METAPLASICO 1 0,3759
MEDULAR 2 0,7519
PAPILAR 7 2,6316
TUBULAR 2 0,7519
266 100
Tabla 2.1: Distribución de pacientes según subtipo histológico.
En cuanto al NPI, las pacientes se distribuyen de forma uniforme entre las tres
categorías, con un leve predominio de los carcinomas moderadamente diferenciados – score II
(36%) Tabla 2.2.
63
SCORE FREC. ABSOLUTA %
I 68 33,498
II 72 35,468
III 63 31,034
203 100
Tabla 2.2: Distribución de pacientes según índice pronóstico de Nottingham (NPI).
64
3. Análisis de factores pronósticos RE, RP, HER-2 y ki-67 (IHQ).
Actualmente en la práctica clínica se utilizan 4 marcadores que son tanto pronósticos como
predictivos
1. El REα se utiliza como marcador predictivo de la respuesta a las drogas que se dirigen
contra los estrógenos (SERMs, SERD, IA). El valor se considera positivo con tan sólo 1%
de las células tumorales marcadas 120, y este porcentaje habilita al tratamiento. En
cuanto a su rol pronóstico, es bien conocido que los tumores con expresión de
receptores son la variedad de mejor pronóstico 49 54.
2. El RP es un marcador pronóstico. Su rol se vincula a la respuesta que tendrá la
paciente al tratamiento antiestrogénico52, si bien no importa cuál sea el resultado del
mismo, el tratamiento de primera elección en pacientes RE+RP- son los
antiestrógenos. En cuanto al rol predictivo se sugiere que podría ayudar a la elección
del abordaje antiestrogénico (TAM vs IA) 56.
3. La presencia de HER-2neu indica el uso de un anticuerpo monoclonal que bloquea
este factor de crecimiento en aquellos tumores donde haya sobreexpresión (3+). Es un
marcador predictivo de la sensibilidad a su tratamiento específico con anticuerpos
monoclonales como el Trastuzumab, y su expresión se asocia a mal pronóstico123,124.
4. El marcador ki-67 se usa para clasificar a las pacientes según su tasa de proliferación a
pesar de que continúa siendo muy discutido el cut point125. El % de ki-67 define qué
pacientes serán consideradas Luminales A o B, conjuntamente con los 3 marcadores
anteriores mencionados. Actualmente es un marcador pronóstico, pero se está
analizando su papel predictivo en la respuesta a quimioterapia neoadyuvante126.
En nuestra población de pacientes la determinación de dichos factores pronósticos se
realiza a doble ciego: por un lado se realiza de rutina en el contexto hospitalario, y la evalúa un
patólogo experto perteneciente a Hospital. Por otra parte, las 4 determinaciones son repetidas
en el laboratorio y evaluadas por segunda vez sin conocer el resultado del hospital. En la gran
mayoría de las oportunidades ambas determinaciones son concordantes, sin embargo, existen
algunos casos en donde no la hay. En estos casos, la determinación se repite y se compara
también, con los valores obtenidos por WB, pero en todos los casos prima la determinación del
hospital ya que cuentan con varios tacos representativos de tumor donde realizar cada
determinación. La distribución de pacientes según sus intervalos de expresión de receptores,
HER-2 y ki-67 se resume en la tabla 3.1. Es importante tener en cuenta que hasta un 20% de
65
los resultados de estas pruebas es equívoco en diferentes laboratorios de anatomía
patológica127.
Dentro de las posibles combinaciones de estos marcadores se esconden muy distintos
escenarios en cuanto a pronóstico y tratamiento. La decisión terapéutica depende de esta
combinación. En especial en nuestro laboratorio estamos interesados en el RP, es por eso que
el grupo de tumores que estudiaremos con más profundidad corresponde a la categoría
Luminal (A, B o C) de la clasificación molecular del CM, considerando negativos a aquellos
tumores sin expresión de RP.
CATEGORÍA DEFINICIÓN FREC ABS %
LUMINAL A RRHH(+); ki-67<14% 47 44,76
LUMINAL B RRHH(+); ki-67>14% 37 35,24
LUMINAL C RRHH(+); HER-2 (+); cualquier ki-67 21 20,00
TOTAL LUMINALES
105 75,00
HER-2 RRHH(-);HER-2 (+), cualquier Ki67 16 11,43
TRIPLE NEGATIVO RRHH(-);HER-2 (-), cualquier Ki67 19 13,57
TOTAL
140 100,00
Tabla 3.1: Distribución de pacientes según la clasificación molecular del CM.
Cuando analizamos a los carcinomas luminales por separado (RE y/o RP +/- HER-2) nos
encontramos con 6 posibles escenarios resumidos en la tabla 3.2, todos ellos englobados
dentro de la categoría LUMINAL pero ciertamente con diferencias biológicas importantes.
RE RP HER-2 FREC. ABS %
1 - + - 3 1,52
2 - + + 0 0,00
3 + - - 12 6,06
4 + - + 5 2,53
5 + + + 21 10,61
6 + + - 157 79,29
Tabla 3.2: Distribución de pacientes categorizados como luminales
Podemos observar que un 80% de las pacientes coexpresan ambos receptores
hormonales solos; y si sumamos a aquellos con sobreexpresión de HER-2 llegan al 90%. Dentro
del 10% restante hay sólo un 1,5% de pacientes sin RE y un 8% sin RP.
66
4. Clasificación de las pacientes según su proporción de isoformas de RP (WB). Correlaciones
entre isoformas de RP y factores pronósticos.
Contamos con la determinación de las isoformas del RP de 282 pacientes, de las cuales un
21,28% (n=60) resultaron negativas para el RP (valores concordantes con aquellos
determinados por IHQ). Del 79% de pacientes con RP (+) la distribución según sus isoformas es
la siguiente: la RPA (≥1.2) está representada por un 52,25% (n=116), las RPB (≤0.83) están
representadas por un 28,83% (n=64) y las equimolares (entre 1.19 y 0.84), por un 18,92%
(n=42). Datos resumidos en la Figura 4.1.
A
B
Figura4.1: Distribución porcentual de pacientes según la isoforma de RP predominante. A)
Gráfico de torta representando los porcentajes de RP (+) y RP (-), y dentro de los RP (+) la
distribución del perfil de isoformas, B) Definición de los intervalos de RP para la categorización
del perfil de isoformas y WB representativo de una paciente de cada grupo (RPA, EQUI y RPB).
RP (+)79%
RP (-)21%
RPA52%
RPB29%
EQUI19%
RPA˃RPB RPA=RPB
RPA˂RPB
Tumores EQUI Tumores RPBRPA/RPB≤0.83
RPA˂RPBTumores RPA
RPA/RPB≥1.2 RPA/RPB <1.2 y >0.84
RPA
RPB
67
Las pacientes RP (-) de nuestra población representan un 21% del total. Se presentan al
diagnóstico con una media de edad de 57 años (rango: 24- 92), casi 5 años antes que las
pacientes con RP (+). Con respecto a los antecedentes familiares, un 18% poseen familiares de
1er y 2do grado con carcinomas mamarios o de ovario; y hasta un 13% de estas pacientes tiene
tumores recurrentes (<10 años entre ambos eventos). Con respecto al estadio clínico al
momento del diagnóstico, un 54% se presentan con enfermedad avanzada (estadio IIb, IIIa,
IIIb, IIIc y IV) lo que conlleva tratamientos más agresivos y un peor pronóstico. De las
características histopatológicas, vale la pena remarcar que un 70% de los tumores son de alto
grado. Según la expresión del RE, HER-2 y ki-67 para configurar los subtipos moleculares, la
distribución de los mismos es la siguiente: un 19% son luminales (2% luminal A, 6% luminal B y
11% luminal C), un 35% son HER-2 (+) y el 45% restante pertenece al grupo de tumores
denominados triple negativos.
Dentro de los pacientes RP (+) podemos distinguir 3 grupos de pacientes según su
perfil de Isoformas: RPA, EQUI Y RPB definidos anteriormente. Las pacientes cuyos tumores se
clasifican como equimolares corresponden a valores que se encuentran entre RPA y RPB, y
presentan las siguientes características clínico- patológicas: la media de la edad de
presentación es de 63 años (rango: 34- 92), poseen un 20% de antecedentes familiares y un
porcentaje similar de recurrencias de 20%. En cuanto a la estadificación clínica, el 65% de las
pacientes se presenta en estadios tempranos y potencialmente curables quirúrgicamente (EI, y
EIa) con tumores menores de 2cm y axila negativa. En cuanto a la morfología de las lesiones
encontradas es destacable la presencia de lesiones in situ, siendo exclusivas de pacientes con
perfil equimolar (de 222 pacientes RP (+), las 5 lesiones de CDIS son equimolares). Con
respecto a la expresión de receptores hormonales, hay dos hechos llamativos: no existen
pacientes con RE 0%, y hay una gran proporción de pacientes que sobre-expresan HER-2
también (21%). Para el marcador de proliferación ki-67, existe un predominio de lesiones
altamente proliferativas (60%) por sobre aquellas con bajos índices de proliferación (40%).
68
RPA
RPB % (n) % (n)
% RP (+) 52,25
28,82
N 116
64
EDAD rango 33- 96
29- 86
media 63
59
ANTECEDENTES FAMILIARES 26,7 (23)
18,1 (6)
% DE RECURRENCIAS 6 (7)
9 (3)
2NDO PRIMARIO 4,3 (5)
6 (2)
TAMAÑO TUMORAL NP 1 (1)
0
<2 48,4 (48)
16,3 (9)
2 - 5 42,4 (42)
62 (34)
>5 O MULTIFOCAL 8 (8)
22 (12)
AXILA COMPROMETIDA 53,2 (49)
51,3 (19)
SUBTIPO HISTOLÓGICO IC NST 81,2 (91)
81 (47)
ILC 12,5 (14)
8,6 (5)
SS 6,2 (7)
10,3 (6)
NPI 1 40,9 (36)
30,4 (14)
2 39,7 (35)
39,1 (18)
3 19,3 17)
30,4 (14)
RE 0 1 (1)
1,9 (1)
1- 25 11,2 (12)
13,4 (7)
26- 50 3,7 (4)
7,7 (4)
51- 75 17,7 (19)
21,1 (11)
76- 100 66,3 (71)
55,7 (29)
RP 0 0
0
1- 25 20,3 (22)
34,6 (18)
26- 50 10,1 (11)
25 (13)
51- 75 20,3 (22)
7,7 (4)
76- 100 49 (53)
32,7 (17)
69
ki-67 <14% 74,13 (43)
30,43 (7)
>14% 25,86 (15)
69,56 (16)
HER-2 POSITIVO 5,9 (6)
16 8)
Tabla 4.1: Características clínico patológicas de la totalidad de las pacientes RPA y RPB.
Dentro de los parámetros clínicos analizados nos focalizamos en especial en aquellos que
poseen valor pronóstico independiente, ya que predicen el curso de la enfermedad una vez
que está instalada. Es importante aclarar que vamos a profundizar el análisis únicamente en
aquellos grupos de pacientes catalogados como RPA o RPB.
Las variables evaluadas y sus resultados son los siguientes:
1. En primer lugar observamos que la media de la edad de presentación de las RPB (rango:
29- 86, media: 59 años) es 4 años menor que la media de las RPA (rango: 33- 96, media: 63
años). En la figura 4.1 se grafica dicha diferencia, si bien la diferencia no alcanza una
diferencia significativa se observa una tendencia con un p= 0.1768.
EDAD
RPARPB
20
40
60
80
100
Edad
a la
1er
a co
nsu
lta
Figura 4.1: Gráfico comparativo de la media de la edad de presentación, y el rango de
edades de presentación de la enfermedad.
70
2. Con respecto a la incidencia de antecedentes familiares de 1er y 2ndo grado de cáncer
de mama y ovario en ambos grupos de pacientes, no hallamos diferencias
remarcables: la incidencia de antecedentes en las RPA es de aproximadamente un 26%
y en las RPB de un 20%.
3. Tres son los elementos que componen la estadificación clínica (TNM): Tumor, N o axila
y Metástasis. En el único de los componentes que vemos diferencias significativas,
tomando cada uno como variable independiente es en el tamaño tumoral (T). Al
respecto se observa que el grupo de pacientes RPB se presenta con tumores de mayor
tamaño, y acompañado en su mayoría de compromiso ganglionar, si bien por
separado la incidencia de esto último no es significativa. Es importante destacar
también que cuando los tumores son <2cm en el grupo RPB, más del 50% se
acompaña de compromiso axilar. Cuando analizamos los dos intervalos extremos de
los tamaños tumorales (figura 4.2), observamos diferencias estadísticamente
significativas a favor de tamaños <2cm para los RPA y >5cm para los RPB.
TAMAÑO TUMORAL
np
< 2 cm
2 - 5 cm
> 5 cm
0
20
40
60
80 RPA (n = 99)
RPB (n = 55)
*** p=0.0001
* p=0.0285
*
***
***
% d
e p
acie
nte
s
Figura 4.2: Distribución porcentual de los tamaños tumorales según isoforma. Los
intervalos utilizados son los mismos que se utilizan en el sistema TNM. Chi2 *: p=
0.0285, *** p= 0.0001
71
4. En cuanto a la evaluación de variables pronósticas de tipo histopatológicas se
contemplaron tanto el subtipo histológico como el NPI (VER RESULTADO 2). En la tabla
4.2 se resume la distribución porcentual según cada isoforma.
RPA % RPB %
SUBTIPO HISTOLÓGICO DCIS 0 0,00 1 1,69
IC NST 91 81,98 47 79,66
ILC 14 12,61 5 8,47
CARCINOMA MUCINOSO 2 1,80 3 5,08
CARCINOMA PAPILAR 2 1,80 2 3,39
CARCINOMA TUBULAR 2 1,80 0 0,00
CARCINOMAMETAPLÁSICO 0 0,00 1 1,69
GRADO HISTOLÓGICO 1 9 10,23 1 2,17
2 35 39,77 12 26,09
3 44 50,00 33 71,74
NOTTINGHAM
1 (bajo) 36 40,91 14 30,43
2 (moderado) 35 39,77 18 39,13
3 (alto) 17 19,32 14 30,43
Tabla 4.2: Distribución de los subtipos histológicos especiales (WHO) según las Isoformas RPA y
RPB.
No hay grandes hallazgos a nivel morfológico en cuanto al subtipo histológico, pero sí
se observa un predominio de lesiones menos diferenciadas en las muestras RPB. En la Figura
4.3 se grafican comparativamente el grado de diferenciación de tumores RPA y RPB.
72
GRADO HISTOLÓGICO
1 2 30
20
40
60
80RPA n=88
RPB n=46
* p=0.0617
*
p=0.1633
p=0.1306
% d
e p
ac
ien
tes
Figura 4.3: Distribución de pacientes RPA y RPB según su grado de diferenciación: 1, bien
diferenciado, 2, moderadamente diferenciado y 3, pobremente diferenciado. Chi2 *: p=0.0617
Después de evaluar los factores pronósticos clínicos, continuamos evaluando los 4
marcadores utilizados en la práctica, para seleccionar el tratamiento de las pacientes. En la
tabla 4.3 se resumen los porcentajes relativos de expresión de cada uno de los marcadores,
HER-2 y ki-67.
RPA RPB RE
0 1 1,9
1- 25 11,2 13,4
26- 50 3,7 7,7
51- 75 17,7 21,1
76- 100 66,3 55,7
RP 0 0 0
1- 25 20,3 34,6
26- 50 10,1 25
51- 75 20,3 7,7
76- 100 49 32,7
73
HER-2 (+) 5,9 16
ki-67 <14% 74,13 30,43
>14% 25,86 69,56
Tabla 4.3: Porcentajes relativos de expresión para RE, RP, ki-67 y HER-2 según las
Isoformas RPA y RPB.
Es destacable que el grupo RPB posee menores niveles en general, de ambos
receptores hormonales, siendo más marcada la diferencia para el RP (figura 4.4). Además
el grupo de tumores PRB, posee sobre-expresión de HER-2 (figura 4.5) y mayores niveles
de proliferación (figura 4.6).
RECEPTOR DE PROGESTERONA
0%
1%- 2
5%
26%- 5
0%
51%- 7
5%
76%- 1
00%0
20
40
60 RPA n=108
RPB n= 52
p=0.078
p=0.0652
* p=0.0192
p=0.0617
*
% d
e p
acie
nte
s
Figura 4.4: Distribución de pacientes RPA y RPB según los intervalos de expresión del RP.
Chi2 *: p=0.0192.
74
HER-2
RPARPB
0
5
10
15
20 RPA n=101
RPB n=50*
*: p=0.0449
% d
e p
aci
en
tes
Figura 4.5: Distribución de pacientes RPA y RPB según la sobreexpresión de HER-2. Chi2 *:
p=0.0449
KI-67
RPARPB
0
5
10
15
20
25
*** p= 0.0010
RPB n=12
RPA n=23
***
% k
i-67
Figura 4.6: Distribución de pacientes RPA y RPB según su índice de proliferación (ki-67
<14% o >14%). Chi2 ***: p=0.0010
75
a. Evolución de las isoformas en las recurrencias o metástasis
Al día de la fecha contamos con 7 pacientes de las cuales tenemos sus biopsias en forma
evolutiva, es decir, tenemos tanto sus tumores primarios como las recurrencias. Si
descartamos aquellos casos donde no pudimos obtener algún resultado de WB durante su
evolución contamos con 4 casos completos: 2/4 negativos y 2/4 RPA. Si bien es un número
bajo de pacientes como para poder sacar conclusiones, nos permitirá en un futuro al aumentar
la casuística, evaluar la variación que presenta la proporción de Isoformas en su evolución
clínica. A su vez, contamos con los datos de factores pronósticos clásicos obtenidos del taco de
parafina, y con la descripción histomorfológica. En la Tabla 4.4 se resumen los datos de las
pacientes con recurrencias de las cuales tenemos datos de WB.
En cuanto a evolución, se observa que una paciente RP (-) y una RPA tuvieron un tiempo
a la recurrencia menor a 18 meses, lo que sugiere tumores biológicamente muy agresivos, o de
presentación en enfermedad avanzada. Las otras dos pacientes, una negativa y una RPA,
tuvieron recidivas con intervalos de tiempo mayores a 45 meses (casi 4 años). A la fecha
(noviembre de 2015) ambas pacientes RPA fallecieron con sobrevidas de 5 y 1,5 años, y ambas
pacientes RP (-) se encuentran vivas. Tenemos que tener en cuenta que, una de las pacientes
RP (-) exhibe 90% de RE y también sobre-expresión de HER-2, lo que le otorga a la paciente
mejores posibilidades terapéuticas.
En cuanto a la evolución del RP, 1 de 4 pacientes pasó de negativo a positivo; el resto
de las pacientes conservaron el status del RP: la paciente negativa continuó siéndolo, y de las
dos RPA, una de ellas mantuvo su perfil de isoforma mientras que la otra cambió su categoría
hacia RPB.
76
PACIENTE 1 2 3 4
1era CX 25/11/2008 06/01/2009 10/06/2010 16/03/2010
# 61 69 158 145
WB NEG RPA RPA NEG
RE 0 85 30% 95
RP 0 85 10% 0
HER-2 NEG NEG 2+ (fish neg) 3+
ki-67 N/E N/E 16,00 14,11
2nda CX 25/02/2010 19/06/2012 30/11/2010 09/09/2014
# 143 247 179 348
Localización anatómica
N/E Prolongación axilar Multifocal al momento del
diagnóstico, MI MD y metástasis en axila izquierda
WB RPB RPB RPA NEG
RE N/E 85 30% 95
RP N/E 25 8% 0
HER-2 N/E NEG N/E 3+
ki-67 N/E 21,71 N/E 7,11
3ra CX 18/02/2014
# 319
Localización anatómica
Tórax
WB3ra
RPB RE
95%
RP
80% HER-2
NEG
ki-67
49,35
Tabla 4.4: Evolución de WB y factores pronósticos evaluados por IHQ en 4 pacientes con
recurrencias. De las pacientes nº1, 3 y 4 tenemos 2 muestras de las cuales se muestran sus datos
de forma evolutiva. De la paciente nº 2 tenemos 3 muestras. Se especifican los valores de los
datos de WB, RE, RP, HER-2 y ki-67, además de la fecha de la cirugía y la localización anatómica.
A modo de resumen de esta sección de la tesis donde se analizaron parámetros clínicos
clásicos y su relación con el perfil de expresión de las isoformas de RP, podemos decir que aquellas
pacientes cuyos tumores expresan mayores niveles de RPA se acompañan de característicos
clínicas asociadas a buen pronóstico.
77
5. Análisis de la correlación existente entre la proporción de isoformas del RP y la
respuesta ex vivo de carcinomas mamarios tratados con MFP.
En la evaluación de la sensibilidad a la MFP sobre muestras frescas de pacientes se comenzó
utilizando el método de cultivo primario, con el cual se ensayaron 70 muestras y se obtuvieron
resultados evaluables solamente en 7 (11.4%) pacientes, a pesar que se intentaron diversos
protocolos de cultivo en adherencia en plástico, en matrigel o en mamoesferas. Adaptando una
tecnología utilizada en neurociencias se puso a punto la técnica de cultivos tisulares mediante el
uso de un chopper 128 (detallada en Materiales y Métodos). Con esta técnica se incuban lonjas de
100 µm de espesor, en presencia o no del antiprogestágeno. Luego de 48 hs de tratamiento, los
fragmentos de tejido son fijados y embebidos en parafina para luego obtener una H&E y realizar
cortes en blanco. Con esta última técnica, logramos una eficiencia aproximada del 45%. Es
necesario destacar que la evaluación completa de la sensibilidad a MFP en las muestras humanas
se compone de tres técnicas: a) el cultivo ex vivo (chopper) del tejido fresco obtenido de la cirugía,
b) el WB realizado con la porción de la muestra que se congela a -70° ni bien se extrae en la cirugía
y c) la evaluación de la viabilidad celular con H&E, técnica de IHQ para ki-67 y posterior
cuantificación de esta última. Por otro lado, también es importante destacar que cuando se realiza
el cultivo no se tiene información previa de la presencia o no de receptores hormonales, o del tipo
de muestra que se está procesando. La selección del fragmento destinado al cultivo, se realiza
dentro del quirófano teniendo en cuenta como parámetro único, las características macroscópicas
de la muestra. Esto último también es uno de los motivos por los cuales disminuye la eficiencia de
la técnica, ya que en principio es realizada “a ciegas”. Sin embargo y debido a que no hay criterio
de selección para incluir la muestra en el testeo de la sensibilidad a MFP, hemos procesado
muestras sin receptores hormonales que se inhiben de forma significativa.
En la Figura 5.1a se muestra un ejemplo representativo de las imágenes de H&E y de las IHQ
de Ki-67 de los cortes de muestras control o incubadas con MFP 10 nM de una muestra
representativa RPA+ y en la Figura 5.1b se muestra un ejemplo representativo de una muestra
RPB+.
78
Figura 5.1a Ejemplo representativo de un cultivo tisular de un paciente RPA+. A.
Cuantificación de Ki-67 (células positivas/ células totales) del área total de la muestra
cuyas imágenes representativas se muestran en C; *: p=0.0303.B. WB de las isoformas A y
B del RP en extractos nuclear (N) y citoplasmático (C) de una muestra representativa. C,
arriba: H&E de un cultivo tisular de un carcinoma de mama (IC–NST) bien diferenciado
creciendo en condiciones control y tratado con MFP (muestra #246), barra: 50 µm; abajo:
Microfotografías ejemplificando la expresión de Ki-67 en cortes de explantos en
condiciones control o tratados por 48 hs con MFP; barra: 100 µm.
5.1aA) B)
C)
*p=0.0303
*
79
Figura 5.1b Ejemplo de un cultivo tisular de un paciente RPB+. A. Cuantificación de Ki-67
(células positivas/ células totales) del área total de la muestra cuyas imágenes
representativas se muestran en C; *: p=0.0136. B.WB de las isoformas A y B del RP en
extractos nuclear (N) y citoplasmático (C) de esta muestra que se estimuló con tratamiento
de MFP. C, arriba: H&E de un cultivo tisular de un carcinoma de mama (IC –NST) bien
diferenciado creciendo en condiciones control y tratado con MFP (muestra #319), barra:
50 µm; abajo: Microfotografías ejemplificando la expresión de Ki-67 en cortes de
explantos en condiciones controlo tratados por 48 hs con MFP; barra: 100 µm.
5.1bA) B)
C)
*p=0.0136
*
80
Para medir la respuesta a MFP tomamos en cuenta dos parámetros: la tasa de
proliferación comparada entre tratados y controles (calculada mediante el índice de ki-67) y la
proporción de isoformas del RP (calculada haciendo la relación entre el valor de la isoforma A y la
isoforma B).
En la tabla 5.1 se muestran los valores de Ki-67 obtenidos en las 19 muestras RPA
analizadas. El índice que se muestra es el cociente entre el valor de la media del Ki-67 del control y
el tratado. Este número refleja la sensibilidad de cada muestra analizada frente al
antiprogestágeno MFP. Observamos que en la totalidad de los casos RPA hubo una significativa
diferencia en la tasa de proliferación cuando comparamos los controles y los tratados. Es
importante destacar que cuanto mayor es el índice mejor es la respuesta de MFP, ya que estamos
mostrando el cociente entre el índice de proliferación del control y el del tratado.
Cuando se analizaron los valores en las 10 muestras RPB (Tabla 5.2), se observó que
mientras en 3 casos las respuestas fueron inhibitorias al igual que las RPA, en dos de ellas se
observó un aumento de proliferación (índice <1). Es importante destacar que las muestras antes
mencionadas corresponden a la misma paciente, representando enfermedad recurrente.
Cuando evaluamos las 4 muestras equimolares, sólo en una de ellas se observó una
inhibición significativa (Tabla 5.3). Como habíamos mencionado anteriormente, cuando
cultivamos las muestras lo hacemos sin conocer el estado de los receptores hormonales, es por
eso que se estudiaron también muestras RP negativas. Uno de los 3 casos RP (-) evaluados, inhibió
su proliferación con MFP (Tabla 5.4). Curiosamente esta muestra mostró un 100% de marcación
para el RA. Esta observación sugiere que sería interesante investigar los efectos de MFP sobre
muestras RA positivas y negativas para investigar si el efecto antiandrogénico de MFP induce
inhibición de la proliferación celular.
81
Muestra índice Ki-67 Subtipo histológico NPI RE RP KI-67 HER-2 RA RG
242 2.18* ICNST 5 35% 25% n/e neg N/E N/E
245 2.11* ICNST 6 90% 75% 4,27 neg N/E 0
246 2.13* ILC NC 100% 100% 7,29 neg 0 80
252 3.03* ICNST 9 95% 70% 35,95 neg 50 30
260 4.33* ICNST 7 5% 5% 9,84 neg 1 30
262 2.00* ICNST 7 85% 45% n/e neg N/E N/E
273 2.5* ICNST 5 95% 95% 37,50 neg 5 30
284 2** ILC NC 90% 80% 24,76 neg 2 60
286 1.82* ICNST 3 80% 85% 8,21 neg 10 12
300 1.45** ICNST 7 95% 95% 7,89 neg 90 15
301 2* ICNST 4 85% 5% 14,52 neg 60 0
305 1.76* ICNST 5 100% 95% 6,69 neg N/E 25
315 1.706* ICNST 8 2% 5% 7,04 neg 0 N/E
323 2.08* ICNST 8 80% 100% 12,94 N/E 70 0
327 1,69* ICNST 6 95% 95% 10,48 neg N/E 0
328 1.52** ICNST 8 100% 90% 17,83 neg N/E N/E
336 1.46* ILC NC 70% 5% 8,90 neg N/E N/E
345 1.9* IC NST 9 2% 6% 25,60 neg 25 N/E
363 2.05* CARCINOMA TUBULAR 3 75% 80% 5,20 neg 70 0
Media ± SD 2.09 ± 0.65
Tabla 5.1: Índice de Ki-67 (Control/tratado) en muestras de pacientes RPA+. *: p<0.05; **: p<0.01 Mann Whittney test, control vs
tratado con MFP.
82
Muestra índice KI-67 Subtipo histológico NPI RE RP KI-67 HER-2 RA RG
240 3* ICNST 6 65% 5% 15,16 3+ 35 0
247 0.73* ICNST 8 85% 25% 21,71 neg 50 5
266 1.56 ILC NC 90% 65% 22,31 neg 60% 65
267 0.99 ICNST 6 98% 95% 30,97 neg 50 40
307 1.04 ICNST 9 0% 2% 46,79 neg 0 10
316 1.46* MUCINOSO 5 75% 45% 0,92 neg 0 0
319 0.71* ICNST 9 95% 80% 49,25 neg 0 0
331 0.97 ICNST 8 N/E N/E N/E neg N/E N/E
355 1.82* IC NST 7 100% 90% 25,00 neg N/E N/E
369 1.45 IC NST 6 60% 20% 40 neg N/E N/E
Media ±
SD
1.37 ± 0.68
Tabla. 5.2 Índice de Ki-67 (Control/tratado) en muestras de pacientes RPB+. *: p<0.05; **: p<0.01 Mann Whittney test, control vs.
tratado con MFP.
83
Muestra índice KI-67 Subtipo histológico NPI RE RP KI-67 HER-2 RA RG
249 1.32 ICNST 8 100% 85% 5,16 neg N/E N/E
259 1.71** ICNST 6 95% 85% 15,63 neg 0 0
285 1.66 ICNST 6 80% 95% 15,26 3+ 70 50
302 1.57 ICNST 5 75% 3% 8,13 3+ 0 0
Media ±
SD
1,56 ± 0.17
Tabla 5.3: Índice de Ki-67 (Control/tratado) en muestras de pacientes Equimolares. **: p<0.01 Mann Whittney test, control vs
tratado con MFP.
Muestra índice KI-67 Subtipo histológico NPI RE RP KI-67 HER-2 RA RG
241 1.26 ICNST 4 0% 0% 12,96 3+ 10 20
348 2.02* ICNST 8 95% 0% 7,77 3+ 100 0
360 1.02 ICNST 7 95% 0% 16,80 N/E N/E N/E
Media ±
SD
1.43 ± 0.5
Tabla 5.4: Índice de Ki-67 (Control/tratado) en muestras de pacientes RP (-). *: p<0.05; **: p<0.01 Mann Whittney test, control vs
tratado con MFP.
84
En resumen, en la Tabla 5.5 se muestra el número de casos en los cuales se obtuvo inhibición y a
su vez se muestra la media +/- DS del índice de Ki-67 del grupo. Se puede observar claramente que el
grupo RPA se favorece con el tratamiento con MFP mientras que en los otros 3 grupos las respuestas son
muy variables pudiéndose observar inclusive estimulaciones frente al tratamiento con MFP. Queda por
explorar porqué algunas muestras del grupo RPB, equimolar o sin expresión de RP se inhiben con MFP y
el papel de los otros receptores hormonales. En la Figura 5.2 se muestra un ejemplo de una de las
muestras sin expresión del RP, pero con 95% de expresión de RA (#348) que se inhibió con el tratamiento
con MFP.
Respuesta a la MFP
Inhibiciones Estimulaciones Índice: Ki-67
Casos/total Casos/total
RPA 19/19 a 0/19 2.09 ± 0.65c
RPB 3/10 b 2/10 1.37 ± 0.68d
Equi 1/4 0/4 1.37 ± 0.68
Neg 1/3 0/3 1.43 ± 0.5
Tabla 5.5: Resumen de la respuesta a MFP por isoforma. X2 global: p= 0.0002; a vs b: p<0.0001
Fisher´s exact test; c vs. d: p=0.0014 Mann Whitney test.
Figura 5.2: Ejemplo de muestra RP negativa (#348) con alta expresión de RA que mostró inhibición
significativa frente al tratamiento con MFP. De izquierda a derecha se muestra la expresión de RE (95%),
RP (0%) y RA (100%); barra: 50 µm.
RARPRE
#348
85
En la Figura 5.3 se muestran los gráficos individuales de cada tumor control y tratado con MFP de los
grupos RPA y RPB.
Figura 5.3. Respuesta a la MFP de muestras de pacientes PRA+ (n=19) y pacientes RPB+ (n=10). Se
muestran los casos individuales de la cuantificación de la media de Ki-67 en los cultivos control y la
media del Ki-67 de los cultivos tratados con MFP, para cada muestra de paciente. Se realizó un t de
Student para muestras pareadas y la diferencia es significativa para el grupo RPA+ (p<0.0001 no así para
el RPB (p=0.38).
En el análisis de las muestras NO RPA [RPB, EQUI y RP (-)] sometidas a MFP observamos
respuestas muy heterogéneas. Se conoce el efecto de este antiprogestágeno sobre los RA y RG por lo
que completamos el estudio de estas pacientes ponderando estos receptores. En la Tabla 5.6 se muestra
la distribución de expresión nuclear de RA y RG en las subpoblaciones RPA y RPB. Categorizamos a estos
receptores en: 1) negativo, 2) baja expresión (1-50%) y 3) alta expresión (>50%). Si bien no vemos
Tumores RPA
Control MFP0
10
20
30
40
50
índ
ice
Ki-
67
Tumores RPB
Control MFP0
10
20
30
40
50
índ
ice
Ki-
67
86
diferencias significativas cuando tomamos las pacientes en su totalidad, no descartamos que cada caso
en particular posea un aporte diferente de estos otros receptores frente a la respuesta a la MFP.
RPA RPB
RA n % n %
0% 13,00 32,5 5,00 33,33
1-50% 14,00 35 7,00 46,67
51-100% 13,00 32,5 3,00 20,00
RG
0% 16,00 43,24 6,00 42,86
1-50% 14,00 37,84 5,00 35,71
51-100% 7,00 18,92 3,00 21,43
Tabla 5.6: Distribución de pacientes según sus niveles de expresión de RA y RG, en poblaciones RPA y
RPB.
Por último, analizamos la expresión de los 4 receptores RE, RP, RA y RG, de forma comparativa
en los grupos RPA y RPB, pero no observamos diferencias significativas. Lo único destacable es que la
población de pacientes RPA posee el doble de pacientes con estas características cuando se compara con
las pacientes RPB; siendo la frecuencia de 12% para los RPA y 6% para los RPB.
Podemos concluir que la isoforma A del RP es la responsable de la sensibilidad al tratamiento con
el antiprogestágeno MFP. Sin embargo, por los hallazgos observados en las pacientes sin RP, RPB o
equimolares podemos hipotetizar que, donde RPA no es la isoforma predominante o directamente no
está presente, el efecto inhibitorio de la MFP se podría deber a la acción de la droga sobre otros
receptores hormonales, tales como RA y RG.
87
RPA % RPB %
N (%) 19 57,5 10 30,3
EDAD
RANGO 37- 80 44- 68
MEDIA 55,7 58,8
ANTECEDENTES FAMILIARES DE CM 5 26,32 3 30
PACIENTES CON RECURRENCIA 4 21,05 4 40
TAMAÑO TUMORAL
NP (no palpable) 0 0 0 0
<2CM 12 63,16 3 30
2- 5CM 5 26,32 3 30
>5CM 0 0 5 50
N/E 2 10,53 0 0
AXILA COMPROMETIDA 11 57,89 4 40
SUBTIPO HSTOLÓGICO
IC- NST 15 78,95 8 80
ILC 3 15,79 1 10
SS 1 5,263 1 10
GH
1 2 10,53 0 0
2 4 21,05 0 0
3 13 68,42 10 100
RE
0% 0 0 1 10
1%- 25% 4 21,05 0 0
26%- 50% 1 5,263 0 0
51%- 75% 1 5,263 3 30
76%- 100% 13 68,42 4 40
RP
0% 0 0 0 0
1%- 25% 6 31,58 4 40
26%- 50% 1 5,263 1 10
51%- 75% 2 10,53 1 10
76%- 100% 10 52,63 4 40
88
Tabla 5.6: Características clínico- patológicas de las pacientes evaluadas en su sensibilidad a MFP
KI-67
<14% 14 73,68 2 20
>14% 5 26,32 7 70
HER-2
POS 0 0 1 10
89
Selección y análisis de la expresión diferencial de genes regulados por una u otra isoforma.
El objetivo principal de esta parte del trabajo consistió en seleccionar un grupo de
genes candidatos que sean fácilmente medibles por IHQ, y que nos permitan predecir la
isoforma predominante. Habiendo previamente validado a la RPA como biomarcador de la
sensibilidad a antiprogestágenos, hicimos un extenso trabajo de selección de genes
basándonos en estudios de otros grupos de trabajo y en los propios. Dichos genes debían
tener, como condición sine qua non, anticuerpos disponibles para uso en técnicas de IHQ.
Selección de genes a partir de datos bibliográficos
Se conoce que las diferentes isoformas del RP regulan un diferente set de genes.
Richer y col. realizaron microarrays de expresión génica de células T47D con expresión de
una u otra isoforma de RP solamente, T47DYA y T47DYB. Observaron que de un total de
94 genes regulados por Pg, 65 estaban regulados exclusivamente por la RPB, 4 estaban
regulados por RPA y 25 estaban regulados por ambas isoformas91. A pesar de que en
condiciones fisiológicas la expresión de las isoformas es siempre conjunta, consideramos
que fue un buen punto de partida para seleccionar genes candidatos. Por otra parte,
Brayman y col demostraron en un modelo de células epiteliales uterinas la asociación
entre la expresión de RPB y la expresión de MUC-1 93.
El listado de genes candidatos seleccionados de la bibliografía para esta sección de la tesis
se resumen en la Tabla 6.1.
GEN Función Regulado por
BCL-xl Proteína Anti apoptótica RPA
NDRG1 Es un factor relacionado con N-Myc y su señalización downstream.
RPB
HEF-1 Adhesión celular RPA
ERR- Factor de Transcripción RPA
90
MUC-1 Mucina de superficie RPB
STAT5/ pSTAT5a Factor de transcripción RPB
c-EBP Factor de Transcripción RPB
ITGA-6 Adhesión celular RPB
Tabla 6.1. Lista de genes tomados de datos bibliográficos, regulados de forma diferencial por las
isoformas del RP. Se especifica la función de cada gen y qué isoforma lo regula de forma
preferencial.
Selección de genes candidatos a partir de RNAseq de un set de nuestras pacientes
RPA vs RPB
Se secuenciaron un total de 16 pacientes, 9 RPA y 7 RPB. Del total de muestras 2 de ellas
fueron excluidas del análisis por diferencias en la calidad del RNA, una RPA (#246) y una RPB
(#209). Una vez que se excluyeron las muestras con baja calidad de RNA, se realizó un análisis
detallado utilizando el algoritmo EBSeq y se hallaron 140 transcriptos diferencialmente regulados
por las isoformas: 55 de ellos regulados positivamente en RPA y 85 en las RPB.
Posteriormente, utilizando tres algoritmos diferentes: EBSeq, baySeq y edgeR (Figura 6.1),
se ponen en evidencia 3 nuevos candidatos que sobresalen de los demás y se tendrán en cuenta
para validar en nuestra población de pacientes: MUC2, CRISP3 Y FCRLB. Este último gen
corresponde a una fracción de Fc receptor-like de Linfocitos B que no posee anticuerpo para su
determinación por IHQ.
91
Figura 6.1: Diagrama de Venn mostrando los genes más sobreexpresados que tienen en común los
3 análisis realizados (EBseq, baySeq y edgeR).
Dado que cuando estudiamos las muestras por RNAseq las elegimos según el WB y la
expresión de RP por IHQ sin conocer los datos de la historia clínica, decidimos analizar estos
pacientes para seleccionar un subgrupo de pacientes más homogéneos en cada grupo.
En la tabla 6.2 se resumen los datos clínico- patológicos de todas las pacientes secuenciadas, sin
aplicar ningún criterio de exclusión.
92
WBn WBc ISOFORMA # EDAD PRIMARIO VS. RECURRENCIA
ESTADIO SUBTIPO
HISTOLÓGICO Nottingham
(NPI) RE RP HER-2
0,66 0,66 X: RPB 10 29 PRIMARIO N/E ICNST 7 75% 50% neg
0,66 0,66 X: RPB 12 77 N/E N/E ICNST 7 85% 80% neg
0,75 0,75 X: RPB 13 49 N/E N/E ICNST 4 85% 95% 3+
0,39 0,84 X: RPB 52 62 N/E N/E ICNST 3 90% 90% 3+
0,69 0,56 X: RPB 56 56 N/E IIA ICNST 6 95% 95% neg
0,14 X: RPB 189 86 RECURRENCIA I ICNST 4 60% 25% neg
0,67 0,5 X: RPB 209 54 PRIMARIO IIA ICNST 6 70% 60% neg
1,2 X: RPA 92 96 PRIMARIO IIA ICNST 6 95% 95% neg
N/E 3,20 X: RPA 126 57 PRIMARIO IIA ICNST 6 80% 85% neg
3,36 1,21 X: RPA 157 57 PRIMARIO IIB ICNST 6 95% 95% neg
2,32 3,8 X: RPA 176 72 PRIMARIO IIIA ILC 7 80% 60% neg
1,83 1,37 X: RPA 206 72 PRIMARIO IIIB ICNST 8 90% 85% neg
2,5 0,92 X: RPA 217 79 PRIMARIO IIIB ICNST 6 90% 45% 3+
2,3 1,54 X: RPA 228 45 PRIMARIO I ICNST 5 95% 25% 3+
2,2 1,4 X: RPA 245 48 PRIMARIO I ICNST 6 90% 75% neg
4,8 2,14 X: RPA 246 70 PRIMARIO I ILC 7 100% 100% neg
Tabla 6.2: Características clínicas e histopatológicas de todas las pacientes estudiadas con RNAseq.
93
Del análisis de los datos clínicos e histopatológicos surgen otros criterios de exclusión:
1. Datos clínicos relevantes
Pacientes premenopáusicas: son pacientes con un background hormonal muy diferente. Son
las muestras #10, #13,#217 y #228
La #217 posee un tamaño tumoral muy grande y un estadio avanzado
2. Evaluación Histológica y factores pronósticos
En cuanto al subtipo histológico, las muestras #176 y 246 son las únicas diferentes. Son
carcinomas lobulillares y el resto (tanto las muestras RPA como las RPB) son ductales.
En cuanto al grado histológico hay una variedad entre bajo, moderado y alto.
En cuanto a los factores pronósticos por IHQ, llama la atención que hay 4/16muestras que
son triples positivas: dos de ellas son RPA (#228 y #217) y dos son RPB (#52 y #13).
Teniendo en cuenta estos criterios se excluyeron las siguientes muestras:
#176, #217, #228, #13 y #52.
Finalmente, considerando todos los criterios de exclusión anteriormente explicados nos
quedamos con 9 muestras, 5 RPA y 4 RPB. Los datos crudos del RNASeq de estas pacientes se
analizaron con el script del PAM-50 (plataforma genética utilizada actualmente en la clínica para la
clasificación de subtipos moleculares y para la predicción del riesgo a la recaída). En la Figura 6.2 se
muestra un mapa de calor con tres sectores para analizar información. En la parte superior se
muestran las pacientes clasificadas según su isoforma combinado con el subtipo molecular calculado
con PAM-50. Se puede apreciar claramente que 4/5 pacientes catalogadas como RPA corresponden
a pacientes Luminales A y que 4/4 pacientes catalogadas como RPB corresponden al subtipo Luminal
B.
94
Figura 6.2: PAM-50 en 9 muestras catalogadas según su perfil de isoformas (5 RPA y 4 RPB)
A la derecha se enumeran los 50 genes en los que se basa la plataforma genética, y
específicamente en rojo aquellos que se correlacionan con proliferación. Por último, en la parte
inferior, se puede discernir cada una de las pacientes y su riesgo de recaída, siendo MR: riesgo
Moderado y HR: alto Riesgo.
De este último análisis se desprende que aquellas pacientes catalogadas como RPA se
acompañan de un perfil molecular similar al de las pacientes Luminales A, donde el riesgo de
enfermedad recurrente oscila entre moderado y bajo. Acompaña este comportamiento menos
95
agresivo una menor sobreexpresión de genes de proliferación, como BIRC5 y ki-67, además de
una menor sobreexpresión de HER-2. Contrariamente, aquellas pacientes RPB, conllevan un alto
riesgo de recurrencia e incremento en los genes relacionados con proliferación y HER-2.
96
7. . Selección de genes candidatos.
BCL-xl
BCL-xl es una proteína anti apoptótica perteneciente a la familia BCL2. Esta familia de
proteínas esta sobre-expresada en una gran cantidad de tumores 129. En cuanto a su relación con las
isoformas del RP, está regulada por la Isoforma A, aumentando su expresión 3.2 veces 91.
Cuando analizamos dicha proteína en nuestra población de muestras catalogadas según su
perfil de isoformas, vimos que efectivamente hay una correlación estadísticamente significativa
(p=0.0174) entre la mayor expresión de la proteína en su localización citoplasmática y la RPA.
Hasta el momento hemos analizado su expresión en 35 muestras RPA y 20 RPB de las cuales
contamos con valor de WB y muestra parafinada. En la figura 7.1 se grafica el score citoplasmático
de BCL-xl de las pacientes con una u otra isoforma, y se ejemplifica con una micrografía de una
paciente RPA (arriba) con un score de 200 y otra paciente RPB (abajo) con un score de 70.
Figura 7.1: A) Tumor catalogado como RPA con un score de 200 (arriba) y tumor RPB (abajo) con un
score de 70; Barra: 50m; B) Dot plot del score citoplasmático de BCL-xl en tumores RPA y RPB,*:
p=0.0174.
BCL-XL
RPARPB
0
100
200
300
400RPB (n=20)
RPA (n=35)
* p=0.0174
Sco
re B
CL-
xl e
n c
ito
pla
sma
A
B
RPB
RPA
97
FGF-10
La familia de los factores de crecimiento fibroblástico (FGF) están constituidos por 22
miembros y están involucrados en desarrollo, reparación y metabolismo entre otras funciones. El
FGF10 en particular señaliza mayormente a través de FGFR-2b y se sabe que tiene un rol crucial en
desarrollo, enfermedad y medicina regenerativa 130. Con respecto a su relación con el CM, se lo
vincula con la iniciación de metástasis por su participación en el proceso de transición epitelio
mesénquima (EMT)131,132. Según al análisis de RNAm realizado las muestras de nuestras pacientes, el
fgf-10 estaría regulado de forma diferencial por la RPA, incrementado su expresión 22 veces.
Hemos analizado 24 muestras RPA y 12 muestras RPB, y si bien aún la diferencia no es
estadísticamente significativa (p=0.0730), existe una tendencia que acompaña los resultados del
RNAseq, siendo mayor la expresión de FGF-10 en pacientes RPA. En la Figura 7.2 se grafica el score
citoplasmático de FGF-10 de las pacientes con una u otra isoforma, y se ejemplifica con una
micrografía de una paciente RPA (arriba) con un score de 150 y otra paciente RPB (abajo) con un
score de 50.
Figura 7.2: A) Tumor catalogado como RPA con un score de 150 (arriba) y tumor RPB (abajo) con un
score de 50; Barra: 50m B) Dot plot del score citoplasmático de FGF-10 en tumores RPA y RPB,
p=0.0730.
FGF-10
RPARPB
0
100
200
300RPA (n=24)
RPB (n= 12)
ns p= 0.0730
sco
re F
GF
-10 e
n c
ito
pla
sm
a
A
B
RPB
RPA
98
STAT-5
La familia de proteínas STAT está involucrada en todos los estadios del desarrollo mamario y
además está implicada en la tumorigénesis mamaria 133. STAT-5 consiste de 2 proteínas STAT5A/B,
las mismas están involucradas en procesos de proliferación y diferenciación 134. Está descripto que la
localización nuclear de este factor de transcripción está vinculado a buen pronóstico en tumores de
tipo Luminal, y se postula que desde un punto de vista clínico, la desregulación de este factor
representa un factor de riesgo 135
Con respecto a la relación entre el perfil de isoformas del RP y esta familia de proteínas,
Richer y col 91 describen que RPB incrementa la expresión de STAT-5a unas 6 veces. En la figura 7.3
se grafica el score de STAT-5 y se ejemplifica una muestra RPA y un RPB (se evaluaron 25 muestras
RPA y 17 RPB). Si bien la diferencia de expresión no es aún significativa, la tendencia es muy clara,
con un p=0.0509.
Figura 7.3:A) Tumor catalogado como RPA con un score de 30 (arriba) y un tumor RPB (abajo) con un
score de 100; Barra: 50m .B) Dot Plot del score nuclear de STAT-5 en tumores RPA y RPB, ns:
p=0.0509.
STAT-5
RPARPB
0
100
200
300
ns p=0.0509
RPA (n=25)
RPB (n=17)
Sco
re S
TA
T-5
en
nu
cle
o
A
B
RPB
RPA
99
MUC-2
Las mucinas humanas (MUC) consisten de varios miembros, desde MUC-1 a MUC-21, y se
clasifican en dos grandes categorías: formas secretadas o formas transmembrana. Las secretadas
(MUC-2, MUC-5A, MUC-5B y MUC-6) forman una barrera física que provee protección de los
epitelios que las secretan 136.Se ha reportado que el patrón de expresión de mucinas podría ser útil
para distinguir los orígenes de ciertos carcinomas 137. En particular MUC-2 se ha descripto en
carcinomas mucinosos de varios sitios, incluyendo la mama 138.
Con respecto a su relación con el perfil de isoformas del RP, los resultados de nuestro
RNAseq arrojaron a esta mucina como uno de los genes más diferencialmente regulados por la RPB.
En la figura 7.4 se grafica la diferencia entre la expresión citoplasmática de MUC-2 para muestras
RPA y RPB. Se evaluaron un total de 24 muestras RPA y 14 muestras RPB, y las diferencias mostraron
significancia estadística (p=0.0061) siendo más altos los scores de aquellas muestras catalogadas
como RPB.
Figura 7.4: A) Tumor catalogado como RPA con un score de 90 (arriba) y un tumor RPB (abajo) con
un score de 250; barra: 50m; B) Dot Plot del score citoplasmático de MUC-2 en tumores RPA y RPB,
**: p=0.0061.
MUC-2
RPARPB
0
100
200
300
** p=0.0061
RPB (n=14)
RPA (n=24)
Sco
re M
UC
-2 e
n c
ito
pla
sm
a
A
B
RPB
RPA
100
CRISP-3
La proteína CRISP-3 (cysteine-rich secretory protein 3), es una glicoproteína descripta en las
interacciones presentes entre gametos masculinos y femeninos 139. Esta proteína es secretada por
múltiples glándulas exocrinas 140 entre ellas páncreas y mama. Poco se sabe sobre el rol de CRISP-3
en CM; se la ha descripto entre los genes regulados por andrógenos en la próstata.141
Al igual que MUC-2, CRISP-3 resalta entre los genes más regulados entre las isoformas, sin
embargo el análisis de las muestras RPA (n=25) y RPB (n=12) no mostraron diferencias significativas
(p=0.1700; figura 7.5.) Sin embargo, fue llamativo que cuando hicimos la estratificación del total de
muestras evaluadas, dejando afuera al grupo de CMTN, estas fueron las muestras que mostraron un
score más elevado, siendo muy homogéneas entre sí para esta característica en particular. Este
hallazgo necesita de validación posterior, pero haciendo un paralelismo con carcinomas de próstata
podría estar relacionada con los andrógenos también en la mama.
Figura 7.5:A) Tumor catalogado como RPA con un score de 100 (arriba) y un tumor RPB (abajo) con
un score de 250; barra: 50m;A) Dot Plot del score citoplasmático de CRISP-3 en tumores RPA y RPB,
ns: p=0.1700.
CRISP-3
RPARPB
0
100
200
300
ns p=0.1700
RPA (n= 25)
RPB (n= 12)
sco
re C
RIS
P-3
en
cit
op
lasm
a
RPB
RPA
A
B
101
CK6A
Las CK de expresión basal comprenden especialmente a la CK 5/6 y la CK 17. Las mismas se
expresan en una minoría de carcinomas mamarios, y se asocian a mal pronóstico142.
En nuestros estudios de RNAseq, la CK6a y la CK6c se regulan de forma diferencial por la
isoforma B del RP. Analizamos un total de 28 pacientes RPA y 13 pacientes RPB y observamos que
existe una correlación significativa (p=0.0493) para su expresión en la membrana plasmática. Las
pacientes RPB poseen mayores niveles de expresión de esta proteína que las muestras RPA. Estos
hallazgos acompañan los análisis realizados con la plataforma PAM50, sobre nuestras muestras,
donde uno de los genes regulados de forma positiva por la isoforma B es justamente la CK6. En la
figura 7.6 se grafica el score de membrana en las muestras catalogadas según su perfil de isoformas,
y se ejemplifican dos casos (un RPA y un RPB) con diferente expresión.
Figura 7.6: A) Tumor catalogado como RPA con un score de 10 (arriba) y un tumor RPB (abajo) con
un score de 70; barra: 50m. B) Dot Plot del score de membrana de CK6a en tumores RPA y RPB, *:
p=0.0493.
CK6A
RPARPB
0
50
100
150
*p= 0.0493
RPA (n=28)
RPB (n=13)
Sco
re C
K6A
en
mem
bra
na
RPB
RPA
A
B
102
De estos 6 candidatos nos resta validar a aquellos genes que muestran significancia estadística o
tendencia marcada (como es el caso del FGF10), en un número mayor de pacientes. De todas
maneras, BCL-xl y FGF10 podrían ser exponentes de la RPA; y MUC-2, CK6A y STAT5 de la RPB.
103
Discusión
104
En este trabajo de tesis demostramos que la isoforma A del RP es un biomarcador de la
sensibilidad al tratamiento con antiprogestágenos y posee, a su vez, un rol pronóstico vinculado a un
menor riesgo a la recurrencia.
De la totalidad de carcinomas mamarios diagnosticados, un 75% pertenece al subgrupo de
tumores denominados luminales; los mismos expresan, en su mayoría, ambos receptores
hormonales 143. Este gran grupo de tumores es muy heterogéneo tanto a nivel clínico como
molecular, pero al día de hoy posee un sólo abordaje terapéutico, dirigido al RE. En nuestro
laboratorio sugerimos que aquellas pacientes con mayor expresión de RPA que RPB serían
beneficiadas de la adición de MFP a su terapia antiestrogénica de elección, en un contexto
adyuvante.
En la población de tumores con RP (+) que comprenden un 75- 80% del total de tumores
diagnosticados, aproximadamente un 52% posee un predominio de la RPA, y como consecuencia,
dichas pacientes serían candidatas a recibir el tratamiento con antiprogestágenos propuesto. De las
pacientes RP (+) restantes, un 28% se definen como pacientes RPB y un 19% como pacientes
equimolares. Esta distribución de pacientes es similar en nuestra cohorte de pacientes y en trabajos
publicados por otros grupos que analizan las isoformas del RP en las muestras de pacientes 95 89 78.
Definición de puntos de corte para la categorización de pacientes según su perfil de isoformas
Para la definición de las pacientes según su isoforma no hay consenso establecido, algunos
autores consideran como punto de corte a valores entre 0 y 1, o >178, por ejemplo. Por otra parte,
estos trabajos antes citados consideran los valores de cada una de las isoformas por separado,
normalizando los valores de cada una de las isoformas, a los controles positivos realizados en
general, con la línea t47Dwt considerada equimolar. En nuestro laboratorio, tomamos en cuenta
siempre la relación de RPA sobre RPB como un único valor ya que tanto en el contexto normal como
tumoral ambas isoformas están presentes en las células 81, además tomando en cuenta nuestra
experiencia sobre modelos experimentales que expresan una u otra isoforma, observamos que la
proporción tiene mucho más peso que cada una por separado. No existen condiciones
fisiopatológicas de ningún órgano con expresión de RP, donde se exprese una u otra isoforma,
siempre lo hacen en forma conjunta. Además de esta consideración, definimos puntos de corte que
poseen cierto nivel de “seguridad” dado que la isoforma predominante determinará la posibilidad de
recibir un tratamiento (en caso de ser catalogada como RPA), o contrariamente, la posibilidad que
105
dicho tratamiento pueda ser perjudicial (en caso de ser RPB). Consideramos a una paciente RPA, si la
misma posee al menos un 20% más de RPA que de RPB; y consideramos a la paciente como RPB si
posee más del 20% de RPB que RPA. Esta manera de cuantificar y catalogar a las pacientes según su
perfil de Isoformas genera sustanciales diferencias entre nuestros hallazgos y los de otros grupos,
que vinculan a la isoforma A con resistencia al TAM, por ejemplo 78 95.
Con respecto al motivo por el cual ocurre el desbalance entre las isoformas, no está del todo
claro el mecanismo, sin embargo tenemos evidencias de nuestro laboratorio y del trabajo de
Pathiraja y col88 que sugieren que la metilación del promotor de RPA90 sería uno de ellos. Se puede
especular que cuando hay mas B hay menos receptor total entonces probablemente sea por pérdida
de RPA más que por sobreexpresión de RPB.
Caracterización clínica de las pacientes según su perfil de isoformas
Con respecto al análisis de parámetros clínicos relacionados a cada una de las Isoformas
enfermedad temprana (tumores de <2cm), con tumores primarios mejor diferenciados que los RPB,
con mayores niveles de expresión de los niveles totales de RE y RP y con bajos índices de
proliferación medidos con ki-67. Cuando clasificamos a la pacientes según si son luminales A o B,
observamos que aproximadamente el 80% (37/47) de ellas fue, a su vez, catalogada como RPA en los
estudios de WB. Además en forma complementaria pudimos realizar el estudio de PAM50 en
algunas de las pacientes y su perfil molecular arrojó datos muy similares. El 80% de las pacientes RPA
se correspondió con pacientes de tipo luminal A según esta plataforma. Con respecto a la respuesta
de estas pacientes al tratamiento antiestrogénico, aún no tenemos un número importante de
pacientes con seguimiento como para llegar a conclusiones relacionadas a este; pero al ser pacientes
con parámetros clínicos de buen pronóstico, y por sobre todo, mayor expresión de receptores
hormonales, creemos que de forma contraria a lo publicado por Hopp en 2004 y por Torsten en
2015, la respuesta de las pacientes RPA será mejor que en aquellas pacientes RPB.
Las pacientes cuyos tumores se clasifican como equimolares corresponden a valores
comprendidos entre 1.2 y 0.83 de RPA/RPB, y presentan características clínico- patológicas que en
líneas generales se encuentran a mitad de camino entre el perfil RPA y RPB. Sin embargo hay ciertos
hallazgos a destacar, como por ejemplo que de la totalidad de pacientes RP (+), son las que menos
recurrencias (2,6%) y metástasis (0%) poseen. En cuanto a la morfología o subtipo tumoral, la
presencia de lesiones in situes prácticamente exclusivo de este grupo de pacientes (de 222 pacientes
RP (+), las 5 lesiones de CDIS son equimolares). Nuestros hallazgos apoyan lo publicado por Ariga y
106
col 94, que estudian una progresión de lesiones desde HDA hasta CI, y proponen que la desregulación
del patrón de Isoformas es un evento temprano en la carcinogénesis. Podríamos hipotetizar que la
desregulación de las isoformas en la evolución de estas lesiones in situ, les otorga un fenotipo más
agresivo con capacidad migratoria. Más aún, entre los CDIS encontramos un 40% (2/5) con
características de “inestabilidad”144 definido por la sobreexpresión de HER-2 y alto índice de ki-67,
creemos que estos podrían ser aquellos que evolucionen hacia un predominio RPB ya que la
población RPB posee con mayor frecuencia estas dos características. Con respecto a la expresión de
receptores hormonales, no existen pacientes con RE 0% ni RP 0%.
Técnicas para la determinación del perfil de isoformas
Con respecto a la técnica utilizada para determinar el perfil de isoformas en las muestras de
las pacientes hay algunos aspectos a discutir. En primer lugar, y haciendo uso de la diferencia de
peso molecular de una y otra isoforma, la técnica "gold standard" para esta determinación es el WB,
sin embargo existen trabajos en la bibliografía que utilizan qPCR94 o IF95.
En primer lugar y con respecto a la qPCR, la misma es técnicamente posible aunque
dificultosa. Como la isoforma A está contenida dentro de la isoforma B, la manera de tener los
valores de las isoformas por qPCR es medir RP total y restarle la isoforma B. De esta forma se
pueden calcular los valores de ambas con este método. En el laboratorio hicimos un análisis de
muestras pareadas (RNAm/ Proteina) para evaluar la posible correlación entre mensajero y proteína
(n=50); no observamos correlación entre ambos, lo que sugiere que existen modificaciones
posteriores que regulan los niveles de proteína (Figura i2: Introducción), como por ejemplo
microRNAs.
En segundo lugar, existen trabajos que evalúan la expresión diferencial por IF. Para utilizar
este abordaje, se hace necesario contar con anticuerpos específicos de una y otra Isoforma. En los
trabajo de Clarke y col, utilizan anticuerpos que reconocen cada una de las Isoformas y realizan una
IF secuencial, para posteriormente medir la señal de ambos canales y así determinar cuál de ellas
predomina 95. Sin embargo, en este estudio existen algunas cuestiones técnicas que son discutibles,
entre ellas, la más importante es que utilizan anticuerpos con diferentes afinidades.
En el laboratorio utilizamos la técnica de WB para la determinación de las Isoformas. La
limitación que posee esta técnica es la necesidad de contar con tejido fresco para la extracción de
proteínas, pero además de esto último, en el proceso de extracción de proteínas no se conoce a
107
ciencia cierta la proporción de tejido no tumoral que acompaña a la muestra. Se conoce que la
glándula mamaria normal expresa hasta un 40% de ambos receptores hormonales 31, y que
considerando específicamente a las Isoformas e RP, la glándula mamaria normal posee cantidades
equimolares de las mismas 7888. Este es el motivo por el cual cuando catalogamos a las pacientes
según su perfil de Isoformas consideramos como complementarios los valores de RP total medido
por IHQ. En los casos donde no existe coincidencia entre ambos valores en su positividad o
negatividad, consideramos que la muestra destinada al análisis por WB ha sido insuficiente o incluye
tejido normal y sus niveles de RP.
Especialmente en este trabajo, durante la evaluación de las pacientes nos enfrentamos con
algunos casos donde eran discordantes los valores de IHQ y los de WB. En todos los casos, ambas
técnicas se repitieron las veces consideradas necesarias con controles positivos y negativos. Sin
embargo, aún tuvimos valores discordantes: en los casos donde el WB fue negativo y la IHQ positiva
la muestra se consideró positiva. Creemos que la diferencia en estos casos pudo estar en que la
proteína del RP es muy lábil, pudiéndose perder su expresión por el método de WB. En los casos
donde el WB fue positivo y la IHQ negativa, se consideró a la muestra como negativa. Creemos que
la razón de la diferencia, en estos casos, fue el aporte del tejido mamario normal presente en la
muestra procesada para extracción de proteínas. Es importante destacar que en la IHQ se puede
evaluar en qué células está presente la marca: si la misma se halla en ductos normales peri
tumorales o en células tumorales propiamente dichas, en el caso del WB esto no es posible. Esta es
la razón por la que a nuestro criterio siempre prima el valor de la IHQ por sobre el del WB.
Evaluación de la sensibilidad de los tumores al tratamiento con antiprogestágenos
Para evaluar la sensibilidad de las muestras de carcinomas mamarios humanos a la MFP
pusimos a punto una técnica que nos permite cultivar lonjas de tejido fresco dispuestas al azar a
condiciones de control o de tratamiento. Esta técnica permite investigar las propiedades
farmacológicas antitumorales preservando el microambiente tumoral original de cada paciente en
particular. Además es un método reproducible, que preserva la arquitectura en 3D, la viabilidad
celular y la expresión génica global con hasta 5 días de cultivo 145 128. La predicción de la respuesta
frente a un tratamiento es un gran desafío, y en base a la aplicación de este tipo de tecnologías
podremos seleccionar mejor a las pacientes.
108
En nuestro caso, la gran ventaja de esta técnica es que, luego de 48hs, los fragmentos
tratados o controles se fijan en formol e incluyen en parafina, pudiendo contar con el análisis
exhaustivo de la H&E. La coloración de rutina (H&E) nos permite evaluar la viabilidad celular, que es
de suma importancia ya que la muestra queda 48hs en estufa a 37°, y como consecuencia directa
una gran cantidad de sus células muere. A su vez, y a diferencia del WB que se realiza “a ciegas”, si la
muestra tomada de quirófano fuera insuficiente o no tumoral es posible determinar su condición
gracias a la posibilidad de mirarla al microscopio óptico. La gran limitante de esta técnica, por otro
lado, es la calidad de la muestra, el tamaño y la celularidad de la misma se relacionan de forma
directamente proporcional al éxito de esta técnica. Del total de las muestras analizadas con este
método (n=95), se logró la evaluación de la sensibilidad a MFP por el método de chopper en 40
pacientes, obteniendo así una eficiencia del 36.8%. Cuatro de ellas, fueron excluidas por presentar
un WB no confiable (n=36). Además, si computamos también los resultados obtenidos de los cultivos
primarios (n=6; resultados obtenidos previamente por la Dra. Paola Rojas y el Dr. Gonzalo Sequeira)
y aquellos obtenidos por este nuevo método implementado, llegamos a un total de 42 pacientes
evaluadas de forma completa y exitosa, para su sensibilidad a MFP.
En el cálculo el número necesario de muestras a evaluar para validar nuestra hipótesis, se
tomaron en cuenta la diferencia entre la media de la tasa de proliferación tanto en condiciones
control como tratado, en estudios pilotos previos. Con estos datos y los errores y que son
constantes, se calculó que era necesario tener 19 muestras en cada grupo (RPA y RPB). Como es de
esperar, se completó el grupo RPA antes que el grupo RPB, ya que son mucho más frecuentes. En
este punto, con 19 paciente RPA evaluadas, se realizó un simulacro imaginando que las 9 muestras
faltantes del grupo RPB para llegar al número pautado de 19 dieran un resultado contrario al
esperado. Aun así la diferencia entre ambos grupos seguiría siendo estadísticamente significativa,
por lo que se consideró que el número de muestras es suficiente para demostrar la hipótesis
planteada.
Genes de regulación diferencial: importancia de una herramienta predictiva.
Como discutimos anteriormente, la técnica más confiable para la determinación del perfil de
isoformas en muestras de pacientes es el WB. Sin embargo, para ser implementada en la práctica
clínica diaria como parte de las herramientas predictivas de diagnostico, es necesario buscar algún
109
método que lo reemplace. La técnica de WB es factible únicamente con extractos proteicos
obtenidos de muestra fresca (ver Materiales y Métodos) y además metodológicamente es una
técnica de muchos pasos, lo que la hace dificultosa. Con la premisa de reemplazar el WB como
objetivo final, y valiéndonos de genes de regulación diferencial por parte de cada una de las
isoformas, nos propusimos desarrollar una herramienta predictiva del perfil de isoformas que sea
robusta, aplicable y reproducible. Sabemos que la técnica de IHQ es universal y de bajo costo,
además, se realiza de rutina en hospitales de todo nuestro país sobre muestras parafinadas.
Para la selección de genes diferenciales tomamos en cuenta, en primer lugar, datos
bibliográficos realizados sobre la línea celular luminal t47D que expresa la RPA o la RPB 91. A pesar de
que no existe tal situación ni en condiciones normales ni patológicas, los estudios sobre líneas
celulares nos permiten disociar algunos mecanismos y regulaciones específicas. Además de estos
estudios sobre t47D, investigamos otros modelos donde hubiera expresión diferencial de las
isoformas. Al respecto, nos encontramos por ejemplo, con evidencias sobre un modelo de células
epiteliales uterinas, donde la RPA se vincula con la regulación diferencial de MUC-1 93; o reportes
donde en células de la granulosa de rata existe una regulación mediada por AMPc 146. Por otro lado,
de nuestro propio análisis de RNAm realizado sobre las pacientes catalogadas por sus isoformas,
obtuvimos un total de 140 transcriptos regulados de forma diferencial. En la selección de estos
genes priorizamos aquellos que cuentan con anticuerpos comerciales específicos y de esa manera
comenzamos a universalizar la regulación diferencial encontrada, en un mayor número de pacientes.
La meta final será generar un algoritmo de expresión determinado por IHQ basado en algunos genes
regulados por RPA y otros por RPB que nos permita predecir la isoforma y, como consecuencia
directa la posibilidad del tratamiento con antiprogestágenos.
La importancia de la selección de pacientes radica en que, a pesar de que los perfiles entre
RPA y luminal A o RPB y luminal B son concordantes en muchos aspectos tanto clínicos como
moleculares, no todas las pacientes catalogadas como luminales A serán beneficiadas de la adición
de MFP a su tratamiento hormonal. En principio hasta un 20% de las pacientes catalogadas como
luminales A no serían candidatas a recibir MFP, y por otro lado, también encontraremos algunas
catalogadas como luminales B, que sobreexpresan RPA, que sí serán beneficiadas del tratamiento
propuesto.
110
111
Conclusiones
112
1. Del análisis de los parámetros clínicos de mayor relevancia pronóstica y el perfil de isoformas del RP,
podemos concluir que:
Las pacientes RPA se asemejan en su perfil génico a las pacientes Luminales A de la
clasificación molecular del CM; y que las pacientes RPB se asemejan a las de tipo
Luminal B.
Los parámetros clínicos clásicos vinculados a buen pronóstico, tales como tamaño
tumoral <2cm, alta expresión de receptores hormonales y baja tasa de proliferación,
se correlacionan con aquellas pacientes cuyos tumores tienen un predominio de
RPA; y en forma contraria se comportan aquellas pacientes con tumores RPB.
El perfil clínico se corresponde con el perfil molecular, pudiendo asociar a las
pacientes RPA con aquellas Luminales A, tanto a nivel de expresión génica como su
valor pronóstico.
2. Los tumores con predominio de la isoforma A del RP son sensibles (se inhiben) frente al tratamiento
con MFP. Esta característica permitirá incorporar el tratamiento con antiprogestágenos al esquema
adyuvante, en tumores de tipo luminal con predominio de RPA. De esta manera la terapia para este
grupo de pacientes será dirigida contra ambos receptores hormonales, pudiendo potenciar el efecto
antitumoral.
3. Un total de 140 trascriptos son regulados de forma diferencial por las Isoformas del RP, el 60%
(n=85) regulados por la RPB y el 40% (n=55) restante por la RPA. Una selección de estos genes y
otros tomados de la bibliografía, serán universalizados en un mayor número de muestras
catalogadas según sus Isoformas para corroborar su expresión diferencial directamente sobre
muestras parafinadas.
4. La determinación de varios genes expresados en los tumores, por técnicas de IHQ, permitirá en un
futuro categorizar a las pacientes según su isoforma predominante. La construcción de un algoritmo
diagnóstico contemplando genes regulados por RPA y RPB incluirá, en principio, a MUC-2 y CK6a por
un lado, y a BCL-xl y FGF-10 por otro. La importancia de discriminar a los pacientes candidatos a
recibir adyuvancia con MFP radica en que, tanto en modelos experimentales como en los cultivos
organotípicos de muestras de pacientes, hemos demostrado que la sobreexpresión de la Isoforma B
del RP puede conllevar una respuesta de tipo estimulatoria frente al tratamiento propuesto.
113
Perspectivas futuras
El desarrollo de una herramienta predictiva del perfil de Isoformas del RP basada en IHQ es
una meta a alcanzar en el futuro próximo, si bien sabemos que vamos a tener que analizar muchos
genes candidatos en muchas pacientes. De todas formas, consideramos que proponer un
tratamiento novedoso acompañado de un método que seleccione a las pacientes, es la base del
tratamiento oncológico dirigido, buscando una mayor eficiencia y una menor proporción de efectos
no deseados.
Nos queda por delante:
el análisis exhaustivo de la población RPB y equimolar, que por lo visto en este
trabajo, es mucho más heterogénea que los RPA en su comportamiento biológico.
explorar el rol de los receptores de andrógenos y glucocorticoides en los tumores de
tipo luminal, y su papel en la respuesta al antiprogestageno MFP.
Analizar el comportamiento del perfil de Isoformas en la evolución de lesiones,
tanto el recurrencias como en metástasis.
114
“El misterio es lo más hermoso que nos es dado
sentir. Es la sensación fundamental, la cuna del
arte y de la ciencia verdadera. Quien no la conoce,
quien no puede asombrase ni maravillarse, está
muerto.”
- Albert Einstein
115
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