UNIVERSIDAD DE COLIMA

CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS

MODULACION KI-OPIACEADE LA EXCITABILIDAD DE FIBRAS NERVIOSAS DEL

NERVIO SURAL DE LA RATA /N VIVO.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DEMAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGíA

P R E S E N T A

MED. CIR. ROBERTO ARCEGA SALAZAR

ASESOR: PH.D. MAURO FRANCISCO PACHECO CARRASCO

COLIMA, COL. ENERO DE 1998

Los trabajos que condujeron a la elaboración de la presente tesis se

realizaron en el Laboratorio de Neurobioiogía del Centro Universitario de

Investigaciones Biomédicas (CUIB) de la Universidad de Colima.

Los resultados de la presente investigación, se presentaron en los

siguientes congresos:

XL Congreso de la Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiol6gicas, Morelia,

MìchoacCln (1997).

IV Foro Estatal de Investigación en Salud, Colima, Colima (1997).

II

RESUMEN

Con la finalidad de evaluar las posibles acciones antinociceptivas

periféricas de agonistas rc-opiáceos, se investigó la posible existencia y función de

receptores ~1 -opiáceos en fibras nerviosas periféricas de origen cutáneo.

Para llevar a cabo la presente investigación se utilizaron ratas macho

adultas (Wistar) de 200 a 300 g de peso corporal, las cuales fueron mantenidas

bajo anestesia profunda (pentobarbital sódico, 35 mg/kg, LP.).

Mediante electrodos colocados alrededor del nervio sural (in situ) expuesto

en la región próxima a la piel, se llevó a cabo el registro (diferencial, A.C.) de los

potenciales de acción compuestos (PAC), inducidos por estimulación antidrómica

supramáxima (pulsos cuadrados catódicos, 3 ms, 0.2 Hz). Se analizaron los

efectos de la aplicación tópica (durante 30 min, utilizando una camarita colocada

en la región central del nervio) de dinorfina A 1-17 (DIN) y de los agonistas

opiáceos ~1 -selectivos no-peptídicos, el (+)-(&,8p)-N-metil-N-v-( 1 -pirrolidinil)-l-

oxaspiro[45]dec-8-yl]-bencenacetamìda (U-69593) y el trans-( 1 S,2S)-3,4-Dicloro-

N-[2-(l-pirrolidinil)ciclohexiI]-bencenacetamida hidrocloruro (U-50488), sobre la

actividad de las diferentes poblaciones de fibras que constituyen el nervio sural.

Tanto los agonistas Kl -opiáceos no peptídicos (10 PM) como la DIN (4 OO

p/lJ) indujeron durante los primeros 20 min un decremento paulatino en la

velocidad de conducción de fibras A& hasta de 10 m/s (de 25 a 15 tis),

inicialmente sin cambio en la magnitud de la descarga de dichas fibras, y

posteriormente seguido por un bloqueo total a los 40 min y la completa

III

recuperación después de 60 min de lavado del fármaco. A partir de los 5 min de

aplicación de los agonistas Ic-opiáceos, los potenciales correspondientes a la

descarga de fibras C sufrieron un decremento paulatino en la amplitud y número

de componentes del PAC registrado hasta su total inhibición (dentro de los

primeros 30 min); estableciéndose dicha acción en un orden secuencial, de menor

a mayor velocidades de conducción (0.2 a 2 mk), y recuperándose en forma

inversa. La máxima recuperación obtenida (después de 3 h de lavado) para los

PAC de fibras C fue del 78.2 f 4.7 % con respecto a la magnitud de los registros

control. Por otra parte, el incremento en la frecuencia de estimulación (de 0.2 a

0.5 Hz) revirtió transitoriamente la inhibición inducida por DIN. Las acciones

inhibitorias observadas fueron bloqueadas por el antagonista K1-op¡@?o

selectivo, nor-binaltorfimina (n-BNI, 50 PM); y este antagonista per se indujo un

incremento significativo (24.3 f 1.7 %) en la magnitud del PAC.

Nuestros resultados demuestran la presencia de receptores ~1 -opiáceos

selectivos, localizados en nervios periféricos, cuya actividad modula en forma

diferencial la excitabilidad de las diferentes poblaciones de fibras nerviosas;

presentando una mayor sensibilidad a dicha modulación las fibras nerviosas de

conducción lenta (< 2 mk). Finalmente, el incremento en la magnitud del PAC

inducido por n-BNI, senala que: la excitabilidad de fibras nerviosas de nervios

periféricos se encuentra sujeta a una modulación basal tónica de naturaleza KI-

opiácea. Estos datos sugieren la posibilidad de que, la disfunción de un sistema

constituido por un ligando endógeno (posiblemente la DIN), y los receptores el-

opiáceos presentes en nervios periféricos, podría resultar en un incremento en la

excitabilidad de las fibras aferentes, y consecuentemente en procesos

neuropatológicos.

IV

INDICE

CONTENIDO PAGINA

CAPITULO 1. INTRODUCCION

1. ANTECEDENTES INMEDIATOS

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

3. JUSTIFICACION

4. HIPOTESIS

5. OBJETIVOS

6. MARCO TEORICO

6.1. ANESTESICOS LOCALES

6.1.1 DEFINICION

6.1.2. INFORMACION HISTORICA

6.1.3. PROPIEDADES DESEABLES EN LOS

ANESTESICOS LOCALES

6.1.4. MECANISMO DE ACCION

6.15 DEPENDENCIA DE LA FRECUENCIA Y DEL USO

6.2. TIPOS DE FIBRAS NERVIOSAS Y SUS VELOCIDADES

DE CONDUCCION

6.3. RECEPTORES, FARMACOS OPIACEOS, Y PEPTIDOS

OPIOIDES ENDOGENOS

6.3.1. ANTECEDENTES HISTORICOS

10

l l

1 2

1 4

16

16

CONTENIDO PAGINA

6.3.2. ESTRUCTURA QUhlCA, SITIOS DE UNION

Y PRECURSORES

6.3.3. DINORFINA Y AGONISTAS K-OF’IACEOS

6.3.4. ANTAGONISTAS K-OPIACEOS

CAPITULO I 1. METODOS

1. PREPARACION EXPERIMENTAL 2 1

2. TECNICA DE REGISTRO 2 1

3. PROCEDIMIENTO FARMACOLOGICO 2 4

4. ANALISIS DE RESULTADOS 24

CAPITULO I I 1. RESULTADOS

1. EFECTOS DE AGONISTAS K-OPIACEOS SOBRE LA

EXCITABILIDAD Y CONDUCCION DE FIBRAS A6 Y C

2. EFECTO DE LA FRECUENCIA DE ESTIMULACION

(DEPENDENCIA DE USO) SOBRE IA ACCION DE LA

DINORFINA EN FIBRAS Ah Y C

3. NATURALEZA OPIACEA DE LOS EFECTOS EJERCIDOS

POR AGONISTAS K-OPIACEOS SOBRE FIBRAS A6 Y C

CAPITULO I V. DISCUSION

1 6

1 7

19

28

3 1

33

35

V I

CONTENIDO

CAPITULO V. CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

PAGINA

40

43

VII

INDICE DE FIGURASCONTENIDO

FIGURA 1. ESQUEMA DE DISPOSITIVO EXPERIMENTAL

FIGURA 2. REGISTRO TIPICO DEL PAC REGISTRADO EN

UNA RAMA CUTANEA DEL NERVIO SURAL 2 6

PAGINA

2 2

FIGURA 3. EFECTO DEL AGONISTA KI-OPIACEO NO PEPTIDICO

U-50488 SOBRE EL PAC DE FIBRAS CUTANEAS DEL

NERVIO SURAL DE LA RATA IN VIVO 30

FIGURA 4. EFECTO DE LA FRECUENCIA DE ESTIMULACION

SOBRE LA ACCION DEPRESORA DE DIN EN FIBRAS

A6 Y C CUTANEAS DEL NERVIO SURAL DE LA RATA

IN VIVO 32

FIGURA 5. EFECTO DEL ANTAGONISTA KI-OPICEO SELECTIVO

n-BNI 34

VIII

CAPITULO I

INTRODUCCION

1. ANTECEDENTES INMEDIATOS.

En el sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos se han identificado tres

familias de péptidos endógenos con actividad opióide: las encefalinas, las endorfinas y

las dinorfinas. Al igual que los otros opióides, las dinorfinas juegan un papel en una

amplia variedad de parámetros fisiológicos, incluyendo: regulación del dolor, de la

actividad motora y c%rdiovascular, así como en la regulación de la respiración,

temperatura, actividad alimentaria, balance hormonal, y respuestas al shock o al estrés

(Smith y Lee, 1988).

A concentraciones menores a 1 PM, las acciones ftsiolbgicas de las dinorfinas se

ejercen a través de su interacción con receptores K-Op¡hiOS, mientras que a

concentraciones mayores esta familia de peptidos se une a receptores p y 6 (Duggan y

Nort, 1983). Con base en las diferentes sensitividades a agonistas y antagonistas, se

han sugerido múltiples subtipos de K-reCeptOreS en el cerebro: un lugar ~1, sensitivo a

benzoacetamidas tales como el (+)-(5a,8P)-N-metil-N-[7-(l-pirrolidinil)-l-

oxaspiro[45]dec-8-yI]-bencenacetamida (U-69593) y el trans-(lS,2S)-3,4-dicloro-N-[2-

(l-pirrolidinil)ciclohexil]-bencenacetamida (U-50488); y un sitio ~2 (insensible a &stos

compuestos) uniéndose principalmente a péptìdos derivados de prodinorfina (Zukin y

col., 1988).

A nivel del SNC, los efectos depresores ejercidos por agonistas K-Op¡h?Os

puede estar relacionada con una influencia de estas drogas sobre el flujo sináptico de

los iones de calcio (Gross y col, 1990). De hecho, en preparaciones sinaptosomales

del tejido cerebral, se ha demostrado que los agonistas K-Op¡&eOS no peptídicos, el U-

69593 y el U-50488, reducen la entrada de los iones de calcio y por lo tanto la

liberación presináptica de neurotransmisores (Bradford y col., 1986).

-2-

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

La participación de las dinorfinas en el procesamiento de información

nociceptiva aferente en la médula espinal, ha sido propuesta en base a estudios

histoquímicos, los cuales muestran una discreta inmunorreactivídad a la dinorfina A l-

17 (DIN), concentrándose ésta en la zona marginal (lámina 1); así como evidencia

anatomice-funcional de que las neuronas de la lámina ll (lámina externa) transfieren

las señales nociceptivas de las aferentes primarias a las neuronas marginales

espinales.

En la rata, la administración i.t. de DIN , induce un decremento en el flujo

sanguíneo de la médula espinal (Long y col., 1987), parálisis flácida de los miembros

posteriores (Hermann y Goldstein, 1985; Spampinato y Candeletti, 1985), y la pérdida

de reflejos espinales (Caudle e Isaac,1988). La pérdida del reflejo de sacudida de la

cola (RSC), al ejercer un estímulo mecánico nociceptivo sobre la cola de la rata,

siempre ocurre concomitante con parálisis inducida por DIN, y ambos eventos se

presentan en forma de todo o nada, lo cual es dependiente de la dosis (Stewart e

Isaac, 1989). Sin embargo, estos fenómenos difieren en que una vez que se presenta

la inhibición del RSC éste se pierde permanentemente, mientras que la parálisis

inducida por DIN es reversible a dosis bajas de éste péptido e irreversible al

administrar dosis altas (Long y col,l988). Además, datos electrofisiológicos han

demostrado que la administración i.t. de DIN induce potenciación transiente del reflejo

provocado por estimulación de las fibras “C”, el cual es seguido por una inhibici6n total

de la actividad inducida sobre la raíz ventral (Caudle e Isaac, 1988). Mientras que la

actividad representativa de los reflejos monosìnápticos y polisinápticos mielinizados

-3-

presentan una recuperación, la actividad refleja de las fibras “C” se pierde

permanentemente.

La pérdida permanente del RSC y de la actividad refleja de las fibras “C”, así

como la parálisis irreversible inducida por la administración i.t. de DIN ha mostrado ser

el resultado de neurotoxicìdad (pérdida de motoneuronas espinales) asociada al

receptor glutamatérgico NMDA. Sin embargo, los mecanismos a través de los cuales la

DIN ejerce la inhibición transiente de reflejos espinales permanece sin ser elucidada.

-4-

3. JUSTIFICACION.

Además de las ya bien caracterizadas acciones de los opióides en el SNC, se ha

incrementado la evidencia de un papel para los receptores opióides en la periferia.

Se sabe que hay receptores K-opiáceos funcionales en tejidos tales como íleo

de cobayo (Trendelemburg, 1971) y los vasos deferentes del ratón (Henderson y col.,

1972). Recientemente se ha demostrado la presencia de receptores K-opiáceos en

nervios periféricos (nervio ciático de la rana), lo cual sugiere un papel funcional en la

modulación de la excitabilidad de las fibras nerviosas (Luna y Pacheco, 1994).

El perfil farmacológico de los agonistas K-opkeos selectivos, originalmente

reportados por Szmuszkovicz y VonVoigtlander en 1982, (como el U-50488 y U-69593),

incluye sedación, analgesia, y efectos anticonvulsivantes que han sido atribuidos a

mecanismos presinápticos que regulan la liberación de neurotransmisores (Proietti y

col. 1991). Sin embargo, se ha postulado una regulación de canales de sodio voltaje

dependiente como mecanismo adicional involucrado en las acciones neurodepresoras

de ~-opiáceos (Iwama y col. 1987). Lo anterior, sugiere que los efectos ejercidos por

dichos fármacos podrían incluir una acción directa sobre la excitabilidad y conducción

nerviosa.

Con base en la información sefialada, surge la posibilidad de que los efectos

depresores inducidos por la administración i.t. de DIN sobre la actividad refleja espinal

(Caudle e Isaac, 1988), resulte de una acción directa de este péptido sobre la

excitabilidad membrana1 en el soma neurona1 y/o sobre la conducción en las fibras

nerviosas. Por lo tanto, es necesario llevar a cabo una investigación que explore la

existencia y función de agonistas ~-opiáceos en fibras nerviosas periféricas.

-5-

4. HIPOTESIS.

Los agonistas wopiáceos modulan la excitabilidad y conducción en nervios

periféricos de origen cutáneo.

-6-

5. OBJETIVOS.

5.1. OBJETIVO GENERAL.

Investigar la posible existencia y función de receptores K-opkheos en fibras

nerviosas periféricas de origen cutáneo.

5.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.

Mediante el registro de potenciales de acción compuestos en el nervio sural de

la rata:

52.1. Determinar el efecto de la DIN y de los agonistas K-Op¡hceoS no-

peptídicos , sobre las excitabilidad y conducción en diferentes poblaciones de fibras

nerviosas.

5.2.2. Determinar farmacológicamente la naturaleza opiácea de los efectos

ejercidos por la DIN y por agonistas K-op¡áCeOS no-peptídicos, mediante la aplicación

del antagonista ~1 -opiáceo selectivo nor-binaltorfimina (n-BNI).

5.2.3. Determinar el efecto de la frecuencia de estimulación nerviosa

(dependencia de uso) sobre la acción de la DIN.

-7-

6. MARCO TEORICO.

6.1. ANESTESICOS LOCALES.

6.1 .l. DEFINICION.

La frase “anestesia local” es usada para describir la pérdida de la sensación en

una área discreta del cuerpo. A diferencia de la anestesia general, en ésta no hay

perdida de la conciencia. La perdida de la sensación puede ser en una pequeña área

del cuerpo ó incluir la mitad inferior del tronco y las extremidades inferiores. Aunque la

anestesia local produce analgesia local, por ejemplo por bloqueo de las fibras que

transmiten información nociceptiva, también bloquea las fibras autonómicas y motoras,

de esta forma la frase anestesia local es más apropiada para describir la condición

producida por la aplicación o inyección de un agente anestésico local.

Todos los agentes anestésicos locales son agentes que bloquean los nervios o

la conducción, pero no todos los agentes que son capaces de bloquear la conducción

en la fibras nerviosas son agentes anestésicos locales. La frase “agente anestésico

local” es, usualmente reservada para agentes que tienen o son investigados con el

animo de definir si cumplen o no con los criterios necesarios para ser clínicamente

usables. Agentes tales como tetrodotoxina, batracotoxina, fenol y etanol, aunque

producen bloqueo nervioso reversible a concentraciones apropiadas, no son

normalmente vistos como agentes anestésicos locales.

6.12. INFORMACIÓN HIST6RICA.

La historia de la anestesia local en la medicina moderna inicia con el aislamiento

de la cocaína de las hojas de Erithroxylon coca por Niemann en 1860 y estudiadas

subsecuentemente por von Anrep y Koller, y otros, quienes demostraron los usos

-8-

clínicos de esta substancia como un agente anestésico local. Una necesidad había

sido cubierta, pero durante los siguientes afios la toxicidad y sus capacidades

altamente adictivas se hicieron evidentes. Esto apresuró la búsqueda de otros

componentes que llenaran la necesidad de un agente anestésico local libre y efectivo.

La procaína, sintetizada por Einhorn en 1905, fue nombrado como el primer agente

anestésico local para ser cuidadosamente usado. Su toxicidad es baja, pero es muy

poco potente, es inestable y su duración de acción, siempre que es usado junto con un

agente vasoconstrictor, es demasiado corta para muchos procedimientos quirúrgicos.

Consecuentemente, la búsqueda de agentes más potentes con una larga duración de

acción y una toxicidad aceptable continuaron. No obstante que, la procaína fue el

primer agente anestésico local a ser cuidadosamente usado, su sinónimo, la

novocaína, es actualmente usado incorrectamente por ambos, legos y profesionales,

como un termino genérico para cualquier agente anestésico local. La continuación en

la búsqueda de un mejor agente anestésico local dio como resultado la tetracaína en

1931. Es éste un agente potente con una larga duración de accibn. Es también tóxico

para muchos tipos de bloqueo, y es usado casi exclusivamente para anestesia espinal

y tópica.

En 1943 Löfgren sintetizó la lidocaína, y éste agente, por que posee una

excelente combinación de potencia adecuada, estabilidad física, moderada toxicidad, y

una duración de acción suficiente para muchos procedimientos quirúrgicos, se volvió

en corto tiempo el agente anestésico local disponible más frecuentemente usado.

Como se ha enfatizado, no hay agentes universales. Aunque algunos, tales

como la lidocaína, son extremadamente versátiles, no pueden llenar adecuadamente

las necesidades en el campo de la anestesia regional.

-9-

Así, la búsqueda de agentes anestésicos locales continúa en la actualidad. De

los numerosos componentes sintetizados y probados cada aíio, muy pocos llegan a las

pruebas clinicas y, de aquellos que lo hacen, sólo un pequeno porcentaje se ha

encontrado que son suficientemente superiores en uno o más aspectos a los agentes

actualmente disponibles para ser utilizados. Un ejemplo de tales, es, la bupivacaína, la

cual fue sintetizada en 1957 por af Ekenstam. La bupivacaína es un congénere de la

mepivacaína, la cual es un agente similar a la lidocaína en potencia, toxicidad, y

duración de acción, sin embargo, es más potente y más tóxica que cualquiera de los

componentes y tambibn tiene una gran duración de acción. Tales agentes son usados

ampliamente para procedimientos quirúrgicos de larga duración y para reducir la

necesidad de agentes analgésicos postoperatorios. La etidocaína, primero reportada

por Adams y col. en 1973, es también un potente anestésico con una larga duración de

acción. Se ha reportado que es especialmente usado en procedimientos quirúrgicos en

los que se requiera buena relajación muscular.

La búsqueda de agentes con una ultralarga duración de acción se ha promovido

por la necesidad de su uso en el control del dolor. En vista de las desafortunadas

consecuencias que resultaron de mezclas tales como Efocaina, la posibilidad de

obtener una analgésis de larga duración por medio de preparaciones ya sea de

depósito o liberación prolongada no debe ser abandonada.

6.1.3. PROPIEDADES DESEABLES EN LOS ANESTESICOS LOCALES

Dentro de las propiedades que debe tener todo buen anestésico local están:

a) No debe ser irritante para el tejido donde se aplica.

b) No debe causar daño permanente a la estructura nerviosa.

- lo-

c) Su toxicidad sistemica debe ser baja, ya que puede ser se absorbida de su sitio de

aplicación. Consecuentemente, el índice terapéutico es un factor importante para

evaluar la eficacia y eficiencia de los anestésicos locales.

d) Debe ser efectivo tanto cuando se inyecta a tejidos, como localmente cuando se

aplica a mucosas.

e) Que el tiempo para la iniciación del efecto anestésico sea lo más breve posible y su

acción debe durar lo suficiente para realizar la cirugia que se pretenda; pero no a tal

grado que el periodo de recuperación sea prolongado. Particularmente un efecto

prolongado del anestésico local puede ser deseable, por ejemplo para obtener control

de dolor tipo crónico. Solo que los fármacos utilizados para este fin generalmente

tienen gran efecto tóxico local, pudiendo producir desde neurolisis con esfacelo y

necrosis de tejidos vecinos, hasta, lesión transversal parcial o total de la medula

espinal con parálisis permanente si la lesión se produce cerca del raquis.

6.1.4. MECANISMO DE ACCIÓN.

La forma en que actúan los anestésicos locales es impidiendo la producción y

conducción de los impulsos nerviosos, a nivel de la membrana celular. De acuerdo con

los trabajos de Hodking y Huxley, es posible explicar (al menos parcialmente), la acción

de los anestésicos locales en base a la teoría iónica de la actividad nerviosa. Los

mencionados fármacos bloquean la conducción, ya sea disminuyendo o impidiendo el

aumento transitorio de permeabilidad de la membrana a los iones de sodio que se

produce por una ligera despolarización de la membrana ( Rítchie, 1975 y Stricharts,

1976 ). La acción anestbsica en un nervio se lleva a cabo por un aumento progresivo

del umbral de excitabilidad eléctrica y una disminución del factor de seguridad de la

conducción; si ésta acción se desarrolla adecuadamente se produce

consecuentemente bloqueo de la conducci6n. Además los anestésicos locales

- ll -

disminuyen la permeabilidad del nervio en reposo tanto al sodio como al potasio, lo

cual explica por que el bloqueo de la conducción no presenta cambios en el potencial

de reposo que sean grandes o sostenidos (Straub, 1956 ). De acuerdo con estudios

realizados por Narahashi y Frasier en 1971, se considera que el sitio de acción de los

anestésicos locales (forma iónica ), se establece únicamente desde la superficie

interna de la membrana. Cuando se aplican externamente éstos deben cruzar la

membrana en la forma no cargada, para luego poder ejercer su acción bloqueante. El

mecanismo preciso por el cual los anestésicos locales influyen sobre la permeabilidad

membrana1 actualmente se desconoce. Shanes en 1958, sugirib que los anestésicos

locales producen el bloqueo nervioso aumentando la tensión superficial de la capa

lipídica que constituye la membrana nerviosa, produciendo así el cierre de los poros

por donde circulan los iones, lo cual produciría una disminución general de

permeabilidad en raposo, limitando también el aumento de la permeabilidad al sodio,

siendo el cambio fundamental para la producción del potencial de acción. Por otra

parte Metcalfe y Burgen en 1968, sugirieron que estos f&macos afectan la

permeabilidad aumentando el grado de desorden de la membrana. La reversión parcial

del bloqueo anestksico local por presión externa elevada concuerda con la última

opinión ( Kinding y Cohen, 1977 ), sin embargo, por lo menos un mecanismo de acción

de los anestésicos locales involucra su combinación con un sitio receptor específico

dentro del canal de sodio que de esta manera queda bloqueado ( Narahashi y Frasier,

1971; Ritchie,l975; Stricharts, 1976; Hille, 1977 ).

6.1.5. DEPENDENCIA DE LA FRECUENCIA Y DEL USO.

El grado de bloqueo producido por una concentración dada de anestésico local

depende principalmente de cuando ha sido estimulado el nervio. Por lo tanto un nervio

en reposo es menos sensible que otro estimulado reciente y repetidamente. Cuanto

- 12-

mayor es la frecuencia de la estimulación precedente, mayor es el grado de

desbloqueo obtenido. Estos efectos dependientes de la frecuencia y el uso existen

porque la molécula del anestésico local en su forma cuaternaria tiene acceso al

receptor solamente cuando las compuertas de la cara interna del canal de sodio se

abren, y por que la afinidad del fármaco por el receptor de sodio depende del voltaje

(Strichartz, 1973; Courtney, 1975; Hille, 1977; Courtney y col., 1978; Ritchie, 1979 ).

- 13-

6.2. TIPOS DE FIBRAS NERVIOSAS Y SUS VELOCIDADES DE

CONDUCCION.

De acuerdo con la clasificación fisiolbgica de las fibras nerviosas tenemos que:

Las fibras de tipo A, son fibras mielinizadas y se les considera conforman

principalmente los nervios raquídeos. Las de tipo B difieren del tipo A únicamente por

el hecho de que no presentan un pos-potencial negativo después de la estimulación;

aunque también son fibras mielinizadas, y se les encuentra formando los nervios

vegetativos preganglionares. Las fibras de tipo C, son fibras no mielínicas muy

delgadas que conducen los impulsos a bajas velocidades, constituyen más de la mitad

de los nervios sensitivos y también todas las fibras neurovegetativas pos-ganglionares.

Más de las dos terceras partes de todas las fibras nerviosas de los nervios periféricos

son fibras de tipo C. Dado su gran número, pueden transmitir enormes cantidades de

información desde la superficie del cuerpo, aunque la velocidad de conducción sea

muy lenta. La utilización de este tipo de fibras para transmitir esta gran cantidad de

información, representa una importante economía de espacio en los nervios, ya que el

empleo de fibras tipo A necesitaría nervios periféricos de las dimensiones de grandes

cables y una medula espinal casi tan voluminosa como nuestro propio cuerpo.

Las fibras de tipo A se subdividen en fibras a, 8, y 6. Las primeras tienen un

diámetro entre 13 y 22 Pm, con velocidades de conducción entre 70 y 120 mk, siendo

su función de tipo motora; las AQ, cuyos diámetros se encuentran entre 8 y 13 Pm y

velocidades de conducción de 40 a 70 m/s, tienen funciones táctiles, de presión y

cinestésicas; por su parte las fibras tipo A6, tienen diámetros que van de 1 a 4 Pm y sus

velocidades de conduccion estCtn entre 5 y 30 tn/s. Se sabe estas fibras

funcionalmente conducen infonnacion nociceptiva, prurito, frío, y calor. Por su parte las

fibras de tipo B, que tienen 1 a 3 Pm de diámetro y velocidades de 3-14 mk, participan

- 14-

en funciones neurovegetativas a nivel preganglionar. Finalmente las fibras de tipo C

las cuales participan funcionalmente a nivel vegetativo posganglionar, así como con

respecto a nocícepcíón, prurito, en sensaciones térmicas (calor y frío), además de

presión. Estas presentan diámetros tan pequefios que se encuentran entre 0.2 y 1 .O

Pm, y sus velocidades de conducción varian de 0.2 a 2 mls.

-lis-

6.3. RECEPTORES, FARMACOS OPIACEOS, Y PEPTIDOS OPIOIDES

ENDOGENOS.

6.3.1. ANTECEDENTES HISTORICOS.

Theophrastus en el siglo tercero A.C., es el autor de la primera referencia sobre

el uso de los opiáceos, destacando sus propiedades analgésicas.

Goldstein y col. a consecuencia de sus trabajos en cerebro de ratón, observaron

la posibilidad de indentificar los receptores opiáceos cuantificando su unión

estereoespecifica a membranas cerebrales aisladas (Dole y col, 1971).

Las dinorfinas A I-17 y A l-l 3 (familia de péptidos endógenos) fueron

identificadas y aisladas de glándulas hipofisarias por Goldstein y col. en 1979. El

descubrimiento de este tipo de péptidos, se ha traducido en aumento de su aplicación

terapeutica, por su semejanza de acción con la morfina, por lo que se considera que

estos compuestos deben tener funciones fisiologicas y que el efecto de la morfina y

otros alcaloides opiáceos se lleva a cabo actuando sobre sistemas funcionales que

utilizan péptidos opióides endógenos ( Lee y col. 1964 ).

6.3.2. ESTRUCTURA QUIMICA, SITIOS DE UNION, Y PRECURSORES.

En el sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos se han identificado tres

diferentes familias de péptidos endógenos con actividad opioide: las encefalinas,

endorfinas y dinorfinas. Sus precursores son: Proencefalina (Proencefalina A);

Proopiomelanocortina ( POMC); y Prodinorfina (proencefalina B), respectivamente.

Cada uno de estos precursores contiene una cantidad de péptidos biológicamente

- 16-

activos, opióides y no opióides, los cuales se detectaron en la sangre y en diversos

tejidos.

La POMC contiene la secuencia de aminoácidos de la hormona melanocito-

estimulante (y-MSH), adrenocorticotrofina (ACTH), y p-lipotrofina (/3-LPH); dentro de la

secuencia de 91 aminoácidos de la p-LPH están tas p-endorfinas y la p-MSH. Aunque

la P-endorfina contiene la secuencia para la Met-encefalina deriva del procesamiento

de la proencefalina. La leu-encefalina y otros péptidos opióides se producen a partir

de la Proencefalina y la Prodinofina. Esta última produce cinco péptidos que

contienen Leu-encefalina, la dinorfina A l-17 (DIN) que puede clivarse a dinorfina A l-

13 ó a dinotftna A 1-8; la dinorfina B (rimotfina); las neoendorfinas CL y p, que sólo

difieren entre sí en un aminoácido.

Dichos péptidos opióides u opiopeptinas son capaces de afectar la excitabilidad

neurona1 por la interacción con varios sitios de reconocimiento en la membrana

neurona1 ( receptores p, K, 6 , 6, etc. ). Las encefalinas se Unen principalmente a 6-

receptores, mientras que la B-endorfina parece interactuar con los receptores p y 6.

Los sitios de unión de las dinotfinas en el cerebro no han sido extensamente

estudiadas, pero los resultados in vitro obtenidos por Chavkin y col. (1982), indicaron

que esta opiopeptina presenta alta afinidad a otro tipo de receptor, el K-receptor.

6.3.3. DINORFINA Y AGONISTAS K-OPIACEOS.

El hipotálamo es el lugar en el que se concentra la mayor cantidad de dinorfina,

aún cuando también se le encuentra en otras regiones del sistema nervioso central

como son: raíz dorsal de la tidula espinal, hipocampo y núcleo estriado. Goldstein y

col. en 1979, fueron quienes demostraron la secuencia de los primeros 13

- 17-

aminoácidos, cuyas propiedades se estudiaron junto con la secuencia completa de 17

aminoácidos. Mediante bioensayos en musculo liso se encontró que la DIN y la

dinorfína 1-13 fueron más potentes que la normorfina, la Leu-encefalina o la p-

endorfina. La DIN también desplaza a la naloxona y a la dihidromorfina (DHM) en

experimentos in vitre, aún cuando este péptido es degradado rápidamente en el tejido

cerebral. Trabajos posteriores mencionan que la DIN l-13 tiene propiedades de K-

agonista y opiáceos relacionados que se unen a receptores distintos a los que se une

la morfina (u) 0 las encefalinas (6). Estudios adicionales revelaron que la

administracibn i.v.c. de DIN no parece tener acciones analgésicas en la rata. La falta

de este efecto fue atribuido a una rápida degradación de la dinorfina en el cerebro.

El perfil farmacológico de los agonistas K-op¡&ceos selectivos, originalmente

reportados por Szmuszkovicz y VonVoigtlander en 1982, (como el U-50488 y U-69593),

incluye sedación, analgesia, y efectos anticonvulsivantes que han sido atribuidos a

mecanismos presinápticos que regulan la liberación de neurotransmisores (Proietti y

col. 1991). Sin embargo, se ha postulado una regulación de canales de sodio voltaje

dependiente como mecanismo adicional involucrado en las acciones neurodepresoras

de K-opi&eOS (Iwama y col. 1987). De echo, en los sinaptosomas de cerebro, el U-

69593 y U-50488 reducen la entrada de los iones de calcio y la líberación presináptíca

de neurotransmisores (Bradford, Crouder y White, 1986). Lo anterior, sugiere que los

efectos ejercidos por dichos fármacos podrían incluir una acción directa sobre la

excitabilidad y conducción nerviosa. El U50488 es un agonísta altamente selectivo al

receptor opíoide K (Von Voigtlander et al., 1983). Alzheimer y Bruggencate (1990)

mostraron evidencia experimental, mediante registros electrofisiolbgicos extra e

intracelulares, de que U-50488 ejerce una aparente acción de anestesíco local,

reduciendo la amplitud de los potenciales de acción sodio-dependientes en neuronas

- 18-

CA3 del hipocampo in vitre, en forma reversible y mediante acciones de naturaleza no

opiácea.

6.3.4. ANTAGONISTAS OPIACEOS.

Las acciones farmacológicas de estos compuestos dependen de si un agonista

opiáceo se administró previamente, del perfil farmacológico del opiãceo, así como del

grado en que se ha desarrollado la dependencia física a ésa sustancia. La Naloxona es

un antagonista competitivo sobre receptores p,8,K y (r. Por otra parte la nor-

binaltorfimina (n-MV& se ha encontrado que es un antagonista ~-1 selectivo.

- 19-

CAPITULO I I

METODOS

- 20 -

1. PREPARACION EXPERIMENTAL.

Los sujetos experimentales utilizados en esta investigación fueron ratas macho

de la cepa Wistar de 200 a 300 g de peso corporal, las cuales se mantuvieron bajo

anestesia profunda con pentobarbital sódico a dosis de 35 mg/Kg de peso por vía

intraperitoneal. Posteriormente se canuló la traquea (traqueostomía) para mantener la

vía respiratoria permeable durante todo el proceso experimental, procediéndose en

seguida a la disección de una rama cutánea del nervio sural en la cara interna de la

extremidad posterior izquierda. Disecándose una pequefla sección del nervio en la

parte mas proximal de la extremidad para en este lugar colocar los electrodos de

estimulación, disecándose también otra pequeña area de la sección más cercana a la

piel (región dista1 de la extremidad) donde se colocaron los electrodos de registro.

Posteriormente se monto la porción central del nervio en la ranura de una camarita

(diámetro 6 mm) colocada bajo éste nervio, tratando de mantener intacta la circulación

en toda el area (fig.1). En la camarita se depositaron los fármacos en estudio.

2. TECNICA DE REGISTRO.

La estimulación antidrómica supramáxima del nervio se llevo a cabo mediante

pulsos cuadrados catódicos (0.1-3 ms, 0.2 Hz). Se analizaron los efectos de la

aplicación tópica de dinorfina A 1-17 (DIN) y de los agonistas re-opiáceos no

peptídicos, sobre la actividad de las diferentes poblaciones de fibras que constituyen el

nervio sural (fig. 1). El registro diferencial (A.C.) de los potenciales de acción

compuestos (PAC) se realizó mediante electrodos bipolares conectados a una punta de

prueba activa (Al 401 X10 , Axon Intruments) conectada a su vez a un

amplificadorkondicionador programable de señales (Cyberamp 320, Axon Instruments)

a través de una interfase digitalizadora (DigiData 1200A, Axon Instruments) conectada

-2l-

a una computadora 466 DX, utilizando el programa de adquisición Clampex (Pclamp6,

Axon Instruments). Las senales electrofisiológicas fueron registradas en un ancho de

banda de 4Hz a 3 KHz, y digitalizadas a 6.6 KHz.

- 22 -

Figura 1.

ESQUEMA DE DISPOSITIVO EXPERIMENTAL

Exposición del n. sural (aprox. 1 cm) en 3 regiones.Región femoral, electrodo de estimulaciónRegión tibial próxima cutánea, electrodo de registro.Región media, cámara para aplicación de fármacos.

Registro (diferencial, A.C.)Potenciales de accióncompuestos (PAC)

Estimulacibn antidrómicapulsos cuadradoscatódicos supramáximos(0.1-3 ms, 0.2 Hz)

Punta de prueba X 10 DigiData 1200ACyberAmp 320 AxoClamp 6

- 23 -

3. PROCEDIMIENTO FARMACOLOGICO.

Una vez que se obtuvo un potencial de acción compuesto estable, se procedió a

la aplicación de los fbrmacos en la camarita central. Los fármacos utilizados fueron

Dinorfina A I-17 (Bachem) a concentraciones de 50 y 100 FM; los agonistas K-

opiaceos no peptídicos , a concentraciones de 0.1, 0.5, 1, lo@; y el antagonista el-

opiáceo selectivo nor-binaltorfimina (n-BNI), a concentración 50 PM. Todos los

fármacos fueron llevados a su concentración final en solución salina isotónica (NaCI

0.9 “x3).

4. ANALISIS DE RESULTADOS.

Los trazos obtenidos mediante el promedio digital de 10 registros unitarios

continuos de los PAC, fueron analizados mediante el programa Clampfit (Pclamp6,

Axon Instruments) y el módulo pclamp del programa Origin (Microcal).

Los potenciales de acción compuestos registrados en ramas cutáneas del nervio

sural de la rata, estuvieron constituidos consistentemente por uno a tres componentes

lentos, y en algunas ocasiones por un componente rápido. El componente rápido

presentó velocidades de conducción de 25 a 5 rnk; mientras que los componentes

lentos mostraron velocidades de conduccibn que oscilaron entre 2 y 0.2 mk. De

acuerdo con la clasifkaci6n de fibras nerviosas de origen cutáneo, el componente

rápido corresponde a fibras tipo AS; mientras que los componentes lentos

corresponden a diferentes subpoblaciones de fibras tipo “C” ( referencia).

En la fig. 2A se muestra un registro típico del PAC del nervio sural, inducido por

estimulación antidrómica supramáxima (pulsos cuadrados catódicos, 3 ms, 0.2 Hz). En

- 24 -

éste registro se observa un primer componente polif&ico (fibras A6) con una latencia

de 1.62 ms (velocidad de conducción = 24.7 m/s) y una duración de aproximadadente

13 ms (fig. 2B), cuya primer deflexión positiva se sobrepone al artefacto del pulso de

estimulación. Por ésta razbn, los efectos ejercidos por los fdrmacos probados sobre la

velocidad de conduccih de fibras A6 se analizaron midiendo los cambios en la latencia

al pico de la segunda deflexión (primera negativa). En la fig. 2C se muestra el registro

correspondiente a varias subpoblaciones de fibras C, con velocidades de conducción

menores de 2 mis. Los efectos de los fármacos probados sobre la magnitud de los

componentes correspondientes a fibras A6 y C, se analizaron tomando como par&netro

el área total (suma de áreas correspondientes a las deflexiones positivas y negativas)

de los componentes correspondientes a cada una de dichas ftbras.

- 25 -

/1.62 ms

(24.7 mis)

100

Tiempo (ms)

l C9ms

0///J b/0.5 mV/

3 ms / --l 0.2 mV

50 ms

Fig. 2. A) Registro típico del PAC registrado en una rama cutánea del nervio sural. 8)

Componente rápido (24.7 mk), correspondiente a la descarga de fibras A6, cuya primer

deflexih positiva se sobrepone al artefacto de estimulación. C) Componente lento,

correspondiente a la descarga de diferentes poblaciones de fibras tipo C, con

velocidades de conducción de 2 a 0.2 mk. Las línea diagonales muestran el área bajo

la curva del primer componente negativo a partir de la línea basal. Ver texto

correspondiente a la sección de análisis de resultados.

- 26 -

CAPITULO I I I

RESULTADOS

- 27 -

1. EFECTO DE AGONISTAS K-OPIACEOS SOBRE LA EXCITABILIDAD Y

CONDUCCION DE FIBRAS Ai? Y C

La aplicación local (sobre el n. sural) durante 30 min, tanto de DIN (100 @M,

n=6) como de U-50488 (10 ~JM, n=9) ó de U-69593 (10 PM, n=4) indujo durante los

primeros 20 min un decremento paulatino en la velocidad de conducción de fibras A6

hasta de 10 mk; inicialmente sin cambio en la magnitud de la descarga de dichas

fibras, y posteriormente seguido por un bloqueo total entre los 35 y 45 min. Después

de 60 a 90 min de lavado del fármaco, la magnitud de la descarga de éstas fibras se

recuperó totalmente. A partir de los 5 min de aplicación de los 3 fármacos estudiados,

los potenciales correspondientes a la descarga de fibras C sufrieron un decremento

paulatino en la amplitud y número de componentes del PAC registrado hasta su total

inhibici& (dentro de los primeros 30 min); estableciéndose dicha acción en un orden

secuencial sobre poblaciones de fibras C de menor a mayor velocidades de conducción

(0.2 a 2 mk), y recuperándose en forma inversa. La mhxima recuperación obtenida

(después de 3 h de lavado) para los PAC de fibras C fue del 78.2 f 4.7 % con respecto

a la magnitud de los registros control.

En la fig. 3 se muestran los efectos del agonista K?-Sek?Ct¡VO no peptídico U-

50488 (10 @) sobre la descarga de fibras de origen cutáneo del nervio sural. Cada

trazo corresponde al promedio digital de diez registros, los cuales fueron inducidos por

medio de estímulos de intensidad supramáxima (3 ms, 0.2 Hz). En el panel de la

derecha se observan los cambios ocurridos en el componente correspondiente al

potencial de fibras A6, donde el trazo señalado a los 0 mín corresponde al registro

control, el cual fue obtenido cuando en la camarita central se tenía únicamente solución

salina isotónica (0.9%) A los 5 min de iniciada la aplicacibn del fármaco se observa un

desplazamiento de este potencial compuesto hacia la derecha indicando un incremento

- 28 -

en la latencia. La velocidad de conducción de estas fibras sufrió un decremento

paulatino sin cambio en la magnitud de dicho potencial hasta los 20 min de la

aplicación del fármaco. A los 30 min la latencia al pico del componente negativo de

este potencial aumentó en 1.06 ms; así mismo, se observa un decremento de la

magnitud (tomando en consideración el área bajo la curva), correspondiendo a una

inhibición de aproximadamente el 72 % con respecto al control. Siendo este

componente totalmente bloqueado a los 40 min. Después de 60 min de iniciado el

lavado del fármaco, observamos una recuperación total en la magnitud del área bajo la

curva; sin embargo, persiste una disminución en la velocidad de conducción en este

componente el cual se continuó recuperando paulatinamente. Después de 2.5 h de

lavado, la latencia al pico del primer componente negativo corresponde a 5.75 ms,

comparativamente con una latencia de 5.7 ms para el registro control. En el panel

izquierdo de dicha figura se observa que a partir de los 5 min de la aplicación de este

fármaco los componentes lentos, correspondientes a la descarga de fibras tipo “C”, son

inhibidos paulatinamente hasta el bloqueo total de dichas fibras a los 30 min. Sin

embargo 10 min después de iniciado el lavado del fármaco observamos una

recuperación en forma inversa, recuperándose inicialmente los componentes mas

lentos, para a los 180 mín tener una recuperación parcial cuya Cirea bajo la curva

corresponde al 76.2 % comparativamente con el control.

- 29 -

(As) (9/\ U-50488 (10 pM)

~~

(min)

nr----- 0

I v 3ms 50 ms

Figura 3. Efecto del agonista Kl-opiáceo no peptídico U-50488, sobre el PAC de fibras

cutáneas del n. sural de rata in vivo. Cada trazo corresponde al promedio digital de 10

registros del PAC inducido por estimulación antidrómica, mediante pulsos cuadrados

catódicos de intensidad supramáxima (3 ms, 0.2 Hz). El tiempo señalado corresponde

al periodo transcurrido a partir de la aplicación del fármaco.

- 30 -

2. EFECTO DE LA FRECUENCIA DE ESTIMULAClON (DEPENDENCIA DE

USO) SOBRE LA ACCION DE LA DIN EN FIBRAS A6 Y C

En otra serie experimental (n=4), se investigc5 el efecto de la frecuencia de

estimulación sobre la acción depresora ejercida por DIN (100 PM) en fibras de origen

cutáneo del n. sural. En la fig. 4 se observa que 10 min después de iniciada la

aplicación de DIN se presenta una depresión de los componentes correspondientes a

la descarga de fibras C, obteniéndose a los 20 min una inhibición del 68% (área bajo la

curva) con respecto a la magnitud del registro control (trazo correspondiente a los 0

min). En estas condiciones, se incrementó la frecuencia de estimulación de 0.2 a 0.5

Hz, observándose en los minutos subsecuentes una recuperación paulatina en la

magnitud de la descarga de dichas fibras. A los 6 min de haber incrementado la

frecuencia de estimulación (26 min después de iniciar la aplicación de DIN), la

magnitud de los componentes de fibras C se recuperó hasta 84% del control; sin

embargo, 2 min después se observan nuevamente los efectos depresores ejercidos por

DIN, presentándose el bloquéo total de todos los componentes registrados (fibras A6 y

C) a los 30 min de haber iniciado la aplicación del fármaco. En éste momento se

procedió a lavar el fármaco y a cambiar la frecuencia, reduciéndola de nuevo a 0.2 Hz.

Después de 60 min (trazo señalado 90 mín) se presentó una recuperacii>n parcial del

componente correspondiente a fibras AS y a los 90 min ya observamos una

recuperación franca de la descarga de fibras C. Finalmente, a los 150 min de lavado,

el componente rápido se ha recuperado totalmente, mientras que el área bajo la curva

correspondiente al componente lento de fibras “C”, se recupró en un 76% con respecto

al registro control.

-31-

DIN (100 @)

0 . 2 H z (min)

P -0

2 02224

26

(lavado)

50 ms

Figura 4. Efecto de la frecuencia de estimulación sobre la acción depresora de DIN en

fibras AZ y C cutáneas del n.sural de la rata in vivo. Cada trazo corresponde al

promedio digital de 10 registros del PAC inducido por estimulación antidrómica,

mediante pulsos cuadrados catódicos de intensidad supramáxima (3 ms, 0.2 ó 0.5 Hz).

El tiempo sefialado corresponde al periodo transcurrido a partir de la aplicación del

fármaco.

- 32 -

3. NATURALEZA OPIACEA DE LOS EFECTOS EJERCIDOS POR AGONISTAS

K-OPIACEOS SOBRE FIBRAS A6 Y C

Con el objetivo de determinar la naturaleza farmacológica de las acciones

inhibitorias ejercidas por DIN, U-50488, y U-69593 sobre la excitabilidad del nervio

sural, se estudiaron los efectos del antagonista KI-opiáceo selectivo n-BNI en ausencia

y en presencia de los agonistas opiáceos.

La aplicación de n-BNI (50 PM) sobre el nervio sural de la rata, indujo por si

misma un incremento (24.3 + 1.7 %; n=lO) significativo (PC 0.001, t de Student

pareada) en la magnitud de todos los componentes del PAC registrado. Por otra parte,

al aplicar n-BNI (50 pnn) conjuntamente con DIN (1 OO pM, n=3), U-50488 (10 PM, n=3),

6 con U-69593 (IOpM, n=4), no solo se bloquearon los efectos inhibitorios del agonista,

sino que se presento un ligero incremento (no significativo; fi 0.05, t de Student

pareada) en la magnitud del PAC registrado.

En la fig. 5 se muestra un incremento del 28.2 % (con respecto al registro

control) en la magnitud (área bajo la curva) del PAC, después de 30 min de la

aplicación de n-BNI (50 $W). Dicho incremento se presento tanto en los componentes

de fibras C como en una población de fibras A6 (velocidad de conducción = 13.1 m/s)

prácticamente imperceptible en el trazo control. A continuación se procedió a aplicar

conjuntamente n-BNI (50 $W) y U-69593 (IOpM), observandose 30 min después un

PAC con una magnitud correspondiente al 105 % del registro control. Transcurridos 90

min de lavado de estos fármacos, el PAC se mantuvo semejante (102%) a la magnitud

del registro control.

- 33 -

control

- n-BNI (50 PM)

n-BNI (50 j.M)+

U-69593 (10 PM)

lavado

50 ms

Fig. 5. Efecto del antagonista Kl-Op¡keo selectivo n-BNI, en ausencia y presencia de

U-69593, sobre el PAC de fibras cutáneas del n. sural de rata in vivo. Cada trazo

corresponde al promedio digital de 10 registros del PAC inducido por estimulación

antidrómica, mediante pulsos cuadrados catódicos de intensidad supramáxima (3 ms,

0.2 Hz).

- 34 -

CAPITULO I V

DISCUSIÓN

- 35 -

Los componentes rápido y lento de los potenciales de acción compuestos,

registrados en el nervio sural de la rata, corresponden a poblaciones de fibras de tipo

AS y “C”, ya que, el primero (componente rápido), presentó velocidades de conducción

entre 25.4 y 5 mk siendo congruentes con las reportadas para estos tipos de fibras

(A6). Mientras que, el segundo (componente lento), de acuerdo con las latencias sus

velocidades de conducción se encontraron en todo el rango de las correspondientes a

las fibras tipo “C” (0.2 a 2 mIs).

Los datos obtenidos en la presente investigación, muestran que los tres

fármacos estudiados (DIN, U-50488, y U-69593) ejercen acciones depresoras sobre los

diversos componentes de los PAC registrados en el nervio sural de la rata. El efecto

de estos compuestos se establece en forma paulatina, apareciendo el máximo efecto

aproximadamente a los 30 min (despues de la aplicación de los fármacos), y

requiriendo un tiempo mayor de una hora para mostrar recuperación (después de lavar

el fármaco). Estos datos concuerdan con los reportados por Luna y Pacheco (1994)

sobre las acciones neuromoduladoras que la DIN ejerce sobre la excitabilidad y

conducción en el nervio ciático de la rana. En dicha preparación, el análisis de la

relación entre la intensidad de estimulación y la amplitud del PAC (relación entrada-

salida), indican que éste péptido induce un decremento en la velocidad de

reclutamiento de fibras activadas al incrementar la intensidad de estímulo,

requiriéndose mayores intensidades de estimulación para activar al 50% de las fibras,

pero sin reducir (a concentraciones menores de 100 PM) el número total de fibras que

pueden ser activadas.

Dado que la intensidad del estímulo utilizado en nuestros experimentos fue

supramáximo, una disminución en la velocidad de conducción de las fibras A6 sin

cambio en la magnitud (área bajo la curva), observadas como efecto inicial de los

- 36 -

agonistas K-OpihceOs estudiados es indicativo de una acción de los fármacos sobre las

propiedades pasivas de la membrana nodal de dichas fibras mielinizadas. Una

explicación tentativa a éste fenómeno es aportada por datos de Aguirre y col. (1993) en

donde, mediante el registro intracelular de neuronas CA3 del hipocampo del cobayo in

vitre, se ha encontrado que los fármacos K-Opih!Os inducen un incremento

significativo en la constante de tiempo (de 22 a 35 ms); por lo cual se requiere un

tiempo mayor para que un pulso despolarizante alcance el potencial umbral.

Por otra parte, la secuencia temporal de los efectos depresores inducidos por

los fármacos K-opi&eOS estudiados se presentó en forma diferencial en las

poblaciones de fibras nerviosas que conforman al nervio sural, siendo afectadas en

primer termino las fibras de tipo “C” y posteriormente las tipo AG; observándose que la

recuperación en todos los casos se efectuó en forma inversa a la mencionada. Asi

mismo, los fármacos K-Opiados no peptídicos, presentaron una potencia relativa 10

veces mayor que la DIN para bloquear completamente los PAC. El diferente curso

temporal para el bloqueo podría deberse a una mayor sensibilidad de las fibras C, lo

cual indicaría una mayor densidad de receptores K-Op¡keOs en la membrana de dichas

fibras nerviosas. Esta propuesta implicaría que la concentración a la cual se induce el

bloqueo total de fibras C debería bloquear solo parcialmente a las fibras rápidas. Sin

embargo, nuestros resultados descartan dicha explicación, dado que a pesar de las

diferencias temporales, tanto las fibras C como las fibras A6 fueron totalmente

bloqueadas a las mismas concentraciones de DIN y de los agonistas K-opiheos no

peptídicos (1 OO y 10 uM, respectivamente). De tal suerte que, tanto la diferencia en el

curso temporal de la inhibición de los diferentes grupos de fibras nerviosas, como la

diferencia en la potencia relativa entre la DIN y los compuestos no peptídicos, es

explicada con base en: a) La barrera dífusional dada por la mielinización de las fibras

A& y b) Factores difusionales debidos a las diferencias estructurales y pesos

- 37 -

moleculares de éstos fármacos. Mientras que la DIN tiene un P.M. de 2148 y está

constituida por 17 aminoácidos, U-50488 y U69593 tienen pesos moleculares. de 465.4

y 356.5 (respectivamente), y estructuralmente son bencenacetamidas. Dichas

características confieren a éstos últimos compuestos una mayor liposolubilidad

(comparativamente con DIN) que les permite difundir a traves del peri y endo-neuro

hasta las membranas de las fibras nerviosas. Lo anterior es apoyado por datos

electrofisiológicos obtenidos en laminillas del hipocampo del cobayo, en donde el

bloqueo de los potenciales de acción, dependientes de sodio, se presenta a dosis

equimolares (100 n/W) de DIN y de los agonistas K-opiáceos no peptídicos (Aguirre y

col, 1993).

Es de destacar que el bloqueo total del PAC, ejercido por los agonistas K-

opiáceos estudiados, fue parcialmente revertido al incrementar la frecuencia de

estimulación (de 0.2 a 0.5 Hz); lo cual indica una dependencia del uso contrario al

reportado para fármacos anestésicos locales (tales como la lidocaina) ya que en estos

un incremento en la frecuencia de estimulacibn facilita el bloqueo de canales de sodio

voltaje dependientes al tener el anestésico local acceso desde el interior celular a los

canales de sodio voltaje dependientes en estado activo (Stricharts, 1973; Courtney,

1975; Hille, 1977; Courtney y col., 1978; Ritchie, 1979).

Por otra parte, nuestros resultados apoyan al planteamiento formulado en la

justificación del presente trabajo, en cuanto a que, en la rata, los efectos depresores

inducidos por la administración i.t. de DIN sobre la actividad refleja espinal (Caudle e

Isaac, 1988), fuese el resultado de una acción directa de este péptido sobre la

excitabilidad y conducción en las fibras nerviosas de las raíces espinales. Así mismo,

nuestros datos revelan los mecanismos electrofisiologicos responsables de las

acciones analgésicas periféricas inducidas por la administración i.v. de U-50488 en un

- 38 -

modelo de inflamacion-hiperalgesia unilateral en la rata (Hiden y col., 1991) en el que

la administración i.t. del agonista K-Op¡b?O carecib de actividad analgésica.

En el nervio sural de la rata, los efectos inhibitorios inducidos tanto por la DIN

como por U-50488 y U-69593 fueron bloqueados por n-BNI, indicando que tales

efectos son de naturaleza K1-op¡kea. Mientras que éstos resultados indican la

presencia de receptores Kl-op¡h?OS funcionales en nervios periféricos, el incremento

en la amplitud del PAC inducido por n-BNI per se, indica que dichos receptores se

encuentran sujetos a una modulación basal t&nica por un K-agonista endógeno, el cual

podría ser la DIN. Estudios histoquimicos han mostrado la presencia de

inmunorreactivìdad a DIN dentro de los paquetes neurovasculares, lo cual apoya la

hipotesis planteada (Moskowitz y col., 1987). Lo anterior senala la posibilidad de que,

la disfunción de un sistema constituido por un ligando endógeno (posiblemente la DIN),

y los receptores K-op¡íkeos presentes en nervios periféricos, podría resultar en un

incremento en la excitabilidad de las fibras aferentes y consecuentemente en procesos

neuropatok5gicos.

Finalmente, dado que la aplicación de los fármacos estudiados se llevo a cabo

en una región dista1 al sitio en el que se colocó el electrodo de estimulación,

realizándose el registro del PAC antidrómicamente; los pulsos de estimulación

indujeron reflejos espinales que resultaron en contracciones de músculos ípsilaterales.

Dichos reflejos no fueron bloqueados por la aplicación de los agonistas K-op¡áceos,

senalando que las acciones ejercidas sobre el PAC del nervio sural se llevaron a cabo

localmente.

- 39 -

CAPITULO V

CONCLUSIONES

-4o-

a) En el nervio sural de la rata in vivo, la administración local de DIN y de los agonistas

~-opiáceos no peptídicos estudiados, modulan la excitabilidad de fibras sensoriales A6

YC*

b) Dicha modulación se ejerce disminuyendo las velocidades de conduccí6n y

deprimiendo la amplitud de los PAC en forma paulatina, hasta su bloqueo total;

recuperándose totalmente las fibras AS (después de 1 h de lavado); y parcialmente las

fibras C (después de 3 h de lavado).

c) En contraste con la acción de anestésicos locales tales como la lidocaína, el

incremento en la frecuencia de estimulación (de 0.2 a 0.5 Hz) revierte transitoriamente

la acción depresora de DIN.

d) Los efectos depresores ejercidos por dichos ftirmacos, así como su bloqueo por

acción de la n-BNI, demuestra la presencia de receptores Kl-opideos funcionales en

fibras nerviosas sensoriales periféricas.

e) El bloqueo farmacológico de receptores Kl-opiáceos, mediante n-BNI, incrementa

la amplitud del PAC inducido por estímulos de intensidad supramáxima; demostrando

que las fibras sensoriales de nervios periféricos se encuentran sujetas a una

modulación basal tónica de naturaleza Kl-op¡áma, por acción de un ligando

endógeno.

9 En conjunto, los datos anteriores aportan evidencia experimental en apoyo al

planteamiento de la existencia de mecanismos fisiológicos que modulan la transmisión

de información sensorial nociceptiva a nivel períférico, además de la modulación

central de información nociceptiva (a nivel espinal y del tallo cerebral):

-4l-

Finalmente nuestros resultados sefialan la posibilidad de que, la disfunción de

un sistema constituido por un ligando endógeno (posiblemente DIN), y los receptores

Kl-opiáceos presentes en nervios periféricos, podría resultar en un incremento en la

excitabilidad de las fibras aferentes, y consecuentemente en procesos

neuropatológicos.

- 42 -

REFERENCIAS

BIBLIOGRAFICAS

- 43 -

- Aguirre,f.J.; Moy, N.A.; Luna, M.R. y Pacheco, M.F. (1993). “Differential nature ofdinorphin actions on calcium- and sodium-dependent actions potentials in CA3pyramidal neurons of the guinea pig hippocampus”. Society of Neurocience.Abstracts 23rd annual meeting. Washington,D.C.

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- Alzheimer, C. and Ten Bruggencate, G. (1990) Nonopiod actions of the Ic-opioidreceptor agonists, U 50488H and U 69593, on electrophysiologic properties ofhippocampal CA3 neurons in vitre. J. Phamacol. Exp. Ther. 255:900-905.

- Bradford,H.F.,Crouder, J.M. and White,E.J. (1986).“lnhibitory actions of opioidcompounds on calcium fluxes and neurotransmitter release from mammaliancerebral cortical slices”.Br. j. Pharmac. 88: 87-93.

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