Upload
others
View
3
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
ANÁLISIS DE RESIDUOS DE VERDE DE MALAQUITA Y LEUCOVERDE DE MALAQUITA EN CAMARÓN ECUATORIANO DE EXPORTACIÓN
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO
AUTOR:
CHRISTIAN DAVID CHICAIZA VERA.
TUTOR: Lcda. MIGDALIA MIRANDA MARTÍNEZ PhD.
GUAYAQUIL - ECUADOR
2018
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO: Análisis de residuos de verde de malaquita y leucoverde de malaquita en camarón ecuatoriano de exportación
AUTOR: Chicaiza Vera Christian David
TUTORA: Lcda. Miranda Martínez Migdalia PhD
INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil
UNIDAD/FACULTAD: Ciencias Químicas
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD: Química y Farmacia
GRADO OBTENIDO: Tercer Nivel – Químico y Farmacéutico
FECHA DE PUBLICACIÓN: 2018 No. DE PÁGINAS: 45
ÁREAS TEMÁTICAS: Inocuidad alimentaria y definición de protocolos en caso de muestras positivas
PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS:
Camarón, LC-MS/MS, verde de malaquita, leucoverde de malaquita.
RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras): Con el desarrollo de los sistemas de producción intensiva e hiperintensiva del camarón, han aparecido también una serie de factores productores de mortalidad, que actúan directa e indirectamente sobre las poblaciones cultivadas con impactos de diferentes magnitudes. Estos factores van desde organismos parásitos patógenos hasta factores fisicoquímicos propios de la ecología de los acuarios, además de la acción de organismos depredadores y errores humanos en el manejo del cultivo. Todo ello ha conllevado al empleo de distintos medicamentos y sustancias químicas para prevenir o tratar enfermedades, controlar los parásitos, ayudar al proceso productivo y favorecer el crecimiento. De ahí que la utilización no reglamentada de algunos ingredientes como conservantes y colorantes empleados con fines de control de enfermedades, puede también ocasionar un riesgo en la inocuidad de los alimentos y del medio ambiente. En este proyecto se desarrolló el estudio durante seis meses sobre la presencia en productos de exportación de dos colorantes: verde malaquita (VM) y leuco verde malaquita (LVM), en muestras de camarón de exportación, analizadas en el periodo de julio a diciembre del año 2015 y que son usados como antimicrobianos. Los resultados indicaron que, durante los meses de estudio, no se detectó la presencia de los colorantes VM y LVM en las muestras analizadas. La aplicación de la técnica LC-MS/MS, resultó adecuada para este tipo de análisis.
ADJUNTO PDF: SI NO
CONTACTO CON AUTOR:
Teléfono: 0993424129 4541746
E-mail: [email protected]
CONTACTO CON LA INSTITUCIÓN:
Nombre: Secretaria Ciencias Químicas Teléfono: (04)2-293680 E-mail: www.fcq.ug.edu.ec
X
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
AGRADECIMIENTO En el presente trabajo de tesis mi agradecimiento va dirigido primordialmente hacia Dios, por permitirme llegar a estas instancias de mi vida tanto personal como profesional. Especial agradecimiento hacia mi madre Olga Vera García, mis hermanos Johanna Castro Vera, Steven Chicaiza Vera, por apoyarme durante toda esta travesía que es mi formación como futuro profesional. Agradezco a la Facultad de Ciencias Químicas, así como también a cada uno de los docentes que impartieron sus conocimientos y sus experiencias propias de la vida profesional. Mi agradecimiento al Instituto Nacional de Pesca y a la Ing. Fernanda Hurtado, al laboratorio de HPLC-MS/MS en el cual me ayudaron con sus conocimientos a realizar mi tesis la QF. Fátima Chalen, QF. Manuel Cambisaca y QF. Diana Palacios.
Finalmente, le agradezco a mi tutora la PhD. Migdalia Miranda, y QF. Celeste Carrillo para ayudarme en este proceso diario de realización de este trabajo.
I
ÍNDICE GENERAL
Contenido INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
Problema ....................................................................................................................... 3
Hipótesis ........................................................................................................................ 3
Objetivo general ........................................................................................................... 3
Objetivos específicos ................................................................................................... 3
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. ......................................................... 4
I.1 CULTIVO DEL CAMARÓN ................................................................................... 4
I.1.1 Obtención de la semilla .................................................................................. 7
I.1.2 La Pre engorda ................................................................................................ 7
I.1.3 Fertilización de los estanques ....................................................................... 8
I.1.4 Fertilizantes orgánicos .................................................................................... 8
I.1.5 Fertilizantes inorgánicos ................................................................................. 8
I.2 PROBLEMAS DEL CULTIVO DE CAMARONES ............................................. 9
I.3 PRODUCTOS QUE MÁS SE EMPLEAN EN LOS CULTIVOS DE
CAMARONES ............................................................................................................. 10
I.3.1 Alimentos naturales ....................................................................................... 10
I.4.- METODOLOGIA ANALITICA ........................................................................... 15
I.4.1 Cromatografía liquida.................................................................................... 15
I.4.2 Espectrometría de masas ............................................................................ 16
I.4.3 Acoplamiento LC-MS/MS ............................................................................. 18
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................... 20
II.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................... 20
II.2 DELIMITACION ................................................................................................... 20
II.3 MUESTRA ............................................................................................................ 20
II.4 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS ...................................................... 20
II.4.1. Equipos ......................................................................................................... 20
II.4.2. Materiales ..................................................................................................... 21
II
II.4.3. Reactivos ...................................................................................................... 21
II.4.4 Estándares .................................................................................................... 21
II.5 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO ............................................................ 22
II.5.1 Preparación de soluciones estándar ............................................................. 22
II.5.2 Preparación de curva de calibración ............................................................... 24
II.5.3 Preparación de reactivos (hidroxilamina) ........................................................ 26
II.5.4 Preparación de la fase móvil ............................................................................ 26
II.6 CONDICIONES ANALÍTICAS ....................................................................... 27
II.6.1 Verificaciones preliminares ............................................................................... 27
II.6.2 Registro de observaciones y de los resultados ........................................... 30
II.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS .................................................................. 30
II.7.1 Preparación del blanco de reactivo ................................................................. 31
II.7.2 Preparación del blanco matriz .......................................................................... 31
II.7.3 Fortificación de las muestras de control .......................................................... 31
II.7.4 Extracción de muestras .................................................................................... 31
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. .................................................... 33
CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................. 39
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 41
III
ÍNDICE DE TABLAS
Contenido
Tabla I. Cantidad en µl de soluciones de estándares y agua pura utilizadas para
la preparación de la curva de calibración de verde de malaquita y leucoverde de
malaquita. .......................................................................................................... 25
Tabla II. Gradientes de concentraciones de la fase móvil. ................................. 27
Tabla III. Transiciones monitoreadas para la detección de (verde y leucoverde de
malaquita) .......................................................................................................... 29
Tabla IV. Valores de tiempos de retención (Tr) y áreas para la concentración de
1 µg/kg de los patrones. .................................................................................... 34
ÍNDICE DE FIGURAS Contenido Figura 1. Etapas del cultivo del camarón ............................................................ 6
Figura 2. Estructura química del verde de malaquita ........................................ 12
Figura 3. Estructura química del leucoverde de malaquita ................................ 13
Figura 4. Cromatogramas de los estándares de VM y LVM .............................. 34
Figura 5. Curva de calibración para el LVM D6 empleado como patrón interno. 35
Figura 6. Curva de calibración para VM. ........................................................... 35
Figura 7. Curva de calibración para LVM. ......................................................... 36
Figura 8. Cromatogramas de VM y LVM en matrices de camarón. ................... 36
IV
RESUMEN
Con el desarrollo de los sistemas de producción intensiva e hiperintensiva del
camarón, han aparecido también una serie de factores productores de
mortalidad, que actúan directa e indirectamente sobre las poblaciones cultivadas
con impactos de diferentes magnitudes. Estos factores van desde organismos
parásitos patógenos hasta factores fisicoquímicos propios de la ecología de los
acuarios, además de la acción de organismos depredadores y errores humanos
en el manejo del cultivo. Todo ello ha conllevado al empleo de distintos
medicamentos y sustancias químicas para prevenir o tratar enfermedades,
controlar los parásitos, ayudar al proceso productivo y favorecer el crecimiento.
De ahí que la utilización no reglamentada de algunos ingredientes como
conservantes y colorantes empleados con fines de control de enfermedades,
puede también ocasionar un riesgo en la inocuidad de los alimentos y del medio
ambiente. En este proyecto se desarrolló el estudio durante seis meses sobre la
presencia en productos de exportación de dos colorantes: verde malaquita (VM)
y leuco verde malaquita (LVM), en muestras de camarón de exportación,
analizadas en el periodo de julio a diciembre del año 2015 y que son usados
como antimicrobianos. Los resultados indicaron que durante los meses de
estudio, no se detectó la presencia de los colorantes VM y LVM en las muestras
analizadas. La aplicación de la técnica LC-MS/MS, resultó adecuada para este
tipo de análisis.
Palabras clave
Camarón, LC-MS/MS, verde de malaquita, leucoverde de malaquita.
V
ABSTRACT
With the development of intensive and hyperintensive shrimp
production systems, a number of mortality-producing factors have also
appeared, which act directly and indirectly on farmed populations with
impacts of different magnitudes. These factors range from pathogenic
parasitic organisms to physicochemical factors specific to aquarium
ecology, as well as the action of predatory organisms and human errors in
crop management. All this has led to the use of different drugs and
chemical substances to prevent or treat diseases, control parasites, help
the production process and promote growth. Hence, the unregulated use
of some ingredients such as preservatives and colorings can also cause a
risk in food safety and the environment. In this project, the study was
carried out for six months on the presence of two dyes: malachite green
(VM) and malachite green leuco (LVM) in export products, analyzed in the
period from July to December. Year 2015 and are used as antimicrobials.
The results indicated that during the study months, although the presence
of the VM and LVM dyes was detected in the analyzed samples, the
concentrations were well below the limits established by the International
Standards. The application of the LC-MS/MS technique was adequate for
this type of analysis.
Keywords
Shrimp, LC-MS / MS, malachite green, leucomalachite green.
1
INTRODUCCIÓN
El porcentaje de la producción pesquera mundial utilizada para el consumo
humano directo ha aumentado considerablemente en los últimos decenios,
pasando del 67 % en la década de los 60 al 87 % (más de 146 millones de
toneladas) en 2014. En los últimos cinco decenios, el crecimiento del suministro
mundial de pescado destinado al consumo humano ha sido superior al de la
población y el consumo mundial aparente de pescado per cápita se ha
duplicado, pasando de unos 10 kg en el decenio de 1960 a los 20 kg en la
actualidad (FAO, 2016).
La acuicultura se define como ‘’el arte de multiplicar y cultivar las especies
animales y plantas acuáticas ‘’. Engloba todas las actividades que tienen por
objeto la producción, crecimiento (desarrollo) y comercialización de organismos
acuáticos, animales o vegetales, de aguas dulces, salobres o saladas
(maricultura) (Barnabé, 1991).
No obstante, dicha producción presenta una problemática referida a aspectos
biológicos y técnicos consecuencia de la producción masiva de especies, así
como problemas de índole ecológica (posible impacto de las instalaciones),
social (posibles competencias con el sector pesquero tradicional), e incluso legal
(utilización de espacios comunes como son costas y áreas de mar). Así mismo,
uno de los principales problemas a los que se enfrenta es la aparición de
enfermedades infecciosas causada por virus, bacterias, hongos y parásitos
(Castello Orvay, 1993).
Con el objetivo de reducir este tipo de enfermedades, se suelen adicionar
compuestos antimicrobianos, generalmente en los alimentos, originando un
problema si no se administran al principio del brote, antes de que aparezca la
pérdida del apetito en los animales (Castello Orvay, 1993).
Como alternativa, se emplean baños cortos de antibióticos a concentraciones
elevadas o baños largos a bajas concentraciones (Castello Orvay, 1993).
2
En ocasiones, entre estos compuestos se emplean algunos colorantes
debidos a su bajo coste y alta efectividad. Así la presencia de ciertos colorantes
antimicrobianos en productos de mar (como los camarones) es una realidad,
como demuestran las alertas emitidas por la Unión Europea (UE) (RASFF,
2012).
Además de la detección de colorantes como resultado de su utilización en
baños para eliminar parásitos en acuicultura (Sudova & Machova, 2007), se
pueden encontrar en los productos de mar como consecuencia de hallarse en
aguas contaminadas con vertidos industriales que los contengan (Boxall y col.,
2003), aunque acostumbra a ser menos frecuente.
Un colorante es un compuesto orgánico que contiene grupos cromóforos y
auxócromos unidos a un anillo benceno (Kim, 2000). Son sustancias que dan
color a un alimento o le devuelven su color original; pueden ser componentes
naturales de los alimentos y de otras fuentes naturales que normalmente no se
consumen, ni se emplean como componentes característicos de los alimentos
(CE, 2008).
Se pueden clasificar en dos grandes grupos: colorantes naturales y
artificiales. A los colorantes naturales permitidos por el momento en alimentos
pertenecen el β-caroteno, el jugo de remolacha roja, los zumos de frutas de
cereza, naranja, pimentón, así como la clorofila (Lindner, 1994). Por otro lado,
entre los colorantes sintéticos tenemos el amarillo de quinoleína o eritrosina
(BOE, 1996), o el empleo de verde de malaquita como medicamento veterinario
en peces ornamentales (JOINT/ FAO/WHO, 2008).
En este proyecto desarrolla el estudio durante seis meses sobre la presencia
en productos de exportación de dos colorantes: verde de malaquita y leuco
verde de malaquita, usados como antimicrobianos en los cultivos de camarón.
3
Problema
¿Será factible la detección inequívoca de verde de malaquita y leucoverde de
malaquita mediante técnica analítica acoplada a espectrometría de masas en
tándem (MS/MS) en camarón ecuatoriano de exportación?
Hipótesis
Mediante la técnica analítica de HPLC acoplada a espectrometría de masas
en tándem (MS/MS), es posible detectar el verde de malaquita y el leucoverde
de malaquita de forma inequívoca.
Objetivo general
Evaluar la concentración de residuos de verde de malaquita y leucoverde de
malaquita en muestras de camarón de exportación, analizadas en el periodo de
julio a diciembre del año 2015
Objetivos específicos
Estudiar mediante LC-MS/MS, si existe contaminación por verde de malaquita
y leucoverde de malaquita en camarones ecuatorianos de exportación.
Definir el protocolo de control acorde a criterios del Instituto Nacional de
Pesca en caso de detección de muestras positivas.
4
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.
I.1 CULTIVO DEL CAMARÓN
El cultivo de cualquier organismo, requiere necesariamente del conocimiento
de aspectos tales como su anatomía y fisiología, alimentación, aspectos
reproductivos, efecto de parámetros ambientales, etcétera (Rojas y col., 2005).
Los camarones son artrópodos mandibulados con apéndices birrameados
articulados, con dos pares de antenas, caparazón, branquias y larvas nauplio
(Botello & Álvarez, 2013).
Los camarones del genero Penaeus, son considerados entre los más
importantes a nivel mundial, tanto para las pesquerías como para el cultivo. Los
miembros del genero Penaeus, han sido divididos por Pérez Farfante en el año
1969, en cuatro subgéneros: Penaeus, Litopenaeus, Fenneropenaeus,
Melicertus (Botello & Álvarez, 2013).
Uno de los parámetros más importantes en el cultivo del camarón es el
nutricional ya que, para lograr un desarrollo óptimo de organismos es
indispensable contar con todos los nutrimentos necesarios, tanto en cantidad
como en calidad (Rojas y col., 2005).
Podemos identificar dos grandes etapas de vida del camarón: la etapa de
desarrollo y la de la madurez. En la etapa de desarrollo el camarón requiere
nutrimentos indispensables para desarrollar todo su potencial genético; de esta
etapa dependen en gran medida las características físicas, como son peso y
talla, del camarón adulto. En la madurez, el camarón utiliza los nutrimentos para
mantener las características físicas y funcionales desarrolladas durante la etapa
de crecimiento y para la reproducción de la especie (Rojas y col., 2005).
El cultivo de camarón data de hace varios siglos y se ha venido practicando
en diferentes países. La forma de cultivar estos organismos ha sufrido diversas
modificaciones de acuerdo a los lugares y a las circunstancias en que se ha
5
llevado a cabo, por esta razón existe una gran cantidad de sistemas de cultivo,
desde los más extensivos, hasta los hipertensivos; muchas veces resulta difícil
establecer la frontera entre un sistema y otro (Programa de información de
especies acuáticas, 2006)
Por cuestión de orden se han establecido los siguientes parámetros para
diferenciar entre cuatro sistemas principales (Programa de información de
especies acuáticas, 2006)
✓ Sistema Extensivo. Es aquel en el que se siembra de 1 a 2 camarones
por metro cuadro y los organismos son mantenidos en condiciones
naturales sin alimentación. La semilla es por lo general obtenida del
medio natural.
✓ Sistema Semiintensivo. Aquí el número de camarones sembrados es de 6
a 10 por metro cuadro y los organismos, aun cuando son mantenidos en
condiciones ambientales naturales, se les proporciona alimento
suplementario. La semilla puede ser obtenida del medio natural o través
de cultivo larvario en condiciones controladas.
✓ Sistema Intensivo. El número de camarones sembrados originalmente en
este sistema, va de 20 a 40 por metro cuadrado, a los organismos se les
proporciona alimentación y aireación artificial para poder mantener estas
altas densidades de población. La semilla es obtenida a través de cultivo
larvario en laboratorio.
✓ Sistema Hiperintensivo. También conocido como superintensivo. En este
sistema se siembra de 200 a 500 organismos por metro cuadrado y los
camarones son mantenidos con alimentación artificial, aireación e
intercambio continuo de agua. La semilla proviene de cultivos larvarios de
laboratorio.
La elección de uno u otro sistema de cultivo depende de diferentes factores,
tales como: capital disponible para la inversión, disponibilidad de terrenos para el
cultivo, área geográfica (Programa de información de especies acuáticas, 2006).
6
En la figura 1 se representan las diversas etapas para el cultivo del camarón.
Figura 1. Etapas del cultivo del camarón
7
I.1.1 Obtención de la semilla
Las postlarvas y juveniles para la siembra eran obtenidos normalmente por
captura del medio natural, aunque en la actualidad existen ya, laboratorios de
producción de larvas. En la forma natural la semilla es capturada de los sistemas
estuarinos en las épocas de mayor abundancia (Silva Rubio & Bermúdez
Huertas, 2013).
Uno de los problemas que enfrenta este tipo de obtención de semilla, es que
la población natural de estos organismos está sujeta a fluctuaciones
estacionales ocasionadas por diferentes parámetros, de tal manera que es
impredecible la disponibilidad de suficientes existencias en el momento en que
estas sean requeridas. Por otra parte, existe el problema de que en cierta forma
se está compitiendo con los pescadores de este recurso al capturar grandes
cantidades de juveniles que deberían volver al mar como adultos. En razón de
esto es cada vez mayor la tendencia a cultivar las larvas que luego se utilizaran
para la siembra (Silva Rubio & Bermúdez Huertas, 2013).
I.1.2 La Pre engorda
Las post-larvas o juveniles capturados o cultivados son colocados en un pre-
criadero, que por lo general consiste de un estanque cavado en tierra y
previamente fertilizado para promover el desarrollo de micro algas y
posteriormente de otros organismos que sirva de alimento al camarón, en
densidades de 150 por metro cuadrado, son mantenidos en esta área por
espacio de unos 30 a 40 días, durante los cuales se les proporciona alimento
complementario. Se toma en cuenta especialmente algunos parámetros del agua
y del sedimento (Chávez-Sánchez & Higuera Ciapara, 2003; Moreno y col.,
2008; Silva Rubio & Bermúdez Huertas, 2013).
8
I.1.3 Fertilización de los estanques
Además del alimento artificial o en algunos sistemas, en vez de este, se
fertilizan los estanques con el fin de promover la producción natural de
organismos que pueden servir de alimento al camarón: fitoplancton, macroalgas,
zooplancton y bentos (anélidos, ostrácodos, otros crustáceos). Sin embargo, la
fertilización depende de una serie de factores que hay que tener en cuenta tales
como: temperatura, fotosíntesis, naturaleza del suelo, intercambio de agua
(Chávez-Sanchez & Montoya-Rodriguez, 2006; Moreno y col., 2008; Silva Rubio
& Bermúdez Huertas, 2013)
I.1.4 Fertilizantes orgánicos
Se utilizan principalmente: gallinaza, estiércol de ganado vacuno y de cerdo.
La proporción de fertilizante orgánico es variable y depende de la calidad de
agua y de la productividad del sistema, generalmente se utilizan entre 1000 y
3000 Kg por hectárea, por cultivo. Puede en ocasiones promover mejor el
crecimiento que los inorgánicos por contener micro elementos que no contienen
aquellos. La aplicación de fertilizantes no tratados, puede promover el
florecimiento de grandes cantidades de bacterias, algunas de las cuales pueden
ser dañinas para los organismos cultivados (Moreno y col., 2008; Silva Rubio &
Bermúdez Huertas, 2013)
I.1.5 Fertilizantes inorgánicos
Los más usados son la urea y el superfosfato y se distribuyen en proporción
de 50 a 1000Kg/ha. La fertilización se puede llevar a cabo al principio del cultivo
y durante el mismo o ambas cosas (Moreno y col., 2008).
9
I.2 PROBLEMAS DEL CULTIVO DE CAMARONES
Con el desarrollo de los sistemas de producción intensiva e hiperintensiva,
han hecho también su aparición una serie de factores productores de mortalidad
que actúan directa e indirectamente sobre las poblaciones cultivadas y con
impactos de diferentes magnitudes (Espinoza, 2014).
Estos factores van desde organismos parásitos patógenos hasta factores
fisicoquímicos propios de la ecología de los acuarios, además de la acción de
organismos depredadores y errores humanos en el manejo del cultivo
(Thompson, 2004; Ponce y col., 2005)
Los principales problemas registrados fueron debido a muertes por hipoxia,
producida por la infestación de la cámara branquial por bacterias filamentosas y
protozoarios pedúnculos del orden Peritrichidae, debido a fallas de
mantenimiento y errores de operación en lo que se refiere a la aplicación de los
tratamientos químicos preventivos, y la regulación de flujos y procedimientos de
limpieza (Leyton & Riquelme, 2008).
El manejo excesivo del camarón durante las labores de limpieza o durante el
levantamiento de muestras para la estimación de las variables de las
poblaciones, puede ser factor de mortalidad (Ponce y col., 2005; Jayasree,
2006).
En los cultivos a cielo abierto, la depredación por aves de diversos órdenes y
familias, ha ocasionado una pérdida de hasta el 50% de la producción esperada.
La relativa poca profundidad y la transparencia de la columna de agua hacen
muy disponible la población para los depredadores (Jayasree, 2006; Leyton &
Riquelme, 2008).
La muerte por el rebasamiento de los límites letales de los factores
fisicoquímicos, debido a fallas en el manejo de los sistemas de recirculación,
aireación, o control de los recambios de agua (Leyton & Riquelme, 2008).
10
Al respecto de la temperatura, se ha registrado en diversas ocasiones que el
rebasamiento de los límites de los 18-20 0C y los 30-32 0C hacia abajo y hacia
arriba respectivamente producen la disminución del consumo del alimento, que
se acumula en el piso de las estructuras de cultivo, donde su putrefacción
conduce a una baja de las condiciones sanitarias (Leyton & Riquelme, 2008).
El canibalismo es un factor que en determinados momentos produce
mortalidades abundantes en las diferentes etapas del ciclo de cultivo. Durante el
desarrollo de todas las etapas del cultivo, la aparición del canibalismo significa
también una probable deficiencia de los niveles de alimentación, por lo que
deben aumentarse las raciones de alimento balanceado (Espinoza., 2014).
También se acentúa cuando la temperatura excede los 29-30 0C, y sobre todo
si coincide con fases terminales de las etapas del cultivo, donde el síntoma
precedente es la hiperactividad de la población y la aparición de mudas masivas
(Espinoza., 2014).
I.3 PRODUCTOS QUE MÁS SE EMPLEAN EN LOS CULTIVOS DE
CAMARONES
I.3.1 Alimentos naturales
✓ Cultivos de diatomeas
A partir del estadio larvario de protozoea 1, el camarón necesita de un
alimento para satisfacer sus requerimientos nutricios y energéticos, por lo que es
necesario agregar un alimento artificial del tamaño adecuado o producir un
florecimiento de fitoplancton, del tipo diatomeas, ya que hasta ahora estas
microalgas al ser suministradas como alimento a las diferentes especies han
dado los mejores resultados en cuanto a crecimiento y supervivencia (Pérez
Castro, 1997; Balda, 2016).
11
La diatomea utilizada como alimento para las larvas de camarón es
Skeletonema costatum, la cual no ha presentado problemas en cuanto a su
mantenimiento e incubaciones a temperaturas de 27 y 29 0C (Pérez Castro,
1997; Balda, 2016).
✓ La vitamina C
El uso de vitaminas, especialmente la vitamina C, a través del denominado
núcleo biotecnológico, parece estar ayudando a la supervivencia de los
camarones en las piscinas (Fenucci & Fernández, 2004; García, 2016; Talavera
& Zapata, 2016, Tacón, 2016)
✓ Kilol DF-100
Es una biomasa biológicamente activa extraída de la pulpa y semilla de la
toronja, con propiedades bactericida, fungicida, viricida, y antiparasitario de
amplio espectro altamente eficaz (Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).
Sus componentes otorgan un fortalecimiento a las funciones inmunológicas,
promoviendo la elaboración de ciertas enzimas imprescindibles para su
metabolismo (Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).
El kilol DF-100 es el único producto 100% orgánico natural aprobado por la
FDA y aceptado por organismos internacionales en defensa del medio ambiente
(Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).
Se lo utiliza en la desinfección de equipos de laboratorio, en la desinfección
de la artemia Salina después de eclosionar dando resistencia inmunológica a los
nauplios y desparasitando las larvas, además lo utilizan las empacadoras por
que ayuda a disminuir el uso de metasulfito de sodio e hipoclorito que son de
usos restringidos por el HCCCP (Álvarez y col., 2016; Soluap, 2016).
12
✓ Kilomar plus
Es aplicado en suelos y aguas de piscina camaroneras evita la proliferación
de organismos patógenos, aplicado al suelo contrarresta una elevada
descomposición orgánica. En el agua primordialmente actúa contra algas
nocivas, bacterias, hongos y virus, además de regular el pH (Álvarez y col.,
2016).
✓ Kilol SP 100
Es promotor del crecimiento con propiedades inmunoestimulantes directas y
que además mantiene el tracto digestivo del camarón libre de parásitos,
protozoarios y microorganismos patógenos en todas y cada una de las etapas de
desarrollo (Soluap, 2016).
✓ Biomasa del camarón
La biomasa se refiere al peso estimado de camarones en el estanque en un
momento dado y excluye a todas las demás especies ya sea peces y otros
organismos que pudiesen estar en el estanque (Álvarez y col., 2016).
✓ Verde malaquita
El verde de malaquita (C23H25ClN2 Pm 369.91 g mol-1) también denominado
verde de la anilina o verde básico, es un sólido de color verde oscuro. Disponible
en varias formas principalmente sal de oxalato o cloruro (Srivastava y col., 2004).
Se trata de un compuesto soluble en metanol y muy soluble en agua (figura 2).
Figura 2. Estructura química del verde de malaquita
13
Entre sus aplicaciones se puede destacar que el verde de malaquita es un
colorante que inicialmente se utilizó en la industria textil y del papel o como
aditivo en alimentos (Srivastava y col., 2004).
Sus aplicaciones más relevantes están relacionadas con su capacidad para
eliminar bacterias, protozoos (Tojo & Santamarina, 2001), cestodos, nematodos
(Hecht & Endermann, 1998). Además, es un excelente fungicida (Campbell y
col., 2001).
Como consecuencia de todas sus propiedades, actualmente en algunos
países está registrado como medicamento veterinario para peces ornamentales,
encontrándose prohibida su utilización en piscifactoría por su toxicidad.
(JOINT/FAO/WHO, 2008).
Estudios han indicado que la toxicidad de compuesto se incrementa cuando
se aumenta la temperatura o disminuye el pH (Srivastava y col., 2004). Entre los
efectos que presenta, destaca causar tumores hepáticos y renales en roedores
(Culp y col., 2006), así como anomalías en el sistema reproductivo
(JOINT/FAO/WHO, 2008).
✓ Leucoverde de malaquita
De formula (C23H26N2, Pm 330.47 g mol-1) es un metabolito producido a partir
del verde malaquita (figura 3). Se trata de un polvo blanco, que es ligeramente
soluble en agua. Este compuesto tiene una vida media bastante superior a la del
compuesto del que procede, siendo aproximadamente de 40 días (Roybal y col.,
1995; Plakas y col., 1996).
Figura 3. Estructura química del leucoverde de malaquita
14
Este compuesto puede considerarse como potencialmente tóxico, además de
poseer un alto potencial cancerígeno (Culp y col., 2002).
Diversos experimentos en ratones han demostrado que el leucoverde de
malaquita aumenta la incidencia de aparición de tumores en la tiroides, como
consecuencia de la inhibición de la peroxisada tiroidea. Además, se han
efectuado numerosos estudios sobre sus posibles propiedades genotóxicas.
Según estos, el leucoverde de malaquita es capaz de unirse covalentemente al
acido desoxirribonucleico (ADN), originando mutaciones en los genes del hígado
(CRD, 2010.).
15
I.4.- METODOLOGIA ANALITICA
I.4.1 Cromatografía liquida
La cromatografía líquida de alta eficacia se encuadra dentro de las
técnicas de elución. En ésta, un líquido (fase móvil), circula en íntimo contacto
con un sólido u otro líquido inmiscible (fase estacionaria). Al introducir una
mezcla de compuestos en la corriente de fase móvil, cada uno de ellos
avanzará a lo largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá
de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que después de
terminado el recorrido de la muestra por la columna, cada uno de los
compuestos introducidos en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es decir,
estarán separados (Gismera y Quintana, 2009).
Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden clasificar de
diferentes maneras, pero la forma más habitual de clasificación es la realizada
en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya que es ésta la que impone
fundamentalmente el mecanismo de separación; de este modo, se pueden
enumerar cuatro tipos de técnicas (Gismera y Quintana, 2009):
✓ Cromatografía de adsorción (líquido-sólido).
La fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en repetidas
etapas de adsorción-desorción.
✓ Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente).
La separación en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase
móvil y la fase estacionaria.
✓ Cromatografía de intercambio iónico.
Este tipo de cromatografía se da cuando la fase estacionaria presenta en
su superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de
16
signo contrario que circulan en la fase móvil.
✓ Cromatografía de exclusión molecular.
La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamaño de
poro controlado, que permite la entrada de ciertas moléculas de manera
selectiva, dejando fuera otras de mayor tamaño.
El mecanismo de retención en los dos primeros casos es similar, variando
únicamente el tipo de interacciones que se producen y de ellas cual sería la
predominante; por esta razón, en la práctica se realiza otra división de los dos
primeros tipos de cromatografía la cual está basada en la polaridad de la fase
estacionaria:
✓ Cromatografía de fase normal:
La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las
interacciones que se producen con el soluto son específicas del grupo activo. La
fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente (sílice o alúmina), o bien, un
soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos
funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc.).
✓ Cromatografía de fase reversa (inversa):
La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas,
grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecíficas (efecto
solvófobo).
I.4.2 Espectrometría de masas
La espectrometría de masas es, sin duda alguna, la técnica analítica
instrumental más extraordinaria y completa. Entre las cualidades que justifican
esta afirmación, de acuerdo con Esteban (1993), podemos citar:
17
a) Su capacidad de identificación, puede identificar cualitativamente y de
forma inequívoca, casi cualquier tipo de sustancia, desde átomos o
compuestos sencillos hasta moléculas extraordinariamente compleja y
lábiles.
b) Es cualitativa y cuantitativa, no solo es capaz de identificar las
sustancias analizadas proporcionando un espectro que es la ‘’huella
digital’’ de la molécula, sino que también puede cuantificar y medir la
concentración de las mismas.
c) Puede analizar mezclas complejas, es capaz de identificar una
sustancia, incluso en presencia de otras de composición similar.
d) Posee una gran sensibilidad puede detectar prácticamente cualquier
elemento en concentraciones del orden de hasta la ‘’ppq’’.
e) Es universal y específica, es decir, puede analizar sustancias o
mezclas de sustancias sólidas, liquidas o gaseosas.
f) Puede proporcionar información estructural de la molécula analizada,
energía de enlaces, información cinética, físico-química, cuántica, etc.
g) Es una técnica muy rápida, puede realizar un espectro en décimas de
segundo. Por ello puede utilizarse para monitorización de procesos,
suministrando información en tiempo real sobre la composición de una
mezcla de gases en un reactor.
18
I.4.3 Acoplamiento LC-MS/MS
Las técnicas que se usan rutinariamente en la actualidad para la introducción
y análisis de muestras liquidas por espectrometría de masas, se pueden
clasificar en dos grupos: las que solo introducen la muestra en la fuente iónica
del espectrómetro, y las que, además, consiguen la ionización ‘’blanda’’ de la
misma (Esteban, 1993).
La ionización por electrospray (ESI), al realizarse a presión y temperatura
prácticamente ambientales, es extremadamente suave, consiguiendo iones
quasi-moleculares intactos, evitando la rotura de enlaces de tipo covalente por
muy delicados que sean. Esta cualidad es muy conveniente en el análisis de
proteínas.
Otra cualidad importante de la ionización ESI es que la formación de aductos
es muy pequeña, y se eliminan muy eficazmente por bombardeo con moléculas
de gas envolvente, a su paso por la primera pre-cámara de vacío (Esteban,
1993).
Una de las limitaciones de la técnica electrospray ‘’clásica’’ es el limitado
rango de flujo de muestra que es capaz de aceptar, típicamente de 1 a 50 µl/min,
aunque ya se han desarrollado técnicas de nebulización asistida
neumáticamente, que son capaces de aceptar flujos de 1ml/min o más. Estas
técnicas asistidas en algunos casos reciben el nombre de ‘’Mega Flow’’
(Esteban, 1993).
El espectro obtenido por ESI es totalmente diferente al que se consigue por
otras técnicas de ionización, y consiste en una serie de señales discretas a lo
largo de todo el dominio espectral, que corresponden, cada una de ellas, a una
molécula intacta cargada con diferente número de cargas, y con un cierto
número de protones añadidos, de tal modo que la diferencia entre señales
adyacente es un protón.
19
El analizador cuadrupolar, filtro de masas cuadrupolar o, simplemente
cuadrupolo, está formado por cuatro barras o polos de sección cilíndrica o
hiperbólica, alineadas paralelamente entre sí, y equidistante una distancia de ro
de un eje central imaginario situado sobre el eje Z cartesiano.
Mediante la aplicación a cada pareja de barras opuestas, de voltajes variables
de corriente continua (DC) y de radiofrecuencia (RF) superpuestos, se consigue
que iones de masas determinadas pasen por el ‘’túnel’’ formando por las cuatro
barras polares, siguiendo trayectorias oscilantes estables que conducen al
detector, mientras que las demás masas, al ser inestables sus trayectorias, no
alcanzan el detector, siendo desviadas fuera del conjunto de barras. Variando
convenientemente estos voltajes se puede ir enfocando de modo sucesivo las
diferentes masas presentes, y así obtener el espectro correspondiente (Esteban,
1993).
20
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
II.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
El tipo de diseño de investigación que se aplicó a este proyecto corresponde
al tipo experimental.
II.2 DELIMITACION
El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio del Instituto Nacional de Pesca-
Guayaquil Ecuador, siguiendo los procedimientos descritos por Sanders y col.,
(2005) y Tao y col., (2007) y establecidos en el laboratorio.
II.3 MUESTRA
Las muestras trabajadas en el presente estudio consistieron en muestras de
camarón de exportación en diferentes presentaciones (congelado entero,
congelado semicocido, congelado limpio, en mariposa), recibidas en el
laboratorio de análisis durante los meses de julio a diciembre de 2015, para
recibir certificado de venta.
II.4 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
II.4.1. Equipos
▪ Licuadora de Laboratorio ▪ Balanza analítica Máx. 210 g d= 0.01 mg, ▪ Agitador vórtex ▪ Micro centrífuga ▪ Centrífuga refrigerada ▪ Equipo de ultrasonido ▪ Bomba de Vacío y Presión ▪ Equipo para filtración de fases móviles con membranas de filtración, tipo
PVDF, tamaño de poro 0.22 µm, 47 mm diámetro ▪ Estufa ▪ Sorbona
21
▪ Sistema de Purificación de agua ▪ Thermohigrómetro de pared ▪ Refrigeradora ▪ Congelador horizontal ▪ Cromatógrafo Líquido Alliance 2695 XE, con desgasificador en línea,
automuestreador, horno para columna, Waters ▪ Espectrofotómetro de Masas, cuadrupolo tandem Quattro Premier XE
system (Micromass, Altrincham, Cheshire, UK). ▪ Columna Symmetry Waters C18, 3.5 um, 2.1 x 100 mm, y precolumna
Waters C18, 3.5 um
II.4.2. Materiales
▪ Pipeta automática 1-5 ml ▪ Micropipeta 1000 µl ▪ Micropipetas 100-1000 µl ▪ Pipeta automática 2000 µl ▪ Pipeta automática 2-10 µl ▪ Pipeta automática 1-5 ml ▪ Micropipeta 1000 µl ▪ Micropipetas 100-1000 µl ▪ Tubos de centrífuga de polipropileno, 15 y 50 ml ▪ Viales de 2 ml de capacidad para HPLC con tapa
II.4.3. Reactivos
• Acetonitrilo grado HPLC
• Acido Fórmico 98%
• Agua grado HPLC
• Metanol grado HPLC
• Clorhidrato de Hidroxilamina ≥ 99%
II.4.4 Estándares
• Estándar de leucoverde de malaquita Pureza: ≥ 92.5% (condiciones de almacenamiento: 20º C ± 4º C)
• Estándar de verde de malaquita Pureza: ≥ 93.5% (condiciones de almacenamiento: 20º C ± 4º C)
22
II.5 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
II.5.1 Preparación de soluciones estándar
Sustancia estándar de verde de malaquita en polvo de pureza 93.5 %. Pesar
14.20 mg de la sustancia y diluir a 100 ml con acetonitrilo, esta solución tendrá
una concentración de 100 µg/ml (ppm), la misma tendrá una estabilidad de un
mes.
II.5.1.1 Soluciones stock de VM y LVM
✓ Solución de verde de malaquita stock (referencia)
Sustancia estándar de verde de malaquita en polvo de pureza 93.5 %. Pesar
7.5 mg de la sustancia y diluir a 50 ml con acetonitrilo, esta solución tendrá una
concentración de 100 µg/ml (ppm), la misma tendrá una estabilidad de 1 año, no
obstante, deberá controlarse la señal de lectura con el estándar de trabajo de 5
µg /kg.
✓ Solución de leucoverde de malaquita stock (referencia)
Sustancia estándar de leucoverde de malaquita en polvo de pureza 99.9 %
EA. Pesar 10.16 mg de la sustancia y diluir a 100 ml con acetonitrilo, esta
solución tendrá una concentración de 100 µg/ml (ppm), esta solución tendrá una
duración de un mes.
✓ Solución de leucoverde de malaquita stock (referencia)
Sustancia estándar de leucoverde de malaquita en polvo de pureza 92.5 %.
Pesar 5.4 mg de la sustancia y diluir a 50 ml con acetonitrilo, esta solución
tendrá una concentración de 100 µg/ml (ppm), la misma tendrá una estabilidad
de 1 año, no obstante, deberá controlarse la señal de lectura con el estándar de
trabajo de 5 µg /kg.
23
✓ Solución estándar de VM de 100 µg /kg
Tomar 100 µl de solución stock (100 ppm) y diluir a 100 ml con acetonitrilo
puro. Almacenar en frascos ámbar de 25 ml y en refrigeración. Esta solución es
estable por 6 meses.
✓ Solución estándar de LVM de 100 µg /kg
Tomar 100 µl de solución stock (100 ppm) y diluir a 100 ml con acetonitrilo
puro. Almacenar en frascos ámbar de 25 ml y en refrigeración. Esta solución es
estable por 6 meses.
II.5.1.2 Soluciones de trabajo
✓ Solución mezcla estándar de trabajo de VM y LVM de 5 µg /kg
Tomar 500 µl de cada una de las soluciones estándar de VM y LVM de 100
µg /kg y diluir a 10 ml con acetonitrilo puro. Esta solución es utilizada para
fortificar las muestras y se preparará semanalmente.
✓ Solución mezcla estándar de trabajo de VM y LVM de 10 µg /kg
Tomar 1000 µl de cada una de las soluciones estándar de VM y LVM de 100
µg /kg y diluir a 10 ml con acetonitrilo puro. Esta solución es utilizada para
fortificar las muestras y se preparará semanalmente.
II.5.1.3 Soluciones del estándar interno D6-LVM
• Solución stock LVM D6 (referencia)
Sustancia estándar de leucoverde de malaquita D6 en polvo de pureza 98.5
% EA. Pesar 2.53 mg de la sustancia y diluir a 25 ml con acetonitrilo, esta
solución tendrá una concentración de 100 µg/ml (ppm), tendrá una duración de
un año.
24
• Solución estándar de D6-LVM de 100 µg /kg
Tomar 100 µl de solución stock (100 ppm) y diluir a 100 ml con acetonitrilo
puro. Almacenar en frascos ámbar de 25 ml y en refrigeración. Esta solución es
estable por 1 mes.
• Solución estándar de trabajo de D6-LVM de 20 µg /kg
Tomar 2000 µL de solución madre (100 µg /kg) y diluir a 10 ml con acetonitrilo
puro. Esta solución es utilizada para fortificar las muestras, se adicionan 200 µl
del estándar interno. Esta solución debe prepararse semanalmente.
II.5.2 Preparación de curva de calibración
✓ Preparación de curva de calibración en matriz con una mezcla de
soluciones estándar de verde de malaquita y leuco verde de
malaquita:
Para obtener la curva de calibración se parte de una mezcla estándar de
concentración de 5 y 10 µg /kg de VM y LVM que se diluye con acetonitrilo puro.
Se pesan 2 g de la matriz a utilizar en tubos de 50 ml con tapa, los necesarios
para preparar 6 puntos de la curva de calibración. En cada uno de los tubos se
adicionan 200 µl del estándar interno LVM D6 de 20 µg /kg, luego se toma por
separado 50, 100 y 200 µl de la mezcla de estándares de concentración de 5 µg
/kg; 400 y 1000 µl de la mezcla de estándares de concentración de 10 µg /kg y
se fortifican en las matrices para obtener concentraciones de 0.25, 0.50, 1.0, 2.0,
y 5.0 µg /kg de cada analito, además de estas concentraciones, se prepara un
estándar de blanco matriz al cual solo se le adiciona 200 µl el estándar interno
LVM D6 de 20 µg /kg.
25
A cada tubo utilizado para la curva de calibración se deberá adicionar agua
pura, para completar un volumen total 1200µl. En la tabla I, se especifican los
volúmenes a añadir a cada muestra que se emplea en la curva de calibración.
Tabla I. Cantidad en µl de soluciones de estándares y agua pura utilizadas para
la preparación de la curva de calibración de VM y LVM.
Una vez realizada la extracción de los analitos, para la inyección en el equipo
se colocan los extractos en viales de 2000 µl de las diferentes concentraciones
de VM Y LVM estándar filtrándolos previamente a través de un filtro de jeringa de
PTFE de 0.22 µm de poro, luego se procede a inyectar en el equipo.
Todas las soluciones de trabajo deben cumplir las siguientes especificaciones:
• La solución madre se rotulará con su respectivo nombre, se indicará la
concentración y se añadirá la fecha de preparación y técnico responsable
de la preparación.
MEZCLA DE
METABOLITOS DE VM y
LVM
VOLÚMEN A TOMAR
PARA FORTIFICAR LA
MATRIZ
µl
CONCENT.
FINAL
µg/kg
Volumen de
Agua
µl
LEUCOVERDE DE MALAQUITA D6 20 µg/kg
200 2.00 800
MIX DE VM y LVM 5 µg/kg
100 0.25 900
MIX DE VM y LVM
5 µg/kg
200 0.50 800 µl
MIX DE VM y LVM
5 µg/kg
400 1.00 600 µl
MIX DE VM y LVM
10 µg/kg
400 2.00 600 µl
MIX DE VM y LVM
10 µg/kg
800 4.00 200 µl
MIX DE VM y LVM
10 µg/kg
1000 5.00 0.00 µl
26
• Las botellas o matraces que contienen los estándares de trabajo se
marcarán con la concentración del estándar preparado, expresado en
µg/kg.
• Cada solución estándar o patrón serán registradas en formato: Preparación
de soluciones madres concentradas y diluidas (RQA3_OP5.6.3)
II.5.3 Preparación de reactivos (hidroxilamina)
✓ Solución de hidroxilamina hidrocloruro 5 g/l (w/v)
Disolver 5 g ± 0.0100 de hidroxilamina hidrocloruro en agua y aforar a 1000
ml. Esta solución tiene una estabilidad de cuatro meses.
II.5.4 Preparación de la fase móvil
A: Metanol HPLC
Filtrar con vacío a través de una membrana de PVDF, 47 mm diámetro, 0.22
µm de poro, la cantidad necesaria a utilizar.
B: Agua con 0.1 % v/v de ácido fórmico
✓ Medir 500 ml de agua en una probeta de 1 L.
✓ Medir 500 µl de ácido fórmico
✓ Mezclar las dos soluciones en un frasco de 500 ml
✓ Filtrar con vacío a través de una membrana de PVDF, 47 mm diámetro, 0.22 µm.
✓ Sonicar por 2 minutos.
✓ Preparar cada vez que se requiera.
27
II.6 CONDICIONES ANALÍTICAS
Para llevar a cabo la separación de las muestras se estableció las
concentraciones del sistema de disolventes en función del tiempo. Los
gradientes de concentración se presentan en la tabla II.
Tabla II. Gradientes de concentraciones de la fase móvil.
II.6.1 Verificaciones preliminares
➢ Cromatógrafo Líquido Alliance 2695 XE
Al iniciar el proceso de análisis se deberá revisar las condiciones del equipo
que incluye lo siguiente:
✓ Condiciones de las fases móviles
✓ Purga de las fases móviles de cada una de las vías
✓ Purga de inyector (se deberá observar que no haya burbujas en él)
✓ Purga de la bomba de lavado de sello
✓ Purga del sistema de lavado de agujas.
✓ Acondicionamiento de la columna (Gradiente)
➢ Espectrómetro de Masas
✓ Se procederá a revisar el estado del espectrómetro por medio de los
siguientes parámetros:
TIEMPO (min)
A % B % FLUJO
0.00 30.0 70.0 0.600
2.00 90.0 10.0 0.600
6.00 90.0 10.0 0.600
6.00 30.0 70.0 0.600
10.00 30.0 70.0 0.600
28
✓ Observar el estado de las partes externas del equipo como el cono de
muestreo, flujo del capilar.
✓ Vacío del sistema: Collision Cell Pirani, Analyser Penning
✓ Verificar el correcto flujo del nitrógeno y argón
➢ Parámetros del HPLC (Inlet method)
✓ Archivo en Mass lynx: VM Y LVM grad waters symmetry 10 min
✓ Sistema: Waters Alliance 2695
✓ Condiciones del HPLC 2695
Columna: C18 3.0 µm 150 X 2mm
Rango del Flujo: 0.2 ml/min
Volumen de Inyección: 15 µl/min
Tiempo de corrida: 10 min
➢ Condiciones iniciales de la bomba
Solventes
A% 30.0 FM A: metanol puro
B% 70.0 FM B: agua: ácido fórmico 0,1
Desgasificador continuo
Stroke volumen 50.0 µl
➢ Condiciones del sistema al inicio y fin del análisis
Rampa de flujo 2.00
Flujo (ml/min.) 0.600
Tiempo de parada (min.) 10.0
Temperatura de la columna (ºC) 40.0
Temperatura Límite de la columna (ºC) 5.0
Presión Mínima (Bar) 0.0
Presión Máxima (Bar) 300.0
Volumen de la Pre columna (µl) 0.0
Posición de la columna Columna 1
29
➢ Condiciones iniciales del auto muestreador
➢ Parámetros del método MS (MS Method)
Modo de Ionización: ES+
Tipo de Data: SIR o MRM data
Tipo Función: MRM de 5 canales
Las condiciones del espectrómetro de masa fueron ajustadas y las
condiciones de trabajo utilizadas se presentan en la tabla III.
Tabla III. Transiciones monitoreadas para la detección de (verde y leucoverde de
malaquita).
ION PRECURSOR
(m/z)
ION PRODUCT
(m/z)
DWELL (Secs)
CONE (Volts.)
COL. ENERGY
RTW (mins) ANALYTE
329.08 312.9 0.500 60.00 38.00 4.35 ± 0.5
min.
VM (Q)
329.08 207.82 0.500 60.00 48.00 VM (C)
331.16 239.01 0.500 33.00 30.00 7.3 ± 0.255
min.
LVM (Q)
331.16 315.96 0.500 33.00 20.00 LVM (C)
337.12 239.93 0.500 33.00 30.00 7.3 ± 0.5 min.
LVM D6
Leyenda: Q: Ion de Cuantificación, C: Ion de Confirmación, RTW: Tiempo de
retención de la ventana; DWELL: ventanas de tiempo; COL: Energía de colisión;
CONE: Fuente de ionización.
Velocidad de arrastre normal
Profundidad de la aguja 2.00
Temperatura de la muestra (ºC) 10.0
Límite de temperatura de la muestra (ºC) 5.0
30
II.6.2 Registro de observaciones y de los resultados
El proceso de cuantificación y registro de los resultados se efectuará con el
módulo Quanlynx del software Masslynx este archivo será creado bajo
extencion.mdb.
El software Quanlynx, realizará de forma automática los cálculos estadísticos
para la realización de la curva de calibración por medio de la regresión lineal, el
cual registrará la ecuación que caracteriza a la curva y por intermedio de ella se
efectuará la cuantificación de las muestras.
La expresión de los resultados se hará en (µg/Kg)
Para cada día de análisis se generará una nueva curva de calibración que se
guardará con la fecha de ese día.
Luego de obtenidas las lecturas en el sistema LC-MS/MS, se imprimen, firman y
guardan en su respectivo registro.
La información es respaldada mensualmente en memoria externa
II.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Se deberá preparar un blanco matriz, previamente licuado, homogenizado y
analizado para confirmar que no contiene el analito a investigar. La muestra
deberá ser colectada del tejido muscular comestible para obtener una buena
homogenización de la misma. Deberá también, almacenarse una contra muestra
de la misma tal como llegó al laboratorio con el código de identificación y congelar
la muestra para conservación.
31
II.7.1 Preparación del blanco de reactivo
Colocar 1000-2000 µl de acetonitrilo en un vial y proceder a su lectura.
II.7.2 Preparación del blanco matriz
Pesar 2 g ± 0.010 g del tejido homogenizado preparado para blancos, en un
tubo de polipropileno (tubo 1) con tapa de 50 ml, fortificar con 200 µl de D6 LVM
de 20 µg/kg, agitar para homogenizar, dejar en agitación por 15 minutos y
proceder a su extracción.
II.7.3 Fortificación de las muestras de control
Pesar 2 g ± 0.010 g del tejido homogenizado preparado (muestra blanco), en
dos tubos de polipropileno de 50 ml con tapa, por duplicado. Fortificar cada uno
con 200 µL de mezcla de estándares de VM y LVM de 5 µg/kg para obtener una
concentración de 0.5 µg/kg, agitar para homogenizar, dejar en agitación por 10
minutos y proceder a su extracción.
II.7.4 Extracción de muestras
• Pesar 2 g ± 0.0100 g de muestra en tubos de 50 ml. de capacidad, igual
peso de tejido (según matriz a analizar), se utiliza para blancos, curva de
calibración y controles.
• Proceder a fortificar las muestras con adición de 200 µl del estándar
interno D6-leucoverde de malaquita (D6 LVM) de concentración de 20
µg/kg, fortificar también una matriz para blanco, puntos de la curva
controles según la matriz a analizar.
• Adicionar 2 ml de una solución de hidroxilamina hidrocloruro de 5 g/l a las
muestras fortificadas de tejido animal, vortear para homogenizar bien.
• Fortificar una matriz de control con 200 µl a partir de una mezcla de
estándar de verde malaquita y leucoverde de malaquita (VM y LVM) de
concentración de 5 µg/kg en el caso de muestras de tejido animal, cuya
concentración será de 0.50 µg/kg; para insumos, alimentos nutricionales
32
y aditivos, se fortificará un control con 400 µl de una mezcla de estándar
de verde malaquita y leucoverde de malaquita (VM y LVM) de
concentración de 5 µg/kg, la concentración final será de 1.0 µg/kg.
• Adicionar luego a las matrices fortificadas y muestras, agua destilada
hasta completar 1200 µl según el caso.
• Vortear para lograr una mejor homogenización luego agitar las muestras
fortificadas por 10-15 minutos mínimos.
Extracción de los analitos de verde malaquita y leucoverde de malaquita
• Adicionar en cada tubo 8 ml de acetonitrilo.
• Agitar por 10 minutos aproximadamente.
• Centrifugar a 5000 rpm por 10 minutos a 4ºC los tubos de 50 ml.
• Tomar aproximadamente 2 ml del sobrenadante con ayuda de una jeringa
y filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0.22 µm de
poro.
• Transferir el líquido filtrado a viales de 2 ml de capacidad, luego proceder
a su lectura en el LC-MS/MS por inyección de un volumen de 15 µl.
33
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
En este trabajo, se llevó a cabo el análisis de muestras de camarón de
exportación, con el objetivo de detectar la presencia de verde de malaquita y
leucoverde de malaquita. El uso de estos compuestos en productos acuícolas, no
está permitido en varios países del mundo, debido a su efecto altamente tóxico y a
los residuos persistentes en el ambiente acuático al emplearse en terapias de
inmersión (Andersen et al., 2006; Según Chalén et al., 2010).
Según diversos autores, estos colorantes son usados globalmente como
antifúngicos y antiparasitarios en peces y mariscos de importancia en acuicultura,
pero es de señalar que, en el tejido de los peces y mariscos, existe un alto
contenido lipídico que permite una elevada absorción y acumulación de estos
compuestos (EC, 2003; Andersen et al., 2006 y Chalén et al., 2010).
Como método de análisis en el estudio para la detección del VM y LVM, se
empleó la cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas en tándem
(LC/MS/MS), por su sensibilidad y especificidad, ya que la Regulación Europea
tiene establecido un límite mínimo de Ejecución requerida (MRPL), que es la
sumatoria de 2 µg/Kg para ambos colorantes (CE, 2003).
En el ensayo de detección cualitativo se inyectaron soluciones de estándar de
una concentración de 1 µg/kg para VM y LVM D6 y LVM respectivamente,
estableciendo los tiempos de retención tal como se muestran en la tabla IV. En la
figura 4 se visualizan los cromatogramas de una de las réplicas obtenidas para
cada patrón a la concentración señalada.
34
Tabla IV. Valores de tiempos de retención (Tr) y áreas para la concentración de 1
µg/kg de los patrones.
Muestras Resultados
Tr (min) Áreas (mV.min) ± SD
VM 4,42 329,2 ± 0,03
LVM 7,26 337,25 ± 0,04
Leyenda: SD= desviación estándar
Figura 4. Cromatogramas de los estándares de VM y LVM
Para la determinación cuantitativa de los colorante VM y LVM se elaboró una
curva de calibración a partir de las concentraciones 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 y
5,00 µg/kg de las matrices fortificadas (X) vs áreas de los picos cromatográficos
(Y).
La curva de calibración para cada uno de los analitos fue determinada por medio
del método del estándar interno, utilizando LVM D6. Para ambos se obtuvo un
buen ajuste de la recta, buena linealidad para cada compuesto, constituyendo un
buen indicador de la ejecución analítica (Chalén et al., 2010).
35
La curva de calibración para el LVM D6 empleado como estándar interno, se
presenta en la figura 5.
Figura 5. Curva de calibración para el LVM D6 empleado como patrón interno.
Para el VM en el rango de concentraciones evaluadas se logró una buena
correlación entre las concentraciones y las áreas, obteniendo una ecuación de la
recta de Y = 0,56942X +0,0012449 con un valor de coeficiente de correlación (r) de
0,999853 (r >0,99) (figura 6).
Figura 6. Curva de calibración para VM.
36
Para el LVM, se logró de igual forma una buena correlación, obteniendo una
ecuación de la recta de Y = 1,35991X + 0,00654114 con un valor de coeficiente de
correlación (r) de 0,999853 (figura 7)
Figura 7. Curva de calibración para LVM.
En la figura 8 se muestran algunos de los cromatogramas obtenidos de
muestras de camarón analizado, donde no se detectaron, los picos cromatográficos
correspondientes a los compuestos investigados, es decir, que, de estar presentes,
su concentración se encuentra por debajo del límite de detección del equipo.
Figura 8. Cromatogramas de VM y LVM en matrices de camarón.
37
En general, los resultados evidenciaron valores que se ubicaron por debajo del
límite de cuantificación. Esto indica que las empresas dedicadas a la actividad de
producción y exportación de camarón, reconocen la función importante que tienen
en la producción de alimentos inocuos, pues de lo contrario el uso indebido de
estas sustancias traería consecuencias graves a la salud humana, dado que los
alimentos destinados a la nutrición constituyen una fuente de introducción de
potenciales contaminantes en la cadena alimentaria (FAO, 2008).
Los resultados obtenidos, muy por debajo del límite de detección, demuestran
que los acuicultores han tomado conciencia en el uso de este tipo de productos y
reconocen los efectos que estos residuos ocasionan tanto en el hombre como al
ambiente, por lo que están limitando la utilización de los mismos (Chalén et al.,
2010).
La importancia de este trabajo radica en su contribución a garantizar la
inocuidad de los camarones de exportación a fin de prevenir los peligros que estos
colorantes pueden producir.
La información brindada contribuye a los protocolos de vigilancia y control de
factores de riesgo debido al uso de estas sustancias durante la producción de
alimentos, particularmente en las empresas camaroneras.
En general la técnica analítica LC-MS/MS, empleada como método para la
detección de los residuos de VM y LVM, ha permitido la determinación selectiva de
estos compuestos, a través de los resultados obtenidos en la matriz estudiada.
Como último aspecto es importante señalar, que el acuerdo ministerial 227 del
Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, establece al Instituto
Nacional de Pesca (INP) como el ente regulador de esta actividad y el único
responsabilizado en otorgar el certificado de calidad a los productos pesqueros de
las diversas empresas del país, por lo que el incumplimiento de las observancias
establecidas, puede ocasionar, no solo, la no emisión del certificado al producto,
sino también el retiro del permiso de funcionamiento de la empresa.
38
El protocolo seguido por el laboratorio de control de calidad del INP, comprende
los siguientes pasos en caso de detectar muestras positivas:
1. Se notifica al área de verificación que la muestra es positiva y que se
proceda a enviar la contra muestra y muestra a dirimir que se encuentra bajo
la custodia del área de verificación.
2. Verificación procede a enviar la contra muestra y muestra a dirimir previa
notificación al usuario para que proceda con la realización del pago para el
nuevo análisis.
3. El control de muestra ingresa al sistema automatizado la muestra y asigna al
área correspondiente.
4. Se procede a realizar el análisis de forma inmediata.
5. En caso de salir positivo una de las dos muestras o las dos muestras se
procede a comunicar a verificación para que active el sistema de gestión de
crisis.
6. Si salen dos muestras negativas se considera el resultado negativo.
39
CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
IV.1 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos permiten arribar a las siguientes conclusiones:
✓ Se evaluaron durante los meses de estudio, diferentes muestras de
camarones de exportación, aplicando la técnica LC-MS/MS, la cual
resultó adecuada para este tipo de análisis.
✓ No se detectó la presencia de los colorantes VM y LVM en las muestras
analizadas.
✓ Existe, apoyado en la Resolución Ministerial 227 del Ministerio de
Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, un Plan Nacional de Control.
Proceso de Aseguramiento de la calidad pesquera, acuícola y ambiental
(ACPAA), que establece los pasos a seguir cuando se detecta muestras
positivas en los análisis.
40
IV.2 RECOMENDACIONES.
Aunque en ninguna de las muestras analizadas se encontró estos colorantes y
teniendo en cuenta el riesgo que representan para la salud del hombre y el
medio ambiente, debe continuarse una estricta vigilancia sobre los productos
que se analicen.
41
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• Álvarez Capote JS, Pérez Castillo M, Toledo Pérez J. (2016). El estado actual de la acuicultura en cuba y perfiles de nutrición y alimentación. En Documentos FAO. La nutrición y alimentación en la acuicultura de America Latina y el Caribe. Disponible en: http://www.fao.org/docrep/field/003/ab487s/AB487S06.htm. Consultado agosto 2016
• Andersen W.C. , Turnipseed S.B. & Roybal J.E. (2006). Quantitative and confirmatory analyses of malachite green and leucomalachite green residues in fish and shrimp. Journal of Agriculture and Food Chemical. 54: 4517-4523.
• Balda G. (2016). Bentos como alimento natural de camarones. Norte Verde. Copryright. Todos los derechos reservados. Disponible en: http://www.norteverde.com.ec/index.php/noticias-norte-verde/fertilizacion-organica-camaroneras
• Barnabé G. (1991). Acuicultura, Barcelona: Ediciones Omega.
• Barnabé G. (1996). Bases biológicas y ecológicas de la acuicultura, Zaragoza: Acribia.
• BOE. (1996). Real Decreto 2001/1995, de 7 de diciembre, por el que se aprueba la lista positiva de aditivos colorantes autorizados para su uso en la elaboración de productos alimenticios, así como sus condiciones de utilización. Publicado en el boletín Oficial del Estado, núm. 19; 1884-1895.
• Botello A & Álvarez F. (2013) Relaciones filogenéticas entre los géneros de camarones palaemónidos de agua dulce (Crustacea: Decapoda) de México: ¿evidencia de invasiones múltiples? Lat. Am. J. Aquat. Res. vol.41 no.4
• Boxall A.B.A., Koplin D.W., Halling-Sorensen B. (2003). Are Veterinary medicines causing environmental risk? Environmental Science and Technology, 37 286A-294ª.
• Brown, M. R., S. W. Jeffrey, J. K. Volkman y G. A. Dunstan. (1997). Nutritional properties of microalgae for mariculture. Aquaculture 151:315-331.
• Campbell R.E., Lilley J.H., Taukhid V., Panyawachira V., Kanchanakhan S. (2001). In vitro screening of novel tretments for Aphanamyces invadons. Aquaculture Research, 32: 223-233.
42
• Castello Orvay F. (1993). Acuicultura Marina: Fundamentos biológicos y tecnológicos de la producción, Barcelona: Universitat, Publicacions.
• CE (2003). Technical guidance document on risk assessment. EUR
20418 EN/2. Joint Research Centre, European Commision,
Italy.GESAMP (IMO/FAO/UNESCOIOC/WMO/WHO/IAEN UN/UNEP
Joint group of experts on the scientific aspects of marine environmental
Protection. 1997. Towards safe and effective use of chemicals in coastal
aquaculture. Red.Stud. GESAMP.65: 40
• CE (2008). Comisión Europea, reglamento N 1333/2008, del parlamento europeo y de consejo de 16 de diciembre de 2008 sobre aditivos alimentarios. Publicado en el Diario Oficial de la Union Europea, 31-Diciembre-2008, L354; 29.
• Chalén F., Sáenz J., Cambisaca M., y Franco F. (2010). Presencia de verde malaquita y leucoverde de malaquita en especies bioacuáticas y productos de uso acuícola. Revista de Ciencias del Mar y Limnología 4 (2) pág. 1-22
• Chávez-Sánchez, M.C. Higuera Ciapara, I. (2003). Manual de Buenas Prácticas de Producción Acuícola de Camarón para la Inocuidad Alimentaria. Elaborado por encargo del SENASICA en el: Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Mazatlán, Sinaloa. México.
• Chávez-Sanchez, M.C. y Montoya-Rodriguez L. (eds.). 2006. Buenas Prácticas y Medidas de Bioseguridad en Granjas Camaronícolas. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. SAGARPA-CONACYT. Mazatlán, Sinaloa. 95 pp.
• CRD. Chemical Regulations Directorate. (2010). Heath the Safety Executive, United Kingdom, Proposal for Harmonised Classifications and Labelling, Disponible en: http://echa.europa.eu/doc/consultations/cl/clh_uk_leucomalachite_green.pdf
• Culp S.J., Beland F.A., Heflich R.H., Benson R.W., Blankenship L.R., Webb P.J., Mellick P.W., Trotter R.W., Shelton S.D., Greenlees K.J., Manjanatha M.G. (2002). Mutagenicity and carcinogeniticy in relation to DNA adduct formation in rats fed leucomalachite Green. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 506/607 55-63.
• Culp S.J., Mellick P.W., Trotter R.W., Greenless K.J., Kodell R.L. and Beland F.A. (2006). Mutagenicity and carcinogeniticy in relation to DNA adduct formation in rats fed leucomalachite Green. Food and chemistry toxicology, 44:1204-1212.
• Espinoza Pico JW. (2014). Estudio microbiológico del agua en diferentes
43
puntos de recorrido en un laboratorio de larvicultura. Proyecto de Graduación previa a la obtención del título de: Acuicultor. Escuela Superior Politecnica del Litoral. Facultad de Ingeniería Marítima, Ciencias Biológicas, Oceánicas y Recursos Naturales.
• Esteban L. (1993). La espectrometría de masa en imágenes. Editorial ACK pags 248. ISBN 978-84-87687-18-1
• FAO (2008). El impacto de los piensos en la inocuidad de los alimentos. Informe de la Reunión conjunta de Expertos FAO/OMS. FAO, Roma 8-12 de octubre 2007. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación.
• FAO (2016). El estado mundial de la pesca y la acuicultura (SOFIA). Departamento de pesca y acuicultura de Roma. Disponible en: http:// www.fao.org/docrep/013/il820s/il820s00.htm. http://www.fao.org/publications/card/es/c/357c79a0-7fee-428f-a04e-9e86ba1a2ac5/
• Fenucci, JL & Fernández A. (2004). Acción de las Vitaminas en la Dieta de Camarones Penaeoideos. In: Cruz Suárez, L.E., Ricque Marie, D., Nieto López, M.G., Villarreal, D., Scholz, U. y González, M. Avances en Nutrición Acuícola VII. Memorias del VII Simposium Internacional de Nutrición Acuícola. 16-19 Hermosillo, Sonora, México
• García Galano T. (2016). Nutrición de Larvas de Camarón. Centro de Investigaciones Marinas, Universidad de la Habana. Disponible en: http://www.uanl.mx/utilerias/nutricion_acuicola/IV/archivos/4tsai.pdf (Consultado agosto 2016)
• Gismera MJ., Quintana MC (2009). Introducción a la Cromatografía Líquida de
Alta Resolución. Editorial Universidad Autónoma de Madrid. ISBN 9788483441459, 130pp.
• Hecht T., Endermann F. (1998). The impact of parasites, infections and diseases on the development ofaquaculture in sub-saharan Africa. Journal of Applied Ichthyology, 14:213-221. http://www.cesaibc.org/sitio/archivos/ProtocoloSanitario_200313154532.pdf
• Jayasree, L., Janakiram, P and Madhavi, R. (2006). Characterization of Vibrio spp. Associated with Diseased Shrimp from Culture Ponds of Andhra Pradesh (India). Journal of the World Aquaculture Society, Volume 37 Issue 4 Page 523.
• JOINT/FAO/WHO. (2008). Expert Committee on Food Additives. Meeting (70th Geneva, Switzerland). Evaluations of certain veterinary drug residues in food: seventieth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives.
• Kim J. (2000) The use of vital dyes in corneal disease. Current Opinion
44
Ophthalmology, 11:241-247.
• Leyton Y, Riquelme C (2008). Vibrios en los sistemas marinos costeros. Revista de biología marina y oceanografía 43:441-456.
• Lindner E. (1994). Toxicología de los alimentos. Zaragoza: Acribia, D.L.
• Moreno M., Sáenz LM., González Alcalá HM. (2008). Protocolo de sanidad para el cultivo del camarón blanco en el Estado de Baja California, Comité Estatal de Sanidad Acuícola e Inocuidad de Baja California A.C.
• Pérez Castro D. (1997). “Cultivo Experimental de las Diatomeas ThaIassiosira subtilis, Skeletonema costatum y Chaetoceros afflnis en condiciones de Laboratorio para fines de Acuacultura”. Tesis Para Obtener el Título de: MAESTRO EN CIENCIAS con Especialidad en Acuacultura. Universidad de Colima. Facultad de Ciencias Marinas. México
• Plakas S.M., El Said K.R., Stehly G.R., Gingerich W.H., Allen J.L. (1996). Can Uptake, tissue distribution, and metabolism of malachite Green in the channel catfish (Ictalurus punctatus). Canadian Journal of fisheries and Aquatic Science, 53 1427-1433.
• Ponce Palafox JT; González Salas R; Romero Cruz O; Febrero Toussaint I; Arredondo Figueroa JL; Esparza Leal H; García-Ulloa GM. (2005). Enfermedades del camarón de agua dulce Macrobrachium tenellum y M. rosenbergii durante el cultivo comercial en estanques rústicos, en empresas rurales (The freshwater shrimp Macrobrachium tenellum and M. rosenbergii diseases in a commercial culture ponds in rural communities). Revista Electrónica de Veterinaria REDVET. Vol. VI, Nº 12, ISSN 1695-7504.
• Programa de infromación de especies acuáticas (2006). Departamento de Pesca y Acuicultura de la FAO. Recuperado el 30 de 07 de 2016, Disponible en: http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Penaeus_vannamei/es
• RASFF The Rapid Alert System for Food and Feed (2012). Annual Report. Luxembourg: Offi ce for Offi cial Publications of the European Communities, ISBN 978-92-79-23020-2 ISSN 1830-7302 doi:10.2772/96194
• Rojas, A.A., Haws, M.C. y Cabanillas, J.A. ed. (2005). Buenas Prácticas de Manejo Para el Cultivo de Camarón. The David and Lucile Packard Foundation. United States Agency for International Development (Cooperative Agreement No. PCE-A-00-95- 0030-05).
• Roybal J.E., Pfenning A.P., Munns R.K., Holland D.C., Hurlbut J.A., Long A.R. (1995). Determination of malachite Green and its metabolite, leucomalachite Green, in catfish (Ictalurus punctatus) tissue by liquid
45
chromatography with visible detection. Journal of AOAC International, 78, 453-457.
• Sanders, P., Delepine B. and Roudaut B. 2005. Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Fish Flesh by Liquid Chromatography- electrospray positive ionization tandem mass spectrometry (LC/MSMS) Validation of a Confirmatory Method. AOAC 3rd Europe – Eurachem Symposium
• Silva Rubio LA & Bermúdez Huertas A. (2013). Medición y alimentación en el cultivo de camarón: tecnologías que apoyan el desarrollo de la camaronicultura en Colombia. Boletín Tecnológico. Pontificia Universidad Javeriana. Banco de patentes SIC
• Soluap E. (2016). Alternativas de Cultivos Acuícolas. KILOL DF-100. Reporte de Mercado/producción. Tomo II. Ecuador. Disponible en: http://famac.www7.50megs.com/mercados/mercadosBI79.html. Consultado: Agosto 2016
• Srivastava S., Sinha R., Roy D. (2004). Toxicological effects of malachite green. Acuatic Toxicology, 663:19-329.
• Sudova E., Machova J., (2007) Negative effects of malachite Green and possibilites of its replacement in the treatment of fish eggs and fish. Veterinarni medicina, 52 527-539.
• Tacón AGJ. (2016). Nutrición y alimentación de peces y camarones cultivados. Manual de capacitación. FAO-ITALIA. GCP/RLA/102/ITA Proyecto Aquila II Documento de Campo No 4. Disponible en: http://www.fao.org/3/a-ab492s/AB492S00.htm#TOC (Consultado agosto 2016)
• Talavera, V & Zapata LM (2016). La vitamina C en los alimentos para crustáceo. Boletín Nicovita. Volumen 3 – Edición 01 – Febrero 1998. Disponible en: http://www.nicovita.com.pe/extranet/Boletines/feb_98.pdf- Consultado agosto 2016
• Tao Ding, Jingzhong Xu, Bin Wu, Huilan Chen, Chongyu Shen, Fei Liu and Kefei Wang (2007): LC-MS/MS Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Fish Products by Liquid Chromatography- electrospray positive ionization tandem mass spectrometry. Thermo Scientific Application Note: 385.
• Thompson FL, Iida T, Swing J (2004). "Biodiversity of Vibrios". Microbiology and Molecular Biology Reviews 68 (3): 403–431.
• Tojo J.L., Santamarina M.T. (2001). Attempts at oral pharmacological treatment of Ichthyophthirius multifiliis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (walbaum). Journal of fish Diseases, 24: 249-252.