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UNIVERSIDAD DE COLIMA MAESTRIA EN CIENCIAS: ÁREA BIOTECNOLOGIA
ANTIBIOSIS Y MICOPARASITISMO DE CEPAS NATIVAS DE Trichoderma spp. (HYPHOMYCETES: HYPHALES), SOBRE
Mycosphaerella fijiensis (LOCULOASCOMYCETES: DOTHIDEALES)
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS: AREA BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
MARÍA ELENA OCHOA MORENO
ASESORES:
DR. OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZ DR. ROBERTO LEZAMA GUTIÉRREZ
TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO JULIO DEL 2002.
UNWIXGIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 294/2002.
C. MARIA ELENA OCHOA MORENOEGRESADA DE LA MAESTRIA EN CIENCIASAREA: BIOTECNOLOGIAP R E S E N T E .
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: deBiotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de queefectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes delmismo, se le autoriza la impresión de la tesis ” ANTIBIOSIS Y MICOPARASITISMO DECEPAS NATIVAS DE Trichoderma spp. (HYPHOMYCETES: HYPHALES), SOBREMycosphaerella fijiencis (LOCULOASCOMYCETES: DOTHIDEALES) “, misma que hasido dirigida por los C.C. Dr. Oscar Rebolledo Dominguez y Dr. Roberto Lezama Gutierrez,Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Maestra en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a formay contenido por los C.C. Dr. Roberto-Lezama Gutierrez, Dr. Sergio Aguilar Espinosa y el Dr.Alfonso Pescador Rubio, Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento, reciba un cordial saludo.
A T E N T A M E N T E‘-“ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA”
10 DEL 2002., ,:ì
ING. RODOLFO ENTÍN DELGADO
C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNOC.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO.RVMD/Lety**
Of. No. 294/2002.
Km 40 hutopista Colima-Manzanillo ?? Tecomán, Colima, México ?? C.P. 28100Tel. 01 (313) 322 94 05 0 Ext. 52251 ? Fax 52252 ? [email protected]
AGRADECIMIENTOS A la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (FCBA) de la Universidad de
Colima por la oportunidad que me brindaron para continuar mis estudios.
A los Drs. Oscar Rebolledo Domínguez y Roberto Lezama Gutiérrez investigadores de
la FCBA y asesores en esta investigación.
A los Drs. Sergio Aguilar Espinosa y Alfonso Pescador Rubio revisores de este trabajo
por sus sugerencias y correcciones.
A mis amigos y compañeros Alejandro Michel Aceves, Ramiro Ruiz Najera, Gilberto
Manzo Sánchez y Argelian Juárez Alcaraz.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por la beca otorgada.
DEDICATORIA
A Dios:
Por permitirme terminar esta etapa de mi vida.
A mi hijo:
Carlos Humberto mi mayor tesoro.
A mis padres:
Por el apoyo que siempre me han brindado y por su confianza.
A mis hermanos:
J. Humberto, Martha Judith y J. Carlos por su cariño, confianza y apoyo que siempre me
han brindado.
CONTENIDO
Pág ÍNDICE DE CUADROS ....................................................................... iii ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................... v RESUMEN ........................................................................................... vi ABSTRACT ......................................................................................... vii I. INTRODUCCIÓN ................................................................................ 1
II. ANTECEDENTES ................................................................. ............. 7 2.1 Control biológico de patógenos en plantas .................................. 7 2.2 Control biológico de enfermedades en partes aéreas de las Plantas .......................................................................................... 7 2.3 Género Trichoderma ..................................................................... 9 2.4 Mecanismos involucrados en el control biológico de fitopatógenos Por especies de Trichoderma ........................................................ 10 2.4.1 Antibiosis como mecanismo de control biológico ................... 11 2.4.2 Competencia como mecanismo de control biológico.............. 17 2.4.3 Micoparasitismo como mecanismo de control biológico......... 18 2.5 Importancia y distribución del cultivo de plátano ............................ 21 2.6 Sigatoka Negra enfermedad ocasionada por Mycosphaerella fijiensis M................................................................ 23 2.7 Síntomas de la enfermedad en el cultivo ........................................ 26 2.8 Variabilidad genética de Mycosphaerella spp.................................. 28 2.9 Métodos de control de M. fijiensis ................................................... 29 2.9.1 Control químico ...................................................................... 29 2.9.2 Manejo de la resistencia vegetal ............................................ 30 2.9.3 Control cultural ....................................................................... 30 2.10 Control biológico como alternativa de control de enfermedades... 31 III. MATERIALES Y METODOS ................................................................. 35
3.1 Localización del área de estudio .................................................... 35 3.2 Poblaciones en estudio ................................................................... 35 3.2.1 Aislamiento de M. fijiensis ...................................................... 35 3.2.2 Especies de Trichoderma utilizadas ...................................... 36 3.3 Evaluación de la producción de enzimas hidrolíticas por Trichoderma spp. ........................................................................... 36 3.3.1 Cuantificación de glucanasas producidas por Trichoderma spp. ........................................................................................ 37 3.3.2 Cuantificación de quitinasas producidas por Trichoderma spp. ......................................................................................... 39 3.4 Evaluación de antibiosis de Trichoderma spp. sobre el
crecimiento de micelio de M. fijiensis. ............................................ 40 3.5 Actividad micoparasítica de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis. ....................................................................................... 41 IV. RESULTADOS ...................................................................................... 43 4.1 Producción de enzimas hidrolíticas por cepas de especies de Trichoderma .................................................................................... 43 4.1.1 Cuantificación de glucanasas de cepas nativas de Trichoderma spp..................................................................... 43 4.1.2 Cuantificación de quitinasas de cepas nativas de Trichoderma spp. .................................................................. 46 4.2 Antibiosis de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis............................ 49 4.2.1 Efecto antibiótico por glucanasas ......................................... 49 4.2.2 Efecto antibiótico por quitinasas............................................ 52 4.3 Micoparasítismo de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis.. 55 V. DISCUSIÓN ........................................................................................... 60 5.1 Producción de enzimas hidrolíticas por cepas nativas de diferentes especies de Trichoderma .......................................... 60 5.2 Ensayos de inhibición de enzimas quitinasas y glucanasas de
Trichoderma spp. sobre el crecimiento de micelio de M. fijiensis... 62
5.3 Micoparasítismo de Trichoderma spp. sobre M.fijiensis................... 64
VI. CONCLUSIONES .................................................................................. 67
VII LITERATURA CITADA....................... ................................................... 68
Índice de Cuadros No. Pág.
1 Análisis de varianza de la actividad total de glucanasas de cepas nativas de Trichoderma .......................................................................... 43 2 Análisis de varianza de la actividad específica de glucanasas de cepas nativas de Trichoderma .......................................................................... 43 3 Actividad total y actividad específica de glucanasas por cepas de Trichoderma spp...................................................................................... 45 4 Análisis de varianza de actividad total de quitinasas de cepas nativas de Trichoderma spp........................................................................... 46 5 Análisis de varianza de actividad específica de producción de quitinasas por cepas nativas de Trichoderma ........................................ 46 6 Actividad total y actividad específica de quitinasas por cepas de Trichoderma spp....................................................................................... 48 7 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por glucanasas sobre M. fijiensis a los 7 días después de la inoculación................................... 49 8 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por glucanasas sobre M. fijiensis a los 28 días después de la inoculación................................. 49 9 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por glucanasas sobre M. fijiensis a los 49 días después de la inoculación................................. 50
10 Efecto de glucanasas de cepas de Trichoderma spp.sobre el crecimiento de micelio de M. fijiensis....................................................... 51
11 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por quitinasas sobre M. fijiensis a los 7 días después de la inoculación................................... 52
12 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por quitinasas sobre M. fijiensis a los 28 días después de la inoculación................................. 53
13 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por quitinasas sobre
M. fijiensis a los49 días después de la inoculación.................................. 53 iii
14 Efecto por quitinasas de Trichoderma spp.sobre el crecimiento de micelio de M. fijiensis................................................................................ 54
15 Niveles de micoparasitismo de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis. Observada en 10 campos diferentes..................................... 56
iv
Índice de Figuras
No Pág.
1 Micrografía de microscopio electrónico de barrido de la interacción entre T. longibrachiatum (Tl-3) y M. fijiensis. (A) Hifa de Trichoderma enrrollado y penetrando en hifas de M. fijiensis. (B) Esporulación de Trichoderma sobre M. fijiensis ......................................................................................... 58
2 Micrografía de microscopio electrónico de barrido de la interacción entre T. longibrachiatum (Tl-11) y M. fijiensis. (A) Hifa de Trichoderma enrollandose en hifas de M. fijiensis. (B) Enrollamiento y colapso de hifas
de M. fijiensis ............................................................................................ 59
RESUMEN Se probaron 22 cepas nativas de Trichoderma spp. para producción de enzimas,
quitinasas y glucanasas, su efecto antibiótico y micoparasítico sobre Mycosphaerella
fijiensis. La actividad total por glucanasas varió de 0.056 a 1.487 µmol glucosa/h; la de
quitinasas entre 0.009 y 0.05933 µmol N-acetilglucosamina/h. La inhibición del
crecimiento del micelio de M. fijiensis, por glucanasas, oscila entre 1.20% a 22.87%, a
los 7 días; de 6.17% a 30.77%, a los 28 días y de 8.10% a 31.53%, a los 49 días,
después de la inoculación. Las quitinasas inhibieron el crecimiento del micelio entre
0.43% y 28.30%, a los 7 días; de 6.90% a 25.47%, a los 28; y de 3.77% a 24.67%, a los
49 días, después de la inoculación. El micoparasitismo se observó por enrollamiento,
penetración y colapso de las hifas de M. fijiensis. Los resultados obtenidos soportan la
teoría de que las enzimas hidrolíticas y el micoparasitismo de Trichoderma spp.
reducen el crecimiento de M. fijiensis in vitro.
Palabras claves: Control biológico, quitinasas, glucanasas, M. fijiensis, Trichoderma,
micoparasitismo, antibiosis.
vi
ABSTRACT
Tested 22 native strains of Trichoderma spp. for the production of enzymes, glucanases
and chitinases, their antibiotic effect and micoparasitic against Mycosphaerella
fijiensis. Total glucanase activity were 0.056 to 1.487 µmol glucose /ml/hr, and total
chitinase activity were 0.009 and 0.05933 µmol Nacetylglucosamine/ml/h. The inhibition
of mycelium growth of M. fijiensis for glucanases were 1.20% to 22.87%, to the 7 days,
6.17% to 30.77% to the 28 days, and 8.10% to 31.53% to the 49 days, after the
inoculation. The inhibition for chitinases of mycelium growth were 0.43% and 28.30% to
the 7 days, 6.90% to 25.47%, to the 28 days, and 3.77% to 24.67% to the 49 days, after
the inoculation. The micoparasitism were observed for the coiling, hyphal penetration,
collapse of hypha and sporulation on mycelium of M. fijiensis. The get result support the
theory of the hydrolitic enzimes and the micoparasitism of Trichoderma spp. reduce the
growth of M. fijiensis in vitro .
Key words: Biological control, chitinases, glucanases, Trichoderma, M. fijiensis,
Micoparasitism, antibiosis.
vii
v
I. INTRODUCCIÓN El plátano (Musa spp.), en la actualidad, es la segundo fruta tropical más consumido y
distribuido en el mundo, después de los cítricos (Musabyimana et al., 2000); se cultiva
en los trópicos y subtrópicos, en regiones húmedas con una latitud entre 30° N y 30° S;
además, es la principal fuente de hidratos de carbono en la dieta de las poblaciones
rurales y urbanas de la mayoría de los países productores (Mobambo et al., 1993). La
producción mundial es de 64, 627, 049 toneladas métricas; la India es el primer
productor mundial y México ocupa el octavo lugar como productor (FAO, 2001).
La sigatoka negra, causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet, es una
enfermedad aérea destructiva, que ataca las hojas de las plantas de plátanos (Craenen
et al., 1996); induce manchas foliares, con la subsecuente clorosis y reducción en la
asimilación neta del rango de luz, lo cual lleva a un decremento en la capacidad
fotosintética y a la maduración prematura de la fruta sobre la planta; ocasiona
disminución en la calidad y en la producción (Okole y Schulz, 1997).
El principal método de control es mediante la utilización de diferentes grupos químicos,
del subgrupo de los triazoles, morfolinas, benzimidazoles y carbamatos (Jacome y
Schuh, 1992). Dichos compuestos, se caracterizan por su alta actividad inhibitoria del
crecimiento de los tubos germinativos y del desarrollo de fructificaciones de M. fijiensis,
lo que trae consigo una disminución del tamaño de las manchas (Pérez et al., 1993;
Pérez y Mauri, 1994; Jeger et al., 1996). Sin embargo, el uso continuo de estos
productos provoca el decremento de la sensibilidad del fitopatógeno y genera
resistencia a los químicos (Smith, 1991).
El control de enfermedades en plantas con la utilización de los plaguicidas ayuda en la
agricultura, a mantener altos rendimientos y satisfacer la calidad de los alimentos. En
los años recientes, estas contribuciones han sido desafiadas en varios reportes
sugieren, que los efectos negativos sobre el medio ambiente pesan más que su
beneficio a la sociedad (Batra, 1982; James et al., 1993; O’Keeffe y Farrel, 2000); por
lo que una alternativa al uso de los productos químicos, en el control de las
enfermedades de las plantas es el control biológico (Lindow y Wilson, 1998; Elad,
2000), mediante la utilización de microorganismos, como agentes de control. Las
especies de Trichoderma, que son cosmopolitas y habitan en todos los suelos y climas
del mundo (Nevalainen et al., 1994), muchas de ellas se consideran agentes de control
biológico de enfermedades causadas por hongos en las partes aéreas, en raíz de
plantas cultivadas y enfermedades postcosecha (Weindling, 1932; Chet, 1987; Jakobs
et al., 1991; Nevalainen et al., 1994; Sivakumar et al., 2000).
El control biológico, se define como una condición bajo la cual la actividad o
supervivencia de un fitopatógeno es reducida, a través de un organismo vivo (excepto el
hombre), como resultado de la reducción en la incidencia y/o severidad de la
enfermedad causada por el patógeno (Garret, 1965).
El éxito del control biológico de agentes fitopatógenos de partes aéreas de las plantas
es escaso, bajo condiciones naturales, posiblemente, porque en este tipo de habitat
afectan varios factores varios factores, como son, las condiciones climáticas y un
habitat adecuado para el crecimiento e invasión de los agentes de control, para que
afecten al fitopatógeno que se desea controlar, además de que es necesario, conocer
los mecanismos de acción de los organismos benéficos (Andrews, 1990).
Una estrategia en el manejo de enfermedades aéreas y de fruto de las plantas, es la
introducción de antagonistas efectivos, utilizando métodos de manejo adecuados, para
mantenerlos en el ecosistema (Stack. et al., 1988). Es posible la utilización de agentes
de control biológico contra fitopatógenos que causan enfermedades en el follaje y fruto
de varios cultivos, aún en enfermedades explosivas del follaje (Sutton y Peng, 1993).
Los mecanismos de acción por los cuales los agentes de control biológico afectan a los
fitopatógenos son: la antibiosis, micoparasitismo y competencia (Papavizas, 1985;
Fravel, 1988; Ordentlich, 1992; Bélanger et al., 1995; Benhamou y Chet, 1997). Estos
mecanismos no son mutuamente excluyentes, por lo que mientras uno parece ser el
principal, en realidad pueden actuar en conjunto (Jensen, 1995). En lo que respecta a
los fitopatógenos de las partes aéreas, se pueden considerar al micoparasitismo
(Benhamou y Chet, 1993) y la antibiosis (Bélanger al et., 1995).
La competencia se da principalmente por espacio o factores nutricionales limitantes, como pueden ser: carbono y nitrógeno; ya que los requieren para germinar, penetrar e infectar el tejido (Inbar. y Chet, 1997).
La antibiosis se da a través de la producción metabólica de pequeñas moléculas
tóxicas volátiles y de enzimas hidrolíticas (Baker y Griffin, 1995) como son quitinasas,
glucanasas, lipasas y proteasas; las cuales se inducen durante la acción parasítica,
entre especies de Trichoderma y algunos hongos fitopatógenos (Roberts y Lumsden,
1990; Carsolio et al., 1999); las enzimas disuelven o dañan polímeros estructurales,
como quitina y glucanos de la pared celular de lo hongos fitopatógenos, produciendo un
efecto adverso sobre su desarrollo (Goldman et al., 1994).
La producción de enzimas hidrolíticas por especies de Trichoderma depende de la
composición del medio donde se desarrolla (Tronsmo y Harman, 1992); así, se ha
demostrado que estas enzimas inhiben el crecimiento de algunos hongos
fitopatógenos, entre ellos Phythium aphanidermatum (Edson) Fitzp (Sivan et al., 1984).
Lorito et al. (1994) reporta efectos inhibitorios de enzimas quitinolíticas y glucanoliticas
de T. harzianum sobre la germinación de esporas de B. cinerea conforme se
incrementa la concentración enzimática.
La habilidad de Trichoderma para reducir los daños en enfermedades causadas por
hongos fitopatógenos esta relacionada por su fuerte capacidad competitiva (Ahmad y
Baker, 1987; Nelson et al., 1988), de antibiosis (Ghrisalberti y Sivacithamparam, 1991)
y la producción de enzimas hidrolíticas (Lorito et al., 1993). Este hongo ha demostrado
buenos resultados contra enfermedades aéreas (Dubos 1987; Melo, 1991), inclusive,
se tiene en el mercado formulaciones a base de Trichoderma para el control de
diferentes enfermedades (Samuel, 1996; Wilson 1997; Elad, Y. 2000). Sin embargo no
se conoce el mecanismo de acción de éste hongo sobre M. fijiensis.
El micoparasitismo de Trichoderma; es un proceso complejo el cual involucra una serie
de eventos que resulta en la muerte de las hifas de los fitopatógenos. Este proceso
inicia con el crecimiento trófico del agente de control biológico hacia el fitopatógeno,
posteriormente las hifas de Trichoderma se enrollan sobre las hifas de este y disuelven
su pared celular, por la activación de enzimas hidrolíticas, las cuales están asociadas
con la penetración física de la pared celular (Chet, 1987; Carsolio et al., 1999) y
finalmente, ocasionan la muerte del fitopatógeno (Lo et al., 1998).
Dado que las especies de Trichoderma atacan a las hifas del hospedero por
enrollamiento, enganchado o aprisionamiento de las estructuras y penetra en la pared
celular del hospedero, por secreción de enzimas líticas como son proteínasas básicas
(Geremia et al., 1993), ß-1,3- glucanasas y quitinasas (Elad et al., 1983), la actividad
antifúngica de las enzimas quitinolíticas, tiene un papel importante en la lisis de la pared
celular de los hongos fitopatógenos (Zhang y Yuen, 2000).
Se encuentran reportes de la presencia de micoparasitismo de T. harzianum, T.
koningii, T. viride, T. longibrachiatum y T. hamatum sobre Rhizoctonia solani, Botrytis
cinerea, Sclerotium rolfsii, Phytium aphanidermatum, Phytophthora capsici Leonina,
penetrandolos y causando lisis del micelio (Naár y Kecskés, 1995; Stefanova y
Sandoval, 1995). Existe evidencia de que el ingreso de Trichoderma a células de
hospederos, está asociado con una serie de eventos de degradación, que incluyen
retracción del plasmalema, desorganización generalizada del citoplasma y por último,
pérdida completa de protoplasma, lo cual trae nuevos entendimientos a los modos de
acción exactos del parasitismo por el antagonista (Benhamou y Chet, 1996).
Las especies T. harzianum y T. virens son las mayormente citadas en el control
biológico (Papavizas, 1985; Chet, 1987). Diferentes especies de Trichoderma han sido
utilizadas en preparados comerciales como es; RootShield, para el control de
enfermedades en tomate y pepino; Trieco, para el control de fitopatógenos de café,
cítricos, uva, chile, algodón y tabaco; Trichodex 20 SP, para el control de enfermedades
en los cultivos de uva, tomate y pepino (O’neill et al., 1996; Fravel et al., 1999; Elad,
2000); F-Stop en el control de enfermedades en cultivos de tomate (Datnoff et al.,
1995).
Trichoderma spp. es un agente que muestra gran capacidad para el control de
fitopatógenos, este ejerce efecto antagónico, ya sea por antibiosis, micoparasitismo o
competencia; pero no se cuenta con antecedentes del efecto que pueda ejercer sobre
el hongo M. fijiensis, por lo que es necesario conocer el o los mecanismos de acción
que puedan estar involucrados en la interacción de estos hongos, para generar
información básica que nos de elementos para investigaciones posteriores, en el
control biológico de M. fijiensis.
Con base en lo anterior se plantea la siguiente pregunta: ¿Las cepas nativas del género
Trichoderma spp. producen enzimas hidrolíticas capaces de inhibir el crecimiento y
parasitar el micelio de M. fijiensis?.
Basado en toda esta revisión se considera que la posible respuesta es la siguiente
hipótesis:
Hipótesis: Las especies nativas de Trichoderma tienen capacidad para producir glucanasas y
quitinasas, reducir el crecimiento y micoparasitar el micelio del hongo M. fijiensis,
agente causal de sigatoka negra en plátano.
Objetivos: * Evaluar la producción de glucanasas y quitinasas de 22 cepas nativas de
Trichoderma spp.
* Evaluar el grado de antibiosis por glucanasas y quitinasas por cepas nativas de
Trichoderma, sobre el crecimiento del micelio de M. fijiensis in vitro.
* Evaluar el micoparasitismo de diferentes cepas nativas de Trichoderma sobre el
hongo M. fijiensis.
II. ANTECEDENTES 2.1 Control biológico de patógenos en plantas.
El control biológico es el decremento de inóculo o de la actividad de un patógeno, por la
acción de uno ó más organismos, incluyendo la planta hospedera, pero excluyendo al
hombre. Este término fue utilizado en relación con los fitopatógenos de plantas por von
Tubeuf en 1914, y para insectos por Smith en 1919, con la amplia interpretación
simplísta del control de un organismo por otro, sin tomar en cuenta al hombre (Baker,
1987). Los agentes de control biológico juegan un papel importante en la protección de
cultivos, como parte de los esquemas de manejo integrado de plagas (Deacon y Berry,
1992).
Para ser efectivo, el control biológico de enfermedades en las plantas depende no
solamente de organismos apropiados para el control biológico, sino también de los
métodos y estrategias, para introducir y mantener al agente en el cultivo (Stack et al.,
1988). Además, se introduce al antagonista cuando hay necesidad de una mayor
efectividad y su población no necesita ser más grande que aquella que suprime
adecuadamente el inóculo primario del patógeno o el progreso de la enfermedad
(Berger, 1988).
2.2 Control biológico de enfermedades en partes aéreas de las plantas.
Los patógenos pueden atacar cualquier parte de la planta; sin embargo,
individualmente pueden ser altamente especializados. Como consecuencia, el rango de
patógeno establecido, sobre diferentes hospederos, muestra también considerable
diversidad, que puede estar asociada con la historia evolutiva de sus hospederos (Clay,
1995).
Las plantas en la naturaleza están cambiando constantemente como respuesta a la
acción de los microorganismos patógenos. En algunos casos, sus mecanismos de
protección involucran mecanismos de defensa inducidos. La habilidad de la planta de
expresar algunas reacciones de defensa, se supone están mediadas por procesos de
reconocimiento entre la planta y los patógenos; dichas reacciones involucran la
detección de ciertas señales moleculares, únicas de fitopatógenos incompatibles;
moléculas receptoras en plantas, con una subsecuente cascada de eventos
bioquímicos, que conducen a la expresión de resistenc ia, tales como: las fitoalexinas
antimicrobianas, la síntesis de enzimas hidrolíticas antifúngicas como quitinasas y
glucanasas; refuerzos de la pared celular al sitio de infección, a través del incremento
de la síntesis y deposisión de hidroxiprolina, calosa, lignina y compuestos fenólicos.
Todos estos procesos contribuyen a los múltiples sistemas de defensa de las plantas
(De Ascensao y Dubery, 2000).
Los enfoques para el control biológico de fitopatógenos sobre las superficies aéreas
son revisados extensivamente en los últimos 20 años (Andrews, 1992) y estas, están
concentradas sobre el uso de un simple agente de control biológico, seleccionado
empíricamente, para antagonizar con un patógeno simple (Wilson, 1997).
En un cultivo susceptible, el incremento de parásitos foliares durante la temporada de
crecimiento, a menudo es determinado por factores climáticos, particularmente,
duración de la humedad y temperatura del aire (Duthie, 1997). El control biológico
trabaja bajo condiciones ambientales diferentes, protegiendo algunos cultivos, así como
controlando varios patógenos de plantas (Chet, 1987). Sin embargo, un número de
agentes de control biológico puede ser selectivo, por su actividad contra patógenos en
diferentes cultivos, porque las características de supervivencia, de estos agentes,
pueden estar fuertemente influenciados por los factores ambientales específicos del
cultivo (Baker y Cook, 1974). Para utilizar los agentes de control biológico con éxito,
para el control de enfermedades, es crucial que su biología y ecología sean
completamente entendidas (Papaviza, 1985). Además de ésto, el tejido necrótico de
diferentes cultivos puede tener efectos diferenciales sobre la manifestación de cada
agente. La densidad de población del antagonista en los substratos necróticos
necesarios para conseguir suficientes niveles de control y la distribución de las
aplicaciones del antagonista, puede depender esencialmente del mecanismo de control
de dicho antagonista (Lo et al., 1998; Köhl et al., 1997).
Trichoderma se está evaluando para el control de enfermedades en partes aéreas de
plantas y de almacén, como tizones, manchas foliares, royas, cenicillas, mildius y
pudrición de fruto, lo cual involucra a los géneros de los hongos Phytium, Botrytis,
Rhizoctonia, Penicillium, Rhizopus, Colletotrichum y Venturia, entre otros (Castoria et
al., 1997; Thrane et al., 1997; Benhamou et al., 1999; Elad, 2000; Carisse et al., 2000).
2.3 Género Trichoderma
El género Trichoderma constituye un número de especies de hongos saprofíticos,
comúnmente establecidos en el suelo, sobre madera en descomposición y restos de
plantas (Jensen y Wolffhechel, 1995; Smith, 1995); los cuales pueden ser fácilmente
reconocidos en cultivos por sus características esporas de color verdes. Aúnque la
identificación del género Trichoderma es relativamente fácil, la identificación de las
especies no es simple (Chet, 1987). El género lo propuso Person en 1794 con cuatro
especies; Rifai (1969) divide a Trichoderma en nueve especies; posteriormente Bisset
(1984, 1991a, 1991b, 1991c) eleva algunas de las especies agregadas por Rifai a
rango de secciones, agrupandolas en Trichoderma, Longibrachiatum, Pachybasium y
Hypocreanum; actualmente se tienen alrededor de 75 especies descritas (Samuels,
1996).
Las formas perfectas son generalmente asignadas a la orden Hypocreales, Eurotiales,
Clavicipitales y Sphaeriales, determinadas especies del género Hypocrea, pueden
tener algunas diferentes Trichoderma como estado anamorfas. De esta manera
Trichoderma harzianum Rifai corresponde a seis diferentes formas sexuales, aunque
ciertas de estas formas sexuales pueden tener otras anamorfas, como es Trichoderma
viride Pers (Leuchtmann et al., 1996).
A pesar de su importancia económica, la taxonomía del género es aún problemática y
los estudios están basados en la morfología (Samuels, 1996), se intenta mejorarla
utilizando acercamientos moleculares, incluyendo huellas y análisis de secuencia (Kuhls
et al., 1997).
Como se espera de los hongos saprofíticos del suelo, las especies de Trichoderma
utilizan un amplio rango de compuestos como fuentes de carbono y nitrógeno. Los
requerimientos de carbono y energía de Trichoderma pueden ser satisfechos por
monosacáridos, disacáridos (Danielson y Davey 1973), polisacáridos complejos,
purinas, pirimidinas y aminoácidos (Tye, 1973), taninos condensados y catechinas
(Arrieta-Escobar, 1982).
Las características del género son conidióforo hialino muy ramificado no verticilado,
fiálides individuales o en grupos, conidios hialinos de una célula, ovoides nacidos en
pequeños racimos terminales (Barnett y Hunter, 1972). Los conidióforos no están bien
definidos y los conidios tienden a acumularse dentro de masas pulvinadas (Samuels,
1996).
2.4 Mecanismos involucrados en el control biológico de fitopatógenos por
especies de Trichoderma.
El género Trichoderma como agente de control biológico actúa contra los
fitopatógenos en forma de antagonistas por parasitismo, competencia, antibiosis o por
una combinación sinergística de estos modos de acción (Ordentlich et al., 1992;
Goldman et al., 1994; Bélanger et al,. 1995; Benhamou y Chet, 1997; Haíssam Jijakli y
Lepoivre, 1998; Hermosa et al., 2001).
2.4.1. Antibiosis como mecanismo de control biológico.
La producción de metabolitos inhibidores por agentes de control biológico fúngicos se
ha introducido en la literatura en las últimas cinco décadas (Ordentlich et al., 1992;
Dennis y Webster, 1971a; Papavizas, 1985; Ghisalberti y Sivasithamparam, 1991;
Cooney y Lauren, 1999). Handelsman y Parke (1989) y Chet et al., (1997) restringen la
definición de antibiosis, para las interacciones que involucran compuestos difusibles de
bajo peso molecular o a un antibiótico producido por un microorganismo que inhibe el
crecimiento de otro microorganismo; esta definición excluye proteínas o enzimas que
pueden matar patógeno. Beker y Griffin (1995) extienden el espacio de la definición a la
inhibición o destrucción de un organismo por la producción metabólica de otro, de este
modo incluyen pequeñas moléculas tóxicas, volátiles y enzimas hidrolíticas (Inbar y
Chet, 1997).
En adición, modernos instrumentos de genética microbiana y análisis químicos tienen la
evidencia de la antibiosis como un mecanismo de control biológico; además de que los
antibióticos han sido aislados de diferentes especies de Trichoderma y cuantificados
por cromatografía de capa fina y HPLC (Rodríguez y Pfender, 1997; Pavlovicova, 1998;
Horvath et al., 1995; Cooney y Lauren 1999).
Los antibióticos y otros metabolitos secundarios son productos naturales y pueden
tener una multitud de funciones de supervivencia en la naturaleza, dentro de los
metabolitos producidos por las especies de Trichoderma se encuentran Pachibasin,
la cual pertenece al grupo de los Octacetidos; Trichodermin , la cual pertenece al
grupo de Monoterpenos o Trichothecanos; Trichorzianinas, los cuales son los
metabolitos antifúngicos mayormente solubles, las Trichorzianinas localizadas sobre
las esporas, pueden mantener su actividad fúngica por períodos prolongados (de 3 a 4
meses); Gliotoxin, la cual presenta una potente actividad antibiótica contra bacteria y
hongos (Howell et al, 2000); Viridiol; Furanone; (Pavlovicova, 1998; Horvath et al.,
1995; Ordentrlich et al., 1992; Cooney et al., 1999); Gliovirin es un antibiótico del grupo
de las dicetopiperacinas el cual actúa destruyendo al hongo Pythium ultimum
causando coagulación del protoplasma (Chet et al., 1997; Howell et al., 2000). Estudios
han demostrado la correlación entre la efectividad de especies de Trichoderma para
controlar enfermedades de plantas y su habilidad para producir metabolitos de pyrona
(Ghisalberti et al., 1990; Worasatit y Sivasithamparam, 1990; Worasatit et al., 1994).
El 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one (6PAP) es un policétido conocido por ser tóxico a un gran
número de patógenos de plantas; presenta un aroma característico a coco; ha
mostrado ser promisorio tanto in vitro como in vivo en la mayoría de hongos
patógenos, que afectan los cultivos, como especies de Armillaria, Botrytis y
Phytophthora; tiene la ventaja de ser de baja toxicidad para los mamíferos; ha sido
aprobado para uso en alimentos por la USFDA y está siendo evaluado actualmente
como un fungicida natural. El 6PAP puede ser preparado sintéticamente en laboratorio
o vía fermentación con especies de Trichoderma, con rendimientos de 0.58 a 1 g/L, a
través de diferentes métodos y especies del hongo (Cooney et al., 1997); por lo general
se recomienda un medio de cultivo enriquecido con aceite de castor, para obtener los
mejores rendimientos (Serrano-Carreón et al., 1997). También, se ha demostrado que
el 6PAP tiene efecto in vitro sobre Cylindrocladium floridanum Sob.&C.P. Seym,
sobre el crecimiento de micelio, a concentraciones de 1000 µg/ml (Dumas et al., 1996).
Se conocen tres categorías de compuestos antibióticos volátiles producidos por T.
harzianum el 6-pentyl-pyrone (6PAP) y la mayoría de los compuestos de la clase
isocyanide, materiales solubles en agua (Ghisalberti y Sivasithamparam, 1991) y
peptaibol, el cual consiste de péptidos hidrofóbicos; estos compuestos son péptidos
con 7 a 20 residuos de amonoácidos, con un N terminal acetilado y la presencia de un
amino alcohol, como leucinol (Leuol), valinol (Valol), tryptophanol (Trpol) o phenylalanilol
(Pheol), al carbono terminal. Sin embargo un alto contenido de ácido a-aminoisobutírico
e isovalina es un peptaibol feature; Los subgrupos más conocidos de la familia del
peptaibol son; paracelsins, alamethicins, hypelcins, suzukacillins y trichorzianines
(Ritieni et al, 1997); las trichorzianines son una mezcla de nonadecapeptidos producido
por T. harzianum (El Hajji, 1987); estos péptidos interaccionan con las membranas
lipídicas de los fitopatógenos y modifican su permeabilidad (El Hajji et al., 1989;
Correa et al., 1995); además de que presentan actividad in vitro contra B. cinirea
(Ritieni et al., 1997).
Se ha demostrado que hay una fuerte relación entre la producción de 6PAP por T.
harzianum y la habilidad del hongo de inhibir la germinación de esporas de F.
oxysporum (Scarselletti y Faull, 1994) y el crecimiento de micelio de R. solani (Fravel,
1988). El 6PAP producido por T. koningii juega un papel importante en el control de
Rhizoctonia en trigo. El control de B. cinerea por 6PAP en el almacenamiento de frutos
de kiwi ha sido investigado (Poole y Whitmore, 1997; Poole et al., 1998); el análisis
cualitativo y cuantitativo de este metabolito producido por diferentes especies de
Trichoderma es importante para posibilitar la selección de cepas biológicamente
activas (Pezet et al.,1999).
Las quitinasas son homopolímeros no ramificados de [1,4 (N-acetilglucosaminidasa)
glucanohidrolasa] son proteínas abundantes encontradas en una gran variedad de
semillas y hay una fuerte evidencia de que son proteínas de defensa con actividad
antifúngica (Margolles-Clark et al., 1996). Las glucanasas son enzimas que hidrolizan
los enlaces glucosídicos de las cadenas de los glucanos, las cuales han sido
caracterizadas de hongos, plantas y bacteria (Pan et al., 1992).
La quitina y ß-1,3 glucano son elementos estructurales importantes de la pared celular
de la moyoría de los hongos y puede representar el sustrato natural de las dos
hidrolasas de plantas (Mauch et al., 1988; Alfonso et al., 1995; El Tarabily et al., 2000).
En respuesta al ataque de patógenos, las plantas activan una variedad de defensas
que incluyendo enzimas, que hidrolizan la pared celular de los hongos patógenos y se
presume que juegan un papel muy importante en la respuesta de defensa de las plantas
(Ji y Kuc, 1996; Annis y Goodwing, 1997; Bolar et al., 2000). La capacidad de producir
enzimas degradadoras de la pared celular es común en una gran cantidad de hongos
saprofíticos. Más del 10% de 160 hongos examinados producen ß-1,3-glucanasa
(Chesters, 1963). En el micoparasitismo, el hospedero puede ser primero debilitado,
simultáneamente por metabolitos tóxicos, que incluyen enzimas (Barnett y Binder 1973).
En los años pasados, algunos autores han debatido el papel de las moléculas
antifúngicas en los procesos antagonistas (Deacon, 1991); sin embargo, la producción
de enzimas extracelulares degradadoras de la pared celular, como son quitinasas y
glucanasas ha sido considerada el principal mecanismo, involucrado en el control
biológico de patógenos fúngicos por especies de Trichoderma (Lorito et al, 1993 a y b;
Santamaría et al., 1994; Santamaría et al., 1995; Boland, 1990; Bolar, 2000).
La evidencia, que sugiere el papel de las quitinasas en la defensa de las plantas, se ha
basado en el dramático y rápido aumento de nivel de enzimas en reacciones
hipersensitivas, durante la resistencia sistémica inducida y los seguimientos de
infección de tejido por el patógeno; las quitinasas también pueden ocasionar
indirectamente reacciones de defensa de la planta, porque los fragmentos liberados de
pared celular fúngica, por digestión enzimática, pueden actuar como inductores en la
biosíntesis de formación para la acumulación de compuestos fenólicos y ligninas en las
células (Schlumbaum et al, 1986).
Los tejidos, en los cuales las quitinasas se acumulan, pueden influenciar su papel
potencial, en las respuestas de defensa; las quitinasas extracelulares, podría esperarse
que tubieran un papel inicial limitando el crecimiento del patógeno a la entrada de las
hifas al hospedero, con quitinasa vacuolar con un efecto secundario o demorando el
efecto de la lísis celular (Punja y Zhang, 1993). El sistema quitinolítico de un aislado de
Trichoderma (aislado TM), está compuesto de dos ß-1,4-N- acetilglucosaminidasa y
cuatro endoquitinasas, la enzima individual más interesante del complejo es la
endoquitinasa (42-kDa), la cual puede hidrolizar in vitro la pared celular de B. cinerea e
inhibir la germinación de esporas y del tubo de elongación de varios hongos (Carsolio
et al., 1999). Las quitinasas también pueden liberar iniciadores de la pared celular, e
inducir varias respuestas de defensas en las plantas (Velazhahan et al., 2000).
Lorito et al., (1994) reporta la purificación de dos enzimas adicionales de T. harzianum,
degradadoras de la pared celular; la N-acetyl-ß-glucosaminidase y ß-1,3-glucanasa
(glucan 1,3-ß-glucosidasa) y encontraron un efecto inhibitorio sinérgico, sobre la
germinación y elongación del tubo germinativo de B. cinerea, cuando dos, tres o cuatro
enzimas son aplicadas juntas.
Dado que las especies de Trichoderma atacan a las hifas del hospedero por
enrollamiento, enganchado o aprisionamiento de las estructuras y penetra en la pared
celular del hospedero, por secreción de enzimas líticas como son proteínasas básicas
(Geremia et al., 1993), ß-1,3- glucanasas y quitinasas (Elad et al., 1983), la actividad
antifúngica de las enzimas quitinolíticas, tiene un papel importante en la lisis de la pared
celular de los hongos fitopatógenos (Zhang y Yuen, 2000). Lorito (1993) evalúa la
actividad de chitobiosidasa y endochitobiosidasa purificada de T. harzianum cepa P1,
sobre la inhibición de la germinación de esporas y elongación del tubo germinativo,
para conocer el nivel de actividad antifúngica contra diferentes especies de hongos y
encuentra que ambos procesos son inhibidos en todos los hongos que contienen
quitina, y que el grado de inhibición es proporcional a los niveles de quitina en la pared
celular de los hongos evaluados. Este autor observa que la combinación de actividades
de endoquitinasa y chitobiosidasa resulta en un incremento sinergíco, las mezclas de
enzimas hidrolíticas y observa, que modos de acción complementaros son necesarios
para maximizar la eficiencia y combinaciones correctas de enzimas pueden
incrementar in vitro la actividad antifúngica (Lorito et al., 1994).
Los resultados muestran que el sistema quitinolítico de T. harzianum no está regulado
por un simple mecanismo de encendido/apagado; si no que está fundamentado, que
los efectos de regulación de quitinasas específicas del hospedero, durante las
interacciones micoparasíticas y que la regulación de varias N-acetylglucosaminidasas y
endochitinasas, es el resultado de un proceso magnificamente establecido. Estudios in
vitro con enzimas quitinolíticas purificadas de T. harzianum muestran un efecto directo
antifúngico de estas enzimas y sinergismo. Este efecto es reportado cuando se utilizan
combinaciones de enzimas, con modo de acción complementario (Haran et al., 1996).
Por lo general, después de la adhesión de las hifas de Trichoderma, a las células de R.
solani, se lleva a cabo una secuencia de eventos de degradación, que incluyen
alteración de la pared celular del hospedero, retracción de la membrana plasmática y
agregación del citoplasma. La observación de que la cantidad de residuos de N-
acetylglucosamina decrece significativamente, en las partes exterior de la cavidad de la
pared de R. solani, lo que correlaciona con la idea de que Trichoderma spp. exhibe la
habilidad de producir quitinasa (Chet, 1987).
La evidencia de una gradual difusión de enzimas hidrolíticas en donde la alteración de
residuos de N-acetylglucosamina ocurre tempranamente y a un alto nivel en los
exteriores que en los interiores de las cavidades de la pared del hospedero. De esta
manera, es posible que una producción gradual de quitinasa por Trichoderma sea
requerida, para la penetración a través de una desorganizada pared celular del
hospedero (Roby et al., 1988). Algunos autores indican que la actividad antagonística
de Trichoderma spp. está relacionada principalmente con la liberación de enzimas
líticas (Tronsmo y Harman, 1992), las cuales son responsables de la degradación de la
pared celular de algunos hongos patógenos (Sivan y Chet, 1989; Lalaoui et al., 2000).
Sin embargo, las quiitinasas pueden no ser las únicas enzimas responsables de la
degradación de la pared celular, por lo que es probable que la acción coordinada de
algunas hidrolasas, por ejemplo ß-1,3-glucanasas, lipasas y proteasas se requiere para
una disolución completa de la pared celular (Benhamau y Chet, 1993).
Mauch et al., (1988) demuestran que las quitinasas y ß-1,3 glucanasa inhiben el
crecimiento de hongos fitopatógenos, a concentraciones que oscilan entre 10 y 30
µg/ml, estas concentraciones de enzimas corresponden a un cuarto o menos de la
cantidad presente en planta de chicharo, lo que indica que la inhibición puede ocurrir
bajo condiciones fisiológicas.
2.4.2 Competencia como mecanismo de control biológico.
Garrett (1965) señala que la causa de muerte más común en microorganismos es por
inanición. Algunos patógenos de plantas requieren nutrientes exógenos, para germinar
prósperamente, después penetran e infectan el tejido hospedero (Inbar y Chet, 1997).
Por lo tanto, la competencia por factores nutricionales limitantes, como carbono,
nitrógeno o hierro, pueden resultar en el control biológico de fitopatógenos (Haïssam-
Jijakli y Lepoivre, 1998). Las reportes tienen registros sobre la competencia en
agentes bacteriales por hierro; en este aspecto, los antagonistas fúngicos han recibido
muy poca atención.
El potencial de un microorganismo aplicado a una semilla, como tratamiento para
proliferar y establecerse el mismo, a lo largo del sistema radicular ha sido llamado
competencia de la rizósfera (Ahmad y Baker, 1987). La competencia por carbono y
nitrógeno en la rizósfera, así como la competencia de rizósfera, se ha sugerido para
estar involucrados en el control biológico de F. oxysporum por T. harzianum cepa T-35
(Sivan y Chet, 1989); sin embargo, se hacen necesarios más estudios en este campo.
2.4.3 Micoparasitismo como mecanismo de control biológico.
El micoparasitismo es un proceso complejo que incluye diversos pasos sucesivos. La
interacción inicial detectable muestra que las hifas del micoparásito crece directamente
hacia el hospedero (Chet et al., 1981). Este fenómeno se manifiesta, como un
crecimiento quimiotrópico de Trichoderma, para algunos estímulos en las hifas del
hospedero o hacia un gradiente de excretas químicas por el hospedero (Chet y Elad,
1983).
Cuando un hongo micoparasítico ataca directamente a un hongo fitopatógeno
(hospedero) en un sistema biótico, éste es considerado como micoparásito. Barnett y
Binder (1973) dividen el micoparasitismo, de acuerdo a la utilización de nutrientes
como: (1) parasitismo necrotrófico (destructivo), en el cual, la relación resulta en la
muerte o destrucción de uno o más componente del hospedero, y (2), parasitismo
biotrófico (balanceado) en el cual el desarrollo del parásito es favorable para vivir antes
de que muera la estructura del hospedero.
El término hiperparasitismo, algunas veces es utilizado para describir a un hongo que
es parasítico de otro hongo antagonista. Como resultado la mayoría de los
micoparasitos utilizados como agentes de control biológico en invernaderos o en fincas
han sido necrotróficos (Adams, 1990; Chet, 1987; Baker, 1987). La actividad
antagónica de micoparásitos necrotróficos es atribuida a la producción de antibióticos,
toxinas o enzimas hidrolíticas, en cantidades que causan la muerte o destrucción de sus
hospederos (Manocha, 1991).
Las investigaciones sobre micoparasitismo, como un mecanismo de control biológico
levanta dos preguntas adicionales: ¿es necesario el contacto físico para la destrucción
del hospedero? y, ¿de que manera participan las enzimas y otros compuestos
extracelulares en el micoparasitismo?. Pachenari y Dix (1980), reportan que cultivos de
Botrytis allii parasitados con G. roseum contienen cantidades considerables de
quitinasas y glucanasas, además, la coagulación del citoplasma ocurrió sin contacto
físico de los dos hongos. En sus evaluaciones, Lorito et al., (1994) utilizan
preparaciones de glucanasas, las cuales degradan el glucano del hospedero.
Cuando el micoparásito llega al hospedero, las hifas se enrollan alrededor o son
apegadas al hospedero y algunas veces penetran en el (Carsolio et al., 1999). T.
hamatum es capaz de producir apresorios en los puntos de las ramificaciones cortas
de las hifas. Siguiendo estas interacciones, el micoparásito penetra el micelio del
hospedero, aparentemente por parcial degradación de la pared celular (Elad et al.,
1983). Utilizando la técnica de microscopía electrónica de barrido se observa que T.
harzianum establece un contacto estrecho con el hospedero por enrrollamiento de las
hifas. El enrollamiento es generalmente muy denso y aparece envolviendo
apretadamente las hifas de R. solani. Después de cuatro días, el antagonista se
multiplica abundantemente y el enrrollamiento persiste, tempranamente se observan
signos de deformación, como las aparentes arrugas mostradas por las células de la
superficie del hospedero. Deformaciones pronunciadas y pérdida de turgencia de hifas
de R. solani es la más típica característica de alteración que se observaron después
de seis días de inoculación (Bélanger et al., 1995).
De acuerdo a observaciones realizadas por Benhamou y Chet (1996), la
desorganización citoplasmática de la célula del hospedero, con frecuencia ocurre en
avance de contacto físico con T. harzianum, lo que sugiere que los compuestos son
difusibles y responsables de las disturbancias observada. En todas las muestras
examinadas, las penetraciones de hifas del antagonista, dentro de la corteza de las
células, es rara vez asociada con marcadas alteraciones de la pared celular del
hospedero.
Observaciones ultrastructurales de una sección de sclerotia parasitada proveé
evidencia de, que el ingreso de Trichoderma está asociado con una serie de eventos
de degradación, incluyen retracción del plasmalema, desorganización generalizada del
citoplasma y por último, pérdida completa de protoplasma en células del hospedero
melanizada y no melanizada (Benhamau y Chet, 1996), estos resultados confirman
observaciones anteriores sobre la habilidad de Trichoderma, para inducir prolongados
daños citoplasmáticos, cuando invaden celulas escleróticas (Elad et al., 1984), y traen
nuevos entendimientos a los modos de acción exactos del parasitismo por el
antagonista. Estas obsevaciones del estudio ultraestructural y citoquímico proveen
indirecta evidencia de que una molécula de galactosa es un determinante en la relación
micoparasítica de T. harzianum y R. solani.
La observación de que cambios celulares marcados, como es la retracción de la
membrana plasmática y agregación del citoplasma, ocurre en las células de R. solani
durante los procesos micoparasíticos; permite la propuesta de una pregunta ¿Cómo se
involucra la antibiosis, mediante la acción enzimática, en la degradación de las células
del hospedero?. T. harzianum puede excretar metabolitos tóxicos o enzimas que
interfieran con la membrana plasmática y causa alteraciones en la permeabilidad y
susceptibilidad. Sin embargo, una desorganización de la estructura de la pared celular,
debido a la hidrólisis de los compuestos de los límites de la pared, también puede
promover desequilibrios osmóticos internos, que lleva a desórdenes intracelulares
(Benhamau y Chet., 1993; Di Pietro et al., 1993).
Investigaciones al microscopio electrónico de barrido, de la región de interacción entre
ambos hongos, demuestran que los daños a las hifas de R. solani comienzan a
aparecer después del enrrollamiento de Trichoderma alrededor del hospedero. Estas
investigaciones proveen evidencia soportando la suposición de, que el resultado de la
interacción es posiblemente determinado por un contacto inicial firme del antagonista al
hospedero, el cual conduce a una serie de eventos en la degradación del patógeno. La
rápida deformación y la pérdida de turgencia de las hifas de R. solani sugieren, que
Trichoderma produce sustancias antifúngicas en respuesta, una vez que el contacto
entre ambas partes se establece (Benhamou y Chet, 1993). Observaciones al
microscopio electrónico muestran que las células de Trichoderma envuelven y
establecen contacto cerrado con el micelio del hospedero.
2.5 Importancia y distribución del cultivo de plátano.
Los plátanos son grandes monocotiledóneas herbáceas en la familia Musaceae del
orden Zingiberales. Los tipos comestibles son partenocárpicos y frecuentemente
infértiles, mientras que sus precursores ancestrales silvestres tienen semillas, son
virtualmente incomestibles y poseen pobres cualidades agronómicas. Todos los
bananos comestibles son híbridos ínter o intraespecíficos naturales de dos especies
diploides: Musa acuminata Colla y Musa balbisiana Colla (n = 11). Musa acuminata
es una especie diversa y hay al menos 9 subespecies descritas (banksii, burmannica,
burmannicoides, malaccensis, microcarpa, errans, siamea, truncata, zebrina). Musa
balbisiana es menos diversa y no hay subespecies descritas (Stover y Simmonds,
1987).
La mayoría de los tipos comestibles que son derivados de estas dos especies son
triploides (n = 33), aunque se conocen diploides y tetraploides. La ploidía y la
contribución relativa de ambas especies a una variedad dada es especificada por un
sistema de letras, donde la contribución haploide de M. acuminata y M. balbisiana es
anotada con una A o una B, respectivamente (Simmonds, 1976). Así los clones
triploides acuminata del subgrupo Cavendish se denominan por AAA, mientras que el
clon Burro Criollo (Bluggoe) que es un triploide híbrido de ambas especies con
participación doble de M. balbisiana se denomina ABB.
A diferencia de otros cultivos, hasta hace relativamente poco tiempo, no existían
híbridos sintéticos cultivados comercialmente a gran escala, producto de programas de
mejora genética, por lo que las principales plagas y enfermedades que afectan el cultivo
a escala comercial son el resultado de una larga coevolución con las principales
variedades en cultivo. Los bananos evolucionaron del Sudeste Asiático (AA,
Archipiélago Malayo y Nueva Guinea; AAA Malasia y las tierras altas de África);
mientras que los plátanos en la India y en menor medida en el archipiélago Malayo e
Islas del Sur del Pacífico (AB, grupo menor en India; AAB y ABB, centro principal en
India, grupo menor en Malasia; ABBB, se conocen algunos clones del sudeste Asiático
y Papua Nueva Guinea (Stover y Simmonds, 1987; Ploetz, 1994).
La historia de los cultivares de banano está íntimamente ligada a las de la poblacion
humana en los trópicos; es posible, que la domesticación del banano tuviera su inicio
en forma paralela con la agricultura de los cultivos alimenticios (Rowe y Rosales, 1996).
En la actualidad, los bananos se cultivan en todas las regiones tropicales del mundo, en
regiones que tienen suficiente agua y en 30° latitud N; Afríca, Islas del Pacífico, Centro
América y El Caribe, donde constituye una parte importante de la dieta básica para
millones de personas; se encuentra entre los más importantes cultivos básicos y
además, suministra una valiosa fuente de ingresos mediante el comercio local e
internacional (Okole y Schulz, 1997; Carlier et al., 2000).
Los bananos se cultivan en una superficie de 3,995,034 hectáreas, con una producción
anual de 64,627,049 toneladas métricas (FAO, 2001) de las cuales cerca de la tercera
parte es producida en cada una de las regiones de África, Ásia, El Pacífico, América
Latina y el Caribe (Jeger, 1996). Sólo el 10% de la producción entra al mercado
internacional y es un importante renglón económico para muchos países. El 90%
remanente se consume localmente, por lo que constituye un importante renglón
alimentario y de sustento de pequeños agricultores en muchos países de América
Latina, Asia y África, que lo consumen fresco, cocido, frito o en forma de cerveza
(Rowe y Rosales, 1996).
Además, en términos de valor bruto de producción, los plátanos son la segunda fruta
tropical más ampliamente consumida después de los cítricos (Musabyimana et al.,
2000). La mayoría de los productores son agricultores en pequeña escala, quienes
cultivan este producto, para consumo familiar o para los mercados locales (Fullerton y
Olsen, 1995); además de ser una fuente barata de energía y fácil de producir, los
plátanos son ricos en vitaminas A, B6, C y potasio (Simmonds, 1976).
México se encuentra en el octavo lugar de producción mundial con el 2.8% y una
superficie de 74, 818 ha del cultivo; los principales estados productores de plátano son;
Chiapas, Tabasco, Veracruz, Nayarit, Colima, Oaxaca, Guerrero y Jalisco (FAO, 2001;
Sagarpa, 2001).
2.6 La Sigatoka Negra enfermedad ocasionada por Mycosphaerella fijiensis M.
Los plátanos sufren el ataque de un grupo importante de enfermedades causadas por
hongos, bacterias, virus y nemátodos, que afectan de una forma u otra forma su
desarrollo normal y productividad. Alguna de ellas han tenido un fuerte impacto
económico, social y ecológico y han sido inclusive las causantes del abandono del
cultivo de variedades, agronómicamente ideales, que no han podido ser igualadas por
los híbridos provenientes de programas genéticos (Craenen y Ortiz, 1996).
El manchado de la hoja o sigatoka negra causada por M. fijiensis Morelet var difformis
Mulder y Stover (Stover y Simmonds, 1987), es la enfermedad más destructiva e
importante de los plátanos y bananos (Musa spp) en el mundo (Romero y Sutton, 1997
(b); Carlier et al., 2000). La presencia de sigatoka negra parece estar limitada para
áreas abajo de 1,200 msn, entre 700 y 1,200 msnm hay un equilibrio en la población del
patógeno, la usencia de sigatoka negra en regiones altas hace estas áreas
potenciales para la producción de plátano (Mouliom-Pefoura et al, 1996).
La Sigatoka Negra (M. fijiensis), se identificó por primera vez en las islas Fiji en 1964,
(Fullerton y Olsen, 1995) la primera aparición de la sigatoka negra fuera de Ásia se
realizó en el continente Americano, específicamente en el país de Honduras en 1972, y
el primer brote epidémico ocurrió en Honduras en 1974, de donde se diseminó a todos
los países de América Central, el Caribe y parte de América del Sur. La detección más
reciente de sigatoka negra fue en Bolivia, en Marzo y Junio de 1997 (Jacome y Schuh,
1992). Las áreas afectadas de este país Sudamericano representan el punto más
cercano de la enfermedad a las regiones productoras de Brasil (alrededor de 700 Km),
el cual es el único país libre de sigatoka negra en América (Tijerina, 1997).
En América Central, la sigatoka negra es por mucho la más dañina y costosa
enfermedad de los plátanos, teniendo el 27% de los costos de producción. El costo del
control químico de la enfermedad en América Central y América del Sur es de
aproximadamente $10 millones de dólares al año (Jeger, 1996).
El buen control de la enfermedad es necesario para la exportación de la fruta, ya que la
fruta que proviene de plantas infectadas tienden a madurar prematuramente y presenta
fruto de tamaño más pequeño de lo normal (Jeger, 1996; Nokoe y Ortiz, 1998). Se han
reportado pérdidas superiores al 33% de la producción en algunas plantaciones, donde
la enfermedad de sigatoka negra ha estado presente (Mobambo et al., 1993).
El hongo pertenece a la clase Ascomycete, género Mycosphaerella y especie fijiensis
Morelet [forma perfecta de Paracercospora fijiensis (Morelet) Deighton]. En la fase
sexual (Telemorfa) presenta pequeñas peritecias como puntos negros en el tejido
necrótico en la superficie y envés de la hoja; cada peritecio contiene 2 -4 ascas, en cada
una de las cuales hay 8 ascosporas; éstas son incoloras y 2 células, una más larga que
la otra y una delagada contracciónen en el septum; son fuertemente descargadas 10
minutos después de que la hoja se moja. A la forma asexual (Anamorfa) se le conoce
como Cercospora fijiensis y ahora se llama P. fijiensis forma racimos de 2-5
conidioforos cortos, que emergen a través de la estoma del envés de la hoja de estrías
jóvenes.
El hongo M. fijiensis causa una enfermedad explosiva; produce los dos tipos de
esporas, que son fácilmente diseminadas, conidias y ascosporas. Al presente se ha
publicado poca información sobre la epidemiología de M. fijiensis, la mayoría proviene
de observaciones en campo bajo infecciones naturales (Chuang y Jeger, 1987).
Estudios realizados en ambientes controlados, pueden hacer posible aislar los efectos
de factores específicos y quitar las presiones que se ejercen bajo condiciones de fincas
(Jacome y Schuh, 1992).
Las ascosporas son consideradas el origen de la mayor tasa inóculo de M. fijiensis
(Stover, 1980). Stover (1980, 1983) sugiere que temperaturas arriba de 21°C y la
presencia de una película de agua favorecen el rápido desarrollo de manchado de la
hoja; el rango de temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad es de 26 a
28°C. En un estudio previo Jacome et al., (1991) indica que las ascosporas requieren
agua libre o un ambiente cercano a la saturación, humedad relativa de 98-100 %, para
la germinación y crecimiento del tubo germinativo. Las conidias, al contrario, germinan
a un rango más amplio de humedad relativa (92-100 %). Las condiciones de Honduras
y Centro América, durante la época seca (febrero a mayo), no conducen a la infección
por ascosporas, durante este período. Los síntomas de enfermedad hacen su aparición
sobre hojas nuevas, si se consideran los bajos requerimientos de humedad relativa
para la germinación, la infección por conidios es la responsable del desarrollo de
enfermedad, durante la parte seca de la estación de crecimiento.
2.7 Síntomas de la enfermedad en el cultivo.
El hongo M. fijiensis induce manchas foliares con una subsecuente clorosis y reducción
en la asimilación neta del rango de luz en plantas de banano y plátano (Okole y Schulz,
1997). Esto lleva al decremento de la capacidad fotosintética y a la prematura
maduración de la fruta sobre la planta (Ramsey et al., 1990).
La caracterización de la evo lución de los síntomas de sigatoka negra ha sido realizada
por diferentes autores (Rhodes, 1964) con material de Fiji; Meredith y Lawrence, (1969)
de Hawaii; Stover y Dickson, (1976) en Honduras; Mulder y Stover, (1976) con material
de diferentes procedencias; Fouré, (1982) en Gabón. De acuerdo a los criterios de
Fouré (1982) las características de los síntomas son conocidos por diferentes estados
de desarrollo de la infección, ellos son:
Estado 1: Aparecen unas pequeñas puntuaciones (pecas) de forma irregular y difusas,
de color amarillo pálido, de un diámetro aproximado de 0.2 mm, solo
perceptibles en el envés de las hojas. Esta puntuación amarilla no es siempre
visible y pasa usualmente inadvertida. No es tampoco claramente visible en
muchos clones. Cuando las condiciones son muy favorables al desarrollo de la
enfermedad, éstas pueden aparecer en la hoja 2 (contando la última hoja
abierta como la hoja 1). Casi siempre aparecen en las hojas 3 y 4. Estas
pecas se alargan y alcanzan aproximadamente 1 mm de longitud, tomando las
características de una raya pardo rojiza y no son visibles por el haz.
Estado 2: La raya se alarga hasta tomar una longitud variable. La principal
característica del estado es que ya las rayas son visibles por el haz de las
hojas y siguen manteniendo su color pardo rojizo - café.
Estado 3: Las rayas se alargan hasta alcanzar 20- 25 mm de longitud y 2 mm de
ancho, manteniendo su color café característico; si la densidad de inóculo es
muy grande, las rayas pueden coalescer formando zonas necróticas, que le
dan un aspecto oscuro a las hojas. La distribución de estas rayas es variable,
en ocasiones es muy numerosa en el semilimbo izquierdo de las hojas, pero
en otras aparecen igualmente distribuidas en ambos. Frecuentemente se
agrupan en ambos lados de la nervadura central de la hoja y a veces varias
rayas coalescen para formar rayas compuestas más grandes.
Estado 4: Puede considerarse el primer estado de mancha. Las rayas se ensanchan y
toman un contorno, más o menos redondeado, elíptico o fusiforme. La
transición de rayas a manchas es caracterizada por el desarrollo de un borde
acuoso o pardo claro alrededor de la mancha. Este borde acuoso se hace
claramente visible temprano en la mañana cuando el rocío está presente o
después de una lluvia.
Estado 5: El color pardo rojizo se torna pardo oscuro o casi negro, el área central que
rodea la mancha se vuelve más pronunciada debido al oscurecimiento. En
este estado, puede ocurrir un amarillamiento ligero del tejido de la hoja que
rodea el borde acuoso de la mancha. Este estado caracteriza el color oscuro
casi negro, que toma el follaje de las plantas afectadas seriamente por la
enfermedad.
Estado 6: El centro de la mancha se seca, se vuelve gris claro y después se deprime.
La mancha es rodeada de un borde estrecho bien definido, pardo oscuro o
negro. Entre este borde y el verde normal de la hoja, hay un halo amarillento
brillante en la zona de transición. Después que las hojas se han secado y
colapsado, las manchas permanecen claramente visibles debido al centro
claro y el borde oscuro.
No todas las manchas siguen esta secuencia de desarrollo. Algunas manchas no se
desarrollan más allá del segundo o tercer estado. De forma igual a Sigatoka, en las
plantas jóvenes las rayas iniciales se desarrollan a manchas ovales pardo - rojizas y las
características de las primeras etapas de las rayas son de poca duración. En el caso
de alta presión de inóculo, aparece sobre las hojas una gran cantidad de lesiones por
unidad de área, generalmente de poco tamaño lo que provoca que a partir del estado 3,
se necrosen los fragmentos provocando la aparición de un gran número de
pseudotecios del patógeno.
El hongo produce toxinas específicas las cuales pueden estar involucradas en la
patología de la enfermedad; han sido identificadas seis, producidas por M. fijiensis
entre estas está 2,4,8 trihidroxitetralona que induce síntomas de la enfermedad,
similares a los producidos por el hongo en las hojas de las plantas (Okole y Schulz,
1997).
2.8 Variabilidad genética de Mycosphaerella spp.
Los estudios de la variabilidad genética, mediante el polimorfismo de los fragmentos
de restricción del ADN genómico (RFLP) de M. fijiensis, han permitido evidenciar una
gran variabilidad entre las poblaciones de diferentes partes del mundo (Carlier et al.,
1993); diferencias genéticas entre las dos especies M. musicola y M. fijiensis, así
como la sinonimia existente entre esta última y M. fijiensis var difformis (Mulder y
Stover, 1976), en virtud de la similitud de sus patrones de hibridación. Así mismo, se
verificó, que las poblaciones de Africa, Australia, América Latina y las Islas del Pacífico,
son grupos genéticamente homogéneos y específicos para cada una de estas
regiones. Ésto sugiere, que las introducciones de M. fijiensis a partir del Sudeste
Ásiático fueron limitadas e independientes unas de otras. Las poblaciones de América
Latina muestran más similitud con las de las islas del Pacífico que con otras
poblaciones.
2.9 Métodos de control de M. fijiensis
2.9.1 Control químico
La sigatoka negra es controlada principalmente por fungicidas químicos, debido a que
las alternativas de control con otros tipos de productos no cuentan con una regulación
comercial aceptable. La alternancia de fungicidas sistémicos con fungicidas de
contacto, son los métodos comunmente utilizados. Los fungicidas pertenecen a
diferentes grupos químicos: triazoles, morfolinas, benzimidazoles, tiofanatos,
carbamatos y el clorotalonil. Los derivados de triazol (inhibidores de la síntesis de
ergosterol de tipo I o inhibidores de la C14 demetilasa), han mostrado el mejor nivel de
eficacia contra M. fijiensis. Se caracterizan por su alta actividad inhibitoria sobre el
crecimiento de los filamentos germinativos y la inhibición del desarrollo de
fructificaciones, así como sobre el tamaño de las manchas foliares (Pérez et al., 1993;
Pérez y Mauri, 1994).
El benomyl, propiconazol y tridemorph, son los principales fungicidas sistémicos
utilizados para el control de esta enfermedad (Romero y Sutton, 1997a). La
disponibilidad de ellos y la capacidad de actividad post-infección, provee una
oportunidad, para la utilización de un sistema de aviso sencillo, basado en la detección
de síntomas en estado inicial de la enfermedad (Ganry y Laville, 1983). La utilización de
este sistema de detección resulta en un decremento significante en el número de
aplicaciones necesarios para el control de sigatoka negra. Entre 1991 y 1992 la
resistencia de M. fijiensis a las aplicaciones de benomyl, dio como resultado un
incremento en la utilización de propiconazol (Romero y Sutton, 1997a). El propiconazol
es un miembro de los fungicidas inhibidores del ergosterol (DMI) (Köller, 1992); sin
embargo, el continuo uso del propiconazol ha provocado un decremento en la
sensibilidad de M. fijiensis a este fungicida (Smith et al., 1991); de la misma manera,
ya se ha reportado resistencia de otros patógenos al propiconazol (Elad, 1992; Stanis y
Jones, 1985).
2.9.2. Manejo de la resistencia vegetal
El mejoramiento genético de bananos y plátanos depende del desarrollo de diploides
con buenas caracterÍsticas agronómicas y resistencia a enfermedades. Los diploides
mejorados son usados como líneas masculinas en cruzamientos con triploides fértiles
(es decir, que producen semillas al ser polinizados), para la producción de híbridos
tetraploides. Los tetraploides seleccionados son evaluados para cualidades
comerciales (Rowe y Rosales, 1996). Consiste en la utilización de variedades de
plátano tolerantes o resistentes a sigatoka negra.
Existen diferentes procesos de mejoramiento genético, siendo uno de ellos el
convencional y a pesar de que en el género Musa las especies comestibles presentan
una gran esterilidad con este método, se han obtenido diferentes híbridos de banano y
plátanos promisorios. Por algunos años, la resistencia de los plátanos a sigatoka negra
ha sido el objetivo de los programas de reproducción. Esterilidad femenina y
características agronómicas indeseables de la presencia de genes diploides de
resistencia, para M. fijiensis ha sido la mayor coacción para el rápido desarrollo de
híbridos resistentes (Romero y Sutton, 1997b).
2.9.3. Control cultural
Las prácticas del cultivo tienen una acción directa sobre el control de la sigatoka negra
y el rendimiento. Los otros métodos de control de la enfermedad deben estar apoyados
por las prácticas de cultivo. En el control químico no se puede depender únicamente de
la eficiencia de los fungicidas, para lograr un buen control (Velastegui 1992). Las
prácticas de cultivo están encaminadas a proporcionar el medio adecuado para un
buen desarrollo de la planta, y a la vez, evitar condiciones favorables para el desarrollo
del hongo, su deficiente aplicación contribuye a aumentar la humedad relativa y las altas
temperaturas, dentro del huerto, condiciones que favorecen la presencia de sigatoka
negra. Estas prácticas por si solas no son suficientes para el control de la enfermedad,
pero sirven de complemento a otras medidas de control (Stover y Simmonds, 1987).
Entre las prácticas de cultivo que se deben considerar están las siguientes prácticas
culturales; la selección de material de siembra, el drenaje, el riego, la densidad de
población, la fertilización, el deshoje, el control de malezas y el recorte de pseudotallos
de las plantas cosechadas.
2.10. Control biológico como alternativa de control de enfermedades
La agricultura moderna es altamente dependiente de los fungicidas, el uso repetido de
los productos químicos para el control de un fitopatógenos ha provocado problemas de
resistencia (Goldman et al., 1994; Nelson et al., 1995); además, la residualidad de los
fungicidas en el suelo y el agua, los cuales provocan daños al medio ambiente, así
como la anulación de registro de ciertos plaguicidas, están creando un fuerte interés en
el uso de control biológico de patógenos fúngicos (Wilson, 1997; Huang et al, 2000).
La eficiencia, la seguridad y los métodos, para aplicar y mantener antagonistas
microbianos son fundamentales, para el éxito de control biológico en sistemas
agrícolas, así como para la aceptación del control biológico por los cultivadores y la
sociedad. Para introducir antagonistas, las consideraciones importantes incluidas son
la viabilidad, formulación y concentración del organismo de control biológico; la clase
de adyuvante, la eficiencia de distribución de aplicaciones del organismo, sin olvidar las
condiciones microclimaticas, durante y después de la aplicación (Wilson et al., 1998).
Un número de enfermedades foliares, incluyendo algunas causadas por B. cinerea,
puede ser reducidas por preinoculación del follage con hongos epifitos filamentosos o
bacterias (Blakeman y Fokkema, 1982; Elad et al., 1996). La habilidad de las especies
de Trichoderma de producir enzimas y atacar o inhibir hongos fitopatógenos lo hacen
excelente para el control biológico (Samuels, 1996).
Las propiedades antagonistas de Trichoderma se conocen desde hace tiempo, la
primera publicación se menciona en 1887 (Vuillemin). La evaluación del fenómeno de
antagonismo y las posibles aplicaciones, como un medio de control de patógenos de
plantas cultivadas comenzó entre las dos guerras mundiales. El primer resultado
positivo de control de la enfermedad, lo reporta Grosclaude (1970) en el control de
“hoja plateada”, éste hecho se considera como el punto de partida de las
investigaciones para la utilización de Trichoderma en el control biológico de patógenos
de las partes aéreas de las plantas.
Las especies del género Trichoderma están siendo extensivamente utilizado como
agente de control biológico, debido a que ataca a una gran variedad de hongos
fitopatógenos responsables de causar enfermedades en los cultivos (Vazquez-
Garcidueñas et al., 1998). Aislados específicos de este grupo tienen la disponibilidad
para el control de un amplio rango de fitopatógenos, bajo una variedad de condiciones
ambientales (Papavizas,1985). No obstante, la extensiva investigación sobre la
utilización de Trichoderma, para el control biológico, los mecanismos por los cuales
controla los hongos fitopatógenos, no están bien conocidos. El principal mecanismo
propuesto es el micoparasitismo, se presume que este proceso requiere la producción
de enzimas, que digieran la pared celular fúngica (Chet, 1987). Las especies de
Trichoderma son conocidas por ser eficientes productores de lyasas, polisacaridos,
proteasas y lipasa, las cuales, todas pueden estar involucradas en la degradación de la
pared celular (Chérif y Benhamou, 1990; Lorito, 1993a). Las enzimas que están
involucradas en el micoparasitismo son aquellas que degradan quitina y glucano; los
cuales son elementos estructurales importantes de la pared celular de muchos hongos
(Harman et al., 1993; Mauch et al, 1988). Trichoderma produce de cinco a siete
enzimas, dependiendo del aislado. El sistema quitinolítico de T. harzianum consiste de
cinco a siete enzimas distintas dependiendo del aislado (Carsolio et al., 1999).
Las tres décadas que siguieron a los trabajos pioneros de Weindling (1934,1937)
sobre Trichoderma, fueron marcados por el oscurecido intento de la idea que
prometía, que estos dos hongos tenían un potencial como agentes efectivos para el
control biológico; sin embargo, en poco tiempo, se ha sido testigo de un dramático
incremento en los esfuerzos de investigación y algunas recientes revisiones de artículos
y libros, consideran la utilización de microorganismos específicos para el control
biológico de enfermedades de plantas.
Las especies T. harzianum y T. virens son las mayormente citadas en control
biológico (Papavizas, 1985; Chet, 1987); T. harzianum sola o en combinación con
otras especies de Trichoderma o con algún adjuvante químico a sido utilizado en el
control de diferentes enfermedades, algunas de estas incluye: “damping-off”
Rhizoctonia spp. en rábano (Lifshitz & Baker, 1985), maíz y soya (Kommedahl et al.,
1981), moho gris en tomate (Migueli et al., 1995), uva y fresa (Elad et al., 1995; Harman
et al., 1995); pudrición de almacenamiento en manzana por Colletotrichum spp.
(Tronsmo y Hjeljord, 1995), pudrición del pepino causada por Rhizoctonia solani J.G.
Kühn (Lewis y Papavizas, 1980; Lewis et al, 1996), “take-all” enfermedad en trigo
(Ghisalberti y Sivasithamparam, 1991), y Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary en
guisante (Knudsen y Eschen, 1991) y S. minor Jagger en lechuga (Vannacci et al.,
1991), y un complejo de marchitamiento predominantemente causado por Sclerotium
rolfsii Sacc. R. solani y F. oxysporum Schldl en lenteja y garbanzo (Mukhopadhyay,
1995).
El hongo T. harzianum es un agente de control biológico, para proteger a las plantas
cultivadas de daños inducidos por Sclerotium rolfsii Sacc. y R. solani, bajo condiciones
de invernadero y de campo; en experimentos de invernadero, el control biológico de S.
rolfsii y R. solani, fue del 97% de reducción de incidencia de enfermedad en semillas
de frijol y 57% de reducción de la incidencia de la enfermedad en suelo infestado
naturalmente y artificialmente con ambos patógenos. La eficiencia del control biológico
se relaciona positivamente con el grado de preparación del inóculo de Trichoderma
aplicada al suelo y negativamente, con el nivel de infestación del patógeno (Elad et al,.
1980). Mejorar los métodos de aplicación de Trichoderma podría dar mejores
resultados en el control de fitopatógenos (Elad et al., 1980).
Existen en el mercado diferentes productos de Trichoderma que se comercializan para
diferentes cultivos (Lumsden, Lewis y Locke, 1993), como es RootShield, para el
control de enfermedades en tomate y pepino; Trieco, para el control de fitopatógenos
en café, citricos, uvas, chile, algodón y tabaco; TRICHODEX 20SP, para el control de
B. cinerea en uva, así como también para el control de enfermedades en tomate y
pepino producidos en invernaderos comerciales (O’neill et al, 1996; Fravel et al,. 1999;
Elad, 2000); F-Stop en el control de F. oxysporum Schlecht. f. sp. radicis-
lycopersiciJarvis & Shoemaker en tomate (Datnoff et al., 1995).
En lo que respecta a M. fijiensis, no existen estudios que señalen el efecto de cepas
nativas de Trichoderma, ya sea por antibiosis, micoparasitismo o competencia.
III MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Localización del área de estudio
El trabajo de investigación se realizó en la Facultad de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias de la Universidad de Colima, ubicada en el Km. 40, carretera Colima-
Manzanillo en Tecomán, Colima, México.
3.2 Poblaciones en estudio
3.2.1 Aislamiento de Mycosphaerella fijiensis
El hongo M. fijiensis se aisló de hojas enfermas, de una plantación comercial ubicada
en el poblado de Marabasco, municipio de Manzanillo, Colima. El aislamiento se realizó
de acuerdo a la técnica de Stover (1976), Porras y Pérez (1997). Se seleccionaron
fragmentos de 3 x 3 cm de hojas con pseudotecios y ascósporas, se presillaron a
discos de papel filtro, de 10 cm de diámetro de forma que el envés quedara expuesto,
para la liberación de las ascósporas. Los fragmentos se incubaron durante 48 horas, en
bolsas de nylon con papel filtro humedecido, para uniformar la maduración de las
ascósporas.
Posterior a la incubación de los fragmentes de hoja, los papeles filtro y los fragmentos
de hojas se sumergieron en agua destilada durante 5 min. El papel filtro se colocó
inmediatamente dentro de las tapas de las placas de Petri, de forma, que el envés de
los fragmentos quedara de frente a las cajas con agar-agua y se dejó descargar las
ascósporas durante una hora.
Las ascósporas se transfirieron a cajas Petri que contenían agar papa-dextrosa y se
incubaron a 25° C por 4 días; una vez que transcurrió este tiempo, las colonias visibles
se transfirieron a agar Mycophil (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville,
MD) y se incubaron a 25°C por 15 días, bajo luz fluorescente continua, para el
crecimiento de la colonia (Romero y Sutton, 1997a).
3.2.2. Especies de Trichoderma utilizadas.
Los aislados de Trichoderma spp. se obtuvieron de la colección de hongos del
Laboratorio de Control Biológico, de la Universidad de Colima. Las 22 cepas que se
utilizaron fueron identificadas por el Dr. Gary Samuels de USDA-ARS y corresponden a
13 de T. longibrachiatum, 5 a T. harzianum, 1 a T. artroviride, 1 a T. koningii , 1 a T.
virens y una no identificada.
3.3. Evaluación de la producción de enzimas hidróliticas por Trichoderma spp.
Con el propósito de evaluar la producción de las enzimas hidrolíticas, quitinasas y
glucanasas, de cada una de las cepas de Trichoderma spp., se utilizó el medio de
cultivo líquido, de acuerdo a las técnicas propuestas por Bruce et al., (1995), Hadar et
al., (1979), Harman et al., (1993) y Worasatit et al.,(1994).
En matraces Erlenmeyer de 250 ml se colocaron 50 ml de medio de cultivo formado por
10 g de KNO3; 5 g de KH2PO4; 2.5 g de MgSO4.7H2O; 2 mg de FeCl3,; 150 ml de jugo
V8; 10 g de polyvinylpyrrolidona (Sigma, St. Louis, MO) y 1,000 ml de agua
desionizada. El medio se suplementó, según fue el caso, con 1% (p/v) de quitina en
hojuelas ó 0.1% de laminarina (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, U.S.A), para
producción específica de quitinasa y glucanasa, respectivamente. El medio se ajustó a
pH de 6.0 con solución de ácido clorhídrico 0.5N y se esterilizó en autoclave a 121oC
por 20 minutos; posteriormente se inoculó con 1 ml de una suspensión de conidios a la
concentración de 1 X 106 conidios/ml y se incubó a 25°C, 12 horas luz/oscuridad en un
agitador rotatorio Lab- Line Instruments a 180 rpm, por cinco días, para producción de
quitinasas y ocho días, para producción de glucanasas (Harman et al., 1993; Worasatit
et al., 1994).
Pasado el tiempo de incubación, del medio de cultivo con las enzimas de interés, se
separó la biomasa por filtración, en papel filtro Whatman No.1; posteriormente el caldo
se centrifugó a 10,000 rpm por 30 min, las partículas residuales se retiraron por
filtración a través de un filtro de fibra de vidrio (Hadar et al., 1979; Harman et al., 1993;
Worasatit et al., 1994). Inmediatamente después, el filtrado se utilizó para cuantificar la
producción de quitinasas o glucanasas y para determinar la inhibición de las enzimas
en el crecimiento de micelio de M. fijiensis.
3.3.1 Cuantificación de glucanasas producidas por Trichoderma spp.
La actividad de las glucanasas se determinó de acuerdo al método de Nelson (1944) y
Somogyi (1952). Se utilizaron los filtrados obtenidos de las 22 cepas de Trichoderma
spp. del medio de cultivo líquido con 8 días de incubación.
Para cada muestra se utilizaron dos tubos, a ambos tubos se les agregó 1 ml de una
solución de 10 mg/ml de laminarina en solución amortiguadora de citrato 0.1M con pH
5 (solución 0.1M de citrato de sodio y 0.1M de ácido cítrico, mezcladas en proporción
21:29 v/v, respectivamente. Y solamente al tubo uno se le agregó un ml del filtrado, y se
incubaron todos los tubos por 4 h a 40°C en baño María.
Después de la incubación, se le agregó 1 ml de filtrado al tubo dos, posteriormente se
agregaron a todos los tubos 2 ml de reactivo de cobre (CR), e inmediatamente se
colocaron los tubos en agua hirviendo por 10 min para destruir la actividad enzimática.
Luego se agregaron 2 ml de reactivo de arsenomolibdato y se aforó a 25 ml con agua
destilada. La solución se homogenizó para el desarrollo de color, y posteriormente se
midio la absorbancia de la solución a 500 nm en un espectrofotómetro (Spectronic 20D,
Milton Roy, Rochester, N.Y.). Se corrio un blanco, el cual llevó el mismo procedimiento
que las muestras, pero en lugar de filtrado se utilizó agua destilada (Bruce et al., 1995).
El reactivo se cobre (CR) se preparó minutos antes de utilizarlo con 4 partes de reactivo
de Cu I y una del reactivo de Cu II. El reactivo I se formó con 16.1 g de tartrato de sodio
y potasio (KNaC4H4O6.4H2O); 24 g de carbonato de sodio (NaCO3); 16 g de
bicarbonato de sodio (NaHCO3); 80.44 g de sulfato de sodio (Na2SO4); disueltos en
800 ml de agua. El reactivo de II se formó con 4 g de sulfato de cobre pentahidratado
(CuSO4.5H2O); 36 g de sulfato de sodio (Na2SO4), disueltos en 200 ml de agua
destilada. En ambas soluciones se calentaron para la disolución de los reactivos, una
vez fríos se corrigió el volumen original. El reactivo de arsenomolibdato se preparó
disolviendo 25 g de molibdato de amonio tetrahidratado (NH4MO7O42.4H2O) en 450 ml
de agua destilada; al cual se le agregaron 21 ml de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4)
y 3 g arseniato disódico (Na 2HA5O4.7H2O) disuelto en 25 ml de agua, los reactivos se
mezclaron y almacenaron a 37°C por 2 días antes de utilizarse (Bruce et al., 1995).
Se realizó una curva de calibración con diferentes concentraciones de glucosa, las
cuales fueron: 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300 y 400 µg/2 ml.
Las diferencias en las lecturas de absorbancias del tubo 1 y 2, se utilizaron para
establecer la actividad de glucanasas por extrapolación de la gráfica estándar. La
actividad de glucanasas de cada filtrado se calculó con cuatro réplicas de análisis
(Hadar et al., 1979).
Las variables utilizadas para cuantificar la actividad de las glucanasas fueron actividad
total (AT) y actividad específica (AE). La actividad enzimática (AT) es la cantidad de
enzima que origina la transformación de sustrato en condiciones óptimas de medida y
se reporta como µmoles glucosa/h ; La actividad específica (AE) es el número de
unidades de enzima por miligramo de proteína, y constituye una medida de la pureza de
la enzima y se expresa como µmoles glucosa/h/mg de proteína Hadar et al., 1979; Madi
et al., 1997). El contenido de proteínas de la solución enzimática se determinó con el
reactivo de Folin de acuerdo a Lowry et al. (1951).
Se realizaron 22 tratamientos que corresponden a las cepas de Trichoderma spp., con
4 repeticiones, distribuidos bajo el diseño experimental completamente al azar. Los
datos se sometieron a un análisis de varianza y pruebas de media de Tukey (P<0.05),
con el paquete estadístico SAS (SAS, 1988).
3.3.2. Cuantificación de quitinasas producidas por Trichoderma spp.
La actividad de quitinasas se cuantificó con los filtrados de 5 días de incubación,
obtenidos de las 22 cepas de Trichoderma spp, de acuerdo a Reissing et al., (1955).
Para cada uno de los filtrados se colocaron cuatro tubos, y a cada uno se les agregó 1
ml de filtrado y 3.8 mg de quitina purificada en polvo (Sigma Chemical), en 1 ml de
McIlvaine de citrato, pH 5.0 (formado por 49 ml de solución 0.1 M de ácido cítrico, más
51 ml de solución 0.2 M de fosfato disódico). Los tubos uno de cada filtrado se
sumergieron en agua hirviendo por 10 minutos, para destruir la actividad enzimática,
posteriormente todos los tubos se incubaron por 24 h a 37°C en baño María.
Después de la incubación se tomaron 0.5 ml de cada uno de los 4 tubos y se colocaron
en tubos de ensaye; y todos los tubos se colocaron en agua hirviendo por 10 minutos;
posteriormente, a cada tubo se le agregó se les agregó 0.1 ml de solución 0.8 M de
tetraborato de potasio y se pusieron a ebullición, por 3 minutos; se dejó enfriar, para
luego agregarles 3 ml de p-dimethylaminobenzaldehido (DMAB, Sigma Chemical), los
tubos se homogenizan en un vortex para el desarrollo del color y se mide la absorbancia
a 544 nm; en un espectrofotómetro (Spectronic 20D, Milton Roy, Rochester, NY) contra
un blanco, al cual se le realizó el mismo procedimiento, solo que en lugar de filtrado se
utilizó agua destilada.
El reactivo de arsenomolibdato se preparó disolviendo 10 g de DMAB en una mezcla
de 12.5 ml de HCl 10N y 87.5 ml de ácido acético glacial (grado analítico);
posteriormente se diluye 1:10 en ácido ácetico glacial antes de utilizarse.
Del mismo modo, se realizó una curva de calibración con las siguientes
concentraciones de N-acetylglucosamina: 0, 1.6, 1.9, 3.1, 3.9, 6.25, 7.8, 12.5, 15.6, 25,
31.25, 40, 50, 62.5, 70, 80, 90, 100, 110, 120 y 125 µg/0.5 ml del amortiguador
McIlvaine, pH 5.0. Las diferencias en las lecturas de absorbancia del tubo uno menos el
promedio de los tubos dos, tres y cuatro, se utilizó para establecer la actividad de N-
acetylglucosamina por extrapolación de la gráfica estandar. La actividad de la N-
acetylglucosamina de cada filtrado se calculó en cuatro réplicas de análisis (Bruce et
al., 1995).
La actividad total (AT) y específica (AE) de las quitinasas se determinó por la
cuantificación de N-acetylglucosamina liberada, según Reissing et al., (1955); la AT se
expresó como µmoles de N-acetylglucosamina/hora y la AE como µmoles de N-
acetylglucosamina/mg de proteína/hora de acuerdo con Hadar et al., (1979) y a Madi et
al., (1997). El contenido de proteínas de la solución enzimática se determinó con el
reactivo de Folin de acuerdo a Lowry et al. (1951).
En total se formaron 22 tratamientos que correspondieron a las cepas de Trichoderma
spp, con 4 repeticiones, distribuidas bajo el diseño experimental completamente al
azar. Los datos se sometieron a un análisis de varianza y pruebas de media de Tukey
(P<0.05), con el paquete estadístico SAS (SAS, 1988).
3.4 Evaluación de antibiosis de Trichoderma spp. sobre el crecimiento de
micelio de M fijiensis.
Para la determinación de actividad antibiótica por glucanasas y quitinasas se realizaron
de acuerdo a la técnica descrita por Rodriguez-Cabana et al., (1983), Mauch et al.,
(1988) y Harman et al., (1993), bajo condiciones estériles, volumen igual (10 ml) de
solución de enzima, la cual se filtro a través de un filtro Millipore 0.22 µm (Millipore Co.
Bedford, MA U.S.A), se mezcló con agar Mycophil y se inoculó con un disco de 5 mm
de diámetro de micelio de una colonia en crecimiento activo de M. fijiensis, se incubó
a 24°C y se midió el diámetro de crecimiento del micelio cada 7 días durante 49 días.
Para el testigo se utilizó agar Mycophil sin solución de enzima en caja Petri y se inoculó
con un disco de 5 mm de diámetro de micelio de una colonia en crecimiento activo de
M. fijiensis.
El porcentaje de inhibición se calculó para cada una de las muestras de la siguiente
forma:
% Inhibición = T – M X 100
T
Donde : T= Crecimiento en mm del testigo
M= Crecimiento en mm de las muestras
En total se formaron 22 tratamientos que corresponden a las cepas de Trichoderma,
para cada una de las enzimas, con 4 repeticiones, distribuidas bajo el diseño
experimental completamente al azar. Los datos se sometieron a un análisis de varianza
y pruebas de media de Tukey (P<0.05), con el paquete estadístico SAS (SAS, 1988).
3.5 Actividad micoparasítica de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis
Se realizaron interacciones entre colonias de M. fijiensis con cada una de las 22 cepas
de Trichoderma, para evaluar los niveles de micoparasitismo de acuerdo a las técnicas
de Elad et al., (1983), Benhamou y Chet, (1993), Bélanger et al., (1995), Benhamou et
al., (1999).
Un disco de micelio de 5mm de diámetro, de una colonia en crecimiento activo de cada
hongo de Trichoderma y uno de M. fijiensis, se colocaron dentro de cajas Petri a 3 cm
de separado sobre una superficie de agar papa-dextrosa (PDA). Las cajas de Petri se
incubaron a 25°C, bajo luz continua por cinco días. A los 1, 3, y 5 días se realizaron
cortes de micelio de la zona de intersección de 1 cm2. Los cortes de micelio se
colocaron en porta objetos y se fijaron con vapores de una solución al 2% (p/v) de
Tetróxido de Osmio, en agua destilada por 20 h, a temperatura ambiente, en la
campana de extracción; posteriormente, a cada muestra se le realizó un baño de oro en
un Nanotech Sputter Coated 18930 (Cambridge, England), después se colocó en un
desecador hasta su observación en Microscopio Electrónico de Barrido (JEOL JSM-
5400 LV, Scanning Electron Microscopy, Tokyo); esto en el Centro Universitario de
Ciencias Exactas e Ingeniería, Departamento de Física de la Universidad de
Guadalajara, a 15 kV. Se tomó película 35 mm Tri -X-Pan 400 blanco y negro (Eastman
Kodak Co, Rochester N.Y.). En total se examinaron cuatro repeticiones por cada una de
las muestras (Benhamou y Chet, 1997; Benhamou et al., 1997).
La presencia de micoparasitismo entre los hongos se determinó al observar la
presencia o ausencia de enrollamiento, colapso de micelio, penetración de hifas o
esporulación. Se formaron 22 tratamientos que corresponden a las cepas de
Trichoderma spp. con 4 repeticiones.
IV RESULTADOS 4.1 Producción de enzimas hidrolíticas por cepas de especies de Trichoderma.
4.1.1. Cuantificación de glucanasas de cepas nativas de Trichoderma spp.
La producción de glucanasas, determinada como actividad total (µmol de glucosa/h) y
actividad específica (µmol de glucosa/h/mg proteína), se presentó en las 22 cepas
nativas de Trichoderma spp. evaluadas. Sin embargo, se observó que la capacidad de
producción de glucanasas de las distintas cepas fue diferente (Cuadros 1 y 2).
Cuadro 1 Análisis de varianza de la actividad total de glucanasas de cepas nativas de Trichoderma
Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 15.28568 0.727889 3.75 0.0001
Error 44 8.5407 0.194108
Total
65 23.8264
R2= 0.6415 C.V. = 64.4962 a =0.05
Cuadro 2 Análisis de varianza de la actividad específica de glucanasas de cepas nativas de Trichoderma
Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 0.07079 0.00337 4.30 0.0001
Error 44 0.03447 0.00078
Total
65 0.10526
R2=0.6724 C.V.=18.84 a =0.05
La actividad total de glucanasas por las cepas de Trichoderma spp. varió de 0.056 a
1.487 µmol de glucosa/h; la prueba de Tukey (P=0.05), no permitió separar claramente
a las medias (Cuadro 3). La cepa Tl-12 (T. longibrachiatum) fue la que
presumiblemente produjo la mayor actividad total por glucanasas, 1.487 µmol de
glucosa/h; y las cepas Thz-1, Tl-9, Tl-11 y Tar-1 presentaron la menor actividad total por
glucanasas con valores de 0.092, 0.060, 0.057 y 0.056 µmol de glucosa/h; con un
amplio sobrelapamiento con el resto de las cepas experimentales.
La actividad específica varió de 0.0009 a 0.1569 µmol de glucosa/h/mg proteína
(Cuadro 3), la prueba de comparación de medias de Tukey (P=0.05), permitió separar
a las medias en dos grupos a y b, en la que destaca únicamente la cepa Tl-6 de la
especie T. longibrachiatum con 0.1569 µmol de glucosa/h/mg proteína, en tanto que
todas las demás cepas no son significativamente diferentes (Cuadro 3).
Cuadro No. 3. Actividad total y actividad específica de glucanasas por cepas de Trichoderma spp.
No. Especie Actividad Total
µmol glucosa/h
Actividad Específica
µmol glucosa /h/mg prot
Tl-12 T. longibrachiatum 1.487 a1 0.0104 b
Tl-1 T. longibrachiatum 1.382 ab 0.0077 b
Tvs-1 T. virens 1.305 ab 0.0089 b
Tl-4 T. longibrachiatum 1.203 ab 0.0532 b
Tl-8 T. longibrachiatum 1.198 ab 0.0077 b
Tl-13 T. longibrachiatum 1.115 ab 0.0139 b
Tl-10 T. longibrachiatum 1.107 ab 0.0106 b
Tl-5 T. longibrachiatum 1.047 ab 0.0103 b
Tl-2 T. longibrachiatum 0.819 ab 0.0075 b
Tl-6 T. longibrachiatum 0.785 ab 0.1569 a
Tl-3 T. longibrachiatum 0.729 ab 0.0095 b
Tk-1 T. koningii 0.718 ab 0.0045 b
Thz-3 T. harzianum 0.537 ab 0.0036 b
T-52 Trichoderma spp 0.506 ab 0.0075 b
Thz-4 T. harzianum 0.324 ab 0.0024 b
Thz-5 T. harzianum 0.200 ab 0.0033 b
Thz-2 T. harzianum 0.182 ab 0.0009 b
Tl-7 T. longibrachiatum 0.119 ab 0.0009 b
Thz-1 T. harzianum 0.092 b 0.0023 b
Tl-9 T.longibrachiatum 0.060 b 0.0013 b
Tl-11 T. longibrachiatum 0.057 b 0.0019 b
Tar-1 T. artroviride. 0.056 b 0.0014 b 1Medias entre columnas seguida con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la
prueba de Tukey (P= 0.05).
4.1.2. Cuantificación de quitinasas de cepas nativas de Trichoderma spp.
Todas las cepas presentaron actividad total y actividad específica por quitinasas. Se
encontró que la capacidad de producción de quitinasas de las distintas cepas fue
diferente entre ellas (Cuadros 4 y 5). Por otro lado, la producción de quitinasas en
términos de actividad total varió de 0.05933 a 0.009 µm N-acetylglucosamina/h; en
tanto que la actividad específica varió de 0.04332 a 0.00030 µm N-
acetylglucosamina/h/mg proteína (Cuadro 6).
Cuadro 4 Análisis de varianza de actividad total de producción de quitinasas por cepas
nativas de Trichoderma Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 0.015955 0.000759 7.05 0.0001
Error 44 0.004740 0.000107
Total
65 0.020695
R2= 0.7709 C.V.= 28.75 a =0.05
Cuadro 5 Análisis de varianza de actividad específica de producción de quitinasas por
cepas nativas de Trichoderma Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 0.00496 0.000236 77.83 0.0001
Error 44 0.00013 0.000003
Total
65 0.00509
R2=0.9737 C.V.=40.03 a =0.05
La prueba de comparación de medias de Tukey (P=0.05) no permitió separar
claramente a las medias. Las cepas Thz-5, Thz-4 de la especie T. harzianum y T-52,
fueron las que presumiblemente presentaron mayor actividad por quitinasa con
0.05933, 0.05900 y 0.05833 µmol N-acetylglucosamina/h respectivamente, estas tres
cepas no son significativamente diferentes. La menor actividad total la presentó la cepa
Tvs-1 de la especie T. virens con 0.009 µmol N-acetylglucosamina/h (Cuadro 6).
De acuerdo a la actividad específica la prueba de comparación de medias permitió
separar a las medias en dos grupos, en las que sobresale con una mayor actividad
especifica la cepa Tar-1 de la especie T. artroviride con 0.04332 µmol N-
acetylglucosamina/h/mg proteína. Las cepas Thz-2, Thz-5, Tl-11, Tk-1, Tl-13, Tl-4, Thz-3,
Tl-10, Tl-5, Tl-3, Thz-1, Tvs-1 y Tl-1 son las que presentaron la menor actividad
específica con 0.00237, 0.00212, 0.00197, 0.00192, 0.00175, 0.00170, 0.00169,
0.00136, 0.00118, 0.00117, 0.00073, 0.00060 y 0.00030 µmol N-
acetylglucosamina/h/mg proteína respectivamente, las cuales no son significativamente
diferentes (Cuadro 6).
Cuadro 6 Actividad total y actividad específica de quitinasas por cepas de Trichoderma spp.
No
cepa
Especie Actividad Total
µmol N-acetylglucosamina
/h
Actividad Específica
µmol N-acetylglucosamina
/h/mg proteína
Thz-5 T.harzianum 0.05933 a1 0.00212 c
Thz-4 T. harzianum 0.05900 a 0.00802 b
T-52 Trichoderma sp. 0.05833 a 0.00282 bc
Tk-1 T. koningii 0.05233 ab 0.00192 c
Tl-7 T. longibrachiatum 0.05067 abc 0.00409 bc
Tar-1 T. artroviride 0.04967 abc 0.04332 a
Tl-11 T. longibrachiatum 0.04867 abc 0.00197 c
Thz-3 T. harzianum 0.04467 abcd 0.00169 c
Tl-2 T. longibrachiatum 0.04400 abcd 0.00259 bc
Tl-9 T. longibrachiatum 0.03933 abcde 0.00430 bc
Thz-2 T. harzianum 0.03800 abcde 0.00237 c
Tl-8 T. longibrachiatum 0.03667 abcde 0.00521 bc
Tl-12 T. longibrachiatum 0.03533 abcde 0.00327 bc
Tl-6 T. longibrachiatum 0.03067 abcde 0.00329 bc
Tl-1 T. longibrachiatum 0.02867 abcde 0.00030 c
Tl-4 T. longibrachiatum 0.02400 bcde 0.00170 c
Tl-13 T. longibrachiatum 0.02067 bcde 0.00175 c
Tl-10 T. longibrachiatum 0.01900 cde 0.00136 c
Thz-1 T. harzianum 0.01600 de 0.00073 c
Tl-3 T. longibrachiatum 0.01567 de 0.00117 c
Tl-5 T. longibrachiatum 0.01433 de 0.00118 c
Tvs-1 T. virens. 0.00900 e 0.00060 c
1Medias entre columnas seguidas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de Tukey (P=0.05).
4.2. Antibiosis de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis.
4.2.1 Efecto antibiótico por glucanasas.
Se encontró que las 22 cepas nativas de Trichoderma presentaron efecto de antibiosis
por glucanasas sobre el crecimiento de micelio de M. fijiensis. Las cepas difieren de
manera importante en el porcentaje de inhibición entre los tratamientos (Cuadros 7,8 y
9).
Cuadro 7 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por glucanasas sobre M. fijiensis a los 7 días después de la inoculación.
Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 3459.0102 164.71477 3.74 0.0001
Error
44 1935.4263 43.986962
Total
65 5394.4365
R2=0.6412 C.V.=47.15 a =0.05
Cuadro 8 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por glucanasas sobre M. fijiensis a los 28 días después de la inoculación. Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 2646.2464 126.0115 9.17 0.0001
Error
44 604.6977 13.7431
Total
65 3250.9403
R2=0.8139 C.V.=15.20 a =0.05
Cuadro 9 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por glucanasas sobre M. fijiensis a los 49 días después de la inoculación.
Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 1527.4901 72.7376 8.83 0.0001
Error
44 362.4345 8.2371
Total
65 1889.9247
R2=0.8082 C.V.=11.81 a =0.05
A los 7 días se observó que las cepas de la especie T. longibrachiatum presentaron
una variación en el efecto antibiótico de 1.20% a 22.87%, presentando el mayor
porcentaje de inhibición la cepa Tl-13 que fue del 22.87%. La especie T. harzianum
presentó una variación en la inhibición de 3.50% a 5.87%, teniendo el mejor efecto
inhibitorio las cepas Thz-1, Thz-4, Thz-5 y Thz-2. La inhibición presentada por la cepa
de la especie T. koningii fue de 3.57%. La cepa T. virens presentó efecto antibiótico
del 2.00%. La inhibición de la especie T. artroviride fue 1.20% y la cepa de
Trichoderma spp. presentó el 2.83% de inhibición. La prueba de comparación de
medias no permitió separar claramente las medias, el mayor porcentaje de inhibición lo
presentó presumiblemente la cepa Tl-13 de la especie T. longibrachiatum con 22.87%.
La menor inhibición la presentó la cepa Tl-7 de la especie T. longibrachiatum y T.
artroviride con el 1.20% (Cuadro 10).
Para los 28 días el porcentaje de inhibición varió de 32.63 a 6.50% para la especie T.
longibrachiatum, y el mejor efecto inhibitorio lo presentaron las cepas Tl-1 y Tl-2. La
especie T. harzianum presentó una variación de 20.93 a 6.17%. La especie T. koningii
presentó un efecto inhibitorio de 14.23%. La cepa de T. artroviride tubo un efecto
inhibitorio de 14.57%; Trichoderma spp. y T. virens presentaron el 12.97% y 8.40% de
inhibición respectivamente.
Cuadro 10 Efecto de glucanasas de Trichoderma spp. sobre el crecimiento de micelio de M fijiensis.
No. Especie % Inhibición
7ddi
% Inhibición
28 ddi
% Inhibición
49 ddi
Tl-13 T. longibrachiatum 22.87 a 1 28.07 ab 20.67 abcdef
Tl-1 T. longibrachiatum 20.20 ab 32.63 a 31.53 a
Tl-10 T. longibrachiatum 18.50 ab 27.77 ab 21.03 abcdef
Tl-4 T. longibrachiatum 16.53 abc 25.23 abc 23.80 abcd
Tl-5 T. longibrachiatum 13.57 abc 25.00 abc 16.23 cdef
Tl-6 T. longibrachiatum 11.07 abcd 27.67 ab 22.93 abcde
Tl-12 T. longibrachiatum 09.20 abcd 19.73 abcde 15.10 cdefgh
Tl-2 T. longibrachiatum 09.17 abcd 30.77 a 30.03 ab
Tl-3 T. longibrachiatum 08.47 abcd 22.50 abcd 18.20 bcdefg
Tl-8 T. longibrachiatum 07.87 abcd 07.87 cdef 12.90 defgh
Thz-1 T. harzianum 05.87 abcd 20.93 abcde 17.67 bcdefgh
Thz-4 T. harzianum 05.57 abcd 14.73 bcdef 10.83 fgh
Thz-5 T. harzianum 05.20 abcd 08.00 ef 08.80 gh
Thz-2 T. harzianum 04.63 abcd 06.17 f 16.53 cdefgh
Tk-1 T. koningii 03.57 abcd 14.23 bcdef 12.00 efgh
Thz-3 T. harzianum 03.50 bcd 17.17 abcde 27.10 abc
T-52 T. sp 02.83 bcd 12.97 bcdef 13.60 defgh
Tl-9 T. longibrachiatum 02.43 bcd 06.50 f 08.10 h
Tl-11 T. longibrachiatum 02.03 bcd 09.90 def 12.23 defgh
Tvs-1 T. virens 02.00 bcd 08.40 ef 10.71 fgh
Tar-1 T. artroviride 01.20 cd 14.57 bcdef 16.87 cdefgh
Tl-7 T. longibrachiatum 01.20 cd 11.53 cdef 18.03 cdefgh
Testigo 00.00 d 00.00 g 00.00 i
1Medias entre columnas seguidas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de Tukey (P=0.05).
La prueba de Tukey (P=0.05) no permitío separa claramente las medias. Los mayores
porcentajes de inhibición lo presentaron presumiblemente la cepa Tl-1 y Tl-2, de la
especie T. longibrachiatum con 32.63, 30.77%. El menor porcentaje de inhibición lo
presentaron la cepa Thz-2 de la especie T. harzianum y Tl-9 de T. longibrachiatum con
6.17% y 6.50% respectivamente (Cuadro 10).
Para los 49 días el efecto inhibitorio para T. longibrachiatum fue de 31.53% a 8.10%,
presentando la mayor inhibición la cepa Tl-1. Para la especie T. harzianum la inhibición
varió de 27.10% a 8.80%, presentando el mayor porcentaje inhibitorio la cepa Thz-3. El
efecto antibiótico de T. koningii fue de 12.00%. La cepa de T. artroviride presentó una
inhibición del 16.87%. La cepa Trichoderma spp. presentó efecto antibiótico de
13.60% y la inhibición que presentó la cepa T. virens fue de 10.71%. La prueba de
comparación de medias de Tukey (P=0.05) no separó claramente las medias;
presumiblemente, el mayor porcentaje de inhibición lo presentó la cepa Tl-1 de la
especie T. longibrachiatum con el 31.53%; la menor inhibición fue para la cepa Tl-9 de
la especie T. longibrachiatum con el 8.10% (Cuadro 10).
4.2.2. Efecto antibiótico por quitinasas.
Se encontró que todas las cepas difieren de manera importante en el porcentaje de
inhibición de M. fijiensis, entre los diferentes tratamientos (Cuadros 11,12 y 13).
Cuadro No. 11 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por quitinasas sobre
M. fijiensis, a los 7 días después de la inoculación. Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 2890.3394 137.6352 9.43 0.0001
Error
44 642.0967 14.5931
Total
65 3532.4362
R2=0.8182 C.V.=19.25
Cuadro 12 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por quitinasas sobre M. fijiensis, a los 28 días después de la inoculación.
Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 1050.8190 50.0390 5.04 0.0001
Error
44 436.6736 9.9244
Total
65 1487.4927
R2=0.7064 C.V.=13.11
Cuadro 13 Análisis de varianza del porcentaje de inhibición por quitinasas sobre M. fijiensis, a los 49 días después de la inoculación.
Factor de Variación
Grados de Libertad
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
F Calculada
Pr>F
Tratamiento
21 2283.2340 108.7254 14.13 0.0001
Error
44 338.4789 7.6927
Total
65 2621.7129
R2=0.8708 C.V.=11.65
El efecto antibiótico de las quitinasas a los 7 días varió para las cepas de la especie T.
longibrachiatum de 28.30% a 0.43%. Para las cepas de T. harzianum el porcentaje de
inhibición fue de 20.63% a 9.23%. La especie T koningii presentó un efecto de 11.47%
de inhibición. El efecto inhibitorio de Trichoderma spp., T. artroviride y T. virens fue de
8.33%, 6.53% y 3.37%. La prueba de Tukey (P=0.05) no permitió separar claramente
las medias. Los mayores porcentajes de inhibición fueron presumiblemente para la
cepa Tl-6 con 28.30%, seguido por las cepas Tl-2 y Thz-1 con 22.33 y 20.63%. El
menor porcentaje de inhibición fue para la cepa Tl-11 con el 0.43% (Cuadro 14).
Para los 28 días la inhibición que presentaron las cepas de T. longibrachiatum varió de
25.47% a 6.90%. Para las cepas de T. harzianum el efecto inhibidor fue de
Cuadro 14 Efecto por quitinasas de Trichoderma spp. sobre el crecimiento de micelio
de M. fijiensis.
No. Especie % inhibición
7 ddi
% Inhibición
28 ddi
% Inhibición
49 ddi
Tl-6 T. longibrachiatum 28.30 a1 14.43 abc 04.17 e
Tl-2 T. longibrachiatum 22.33 ab 19.47 ab 06.37 de
Thz-1 T. harzianum 20.63 ab 17.10 abc 06.20 de
Thz-2 T. harzianum 17.60 abc 20.03 ab 21.93 ab
Tl-4 T. longibrachiatum 17.57 abc 25.47 a 24.33 a
Tl-5 T. longibrachiatum 16.27 abcd 15.07 abc 03.77 e
Tl-10 T. longibrachiatum 15.77 abcd 06.90 d 13.50 bcd
Tl-7 T. longibrachiatum 15.27 abcd 18.00 abc 20.33 abc
Tl-3 T. longibrachiatum 14.50 abcd 17.97 abc 14.53 abcd
Tl-1 T. longibrachiatum 14.37 abcde 16.40 abc 23.93 a
Tl-8 T. longibrachiatum 13.03 abcdef 20.13 ab 19.73 abc
Thz-4 T. harzianum 13.00 abcdef 17.70 abc 22.13 ab
Thz-3 T. harzianum 12.20 bcdef 21.90 ab 22.50 ab
Tk-1 T. koningii 11.47 bcdef 21.80 ab 20.13 abc
Tl-13 T. longibrachiatum 11.10 bcdef 11.03 bcd 24.67 a
Thz-5 T. harzianum 09.23 bcdef 21.20 ab 23.06 ab
T-52 T. sp 08.33 bcdef 18.83 ab 15.50 abc
Tl-9 T. longibrachiatum 07.03 defg 18.03 abc 19.60 ab
Tar-1 T. artroviride 06.53 cdef 17.90 abc 18.03 abc
Tl-12 T. longibrachiatum 03.97 fgh 08.53 cd 19.37 abc
Tvs-1 T. virens 03.37 efgh 11.27 bcd 10.30 cde
Tl-11 T. longibrachiatum 00.43 gh 17.03 abc 21.87 ab
Testigo 00.00 h 00.00 e 00.00 f 1Medias seguidas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de
Tukey (P=0.05).
21.90% a 17.10%. El porcentaje de inhibición presentado por T. koningii fue de
21.80%. La especie Trichoderma spp. presentó un efecto de inhibición de 18.83%. La
cepa de T. artroviride tubo un porcentaje de inhibición de 17.90 y T. virens presetó
efecto de inhibición de 11.27%. La prueba de comparación de medias no permitió
separar claramente las medias. El mayor porcentaje de inhibición lo presentó
presumiblemente la cepa Tl-4 de T. longibrachiatum con el 25.47%. El menor
porcentaje de inhibición lo presentó la cepa Tl-10 con el 6.90% (Cuadro 14).
Para los 49 días las cepas de T. longibrachiatum presentaron una variación en el
porcentaje de inhibición de 24.67% a 4.17%. Las cepas de T. harzianum variaron en la
inhibición de 23.06% a 6.20%. La especie T. koningii presentó una inhibición del
20.13%. La cepa de T. artroviride presentó efecto antibiótico de 18.03%, seguido por
Trichoderma spp. con 15.50% y la cepa T. virens con el 10.30%. La prueba de
comparación de medias no separó claramente las medias. El mayor porcentaje de
inhibición lo presentaron las cepas Tl-13, Tl-4 y Tl-1 con el 24.67, 24.33 y 23.93%, las
cuales no son significativamente diferentes. El menor porcentaje de inhibición fue para
la cepa Tl-5 con el 3.77% (Cuadro 14).
4.3. Micoparasitismo de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis
Se encontró que 21 de las 22 cepas presentaron efecto micoparasítico sobre el
fitopatógeno (Cuadro No. 16).
Diez cepas de T. longibrachiatum (Tl-1, Tl-2, Tl-3, Tl-4, Tl-5, Tl-6, Tl-7, Tl-11, Tl-12 y Tl-
13), presentaron enrollamiento sobre M. fijiensis, destacando, de éstas las cepas Tl-3
y Tl-11, las cuales presentaron un enrollamiento más claro sobre el fitopatógeno; 5
cepas de T. harzianum (Thz-1, Thz-2, Thz-3, Thz-4 y Thz-5); T. artroviride (Tar-1); T.
koningii (Tk-1); T. virens (Tvs-1) y Trichoderma no identificada (T-52), también
presentaron el efecto de enrollamiento sobre el fitopatógeno (Fig. 1 y 2).
Cuadro 15. Niveles de micoparasitismo de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis.
Observados en 10 diferentes campos.
No. Especie Enrollamiento Penetración Estrangulamiento
Colapso Esporulación
Tl-1 T. longibrachiatum
2X - - X X
Tl-2 T. longibrachiatum
2X - - - X
Tl-3 T. longibrachiatum
3X 2X - X X
Tl-4 T. longibrachiatum
3X X - - -
Tl-5 T. 2X - - - -
longibrachiatum
Tl-6 T. longibrachiatum
X - - - X
Tl-7 T. longibrachiatum
2X X X - -
Tl-8 T. longibrachiatum
- - - 2X -
Tl-9 T. longibrachiatum
- - - - 2X
Tl-10 T. longibrachiatum
- - - - -
Tl-11 T. longibrachiatum
4X 2X - 2X -
Tl-12 T. longibrachiatum
3X 2X - - -
Tl-13 T. longibrachiatum
3X X - - -
Thz-1 T. harzianum 3X - - - X
Thz-2 T. harzianum 2X - - - -
Thz-3 T. harzianum 3X - - X -
Thz-4 T. harzianum 3X - - X -
Thz-5 T. harzianum 2X X - X -
Tar-1 T. artroviride 3X X - X X
Tk-1 T. koningii 2X X - - -
Tvs-1 T. virens 3X - - X X
T-52 T. sp 2X X - X X
( - ) Ausncia de micoparasitismo
(2X) de un promedio de 4 muestras, número de veces que se observó el tipo de
micoparasitismo.
Presentaron penetración de las hifas de M. fijiensis seis cepas de la especie T.
longibrachiatum (Tl-3, Tl-4, Tl-7, Tl-11, Tl-12 y Tl-13); 1 de la cepa T. harzianum (Thz-5);
T. artroviride (Tar-1); T. koningii (Tk-1) y Trichoderma sp. (T-52) (Cuadro 15).
La especie T. longibrachiatum (Tl-7) presentó estrangulamiento de las hifas de M.
fijiensis (Cuadro 15).
El colapso de las hifas de M. fijiensis por efecto de Trichoderma lo mostraron 4 cepas
de T. longibrachiatum (Tl-1, Tl-3, Tl-8 y Tl-11); 3 cepas de T. harzianum (Thz-3, Thz-4 y
Thz-5); T. artroviride (Tar-1); T. virens (Tvs-1) y Trichoderma sp. (T-52) (Fig. 2).
Se observó esporulación de Trichoderma sobre el micelio de M. fijiensis en 5 cepas
de la especie T. longibrachiatum (Tl-1, Tl-2, Tl-3, Tl-6 y Tl-9); T. harzianum (Thz-1); T.
artroviride (Tar-1); T. virens (Tvs-1) y Trichoderma sp. (T-52) (Fig 1).
Figura 1. Mocrografía de microscopio electrónico de barrido de la inteacción entre T. longibrachiatum (TI-3) y M. fijiensis. (A) Hifa de Trichoderma enrollado y penetrando sobre M. fijiensis. (B) Espoluración de Trichoderma sobre M. fijiensis.
Figura 2. Mocrografía de microscopio electrónico de barrido de la inteacción entre T. longibrachiatum (TI-11) y M. fijiensis. (A) Hifa de Trichoderma enrollandose sobre M. fijensis. (B) Enrrollamiento y copalso de hifas de M. fijiensis.
V. DISCUSIÓN
5.1 Producción de enzimas hidrolíticas por cepas nativas de diferentes especies
de Trichoderma
Desde los trabajos pioneros de Weindling (1934), mucho se ha debatido, sobre la
actividad de Trichoderma contra fitopatógenos, y el papel de las enzimas en los
procesos antagónicos. La producción y secreción de enzimas degradadoras de la
pared celular, principalmente quitinasas y glucanasas, que afectan la integridad de las
membranas fúngicas y la pared celular, son consideradas una gran herramienta en los
procesos antagónicos de especies de Trichoderma (Soler et al., 1999), ya que las
enzimas degradadoras juegan un papel importante en el control de enfermedades, por
el debilitamiento de la pared celular del fitopatógeno, lo cual facilita la difusión de
antibióticos dentro de la membrana citoplasmática (Worasatit et al., 1994).
Los resultados de esta investigación muestran, que todas las cepas nativas evaluadas
fueron capaces de producir quitinasas y glucanasas; lo que confirma lo reportado por
Carsolio et al., (1999) que Trichoderma es capaz de producir ambas enzimas, las
cuales son utilizadas en el control biológico de fitopatógenos. Se menciona que entre
mayor es la cantidad producida de estas enzimas, mayor es la posibilidad de inhibir el
crecimiento del micelio del fitopatógeno, por lo que los aislados con mayor producción y
actividad enzimática pueden ser prospectos para utilizarse como agentes de control
biológico, como lo propone Lorito et al.,(1994) quienes agregan además que a mayor
concentración enzimática se reduce la germinación de esporas de B. cinerea.
Las especies nativas evaluadas en este estudio fueron; T. longibrachiatum, T.
harzianum, T. koningii, T. virens, T. artroviride y Trichoderma spp.; Harrison y Steward,
(1988), Roberts y Lumsden, (1990) y Etebarian et al., (2000) reportan que T. virens
produce enzimas, las cuales juegan un papel importante en el control de hongos
fitopatógenos. Del mismo modo, se menciona que la especie T. koningii produce
quitinasas, glucanasas, xilanasas y celulasas (Worasatiti et al.,1994). Además, se
reporta que la especie T. harzianum produce enzimas degradadoras de la pared
celular y que tienen efectividad en el control biológico de enfermedades en plantas
(Bruce et al., 1995; Thrane et al., 1997; Carsolio et al., 1999). Hasta el momento no se
han encontrado referencias sobre la producción de enzimas por las especies T.
longibraquiatum y T. artroviride, por lo que, al parecer este es el primer reporte en
donde se obtiene que estas especies del hongo también producen enzimas y estos
datos comprueban que Trichoderma es un productor de enzimas hidrolíticas.
Nuestros resultados coinciden con los reportados por Bruce et al., (1995); quienes
reportan una mayor producción de glucanasas que de quitinasas, pero con diferencias
en sus valores y aún, entre cepas de la misma especie. Los mayores valores de
actividad por glucanasas en esta investigación, lo presentó la cepa Tl-12 de la especie
T. longibrachiatum con 1.487 µmol glucosa/ml/h. Bruce et al.,(1995), reportan una
actividad total para diferentes especies de Trichoderma de 0.12 a 3.96 µmol
glucosa/h, y una actividad específica de 0.38 a 3.07 µmol glucosa/h/mg de proteína . En
otra investigación Znidarsic et al., (1995) reportan la producción de glucanasas por T.
harzianum de 0.91µmol glucosa/h y para quitinasas de 2.53µmol N-
acetylglucosamina/h. Soler et al., (1999) obtuvieron producciones de glucanasas de 0.5
a 3.2 µmol de glucosa utilizando diferentes cepas de Trichoderma en el medio de
cultivo Czapek. Probablemente sus valores se debieron a la composición del medio en
el cual se produjeron las enzimas, ya que es el principal factor para la producción de
enzimas (Bruce et al., 1995; Znidarsic et al., 1995; Castoria et al., 1997). En esta
investigación se utilizó el medio de cultivo líquido propuesto por Bruce et al.,(1995),
Hadar et al., (1979), Harman et al., (1993).
Para quitinasas las mayores producciones de esta enzima la presentaron 2 cepas de
la especie T. harzianum (Thz-5 y Thz-4) y Trichoderma spp. (T-52) con una actividad
total de 0.05933, 0.05900 y 0.05833 µmol N-acetyglucosamina/ml/h respectivamente,
los cuales son valores menores a los reportados por Bruce et al., (1995) con 3.96 µmol
N-acetyglucosamina/ml/h y Hadar et al., (1979) que reporta 2.50 µmol N-
acetyglucosamina/h ambos, para la especie T. harzianum. Para actividad específica
Bruce et al., (1995) reporta valores que van de 0.008 a 0.416 µmol N-
acetylglucosamina/h/mg de proteína. Las diferencias en la producción de enzimas
puede deberse a la variación interespecífica que presentan las diferentes especies de
Trichoderma (Samuels, 1996).
5.2 Ensayos de inhibición de enzimas quitinasas y glucanasas de Trichoderma
sobre el crecimiento de micelio de M. fijiensis.
Se reporta que las especies de Trichoderma producen las enzimas quitinasas y
glucanasas para degradar la pared celular del fitopatógeno y así disminuir los niveles
de propagación de éstos (Haran et al., 1995); De acuerdo a Siwek et al., (1997) las
enzimas hidrolíticas producidas por las cepas de Trichoderma spp. son las
responsables de la inhibición in vitro de hongos. Hasta la fecha no se encontraron
investigaciones que relacionen al hongo Trichoderma como agente de control biológico
de M. fijiensis.
En este trabajo se encontró variabilidad en el efecto de las enzimas quitinasas y
glucanasas producidas por las especies de Trichoderma y las diversas cepas
examinadas sobre el crecimiento de micelio de M. fijiensis, desde los siete días
después de la inoculación. En lo que respecta a las glucanasas, destaca la cepa Tl-13
de la especie T. longibrachiatum que inhibó un 22.87%. El mayor efecto de inhibición
por quitinasas se obtuvo con la cepa Tl-6 de T. longibrachiatum con el 28.30%
respectivamente. Se le dió mayor importancia al efecto de inhibición que presentó
Trichoderma sobre M. fijiensis a los siete días después de la inoculación, debido a que
se está buscando la cepa que presente un efecto en el menor tiempo posible, ya que M.
fijiensis es una enfermedad explosiva, la cual, bajo condiciones favorables se
desarrolla muy rápidamente, presentando pérdidas considerables en el cultivo (Chuang
y Jeger, 1987).
La comparación de medias para porcentaje de inhibición nos da un sobrelapamiento
entre los diferentes valores, esto puede ser debido al número de repeticiones en los
tratamientos, los cuales debieron de ser más de cuatro.
Ji y Kuc, (1996) reportan la inhibición del 50% de crecimiento de Colletotrichum
lagenarium por glucanasas y 75% de inhibición por efecto de quitinasas. De la misma
manera Sivan et al., (1984) reportan a la especie T. harzianum T-315, la cual inhibe el
crecimiento in vitro de Pythium aphanidermatum en un 83%; en resultados obtenidos
por Etebarian et al.,(2000) con las especies T. harzianum T39 y T. virens DAR 74290,
obtienen reducción del crecimiento de micelio de Phytophthora erythroseptica en 49-
54% y 49-71% respectivamente.
No se encontró correlación entre actividad enzimática y la inhibición de micelio de M.
fijiensis (r2 =0.0579 para quitinasas) y (r2=0.1324 para glucanasas); lo cual de acuerdo
a Elad, (2000), el potencial de producción de enzimas por especies de Trichoderma no
es necesariamente garantía de que sean buenos agentes de control biológico. Estos
resultados no concuerdan con lo citado por Carsolio et al., (1999) y Lorito et al., (1994)
quienes reportan que a mayor actividad enzimática el efecto inhibitorio contra
fitopatógenos es mayor.
De acuerdo a Lorito et al., (1993), las enzimas quitinolíticas de T. harzianum son
fuertes agentes antifúngicos in vitro, especialmente cuando se utilizan en combinación;
más aún si existe sinergismo positivo de actividad quitinolítica y glucanolítica; en este
estudio, el efecto de sinergismo entre ambas enzimas sobre la inhibición de
crecimiento de micelio de M. fijiensis no se evaluó. Es probable que el efecto se
atribuya al ataque enzimático sobre la quitina recientemente formada, en el crecimiento
apical de las hifas, perturbando el balance entre la síntesis e hidrólisis requerida, para
el crecimiento de estas; lo anterior, sugiere, que las quitinasas y glucanasas, son
ordenadamente inducidas sobre los fitopatógenos que atacan a las plantas
(Schlumbaum et al., 1986). Se tiene reportado el control de B. cinerea por T. harzianum
T39, la cual, obstruye la germinación de conidias (Zimand et al., 1996). Mauch et al.,
(1988) demostró directamente que las quitinasas y glucanasas inhiben el crecimiento
de hongos fitopatógenos a concentraciones más bajas de 10 a 30 µg/ml.
5.3 Micoparasitismo de Trichoderma spp. sobre M. fijiensis.
El micoparasitismo es un proceso complejo, la habilidad de las especies de
Trichoderma de micoparasitar, se ha demostrado en diferentes hongos fitopatógenos
(Benhamou y Chet, 1993), las hifas de Trichoderma crecen sobre su hospedero y se
enrollan alrededor de él o producen ramificaciones cortas, que rodean apretadamente
las hifas del fitopatógeno; el enrollamiento denso y la disolución de la pared celular, del
hospedero se observa como un proceso continuo (Inbar et al., 1996); y algunas veces
se observa la penetración de las hifas del antagonista sobre el hospedero (Carsolio et
al., 1999).
En este estudio se observó que todas las cepas, salvo la Tl-10, de Trichoderma,
hicieron contacto con M. fijiensis, solo que a diferentes tiempos. Inicialmente se
observó un sobrecrecimiento de Trichoderma sobre el micelio de M. fijiensis, lo cual es
un carácter ventajoso en la disputa por colonizar el área, compitiendo por espacio y
nutrientes; ésta es una manera de ejercer biocontrol, al reducir o detener
completamente el desarrollo del micelio (Dennis y Webster, 1971 a,b).
Dos cepas de la especie T. longibrachiatum (Tl-11 y Tl-3) presentaron los mayores
efectos, con un enrollamiento constante de sus hifas sobre M. fijiensis, desde el primer
día de contacto y la penetración de las hifas del antagonista sobre el hospedero al
tercer día de contacto y esporulación de ambos hongos. Estos resultados son similares
a los reportados por Elad et al., (1983), Benhamou y Chet, (1993) y Benhamou et al.,
(1997), quienes presentaron evidencias del enrollamiento de Trichoderma spp. en hifas
de varios fitopatógenos, entre ellos R. solani, S. rolfsii, y B. cinerea. Por su parte
Benhamau y Chet (1993) reportan en la zona de interacción entre Trichoderma y R.
solani daños en las hifas de R. solani justo después de iniciado el enrollamiento de
Trichoderma sobre el hospedero. Elad et al., (1996) reportan el enrollamiento denso
de las hifas de T. harzianum sobre S. Sclerotiorum y la disolución de la pared celular
como un proceso continuo. De acuerdo a Bélanger et al., (1195) después de un
enrollamiento persistente se observan signos de deformación, como son aparentes
arrugas mostradas por las células de la superficie del hospedero, deformaciones
pronunciadas y perdidas de turgencia
En este estudio el colapso de micelio fue observado en 10 cepas, 4 fueron de la
especie T. longibrachiatum (Tl-1, Tl-3, Tl-8 y Tl-11); 3 cepas de T. harzianum (Thz-3,
Thz-4 y Thz-5), y las cepas T. artroviride (Tar-1); T. virens (T-vs1) y Trichoderma sp (T-
52); estos hallazgos también son reportados por Benhamou et al., (1997), (Calistru, et
al., 1997). Se sugiere que este fenómeno es debido a la excreción de metabolitos
extracelulares o compuestos volátiles, una vez que el contacto entre ambas partes se
establece (Benhamou y Chet, 1993), lo cual trae como consecuencia la pérdida de
turgencia del micelio del fitopatógeno provocando su muerte (Carsolio et al., 1999).
Se observo también, una esporulación de 9 cepas de Trichoderma sobre el micelio de
M. fijiensis, de las cuales 5 fueron de T. longibrachiatum (Tl-1, Tl-2, Tl-3, Tl-6 y Tl-9); 1
de T. harzianum (Thz-1); T. artroviride (Tar-1); T. virens (Tvs-1) y Trichoderma spp. (T-
52), lo cual es otra característica importante, dado que se producen enzimas o
compuestos volátiles en la interfase, los cuales pueden afectar el crecimiento del
fitopatógeno ya sea por modificación de su permeabilidad o hidrolizando la pared
celular, tal como lo mencionan Ribamar y Oliveira, (1998), y por lo tanto la esporulación.
No se encontró reportes que señalen la presencia de micoparasitismo entre especies
de Trichoderma y M. fijiensis, por lo que lo encontrado en esta investigación sienta las
bases, para la continuación del estudio sobre la potencialidad del uso de especies de
Trichoderma para el control biológico de M. fijiensis. Hasta el momento se constata
que diferentes cepas de Trichoderma son capaces de producir enzimas con actividad
antibiótica, además presentan micoparasitismo sobre M. fijiensis, agente causal de
Sigatoka Negra en plátano.
VI. CONCLUSIONES
Bajo las condiciones en que se llevó a cabo la presente investigación se puede concluir
lo siguiente:
Se demostró que todas las cepas fueron capaces de producir las enzimas hidrolíticas,
con niveles que varían de 0.009 a 0.05933 µmoles de N-acetylglucosamina/h y 0.056 a
1.487 µmoles de glucosa/h, para quitinasas y glucanasas respectivamente.
Las enzimas quitinasas y glucanasas presentan actividad antibiótica sobre el
crecimiento de micelio de M. fijiensis, a partir de 0.009 µmoles de N-acetylglucosamina
para quitinasas y 0.056 µmoles de glucosa para glucanasas.
Es el primer reporte que se tiene de producción de glucanasas y quitinasas por T.
longibrachiatum y T. artroviride.
Las diferentes especies de Trichoderma presentan actividad micoparasítica sobre M.
fijiensis.
No existen investigaciones que relacionen a Trichoderma spp. como agente de control
de M. fijiensis.
Igualmente, las glucanasas presentaron inhibición sobre el crecimiento de micelio de M.
fijiensis, este varió de 1.20 a 22.87% para los 7 días después de la inoculación; 6.17 a
32.63% para los 28 días después de la inoculación y de 8.10 a 31.53% para los 49 días
después de la inoculación. El efecto inhibitorio de las quitinasas, varió de 0.43 a
28.30% para los 7 días espués de la inoculación; de 6.90 a 25.47% para los 28 días
después de la inoculación y de 3.77 a 24.67% para los 49 días después de la
inoculación.
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UNWIXGIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 294/2002.
C. MARIA ELENA OCHOA MORENOEGRESADA DE LA MAESTRIA EN CIENCIASAREA: BIOTECNOLOGIAP R E S E N T E .
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: deBiotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de queefectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes delmismo, se le autoriza la impresión de la tesis ” ANTIBIOSIS Y MICOPARASITISMO DECEPAS NATIVAS DE Trichoderma spp. (HYPHOMYCETES: HYPHALES), SOBREMycosphaerella fijiencis (LOCULOASCOMYCETES: DOTHIDEALES) “, misma que hasido dirigida por los C.C. Dr. Oscar Rebolledo Dominguez y Dr. Roberto Lezama Gutierrez,Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Maestra en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a formay contenido por los C.C. Dr. Roberto-Lezama Gutierrez, Dr. Sergio Aguilar Espinosa y el Dr.Alfonso Pescador Rubio, Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento, reciba un cordial saludo.
A T E N T A M E N T E‘-“ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA”
10 DEL 2002., ,:ì
ING. RODOLFO ENTÍN DELGADO
C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNOC.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO.RVMD/Lety**
Of. No. 294/2002.
Km 40 hutopista Colima-Manzanillo ?? Tecomán, Colima, México ?? C.P. 28100Tel. 01 (313) 322 94 05 0 Ext. 52251 ? Fax 52252 ? [email protected]
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSARESPONSABLE DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA-FCBAP R E S E N T E . -
Por este conducto, los abajo firmantesinvestigadores de la
profesores-Univ. D e Colima, hacemos de su
conocimiento que después de haber revisado el borrador detesis tituladode
"Antibiosis y micoparasitismo de cepas nativasTrichodenna SPP- (Hyphomycetes:Hyphaales), sobre
Mycosphaerella fijiensis (Loculoascomycetes:Dothideales", quepresenta la C-María Elena Ochoa Moreno, egresada del posgradoen Biotecnología de esta Facultad, consideramos que reúne loselementos suficientes de contenido y forma de un documento deMaestría. Por ello, expresamos nuestra aprobación para que seimprima y se sigan los tramites académicos que correspondan.
Sin otro particular, le saludamos cordialmente
ATENTAMENTETecomán, Col ima, a 21 de Junio de 2002
D r . Rober&ierrez Dr$$$~~o!?~%o
c.c.p. Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado.- Director de laF.C.B.A.c.c.p. Interesadoc.c.p. Archivo Personal
UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
COORDINACIÓN DE POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ING. RODOLFO V. MORENTÍN DELGADODIRECTOR DE LA F.C.B.A.PRESENTE
En atención a que la C. María Elena Ochoa Moreno, alumnaegresada de la Maestría en Ciencias, área Biotecnología, connúmero de cuenta 98-3030, ha realizado todas las correccionesal manuscrito de tesis que presentó al cuerpo académico derevisores, constituido por: Dr. Roberto Lezama Gutierrez, Dr.Sergio Aguilar Espinosa, ambos profesores investigadores dela FCBA de la U de C. y el Dr. Alfonso Pescador RubioDirector del CUIDA-UdeC Me dirijo respetuosamente parasolicitarle la autorización de impresión de la tesistitulada: "Antibiosis y micoparasitismo de cepas nativas deTrichoderma SPP* (Hyphomycetes:Hyphaales) , sobreMycosphaerella fijiensis (Loculoascomycetes:Dothideales".
Esta tesis ha sido dirigida por el' Dr. Oscar RebolledoDomínguez y el Dr. Roberto lezama, ambos profesores-investigadores de la FCBA de la U de C.
Sin otro asunto más que tratar, me es grato reiterarle midisposición en todas las actividades que me encomiende.
Reciba mi agradecimiento, saludo y consideración distinguida.
Atentamente
Estudia*Lucha*Trabaja
Tecomán, Colima a 21 de Junio de 2002
lar EspinosaResponsable de Posgrado
c.c.p. Expediente Académico del Alumnoc.c.p Interesadoc.c.p. Archivo
