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Rafael Bañón Arias
Málaga, 1999
Universidad de Málaga
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA
HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO
VIRGEN DE LA VICTORIA
SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA
ASPECTOS FARMACOLÓGICOS DE LA ACCIÓN
ANTIMICROBIANA SOBRE STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE
EL DOCTOR D. ALFONSO PINEDO SÁNCHEZ,
PROFESOR TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE
MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA DE LA
FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE
MÁLAGA, Y JEFE DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA
DEL HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO VIRGEN DE LA
VICTORIA,
CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral que presenta el
Licenciado, D. Rafael Bañón Arias,
ASPECTOS FARMACOLÓGICOS
DE LA ACCIÓN ANTIMICROBIANA SOBRE
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE,
ha sido realizada bajo mi dirección en condiciones
que la hacen acreedora del título de Doctor.
Málaga, a 20 de octubre de 1999
Firmado Dr. A. Pinedo Sánchez
Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todos los que han hecho
posible la realización de este trabajo:
Al Dr. D. Alfonso Pinedo Sánchez, Profesor Titular del Departamento de Medicina
Preventiva y Salud Pública de la Facultad de Medicina, y Jefe de Servicio de Microbiología
del Hospital Virgen de la Victoria de Málaga, por la confianza prestada al brindarme la
oportunidad y los medios necesarios para su realización, así como por su inapreciable ayuda
en la dirección y corrección de esta tesis.
A la Dra. D. María Victoria García López, Adjunta del Servicio de Microbiología del
Hospital Virgen de la Victoria de Málaga, por su apoyo incondicional y colaboración en el
desarrollo de esta tesis
Al Dr. D. Manuel de la Rosa Fraile, Jefe de Servicio de Microbiología del Hospital
Virgen de las Nieves de Granada, por iniciarme en la labor de investigación durante mis
años de formación como residente.
A mi familia, por lo que ha soportado
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 9
INDICE
INDICE ..........................................................................................................................9
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................19
1. - INTRODUCCIÓN HISTÓRICA ........................................................................19
2. - CARACTERES GENERALES DEL STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ...20
2.1. - SITUACIÓN TAXONÓMICA ..................................................................................20
2.2. - CRITERIOS DE CLASIFICACIÓN ...........................................................................21
2.3. - CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS...................................................................21
2.4. - CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.......................................................................23
2.5. - CARACTERÍSTICAS NUTRICIONALES ..................................................................23
2.6. - COMPOSICIÓN DE LA PARED CELULAR ...............................................................24
2.7. - ESTRUCTURA ANTIGÉNICA ................................................................................25
2.7.1. - Antígeno capsular (SSS).............................................................................25
2.7.1.1. - Estructura...................................................................................................................................... 25
2.7.1.2. - Reacciones cruzadas ..................................................................................................................... 25
2.7.1.3. - Identificación serológica............................................................................................................... 26
2.7.1.4. - Factor de virulencia ...................................................................................................................... 26
2.7.2. - Antígenos somáticos...................................................................................26
2.8. - TOXINAS............................................................................................................27
2.8.1. - Neumolisina ...............................................................................................28
2.8.2. - Principio productor de púrpura.................................................................28
2.8.3. -. Otros factores de virulencia......................................................................28
2.9. - AUTOLISINAS ....................................................................................................28
2.10. - BACTERIÓFAGOS .............................................................................................29
2.11. - TRANSFORMACIÓN ..........................................................................................29
3. - EPIDEMIOLOGÍA ..............................................................................................29
3.1. - NEUMONÍA NEUMOCÓCICA. INCIDENCIA ...........................................................31
3.2. - TRANSMISIÓN....................................................................................................31
3.3. - DISTRIBUCIÓN DE SEROTIPOS ............................................................................32
4. - PATOGENIA Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS .......................................33
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 10
4.1. - ASPECTOS CLÍNICOS ..........................................................................................33
4.2. - COMPLICACIONES..............................................................................................34
4.3. - INFECCIONES EXTRAPULMONARES ....................................................................35
4.3.1. - Otitis media ................................................................................................35
4.3.2. - Sinusitis aguda ...........................................................................................35
4.3.3. - Meningitis...................................................................................................36
4.3.4. - Endocarditis ...............................................................................................37
4.3.5. - Artritis ........................................................................................................37
4.3.6. - Peritonitis...................................................................................................38
5. - DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO .............................................................38
5.1. - AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO ..............................................................38
5.1.1. - Toma de la muestra....................................................................................38
5.1.2. - Examen directo ..........................................................................................38
5.1.3. - Cultivo........................................................................................................39
5.1.4. - Patogenicidad en animales ........................................................................40
5.2. - IDENTIFICACIÓN ................................................................................................41
5.2.1. - Identificación del antígeno capsular..........................................................42
5.2.1.1. - Coaglutinación.............................................................................................................................. 42
5.2.1.2. - Test de aglutinación en látex. ....................................................................................................... 42
5.2.1.3. - Contrainmunoelectroforesis.......................................................................................................... 42
5.2.2. - Identificación de otros componentes bacterianos......................................43
5.3. - ANTICUERPOS CIRCULANTES. ............................................................................43
6. - INMUNIDAD. .......................................................................................................43
6.1. - INMUNIDAD NATURAL. ......................................................................................43
6.2. - INMUNIDAD ADQUIRIDA. ...................................................................................43
6.2.1. - Vacunas......................................................................................................44
6.3. - INFECCIONES EN PACIENTES INMUNOCOMPROMETIDOS. ....................................45
6.3.1. - Esplenotomía..............................................................................................45
6.3.2. - Agammaglobulinemia. ...............................................................................45
6.3.3. - Enfermedades hematológicas. ...................................................................45
6.3.4. - Infecciones neumocócicas en pacientes infectados por el virus de la
inmunodeficiencia humana ................................................................................................45
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 11
7. - TRATAMIENTO..................................................................................................46
7.1. - INTRODUCCIÓN..................................................................................................46
7.1.1. - Situación actual del tratamiento de las infecciones neumocócicas ...........46
7.1.2. - Elección del agente antimicrobiano ..........................................................48
7.1.3. - Tabla 2: Niveles en suero y LCR ...............................................................50
7.2. - PENICILINA G ....................................................................................................51
7.2.1. - Farmacología.............................................................................................51
7.2.2. - Acción de los ß-lactámicos. .......................................................................52
7.2.2.1. - Pared celular ................................................................................................................................. 52
7.2.2.2. - Proteínas fijadoras de penicilina (PFPs o PBPs)........................................................................... 53
7.2.2.3. - Autolisinas.................................................................................................................................... 56
7.2.2.4. - Tolerancia. .................................................................................................................................... 58
7.2.2.5. - Cinética de la acción bactericida por ß-lactámicos ....................................................................... 59
7.2.2.6. - Criterio de resistencia. .................................................................................................................. 60
7.2.2.7. - Prevalencia y distribución de neumococos resistentes a penicilina. ............................................. 60
7.2.2.8. - Resistencia múltiple...................................................................................................................... 61
7.3. - CEFEMAS: CEFTRIAXONA..................................................................................64
7.3.1. - Farmacología.............................................................................................64
7.3.2. - Mecanismo de acción.................................................................................65
7.3.3. - Resistencia. ................................................................................................66
7.4. - CARBAPENEMAS: IMIPENEM..............................................................................66
7.4.1. - Farmacología.............................................................................................67
7.4.2. - Mecanismo de acción.................................................................................67
7.4.3. - Resistencia. ................................................................................................68
7.5. - GLUCOPÉPTIDOS: VANCOMICINA. .....................................................................68
7.5.1. - Farmacología.............................................................................................68
7.5.2. - Mecanismo de acción.................................................................................69
7.5.3. - Resistencia. ................................................................................................70
7.6. - FOSFOMICINA. ...................................................................................................70
7.6.1. - Farmacología.............................................................................................71
7.6.2. - Mecanismo de acción.................................................................................71
7.6.3. - Resistencia. ................................................................................................72
7.7. - QUINOLONAS. ESPARFLOXACINO. .....................................................................72
7.7.1. - Farmacología.............................................................................................74
7.7.2. - Mecanismo de acción.................................................................................75
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 12
7.7.3. - Resistencia. ................................................................................................77
8. - PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD .................................................................78
8.1. - PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD POR DIFUSIÓN EN AGAR CON DISCO.....................78
8.2. - PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD POR E-TEST.........................................................79
8.3. - PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD POR DILUCIÓN...................................................80
8.3.1. - Prueba de susceptibilidad por dilución en caldo.......................................80
8.3.2. - Tasas de letalidad in vitro..........................................................................80
8.3.2.1. - Cinética del crecimiento en medio líquido. Ciclo de crecimiento................................................. 80
8.3.2.2. - Curvas de muerte .......................................................................................................................... 82
8.3.2.3. - Factores que afectan los resultados de las curvas de muerte......................................................... 83
8.3.3. -. Estudio de la acción bactericida en animales ..........................................83
8.4. - OTROS ASPECTOS FARMACOLÓGICOS: EFECTO POST-ANTIBIÓTICO (EPA).........83
8.4.1. - ß-lactámicos ...............................................................................................84
8.4.2. - Glicopéptidos .............................................................................................85
8.4.3. - Quinolonas .................................................................................................85
8.4.4. - Estudio in vitro del EPA............................................................................85
8.4.4.1. - Métodos de eliminación del antimicrobiano................................................................................. 86
8.4.4.2. - Métodos de recuento bacteriano ................................................................................................... 88
8.4.4.3. - Factores que afectan al EPA. ........................................................................................................ 89
8.4.5. - Estudios del EPA mediante modelos animales ..........................................94
8.4.6. - Implicaciones sobre los regímenes de dosificación...................................95
8.5. - COMBINACIONES DE ANTIMICROBIANOS............................................................95
8.5.1. - Estudio in vitro de las combinaciones de antimicrobianos .......................96
8.5.2. - Definiciones de la interacción antimicrobiana in vitro .............................97
8.5.3. - Interacciones antagónicas .........................................................................98
8.5.3.1. - ß-lactámicos.................................................................................................................................. 98
8.5.3.2. - Fluorquinolonas............................................................................................................................ 99
8.5.4. - Interacciones sinérgicas ............................................................................99
8.5.4.1. - Fosfomicina más ß-lactámicos...................................................................................................... 99
8.5.4.2. - Vancomicina más ß-lactámicos .................................................................................................... 99
OBJETIVO GENERAL ...........................................................................................101
OBJETIVOS EXPERIMENTALES .......................................................................101
1. - ACCIÓN BACTERICIDA.................................................................................101
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 13
1.2. - OBJETIVOS METODOLÓGICOS ..........................................................................101
1.2.1. - Influencia de la variación en el tamaño del inóculo................................101
1.2.2. - Evaluación del medio de cultivo empleado..............................................102
1.3. - CURVAS DE LETALIDAD...................................................................................102
1.4. - EFECTO POST-ANTIBIÓTICO .............................................................................102
1.4.1. - Efecto de la concentración del antimicrobiano sobre el efecto post-
antibiótico ........................................................................................................................102
1.4.2. - Efecto del tiempo de exposición sobre el efecto post-antibiótico ............103
1.5. - COMBINACIÓN DE ANTIMICROBIANOS .............................................................103
MATERIAL Y MÉTODOS .....................................................................................105
1. - MATERIAL ........................................................................................................105
1.1. - CEPAS..............................................................................................................105
1.2. - SELECCIÓN DE CEPAS. .....................................................................................105
1.2.1. - Caracterización e identificación. .............................................................105
1.2.1.1. - Pruebas morfológicas.................................................................................................................. 106
1.2.1.1.1. - Morfología celular............................................................................................................... 106
1.2.1.1.2. - Morfología colonial............................................................................................................. 106
1.2.1.2. - Pruebas diagnósticas................................................................................................................... 106
1.2.1.2.1. - Pruebas clásicas................................................................................................................... 107
1.2.1.2.1.1. - Sensibilidad a la optoquina. ......................................................................................... 107
1.2.1.2.1.2. - Solubilidad en bilis. ..................................................................................................... 107
1.2.1.2.2. - Pruebas inmunoespecíficas.................................................................................................. 107
1.2.1.2.3. - Serotipado. .......................................................................................................................... 107
1.2.2. - Cepas controles........................................................................................108
1.3. - MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANO. .................................................................109
1.3.1. - Medios para la conservación de cepas. ...................................................109
1.3.2. - Medios de aislamiento. ............................................................................109
1.3.3. - Medios empleados en las técnicas. ..........................................................110
1.3.3.1. - Técnica de difusión en agar. ....................................................................................................... 110
1.3.3.2. - Técnica Etest®. ........................................................................................................................... 110
1.3.3.3. - Técnica por dilución en caldo..................................................................................................... 110
1.3.3.3.1. - Caldo Mueller-Hinton II...................................................................................................... 110
1.3.3.3.2. - Sangre de caballo lisada. ..................................................................................................... 111
1.4. - ANTIMICROBIANOS..........................................................................................111
1.4.1. - Selección de antimicrobianos. .................................................................111
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 14
1.4.2. - Selección del rango de concentraciones. .................................................111
1.4.3. - Preparación y almacenamiento. ..............................................................111
1.4.4. - Soluciones de antimicrobianos. ...............................................................112
1.4.4.1. - Penicilina G sódica. .................................................................................................................... 112
1.4.4.2. - Vancomicina............................................................................................................................... 112
1.4.4.3. - Ceftriaxona. ................................................................................................................................ 112
1.4.4.4. - Imipenem.................................................................................................................................... 112
1.4.4.5. - Fosfomicina. ............................................................................................................................... 113
1.4.4.6. - Esparfloxacino. ........................................................................................................................... 113
2. - MÉTODOS..........................................................................................................114
2.1. - PRUEBA DE SENSIBILIDAD POR EL MÉTODO DISCO-PLACA ...............................114
2.2. - CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA (CIM). ...............................................114
2.2.1. - Método de microdilución en caldo...........................................................114
2.2.1.1. - Preparación del inóculo. ............................................................................................................. 114
2.2.1.2. - Rango de concentraciones estudiadas. ........................................................................................ 115
2.2.1.3. - Desarrollo de la técnica. ............................................................................................................. 115
2.2.2. - Método Etest®. ........................................................................................116
2.2.2.1. - Estandarización del inóculo. ....................................................................................................... 116
2.2.2.2. - Desarrollo de la técnica Etest®.................................................................................................... 116
2.2.2.3. - Lectura de las CIMs Etest®......................................................................................................... 116
2.3. - ACCIÓN BACTERICIDA. CURVA LETAL.............................................................117
2.3.1. - Preparación del inóculo...........................................................................117
2.3.2. - Cepas estudiadas......................................................................................119
2.3.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos. .....................................119
2.3.4. - Técnica. ....................................................................................................120
2.3.4.1. - Material. ..................................................................................................................................... 120
2.3.4.2. - Desarrollo de la técnica. ............................................................................................................. 121
2.3.4.3. - Lectura........................................................................................................................................ 121
2.3.4.4. - Representación gráfica................................................................................................................ 122
2.3.4.5. - Interpretación.............................................................................................................................. 123
2.4. - EFECTO POST-ANTIBIÓTICO (EPA). .................................................................124
2.4.1. - Preparación del inóculo...........................................................................124
2.4.2. - Cepas probadas........................................................................................124
2.4.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos. .....................................125
2.4.4. - Técnica. ....................................................................................................125
2.4.4.1. - Material. ..................................................................................................................................... 125
2.4.4.2. - Desarrollo de la técnica. ............................................................................................................. 125
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 15
2.4.4.2.1. - Preparación de los antimicrobianos.................................................................................... 125
2.4.4.2.2. - Curvas de muerte................................................................................................................. 125
2.4.4.2.3. - Efecto post-antibiótico tras 1 hora de exposición. ............................................................... 126
2.4.4.2.4. - Efecto post-antibiótico tras 2 horas de exposición. ............................................................. 126
2.4.4.3. - Lectura........................................................................................................................................ 126
2.4.4.4. - Representación gráfica................................................................................................................ 126
2.4.4.5. - Interpretación.............................................................................................................................. 127
2.5. - COMBINACIÓN DE ANTIBIÓTICOS: ACCIÓN BACTERICIDA. ...............................127
2.5.1. - Preparación del inóculo...........................................................................128
2.5.2. - Cepas estudiadas......................................................................................128
2.5.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos. .....................................129
2.5.4. - Técnica. ....................................................................................................129
2.5.4.1. - Material. ..................................................................................................................................... 129
2.5.4.2. - Desarrollo de la técnica. ............................................................................................................. 129
2.5.4.3. - Lectura........................................................................................................................................ 129
2.5.4.4. - Representación gráfica................................................................................................................ 130
2.5.4.5. - Interpretación.............................................................................................................................. 130
RESULTADOS..........................................................................................................131
1. - CEPAS BACTERIANAS. ..................................................................................131
2. - ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS....................132
2.1. - DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA......................132
2.2. - CONTROL DE CALIDAD ....................................................................................133
3. - ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS SOLOS:.........133
3.1. - COMPARATIVA DEL MEDIO EMPLEADO. AUTÓLISIS .........................................133
3.2. - EFECTO DE LA VARIACIÓN DEL TAMAÑO DEL INÓCULO ...................................133
3.3. - ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS SOLOS ................................137
3.3.1. - Cepas sensibles a penicilina. ...................................................................138
Efectos a las 2 horas .............................................................................................................................. 138
Efectos a las 4 horas .............................................................................................................................. 139
Efectos a las 6 horas .............................................................................................................................. 140
Efectos a las 8 horas .............................................................................................................................. 140
Efectos a las 10 horas ............................................................................................................................ 141
3.3.2. - Cepas con resistencia intermedia a penicilina ........................................144
Efectos a las 2 horas .............................................................................................................................. 144
Efectos a las 4 horas .............................................................................................................................. 144
Efectos a las 6 horas .............................................................................................................................. 145
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 16
Efectos a las 8 horas .............................................................................................................................. 146
Efectos a las 10 horas ............................................................................................................................ 147
3.3.3. - Cepas penicilina resistentes.....................................................................149
Efectos a las 2 horas .............................................................................................................................. 149
Efectos a las 4 horas .............................................................................................................................. 149
Efectos a las 6 horas .............................................................................................................................. 150
Efectos a las 8 horas .............................................................................................................................. 150
Efectos a las 10 horas ............................................................................................................................ 151
3.4. - EFECTO POST-ANTIBIÓTICO .............................................................................154
3.4.1. - Influencia de la concentración y el tiempo de exposición .......................164
4. - ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS EN
ASOCIACIÓN ......................................................................................................................166
4.1. - EFECTIVIDAD DE LAS ASOCIACIONES...............................................................166
4.2. - EFECTIVIDAD DE LAS PROPORCIONES ..............................................................167
DISCUSIÓN ..............................................................................................................183
2.- CEPAS BACTERIANAS ....................................................................................184
3.- MÉTODO DE RECUENTO DE VIABLES......................................................185
3.1.- Limitaciones, precisión, reproducibilidad y umbral del método .................185
3.2.- COMPARATIVA DEL MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO. AUTÓLISIS ......................186
3.3.- EFECTO DE LA VARIACIÓN EN EL TAMAÑO DEL INÓCULO..................................188
4.- ACCIÓN BACTERICIDA..................................................................................189
4.1.- ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS .........................................................................189
4.1.1.- Cepas sensibles a penicilina .....................................................................189
4.1.1.1. - Cepas resistentes a penicilina ..................................................................................................... 190
4.1.1.1.- Cepas resistentes a penicilina ...................................................................................................... 190
4.1.1.2.- Cepas con resistencia intermedia a penicilina ......................................................................... 191
4.1.1.1.3.- Cepas con alta resistencia a penicilina. ................................................................................ 192
4.2.- VANCOMICINA..................................................................................................192
4.3.- ESPARFLOXACINO ............................................................................................193
5.- EFECTO POST-ANTIBIÓTICO.......................................................................195
5.2.- LIMITACIONES DE LA TÉCNICA .........................................................................195
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 17
5.3.- INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN Y EL TIEMPO DE EXPOSICIÓN SOBRE EL EPA
.............................................................................................................................................196
6.- ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS EN
ASOCIACIÓN ......................................................................................................................199
6.1. - EFECTIVIDAD DE LAS ASOCIACIONES...............................................................200
6.1.1. - ß-lactámicos más vancomicina ................................................................200
6.1.2. - ß-lactámicos más fosfomicina..................................................................201
6.2. - Eficacia de las proporciones.......................................................................201
CONCLUSIONES.....................................................................................................203
BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................205
APÉNDICE I: CURVAS DE LETALIDAD..........................................................269
APÉNDICE II: EFECTO POST-ANTIBIÓTICO.................................................269
APÉNDICE III: COMBINACIÓN DE ANTIMICROBIANOS ..........................269
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Indice 18
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 19
INTRODUCCIÓN
1. - Introducción histórica
El establecimiento sistemático, a lo largo del
tiempo, de las características del Streptococcus
pneumoniae [(Klein) Chester, 1901] (neumococo, antes
Diplococcus pneumoniae), como un agente productor
de enfermedad, ha proporcionado algunos de los más
importantes descubrimientos de las ciencias
biomédicas. Fue aislado por primera vez de la saliva
humana en 1880 por Pasteur en Francia que lo
denominó Microbe septicemique du salive y por
Sternberg en los Estados Unidos que lo llamó
Micrococcus pasteuri siendo establecida su relación
con la neumonía lobular pocos años después en 1883 por Friedlander y Talamon
(Musher, 1995), A principios de la década de 1890 Félix y Georg Klemperer demostraron
que la inmunización con neumococos muertos protegía a los animales de
experimentación contra la inoculación ulterior de neumococos y, además, que esta
protección podía transferirse mediante la infusión de suero de ratones inmunizados a
receptores no expuestos. Neufeld y Rimpau demostraron que la inmunidad se debía
a la presencia de factores séricos que facilitaban la fagocitosis por parte de los
leucocitos, proceso que estos autores designaron como opsonización. Estas
observaciones brindaron los fundamentos de lo que hoy conocemos como
inmunidad humoral. Entre 1900 y 1902 Neufeld descubrió la lisis por bilis y la
reacción de qquueelllluunngg. Se debe a Neufeld y a Handel el reconocimiento de los
distintos tipos de neumococo que en 1910 condujo a la obtención de distintos
antisueros específicos, y con ello, al primer tratamiento eficaz de la neumonía
neumocócica. Siguieron después las observaciones fundamentales de Avery,
Heidelberger y Goebel sobre la estructura química del antígeno capsular y su papel
en la virulencia bacteriana. Posteriormente al estudio de Griffith, en 1928, sobre si
las células de neumococo de un tipo serológico podían transformarse en células
neumocócicas de otro tipo in vivo, Avery, MacLeod y McCarty en 1944 descubrieron
Fig. 1: Pasteur codescubridor del
neumococo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 20
que el componente químico de las células neumocócicas responsable de la
transformación es su DNA (McCarty, 1994). Antes de 1940 el conocimiento del fenómeno
genético provenía de las investigaciones sobre plantas y animales, pero no se sabía
si estos resultados se podían aplicar a los microorganismos. Encontraron que el
material de DNA de un tipo de neumococos puede transferir una característica
hereditaria a otro tipo de neumococos. Posteriormente, en 1953 Watson, Crick y
Wilkins descubrieron la estructura molecular del DNA. Estos descubrimientos, junto
con otros, establecieron que la información genética de todos los organismos está
codificada en el DNA. Esto hizo de los microorganismos un modelo muy atractivo
para la investigación genética, al abrir la puerta de la genética molecular (Davis B.D., 1996;
Austrian, 1996). Actualmente y utilizando la tecnología del DNA recombinante o ingeniería
genética se pueden transferir fragmentos de DNA de un organismo a otro.
2. - Caracteres generales del Streptococcus pneumoniae
2.1. - Situación taxonómica
La 8ª edición del Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, clasifica
el género Streptococcus - [Rosembach 1884] - como perteneciente a la familia
Streptococcaceae junto a otros géneros: Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus y
Gemella; sin embargo, el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Hardie 1986),
no lo incluye en ninguna familia, considerándolo un género independiente.
El género fue clasificado en cuatro divisiones principales (piogénico, viridans,
láctico y enterococo). Una clasificación más reciente, divide el género en siete
grupos denominados piogénico, neumococo, oral, fecal, láctico anaeróbico y otros
estreptococos. Sin embargo es marcadamente artificial y en la mayoría de los casos
sin estricta validez taxonómica. Una ordenación similar a la anterior es la que
presenta el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology con la diferencia de la
inclusión del Streptococcus pneumoniae en el grupo piogénico. La situación
taxonómica del S. pneumoniae está basada en un polisacárido específico de la
pared celular, y en distintas propiedades fisiológicas como son la actividad
hemolítica, solubilidad en bilis y la sensibilidad a los discos de 5 µg de Optoquina
(etilhidro-cupreína) en placa de agar sangre, entre otras pruebas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 21
2.2. - Criterios de clasificación
El neumococo, antes conocido por el nombre de Diplococcus pneumoniae, ha
sido definitivamente clasificado dentro del género Streptococcus y debe
denominarse como Streptococcus pneumoniae (Deibel, 1974). La similitud entre el
neumococo y otros estreptococos comprende las siguientes características:
(a) Morfología: El S. pneumoniae es un coco Gram positivo capaz de crecer
en medios líquidos formando pequeñas cadenas.
(b) Metabolismo: Los estreptococos, incluyendo el neumococo, son bacterias
lácticas, esto es, capaces de fermentar la glucosa por la vía de los monofosfatos de
hexosa para rendir ácido láctico.
(c) Hemólisis: Se produce una fuerte alfahemólisis en agar sangre cuando los
cultivos son incubados en aerobiosis, mientras que en incubación anaerobia la
hemólisis puede faltar o puede producirse betahemólisis (Austrian, 1996) debido a la
neumolisina O idéntica a la estreptolisina O (Rotta, 1986).
(d) Estructura antigénica: Los neumococos y otros estreptococos contienen un
hidrato de carbono y una proteína M específicos de grupo, aunque esta última
carece de poder antifagocítico en el caso del neumococo (Rota, 1986; Musher, 1995).
(e) Mecanismos de transformación: Se ha logrado la transferencia de la
resistencia a antibióticos, especificidad antigénica de tipo y otros marcadores
genéticos entre especies de estreptococos (Rotta, 1986).
(f) Proporción molar Guanina + Citosina en ácidos nucleicos: La proporción
molar de las especies de Streptococcus incluyendo el S. pneumoniae es de un rango
similar entre 33 y 42 % (Hardei, 1986; Musher, 1995).
2.3. - Características morfológicas
S. pneumoniae se presenta como células cocoides de 0,5 a 1,25 µm de
diámetro, Gram positivas, inmóviles, no esporuladas, anaerobias facultativas, crecen
formando parejas típicas y sólo ocasionalmente en cadenas cortas (Hardie, 1986). Antes
de la división celular los cocos se alargan según un eje, escindiéndose
posteriormente para originar parejas. Cuando no se completa la separación se
forman las cadenas (Austrian, 1996). Las parejas presentan en sus terminaciones distales
una ligera deformación en punta que les da un aspecto lanceolado (Deibel 1974; Figura 2).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 22
En los aislamientos primarios generalmente se presentan en parejas
encapsuladas en material polisacarídico denominado sustancia específica soluble
(specific soluble sustance o SSS), mientras que el crecimiento prolongado en los
medios de laboratorio, especialmente en agar con bajo contenido en Mg++, o la
presencia de anticuerpos tipoespecíficos promueve la formación de cadenas cortas.
La tinción Gram positiva puede perderse en los cultivos viejos (Austrian, 1996).
Dado que las cadenas estreptocócicas son
difíciles de fragmentar manteniendo la viabilidad de los
microorganismos, algunos autores prefieren hablar de
unidades estreptocócicas al indicar el número de
colonias contadas, que es sólo un índice aproximado al
número de células influido por la longitud de las
cadenas (Austrian, 1996).
En medio líquido, la mayoría de las cepas
capsuladas originan un crecimiento difuso que
sedimenta cuando el medio se torna ácido, las cepas
no capsuladas, particularmente aquellas que tienden a formar cadenas, presentan
un crecimiento flocular que rápidamente sedimenta.
Si se prolonga la incubación en medio líquido, el recuento de formas viables
baja y el cultivo tiende a clarificarse. Estos cambios son debidos en parte a la acción
de los enzimas autolíticos que primeramente consiguen que las células pasen a
Gram negativas para acabar lisándolas. Esta autólisis es estimulada por agentes
tensioactivos como las sales biliares, propiedad que se utiliza en el diagnóstico del
S. pneumoniae.
En la superficie de los medios sólidos las células capsuladas forman colonias
mucosas que alcanzan un diámetro de 0.5 a 1.5 mm de diámetro después de 24 a
36 horas. Al envejecer las colonias suelen presentar el centro colapsado por la
autólisis. En los medios con sangre presentan una zona de hemólisis incompleta o
alfahemólisis si la incubación es aeróbica, mientras que en anaerobiosis pueden ser
betahemolíticos, debido a la neumolisina O sensible al oxígeno, o no mostrar
hemólisis (Musher, 1995). El tipo y extensión de la hemólisis, está influida por la
composición del medio base, el tipo y concentración de la sangre así como las
condiciones de cultivo (Deibel, 1974). El S. pneumoniae es capaz de presentar, en
Fig. 2: Diplococos grampositivos
(neumococos)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 23
variación de fase, diferencias en la transparencia de la colonia relacionadas con las
tasas de autolisis y otras propiedades fisiológicas y factores de virulencia (Weiser, 1996).
La cápsula neumocócica es demostrable al microscopio óptico suspendiendo
microorganismos en tinta china, también puede ser vista fácilmente mediante la
denominada reacción de quellung consistente en un tratamiento con anticuerpos
homólogos tipoespecíficos que hacen la cápsula más refringente cuando se unen al
polisacárido capsular.
2.4. - Características bioquímicas
Los neumococos son microorganismos exigentes que requieren de un medio
completo para su crecimiento. Sus requerimientos energéticos son satisfechos
principalmente por la fermentación láctica, siendo generalmente capaz de fermentar
la glucosa, galactosa, fructosa, sucrosa, lactosa, maltosa, rafinosa y glucógeno.
Mientras que su capacidad para metabolizar la inulina lo separa de la mayoría de los
otro estreptococos alfa hemolíticos (Deibel, 1974). Es capaz de realizar una lenta
producción de ácido a partir del glicerol (en incubación aeróbica), xilosa, arabinosa y
erithritol. Algunas cepas pueden fermentar el manitol. No producen ácidos a partir
del dulcitol o sorbitol.
El S. pneumoniae es anaerobio facultativo, oxidasa y catalasa negativo, con
tendencia a acumular ácidos acético y fórmico, lo que puede ocasionar, al disminuir
excesivamente el pH, una pérdida de viabilidad en los cultivos. En presencia de una
fuente de catalasa como los glóbulos rojos, el neumococo logra sobrevivir a 0-4 ° C
durante largo tiempo (Musher, 1995).
2.5. - Características nutricionales
El neumococo es un parásito obligado con requerimientos nutritivos
semejantes a los de sus hospedadores. El pH óptimo es de 7,8 dentro de un rango
de 6,4 - 8,3. El pH final que la actividad fermentativa del S. pneumoniae llega a
lograr en caldo glucosado es del orden de 5. La temperatura óptima de crecimiento
oscila entre 25 y 42 °C. De un 5 a un 10 % de los aislamientos requieren de una
atmósfera de CO2 para crecer en los medios de agar, por ello todos los cultivos
primarios deben incubarse en estufa de carbónico.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 24
Un medio satisfactorio es el caldo infusión de carne conteniendo un 10 % de
suero o sangre, y ajustado a un pH 7,4 - 7,8. El caldo infusión puede ser algo
inhibitorio cuando se expone al aire, por lo que debería añadirse algún agente
antioxidante como cisteína o tioglicolato para permitir el crecimiento, especialmente
cuando el inóculo es bajo.
A diferencia de otros estreptococos, el neumococo requiere de colina para
crecer en medios definidos (Rotta, 1986). La etanolamina puede sustituir a la colina en
los medios sintéticos pero aparece después como componente del ácido teicoico
originando ciertas alteraciones: las células no pueden dividirse y forman largas
cadenas, se hacen resistentes a la autólisis en presencia de penicilina, pierden la
capacidad de producir transformación y de adsorber sus fagos.
La mayoría de las cepas requieren de 4 vitaminas B además de guanina,
adenina, uracilo y de 7 a 10 aminoácidos esenciales. Se ha descrito un medio
sintético por Tomasz, y aunque no resulta adecuado para su uso rutinario, si lo es
para la recuperación de fracciones dializables (Austrian, 1996).
2.6. - Composición de la pared celular
Es la composición característica de las bacterias Gram positivas, constituida
principalmente por peptidoglicano al que se le unen una serie de carbohidratos,
ácidos teicoicos y antígenos proteicos de superficie.
Este peptidoglicano está formado por pequeñas cadenas de péptidos que
unen de forma cruzada a largas cadenas de polisacáridos.
Estos polisacáridos están formados por unidades alternas de N-
acetilglucosamina y ácido N- acetilmurámico.
La pared celular de los estreptococos contiene siempre el aminoazúcar
glucosamina y el ácido murámico, siendo la galactosamina un componente variable
dentro del género. Los azúcares reductores que se encuentran con mayor frecuencia
son glucosa, galactosa y ramnosa en diferentes combinaciones según la especie.
Algunos estreptococos contienen ácidos teicoicos además del ácido lipoteicoico
común en muchas bacterias Gram positivas.
A diferencia de otras especies estreptocócicas, en el neumococo la colina
forma parte de los ácidos teicoicos como en el ácido ribitol teicoico con fosfato de
colina (Rotta, 1986).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 25
Algunos componentes de la pared celular poseen propiedades inflamatorias
(Carlsen, 1992)
2.7. - Estructura antigénica
Se han diferenciado 90 serotipos según los
polisacáridos capsulares, lo que constituye la base
de su clasificación a diferencia de otros
estreptococos que se clasifican por los antígenos
somáticos.
Dos sistemas de nomeclatura se han
establecido: el americano y el danés siendo este
último más utilizado (Rotta, 1986).
Por otro lado se han descrito hasta tres clases de antígenos somáticos: el
antígeno proteico R, poco conocido, y la sustancia C glucídica, son específicos de
especie, mientras que el antígeno M es una proteína tipo-específica genética e
inmunológicamente independiente del polisacárido capsular (Rotta, 1986).
2.7.1. - Antígeno capsular (SSS)
2.7.1.1. - Estructura
La cápsula neumocócica está compuesta por grandes polímeros
polisacarídicos que constituyen un gel hidrofílico en la superficie de los organismos
Se ha dilucidado la estructura de algunos, así el tipo 3, por ejemplo, está compuesto
por unidades repetidas de ácido celobiourónico [ ácido D-glucurónico unido a D-
glucosa por enlaces beta 1-4 ] unidas por enlaces glucosídicos beta 1-3 (Austrian, 1996;
Morona, 1997).
2.7.1.2. - Reacciones cruzadas
Aunque los polisacáridos capsulares del neumococo muestran un alto grado
de especificidad de tipo, algunos pueden presentar reacciones cruzadas con
antígenos capsulares de otros tipos y hasta de otras especies bacterianas como
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., Haemophilus influenzae
tipo B y con estreptococos del grupo viridans. El tipo 14 por ejemplo, muestra
reacciones cruzadas con Streptococcus agalactiae tipo III y con isoantígenos
humanos del grupo ABO (Musher, 1995).
Neuroaminidasa
Autolisina
Peumolisina
Polisacárido capsular
Pared celular
PspA dímero
PsaA
Acido teicoico
Membrana celular
Acido lipoteicoico
Fig. 3: Estructura antigénica delneumococo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 26
2.7.1.3. - Identificación serológica
La clasificación en serotipos se efectúa a partir de los polisacáridos
capsulares, que pueden demostrarse por aglutinación, por
contrainmunoelectroforesis o por una reacción de precipitación en su cápsula
denominada reacción de quellung (Musher, 1995). El procedimento consiste en dejar
secar al aire una suspensión del microorganismo en un portaobjetos y volver a
suspenderlo con una cantidad de suero antineumocócico al que se le añade azul de
metileno. Después de algunos minutos se observa al microscopio con objetivo de
inmersión, y se aprecia, si es positivo, al microorganismo rodeado de una cápsula
grande refringente.
Recientemente se han desarrollado otras técnicas de serotipado como la de
dot blot, con objeto de simplificar el estudio de grandes números de cepas (Fenoll, 1997).
Hasta el momento se han identificado 84 serotipos patógenos para el hombre.
Los serotipos 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 y 23 son los que se aíslan con
mayor frecuencia en la clínica. El serotipo 3 es el clásicamente más virulento y el 23
(23F) el que con mayor asiduidad se asocia a la resistencia a la penicilina en España
(Fenoll, 1998), habiéndose descrito en cepas con alta resistencia a cefalosporinas
(Figueiredo, 1992)
2.7.1.4. - Factor de virulencia
La patogenicidad del neumococo está directamente relacionada con el
polisacárido capsular (Kelly, 1994; Vidarson, 1994; Watson, 1995), principalmente debido a su
capacidad antifagocítica. Las cepas capsuladas (S o mucosas) son virulentas para
humanos y animales de experimentación, mientras que las cepas acapsuladas (R o
rugosas) no lo son. La inmunización con polisacárido capsular purificado protege
contra la infección por tipos homólogos (Musher, 1995; Giebink, 1993; Vi�arson, 1994; Ekdahl, 1997).
2.7.2. - Antígenos somáticos
En 1930 Tillet, Goebbel y Avery aislaron a partir de células neumocócicas un
carbohidrato, que a diferencia de los polisacáridos capsulares contenía restos
fosfato y era específico de especie (Tomasz, 1988).
El determinante antigénico de este polisacárido, denominado sustancia C o
polisacárido C neumocócico, es un ácido teicoico formado por restos fosfato N-
acetilgalactosamina (Yother, 1998), que llega a constituir mas del 30 % del carbohidrato
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 27
de la pared celular, y que no se ha encontrado en otras células bacterianas, mientras
que el componente fosfato de colina es el responsable de la reactividad del
neumococo con la proteína C reactiva, una betaglobulina presente a bajas
concentraciones en el suero normal.
La liberación de componentes neumocócicos durante el tratamiento
antimicrobiano de la meningitis, suele ser causa de inflamación meníngea, siendo
los ácidos teicoico y lipoteicoico unos de los componentes con mayor capacidad
inflamatoria. Este proceso inflamatorio es responsable en parte, de la alta mortalidad
y secuelas de la meningitis neumocócica, por lo que se ha investigado el uso de anti-
inflamatorios (Tuomanem, 1987; 1990; Word, 1989; Bradley, 1994; Cabellos, 1995; Kanra, 1995; Lebel, 1988), así
como la selección de antimicrobianos que minimicen la liberación de antígenos (Stuertz
K., 1998; 1998b).
Antígeno proteico M. Los neumococos capsulados o no, poseen una proteína
somática antigénica específica de tipo, con propiedades fisicoquímicas semejantes a
las proteínas M de los estreptococos del grupo A (Austrian, 1996). Sin embargo no posee
propiedades antifagocíticas, ni los anticuerpos producidos contra ella son
protectores.
Antígeno proteico R. El antígeno de la proteína R fue aislado inicialmente de
cepas no capsuladas o rugosas. Se localiza en o cerca de la superficie celular, y no
se ha definido químicamente.
La neuroaminidasa, factor responsable de la unión del ácido N-
acetilneuramínico a la mucina, gangliósidos y glicoproteínas, puede afectar al mucus
protector respiratorio, favoreciendo la colonización (Cámara, 1994)
2.8. - Toxinas
La capacidad del neumococo para producir enfermedad es en gran parte
debida a su resistencia a la fagocitosis con la subsiguiente invasión y multiplicación
en los tejidos del huésped, y la génesis de las lesiones neumocócicas es un ejemplo
característico de la contribución de los componentes de la pared celular a los
síntomas y signos de la enfermedad (Tuomanem, 1995). Sin embargo algunas
observaciones clínicas indican la elaboración de sustancia tóxicas por el
microorganismo, como son el comienzo brusco de los síntomas, toxicidad sistémica
y curso fulminante con aparición de coagulación intravascular diseminada en
pacientes esplenotomizados.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 28
Los mecanismos patogénicos de algunas de las toxinas neumocócicas que
seguidamente se describen, no están totalmente dilucidados (Musher, 1995; Kim, 1995).
2.8.1. - Neumolisina
Esta proteína, factor de virulencia citoplasmático, es liberada durante la
autólisis, tiene un peso molecular de 63.000, es destruida por el calor e inactivada
por el oxígeno.
Está relacionada con la hemolisina O oxígeno- lábil de los estreptococos
hemolíticos, Clostridium tetani y C. welchii (Musher, 1995) siendo la responsable de la
betahemólisis que produce el neumococo en anaerobiosis.
Aunque no es necesaria para desencadenar la respuesta inflamatoria en el
SNC (Friedland, 1995b), ha demostrado propiedades dermatotóxicas y puede ser la causa
de la anemia hemolítica observada en conejos y ratones con bacteriemia
neumocócica (Musher, 1995; Benton, 1995; Cavin, 1995; Berry, 1995).
Se ha empleado como base para el desarrollo de técnicas diagnósticas (Kalin,
1987).
2.8.2. - Principio productor de púrpura
Está asociado al mucopéptido de la pared celular y es liberado durante la
autólisis (Musher, 1995). Produce púrpura y hemorragia dérmica en los animales de
experimentación.
2.8.3. -. Otros factores de virulencia
Algunos adenovirus son capaces de facilitar infecciones bacterianas del tracto
respiratorio por mecanismos no bien conocidos. En el caso del neumococo
favorecen in vitro la adherencia a las células (Hakansson, 1994).
El S. pneumoniae tienen una alta capacidad de adherencia a la fibronectina
no soluble, glicoproteína de los mamíferos presente en plasma, LCR y líquido
amniótico, que le proporciona un mecanismo para invadir los epitelios dañados (Flier,
1995).
2.9. - Autolisinas
Las células neumocócicas se lisan durante la incubación prolongada, esto
también sucede en presencia de agentes tensioactivos como las sales biliares y
antimicrobianos inhibidores de la síntesis de la pared celular. En las condiciones
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 29
anteriores se libera la enzima N-acetil-muramil-l- alanina amidasa una autolisina
capaz de romper los puentes entre el ácido murámico y la alanina en el
peptidoglicano de la pared celular (Musher, 1995; Gillespie, 1997).
La actividad de las autolisinas no sólo transciende sobre la división celular e
infección por bacteriófagos (Díaz, 1992; Austrian, 1996), sino que también lo hace sobre la
acción de los antimicrobianos (Azoulay-Dupuis, 1996), y sobre la patogenia de la infección
(Rubins, 1994; Rayner, 1995; Canvin, 1995).
La acción autolítica de los neumococos, dificulta considerablemente su
estudio en medios líquidos a partir de las 10 - 12 horas. Para afrontar este problema,
y para simular comportamientos farmacocinéticos, se han diseñado diversas
tecnologías in vitro de cultivos controlados (Grasso, 1978; Cappelletty, 1996; Casetta, 1996)
2.10. - Bacteriófagos
Un diplofago - Dp1 - y numerosos fagos omega han sido aislados del S.
pneumoniae. Sustancias del diplofago pueden ser las responsables de la inducción
de autólisis necesaria para la liberación de la progenie fágica.
2.11. - Transformación
La recombinación genética por DNA exógeno fue descubierta por Avery y
colaboradores en 1944 en el neumococo. Estas transformaciones han sido
demostradas experimentalmente en ratones y pueden ocurrir en forma natural. Los
cultivos de neumococos liberan ADN transformante de forma más acusada durante
la fase de crecimiento, cuando son también más susceptibles al DNA añadido. Los
marcadores genéticos que se han transformado in vitro con éxito en neumococos
son: la especificidad de tipo del polisacárido capsular, la cantidad de polisacárido
capsular producida, la resistencia antimicrobiana (penicilina, estreptomicina y
sulfamidas) y a la optoquina, la especificidad de tipo de algunas proteínas M, la
formación de cadenas de mutantes lisas y rugosas, y la capacidad de producir
ciertas enzimas inducibles (Davis, 1996b; Austrian, 1996; Mufson, 1995).
3. - Epidemiología
Los neumococos colonizan con frecuencia las vías respiratorias superiores de
los individuos sanos, de forma que el 5-70% de ellos pueden ser portadores
asintomáticos (Musher, 1995). La tasa de portadores es más elevada en niños, en
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 30
comunidades cerradas, en invierno y durante los brotes de infección respiratoria
aguda (Kurtii, 1997; Thornsberry, 1997). La infección neumocócica suele presentarse de forma
esporádica en un portador con algún factor predisponente (Tabla 1). En algunos
casos la adquisición es nosocomial, en especial en pacientes intubados
recientemente o inmunodeprimidos como pacientes infectados por el VIH. Al tratarse
de una infección endógena, los pacientes hospitalizados no requieren aislamiento.
El neumococo causa aproximadamente el 60% de las neumonías
extrahospitalarias en los adultos y el 25% en los niños, con amplias variaciones
según las series. Asimismo, es la segunda causa de meningitis tras el meningococo,
en adolescentes y adultos, aumentando su frecuencia y gravedad con la edad. En
España, el 30% de las meningitis bacterianas del adulto son de etiología
neumocócica; este porcentaje se eleva al 90% si se consideran sólo los casos de
meningitis recurrente.
Tabla 1: Alteraciones de los mecanismos defensivos que
predisponen a la adquisición de neumonía neumocócica
Tipo de alteración Causa o enfermedad subyacente
Disminución de los reflejos epiglótico y tusígeno Inconsciencia, convulsiones,
alcohol, anestesia, sedación
Disminución de la actividad mucociliar Tabaco, inhalación de tóxicos,
Infección de las vías respiratorias altas,
Bronquitis crónica, intubación
Aumento de secreciones Infección vírica respiratoria, anestesia,
Bronquiectasias
Edema intralveolar Insuficiencia cardíaca, traumatismo,
Aspiración, hipoproteinemia
Alteración fagocitosis Neutropenia, asplenia funcional o
anatómica
Alteración de la inmunidad humoral Hipogammaglobulinemia, mieloma,
Hipocomplementemia
Alteración de la inmunidad Infección VIH
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 31
3.1. - Neumonía neumocócica. Incidencia
S. pneumoniae es la causa más frecuente de neumonía adquirida en la
comunidad, observándose las mayores tasas en comunidades cerradas como
cuarteles y en ciertas poblaciones como mineros nativos en la Unión Sudafricana
(Hedlund, 1995; Musher, 1995; Porath, 1997). También es un patógeno a considerar en neumonías
nosocomiales.
Tiene mayor incidencia en hombres que en mujeres de todas las edades. En
personas mayores de 40 años la incidencia es tres a cuatro veces mayor que en la
década anterior. Por otro lado, los mayores picos en climas templados suceden en
los meses de invierno y principio de la primavera (Kim, 1996). La neumonía por
neumococos en la complicación secundaria más común tras la infección por virus
influenza (Musher, 1995), y el incremento de casos de neumonía suele ser paralelo a las
epidemias por este virus.
El número de infecciones neumocócicas también ha aumentado en años
recientes debido a la incidencia del VIH. En un estudio prospectivo realizado por
Bouza y col. (Bouza, 1998) un 18% de todos los ingresados con infecciones
neumocócicas eran VIH positivo. La mayoría de las veces los pacientes debutaron
con neumonía. Más de un 50% de las neumonías neumocócicas que ocurren en la
población menor de 50 años de edad tienen como situación de base la infección por
VIH, y el riesgo global de sufrir neumonía neumocócica en la población VIH positiva
es de 10 a 100 veces superior a la de la población VIH negativa.
3.2. - Transmisión
El neumococo se encuentra normalmente en el tracto respiratorio superior
humano, habiendo sido aislado en un 5 al 70 % de poblaciones adultas sanas. La
tasa de portadores asintomáticos varía con la edad, ambiente y presencia de
infecciones respiratorias (Musher, 1995). En población urbana la tasa desciende con la
edad, y es muy alta en colegios e instalaciones militares. La duración de la
colonización también varía resultando mayor en niños y en adultos con bajo nivel de
anticuerpos antes de la colonización. La relación entre la colonización y el desarrollo
de inmunidad natural no esta bien estudiado. Un aumento significativo de
anticuerpos tipo-específicos, ha sido observado después de la colonización en un 50
% de niños, pero rara vez en adultos.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 32
La mayoría de las cepas obtenidas de portadores son de los tipos altamente
capsulados que no suelen estar asociados a enfermedad. Por otro lado, los mismos
serotipos aislados en procesos neumocócicos tales como neumonía u otitis media,
se han recuperado del tracto respiratorio superior durante el proceso agudo. Como
la neumonía neumocócica suele ser una infección endógena, los pacientes
hospitalizados no requieren de aislamiento.
Las epidemias de neumonía neumocócica son infrecuentes, aún en
poblaciones cerradas, y se asocian a poblaciones susceptibles de distinto tipo.
Durante los períodos epidémicos, la transmisión entre personas es posible por gotas
de saliva (Hendley, 1975; Austrian, 1996).
La mortalidad varía con la edad, tipo capsular y condiciones subyacentes, y
especialmente aumenta cuando cursa con bacteriemia y otros focos
extrapulmonares.
Se han determinado algunos factores de riesgo, asociados a infecciones por
neumococos resistentes a penicilina como la edad menor de 15 años, el tratamiento
previo con ß-lactámicos o la infección por VIH (Bédos, 1995; Boken, 1995).
3.3. - Distribución de serotipos
Al menos 90 serotipos de S. pneumoniae han sido caracterizados (Henrichsen,
1995) aunque sólo un reducido número de ellos se ha mostrado patógeno para
humanos. En la era pre-antibiótica los tipos más abundantes eran el 1, 2 y 3 que
causaban del orden del 75 % de los procesos bacteriémicos (Musher, 1995).
Sin embargo, durante las últimas décadas, se da una distribución distinta
siendo los serotipos 8 - 10 responsables de los casos mas graves de enfermedad
con bacteriemia en adultos. Los serotipos más frecuentes son 1, 3, 4, 7, 8, 9, 12, 14
y algo menos frecuentes son los tipos 6, 18 y 19 (Parkinson, 1994; Musher, 1995; Casal, 1982; Jacobs,
1979; Latorre, 1985; Plouffe, 1994 Shapiro, 1994; Fenoll, 1991; 1998; Scott, 1995; Sessegolo, 1994; Simberkoff, 1986).
Los serotipos más frecuentemente asociados a resistencia a penicilina son el
9, 14 y 23 (Verhaegen, 1998).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 33
4. - Patogenia y manifestaciones clínicas
4.1. - Aspectos clínicos
La patogénesis en la neumonía
neumocócica es debida a la rápida
multiplicación del microorganismo en los
espacios alveolares, merced a su resistencia a
la fagocitosis. La presencia de exudado intra-
alveolar favorece la multiplicación. Sin
embargo, los mecanismos patogénicos
fundamentales no se conocen con exactitud (Bruyn, 1992; Boulnois, 1992; Cundell, 1995; 1995b). La
acción de diversas enzimas y toxinas parece poco importante; por el contrario, se
sabe que los polisacáridos capsulares protegen al organismo de la acción de los
fagocitos y son claros factores de virulencia. Asimismo, se ha demostrado que
distintos componentes de la pared celular son capaces de producir una intensa
reacción inflamatoria en el SNC de pacientes con meningitis (Musher, 1995). Los
mecanismos defensivos del hospedador incluyen a nivel del tracto respiratorio:
células secretorias de mucus, reflejo epiglótico, cilios, reflejo de tos, nódulos
linfáticos, leucocitos fagocíticos como leucocitos polimorfonucleares y macrófagos, y
opsoninas.
El periodo de incubación de la neumonía neumocócica es de 1 a 3 días. Antes
del uso de la antibioticoterapia, la recuperación natural sucedía en 5 a 7 días
coincidiendo con la aparición de anticuerpos circulantes. Clínicamente la
recuperación estaba caracterizada por una brusca caída de la temperatura que se
denominaba crisis.
El cuadro clínico se inicia abruptamente con escalofríos, fiebre, tos, dolor en
punta de costado, disnea y emisión de un esputo herrumbroso en el que se
observan hematíes, leucocitos polinucleares y, en tinción de Gram, diplococos Gram
positivos capsulados.
La neumonía normalmente se desarrolla, después de la aspiración a través
del tracto respiratorio superior, de secreciones conteniendo neumococos, en
Fig. 4: Neumonía lobular neumocócica
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 34
pacientes con defensas debilitadas por alcoholismo, anestesia, o por la acumulación
de fluidos en alveolos frecuentemente asociada a fallo cardiocirculatorio.
Los hallazgos de laboratorio normalmente demuestran leucocitosis con
aumento de neutrófilos y formas en banda (desviación a la izquierda). Sin embargo,
en pacientes ancianos, puede haber leucopenia. La anemia un nivel aumentado de
bilirrubina indirecta puede sugerir cierto grado de hemólisis con o sin enfermedad
pulmonar. Los gases en sangre arterial a menudo demuestran hipoxia y
ocasionalmente un descenso del CO2. El esputo debe ser examinado en tinción de
Gram, y si es posible, observar la reacción de quellung.
La mejoría clínica en respuesta a un adecuado tratamiento puede observarse
en 12 - 36 horas hasta 96 horas. Sin embargo, la curación clínica no marcha paralela
con la curación anatómica, ya que se necesitan de 4 a 8 días mas para que los
macrófagos y fermentos celulares dejen los alveolos en su estado normal,
observándose una completa resolución radiológica en 2-3 semanas en pacientes sin
complicaciones.
4.2. - Complicaciones
El derrame de líquido pleural es la complicación más frecuente en la
neumonía neumocócica sucediendo en un 25 % de los pacientes. El líquido tiene
aspecto de exudado pero la tinción de Gram y los cultivos no suelen demostrar
microorganismos.
La aspiración diagnóstica del líquido pleural debe ser realizada cuando se
sospeche la presencia de empiema, esta complicación, hoy día mucho menos
frecuente, ocurre en un 1 % de los pacientes con
neumonía, y en un 10 % de aquellos con efusión
pleural. Otras complicaciones poco frecuentes en la
actualidad, serían la pericarditis neumocócica y los
abscesos pulmonares.
Bacteriemia. Se detecta bacteriemia en un 25
- 30 % de los pacientes con neumonía neumocócica,
incrementándose la tendencia (Baer, 1995), sin embargo,
la frecuencia relativa varía según el serotipo. La vía de penetración podría ser la
linfática a través de conducto torácico. La mortalidad de los pacientes con
Fig. 5: Absceso neumocócico enpaciente con SIDA
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 35
bacteriemia es el doble que en el resto (Afessa, 1994; Gómez, 1995; Plouffe, 1996) Un curso
clínico fulminante puede darse en los pacientes con neumonía neumocócica y
asplenia con el desarrollo de coagulación intravascular diseminada (Kuikka, 1992; Carpenter,
1997). Los neumococos pueden ser vistos en la sangre periférica de estos pacientes,
siendo origen de infecciones secundarias (Ejlertsen, 1997; Kutas, 1994; Souweine, 1997)
Un elevado porcentaje de neumonías neumocócicas en el paciente VIH
positivo se acompaña de bacteriemia (Janoff, 1992; Bartlett, 1995; Bouza, 1998). Pese a ello, la
evolución de la neumonía en el grupo infectado por VIH sigue un curso más benigno
y con menor mortalidad que en la población VIH negativa.
4.3. - Infecciones extrapulmonares
4.3.1. - Otitis media
El Streptococcus pneumoniae es uno de los agentes más comunes
productores de otitis aguda media, bacteriemia y meningitis en niños. El 76 a 95 %
de los menores de 6 años presentan al menos un episodio de otitis media, siendo el
S. pneumoniae responsable de un 50 % de los casos (Block, 1995), aumentando la
frecuencia de cepas resistentes (Nelson, 1994).
4.3.2. - Sinusitis aguda
La sinusitis aguda, con afectación de uno o varios senos paranasales, suele
presentarse como complicación de una infección vírica de vías respiratorias
superiores. En ocasiones se observa en pacientes con rinitis alérgica o defectos
anatómicos nasales. Es más frecuente en adultos que en niños, puesto que los
senos maxilares, frontales y esfenoidales no se hallan totalmente desarrollados
hasta la adolescencia. La extensión intracraneal de la infección puede originar
osteomielitis, absceso cerebral, empiema subdural, flebitis supurada, meningitis o
cualquier combinación de ellas.
El neumococo es responsable de un tercio aproximadamente de los casos de
sinusitis aguda y, cuando produce una complicación, suele ser en forma de
meningitis aguda.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 36
4.3.3. - Meningitis
La meningitis neumocócica puede ser una de las complicaciones de la
neumonía bacteriémica, otitis media, mastoiditis y sinusitis, así como de fracturas
que comuniquen la nasofaringe con el espacio subaracnoideo. Una cuarta parte de
los pacientes con meningitis neumocócica tienen también neumonía. Aisa encontró
en una revisión que el 85% de los pacientes presentaban factores predisponentes o
enfermedad de base, destacando un 55,5% por defectos anatómicos congénitos o
traumáticos (Aisa, 1990).
La enfermedad afecta a todos los grupos de edad aunque la mayor mortalidad
la presentan los ancianos (Paredes, 1976; Kornelisse, 1995). En adultos S. pneumoniae es la
causa más frecuente de meningitis bacteriana (Greenlee, 1990), y dadas las campañas de
vacunación contra H. influenzae (tipo b), puede que suceda como en algún país
escandinavo, donde también es la causa de más frecuente de meningitis en niños
(pero no en neonatos).
Los síntomas clínicos y complicaciones neurológicas son similares a los de
cualquier meningitis bacteriana purulenta. Los datos clínicos y características del
LCR no difieren básicamente de los de otras meningitis purulentas. Los hemocultivos
y la tinción de Gram del LCR son positivos en alrededor del 80% de los casos.
Sin embargo, su presentación suele ser muy aguda, su progresión rápida y la
afectación neurológica es en general más grave que la observada en otras etiologías
(Ara, 1994; Chemlal, 1996). La mortalidad global de la meningitis neumocócica es de
alrededor del 10% en los niños y del 30% en los adultos y apenas ha variado en los
últimos 30 años (McGee, 1990). Su principal causa reside en la gran hipertensión
intracraneal y la afectación cerebral secundarias a la intensa reacción inflamatoria
del LCR ocasionada por el neumococo. Algunos pacientes mueren a pesar de
conseguir la esterilización del LCR y otros fluidos corporales, y en otros se ha
observado secuelas neurológicas persistentes (Tuomanem, 1987; Lebel, 1988). La proliferación
bacteriana junto con los productos tóxicos de la pared del neumococo,
especialmente cuando en el comienzo de la terapia antimicrobiana, produce una
lisis masiva que conlleva una explosión de los procesos inflamatorios en el SNC que
puede sobrepasar la capacidad adaptativa del espacio intracraneal (Tuomanen, 1992;
Greenlee, 1990; Tauber, 1991; 1992; Pfister, 1992).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 37
La mortalidad debida a cepas resistentes llega a ser del 90 %, mientras que a
cepas penicilina sensibles solo es del 30 % (Apelbaum, 1987). Se ha obtenido una
reducción de la mortalidad por meningitis neumocócica, así como en las secuelas
neurológicas de pacientes a los que se le ha administrado dexametasona como
modulador de la respuesta inflamatoria, a la misma vez que se instauraba la terapia
antimicrobiana (Grigis, 1989; Fernández-Viladrich, 1991). La mortalidad es superior en los casos
de meningitis “primaria” o secundaria a una neumonía y muy inferior en las
meningitis recurrentes por fístula pericraneal. Asimismo, la existencia de shock y/o
coma no reactivo al ingreso, así como el desarrollo de convulsiones, ensombrecen el
pronóstico (Kornelisse, 1995).
El punto mas crítico en la terapia es la administración temprana de las
cantidades adecuadas del antimicrobiano óptimo (Plotkin, 1988; Barquet, 1997). Este suele ser
penicilina G 70.000 UI/Kg cada 8 horas en neonatos y 50.000 UI/Kg cada 4 horas en
adultos. La pronta esterilización del LCR es un factor de pronóstico favorable
(McCraken, 1972).
La prevalencia en casos de meningitis de cepas moderadamente resistentes a
penicilina (CIM 0,12-1 mg/l), y que han sido asociadas a fallo del tratamiento
(Handwerger, 1986) puede ser de hasta el 60 % en algunas áreas (Aísa, 1991).
4.3.4. - Endocarditis
Antes del establecimiento de la terapia antimicrobiana, la endocarditis
neumocócica suponía un 10 % de los casos de endocarditis bacteriana. Hoy día sólo
supone un 1 % de los casos de infecciones neumocócicas bacteriémicas (Aronin, 1998).
Normalmente es una complicación de la neumonía neumocócica y sucede en
pacientes con válvulas nativas sanas o previamente dañadas. El curso clínico es en
general agudo y destructivo y en muchas ocasiones el tratamiento requiere un
recambio valvular durante la fase activa de la infección, en especial cuando se
afecta la válvula aórtica.
4.3.5. - Artritis
Es relativamente infrecuente, sucede principalmente en niños y ancianos y
suele presentarse en forma de monoartritis aguda, sin otras características
diferenciales. La artritis neumocócica es secundaria a la diseminación hematógena
desde las vías respiratorias.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 38
La aspiración del material purulento es un complemento necesario de la
antibioticoterapia. La instilación intra-articular de penicilina suele ser innecesaria
pues se consiguen niveles adecuados por administración parenteral.
4.3.6. - Peritonitis
De forma infrecuente, el neumococo causa peritonitis espontánea en
pacientes con cirrosis hepáticas y en niños con síndrome nefrótico. La patogenia de
estas infecciones no está clara, aunque es verosímil que se produzcan tras
episodios de bacteriemia originados a partir de las vías respiratorias. El diagnóstico
se realiza mediante tinción de Gram y cultivo del líquido peritoneal obtenido por
paracentesis. El tratamiento antibiótico por vía sistémica es suficiente para obtener
la curación.
5. - Diagnóstico de laboratorio
Se efectúa por el aislamiento e identificación del neumococo, o la
demostración del antígeno capsular en los productos del enfermo (Facklam 1987).
5.1. - Aislamiento del microorganismo
5.1.1. - Toma de la muestra
Las muestras adecuadas deben ser tomadas antes de la instauración de una
terapia antibiótica. El material debe ser recogido en recipientes estériles y procesado
inmediatamente o guardado a 4 ° C por el mínimo espacio de tiempo. Los esputos
deben proceder del aparato respiratorio inferior. La presencia de abundantes células
epiteliales demuestra la contaminación con saliva y, por tanto, por la flora oral
normal. Cuando no puede obtenerse una muestra de esputo, como en niños muy
pequeños, debe realizarse un cultivo faríngeo. En el frotis faríngeo, dada la labilidad
del neumococo a la solución salina y a la desecación, los hisopos deben colocarse
en tubos con medio de cultivo líquido o semisólido.
5.1.2. - Examen directo
En el frotis teñido por el método de Gram, cuando el neumococo presenta la
morfología típica (diplococo lanceolado, grampositivo, con las puntas hacia fuera y
rodeado de un halo claro), existe una fuerte presunción, que debe confirmarse
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 39
mediante otras pruebas diagnósticas. Como muchos individuos sanos portan
neumococos en la faringe, sólo sería valorable su presencia en frotis de esputos si
se observara una elevada proporción de neumococos y leucocitos
polimorfonucleares. La cápsula se demuestra muy bien por tinción negativa con tinta
china (Austrian, 1994, 1996).
Sin embargo, en los enfermos tratados se observan menos leucocitos, y los
neumococos pueden presentar formas atípicas ovoides, en cadenas cortas, etc. y
ser gramnegativos. En estos casos es imposible diferenciar por el método de Gram
los neumococos de otros estreptococos (Musher, 1995)
5.1.3. - Cultivo
Se debe realizar siembras por agotamiento en placas recientes de agar
sangre de carnero con una atmósfera del 10 % de CO2. La adición de 5 µg/mL de
gentamicina al agar suprime el crecimiento de otros estreptococos pudiendo
aumentar la sensibilidad del cultivo. A las 12-18 horas se observan colonias muy
pequeñas (1 mm), planoconvexas y transparentes, rodeadas de una pequeña zona
de alfahemólisis, que a las 24 horas se aplanan y toman forma de disco. Con el
tiempo los fenómenos de autólisis son mas acentuados, aparece una depresión
central o colonias en anillo, y, en estos casos por lo general los neumococos se
hacen gramnegativos (Austrian, 1996). Los neumococos denominados tipo III forman
colonias mucosas.
Para la detección de neumococos en esputos, cuando son escasos y existe
abundante flora comensal, puede utilizarse medios selectivos como el de Nichol y
Freeman que contiene cristal violeta, ácido nalidíxico y gentamicina, siendo capaz de
inhibir el crecimiento de la mayoría de las cepas de enterobacterias, difteroides,
Staphylococcus aureus y Branhamella catarrhalis aunque permite el crecimiento de
otros estreptococos no hemolíticos y viridans abundantes en la boca. Igualmente
existe poca especificidad en los exámenes disponibles para la detección de
neumococos en esputos, ya que muestran hasta un 68 % de reacciones cruzadas
con estreptococos viridans. Algunos autores han propuesto el cultivo cuantitativo
para determinar la significación microbiológica. Si el número de neumococos es igual
o superior a 1x106 UFC/mL, entonces es muy probable que se trate de una infección
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 40
del tracto respiratorio inferior; pero si el recuento es menor de 1x106 UFC/mL puede
que se trate de una contaminación.
En los casos de endocarditis, sepsis y de neumonía cuando la fiebre es alta,
se debe practicar un hemocultivo. La bacteriemia es indicadora de una infección
grave y posee significado pronóstico. Las muestras obtenidas por punción venosa y
LCR, así como los líquidos serosos obtenidos de la pleura, pericardio, peritoneo y
cavidades sinoviales, antes de la administración de antibióticos, deben sembrarse
inmediatamente en caldo de carne y un medio que contenga tioglicolato. El último se
halla indicado porque los pequeños inóculos de neumococo tienden a crecer mejor
en medios con bajo potencial de óxido - reducción (Austrian, 1996). En los enfermos
tratados con penicilina, no se mejora el aislamiento añadiendo penicilinasa al medio
del hemocultivo.
En la meningitis neumocócica, el LCR contiene frecuentemente gran número
de neumococos, pudiendo hacerse un diagnóstico presuntivo mediante la tinción de
Gram. Como los neumococos sufren autólisis con facilidad, debe examinarse
cuidadosamente la preparación antes de descartarla como negativa. Por la misma
razón anterior es especialmente recomendable en los LCR la investigación de
antígenos neumocócicos mediante técnicas serológicas.
5.1.4. - Patogenicidad en animales
El ratón resulta especialmente sensible a los neumococos virulentos, que
podrían investigarse directamente de la muestra emulsionándola con 1 mL de caldo
e inyectándola intraperitonealmente (Musher, 1995). Los neumococos se desarrollan
rápidamente y pueden aislarse a las pocas horas del líquido peritoneal y más tarde
de la sangre, muriendo el ratón dentro de cuatro días (Austrian, 1996).
El resto de la flora normal suele ser destruida por los fagocitos del ratón, que
así puede servir como medio selectivo de cultivo. Sin embargo, ciertos serotipos,
especialmente el 14, pueden no ser virulentos para el ratón (Musher, 1995).
En otros animales el neumococo puede ser agente ocasional de mastitis y
septicemia en ganado vacuno y ovino, y de infecciones del tracto respiratorio en
monos (Rotta, 1986).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 41
5.2. - Identificación
En los cultivos se observan colonias αhemolíticas,
compuestas por cocos grampositivos, catalasa negativa y que
en general no pueden diferenciarse de los estreptococos
viridans.
Las pruebas de identificación presuntiva del neumococo
se basan en su solubilidad en la bilis o soluciones de
desoxicolato sódico y en la sensibilidad a la optoquina. Esta
última es la más utilizada en el diagnóstico de rutina; se realiza
colocando un disco que contiene 5 µg de etilhidrocupreína
(optoquina) en una placa de agar-sangre recién sembrada, y a
las 24 horas de incubación se observa un área de inhibición de
15 mm o mayor alrededor del disco. Este método obtiene una
buena correlación con los resultados
obtenidos por cultivo de esputos, en el 95
% de adultos enfermos de neumonía neumocócica (Musher, 1995;
Gardam, 1998).
La prueba de solubilidad en bilis puede efectuarse mejor
en desoxicolato al 2 % p/v, y debe realizarse mejor con
suspensiones salinas de las células bacterianas porque las
proteínas extrañas del medio líquido inhiben la reacción,
posiblemente por fijar el desoxicolato (Musher, 1995). Igualmente no debe realizarse la
prueba en superficies de agar ya que se producen resultados falsos positivos.
Pruebas confirmatorias de identificación se basan en la reacción de hinchazón
de la cápsula (quellung) en presencia de un suero antineumocócico polivalente. La
unión del polisacárido capsular con el anticuerpo correspondiente forma un
precipitado intracapsular, que aumente su refringencia. La identificación del tipo
antigénico del neumococo causal debe realizarse mediante el empleo de sueros
monovalentes. Algunos serotipos, especialmente el 3 y 37 pueden dar falsos
negativos debido a un exceso de antígeno - fenómeno de zona (Musher, 1995).
Fig. 6: Prueba de laoptoquina
Fig. 7: Prueba en tubode lisis por bilis
Fig 8: Prueba deQuellung
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 42
5.2.1. - Identificación del antígeno capsular
Para el establecimiento de un diagnóstico precoz, y especialmente cuando los
cultivos son negativos o nos encontramos ante un enfermo tratado con antibióticos;
se puede llegar algunas veces al diagnóstico por la demostración del antígeno
capsular en los líquidos tisulares (LCR, orina, liquido pleural y esputos) mediante
pruebas de precipitación, aglutinación en látex (LA), coaglutinación (COA), y menos
frecuentemente por contrainmunoelectroforesis (CIE) frente a sueros específicos
polivalentes. Estas técnicas para la detección de antígenos resultan rápidas,
sensibles y específicas especialmente en LCR donde resultan positivas en el 90 %
de los casos de meningitis neumocócica. La proporción de pacientes con antígeno
en esputo, sangre u orina varía considerablemente según los diferentes estudios
(Ajello 1987), así la antigenemia se presenta del 45 al 80 %, y la antigenuria lo hace en
un 50 al 65 % de los casos con neumonía neumocócica. En estudios comparativos
sobre LCR la COA dio mayor número de resultados positivos que los obtenidos por
tinción de Gram o cultivo (Musher, 1995).
5.2.1.1. - Coaglutinación.
El reactivo está formado por células muertas de Staphylococcus aureus
capaces mediante su proteína A superficial, de unirse a la fracción constante Fc de
inmunoglobulinas, en este caso de anticuerpos específicos contra neumococo. Así
cuando neumococos vivos o muertos, o antígeno neumocócico libre (SSS) se unen a
estas células se produce una aglutinación visible a simple vista.
5.2.1.2. - Test de aglutinación en látex.
También se dispone de ellos comercialmente, y constan de partículas de látex
o de otro tipo, recubiertas de anticuerpos antineumocócicos para la detección de
antígenos en LCR, suero y orina.
5.2.1.3. - Contrainmunoelectroforesis.
Este método es especialmente sensible, pudiendo dar resultados positivos
cuando la COA es negativa La técnica es relativamente rápida y permite la detección
del antígeno polisacarídico capsular en LCR, sangre, esputos, orina, liquido pleural y
peritoneal (Musher, 1995).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 43
5.2.2. - Identificación de otros componentes bacterianos
Se han utilizado técnicas de amplificación de ADN (PCR) para el diagnóstico
de S. pneumoniae en otitis (Virolainen, 1994; Friedland, 1994c), esputo (Gillespie, 1994), suero (Dagan,
1998) y meningitis (Hall, 1995; Cherian, 1998).
Otras técnicas han probado la determinación de neumolisina para el
diagnóstico de neumonía (Kalin, 1987), o de los ácidos teicoicos y lipoteicoicos en el
diagnóstico de meningitis (Stuertz, 1998, 1998b)
5.3. - Anticuerpos circulantes.
Los procedimientos serológicos actuales no proporcionan la necesaria rapidez
diagnóstica. Se ha utilizado extensamente el radioinmunoensayo (RIA) para evaluar
la respuesta a la vacuna antineumocócica, así como la persistencia de los niveles de
anticuerpos
Anticuerpos circulantes a la hemolisina neumocócica han sido medidos con
enzimoinmunoanálisis - ELISA - (Kalin 1987)
6. - Inmunidad.
6.1. - Inmunidad natural.
Las defensas celulares juegan un papel importante en la protección contra la
neumonía neumocócica. Los leucocitos alveolares macrófagos y polimorfonucleares
son las principales células fagocíticas actuantes en la neumonía (Johnston 1981). La
activación del complemento también juega un papel importante en el curso de las
infecciones neumocócicas, su activación por la vía alternativa promueve la
fagocitosis e induce la quimiotaxis de los neutrófilos.
6.2. - Inmunidad adquirida.
Los anticuerpos anticapsulares aparecen al quinto o sexto día de la
enfermedad (Austrian, 1996). Son tipo-específicos, protectores y duraderos, aunque el
efecto de un tratamiento precoz sobre la producción de anticuerpos es desconocido.
Su efecto protector se basa principalmente en promover la fagocitosis por los
neutrófilos. Las infecciones sistémicas recurrentes con el mismo serotipo son raras
excepto en pacientes con hipogammaglobulinemia o con focos persistentes. A pesar
de la presencia de anticuerpos circulantes protectores, pueden recobrarse
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 44
neumococos del aparato respiratorio superior durante días o semanas. Los
anticuerpos pueden ser detectados por RIA y enzimoinmunoanálisis (Musher, 1995).
6.2.1. - Vacunas
La decisión de desarrollar una vacuna basada en el polisacárido capsular
partió de los numerosos trabajos de Avery y colaboradores, que indicaban como el
neumococo presentaba su superficie externa cubierta de dicho polímero. Los
anticuerpos generados eran altamente protectores contra la infección letal, pero
existía la complicación de encontrar más de ochenta serotipos capsulares. Cuando
se pudo asociar determinados serotipos a determinadas infecciones, se elaboraron
vacunas primeramente de 14 y actualmente se encuentra en el mercado, de los 23
serotipos que causan neumonía con mayor frecuencia. Esta vacuna es efectiva en
individuos adultos inmunocompetentes, pero sólo lo es un 60% en ancianos; e inútil
en niños menores de 2 años en los que la respuesta inmunológica contra los
polisacáridos es inmadura (Briles, 1998).
A pesar de que, desde el principio, se apreció el poder protector de la vacuna
con microorganismos muertos enteros, su evaluación sobre poblaciones de mayor
riesgo con cierto grado de inmunodeficiencia como ancianos, no llegó a demostrarlo;
tal vez debido al compromiso de la inmunidad que no permite la respuesta a la
vacuna. A pesar del la baja respuesta promedio, está indicada su aplicación en
pacientes inmunocompetentes con EPOC, enfermedad cardiovascular avanzada,
diabetes, alcoholismo, cirrosis, insuficiencia renal y toda persona mayor de 65 años.
Y, además, en pacientes inmunocomprometidos pero con alto riesgo de infección
neumocócica por disfunción esplénica, linfoma, VIH, trasplantados, etc.
Posiblemente si se mantiene el incremento de la prevalencia de neumococos
resistentes a penicilina, será razonable aumentar la población susceptible de
vacunación (Musher, 1995; Briles, 1998).
Actualmente se están investigando vacunas basadas en conjugados de
proteína con polisacárido para favorecer la respuesta, aunque persiste el problema
de la variedad de serotipos (Watson, 1996; Briles, 1998). Otras investigaciones trabajan sobre
proteínas como la neumolisina, autolisinas, neuroaminidasa; y en la denominada
adhesina A (pspA) proteína de la superficie del neumococo cuyos anticuerpos son
protectores contra diversos serotipos (Sampson, 1994; Briles, 1998).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 45
6.3. - Infecciones en pacientes inmunocomprometidos.
6.3.1. - Esplenotomía.
Las infecciones neumocócicas en pacientes esplenotomizados suelen cursar
de forma rápida y fatal. Suele aparecer coagulación intravascular diseminada y los
microorganismos pueden ser detectados en sangre periférica.
Especialmente las infecciones neumocócicas suelen ser comunes en niños
con anemia de células falciformes (drepanocitosis), donde el neumococo suele ser el
principal agente de bacteriemias y meningitis (Musher, 1995).
6.3.2. - Agammaglobulinemia.
Los niños y jóvenes con inmunodeficiencia hereditaria suelen ser
especialmente susceptibles a las infecciones piógenas incluyendo las neumocócicas
(Musher, 1995).
6.3.3. - Enfermedades hematológicas.
Las infecciones neumocócicas son frecuentes en pacientes con mieloma
múltiple y agudo así como en aquellos con leucemia linfocítica crónica.
6.3.4. - Infecciones neumocócicas en pacientes infectados por el virus
de la inmunodeficiencia humana
La colonización por S. pneumoniae es similar en el VIH positivo y en el grupo
de pacientes VIH negativos. La mayor incidencia de esta infección en el primero de
los grupos tiene su base en la deficiencia de respuesta humoral frente a antígenos
neumocócicos en la población VIH+ y quizá en la incapacidad de producir IgA
mucosa en cantidad y calidad adecuada (Bouza, 1998).
Las infecciones neumocócicas pueden ocurrir en cualquier momento de la
historia natural de la infección VIH, pero la mayoría de ellas se presentan cuando los
pacientes tienen cifras de células CD4+ menores de 200/mL. La infección
neumocócica puede ser la primera manifestación clínica de infección VIH, en un
porcentaje que supera el 40% de los episodios. La mayoría de las neumonías
neumocócicas en el paciente VIH positivo suelen adquirirse en la comunidad.
Clínicamente el cuadro es bastante semejante al de la neumonía en el resto de los
grupos de población.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 46
En nuestro medio, el tratamiento aplicado a la neumonía neumocócica en el
paciente VIH positivo no difiere del aplicado a otros grupos de población. Debe
recordarse que la incidencia de aislados con resistencia intermedia o alta a la
penicilina supera el 40% en muchos hospitales, y que la resistencia a macrólidos
(Shortrige, 1996), cloramfenicol y tetraciclina son mayores del 20% en muchos casos. El
cotrimoxazol, fármaco muy utilizado ante neumonías con prueba o sospecha de
estar causados por P. carinii tiene más de un 60% de resistencias frente a S.
pneumoniae, y, por tanto, no debe utilizarse en el tratamiento empírico de la
neumonía bacteriana.
La tendencia a la recurrencia en pacientes VIH positivos (Jordens, 1995) con
neumonía neumocócica es elevada, por lo que se han desarrollado diversas pautas
profilácticas (Peters, 1994)
7. - Tratamiento
7.1. - Introducción
7.1.1. - Situación actual del tratamiento de las infecciones neumocócicas
La penicilina G, por su excelente actividad contra el S. pneumoniae, ha sido
durante muchos años el tratamiento de elección de las infecciones neumocócicas
(Tarpay, 1978; Stratton, 1995). Sin embargo durante las dos pasadas décadas, se han descrito
cepas de neumococo con menor sensibilidad a penicilina por casi todo el mundo
(Appelbaum, 1987, 1992; Jorgensen, 1990, 1994, 1994b; Klugman, 1988, 1990, 1992; 1993; Schutze, 1994; Dowson, 1993;
Breiman, 1994; Doit, 1996), incluida España (Liñares, 1984, 1992; 1992b; Latorre, 1985; 1988; Fenoll, 1989, 1998; de
Cueto, 1990; Baquero, 1991; Gómez, 1994; Pallarés, 1995; Fridmodt-Moller, 1997). Pero la resistencia a
penicilina es sólo un aspecto del problema, ya que la tasa de cepas resistentes a
múltiples antibióticos es mayor en las cepas resistentes a penicilina, que, además,
presentan una menor sensibilidad frente a otros ß-lactámicos (Jacobs, 1978; Zighelboim, 1980;
Liu, 1985; Applebaum, 1987; Liñares, 1992; McDouglas, 1992; Reichler, 1992; Cantón, 1993; Lister, 1994, 1995; Barnes, 1995;
Klugman, 1996; Mason, 1996).
Infecciones extrameníngeas. Los criterios de sensibilidad de la NCCLS para
penicilina y cefalosporinas de tercera son restrictivos al asumir el punto de vista de
las infecciones meníngeas. Sin embargo, la penicilina G persiste como el antibiótico
de primera elección en las infecciones extrameníngeas por neumococo (Pallarés, 1987;
Musher, 1995; Mason, 1998). La mayoría de los pacientes hospitalizados reciben medicación
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 47
parenteral, y en esos casos es suficiente la administración de 500.000 - 1.000.000 UI
de penicilina G cada 4 horas. La amoxicilina por su completa absorción en
administración oral, y su mayor vida media resulta una opción adecuada para el
tratamiento de la neumonía neumocócica en dosis de 500 mg cada 8 horas (Andes,
1998; Balcabao, 1996; Pérez-Trallero, 1998). El índice de resistencia a eritromicina, en las cepas
resistentes a penicilina, hace desaconsejable su elección (Moreno, 1995; Ednie, 1996; Visalli,
1997).
Infecciones meníngeas. Aquellos pacientes con aislamientos resistentes a la
penicilina y compuestos relacionados, pueden administrárseles una cefalosporina de
tercera generación como cefotaxima o ceftriaxona (Scholz, 1998), o cloramfenicol (Pécoul,
1991), aunque se han documentado fracasos terapéuticos con cefalosporinas de
tercera (Bradley, 1991; 1994; Sloas, 1992; Chandy, 1993; Raymond, 1995; Flórez, 1996), y aislado cepas
resistentes al cloramfenicol (Friedland, 1992). En cualquier aislamiento de S. pneumoniae
procedente de líquidos estériles debe estudiarse, la sensibilidad a cefalosporinas de
tercera (Daum, 1994).
Aunque algunos autores americanos, en pacientes con meningitis,
endocarditis y artritis siguen indicando dosis de 12 a 24 millones de UI de penicilina
(Musher, 1995), existe, ante el incremento de cepas altamente resistentes a penicilina, los
niveles alcanzables en el SNC y la publicación de fallos terapéuticos, el general
consenso (Tweardy, 1983; Klugman, 1990; Viladrich, 1991; Paris, 1995; Jacobs, 1996) en desaconsejar el uso
de penicilina, y en recomendar (Tan, 1992; Lister, 1995; Mensa, 1998) para el tratamiento de
meningitis por S. pneumoniae, agentes como las cefalosporinas de tercera
generación (p.ej. cefotaxima o ceftriaxona) que atraviesan bien la barrera
hematoencefálica (Pallares, 1995).
Con neumococos de CIM a cefotaxima ≤ 1 µg/mL, el tratamiento es con altas
dosis de la misma (300 mg/kg/día) (Tan, 1994); sin embargo la infección con cepas de
CIM a cefotaxima ≥ 2 µg/mL debe tratarse con altas dosis de vancomicina (1 g /8-12
hr en perfusión lenta) asociada a rifampicina o a una cefalosporina de tercera
generación, o imipenem (Doit, 1997; Paris, 1995; Bhatacharya; Friedland 1993, 1995).
Vancomicina se asocia con una capacidad variable de atravesar la barrera
hematoencefálica y no es confiable en monoterapia de primera elección para el
tratamiento de la meningitis en adultos (Viladrich, 1991). Imipenem y esparfloxacino, a
pesar de la excelente actividad contra S. pneumoniae (Asensi, 1989; Spangler, 1994; 1997; Visalli,
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 48
1996; 1996b; Pikis, 1997; Baquero, 1996; Barakett, 1996b; Barret, 1996; Goa, 1997; Liñares, 1998) por la producción
de efectos adversos, tampoco son aconsejables como tratamiento de elección en
meningitis. Sin embargo vancomicina, imipenem y las fluorquinolonas mantienen su
utilidad en otros tipos de infecciones neumocócicas (Aísa, 1990; Barr, 1990; Craig, 1994; Liu, 1995;
Siami, 1995; Lacka, 1996; Balfour, 1996; Aubier, 1996, 1998; Allegra, 1996; Crokaert, 1996; Basoli, 1997; Kaplan, 1998),
Actualmente se investiga en el tratamiento de meningitis neumocócica, el uso
de otras cefalosporinas como cefepime o cefpiroma (Gialdroni, 1993; Giamarellou, 1993; Hoepelman,
1993; Kieft, 1993; Leophonte, 1993; Fitoussi, 1995; Fremaux, 1998; Jones, 1998), penemas como meropenem
(Dagan, 1994; Barakett, 1996; Bradley, 1997), clindamicina (Paris, 1996) y fluorquinolonas como el
trovafloxacino (Thomson, 1997; Kaplan, 1998), o el moxifloxacin (Ostergaard, 1998). La posible
ventaja de algunos de estos antimicrobianos, sobre ceftriaxona, imipenem y
esparfloxacino, de una actividad superior contra S. pneumoniae, no refleja
necesariamente una mayor eficacia terapéutica ya que en todos los casos es factible
superar los niveles bactericidas.
7.1.2. - Elección del agente antimicrobiano
Una vez presumido o conocido el S. pneumoniae como responsable de la
infección, y contando con la información más exacta posible a cerca de su
susceptibilidad antimicrobiana, o de su prevalencia, hay que considerar los
denominados factores del huésped, siendo el más importante el lugar de la
infección, que determina no sólo la elección del antimicrobiano, sino también su
dosis y la vía de administración (Jernigans, 1996) en función de sus características
farmacodinámicas y farmacocinéticas.
Si la penetración es aceptable, en aquellos fármacos como ß-lactámicos,
vancomicina o fosfomicina, cuya acción bactericida depende más del tiempo de
exposición que de la concentración del fármaco, y que suelen producir un mínimo o
moderado efecto post-antibiótico, debe seleccionarse una dosificación y vía de
administración que mantenga niveles constantes por encima de la CIM. En los
antimicrobianos cuya acción bactericida depende altamente de la concentración y
suelen producir efectos post-antibióticos prolongados como las fluorquinolonas se
considera que la concentración local debe ser mayor de 8 veces la CIM para un
efecto antimicrobiano óptimo y un mínimo desarrollo de resistencias, aunque se ha
visto que concentraciones subinhibitorias pueden ejercer efectos antimicrobianos,
que ayudan a las defensas naturales, alterando propiedades como la adherencia
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 49
celular y los requerimientos opsónicos, aumentando la fagocitosis e, incluso, pueden
ayudar a la destrucción intracelular por lo leucocitos polimorfonucleares (Moellering, 1995).
En procesos graves como meningitis, donde es crítico conseguir un efecto
bactericida rápido, los estudios en animales indican que se necesita obtener una
concentración ≥10 CIM (Scheld, 1985).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 50
7.1.3. - Tabla 2: Niveles en suero y LCR
Ref
eren
cia
Ant
ibió
tico
Vía
de
adm
.
Dos
is
T½
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Pic
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CR
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con
men
ingi
tis)
Amsdem, 1995 PEN IV 2.000.000 U.I. 0,4-0,5 20 0-10 *
Mensa, 1998 PEN IV 1.000.000 U.I. 0,5 20 5-10**
Gerding, 1996 PEN IV 1.200.000 U.I. 0,5 74 (12-91) 1 0,17 (0,09-0,37) 1 0,2
Dámaso, 1990 PEN IV 1.000.000 U.I. 0,5-1 0,3-200,5-33 UI
0,5
Gerding, 1996 VAN IV 500 mg/kg 6 6,3 (4,3-10) 1-2,5 0 sin infecc 0 sin infecc
Mensa, 1998 VAN IV 1g 6 25-40 5-20*†
Amsdem, 1995 VAN IV 1 g 4-6 25 7,21*
Fekety, 1995 VAN IV 1 g 6-8 7-35 (2) 1 <1 - 7 *
Dámaso, 1990 VAN IV 0.5 g1g2 g
4-6 102550
222
10-20*
Mensa, 1998 CTR IV 1 g/dia 8 150 5-10*‡+§
Gerding, 1996 CTR IV 100 mg/kg/dia 4 128,2 2 11 2 8,6
Amsdem, 1995 CTR IV 1 g2 g3 g
5,4-10,9 123-150223-276216-281
16-32
Karchmer, 1995 CTR IV 2 g 8 250 1,2 - 39
Balfour, 1996 IMP IV 1 g 30-4260-72
0,6-0,91,1-2,3
1-81-6
20-30
Gerding, 1996 IMP IV 1 g 20 (12-41) 1-2 1,7 (0,65-3,0) 2-6 8,5
Mensa, 1998 IMP IVIVIM
1,0 g0,5 g0,5 g
704010
10***
Dámaso, 1990 IMP IV 1 g1 g
1 g/6 hr
0,6-0,91,1-2,3*0,5-11*
1-81-61-2
Dámaso, 1990 IMP IV 0,25 g0,50 g1,00 g
12-2021-5841-83
Chambers, 1995 IMP IV 0,250,501,00
111
133252
Amsdem, 1995 IMP IV 0,250,501,00
0,8-1 14-221-5841-83
1-10*
Goa, 1997 ESP PO 100 mg200 mg400 mg
15,8- 16,815,8-20,816-20,2
0,39-0,440,62-0,710,56-1,60
2,3-2,63,5-4
2,05-5,6
Entenza, 1994 ESP IV 400 mg 18-20 4-61,5-2,5
124
Davey, 1994 ESP PO 400 mg 2,541,582,24
3-6 0,420,570,84
3-6
Trautmann, 1986 ESP PO 400 mg 24 1,5 2
Zix, 1997 ESP PO 400 mg 20 1,3 4
Mensa, 1998 FOS IV 2 g 3-5 90 25*
Dámaso, 1990 FOS IV 0,25 g0,50 g1,00 g2,00 g
1,2-2 12.6-1831,5
44,4-5878,4-93,2
15 min
PEN: Penicilina G sódica; VAN: Vancomicina; CTR: Ceftriaxona sódica; IMP: Imipenem;ESP: Esparfloxacino; FOS: Fosfomicina
* Si la concentración en LCR es superior a 5 µg/mL, existe el riesgo de encefalopatía y convulsiones† La concentración en LCR es a menudo subterapéutica. Puede administrarse intratecalmente, debiéndose controlar los niveles entre 10 - 20 �g/ml‡ En términos absolutos corresponde a una concentración de 5 - 15 µg/mL eficaz frente a la mayoría de los microorganismos sensibles§ La elevada fijación proteica de la ceftriaxona (90%) limita su difusión al LCR. Sin embargo hay datos sobre la existencia en el plexo coroideo, de un mecanismo de transporte activo para este antimicrobiano** Disminuye el umbral de aparición de convulsiones
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 51
7.2. - Penicilina G
La penicilina fue descubierta por Fleming en 1928 en el Penicillinum notatum.
A partir del trabajo de Florey, Chain y colaboradores en 1941 se pudo obtener
comercialmente. La estructura de la penicilina G, como la mayor parte de penicilinas
del mercado, posee el anillo ß-lactámico, un anillo tiazolidinico, y una cadena lateral.
Generalmente existen como sales de sodio o potasio. El anillo ß-lactámico es
esencial para la actividad antimicrobiana, mientras que la cadena lateral determina,
en gran parte, el espectro antibacteriano y las propiedades farmacológicas.
7.2.1. - Farmacología
La penicilina G no es estable a los ácidos, lo que limita su administración a la
vía parenteral. Se une a las proteínas plasmáticas un 55%, principalmente a la
albúmina. La unión a proteínas séricas puede afectar tanto la distribución tisular (la
fracción unida no atraviesa membranas) como la actividad de los agentes
antimicrobianos (la fracción unida no se une a los receptores). Aunque se han
llevado a cabo cuidadosas investigaciones sobre la unión a proteínas (Merrikin, 1983; Wise,
1986), todavía se debe determinar la significación clínica de este fenómeno. Se ha
demostrado que sólo la forma libre de un antimicrobiano es activa in vitro (y
presumiblemente también in vivo); no obstante como la unión a proteínas es
rápidamente reversible incluso la actividad de agentes altamente unidos a proteínas,
puede no estar limitada por ello (Craig, 1977; Cars, 1991).
Se excreta con rapidez por la orina, por lo que tiene una vida media corta de
menos de 30 minutos. Las células de los túbulos renales, en virtud de mecanismos
activos, pueden eliminar hasta 4 g/hr de penicilina G. Esta excrección puede ser
bloqueada por el probenecid que aumenta la vida media de todas las penicilinas.
Además el probenecid también compite por los lugares de unión a la albúmina
aumentando la fracción libre activa.
Fig. 9: Estructura de la Penicilina G
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 52
Distribuye bien por la mayor parte de las áreas corporales, como el pulmón, el
hígado, el riñón, el músculo, el hueso y la placenta. Los niveles de penicilina en los
abscesos, el oído medio y los líquidos peritoneal, pleural, o sinovial, son en
presencia de inflamación, suficientes para inhibir a la mayoría de los
microorganismos susceptibles. La mayoría de las penicilinas son relativamente
insolubles en lípidos y atraviesan mal las membranas, por lo que su distribución en
ojos, SNC o próstata es prácticamente nula en ausencia de inflamación. La
inflamación altera las barreras normales, permitiendo el ingreso de las penicilinas,
pero lo más importante es que interfiere la bomba de aniones que elimina penicilina
del líquido cefalorraquídeo (Musher, 1995).
7.2.2. - Acción de los ß-lactámicos.
No se sabe con precisión de qué manera las penicilinas destruyen las
bacterias. El estudio de su acción ha contribuido en muchos aspectos al
conocimiento de la fisiología bacteriana, pero avances recientes sugieren que el
concepto de que la penicilina destruye bloqueando simplemente el último paso de la
síntesis de la pared celular es simplista. La síntesis del peptidoglucano es un
proceso complejo, en el que intervienen no menos de 30 enzimas, que empieza en
el citoplasma, continúa a través de la membrana citoplasmática y da lugar a nuevas
unidades en la pared.
7.2.2.1. - Pared celular
La pared celular de las bacterias
grampositivas es una gran capa de 50 a
100 moléculas cuyo componente principal
es el peptidoglucano. Este consta de largas
cadenas de polisacáridos en las que la N-
acetil glucosamina (NAG) y el ácido N-
acetil murámico (NAM) se alternan linealmente. Las cadenas individuales son fijadas
por péptidos cortos unidos en el enlace amida al penúltimo grupo D-alanil del ácido
N-acetil murámico.
La síntesis del peptidoglucano ha sido estudiada en tres fases. La primera
corresponde a la síntesis de precursores UDP-NAM-pentapéptido y UDP-NAG.
Estos dos compuestos son transportados a través de la membrana citoplasmática
Cápsula
Péptidoglicano
Membrana
Fig. 10: Esquema de la pared celular del neumococo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 53
por un transportador liposoluble; y en esta
etapa se produce la transglicosilación del
monómero del disacárido en polímero del
peptidoglucano. La reacción final, que inhibe
la penicilina, es la fijación del nuevo
peptidoglucano al existente en la pared. Un
grupo amino libre del tercer aminoácido del
NAM-pentapéptido de una cadena, desplaza la D-alanina terminal de un
pentapéptido de una segunda cadena en una reacción de transpeptidación. Parece
haber transpeptidasas definidas que permiten la fijación del nuevo peptidoglucano al
antiguo, que fijan estructuras especiales y conforman el tabique de la pared celular.
Además la penicilina es capaz de inhibir otras enzimas carboxipeptidasas, de
importancia no dilucidada. En cualquier caso el efecto letal parece ser dependiente
del ciclo celular y la inhibición induce la alteración del evento crítico de la división
celular.
7.2.2.2. - Proteínas fijadoras de penicilina (PFPs o PBPs)
Los neumococos con resistencia aumentada a los antibióticos ß-lactámicos no
son productores de beta-lactamasas (Robins-Browne, 1979) sino que la resistencia
intrínseca observada se ha demostrado asociada a alteraciones secuenciales y
acumuladas de los enzimas sensibles a penicilina denominados proteínas fijadoras
de penicilina [PFPs] (Jacobs, 1978; Hakenbeck, 1980; 1991; 1991b; Williamson, 1980; Jabes, 1989; Smith, 1995;
Greebe, 1995; 1997; Severin, 1996; 1997; Guilmi, 1998), que modifican su número (Tumanem, 1986), y su
afinidad y especificidad por los ß-lactámicos (Handwerger, 1986b). Se entiende también que
una prolongada presión antibiótica, haya seleccionado cepas portadoras de
modificaciones múltiples que las hacen capaces de sobrevivir ante altas
concentraciones de penicilina (Bryan, 1991). Las alteraciones en la secuencia de DNA,
unidas a los cambios observados en las PFPs, sugieren que la resistencia a la
penicilina, y otros antimicrobianos en el neumococo es posiblemente el resultado de
una transformación natural por recombinación genética de los genes codificadores
de las PFPs, con genes de otras especies resistentes como el Streptococcus mitis
(Dowson, 1993; Tomasz, 1995; Adrian, 1997; Reichman, 1997; Asahi, 1998; Hakenbeck, 1998). El proceso de
recombinación puede suceder cuando la diferencia entre el segmento entrante y el
Fig. 11: Estructura del péptidoglicano en elmeumococo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 54
reemplazado es menor del 25 - 30%. Estos genes segmentados o en mosaico,
determinan la resistencia a ß-lactámicos. Es por ello que las cepas de neumococo
resistentes a los ß-lactámicos ofrecen PFPs alteradas (Hakenbeck, 1980; Markiewicz y Tomasz,
1989; Jabes, 1989).
Las bacterias suelen producir varias clases de PFPs semejantes
estructuralmente. Las PFPs de alto peso molecular (>50 kiloDalton [kDa]) y las de
bajo peso molecular (<50 kDa) catalizan las reacciones de transpeptidación y
carboxipeptidación en la ensambladura de la pared celular. Los antibióticos ß-
lactámicos se unen a ambas en forma covalente por acilación del sitio activo del
residuo serina. Las funciones críticas para la supervivencia celular suelen residir en
las PFPs de alto peso molecular (Musher, 1995).
En los estudios de un determinado microorganismo, las PFPs se enumeran
de acuerdo con el peso molecular, designándose PFP1 a la de mayor peso. Si
posteriormente resulta que alguna de ellas, en realidad, son varias de peso
molecular parecido, se las distingue con una letra o signo prima (p.ej PFP1b).
Las PFPs más importantes en los Gram positivos son PFP1, PFP2 y PFP4.
Las PFPs suponen un 1% de las proteínas de membrana, variando tanto en número
como en funciones durante la formación de la pared celular. También difieren en su
afinidad con los antibióticos ß-lactámicos, lo que contribuye a explicar las diferencias
de actividad antibacteriana de estos antimicrobianos (Hakenbeck, 1988). Por otro lado la
especificidad de la interacción de los ß-lactámicos con las PFPs neumocócicas
depende parcialmente del resto R1 unido al anillo betalactámico, de tal manera que
ß-lactámicos con diferentes estructuras, pero con la misma cadena R1, se unen a
las mismas PFPs. La especificidad de un ß-lactámico por las distintas PFPs
trasciende del puro interés académico, pues aquellos que se unen preferentemente
a la PFP3 como la mayoría de las penicilinas y las cefalosporinas aminotiazólicas,
permiten un considerable desarrollo de la biomasa antes de que los procesos
bacteriolíticos sean predominantes. Cuando los filamentos lisan, al menos in vitro se
produce una liberación masiva de productos bacterianos, con el consiguiente riesgo
de shock séptico in vivo. La acción de los antimicrobianos que se unen
proporcionalmente más a las PFPs 1a, 1b y 2 como imipenem, minoriza dicho riesgo
ya que sólo permiten un pequeño incremento de la biomasa antes de la lisis celular.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 55
Seis PFPs se encuentran en la mayoría de las cepas susceptibles (Ellerbrok y
Hakenbeck, 1988).
Tabla 3: PFPs de Streptococcus pneumoniae
PFP Masa molecular (kDa)* Esencial Comentarios
1a 92 - 100 Sí
1b 89 - 95 Sí
2a 81 Sí
2b 77 - 79 Sí
2x 85 Sí
3 43 - 52 No
PFP1c es una
forma de la PFP1a
con baja afinidad
Los pesos moleculares varían en distintos aislamientos, debido a que las PFPs están
codificadas por genes segmentados.
Tomado de Livermore y Williams, 1996, modificado.
Ninguna PFP es el blanco único de un ß-lactámico, antibióticos que provocan
su efecto letal por inhibición simultánea de diversas PFP. Algunos estudios sobre
aislados clínicos resistentes a penicilina, sugieren que son las PFP-1 y PFP-2 las
dianas preferentes a través de las cuales los ß-lactámicos ejercen su acción
bactericida.
Una cepa sudafricana con una CIM 1000 veces mayor que la correspondiente
a una cepa sensible, mostró numerosos cambios en sus PFPs siendo los principales
la pérdida de las PFPs- 1a, -1b y -2b (Handwerger y Tomasz, 1986) y la adquisición de una
nueva PFP-1c (Zighelboim y Tomasz, 1980), así como la reducción de la afinidad por la
bencilpenicilina de la PFP-2a.
Análisis de los perfiles de PFPs muestran una serie de cambios asociados
con un incremento de la resistencia como es el descenso de la afinidad de la PFP-
2a, pérdida de la PFP-2b, descenso de la afinidad seguido de pérdida de la PFP-1a
y PFP-1b, asociado con la aparición de la PFP-1c en las cepas con alta resistencia
(Tomasz, 1988). En todos estos microorganismos no se observaron cambios en la PFP-3.
Aquellos antibióticos que no se unen a la PFP-2b no producen lisis celular, lo
que podría indicar que la unión a dicha enzima es esencial para la actividad lítica de
los ß-lactámicos sobre el neumococo (Hakenbeck, 1986; 1988). Además esta proteína puede
realizar un papel crítico en la síntesis del peptidoglicano, ya que en presencia de
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 56
penicilina, la cantidad de PFP-2b no saturado por penicilina está correlacionada con
la cantidad de peptidoglicano sintetizado.
Estos resultados sugieren que la mayoría de las PFPs en el neumococo
desarrollan funciones esenciales y son diana de los antibióticos ß-lactámicos.
El tratamiento de Streptococcus pneumoniae con concentraciones
subinhibitorias de numerosos ß-lactámicos producen la hinchazón de la bacteria,
aunque ello no ha podido relacionarse con la unión a determinada PFP (Williamson, 1981).
La acción no contrarrestada de la autolisinas cuando las PFPs son inhibidas
por los ß-lactámicos, también contribuyen a su efecto antibacteriano en el
neumococo.
7.2.2.3. - Autolisinas.
Los antibióticos ß-lactámicos traspasan la pared celular e interactúan con las
PFPs a las que se unen covalentemente. Queda la cuestión de qué manera la
inactivación de PFPs esenciales produce efectos irreversibles con muerte y lisis.
Una de las primeras observaciones sobre la acción antibacteriana de la
penicilina fue que sólo resultaba letal sobre
gérmenes en crecimiento. Con el
descubrimiento de que los antibióticos ß-
lactámicos inhibían la biosíntesis del
peptidoglicano, se pensó que los efectos
bactericidas de estos antibióticos eran
consecuencia del crecimiento
desbalanceado que sufrían al impedirse el
desarrollo de la pared celular. A las
autolisinas, enzimas capaces de hidrolizar
los puentes entre los glúcidos
(glicosidasas), o los péptidos (amidasas y
peptidasas) del peptidoglicano, se les consideraba con un importante papel en la
incorporación de nuevas unidades al polímero de la pared. Bajo la acción inhibidora
de los ß-lactámicos, que impide los enlaces cruzados, la autolisinas continuaban su
acción autolítica debilitando la pared, que se hacía incapaz de sostener la
Fig. 12: Lugares de acción de autolisinas. �-N-acetilglucosaminidasa, Transglicosilasa y �-N-acetilmuraminidasa, DD-endopeptidasa N-acetilmuramil-L-alanina amidasa, D,Dcarboxipeptidasa. (De Livermore, 1996)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 57
membrana celular ante la gran presión osmótica interna, la pared terminaba
dañándose y se producía la muerte del microorganismo.
La primera evidencia directa de la implicación de las autolisinas en la lisis
inducida por penicilina en las bacterias, se constató en una investigación realizada
en un S. pneumoniae mutante defectivo de la actividad N-acetilmuramil- L-alanina
amidasa. La cepa original no defectiva lisaba en el tratamiento con ß-lactámicos y
otros antibióticos inhibidores de la síntesis de la pared celular, mientras que la cepa
mutante amidasa-deficiente si bien su crecimiento era inhibido, no lisaba,
permaneciendo las células viables durante largo tiempo (son cepas de CIM normal y
CMB muy alta).
Iguales resultados se obtuvieron de cepas con producción de amidasa
disminuida; y de cepas con la pared celular modificada al reemplazar la colina por
etanolamina en el medio, que resultan insensibles a la acción de las autolisinas.
Ninguna de estas cepas tolerantes muestra disfunción en el crecimiento, por lo que
se creyó que estas enzimas no eran esenciales para la supervivencia o síntesis de la
pared celular, sin embargo se ha visto que en estas mutantes persiste una pequeña
cantidad crítica de dicha actividad.
A partir de estos y otros hallazgos se ha postulado por Tomasz y
colaboradores que las autolisinas están inhibidas por los ácidos lipoteicoicos y otras
sustancias anfipáticas de la membrana (Tomasz, 1988; Moreillon, 1988; 1990). Estos mismos
autores han postulado un modelo para explicar los mecanismos por los cuales los ß-
lactámicos producen lisis y muerte en las bacterias. En este modelo, las autolisinas
están naturalmente inhibidas por las sustancias antes mencionadas, por acción de
los ß-lactámicos se inhibe la síntesis de peptidoglicano lo que de alguna manera
hace que se liberen los inhibidores y la actividad enzimática autolítica se dispare. De
esta manera la acción bactericida de los ß-lactámicos se debe a factores
secundarios como es la hidrólisis del peptidoglicano por enzimas específicas que
directamente no tienen relación con los antibióticos.
Esto también explicaría las recientes observaciones de cepas mutantes
penicilina- tolerantes que contienen cantidades normales de autolisinas, el
crecimiento de estas cepas se inhibe por acción de la penicilina aunque las células
permanecen viables (Bryan, 1991). Por otro lado presentan un perfil de PFPs normal, por
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 58
lo que se concluye que en estas cepas falla el paso que conecta la inhibición de las
PFPs con la liberación de la acción autolítica (Liu y Tomasz, 1985).
Por otro lado, se ha apreciado recientemente, cierta asociación entre la
resistencia a la penicilina y la deficiencia autolítica (Tomasz, 1988; Appelbaum, 1987). Estos
autores lo explican considerando que en el curso de un tratamiento antibiótico, las
bacterias se ven sometidas a picos de muy alta concentración, por encima de la
CIM, seguido de un período de aclaramiento del antibiótico a niveles por debajo de
la CIM durante el cual las células sobrevivientes pueden volver a crecer. Este
proceso repetido favorece la supervivencia de mutantes deficientes en autólisis, por
lo que existe una mayor probabilidad de que los mutantes penicilina-resistentes se
originen de dicha población.
7.2.2.4. - Tolerancia.
Algunas bacterias pueden sobrevivir en presencia de un antibiótico aunque se
encuentren inhibidas, y se les denomina tolerantes al antibiótico (Horne, 1981). Estas
bacterias, que en condiciones normales presentan crecimiento óptimo se definen
como genotípicamente tolerantes cuando la CMB (establecida como la
concentración mínima que mata el 99,9 % del inóculo) resulta 32 veces mayor que la
CIM (Allen, 1978; Brennan y Durack, 1983; Sherris, 1986; Betriu, 1994). Algunos trabajos sugieren la
alteración de las proteínas fijadoras de penicilina PFP, con relación a la tolerancia a
penicilina por los estreptococos (Asselt, 1995)
La tolerancia fenotípica es reconocida desde el principio de la era antibiótica
como una pérdida o reducción de la capacidad bactericida de un agente, bajo ciertas
condiciones restringidas de crecimiento bacteriano; siendo una muestra de ello la
pérdida de susceptibilidad a los ß-lactámicos por parte de las bacterias en
crecimiento estacionario sin que por ello cambie la CIM de la cepa. Sin embargo
existen algunos ß-lactámicos capaces de producir una reducción significativa de
viables en crecimiento estacionario, son los penems como imipenem, MT141 y CGP
14233.
A diferencia de la tolerancia de origen genotípico, la tolerancia fenotípica es
una propiedad virtual de todas las bacterias, y por ello, de mucha mayor incidencia
en la clínica (Brennan, 1982; Tuomanem, 1986; Cozens, 1987). Se acepta hoy día que en la mayoría
de las infecciones, la tasa de crecimiento bacteriano es mucho menor que las
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 59
conseguidas en los cultivos de laboratorio, siendo común una tasa de crecimiento
reducida en las infecciones crónicas o en los últimos estadíos de los episodios
agudos.
Un ejemplo de ello se da en el curso del establecimiento de una infección
meníngea, la bacteria debe hacer una transición desde un medio rico como el suero
a otro relativamente pobre como el LCR. La concentración en los numerosos
aminoácidos y oligoelementos requeridos por el neumococo es relativamente baja
en el LCR. Tales deficiencias llevan a una fase de adaptación nutricional, que
presumiblemente conlleva al establecimiento de un período lag antes de la fase de
crecimiento exponencial. Se establece así una etapa en la que los microorganismos
muestran tolerancia fenotípica a los ß-lactámicos.
Análogamente, en las valoraciones in vitro, tiene gran influencia la tolerancia
fenotípica que puede conseguirse por factores variables del medio empleado como
son el pH (Horne, 1981), nutrientes (Mayhall y Apollo, 1980; Kim, 1979), oligoelementos, presión
osmótica y potencial redox en microorganismos exigentes como Streptococcus
pneumoniae.
7.2.2.5. - Cinética de la acción bactericida por ß-lactámicos
El número de microorganismos destruídos, después de la exposición al
antimicrobiano, se relaciona con la manera en que este destruye (dependiente de la
concentración vs independiente de la concentración). En el caso de antibióticos
bactericidas relativamente independientes de la concentración como los ß-
lactámicos, la tasa de destrucción que se genera a altas concentraciones es la
misma que a concentraciones a mitad de la curva o incluso por debajo, cerca de la
CIM. En consecuencia, el número total de microorganismos muertos por una dosis
del antimicrobiano, es la tasa de destrucción (casi constante) por el tiempo que las
concentraciones superan la CIM (o la CBM sí es muy diferente) (Soriano, 1992). Cuando
el éxito terapéutico guarda relación con la capacidad para erradicar el agente
infeccioso, entonces se obtiene un éxito creciente, hasta un valor máximo,
aumentando el tiempo en que la concentración del fármaco supera la CIM. Otros
autores (Tauber, 1984) encuentran más significativo el obtener picos ≥ 10 CIM.
En contados casos, la penicilina muestra contra estreptococos el denominado
efecto paradójico o efecto Eagle,, donde la tasa de muerte disminuye cuando la
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 60
concentración supera ciertos límites. Aunque es conocido desde el principio del
estudio de los antibióticos, no se conoce su causa, siendo posibles explicaciones
que el balance de la inhibición de las distintas PFPs, sea menos favorable a la lisis
que a menores concentraciones; o que la liberación de autolisinas se favorezca a
bajas concentraciones del antibiótico, y se inhiba a concentraciones altas.
Los antimicrobianos cuya tasa de destrucción es muy dependiente de la
concentración, como las fluorquinolonas, la tasa de destrucción cambia con la
concentración (tiempo en el paciente), y el número total de microorganismos
muertos es una integral de la tasa de destrucción con respecto al tiempo. Los
fármacos de este tipo tiene un resultado terapéutico vinculado al área bajo la curva
(ABC), que es en sí misma, una integral de la concentración - tiempo.
7.2.2.6. - Criterio de resistencia.
La relevancia clínica de la resistencia intermedia en el tratamiento de
meningitis neumocócicas y la potencial importancia de la distinción entre resistencia
intermedia y la de alto nivel en el tratamiento de todas las infecciones neumocócicas,
hace que sea conveniente la subdivisión de las cepas resistentes a penicilina. Se
aplica el término de resistencia intermedia a aquellos neumococos con una CIM de
0,1 a 1.0 µg/mL ambos extremos inclusive, y el término de altamente resistentes a
aquellos con una CIM > 1 (≥ 2) µg/mL. Por contra se denomina cepas sensibles
aquellas con CIM < 0,1 (≤ 0,06) µg/mL (Klugman 1990; Jacobs, 1992; NCCLS, 1997).
7.2.2.7. - Prevalencia y distribución de neumococos resistentes a penicilina.
En 1943, la penicilina G a la concentración de 0,008 µg/mL era capaz de
matar los neumococos (Neu, 1994). La primera descripción de un neumococo resistente
a penicilina se hizo en 1967 refiriéndose una CIM del orden de 0.25 µg/mL, y por lo
general el término resistente se aplicaba en la literatura a aquellas cepas con CIM
mayor o igual a 0,1 µg/mL.
Desde entonces la distribución, de cepas moderada y altamente resistentes,
(CIM > 0,1 µg/mL) ha llegado a ser mundial (Appelbaum, 1987, 1991; Klugman, 1990, 1992; Koornhof,
1992; Geslin, 1991; Ridgway, 1992; Schutze, 1994; Goldstein, 1994; Hortal, 1994; Privitera, 1994; Reinert, 1995; Marchese,
1995; McCraken, 1995; Nissinen, 1995; Pradier, 1997). Zonas con mas del 10% de aislados resistentes
a penicilina han sido comunicados en Nueva Guinea, Israel, España, Polonia,
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 61
Sudáfrica y Estados Unidos de América (Istre, 1987; Simberkoff, 1986), y continúan
comunicándose desde todas las partes del mundo.
Según una revisión del CDC en 1989, hasta un 20 % de los neumococos
aislados en los Estados Unidos son relativamente resistentes a penicilina con una
CIM > 0,1 µg/mL, y un 5 % son altamente resistentes con CIM superiores a 2 µg/mL
(Neu, 1994).
La prevalencia de cepas resistentes en aislados clínicos varía del 1 % al 60
%, habiéndose comunicado las tasas mas altas en Africa de Sur y en Cataluña
(Applebaum, 1987; Latorre, 1985). El uso de antibióticos orales pudiera estar correlacionado con
la colonización por cepas resistentes de neumococo (Pallarés, 1987; Chadwick, 1993; Gómez, 1994;
Nava, 1994; Negri, 1994; Frimodt-Moller, 1997; Castillo, 1998).
En el brote de Africa de Sur en 1977 se demostraron cepas no solo
resistentes a penicilina (CIM 0,12 - 4 µg/mL), sino también a tetraciclinas (CIM 16 -
64 µg/mL), cloramfenicol (CIM 16 - 32 µg/mL), eritromicina (CIM 32 - 64 µg/mL) y
clindamicina (CIM 64 - 128 µg/mL). Muchas de estas cepas resultaron resistentes a
la rifampicina después del uso profiláctico de esta. Todos los aislados de neumococo
fueron sensibles a la vancomicina que se usó pues, para la erradicación de
portadores de cepas multirresistentes (Appelbaum, 1987).
En Europa, España constituyó un posible foco de cepas resistentes dado el
número de aislamientos tanto en portadores como en enfermos. Sin embargo en
1989 se ha comunicado desde Hungría un porcentaje de aislados resistentes mayor
al 50 %. Esta alta prevalencia de la resistencia a penicilina se atribuye al bajo coste
y fácil accesibilidad a los antibióticos en estos países. La resistencia a penicilina
parece mantenerse a bajo nivel en el resto de Europa.
Según los datos del Laboratorio de Referencia de Neumococos del Centro
Nacional de Microbiología de Majadahonda, Madrid, los porcentajes de resistencia a
los antimicrobianos de 9.243 cepas de Streptococcus pneumoniae aisladas en el
período 1990 - 96 fueron los siguientes: penicilina 49%, cefotaxima 21,7%,
eritromicina 22,5%, tetraciclina 43,4% (Fenoll, 1998).
7.2.2.8. - Resistencia múltiple.
La resistencia contra al menos tres clases distintas de antibióticos es
denominada resistencia múltiple. El seguimiento de los primeros casos en Sudáfrica
de cepas multirresistentes sugirió su origen en España (cepa serotipo 23F) (Lefévre,
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 62
1995 Marchese, 1998), en ambos casos la epidemiología fue inicialmente similar, por la
asociación encontrada en niños hospitalizados con tratamiento antibiótico. Pero
posteriores estudios bioquímicos, genéticos y epidemiológicos indican que las cepas
resistentes a penicilina tiene múltiples orígenes (Jabes, 1989; Muñoz, 1992; 1992b; Sibold, 1992;
Swiatlo, 1996; Maskell, 1997), y su difusión es mundial (Jacobs, 1979; Zighelboim, 1980; Landesman, 1981b; Liu,
1985; Klugman, 1990; McDouglas, 1992; Reichler, 1992; Leggiadro, 1993; 1994; Reichler, 1992; Lister 1995; Mason, 1992;
1993; 1995; 1995b; Welby, 1994; Doern, 1996).
Los procesos debidos a neumococos resistentes son especialmente un
problema en España (Casal, 1982; García Leoni y Bouza, 1988; 1992; Asensi, 1989; Ramos, 1998), donde el
73% de las cepas penicilina resistente lo son también a tres o más antibióticos no ß-
lactámicos, mientras que la tasa es del 11% en las cepas sensibles a penicilina
(Liñares, 1992).
Se ha empleado la rifampicina para profilaxis de portadores nasofaríngeos de
cepas resistentes a penicilina, con los inconvenientes de reaparición de la misma
cepa después de semanas, y la presentación de cepas resistentes a rifampicina
(Ekdahl. 1997; García-Arenzana, 1994).
No han sido descritas cepas de neumococos resistentes a vancomicina o
teicoplanina (Klugman, 1990).
La resistencia a penicilina conlleva una disminución de la sensibilidad a ß-
lactámicos de otras clases como cefemas o penemas (Ward, 1981; Spangler, 1994-1997; Pikis,
1997). (Tabla 4)
Tabla 4: Susceptibilidad in vitro a ß-lactámicos
de cepas sensibles y resistentes a penicilina
MIC90 (µg/mL) para los grupos de sensibilidad a penicilinaAntimicrobiano
Sensible Intermedia Resistente
Penicilina 0,015 - 0,06 0,5 - 1,0 4 - 16
Ceftriaxona 0,01 - 0,06 0,5 1 -2
Cefotaxima 0,01 - 0,12 0,25 - 1,0 1 -4
Imipenem ≤0,015 0,06 - 1,0 0,125 - 2,0
Meropenem 0,01 - 0,03 0,125 - 0,5 0,5 - 1,0
Tomado de Lister, 1995 modificado
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 63
Tabla 5: Resistencia de neumococos a antimicrobianos no ß-lactámicos en
España.
Antimicrobiano Punto
de corte(µg/mL)
Período
Estudiado
Resistencia
(%)
Origen Referencia
Eritromicina >0,5 1991-95 35,3 Andalucía García-Martos, 1997
>0,25 1979-96 21,7 Nacional Fenoll, 1998
>0,5 1980-91 9,1 Guipúzcoa García-Arenzana, 1991
>0,5 1996-97 28,4 Cataluña Liñares, 1998
>0,25 1997 22,6 Levante García de Lomas, 1997
Cloramfenicol >4,0 1979-96 22,5 Nacional Fenoll, 1998
>4,0 1996-97 27,9 Cataluña Liñares, 1998
Cotrimoxazol >2/38 1991-95 65,5 Andalucía García-Martos, 1997
>2/38 1996-97 49,6 Cataluña Liñares, 1998
>2/38 1997 83,0 Levante García de Lomas, 1997
Tetraciclinas >2,0 1979-96 30,9 Nacional Fenoll, 1998
>2,0 1991-95 33,7 Andalucía García-Martos, 1997
>2,0 1996-97 41,0 Cataluña Liñares, 1998
Ciprofloxacino >1,0 1994 18,0 Madrid Baquero, 1994
>2,0 1996-97 3,1 Cataluña Liñares, 1998
Esparfloxacino >1,0 1996 1,2 Madrid Baquero, 1996
>1,0 1996-97 2,1 Cataluña Liñares, 1998
Ofloxacino >4,0 1996-97 2,1 Cataluña Liñares, 1998
Trovafloxacino >2,0 1996-97 0,6 Cataluña Liñares, 1998
Vancomicina >1,0 1979-96 0 Nacional Fenoll, 1998
>1,0 1991-95 0 Andalucía García-Martos, 1997
>1,0 1996-97 0 Cataluña Liñares, 1998
Cepas sensibles y resistentes a penicilina. Criterio de resistencia
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 64
Fig. 13: Estructura de la Ceftriaxona sódica
7.3. - Cefemas: Ceftriaxona
Las cefemas (cefalosporinas y cefamicinas) son antibióticos semisintéticos de
estructura ß-lactámica, con actividad primariamente bactericida, de amplio espectro
(Neu, 1984), que actúan sobre las bacterias
sensibles inhibiendo la síntesis de la pared
celular.
El descubrimiento de actividad
antibiótica en los caldos de cultivo del hongo
Cephalosporium (actualmente Acremonium
crysogenum) aislado por Brotzu en aguas residuales de Cagliari (Cerdeña), y los
posteriores trabajos de Florey, Burton y Abraham produjeron el aislamiento de una
serie de moléculas entra las que se encuentra la cefalosporina C que poseía un
amplio espectro de actividad antibacteriana y resistía la acción de la penicilinasa
estafilocócica. De esta cefalosporia C derivan las penicilinas semisintéticas.
La molécula de la cefalosporina C se compone de un núcleo ß-lactámico
denominado ácido 7-aminocefalosporánico o cefem, una cadena lateral acetilo, y la
otra, un residuo aminoacetilo. Para la actividad antibacteriana se requiere de la
integridad estructural del núcleo y de la sustitución en determinados sitios de la
molécula (Cleeland, 1984)
7.3.1. - Farmacología.
La difusión tisular y humoral de las cefemas es buena, pudiendo lograrse
niveles terapéuticos en tejidos y líquidos orgánicos como pulmón, riñón e hígado,
líquido pleural, sinovial, pericárdico y ascítico (Finch, 1987; Patel, 1991). Si bien, en general
difunden mal al SNC (Nau, 1993), pueden conseguirse niveles terapéuticos en LCR de
sujetos con meninges inflamadas (Schaad, 1981; del Río, 1982; Jones, 1987; 1992; Holt, 1990; Ellmen, 1991;
Sakata, 1994; Cabellos, 1995b; Doit, 1997; Friedland, 1997; Lutsar, 1997)
Las cefalosporinas, como las penicilinas y en contraste con las quinolonas, no
muestran una destrucción de células dependiente de la concentración. Su efecto
bactericida alcanza un máximo con 4-5 veces la CIM (Karchmer, 1995) y existe un EPA
relativamente corto para los estreptococos. Estas consideraciones sugieren que es
el período de tiempo que los niveles de una cefalosporina permanecen por encima
de la CIM del patógeno, el parámetro farmacológico más importante. Un breve
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 65
período de pico alto, seguido de un tiempo considerable por debajo de la CIM, no es
conveniente (Craig, 1977). Los estudios en modelos animales, así como los que
correlacionan observaciones farmacocinéticas, microbiológicas y clínicas en seres
humanos avalan este concepto (Frimodt, 1986; Schentag, 1991; Vogelman, 1985b; Holt, 1992; Caballero,
1996). El tratamiento por infusión continua, los intervalos más cortos entre las dosis y
las estrategias para retrasar la excrección, contribuyen a la adecuada administración
de las cefalosporinas de vida media corta. Con pocas excepciones las
cefalosporinas alcanzan una excelente penetración en los tejidos y en los
compartimentos líquidos como el pulmón (Adu, 1995)
Ceftriaxona en dosis de 2 g/12 hr presenta un pico sérico de 250 µg/mL, una
vida media de 8 horas, una fijación a proteínas plasmáticas del orden de 83-96%,
una excrección renal del 50% y biliar del 40%, alcanzando en LCR niveles de 1,2 -
39 µg/mL (Karchmer, 1995). En consecuencia la mayoría de las infecciones serias pueden
tratarse con menos dosis diarias, por ejemplo meningitis en adultos con 1-2 g/12 hr o
en niños 50-100 mg/kg/día (del Río, 1982; Schaad, 1990), siempre que la prevalencia de
neumococos resistentes (CIM ≥ 2 µg/mL) en el área no sea alta (Cabellos, 1995; Mensa, 1998).
Sin embargo la ceftriaxona a pesar de la comodidad de su administración cada 24
horas, tiene un límite de dosis total diaria de 4 g y no estaría recomendada su
utilización en solitario contra cepas altamente resistentes a cefalosporinas (Viladrich,
1994).
7.3.2. - Mecanismo de acción.
El mecanismo de acción de las cefemas es similar a la de las penicilinas:
inhiben la síntesis de la pared bacteriana de células sensibles en crecimiento, por
inhibición de las enzimas transpeptidasas y carbopeptidasas encargadas de la
formación de los puentes que unen las cadenas lineales del peptidoglicano. Las
enzimas inhibidas, que reconocen como substratos competitivos a penicilinas,
cefalosporinas y cefamicinas, son las denominadas proteínas fijadoras de penicilina
o PFPs (ver sección 7.2.2.2. - Proteínas fijadoras de penicilina (PFPs o PBPs).
En última instancia, la actividad antineumocócica de las cefemas depende de
la accesibilidad a las PFPs, y a la afinidad y especificidad por las distintas PFPs (Ikeda,
1995). La actividad in vitro contra S. pneumoniae de cefotaxima y ceftriaxona (Pankuch,
1994; 1995), es esencialmente idéntica contra cepas sensibles o con resistencia
intermedia a penicilina (Barry, 1995; 1995b; 1996).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 66
7.3.3. - Resistencia.
La menor afinidad de las PFPs por los antibióticos ß-lactámicos, es el
mecanismo por el que algunas cepas de Streptococcus pneumoniae han disminuído
su sensibilidad a cefalosporinas como la ceftriaxona (Figueiredo, 1992; Karchmer, 1995; McDouglas,
1995). Concretamente se debe en algunos casos a la producción de PFPs alteradas:
PFP2x (Sifaoui, 1996; Zhao, 1997) y PFP1a (Smith, 1998); y estas pueden ser transferidas a
cepas sensibles en un solo paso de transformación (Muñoz, 1992).
Las cefemas y carbapenemas a menudo permanecen activas contra cepas de
neumococos y otros patógenos con PFPs alteradas, aunque presentan CIM más
altas que las cepas sensibles. Sin embargo es preocupante el hecho de que basta la
alteración de dos PFPs (1a y 2x) para obtener cepas resistentes a cefotaxima y
ceftriaxona (CIM ≥ 2 µg/mL); mientras que la resistencia de nivel alto a penicilina
requiere de al menos 4 PFPs modificadas (1a, 2a, 2b y 2x). Este hecho implica que
la futura evolución de la resistencia a cefalosporinas puede ser rápida. Existen
publicaciones de que la resistencia a cefotaxima y ceftriaxona puede ser superior
(CIM > 16 µg/mL), que la resistencia a penicilina (Coffey, 1995).
7.4. - Carbapenemas: Imipenem.
El imipenem o imipenema, N-formimidoiltienamicina es un antibiótico
semisintético, de estructura β-lactámica carbapenémica, con actividad primariamente
bactericida, de amplio espectro, que actúa inhibiendo la síntesis de la pared celular.
Ha sido el primero de los carbapenem en ser introducido en terapéutica. Deriva de la
tienamicina, metabolito elaborado por el Streptomyces cattleya, que presenta una
gran inestabilidad físico-química, incoveniente resuelto con la obtención de
derivados semisintéticos como el N-formimidoiltienamicina.
Los carbapenémicos se diferencian de otros ß-lactámicos por el reemplazo
del átomo de azufre, que contienen en su anillo principal α las penicilinas y
Fig. 14: Estructura del Imipenem
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 67
cefalosporinas, por un grupo metileno. Esta sustitución le confiere al imipenem una
mayor reactividad con las proteínas de la pared celular, y por tanto, un efecto
bactericida más potente. Además difiere de los ß-lactámicos convencionales en el
carácter y configuración de su cadena lateral: éstos poseen una cadena lateral
acilamino en configuración cis, mientras que imipenem posee una cadena lateral
hidroxietil en configuración trans. Esta configuración trans es la responsable de la
estabilidad del imipenem ante las ß-lactamasas.
7.4.1. - Farmacología.
El imipenem no es estable en medio ácido y no se puede administrar
oralmente. Se excreta por filtración glomerular y secreción (Kesado, 1980; Buckley, 1992). A
diferencia del meropenem (Dreetz, 1996), es hidrolizado en gran parte por la peptidasa
renal dihidropeptidasa-1, localizada en los cepillos de los túbulos renales proximales.
Para impedir esta metabolización se sintetizaron inhibidores específicos que
presentaran mayor afinidad por el enzima que el imipenem, seleccionándose la
cilastatina. Esta se admistra en igual dosis que imipenem (Tegeder, 1997), no presenta
actividad antimicrobiana ni interfiere la del imipenem. En ausencia de cilastatina el
imipenem es nefrotóxico.
Después de 20-25 minutos de infusión de 250 mg de imipenem (más
cilastatina), se observan picos séricos de 13 µg/mL, con 500 mg el pico es de 33
µg/mL, y con 1.000 mg el pico es de 52 µg/mL.
El imipenem se distribuye ampliamente por los diversos compartimientos
corporales. Su secreción biliar es mínima, y también lo es el cambio de la flora
intestinal. Se han registrado en LCR niveles de 1-5 µg/mL en presencia de
inflamación meníngea.
Las convulsiones, que constituyen el efecto tóxico más serio, son poco
comunes (0,4-1,5 %) y afecta en la mayoría de los casos a pacientes con patología
subyacente del SNC e individuos con función renal disminuída a los que no se ha
ajustado la dosis (Chamber, 1995; Garau, 1997).
7.4.2. - Mecanismo de acción.
El mecanismo de acción es semejante al de otros ß-lactámicos interfiriendo la
síntesis de la pared celular El imipenem se combina con alta afinidad con las PFPs
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 68
de alto peso molecular, especialmente la PFP2 y algo menos con la PFP1a; lo que
rápidamente provoca muerte y lisis celular (Chamber, 1995).
Además provoca un efecto post-antibiótico significativo.
7.4.3. - Resistencia.
Al igual que en cefalosporinas, se ha observado un descenso de sensibilidad
a imipenem en cepas de neumococos resistentes a penicilina (Tabla 4:
Susceptibilidad in vitro a ß-lactámicos de cepas sensibles y resistentes a penicilina)
Se ha descrito resistencia a imipenem en Pseudomonas aeruginosa, por alteración
de su principal diana, la PFP2, y ello es probablemente la causa de la resistencia en
Enterococcus faecium (Dámaso, 1990; Livingstone, 1995).
7.5. - Glucopéptidos: Vancomicina.
Los glucopéptidos son un grupo de antibióticos de espectro reducido, formado
por dos únicos componentes: vancomicina y teicoplanina. La vancomicina se obtuvo
en 1956 a partir de cultivos de Streptomyces orientalis (actualmente Amycolatopsis
orientalis). Posee una estructura química compleja, no relacionada con ningún otro
grupo de antimicrobianos. La estructura central es un heptapéptido con siete
residuos de aminoácido de los que cinco son aromáticos y comunes de los
glucopéptidos. La teicoplanina difiere en las posiciones 1 y 3, y en algunos
sustituyentes de los anillos aromáticos. En vancomicina, el heptapéptido se
encuentra unido a un disacárido, formado por la unión de una molécula de glucosa
con el aminoazúcar vancosamina. En teicoplanina, la presencia de cadenas
laterales, portadoras de ácidos grasos, confieren a esta molécula un carácter
lipofílico entre 50 - 100 veces mayor que vancomicina,
lo que determina en gran medida su farmacología
(Chambers, 1990; Greemberg, 1990; Kaatz, 1990; Wood, 1996; Sábada, 1998).
7.5.1. - Farmacología.
Ningún glucopéptido se absorbe oralmente, por
que su administración es parenteral. Los valores de
concentración máxima y área bajo la curva (ABC)
después de la administración IV, indican que estos
fármacos siguen una cinética lineal, es decir que estos parámetros aumentan con la
Fig. 15: Estructura de la
Vancomicina
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 69
dosis. La cinética de vancomicina se ha descrito como un modelo tricompartimental
en el que se da una primera fase de distribución rápida, seguida de otra más lenta y
una tercera de eliminación.
Los glucopéptidos penetran mal en LCR, salvo que exista inflamación
meníngea, y en estos casos tampoco puede que se consigan concentraciones
elevadas, siendo en ocasiones necesaria su administración intratecal (Pfausler, 1997).
Aunque la administración simultánea de antiinflamatorios como la dexametasona
puede reducir la penetración de vancomicina al SNC (Paris, 1994; 1995b), existen datos de
que se mantienen concentraciones efectivas.
La vancomicina se une poco a proteínas plasmáticas (30 - 60%), mientras que
teicoplanina lo hace en un 90%. El grado de unión es independiente de la dosis, es
decir, la fracción no unida permanece constante, no se produce saturación. La
eliminación es fundamentalmente renal, por filtración glomerular pasiva,
recogiéndose en orina un 80 - 90% de la dosis en las primeras 24 horas. Sufre algún
metabolismo hepático (<10%) siendo su vida media de 3 - 9 horas. Desde un inicio
se ha relacionado la eficacia y la toxicidad de vancomicina con las concentraciones
plasmáticas (Cobo, 1996). Así, la eficacia depende de mantener la concentración por
encima de la CIM90 durante el intervalo de administración, con valores de 8 veces la
CIM90 en el pico máximo, y al menos, dos veces en la concentración mínima (Ackerman,
1992; James, 1996).
7.5.2. - Mecanismo de acción.
La vancomicina es un fármaco bactericida frente a cocos y ciertos bacilos
grampositivos, al inhibir la síntesis de la pared celular bacteriana. Los glucopéptidos
se unen a las dos D-alaninas terminales del pentapéptido, formando un complejo
intermediario de carácter lipídico que inhibe la acción de la transglicolasa, enzima
que facilita la unión del disacárido-pentapéptido a la cadena de peptidoglicano
preexistente. También inhiben las transpeptidasas, enzimas encargadas de unir
entre sí o entrecruzar las diferentes cadenas de polisacáridos para formar la pared
celular, también bloquean la liberación del fosfolípido encargado de transportar las
unidades básicas a través de la ‘membrana de la bacteria, de forma que se
acumulan en el citoplasma y no acceden al exterior que es donde se realiza la
transpeptidación o polimerización de la pared. Como consecuencia de estos efectos
se impide el ensamblaje del nuevo péptidoglicano a la pared preexistente, se inhibe
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 70
la formación de la pared celular y además, el efecto continuo de las autolisinas
bacterianas consigue la muerte celular. En cualquier caso, esta muerte es más lenta
que la que producen los antibióticos ß-lactámicos.
7.5.3. - Resistencia.
No se ha descrito ningún Streptococcus pneumoniae resistente a
vancomicina. Las resistencias bacterianas a los glucopéptidos se producen como
consecuencia de la síntesis de proteínas de membrana incapaces de unirse a estos
antibióticos, impidiendo la acción inhibitoria de la síntesis de la pared celular.
Se han descrito tres tipos de resistencia: La resistencia de tipo A (Van A)
es de alto grado, es decir, las bacterias resistentes presentan CIM90 superiores a
256 µg/mL. Es una resistencia autoinducible, plasmídica y transferible, y codifica tres
nuevas enzimas que sintetizan precursores del peptidoglicano diferentes, impidiendo
su unión a los glucopéptidos. Aparece fundamentalmente en Enterococcus faecium
y, en menor medida, en E. faecalis, E. durans y E. avium (Patel, 1998) Produce
resistencia cruzada entre ambos glucopéptidos. La resistencia de tipo B (Van B),
de bajo grado (CIM90 = 16-32 µg/mL), es cromosómica y no transferible, y codifica
dos proteínas. Es inducible, y suele afectar únicamente a vancomicina, por lo que las
bacterias permanecen sensibles a teicoplanina (CIM90 = 0,51 µg/mL). Se ha
observado sobre todo en E. faecium. La resistencia de tipo C (Van C), de bajo
grado es cromosómica, no transferible y con poca repercusión clínica. Se ha
observado E. gallinarum y E. casseliflavus. También en este caso los
microorganismos permanecen sensibles a teicoplanina.
7.6. - Fosfomicina.
La fosfomicina es un antibiótico natural de
estructura epoxídica, con actividad
predominantemente bactericida al inhibir la síntesis
de la pared celular. Fue aislada en 1966 de una
cepa de Streptomyces fradiae procedente de un
suelo de Alicante, y posteriormente, de otras cepas
de Streptomyces. Actualmente se produce por síntesis química obteniéndose un
producto puro. La sal sódica se emplea parenteralmente, y la sal cálcica por vía oral.
PO3H2
C C
H3C
O
H H
Fig. 16: Estructura de la Fosfomicina
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 71
7.6.1. - Farmacología.
La fosfomicina en las formas de administración oral, como sal cálcica o
trometamol, resulta ácido lábil y su biodisponibilidad es incompleta (Patel, 1997). Por vía
intramuscular (fosfomicina disódica), tiene una absorción completa y rápida,
obteniéndose niveles séricos de 3 a 5 veces superiores a la vía oral. Por vía
intravenosa los niveles sanguíneos son casi el doble que los obtenidos por inyección
intramuscular, alcanzándose la concentración máxima a los 15 minutos. Infusiones
intravenosas continuas de 500 y 650 mg/hr producen unos niveles constantes de 60
y 80 µg/mL, infusiones de 4 g/ 6 horas proporcionan concentraciones de 195 µg/mL
después de la primera dosis, y 253 µg/mL tras la segunda, dosificaciones repetidas
producen efectos acumulativos (Patel, 1997).
Debido al pequeño tamaño (peso molecular 138,1 g/mol), la fosfomicina
difunde bién tisular y humoralmente, penetrando bién en el SNC (Sicilia, 1981; Dámaso. 1990).
La hemivida de la fosfomicina es de 1,5 - 2 horas, no se conjuga con las proteínas
plasmáticas y no metaboliza.
La fosfomicina por vía parenteral, se elimina preferentemente (89 - 90% de la
dosis) mediante filtración glomerular, en forma activa sin metabolizar. Presenta una
recirculación enterohepática. Por vía oral una fracción se elimina en las heces.
7.6.2. - Mecanismo de acción.
La fosfomicina actúa de forma bactericida mediante un efecto neto inhibidor
de la síntesis de la pared celular. Su acción se ejerce en la primera etapa de la
biosínteis del péptidoglicano, al competir estructuralmente con el fosfoenolpiruvato,
por la enzima N-acetilglucosamina-3-O-enolpiruviltransferasa. Esta enzima es
responsable de la incorporación del fosfoenolpiruvato a la uridindifosfo-N-
acetilglucosamina para originar el ácido uridindifosfo-N-acetilmurámico.
Penetra en la célula bacteriana transportada por las mismas permeasas que
normalmente permiten el paso del L-alfa-glicerofosfato y la D-glucosa-6-fosfato.
La fosfomicina es un antibiótico bactericida, con una buena actividad in vitro
contra cocos gram positivos, incluídas cepas resistentes a penicilina de
Streptococcus pneumoniae. Además, por su bajo peso molecular y escasa unión a
proteínas plasmáticas, consigue una penetración adecuada en los tejidos infectados,
incluído el líquido cefalorraquídeo de pacientes con meningitis.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 72
Numerosos investigadores han publicado una sinergia in vitro e in vivo entre
antibióticos ß-lactámicos y fosfomicina (Eliopoulos, 1986), contra dichos neumococos (Nau,
1995; Barakett, 1993; Chavanet, 1995; 1996)
Su uso como único antibiótico contra S. pneumoniae, conlleva un riesgo
significativo de seleccionar mutantes resistentes.
La combinación de fosfomicina con una cefalosporina de tercera generación,
se ha mostrado más eficaz contra neumococos resistentes a penicilina que la
combinación con rifampicina.
7.6.3. - Resistencia.
En casi todas las poblaciones bacterianas existen mutantes espontáneos
resistentes a fosfomicina en un solo escalón con una frecuencia alta (104 - 105), que
se ponen de manifiesto en forma de colonias más o menos numerosas, según el
tamaño del inóculo, en los halos de inhibición. Esta resistencia es debida a la
incapacidad de penetración del antibiótico dentro de la célula, al carecer de los
sistemas de transporte del L-alfa-glicerolfosfato y la D-glucosa fosfato. Estas cepas,
mutantes defectivos, presentan una disminución o pérdida de virulencia en
infecciones experimentales.
Además existe una resistencia adquirida, posiblemente localizada en el
cromosoma, en virtud de la cual cepas sensibles a fosfomicina, adquieren en uno o
varios pasos, niveles de resistencia 16 a 256 veces mayores. Estas cepas, aisladas
de recaídas o fracasos terapéuticos, no se trata de mutantes defectivas y mantienen
su virulencia (Dámaso D., 1974).
7.7. - Quinolonas. Esparfloxacino.
Las quinolonas están relacionadas con el
ácido nalidíxico, fármaco sintetizado a partir de la
cloroquina en 1962. Desde entonces se ha
desarrollado ampliamente este grupo terapéutico.
Dos acontecimientos consistentes en la
incorporación en la estructura química básica de
un átomo de flúor en posición 6- (flumequino), y
un anillo piperacinico en posición 7- (ácido pipemídico), logró mejorar la actividad
antimicrobiana y los parámetros farmacocinéticos (Gerding, 1989). Esto dio origen a una
Fig. 17: Estructura del Esparfloxacino
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 73
búsqueda de la relación entre estructura y actividad, con la que se avanzó en el
diseño de las nuevas moléculas. El éxito fue notable hasta lograr patentar miles de
substancias diferentes en poco espacio de tiempo (Paton, 1988; Tanaka, 1993; Clement, 1994).
Las quinolonas tienen como núcleo común la estructura 4-oxo-1,4-
dihidroquinoleína. El nitrógeno en posición 1 y el grupo carboxílado en posición 3
son indispensables para la actividad antibacteriana. Las fluoroquinolonas poseen un
átomo de flúor en posición 6 y un anillo piperacina (norfloxacino, ciprofloxacino,
enoxacino y esparfloxacino) o metilpiperacina (ofloxacino, pefloxacino, amifloxacino)
en posicion 7. Se diferencian entre sí por el radical en la posición N-1 del núcleo
principal y por el radical unido al grupo piperacina.
Se han propuesto varias clasificaciones de las quinolonas: generaciones en
función de su aparición en el mercado, o de forma más práctica en grupos según la
indicación clínica.
Tabla 6: Clasificación de las fluorquinolonas
Clasificación de la quinolonas fluoradas
Grupo I: Fluorquinolonas orales con indicación esencial limitada a infecciones del tracto urinario.
Presentan una hemivida prolongada (10 - 12 horas) y concentraciones urinarias altas
Norfloxacino
Pefloxacino
Grupo II: Fluorquinolonas de utilización sistémica con amplias indicaciones.
Con buena actividad contra bacilos gramnegativos, pero limitada contra cocos grampositivos
incluyendo neumococos.
Fleroxacino
Ofloxacino
Ciprofloxacino
Grupo III: Fluorquinolonas con actividad mejorada frente a grampositivos y patógenos atípicos.
La hemivida es superior a la del grupo anterior salvo fleroxacino. Especialmente indicadas en
neumonía neumocócicas y atípicas.
Levofloxacino
Esparfloxacino
Grepafloxacino
Grupo IV: Fluorquinolonas con actividad mejorada frente a grampositivos, patógenos atípicos y
anaerobios. Mejoran la actividad, espectro y farmacocinética de los anteriores grupos de indicación
sistémica.
Gatifloxacino
Trovafloxacino
Moxifloxacino
Clinafloxacino
Tomado de Gomis et al. 1998, modificado
Las CMI de ciprofloxacino y ofloxacino frente a los aislamientos de S.
pneumoniae, están muy próximas a los niveles máximos alcanzados en suero por
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 74
dichos antimicrobianos (límite terapéutico), siendo inadecuados para el tratamiento
antineumocócico, especialmente de infecciones graves que precisen una rápida
eliminación del patógeno.
El esparfloxacino presenta un amplio espectro (Brueggemann, 1997; Wakabayashi, 1994)
que incluye al S. pneumoniae (Neu, 1992; Fuchs, 1993; 1996; Pankuch, 1994; 1996; 1998; Hoogkamp, 1997;
Richard, 1998), microorganismo que resulta mucho menos sensible a las primeras
quinolonas. El sustituyente amina en la posición 5 del núcleo quinolónico, diferencia
al esparfloxacino de las otras quinolonas, y contribuye a su actividad contra cocos
grampositivos. El grupo carboxilo en posición 3 y la cetona en la 4 son los lugares de
unión al ADN y a la girasa ADN. El flúor en posicion 6 aumenta la capacidad de
penetración al interior de la bacteria y mejora la afinidad por la girasa. Tambíen se
ha relacionado alguno de estos radicales con diferencias farmacocíneticas; así, las
quinolonas con un grupo metilpiperacina en posicion 7 o las que poseen un núcleo
naftiridona poseen vidas medias de eliminacion mas prolongadas. El anillo
piperacina en posicion 7 es el principal lugar de metabolismo del fármaco.
La neurotoxicidad se ha relacionado con el anillo piperacina sin ningún
sustituyente en posicion 7 del núcleo principal (ciprofloxacino, enoxacino,
norfloxacino) (Davey, 1994) y la fototoxicidad, fundamentalmente con el halógeno situado
en posición 8 (esparfloxacino) (Sábada, 1998)
7.7.1. - Farmacología.
Esparfloxacino penetra bien en los tejidos, presentando un volumen aparente
de distribución alto (3,6 L/Kg) (Goa, 1997; Zix, 1997). Como otras quinolonas (Sorgel, 1989),
alcanza concentraciones elevadas en tejidos, y a nivel intracelular, atraviesa bien las
barreras, sobre todo si están inflamadas (meninges, placenta, próstata). Los picos
de concentración conseguidos en tejido broncopulmonar, macrófagos alveolares y
esputo, suelen superar la CIM de los patógenos más usuales (Entenza, 1994), incluido el
S. pneumoniae (Trautmann, 1996). Las concentraciones observadas en el líquido
cefalorraquídeo, en la grasa o en el ojo son la mitad que las obtenidas en plasma,
aunque en el caso de esparfloxacino pueden resultar activas. En cambio en piel,
músculo, saliva, mucosas, pulmón, corazón, riñón o liquido sinovial las
concentraciones generalmente exceden a la plasmática (Douidar, 1989; Schaad, 1994). Por
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 75
esto se define la farmacocinética de las quinolonas con un modelo tricompartimental
(Borner, 1986), donde se considera la presencia de un compartimento profundo.
Se une un 40% a proteínas plasmáticas, posee una larga vida media de 15 a
20 horas y en parte se excreta por mecanismos no renales pero su eliminación se
consigue principalmente por metabolización hepática en derivados inactivos.
La cinética de este fármaco es lineal, de forma que tanto la concentración
máxima como el área bajo la curva de niveles plasmáticos en el tiempo aumentan
proporcionalmente con la dosis.
La incidencia de efectos adversos durante la realización de ensayos clínicos
es similar para el grupo de las fluorquinolonas (Frías Iniesta, 1999), siendo la tasa de
abandonos por eventos adversos del 6,6% de 1585 pacientes que recibieron
esparfloxacino y del 5% de 6000 pacientes que recibieron trovafloxacino. La
reacción de fototoxicidad con quinolonas era predecible, pues ya se había descrito
con el ácido nalidíxico. Es un fenómeno relacionado con la dosis, mejora e un mes y
se previene o reduce evitando los rayos UVA. En Francia y Japón detectaron una
alta toxicidad con esparfloxacino, requiriendo hospitalización el 10 al 15% de los
casos (Ball, 1995).
7.7.2. - Mecanismo de acción.
Penetra en el interior de la bacteria por las porinas, canales acuosos de la
membrana externa, probablemente mediante un transportador de membrana.
Parece que las quinolonas afectan los enlaces entre los lipopolisacandos de
membrana, aumentando la permeabilidad de la pared celular bacteriana.
La actividad de las fluorquinolonas se debe principalmente a que interfieren la
actividad de dos enzimas necesarias para la replicación del ADN bacteriano: ADN-
girasa y topoisomerasa IV. Ambas son tetrámeros, la primera consta de dos
subunidades A y dos B, la segunda de dos subunidades C y dos E. La girasa
humana consta de un monómero A y otro B, y por tanto, no es substrato de la acción
de estos antimicrobianos.
La topoisomerasa IV, responsable de la separación de las cadenas de ADN
durante la división celular, es la diana principal en estreptococos, mientras que en
microorganismos gramnegativos sólo sería un objetivo secundario.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 76
La ADN girasa, es la enzima encargada de producir tanto el
superenrollamiento de las dos hélices del ADN como su separación y la ruptura de
enlaces, para permitir diferentes funciones (replicación del ADN, transcripción a
ARN). La quinolona se une al sitio especifico del ADN donde debía unirse la
subunidad A y a la propia girasa, formando un complejo ternario que interfiere de
forma directa su acción reparadora final del proceso de superenrollamíento.
Además, parece que la existencia de este complejo bloquea la transcripción
del ARN por las polimerasas. Al impedir la reparación del ADN, y por tanto el
superenrollamiento, el ADN pierde su estructura, y no tiene espacio suficiente en el
interior de la bacteria. Ésta pierde su aspecto inicial, adquiriendo una forma
filamentosa. Posteriormente sufre la acción de las autolisinas propias,
produciéndose el efecto bactericida.
Este mecanismo de acción no explica, por sí solo, el efecto bactericida de las
quinolonas y, por tanto, hay que pensar en otros posibles efectos. De hecho, se han
observado indicios de como la liberación de polisacáridos de membrana conduce a
un aumento de la permeabilidad y a una mayor sensibilidad frente a otros factores
antiinfecciosos, alteraciones en la síntesis de ARN y de proteínas, producción de
exonucleasas, que provocarían la degradación del ADN cromosómico y cambios en
la superficie celular bacteriana tras la exposición a las quinolonas. Incluso a
concentraciones elevadas, mucho más altas que la concentración inhibitoria mínima
(CIM), hay evidencia de alteraciones significativas del péptidoglicano.
En principio, todas las quinolonas presentan el mismo mecanismo de acción,
con efecto bactericida sobre microorganismos en reproducción, es decir, con síntesis
de ARN y de proteínas y división celular (mecanismo A). Algunas quinolonas
pueden, además, continuar siendo bactericidas frente a algunos microorganismos
que no se encuentran en fase de multiplicación, ni sintetizando ARN o proteínas
(mecanismo B). Parece que existe un tercer mecanismo C, que puede darse cuando
la bacteria mantiene sus procesos de síntesis, aunque no haya división celular. Si
únicamente presentan el mecanismo A, se produce un efecto paradójico, y es que
por encima de cierta concentración, el efecto bactericida disminuye, puesto que la
síntesis de proteínas bacterianas se encuentra muy comprometida.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 77
7.7.3. - Resistencia.
Existen al menos tres mecanismos fundamentales mediante los que las
bacterias desarrollan resistencias a la acción de las quinolonas (Janoir, 1996; Pan, 1996;
1997): Alteraciones de la permeabilidad de la membrana restringiendo el acceso del
antimicrobiano a los lugares de acción; Alteraciones en la subunidad C de la
topoisomerasa IV; y Alteraciones estructurales de la subunidad A de la girasa,
impidiendo la unión de esta enzima a las quinolonas.
La presencia de mutaciones en el gen parC da como resultado sustituciones
de aminoácidos en la subunidad C de la topoisomerasa IV, y confiere resistencia de
bajo nivel a ciprofloxacino que ve aumentada de 4 a 8 veces la CIM, mientras que no
afecta significativamente a esparfloxacino o trovafloxacino. Si en estas cepas con
mutaciones del gen parC aparecen mutaciones secundarias en el gen gyrA, se
originan alteraciones de la subunidad A de la girasa en posiciones próximas a la
zona de unión con la quinolona. Diferentes mutaciones a este nivel dan lugar a
enzimas que no pueden unirse a las quinolonas y, dependiendo del número de
mutaciones en esta subunidad, la resistencia será de mayor o menor grado, dando
lugar a resistencia de alto nivel a ciprofloxacino, ofloxacino y esparfloxacino, y
resistencia moderada a trovafloxacino (Taba, 1998).
Se han descrito otros mecanismos como el desarrollo de sistemas
bacterianos que expulsan de forma activa a las quinolonas del interior de la bacteria,
en microorganismos gramnegativos y en grampositivos como el neumococo (Brenwald,
1998; Zeller, 1998).
De esta forma, la concentración de antibiótico en el interior de la bacteria es
menor, y, por tanto, también la susceptibilidad. Parece que este mecanismo
depende de las características fisicoquímicas de la quinolona, de manera que afecta
mas a las de carácter hidrofilico. Alguna de estas mutaciones se ha relacionado con
el desarrollo de resistencias a diferentes antibióticos, como tetraciclinas,
cloramfenicol y ß-lactámicos.
La mayor parte de estas resistencias se producen por mutación cromosómica,
ya que, al ser estos antibióticos inhibidores de la síntesis del ADN, es difícil la
aparición de plásmidos transmisores de estas resistencias.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 78
La resistencia es cruzada entre las diferentes fluorquinolonas, pero no con el
resto de los antibióticos de este grupo. Igualmente, la resistencia a antibióticos no
fluorados es cruzada entre sí, pero no lo es con las fluoroquinolonas (Cormican, 1995).
La aparición de resistencias a las fluoroquinolonas es relativamente frecuente
en Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S epidermidis y otros
Staphylococcus coagulasa negativos o Streptococcus pneumoniae. Liñares et al.
(Liñares, 1998) constata la buena actividad y baja frecuencia de resistencias frente a S.
pneumoniae de esparfloxacino y trovafloxacino.
Esparfloxacino fue pues la primera fluorquinolona con una buena actividad in
vitro e in vivo contra S. pneumoniae, demostrando a su vez eficacia clínica (Allegra,
1996). Y aunque actualmente ha sido superado en espectro de acción, propiedades
farmacológicas y menor toxicidad por otras quinolonas, su excelente actividad y baja
tasa de resistencias frente a Streptococcus pneumoniae ( Aubier, 1996; Barry, 1996d; Goa, 1997;
Richard, 1998), lo promocionaban, en el momento de la realización de esta tesis, como
una excelente opción terapeútica.
8. - Pruebas de susceptibilidad
8.1. - Prueba de susceptibilidad por difusión en agar con disco.
Este método, aceptado ampliamente como estándar, es esencialmente un
método cualitativo que ubica los microorganismos en las categorías de sensibles,
intermedios o resistentes.
Los antimicrobianos se aplican normalmente a las placas de prueba en forma
de discos secos de papel filtro. El resultado final es un gradiente de concentración
del antimicrobiano en el agar que rodea cada disco. No aparece ningún crecimiento
en el área donde la droga está a concentraciones superiores a la mínima inhibitoria.
El tamaño de la zona de inhibición depende de numerosos factores
experimentales, sin embargo para la prueba estandarizada se obtiene una buena
correlación entre el tamaño del halo y la categoría de susceptibilidad para el
microorganismo (Barry 1995b).
Los neumococos son normalmente inhibidos por ≤ 0.02 µg de penicilina G por
mL. Se han descrito cepas moderadamente resistentes (MIC entre 0,1 y 1 µg/mL) y
cepas resistentes a penicilina (MIC ≥ 2 µg/mL) (Flacklam, 1987; Jorgensen, 1994).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 79
El uso del método de sensibilidad con discos de oxacilina como un screening
para la detección de cepas penicilina-resistentes de Streptococcus pneumoniae ha
sido ampliamente recomendado (National Committee for Clinical Laboratory Standards [NCCLS], 1984). Sin
embargo no es recomendable para distinguir entre cepas moderadamente
resistentes y altamente resistentes (Swenson, 1986).
8.2. - Prueba de susceptibilidad por E-test
La técnica E-test (E-test, AB Biodisk; Solna, Sweden) es un método bién
contrastado (Skulnick, 1995; Tenover, 1996; Scheel, 1997) y actualmente muy utilizado (Jorgensen, 1991;
Jacobs, 1992b), recomendado por el Grupo de Trabajo de la NCCLS como una alternativa
aceptable al método de referencia por dilución en agar para el neumococo (Krisher, 1994;
Kiska, 1995). A diferencia del disco de oxacilina, permite la rápida diferenciación entre
cepas intermedias y altamente resistentes a penicilina, y otros antimicrobianos (Macias,
1994)
Consiste en tiras plásticas inertes y no porosas, de 5 cm de largo por 5 mm de
ancho, en una cara se ha desarrollado y afianzado un gradiente de antimicrobiano,
equivalente a 15 doblediluciones seriadas, que difunde inmediatamente al aplicar las
tiras sobre la superficie del agar. De forma similar a otras técnicas de difusión en
agar, se crea un gradiente exponencial proporcional a la concentración presente en
los puntos teóricos de la tira. Tras la incubación se puede observar una zona de
inhibición elipsoidal y simétrica. El punto en que el extremo de la zona de inhibición
intersecciona con la tira, es el valor de la CIM (Mirelis, 1995).
Además de por las limitaciones comunes a las técnicas de difusión en agar
como son la composición y grosor del agar, temperatura, pH, electrolitos, carga del
inóculo, etc., pueden producirse errores o discrepancias por la aplicación
inadecuada de las tiras o mala interpretación de los resultados (Acar, 1996).
Especialmente con el neumococo hay que tener en cuenta la posible existencia de
microcolonias o colonias aisladas dentro del área de inhibición; o la presentación del
denominado dip-effect, debiendo entonces realizarse la lectura sobre la curva virtual
final de la elipse.
Se ha investigado la aplicación del método Etest en la valoración de
parámetros farmacológicos como el efecto post-antibiótico y sinergia antimicrobiana
(Hollander, 1998).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 80
8.3. - Pruebas de susceptibilidad por dilución.
Resultan métodos más cuantitativos, dando resultados directos que no están
tan influenciados por factores experimentales complejos de las técnicas de difusión.
Como en todas las pruebas de susceptibilidad se debe cuidar especialmente el
tamaño del inóculo y el tiempo de lectura (Thornsberry, 1987; Laverdiere, 1978; Tarpay, 1978).
8.3.1. - Prueba de susceptibilidad por dilución en caldo.
Concentración inhibitoria mínima (CIM)
En la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM), diluciones
seriadas de los antimicrobianos se inoculan con el microorganismo, se incuban, y se
lee la CIM como la correspondiente al pocillo de menor concentración sin
crecimiento visible a simple vista (Washington, 1985). Se usa para determinar de forma
aproximada la concentración mínima de un antimicrobiano necesaria para inhibir o
matar a un microorganismo. Ello permite cuantificar la acción de los antimicrobianos
y comparar las concentraciones inhibitorias con las tisulares. Un microorganismo se
considera resistente cuando los niveles alcanzados en el lugar de la infección por el
antimicrobiano, no son suficientes para inhibirlo.
8.3.2. - Tasas de letalidad in vitro
Aunque el parámetro que cuantifica la sensibilidad de un microorganismo a un
antimicrobiano es la CIM, existen situaciones clínicas como la meningitis o las
infecciones en pacientes inmunodeprimidos, que precisan de una actividad
bactericida rápida.
Sobre la base del estudio de curvas de muerte, se han descrito numerosos
métodos in vitro de diferente complejidad para la determinación del efecto
bactericida, simulando diversos patrones o condiciones farmacocinéticas (Thorburn, 1998).
8.3.2.1. - Cinética del crecimiento en medio líquido. Ciclo de crecimiento
Cuando se inoculan bacterias en un medio fresco, la curva de crecimiento
suele mostrar tres fases: la de latencia (también denominada lag), la exponencial
(denominada logarítmica o log) y la estacionaria (Fig. 18).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 81
Al principio la turbidez aumenta muy lentamente, mientras se van sintetizando
ribosomas y otros componentes necesarios, hasta que el crecimiento se hace
exponencial. Si se inoculan células procedentes de un estado estacionario el periodo
lag es mayor, ya que las células han de crecer antes de poder empezar a dividirse.
Si se inoculan células procedentes de un cultivo en fase exponencial, en el mismo
medio a temperatura idónea, el período
de latencia puede resultar inapreciable.
Avanzado el tiempo empiezan a
escasear los nutrientes y las células se
hacen más pequeñas, produciéndose
cambios en su composición como la
reducción de ribosomas que se utiliza
para sintetizar otras moléculas necesarias
para continuar la división celular sin
aumento de la masa total.
Transcurrido cierto tiempo en fase estacionaria, las células del neumococo
empiezan a lisarse, situación denominada a veces fase de muerte. Parece que
durante esta fase, el proceso adaptativo de degradación ribosómica se convierte en
una estrategia suicida, ya que se elimina hasta el último ribosoma y no es posible la
síntesis proteica necesaria para formar nuevos ribosomas.
Representación gráfica.
Durante la fase exponencial de crecimiento, la tasa de incremento de la masa
bacteriana en un tiempo determinado es proporcional a la masa presente:
dB/dt = αB
Donde B es la masa bacteriana, t el tiempo y α la tasa constante de crecimiento
bacteriano para cada cultivo concreto. Por tanto:
dB / B = α dt (o ln B = α dt)
Bt = Boeαt ; e integrando:
ln Bt /Bo = αt, o ln Bt = ln Bo + αt
Por tanto, durante la fase exponencial la representación gráfica del logaritmo
de la masa bacteriana (o de lo que es equivalente, de las unidades formadoras de
colonias), frente a tiempo da lugar a una línea recta. Esta gráfica semilogarítmica
suele ser la que se emplea para representar curvas de crecimiento bacteriano.
Streptococcus pneumoniae
Cepa nº 2461
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 H24
tiempo (horas)
log
It
(UF
C/m
L)
fase
exponencial
temprana
fase
exponencial
fase de
latencia
fase
lítica
fase
exponencial
tardía
Fig.18: Cinética de crecimiento del neumococo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 82
8.3.2.2. - Curvas de muerte
Las pruebas de susceptibilidad de rutina, incluyendo las determinaciones de
CIM, estiman la acción bacterioestática o inhibidora de los antimicrobianos. En la
práctica esto es suficiente como guía de la quimioterapia en la mayoría de los casos,
dado que el éxito de la acción antimicrobiana in vivo depende mucho de los propios
mecanismos de defensa del huésped que son los que en última instancia matan y
eliminan los microorganismos que han sido reducidos por los agentes
antimicrobianos bactericidas o bacteriostáticos. (Schoenknecht, 1987).
Las curvas de muerte o tasas de letalidad son la representación gráfica de los
puntos correspondientes a los supervivientes de un teórico tratamiento
antimicrobiano. Esta técnica ha sido usada para comparar nuevos antimicrobianos y
para el estudio en los cambios de susceptibilidad de patógenos importantes como el
neumococo. Aunque rara vez se emplean como guía en alguna quimioterapia
concreta, si lo han sido en casos de endocarditis bacteriana, bacteriemia en
pacientes con cáncer, osteomielitis o artritis séptica y especialmente en meningitis.
Algunos antibióticos como los ß-lactámicos, aunque resultan altamente
bactericidas para células en rápido crecimiento in vitro, pueden ser menos efectivos
contra bacterias en lento o nulo crecimiento (Allen, 1978), tal como sucede en algunos
compartimentos anatómicos debido a algunas deficiencias nutricionales,
especialmente para algunos microorganismos exigentes como el neumococo, y
cuando se alcanzan altas concentraciones bacterianas (Baker, 1973). Una comparación
directa entre la composición de un medio mínimo definido, frente a la del LCR (Diem,
1981) nos muestra que este último resulta 100 veces más pobre en algunos
aminoácidos y manganeso. Por otro lado, se ha demostrado que los estreptococos
(McGeary, 1983), y dentro de ellos el neumococo (Feldman, 1976), pueden alcanzar en LCR
altas concentraciones del orden de 1x108 UFC/mL
Esto puede suponer un importante problema terapéutico especialmente
cuando o donde las defensas del huésped están disminuidas, tal como sucede en el
espacio subaracnoideo (Tuomanem, 1986). Y por ello las curvas de muerte, que pueden
aportar datos sobre la dinámica de crecimiento o muerte respecto al tiempo, son
útiles para comprender la influencia de dicho aspecto en procesos infecciosos de
curso rápido y grave como la meningitis bacteriana.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 83
La limitada experiencia, experimental y clínica en el tratamiento de las
meningitis y otros procesos graves, por neumococos resistentes a penicilina, hace
especialmente interesante el estudio de la cinética de muerte de dichas cepas ante
algunos de los antibióticos preconizados para su tratamiento. (McCraken y Sakata, 1985;
Appelbaum, 1987; Piérard, 1994; Musher, 1995).
8.3.2.3. - Factores que afectan los resultados de las curvas de muerte
Como en las técnicas anteriores para la determinación de la CIM, existen
numerosos factores que influyen en los resultados de las curvas de muerte para el
estudio de las tasas de letalidad en función de las concentraciones del
antimicrobiano (Magnusson, 1995), del efecto post-antibiótico y del efecto de las
combinaciones antimicrobianas, y según el control que se haga de ellos, numerosas
variantes de los procedimientos de laboratorio. Alguna de ellas se describen más
adelante.
8.3.3. -. Estudio de la acción bactericida en animales
Los modelos de infección en animales, proporcionan una aproximación
necesaria, al resultado de las numerosas interacciones entre el antimicrobiano, el
microorganismo y el huésped (Dalhoff, 1990).
Se han empleado modelos diferentes intentando oviar o aislar determinados
factores, como la respuesta inmune celular empleando animales neutropénicos (Martín-
Caminero, 1997); o reproducir procesos patológicos como la neumonía (Gavaldá, 1997).
8.4. - Otros aspectos farmacológicos: efecto post-antibiótico (EPA)
Inicialmente, los intervalos entre las dosis estaban determinados por las
distintas farmacocinéticas. Posteriormente se han tenido en cuenta otros
parámetros, tales como el modo de acción de los antibióticos (bacteriostático,
bactericida, lugar de acción sobre las bacterias), su paso a distintos lugares (líquido
intersticial, concentración intracelular, unión a los lisosomas, vía de eliminación), etc.
La presencia del efecto post-antibiótico (EPA) o persistencia en la supresión
del crecimiento que sigue tras una corta exposición de las bacterias a los agentes
antimicrobianos, puede ser una curiosidad microbiológica de valor cuestionable al
menos se demuestre su valor en situaciones clínicas, interrelacionando una serie de
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 84
datos y conocimientos como son la dosis, farmacodinamia, CIM de la bacteria, EPA
y su relación con la ABC (área bajo la curva), y las enfermedades de base del
enfermo junto con sus factores de riesgo a la adquisición de las mismas.
El EPA puede tener su mayor influencia en el régimen de dosis (Kunin, 1981). Por
ejemplo se consigue una mayor persistencia de la supresión del crecimiento mediante
concentraciones sub-CIM (efecto post-antibiótico sub-CIM) (Odenholt, 1992; 1997; Gudmundsson,
1994; Kikuchi, 1994), si el microorganismo ha sido previamente tratado a concentraciones
por encima de la CIM. Estas concentraciones sub-CIM, las encontramos entre dosis
en administración intermitente (Cars, 1993). Por otro lado la exposición in vitro de S.
pneumoniae a concentraciones sub-CIM favorece el desarrollo de resistencias (Carsenti-
Etesse, 1995). Luego la elección de una administración intermitente, debe tener en
cuenta la incidencia de resistencias (Fung-Tomc, 1990).
La situación microorganismo-antibiótico que no haya demostrado EPA, o este
sea muy corto, puede requerir de una dosificación mas frecuente que aquella en la
que si se haya demostrado (Hollander, 1998). Este es el caso de la mayoría de los
antibióticos ß-lactámicos, cuyos datos indican seguir con dosis repetidas que
consigan niveles por encima de las CIM. Por el contrario, antimicrobianos como los
aminoglucósidos, macrólidos, glicopéptidos y rifamicinas, su farmacocinética, niveles
hísticos específicos y EPA prolongado, son datos a favor de espaciar la dosis.
8.4.1. - ß-lactámicos
Los antibióticos ß-lactámicos producen un EPA corto o intermedio sobre la
mayoría de bacterias grampositivas con la excepción de los carbapenenes, como
imipenem y meropenem que inducen EPA largo de varías horas, frente a las mismas
(Gudmundsson, 1986; Rennenberg, 1989; Munckhof, 1997; Odenholt, 1998).
Entre las cefalosporinas, la cefalotina produce EPA más largo sobre S.aureus
(Bundtzen, 1981). Las cefalosporinas de segunda y tercera generación consiguen EPA de
aproximadamente 5 horas frente a esta bacteria, mientras que el resto de
cefalosporinas inducen un EPA corto o nulo.
La penicilina G 10xCIM es capaz de producir un EPA de 1,2 horas en
Streptococcus pyogenes, al parecer por unión irreversible a las PFPs 1 - 3,
representando el tiempo requerido para la síntesis de nuevas PFPs necesarias para
la síntesis celular (Yan, 1994).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 85
La dosificación continua de ß-lactámicos ha demostrado sostenidamente más
eficacia que dosificaciones intermitentes en modelos animales. La duración del tiempo
en el que los niveles séricos exceden la CIM es un parámetro farmacocinético
importante para la eficacia de esos antimicrobianos.
Con muy altas dosis de penicilina, se observó una eficacia equivalente cuando
en ambos modelos los niveles séricos superaban la CIM. Otros trabajos en ratas con
capacidad fagocitaria alterada por veneno de cobra, el régimen de dosificación
continuo fue bastante más efectivo. Esto sugiere que las defensas del hospedador
intactas contribuyen de forma significativa a la eficacia del régimen intermitente de
penicilina G contra S. pneumoniae.
8.4.2. - Glicopéptidos
Teicoplanina y vancomicina producen EPAs intermedios con E. faecalis y
cortos con cepas de S.aureus resistentes a la meticilina (Cooper, 1990). Vancomicina
frente a S. pneumoniae consigue un EPA de 1,8 a 4,5 horas, y frente a S. pyogenes
de 2,9 - 3,8 horas (Odenholt-Tornqvist, 1992).
8.4.3. - Quinolonas
Los inhibidores de la DNA girasa producen EPA intermedio o de varias horas
de duración sobre bacterias grampositivas (Gudmundsson, 1991; Minguez, 1991). Esparfloxacino
frente a E. faecalis obtiene EPAs de 0 a 112 minutos (Pastor, 1994) y de 1,7 a 2,3 horas
(Odenholt, 1997), y frente a S. pneumoniae de 1,8 - 2,6 horas (Odenholt-Tornqvist, 1992).
En general se puede decir que los antimicrobianos que inhiben la síntesis de
RNA o de proteínas, como cloranfenicol, macrólidos, rifampicina, tetraciclina y
vancomicina, con la excepción de los aminoglucósidos, tienden a producir un EPA
más largo sobre las bacterias grampositivas que los antibióticos ß-lactámicos.
8.4.4. - Estudio in vitro del EPA
Se han descrito numerosos métodos in vitro de diferente laboriosidad (Craig,
1996; Gottfredsson, 1991; Odenholt, 1993; Jason, 1994) para la determinación del EPA. Básicamente
se trata de medir el crecimiento bacteriano después de la eliminación del
antimicrobiano. La diferencia entre unos métodos y otros consiste en la forma de
medir el crecimiento, y en la forma de eliminar el antimicrobiano.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 86
Tabla 7: Métodos de estudio del EPA
Estudio del EPA
Métodos de eliminación del antimicrobiano
• Dilución
• Filtración en membrana
• Centrifugación y lavado
• Inactivación enzimática
Métodos de recuento bacteriano
Directos
• Recuento de células viables
• Cambio de la morfología celular
Indirectos
• Espectrofotometría
• Conductancia eléctrica
• Medición de productos bacterianos
• Incorporación de isótopos radiactivos
• Bioluminiscencia
8.4.4.1. - Métodos de eliminación del antimicrobiano
En la mayor parte de los estudios recogidos, se usa el método de dilución
para la eliminación del antimicrobiano. Un
pequeño volumen del cultivo con antibiótico es
añadido a un gran volumen de medio sin
antibiótico. Se pretende que la dilución sea tan
grande que la concentración del antibiótico no
afecte el crecimiento del cultivo control. Para
concentraciones cercanas a la CIM, una
dilución de 10-2 es suficiente; para
concentraciones mayores suele necesitarse
diluciones del orden de 10-3 a 10-4. También
es preciso partir de inóculos iniciales del microorganismo del al menos 105 a 106
UFC/mL, ya que también es diluido en la misma extensión que la droga. Al igual que
el lavado repetido, la técnica de dilución es aplicable a todos los antimicrobianos. Sin
embargo, con drogas de rápida acción bactericida, la dilución puede reducir el número
de recuentos viables por debajo del umbral detectable mas fácilmente que en el
sistema de lavado.
EPA 1 HORA Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 + Penicilina G 1 mcg/mL
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24
Tiempo (horas)
log
(UF
C/m
L)
DiluciónControl
T
C
EPA = T(5)-C (2) = 3 hr
Fig. 19: Eliminación del antimicrobiano por elmétodo de dilución
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 87
Algunos investigadores han usado un sistema de centrifugación por
membrana para la eliminación de la droga. Filtros de membrana también han sido
utilizados para exponer los microorganismos a la droga que difunde desde una
superficie de agar. Esta es eliminada por repetida trasferencia de los filtros a placas de
agar sin droga. La ventaja potencial de este método es que los microorganismos son
menos afectados por la presión osmótica y otros efectos mecánicos. La eliminación de
los microorganismos de los filtros consume mas tiempo que el muestreo de los caldos.
El sistema de lavado repetido de los microorganismos es un método común
usado para la rápida remoción del fármaco. Se logra por centrifugación de los cultivos
en caldo a 1200 x g o más durante 5 a 10 minutos, decantando el supernadante, y
resuspendiendo el sedimento en medio nuevo. Todos los investigadores han utilizado
al menos dos lavados para asegurar una completa eliminación de la droga. Con la
eliminación del 90% del sobrenadante, dos lavados consiguen reducir la
concentración de la droga unas 100 veces. Con la decantación completa del
sobrenadante puede reducirse la concentración hasta 10.000 veces. El lavado
ocasiona per se una reducción temporal de la tasa de crecimiento bacteriano, esto
puede ser debido a un descenso de la temperatura durante la centrifugación, a efectos
mecánicos, o a la reducción del aporte de nutrientes a las bacterias agrupadas en el
sedimento. En cualquier caso, es importante cuando se utiliza este método, procesar
controles sin tratar. Aunque este método es aplicable a cualquier antimicrobiano, su
elaboración requiere de al menos 30 minutos.
Un método más rápido para la eliminación del antimicrobiano es la
inactivación del fármaco, aunque está muy limitado a los ß-lactámicos. La simple
adición de •-lactamasa comercial al cultivo con antibiótico, rápidamente inactiva a
penicilinas y cefalosporinas, otras clases de antimicrobianos no son tan fácilmente
inactivadas. El fosfato de celulosa es capaz de unirse e inactivar las moléculas de
aminoglucósidos, pero requiere un paso de centrifugación para separar el complejo
celulosa-aminoglucósido. La eliminación del fármaco por resinas de intercambio iónico
podría tener aplicación en numerosas drogas, pero sólo ha sido estudiado bien en un
antibiótico.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 88
8.4.4.2. - Métodos de recuento bacteriano
Recuento de viables. Se emplea ampliamente el recuento de viables
(unidades formadoras de colonias o UFC/mL) para seguir la cinética de crecimiento
bacteriano después de la eliminación de la droga. Las curvas de viabilidad de un
neumococo estandard, después de una hora de exposición a penicilina G y su
eliminación por lavado se ilustran en la Figura 19.
Después de la eliminación de la droga, se da un retraso del crecimiento que
persiste durante 0 a 3 horas. Los primeros investigadores cuantificaron el EPA
estimando el período de tiempo en fase estacionaria de crecimiento. Sin embargo
las curvas de crecimiento EPA no siempre reflejan una fase estacionaria seguida de
otra fase logarítmica, a menudo se reanuda diréctamente el incremento logarítmico
de viables.
Cuantificación mecánica. Medidas ópticas y eléctricas han sido usadas por
numerosos investigadores para cuantificar el EPA. MacKenzie y Gould (MacKenzie, 1994,
1994b) han comparado simultáneamente estos resultados con los obtenidos en
Enterobacteriaceae por recuento de viables.
Limitaciones de estas técnicas son que la densidad óptica infravalora la
intensidad de la acción bactericida de los antibióticos ß-lactámicos y
aminoglucósidos sobre bacilos gram-negativos, resultando EPAs mucho mayores que
los calculados con recuento de viables.
El contaje electrónico de partículas ha mostrado un EPA comparable al
obtenido por recuento de viables de S. aureus contra dicloxacilina (Li, 1996). Sin
embargo, la validez de este método para bacilos gram-negativos y otros antibióticos
es desconocida.
Concentraciones por debajo de 106 UFC/mL no son bien detectadas por
densidad óptica (Odenholt-Tornqvist, 1993) o medidas de la impedancia, el crecimiento
logarítmico determinado por estos métodos puede mostrar un aparente periodo lag,
donde las bacterias exceden el umbral de detección. Entonces si la densidad óptica o
la impedancia son usadas para la determinación de EPA, es preciso realizar curvas
control por recuento de viables para los diferentes inóculos.
Determinaciones bioquímicas. El contenido de ATP intracelular medido por
bioluminiscencia también ha sido usado para la determinación de EPA (MacKenzie, 1994,
1994b; Handberger, 1990). En algunos casos la intensidad de la acción bactericida fue
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 89
marcadamente infravalorada por el método del ATP, tal vez debido al número de
células muertas pero intactas y conservando su ATP intracelular.
Gottfredsson y col. (Gottfredsson, 1991) han comparado la producción de C02
derivada del metabolismo bacteriano con el recuento de viables, utilizando un sistema
comercial de hemocultivos BACTEC NR 740 (Becton-Dickinson S.A.), capaz de
detectar por espectroscopía de infrarrojos la producción de CO2, obteniendo una
excelente correlación (r = 0,93).
Método radiométrico. La tasa de incorporación de timidina marcada con tritio
por las bacterias después de la exposición al antimicrobiano, también ha sido utilizada
en la cuantificación del EPA. El EPA cuantificado por este método, es prácticamente el
mismo que el medido por el procedimiento estándar y no parece rentable su uso.
Morfología. Se puede usar técnicas como la microscopía de contraste de
fases, microscopía electrónica o citometría (Craig, 1996) para hacer un seguimiento de la
morfología celular o de cambios estructurales relacionados con la acción del
antimicrobiano. La persistencia de esas alteraciones se correlacionan bien con la
duración del EPA determinado por recuento de viables.
8.4.4.3. - Factores que afectan al EPA.
Tabla 8: Factores in vitro que afectan al EPA
Microorganismo• Tipo• Cepa• Tiempo de generación• Fase de crecimiento• Sensibilidad antibiótica• Tamaño del inóculo• Asociación bacterianaAntimicrobiano• Tipo• Modo de acción• Concentración• Combinación• Coeficiente de particiónCondiciones experimentales• Método experimental• Duración de la exposición• Eliminación antibiótica• Agitación• Medio de cultivo• pH del medio• Temperatura• Presencia de iones, orina, suero, LCR
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 90
Numerosos factores pertenecientes a los microorganismos, al antimicrobiano y
a las condiciones experimentales, pueden afectar la duración e incluso la existencia
de EPA. En general, los factores que pueden afectar el EPA son los mismos que
afectan otros parámetros farmacológicos como CIM o CBM, con pocas excepciones.
La variable más importante y una de las mejor estudiadas es el tipo de
microorganismo y la clase de antimicrobiano. Los efectos de la concentración de la
droga y de la duración de la exposición al antimicrobiano también han sido estudiados.
Parámetros sobre los que existe un número limitado de experiencias son el tamaño
del inóculo, la fase de crecimiento en el momento de la exposición, agitación
mecánica del cultivo, tipo de medio, pH del medio y efecto de la combinación de
fármacos (Craig y Gudmunsson, 1996).
Tipo de microorganismo y antimicrobiano
Aunque el efecto post-antibiótico ha sido observado en una amplia variedad de
bacterias y levaduras; y este fenómeno también parece ser una característica de
todos los antimicrobianos. Sin embargo la duración del EPA puede variar
significativamente según la combinación antimicrobiano - microorganismo. Así se ha
observado que los antimicrobianos que interfieren la síntesis de la pared celular
inducen EPAs más largos sobre bacterias grampositivas que sobre gramnegativas.
Por el contrario antimicrobianos como las fluorquinolonas producen EPAs más largos
en gramnegativos que en grampositivos (Martín Caminero, 1993).
MacKenzie y col. investigaron por cinco métodos distintos, el efecto de una
exposición a meropenem en diferentes especies de la familia Enterobacteriaceae,
encontrando distintos EPAs en cada microorganismo (McKenzie, 1991; 1994).
Excepto gentamicina, los inhibidores de la síntesis proteica o de ácidos
nucleicos, tienden a producir mayores EPAs que los antimicrobianos ß-lactámicos
(Craig, 1996).
Concentración del antimicrobiano
Las concentraciones a las que se ha ensayado el EPA suelen ser, en la
mayoría de los casos, las que se alcanzan en suero o líquidos orgánicos después de
una dosis habitual de antimicrobiano, o bien a concentraciones superiores a la CIM
del microorganismo. Por otra parte, hay que tener en cuenta que cuando se produce
mucha letalidad el EPA es difícil de medir, como ocurre con los antimicrobianos
rápidamente bactericidas como imipenem. Zhanel y colaboradores (Zhanel, 1991), han
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 91
sugerido que los estudios sobre el EPA incluyan concentraciones inferiores a la CIM
del microorganismo ya que los antibióticos que son bactericidas a concentraciones
iguales o un poco por encima de la CIM (ß-lactámicos y quinolonas), eliminarán una
gran parte de las bacterias expuestas a la acción del antimicrobiano y en estos
casos el EPA podría representar la recuperación de los miembros más resistentes
de la población bacteriana. Si los estudios se realizasen a concentraciones inferiores
a la CIM, representarían la recuperación de casi toda la población bacteriana
durante el ensayo y no la de los miembros más resistentes.
Los estudios de la cinética de la actividad bactericida con respecto a la
concentración han puesto de manifiesto que existen diversas categorías de
antimicrobianos: Antimicrobianos con un marcado efecto bactericida, dependiente
de la concentración, como los aminoglucósidos. Antimicrobianos con poco efecto
de la concentración en la actividad bactericida, como los ß-lactámicos.
Antimicrobianos que tienen sólo acción bacterioestática, como el cloramfenicol.
Antimicrobianos cuya acción bactericida aumenta con la concentración hasta
alcanzar un máximo a partir del cual la acción bactericida disminuye; esto es lo que
se llama efecto paradójico, como las quinolonas (Pastor, 1992; 1992b; Dudley, 1991). Estas
categorías también quedan reflejadas en el EPA.
En los ß-lactámicos, al actuar sobre los microorganismos grampositivos, un
incremento en la concentración produce un incremento en la actividad bactericida y
el EPA consiguiendo el efecto máximo cuando la concentración es de 5 a 10 veces
la CIM del microorganismo. Por encima de esta concentración no se da un aumento
del EPA aunque se incremente la misma. Con gramnegativos, la mayoría de los
datos de los ß-lactámicos indican que se producen EPAs pequeños o nulos pero
indiferentes de la concentración del antimicrobiano.
Un efecto paradójico del EPA aparece cuando se incrementa la concentración
de penicilina ya que se produce un decrecimiento de la duración del mismo a partir
de un punto máximo (Eagle, 1950[Craig, 1996]). Con los antibióticos bacteriostáticos como
eritromicina, tetraciclina o cloramfenicol, el EPA sólo se produce cuando las
concentraciones empleadas son de 5 a 10 veces la CIM del microorganismo, tanto si
son grampositivos como si son gramnegativos (Vogelman, 1985). El EPA producido por las
fluoroquinolonas se muestra dependiente de la concentración de antimicrobiano, un
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 92
aumento en la misma lleva consigue un incremento en la duración del EPA (Pastor,
1992).
La concentración que alcance el antimicrobiano en un lugar determinado,
también puede afectar el EPA (Bergeron, 1981).
Duración de la exposición.
Aumentando el tiempo de exposición al antimicrobiano, también se logra una
prolongación del EPA (Bundtzen, 1981; Gerber, 1993; Vogelman, 1985). De esta forma, como ocurre
con la concentración, el EPA aumenta con el tiempo de exposición al antimicrobiano
hasta un punto de máxima respuesta a partir del cual ya no se produce aumento del
EPA.
La ampicilina frente a Streptococcus pneumoniae, con mayores períodos de
exposición produce mayores EPAs. En algunos antimicrobianos, como en el caso de
las carbapenemas, la máxima duración del EPA es difícil de determinar debido a la
rápida acción bactericida que producen cuando se ensayan a concentraciones
elevadas o con exposiciones largas.
Eagle y colaboradores (Eagle, 1949 [Craig, 1996]) observaron que el máximo EPA
producido por la penicilina sobre bacterias grampositivas se obtenía después de 2-4
horas de exposición; sin embargo, algunas cepas muestran incrementos del EPA
después de 24 horas. La eritromicina, por su parte, produce el máximo EPA sobre S.
aureus después de 8 horas de exposición. Así mismo, se ha observado que la
duplicación de la duración de la exposición tiene el mismo efecto que el de duplicar
la concentración del antimicrobiano (Craig, 1996).
Por tanto el área bajo la curva (ABC o AUC), esto es concentraciones frente a
tiempo de exposición, aparece como el principal factor determinante de la duración
del EPA para una determinada combinación bacteria-antimicrobiano. Se ha
demostrado una excelente correlación entre la ABC y la duración del EPA de
imipenem y varios bacilos gramnegativos (Munckhof, 1997), penicilina G y S. aureus, y
roxitromicina y S. pneumoniae.
Método de determinación.
Se pueden apreciar diferencias en la duración del EPA dependiendo del
método utilizado para su determinación. Las diferencias entre unos métodos y otros
radican en la forma de medir el crecimiento bacteriano, una vez ha sido eliminado el
antimicrobiano (McKenzie, 1991).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 93
Tamaño del inóculo
Los incrementos del inóculo se asocian a ligeros descensos en la duración del
EPA. De forma similar, el incremento del inóculo en bacilos gram-negativos da lugar
a EPA más cortos en imipenem, tobramicina y ciprofloxacino.
Fase de crecimiento del microorganismo
Muchos estudios del EPA se han desarrollado con microorganismos en fase
logarítmica de crecimiento. Con penicilina G y S. aureus (Craig, 1996) se han revelado
duraciones similares del EPA con microorganismos en fase lag o en fase log. Por
otro lado, Tuomanem (Tuomanem, 1986) ha demostrado un inmediato recrecimiento de S.
pneumoniae en lento desarrollo, después de la eliminación de la penicilina G,
mientras que otros investigadores han observado mayores EPAs durante la fase log
de crecimiento (Bundtzen, 1981; Kim, 1981).
Agitación mecánica
Algunos autores no han observado diferencias significativas en la duración del
EPA con S. aureus y penicilina G en condiciones estacionarias o en agitación en
baño-María (Fuursted, 1997). Sin embargo otros encontraron mayores EPAs en E. coli y
ampicilina en condiciones estacionarias que en agitación continua (Craig, 1996).
La agitación conlleva un aumento de la tensión de oxígeno, lo que puede
alterar la acción de antimicrobianos como vancomicina, aminoglucósidos y
quinolonas, si bién su importancia no está dilucidada (Fuursted, 1997).
Aunque no está clara la influencia de la condición experimental de agitación,
todos los estudios realizados en este trabajo, se han desarrollado en agitación
mecánica continúa.
Tipo de medio
El empleo de diferentes medios produce efectos variables en el EPA, los más
pronunciados se han observado con trimetoprim, seguramente debidos a distintos
contenidos en timidina que pueden inhibir la acción del trimetoprim.
Wilson y Rolinson (Wilson, 1979) no observan diferencias en la duración del EPA
en S. aureus y penicilina G en caldo nutritivo o en caldo infusión cerebro corazón.
Influencia del pH
A pesar de que la influencia del pH es notoria sobre la acción de los
antimicrobianos, existe un reducido número de trabajos que la estudien.
Gudmundsson y col. (Gudmundsson, 1991) demostraron que la actividad de imipenem,
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 94
ciprofloxacino y otros antimicrobianos se ve disminuída por la acidificación del
medio.
La duración del EPA se puede afectar significativamente modificando el pH
del medio post-exposición, donde S. aureus crece más despacio a pH 6,0 o a pH
9,0, que a pH 7,4 (Fuursted, 1997).
Temperatura
Al igual que con el pH, suele existir un rango de temperatura óptimo para el
crecimiento de determinadas bacterias, por lo que la temperatura, también suele
afectar a parámetros como la CIM o CBM y naturalmente al EPA (Fuursted, 1997;
Magnunsson, 1995).
Presencia de suero
La presencia de suero humano incrementa el EPA de algunas fluorquinolonas
frente a cocos grampositivos (Davidson, 1991), y la actividad de cefalosporinas frente otros
patógenos (Leggett, 1989; 1989b)
8.4.5. - Estudios del EPA mediante modelos animales
El número de experiencias in vivo (animales o humanas) sobre el EPA es
mucho menor que el número de estudios in vitro publicados. La mayoría de los
autores emplean los modelos de infección en ratón neutropénico, de músculo
(Gudmunsson, 1982; Martín-Caminero, 1997), o de neumonía (Moine, 1994; Sauve, 1996; Candiani, 1997) y el de
meningitis en conejo (Sande, 1981; McCraken, 1983; Paris, 1994, 1995, 1996; Nau, 1995) para el estudio
del EPA en S. pneumoniae y otros patógenos. Menos frecuentes son los modelos
de ratón normal en infección subcutánea (Renneberg, 1989), peritonitis (Sullivan, 1993; Tsuji, 1994;
Knudsen, 1997, 1998) y otros (Tateda, 1996; Ponte, 1996; Destache, 1996; Saladino, 1997).
Al parecer todos los antimicrobianos son capaces de producir in vivo EPAs de
acuerdo con los encontrados in vitro en cocos grampositivos (Zhanel, 1991). La excepción
puede ser precisamente la penicilina que produce en S. pneumoniae EPAs de
varias horas in vitro, pero no en ratón neutropénico (Craig, 1996), sin embargo otros
autores si han encontrado EPA in vivo con penicilina o ampicilina, discrepancia que
puede deberse a factores experimentales no controlados como variación en las
cepas, o en el método animal empleado.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 95
8.4.6. - Implicaciones sobre los regímenes de dosificación
Experiencias tempranas con penicilina G sugirieron que muchas infecciones
podrían ser tratadas adecuadamente con una terapia antimicrobiana intermitente,
aunque los niveles en suero y tejidos estén por debajo de la CIM durante horas. Por
ejemplo, la neumonía neumocócica, la escarlatina, y las infecciones estafilocócicas de
piel y tejidos blandos han sido tratadas con 80.000 a 300.000 unidades de penicilina G
administradas 1 o 2 veces al día.
El estudio de la eficacia del tratamiento continuo o del intermitente también se
ha abordado en una serie de modelos de infección animal para determinar la
dosificación óptima de penicilina G (Bergeron, 1981; Bakker, 1984), los resultados de tales
trabajos se atribuyen en parte al EPA (Sande, 1981; Craig, 1992; 1993).
Los datos más recientes de EPA sobre una amplia variedad de antimicrobianos
y microorganismos proveen de una teoría racional sobre la dosificación continua o
intermitente de antimicrobianos (Turnidge, 1991), dependiendo del microorganismo
infectante y el antimicrobiano utilizado. Una dosificación intermitente puede ser
aplicada en primera instancia a aquellas parejas microorganismo-antimicrobiano que
presentan un EPA prolongado. Por contra es necesaria una dosificación continua en
aquellas que carecen de EPA.
Existen muy pocos ensayos clínicos humanos que hayan estudiado la
diferencia de eficacia entre dosificación continua o intermitente de antimicrobianos
parenterales (Craig, 1992). Sin embargo si se han realizado ensayos con antibioterapia
oral en bronquitis e infecciones del tracto respiratorio superior, que han demostrado
que una dosificación dos veces al día es tan efectiva como una dosificación 3 o 4
veces diaria.
Existe una documentada eficacia de la dosificación espaciada de
aminoglucósidos en modelos animales, esta también a resultado con menor oto- y
nefrotoxicidad (Renneberg, 1989). Estas observaciones han llevado a la evaluación de una
dosificación una vez al día de los aminoglucósidos en humanos.
8.5. - Combinaciones de antimicrobianos
Las combinaciones antimicrobianas se han utilizado ampliamente para
proveer empíricamente una cobertura de amplio espectro en el tratamiento de
pacientes con procesos graves. Con menor frecuencia se emplean cuando se ha
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 96
identificado un patógeno resistente a las dosis convencionales de un antibiótico pero
que en combinación puede conseguirse el efecto antimicrobiano. En ambos casos,
el resultado clínico puede depender de los efectos de las combinaciones
antimicrobianas contra los microorganismos individuales.
La aplicación de las combinaciones antimicrobianas para conseguir una
actividad in vitro y una eficacia clínica frente a microorganismos resistentes a la
inhibición o muerte, mediante dosis poco tóxicas, sigue siendo objetivo de
investigación intensiva por su gran importancia clínica.
Por todo lo anteriormente mencionado, es conveniente la verificación del
efecto sinérgico de una determinada combinación antimicrobiana contra un
patógeno. Igualmente importante sería utilizar los ensayos in vitro para descartar
interacciones antagónicas.
8.5.1. - Estudio in vitro de las combinaciones de antimicrobianos
La técnica de concentraciones cruzadas en tablero de ajedrez, ha sido utilizada
con frecuencia para el estudio de las combinaciones antimicrobianas. Sin embargo, la
limitación a la observación de crecimiento bacteriano (turbidez), ofrece solamente
datos de inhibición del crecimiento, de poca utilidad en cuanto las combinaciones
antimicrobianas se utilizan precisamente para obtener efectos bactericidas rápidos.
En segundo lugar, tanto el cálculo de los índices como la interpretación del
isobolograma, asumen incorrectamente que todos los antimicrobianos tienen una
relación lineal dosis-respuesta. Aunque los resultados del tablero cruzado a menudo se
utilizan para determinar la relación dosis-respuesta entre un antimicrobiano y un
microorganismo, el test origina normalmente respuestas del tipo todo o nada
(crecimiento o no), y es por tanto incapaz de medir una respuesta gradual necesaria
para elaborar una curva dosis-respuesta.
Finalmente, debido a que los resultados se obtienen al final de un período, los
resultados del tablero cruzado son principalmente estáticos, no aportan ningún dato
dinámico de la interacción antimicrobiana, y presentan disparidades con las técnicas de
cinéticas (Barr, 1990)
Curvas de muerte.
En contraste con la técnica de tablero cruzado, que sólo proporciona datos de
inhibición del crecimiento, la técnica de curva de muerte mide la actividad bactericida
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 97
de la combinación. Por esta razón puede ser mas apropiada para estudiar procesos
correspondientes a situaciones clínicas en las que es deseable una acción bactericida.
Sin embargo, el recuento colonial repetido significa un tedioso y serio límite al
número de concentraciones y combinaciones testadas. Por ello es esencial que las
concentraciones ensayadas del antimicrobiano sean elegidas cuidadosamente a fin de
que sean representativas de las realmente pueden conseguirse in vivo en el lugar de la
infección.
La mayoría de los ensayos se realizan con inóculos de 105 a 107 UFC/mL,
obtenidos mediante la dilución de un cultivo nocturno ajustado a 0,5 de McFarland,
teniendo en cuenta la segunda dilución que se produce al añadir el antimicrobiano.
8.5.2. - Definiciones de la interacción antimicrobiana in vitro
A pesar de las diferencias en los métodos experimentales y de los criterios
para definir cuantitativamente los resultados de las combinaciones antimicrobianas,
existe una general aceptación en las definiciones cualitativas de sinergismo y
antagonismo.
Cuando no existe una interacción significativa entre las drogas, el resultado se
describe como aditividad o como autonomía. La aditividad viene dada cuando los
efectos observados por una combinación, equivalen a la suma de los efectos
separados. Autonomía (o indiferencia) se basa en el concepto de que, en un
momento dado, sólo una vía metabólica puede ser limitante de la tasa de
crecimiento. Según esto la autonomía supondría que el efecto de dos drogas que no
interactúan es simplemente el de la droga más activa.
Sinergismo- interacción positiva consistente en un resultado mayor que el
esperado cuando se usan independientemente los antibióticos, por efecto de su
acción combinada. Cuando ambos antimicrobianos matan, la definición de sinergia
exige que el efecto coordinado sea mayor que la suma de los efectos
independientes (aditividad).
Antagonismo- interacción negativa cuando el uso combinado de las drogas da
un resultado menor que el obtenible con los fármacos solos.
Las definiciones cuantitativas de interacción antimicrobiana con la técnica de
curva de muerte, se basan en los estudios realizados con enterococos,
aminoglucósidos y penicilina. Los resultados de la combinación son interpretados en
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 98
función de la droga mas activa. Sinergismo se define como un incremento ≥100 veces
(≥2 log10) de la muerte en 24 horas con la combinación sobre la droga mas activa. El
antagonismo se define como un descenso ≥100 veces de la tasa de muerte en 24
horas de la combinación sobre la droga más activa. Aditividad o indiferencia se define
como cambios de ≤10 (≤1 log10) veces en la tasa de muerte en 24 horas con la
combinación, sobre la droga más activa. Las definiciones anteriores asumen que al
menos uno de los fármacos no produce inhibición significativa o muerte por si solo
(p.ej. aminoglucósidos frente a enterococos). Al presente no se han establecido
criterios para evaluar los resultados sobre sinergismo obtenidos, con la técnica de
curva de muerte, usando dos o más drogas con actividad antibacteriana por si solas.
Numerosos autores (Landesman, 1981; Schoenknecht, 1987; Barr, 1990; Friedland, 1994; Cormican,
1995b; Lhopital, 1996; Ferrara, 1997) aceptan como sinergia, una caída del recuento de
supervivientes igual o mayor a 2 log10 (UFC/mL) producida por la combinación
respecto a la producida por el más activo de los antimicrobianos.
8.5.3. - Interacciones antagónicas
8.5.3.1. - ß-lactámicos
Un ejemplo clásico de antagonismo entre antibacterianos fue publicado en un
estudio sobre meningitis neumocócica, donde los pacientes tratados con penicilina
más tetraciclina presentaban una tasa de muerte muy superior que los tratados solos
con penicilina (Eliopoulos, 1991 [Lepper, 1951]). Estos resultados clínicos posiblemente reflejan
la capacidad de las tetraciclinas de inhibir la acción bactericida de la penicilina in
vitro. Aunque el mecanismo exacto de este proceso no es conocido enteramente, si
se sabe que antimicrobianos bactericidas como la penicilina requieren que el
microorganismo sensible esté en crecimiento, y que la tetraciclina posee una acción
neta bacterioestática. Otros antimicrobianos bacteriostáticos como el cloramfenicol,
también antagonizan la acción bactericida de la penicilina o la cefotaxima. Un
mecanismo adicional para el Streptococcus pneumoniae en la acción de
antimicrobianos baceriostáticos que inhiben la síntesis proteica, es la inhibición de la
síntesis de autolisinas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 99
8.5.3.2. - Fluorquinolonas
A pesar de los numerosos trabajos sobre interacciones de fluorquinolonas, las
combinaciones que han demostrado ser antagónicas son relativamente infrecuentes.
In vitro el cloramfenicol, la vancomicina y la rifampicina antagonizan la acción del
ciprofloxacino sobre cepas de S. aureus (Eliopoulos, 1991).
8.5.4. - Interacciones sinérgicas
Existen al menos cuatro mecanismos que producen sinergismo
antibacteriano: inhibición secuencial de la misma ruta metabólica (p.ej TMP/SMZ);
inhibición de enzimas protectoras bacterianas (p.ej. AMP/Ác. Clavulánico);
agentes que colaboran en modificar la pared celular (mecilinama + otros ß-
lactámicos); agentes que modifican la pared celular permitiendo la acción de otros
antimicrobianos (p.ej. penicilina + estreptomicina).
8.5.4.1. - Fosfomicina más ß-lactámicos
Las combinaciones de fosfomicina más ß-lactámicos han demostrado acción
sinérgica contra numerosos microorganismos. Sin embargo, debido a la fácil
aparición de mutantes resistentes a fosfomicina, no está claro si la interacción
positiva se debe a la eliminación de aquellos más que a una verdadera sinergia.
Los derivados del ácido fosfónico como la fosfomicina actúan en los primeros
pasos de la síntesis de la pared celular, inhibiendo las enzimas alanina-racemasa,
uridin-5´-difosfato N-acetil-muramil-L-alanina sintetasa y fosfoenolpiruvato sintetasa.
La interacción observada entre fosfomicina y ß-lactámicos, seguramente se debe a
la incidencia sobre dos puntos de la cadena de síntesis de la pared. La fosfomicina
además también afecta la síntesis de PFPs, lo que proporciona otro posible
mecanismo de interacción con los ß-lactámicos.
Frente a S. pneumoniae las combinaciones de fosfomicina más cefotaxima
(Barakett, 1993) y más ceftriaxona (Chavanet, 1995) han demostrado ser sinérgicas.
8.5.4.2. - Vancomicina más ß-lactámicos
La vancomicina actúa en un paso anterior a los ß-lactámicos, y ha
demostrado acción sinérgica en distintas combinaciones con ß-lactámicos (Barr, 1990;
Lacka, 1996). Al igual que fosfomicina, la interacción entre vancomicina y penicilina o
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Introducción 100
ceftriaxona puede clasificarse como una inhibición secuencial sobre dos puntos
distintos de la síntesis de la pared.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Objetivos 101
Objetivo general
En las últimas décadas Streptococcus pneumoniae ha presentado una
disminución de sensibilidad a los antimicrobianos clásicos, además, existe un
aumento de su implicación en infecciones, especialmente graves en pacientes
inmunodeprimidos. Por ello, compete una revisión de la actitud terapéutica de las
infecciones neumocócicas, principalmente de aquellas graves como meningitis, o las
que afectan a pacientes inmunodeprimidos, que requieren de un tratamiento
rápidamente bactericida.
Es objetivo general de esta tesis, el estudio de factores farmacológicos que
pueden suministrar una base teórica para la obtención de la acción bactericida,
como la tasa de muerte bacteriana con relación al tiempo y a la concentración del
antimicrobiano, del efecto post-antibiótico a distintos tiempos de exposición y a
distintas concentraciones del antimicrobiano, y especialmente un enfoque en los
resultados bactericidas de algunas combinaciones de antibióticos frente a S.
pneumoniae.
Objetivos experimentales
1. - Acción bactericida
1.2. - Objetivos metodológicos
Dada la limitada estandarización de las técnicas para la determinación del
poder bactericida, nos hemos propuesto evaluar la influencia de algunos factores
experimentales en los resultados, mediante el estudio de los siguietes objetivos.
1.2.1. - Influencia de la variación en el tamaño del inóculo
Valorar la modificación de la acción antimicrobiana que puede originar la
variación del tamaño del inóculo realizado, comparando los resultados obtenidos con
los antimicrobianos enfrentados a distintas concentraciones del inóculo ajustadas a
las mismas condiciones experimentales.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Objetivos 102
1.2.2. - Evaluación del medio de cultivo empleado
Una importante dificultad técnica, en la realización y reproducibilidad de las
pruebas in vitro del neumococo, es su notoria tendencia a la autolísis. Queremos
evaluar el medio recomendado internacionalmente, caldo Mueller-Hinton Broth
catión ajustado y suplementado con sangre de caballo lisada (MH2+5%SCL), en su
capacidad para mantener viables los cultivos, y para ello comparamos los resultados
obtenidos con un medio caldo sin sangre Brain Heart Infusion (BHI Oxoid CM 225)
empleado en anteriores experiencias, y los obtenidos en la experiencia actual con el
medio recomendado.
1.3. - Curvas de letalidad
Estudiar mediante el método de recuento de viables, para un rango de
concentraciones de antimicrobianos diferentes, la acción bactericida respecto al
tiempo en cepas penicilina sensibles, intermedias y resistentes. Los estudios in vitro
de la cinética de muerte, mediante curvas de letalidad, constituyen una primera fase
en el estudio y comparación de la actividad bactericida y sinérgica de los
antimicrobianos en combinación. Este conocimiento es esencial en los casos que,
como meningitis o inmunodeprimidos, la capacidad y rapidez bactericida de un
antimicrobiano son cruciales para la vida del paciente (Drusano, 1988; Chesney, 1995).
1.4. - Efecto post-antibiótico
Comprobar el efecto post-antibiótico que puede producir la penicilina, sobre S.
pneumoniae resistente a penicilina. Además interesa comparar con el EPA que
pueden producir antimicrobianos alternativos, especialmente desde el punto de vista
del tratamiento de las meningitis donde por diversas causas, no siempre se consigue
mantener concentraciones por encima de la CIM.
1.4.1. - Efecto de la concentración del antimicrobiano sobre el efecto
post-antibiótico
Comprobar el efecto post-antibiótico respecto al tiempo, que se puede
conseguir con las diferentes concentraciones de cada antimicrobiano, por el método
de dilución y recuento de viables en cepas intermedias y resistentes a penicilina
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Objetivos 103
1.4.2. - Efecto del tiempo de exposición sobre el efecto post-antibiótico
Comparar, en cepas penicilina intermedias y resistentes, el efecto post-
antibiótico respecto al tiempo, conseguido con diferentes tiempos de exposición a
cada antimicrobiano.
1.5. - Combinación de antimicrobianos
Examinar, en cepas penicilina intermedias y resistentes, la acción bactericida
respecto al tiempo, conseguida con diferentes concentraciones y proporciones en
diversas combinaciones de antimicrobianos. El uso de las combinaciones
antimicrobianas tiene generalmente una base empírica, sin embargo el resultado
clínico puede depender de la acción de la combinación contra cierta clase de cepas,
por lo que conviene la verificación del efecto sinérgico.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 105
MATERIAL Y MÉTODOS
1. - Material
1.1. - Cepas
Las cepas fueron seleccionadas procedentes de un trabajo previo (García López,
1996), sobre sensibilidad en neumococos aislados durante el período de Enero 1994
a Febrero 1996, en la rutina normal de laboratorio de diversas muestras clínicas
enviadas al Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen de la Victoria
de Málaga, y a la Unidad de Microbiología del Hospital Infanta Margarita de Cabra,
Córdoba
1.2. - Selección de cepas.
Clasificamos para los diversos estudios con los diferentes antimicrobianos, las
cepas de Streptococcus pneumoniae de acuerdo con su sensibilidad al antibiótico de
referencia la penicilina.
Tabla 9: Selección de cepas.
Penicilina
(categorías)Técnica Nº de cepas
S I R
Acción bactericida 9 3 3 3
Efecto post-antibiótico 4 - 2 2
Combinaciones 10 - 5 5
1.2.1. - Caracterización e identificación.
Las cepas fueron identificadas como pertenecientes a la familia
Streptococcaceae, siguiendo los criterios habituales en el laboratorio de
microbiología clínica (Fackland, 1987). El origen de la cepa infectante, su morfología
colonial y la actividad hemolítica en placas de agar sangre, son las características
usadas para determinar las pruebas a realizar. El género Streptococcaceae y la
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 106
especie S. pneumoniae pueden identificarse presuntivamente con un mínimo de
pruebas simples y de forma más exacta y completa por medio de procedimientos
serológicos.
1.2.1.1. - Pruebas morfológicas.
1.2.1.1.1. - Morfología celular.
Tinción de Gram: células esféricas Gram positivas de 0.6 a 1.2 �m de
diámetro, formando parejas que presentan los extremos distales en punta, o
cadenas de longitud corta (Deibel, 1974).
1.2.1.1.2. - Morfología colonial.
Las colonias neumocócicas después de 18-24 horas de incubación en agar
sangre en atmósfera de anhídrido carbónico, son típicamente lisas con bordes
enteros, rodeadas por una zona pequeña de lisis incompleta (alfa- hemólisis) aunque
en algunas cepas la lisis de eritrocitos puede faltar por completo (no hemólisis)
(Musher, 1995). En el medio selectivo agar sangre -nalidíxico, las características
coloniales son las mismas que en agar sangre. Con el tiempo presentan un aspecto
de ficha de damas debido al colapsamiento del centro de la colonia por la lisis
celular, llegando a aparecer una depresión central anular con un botón central que le
da a la colonia un aspecto de pulsador. Los neumococos del grupo III producen
colonias mucosas (Austrian, 1996).
1.2.1.2. - Pruebas diagnósticas.
A los microorganismos seleccionados como presuntos neumococos por las
características mencionadas anteriormente, los sometimos a una serie de pruebas
para su identificación.
En el laboratorio microbiológico de rutina a los neumococos los identificamos
por tres reacciones: (1) la llamada alfahemólisis en agar sangre, (2) la negatividad
con la prueba de la catalasa y (3) la solubilidad en sales biliares o la susceptibilidad
a la etilhidrocupreína (optoquina) (Musher, 1995).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 107
1.2.1.2.1. - Pruebas clásicas.
1.2.1.2.1.1. - Sensibilidad a la optoquina.
Usamos específicamente el disco de optoquina para diferenciar el
Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de Streptococcus
(resistentes) (Mac Faddin, 1980). Discos de 5 µg de clorhidrato de etilhidrocupreína
(optoquina) en placa de agar-sangre recién sembrada y observando a las 24 horas
el halo de inhibición de 15 mm o mayor alrededor del disco.
En los últimos años se han aislado varias cepas resistentes a la optoquina,
por lo que esta prueba puede no bastar para la identificación definitiva (Muñoz R., 1990;
Borek, 1997). En nuestro caso no encontramos cepas resistentes a la optoquina.
1.2.1.2.1.2. - Solubilidad en bilis.
Se basa en la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en
presencia de sales biliares, en un tiempo y temperatura específicos. Empleamos
generalmente dexoxicolato de sodio o taurocolato de sodio ya que son los
componentes líticos más activos. El proceso es complejo y no bien dilucidado.
Técnica directa: depositamos unas gotas de solución de desoxicolato sódico
al 2 % p/v sobre algunas colonias aisladas y observamos su lisis en 5-10 minutos
(Mac Faddin, 1980).
1.2.1.2.2. - Pruebas inmunoespecíficas.
De las diversas pruebas basadas en el uso de anticuerpos específicos contra
Streptococcus pneumoniae, hemos utilizado en su identificación definitiva, y como
control interno, una de las basadas en la determinación polivalente de antígeno
capsular (Slide pneumo-kit bioMerieux 58 821).
1.2.1.2.3. - Serotipado.
Las colonias identificadas como Streptococcus pneumoniae pueden
identificarse serológicamente por la reacción de quellung.. Las células de una sola
colonia, suspendidas en una gota de solución salina fisiológica, o las procedentes de
un cultivo en caldo pueden examinarse directamente. Mezclando con los antisueros
específicos en un porta, añadimos azul de metileno para favorecer el contraste y
observamos al microscopio con iluminación oblicua (Facklam, 1985). La reacción positiva
de quellung se debe a la unión del polisacárido capsular con el antisuero tipo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 108
específico. El consiguiente cambio del índice de refracción hace que la cápsula
parezca hinchada, aunque sólo se hace más visible. La célula neumocócica se tiñe
de azul oscuro y está rodeada de un halo netamente marcado que corresponde al
borde externo de la cápsula. La agrupación serológica se realiza, en la mayoría de
los casos, con los antisueros del Instituto Nacional de Sueros de Copenhague,
Dinamarca (Casal J., 1982; Fenoll, 1989; Bogaerts, 1993; Barnes 1995, Scott, 1996). Todas las cepas las
remitimos para su serotipado, al Laboratorio de referencia de neumococos del
Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid
(Tabla 10).
Tabla 10: Serotipos de las cepas estudiadas
Cepa nº Serotipo
9679C 35
3923M 23F
2150M 23F
52190M 23F
40532M 19
9457M 14
9036M 14
4699C 9V
2461M 9V
4477C 7
16109M 6B
12087M 6B
19633M Nt
Nt: no tipada
1.2.2. - Cepas controles.
Empleamos como cepas controles en algunas de las técnicas, los
Streptococcus pneumoniae de la American Type Culture Collection (Rockville, Md):
ATCC® 6303 (Thorburn, 1998) y la recomendada internacionalmente ATCC® 49619.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 109
Tabla 11: Control de calidad.
Rangos de concentración mínima inhibitoria (CMI) (µg/mL)
para Streptococcus pneumoniae ATCC ® 49619.
Antimicrobianos CIMs (µg/mL)
Penicilina 0,25 - 1,00
Ceftriaxona 0,03 - 0,12
Imipenem 0,03 - 0,12
Esparfloxacino 0,12 - 0,50
Vancomicina 0,12 - 0,50
(NCCLS, 1997: M7-A4, tabla 3C modificada; Fuchs, 1997).
1.3. - Medios de cultivo bacteriano.
1.3.1. - Medios para la conservación de cepas.
Las cepas seleccionadas las conservamos preparando una suspensión alta
en medio MHB-II (ver sección 1.3.3.3.1) partiendo de un cultivo puro de 18 horas,
mezclado a partes iguales con leche desnatada (Bacto skim millk Difco ref. 0032-01-
1) previamente esterilizada en alícuotas Eppendorf. Las congelamos a -40ºC hasta
su uso. Repetimos este proceso cada 2 meses, para garantizar la viabilidad de las
cepas al no disponer de un sistema de congelación más efectivo.
1.3.2. - Medios de aislamiento.
Para los aislamientos utilizamos placas comerciales de agar sangre con una
proporción de sangre de carnero del 5 % y pH final de 7,3.
Los cultivos primarios y los aislamientos los incubamos en atmósfera de CO2
a 37° C.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 110
1.3.3. - Medios empleados en las técnicas.
1.3.3.1. - Técnica de difusión en agar.
Para esta técnica hemos empleado placas del medio Mueller-Hinton II Agar
con 5% de sangre de cordero, elaboradas comercialmente (bioMérieux c/ Manuel
Tovar, 36 28034 Madrid, referencia 43 321).
1.3.3.2. - Técnica Etest®.
Usamos el medio Mueller-Hinton II Agar (bioMérieux ref. 51075). Preparado
según las instrucciones del fabricante, con suplemento de 5% de sangre de caballo
lisada (ver apartado 1.3.3.3.2), y dispuesto en placas de 150 mm.
1.3.3.3. - Técnica por dilución en caldo.
Empleamos el medio recomendado (NCCLS, 1997: M7-A4). MHB-II o MHBCA.
Ajustado con las sales necesarias para proporcionar de 20 a 25 mg por litro de calcio
(Ca++), y 10 a 12,5 mg por litro de magnesio (Mg++). Bajo contenido en timina y
timidina,.suplementado con 5% de sangre de caballo lisada y pH final de 7,3 (+/-
0,1).
1.3.3.3.1. - Caldo Mueller-Hinton II
Ajustado en cationes (MHBCA o MHB-II). (BBL lote 1000A8DFKF). El medio
lo preparamos según las instrucciones del fabricante, suspendiendo 22 g de polvo
en un litro de agua purificada y calentando a baño María hasta su disolución
completa. Lo envasamos en tubos de cristal de 15 mL con tapón a rosca, que
esterilizamos entre 116 y 121 ºC durante 10 minutos procurando evitar
calentamientos excesivos. Le elaboramos periódicamente, conservándolo en
frigorífico a 4 ºC. Controlamos la esterilidad de cada tubo observando su
transparencia, y la del lote mediante siembras en agar sangre en atmósferas CO2 y
anaerobia.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 111
Con 5% de sangre de caballo lisada. (MHB-II+5%LHB). Al medio anterior
añadimos asépticamente la cantidad necesaria de LHB 50% para obtener una
concentración del 5%. Realizamos un control de esterilidad mediante siembras en
agar sangre en atmósferas CO2 y anaerobia.
1.3.3.3.2. - Sangre de caballo lisada.
Elaboración de la sangre de caballo lisada (LHB) (NCCLS, 1997: M7-A4). Sangre
desfibrinada de caballo (bioMérieux ref. 55833). Lisamos los hematíes mediante un
número suficiente de ciclos de congelación y descongelación consecutivas,
añadimos asépticamente agua destilada estéril a partes iguales (LHB 50%) y
centrifugamos a 12.000 x g durante 20 minutos. Decantamos el sobrenadante que
debe resultar diáfano, centrifugando otra vez si es necesario.
1.4. - Antimicrobianos.
1.4.1. - Selección de antimicrobianos.
Hemos utilizado para este estudio antimicrobianos ampliamente
recomendados en la literatura para las infecciones por Streptococcus pneumoniae.
Seleccionamos los más apropiados de acuerdo con la bibliografía existente y la
práctica en el tratamiento de las enfermedades infecciosas (Klugman, 1994; Friedland, 1994b;
Cassinat, 1994; Musher, 1995; Bradley, 1995; Lister, 1995; Paris, 1995; Sanford, 1998).
1.4.2. - Selección del rango de concentraciones.
El rango y las concentraciones específicas ensayadas de cada antimicrobiano
los escogimos en acuerdo con los niveles que podemos conseguir en humanos
(Gerding, 1996; Amsdem, 1995; Morrissey, 1997) y con los puntos de corte interpretativos publicados
(NCCLS, 1997: M7-A4; Amsterdam, 1996).
1.4.3. - Preparación y almacenamiento.
Todas las sustancias fueron suministradas con potencia valorada por los
fabricantes o por otras fuentes comerciales. Los polvos valorados fueron
almacenados según instrucciones del fabricante o a - 40ºC y utilizados dentro de su
período de caducidad. De los antimicrobianos pesamos la suficiente cantidad con
una balanza analítica para obtener soluciones madre, según las recomendaciones
del fabricante y las publicadas (NCCLS, 1997: Vol.17 nº2 Tabla 4). Esta dilución la empleamos
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 112
una sola vez o la congelamos a -40 ° C según los casos. De la solución anterior,
obtuvimos por dilución la solución de trabajo. Estas las desechamos siempre
después de su uso.
1.4.4. - Soluciones de antimicrobianos.
1.4.4.1. - Penicilina G sódica.
Penicilina G sódica (Bencilpenicilina). Vial de sustancia valorada
proporcionado por CEPA, S.L. Paseo de la Castellana, 141. 28046 Madrid.
Preparamos con agua destilada estéril, soluciones madre de 5120 µg/mL que
congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.
1.4.4.2. - Vancomicina.
Vancomicina clorhidrato. Viales de polvo valorado con 101,4 mg/vial (USP).
Laboratorio Eli Lilly & C. lote RS0171, proporcionados por Lilly S.A. Avda. de la
Industria, 30. 28100 Madrid. Preparamos con agua destilada estéril, soluciones madre
de 5120 µg/mL que congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación
a -40ºC 3 meses.
1.4.4.3. - Ceftriaxona.
Ceftriaxona sal disódica (RO-13-9904/001). Procedencia Laboratorio Roche
(F. Hoffmann - La Roche LTD, CH-4002 Basel, Switzerland), proporcionado por
Roche, S.A. Carretera de Carabanchel a Andalucía s/n. Apdo. de Correos 1157.
28080 Madrid. Vial de 1000 mg lote B0453 potencia declarada 845 µg/mg.
Elaboramos con agua destilada estéril, soluciones madre de 5120 µg/mL que
congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 3 meses.
1.4.4.4. - Imipenem.
Imipenem (N-Formimidoyl thienamicin monohidrate). Procedencia Laboratorio
Merck, Sharp & Dohme. West Point, PA 19486 USA. Vial de 100 mg lote 7019A
potencia declarada 924 µg/mg (92,4 mg). Proporcionado por MS&D de España, S.A.
c/ Josefa Varcálcer, 38. 28027 Madrid. Elaboramos asépticamente soluciones
extemporáneas, disolviendo el polvo valorado y diluyendo hasta la solución de
trabajo, con solución fosfato pH 7.2 - 0,01 M esterilizada por filtración.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 113
Solución tampón fosfatos de Sörensen.
Solución A: PO4Na2H (M/15) 9,45 g de reactivo anhidro en un litro de agua
destilada estéril.
Solución B: PO4KH2 (M/15) 9,08 g de reactivo anhidro en un litro de agua
destilada estéril.
Solución pH 7.2 - 0,01 M: 71,5 mL (A) + 28,5 mL (B) y dilución a 1/10 de la
mezcla. Esterilización por filtración. Controlamos el pH.
1.4.4.5. - Fosfomicina.
Fosfomicina (Phosphomycin disodium salt C3H5Na2O4P: solubilidad 50 µg/mL
agua). Vial del Lote: E-668 de potencia declarada 748 mg/g proporcionado por
CEPA, S.L. Paseo de la Castellana, 141. 28046 Madrid. Preparamos con agua
destilada estéril, soluciones madre de 12800 µg/mL que congelamos asépticamente
en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.
D-Glucosa 6 fosfato monosódico Sigma (G7879).
Elaboramos con agua destilada estéril, soluciones madre de 400 µg/mL que
congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.
1.4.4.6. - Esparfloxacino.
Esparfloxacino. RP 64206 Rhone-Poulenc-Rorer 13 Quai J Guesde BP 14
94403 Vitry sur Seine CEDEX, proporcionado por RPR, S.A. Avda. de Leganés, 62.
28925 Madrid. Vial de 1 gramo de sustancia valorada lote MIJ500 con potencia
declarada del 99,9%. Solubilidad del polvo 20 mg en 1 mL de 0,1N NaOH.
Disolvimos el polvo con agua destilada y estéril añadiendo gotas de NaOH 0,1N en
cantidad suficiente, completando luego con agua hasta la concentración deseada.
Elaboramos soluciones madre de 5120 µg/mL que congelamos asépticamente en
alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 114
2. - Métodos
2.1. - Prueba de sensibilidad por el método disco-placa
Usamos el método de sensibilidad con discos de oxacilina (1 µg) como un
screening para la detección de cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a
penicilina (NCCLS, 1997: M2-A6).
Preparamos el inóculo mediante la suspensión de las suficientes colonias en
BHI para obtener una turbidez aproximada al 0.5 de McFarland, y sembramos en
placas de Mueller-Hinton suplementado con 5 % de sangre de carnero, que
incubamos en estufa de CO2 a 37 ° C durante 24 horas. El punto de ruptura se
estableció para un halo con diámetro de 20 mm (Jacobs, 1979), determinando como
sensibles a penicilina aquellas cepas con un halo de inhibición de ≥ 20 mm de
diámetro y resistentes (intermedias o altas) la que presentan un halo de diámetro
menor de 20 mm La incubación en atmósfera de CO2, aunque no es necesaria para
las técnicas de microdilución, se recomienda (NCCLS, 1997: M2-A6, pág. 20) para obtener un
crecimiento fiable en la superficie del agar.
2.2. - Concentración inhibitoria mínima (CIM).
2.2.1. - Método de microdilución en caldo.
Las CIMs fueron determinadas por el método de microdilución recomendado
por el National Committee For Clinical Laboratory Standards 1997(NCCLS, 1997: M7-A4),
Esta técnica permitió confirmar la selección previa de las cepas a estudiar, y
clasificarlas según la CMI a penicilina.
2.2.1.1. - Preparación del inóculo.
Para la preparación del inóculo partimos de un cultivo puro en agar de 18-20
horas, tomamos varias colonias que inoculamos en un caldo Mueller-Hinton II sin
sangre hasta conseguir una turbidez de un estándar 0,5 de McFarland lo que
equivale aproximadamente a 108 UFC/mL. Pipeteamos 125 µL de esta suspensión
estandarizada en un tubo de tapón roscado que contenga 12,5 mL de Mueller-Hinton
II con 5% de sangre lisada de caballo. Mezclando bien, la suspensión bacteriana
obtenida es aproximadamente de 106 UFC/mL.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 115
2.2.1.2. - Rango de concentraciones estudiadas.
Tabla 12: Rango de estudio de las CMIs
Antimicrobiano Rango (µg/mL)
(11 diluciones)
Penicilina 16 - 0,016
Vancomicina 16 - 0,016
Ceftriaxona 16 - 0,016
Imipenem 16 - 0,016
Fosfomicina 512 - 0,50
Esparfloxacino 16 - 0,016
2.2.1.3. - Desarrollo de la técnica.
En placa microtiter de 8x12 pocillos, estéril, para un antibiótico y ocho cepas.
Cada paso lo realizamos con puntas nuevas estériles desechables.
1. - Añadimos a todos los pocillos 50 µL de MHBCA+5%LHB
(aproximadamente 5 mL por placa)
2. - Añadimos en la primera columna 50 µL de la solución antibiótica a la
concentración cuádruple de la máxima deseada. Queda el antibiótico a
concentración doble.
3. - A partir de la primera columna, doblediluímos 10 veces dejando la última
columna sin antibiótico como control.
4. - Añadimos a todos los pocillos 50 µL del inóculo 106 UFC/mL, queda por
pocillo 5x105 UFC y las concentraciones deseadas.
5. - Del pocillo control sembramos 1 µL para recuento del inóculo.
6. - Incubamos a 35ºC con tapa, 20-24 horas antes de la lectura.
7. - Lectura: consideramos crecimiento significativo una turbidez definida o un
botón mayor o igual a 2 mm. El punto final correspondiente a la CMI es el de mínima
concentración del antimicrobiano que inhibe el crecimiento detectable a simple vista
(comparando con el pocillo control sin antibiótico). (Landesman, 1981; Mazulli 1990; NCCLS, M7-A4:
1997).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 116
2.2.2. - Método Etest®.
El método comercial PDM Epsilómetro o Etest® (AB
Biodisk, Solna, Sweden) es una técnica incorporada al
laboratorio de microbiología en esta última década, ha sido
empleada por numerosos autores para el estudio de la CMI
en neumocos y otros patógenos (Baker, 1991; Kriser, 1994; Macias, 1994;
Bolmstrom, 1994; Skulnick, 1995). Se trata de un transportador inerte,
una tira de plástico poroso de 5 mm de ancho por 5 cm de
largo (Fig. 20), con un gradiente continuo del agente
antimicrobiano, equivalente a 15 diluciones dobles
progresivas, aplicado en una cara de la tira. El proceso es
semejante al de difusión en agar con disco. La técnica
consiste en sembrar sobre toda la superficie de una placa de
agar MH un inóculo estandarizado, luego depositamos la tira y tras la incubación,
leemos la CMI donde la curva de la elipse de inhibición cruza con la tira graduada
(Acard y Goldstein, 1996).
2.2.2.1. - Estandarización del inóculo.
De acuerdo con las instrucciones del fabricante y de algunos autores (Jorgensen,
1994; Tenover, 1996). El inóculo lo preparamos, por el método directo de suspensión
colonial en caldo Mueller-Hinton II ajustando a una turbidez de 0,5 de McFarland; 1
de McFarland para cepas mucosas, y utilizando la suspensión antes de 15 minutos.
2.2.2.2. - Desarrollo de la técnica Etest®.
1. - El inóculo estandarizado, lo sembramos sobre la superficie de una placa
de Mueller-Hinton II con 5% de sangre de caballo lisada, con un escobillón en tres
direcciones y dejamos secar.
2. - Aplicamos las tiras e incubamos a 37ºC en
atmósfera de CO2, por un período completo de 24 horas.
2.2.2.3. - Lectura de las CIMs Etest®.
Siguiendo las instrucciones del fabricante, leímos
la CMI usando una luz oblicua y observando la inhibición
completa de cualquier tipo de crecimiento incluyendo
Fig. 20: Tira de Etest
Fig. 21: Disposición y lectura
en placa de 150 mm
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 117
microcolonias o colonias aisladas dentro de la elipse de inhibición. En los casos de
valores intermedios de CIM, redondeamos a la dilución superior más próxima. Se ha
publicado discrepancias entre microdilución y Etest, en el ensayo de vancomicina
frente a S. pneumoniae (Hashemi, 1996).
2.3. - Acción bactericida. Curva letal.
La determinación de la velocidad microbicida o el establecimiento de una
curva letal ha sido ampliamente aplicado a la evaluación y comparación de nuevas
drogas y al estudio de diferencias y cambios en la susceptibilidad antimicrobiana
(Decazes, 1983; Schoentnecht, 1987; Potel, 1991; Hohl, 1990; Carret, 1991; Ackerman, 1992; Friedland, 1994; Keil, 1995;
Visalli, 1996-97; Spangler, 1996-97; Klugman, 1996 Corvasier, 1998), especialmente cuando se pretende
valorar la rapidez de la acción bactericida.
2.3.1. - Preparación del inóculo.
Previamente para cada cepa realizamos un estudio de la densidad celular del
inóculo, suspendiendo de 4 a 5 colonias procedentes de un cultivo en AS de 18-20
horas, en caldo Mueller-Hinton II sin sangre, e incubando hasta conseguir o superar
una turbidez (absorbancia) comparable al 0,5 de la escala de McFarland* con el
espectrofotómetro† ajustado en 625 nm. Este enturbiamiento corresponde
aproximadamente a 2-3 x108 UFC/mL y normalmente lo conseguimos mediante un
cultivo nocturno de 12 -18 horas (NCCLS, 1997: M2-A6; pág. 23).
Este proceso lo repetimos reajustado, para elaborar el inóculo 2-3 x108
UFC/mL y a partir de éste realizamos la dilución de trabajo en Mueller-Hinton II +
5%LHB mediante dilución 1/100, obteniéndose una concentración aproximada de
5x105 UFC/mL, que constituye el inóculo utilizado. El inóculo de trabajo lo
elaboramos una hora antes de la exposición a antibióticos y usamos Mueller-Hinton
II + 5%LHB precalentado a 37ºC a fin de reducir la fase de retardo y favorecer la
rápida instauración del período de crecimiento logarítmico (Peterson, 1978; Friedland, 1994; Doit,
1997).
* Patrón 0,5 McFarland BaSO4. P.ej. 250 �L [0,048M/L BaCl2] o [1,1175 % p/v BaCl2x2H2O] + 4750 �L [0,18 M/L
(0,36N) SO4H2 (1%v/v). Debe presentar una absorbancia de 0,08 - 0,1 a 625 nm en cubeta de 1 cm.† Spectronic, Bausch and Lomb Inc., Rochester,NY
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 118
Tabla 13: Factores técnicos que afectan las curvas de muerte y condicionesasumidas en este trabajo.
Factores Efectos Condiciones experimentales
Concentración del antimicrobiano Existen antimicrobianos conefectos muy dependientes dela dosis como quinolonas,mientras que otros como ß-lactámicos la dependencia esmucho menor
Se emplea rangos deconcentracionesrecomendados, reproduciblesen humanos.
Fase del crecimiento En la fase estacionariaaumenta los supervivientes; elefecto paradógico (Eagle)aumenta en la faselogarítmica tardía
Tamaño del inóculo Con altos inóculos seobtienen menores tasas demuerte.
La fase de crecimiento y eltamaño del inóculo secontroló de igual forma entodas las técnicas. Ajustandoun inóculo de 8 - 10 horas al0,5 McF, y preincubando 1 - 2horas antes de la exposicióna los antibióticos.
Temperatura de incubación La tasa de crecimiento tieneun rango óptimo detemperatura
Las placas se incubaron alaire en estufa a 37ºC. Y sereincubaron inmediatamentetras cada período demuestreo (máximo 5 minutos)
Medio de cultivo y contenido encationes.
Sobre el desarrollo óptimo yla reproducibilidad del test
Se usó el mediorecomendado Muller-Hinton 2con 5% LHB y ajustado encationes
Tipos de tubos o pocillos La adhesión a las superficiescargadas electrostáticamentevaría según el materialpudiendo dar falsosresultados.
Modo de inoculación La adhesión por encima delmenisco, puede ser eliminadainoculando en pequeñosvolúmenes por debajo delmenisco, y agitando
Agitación Un sistema de agitación esnecesario para resuspenderlas células, favoreciendo eldesarrollo en medio líquido ypermitiendo tomar muestrasrepresentativas.
Las placas de incubación demantuvieron en agitación(175-180 rpm) durante todo elproceso. Las inoculacionesde antimicrobiano serealizaron con pipetasautomáticas con puntasdesechables que sirvieronagitar la mezcla. Losmuestreos se realizaron conasas calibradas o puntas depipeta desechables, agitandopara tomar una muestrahomogénea
Arrastre de antibiótico o de inóculobacteriano
Se pueden obtener falsosresultados negativos cuandoarrastramos antibióticos aaltas concentraciones, ofalsos resultados positivos siarrastramos altos inóculosbacterianos
Aunque no se utilizaron altasconcentraciones deantimicrobiano (máximo 4CIM), el sistema de dilucionesdecimales para recuento,manifiesta si existe inhibiciónpor arrastre de antibióticocuando alcanza la diluciónsuficiente. En cada paso demuestreo o dilución secambiaron las puntas depipeta desechables.
Reincubación del medio libre deantibióticos
Puede ser necesaria unaincubación de 48 horas, paraapreciar los resultados
La lectura se realizó en 24 o48 horas según lascaracterísticas de la cepa.
Adaptado de Schoenknecht y col. 1985
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 119
2.3.2. - Cepas estudiadas.
Tabla 14: Cepas estudiadas en curvas de letalidad.
Cepa nº CMIpenicilina (µg/mL) Categoría (penicilina)
4477 0,063 S
9679 0,012 S
ATCC 6303 0,063 S
19633 0,500 I
2461 1,000 I
9036 1,000 I
3923 2,000 R
9457 2,000 R
12087 2,000 R
2.3.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos.
Tabla 15: Concentraciones probadas de antimicrobianos (µg/mL).
Penicilina Vancomicina Ceftriaxona Imipenem Esparfloxacino
4,00 2,00 4,00 1,00 4,00
2,00 1,00 2,00 0,50 2,00
1.00 0,50 1,00 0,25 1,00
0,125 0,25 0,50 0,125 0,50
0,062 0,125 0,125 0,015 0,25
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Material y métodos 120
2.3.4. - Técnica.
2.3.4.1. - Material.
Empleamos, para cada inóculo bacteriano y cuatro
antimicrobianos, una placa de propileno rígido, estéril,
desechable y con tapa, de 4 x 6 pocillos, cada pocillo con
una capacidad máxima de dos mililitros (Pearson, 1980; Barry y
Lasner, 1979). Incubamos en estufa a 37ºC y en agitación*.
Para evitar el arrastre de antibiótico o cultivo bacteriano, en
cada transferencia utilizamos puntas estériles nuevas y
desechables (Barry, 1979)
Uso de placas. Se requiere una cantidad
considerable de antimicrobianos y medio para realizar la técnica
mediante filas de tubos. Por ello preferimos por su mejor
practicabilidad y menor requerimiento de material el uso de
placas de pocillos. Aunque los volúmenes empleados son
menores (2 mL), la información producida es básicamente
similar. Sin embargo existen al menos dos problemas
potenciales en la adaptación a placas, que no encontramos en
el test de tubos.
Evaporación. Debido a que el volumen de cada pocillo
es de 2000 •L, una pequeña evaporación puede originar un incremento significativo
de las concentraciones de los antimicrobianos que produzca una reducción de las CIM
o CBM. Esto puede prevenirse utilizando película plástica o etiquetas adhesivas, o
como en nuestro caso, utilizando placas con tapa que posee para cada pocillo un
reborde que ajusta evitando la evaporación y el paso de material de un pocillo a otro.
Electricidad superficial. La electricidad estática puede acumularse en las placas,
interfiriendo la disolución del antimicrobiano, o la floculación de las células bacterianas
en cuyo caso podría dar resultados falsos. Dado que los antimicrobianos añadimos los
antimicrobianos disueltos, y el medio estaba en agitación contínua, no creemos que
este problema influya significativamente.
* Agitador orbital regulable bioMerieux a 175 rpm dentro de la estufa a 37ºC.
Fig.22 Placa de cultivo 6x4 en
agitación e incubación aerobia a
37ºC.
Fig. 23 : Placa de cutivo
6x4 pocillos
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Material y métodos 121
2.3.4.2. - Desarrollo de la técnica.
1. - Preparación de los antimicrobianos.
(A). - Realizamos la predilución de la solución madre antibiótica 5120 µg/mL a
800 µg/mL.
(B). - A partir del 800 µg/mL en placa microtiter doblediluyendo con MHB-II,
obtenemos las prediluciones necesarias: 400; 200; 100; 50; 25; 12,5; etc. µg/mL
2. - Preparación del inóculo. En todos los pocillos pusimos 2000 µL del
inóculo [105 - 106 UFC/mL]:
3. - Añadimos 20 µL de las soluciones correspondientes a cada pocillo con
200 µL de medio (tiempo 0), lo que supone una dilución 1/100.
4. - Incubación de la placa: a 37ºC, en agitación y tapada.
2.3.4.3. - Lectura.
La lectura la realizamos mediante recuentos de las siembras. El volumen de
caldo subcultivado debe ser lo suficientemente grande para detectar poblaciones del
orden de 1x102 UFC/mL (0,01% del inóculo inicial 105 - 106), pero no tan grande que el
antibiótico transportado produzca resultados falsos negativos (Barry, 1979).
Periodicidad de la siembra: Hora 0: Recuento del inóculo inicial del pocillo
control. Horas 2, 4, 6, 8, 10 y 24: Recuento de cada pocillo con antibiótico y pocillo
control.
Técnica de la siembra:
(A). - Directamente de cada pocillo tomamos
con pipeta 10 µL que sembramos en gota sobre
una placa de agar-sangre (equivale a la
dilución 1/100), y sin cambiar la punta
ponemos otros 10µL en el primer pocillo de
la placa de diluciones decimales (placa
microtiter con 100µL de solución salina
estéril en cada pocillo). Incubamos
inmediatamente la placa con el cultivo en la estufa.
(B). - Diluciones 1/10. Con la pipeta multicanal, 8 veces: diluir 10µL en 100µL.
Sembramos gotas de 10µL de cada dilución, empezando por la más diluida (1x10-10),
en la mitad de una placa según el orden establecido (Figura 24).
10-3
10-4
10-5
10-6 10-8
10-9
10-7
10-10
Fig. 24: Disposición de siembra de lasgotas de 10 µL para recuento,
equivalencias de dilución
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Material y métodos 122
Dilución salina. Como normalmente la desarrollamos, en este método y en los
siguientes, usamos una placa de pocillos microtiter con 100µL de solución salina estéril
para realizar diluciones seriadas del inóculo, que después sembramos.
Lectura: Procedimos al recuento de viables, leyendo el inóculo
correspondiente a la mayor dilución que presentaba algún crecimiento, expresándolo
como UFC/mL, tras 24-48 horas de incubación a 37 ° C de las placas de agar
sangre.
Limitaciones y precauciones en el desarrollo de la técnica. Aunque las
diferencias significativas entre antimicrobianos o combinaciones de antimicrobianos
normalmente se definen como variaciones del orden de 10 a 100 veces el número
de UFC/mL (1-2 log) después de 4 a 24 horas de incubación (Craig y Gudmunsson, 1996). Si
esperamos que el recuento colonial sea muy bajo, conviene sembrar una alícuota de
la muestra sin diluir. Oviamente no podemos emplear la misma punta empleada para
tomar la muestra directa para las diluciones, debido al potencial arrastre de
microorganismos. Y en algunos casos, debemos comprobar que el arrastre del
antimicrobiano no es lo suficientemente grande para dar falsos resultados. Esto no
suele ser un problema cuando el recuento lo realizamos mediante diluciones
decimales de una pequeña muestra (10µL), donde a partir de las primeras
diluciones la cantidad de antimicrobiano resulta inapreciable. Es importante tener en
cuenta, que para aquellos antibióticos que han demostrado un efecto inóculo, las
concentraciones del antibiótico muy debajo de la CIM y con un inóculo normalizado,
pueden inhibir el crecimiento de las pocas colonias de las diluciones.
2.3.4.4. - Representación gráfica.
Representamos los resultados sirviéndonos del programa informático Excel
(Microsoft®) disponiendo en el eje de ordenadas la diferencia entre el logaritmo del
inóculo inicial y el logaritmo del recuento a tiempo t, y en el eje de abscisas el tiempo
en horas de incubación del cultivo en presencia del antimicrobiano.
Dada la general autólisis de las cepas a partir de las diez horas de incubación,
y por tanto la dificultad de valorar las curvas a partir de dicha hora, éstas solo hemos
representado los datos hasta las diez horas, para simplificar las gráficas.(Apéndice I)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 123
2.3.4.5. - Interpretación.
En la representación gráfica utilizada consideramos efecto bactericida la
muerte del 99,9% o más del inóculo inicial, lo que supone una caída de 3 o más
puntos del logaritmo para inóculos del orden de 106 UFC/mL (Barry, 1979; Pearson, 1980).
Tabla 16: Prediluciones y concentraciones del estudio
para los distintos antimicrobianos.
(A) Pre-Diluciones
(µg/mL)
Dilución 1/100: 20µLde (A) en 2000µL demedio.(µg/mL)
Penicilina Vancomicina Impenem Ceftriaxona Esparfloxacin
400 4,000 X X X
200 2,000 X X X X
100 1,000 X X X X X
50 0,500 X X X X
25 0,250 X X X
12.5 0,125 X X X X
6,25 0,062 X
3,12 0,031
1,56 0,015 X
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 124
2.4. - Efecto post-antibiótico (EPA).
La mayor parte de los estudios publicados (Neu, 1987; Cooper, 1990; Gudmundsson, 1991;
Davidson, 1991; Martín-Caminero, 1993; Fuursted, 1997), usan el método de dilución para la
eliminación del antimicrobiano. Un pequeño volumen del cultivo con antibiótico es
añadido a un gran volumen de medio sin antibiótico. Se pretende que la dilución sea
tan grande que la concentración del antibiótico no afecte el crecimiento del cultivo
control. Para concentraciones cercanas a la CIM, una dilución de 10-2 sería
suficiente; para concentraciones mayores suele necesitarse diluciones del orden de
10-3 a 10-4,. En nuestro estudio empleamos la dilución 10-3, mediante transferencias
con asas calibradas de 1 µL.
También es preciso partir de inóculos iniciales del microorganismo del al
menos 105 a 106 UFC/mL, ya que también es diluido en la misma extensión que la
droga. Sin embargo, con antimicrobianos de rápida acción bactericida, la dilución
puede reducir el número de recuentos viables por debajo del umbral detectable (Craig y
Gudmundsson, 1996).
2.4.1. - Preparación del inóculo.
Este proceso es semejante al descrito en el apartado 2.3.1. Lo repetimos
ajustado para elaborar el inóculo 2-3 x108 UFC/mL y a partir de éste realizamos los
inóculos de trabajo en Mueller-Hinton II + 5%LHB mediante dilución 1/10 (inóculo
alto) y dilución 1/100 (inóculo bajo), obteniéndose una concentración aproximada
de 5x107 y 5x105 UFC/mL respectivamente, que constituyeron los inóculos alto y
bajo utilizados.
2.4.2. - Cepas probadas.
Tabla 17: Cepas estudiadas de EPA.
Cepa nº CMIpenicilina (µg/mL) Categoría
(penicilina)
ATCC 49619 0,25 I
40532 0,25 I
4699 2,00 R
16109 2,00 R
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 125
2.4.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos.
Los antimicrobianos y concentraciones probados fueron los mismos, que en
las curvas de muerte descritas en el apartado 2.3.3.
2.4.4. - Técnica.
2.4.4.1. - Material.
El estudio del EPA lo realizamos como parte de una técnica múltiple en placa
de 6x4 para una cepa y un antibiótico por experiencia, de la que obtenemos: una
curva letal a inóculo alto en la primera columna, una curva letal a inóculo bajo en la
segunda columna, efecto post-antibiótico a tiempo de exposición de 1 hora en la
tercera columna y efecto post-antibiótico a tiempo de exposición de 2 horas en la
cuarta columna.
El preinóculo lo preparamos a partir de un cultivo nocturno, incubando 1 hora
para obtener la fase logarítmica temprana.
Usamos, para cada cepa y antimicrobiano, una placa de propileno rígido,
estéril, desechable, de 4 x 6 pocillos y con tapa, cada pocillo con una capacidad
máxima de dos mililitros. Incubamos en estufa a 37ºC y en agitación a 175 rpm.
2.4.4.2. - Desarrollo de la técnica.
2.4.4.2.1. - Preparación de los antimicrobianos.
(a). - Realizamos la predilución de la solución madre antibiótica 5120 µg/mL a
800 µg/mL.
(b). - A partir del 800 µg/mL en placa microtiter, doblediluyendo con MHB-II,
obtuvimos las prediluciones necesarias: 400; 200; 100; 50; 25; 12,5; etc. µg/mL
2.4.4.2.2. - Curvas de muerte.
1. - Preparación del inóculo para las curvas de letalidad.
(a). - En todos los pocillos de la primera columna pusimos 2000µL del inoculo
alto (106 - 107 UFC/mL). A partir de estos pocillos estudiamos el EPA.
(b). - En todos los pocillos de la segunda columna pusimos 2000µL del inoculo
bajo (105 - 106 UFC/mL).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 126
2. - Añadimos 20µL de las prediluciones del antibiótico para obtener las
concentraciones a estudiar, según el esquema del apartado 2.3.4.2.
3. - Incubación de la placa: a 37ºC, en agitación y tapada
2.4.4.2.3. - Efecto post-antibiótico tras 1 hora de exposición.
1. - Añadimos en los pocillos de la columna 3, 2000µL de MHB+5%LHB
2. -Transferimos con asa calibrada de 1µL, 2µL de cada pocillo de la columna
1, al pocillo con medio correspondiente de la columna 3.
2.4.4.2.4. - Efecto post-antibiótico tras 2 horas de exposición.
1. - Añadimos en los pocillos de la columna 4, 2000µL de MHB+5%LHB
2. -Transferimos con asa calibrada de 1µL, 2µL de cada pocillo de la columna
1, al pocillo con medio correspondiente de la columna 4.
2.4.4.3. - Lectura
Procedimos a la lectura mediante recuento de las siembras (UFC/mL),
realizadas con puntas estériles desechables.
Periodicidad de la siembra:
Curvas de muerte a las 0 (controles), 1, 2, 4, 6, 8, 10 y 24 horas
EPA cada hora:
EPA de 1 hora: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 24
EPA de 2 horas: _, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 24
Técnica de la siembra:
Es la misma descrita en el apartado de acción bactericida
Lectura: Procedimos a recuento de viables, expresándose como UFC/mL,
tras 24-48 horas de incubación a 37 ° C de las placas de agar sangre.
2.4.4.4. - Representación gráfica.
Representamos los resultados sirviéndonos del programa informático Excel
(Microsoft®) disponiendo en el eje de ordenadas el logaritmo del recuento a tiempo t,
y en el eje de abscisas el tiempo en horas de incubación del cultivo en presencia del
antimicrobiano.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 127
2.4.4.5. - Interpretación.
Después de la eliminación de la droga, se da un retraso del crecimiento que
persiste durante 1,4 a 1,6 horas. Ocasionalmente pueden apreciarse ligeras
disminuciones del recuento tras la fase estacionaria, y ello puede ser debido a un
error del recuento.
El gráfico de crecimiento del cultivo (Fig 19) representa la media de los
retrasos experimentados por las células individuales. Se ha demostrado una
variabilidad intercelular, encontrando que el EPA en células individuales puede variar
de 20 minutos hasta 3 horas (Craig y Gudmundsson, 1996)
A fin de soslayar los problemas mencionados, y suministrar un método
estándar para comparar diferentes metodologías y similares experimentos de
distintos días, se ha propuesto la siguiente ecuación para la cuantificación del EPA:
EPA = T + C
Donde T es el tiempo requerido para que el cultivo tratado aumente 1 log10
(10 veces) después de la eliminación de la droga, y C es el tiempo requerido para
que el cultivo control aumente 1 log10 después de la aplicación del mismo
procedimiento que al cultivo tratado. La razón para escoger un incremento de 1 log10
de las UFC/mL es que más allá de esta tasa, es igual el crecimiento para los
microorganismos tratados o no. Entonces lo realmente medido, sería el tiempo
necesario para reanudar la fase logarítmica de crecimiento.
2.5. - Combinación de antibióticos: acción bactericida.
En contraste con la técnica de tablero cruzado, que sólo proporciona datos de
inhibición del crecimiento, la técnica de curva de muerte mide la actividad bactericida
de la combinación. Por esta razón puede ser más apropiada para estudiar procesos
correspondientes a situaciones clínicas en las que es deseable una acción bactericida
(Barriere, 1984; Eliopoulos y Moellering, 1996).
Sin embargo, el recuento colonial repetido significa un tedioso y serio límite al
número de concentraciones y combinaciones testadas. Por ello es esencial que las
concentraciones ensayadas del antimicrobiano sean elegidas cuidadosamente a fin de
que sean representativas de las que realmente podemos conseguir in vivo en el lugar
de la infección. Las concentraciones ensayadas de cada antimicrobiano, normalmente
cubren el rango de 4 a 5 diluciones por debajo de la CMI, y dos veces por encima de la
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 128
CMI (o más sí esperamos un antagonismo), empleando doble diluciones de cada
antimicrobiano.
Este estudio de la acción bactericida para evaluar combinaciones de
antimicrobianos lo desarrollamos en placa 6x4, aunque utilizamos solamente 16
pocillos, testando las combinaciones posibles entre las concentraciones 4CMI, 1CMI
y ¼CMI de dos antimicrobianos frente a una cepa.
2.5.1. - Preparación del inóculo.
Este proceso es semejante al descrito en el apartado 2.3.1. Lo repetimos
reajustado para elaborar el inóculo 2-3 x108 UFC/mL, y a partir de éste realizamos la
dilución de trabajo en Mueller-Hinton II + 5%LHB mediante dilución 1/100,
obteniéndose una concentración aproximada de 5x105 UFC/mL, que constituyó el
inóculo utilizado.
2.5.2. - Cepas estudiadas.
Tabla 18: Cepas estudiadas en combinaciones de antimicrobianos.
Cepa nº CMIpenicilina
(µg/mL)
Categoría
(penicilina)
40532 0,25 I
19633 0,50 I
9036 1,00 I
ATCC® 49619 0,25 I
2461 1,00 I
52190 2,00 R
2150 2,00 R
4699 2,00 R
3923 2,00 R
9457 2,00 R
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Material y métodos 129
2.5.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos.
Probamos las combinaciones penicilina + vancomicina, penicilina +
fosfomicina, ceftriaxona + vancomicina y ceftriaxona + fosfomicina. En todas las
combinaciones cruzadas de las concentraciones 4 CMI, 1 CMI y ¼ CMI.
Tabla 19: Disposición en la placa de cultivo
de las combinaciones antimicrobianas (A+B).
4 CIM(a) 4 CIM(a) + ¼ CIM(b) 4 CIM(a) + 1 CIM(b) 4 CIM(a)+ 4 CIM(b)
1 CIM(a) 1 CIM(a) + ¼ CIM(b) 1 CIM(a) + 1 CIM(b) 1 CIM(a) + 4 CIM(b)
¼ CIM(a) ¼ CIM(a) + ¼ CIM(b) ¼ CIM(a) + 1 CIM(b) ¼ CIM(a) + 4 CIM(b)
Control sin antibiótico ¼ CIM(b) 1 CIM(b) 4 CIM(b)
Realizamos a partir de la solución madre, las prediluciones correspondientes
a las concentraciones necesarias.
2.5.4. - Técnica.
2.5.4.1. - Material.
Utilizamos como en las técnicas anteriores, para cada inóculo bacteriano y
una combinación, una placa de propileno rígido, estéril, desechable, de 4 x 6 pocillos
y con tapa, cada pocillo con una capacidad máxima de dos mililitros. Empleamos 4 x
4 pocillos, e incubamos en estufa a 37ºC y en agitación.
2.5.4.2. - Desarrollo de la técnica.
1. - Inoculación. En todos los pocillos ponemos 2000 µL del inóculo.
2. - Antibióticos. Añadimos el volumen necesario de las soluciones
correspondientes a cada pocillo con 2000 µL de medio inoculado (hora 0).
3. - Incubación de la placa: a 37ºC, en agitación (175 rpm) y tapada
2.5.4.3. - Lectura.
Realizada mediante recuentos de las siembras.
Periodicidad de las siembras.
Hora 0: Recuento del inóculo inicial del pocillo control sin antibiótico.
Recuentos de cada pocillo y pocillo control a las 2, 4, 6, 8 y 24 horas.
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Material y métodos 130
Técnica de la siembra.
Es la misma descrita para las otras técnicas en el apartado 2.3.2.3.
Lectura.
Procedimos a recuento de viables, expresándose como UFC/mL, tras 24-48
horas de incubación a 37 ° C de las placas de agar sangre.
2.5.4.4. - Representación gráfica.
Representamos los resultados sirviéndonos del programa informático Excel
(Microsoft®) disponiendo en el eje de ordenadas el logaritmo del recuento a tiempo t,
y en el eje de abscisas el tiempo en horas de incubación del cultivo en presencia del
antimicrobiano.
2.5.4.5. - Interpretación
En la representación gráfica utilizada, consideramos efecto sinérgico de la
combinación, una caída de 2 o más puntos del logaritmo para inóculos del orden de
5x105 UFC/mL
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 131
RESULTADOS
1. - Cepas bacterianas.
Las cepas seleccionadas fueron identificadas siguiendo pruebas clásicas para
neumococos, obteniéndose los siguientes porcentajes:
Tabla 20: Características microbiológicas de las cepas aisladas
Hemólisis en AS/CO2/37ºC 100 %
Sensibilidad a la optoquina 100 %
Lisis por bilis 100 %
Látex positivo 100 %
Las cepas las remitimos para su serotipado, al Laboratorio de referencia de
neumococos del Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III,
Majadahonda, Madrid, recogiéndose los resultados en la Tabla 21.
Tabla 21 : Serotipos de las cepas estudiadas
Cepa nº Serotipo
9679 35
3923 23F
2150 23F
52190 23F
40532 19
9457 14
9036 14
4699 9V
2461 9V
4477 7
16109 6B
12087 6B
19633 -
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 132
2. - Estudio de susceptibilidad a antimicrobianos
2.1. - Determinación de la concentración mínima inhibitoria
Las CIMs fueron determinadas por el método de microdilución descrito en el
apartado de material y métodos, recomendado por el National Committee For
Clinical Laboratory Standards 1997(NCCLS, 1997: M7-A4). Los datos se confrontaron, como
control de calidad-reproducibilidad, con las CIMs obtenidas por el método comercial
Etest®. Los resultados se expresan en la Tabla 22
Tabla 22: CIMs (µg/mL) de S. pneumoniae a penicilina, vancomicina, imipenem,
ceftriaxona, esparfloxacino y fosfomicina
Penicilina Vancomicina Imipenem Ceftriaxona Esparfloxacino Fosfom+G6P
cepa diluc. etest diluc. etest diluc. etest diluc. etest diluc. etest diluc. etest
ATCC 6303 0,063 0,016 0,125 0,125 0,016 0,002 0,016 0,008 0,031 0,125 16 16
ATCC 49619 0,250 0,190 0,250 0,190 0,063 0,064 0,032 0,032 0,125 0,500 16 16
19633 0,500 0,500 0,250 0,380 0,125 0,125 0,250 0,250 0,063 0,125 16 16
16109 2,000 1,500 0,500 0,750 0,500 0,250 1,000 0,750 0,031 0,125 32 48
40532 0,250 0,250 0,125 0,320 0,016 0,094 0,250 0,190 0,250 0,500 16 24
4699 2,000 3,000 0,500 0,750 0,250 0,500 1,000 1,500 0,125 0,250 32 64
4477 0,063 0,063 0,125 0,250 0,016 0,064 0,016 0,064 0,016 0,125 128 256
9679 0,016 0,063 0,125 0,063 0,016 0,006 0,016 0,006 0,125 0,250 64 48
3923 2,000 2,000 0,500 0,500 0,250 0,500 1,000 0,750 0,250 0,190 128 24
9457 2,000 2,000 0,250 0,750 0,250 0,500 1,000 0,750 0,031 0,125 64 32
12087 2,000 1,500 0,500 0,500 0,500 0,500 1,000 0,500 0,250 0,500 32 32
9036 1,000 0,750 0,500 0,750 0,125 0,500 0,500 0,500 0,125 0,250 64 32
2461 1,000 1,000 0,500 0,750 0,125 0,380 0,500 0,500 0,031 0,125 32 32
2150 2,000 3,000 0,500 0,750 0,500 0,750 2,000 1,500 0,016 0,125 32 16
52190 2,000 2,000 0,500 0,750 0,250 0,500 1,000 1,000 0,125 0,250 8 16
Notas: diluc. = microdilución en caldo. G6P = glucosa 6-fosfato
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 133
2.2. - Control de calidad
Las concentraciones de los antimicrobianos fueron verificadas con las cepas
control ATCC® 6303 y con la actualmente recomendada internacionalmente ATCC®
49619.
3. - Acción bactericida de los antimicrobianos solos:
3.1. - Comparativa del medio empleado. Autólisis
Valoramos el efecto del medio empleado en el desarrollo de las técnicas, y
puesto que se trata de técnicas que miden la variación de la población o cinética del
crecimiento, comparamos los resultados obtenidos sobre la cinética de crecimiento
de los cultivos control, con el medio brain heart infusion (BHI) sin sangre de
anteriores experiencias, y los obtenidos en la experiencia actual con MHB2+5%LHB.
Tabla 23: Variación media de los cultivos controles según el
medio de cultivo empleado
0 horas 10 horas 24 horas 10-24horas
Nº de Pruebas
Inóculo Medio
RecuentoMedio
Recuentomedio
�recuentomedio
%
(UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL)
BHI 53 2,4x105
1,5x108
4,2x107
-1,1x108 -28,0
MHB+LHB5% 40 9,0x105
1,0x1011
1,5x1010
-8,5x1010 -15,0
.- Recuento a las 24 horas menos el recuento a las 10 horas
.- Variación relativa (%) del recuento de 24 horas respecto al recuento de 10 horas
Los datos se presentan según intervalos clásicos de la curva de crecimiento
del neumococo correspondiendo el tramo de 0 a 10 horas a la fase de crecimiento
logarítmico, el tramo de 10 a 24 horas a la fase estacionaria y comienzo de los
procesos líticos,y el tramo de 0 a 24 horas al conjunto del proceso (Tabla 23).
En todas las cepas estudiadas, y especialmente unido a la concentración
bacteriana y al tiempo de incubación, se observa un marcado efecto de autólisis.
3.2. - Efecto de la variación del tamaño del inóculo
Estudiamos en cuatro cepas (Tabla 17) el efecto de la variación del tamaño
del inóculo empleado, en el desarrollo de las técnicas. Comparando los resultados
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 134
obtenidos con los antibióticos enfrentados a distintas concentraciones del inóculo.
Los resultados se muestran en las tablas 24 a 29, seleccionándose las 6 horas como
segmento representativo de la influencia que sobre la acción bactericida puede tener
la variación del inóculo en tamaño.
Tabla 24: Efecto bactericida de penicilina en inóculo alto (A) y bajo (B)
4 µg/mL 2 µg/mL 1 µg/mL 0,125 µg/mL 0,062 µg/mL
hr Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B
1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 2 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0
6 4 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0
8 4 2 0 2 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0
10 4 3 0 3 3 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0
24 4 4 0 4 4 0 3 3 0 2 2 0 2 2 0
Tabla 25: Efecto bactericida de ceftriaxona en inóculo alto (A) y bajo (B)
4 µg/mL 2 µg/mL 1 µg/mL 0,5 µg/mL 0,125 µg/mL
hr Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 2 1 1 2 0 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0
6 4 3 1 2 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0
8 4 3 1 3 3 0 1 2 -1 0 0 0 0 0 0
10 4 4 0 4 3 1 3 2 1 1 1 0 1 0 1
24 4 4 0 4 3 1 4 2 2 1 1 0 1 1 0
A = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo alto (107-108 UFC/mL )
B = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo bajo (105-106 UFC/mL)
A-B Diferencia: Nº cepas muertas en inóculo alto menos nº de cepas muertas en inóculo bajo.
Efecto inóculo: A-B < 0 (negativo)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 135
Tabla 26: Efecto bactericida de imipenem en inóculo alto (A) y bajo (B)
1 µg/mL 0,5 µg/mL 0,25 µg/mL 0,125 µg/mL 0,015 µg/mL
hr Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B
1 1 0 1 0 1 -1 1 0 1 0 0 0 0 0 0
2 3 3 0 2 3 -1 1 2 -1 1 1 0 1 0 1
4 3 3 0 2 3 -1 2 2 0 2 2 0 1 1 0
6 3 3 0 2 4 -2 3 3 0 3 2 1 1 1 0
8 3 4 -1 3 4 -1 3 3 0 3 2 1 1 1 0
10 4 4 0 3 4 -1 3 3 0 3 2 1 1 1 0
24 4 4 0 3 4 -1 3 3 0 3 2 1 1 1 0
Tabla 27: Efecto bactericida de vancomicina en inóculo alto (A) y bajo (B)
2 µg/mL 1 µg/mL 0,5 µg/mL 0,25 µg/mL 0,125 µg/mL
Hr Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B
1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 1 0 1 0 0 0
4 2 2 0 2 2 0 3 2 1 3 1 2 0 0 0
6 3 3 0 3 2 1 3 2 1 3 1 2 1 0 1
8 4 3 1 4 3 1 3 3 0 3 1 2 1 1 0
10 4 3 1 4 3 1 3 3 0 3 1 2 1 1 0
24 4 4 0 4 4 0 3 4 -1 4 2 2 2 1 1
A = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo alto (107-108 UFC/mL )
B = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo bajo (105-106 UFC/mL)
A-B Diferencia: Nº cepas muertas en inóculo alto menos nº de cepas muertas en inóculo bajo.
Efecto inóculo: A-B < 0 (negativo)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 136
Tabla 28: Efecto bactericida de esparfloxacino en inóculo alto (A) y bajo (B)
4 µg/mL 2 µg/mL 1 µg/mL 0,125 µg/mL 0,062 µg/mL
hr Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 2 1 1 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 4 4 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 4 4 0 4 4 0 2 2 0 1 1 0 0 0 0
10 4 4 0 4 4 0 2 2 0 2 2 0 0 0 0
24 4 4 0 4 4 0 3 3 0 2 2 0 0 0 0
A = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo alto (107-108 UFC/mL )
B = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo bajo (105-106 UFC/mL)
A-B Diferencia: Nº cepas muertas en inóculo alto menos nº de cepas muertas en inóculo bajo.
Efecto inóculo: A-B < 0 (negativo)
Tabla 29: Efecto del tamaño del inóculo
sobre la acción bactericida a las 6 horas
Penicilina µg/mL 4 2 1 0,125 0,062
A-B 1 0 0 0 0
Ceftriaxona µg/mL 4 2 1 0,5 0,125
A-B 1 0 0 0 0
Imipenem µg/mL 1 0,5 0,25 0,125 0,015
A-B 0 -2 0 1 0
Vancomicina µg/mL 2 1 0,5 0,25 0,125
A-B 0 1 1 2 0
Esparfloxacino µg/mL 4 2 1 0,5 0,25
A-B 0 0 0 0 0
A = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo alto (107-108 UFC/mL )
B = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo bajo (105-106 UFC/mL)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 137
3.3. - Acción bactericida de los antimicrobianos solos
Comparamos en cepas penicilina sensibles, intermedias y resistentes (Tabla
14), las tasas de muerte conseguidas, respecto al tiempo, con las diferentes
concentraciones de cada antimicrobiano. Para ello, a partir de los recuentos de
microorganismos viables (UFC/mL.), se elaboran las curvas de letalidad respectivas,
de las que se obtiene la tasa de muerte para un determinado tiempo y concentración
del antimicrobiano.
Representamos los resultados disponiendo en el eje de ordenadas la
diferencia entre el logaritmo del inóculo inicial y el logaritmo del recuento a tiempo t,
a fin de normalizar las pequeñas variaciones del inóculo inicial; y en el eje de
abscisas el tiempo en horas de incubación del cultivo en presencia del
antimicrobiano (Apéndice I: Curvas de letalidad).
Las tablas siguientes (Tablas 31 a 33) resumen de forma gráfica las distintas
tasas de muerte conseguidas a lo largo del tiempo con las diferentes
concentraciones de los antimicrobianos, descritas en los apartados 3.3.1. a 3.3.3.
Según la definición, establecida anteriormente en el apartado de Métodos,
para el efecto bactericida o simplemente muerte, consideramos efecto bactericida la
muerte del 99,9% o más del inóculo inicial, lo que supone una caída de 3 o más
puntos del logaritmo para inóculos del orden de 106 UFC/mL.
Los estudios mediante curvas de muerte, han permitido clasificar a los
antimicrobianos según la relación entre concentración y actividad bactericida, en dos
grandes grupos:
Antimicrobianos que muestran una actividad bactericida dependiente de la
conncentración y un efecto post-antibiótico prolongado. El objetivo farmacológico
con estos antimicrobianos es alcanzar la máxima concentración, estando su eficacia
correlacionada con el área bajo la curva (AUC o ABC) y los picos máximos en suero
(Cmax).
Antimicrobianos que muestran una actividad bactericida más dependiente
del tiempo de exposición que de la concentración, ya que tras alcanzar un máximo
efecto bactericida a 5-10 veces la CIM, presentan un patrón de saturación donde un
incremento de la concentración no supone mayor efecto bactericida (Bundtzen, 1981;
Gerber, 1993). Por encima de estas concentraciones, puede darse incluso en el caso de
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 138
la penicilina un efecto paradójico de descenso de la actividad (efecto Eagle). El
objetivo farmacológico con estos antimicrobianos es obtener y mantener
concentraciones por encima de la CIM90 el mayor tiempo posible
En nuestros trabajos, estudiamos la acción bactericida de varios
antimicrobianos del grupo de los ß-lactámicos, además de vancomicina y
fosfomicina, descritos como de baja dependencia de la concentración, y una
fluorquinolona, grupo descrito como concentración-dependiente: el esparfloxacino.
Las concentraciones ensayadas están dentro de las recomendadas
internacionalmente para pruebas de sensibilidad (NCCLS, 1997), y salvo esparfloxacino
(Tabla 30, pág 130), las medias de las concentraciones no superan 4 CIM. Por lo tanto en
todos los casos trabajamos con rangos donde el efecto bactericida es concentración-
dependiente (Tauber, 1984), lo que hay que tener en cuenta a la hora de comparar
resultados in vitro, mientras el carácter bactericida dependiente o no de la
concentración es el parámetro más importante para comparar resultados in vivo.
Tabla 30: Relación CIM/concentraciones ensayadas
Concentraciones probadas µg/mL CIM µg/mL
Rango Media (n=5) Rango Media (n=9)
Relación
CIM/conc.
Penicilina 4 - 0,062 1,44 2 - 0,016 0,96 1,55
Vancomicina 2 - 0,125 0,78 0,5 - 0,125 0,33 2,36
Ceftriaxona 4 - 0,125 1,53 1 - 0,016 0,48 3,20
Imipenem 1 - 0,015 0,38 0,5 - 0,016 0,16 2,40
Esparfloxacino 4 - 0,125 1,55 0,25 - 0,016 0,10 15,50
3.3.1. - Cepas sensibles a penicilina.
(CMI ≤ 0,06 µg/mL )
Efectos a las 2 horas
• Penicilina
• concentraciones supra CMI (≥≥≥≥ 0,12 µg/mL)
• Penicilina 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de 3 cepas
estudiadas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 139
• Penicilina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,12 µg/mL: alcanza la acción bactericida en
1 de 3 cepas estudiadas.
• concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 0,06 µg/mL)
• Penicilina 0,06 µg/mL: no alcanza la acción bactericida en ninguna cepa.
• Otros quimioterápicos
• Vancomicina 2 y 0,5 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
• Ceftriaxona 4 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3 cepas
estudiadas.
• Ceftriaxona 2 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 cepa.
• Imipenem 1 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3 cepas estudiadas.
• Imipenem 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 cepa.
• Esparfloxacino: no se alcanza la acción bactericida en ninguna de las
cepas estudiadas.
Efectos a las 4 horas
• Penicilina
• concentraciones supra CMI (≥≥≥≥ 0,12 µg/mL)
• Penicilina 4 µg/mL, 2 µg/mL y 1 µg/mL: alcanza la acción
bactericida en todas las cepas estudiadas.
• Penicilina 0,12 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3 cepas
• concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 0,06 µg/mL)
• Penicilina 0,06 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 cepa.
• Otros quimioterápicos
• Vancomicina a todas las concentraciones: obtiene la acción
bactericida en 1 de 3 cepas estudiadas.
• Ceftriaxona a 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción
bactericida en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Imipenem a 1; 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: logra la acción bactericida
en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Imipenem a 0,015 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 140
• Esparfloxacino a 4;2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2
de 3 cepas estudiadas.
• Esparfloxacino a 0,5 y 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en
1 de 3 cepas estudiadas.
Efectos a las 6 horas
• Penicilina
• concentraciones supra CMI (≥ 0,12 µg/mL)
• Penicilina 4 µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,12 µg/mL: consigue la
acción bactericida en todas las cepas.
• concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 0,06 µg/mL)
• Penicilina 0,06 µg/mL: consigue la acción bactericida en dos de las
cepas.
• Otros quimioterápicos
• Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción
bactericida en 2 de 3 cepas.
• Vancomicina 0,25 y 0,125 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1
de 3 cepas estudiadas.
• Ceftriaxona 4;2; 1;0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción bactericida
en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Imipenem 1; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,015 µg/mL: logra la acción
bactericida en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Esparfloxacino 4 µg/mL y 2 µg/mL: consigue la acción bactericida
en 3 de 3 cepas.
• Esparfloxacino 1 y 0,5 µg/mL: alcanzan acción bactericida en 2 de
3 cepas estudiadas.
• Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
Efectos a las 8 horas
• Penicilina
• concentraciones supra CMI (≥≥≥≥ 0,12 µg/mL)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 141
• Penicilina 4 µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,12 µg/mL: consigue la
acción bactericida en todas las cepas.
• concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 0,06 µg/mL)
• Penicilina 0,06 µg/mL: consigue la acción bactericida en dos de las
cepas.
• Otros quimioterápicos
• Vancomicina 2 µg/mL y 1 µg/mL: consigue la acción bactericida en
3 de 3 cepas.
• Vancomicina 0,5 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
• Vancomicina 0,25 y 0,125 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1
de 3 cepas estudiadas.
• Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción bactericida
en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Imipenem 1; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,015 µg/mL: logra la acción
bactericida en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Esparfloxacino 4 µg/mL, 2 µg/mL y 1 µg/mL: alcanza la acción
bactericida en 3 de 3 cepas estudiadas
• Esparfloxacino 0,5 y 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2
de 3 cepas estudiadas.
Efectos a las 10 horas
• Penicilina
• concentraciones supra CMI (≥≥≥≥ 0,12 µg/mL)
• Penicilina 4 µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,12 µg/mL: consigue la
acción bactericida en todas las cepas.
• Penicilina 0,06 µg/mL: consigue la acción bactericida en dos de las
cepas.
• Otros quimioterápicos
• Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL : consigue la acción bactericida en
3 de 3 cepas.
• Vancomicina 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: obtiene la acción bactericida
en 2 de 3 cepas estudiadas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 142
• Ceftriaxona 4;2; 1;0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción bactericida
en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Imipenem 1; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,015 µg/mL: logra la acción
bactericida en 3 de 3 cepas estudiadas.
• Esparfloxacino a todas las concentraciones: consigue la acción
bactericida en 3 de 3 cepas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 143
Tabla 31: Tasas de muerte (% del inóculo). Cepas sensibles a penicilina
Tiempo 2 horas 4 horas 6 horas 8 horas 10 horas 24 horas
Tasa de muerte (% del inóculo) / número de cepasAntimicrobianos
µg/mL90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9%
Penicilina (CIM pen = 0,046 µg/mL)
4 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
2 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
1 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,1 1 0 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,062 0 0 0 0 1 1 0 0 2 0 0 2 0 0 2 0 0 2
Vancomicina (CIM van = 0,167 µg/mL)
2 1 0 1 1 0 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3
1 1 1 0 1 1 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 0 0 1 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2
0,25 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 2 0 0 2
0,125 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 2 0 0 2
Ceftriaxona (CIM ctr = 0,021 µg/mL)
4 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
2 2 0 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
1 1 1 0 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 1 1 0 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,125 0 2 0 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
Imipenem (CIM imp = 0,032 µg/mL)
1 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 1 1 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,25 1 1 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,125 2 0 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,015 1 1 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
Esparfloxacino (CIM esp = 0,052 µg/mL)
4 2 0 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
2 2 0 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
1 3 0 0 0 1 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 1 0 0 1 1 1 0 1 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3
0,25 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3
Nota: los sombreados representan la tasa de muerte bactericida (99,9%) correspondiente a tiempo marcado
en la columna. Tasas de muerte: -1 log10 = muerte del 90% del inóculo; -2 log10 = muerte del 99% del inóculo; -3 log10 =
muerte del 99,9% del inóculo.
CIM x = Concentración inhibitoria mínima media (µg/mL) del antimicrobiano x
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Resultados 144
3.3.2. - Cepas con resistencia intermedia a penicilina
(CIM 0,12 - 1 µg/mL)
Efectos a las 2 horas
♦ Penicilina
♦ concentraciones supra CMI (≥≥≥≥ 2 µg/mL )
♦ Penicilina 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
♦ concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 1 µg/mL)
♦ Penicilina 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción bactericida
en ninguna cepa.
♦ Otros quimioterápicos
♦ Vancomicina 2 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: no logra alcanzar la acción
bactericida en ninguna de las cepas estudiadas.
♦ Imipenem 1; 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
♦ Imipenem 0,015 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Esparfloxacino no alcanza la acción bactericida en ninguna de las
cepas estudiadas.
Efectos a las 4 horas
♦ Penicilina
♦ concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 2 µg/mL )
♦ Penicilina 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 1 µg/mL)
♦ Penicilina 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción bactericida
en ninguna cepa.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 145
♦ Otros antimicrobianos
♦ Vancomicina 2 µg/mL y 1 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1
de 3 cepas estudiadas.
♦ Vancomicina 0,25 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 1y 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida 1 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Imipenem 1 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Imipenem 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3
cepas.
♦ Esparfloxacino 4 µg/mL: a alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
Efectos a las 6 horas
♦ Penicilina
♦ concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 2 µg/mL )
♦ Penicilina 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 1 µg/mL)
♦ Penicilina 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción bactericida
en ninguna cepa.
♦ Otros antimicrobianos
♦ Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción
bactericida en 2 de 3 cepas.
♦ Vancomicina 0,25 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida 1 de 3 cepas
estudiadas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 146
♦ Imipenem 1; 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3
cepas estudiadas.
♦ Imipenem 0,125 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Esparfloxacino 4 µg/mL: consigue la acción bactericida en 3 de 3
cepas.
♦ Esparfloxacino 2 y 1 µg/mL: alcanzan acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
Efectos a las 8 horas
♦ Penicilina
♦ concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 2 µg/mL )
♦ Penicilina 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 1 µg/mL)
♦ Penicilina 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción bactericida
en ninguna cepa.
♦ Otros antimicrobianos
♦ Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción
bactericida en 2 de 3 cepas.
♦ Vancomicina 0,25 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida 1 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Imipenem 1; 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3
cepas estudiadas.
♦ Imipenem 0,125 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Esparfloxacino 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de
3 cepas estudiadas
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 147
♦ Esparfloxacino 0,5 y 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2
de 3 cepas estudiadas.
Efectos a las 10 horas
♦ Penicilina
♦ concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 2 µg/mL )
♦ Penicilina 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 1 µg/mL)
♦ Penicilina 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en dos cepas.
♦ Otros antimicrobianos
♦ Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción
bactericida en 2 de 3 cepas.
♦ Vancomicina 0,25 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
♦ Ceftriaxona 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida 1 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Imipenem 1; 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3
cepas estudiadas.
♦ Imipenem 0,125 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
♦ Esparfloxacino 4; 2; 1 y 0,5 µg/mL: alcanza la acción bactericida en
3 de 3 cepas estudiadas
♦ Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 148
Tabla 32: Tasas de muerte (% del inóculo). Cepas con resistencia intermedia a penicilina
Tiempo 2 horas 4 horas 6 horas 8 horas 10 horas 24 horas
Tasa de muerte (% del inóculo) / número de cepasAntimicrobianos
µg/mL90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9%
Penicilina (CIM pen = 0,833 µg/mL)
4 0 1 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3
2 0 1 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3
1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 2 0 1 0
0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,062 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Vancomicina (CIM van = 0,417 µg/mL)
2 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 3
1 0 2 0 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 3
0,5 1 2 0 0 2 0 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 2
0,25 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ceftriaxona (CIM ctr = 0,417 µg/mL)
4 0 2 0 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 3
2 0 2 0 0 0 2 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3
1 0 2 0 0 1 1 1 0 2 1 0 2 1 1 1 0 1 2
0,5 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1
0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Imipenem (CIM imp = 0,125 µg/mL)
1 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 0 2 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,25 0 2 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,125 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
0,015 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Esparfloxacino (CIM esp = 0,073 µg/mL)
4 2 0 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
2 1 0 0 0 3 0 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3
1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3
0,25 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 2 1 0 2 1 0 2
Nota: los sombreados representan la tasa de muerte bactericida (99,9%) correspondiente a tiempo marcado
en la columna. Tasas de muerte: -1 log10 = muerte del 90% del inóculo; -2 log10 = muerte del 99% del inóculo; -3 log10 =
muerte del 99,9% del inóculo.
CIM x = Concentración inhibitoria mínima media (µg/mL) del antimicrobiano x
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 149
3.3.3. - Cepas penicilina resistentes
(CIM � 2 µg/mL)
Efectos a las 2 horas
Penicilina
concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 4 µg/mL )
Penicilina 4 µg/mL: no logra alcanzar la acción bactericida en
ninguna cepa.
concentraciones CMI y sub CMI (≤≤≤≤ 2 µg/mL)
Penicilina 2; 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción
bactericida en ninguna cepa.
Otros antimicrobianos
Vancomicina 2; 1; 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: no obtiene la acción
bactericida en ninguna de las cepas estudiadas.
Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: no logra alcanzar la acción
bactericida en ninguna de las cepas estudiadas.
Imipenem 1; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,015 µg/mL: no logra la acción
bactericida en ninguna de las cepas estudiadas.
Esparfloxacino: No se alcanza la acción bactericida en ninguna de
las cepas estudiadas.
Efectos a las 4 horas
Penicilina
concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 4 µg/mL )
Penicilina 4 µg/mL: no logra alcanzar la acción bactericida en
ninguna cepa.
concentraciones CMI y sub CMI (≤≤≤≤ 2 µg/mL)
Penicilina 2; 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción
bactericida en ninguna cepa.
Otros antimicrobianos
Vancomicina 2; 1; 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: no obtiene la acción
bactericida en ninguna de las cepas estudiadas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 150
Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: no logra alcanzar la acción
bactericida en ninguna de las cepas estudiadas.
Imipenem 1; 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
Esparfloxacino 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
Efectos a las 6 horas
Penicilina
concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 4 µg/mL )
Penicilina 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3 cepas
estudiadas.
concentraciones CMI y sub CMI (≤≤≤≤ 2 µg/mL)
Penicilina 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
Otros antimicrobianos
Vancomicina 2; 1 y 0,5 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de
3 cepas estudiadas.
Ceftriaxona 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
Imipenem 1y 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3 cepas
estudiadas.
Imipenem 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
Esparfloxacino 4; 2 y 1 µg/mL: consigue la acción bactericida en 2
de 3 cepas.
Esparfloxacino 0,5 µg/mL: alcanzan acción bactericida en 1 de 3
cepas estudiadas.
Efectos a las 8 horas
Penicilina
concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 4 µg/mL )
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 151
Penicilina 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3 cepas
estudiadas.
concentraciones CMI y sub CMI (≤≤≤≤ 2 µg/mL)
Penicilina 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
Otros antimicrobianos
Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción
bactericida en 3 de 3 cepas.
Ceftriaxona 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
Imipenem 1y 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3 cepas
estudiadas.
Imipenem 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
Esparfloxacino 4; 2; 1 y 0,5 µg/mL: alcanza la acción bactericida en
2 de 3 cepas estudiadas
Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1de
3 cepas estudiadas.
Efectos a las 10 horas
Penicilina
concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 4 µg/mL )
Penicilina 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de 3 cepas
estudiadas.
concentraciones CMI y sub CMI (≤≤≤≤ 2 µg/mL)
Penicilina 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3 cepas.
Otros antimicrobianos
Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción
bactericida en 3 de 3 cepas.
Ceftriaxona 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de 3
cepas estudiadas.
Imipenem 1y 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3 cepas
estudiadas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 152
Imipenem 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3 cepas
estudiadas.
Esparfloxacino 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de
3 cepas estudiadas
Esparfloxacino 0,5 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3
cepas estudiadas.
Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1de 3
cepas estudiadas
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 153
Tabla 33: Tasas de muerte (% del inóculo). Cepas con alta resistencia a
penicilina
Tiempo 2 horas 4 horas 6 horas 8 horas 10 horas 24 horas
Tasa de muerte (% del inóculo) / número de cepasAntimicrobianos
µg/mL90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9%
Penicilina (CIM pen = 2,000 µg/mL)
4 1 0 0 1 2 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3
2 0 0 0 2 0 0 2 0 1 1 1 1 0 1 2 0 0 3
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,062 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Vancomicina (CIM van = 0,417 µg/mL)
2 0 0 0 1 2 0 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3
1 0 0 0 1 2 0 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 1 0 0 1 2 0 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ceftriaxona (CIM ctr = 1,000 µg/mL)
4 0 0 0 1 1 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3
2 0 0 0 1 1 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 2
0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Imipenem (CIM imp = 0,334 µg/mL)
1 2 1 0 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,5 1 1 0 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3
0,25 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 2
0,125 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,015 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Esparfloxacino (CIM esp = 0,177 µg/mL)
4 2 1 0 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3
2 3 0 0 1 2 0 1 0 2 1 0 2 0 0 3 0 0 3
1 0 0 0 0 2 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3
0,5 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 2 0 1 2 0 0 3
0,25 0 0 0 2 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Nota: los sombreados representan la tasa de muerte bactericida (99,9%) correspondiente a tiempo marcado
en la columna. Tasas de muerte: -1 log10 = muerte del 90% del inóculo; -2 log10 = muerte del 99% del inóculo; -3 log10 =
muerte del 99,9% del inóculo.
CIM x = Concentración inhibitoria mínima media (µg/mL) del antimicrobiano x
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 154
3.4. - Efecto post-antibiótico
La obtención de resultados mediante gráficos se ilustra con algunos ejemplos
en el Apéndice II.
Presentamos en las tablas 34 a 43 los resultados de la influencia de la
concentración, y del tiempo de exposición al antimicrobiano sobre el efecto post-
antibiótico, con penicilina, ceftriaxona, imipenem, vancomicina y esparfloxacino a
cinco concentraciones diferentes en cuatro cepas de S. pneumoniae con resistencia
intermedia y alta a penicilina.
Tabla 34: Penicilina. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora
Concentración de
Penicilina (µg/mL)
CIM Pen
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,062 0,25 0,0 1,0 0,1
0,062 0,25 0,0 1,0 0,1
0,125 0,25 0,0 1,0 0,1
0,125 0,25 0,7 1,0 0,1
1 0,25 0,0 1,0 1,0
1 0,25 2,9 1,0 1,0
2 0,25 1,0 1,0 2,0
2 0,25 2,4 1,0 2,0
4 0,25 3,0 1,0 4,0
4 0,25 4,0 1,0 4,0
0,062 2,00 0,0 1,0 0,1
0,062 2,00 0,0 1,0 0,1
0,125 2,00 0,0 1,0 0,1
0,125 2,00 0,0 1,0 0,1
1 2,00 0,0 1,0 1,0
1 2,00 0,0 1,0 1,0
2 2,00 0,0 1,0 2,0
2 2,00 0,0 1,0 2,0
4 2,00 0,2 1,0 4,0
4 2,00 0,7 1,0 4,0
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 155
Tabla 35: Penicilina. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 2 horas
Concentración de
Penicilina (µg/mL)
CIM Pen
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,062 0,25 0,0 2,0 0,1
0,062 0,25 0,0 2,0 0,1
0,125 0,25 0,0 2,0 0,3
0,125 0,25 1,4 2,0 0,3
1 0,25 5,5 2,0 2,0
2 0,25 5,7 2,0 4,0
4 0,25 6,1 2,0 8,0
0,062 2,00 0,0 2,0 0,1
0,062 2,00 0,0 2,0 0,1
0,125 2,00 0,0 2,0 0,3
0,125 2,00 0,0 2,0 0,3
1 2,00 0,0 2,0 2,0
1 2,00 0,0 2,0 2,0
2 2,00 0,0 2,0 4,0
2 2,00 0,0 2,0 4,0
4 2,00 1,7 2,0 8,0
4 2,00 3,5 2,0 8,0
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 156
Tabla 36: Ceftriaxona. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora
Concentración de
Ceftriaxona (µg/mL)
CIM Ctr
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,125 0,032-0,25 0,0 1,0 0,1
0,125 0,032-0,25 0,2 1,0 0,1
0,5 0,032-0,25 0,3 1,0 0,5
0,5 0,032-0,25 0,7 1,0 0,5
1 0,032-0,25 0,7 1,0 1,0
1 0,032-0,25 0,7 1,0 1,0
2 0,032-0,25 1,2 1,0 2,0
2 0,032-0,25 1,7 1,0 2,0
4 0,032-0,25 0,5 1,0 4,0
4 0,032-0,25 1,7 1,0 4,0
0,125 1,00 0,0 1,0 0,1
0,125 1,00 0,0 1,0 0,1
0,5 1,00 0,0 1,0 0,5
0,5 1,00 0,0 1,0 0,5
1 1,00 0,8 1,0 1,0
1 1,00 0,9 1,0 1,0
2 1,00 1,0 1,0 2,0
2 1,00 1,5 1,0 2,0
4 1,00 1,5 1,0 4,0
4 1,00 1,6 1,0 4,0
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 157
Tabla 37: Ceftriaxona. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora
Concentración de
Ceftriaxona (µg/mL)
CIM Ctr
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,125 0,032-0,25 0,0 2,0 0,3
0,125 0,032-0,25 0,5 2,0 0,3
0,5 0,032-0,25 0,0 2,0 1,0
0,5 0,032-0,25 0,8 2,0 1,0
1 0,032-0,25 0,8 2,0 2,0
1 0,032-0,25 0,9 2,0 2,0
2 0,032-0,25 1,0 2,0 4,0
2 0,032-0,25 1,9 2,0 4,0
4 0,032-0,25 3,0 2,0 8,0
4 0,032-0,25 4,1 2,0 8,0
0,125 1,00 0,0 2,0 0,3
0,125 1,00 0,0 2,0 0,3
0,5 1,00 0,0 2,0 1,0
0,5 1,00 0,3 2,0 1,0
1 1,00 0,1 2,0 2,0
1 1,00 0,3 2,0 2,0
2 1,00 0,3 2,0 4,0
2 1,00 1,7 2,0 4,0
4 1,00 2,0 2,0 8,0
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 158
Tabla 38: Imipenem. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora
Concentración de
Imipenem (µg/mL)
CIM Imp
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr
ABC
(µg hr/mL)
0,015 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,015 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,015 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,125 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,125 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,125 0,016 - 0,5 0,9 1 0,1125
0,25 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,25 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,25 0,016 - 0,5 1,1 1 0,275
0,5 0,016 - 0,5 0,0 1 0
0,5 0,016 - 0,5 1,7 1 0,85
0,5 0,016 - 0,5 2,0 1 1
1 0,016 - 0,5 0,9 1 0,9
1 0,016 - 0,5 1,7 1 1,7
1 0,016 - 0,5 2,4 1 2,4
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 159
Tabla 39: Imipenem. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 2 horas
Concentración de
Imipenem (µg/mL)
CIM Imp
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,015 0,016 - 0,5 0,0 2 0
0,015 0,016 - 0,5 0,0 2 0
0,015 0,016 - 0,5 0,0 2 0
0,125 0,016 - 0,5 0,0 2 0
0,125 0,016 - 0,5 0,9 2 0,1125
0,125 0,016 - 0,5 1,5 2 0,1875
0,25 0,016 - 0,5 0,0 2 0
0,25 0,016 - 0,5 2,2 2 0,55
0,5 0,016 - 0,5 0,0 2 0
0,5 0,016 - 0,5 2,5 2 1,25
1 0,016 - 0,5 2,5 2 2,5
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 160
Tabla 40: Vancomicina. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora
Concentración de
Vancomicina (µg/mL)
CIM Van
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,125 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,125
0,125 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,125
0,125 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,125
0,125 0,125 - 0,5 0,6 1,0 0,125
0,25 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,25
0,25 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,25
0,25 0,125 - 0,5 1,3 1,0 0,25
0,5 0,125 - 0,5 0,2 1,0 0,5
0,5 0,125 - 0,5 0,3 1,0 0,5
0,5 0,125 - 0,5 1,6 1,0 0,5
1 0,125 - 0,5 0,4 1,0 1
1 0,125 - 0,5 1,6 1,0 1
1 0,125 - 0,5 2,0 1,0 1
2 0,125 - 0,5 0,7 1,0 2
2 0,125 - 0,5 1,8 1,0 2
2 0,125 - 0,5 2,0 1,0 2
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 161
Tabla 41: Vancomicina. Efecto post-antibiótico.
Tiempo de exposición 2 horas.
Concentración de
Vancomicina (µg/mL)
CIM Van
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,125 0,125 - 0,5 0,0 2 0,25
0,125 0,125 - 0,5 0,0 2 0,25
0,125 0,125 - 0,5 0,5 2 0,25
0,125 0,125 - 0,5 1,5 2 0,25
0,25 0,125 - 0,5 0,2 2 0,5
0,25 0,125 - 0,5 1,6 2 0,5
0,5 0,125 - 0,5 2,0 2 1
1 0,125 - 0,5 2,2 2 2
2 0,125 - 0,5 2,8 2 4
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 162
Tabla 42: Esparfloxacino. Efecto post-antibiótico.
Tiempo de exposición 1 hora.
Concentración de
Esparfloxacino (µg/mL)
CIM esp
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,25 0,031 - 0,25 0,0 1,0 0,25
0,25 0,031 - 0,25 0,0 1,0 0,25
0,25 0,031 - 0,25 0,1 1,0 0,25
0,25 0,031 - 0,25 0,3 1,0 0,25
0,5 0,031 - 0,25 0,1 1,0 0,5
0,5 0,031 - 0,25 0,4 1,0 0,5
0,5 0,031 - 0,25 0,9 1,0 0,5
0,5 0,031 - 0,25 1,0 1,0 0,5
1 0,031 - 0,25 0,4 1,0 1
1 0,031 - 0,25 0,4 1,0 1
1 0,031 - 0,25 0,9 1,0 1
1 0,031 - 0,25 1,1 1,0 1
2 0,031 - 0,25 1,0 1,0 2
2 0,031 - 0,25 1,3 1,0 2
2 0,031 - 0,25 1,3 1,0 2
2 0,031 - 0,25 1,3 1,0 2
4 0,031 - 0,25 0,8 1,0 4
4 0,031 - 0,25 1,0 1,0 4
4 0,031 - 0,25 1,2 1,0 4
4 0,031 - 0,25 2,0 1,0 4
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 163
Tabla 43: Esparfloxacino. Efecto post-antibiótico.
Tiempo de exposición 2 horas.
Concentración de
Esparfloxacino (µg/mL)
CIM esp
(µg/mL)
EPA
(hr)
Tiempo de
Exposición (hr)
ABC
(µg hr/mL)
0,25 0,031 - 0,25 0,4 2,0 0,5
0,25 0,031 - 0,25 0,6 2,0 0,5
0,25 0,031 - 0,25 1,1 2,0 0,5
0,5 0,031 - 0,25 0,4 2,0 1
0,5 0,031 - 0,25 0,9 2,0 1
0,5 0,031 - 0,25 1,0 2,0 1
0,5 0,031 - 0,25 1,0 2,0 1
1 0,031 - 0,25 0,9 2,0 2
1 0,031 - 0,25 1,1 2,0 2
1 0,031 - 0,25 1,2 2,0 2
1 0,031 - 0,25 2,4 2,0 2
2 0,031 - 0,25 1,4 2,0 4
2 0,031 - 0,25 1,8 2,0 4
2 0,031 - 0,25 2,5 2,0 4
2 0,031 - 0,25 3,0 2,0 4
4 0,031 - 0,25 1,4 2,0 8
4 0,031 - 0,25 2,3 2,0 8
4 0,031 - 0,25 2,5 2,0 8
4 0,031 - 0,25 3,0 2,0 8
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 164
Las concentraciones a las que se ha ensayado el EPA, son las mismas que
las recomendadas para las pruebas bactericidas (NCCLS, 1997), en un rango próximo a la
CIM del microorganismo, y suelen ser, en la mayoría de los casos, las que se
alcanzan en suero o líquidos orgánicos después de una dosis habitual del
antimicrobiano.
Hay que tener en cuenta que, si la concentración ensayada es muy alta, se
produce mucha letalidad y el EPA es difícil de medir, especialmente en los
antimicrobianos rápidamente bactericidas como imipenem o vancomicina a las
concentraciones empleadas.
Por el contrario si las concentraciones ensayadas son excesivamente bajas,
por debajo de la CIM, tampoco se consigue demostrar EPA con la técnica de
recuento de viables.
Por ambas razones sólo se ha podido determinar EPAs tras 1 hora en
imipenem y vancomicina, en 15/25 y 16/25 casos, y EPAs tras 2 horas en 11/25 y
9/25 casos respectivamente.
3.4.1. - Influencia de la concentración y el tiempo de exposición
Los EPAs medios conseguidos, tras un tiempo de exposición de 1 hora (Tabla
44), con los distintos antimicrobianos, son muy semejantes: 0,75; 0,75; 0,72; 0,78 y
0,78 horas.
Tabla 44: Efecto post-antibiótico: Resultados medios tras
exposición de 1 hora
Antimicrobianos(casos)
CIMs
(µg/mL)
Concentración
(µg/mL)
Conc/ CIM
EPA
(1hr)
ABC
(µg*hr/mL)
Penicilina (20) 1,13 1,44 1,27 0,75 1,44
Ceftriaxona (20) 0,57 1,53 2,68 0,75 0,32
Imipenem (15) 0,29 0,38 1,31 0,72 0,38
Vancomicina (16) 0,40 0,73 1,82 0,78 0,30
Esparfloxacino(20) 0,13 1,55 11,92 0,78 1,55
Los EPAs medios conseguidos tras 2 horas de exposición (Tabla 45): 1,40;
0,93; 0,87; 1,20 y 1,46 son superiores y también presentan mayores diferencias
entre ellos.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 165
Tabla 45: Resultados medios tras exposición de 2 horas:
Antimicrobianos
(casos)
CIMs
(µg/mL)
Concentración
(µg/mL)
Conc
/ CIM
EPA
(2hr)
ABC
(µg*hr/mL)
Penicilina (17) 1,28 1,28 1,00 1,40 2,56
Ceftriaxona (19) 0,54 1,39 2,57 0,93 2,79
Imipenem (11) 0,24 0,27 1,13 0,87 0,53
Vancomicina (9) 0,43 0,50 1,16 1,20 0,24
Esparfloxacino (20) 0,13 1,55 11,92 1,46 3,1
El incremento del EPA en el rango de tiempo estudiado es mínimo para
imipenem, y máximo para penicilina y esparfloxacino (Tabla 46)
Tabla 46: Influencia del tiempo: comparación de los EPAs medios
Antimicrobianos EPA (1hr) EPA (2hr) ∆EPA (%)
Penicilina 0,75 1,40 0,65 (87%)
Ceftriaxona 0,75 0,93 0,18 (24%)
Imipenem 0,72 0,87 0,15 (21%)
Vancomicina 0,78 1,20 0,42 (54%)
Esparfloxacino 0,78 1,46 0,68 (87%)
El producto de la concentración por el tiempo de exposición equivale al la
cantidad de antimicrobiano disponible en un período, posee las mismas dimensiones
(Masa*Tiempo/Volumen = µg*hr/mL) que las curvas farmacocinéticas ABC (área
bajo la curva) con las que puede ser comparado.
Los resultados medios del producto de la concentración por el tiempo de
exposición (Tablas 44 y 45) o ABCs conseguidas in vitro, tras un tiempo de
exposición de 1 hora, con los distintos antimicrobianos, son 1,44; 0,32; 0,38; 0,30 y
1,55 horas, mientras que los obtenidos tras 2 horas de exposición suelen ser
mayores: 2,56; 2,79; 0,53; 0,24 y 3,1 horas
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 166
4. - Acción bactericida de los antimicrobianos en asociación
Los resultados medios obtenidos se exponen en las tablas 47 a 50 y se
representan en los gráficos del Apéndice III.
Al presente no se han establecido criterios para evaluar los resultados sobre
sinergismo obtenidos, con la técnica de curva de muerte, usando dos o mas drogas
con actividad antibacteriana por si solas. La eficiencia de la combinación suele ser
definida en función del antimicrobiano mas eficaz, esto es la diferencia entre el efecto
de la combinación menos el efecto del antimicrobiano más activo (Chavanet, 1998).
Además de los elementos que influyen generalmente sobre la acción
antimicrobiana, en las combinaciones son factores importantes los tipos de
antimicrobianos asociados, especialmente en cuanto a similitudes o diferencias,
cualitativas y cuantitativas, de sus mecanismos de acción, en el mismo punto o en
puntos distintos de la misma o distintas vías metabólicas, resultando una acción
predominantemente bactericida o bacterioestática, así como la concentración y las
proporciones.
4.1. - Efectividad de las asociaciones
Para inóculos del orden de 106 UFC/mL diferenciamos:
Sinergia, la definimos como un aumento en la tasa de muerte igual o mayor de
100 veces (≥2 log10), producida por la combinación respecto a la producida por el
más activo de los antimicrobianos.
Aditividad o sinergismo parcial lo definimos como un aumento en el rango de
100 a 10 (2 - 1 log10) veces en la tasa de muerte de la combinación, sobre la droga
más activa.
Indiferencia se define como cambios de ± 10 veces (± 1 log10) en la tasa de
muerte con la combinación, sobre la droga más activa.
Disminución o antagonismo parcial lo definimos como una disminución en el
rango de 100 a 10 (2 - 1 log10) veces de la tasa de muerte con la combinación, sobre la
droga más activa.
Antagonismo se define como un descenso ≥100 veces (≥2 log10), de la tasa de
muerte de la combinación sobre la droga más activa.
La fórmula empleada es: ∆∆∆∆neto = C - A
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 167
Eficacia de la combinación (-∆∆∆∆ Log10 (UFC/mL) o C
Eficacia del antimicrobiano más activo (-∆∆∆∆ log10 (UFC/mL) o A
4.2. - Efectividad de las proporciones
Para poder comparar la eficacia intrínseca de las distintas proporciones,
dentro de una combinación de antimicrobianos, es necesario considerar los
resultados en términos relativos, a fin de oviar la influencia de la concentración.
Si consideramos la eficacia del antimicrobiano más activo como el 100% (A = -
∆∆∆∆ log10 (UFC/mL) = 100%); la eficacia de la combinación C en términos relativos
sería:
C% =(C/A)x100
Y el incremento de la eficacia de la combinación respecto al antimicrobiano
más activo sería:
∆∆∆∆% = C% - A% = [(Cx100/A)-100] = [100x(C-A)/A]
Fig. 26: Definición gráfica de la interacción antimicrobiana
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 168
Tabla 47: Penicilina + Vancomicina. (CIM).
Resultados medios (log10(UFC/mL)). (n = 10)
Tiempo (hr) 0 2 4 6 8
4Pen+4Van 5,41 4,65 3,53 3,12 2,26
4Pen 5,41 5,02 4,21 3,21 3,01
4Van 5,41 4,89 4,15 3,53 2,97
∆% 0,0% 4,9% 14,9% 3,0% 23,8%
∆ neto 0,0 0,2 0,6 0,1 0,7
4Pen+Van 5,41 4,97 4,20 3,24 2,15
4Pen 5,41 5,02 4,21 3,21 3,01
Van 5,41 5,19 4,79 4,36 3,88
∆% 0,0% 0,9% 0,3% -0,9% 28,7%
∆ neto 0,0 0,0 0,0 0,0 0,9
4Pen+Van/4 5,41 4,91 4,35 3,49 2,69
4Pen 5,41 5,02 4,21 3,21 3,01
Van/4 5,41 5,72 6,20 6,99 7,97
∆% 0,0% 2,1% -3,2% -8,8% 10,5%
∆ neto 0,0 0,1 -0,1 -0,3 0,3
Pen+4Van 5,41 4,71 4,09 3,09 2,42
Pen 5,41 5,52 5,05 4,62 4,69
4Van 5,41 4,89 4,15 3,53 2,97
∆% 0,0% 3,7% 1,3% 12,5% 18,5%
∆ neto 0,0 0,2 0,1 0,4 0,5
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 169
Tabla 47: Penicilina + Vancomicina. (Continuación)
Pen+Van 5,41 4,74 4,45 3,26 2,42
Pen 5,41 5,52 5,05 4,62 4,69
Van 5,41 5,19 4,79 4,36 3,88
∆% 0,0% 8,6% 7,1% 25,2% 37,6%
∆ neto 0,0 0,4 0,3 1,1 1,5
Pen+Van/4 5,41 5,37 4,71 3,94 3,81
Pen 5,41 5,52 5,05 4,62 4,69
Van/4 5,41 5,72 6,20 6,99 7,97
∆% 0,0% 2,7% 6,8% 14,9% 18,6%
∆ neto 0,0 0,1 0,3 0,7 0,9
Pen/4+4Van 5,41 5,01 4,13 3,28 2,63
Pen/4 5,41 5,93 6,56 7,75 9,11
4Van 5,41 4,89 4,15 3,53 2,97
∆% 0,0% -2,3% 0,5% 7,2% 11,6%
∆ neto 0,0 -0,1 0,0 0,3 0,3
Pen/4+Van 5,41 4,96 4,30 3,59 3,27
Pen/4 5,41 5,93 6,56 7,75 9,11
Van 5,41 5,19 4,79 4,36 3,88
∆% 0,0% 4,3% 10,2% 17,6% 15,7%
∆ neto 0,0 0,2 0,5 0,8 0,6
Pen/4+Van/4 5,41 5,51 5,32 5,77 6,25
Pen/4 5,41 5,93 6,56 7,75 9,11
Van/4 5,41 5,72 6,20 6,99 7,97
∆% 0,0% 3,6% 14,2% 17,4% 21,6%
∆ neto 0,0 0,2 0,9 1,2 1,7
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 170
Fig. 27: Penicilina + Vancomicina. Incremento medio (log) de la combinación sobre el
antimicrobiano más activo
Fig. 28: Penicilina + Vancomicina. Incremento medio (%) de la combinación sobre el
antimicrobiano más activo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 171
Tabla 48:.Resultados medios (log10(UFC/mL)). (n = 10)
de la combinación (CIM) Penicilina + Fosfomicina.
Tiempo (hr) 0 2 4 6 8
4Pen+4Fos 5,41 4,42 3,17 2,53 1,23
4Pen 5,41 4,66 3,72 2,81 1,40
4Fos 5,41 4,83 3,91 3,17 2,38
∆% 0,0% 5,3% 14,8% 9,8% 12,7%
∆ neto 0,0 0,2 0,6 0,3 0,2
4Pen+Fos 5,41 4,43 3,57 2,67 1,26
4Pen 5,41 4,66 3,72 2,81 1,40
Fos 5,41 5,07 4,64 4,66 4,96
∆% 0,0% 5,0% 4,0% 5,0% 10,2%
∆ neto 0,0 0,2 0,2 0,1 0,1
4Pen+Fos/4 5,41 4,64 3,90 2,58 1,05
4Pen 5,41 4,66 3,72 2,81 1,40
Fos/4 5,41 5,46 6,38 7,14 8,20
∆% 0,0% 0,5% -4,7% 8,0% 25,3%
∆ neto 0,0 0,0 -0,2 0,2 0,4
Pen+4Fos 5,41 4,64 3,59 2,56 1,27
Pen 5,41 4,89 4,47 3,87 3,77
4Fos 5,41 4,83 3,91 3,17 2,38
∆% 0,0% 4,0% 8,3% 19,1% 46,8%
∆ neto 0,0 0,2 0,3 0,6 1,1
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 172
Tabla 48: Penicilina + Fosfomicina (Continuación)
Pen+Fos 5,41 4,68 3,97 2,63 1,67
Pen 5,41 4,89 4,47 3,87 3,77
Fos 5,41 5,07 4,64 4,66 4,96
∆% 0,0% 4,3% 11,2% 32,2% 55,7%
∆ neto 0,0 0,2 0,5 1,2 2,1
Pen+Fos/4 5,41 4,97 4,32 3,06 2,22
Pen 5,41 4,89 4,47 3,87 3,77
Fos/4 5,41 5,46 6,38 7,14 8,20
∆% 0,0% -1,7% 3,4% 21,0% 41,2%
∆ neto 0,0 -0,1 0,2 0,8 1,6
Pen/4+4Fos 5,41 4,51 3,95 2,42 1,52
Pen/4 5,41 5,53 5,61 6,28 7,75
4Fos 5,41 4,83 3,91 3,17 2,38
∆% 0,0% 6,7% -1,1% 23,8% 36,3%
∆ neto 0,0 0,3 0,0 0,8 0,9
Pen/4+Fos 5,41 5,03 4,28 3,46 2,36
Pen/4 5,41 5,53 5,61 6,28 7,75
Fos 5,41 5,07 4,64 4,66 4,96
∆% 0,0% 0,7% 7,7% 25,6% 52,4%
∆ neto 0,0 0,0 0,4 1,2 2,6
Pen/4+Fos/4 5,41 5,24 5,09 5,18 5,22
Pen/4 5,41 5,53 5,61 6,28 7,75
Fos/4 5,41 5,46 6,38 7,14 8,20
∆% 0,0% 4,1% 9,3% 17,5% 32,7%
∆ neto 0,0 0,2 0,5 1,1 2,5
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 173
Fig. 29: Penicilina + Fosfomicina. Incremento medio (log) de la combinación sobre el
antimicrobiano más activo
Fig. 30: Penicilina + Fosfomicina: Incremento (%) de la combinación sobre el
antimicrobiano más activo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 174
Tabla 49: Resultados (log10(UFC/mL). medios (n = 10)
de la combinación (CIM) Ceftriaxona + Vancomicina.
Tiempo (hr) 0 2 4 6 8
4Ctr+4Van 5,40 4,90 3,85 3,01 2,06
4Ctr 5,40 5,20 4,61 3,66 3,22
4Van 5,40 5,23 3,98 3,48 2,62
∆% 0,0% 5,8% 3,4% 13,4% 21,5%
∆ neto 0,0 0,3 0,1 0,5 0,6
4Ctr+Van 5,40 4,81 3,88 3,30 2,68
4Ctr 5,40 5,20 4,61 3,66 3,22
Van 5,40 5,20 4,72 4,34 4,03
∆% 0,0% 7,4% 15,8% 9,7% 16,8%
∆ neto 0,0 0,4 0,7 0,4 0,5
4Ctr+Van/4 5,40 5,17 4,60 3,75 2,89
4Ctr 5,40 5,20 4,61 3,66 3,22
Van/4 5,40 5,86 6,45 7,18 8,15
∆% 0,0% 0,5% 0,1% -2,5% 10,1%
∆ neto 0,0 0,0 0,0 -0,1 0,3
Ctr+4Van 5,40 5,03 3,89 3,13 2,62
Ctr 5,40 5,62 5,72 6,09 6,14
4Van 5,40 5,23 3,98 3,48 2,62
∆% 0,0% 3,8% 2,4% 10,1% 0,0%
∆ neto 0,0 0,2 0,1 0,4 0,0
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 175
Tabla 49: Ceftriaxona + Vancomicina. (Continuación)
Ctr+Van 5,40 4,97 4,27 3,53 3,28
Ctr 5,40 5,62 5,72 6,09 6,14
Van 5,40 5,20 4,72 4,34 4,03
∆% 0,0% 4,5% 9,6% 18,5% 18,7%
∆ neto 0,0 0,2 0,5 0,8 0,8
Ctr+Van/4 5,40 5,32 4,85 4,62 4,41
Ctr 5,40 5,62 5,72 6,09 6,14
Van/4 5,40 5,86 6,45 7,18 8,15
∆% 0,0% 5,4% 15,2% 24,0% 28,1%
∆ neto 0,0 0,3 0,9 1,5 1,7
Ctr/4+4Van 5,40 5,30 4,11 3,47 2,85
Ctr/4 5,40 6,02 7,17 8,48 9,49
4Van 5,40 5,23 3,98 3,48 2,62
∆% 0,0% -1,3% -3,1% 0,2% -8,7%
∆ neto 0,0 -0,1 -0,1 0,0 -0,2
Ctr/4+Van 5,40 5,03 4,52 3,63 3,31
Ctr/4 5,40 6,02 7,17 8,48 9,49
Van 5,40 5,20 4,72 4,34 4,03
∆% 0,0% 3,3% 4,3% 16,3% 18,0%
∆ neto 0,0 0,2 0,2 0,7 0,7
Ctr/4+Van/4 5,40 5,39 5,85 6,47 6,76
Ctr/4 5,40 6,02 7,17 8,48 9,49
Van/4 5,40 5,86 6,45 7,18 8,15
∆% 0,0% 8,0% 9,3% 10,0% 17,0%
∆ neto 0,0 0,5 0,6 0,7 1,4
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 176
Fig. 31: Ceftriaxona + Vancomicina. Incremento medio (log) de la combinación sobe el
antimicrobiano más activo
Fig. 32: Ceftriaxona + Vancomicina. Incremento medio (%) de la combinación sobre el
antimicrobianos más activo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 177
Tabla 50: Resultados (log10(UFC/mL). medios (n = 10) de
la combinación (CIM) Ceftriaxona + Fosfomicina
Tiempo (hr) 0 2 4 6 8
4Ctr+4Fos 5,40 4,64 3,97 2,66 1,26
4Ctr 5,40 4,67 4,08 3,16 1,89
4Fos 5,40 5,03 3,89 3,17 2,21
∆% 0,0% 0,5% -2,2% 15,8% 33,7%
∆ neto 0,0 0,0 -0,1 0,5 0,6
4Ctr+Fos 5,40 4,56 4,12 2,56 1,43
4Ctr 5,40 4,67 4,08 3,16 1,89
Fos 5,40 4,97 4,68 4,83 5,00
∆% 0,0% 2,2% -1,1% 19,2% 24,5%
∆ neto 0,0 0,1 0,0 0,6 0,5
4Ctr+Fos/4 5,40 4,78 4,21 3,03 1,31
4Ctr 5,40 4,67 4,08 3,16 1,89
Fos/4 5,40 5,71 6,44 7,44 8,58
∆% 0,0% -2,3% -3,3% 4,3% 30,9%
∆ neto 0,0 -0,1 -0,1 0,1 0,6
Ctr+4Fos 5,40 4,68 3,84 2,58 1,34
Ctr 5,40 4,85 4,83 4,43 3,52
4Fos 5,40 5,03 3,89 3,17 2,21
∆% 0,0% 3,5% 1,4% 18,4% 39,6%
∆ neto 0,0 0,2 0,1 0,6 0,9
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 178
Tabla 50: Ceftriaxona + Fosfomicina (Continuación)
Ctr+Fos 5,40 4,84 4,16 2,90 1,43
Ctr 5,40 4,85 4,83 4,43 3,52
Fos 5,40 4,97 4,68 4,83 5,00
∆% 0,0% 0,1% 11,1% 34,5% 59,3%
∆ neto 0,0 0,0 0,5 1,5 2,1
Ctr+Fos/4 5,40 4,95 4,52 3,98 2,47
Ctr 5,40 4,85 4,83 4,43 3,52
Fos/4 5,40 5,71 6,44 7,44 8,58
∆% 0,0% -2,0% 6,4% 10,3% 29,8%
∆ neto 0,0 -0,1 0,3 0,5 1,0
Ctr/4+4Fos 5,40 4,77 3,84 2,72 1,38
Ctr/4 5,40 5,67 6,28 7,46 8,84
4Fos 5,40 5,03 3,89 3,17 2,21
∆% 0,0% 5,3% 1,3% 14,1% 37,8%
∆ neto 0,0 0,3 0,1 0,4 0,8
Ctr/4+Fos 5,40 4,97 4,38 3,66 3,05
Ctr/4 5,40 5,67 6,28 7,46 8,84
Fos 5,40 4,97 4,68 4,83 5,00
∆% 0,0% 0,0% 6,3% 24,1% 39,0%
∆ neto 0,0 0,0 0,3 1,2 2,0
Ctr/4+Fos/4 5,40 5,40 5,31 5,77 6,31
Ctr/4 5,40 5,67 6,28 7,46 8,84
Fos/4 5,40 5,71 6,44 7,44 8,58
∆% 0,0% 4,8% 15,5% 22,5% 26,4%
∆ neto 0,0 0,3 1,0 1,7 2,3
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 179
Fig. 33: Ceftriaxona + Fosfomicina: Incremento medio (log) de la combinación sobre el
antimicrobiano más activo
Fig. 34: Ceftriaxona + Fosfomicina: Incremento medio (%) de la combinación sobre el
antimicrobiano más activo
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 180
Tabla 51: Resultados (log (UFC/mL) medios (n = 10) delas distintas combinaciones
Tiempo (hr) 2 4 6 8
(Ctr+Fos) vs Ctr 4,80 4,20 2,90 1,40
Ctr 4,80 4,80 4,40 3,50
Fos 5,00 4,70 4,80 5,00
∆% 0,1% 11,1% 34,5% 59,3%
∆ neto 0 0,5 1,5 2,1
(Ctr+Van) vs Van 5,00 4,30 3,50 3,30
Ctr 5,60 5,70 6,10 6,10
Van 5,20 4,70 4,30 4,00
∆% 4,5% 9,6% 18,5% 18,7%
∆ neto 0,2 0,5 0,8 0,8
(Pen+Fos) vs Pen 4,70 4,00 2,60 1,70
Pen 4,90 4,50 3,90 3,80
Fos 5,10 4,60 4,70 5,00
∆% 4,3% 11,2% 32,2% 55,7%
∆ neto 0,2 0,5 1,2 2,1
(Pen+Van) vs Van 4,70 4,40 3,30 2,40
Pen 5,50 5,10 4,60 4,70
Van 5,20 4,80 4,40 3,90
∆% 8,6% 7,1% 25,2% 37,6%
∆ neto 0,4 0,3 1,1 1,5
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 181
Fig. 35: Combinaciones [CIM+CIM] vs CIM. Incremento medio (log) del efecto de la
combinación sobre el antimicrobiano más activo
Fig. 36: Combinaciones [CIM + CIM] vs CIM. Incremento (%) el efecto de la combinación
sobre el antimicrobiano más activo (100%)
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Resultados 182
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 183
DISCUSIÓN
El rápido y generalizado desarrollo de la resistencia del Streptococcus
pneumoniae a penicilina y otros antimicrobianos, ha hecho que el tratamiento
antimicrobiano de las infecciones neumocócicas antes relativamente sencillo, esté
sujeto a revisiones conforme varía el perfil de sensibilidad del patógeno. Numerosas
publicaciones en los años setenta relataban aislamientos con CIMs de 0,1 a 1 µg/mL
asociados a fallos clínicos en pacientes con meningitis tratados con penicilina, lo que
llevó a la conclusión de que con la penicilina a dosis normales no se obtenían
niveles suficientes contra dichas cepas, y al consenso en los años ochenta, sobre el
uso de cefalosporinas de tercera generación como alternativa terapeútica de
elección.
Diversos autores han publicado en los últimos años, un aumento significativo
de la prevalencia de cepas resistentes a cefalosporinas de tercera generación,
aunque se han descrito relativamente pocos fracasos terapéuticos, generalmente en
casos de meningitis, tal vez por que en parte se pudieron resolver con altas
concentraciones de cefalosporina en aislamientos con CIMs ≥ 1 µg/mL o la
utilización de fármacos como la vancomicina, el imipenem o diversas asociaciones
en los infrecuentes casos de CIMs ≥ 2 µg/mL (Bradley, 1991).
Las categorías de sensibilidad del S. pneumoniae dadas por el NCCLS en
1997 para los ß-lactámicos, están basadas en el tratamiento de las meningitis
neumocócicas, sin embargo para infecciones con otra localización, podrían utilizarse
mayores puntos de corte basados en consideraciones farmacocinéticas y
farmacodinámicas del lugar de infección. Una cepa de S. pneumoniae con CIM =
0,5 µg/mL puede ser resistente a penicilina si el microorganismo produce meningitis,
pero sensible si causa neumonía.
A la disminución de la sensibilidad a antimicrobianos, y a la alta mortalidad de
las meningitis neumocócicas, hay que añadir el aumento de las infecciones que S.
pneumoniae produce en inmunodeprimidos, grupo de población en aumento por
diversas causas, y motivo de la orientación de este trabajo hacia los ß-lactámicos
parenterales y sus posibles alternativas.
Las principales consideraciones para una dosificación óptima de los
antimicrobianos, en procesos graves como la meningitis son la penetración del
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 184
antimicrobiano en el sitio de la infección (Schentag, 1989), la necesidad crítica de
conseguir efectos bactericidas, el modo de administración (intermitente o continuo)
con la posible obtención de efecto post-antibiótico, y la duración de la terapia, por lo
que hemos aplicado algunas de las técnicas microbiológicas que pueden aportar
datos sobres estas cuestiones.
Los estudios microbiológicos in vitro (Blaser, 1985, 1987), y los modelos animales in
vivo (Bergeron, 1981; Scheld, 1985; Schentag, 1991) son actualmente las técnicas que nos
proporcionan la valoración tanto de los nuevos como de los antimicrobianos clásicos,
de la actividad bactericida única o en diferentes asociaciones, frente a la población
cambiante de un patógeno como S. pneumoniae .
A pesar de que son numerosos los factores metodológicos que pueden influir
en los resultados obtenidos, lo que sin duda dificulta su estandarización, las curvas
de letalidad han sido utilizadas por numerosos autores como buenos predictores de
la actividad bactericida única o sinérgica in vitro. Su valoración debe realizarse en
función de otros parámetros como la CIM y los niveles terapéuticos conseguibles.
2.- Cepas bacterianas
Dada la laboriosidad de las técnicas de curvas de muerte y especialmente del
estudio del efecto post-antibiótico, el número de cepas seleccionadas ha sido
necesariamente limitado.
En la técnica de estudio simple de la acción bactericida mediante curvas de
letalidad, se seleccionaron cepas sensibles y con resistencia intermedia y alta a
penicilina, para valorar el efecto bactericida de los antimicrobianos elegidos, sobre
todo el espectro de susceptibilidad del S. pneumoniae.
Sin embargo, en los estudios del efecto post-antibiótico y de sinergia
antimicrobiana, seleccionamos cepas con resistencia intermedia y alta a penicilina,
ya que tratamos de observar aspectos farmacológicos que nos permitan valorar
opciones terapéuticas, como lo son la variación de las pautas medicamentosas o el
empleo de combinaciones antimicrobianas, ante respuestas clínicas insuficientes
asociadas a cepas resistentes a penicilina o cefalosporinas.
Por el método de sensibilidad con discos de oxacilina (1 µg) realizamos una
primera clasificación de las cepas estudiadas (datos no presentados), como un
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 185
screening para la detección de cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a
penicilina (NCCLS, 1997: M2-A6).
Este método no permite diferenciar entre cepas intermedia y altamente
resistentes a penicilina, y debe ajustarse a las condiciones del laboratorio para
minimizar los errores (Manninen, 1998)
Dowson et al. (Dowson, 1994) en un estudio de resistencia a oxacilina en cepas del
Reino Unido y España, encontraron que la adquisición de una PFP2x de baja
afinidad, confiere a las mutantes resistencia a oxacilina, cloxacilina y meticilina, así
como un nivel intermedio de resistencia a cefotaxima, permaneciendo por el
contrario sensibles a penicilina. En nuestro estudio las cepas clasificadas como
resistentes en función del halo de inhibición a oxacilina, se confirmaron con la
técnica de microdilución en caldo.
Las CIMs fueron determinadas por el método de microdilución descrito en el
apartado de material y métodos; recomendado por el National Committee For
Clinical Laboratory Standards 1997 (NCCLS, 1997: M7-A4).
3.- Método de recuento de viables.
3.1.- Limitaciones, precisión, reproducibilidad y umbral del método
Según la descripción establecida anteriormente, consideramos efecto
bactericida la muerte del 99,9% o más del inóculo inicial, lo que supone una caída de
3 o más puntos del logaritmo para inóculos del orden de 106 UFC/mL.
Para la determinación de la acción bactericida o el efecto post-antibiótico se
requiere del suficiente volumen de cultivo que permita el subcultivo periódico a lo
largo de la técnica. Oviamente el volumen subcultivado para recuento debe ser a su
vez lo suficientemente grande para detectar pequeñas poblaciones, especialmente si
tratamos de valorar el EPA por el método de dilución. Por el contrario el manejo de
grandes volúmenes en tubos limita, por excesivamente laborioso, el número de
ensayos (Pelletier, 1984).
El empleo de placas desechables de 16 pocillos de 2 mL y con tapa,
proporciona un volumen adecuado para el recuento repetido. Permite algunas de las
ventajas de los micrométodos como la facilidad de manipulación, sin que influyan
problemas característicos como la evaporación, lo que facilita enormemente este
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 186
tipo de estudios (Barry, 1978; Prober, 1979). El subcultivo de 14 a 24 alícuotas como máximo
para el EPA, de 10µL (140 -240µL ) supone solamente un 7-14% del volumen total
de 2 mL.
El método de siembra directa de una pequeña alícuota de 10µL y de sus
diluciones decimales, reduce considerablemente otra potencial fuente de error,
particularmente importante si la siembra se realiza como en nuestro caso por goteo
sin extensión. Aunque no hemos utilizado concentraciones muy altas de
antimicrobianos, es posible que en la siembra directa (10-2) y aún en las primeras
diluciones los recuentos fueran menores debidos al arrastre de antimicrobiano, pero
ello es fácilmente detectable por un aumento de los recuentos en las diluciones
superiores.
Barry et al. (Barry, 1979) estudió la precisión de los recuentos de Streptococcus
faecalis obtenidos mediante pequeños muestreos de 1µL a 25µL realizados con
micropipetas o asas calibradas desde microplacas o tubos, y sembrados por goteo
en secciones de 1/8 de placas de 15 cm MH. Encontrando que la alícuota de 10µL
con micropipeta presentaba el menor coeficiente de variación (17,7%) y desviación
estándar (6,2) en el muestreo de volúmenes de 1 mL, por lo que lo recomendaba, al
igual que Pearson et al. (Pearson, 1980) para inóculos del orden de 1x106 UFC/mL.
Eliopoulos (Eliopoulos, 1991) también describe este método en la realización de
curvas de letalidad, declarando una variabilidad general del ± 10% para el recuento,
lo que supone una variación del logaritmo del recuento de ± 0,04 log10.
La siembra de xUFC contenidas en 10µL equivale a una dilución 1/100 en
UFC/mL
mL
xUFC
mL
L
L
xUFC ×=× 1001
1000
10
µµµµµµµµ
por lo que el umbral de detección se sitúa por encima de 1x102 UFC/mL,
suficiente para detectar el efecto bactericida sobre inóculos de 1x106 UFC/mL.
3.2.- Comparativa del medio de cultivo empleado. Autólisis
Para valorar la influencia del medio de cultivo empleado en el desarrollo de
las técnicas, y puesto que se trata de medir la variación de la población o cinética del
crecimiento, comparamos los resultados obtenidos sobre la cinética de crecimiento
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 187
de los cultivos control, con el medio brain heart infusion (BHI) sin sangre, empleado
en anteriores pruebas, y los obtenidos en la experiencia actual con MHB2+5%LHB.
El uso de un medio con sangre lo avalan trabajos como el de Musher, donde
en presencia de una fuente de catalasa como los glóbulos rojos, el neumococo logra
sobrevivir de 0 a 4 ° C durante largo tiempo (Musher, 1995).
Otros medios con sangre o suplementados proporcionan buenos resultados
(D´Amato, 1987; Jorgensen, 1992; Marshall, 1993; Gratten, 1994), mientras que medios como el MHA
chocolatizado antagoniza la acción de teicoplanina y vancomicina, o los medios
Haemophilus test y Wilkins-Chalgren que no son capaces de desarrollar algunas
cepas de neumococos (Traub, 1996).
La concentración de Ca++ y Mg++ tienen una influencia importante sobre la
fisiología del neumococo (Trombe, 1992), y sobre la acción de los antimicrobianos
modificando parámetros como la CIM o el EPA (Amsterdam, 1996). Algunas quinolonas
pueden quelar iones metálicos, modificándose su acción. El Mg++ es el catión más
importante en la reducción del EPA y de la actividad bactericida de las quinolonas
(Marshall, 1994). La adición de Mg++ al medio hace descender en un 50% el EPA de
ofloxacino sobre S. aureus (Pastor, 1992b). El hecho de que se emplee para este estudio
el medio MHB2 con una cantidad ajustada cationes incluyendo Mg++ y Ca++, sin duda
contribuirá a su reproducibilidad, ya que la osmolaridad del medio afecta la unión de
los ß-lactámicos a las PBPs (Amsterdam, 1996).
Con el medio MHB2+LHB5%, en comparación con el medio sin sangre BHI,
se consiguen mejores rendimientos netos (UFC/mL) en los períodos de 0 a 10 horas
y de 0 a 24 horas, pero además aporta mayor estabilidad al cultivo si se considera el
tramo de 10 a 24 horas, correspondiente a la fase estacionaria y comienzo de los
procesos líticos, donde con MHB2+LHB5% la tasa relativa de muerte del control es
menor.
Para inóculos altos del orden de 1x108 UFC/mL el efecto es mucho más
pronunciado resultando generalmente en la muerte total del control sin antibiótico a
las 24 horas de incubación en la mayoría de los casos. En numerosos casos, la
autólisis impide valorar el efecto de los antibióticos mas allá de las diez horas de
incubación, por lo que decidimos descartar los resultados obtenidos a las 24 horas
en diversas pruebas.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 188
3.3.- Efecto de la variación en el tamaño del inóculo
La elaboración del inóculo no supone un hecho simple sobre el resultado
obtenible, que cambia según la especie y aún la cepa, pues no disponemos de una
población homogénea, y existen contingencias de carácter cualitativo y cuantitativo.
En un inóculo alto hay un mayor número de mutantes resistentes resultando una
tasa de supervivencia mayor. Tampoco todas las células se encuentran en la misma
fase de crecimiento. A concentraciones altas ≥ 108 UFC/mL en medios de cultivo
estancados se alcanza pronto la fase estacionaria.
Estudiamos la influencia que la variación en el tamaño del inóculo empleado,
tiene sobre el desarrollo de las técnicas (Anónimo, 1989; Greewood, 1997; Kennedy, 1996),
comparando los resultados obtenidos en el tiempo, con los antibióticos en el rango
de concentraciones estudiados, enfrentados a tamaños de 1x107 - 1x108 UFC/mL
(inóculo alto) y 1x105 - 1x106 UFC/mL (inóculo bajo).
En algunos trabajos que presentan una evaluación de la influencia del tamaño
del inóculo (Laverdiere, 1978; Mayhall, 1980; Kennedy, 1996) obtienen los inóculos altos mediante
incubación nocturna y en fase estacionaria, por lo que la influencia del tamaño del
inóculo que publican, puede ser debida en parte a la fase de crecimiento, estatus
metabólico de primera importancia según el mecanismo de acción del
antimicrobiano, y no solo al número de UFC/mL presentes.
En experiencia* anterior con S. pneumoniae utilizando concentraciones
bacterianas semejantes: 1x108 - 1x109 UFC/mL (inóculo alto) y 1x105 - 1x106
UFC/mL (inóculo bajo), donde empleamos directamente un cultivo nocturno,
inmediatamente después de ajustar la concentración con el espectrofotómetro, esto
es en fase estacionaria de crecimiento, constatamos importantes diferencias según
el inóculo empleado. Friedland et al. (Friedland, 1994) en un estudio de curvas de letalidad
con cepas de S. pneumoniae, sobre el efecto del tamaño y fase del inóculo, preparó
inóculos en fase estacionaria (cultivo nocturno directo), fase logarítmica temprana
(preincubación de 2 horas) y fase logarítmica media (preincubación de 4 horas);
encontrando variaciones significativas en los resultados hasta las 6-8 horas de
incubación, siendo después mínimas las diferencias de concentración.
* Bañón R. Memoria de licenciatura Acción de diversos antimicrobianos en la dinámica de
crecimiento del Streptococcus pneumoniae. 1991. Universidad de Granada.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 189
En el presente estudio realizamos una preincubación de al menos dos horas
después del ajuste de concentración a McF 0,5 SO4Ba, sin variar sustancialmente el
tamaño del inóculo como se demuestra por los recuentos control, conseguimos que
una parte importante del cultivo esté en fase inicial de crecimiento logarítmico, lo que
se demuestra a su vez por el incremento de la curva de crecimiento del control.
Si consideramos los datos a partir de obtenerse resultados bactericidas, esto
es desde las 6-8 horas, penicilina, ceftriaxona y esparfloxacino presentan, a
concentraciones iguales o menores a la CIM, las mismas tasas bactericidas frente a
inóculos altos y bajos. Vancomicina reúne generalmente mayores tasas de muerte a
inóculos altos (Tabla 27).
Imipenem, si bien presenta variación en sus tasas, esta es de signo contrario
en concentraciones consecutivas, y por tanto no relacionada con la concentración,
por lo que puede deberse a variaciones experimentales.
Por tanto, en los rangos de concentración del antimicrobiano y tamaño del
inóculo estudiados, ningún antibiótico presenta el denominado efecto del tamaño del
inóculo, esto es constantes y menores tasas de muerte frente a inóculos altos
(Tablas 24 a 28).
4.- Acción bactericida
4.1.- Antibióticos ββββ-lactámicos
4.1.1.- Cepas sensibles a penicilina
Frente a cepas sensibles a penicilina, los antibióticos ß-lactámicos siguen
presentando excelentes resultados (Tabla 31), obteniendo penicilina (CIM pen =
0,046 µg/mL), a la concentración de 4 µg/mL la muerte de todas las cepas a las 2
horas; y prácticamente a casi todas las concentraciones desde las 4 horas,
penicilina, imipenem (CIM imp = 0,032 µg/mL) y ceftriaxona (CIM ctr = 0,021 µg/mL)
Teniendo en cuenta que los puntos de corte recomendados se refieren
principalmente a procesos meníngeos, se admite que a pesar de la alta tasa de
resistencia a penicilina, esta se mantenga como antibiótico de elección en pacientes
inmunocompetentes con procesos no graves (Pallarés, 1987; Musher, 1995; Mensa, 1998).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 190
En cualquier caso, la elección del tratamiento debe fundarse en datos de
prevalencia de la resistencia a ß-lactámicos y en parámetros farmacocinéticos (Bradley,
1995; Azanza, 1989), hasta disponer de los datos microbiológicos de sensibilidad.
4.1.1.1. - Cepas resistentes a penicilina
El tratamiento de las infecciones producidas por S. pneumoniae resistente a
los antimicrobianos está cambiando, conforme cambia su perfil de sensibilidad. El
uso de diferentes pautas de dosificación o combinaciones de los antimicrobianos
conocidos, o el empleo de antimicrobianos nuevos con distintos mecanismos de
acción, son los principales enfoques frente a este problema (Kaplan, 1998).
Contra cepas resistentes a penicilina, la eficacia de los antimicrobianos en el
nuestro estudio y en otros publicados, es en general menor, especialmente como es
lógico, la de los ß-lactámicos que actúan sobre algunas dianas comunes (Pankuch, 1994).
Vancomicina y esparfloxacino en series más amplias (Visalli, 1996) no han mostrado
influenciarse por la resistencia a penicilina, sin embargo en nuestro trabajo, las
cepas resistentes a penicilina seleccionadas si presentan menor sensibilidad a
dichos antimicrobianos.
4.1.1.1.- Cepas resistentes a penicilina
El tratamiento de las infecciones producidas por S. pneumoniae resistente a
los antimicrobianos está cambiando, conforme cambia su perfil de sensibilidad. El
uso de diferentes pautas de dosificación o combinaciones de los antimicrobianos
conocidos, o el empleo de antimicrobianos nuevos con distintos mecanismos de
acción, son los principales enfoques frente a este problema (Kaplan, 1998).
Contra cepas resistentes a penicilina, la eficacia de los antimicrobianos en el
nuestro estudio y en otros publicados, es en general menor, especialmente como es
lógico, la de los ß-lactámicos que actúan sobre algunas dianas comunes (Pankuch, 1994).
Vancomicina y esparfloxacino en series más amplias (Visalli, 1996) no han mostrado
influenciarse por la resistencia a penicilina, sin embargo en nuestro trabajo, las
cepas resistentes a penicilina seleccionadas si presentan menor sensibilidad a
dichos antimicrobianos.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 191
4.1.1.2.- Cepas con resistencia intermedia a penicilina
Pallarés et al., (Pallarés, 1987) publican buenos resultados (0/3 muertes/casos
tratados) en neumonías por S. pneumoniae con CIMs de ≥ 0,1 a ≤ 1 µg/mL tratadas
con altas dosis de penicilina IV. Sin embargo, estos mismos autores, siete años
después (Pallarés, 1995) reconocen menores resultados (4/14) para el mismo tipo de
cepas y tratamiento.
Weingarten et al. (Weingarten, 1990) notifican un caso de fracaso terapéutico en el
tratamiento con penicilina de meningitis por una cepa con resistencia intermedia a
penicilina (CIM = 1 µg/mL), superado con cefotaxima (CIM = 0,125 µg/mL).
Tan et al. publican (Tan, 1992) 19 casos de infección sistémica por S.
pneumoniae con sensibilidad intermedia a penicilina, recomendando el tratamiento
empírico en casos de meningitis o sepsis con cefalosporinas de tercera.
Dagan et al. (Dagan, 1996) informan de mala respuesta clínica por el uso de
cefalosporinas orales frente a cepas de resistencia intermedia a penicilina.
La experiencia clínica a la fecha, nos demuestra que la respuesta a la terapia
con cefalosporinas de tercera, en casos de meningitis por neumococos con
resistencia intermedia a penicilina ha cambiado, informándose de fallos terapéuticos
en casos de meningitis (Bradley, 1991; Sloas, 1992; Chandy, 1994; Lonks, 1995; Raymond, 1995).
Los autores arriba mencionados (Tan, 1994) publican cinco casos de meningitis
neumocócica en niños originados por cepas con CIM a cefotaxima de 0,5 a 1 µg/mL
en los que se obtuvo la curación con cefotaxima a dosis de 200-225 mg/kg/día.
Actualmente algunos autores, considerando la baja prevalencia de resistencia
a cefalosporinas de tercera generación, mantienen la recomendación de utilizar altas
dosis en los casos de meningitis causadas por cepas con CIMpen de hasta 2 µg/mL
(Cabellos, 1995b, Viladrich, 1988; 1996).
En nuestro estudio penicilina � 1 µg/mL (CIM pen = 0,833 µg/mL) y
ceftriaxona ≥≥≥≥ 1 µg/mL (CIM ctr = 0,417 µg/mL), si bién lo logran la acción bactericida
en 2 de los 3 casos desde las cuatro horas, en el caso restante y con el rango de
concentraciones estudiadas no logran la muerte en 10 primeras horas de incubación.
Imipenem ≥≥≥≥ 1 µg/mL (CIM imp = 0,125 µg/mL) si alcanza mejores resultados con la
acción bactericida de las 3 cepas a las 4 horas (Tabla 32).
Aunque podría optarse por aumentar la dosis de penicilina, la dificultad para
obtener altos niveles en LCR, y considerando que superar la concentración de 5
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 192
µg/mL en LCR conlleva el riesgo de encefalopatías y convulsiones (Mensa, 1998), nos
parece más razonable a la luz de nuestros resultados, que si el aislamiento se
confirma de resistencia intermedia a penicilina, el usar una cefalosporina de tercera
generación, pero teniendo en cuenta la posibilidad del fracaso, y debiendo pues
realizar al menos un control microbiológico del resultado (Kleiman, 1993). Otras opciones
serían el uso de imipenem o la asociación con vancomicina. En localizaciones
extrameníngeas la penicilina a altas dosis mantiene su utilidad.
4.1.1.1.3.- Cepas con alta resistencia a penicilina.
Sauve et al. (Sauve, 1996) de un estudio mediante modelo de neumonía en ratón
neutropénico, llegan a la conclusión de que ceftriaxona, a pesar de tener la misma
CIM que cefotaxima, es más eficaz a igual dosis, contra cepas de neumococo
altamente resistentes a penicilina y resistentes a cefalosporinas, por mantener
concentraciones por encima de la CIM durante más tiempo.
En nuestro estudio, frente a cepas altamente resistentes a penicilina, y
considerando que todas las cepas tenían una CIMpen de 2 µg/mL, en el límite de la
definición de alta resistencia, los efectos con ß-lactámicos son semejantes a los
obtenidos con cepas de resistencia intermedia, aunque para conseguir los mismos
resultados se requieran concentraciones superiores. Imipenem ≥≥≥≥ 2 µg/mL (CIM imp
= 0,334 µg/mL) es el primero en conseguir tasas bactericidas a las 6 horas, mientras
que penicilina 4 µg/mL (CIM pen = 2 µg/mL) y ceftriaxona ≥≥≥≥ 2 µg/mL (CIM ctr = 1
µg/mL) no lo consiguen hasta las 10 horas (Tabla 33).
Ceftriaxona presenta mejores resultados, pero la limitación de su dosis a 4
gramos diarios, puede también hacer desaconsejable su uso en solitario (Viladrich, 1994);
y en el caso de que la CIM a cefotaxima fuera ≥ 2 µg/mL estamos de acuerdo con
otros autores en el empleo de antimicrobianos alternativos como imipenem (Asensi,
1989; Balfour, 1996), a pesar de su menos actividad contra cepas resistentes a penicilina
(Pikis, 1997); o como vancomicina a dosis de al menos 1g/8-12 horas en perfusión lenta,
sola o asociada a una cefalosporina de tercera generación.
4.2.- Vancomicina
La eficacia de vancomicina contra cepas resistentes de Streptococcus
pneumoniae, ha sido demostrada en numerosos ensayos in vitro (Liñares, 1992; Spangler,
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 193
1994; Pankuch, 1994b; Doit, 1994; Klugman: 1996b; Visalli, 1996; Knudsen, 1997) y en modelos animales (Beam,
1981; Cabellos, 1995). Beam comprueba mediante ensayos en conejos la efectividad de
vancomicina IV frente a cepas sensibles y resistentes de neumococos, obteniendo
efectos bactericidas con niveles en LCR semejantes a la CIM, no siendo necesario
alcanzar la CBM para ello.
Sin embargo Viladrich et al. (Viladrich, 1991) publican 4 casos de fracasos
terapéuticos de un total de 11 adultos tratados con vancomicina (7,5 mg/kg/ 6 horas)
y dexametasona. La penetración de la vancomicina depende en gran manera del
grado de inflamación, y se reduce significativamente por la acción de la
dexametasona (Paris, 1994; Cabellos, 1995), antiinflamatorio que no influye en la acción de
otros antimicrobianos (Lebel, 1988; Paris, 1994; Bradley, 1994; Kanra, 1995) Chesney et al. (Chesney,
1995) también presenta un caso de meningitis en paciente inmunocomprometido
tratado de septicemia neumocócica con cefotaxima y vancomicina, donde empleó
dosis de 40 mg/kg/día de vancomicina. Ambos casos ilustran la fina línea que existe
entre dosis efectivas o no en el tratamiento de meningitis por S. pneumoniae
resistentes, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Chesney
recomienda una dosificación inicial de vancomicina de 40-60 mg/kg/día esto es 10-
15 mg/kg/6horas. Otros autores con el fin de conseguir niveles suficientes en LCR,
han recomendado la administración intratecal.
En nuestro estudio (Tablas 31-33), vancomicina, aunque no es más eficaz
que los ß-lactámicos frente a cepas sensibles a penicilina, si demuestra una
capacidad bactericida suficiente para sustituir a penicilina o ceftriaxona en los casos
de cepas altamente resistentes a penicilina (CIM van = 0,417 µg/mL), donde logra la
muerte de todas las cepas en 8 primeras horas de incubación, si bién lo logran en 2
de los 3 casos a las 6 horas.
4.3.- Esparfloxacino
El impresionante desarrollo de las quinolonas en estos últimos años, ha dado
lugar a que moléculas como el esparfloxacino cuyos primeros ensayos in vitro (Fuch,
1993; Pankuch, 1994, 1997; Visalli, 1997) indicaban como un agente antineumocócico excelente,
se hayan visto rápidamente superadas en actividad, aspectos farmacocinéticos y
menor toxicidad, por otras nuevas sustancias como el trovafloxacino o el
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 194
levofloxacino. Por ello recientemente, durante el desarrollo de esta tesis, el
esparfloxacino se ha dejado de comercializar.
En modelos animales la tasa de supervivencia de ratones infectados con
neumococos sensibles a penicilina fue superior con esparfloxacino frente a
ciprofloxacino (Azoulay-Dupuis, 1992). Entenza et al. (Entenza, 1994) usa un modelo animal de
endocarditis estreptocócica para comparar la eficacia de esparfloxacino versus
ceftriaxona, intentando mimetizar las cinéticas humanas de ambos fármacos.
Aunque ambos fueron capaces de eliminar las vegetaciones, el esparfloxacino lo
hizo más lentamente.
También ha demostrado su eficacia clínica en la neumonía comunitaria (Richard,
1998) así como en la exacerbaciones agudas de los procesos respiratorios
obstructivos (Allegra, 1996).
Esparfloxacino, como otras fluorquinolonas, presenta una actividad semejante
contra neumococos sensibles y resistentes a penicilina (Liñares, 1992; Spangler, 1992; Gootz,
1996; Fuchs, 1997b), y en nuestro estudio las CIM esp para los tres grupos de sensibilidad a
penicilina seleccionados, han sido muy semejantes con una amplitud de rango de
dos diluciones.
Encontramos que los mejores resultados los obtiene frente a cepas sensibles
a penicilina (CIM esp= 0,052 µg/mL) consiguiendo la acción bactericida de todas las
cepas entre las 6 y 10 horas (Tabla 32), estos son inferiores a los obtenidos por los
ß-lactámicos, aunque mejores que vancomicina. Contra cepas resistentes
intermedias (Tabla 32), a penicilina, esparfloxacino (CIM esp = 0,073 µg/mL) presenta
casi los mismos resultados que frente a cepas sensibles a penicilina, sólo
ligeramente inferiores en la concentración más baja.
Frente a cepas altamente resistentes (Tabla 33), a penicilina, esparfloxacino
(CIM esp = 0,177 µg/mL) obtiene menores y más tardíos resultados que los
conseguidos frente a cepas sensibles o con resistencia intermedia.
Aunque el esparfloxacino ha sido retirado del mercado, los resultados
obtenidos en este trabajo podrían trasladarse en parte a otros fármacos de
características similares en cuanto actividad antineumocócica y buena penetración
como el trovafloxacino (Tabla 52), con el que se han realizado estudios de meningitis
experimental en conejos (Paris, 1995b). Los resultados publicados y los obtenidos por
nosotros, abonan la posibilidad de las fluorquinolonas para el tratamiento de la
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 195
infeciones graves neumocócicas. En cualquier caso son necesarios más estudios
experimentales y clínicos para asegurar la eficacia de las fluorquinolonas como
alternativa terapéutica en meningitis.
Tabla 52: Farmacocinética y actividad antineumocócica de esparfloxacino y trovafloxacino
Esparfloxacino Trovafloxacino
Concentración sérica (400 mg/PO) 2,54 µg/mL1 5,9 µg/mL2
Concentración en LCR3 0,42 µg/mL1 0,25 µg/mL4
Volumen de distribución 3,6 L/Kg 1,4 L/Kg
CIM90 S. pneumoniae 5 0,25 µg/mL 0,12 µg/mL
: Davey, 1994. : Vincent J., 1997. : Individuos sanosvoluntarios. : Cutler N.R. 1997. : Liñares, 1998
5.- Efecto post-antibiótico
Estudiamos el efecto post-antibiótico y su afectación por la concentración, y
tiempo de exposición al antimicrobiano, obtenido sobre cuatro cepas de S.
pneumoniae con resistencia intermedia y alta a penicilina, con penicilina, ceftriaxona,
imipenem, vancomicina y esparfloxacino a cinco concentraciones diferentes. El
objeto de dicho estudio es valorar la importancia del EPA como factor farmacológico.
5.2.- Limitaciones de la técnica
Para el efecto post-antibiótico se producen cambios, posiblemente
interrelacionados, en la síntesis proteica (Yan, 1994), modificación del tiempo de
generación y morfología celular (Lorian, 1991), susceptibilidad a los leucocitos
polimorfonucleares (Craig, 1991b), susceptibilidad a los antibióticos (Gudmundsson, 1994),
adherencia bacteriana (Shibl, 1995), etc.. Imipenem y otros ß-lactámicos con alta
afinidad por las PFP2 originan esferoplastos (Gudmundsson, 1986; Hanberger, 1990) que pueden
permanecer viables.
Los ensayos in vitro por cinética de muerte, presentan una limitación de su
sensibilidad, en cuanto a la detección del EPA debido a daños subletales, que no
afectan significativamente a las curvas de muerte, pero que trascienden en una
menor virulencia o capacidad del microorganismo para enfrentarse a los sistemas de
protección del hospedador (Davidson, 1991; Fuursted, 1997b), o como en el caso de las
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 196
fluorquinolonas que incrementan su acción con la incorporación de suero (Davidson,
1991).
Esta restricción supone en primer lugar una base para la discrepancia de
resultados con los modelos animales (Zhanel, 1991; Craig, 1996), y lo que es más importante,
que los ensayos in vitro como el realizado por nosotros, pueden ser sólo una
aproximación al valor e importancia real del EPA.
Las concentraciones a las que ensayamos el EPA, son las mismas que las
recomendadas para las pruebas bactericidas (NCCLS, 1997), en un rango próximo a la
CIM del microorganismo, y suelen ser, en la mayoría de los casos, próximas a las
que se alcanzan en suero o líquidos orgánicos después de una dosis habitual del
antimicrobiano.
Hay que tener en cuenta que, si la concentración estudiada es alta, se
produce mucha letalidad y el EPA es difícil de medir, especialmente en los
antimicrobianos rápidamente bactericidas como imipenem y con la técnica de
dilución.
Por el contrario si las concentraciones ensayadas son excesivamente bajas,
por debajo de la CIM, tampoco se consigue demostrar EPA con la técnica de
recuento de viables.
Por ambas razones, en nuestro estudio no se ha podido determinar el EPA
en todos los casos, por ejemplo imipenem y vancomicina tras 1 hora en 15/25 y
16/25 casos, y tras 2 horas en 11/25 y 9/25 casos respectivamente (Tablas 38 a
41).
5.3.- Influencia de la concentración y el tiempo de exposición sobre el
EPA
Dado que el EPA es un aspecto de la acción bactericida, las categorías de
esta pueden trasladarse al EPA y por ejemplo, cuando utilizamos antimicrobianos
poco dependientes de la concentración como los ß-lactámicos contra cocos
grampositivos, tanto la actividad bactericida como el EPA aumentan con el
incremento de la concentración, hasta alcanzar un máximo generalmente alrededor
de 5 a 10 veces la CIM (Bundtzen, 1981; Gerber, 1993).
En nuestro estudio, la relación entre concentración media empleada de cada
antimicrobiano, y la CIM media de la cepa estudiada son semejantes, salvo en el
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 197
caso de esparfloxacino, por lo que, como en el estudio de la acción bactericida, nos
mantenemos dentro de rangos donde el efecto es concentración-dependiente. Pero
aún incluyendo el caso del esparfloxacino, los EPAs medios conseguidos, tras un
tiempo de exposición de 1 hora, con los distintos antimicrobianos, son muy
semejantes: 0,75; 0,75; 0,72; 0,78 y 0,78 horas.(Tabla 44)
La tendencia de los resultados se representan mediante curvas de que
muestran unos coeficientes de determinación intermedios: imipenem (r2=0,53);
vancomicina (r2=0,47); penicilina (r2=0,31); ceftriaxona (r2=0,77) y esparfloxacino
(r2=0,63) (Fig. 36)
Los EPAs medios conseguidos tras 2 horas de exposición son: 1,40; 0,93;
0,87; 1,20 y 1,46 horas, no sólo son superiores, sino que presentan mayores
diferencias entre ellos, posiblemente debido a que la influencia del tiempo de
exposición es distinta para cada antimicrobiano (Tabla 45).
Estos resultados están de acuerdo con otros publicados para ß-lactámicos
Fig 36 EPA después de 1 hora de exposiciónEfecto de la concentración
Fig. 37: EPA después de 2 horas de exposición.Efecto de la concentración
Fig. 38Efecto de la concentración sobre el EPA encepas con resistencia intermedia a penicilina
Fig. 39: Efecto de la concentración sobre el EPAen cepas con resistencia alta a penicilina
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 198
(Bundtzen, 1981), que producen a concentraciones de 5 CIMs, EPAS de 1-3 horas. Con
vancomicina frente a S. aureus, Cooper (Cooper, 1990). obtiene con 2-10 CIM EPAs de
0,2 - 2 horas, y Hanberger (Hanberger, 1991) EPAs de 0,5 a 1 hora y de forma semejante
a los ß-lactámicos, una baja dependencia de la dosis.
Los resultados se representan, mediante curvas con tendencia a un máximo,
con unos coeficientes de determinación generalmente más altos: imipenem
(r2=0,40); vancomicina (r2=0,69); penicilina (r2=0,34); ceftriaxona (r2=0,79) y
esparfloxacino (r2=0,66) (Fig. 37)
Comparando la relación entre EPA y concentración para cepas con
resistencia intermedia y alta a penicilina, podemos observar pautas diferentes según
el tiempo de exposición; y así en cepas con resistencia intermedia a penicilina se
aprecia EPA desde las primeras concentraciones y si bien en la primera hora la
relación parece lineal (r2=0,7), en la segunda hora el EPA conseguido es mucho
mayor y con tendencia a un máximo (r2=0,9) (Fig. 38).
Por el contrario las cepas altamente resistentes a penicilina (CIM ≥ 2 µg/mL)
en ningún caso empiezan a manifestar EPA hasta superar una concentración mayor
o igual a 2 µg*hr/mL; con un coeficiente de correlación de (r2 1 horas=0,71 y r2
2
horas=0,86) (Fig. 39).
Dado que los ß-lactámicos no presentan una actividad bactericida tan
dependiente de la concentración como aminoglucósidos o quinolonas, sino que su
actividad se relaciona mejor con la duración de la exposición, el hecho de que las
cepas altamente resistentes a penicilina estudiadas, necesiten concentraciones
superiores para manifestar EPAs, induce a pensar que ante este tipo de aislamiento
se debe vigilar especialmente que los niveles se mantengan por encima de la CIM
Fig. 40: Efecto del ABC sobre el EPA de distintosantimicrobianos, en cepas con resistencia
intermedia y alta a penicilina
Fig. 41: Efecto del ABC sobre el EPA de penicilina,en cepas con resistencia intermedia y alta a
penicilina
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 199
durante todo el intervalo de dosificación. Existen numerosos datos clínicos que
documentan que la dosificación continua de ß-lactámicos es más eficaz que la
intermitente (Vogelman, 1986).
El todos los casos, el producto de la concentración por el tiempo de exposición (ABC
in vitro) se relaciona mejor con el EPA producido (Munckof, 1997). La media del producto
de la concentración por el tiempo de exposición, equivalente al ABC, tras un tiempo
de exposición de 1 hora, con los distintos antimicrobianos, son 1,44; 0,32; 0,38; 0,30
y 1,55 horas, mientras que los obtenidos tras 2 horas de exposición suelen ser
mayores: 2,56; 2,79; 0,53; 0,24 y 3,1 horas (Tablas 44 y 45).
La tendencia de los resultados se representan en el mediante curvas de que
presentan unos coeficientes de determinación excelentes: imipenem (r2=0,82);
vancomicina (r2=0,53); ceftriaxona (r2=0,71) y esparfloxacino (r2=0,63), salvo
penicilina (r2=0,35) (Fig.40)
Apreciamos un comportamiento similar del EPA/ABC respecto al de la
EPA/concentración, y así en cepas altamente resistentes a penicilina (CIM ≥ 2
µg/mL) no empiezan a manifestar EPA hasta superar una ABC ≥ 2 µg*hr/mL y un
coeficiente de correlación de (r2=0,85). Por
el contrario las cepas con resistencia
intermedia empiezan a mostrar EPA desde
el principio, también con un buen coeficiente
de correlación (r2=0,74) (Fig. 41)
De igual forma, ceftriaxona consigue
en cepas intermedias a ceftriaxona efecto
post-antibiótico a partir de concentraciones
por debajo de la CIM (r2=0,65), lo que
contribuiría a explicar la eficacia de altas
dosis de cefalosporinas frente a cepas con CIMctr ≤ 1 µg/mL (Fig. 42)
6.- Acción bactericida de los antimicrobianos en asociación
Se han descrito los resultados positivos in vitro e in vivo de numerosas
asociaciones antimicrobianas, alguna de las cuales: ß-lactámicos más vancomicina y
ß-lactámicos más fosfomicina, consideramos en este trabajo. Otras asociaciones
posibles frente a cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina, podrían ser ß-
Fig 42 Efecto del ABC sobre el EPA deceftriaxona, en cepas sensibles e intermedias a
ceftriaxona
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 200
lactámicos más fluorquinolonas (Jenkins, 1993; Giron, 1995; Gimeno, 1998; Nicolau, 1998) , ß-
lactámicos más aminoglucósidos (Gross, 1995; Scaglione, 1995; Schegel, 1995), o ß-lactámicos más
otro betalactámico (Jones, 1998; Klugman, 1995; Schmutzhard, 1995) que actúen de forma diferente
sobre las PFPs, ß-lactámicos más rifampicina (Tubau, 1996), fluorquinolonas más
glicopéptidos o rifampicina (Klugman, 1996b), y glicopéptidos más aminoglucósidos (Martínez,
1993)
6.1. - Efectividad de las asociaciones
6.1.1. - ß-lactámicos más vancomicina
La eficacia de distintas combinaciones de ß-lactámicos con glicopéptidos ha
sido publicada en numerosos artículos (Barr, 1990; Cassinat, 1994; Cabellos, 1995, Klugman, 1995;
Lhopital, 1996)
Friedland et al., (Friedland, 1993b, 1994c) encontraron sinérgica la asociación de
ceftriaxona con vancomicina frente a S. pneumoniae resistentes a penicilina y
cefalosporinas, tanto in vivo en modelo experimental de meningitis, como in vitro
mediante curvas de muerte. Klugman et al., (Klugman, 1995) en un estudio de meningitis
tratadas con diferentes pautas antibióticas, demuestran que los LCR de los
pacientes tratados con ceftriaxona más vancomicina presentaron mayor actividad
bactericida frente a S. pneumoniae con sensibilidad disminuída a ceftriaxona, que
los tratados con ceftriaxona sola, por lo que recomienda dicha asociación para el
tratamiento de las meningitis por cepas resistentes a cefalosporinas de tercera
generación.
Sin embargo otros trabajos no consiguen demostrar sinergia, Doit et al. (Doit,
1997) en un estudio multicéntrico sobre meningitis neumocócicas en niños tratados
con altas dosis de cefotaxima y vancomicina, mediante ensayos bactericidas en LCR
halla una interacción aditiva. Tubau et al. , (Tubau, 1996b) encuentra la asociación
ceftriaxona más vancomicina indiferente aunque con cierta actividad bactericida.
Chesney et al. (Chesney, 1995) publica un fracaso terapéutico inicial de un tratamiento
con ceftriaxona más vancomicina en paciente inmunocomprometido.
Las asociaciones de penicilina o ceftriaxona con vancomicina en nuestro
estudio (Figs. 27, 28, 31 y 32) no han demostrado sinergismo neto ( ≥ 2 log10) sobre
la acción del antimicrobiano más activo, sin embargo ambas combinaciones fueron
bactericidas, llegando a mostrar un sinergismo parcial (>1log10) a partir de las 6
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 201
horas incluso a concentraciones por debajo de la CIM, normalmente obtenibles en
LCR en casos de meningitis (Klugman, 1995b).
6.1.2. - ß-lactámicos más fosfomicina
Las asociaciones de ß-lactámicos más fosfomicina se han mostrado eficaces
frente a cocos grampositivos (Ferrara, 1997). Frente a S. pneumoniae Cassinat et al.
(Cassinat, 1994) mediante técnicas de concentraciones cruzadas, y Chavanet et al.
(Chavanet, 1995) mediante curvas de muerte e in vivo mediante coágulos infectados,
comprueba la eficacia de la asociación de fosfomicina a ceftriaxona o cefotaxima,
proponiendo su uso en el tratamiento de la infecciones neumocócicas. Nau et al. (Nau,
1995) con un modelo de meningitis neumocócica en conejo, a pesar de su buena
farmacocinética en el SNC, descarta por ineficaz el uso de fosfomicina en solitario,
pero por su efecto aditivo sobre la acción de la ceftriaxona, lo propone en
combinación cuando falla la monoterapia con cefalosporinas. Tubau, (Tubau, 1996c)
observa una sinergia total (FIC ≤ 0,5) en la combinación de ceftriaxona con
fosfomicina frente a una cepa de neumococo resistente a penicilina y cefotaxima; y
si bién encuentra un incremento de la actividad bactericida en la asociación de
penicilina más fosfomicina a las 6 horas, a las 24 horas la cepa estudiada desarrolló
resistencia a fosfomicina cuando se estudió en solitario o asociada a penicilina.
Nuestros resultados están de acuerdo con la eficacia de la combinación de
fosfomicina con ß-lactámicos, mostrando las combinaciones de penicilina o
ceftriaxona más fosfomicina efectos sinérgicos parciales desde las 6 horas,
alcanzando efectos sinérgicos netos (≥2log10) a las 8 horas (Figs. 29, 30, 33 y 34).
Si presumiblemente por su bajo peso molecular, la penetración en el SNC de
la fosfomicina no es afectada por la acción de la dexametasona, sería una ventaja
añadida que apoya el que se realicen los necesarios ensayos clínicos para asegurar
su eficacia.
6.2. - Eficacia de las proporciones
Para poder comparar la eficacia intrínseca de una determinada proporción,
dentro de una combinación de antimicrobianos, es necesario considerar los
resultados en términos relativos, a fin de reducir la influencia de la concentración. En
todos los casos la proporción más efectiva en términos relativos fue 1CIM + 1CIM,
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Discusión 202
salvo ceftriaxona más vancomicina que fue 1CIM ceftriaxona + 1/4CIM de
vancomicina. Y en general, la eficacia relativa de las asociaciones fue mayor,
cuando el antimicrobiano primario se encuentra a concentraciones CIM o 1/4CIM
(Figs. 35 y 36).
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Conclusiones 203
Conclusiones
1.- Dentro del rango estudiado de concentración del inóculo, y en las
condiciones bajo las que desarrollamos las técnicas, no apreciamos que un aumento
en la densidad del inóculo produzca un descenso de la acción bactericida.
2.- Encontramos que el medio de cultivo actualmente recomendado, caldo
Muller-Hinton ajustado en cationes y suplementado con sangre, proporciona un
incremento en la capacidad de desarrollo y mantenimiento de la viabilidad de las
cepas estudiadas.
3.- Frente a cepas de neumococos sensibles a penicilina, encontramos que ß-
lactámicos de primera linea como penicilina o ceftriaxona, mantienen una eficacia
bactericida excelente, sin que otros antimicrobianos estudiados en este trabajo
aporten ventajas significativas, salvo casos de hipersensibilidad medicamentosa.
4.- Frente a cepas con resistencia intermedia a penicilina, la ceftriaxona ofrece
buenos resultados, siendo otras posibles opciones el imipenem, o la asociación de
vancomicina a ceftriaxona o cefotaxima.
5.- Frente a cepas con alta resistencia a penicilina consideramos más
recomendable el uso de antimicrobianos alternativos como el imipenem, siendo la
asociación de ceftriaxona con vancomicina otra opción.
6.- La actividad bactericida in vitro del esparfloxacino se muestra adecuada
frente a cepas sensibles y resistentes a penicilina, por lo que consideramos que las
fluorquinolonas deben estudiarse como alternativa terapéutica en los procesos
graves por neumococos resistentes a ß-lactámicos.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
Conclusiones 204
7.- En los rangos de concentración y tiempo de exposición estudiados, los
EPAs producidos por todos los antimicrobianos, no son de suficiente magnitud para
apoyar una administración que no mantenga niveles constantes por encima de las
CIMs.
8.- El hecho de que las cepas altamente resistentes a penicilina no manifiesten
EPAs a concentraciones por debajo de las CIMs, lo consideramos como un aspecto
más de la resistencia a penicilina.
9.- Por el contrario, el hecho de que se produzca algún grado de EPA con
ceftriaxona a concentraciones por debajo de la CIM, frente a cepas con sensibilidad
intermedia a ceftriaxona, está de acuerdo con el hecho de su eficacia en dichos
casos.
10.- La combinación ß-lactámicos más vancomicina, resulta normalmente
superior al antimicrobiano más activo. Aunque no hemos podido demostrar efecto
sinérgico, este hecho puede justificar su empleo clínico.
11.- La asociación de ß-lactámicos más fosfomicina resulta de una eficacia
mayor, llegando a conseguir efectos sinérgicos. Sin embargo son necesarias más
pruebas experimentales y clínicas para poder asegurar su eficacia en procesos
graves.
Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae
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Apéndices 269
Apéndice I: Curvas de letalidad
Apéndice II: Efecto post-antibiótico
Apéndice III: Combinación de antimicrobianos
Apendice I: Curvas de letalidad 249
Apéndice I: Curvas de letalidad
Apendice II: Efecto post-antibiótico 305
Apéndice II: Efecto post-antibiótico
Apendice II: Combinaicón de antimicrobianos 327
Apéndice III: Combinaicón de antimicrobianos