UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

“OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA NUEVA LIPASA BACTERIANA DE ORIGEN MARINO ANTÁRTICO, CON ACTIVIDAD ENZIMATICA A BAJAS TEMPERATURAS,

EN SU FORMA NATIVA Y RECOMBINANTE”

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica

área de especialización en Bioquímica de Proteínas Recombinantes, y Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímica

Por:

GIANNINA ANGÉLICA ESPINA SILVA

Directores de Tesis

Dr. Juan Asenjo Dra. Barbara Andrews

SANTIAGO- CHILE 2010

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN

TESIS DE MAGISTER

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Magister presentada por la candidata:

GIANNINA ANGÉLICA ESPINA SILVA

Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Magister en Bioquímica área de especialización Bioquímica de Proteínas Recombinantes, en el examen de defensa de Tesis rendido el día 06 de Octubre del 2010. Directores de Tesis:

Dr. Juan Asenjo ___________________________

Dra. Barbara Andrews ___________________________ Comisión Informante de Tesis:

Dra. Inés Contreras (Presidenta) ___________________________

Dra. Ana María Kettlun ___________________________

Dra. Marta Mancilla ___________________________

Dedico esta tesis y estas palabras

a mi hermano Sergio

El esfuerzo solo proporciona plenamente su recompensa,

después de que una persona se niega a darse por vencida.

Napoleón Hill

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AGRADECIMIENTOS

En estos momentos, cuando ya me encuentro próxima a concluir una de las etapas más importantes de mi vida, me siento en el deber de agradecer a todos quienes directa o indirectamente hicieron posible el que hoy esté a punto de titularme y pronta a ser, por fin, una Bioquímica. Para cumplir con este objetivo, uno de los requisitos, por cierto el más difícil, largo, tedioso, pero a la vez gratificante y el más enriquecedor para mi formación como profesional, ha sido la realización de la presente tesis. La cual fue desarrollada en el Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología (CIByB), Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Universidad de Chile, gracias al financiamiento otorgado por el Proyecto ICM-P05-001-F, del Instituto de Dinámica Celular y Biotecnología (ICDB).

Quiero agradecer a mis directores de tesis el Dr. Juan Asenjo y la Dra. Barbara Andrews, por recibirme en el laboratorio y por confiar en mí y en mi trabajo, además de apoyarme y ayudarme en todo lo relacionado con el desafió que enfrentaré próximamente

Así también, quiero dar las gracias a Patricia Martínez, por escucharme y ayudarme siempre en todo lo que he necesitado desde mi primer día en el laboratorio, tal como Nancy Carrasco, a quien a lo largo de estos meses, le hice innumerables preguntas y peticiones a las que siempre respondió con una sonrisa. También quiero agradecer a la Profesora Oriana Salazar, a quien recurrí cada vez que me surgía alguna duda (las que también fueron incontables ocasiones) y de quien admiro su increíble capacidad de saber todo lo uno le pregunte. A las tres les agradezco la excelente disposición y buena voluntad que tuvieron conmigo para atenderme y guiarme siempre.

A Loreto Parra, por introducirme en esta investigación y haber tenido la paciencia de enseñarme cuando aún no contaba con los conocimientos suficientes. A la Dra. Casilda Mura, quien se dio el tiempo de escucharme e intentar ayudarme y a Álvaro Olivera, de quien recibí las recomendaciones que me permitieron avanzar, cuando todas las cosas que intentaba no estaban dando buenos resultados.

Por supuesto también quiero agradecer a mis amigos del laboratorio, compañeros de alegrías y frustraciones, con los que se hicieron mucho más gratos los intensos días realizando experimentos:

En primer lugar a Iván Gajardo, quien desde que entramos a la carrera tuvo la excelente disposición de enseñarme, por esa época en donde nuestras preocupaciones eran estudiar para las pruebas y no si es que resultaba un PCR. Quiero agradecerle todas las veces en que me ayudó, y toda la buena onda con la que siempre consiguió hacerme reír y subirme el ánimo, agradezco además, todo su tiempo y ayuda con el análisis bioinformático realizado en la última parte de esta tesis.

A Vida Rodríguez, a quien acudí todas las veces en que me ví atormentada por alguna metodología o resultado, recibiendo siempre su amabilidad y ayuda. A Anita Quiroga quien fue víctima (junto a la profe Oriana), de todas mis dudas existenciales relacionadas con la expresión de proteínas, escuchándome e indicándome que más podía hacer, cuando se me comenzaban a acabar las ideas.

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A Patricia Lozada, que aunque la conocí cuando mi trabajo en el laboratorio estaba casi finalizando, me ayudó mucho y le agradezco todas las veces que se ha preocupado de mi y me ha dado esperanzas.

A mi amiga Daniela Sandoval, quien ha sabido ayudarme no solo en lo experimental sino que en todos los aspectos cotidianos, a quien he recurrido muchísimas veces, siempre recibiendo algún sabio consejo. Gracias por calmarme con tu seguridad y esa increíble capacidad de encontrar siempre una buena solución a todo, enfrentando las cosas sin tiempo que perder.

Obviamente también quiero agradecerle a todas las niñas que me alegran los días en el CIByB: Camila Wilkens, Gabriela Sandoval, Francesca Mercado, María Patricia Romero, Anamaría Sánchez, María Paz Merino, Alicia Lucero, Daniela Vaisman. Y los niños, Sergio Mercado quien siempre me alienta y logra contagiar su entusiasmo, Alexis Petersen y Miguel Ángel Campodonico. También quiero mencionar a aquellos con quienes ya no comparto porque emigraron del laboratorio, pero que fueron muy importantes cuando recién llegué: Catalina Montecinos, Alejandra Guerrero, Alejandro Salinas, Maricelle Delpiano, Tomás Niklitschek, Ricardo Pezoa, Adriana López y Marcela Vega.

Agradezco y atesoro los momentos y emociones compartidas con todos ustedes, y con orgullo puedo decir que fue un placer haber tenido la oportunidad de conocerlos y trabajar juntos. .

Me gustaría también, darles las gracias a mi comisión evaluadora, las Doctoras: Ana María Kettlun, Marta Mancilla e Inés Contreras, por su tiempo, paciencia, dedicación y exhaustivas correcciones. Al cuerpo académico de nuestra Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, cuya labor docente se encarga de abrirnos las puertas e inspirar nuestra búsqueda hacia nuevos conocimientos. Y en especial, a las Profesoras Daniela Seelenlenfreund, María Antonieta Valenzuela, y Mercedes Zaldívar por orientarme a lo largo de estos años y enseñarme el gusto de estudiar y desarrollar esta hermosa carrera. Admiro y agradezco la vocación y amor con el cuál realizan ciencia y docencia.

Por último, pero no menos importante, quiero agradecer a todas las personas que no se relacionan directamente con esta investigación, pero que sin ellas yo no habría podido llevarla a cabo. Por esta razón, quisiera agradecer el apoyo constante y la paciencia de todos aquellos que me han acompañado a lo largo de este recorrido:

En primer lugar mi mamá, María Angélica Silva, quien siempre ha encontrado el momento adecuado para decirme la palabra precisa justo cuando más lo he necesitado, enseñándome, cuidándome y brindándome todo el amor y comprensión desde que nací. A mi hermano Sergio Eduardo Espina por escucharme y estar conmigo en las buenas y en las malas, sacándome más de alguna sonrisa con su gran sentido del humor, a él dedico esta tesis con la intención de mostrarle que al final, todos los esfuerzos valen la pena y las cosas se logran cuando uno de verdad se lo propone y da lo mejor de sí para alcanzar una meta, quiero decirle que aunque después estemos lejos, nunca se rinda, confíe y siga adelante enfrentando y superando todos los obstáculos que se le interpongan. Quiero agradecer también a mi padre, Sergio Espina, quien siempre ha creído y confiado en mí más que yo misma, y que con su esfuerzo, aciertos y equivocaciones, me entregó las herramientas para poder ser quien soy ahora.

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Quiero dar las gracias, en especial, a mi amor y compañero de vida, Carlo Cortés, quien siempre me ha apoyado y demostrado cuanto me ama frente a cada circunstancia que hemos atravesado juntos, agradezco el haberte conocido y que tú que me hayas elegido y estés dispuesto a todo conmigo. Gracias por darme paz en los momentos difíciles y por iluminar mis días y mi vida con tu maravillosa forma de ser, tus cariños e infinitos gestos y detalles, tus palabras de aliento, optimismo y la energía que me das cuando a mi se me acaba. Agradezco la paciencia y comprensión que haz tenido, sobretodo este último tiempo, en el que muchas veces me vi consumida por los experimentos, gracias por esperarme siempre con los brazos abiertos y el mejor de los ánimos. Gracias por hacerme inmensamente feliz todos los días y por tener el valor y las ganas de querer enfrentar junto a mí los desafíos y aventuras que el futuro nos depare, confiando y creyendo que los dos seremos capaces de superar lo que se nos venga por delante.

También quiero aprovechar de agradecerles a mis grandes amigos, con los que siempre he podido contar, compartiendo juntos las cosas buenas, así como las que no lo han sido tanto:

A mi querida amiga Fabiola Altimira, quien a pesar de la distancia, me ha acompañado día a día y cuya sabiduría, valores y forma de ser, me han enseñado a ser mejor persona. Agradezco todas nuestras especiales conversaciones a lo largo de estos años, en las que siempre me haz mostrado el lado bueno de las cosas y que con fe y valor todo se alcanza. Admiro y aprecio inmensamente nuestra hermosa amistad y confianza, que nos ha llevado a que tú seas la cómplice de todos nuestros sueños.

Le agradezco también a Fabián Salazar y José Manuel Jiménez por todo su tiempo y conversaciones en las que siempre me han guiado para que pueda ver las cosas de forma más pragmática, por ayudarme con los ramos a lo largo de la carrera y por provocar en mí una gran admiración hacia ambos. También quiero agradecer a Naria Oyanedel por todo su tiempo, preocupación, energía, buena voluntad y disposición, con la que me ha ayudado y aconsejado en variadas oportunidades. A Javiera Bravo quien con su simpatía supo hacerme las críticas constructivas necesarias, en su debido momento, las que significaron un verdadero aporte a mi trabajo. Y por supuesto a Jennylee Chameng y Ta-Ying Zhong, quienes siempre logran hacerme sentir bien con su gentileza y ternura. Agradezco a todos su apoyo, compañía y los gratos momentos que hemos disfrutado juntos a lo largo de estos ya 7 años.

De la misma manera, quiero dar las gracias por todo el cariño, preocupación, cuidados y apoyo que he recibido de mi querida suegra Ximena Fernández así como de Rosa Angélica Hernández, quienes me han contenido y acogido como a una hija. También les quiero agradecer a Cristian Fernández y Carolina Quinteros, quienes tuvieron el interés y supieron justo como ayudarme cuando más lo necesite, dándome los ánimos necesarios para que no me rindiera cuando quedaba tan poco.

Finalmente, quiero mencionar también, a quienes han estado, se han preocupado y han confiado y creído en mi: mi abuelita Irma Zuñiga, mis padrinos Loreto Silva y Claudio Silva, mis tíos Francisco Espina y Rosa Poblete, la Familia Fuentes Fernández, Fernando Antonio Sabattini, Carlos Morales, Felipe Morales, Matías Morales, Tamara Fernández, Antonia Pacheco, Alicia Oyanedel, Fernando Medina, mi hermano Harold Espina, mi prima Carolina Castañeda, mis amigas Fabiola Morales y Javiera Riveros, y a quienes, sin querer, puedo estar olvidando en este instante.

¡Muchas Gracias a Todos!

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA AGRADECIMIENTOS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS LISTA DE ABREVIATURAS RESUMEN ABSTRACT I. INTRODUCCIÓN

I.1 Uso Biotecnológico de las Enzimas I.2 Enzimas Comerciales: Lipasas I.3 Estructura y Mecanismo Catalítico de Lipasas I.4 Fuentes de Lipasas I.5 Organismos Psicrófilos, Fuente de Lipasas Activas a Bajas Temperatura I.6 Características de las Lipasas Bacterianas Activas a Bajas Temperaturas I.7 Obtención de Lipasas Activas a Bajas Temperaturas I.8 Proyecto de Tesis I.8.1 Hipótesis I.8.2 Objetivos

I.8.2.1 Objetivo General I.8.2.2 Objetivos Específicos II. MATERIALES Y MÉTODOS II.1 Materiales II.1.1 Reactivos II.1.2 Cepas bacterianas II.1.3 Sistemas Recombinantes II.1.4 Sistemas Comerciales II.1.5 Enzimas II.1.6 Oligonucleótidos II.1.7 Materiales de purificación II.1.8 Material de plástico II.1.9 Material de vidrio II.1.10 Equipos II.1.11 Herramientas computacionales

II.1.11.1 Programas II.1.11.2 Sitios Web

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II.2 Métodos II.2.1 Cultivo de microorganismos psicrófilos II.2.2 Extracción ADN genómico de bacterias antárticas II.2.3 Determinación de pureza y concentración de ADN II.2.4 Electroforesis de ADN II.2.5 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa II.2.6 Amplificación del gen ADNr 16S mediante PCR II.2.7 Obtención de genes codificantes de lipasas mediante Genome Walking

II.2.7.1. Diseño de partidores para la obtención de la secuencia río arriba y río abajo de los fragmentos ya secuenciados de genes codificantes de lipasas y construcción del oligo-adaptador

II.2.7.2 Digestión del ADN genómico con enzimas de restricción y extensión II.2.7.3 Construcción de la genoteca-adaptador

II.2.7.4 Amplificación de los extremos río arriba 5’ y río abajo 3’ del gen codificante de lipasa

II.2.8 Obtención de genes codificantes de lipasas utilizando partidores diseñados en base a la secuencia del gen de Shewanella frigidimarina. II.2.9 Secuenciación de ADN y análisis de secuencia

II.2.9.1 Complementación de la secuencia del gen codificante de lipasa II.2.9.2 Construcción de árboles filogenéticos II.2.9.2.1 A partir de las secuencias parciales del ADNr 16S II.2.9.2.1 A partir de las secuencias aminoacídicas de las proteínas lipasas II.2.10 Clonamiento del gen codificante de lipasa en los vectores de expresión II.2.10.1 Diseño de partidores II.2.10.2 Amplificación del gen codificante de lipasa mediante PCR II.2.11 Ligación a los vectores de clonamiento y expresión II.2.11.1 Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy II.2.11.2 Ligación en los vectores de expresión pET22b(+) y pMAL-c2E II.2.12 Preparación de células electrocompetentes II.2.13 Transformación de células electrocompetentes

II.2.14 Selección de clones con inserto II.2.14.1 En el vector pGEM-T Easy II.2.14.2 En los vectores pET22(b+) y pMAL-c2E II.2.15 Minipreparación de ADN plasmidial II.2.16 Digestión del ADN plasmidial II.2.17 Producción de proteínas

II.2.17.1 Sistema de expresión E. coli BL21(D3E)/pET22b(+) II.2.17.2 Sistema de expresión E. coli BL21(DE3)/pMAL-c2E II.2.17.3 Lipasa psicrófila nativa de la cepa E5 II.2.18 Medición del crecimiento celular II.2.19 Obtención de las distintas fracciones celulares

II.2.19.1 Fracción sobrenadante II.2.19.2 Fracción periplasmática II.2.19.3 Fracción citoplasmática o soluble II.2.19.4 Fracción insoluble II.2.20 Comprobación de la correcta extracción de las distintas fracciones celulares II.2.21 Ensayo con inhibidor de proteasas PMSF II.2.22 Ensayo de toxicidad de la lipasa recombinante

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II.2.23 Determinación de la concentración de proteínas II.2.24 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida II.2.25 Tinción de geles II.2.25.1 Azul de Coomassie II.2.25.2 Nitrato de plata II.2.26 Medición de actividad lipolítica II.2.26.1 Ensayo de actividad en medio sólido II.2.26.2 Ensayo de actividad en medio líquido II.2.26.3 Ensayo de actividad in situ II.2.27 Purificación de la lipasa II.2.27.1 Sistema de expresión E. coli BL21(D3E)/pET22b(+) II.2.27.2 Sistema de expresión E. coli BL21(D3E)/pMAL-c2E II.2.27.3 Nativa III. RESULTADOS III.1 Cultivo de los microorganismos psicrófilos productores de lipasas III.2 Extracción de ADN genómico de las cepas bacterianas antárticas productoras de lipasas III.3 Análisis filogenético del ADNr 16S de las bacterias marinas antárticas III.4 Obtención de genes codificantes para lipasas mediante técnica de Genome Walking III.4.1 Pruebas de digestión del ADN genomico de las distintas cepas III.4.2 Elongación y amplificación de los extremos 3’ y 5’ de los genes codificantes para lipasas.

III.5 Análisis de las secuencias obtenidas mediante Genome Walking de genes codificantes de lipasas III.6 Amplificación del gen codificante de lipasa de la cepa E13 y clonamiento en los vectores de expresión III.7 Obtención de de genes codificantes para lipasas mediante el uso de partidores diseñados desde la secuencia del gen de Shewanella frigidimarina III.8 Análisis de las secuencias aminoacídicas codificadas por los genes obtenidos mediante el uso de partidores diseñados desde la secuencia del gen de la bacteria Shewanella frigidimarina III.9 Análisis de las secuencias de lipasas obtenidas III.10 Selección del gen codificante de lipasa de la cepa E5 y clonamiento en los vectores de expresión III.11 Expresión de la lipasa recombinante III.12 Ensayo de toxicidad del gen codificante de lipasa de la cepa E5 III.13 Inducción de la síntesis de la lipasa recombinante con 0,01 mM de IPTG III.14 Ensayo con inhibidor de proteasas PMSF III.15 Ensayo de actividad lipolítica en medio sólido de las fracciones celulares de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+) y pMAL-c2E III.16 Purificación de la lipasa recombinante III.16.1 Desde la fracción periplasmática E.coli BL21(DE3)/pET22(b+) III.16.2 Desde la fracción citoplasmática de las células E.coli BL21(DE3)/pMAL-c2E

III.17 Ensayo de actividad en medio líquido a distintas temperaturas de la lipasa recombinante expresada por el sistema pET22(b+)

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III.18 Obtención de la proteína Lipasa nativa de la cepa bacteriana antártica E5 III.19 Ensayo de actividad lipolítica en medio sólido de las fracciones celulares de la cepa bacteriana antártica E5 III.20 Purificación de la proteína Lipasa nativa III.20.1 Ensayo de actividad lipolítica en medio líquido de las fracciones obtenidas mediante la purificación por cromatografía de exclusión en gel de la lipasa nativa III.20.2 Ensayo de actividad lipolítica in situ de las fracciones obtenidas mediante la purificación por cromatografía de exclusión en gel de la lipasa nativa III.20.3 Ensayo de actividad en medio líquido a distintas temperaturas de la proteína lipasa nativa purificada III.20.4 Ensayo de actividad en medio líquido a distintos pH de la proteína lipasa nativa purificada

III.21 Análisis bioinformático de las características estructurales y funcionales de la lipasa codificada por el gen aislado de la cepa E5

IV. DISCUSIÓN IV.1 Análisis filogenético de la secuencia parcial del ADNr 16S de las bacterias marinas antárticas IV.2 Búsqueda de las secuencias de genes codificantes de lipasa mediante Genome Walking IV.3 Clonamiento del gen codificante de lipasa de la cepa E13 IV.4 Análisis de las secuencias de lipasas obtenidas IV.5 Expresión recombinante del gen codificante de lipasa de la cepa E5 IV.6 Toxicidad del gen codificante de lipasa de la cepa E5 IV.7 Obtención de una lipasa recombinante funcional y activa a bajas temperaturas utilizando el sistema de expresión E. coli BL21(DE3)/pET22(b+) IV.8 Estudio de la lipasa nativa E5 IV.9 Proyecciones y alcances de este trabajo de tesis

V. CONCLUSIONES VI. BIBLIOGRAFÍA

VII. ANEXO VII.1 Curvas de Calibración VII.1.1 Curvas de calibración de crecimiento de biomasa VII.1.2 Curva de calibración ensayo de Bradford VII.1.3 Curva de calibración ensayo de actividad lipolítica en medio líquido VII.1.4 Curva de calibración cromatografía por filtración en gel

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VII.2 Secuencias nucleotídicas parciales de ADNr 16S VII.2.1 Cepa A19 VII.2.2 Cepa B2 VII.2.3 Cepa B9 VII.2.4 Cepa E5 VII.2.5 Cepa E13 VII.2.6 Alineamiento Secuencias nucleotídicas parciales del ADNr 16S VII.3 Secuencias de genes codificantes de lipasas obtenidos VII.3.1 Mediante Genome Walking VII.3.1.1 Secuencia nucleotídica parcial (89%) del gen codificante de lipasa de la cepa E5 VII.3.1.2 Secuencia nucleotídica del gen codificante de lipasa de la cepa E13 VII.3.2 Mediante partidores diseñados en base a secuencia del gen codificante de lipasa de Shewanella frigidimarina VII.3.2.1 Cepa A19 VII.3.2.2 Cepa B9 VII.3.2.3 Cepa E5 VII.3.3 Alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas de los genes codificantes de lipasas de las cepas A19, B2,B9, E5, E13 y Shewanella frigidimarina

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24. Figura 25. Figura 26.

Diagrama del plegamiento α/β-hidrolasa. Mecanismo catalítico de lipasas. Diagrama de técnica de Genome Walking. Colonias identificadas como productoras de lipasas. Análisis electroforético del ADN genómico extraído de las cepas productoras de lipasas. Análisis electroforético del producto de amplificación del ADNr 16S. Árbol filogenético construido a partir de las secuencias ADNr 16S. Análisis electroforético de las pruebas de digestión del ADN genómico de las cepas bacterianas. Análisis electroforético de la amplificación por Genome Walking. Secuencia aminoacídica codificada por el gen de la cepa E13 obtenido por Genome Walking. Resultado de la búsqueda de dominios conservados para la secuencia obtenida de la cepa E13. Análisis electroforético del producto de amplificación del gen codificante de lipasa de la cepa E13 obtenido mediante Genome Walking. Análisis electroforético de la amplificación de los genes codificantes de lipasas utilizando partidores diseñados en la secuencia de Shewanella frigidimarina. A.- Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica de la lipasa de la cepa A19. B.- Resultado de la búsqueda de dominios conservados. A.- Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica de la lipasa de la cepa B9. B.- Resultado de la búsqueda de dominios conservados. A.- Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica de la lipasa de la cepa E5. B.- Resultado de la búsqueda de dominios conservados. Alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídicas codificadas por los genes de lipasas. Árbol filogenético de las proteínas lipasas. Análisis electroforético de la digestión de los vectores de expresión. Gráfico efecto del inductor en células E. coli BL21/(DE3) transformadas con vector pET22. Gráfico efecto del inductor en células E. coli BL21/(DE3) transformadas con vector pMAL-c2E. Efecto del inductor en células E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector pET22(b+). Efecto del inductor en células E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector pMAL-c2E. Gráfico efecto del inductor en células E. coli BL21/(DE3) transformadas con vector pET22. Análisis electroforético de las distintas fracciones celulares de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+) Ensayo de actividad lipolítica en medio sólido, de las distintas fracciones celulares de bacterias E. coli BL21 transformadas con el vector pET22(b+).

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Figura 27. Figura 28. Figura 29. Figura 30. Figura 31. Figura 32. Figura 33. Figura 34. Figura 35. Figura 36. Figura 37. Figura 38. Figura 39. Figura 40. Figura 41. Figura 42. Figura 43. Figura 44. Figura 45. Figura 46. Figura 47. Figura 48. Figura 49. Figura 50.

Análisis electroforético de las distintas fracciones colectadas en la purificación con resina de níquel del periplasma de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+). Análisis electroforético de las distintas fracciones colectadas en la purificación con resina de amilosa del citoplasma de las bacterias transformadas con el vector pMAL-c2E. Ensayo de actividad en medio líquido de las distintas fracciones celulares de las bacterias transformadas con el vector pET 22(b+). Ensayo de actividad lipolítica de las distintas las distintas fracciones celulares obtenidas de las bacterias marinas antárticas de la cepa E5. Cromatograma de la purificación por filtración en gel del sobrenadante de la cepa E5 cultivada en medio marino con aceite de oliva 1%. Gráfico actividad lipasa que presentó cada fracción de la cromatografía en filtración en gel del sobrenadante de la cepa E5. Análisis electroforético de las fracciones 19 a la 24. Ensayo de actividad lipolítica in situ de las fracciones 18 a la 24. Gráfico ensayo de actividad en medio líquido de la fracción n°24, realizado a distintas temperaturas. Gráfico Ensayo de actividad en medio líquido de la fracción n°24, realizado a distintos pH. Modelo tridimensional propuesto para la proteína codificada por la secuencia obtenida del codificante de lipasa de la cepa E13. Superposición estructural entre el modelo propuesto para la lipasa codificada por el gen aislado de la cepa E5 con el molde PDB de la proteína brefeldina A de Bacillus subtilis. Orientación de residuos del sitio activo para los diferentes modelos estructurales. Alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídica de la proteína brefeldina A esterasa de la bacteria Bacillus subtilis con la secuencia aminoacídica codificada por el gen de lipasa de la cepa E5. Alineamiento de la secuencia nucleotídica del gen amplificado con los partidores E13pET22F, E13pET22R, E13pMALF y E13pMALR. Análisis mediante UNIPROT de la secuencia del gen codificante de lipasa de la cepa Shewanella frigidimarina. Curva de calibración masa seca de bacterias E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector LipE5pET22. Curva de calibración masa seca de bacterias E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector LipE5pMAL-c2E. Curva de calibración masa seca de cepa bacteriana marina antártica E5. Curva de calibración de concentración de BSA. Curva de calibración de concentración ρ-nitrofenol. Curva de calibración para determinación de tamaño molecular. Alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas parciales del ADNr 16S de las 5 cepas bacterianas antárticas. Alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas de los 4 genes codificantes de lipasas obtenidos y el de Shewanella frigidimarina.

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Tabla 5. Tabla 6. Tabla 7. Tabla 8. Tabla 9. Tabla 10. Tabla 11. Tabla 12.

Reactivos. Enzimas de Restricción. Oligonucleótidos. Equipos. Análisis mediante BLASTn de las secuencias parciales del ADNr 16S. Secuencias parciales de genes obtenidas mediante Genome Walking. Análisis del porcentaje de secuencia conocido de los genes codificantes de lipasas obtenidos. Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica codificada por el gen de lipasa. Diseño experimental de pruebas de inducción para optimizar la producción de la lipasa. Unidades de actividad lipasa y actividad específica obtenidas del ensayo en medio líquido de la fracción periplasmática de las bacterias transformadas con LipE5pET22. Resultado de la determinación del peso molecular aproximado según volumen de elución de las fracciones 21 a 24. Proteínas descritas en base de datos PDB, relacionadas estructuralmente con el modelo propuesto para la secuencia de la proteína lipasa obtenida de la cepa E5.

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LISTA DE ABREVIATURAS

aa Aminoácidos ADN Ácido desoxirribonucleico ADNr Ácido desoxirribonucleico ribosomal ARN Ácido ribonucleico ATP Adenosíntrifosfato BLAST Herramienta de búsqueda de alineamientos locales BRENDA Base de datos de Enzimas BSA Seroalbúmina de bovino CDD Base de datos de dominios conservados CIByB Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología ºC Grados Celsius CODEHOP Oligonucleotidos degenerados de regiones de consenso dATP Desoxi-adenina trifosfato dCTP Desoxi-citosina trifosfato dGTP desoxi-guanina trifosfato dNTPs Deoxiribonucleótidos trifosfato DO Densidad óptica DTT Ditiotreitol dTTP Desoxi-timina trifosfato EBI Instituto Bioinformático Europeo EDTA Etilendiaminotetraacetato EMBL Laboratorio de Biología Molecular Europeo g Fuerza de gravedad g Gramo h Hora HCL Acido clorhídrico HSL Lipasa sensible a hormonas ICDB Instituto de Dinámica y Biología Celular IMAC Cromatografía de afinidad por metales IPTG Isopropil tio-β-D-galactósido Kbp Kilo pares de bases kDa Kilo Dalton L Litro LB Medio Luria-Bertani M Molar MBP Proteína de unión a maltosa min Minutos µF Microfaradios µL Microlitros µM Micromolar mg Miligramos mL Mililitros mM Milimolar

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ms nº NCBI

Milisegundos Número Centro Nacional (EE.UU) de Información Biotecnológica

ηg Nanogramos nm Nanómetros NTA Acido nitriloacético ONPG orto-nitrofenilgalactopiranosido ORF Marco de lectura abierto PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa pH Potencial hidrógeno pI Punto Isoeléctrico PDB Banco de datos de proteínas PIR Recurso de Información de Proteínas ρM Picomolar PMSF Parametilsulfonilfluoruro ρ-NFC Paranitrofenilcaprato PSA Persulfato de amonio RB Medio Rich Broth rpm Revoluciones por minuto s SDS

Segundos Dodecil sulfato de sodio

SIB Instituto Bioinformático Suizo TB Medio Terrific Broth TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina Tº Temperatura TAE Tampón Tris Acetato EDTA TES Tampón Tris EDTA Sacarosa Tm Temperatura de alineamiento Tris Tris-(hidroximetil)-aminoetano Tween Monolaureato de polioxietileno sorbitano U Unidad enzimática UK Reino Unido USA Estados Unidos UV Radiación ultravioleta V Voltio X-GAL 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

xvii

RESUMEN

Las lipasas son enzimas con un gran potencial biotecnológico y altos niveles de

demanda pues son utilizadas en múltiples aplicaciones a nivel industrial. Las lipasas que se

encuentran disponibles en el mercado son, en su mayoría, de origen microbiano mesófilo y

presentan actividad enzimática a 50ºC. Por esta razón, muchas veces ven reducida su eficiencia

al enfrentarse a condiciones industriales, requiriendo el uso de energía calórica adicional, que se

traduce en un incremento en los costos de los procesos. En base a lo anterior, el propósito de

esta tesis es la obtención de una nueva lipasa con actividad enzimática a bajas temperaturas.

Sabiendo que una buena fuente de este tipo de enzimas son los organismos psicrófilos,

dado que su metabolismo se encuentra adaptado para sobrevivir y crecer en condiciones

extremas de frío, se trabajó con 5 distintas cepas bacterianas de origen marino antártico

productoras de lipasas. A partir de ellas se logró completar 4 secuencias de genes codificantes

de lipasas. Estas presentaban alta identidad entre sí, a pesar de provenir de especies diferentes, y

con la proteína lipasa codificada en el genoma de la bacteria Shewanella frigidimarina, siendo

distantes filogenéticamente a todas las demás lipasas descritas.

Se seleccionó el gen de la cepa identificada como E5 y se clonó en dos vectores de

expresión (pET22(b+) y pMAL-c2E), utilizando como huésped heterólogo la bacteria E. coli

BL21(DE3). La expresión recombinante de la proteína lipasa se vió dificultada debido a que

ésta resultó ser tóxica. Sin embargo, luego de optimizar las condiciones de inducción y

utilizando el sistema de pET22(b+), se consiguió la expresión de una lipasa recombinante

funcional y activa a bajas temperaturas (15º-25ºC), en el periplasma del huésped mesófilo.

También se estudió la lipasa nativa producida por la cepa psicrófila E5 y se determinó que esta

enzima es extracelular, su expresión es inducida por aceite de oliva, es posible purificarla

mediante cromatografía de filtración en gel, presenta actividad enzimática entre 5º-25ºC entre

los pH 7 y 9. Para ambas lipasas obtenidas de la cepa E5, nativa y recombinante, se realizaron

distintos ensayos enzimáticos con los que se estableció que la primera presenta actividad

lipolítica frente a los sustratos tributirina y ρ-nitrofenilcaprato, mientras que la enzima nativa

presenta una mayor actividad frente a los mismos sustratos más α-naftilacetato. Finalmente

mediante un análisis bioinformático se construyó un modelo tridimensional de la proteína lipasa

de la cepa E5 la que resultó ser altamente homóloga en estructura y función con la proteína

esterasa brefeldina A de la bacteria Bacillus subtilis.

xviii

ABSTRACT

Lipases are enzymes with great biotechnological potential and high demand because

they are used in many industrial applications. Commercially available lipases are mostly of

microbial origin and have optimal enzymatic activity at 50° C. For this reason, they often are

less efficient in dealing with industrial conditions, requiring the use of additional energy, thus

increasing processing costs. The purpose of this thesis is to obtain a new lipase with high

activity at lower temperatures.

A good source of cold-active enzymes are psychrophilic microorganisms, as their

metabolism is well adapted to survive and thrive in extremely cold conditions. This work began

with five different strains of lipase producing Antarctic marine bacteria. Four complete

sequences of genes encoding lipases were obtained. These showed high identity among them,

despite being from different species, and also they showed high identity with the lipase gene of

the bacteria Shewanella frigidimarina, being phylogenetically distant to all other lipases

described.

The gene of the strain identified as E5 was selected and cloned into two expression

vectors (pET22(b+) and pMAL-c2E), using as a heterologous host the bacteria E. coli BL21

(DE3). The recombinant expression of the lipase protein was hampered because it proved to be

toxic. However, after optimizing the conditions of induction and using the pET22(b+) system,

the expression of functional recombinant lipase active at low temperatures (15º -25º C) was

achieved in the periplasm of the mesophilic host. Additionally the native lipase produced by the

psychrophilic strain E5 was studied and characterized. This enzyme is extracellular, its

expression is induced by olive oil, it can be purified by gel filtration chromatography, has

enzymatic activity between 5º -25º C and between pH 7 and 9.

Enzymatic assays were done for both lipases obtained from the strain E5, native and

recombinant, and it was established that the recombinant lipase has lipolytic activity against the

substrates tributyrin and ρ-nitrophenylcaprate, while the native enzyme shows higher activity

against the same substrates plus α-naphthylacetate. Finally, through a bioinformatics analysis, a

three-dimensional model of the protein lipase E5 strain was designed, which was highly

homologous in structure and function with brefeldin A esterase protein of the bacterium

Bacillus subtilis.

1

I. INTRODUCCIÓN

I.1 Uso biotecnológico de las enzimas

Según el Convenio sobre la Diversidad Biológica, firmado por las Naciones Unidas en

1992, la biotecnología se define como la aplicación de la biología e ingeniería para desarrollar

tecnologías basadas en el uso de organismos o partes de ellos, ya sean de forma natural o

modificada para la producción de bienes y servicios de valor para el hombre y/o la mejora de los

procesos ya existentes. Dentro de esto, las enzimas pueden verse como una alternativa

biotecnológica que permite mejorar procesos industriales al utilizarse como biocatalizadores, ya

que presentan ventajas con respecto a los catalizadores químicos. Las enzimas poseen

velocidades de reacción más elevadas, una especificidad de reacción mayor tanto con sus

sustratos como de sus productos, pueden modificar un único sustrato en una mezcla de sustratos

muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómeros de una mezcla racémica de un

compuesto quiral y casi no proporcionan productos laterales. Asimismo, son muy selectivas ya

que pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una molécula que tenga

varias posiciones modificables, y por último, requieren de condiciones de reacción más suaves

que los catalizadores químicos que usualmente necesitan temperaturas y presiones elevadas a

valores de pH extremos.

Las enzimas o catalizadores biológicos tienen un amplio espectro de aplicaciones en la

industria y en otras áreas relacionadas, su utilización ha llevado a mejorar los procesos y

productos de la empresa. El uso de enzimas es ecológicamente más favorable que otras formas

de producción, beneficiando tanto a operarios como al medio ambiente, reduciendo el consumo

de químicos y compuestos tóxicos, lo que finalmente disminuye costos e impacto ambiental.

Las industrias que incorporan el uso de enzimas dentro de sus procesos de producción, lo han

hecho además porque éstas les permiten ahorrar energía y reducir el consumo de agua,

aumentando la rentabilidad de los procesos.

Debido a esto, el mercado para la venta de enzimas con aplicaciones industriales y el

desarrollo e investigación de nuevas enzimas ha crecido enormemente en los últimos años. En el

año 2004, el mercado global de las enzimas industriales se estimó cercano a 2 billones de

2

dólares, en ese entonces se proyectaba alcanzar una tasa de crecimiento anual de sobre el 3% en

los 4 años siguientes, esperando que el mercado total de enzimas industriales alcanzáse los US$

2,4 billones en el 2009 (Joseph y col., 2008). Actualmente, sabemos que este crecimiento ha

sido aun mayor y de acuerdo con el Market Research Report publicado en World Enzymes en el

año 2007, el mercado mundial para las enzimas se espera que crezca 7,6% por año y llegue a

alcanzar los 6 billones de dólares en el año 2011 (Leary, 2009), por lo que este campo resulta

muy promisorio.

Las principales áreas industriales que tradicionalmente han utilizado enzimas en sus

procesos o productos finales son: las empresas de alimentos (alimentos para animales,

producción de cervezas, vinos, procesamiento de carnes, panadería, quesos, yogur, etc.),

empresas textiles, empresa de cueros y detergentes. En la última década nuevas áreas

industriales han comenzado a incorporar la utilización de enzimas en sus procesos, como por

ejemplo la industria del papel. En este caso, la utilización de enzimas ha permitido el

mejoramiento de su calidad, el ahorro de energía, menor utilización de agua y la disminución

del uso de agentes químicos en su proceso de producción. Otras áreas de mucha importancia

hoy en día son: la industria de los biocombustibles, acuicultura, biorremediación, entre otras.

Para que una enzima sea utilizada en un proceso industrial debe cumplir ciertos

requisitos, lo primero es que esté disponible, que permita disminuir los costos totales del

proceso en comparación a los catalizadores químicos, que existan adecuados métodos de

análisis para describirla y controlarla, y se debe conocer su especificidad y los activadores e

inhibidores que influyen en ella. Además, debe ser estable a las condiciones presentes en los

procesos industriales, como la temperatura, pH, concentración de sales y metales. Para cumplir

con estos requisitos, generalmente se utilizan microorganismos como fuentes de enzimas ya que

permiten un fácil manejo y alto rendimiento debido a que son de fácil cultivo y crecimiento, se

pueden encontrar enzimas extracelulares que son secretadas al medio de cultivo, es posible

producir grandes cantidades a bajo costo y finalmente, se pueden utilizar mutantes ya que existe

la posibilidad de producir enzimas recombinantes y optimizarlas a través de ingeniería genética

y diseño de proteínas.

3

I.2 Enzimas comerciales: Lipasas

La mayor comercialización de enzimas industriales en el mercado está compuesta por

las enzimas hidrolíticas como proteasas, amilasas, amidasas, esterasas y lipasas, estas últimas

han emergido como enzimas claves en el rápido crecimiento de la biotecnología debido a que

sus propiedades les permiten un amplio rango de aplicaciones industriales (Gupta y col., 2004).

Las lipasas son enzimas lipolíticas pertenecientes a la clase de enzimas hidrolasas

(E.C.3) y actúan en los enlaces éster (E.C.3.1) de los ésteres carboxílicos (E.C.3.1.1) presentes

en lípidos y sus derivados (Joseph y cols, 2008). Una lipasa verdadera se define entonces, como

una carboxilesterasa, que en condiciones acuosas cataliza la hidrólisis y síntesis de acilgliceroles

de cadena larga, siendo su sustrato natural el triacilglicerol, por lo que actualmente, también,

son conocidas como triacilglicerol hidrolasas (E.C.3.1.1.3). Esta reacción produce la liberación

de ácidos grasos, diacilglicerol, monoacilglicerol y glicerol (Villeneuve y col., 2000; Jaeger y

Eggert, 2002). Además catalizan un amplio rango de reacciones que incluyen hidrólisis e

interesterificación, alcoholisis y aminólisis entre otras (Jaeger y col. 1999).

Las lipasas son enzimas ubicuas, ampliamente distribuidas a lo largo de la mayoría de

las especies animales, plantas, hongos y bacterias, debido a que son importantes tanto en la

movilización de lípidos intracelulares como en la transferencia de estos entre organismos

(Beisson y col. 2000). Las lipasas en vista de sus actuales y potenciales aplicaciones, son

consideradas como una particular y prometedora clase de enzimas industriales. Además de sus

sustratos naturales, como ésteres insolubles en agua y triglicéridos, catalizan la hidrólisis y

síntesis enantioselectiva y regioselectiva de un amplio rango de ésteres naturales y no naturales.

Es por esto que las lipasas resultan tan atractivas y son ampliamente utilizadas por la

oleoquímica y la química orgánica (Schmidt-Dannert y col., 1998).

Las características que hacen de estas enzimas importantes biocatalizadores son:

i) Poseen grandes dominios proteicos para el reconocimiento de los grupos acilos de los

triglicéridos, lo que les permite interaccionar con muchos sustratos diferentes, sin

perjuicio de su capacidad de reconocer centros quirales (Arroyo, 2000).

4

ii) Han desarrollado una estructura estable al efecto denaturalizante que ejercen las

interfases donde actúan y por este motivo son también estables en los solventes

orgánicos. En un medio acuoso, el intermediario tetraédrico se hidroliza

inmediatamente regenerando la enzima y liberando el ácido. Si el medio está

constituido por un solvente orgánico, otro nucleófilo diferente al agua puede atacar al

intermediario acil-enzima con lo que se produce una reacción de síntesis. De este modo,

las lipasas pueden catalizar una gran variedad de reacciones reversas como:

esterificaciones, transesterificaciones, tiotransesterificaciones, aminólisis, oximólisis,

etc. Como ventaja adicional las lipasas no pierden su enantioselectividad en estas

condiciones.

iii) Han demostrado su utilidad en la resolución de mezclas racémicas de ésteres, ácidos

carboxílicos y alcoholes. La hidrólisis enantioselectiva de ésteres y alcoholes acetilados

se realiza en medio acuoso, mientras en medios orgánicos anhidros, las lipasas son

capaces de catalizar la esterificación o transesterificación enantioselectiva de ésteres a

partir de mezclas racémicas (Arroyo, 2000).

iv) No necesitan de cofactores (Jaeger y Eggert, 2002).

Debido a estas atractivas propiedades, el número de lipasas descritas se ha incrementado

considerablemente desde la década de los 80. Esto es principalmente resultado de enormes

logro3.6s alcanzados en el clonamiento y expresión de enzimas de microorganismos así como la

alta demanda por estos biocatalizadores. Varios procesos industriales en que se utilizan estas

enzimas han sido establecidos en términos de valores productivos, como un ejemplo

sorprendente, procesos a gran escala de más de 2.000 toneladas por año son operados por la

compañía alemana de productos químicos BASF para la resolución cinética de varias aminas

(Bornscheuer y col., 2002) ya que estas enzimas resultan muy efectivas en la síntesis de

compuestos ópticamente puros, es posible que más de 1.000 mezclas de diferentes sustancias

sean resueltas eficientemente usando lipasas.

En los últimos años ha ocurrido un gran aumento en el número de publicaciones en el

campo de las reacciones catalizadas por lipasas en solventes orgánicos comunes, líquidos

5

iónicos e incluso en solventes no convencionales. Investigaciones han mostrado que las

reacciones catalizadas por estas enzimas son realizadas más eficientemente que sus análogos

químicos (Joseph y col., 2008). Actualmente las lipasas han demostrado ser de gran utilidad en

la industria biotecnológica. En este campo se ha puesto especial atención en el uso de lipasas de

origen microbiano (Pandey y col., 1999) y se han establecido exitosamente aplicaciones

industriales utilizando lipasas en diversos ámbitos, como por ejemplo:

- En la industria alimenticia se utilizan con el fin de mejorar el proceso químico tradicional de

la manufactura de alimentos. También se ocupan en la producción de variados productos

como jugos de frutas, alimentos cocidos, fermentación de vegetales, sabores deseados en

quesos e interesterificación de grasas y aceites para producir acilgliceroles modificados

(Pandey y col., 1999).

- En la síntesis de químicos complejos, las lipasas son intermediarios claves en la síntesis de

componentes terapéuticos como antagonistas de calcio y antiinflamatorios como ibuprofeno

y naproxeno, agroquímicos como pesticidas, saborizantes y aromatizantes. Usualmente

estos son compuestos quirales y químicamente complejos que son difíciles de sintetizar con

métodos químicos (Jaeger y Eggert, 2002).

- En biosensores, ya que la determinación cuantitativa de triacilgliceroles es de gran

importancia no sólo a nivel clínico. Los biosensores lipídicos también son de gran utilidad

en la industria farmacéutica, alimenticia, de aceites y grasas y en el análisis de

contaminantes, especialmente pesticidas (Pandey y col., 1999).

- En la industria de los detergentes cada año se comercializan más de 1000 toneladas de

lipasas, estas enzimas junto a proteasas, amilasas y celulasas se adicionan a las

formulaciones de detergentes y en conjunto catalizan el rompimiento de enlaces químicos

con la adición de agua (Jaeger y col., 1999; Pandey y col., 1999). Este mercado representa

más del 40% del total de las ventas de enzimas (Marx y col., 2007).

- En la síntesis de biopolímeros, como polifenoles, polisacáridos y poliéster que muestran un

considerable grado de diversidad y complejidad. Estos materiales actualmente están

recibiendo gran atención debido a que son biodegradables y son producidos a partir de

6

recursos naturales renovables. Las lipasas son utilizadas como catalizadores para su síntesis,

en donde la principal ventaja es la alta selectividad (estereoselectividad, regioselectividad, y

quimioselectividad) bajo condiciones suaves de reacción. Monómeros estructuralmente

complejos con grupos reactivos multifuncionales son polimerizados en catálisis enzimáticas

de alto rendimiento usando lipasas disponibles comercialmente de diversas fuentes (Jaeger y

Eggert, 2002).

- En la producción de biodiésel, que es una fuente alternativa de energía producida

químicamente usando aceites de diversas plantas. Las lipasas son utilizadas para catalizar la

conversión de los aceites vegetales a ésteres alcohólicos de cadena corta, en una sola

reacción de transesterificación que ocurre en solventes orgánicos (Jaeger y Eggert, 2002).

El uso comercial de las lipasas es un negocio de billones de dólares debido a la amplia

variedad de aplicaciones industriales que compromete, y el enorme interés en estas versátiles y

multifacéticas enzimas, se ha visto reflejado por el crecimiento rápido en el número de

excelentes artículos, review y monografías que cubren la biología molecular, caracterización

bioquímica, estructura tridimensional y aplicaciones biotecnológicas de las lipasas, demostrado

en la aparición de un promedio de 1000 publicaciones originales al año sobre lipasas (Pandey y

col. 1999; Jaeger y Eggert, 2002).

I.3 Estructura y Mecanismo Catalítico de Lipasas

Algunas lipasas han sido purificadas y secuenciadas y su estructura tridimensional esta

disponible en el Protein Data Bank. Estas estructuras a pesar de que poseen diferentes

secuencias aminoacídicas y difieren en tamaño (22-60 kDa) se pliegan de la misma forma y

poseen sitios activos parecidos. El plegamiento de todas las lipasas corresponde al modelo α/β

hidrolasa, el que se muestra en la figura 1. Este consiste en ocho hebras β centrales dispuestas

en forma paralela a excepción de la segunda hebra β dispuesta en sentido antiparalelo. Las

hebras paralelas desde la β3 hasta la β8 están conectadas por α- hélices.

El sitio activo de las enzimas con este modelo de plegamiento consiste en tres residuos

catalíticos: un residuo nucleófilo (serina, cisteína o aspartato), un residuo catalítico ácido

7

(aspartato o glutamato) y un residuo de histidina, siempre en este orden en la secuencia de

aminoácidos. En las lipasas el nucleófilo es siempre una serina, que se encuentra en el

pentapéptido altamente conservado Gly-X-Ser-X-Gly que forma un doblez tipo γ entre la lámina

β5 y la α- hélice contigua, lo que forma la estructura más conservada del plegamiento α/β

hidrolasa. Como existe un contacto cercano entre los residuos, dos posiciones antes y dos

después de la serina, ambos son glicinas, aunque pueden ser sustituidos por otros residuos

pequeños como alanina, valina, serina o treonina. El residuo catalítico ácido (Asp-Glu) se

encuentra después de la hebra β7, está enlazado por un hidrógeno a la histidina del sitio activo,

sin embargo su posición puede ser variable. El tercer residuo catalítico en las lipasas es la

histidina que se ubica en un loop después de la hebra β8 del plegamiento α/β hidrolasa, el largo

y la conformación del loop son variables (Jaeger y col. 1999; Nardini y Dijkstra, 1999).

Adicionalmente, el sitio activo consta de tres hendiduras o bolsillos que acomodan las cadenas

acilos del sustrato triacilglicerol (denominados sn-1, sn-2, sn-3). El carácter hidrofóbico y el

tamaño de los bolsillos parecieran determinar la preferencia de sustrato, incluyendo la

enantioselectividad (Jaeger y col. 1999; Pleiss y col., 2000).

Figura 3. Diagrama del plegamiento α/β-hidrolasa. Las hélices α y las láminas β están

representadas por los cilindros y flechas, respectivamente. La ubicación de los residuos del sitio activo está señalada por círculos. Las líneas discontinuas indican la localización de posibles inserciones.

Las enzimas lipolíticas se caracterizan por el drástico aumento de actividad cuando

actúan en interfases lípido-agua de sustratos micelar o emulsificados, un fenómeno llamado

activación interfacial, este incremento en la actividad enzimática es gatillado por cambios

estructurales en la región del sitio activo de la lipasa. La acción catalítica de las lipasas se divide

en dos etapas. En solución acuosa, un segmento helicoidal de la cadena proteica denominado

8

“tapa”, que es un loop en la superficie de la proteína, cubre el sitio activo de la lipasa. En

presencia de una interfase o en un medio orgánico la “tapa” se abre, exponiendo la entrada al

sitio activo y favoreciendo la interacción de la enzima con el sustrato.

Como se puede observar en la figura 2, el sustrato se sitúa en el sitio activo de la lipasa

de tal manera que el carbono carboxílico del enlace éster toma contacto con el grupo hidroxilo

de la serina. El protón del grupo hidroxilo de la serina se transfiere al Nε de la histidina de la

triada catalítica y el Oγ con carga negativa ataca nucleofílicamente al grupo carboxilo del

sustrato con lo que se produce un intermediario tetraédrico. La carga negativa en un principio

situada en el Oγ de la serina, sufre una translocación hacia el oxígeno del grupo carboxilo,

originando un oxianión. Este oxianión encaja en una cavidad que se forma tras la apertura de la

“tapa”. El intermediario tetraédrico se rompe cuando el protón cedido a la histidina se transfiere

al oxígeno del alcohol. El alcohol se libera y seguidamente se forma el complejo acil-enzima. Se

produce un segundo intermediario tetraédrico que, a continuación se rompe, liberando un ácido

graso y regenerando el ion hidroxilo de la serina. La función del ácido aspártico o glutámico,

presente en la triada catalítica, es la estabilización de la carga positiva generada sobre la

histidina en los intermediarios tetraédricos (Arroyo, 2000).

Figura 4. Mecanismo catalítico de lipasas. En el esquema se indican los pasos involucrados en

la catálisis enzimática de las lipasas: unión del sustrato, formación del intermediario tetraédrico, formación de intermediario covalente y liberación del producto final y regeneración del catalizador. Si R3 = H, reacción de hidrólisis; si R3 ≠ H, reacción de alcohólisis o esterificación.

9

I.4 Fuentes de Lipasas

Por décadas, las lipasas han sido utilizadas a nivel industrial dadas las diversas

aplicaciones que presentan, sobre todo en el área biotecnológica (Jaeger y col., 1994). La

mayoría de las lipasas comerciales como por ejemplo: Lipomax® y Lumufast® de Danisco,

Genencor, Lipolase® y Lipozyme® de Novozymes, son enzimas extracelulares de origen

microbiano (Schmidt-Dannert C y col., 1998), provienen de organismos mesófilos (que crecen a

temperaturas moderadas) y requieren de temperaturas controladas sobre 40ºC para alcanzar una

adecuada actividad, ya que su temperatura óptima se encuentra entre los 30º y 50ºC con una

actividad máxima alrededor de los 45ºC. A menores temperaturas su eficiencia catalítica se ve

severamente reducida y su actividad disminuye ostensiblemente a los 0°C, pues su tasa de

reacción cae cercana a cero con las bajas temperaturas (Mayordomo y col., 2000). Sin embargo,

muchas de las aplicaciones en que se utilizan no necesitan temperaturas controladas de

operación, sino más bien de temperatura ambiental o de bajas temperaturas, situaciones en que

las lipasas mesófilas ven reducida su actividad. Las lipasas adaptadas o activas a bajas

temperaturas aparecen como una solución ideal frente a estos inconvenientes (Pandey y col.,

1999), puesto que estas muestran una alta actividad especifica en el rango de 0 - 20ºC

(Mayordomo y col., 2000).

I.5 Organismos Psicrófilos, Fuente de Lipasas Activas a Bajas Temperaturas

Las lipasas adaptadas o activas a bajas temperaturas se encuentran ampliamente

distribuidas en los microorganismos que sobreviven en temperaturas cercanas a 5ºC, estos son

denominados organismos psicrófilos ya que son capaces de vivir en condiciones extremas de

frío (temperaturas de -2 a 20ºC). Estos organismos son numerosos e incluyen una gran variedad

de especies desde arqueas, bacterias, hongos, algas, invertebrados marinos, insectos y peces

polares, los que se encuentran ampliamente distribuidos. Se caracterizan por crecer

óptimamente a temperaturas menores a los 15ºC y a una temperatura máxima de 20ºC, por lo

tanto habitan los ambientes más fríos de la Tierra. Estos ambientes constituyen alrededor de las

tres cuartas partes de nuestro planeta, e incluyen: las regiones polares, montañas, glaciares,

profundidades oceánicas, superficies de sistemas subterráneos (cuevas), entre otros, en donde

10

las temperaturas nunca exceden los 5ºC (Gianese y col., 2001; Feller y Gerday, 2003; Gomes y

Steiner, 2004).

La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes para la vida, ya que

influyen la mayoría de las reacciones bioquímicas (D’Amico y col., 2002). Los principales

efectos deletéreos de las bajas temperaturas son las membranas y las enzimas, ya que tienden a

la rigidez cuando la temperatura disminuye. El frío afecta la permeabilidad de la membrana

citoplasmática, la que va perdiendo su función y la capacidad de transporte de nutrientes y

productos de desechos. Las bajas temperaturas favorecen el mal plegamiento y denaturación de

proteínas, además de afectar la catálisis enzimática ya que las enzimas requieren cierta

flexibilidad para funcionar (D’Amico y col., 2006). Las actividades biológicas claves como la

replicación del ADN, su transcripción y traducción, también pueden verse afectadas con la

exposición al frío, debido a que los ácidos nucleicos forman estructuras secundarias o

superenrrolladas. Para poder sobreponerse a todos estos efectos perjudiciales de las bajas

temperaturas, los organismos psicrófilos han debido desarrollar diversas estrategias y

mecanismos adaptativos para llevar a cabo sus funciones metabólicas, incorporando

características únicas para preservar la estabilidad y la permeabilidad de la membrana, y

mantener sus proteínas y actividades enzimáticas a niveles apropiados.

Vivir a temperaturas cercanas a los 0ºC, requiere de múltiples adaptaciones cruciales,

estas incluyen cambios bioquímicos en todos los niveles: en la fisiología completa del

organismo regulando vías metabólicas, a nivel subcelular regulando canales iónicos y

polimerización de microtúbulos, entre otros y a nivel molecular, sintetizando moléculas

especiales como: Caps: proteínas de aclimatación al frío, CSP: cold-shock proteins, AFP:

antifreeze proteins, crioprotectores y enzimas activas a bajas temperaturas (Feller y Gerday,

1997; Gomes y Steiner, 2004; D’Amico y col., 2006). Estas últimas son la principal adaptación

fisiológica a nivel enzimático, debido a que son capaces de compensar las bajas tasas de

reacción provocadas por el frío y la viscosidad del medio que hace que estas disminuyan aún

más (Marx y col., 2006).

De acuerdo a la ecuación de Arrhenius kcat = Ae-Ea/RT, la actividad de una enzima

disminuiría fuertemente a bajas temperaturas (Hoyoux y col., 2004). Como se deduce de esta

ecuación, la disminución de la temperatura de 37 a 0ºC causaría una disminución exponencial

de la tasa de reacción, disminuyendo la actividad de una enzima de 16 a 80 veces (Feller y col.,

11

1996). Sin embargo los organismos psicrófilos son capaces de sintetizar enzimas con una

actividad especifica 10 veces mayor (Feller, 2003). Se espera que la eficiencia catalítica de las

enzimas que participan en el metabolismo primario de organismos psicrófilos mantengan tasas

metabólicas que son suficientes para sobrevivir y crecer, similares a las que muestran los

organismos mesófilos a temperaturas moderadas (Feller y Gerday, 2003). Además, que la

eficiencia catalítica de estas enzimas provenientes de organismos adaptados a bajas

temperaturas sea equivalente a la de las enzimas de organismos mesófilos con similares tasas de

crecimiento a 37ºC, es decir, las verdaderas enzimas adaptadas al frío, deben tener eficiencias

catalíticas del mismo orden de magnitud que las enzimas mesófilas a sus respectivas

temperaturas óptimas.

Cabe destacar que la temperatura de actividad máxima para una enzima usualmente no

es la misma que el organismo alcanza en su crecimiento óptimo y las enzimas en general, tienen

temperaturas aparentes de actividad máxima que son 10-20ºC más altas que la temperatura ideal

para el crecimiento del organismo parental (Sheridan y col.,2000; Feller, 2003). Se ha descrito

que las lipasas provenientes de microorganismos psicrófilos tienen una actividad óptima

alrededor de los 20ºC. Las lipasas que posean actividad y estabilidad a varias condiciones

físicas y químicas pueden ser potencialmente útiles para aplicaciones industriales y

biotecnológicas a bajas temperaturas (Joseph y col., 2008).

Las enzimas activas a bajas temperaturas se caracterizan por tener adaptaciones

relacionadas con su sitio activo, frecuentemente, se observan sitios catalíticos de mayor tamaño

y con mejor accesibilidad. Estas adaptaciones permiten acomodaciones de los sustratos,

liberación y salida de los productos a menores costos energéticos. En comparación con las

proteínas de mesófilos y termófilos, en las enzimas psicrófilas se han encontrado

modificaciones estructurales que involucran: clusters de glicinas que proveen de movilidad

local, una disminución en el número de residuos de prolina en loops que se traduce en una

aumentada flexibilidad de las cadenas entre las estructuras secundarias, una disminución en el

número de arginina y otros residuos que son capaces de formar puentes salinos y puentes de

hidrógeno, así como un menor número de pares iónicos, interacciones aromáticas o enlaces de

hidrógeno y la debilidad en las interacciones dipolo en las α-hélices (D’Amico y col., 2002). En

general, estas enzimas poseen menos puentes salinos, menos grupos hidrofóbicos y un mayor

número de residuos cargados en su superficie (Hoyoux y col., 2004). Se ha propuesto que estos

12

cambios estarían correlacionados con un alto nivel de flexibilidad estructural que puede

presentarse en forma global en toda la proteína, como también localizada en las zonas de

importancia catalítica. El aumento en la flexibilidad estructural probablemente facilitaría los

cambios conformacionales, resultando una disminución en la energía requerida para la catálisis

a bajas temperaturas (Gomes y Steiner, 2004).

Una consecuencia esperada de la mayor flexibilidad, es la disminución en la estabilidad

térmica (Marshall, 1997). Por décadas, se ha reconocido la rápida inactivación que sufren las

enzimas psicrófilas frente al aumento de temperatura. La vida media para la mayoría de estas

enzimas a 50- 60ºC es alrededor de 10 min y unas pocas horas a 37ºC, sin embargo, algunas

enzimas activas a bajas temperaturas son denaturadas a incluso 20- 25ºC (Feller, 2003).

Estas dos principales características de las enzimas psicrófilas: su capacidad para

catalizar reacciones a bajas o moderadas temperaturas y su baja estabilidad térmica, son las que

ofrecen un gran potencial industrial y biotecnológico (Gomes y Steiner, 2004). Una de las

principales ventajas que, actualmente, motivan el interés por el uso de las enzimas activas a

bajas temperaturas, es que no es necesario aplicar energía calórica para su actividad, lo que en

consecuencia trae beneficios económicos debido al ahorro energético en los procesos. Además,

otros beneficios se generan de sus capacidades para funcionar en un ambiente frío,

incrementando el producto de reacción, teniendo en cuenta un alto nivel de estereoespecificidad

y minimizando las reacciones químicas no deseadas que ocurren a altas temperaturas.

Asimismo, el uso de enzimas activas a bajas temperaturas minimiza la necesidad de utilizar

grandes cantidades de enzima para compensar la menor eficiencia cuando se utilizan enzimas

mesófilas a bajas temperaturas. Además, la inestabilidad y labilidad térmica de las enzimas

psicrófilas, permiten su fácil y rápida inactivación cuando sea requerida (Hoyoux y col., 2004).

Algunos ejemplos de estos beneficios biotecnológicos se dan en la industria de los

detergentes, donde la ventaja de incorporar enzimas activas a bajas temperaturas conllevaría a

una reducción en el consumo energético. De esta manera, es posible usar hidrolasas activas a

bajas temperaturas como lipasas, proteasas, amilasas y celulasas en la formulación de

detergentes, lo que puede significar una gran mejoría para el lavado en frío (Feller y col, 1996;

Marshall, 1997; Gomes y Steiner, 2004). En la industria alimenticia el uso de enzimas adaptadas

a bajas temperaturas permitiría la obtención de productos a temperaturas donde el crecimiento

13

microbiano es mínimo y su uso entregaría mejores alternativas en la fermentación, manufactura

de quesos, panaderías y procesamiento de carnes. Por otro lado, los organismos adaptados al

frío tienen un gran potencial en la aplicación de procesos de biorremediación como por ejemplo

en el compostaje y la biodegradación de aceites o xenobióticos (Feller y col.,1996; Marshall,

1997, Joseph y col., 2008).

I.6 Características de las Lipasas Bacterianas Activas a Bajas Temperaturas

Las lipasas bacterianas se clasifican en ocho familias basadas en la identidad de sus

secuencias aminoacídicas. La familia IV corresponde al grupo de las lipasas adaptadas a bajas

temperaturas, grupo que también se conoce como HSL (Hormone Sensitive Lipase) debido a la

similitud estructural que muestran con lipasas sensibles a hormonas de mamíferos. La familia IV

se caracteriza por contener un pentapéptido de consenso GDSAG, que contiene el aminoácido

serina que forma parte del sitio activo y una alanina de la cavidad oxianiónica, esta secuencia se

ubica cerca del extremo amino terminal de la proteína. También tienen otro motivo altamente

conservado HGGG, en que la tercera glicina formaría parte de la cavidad oxianiónica (Arpigny y

Jaeger, 1999; Jaeger y col., 1999). Basándose en el alineamiento de sus secuencias

aminoacídicas, se deduce, que una característica posiblemente involucrada en la adaptación al

frío es la presencia de residuos de glicina, en las secuencias conservadas que contienen la serina y

la histidina del sitio catalítico, que probablemente les da mayor flexibilidad al sitio catalítico.

I.7 Obtención de Lipasas Activas a Bajas Temperaturas

Se han realizado muchos intentos para aislar estas lipasas que tienen alta actividad a

bajas temperaturas desde microorganismos psicrófilos. Actualmente, hay diferentes fuentes

productoras de estas lipasas que están disponibles, pero sólo unas pocas bacterias están siendo

explotadas para la producción de lipasas activas a bajas temperaturas. Estas cepas bacterianas

han sido aisladas mayormente de la antártica y regiones polares que presentan frío permanente

(0 + 2 ºC). Los estudios realizados han mostrado una alta cantidad de bacterias 105 ml-1 y 106

ml-1 en columnas de agua y en el mar congelado (Joseph y col., 2008), las que podrían constituir

una buena fuente de enzimas activas a bajas temperaturas.

14

La importancia de las lipasas activas a bajas temperaturas es extensamente reconocida

en un gran número de aplicaciones comerciales, y en la mayoría de ellas las enzimas no siempre

necesitan una preparación homogénea, sin embargo un cierto grado de pureza es requerido

dependiendo de la aplicación final. La purificación de enzimas permite la determinación de su

secuencia aminoacídica y, más recientemente, de su estructura tridimensional. Además,

preparaciones de lipasas purificadas son necesarias en las industrias que emplean enzimas para

la producción biocatalítica de químicos complejos, cosméticos y en la industria farmacéutica

(Saxena y col., 2003).

Las lipasas activas a bajas temperaturas son mayormente extracelulares y su producción

es altamente influenciada por factores nutricionales y fisicoquímicos como la temperatura,

agitación, pH, fuentes de nitrógeno, de carbono, inductores, fuentes inorgánicas y oxígeno

disuelto. La fermentación sumergida es el método más comúnmente usado para la obtención de

estas enzimas, pero los microorganismos psicrófilos son difíciles de crecer en forma eficiente en

biorreactores. Adicionalmente, la baja termoestabilidad de las lipasas activas a bajas

temperaturas es el principal problema en su purificación (Joseph y col., 2008). La mayoría de

los esquemas de purificación de estas enzimas están basados en estrategias de múltiples pasos,

los que suelen ser problemáticos, laboriosos, consumidores de tiempo y resultan en bajos

rendimientos. Puesto que para aplicaciones industriales los pasos de purificación deben ser

económicos, rápidos, de alto rendimiento y fáciles de producir en operaciones a gran escala,

ellos deben tener el potencial para una recuperación continua del producto con una

relativamente alta capacidad y selectividad del producto deseado (Gupta y col., 2004). Otros

inconvenientes han surgido específicamente en la purificación de lipasas provenientes de

bacterias de la Antártica, las que han sido sujetas a varios estudios pero todos han fallado en la

obtención de formas completamente purificadas debido a la dificultad de eliminar los

lipopolisacáridos producidos por estos microorganismos, que se encuentran fuertemente

asociados con las hidrolasas lipídicas (Gerday y col., 1997).

Debido a estas razones, la obtención de lipasas activas a bajas temperaturas podría

facilitarse con estrategias de producción de proteínas recombinantes, ya que un gen

codificante para la enzima de interés es clonado en un vector de expresión con el que se

transforma a organismos adaptados para la expresión de grandes cantidades de proteínas

heterólogas. A la fecha, se han descrito un gran número de genes codificantes de lipasas de

15

bacterias psicrófilas y se han llevado a cabo estudios relacionados a su clonamiento y expresión

por parte del huésped mesófílo Escherichia coli (Joseph y col., 2008).

Los pasos a seguir para la obtención de genes codificantes de lipasas activas a bajas

temperaturas, son primero aislar microorganismos psicrófilos desde un ambiente frío. Luego se

debe identificar las cepas bacterianas son productoras de lipasas, para esto se han descrito

diferentes métodos (Beisson y col., 2000). Dentro de los más utilizados se encuentran: el

descrito por Starr en 1941 en el que la búsqueda de cepas productoras de lipasas se realiza en

placas con agar Spirit Blue suplementado con reactivo lipasa (tributirina + polisorbato 80) como

sustrato y la expresión de lipasas se detecta por la aparición de halos claros alrededor de la

colonia, indicando la lipólisis; el método descrito por Sierra en 1957, en el cual se identifica la

actividad lipolítica utilizando Tween 80 como surfactante en un medio sólido, la formación de

zonas opacas alrededor de las colonias es un indicador de que el microorganismo es productor

de lipasas; y el ensayo descrito por Kouker y Jaeger en 1986 en donde se utilizan placas de agar

con Rodamina B - aceite de oliva, en que la actividad lipolítica se evidencia por la aparición de

halos naranjos fluorescentes alrededor de las colonias luego de ser expuestas a radiación UV a

350 nm.

Una vez seleccionada la cepa bacteriana productora de lipasas, se extrae su material

genético (Sharma y col., 2001; Kim y col., 2004). Luego se debe realizar una búsqueda de

fragmentos de genes codificantes de lipasas directamente en el ADN genómico de los

microorganismos, para ello y aprovechando la similitud que existe entre los miembros de una

misma familia de enzimas se efectúa un alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas o

aminoacídicas. Junto al conocimiento de las secuencias que han sido conservadas

evolutivamente, se diseñan partidores basados en las regiones de consenso (Bell y col., 2002)

y/o partidores degenerados diseñados con el programa CODEHOP (Rose y col.,1998), lo que

permite amplificar fragmentos de genes codificantes de lipasas mediante PCR y obtener asi sus

secuencias parciales. El resto de la secuencia del gen puede ser identificada mediante

hibridización de colonias de una genoteca utilizando una sonda marcada o mediante la técnica

de Genome o Chromosome Walking que permite obtener las secuencias río arriba y río abajo a

partir de una secuencia parcialmente conocida (Acevedo y col., 2008; Parra y col., 2008).

A continuación, es necesaria la amplificación del gen completo, el clonamiento y su

expresión utilizando alguno de los sistemas disponibles comercialmente (Jaeger y Eggert,

16

2002). Posteriormente, la lipasa recombinante obtenida se debe caracterizar, debido a que la

determinación y comparación de las actividades específicas y especificidad de sustrato de

diferentes lipasas es absolutamente requerido para investigar y juzgar su utilidad en aplicaciones

biotecnológicas (Jaeger y col., 1999). La caracterización y cinética de lipasas activas a bajas

temperaturas son estudiadas en términos de pH óptimo y estabilidad, temperatura óptima,

termoestabilidad y efecto de agentes quelantes, inhibidores, solventes e iones metálicos (Joseph

y col., 2008).

I.8 Proyecto de Tesis

Algunas lipasas producidas por microorganismos psicrófilos han sido investigadas y se

han determinado sus secuencias nucleotídicas, aun así, existen pocas lipasas activas a bajas

temperaturas descritas en la literatura, las cuales son principalmente caracterizadas en distintas

condiciones experimentales, detallándose muy poco acerca de los determinantes de adaptación a

bajas temperaturas. En base a lo anterior, la determinación de una nueva secuencia de lipasa con

actividad a bajas temperaturas y su caracterización podría ser un aporte para el estudio sobre la

adaptación de proteínas al frío. Además, la obtención de la proteína recombinante funcional que

presente actividad lipolítica a bajas temperaturas es interesante para su futura producción a gran

escala y utilidad en alguna de sus múltiples potenciales aplicaciones.

La Antártica se caracteriza por una temperatura permanente de alrededor -1ºC, lo que

junto a su aislamiento geográfico ha producido un ambiente único, rico en especies adaptadas a

estas condiciones extremas (Clark y col., 2004). Las bacterias psicrófilas nativas han debido ser

capaces de desarrollar adaptaciones exitosas que les permiten vivir y crecer en las condiciones

desafiantes de este medio, por lo que sus enzimas deben estar adaptadas a bajas temperaturas

(Marx y col., 2007).

En el año 2003, el laboratorio de CIByB tuvo la iniciativa de recoger muestras en época

estival de la capa superficial del agua de mar de la Antártica Chilena en la Isla Rey Jorge,

ubicada en la base aérea Frei Montalva (Lat 62º 11’’S Long 58º 58’W), con el propósito de

obtener cepas bacterianas psicrófilas, productoras de enzimas activas a bajas temperaturas. Estas

cepas bacterianas marinas antárticas fueron aisladas y caracterizadas fenotípicamente de

17

acuerdo a su morfología y color. Se confeccionó un cepario antártico el que se conserva en

glicerol al 10% a -80ºC. A partir de este, se crecieron 120 cepas bacterianas y para identificar

cuáles de ellas eran productoras de lipasas, se utilizó el método descrito por Starr en 1941.

Un total de 91 cepas fueron capaces de crecer en el medio Spirit Blue y de estas, 36

fueron capaces de producir lipasas activas a bajas temperaturas, distinguiendose visualmente por

la formación de un halo alrededor de las colonias indicando hidrólisis del lípido tributirina. De

estas cepas bacterianas marinas antárticas productoras de lipasas, se seleccionaron 5, que se

caracterizaron por tener una razón de tamaño halo/ tamaño colonia significativa, indicando una

mayor cantidad de enzima producida y/o mayor actividad. Estas cepas se identificaron como

A19, B2, B9, E5 y E13. Luego, se diseñaron partidores degenerados, en base a los dos motivos

altamente conservados en las lipasas activas a bajas temperatura HGGG y GDSAG (Arpigny y

Jaeger, 1999) y mediante PCR se logró amplificar fragmentos de genes codificantes para

enzimas lipolíticas a partir de las 5 cepas. En base a este trabajo realizado anteriormente por el

laboratorio se planteó la siguiente hipótesis y objetivos.

I.8.1 Hipótesis

Una lipasa funcional y activa a bajas temperaturas, puede ser expresada de forma

recombinante por un huésped mesófilo.

I.8.2 Objetivos

I.8.2.1 Objetivo General

Obtener una lipasa con actividad enzimática a bajas temperaturas

a partir de bacterias de origen marino antártico.

I.8.2.2 Objetivos Específicos

1. Obtención de la secuencia completa de genes codificantes de lipasas de

microorganismos psicrófilos.

2. Clonamiento y expresión recombinante de uno de los genes obtenidos.

3. Obtencion de la lipasa nativa y comparación con la lipasa recombinante producida.

18

II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1 Materiales

II.1.1 Reactivos

A continuación, en la tabla 1, se detallan los reactivos utilizados:

Tabla 1. Reactivos utilizados este trabajo de tesis Reactivos Laboratorio Proveedor

Azul de Bromofenol Amersham-Pharmacia Biotech, Suecia Agar Difco, Agar Spirit Blue Difco, Extracto de Levadura Difco, Medio Luria- Bertani Difco, Medio Marino 2216 Difco, Reactivo Lipasa Difco, Triptona Difco

Becton Dickinson, Francia

Ampicilina Calbiochem, USA Agarosa Fermelo, Chile dATP, dCTP, dGTP, dTTP, High DNA Mass Ladder, IPTG, Estándar de tamaño molecular preteñido de proteínas

Fermentas, USA

Persulfato de amonio Gibco BRL, UK Carbenicilina, EDTA, Estándar de 1 Kbp, TEMED, Tween 20 Invitrogen, USA Acetato de sodio, Ácido cítrico, Ácido clorhídrico, Bromuro de etidio, β-mercaptoetanol, CAPS, Carbonato de sodio, Cloroformo, Cloruro de sodio , Desoxicolato de sodio, Etanol absoluto, Formaldehido al 37%, Fosfato de Sodio, Glucosa, Ácido Acetico glacial, Hidróxido de sodio, Imidazol, Isopropanol, Maltosa, Metanol, Nitrato de plata, Potasio fosfato monobásico, Potasio fosfato dibasico, Sacarosa, Sulfato de magnesio

Merck, Alemania

Resina de Amilosa New England Biolabs, UK Resina Ni-NTA Agarosa Qiagen Inc., USA Aceite de Oliva, α-naftilacetato, Brilliant Blue R, BSA, Fast Garnet GBC, Goma Arabica, ρ-nitrofenilcaprato, X-Gal, N,N’- dimetil-formamida

Sigma Aldrich, USA

Acetona, Ácido acético, Hipoclorito de Sodio TCL, Chile Acrilamida: Bisacrilamida 29:1, DTT, Fenol, Glicerol, Glicina, SDS, Tris, Tritón X-100, Tween 80

Winkler, Chile

II.1.2 Cepas Bacterianas

- E. coli DH5α, de Invitrogen, USA, genotipo: F- φ80d lacZ∆M15 ∆(lacZYA –argF) U169

endA1 recA1 hsdR17(rk -, mk

+) deoR thi-1 phoA supE44 λ- gyrA96 relA1.

- E. coli BL21(D3E) de Novagenn, USA, genotipo: F- ompT hsdSB (rB-mB

+) gal dcm (DE3).

- E. coli TB1 de New England Biolabs, UK, genotipo: F-ara∆(lac-

proAB)[Φ80dlac∆(lacZ)M15]rpsL(StrR) thi hsdR.

- Cepas bacterianas marinas antárticas obtenidas de la capa superficial del agua de mar de la

Antártica Chilena en la Isla Rey Jorge, ubicada en la base aérea Frei Montalva (Lat 62º

11’’S Long 58º 58’W).

19

II.1.3 Sistemas Recombinantes

- Vector de Clonamiento: pGEM-T Easy de Promega, USA

- Vectores de Expresión: pET22(b+) de Novagen, USA y pMAL-c2E de New England

Biolabs, UK

II.1.4 Sistemas Comerciales

- QIAEX II Gel Extraction y QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen Inc., USA

- Sistema LMW de calibración para filtración en geles de Amersham Pharmacia Biotech,

Suecia

II.1.5 Enzimas

- ADN Polimerasas: Go Taq de Promega, USA; Elongasa de Invitrogen, USA

- T4 ADN ligasa de Invitrogen, USA

- Enzimas de Restricción: En la tabla 2, se describen las enzimas de restricción utilizadas:

Tabla 2. Enzimas de restricción utilizadas en este trabajo de tesis. El símbolo ˆ representa el sitio de corte de la enzima.

Enzima Secuencia de Corte (5’→ 3’) Laboratorio Proveedor KpnI G GTACˆC

Fermentas, USA PstI C TGCAˆG SalI GˆTCGA C EcoRI GˆAATT C

New England Biolabs, UK

EcoRV GATˆATC KasI GˆGCGC C NcoI CˆCATG G NdeI CAˆTA TG PmeI GTTTˆAAAC PvuII CAGˆCTG SmaI CCCˆGGG XbaI TˆCTAG A XhoI CˆTCGA G BamHI G ˆGATC C

Promega, USA ClaI ATˆCG AT HindIII AˆAGCT T

II.1.6 Oligonucleótidos:

Todos los oligonucleótidos utilizados en esta tesis fueron sintetizados por Integrated

DNA Technologies, IDT, USA, y se resumen, a continuación, en la tabla 3:

20

Tabla 3. Oligonucleótidos utilizadas en este trabajo de tesis. Nombre Secuencia (5’→ 3’) Tm (ºC)

16SF AGCTAGTTGGTAGGGTAAAG 51,1

16SR CCGCGATTACTAGCGATTCC 55,6

AdaptF CTAGGCCACGCGTCGACTAGTACTAGCTT 69,1

AdaptR AGCTAGTACTAGTCGACGCGTGGCCTAG 60,2

AdaptF2 CACGCGTCGACTAGTACTAGCTT 68,4

GW1F CTGGCTAAACATGGCAACATG 60,0

GW1R GGAATTTATGTTCTGGAGCCAG 61,4

GW2F CTGGCTCCAGAACATAAATTCC 60,0

GW2R CATGTTGCCATGTTTAGCCAG 61,4

LipShewF ATGGATAACATTAATAAGCCAACACC 60,6

LipShewR TTCATTAAAGCTGTTTAATCCCATTG 61,6

LipE13pET22F CCATGGATAACCTTAATAAACCAACATCA 64,7

LipE13pET22R CTCGAGAAAGCTGTTTAATCCCATTG 65,1

LipE13pMALF GGTACCGGATAACCTTAATAAACCAACATC 65.2

LipE13pMALR CTGCAGTCATTCATTAAAGCTGTTTAATCC 65.8

pET22ShewF CCATGGATAACATTAATAAGCCAACACC 65,2

pET22ShewR CTCGAGAAAGCTGTTTAATCCCATTG 65,1

pMALShewF GGTACCGGATAACATTAATAAGCCAACAC 65,3

pMALShewR CTGCAGTCATTCATTAAAGCTGTTTAATCC 65,8

II.1.7 Materiales Purificación

- Columna cromatográfica: SigmaChromTM GFC- 100 Gel Filtration HPLC Column, 13,25

mL de 300 x 7,5 mm Supelco de Sigma Aldrich, USA.

- Resina de Níquel-NTA de Qiagen Inc., USA.

- Resina Amilosa de New England Biolabs, UK.

II.1.8 Material de plástico

- Tubos Eppendorf de 0.2, 0.6, 1.5 y 2 mL de Axygen Scientific, USA.

- Tubos cónicos de polipropileno Falcon Blue Max de 15 y 50 mL y Placas BD Falcon de 96

pocillos de Becton Dickinson, Francia.

- Placas de PCR Ultra Amp de Sorenson BioScience, Inc, USA.

- Placas de Petri estériles de Greiner Bio One, Alemania.

- Cubetas de polipropileno de 1.5 ml, 1 cm de paso de luz, Cuvtte-2 PS de EDLAB, Brazil.

- Microfiltration System y Dismic – 25 AS 0.2 um de Advantec, USA.

- Tubos Centriplus Amicon de Millipore, USA.

- Columna PD-10 de Bio-Rad Laboratories, USA.

- Probetas de 50, 100, 250, 500 y 1000 mL de Azlon, SKS Science Products, USA.

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II.1.9 Material de vidrio

- Botellas de: 100, 250, 500 y 1L; matraces Erlenmeyer de: 500, 1000 y 2000 mL y matraces

de aforo: 100, 250 y 500 mL de Schott Duran, Alemania.

- Matraces Erlenmeyer de 100 y 250 mL de Pyrex, USA.

- Vasos precipitados de: 50, 100, 250, 600 y 1000 mL de Boeco, Alemania.

II.1.10 Equipos:

En la tabla 5, se describen los equipos utilizados para la realización de este trabajo de

tesis:

Tabla 5. Equipos utilizados en este trabajo de tesis. Equipos Proveedor

Agitador orbital MaxQ 4000 Barnstead, Lab-Line, USA

ÄKTA Purifier 10 GE Healthcare Biocare, Suecia

Autoclave Orthmann, Chile

Camara Fotográfica Coolpix 4500 Nikon, Japon

Cámara horizontal Horizon-58 Fuente de poder Model 500 Electroporador Cell-Porator Electroporation System

GIBCO BRL Life Technologies, Inc., USA

Cámara vertical MiniProtean II Fuente de poder Power Pac 1000

Bio-Rad Laboratories Inc., USA

Centrífuga Eppendorf 5804 R Rotor F34-63-8 Eppendorf Mastercycler Gradient Eppendorf Thermomixer confort

Eppendorf AG, Alemania

Estufa Gallenkamp, UK

Centrífuga IEC Modelo MP4R, Rotor 224 International Equipment Company, USA

Centrífuga preparativa RC-28S, rotor GS-3 y rotor F-24

Sorvall, DuPont, USA

Espectrofotómetro Genesys 6 Thermo Scientific, USA

Espectrofotómetro UV/visible Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech Ltd, UK

Lector de placas de 96 pocillos Asys UVM 340 Biochrom Ltd., UK

Maquina de hielo Scotsman, Italia

Sistema de Purificación de Agua Milli-Q Millipore, USA

Sonicador Microson Ultrasonic Cell Disruptor Misonix, USA

Balanza Analítica Ohaus Analytical Plus Balanza Ohaus Precision Standar

Ohaus, USA

Refrigerador -20°C, 4°C Mademsa, Chile

Refrigerador -80°C Ultralow freezer Solow Environmental Equipment, USA

Termociclador PTC-100 MJ Research, Inc., USA

Transiluminador UV Vilber Loumat, Francia

Agitador Vortex Type 37600 Mixer Agitador magnético termorregulado Nuova II

Thermolyne, USA

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II.1.11 Herramientas Computacionales

II.1.11.1 Programas:

- BioEdit versión 7.0.0.

- Digiread, Microplate Instrumentation Control.

- Omiga 2.0, Rainbow Sentinel/LM, Rainbow Technologies, inc.

- TreeView versión 1.6.6.

- UNICORN 5.1.

II.1.11.2 Sitios Web:

- Basic Local Alignment Search Tool, BLAST, National Center for Biotechnology

Information, NCBI, U.S. National Library of Medicine: http://BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/

- BRaunschweig ENzyme Database, BRENDA, Technische Universität Braunschweig,

Department of Bioinformatics and Biochemistry, Alemania.

http://www.brenda-enzymes.org/

- ClustalW2, European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute,

EMBL-EBI: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html/

- Conserved Domain Database CDD, National Center for Biotechnology Information, NCBI,

U.S. National Library of Medicine: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml

- Integrated DNA Technologies, IDT, Sci Tools Oligo Analyzer 3.1:

http://www.idtDNA.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

- I-TASSER, ZhangLab, University of Michigan, USA:

http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/

- Protein Data Bank, RCSB PDB, The State University of New Jersey and the University of

California, San Diego, USA: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do/

- ProtParam, Expasy, Swiss Institute of Bioinformatics, SIB:

http://www.expasy.org/tools/protparam.html/

- UNIPROT, European Bioinformatics Institute EBI, Swiss Institute of Bioinformatics SIB,

Protein Information Resource PIR: http://www.uniprot.org/

23

II.2 Métodos

II.2.1 Cultivo de microorganismos psicrófilos

El medio de cultivo utilizado para el crecimiento de las bacterias marinas antárticas fue

el medio marino 2216, que contiene por cada litro: 5 g de triptona, 1 g de extracto de levadura,

0,1 g de citrato férrico, 19,45 g de cloruro de sodio, 8,8 g de cloruro de magnesio, 3,24 g de

sulfato de sodio, 1,8 g de cloruro de calcio, 0,55 g de cloruro de potasio, 0,16 g de bicarbonato

de sodio, 0,08 g bromuro de potasio, 0,034 g de cloruro de estroncio, 0,022 g de ácido bórico,

0,004 g de silicato de sodio, 0,0024 g de fluoruro de sodio, 0,0016 g de nitrato de amonio y

0,008 g de fosfato disódico. Este medio se preparó disolviendo 37,4 g por litro de agua

destilada. Para la preparación de este medio sólido, se agregó agar 1,5% p/v. El pH se ajustó a

7,6, y se esterilizó por autoclave.

A partir de un cepario antártico del laboratorio CIByB almacenado a -80ºC en glicerol

10%, se inoculó cada cepa bacteriana seleccionada como productora de lipasas (A19, B2, B9,

E5 y E13) en una placa Petri con medio marino 2216-agar, la que permaneció a 4ºC por una

semana hasta la aparición de colonias.

II.2.2 Extracción de ADN genómico de bacterias antárticas

Se prepararon 5 cultivos de 10 mL con medio marino 2216, en los cuales se inoculó

cada colonia productora de lipasas obtenidas en el punto anterior, se crecieron en un agitador

orbital MaxQ 4000 con agitación de 200 rpm a una temperatura de 4ºC durante 4 días. Para la

extracción del ADN genómico, se utilizó el protocolo descrito por Sambrook y col., 1989.

II.2.3 Determinación de pureza y concentración de ADN

Para determinar la pureza y concentración del ADN genómico obtenido, se utilizó un

espectrofotómetro Genesys 6 y se midió espectrofotométricamente la absorbancia a 260 nm

(DO260) y a 280 nm (DO280). Se hicieron diluciones de la muestra de ADN en agua Milli-Q hasta

que la DO260 estuviera en el rango de absorbancia 0,1-1 y la pureza se determinó de acuerdo a

Warburg y Christian en 1942, utilizando como criterio de pureza la razón DO260/DO280 mayor a

1,8. La concentración se determinó en base a la absorbancia a 260 nm según:

µg/mL ADN = DO260 × 50 × Factor de dilución.

24

II.2.4 Electroforesis de ADN

Las electroforesis de ADN se realizaron en una cámara horizontal Horizon-58. Las

muestras se mezclaron en proporción 5:1 con tampón de carga 6X (glicerol 30% p/v y azul de

bromofenol 0,25% p/v) y luego se cargaron en geles de agarosa a una concentración ajustada al

tamaño del fragmento de ADN que se esperaba observar. Estos se prepararon a concentraciones

entre 0,8% p/v para tamaños de ADN genómicos hasta 2,5% p/v para fragmentos de 150-300

pb. La agarosa se disolvió en tampón TAE 1X (Tris 40 mM, acetato 20 mM, EDTA 1 mM) y

0,2 ug/mL de bromuro de etidio. Se incluyó 5 uL de estándar de peso molecular de tamaño 1

Kpb, y para determinar la concentración de ADN se incluyeron los uL necesarios de High DNA

Mass Ladder. Las electroforesis se realizaron a voltaje constante de 100 V. Se utilizó como

tampón de corrida TAE 1X. Finalmente se observó el gel sobre un transiluminador UV y se

fotografió con una cámara Nikon Coolpix 4500.

II.2.5 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa

Con el fin de purificar fragmentos de ADN desde geles de agarosa, se cortó la banda de

ADN del gel, minimizando el exceso de agarosa. Después se colocó en un tubo Eppendorf de

1,5 mL esterilizado por autoclave, para luego utilizar el sistema QIAEX II Gel Extraction de

acuerdo a las instrucciones del fabricante.

II.2.6 Amplificación del gen ADNr 16S mediante PCR

Con el objetivo de conocer la especie a la cual pertenecían las 5 cepas bacterianas

antárticas, se realizó un análisis filogenético mediante la amplificación del gen ADNr 16S

utilizando la técnica de PCR (Mullis y Faloona, 1987). Se utilizó como templado el ADN

genómico de las 5 cepas y unos partidores especialmente diseñados denominados 16SF y 16SR

(Tabla 3). Estos partidores fueron diseñados por el laboratorio de BioHidroMetalurgia del

Departamento de Química de la Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad

de Chile. El PCR se llevó a cabo utilizando la enzima Go Taq ADN polimerasa y las

condiciones de la reacción de PCR utilizada fueron las siguientes: 150 ng de ADN genómico, 1

µM de cada partidor, 0,2 mM de cada dNTP, 1,4 mM de cloruro de magnesio, tampón Go Taq

1X , 1 unidad de enzima Go Taq, en un volumen total de 50 µl. El programa requerido para la

amplificación del ADNr 16S, incluía una etapa inicial de denaturación a 94ºC durante 3 min,

25

seguida por 40 ciclos de amplificación que incluían 3 etapas: 32 s a 94ºC, 45 s a 50ºC y una

etapa de extensión de 2 min a 72ºC. Finalmente, un último ciclo de 7 min a 72ºC.

II.2.7 Obtención de genes codificantes de lipasas mediante Genome Walking

Para conocer las secuencias río arriba y río abajo de las secuencias parciales de genes

codificantes para lipasas se utilizó la técnica de Genome Walking estandarizada en el laboratorio

(Acevedo y col., 2008). Esta técnica se basa en la construcción y ligación de un mismo oligo-

adaptador a fragmentos de ADN genómico, y una posterior amplificación de las secuencias

mediante PCR. Para esto fue necesario cumplir con 4 etapas:

II.2.7.1. Diseño de partidores para la obtención de la secuencia río arriba y río abajo de los

fragmentos ya secuenciados de genes codificantes de lipasas y construcción del oligo-adaptador

Se realizó un alineamiento múltiple mediante Clustal W de las 5 secuencias parciales

conocidas de los genes codificantes de lipasas obtenidas de las cepas de bacterias marinas

antárticas. A partir de las zonas más conservadas, se diseñaron partidores específicos con sitios

de alineamiento sucesivos de manera de generar un PCR tipo nested (Saito y col., 2001) para la

amplificación río arriba: GW1F, GW2F y para la amplificación río abajo: GW1R y GW2R.

Además, se construyó un oligo-adaptador, alineando dos oligonucleótidos, AdaptF y

AdaptR, para formar el adaptador de doble hebra AdaptT. Esto se realizó hirviendo a “baño

María” una solución 10 µM de estos oligonucleótidos, seguido de un enfriamiento lento hasta

alcanzar una temperatura ambiente para lograr la correcta hibridización de los partidores. A

partir de la secuencia de este oligo-adaptador se diseñó un partidor específico AdapF2, que se

une a una región en AdaptT para amplificar el ADN ligado al oligo-adaptador.

Las secuencias y temperaturas de alineamiento de todos los partidores utilizados en esta

etapa se detallan en la tabla 3.

II.2.7.2 Digestión del ADN genómico con enzimas de restricción y extensión

Con el fin de obtener fragmentos que incluyeran íntegramente los genes codificantes

de lipasas fue necesario digerir el ADN genómico bacteriano. Se utilizaron enzimas de

restricción (Tabla 2) que cortan y generan fragmentos con extremos cohesivos 5’ (BamHI, ClaI,

HindIII, KasI, NdeI, SalI, XbaI,) y también enzimas que dejan extremos romos (EcoRV, PmeI,

PvuII y SmaI). La reacción de digestión se efectuó en un volumen final de 20 µL que contenía 1

µg de ADN, tampón 1X recomendado por el proveedor y 1 unidad de enzima, además de BSA

26

al 1% en caso de que fuese necesario. El resto del volumen se completó con agua Milli-Q

estéril. La mezcla se incubó a 37°C por 2 horas. La reacción de digestión final con la enzima

HindIII se preparó en un volumen de 50 µL y contenía 4 µg de ADN previamente purificado, 5

µL de tampón 10X y 40 unidades de enzima. El resto del volumen se completó con agua Milli-

Q y la mezcla se incubó a 37°C por 2 horas. Luego, los fragmentos de ADN fueron purificados

y elongados a través de la actividad adenina transferasa de la enzima Taq ADN polimerasa, que

agregó una adenina a los extremos 3’ de cada fragmento, para esto se realizó una mezcla de 20

uL que contenía: 500 ηg de ADN digerido y purificado, 0,2 mM de cada dNTP, 1,4 mM de

cloruro de magnesio, tampón Go Taq 1X, 1 unidad de enzima Go Taq, se completó con agua

Milli-Q estéril hasta un volumen final de 50 µL. La reacción se incubó a 70 ºC por 45 min.

II.2.7.3 Construcción de la genoteca-adaptador.

Posteriormente, los fragmentos genómicos con la adenina desapareada en el extremo 3’

fueron ligados al oligo-adaptador AdaptT gracias a que este posee una timidina no apareada en

el extremo 3’. De esta manera se obtuvieron diferentes genotecas de fragmentos digeridos y

ligados a un mismo oligo-adaptador. Para la reacción de ligación 7 µl del ADN extendido se

mezclaron con 15 ρmoles del adaptador AdaptTotal y una unidad de T4 ADN ligasa, en 10 µL

de volumen de reacción. Esta reacción se incubó a 16ºC por 16 horas.

II.2.7.4 Amplificación de los extremos rio arriba 5’ y rio abajo 3’ del gen codificante de lipasa.

Las genotecas de fragmentos unidos al oligo-adaptador AdaptT se utilizaron como

templado en una sucesión de dos reacciones de PCR realizados con la enzima Elongasa como

ADN polimerasa. La primera ronda de PCR se llevó a cabo usando solo el primer partidor

específico (GWF1 o GWR1) lo que generó la amplificación de una sola hebra del ADN,

aumentando el número de copias en forma lineal. El PCR consistió en 2 mezclas con un

volumen final de 50 µL. La mezcla 1 se preparó de acuerdo a: 5 ρM de partidor, 150 ηg de

templado, 0,2 mM de cada dNTP, se completó el volumen con agua Milli-Q estéril hasta 20 µL.

La mezcla 2 consistió de: tampón A 5X y tampón B 5X para una concentración final de Tris-

SO4 60 mM (pH 9,1), (NH4)2SO4 18 mM y sulfato de magnesio 1,9 mM más 5 unidades de

enzima Elongasa, se completó el volumen con agua Milli-Q estéril hasta 30 µL. La mezcla 1 se

calentó durante 30 s a 94ºC, luego, se agregó la mezcla 2 y se siguió con el programa requerido.

El programa utilizado consistió en 20 ciclos de 94ºC por 30 s, 68ºC por 5 min y un ciclo

adicional de 7 min a 68ºC. Esta etapa correspondió al enriquecimiento del templado y el

27

producto de PCR de esta primera amplificación fue diluido 10 veces. Luego 3 µl de esta

dilución fueron utilizados como templado para la segunda reacción de PCR, que buscaba

amplificar el extremo 3’ y 5’ del gen de lipasa, donde se utilizó el segundo partidor específico

(GWF2 o GWR2) más 5 ρM de AdaptF2. Se prosiguió de la misma manera que para el primer

PCR, pero cambiando el programa utilizado el que consistió en 35 ciclos de 94ºC por 30 s, 64º

por 45 s a, 68 ºC por 5 min y un ciclo adicional a 68 ºC por 7 min.

En la figura 3 se resumen las etapas involucrada en la técnica de Genome Walking:

Figura 5. Diagrama de técnica de Genome Walking empleada para la obtención de las

secuencias río arriba y río abajo del gen de lipasa. Se detalla paso a paso la técnica utilizada. Luego de digerir el ADN genómico con la enzima de restricción HindIII, los fragmentos se extendieron con Taq aprovechando su capacidad de dejar una adenina en el extremo 3’, y luego se ligaron al oligo-adaptador AdaptT gracias a su timidina desapareada. Mediante un PCR se realizó un enriquecimiento desde cada extremo del gen utilizando el partidor 1 diseñado para dicho fin. Finalmente se realizó un segundo PCR con un partidor 2 diseñado a partir del fragmento de lipasa que se encuentra más adentro que el partidor 1 y el partidor AdapF2 diseñado a partir de la secuencia del oligo-adaptador.

28

II.2.8 Obtención de genes codificantes de lipasas utilizando partidores diseñados en base a

la secuencia del gen de Shewanella frigidimarina.

Se diseñaron los partidores LipShewF y LipShewR en base a la secuencia del gen

codificante de lipasa de la bacteria Shewanella frigidimarina (código de acceso NCBI

YP_752317.1). El PCR se realizó utilizando la enzima Elongasa y consistió en 2 mezclas con un

volumen final de 50 µL. La mezcla 1 se preparó de acuerdo a: 5 ρM de cada partidor, 150 ηg de

templado, 0,2 mM de cada dNTP, se completó el volumen con agua Milli-Q estéril hasta 20 µL.

La mezcla 2 consistió de: tampón A 5X y tampón B 5X para una concentración final de Tris-

SO4 60 mM (pH 9,1), (NH4)2SO4 18 mM y sulfato de magnesio 1,9 mM más 5 unidades de

enzima Elongasa, se completó el volumen con agua Milli-Q estéril hasta 30 µL. La mezcla 1 se

calentó durante 30 s a 94ºC y luego se agregó la mezcla 2. El programa requerido para la

amplificación del gen codificante de lipasa consistió en una etapa inicial de denaturación a 94ºC

durante 3 min, seguida por 25 ciclos de amplificación que incluían 3 etapas: 30 s a 94ºC, 45 s a

55ºC, una etapa de extensión de 3 min a 68ºC y un último ciclo de 10 min a 72ºC.

II.2.9 Secuenciación de ADN y análisis de secuencia

Los productos de PCR obtenidos se purificaron a partir de los geles de agarosa, se

ligaron a los vectores como se describe en el punto II.2.11, luego se aisló el ADN plasmidial

mediante minipreparacion como se indica en el punto II.2.15 y 20 uL de los plasmidios aislados

se enviaron a secuenciar a la empresa Macrogen S.A, Korea. El resultado de la secuenciación

obtenida fue analizado utilizando el programa Omiga 2.0 y los algoritmos BLASTn o BLASTp

(Altschul y col., 1997), se compararon las secuencias nucleotídicas o aminoacídicas

respectivamente con otras secuencias descritas en las bases de datos de NCBI para corroborar

que eran las secuencias esperadas.

II.2.9.1 Complementación de la secuencia del gen codificante de lipasa

Con el fin de completar la secuencia del gen codificante de lipasa, las secuencias

obtenidas utilizando la técnica de Genome Walking junto a las secuencias parciales conocidas

anteriormente, se complementaron utilizando el programa Omiga 2.0. Luego, para obtener la

secuencia aminoacídica codificada por el gen, se utilizó la herramienta de búsqueda de ORF

que tradujo la secuencia nucleotídica en todos sus marcos de lecturas utilizando como referencia

las secuencias de motivos bacterianos conservados.

29

II.2.9.2 Construcción de árboles filogenéticos

Para la construcción de los árboles filogenéticos, tanto del ADNr 16S como de la proteína

lipasa, se utilizó el programa Bioedit (Hall, 1999) y luego se visualizó mediante el programa

TreeView versión 1.6.6 (Page, 1996).

II.2.9.2.1 A partir de las secuencias parciales del ADNr 16S Con la herramienta ClustalW se alinearon las secuencias 5 secuencias de ADNr 16S

obtenidas partir de las bacterias de origen marino antártico, más 15 secuencias ADNr 16S

obtenidas desde la base de datos de NCBI. Luego se utilizó la herramienta ADNDist→

Neighbor phylogenetic tree para hacer el análisis de distancia.

II.2.9.2.2 A partir de las secuencias aminoacídicass de las proteínas lipasas Con la herramienta ClustalW se alinearon las 4 secuencias de las lipasas obtenidas a

partir de las bacterias de origen marino antártico, más 16 secuencias de lipasas activas a bajas

temperaturas obtenidas desde la base de datos de NCBI. Luego se utilizó la herramienta

ProtDist→ Neighbor phylogenetic tree para hacer el análisis de distancia.

II.2.10 Clonamiento del gen codificante de lipasa en los vectores de expresión.

II.2.10.1 Diseño de partidores

Basándose en el análisis de la secuencia obtenida del gen codificante de lipasa se

diseñaron los partidores: LipE13pET22F y LipE13pET22R que incluían los sitios de restricción

NcoI y XhoI, respectivamente, los cuales proporcionaron los extremos requeridos para clonar el

gen en el vector pET-22b(+). Asimismo, se diseñaron los partidores: LipE13pMALF y

LipE13pMALR que incluían los sitios de restricción KpnI y PstI respectivamente, los que

proporcionaron los extremos requeridos para clonar el gen en el vector pMAL-c2E.

Adicionalmente, se diseñaron los partidores pETShewF, pETShewR, pMALShewF,

pMALShewR a partir de los extremos de la secuencia nucleotídica del gen codificante de lipasa

de la bacteria Shewanella frigidimarina con los sitios de restricción necesarios para clonar el

gen en los vectores de expresión respectivos. La secuencia y temperaturas de alineamiento de

todos los partidores utilizados en este punto se detallan en la tabla 3.

30

II.2.10.2 Amplificación del gen codificante de lipasa mediante PCR

Para poder clonar el gen codificante de lipasa completo, éste se amplificó mediante

PCR. Se utilizó como templado el ADN genómico de las 5 cepas bacterianas marinas antárticas

y las parejas de partidores: LipE13pET22F-LipE13pET22R y pETShewR-pETShewR para ser

clonados en el vector de expresión pET22(b+) y LipE13pMALF- LipE13pMALR y

pMALShewF-pMALShewR, para ser clonados en el vector de expresión pMAL-c2E.

El PCR se llevó a cabo utilizando la enzima Elongasa, consistió en 2 mezclas con un

volumen final de 50 µL. La mezcla 1 se preparó de acuerdo a: 5 ρM de partidor, 150 ηg de

templado, 0,2 mM de cada dNTP, se completó el volumen con agua Milli-Q estéril hasta 20 µL.

La mezcla 2 consistió de: tampón A 5X y tampón B 5X para una concentración final de Tris-

SO4 60 mM (pH 9,1), (NH4)2SO4 18 mM y sulfato de magnesio 1,9 mM más 5 unidades de

enzima Elongasa, se completó el volumen con agua Milli-Q estéril hasta 30 µL. Se calentó

mezcla 1 durante 30 s a 94ºC, y luego se agregó la mezcla 2. El programa requerido para la

amplificación del gen codificante de lipasa se determinó empíricamente mediante la utilización

de gradientes de temperatura. Sin embargo, en general incluía una etapa inicial de desnaturación

a 94ºC durante 3 min, seguida por 25 ciclos de amplificación que incluían 3 etapas: 30 s a 94ºC,

45 s a la temperatura determinada dependiendo de los partidores utilizados, una etapa de

extensión de 3 min a 68ºC y un último ciclo de 10 min a 72ºC.

II.2.11 Ligación a los vectores de clonamiento y expresión

Para la reacción de ligación se utilizó como inserto los productos de PCR purificados

desde geles de agarosa, los cuals se ligaron a vectores de clonamiento o expresión dependiendo

del interés utilizando una razón inserto: vector de 3:1. A continuación se detallan los

procedimientos.

II.2.11.1 Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy

La reacción de ligación se realizó en un volumen final de 10 uL en una mezcla que

contenía 50 ηg de vector pGEM-T Easy, 3,5 µL de inserto, tampón de ligación 2X y 1 unidad de

enzima T4-ADN ligasa y se completó el volumen con agua Milli-Q. Se dejó ligando por 16

horas a 16ºC y el producto de esta ligación se utilizó para transformar células de E. coli DH5α

electrocompetentes.

31

II.2.11.2 Ligación en los vectores de expresión pET22b(+) y pMAL-c2E

La reacción de ligación se realizó en un volumen final de 10 µL en una mezcla que

contenía 100 ηg de vector digerido, 300 ng de inserto digerido con las mismas enzimas de

restricción, tampón T4 ADN ligasa 5X (Tris/HCl 250 mM pH 7,6, cloruro de magnesio 50 mM,

ATP 5 mM, DTT 5 mM, polietilénglicol-8000 25% p/v) y 1 µL de T4 ADN ligasa. Se completó

el volumen con agua Milli-Q. Se dejó ligando por 16 horas a 16ºC y el producto de esta ligación

se utilizó para transformar células de E. coli BL21(DE3) o TB1 electrocompetentes.

II.2.12 Preparación de células electrocompetentes

La preparación de células electrocompetentes de E. coli DH5α así como las cepas

BL21(DE3) se realizó de la misma forma. El medio de cultivo utilizado fue el medio SOB que

contiene por litro de solución: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 0,584 g de cloruro

de sodio, 0,186 g de cloruro de potasio. El pH se ajustó a 7,6 y se esterilizó por autoclave.

Se preparó un cultivo de 10 mL con medio SOB y se inoculó con una colonia de la cepa

requerida. Este cultivo permaneció en un agitador orbital MaxQ 4000 con agitación de 200 rpm,

a una temperatura de 37ºC durante 16 horas. Se midió la densidad óptica del cultivo a 600 nm

(DO600) utilizando como blanco medio estéril y se determinó el volumen requerido para inocular

1 L de medio SOB a una DO600 inicial de 0,05 unidades de absorbancia. Este cultivo se dejó

creciendo a la misma temperatura y agitación hasta alcanzar una DO600 entre 0,6 y 0,8 (2-4 h).

El cultivo se enfrió en hielo durante 10 min y se centrifugó a 5.000g durante 10 min centrífuga

Sorvall RC-28S, rotor GS-3 a 4ºC. El precipitado obtenido se lavó 4 veces con glicerol 10% v/v

estéril, luego del último lavado, el precipitado se resuspendió en el residuo de glicerol, y fue

alicuotado en volúmenes pequeños de 25 y 100 µL para ser almacenados a -80ºC.

II.2.13 Transformación de células electrocompetentes

Se agregó 1 µL de mezcla de ligación obtenida en el punto II.2.11 sobre 20 µL de

células electrocompetentes de E. coli DH5α, BL21(DE3) o TB1. La electroporación se realizó

en un equipo Cell-Porator Electroporation System en las siguientes condiciones: 420V, 330µF,

baja impedancia, una tasa de carga rápida y un tiempo máximo de 2,5 ms. Las células

transformadas se mezclaron con 1 mL de medio LB y se incubaron a 37ºC durante 1 hora con

agitación de 200 rpm. Luego se centrifugó a 13.000 rpm en la centrífuga IEC MP4R, Rotor 224

durante 1 min, se descartaron 950 µL de sobrenadante y el sedimento se resuspendió en el

volumen restante. Esta muestra de células resuspendidas fue sembrada en placas con medio

32

selectivo que contiene por cada litro 15,5 g de medio LB, 10 g de cloruro de sodio, agar 1,5%

p/v y 100 µg/mL de ampicilina. Las placas de transformación se incubaron a 37ºC durante 16 h

y se conservaron a 4ºC.

II.2.14 Selección de los clones que poseen el inserto

II.2.14.1 En el vector pGEM-T Easy

Para identificar los clones positivos que poseían el inserto de interés dentro del vector

pGEM-T Easy se aprovechó la propiedad de α-complementación de este sistema en las bacterias

Escherichia coli DH5α (Welply y col., 1981). Las células electrocompetentes transformadas

fueron sembradas en placas con medio selectivo (II.2.13) más IPTG 0,1 mM, y X-Gal 40 mg/L

preparado en N,N’- dimetil-formamida. Las placas de transformación se incubaron a 37ºC

durante 16 horas y luego se seleccionaron las colonias blancas.

II.2.14.2 En el vector pET22(b+) y pMAL-c2E

Para identificar los clones positivos que poseían el inserto de interés dentro del vecror

pET22(b+) y pMAL-c2E fue necesario realizar un PCR de las colonias. Los clones

seleccionados se transfirieron, mediante una punta estéril, desde la placa de transformación a

placas grillas con medio selectivo y a un tubo Eppendorf con 100 µL de agua Milli-Q estéril.

Esta suspensión se incubó a 100ºC durante 10 min y se tomaron 5 µL para utilizarlos como

templado, los que se agregaron sobre 15 µL de mezcla de PCR que contenía 1 µM de cada

partidor con los que se amplificó el fragmento clonado, 0,2 mM de cada dNTP, 1,4 mM de

cloruro de magnesio, tampón Go Taq 1X y 1 unidad de enzima Go Taq ADN polimerasa.

El programa requerido para el PCR de colonias fue el mismo que se utilizó para

amplificar el fragmento que se clonó. Luego los productos de este PCR de colonias se

analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v.

II.2.15 Minipreparación de ADN plasmidial

Se preparó un cultivo de 4 mL con medio LB, que contiene por cada litro: 10 g de

triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio y ampicilina 100 µg/mL.

Este cultivo permaneció en un agitador orbital MaxQ 4000 con una agitación de 200

rpm a una temperatura de 37ºC durante 16 horas. Luego para la extracción del ADN plasmidial

33

se utilizó el sistema comercial QIAprep Spin Miniprep Kit. La extracción se realizó según las

instrucciones del fabricante.

II.2.16 Digestión del ADN plasmidial

El ADN plasmidial aislado mediante minipreparación como se indica en el punto

anterior, se digirió con distintas enzimas dependiendo del interés. La enzima EcoRI se utilizó

para corroborar la presencia de insertos ligados en pGEM-T Easy, NcoI y XhoI se usaron para

digerir el vector pET22b(+), ya fuera para su linealización o para recuperar insertos ligados en

él, mientras que las enzimas KpnI y HindIII se utilizaron para digerir el vector pMAL-c2E, ya

fuera para su linealización o para escindir insertos ligados en él.

La reacción de digestión en cada caso se realizó en un volumen final de 20 µL y

contenía 2 µL de tampón 5X recomendado por cada proveedor, las unidades de enzima(s)

indicadas por el proveedor y 100 ηg de vector para el caso de pGEM-T Easy con inserto. Para el

caso de la linealización, se utilizó 500 ηg de los vectores de expresión y para los vectores de

expresión más el inserto se ocupó 1,5 µg. La mezcla se llevó al volumen final con agua Milli-Q

estéril. Esta mezcla de digestión se dejó reaccionando durante 2 horas a 37ºC y el resultado se

analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% p/v.

II.2.17 Producción de Proteínas

II.2.17.1 Sistema de expresión E. coli BL21(D3E)/pET22b(+).

El vector de expresión pET22(b+) ligado con el gen de la lipasa de interés se denominó

LipE5pET22 y se utilizó para transformar células electrocompetentes de E. coli BL21(DE3),

como control se utilizaron las mismas células transformadas con el vector sin el inserto

(pET22). Se realizó un stock en glicerol al 10% v/v de estos dos tipos de células transformadas,

se almacenó a -80ºC y a partir de éstos se realizaron todos los cultivos.

El medio de cultivo utilizado para el crecimiento y expresión de la proteína

recombinante por las bacterias E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector pET22(b+) fue el

medio Terrific Broth (TB), que contiene por cada litro de solución: 12 g de triptona, 24 g de

extracto de levadura y 4 mL de glicerol. El volumen se llevó a 900 mL con agua Milli-Q, se

esterilizó por autoclave. Antes de utilizar se agregó 100 mL de sales de fosfato de potasio

34

(potasio fosfato monobásico 0,72 M y potasio fosfato dibasico 0,17 M) más glucosa estéril a

una concentración final de 1% v/v y carbenicilina a una concentración final de 200 ug/mL.

Se prepararon dos cultivos de 20 mL con medio TB y se inoculó cada uno con el stock

en glicerol de la cepa requerida. Estos cultivos permanecieron en un agitador orbital MaxQ

4000 con agitación de 200 rpm a una temperatura de 25ºC durante 16 horas. Al día siguiente

utilizando el espectrofotómetro Ultrospec 3000, se midió la densidad óptica a 600 nm de cada

cultivo utilizando como blanco medio estéril y se determinó el volumen requerido para inocular

250 mL de medio TB a una DO600 inicial de 0,05 unidades de absorbancia. Estos cultivos se

dejaron creciendo a la misma temperatura y agitación hasta alcanzar un valor de DO600 entre 0,6

y 1,3. Antes de la inducción se debió cambiar los medios de cultivo, lo cual se realizó

colectando las células (en botellas esterilizadas) mediante centrifugación 5.000g, durante 10 min

a 4ºC en la centrífuga Sorvall RC-28S y rotor GS-3. Los precipitados se resuspendieron en 250

mL de medio TB estéril sin glucosa, se pasaron a un matraz Erlenmeyer de 1 L estéril y se

indujeron agregando IPTG estéril para alcanzar una concentración final entre 0,01 y 1 mM. Los

cultivos se mantuvieron en un agitador orbital MaxQ 4000 con agitación de 200 rpm, a una

temperatura de 15ºC por períodos entre 3 a 16 h.

I.2.17.2 Sistema de expresión E. coli BL21(DE3)/pMAL-c2E.

El vector de expresión pMAL-c2E ligado con el gen de la lipasa de interés se denominó

LipE5pMAL, y se utilizó para transformar células electrocompetentes de E. coli BL21(DE3),

como control se utilizaron las mismas células transformadas con el vector sin el inserto

(pMAL). Se realizó un stock en glicerol al 10% de estos dos tipos de células transformadas, el

que se almacenó a -80ºC, y a partir de estos se realizaron todos los cultivos.

El medio de cultivo utilizado para el crecimiento y expresión de la proteína

recombinante por las bacterias E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector pET22(b+) fue el

medio Rich Broth (RB), que contiene por cada litro de solución: 10 g de triptona, 5 g de

extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio y 2 g de glucosa. El volumen se llevó a 1 L con

agua Milli-Q. Se esterilizó por autoclave y antes de utilizar se le agregó carbenicilina a una

concentración final de 200 µg/mL

Se prepararon dos cultivos de 20 mL con medio RB y se inoculó cada uno con el stock

en glicerol de la cepa requerida. Estos cultivos permanecieron en un agitador orbital MaxQ

4000 con agitación de 200 rpm, a una temperatura de 25ºC durante 16 h. Al día siguiente

utilizando el espectrofotómetro Ultrospec 3000, se midió la densidad óptica a 600 nm de cada

35

cultivo utilizando como blanco medio estéril y se determinó el volumen requerido para inocular

250 mL de medio RB a una DO600 inicial de 0,05 unidades de absorbancia. Estos cultivos se

dejaron creciendo a la misma temperatura y agitación, hasta alcanzar un valor entre 0,6 y 1,3 y

se indujeron agregando IPTG estéril para alcanzar una concentración final entre 0,01 y 1 mM.

Los cultivos se mantuvieron en un agitador orbital MaxQ 4000 con agitación de 200 rpm, a una

temperatura de 15ºC por períodos entre 3 a 16 h.

II.2.17.3 Lipasa psicrófila nativa de la cepa E5

Se prepararon dos cultivos de 20 mL con medio marino 2216 y se inoculó cada uno con

el stock en glicerol de la cepa bacteriana Antártica E5. Estos cultivos permanecieron en un

agitador orbital MaxQ 4000 con agitación de 200 rpm, a una temperatura de 4ºC durante 2 días.

Luego, estos cultivos se centrifugaron a 5000g en la centrífuga Eppendorf 5804 R Rotor F34-

63-8, durante 5 min y el sedimento de células se utilizó como preinóculo para otros dos cultivos.

Uno de 100 mL de medio marino 2216, y otro de 100 mL de medio marino 2216 suplementado

con aceite de oliva al 1% emulsificado mediante ultrasonido utilizando el sonicador Microson.

Estos cultivos permanecieron en un agitador orbital MaxQ 4000 con agitación de 200 rpm, a

una temperatura de 4ºC durante 7 días.

II.2.18 Medición del crecimiento celular

El crecimiento celular de las bacterias E. coli BL21(DE3) transformadas con los

plasmidios LipE5pET22 y LipE5pMAL, asi como de la bacteria marina antártica E5, fue

monitoreado mediante mediciones constantes de absorbancia a 600 nm de longitud de onda . A

partir de los cultivos preparados como se indica en el punto II.2.17, se tomaron alícuotas de 1

mL cada 30 min para E. coli, y cada 12 h para la cepa E5. Se midió la DO600 utilizando el

espectrofotómetro Ultrospec 3000. En caso de ser necesario, la muestra se diluyó con agua

destilada para estar dentro del rango de linealidad del espectrofotómetro (hasta 0,1 unidades de

absorbancia).

Los gramos de peso seco de bacterias se determinaron mediante una curva de

calibración de masa seca en función de la absorbancia de las células a 600 nm (Anexo VI.1.1).

Para elaborarla, se prepararon variadas diluciones con agua destilada en tubos de 50 mL

previamente secados y pesados y e midió la DO600 a las muestras diluidas una vez finalizado el

cultivo. Posteriormente, los tubos fueron centrifugados a 10.000g durante 30 min en la

36

centrifuga Eppendorf 5804 R Rotor F34-63-8, se descartaron los sobrenadantes y los tubos con

el sedimento celular se secaron en la estufa Gallenkamp a 80oC, hasta alcanzar un peso

constante aproximadamente a las 20 h. Finalmente, los tubos fueron pesados y se restó el peso

de los tubos vacíos, obteniendo de este modo, el peso de las células correspondiente a las

unidades de absorbancia medidas para cada dilución.

II.2.19 Obtención de las distintas fracciones celulares

II.2.19.1 Fracción extracelular

La fracción extracelular de las bacterias se obtuvo centrifugando los medios de cultivo a

5.000g durante 10 min a 4ºC en la centrífuga Sorvall RC-28S y rotor GS-3. El sobrenadante

obtenido se almacenó a 4ºC.

II.2.19.2 Fracción periplasmática

Las células colectadas en el punto anterior se resuspendieron en 50 mL/g peso húmedo

de una solución Tris/HCl 30 mM, sacarosa 20%, pH 8, luego se agregó EDTA frío a una

concentración final de 1 mM. Se agitó suavemente en hielo durante 10 min y se centrifugaron a

10.000g durante 10 min a 4ºC en la centrífuga Sorvall RC-28S y rotor GS-3. El sobrenadante

obtenido de esta centrifugación correspondiente a la fracción de lavado la que también se

guardó a 4ºC. Posteriormente, las células precipitadas se resuspendieron en un volumen igual al

anterior de una solución de sulfato de magnesio 5 mM frío. Se agitó suavemente en hielo

durante 10 min y se centrifugó a 10.000g durante 10 min a 4ºC en la centrífuga Sorvall RC-28S

y rotor GS-3. El sobrenadante obtenido en esta etapa correspondió a la fracción periplasmática,

y se guardó a 4ºC.

II.2.19.3 Fracción citoplasmática o soluble

El precipitado del punto anterior se guardó a -20ºC por 30 min, luego se resuspendió en

un volumen de 5 mL/g del peso húmedo inicial del cultivo en una solución de Tris/HCl 30 mM

pH 8. La suspensión se mantuvo en hielo y se sonicó utilizando el sonicador Microson, con

pulsos de 30 s durante 10 min. Luego se centrifugó a 10.000g durante 30 min a 4ºC en la

centrífuga Eppendorf 5804 R Rotor F34-63-8, el sobrenadante obtenido en esta etapa

correspondió a la fracción citoplasmática, la que se almacenó a 4ºC.

37

II.2.19.4 Fracción insoluble

El precipitado obtenido en el punto anterior se solubilizó en Tris/HCl pH 8 en el caso de

bacterias antárticas y con Urea 8M si este precipitado correspondía a cuerpos de inclusión

formados por E. coli como resultado de la expresión de la proteína recombinante.

II.2.20 Comprobación de la correcta extracción de las distintas fracciones celulares

Para descartar la contaminación de una fracción con otra, se realizó un ensayo

enzimático de β-galactosidasa, por ser un eficiente marcador de citoplasma, que no debe

presentar actividad en ninguna otra fracción celular.

El ensayo enzimático se realizó según el protocolo descrito por Araujo y col., 2007,

utilizando como sustrato ONPG (orto-nitrofenilgalactopiranosido) en una concentración de

0,015 M. La mezcla de reacción contenía 100 uL de muestra, 100 uL de sustrato en 2,8 mL de

tampón Tris/HCl 50 mM pH 8. Luego de 10 min de reacción a temperatura ambiente, se analizó

la liberacion de ρ-nitrofenol de coloración amarilla, la actividad β-galactosidasa se determinó

cualitativamente como positiva o negativa para cada fracción.

II.2.20 Ensayo con inhibidor de proteasas PMSF

Se preparó un stock 0,1 M del inhibidor de proteasas PMSF en isopropanol. Luego se

agregó a cada fracción celular obtenida en el punto II.2.19 a una concentración final de 1 mM.

II.2.22 Ensayo de toxicidad de la lipasa recombinante

Se realizó un ensayo de toxicidad basado en el ensayo de inestabilidad de plasmidio

descrito en el Manual del Sistema pET (Novagen, 2006). Para esto, se prepararon dos cultivos

de 20 mL, uno con medio TB y otro con medio RB y se inoculó cada uno con el stock en

glicerol de la cepa requerida LipE5pET22 y LipE5pMAL, respectivamente. Estos cultivos

permanecieron en un agitador orbital MaxQ 4000 con agitación de 200 rpm a una temperatura

de 25ºC durante 16 h. Al día siguiente se midió la DO600 de cada cultivo utilizando como blanco

medio estéril y se determinó el volumen requerido para inocular 250 mL de medio TB y 250 mL

de medio RB a una DO600 inicial de 0,05 unidades de absorbancia. Estos cultivos se dejaron

creciendo a la misma temperatura y agitación hasta alcanzar un valor de DO600 = 1. Luego, se

calculó la cantidad de cultivo necesaria para obtener una dilución aproximada de 1 x 10-7 células

en placas y con esta cantidad se procedió a sembrar placas con medio LB agar suplementadas

38

con distintas concentraciones del inductor IPTG (entre 0,01 mM y 1 mM) con o sin el

antibiótico carbenicilina en una concentración de 200 µg/mL. Todas las placas se incubaron a

20ºC durante toda la noche y finalmente se realizó el conteo de colonias presentes en cada una

de ellas.

II.2.23 Determinación de la concentración de proteínas

La concentración de proteínas de las diferentes muestras se determinó mediante el

ensayo de Bradford (Bradford, 1976) modificado, para lo cual se mezcló: 1,7 mL de agua

destilada, 500 uL de reactivo de Bradford (1g/L de azul de Coomassie preparado en ácido

clorhídrico 2,2% v/v) y 50 µL de muestra o proteína estándar de calibración.

Se utilizó la proteína BSA 0,5 mg/mL como solución patrón para la construcción de una

curva de calibración en concentraciones entre 0,0625 y 1 mg/mL. Se midió las unidades de

absorbancia a 465 nm (DO465) y 595 nm (DO595) y se calculó la razón DO465 / DO595. El valor

obtenido en ausencia de BSA se restó a todas las demás razones y se graficó en función de la

concentración de BSA (Anexo VII.1.2).

Para determinar la concentración de proteínas totales de una muestra, se obtuvo la razón

DO465/ DO595 y este valor se dividió por la pendiente de la curva de calibración

II.2.24 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida

Las separaciones electroforéticas en condiciones denaturantes (SDS -PAGE) se

realizaron en una cámara vertical MiniProtean II. La electroforesis se realizó según Bollag y

col. (1996), las muestras se mezclaron en proporción 4:1 con tampón de carga 5X (Tris/HCl 60

mM, glicerol 25% v/v, SDS 2% p/v, β- mercaptoetanol 14,4 mM y azul de bromofenol 0,1% p/v

pH 6,8), se denaturaron calentando a 100ºC durante 5 min y posteriormente se cargaron en geles

de poliacrilamida preparados de acuerdo al porcentaje de acrilamida que fuese necesario

(Laemmli, 1970). Se incluyó 5 uL de marcador de peso molecular preteñido. Las electroforesis

se realizaron bajo voltaje constante de 150 V y como tampón de corrida se utilizó una solución

que contenía Tris 25 mM, glicina 192 mM y SDS al 0,1% p/v.

39

II.2.25 Tinción de geles

II.2.25.1 Azul de Coomassie

El gel se incubó durante una hora en solución de tinción (1 g/L de azul de Coomassie,

45% v/v de metanol, 10% v/v de ácido acético) por 1 hora, para luego incubarlo con solución de

distinción (45% v/v de metanol, 10% v/v de ácido acético). Finalmente, el gel se lavó con agua

destilada y se fotografió con una cámara Nikon Coolpix 4500.

II.2.25.2 Nitrato de Plata

En caso de no observar proteínas después de realizar la tinción con azul de Coomassie

descrita en el punto anterior, fue necesario teñir el gel con nitrato de plata, ya que esta tinción es

más sensible y permite visualizar 1 a 2 ηg de proteínas. Para esto, el gel se incubó durante 1 h

con 100 mL de una solución al 40% etanol y 10% ácido acético, luego se lavó en agua destilada

durante 2 h o toda la noche. A continuación, el gel se incubó con una solución 5 µg/mL DTT

durante 30 min. Posteriormente, se retiró el reactivo DTT y se incubó en oscuridad en una

solución de nitrato de plata 0,1% p/v durante 30 min, se reveló en carbonato de sodio 3% p/v

que contenía 50 µL de formaldehido al 37%, luego de verificar la aparición de bandas se detuvo

la reacción adicionando ácido cítrico 2,3 M. Finalmente, el gel se lavó con agua destilada y se

fotografió con una cámara Nikon Coolpix 4500.

II.2.26 Medición de actividad lipolítica

II.2.26.1 Ensayo de actividad en medio sólido

Para determinar la actividad lipolítica de las fracciones celulares obtenidas en el punto

II.2.19, se utilizó utilizando el agar Spirit Blue (Starr, 1941) que contiene por cada litro de

solución: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 20 g de agar y 0,15 g de Spirit Blue. Este

medio se preparó disolviendo 35 g por litro de agua destilada y se esterilizó por autoclave. Se

dejó enfriar a 50°C y se adicionó 3% v/v de reactivo lipasa que contiene el lipido tributirina y

polisorbato 80. Luego de homogeneizar el agar con el reactivo, se virtieron 20 mL de la mezcla

en placas de Petri estériles, éstas se dejaron gelificar, se sellaron con parafilm y luego se

guardaron a 4°C. La actividad lipolítica se determinó, cualitativamente, al observar el cambio

de coloración del indicador de pH presente en el agar Spirit Blue frente a la reacción de

hidrólisis efectuada por una lipasa.

40

II.2.26.2 Ensayo de actividad en medio líquido

Para la cuantificación de la actividad lipolítica se utilizó el protocolo descrito por Izrael-

Zivkovic y col. (2009), con algunas modificaciones. Para el ensayo estándar se preparó una

solución stock de ρ-nitrofenilcaprato (ρ-NFC) 3 mg/mL en isopropanol como sustrato y un

tampón de ensayo que contiene Tris/HCl 50 mM pH 8, desoxicolato de sodio 5 mM y goma

arábica 1,1 mg/mL. La solución sustrato/tampón de ensayo se preparó en una proporción 1:9, el

sustrato se agregó lentamente bajo agitación continua a la solución de ensayo. La reacción se

realizó en placas de PCR Ultra Amp, donde en cada pocillo se agregó 225 uL de la mezcla

sutrato/ tampón de ensayo y luego se adicionó 25 uL de la muestra. Despues de 30 min de

reacción a 20ºC, la reacción se detuvo según Kanwar y col., 2005, utilizando una mezcla una

mezcla de etanol: acetona. Finalmente se depositaron 200 uL en una placa Falcon de 96

pocillos, se leyó la densidadoptica a 405 nm en un lector de placas Asys UVM 340 para seguir

espectrofotométricamente la liberación de ρ-nitrofenol. Como referencia se utilizó la solución

de ensayo y también se analizó la hidrólisis no enzimática.

Las unidades de actividad lipasa se determinaron según:

(Absorbancia (Muestra) – Absorbancia (Control) – n) x 1000

Trx m

En la formula n y m corresponden al intercepto y la pendiente de la curva de calibración

respectivamente (Anexo VI.1.3), Trx al tiempo de duración de la reacción el que fue de 30 min,

y se multiplicó por 1.000 para obtener la actividad en µmoles/(min·mL). Se definió la unidad de

actividad enzimática lipasa como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de ρ-

nitrofenol desde el sustrato utilizado por minuto.

La actividad específica se determinó: Unidades de Actividad Lipasa Concentración de proteínas totales

II.2.26.2.1 Ensayo a distintas temperaturas:

Se realizó en placas de PCR Ultra Amp utilizando el termociclador Eppendorf

Mastercycler Gradient para generar distintas temperaturas.

41

II.2.26.2.2 Determinación de pH óptimo:

Se prepararon distintas soluciones de ensayo dependiendo del rango de pH: para los pH

5 y 6 se preparó el tampón de ensayo: acetato de sodio 20 mM, Triton X-100 4,4 mg/mL y

goma arábica 1,1 mg/mL; para los pH 7, 8 y 9 se utilizó el tampón de ensayo: Tris/HCl 50 mM,

desoxicolato de sodio 5 mM y goma arábica 1,1 mg/mL; para los pH 11 y 10 se preparó el

tampón de ensayo: CAPS 50 mM, desoxicolato de sodio 5 mM y goma arábica 1,1 mg/mL

II.2.26.3 Ensayo de actividad in situ

Para determinar la actividad enzimática in situ (en gel), primero se corrió un gel de

poliacrilamida en condiciones denaturantes y luego se renaturó in situ. Para esto, se utilizó el

procedimiento descrito por Hou y col. (1999). El gel se incubó dos veces durante 5 min en

isopropanol 25% v/v preparado en Tris/HCl 20 mM pH 8 y luego se lavó 2 veces en el tampón

Tris/HCl 20 mM pH 8 durante 8 min cada vez. Todo el proceso se realizó a temperatura

ambiente. Luego, se siguió el protocolo descrito por Brahimi-Horn y col. (1991), con algunas

modificaciones. Se utilizó como sustrato α-naftilacetato y se solubilizaron 75 mg de éste en una

mezcla de 4,7 mL de acetona y 0,3 mL de Triton X-100. La solución obtenida se agregó

lentamente a 100 mL de tampón Tris/HCl 20 mM pH 8, calentado con anterioridad a 45ºC.

Posteriormente, se agregó 75 mg de la sal Fast Garnet GBC a la solución de sustrato/tampón

fría. El gel se incubó en la solución de sustrato/Fast Garnet GBC/tampón hasta la aparición de

una banda café. Todas las soluciones se prepararon en el momento de realizar el ensayo.

II.2.27 Purificación de la Lipasa

II.2.27.1 Sistema de expresión E. coli BL21(D3E)/pET22b(+)

La purificación de la lipasa expresada en el vector pET22 se realizó por cromatografía

de afinidad por metales IMAC. El periplasma obtenido, como se indica en el punto II.2.19.2, se

incubó en hielo con 500 uL de la resina de agarosa níquel-NTA, durante 2 h y luego se cargó en

una columna plástica PD10 previamente equilibrada con tampón de equilibrio (fosfato de sodio

50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 30 mM, pH 8). La columna se lavó con 4 mL de

tampón de unión (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 10 mM, pH 8),

luego con 2 mL de tampón de equilibrio y finalmente se eluyó con 1 mL de tampón de elución

(tampón de unión más imidazol 250 mM, pH 8) en 10 fracciones de 100 uL. A las fracciones

obtenidas se les midió concentración de proteínas mediante ensayo de Bradford (II.2.23), tras lo

42

cual las fracciones con mayor concentración de proteínas fueron cargadas en un gel SDS- PAGE

(II.2.24)

II.2.27.2 Sistema de expresión E. coli BL21(D3E)/pMAL-c2E

La purificación de la lipasa expresada en el vector pMAL-c2E se realizó mediante una

cromatografía de afinidad en resina de amilosa. El citoplasma obtenido, como se describe en el

punto II.2.19.3 se incubó en hielo con 500 uL de resina durante 2 h y luego se cargó en una

columna plástica PD10 previamente equilibrada con el tampón de equilibrio (Tris/HCl 20 mM,

cloruro de sodio 200 mM, EDTA 1 mM pH 8). La columna se lavó con 6 mL de tampón de

equilibrio y finalmente se eluyó con 1 ml de tampón de elución (tampón de equilibrio más

maltosa 10 mM) en 10 fracciones de 100 uL. A las fracciones obtenidas se les midió la

concentración de proteínas mediante un ensayo de Bradford (II.2.23), tras lo cual las fracciones

con mayor concentración de proteínas fueron cargadas en un gel SDS –PAGE (II.2.24).

II.2.27.3 Nativa

Se cultivó la cepa psicrófila E5 según lo descrito en el punto II.2.17.3, y se obtuvo la

fracción extracelular como se indica en el punto II.2.19.1. El sobrenadante se concentró

utilizando tubos centriplus los cuales fueron centrifugados a 3000g durante 6 h a 4ºC en una

centrífuga Sorvall RC-28S y rotor F-24. Luego, se realizó una cromatografía de filtración en

gel, en una columna Supelco GFC 100 de 13,25 mL de 300 x 7,5 mm, equilibrada con tampón

de equilibrio (acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 0,1 mM, pH 6) a un flujo de elución de

0,08 mL/min al 100% de tampón de equilibrio en 1,5 volúmenes de columna, se cargaron 500

uL del sobrenadante concentrado y se colectaron fracciones de 250 uL a las que se les realizó

ensayo de actividad en medio líquido como se describe en el punto II.2.26.2.

Se confeccionó una curva de calibración (Anexo VI.1.4) separando bajo las mismas

condiciones proteínas utilizando de peso molecular conocidos BSA (67 kDa), Ovalbúmina (45

kDa), Quimiotripsinógeno (25 kDa) y Ribonucleasa A (13,7 kDa), con el fin de determinar la

masa molecular según el volumen de elución de las proteínas.

43

III. RESULTADOS

III.1 Cultivo de los microorganismos psicrófilos productores de lipasas

Se trabajó con 5 cepas bacterianas de origen marino antártico identificadas como: A19,

B2, B9, E5 y E13 seleccionadas por ser productoras de enzimas lipolíticas, y de las que se

conocían sus secuencias parciales de genes codificantes de lipasas (240 pb).

A continuación, en la figura 4, se puede observar las colonias de estas 5 cepas,

creciendo en medio marino 2216- agar a 4ºC.

Figura 4. Colonias identificadas como productoras de lipasas: A19, B2, B9, E5 y E13

creciendo en medio marino-2216 agar a 4ºC.

III.2 Extracción de ADN genómico de las cepas bacterianas antárticas productoras de

lipasas

Se extrajo el ADN genómico de estas 5 cepas bacterianas con el fin de utilizarlo como

templado para la amplificación de los genes ADNr 16S (para análisis filogenético) y genes

codificantes de lipasas. El resultado de esta extracción se muestra en la figura 5.

pb

12.216

M A19 B2 B9 E5 E13

Figura 5. Análisis electroforético del ADN genómico extraído de las cepas productoras de lipasas. Se cargaron aproximadamente 150 ηg de ADN en gel de agarosa 0,7% p/v. M= Marcador 1 kpb.

44

En la figura 5, se observa la integridad del ADN genómico y la ausencia de

contaminantes. En todos los casos el ADN genómico se obtuvo de forma pura, ya que el

coeficiente DO260 / DO280 de cada uno siempre fue superior a 1,8.

III.3 Análisis filogenético del ADNr 16S de las bacterias marinas antárticas

Se amplificaron los fragmento del ADNr 16S de las cepas: A19, B2, B9, E5 y E13,

mediante PCR, utilizando como templado su ADN genómico y partidores especialmente

diseñados. El resultado de este procedimiento se muestra en la figura 6:

pb 1.018

M A19 B2 B9 E5 E13

Figura 6. Análisis electroforético del producto de amplificación del ADNr 16S de las cepas bacterianas de origen marino antártico. Se cargó el total de la mezcla de PCR en un gel de agarosa 1% p/v. M= Marcador 1 kpb.

En la figura 6 se distingue un producto de amplificación cercano a los 1.000 pb

correspondiente al ADNr 16S en las 5 cepas bacterianas, en el caso de las cepas B9 y E13

además se observan otras bandas correspondientes a productos de amplificación inespecíficos.

El resultado de la secuenciación de estas bandas fueron 5 secuencias de alrededor de

1.100 pb cada una (Anexo VII.2), las que fueron analizadas mediante el algoritmo BLASTn y

los resultados obtenidos se resumen a continuación en la tabla 5.

Tabla 5. Análisis mediante BLASTn de las secuencias parciales del ADNr 16S. A19 y B2 B9 E5 y E13

Identidad 99% 98% 98% Cepa Pseudoalteromonas

haloplanktis TAC125 Psychrobacter arcticus

273-4 Shewanella frigidimarina

NCIMB 400 Familia Pseudoalteromonadaceae Moraxellaceae Shewanellaceae

Orden Alteromonadales Pseudomonadales Alteromonadales

Se construyó un árbol filogenético con las secuencias del ADNr 16S de las 5 cepas

bacterianas marinas antárticas, más 15 secuencias ADNr 16S obtenidas desde la base de datos

45

de NCBI, correspondientes a diferentes especies pertenecientes a las familias

Pseudoalteromonadaceae, Moraxellaceae y Shewanellaceae. Este árbol filogenético del ADNr

16S se muestra en la figura 7.

Figura 7. Árbol filogenético construido a partir de las secuencias ADNr 16S. Las cepas

bacterianas de origen marino antártico se destacan en color rojo. La escala 0,1 indica el número de sustituciones nucleotídicas por sitio.

El árbol filogenético en la figura 7, muestra que pese a que existen mínimas diferencias

a nivel de secuencia nucleotídica del ADNr16S entre las 5 cepas bacterianas de origen marino

antártico (Anexo VII.2.6), efectivamente se trata de 5 especies diferentes, las que tienen en

común ser gammaproteobacterias. Por este motivo se decidió no descartar ninguna de ellas.

III.4 Obtención de genes codificantes para lipasas mediante técnica de Genome Walking

III.4.1 Pruebas de digestión del ADN genomico de las distintas cepas

Para la obtención de los extremos de los genes mediante la técnica de Genome Walking

fue necesario digerir el ADN en fragmentos de mediano tamaño (2-8 Kb) de manera de obtener

fragmentos que incluyeran íntegramente los genes codificantes de lipasas. Con este propósito se

46

efectuaron pruebas de digestión con diversas enzimas de restricción, entre ellas se utilizaron

enzimas que cortan y generan fragmentos con extremos cohesivos 5’ (BamHI, ClaI, HindIII,

KasI, NdeI, SalI y XbaI) y también enzimas que dejan extremos romos en los fragmentos

(EcoRV, PmeI, PvuII y SmaI). Las secuencias de corte de todas las enzimas utilizadas se

detallan en la tabla 2. El resultado de las digestiones del ADN genómico de las 5 cepas se

muestra a continuación en la figura 8.

A19

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

B2

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

B9

E5

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

E13

Figura 8. Análisis electroforético de las pruebas de digestión del ADN genómico de las cepas bacterianas con las distintas enzimas de restricción: 1. BamHI, 2.ClaI, 3. HindIII, 4. KasI, 5. NdeI, 6. SalI, 7. XbaI, 8. EcoRV, 9 PmeI, 10. PvuII y 11. SmaI. Se cargó el total de la digestión en un gel de agarosa 0,7% p/v.

47

Observando la figura 8, se determinó que para la cepa A19, las enzimas que digirieron

mejor su ADN genómico fueron HindIII y KasI, para la cepa B2 lo hicieron las enzimas HindIII

y PvuII, para la cepa B9 solo la enzima HindIII, mientras que la cepa E5 se digirió con todas las

enzimas probadas y la cepa E13 se digirió totalmente con las enzimas ClaI, HindIII, KasI, SalI,

EcoRV y PvuII.

Se seleccionó la enzima HindIII por ser común a las 5 cepas. Se realizó la digestión

total del ADN genómico y luego los fragmentos de ADN fueron purificados y extendidos

utilizando la enzima Go Taq ADN polimerasa y dNTPs. Con el fin de obtener fragmentos

genómicos con una adenina desapareada en el extremo 3’, los que posteriormente se ligaron al

oligo-adaptador AdaptT. De esta manera, se obtuvieron diferentes genotecas de fragmentos

digeridos, ligados a un mismo oligo-adaptador.

III.4.2 Elongación y amplificación de los extremos 3’ y 5’ de los genes codificantes para lipasas.

Se realizaron dos rondas de PCR, la primera con un solo partidor específico para el sentido

3’ o 5’, seguido de otro PCR utilizando un segundo partidor específico 3’ o 5’ más un partidor

que alineaba con la secuencia del oligo-adaptador.

Algunos de los productos de amplificación obtenidos se muestran en la figura 9.

pb 12.216

3.054 1.018

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1. Extremo 3’ A19 2. Extremo 5’ A19 3. Extremo 3’ B2 4. Extremo 5’ B2 5. Extremo 3’ B9 6. Extremo 5’ B9 7. Extremo 3’ E5 8. Extremo 5’ E5 9. Extremo 3’ E13 10. Extremo 5’ E13

Figura 9. Análisis electroforético de la amplificación por Genome Walking de los extremos 3’ y 5’ de los genes codificantes de lipasas de las cepas bacterianas.

Las bandas obtenidas se cortaron, purificaron, clonaron al vector pGEM-T Easy y se

mandaron a secuenciar. Los resultados fueron analizados utilizando el algoritmo BLASTn,

obteniéndose los resultados que se resumen a continuación en la tabla 6.

a b

d e

g

h

i

k

l

m

n

o

p q

r

f

c

j

p

48

Tabla 6. Secuencias parciales de genes obtenidas mediante Genome Walking

a No Significant Similarity Found g DNA Polymerase III Subunit

Delta Prime m

Rep Helicase, A Single-Stranded

DNA-Dependent ATPase

b Extracellular Arabinanase h DNA-Dependent Helicase III n Hypothetical Protein

c Dehydrogenase i Hypothetical Protein o Alpha/Beta Hydrolase Domain-Containing Protein

d DNA Polymerase III Subunit

Delta Prime j Extracellular Arabinanase p

Alpha/Beta Hydrolase Domain-Containing Protein

e Hypothetical Protein k No Significant Similarity Found q Alpha/Beta Hydrolase Domain-Containing Protein

f DNA-Dependent Helicase III l Hypothetical Protein r Alpha/Beta Hydrolase Domain-Containing Protein

Como se muestra en la tabla 6, se obtuvieron secuencias pertenecientes a genes

codificantes de lipasas solamente desde los fragmentos o, p, q y r amplificados a partir del ADN

genómico de las cepas E5 y E13, todas las otras secuencias obtenidas fueron productos

inespecíficos correspondientes a partes de otros genes codificantes o no codificantes de

proteínas amplificados utilizando la técnica de Genome Walking.

III.5 Análisis de las secuencias obtenidas mediante Genome Walking de genes codificantes

de lipasas

Las secuencias obtenidas mediante Genome Walking, junto a las secuencias parciales

con las que se contaba antes de iniciar el trabajo experimental de esta tesis, se complementaron

utilizando el programa Omiga 2.0, obteniéndose los resultados que se resumen a continuación

en la tabla 7:

Tabla 7. Análisis del porcentaje de secuencia conocido de los genes codificantes de lipasas obtenidos

Cepa

% de Identidad

Gen codificante de

Microorganismo Valor E

% de Secuencia Completaa

A19 94% Alpha/Beta Hydrolase

Domain-Containing Protein

Shewanella frigidimarina NCIMB 400

4e-89 22%

B2 94% Alpha/Beta Hydrolase

Domain-Containing Protein

Shewanella frigidimarina NCIMB 400

9e-96 22%

B9 94% Alpha/Beta Hydrolase

Domain-Containing Protein

Shewanella frigidimarina NCIMB 400

1e-93 22%

E5 94% Alpha/Beta Hydrolase

Domain-Containing Protein

Shewanella frigidimarina NCIMB 400

8e-91 89%

E13 95% Alpha/Beta Hydrolase

Domain-Containing Protein

Shewanella frigidimarina NCIMB 400

0.0 100%

a Para el cálculo del porcentaje secuenciado, se consideró como 100% el largo de la secuencia de la proteína con la cual se obtuvo el mejor alineamiento en BLASTn, para cada uno de los casos

49

Como se observa en la tabla 7, debido a que no se logró amplificar secuencias de genes

codificantes de lipasas a partir de las cepas A19, B2 y B9, el porcentaje de secuencia conocida

se mantuvo, siendo solo del 22%. Para las cepas E5 y E13 en cambio, se pudo conocer más de

su secuencia utilizando la técnica de Genome Walking, ya que efectivamente se amplificaron

secuencias de genes codificantes de lipasa. Se observa que de la cepa E5 se logró completar el

89% de la secuencia y que se obtuvo la secuencia completa del gen codificante de lipasa de la

cepa E13 (Anexo VII.3.1).

Para obtener el gen completo de la cepa E13 se reconstruyó una secuencia de ADN

correspondiente a 1.588 pb que contenía un ORF de 1.119 pb codificante de 373 aa de una

proteína lipasa. En la figura 10 se muestra la secuencia aminoacídica traducida a partir de este

gen, en la que se puede observar los motivos altamente conservados: HGGG y GDSAG,

descritos para las lipasas bacterianas activas a bajas temperaturas pertenecientes a la familia IV

según la clasificación de Arpigny y Jaeger, 1999.

Figura 10. Secuencia aminoacídica de la lipasa de la cepa E13 obtenida por Genome

Walking, los recuadros verdes corresponden a los sitios conservados de las lipasas bacterianas de la Familia IV activas a bajas temperaturas.

La secuencia aminoacídica mostrada en la figura 10, se analizó mediante el algoritmo

BLASTp (Altschul y col., 1997), los resultados obtenidos se resumen en la tabla 8:

Tabla 8. Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica codificada por el gen de lipasa % de Secuencia

Cubierta % de

Identidad

Proteína

Microorganismo

Valor E 100% 95% Alpha/beta hydrolase

domain-containing protein Shewanella frigidimarina

NCIMB 400 0.0

73% 42% Probable

lipase/esterase LipN Marine gamma

proteobacterium HTCC2207 7e-59

67% 41% Lipolytic enzyme Uncultured bacterium 3e-49

50

En la tabla 8, se muestran los tres primeros resultados entregados por el programa

BLASTp (Altschul y col., 1997). Todos los valores E son bajos, indicando una muy baja

probabilidad de alineamientos al azar. Mediante este análisis se corroboró que la secuencia

obtenida codifica para una proteína lipasa y que tiene una muy alta identidad, 95%, con la

proteína lipasa de Shewanella frigidimarina NCIMB 400. Mientras que la segunda y tercera

secuencia más parecidas, la lipasa esterasa LipN de la cepa Marine gamma proteobacterium

HTCC2207 y una enzima lipolítica de una bacteria no cultivada , poseen solo un 42% y 41% de

identidad respectivamente con la secuencia codificada por el gen de la cepa E13.

La búsqueda de dominios conservados con la herramienta CDD (Marchler-Bauer A y

col. 2009), reveló que la secuencia aminoacídica corresponde efectivamente a una proteína

perteneciente a la familia de las enzimas lipasa/esterasas ya que de los 7 dominios conservados

que presenta esta secuencia aminoacídica, seis están involucrados en la función lipolítica

asociada a estas enzimas y el plegamiento característico de ellas.

En la figura 11 se puede observar un esquema de la secuencia aminoacídica y los

dominios conservados que esta presenta.

Descripción Dominio Conservado E value PRK10162 Acetil esterasa 2.48e-22 Esterase_lipase Superfamilia de esterasas y lipasas 5.76e-04 Abhydrolase_3 Dominio catalítico plegamiento α/β hidrolasa 1.73e-59 Aes Esterasa/lipasa (Metabolismo de lípidos) 8.57e-48 PnbA Carboxilesterasa tipo B (Metabolismo de lípidos) 6.14e-06 COesterase Carboxilesterasa 3.99e-04 DAP2 Dipeptidilaminopeptidasas/acilaminoacilpeptidasas

(Transporte de aminoácidos y metabolismo) 9.83e-04

Figura 11. Resultado de la búsqueda de dominios conservados para la secuencia obtenida de la cepa E13 utilizando la herramienta CDD. La barra gris superior numerada representa la secuencia aminoacídica obtenida de la cepa E13 y en la tabla se especifican los dominios conservados

51

III.6 Amplificación del gen codificante de lipasa de la cepa E13 y clonamiento en los

vectores de expresión

Se decidió probar simultáneamente dos sistemas de expresión distintos, para aumentar

las posibilidades de obtener una lipasa recombinante funcional. Los vectores de expresión

elegidos fueron: el vector pET22(b+) que se caracteriza por producir una proteína recombinante

unida por su extremo carboxilo terminal a un hexapéptido de histidina, que facilita su

purificación por cromatografía de afinidad a níquel, además de tener una secuencia señal N-

terminal pelB para una potencial localización periplasmática de la proteína; y el vector pMAL-

c2E, que se caracteriza por producir una proteína recombinante fusionada en su extremo amino

terminal a la proteína de unión a maltosa MBP que permite la estabilización de la proteína y su

posterior purificación mediante cromatografía de afinidad a amilosa, además este vector tiene

una deleción en la secuencia señal malE, que conlleva la expresión citoplasmática de la proteína

de fusión.

Para amplificar y posteriormente clonar el gen, se diseñaron partidores utilizando la

secuencia de los extremos del gen aislado de la cepa E13 que incluían los sitios de restricción

necesarios para ser clonados en cada vector de expresión: LipE13pET22F, LipE13pET22R,

LipE13pMALF, LipE13pMALR. En la figura 12 se puede apreciar los productos de PCR.

pb

1.018

M E13pET22 E13pMAL

Figura 12. Análisis electroforético del producto de amplificación del gen codificante de

lipasa de la cepa E13 obtenido mediante Genome Walking. M= Marcador de 1 kpb.

En la figura 12 se puede observar que las bandas obtenidas corresponden al tamaño

esperado de alrededor de 1.000 pb (tamaño del gen 1.119 pb), éstas se cortaron, purificaron,

digirieron y ligaron a sus respectivos vectores, los que posteriormente se mandaron a

secuenciar. El resultado obtenido se analizó utilizando el algoritmo BLASTn, el que indicó que

52

se clonó exitosamente parte del gen de cysteine/glutathione ABC transporter membrane/ATP-

binding component, de Shewanella frigidimarina. Razon por la cual fue necesario buscar otra

estrategia para obtener el gen y la proteína lipasa.

III.7 Obtención de de genes codificantes para lipasas mediante el uso de partidores

diseñados desde la secuencia del gen de Shewanella frigidimarina.

Debido a la alta identidad que presentaban las secuencias parciales conocidas de los genes

codificantes de lipasas de las 5 cepas con el gen de la bacteria Shewanella frigidimarina (Tabla

7), se diseñaron partidores basados en los extremos de su secuencia: LipShewF y LipShewR.

Cabe destacar que estos partidores diferían de los diseñados para la cepa E13 en solo 3 bases.

En la figura 13, se puede observar los productos de PCR obtenidos.

pb 1.018

M A19 B2 B9 E5

Figura 13. Análisis electroforético de la amplificación de los genes codificantes de lipasas utilizando partidores basados en la secuencia de Shewanella frigidimarina. M= Marcador de 1 kpb.

Las bandas obtenidas se cortaron, purificaron, digirieron, se clonaron en el vector pGEM-

T Easy y se mandaron a secuenciar y esta vez, al analizar mediante el algoritmo BLASTn, se

consiguió la obtención de secuencias correspondientes a los genes codificantes de lipasas.

De esta forma se logró obtener 3 nuevas secuencias completas de genes codificantes de

lipasa (Anexo VII.3.2) cuya incerteza esta dada por los 25 pb de cada extremo correspondientes

a los partidores, que pueden ser distintos o no, a la secuencia del gen codificante de lipasa de la

bacteria Shewanella frigidimarina. Desde la cepa B2 no se logró obtener secuencias

correspondientes al gen codificante de lipasa mediante ninguna de las metodologías empleadas,

por lo que se presume que su secuencia difiere de las otras y por esta razón esta cepa fue

descartada.

53

III.8 Análisis de las secuencias aminoacídicas codificadas por los genes obtenidos mediante

el uso de partidores diseñados desde la secuencia del gen de la bacteria Shewanella

frigidimarina

Utilizando la estrategia basada en el uso de partidores diseñados desde la secuencia del

gen codificante de lipasa de la bacteria Shewanella frigidimarina, se logró obtener otras 3

secuencias completas de genes codificantes de lipasas a partir de las cepas A19, B9 y E5. Cada

uno con un ORF de 1.119 pb que codifica para una proteína lipasa de 373 aminoácidos, al igual

que la del gen de la cepa E13 obtenido mediante Genome Walking. Estas 3 secuencias se

analizaron mediante BLASTp y se realizó la búsqueda de dominios conservados utilizando la

herramienta CDD. Los resultados de estos análisis se observan en las figuras 14, 15 y 16

respectivamente:

A.

B.

Descripción Dominio Conservado E value PRK10162 Acetil esterasa 6.90e-23 Esterase_lipase Superfamilia de esterasas y lipasas 1.11e-04 Abhydrolase_3 Dominio catalítico plegamiento α/β hidrolasa 5.29e-61 Aes Esterasa/lipasa (Metabolismo de lípidos) 2.27e-48 PnbA Carboxilesterasa tipo B (Metabolismo de lípidos) 2.95e-05 COesterase Carboxilesterasa 4.01e-04 DAP2 Dipeptidilaminopeptidasas/acilaminoacilpeptidasas

(Transporte de aminoácidos y metabolismo) 6.77e-04

% de Secuencia Cubierta

% de Identidad

Proteína

Microorganismo

Valor E

100% 95% Alpha/beta hydrolase

domain-containing protein Shewanella frigidimarina

NCIMB 400 0.0

84% 38% Probable

lipase/esterase LipN Marine gamma

proteobacterium HTCC2207 4e-60

67% 41% Lipolytic enzyme Uncultured bacterium 3e-50

Figura 14. A.- Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica del gen codificante de lipasa de la cepa A19. B.- Resultado de la búsqueda de dominios conservados para la secuencia obtenida A19 utilizando la herramienta CDD. La barra gris superior numerada representa la secuencia aminoacídicas obtenida de la cepa A19 y en la tabla se especifican los dominios conservados.

54

A.

B.

Descripción Dominio Conservado E value

PRK10162 Acetil esterasa 5.25e-23

Esterase_lipase Superfamilia de esterasas y lipasas 1.04e-04

Abhydrolase_3 Dominio catalítico plegamiento α/β hidrolasa 5.58e-61 Aes Esterasa/lipasa (Metabolismo de lípidos) 2.56e-48

PnbA Carboxilesterasa tipo B (Metabolismo de lípidos) 2.65e-05 COesterase Carboxilesterasa 4.24e-04

DAP2 Dipeptidilaminopeptidasas/acilaminoacilpeptidasas (Transporte de aminoácidos y metabolismo)

1.89e-03

% de Secuencia Cubierta

% de Identidad

Proteína

Microorganismo

Valor E

100% 95% Alpha/beta hydrolase

domain-containing protein Shewanella frigidimarina

NCIMB 400 0.0

84% 38% Probable

lipase/esterase LipN Marine gamma

proteobacterium HTCC2207 4e-60

67% 41% Lipolytic enzyme Uncultured bacterium 2e-50

Figura 15. A.- Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica del gen codificante de lipasa de la cepa B9. B.- Resultado de la búsqueda de dominios conservados para la secuencia obtenida B9 utilizando la herramienta CDD. La barra gris superior numerada representa la secuencia aminoacídica obtenida de la cepa B9 y en la tabla se especifican los dominios conservados.

55

A.

B.

Descripción Dominio Conservado E value PRK10162 Acetil esterasa 6.45e-23 Esterase_lipase Superfamilia de esterasas y lipasas 1.00e-04 Abhydrolase_3 Dominio catalítico plegamiento α/β hidrolasa 1.16e-60 Aes Esterasa/lipasa (Metabolismo de lípidos) 2.64e-48 PnbA Carboxilesterasa tipo B (Metabolismo de lípidos) 2.78e-05 COesterase Carboxilesterasa 4.16e-04 DAP2 Dipeptidilaminopeptidasas/acilaminoacilpeptidasas

(Transporte de aminoácidos y metabolismo) 6.75e-04

% de Secuencia Cubierta

% de Identidad

Proteína

Microorganismo

Valor E

100% 95% Alpha/beta hydrolase

domain-containing protein Shewanella frigidimarina

NCIMB 400 0.0

84% 38% Probable

lipase/esterase LipN Marine gamma

proteobacterium HTCC2207 3e-60

67% 41% Lipolytic enzyme Uncultured bacterium 3e-50

Figura 16. A.- Resultado del análisis BLASTp a la secuencia aminoacídica del gen codificante de lipasa de la cepa E5. B.- Resultado de la búsqueda de dominios conservados para la secuencia obtenida E5 utilizando la herramienta CDD. La barra gris superior numerada representa la secuencia aminoacídica obtenida de la cepa E5 y en la tabla se especifican los dominios conservados.

En estas tres figuras se puede observar que los resultados obtenidos son prácticamente

idénticos entre las 3 secuencias obtenidas de las cepas A19, B9 y E5, cambiando sólo sus

valores E. A su vez, estos son muy parecidos a los resultados obtenidos del análisis de la cepa

E13 (Figura 11, Tabla 8. Con estos resultados se corrobora que las secuencias efectivamente

corresponden a lipasas.

III.9 Análisis de las secuencias de lipasas obtenidas

Para analizar las diferencias y similitudes entre las secuencias, se realizó un

alineamiento múltiple mediante ClustalW de las secuencias aminoacídicas traducidas desde los

genes codificantes de lipasas obtenidos de las cepas A19, B9, E5, junto a la secuencia

56

aminoacídica traducida desde el gen codificante de lipasa de la E13 obtenido mediante Genome

Walking, más la secuencia de la proteína lipasa codificada en el genoma de la bacteria

Shewanella frigidimarina. El resultado de este alineamiento se muestra a continuación en la

figura 17.

Figura 17. Alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídicas codificadas por los genes de las cepas Shewanella frigidimarina, A19, B9, E5 y E13. En los recuadros negros se enmarcan los motivos altamente conservados para las lipasas bacterianas activas a bajas temperaturas HGGG Y GDSAG.

En la figura 17 se puede observar que existen mínimas diferencias entre las secuencias

aminoacídicas de estas 5 proteínas a pesar de provenir de especies diferentes (Figura 7). En base

a este resultado, se puede afirmar que todas las secuencias pertenecen a la familia IV de las

lipasas bacterianas, ya que poseen los dos dominios conservados descritos para las lipasas

activas a bajas temperaturas HGGG Y GDSAG.

Con el fin de visualizar la distancia evolutiva de las 4 secuencias de lipasas obtenidas

con respecto a las lipasas descritas en la literatura, se realizó un análisis filogenético de la

57

proteína. Se construyó un árbol filogenético con las secuencias aminoacídicas codificadas por

los 4 genes obtenidos de las cepas bacterianas marinas antárticas, más otras 16 secuencias de

lipasas activas a bajas temperaturas resultado de un análisis BLAST Psi de la secuencia de

lipasa obtenida a partir de la cepa E13. Éste se observa a continuación en la figura 18.

Figura 18. Árbol filogenético de las proteínas lipasas. Se construyó un árbol filogenético

basado en las secuencias de lipasas obtenidas y las más parecidas según el análisis de BLASTp. Las lipasas de las cepas bacterianas antárticas se destacan en color rojo. La escala 0,1 indica el número de sustituciones aminoacídicas por sitio.

Al observar el árbol filogenético construído con las secuencias de las proteínas lipasas,

se puede observar que las 4 secuencias obtenidas de genes codificantes de lipasas junto con la

lipasa de Shewanella frigidimarina están muy relacionadas filogenéticamente a pesar de

provenir de especies distintas, lo que concuerda con la alta identidad entre las secuencias

obtenidas. Se puede notar que la cercanía filogenética de la lipasa de la bacteria Shewanella

frigidimarina es mayor con respecto a la cepa E13 que con las secuencias obtenidas de las

cepas A19, B9 y E5. Asimismo, se puede observar que las 4 secuencias obtenidas, así como la

secuencia de la proteína lipasa de Shewanella frigidimarina, son distantes filogenéticamente a

todas las demás secuencias de lipasas descritas pertenecientes a la familia IV de lipasas

bacterianas activas a bajas temperaturas.

58

III.10 Selección del gen codificante de lipasa de la cepa E5 y clonamiento en los vectores de

expresión

Debido al trabajo requerido para la expresión de la proteína recombinante se prosiguió

sólo con el gen codificante de lipasa obtenido de la cepa E5, dado que este además, fue

secuenciado en un 89% utilizando la técnica de Genome Walking. El gen de 1.119 pb se clonó

exitosamente en los dos vectores de expresión pET22(b+) y pMAL-c2E.

Los plasmidios denominados LipE5pET22 (6.612 pb) y LipE5pMAL (7.768 pb),

correspondientes a los vectores respectivos con el inserto del gen codificante de lipasa, se

aislaron y mandaron a secuenciar, con lo que se corroboró que la secuencia aminoacídica de la

proteína lipasa codificada por el gen de la cepa E5, se encontraba en el correcto marco de

lectura y que no se incluían codones de término en el interior de la secuencia.

El huésped heterólogo utilizado fue la bacteria Escherichia coli, para ambos sistemas de

expresión pET22(b+) y pMAL-c2E se utilizó la cepa BL21(DE3). Se transformaron las células

electrocompetentes con los plasmidios LipE5pET22 y LipE5pMAL, como control se

transformaron las mismas bacterias con cada vector sin inserto. A continuación, en la figura 19

se puede observar el resultado de las digestiones del ADN plasmidial de las cepas

transformadas: control pET22 (sin inserto), LipE5pET22, control pMAL (sin inserto) y

LipE5pMAL.

pb 7.126 5.090

1.636 1.018

M 1 2 3 4

1. Digestión del ADN plasmidial de las cepas BL21(DE3) control, transformadas con el vector pET22(b+) sin inserto.

2. Digestión del ADN plasmidial de las cepas BL21(DE3), transformadas con el vector pET22(b+) con el inserto LipE5 (gen codificante de lipasa).

3. Digestión del ADN plasmidial de las cepas BL21(DE3) control, transformadas con el vector pMAL-c2E sin inserto.

4. Digestión del ADN plasmidial de las cepas BL21(DE3) control, transformadas con el vector pMAL-c2E con el inserto LipE5 (gen codificante de lipasa).

Figura 19. Análisis electroforético de la digestión de los vectores de expresión con el fin de corroborar la presencia del inserto en los vectores de expresión, y su ausencia en las bacterias control. Se cargó el total de las digestiones en un gel de agarosa 1% p/v.

59

En la figura 19, se observa la correcta digestión de los vectores de expresión con sus

respectivas enzimas de restricción, en los carriles 1 y 2 la banda de mayor tamaño corresponde a

los 5.493 pb vector pET22(b+) mientras en los carriles 3 y 4 se puede observar la banda de

6.646 pb correspondiente al vector pMAL-c2E. En los carriles 2 y 4 se logra distinguir una

banda del tamaño correcto alrededor de 1.000 pb correspondiente al inserto.

III.11 Expresión de la lipasa recombinante

Al utilizar el sistema de expresión del vector pET22(b+) se espera obtener una proteína

recombinante de un tamaño aproximado de 42,5 kDa expresada en el periplasma, mientras que

con el sistema de expresión del vector pMAL-c2E se espera producir una proteína recombinante

de un tamaño de 84 kDa expresada en el citoplasma.

Se determinaron las curvas de crecimiento a 25ºC de las bacterias transformadas con

ambos vectores de expresión con el fin de conocer el tiempo aproximado que tardaban en

alcanzar una determinada densidad óptica para la posterior inducción. También se confeccionó

una curva de calibración de biomasa (Anexo VI.1.1) para conocer el peso seco de las células en

mg/mL a partir del valor de la absorbancia a 600 nm obtenido.

Para aumentar las probabilidades de obtener la correcta expresión de la proteína

recombinante, se diseñó una matriz de experimentos, en la que cambiando una condición a la

vez (densidad óptica de las células antes de inducir, concentración del inductor o tiempo de

inducción) se pudiese ir optimizando la producción de la lipasa, manteniendo constantes las

temperaturas de crecimiento e inducción, la agitación, el volumen de los cultivos y un

preinóculo para alcanzar una DO600= 0,05. Este diseño experimental se resume en la tabla 9 y se

utilizó para ambos sistemas de expresión: pET22(b+) y pMAL-c2E.

Tabla 9. Diseño experimental de pruebas de inducción para optimizar la producción de la lipasa. Nº EXP

CONSTANTES VARIABLES Vol.

cultivo DO600 inicial

Tº Crecimiento

Agitación

Tº Inducción

DO600 Inducción

Concentración IPTG

Tiempo Inducción

# 1 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 0,6 0,1 mM 16 h # 2 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1,3 0,1 mM 16 h # 3 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 0,3 mM 3 h # 4 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 0,3 mM 16 h # 5 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 0,5 mM 3 h # 6 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 0,5 mM 16 h # 7 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 0,7 mM 3 h # 8 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 0,7 mM 16 h # 9 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 1 mM 3 h # 10 250 ml 0,05 25ºC 200 rpm 15ºC 1 1 mM 16 h

60

Lamentablemente, en ninguna de estas 10 condiciones ensayadas para cada sistema de

expresión se pudo obtener la proteína lipasa recombinante, no observándose diferencias al

analizar los patrones electroforéticos de los geles SDS-PAGE entre las fracciones celulares

(extracelular, periplasma, citoplasma, cuerpos de inclusión) obtenidas de las bacterias control y

las transformadas con los plasmidios LipE5pET22 y LipE5pMAL. Estos resultados motivaron

la búsqueda de una explicación a lo que estaba ocurriendo.

III.12 Ensayo de toxicidad del gen codificante de lipasa de la cepa E5

Debido a la imposibilidad de obtener la expresión de la proteína recombinante, se

decidió analizar la probabilidad de que la lipasa psicrófila fuese tóxica para las células

hospederas, limitando su sobrevida. De esta manera sólo quellas que perdían el vector o la

capacidad de expresar la proteína, estaban creciendo, por sta razón no se observaron diferencias

al analizar los patrones electroforéticos de las distintas fracciones celulares.

Para corroborar esta hipótesis, se realizó un ensayo de toxicidad (en duplicado) basado

en el ensayo de inestabilidad de plasmidio (Novagen, 2006). Se prepararon 2 cultivos como se

describe en el punto II.2.22, se calculó la cantidad de cultivo para obtener una dilución

aproximada de 1 x 10-7 células en placas. Con esta cantidad de células se procedió a sembrar

placas con medio LB agar suplementadas con distintas concentraciones del inductor IPTG (entre

0,01 mM y 1 mM) con o sin el antibiótico carbenicilina en una concentración de 200 µg/mL. En

la figura 20 se observa el efecto de la concentración del inductor sobre las células transformadas

con el vector pET22(b+) y en la figura 21 se observa el efecto del inductor sobre las células

transformadas con el vector pMAL-c2E.

Número de células x 10

-7

Concentración de IPTG [mM]

Figura 20. Gráfico efecto del inductor en células E. coli BL21/(DE3) transformadas con vector pET22. Número de células v/s Concentración de inductor.

61

Número de células x 10

-7

Concentración de IPTG [mM]

Figura 21. Efecto del Inductor en células E. coli BL21/(DE3) transformadas con vector pMAL-c2E. Número de células v/s Concentración de inductor.

Tanto en la figura 20 como en la 21, se observa claramente que a concentraciones

crecientes del inductor hay una disminución de la cantidad de células transformadas con los

plasmidios LipE5pET22 y LipE5pMAL. En las placas sin antibiótico esta disminución no es tan

drástica pero da cuenta de que las células que fueron capaces de crecer en ellas probablemente

no poseen el vector pues si se comparan con las placas que contienen carbenicilina 200 µg/mL

la diferencia es muy notoria. Con lo que se presume que la expresión del gen codificante de la

proteína lipasa resulta ser tóxica para la célula hospedera, lo que se comprueba al observar el

comportamiento de las células control que poseen el vector pero sin el inserto, en donde las

concentraciones del inductor no tienen efecto en la viabilidad bacteriana en presencia o ausencia

de antibiótico.

Al observar los gráficos se puede notar que el número de células transformadas con los

plasmidios LipE5pET22 y LipE5pMAL empiezan a disminuir a concentraciones superiores a

0,01 mM de IPTG, aunque lo hacen de forma distinta, puesto que en el sistema de expresión

pET22(b+) esto ocurre drásticamente entre las concentraciones 0,1 y 0,5 mM, mientras que para

el sistema de expresión pMAL-c2E, ocurre de una forma más gradual entre las concentraciones

0,05 y 0,1 mM.

Estos mismos resultados se pueden visualizar mejor en las figuras 22 y 23, ya que en

ellas se observa de una forma más clara, que a concentraciones crecientes del inductor y al

aumentar la expresión de la lipasa recombinante tóxica, disminuyen la viabilidad de las células

capaces de expresarla.

62

Concentración IPTG

Control pET22

Control pET22 + Carbenicilina

LipE5pET22 LipE5pET22 + Carbenicilina

0 mM

0,01 mM

0,05 mM

0,1 mM

0,5 mM

1 mM

Figura 22. Efecto del Inductor en células E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector

pET22(b+).

63

Concentración IPTG

Control pMAL

Control pMAL + Carbenicilina

LipE5pMAL LipE5pMAL + Carbenicilina

0 mM

0,01 mM

0,05 mM

0,1 mM

0,5 mM

1 mM

Figura 23. Efecto del Inductor en células E. coli BL21(DE3) transformadas con el vector

pMAL-c2E.

64

A partir de las figuras 22 y 23, es posible obervar que en las placas con concentraciones

mayores a 0,1 mM de IPTG disminuyó drásticamente la cantidad de bacterias que contienen el

vector con el inserto (lo que se demuestra porque son capaces de crecer en el medio con la

presión selectiva del antibiótico). Mientras que en las placas con las bacterias control no se

observaron diferencias en el número de colonias, lo que demuestra que las concentraciones

crecientes del inductor tienen un efecto negativo solo en las células que son capaces de expresar

la lipasa recombinante, pues esta es muy activa o tóxica.

Con el fin de determinar la concentración óptima de IPTG sin afectar la viabilidad de

las células y a su vez, lograr la expresión y producción de la proteína recombinante, se realizó el

mismo ensayo de toxicidad pero esta vez en un rango menor de concentraciones del inductor,

entre 0,01 mM y 0,1 mM. Nuevamente se contaron las células y el resultado se muestra en la

figura 24.

Número de células x 10

-7

Concentración de IPTG [mM] Figura 24. Gráfico efecto de las concentraciones entre 0,01 mM y 0,1 mM del inductor en

las células que expresan la lipasa recombinantes. Numero de células v/s Concentración de inductor.

En la figura 24, se observa que ambos vectores son estables en el rango de

concentración entre 0,01 mM y 0,03 mM del inductor IPTG. Con esto se demuestra la alta

toxicidad del gen codificante de lipasa y es la razón por la cual no había sido posible obtener la

proteína recombinante en ninguna de las pruebas de inducción efectuadas (Tabla 9). Esto debido

a que en las condiciones anteriores se trabajó con concentraciones de IPTG dentro del rango

entre 0,1 mM y 1 mM (que correspondían 10 y 100 veces más respectivamente de la

concentración a la que no se ve afectada la viabilidad de las células huésped), resultando en que

al inducir la expresión de la lipasa, también se afectaba la viabilidad de las células que la

65

producían y por ende se trabajó con las bacterias que habían perdido el vector o la capacidad de

expresar la lipasa recombinante.

III.13 Inducción de la síntesis de la lipasa recombinante con 0,01 mM de IPTG

Se crecieron las células transformadas con los distintos vectores de expresión a 25ºC, y

se indujo la expresión con 0,01 mM de IPTG cuando las células alcanzaron DO600 = 1. La

inducción se mantuvo por 16 h. Luego se procesaron las células para obtener las distintas

fracciones celulares. Se cargó la misma concentración de proteínas totales para cada fracción en

geles SDS-PAGE. A continuación en la figura 25 se observa el análisis electroforético de las

fracciones celulares de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+).

kDa 117 85 50

34 25

19

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1. Células control inducidas 2. Células inducidas LipE5 3. Sobrenadante control 4. Sobrenadante LipE5 5. Periplasma control 6. Periplasma LipE5 7. Citoplasma control 8. Citoplasma LipE5 9. Cuerpos de inclusión control 10. Cuerpos de inclusión LipE5

Figura 25. Análisis electroforético de las distintas fracciones celulares de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+) en un gel SDS PAGE 15%. M= Marcador preteñido de peso molecular de proteínas.

En la figura 22 se puede observar que en la fracción correspondiente al periplasma de

las células transformadas con el vector, se pueden distinguir 2 bandas de mayor expresión con

respecto al control. Aunque las mismas bandas están presentes tanto en el periplasma del control

sin inserto, como en el de las bacterias transformadas con LipE5pET22, debido a que se cargó la

misma concentracion de proteínas totales en ambos carriles, se puede deducir que la lipasa

recombinante coincide en el tamaño con alguna de las proteínas endógenas de Escherichia coli

BL21(DE3).

De estas bandas, la nº 1 corresponde al tamaño esperado de aproximadamente 42 kDa,

mientras que la nº2 podría corresponder a un fragmento de degradación de la misma lipasa

1

2

66

recombinante que ha sido digerida por acción de proteasas o alguna otra proteína que ha sido

inducida en el sistema.

Para el sistema de expresión pMAL-c2E, no se observaron diferencias en el patrón de

bandas entre el control y LipE5pMAL con ninguna de las fracciones analizadas, con lo que se

puede deducir que la producción por parte de este sistema es ineficiente y esto conlleva a una

baja concentración de la proteína recombinante que no alcanza a ser visualizada en los geles

SDS-PAGE.

III.14 Ensayo con inhibidor de proteasas PMSF

Debido a que en la figura 25 se observaron 2 bandas con mayor expresión respecto al

control en la fracción correspondiente al periplasma de las bacterias transformadas con el

plasmidio LipE5pET22, y sólo una de ellas correspondía al tamaño esperado, y a su vez no se

observó la sobreexpresión de alguna proteína en las fracciones celulares de las bacterias

transformadas con el plasmidio LipE5pMAL, se optó por realizar un ensayo en presencia del

inhibidor de proteasas PMSF como se indica en el punto II.2.21. De este modo, descartar que la

lipasa recombinante estuviese siendo degradada por proteasas durante el proceso de obtener las

distintas fracciones celulares. Las fracciones preparadas en presencia de PMSF se analizaron en

geles SDS-PAGE y en ambos casos se distinguió el mismo patrón electroforético observado

anteriormente para los dos sistemas de expresión. No se observaron diferencias entre las

fracciones tratadas con el inhibidor de proteasas y las preparadas en ausencia de PMSF, por lo

que se prescindió de usarlo, pues al ser un inhibidor de las serinproteasas, también inactiva

irreversiblemente la actividad de las lipasas, ya que éstas poseen como residuo nucleófilo una

serina.

III.15 Ensayo de actividad lipolítica en medio sólido de las fracciones celulares de las

bacterias transformadas con el vector pET22(b+) y pMAL-c2E

Se realizó un ensayo cualitativo de actividad lipolítica en placas de agar Spirit Blue en

donde la presencia de la actividad lipasa se detectó por el cambio de color del indicador de pH

en el agar si el lípido tributirina es hidrolizado. Las placas se incubaron una noche a 15ºC y se

analizaron las distintas fracciones celulares, a las que, además, se les midió la actividad de la

enzima β-galactosidasa como un marcador de citoplasma. Esta es una forma de determinar si las

67

fracciones celulares fueron correctamente extraídas y no presentaban contaminación. El ensayo

de la β-galactosidasa también, es cualitativo donde la actividad se visualiza por la coloración

amarilla del ρ-nitrofenol liberado cuando el sustrato orto-nitrofenilgalactopiranosido es

hidrolizado por acción de la enzima β-galactosidasa.

A continuación en la figura 26 se observa el ensayo de actividad lipasa realizado en las

fracciones celulares de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+) y como control de

la extracción de las fracciones el ensayo de la enzima β-galactosidasa.

Fracciones: Extracelular pET22 Periplasma pET22 Citoplasma pET22

Ensayo actividad Lipasa

Ensayo β-galactosidasa

Figura 26. Ensayo de actividad lipolítica y actividad de la enzima β-galactosidasa de las

distintas fracciones celulares de bacterias E. coli BL21 transformadas con el vector pET22(b+). La expresión recombinante fue inducida con 0,01mM de IPTG. Placas de agar Spirit Blue con reactivo lipasa.

En la figura 26 se puede observar que en las placas correspondientes a las fracciones

extracelular y citoplasmática, se observan halos de lipólisis tanto en las fracciones del control

como en las del vector de expresión LipE5pET22. Este resultado da cuenta de la presencia de

una lipasa endógena expresada por las células Escherichia coli BL21(DE3) transformadas con

el vector pET22, cultivadas en el medio Terrific Broth. Esta lipasa endógena no está presente en

el periplasma que es en donde debe expresarse la proteína recombinante, y en la placa

correspondiente se observa un halo de lipólisis solo en la fracción periplasmática de las

bacterias transformadas con LipE5pET22. Con esto se podría concluir que se trata de la proteína

recombinante, antes visualizada en las bandas de sobreexpresión en los geles SDS-PAGE

(Figura 25) ya que el vector pET22(+) tiene una secuencia pelB de exportación al periplasma.

El ensayo de actividad de la enzima β-galactosidasa da cuenta que las fracciones

celulares se obtuvieron correctamente, puesto que esta enzima es un marcador de citoplasma, y

no se observa actividad en las otras fracciones obtenidas.

C LipE5 C LipE5 C LipE5

C LipE5 C LipE5 C LipE5

68

Este mismo ensayo se realizó para las fracciones celulares de las bacterias

transformadas con el vector pMAL-c2E y se pudo observar en la fracción extracelular la

presencia de una lipasa endógena secretada por Escherichia coli, pero no se visualizó actividad

lipasa en el citoplasma, que es la fracción en donde se esperaba la expresión de la proteína

recombinante. Con estos resultados se puede deducir que si la lipasa recombinante es producida

por este sistema de expresión, lo hace de forma inactiva.

III.16 Purificación de la Lipasa Recombinante

III.16.1 Desde la fracción periplasmática E.coli BL21(DE3)/pET22(b+)

Debido a que la proteína recombinante se produce unida a una cola de polihistidina en

su extremo carboxilo terminal, su purificación se ve facilitada por una cromatografía de afinidad

por metales IMAC, utilizando una resina de agarosa níquel-NTA. Se purificó la fracción

correspondiente a 25 mL de periplasma obtenido a partir de un cultivo de 250 mL de bacterias

E. coli transformadas con el vector pET22(b+) como se indica en el punto II.2.27.1. Se

colectaron 10 fracciones de 100 uL cada una, a las que se les midió la concentración de

proteínas totales y se cargó en un gel SDS-PAGE el mismo volumen de las fracciones que

presentaban mayor concentración. Se realizó una tinción con nitrato de plata debido a que las

fracciones eluídas presentaban muy baja concentración de proteínas (Figura 27).

kDa 117 85 50 34 25

1 2 3 4 M 5 6 7 8 9

1. Fracción 3 Control 2. Fracción 4 Control 3. Fracción 5 Control 4. Fracción 6 Control 5. Fracción 3 LipE5 6. Fracción 4 LipE5 7. Fracción 5 LipE5 8. Fracción 6 LipE5 9. Fracción 7 LipE5

Figura 27. Análisis electroforético de las distintas fracciones colectadas en la purificación con resina de níquel del periplasma de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+) en un gel SDS PAGE 10%. M= Marcador preteñido de peso molecular de proteínas.

En la figura 27 se observa una banda del tamaño esperado que no está presente en las

fracciones control, la que podría corresponder a la lipasa recombinante, obteniéndose una mayor

concentración en la fracción nº 6 correspondiente a un volumen de elución de 600 ml.

69

Si se compara este resultado con la banda de sobreexpresión del tamaño esperado

visualizada en el gel SDS-PAGE de la figura 22, se puede deducir que existe una proteína

endógena de Escherichia coli que coincide en tamaño con la lipasa recombinante obtenida, y

encubre la real concentración de la lipasa presente la fracción periplasmática, lo que da cuenta

que la inducción realizada con el inductor IPTG en la concentración de 0,01 mM conlleva una

produccion ineficiente de la proteína recombinante.

Con el fin de optimizar la producción de la proteína recombinante y aumentar la

concentración obtenida después de su purificación, se realizaron cultivos celulares con distintos

volúmenes de medio (100 mL, 500 mL y 1 L) bajo las mismas condiciones determinadas

anteriormente con el fin de evitar el problema de la toxicidad. Sin embargo, no se logró obtener

una mayor cantidad y en la figura 27 se visualiza un gel representativo de las demás

purificaciones realizadas, en donde siempre fue necesario teñir con nitrato de plata para

visualizar la lipasa recombinante purificada.

III.16.2 Desde la fracción citoplasmática de las células E.coli BL21(DE3)/pMAL-c2E

Debido a que la proteína recombinante se produce fusionada a la proteína de unión a

maltosa MBP, se facilita su purificación por cromatografía de afinidad, utilizando una resina de

amilosa. Como no se observó actividad lipasa utilizando este sistema de expresión, con el fin de

establecer si la proteína recombinante se expresaba en forma inactiva o esta no se estaba

produciendo, se purificó la fracción correspondiente al citoplasma de las bacterias E. coli

transformadas con el vector pMAL-c2E como se indica en el punto II.2.27.2. Las fracciones

eluídas se analizaron mediante geles SDS-PAGE (Figura 28).

kDa 117 85 50 34 25

1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1. Fracción 1 Control 2. Fracción 2 Control 3. Fracción 3 Control 4. Fracción 4 Control 5. Fracción 5 Control 6. Fracción 6 Control 7. Fracción 1 LipE5 8. Fracción 2 LipE5 9. Fracción 3 LipE5 10. Fracción 4 LipE5 CR 11. Fracción 1 LipE5 CR 12. Fracción 2 LipE5 CR 13. Fracción 3 LipE5 CR 14. Fracción 4 LipE5 CR

Figura 28. Análisis electroforético de las distintas fracciones colectadas en la purificación con resina de amilosa del citoplasma de las bacterias transformadas con el vector pMAL-c2E en un gel SDS-PAGE 10%. M= Marcador de peso molecular de proteínas. CR= Union a la resina bajo condición reductora, utilizando β-mercaptoetanol.

70

En la figura 28 se puede observar la afinidad a la resina de amilosa de una proteína

presente tanto en las fracciones control como en el citoplasma purificado de las células

transformadas con LipE5pMAL. A juzgar por su tamaño ésta corresponde a la proteína MBP no

fusionada a la lipasa, ya que tiene un peso aproximado a 42,5 kDa. Cuando la unión de la

proteína LipE5 a la resina se realizó bajo condiciones reductoras utilizando β-mercaptoetanol, se

observó una gran banda de sobreexpresión correspondiente a MBP y ninguna banda del tamaño

esperado. Con estos experimentos se concluyó que la lipasa recombinante no se está

produciendo mediante este sistema, por lo tanto, se continuó trabajando solo con la expresión de

la lipasa recombinante en el vector pET22(b+).

III.17 Ensayo de actividad en medio líquido a distintas temperaturas de la lipasa

recombinante expresada por el sistema pET22(b+)

Se realizó un ensayo de actividad en líquido utilizando el sustrato ρ-nitrofenilcaprato,

que en presencia de una lipasa se hidroliza y el ρ-nitrofenolato liberado presenta una coloración

amarilla. Este ensayo es cuantitativo y los cambios de absorbancia se siguieron

espectrofotométricamente a 405 nm.

Este ensayo se realizó con la proteína purificada mediante cromatografía de afinidad por

metales, sin embargo, no se encontró actividad debido a que la presencia de imidazol utilizado

para lavar y eluir la proteína desde la columna de níquel-NTA, interfería en las mediciones. Por

este motivo, se analizaron las diferentes fracciones celulares (extracelular, periplasma y

citoplasma) de las bacterias transformadas con el vector pET22(b+). Este ensayo se efectuó en

triplicado a distintas temperaturas desde 5ºC hasta 80ºC y los resultados se presentan en la

figura 29. Cabe destacar que a las unidades de absorbancia a 405 nm obtenidas del ensayo de las

fracciones celulares de las bacterias transformadas con el plasmidio LipE5pET22 se les restó las

unidades de absorbancia obtenidas del ensayo de las fracciones celulares de las bacterias

control.

71

∆∆ ∆∆ Abs. 405 nm

(LipE5pET22 – Control)

Temperatura ºC Figura 29. Ensayo de actividad en medio líquido de las distintas fracciones celulares de las

bacterias transformadas con el vector pET 22(b+) utilizando como sustrato ρ-nitrofenilcaprato. Diferencia entre las unidades de absorbancia a 405 nm obtenidas por las distintas fracciones celulares bacterias transformadas con el plasmidio LipE5pET22(b+) y las bacterias control v/s Temperatura.

Se comprobó que la lipasa de la cepa E5 se expresa en la fracción periplasmática de las

bacterias transformadas con el plasmidio LipE5pET22 y que la proteína recombinante obtenida

presenta actividad a las condiciones en las que se realizó este ensayo (solución de ensayo pH=8,

enzima sin purificar en su correspondiente fracción celular) entre los 10º y 30ºC. La mayor

actividad lipasa se observa entre los 18º y 25ºC con un máximo a la temperatura de 25ºC, como

se puede observar en la figura 29.

La diferencia de unidades de absorbancia a 405 nm obtenidas entre el periplasma de las

bacterias que expresan la proteína y las bacterias control se utilizó para calcular las unidades de

actividad lipasa, y se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de ρ-

nitrofenol desde el sustrato utilizado por minuto. Los valores negativos se asignaron como 0 y

los resultados obtenidos en este ensayo, junto con la actividad específica, se muestran a

continuación en la tabla 10.

Tabla 10. Unidades de actividad lipasa obtenidas del ensayo en medio líquido de la fracción periplasmática de las bacterias transformadas con LipE5pET22.

Temperatura Ensayo Medio Líquido Unidades Actividad Lipasa 18ºC 7,6 23ºC 40,3 25ºC 56,8

En la tabla 10, se puede observar que las unidades de actividad lipasa obtenidas son

bajas lo que se correlaciona con la poca concentración de proteína recombinante presente en la

fracción periplasmática.

72

III.18 Obtención de la proteína lipasa nativa de la cepa bacteriana antártica E5

Para comparar la proteína lipasa recombinante obtenida con la lipasa nativa proveniente

de la bacteria psicrófila fue necesario producirla ya que no existen antecedentes en la literatura.

Se realizaron dos distintos cultivos de 100 mL de medio marino 2216, uno de ellos fue

suplementado con 1% de aceite de oliva y ambos fueron inoculados con la cepa bacteriana

antártica E5 como se describe en el punto II.2.17.3. Estos cultivos se dejaron creciendo a 4ºC

con 200 rpm de agitación durante 7 días. Luego estas células se procesaron para obtener las

distintas fracciones celulares (extracelular, periplasma, citoplasma, fracción insoluble).

III.19 Ensayo de actividad lipolítica en medio sólido de las fracciones celulares de la cepa

bacteriana antártica E5

Se realizó el ensayo cualitativo de actividad lipolítica en placas de agar Spirit Blue. Las

placas se incubaron una noche a 15ºC y se analizaron las distintas fracciones celulares obtenidas

de las bacterias de la cepa E5 cultivadas en medio marino y en medio marino suplementado con

el 1% de aceite de oliva. Como control se utilizó la misma fracción calentada a ebullición

durante 5 min. El resultado del ensayo en medio sólido realizado se muestra a continuación en

la figura 30.

Medio Marino

Medio Marino + 1% Aceite de oliva

Sobrenadante Periplasma

C E5

C E5

Citoplasma Insoluble

Figura 30. Ensayo de actividad lipolítica de las distintas las distintas fracciones celulares

obtenidas de las bacterias marinas antárticas de la cepa E5 cultivadas en medio marino y en medio marino suplementado con el 1% de aceite de oliva. Placas de agar Spirit Blue con reactivo lipasa.

73

En la figura 30 se puede observar la expresión de una enzima lipasa nativa extracelular

en las bacterias marinas antárticas de la cepa E5 crecida en ambos medios de cultivo, siendo

mayor la expresión cuando el medio de cultivo marino es suplementado con 1% de aceite de

oliva, el cual se ha descrito como inductor de la expresión de lipasas (Akhtar y col., 1980).

Cabe destacar que a las fracciones obtenidas, también, se les midió la actividad de la

enzima β-galactosidasa como un marcador de citoplasma y determinar si las fracciones celulares

fueron correctamente extraídas y no presentaban contaminación. Éste último ensayo no fue

concluyente debido a que la bacteria Shewanella frigidimarina que tiene un 98% de identidad

con la cepa E5 a nivel de secuencia de ADNr16S, no posee la enzima β-galactosidasa (Bozal y

col., 2002).

III.20 Purificación de la proteína lipasa nativa

Debido a que se conoce la secuencia nucleotídica del gen codificante de lipasa de la

cepa E5 y por ende su secuencia aminoacídica, se utilizó el programa ProtParam para predecir

su peso molecular y se determinó un tamaño de 41,589 kDa. Con este antecedente, se realizó

una cromatografía de filtración en gel a temperatura ambiente, como primer paso de

purificación de la fracción extracelular concentrada de las bacterias crecidas en medio marino

2216 suplementado con 1% de aceite de oliva. En la figura 31 se puede observar el perfil de

elución.

Figura 31. Cromatograma de la purificación por filtración en gel del sobrenadante de la

cepa E5 cultivada en medio marino con aceite de oliva 1%. Milli unidades de absorbancia a 280 nm v/s volumen de elución (mL), en verde se destacan las fracciones obtenidas de 250 uL cada una.

En la figura 31 se puede observar 3 máximos en la elución de proteínas. Se midió

actividad lipasa mediante ensayo de actividad líquido realizado a 20°C a todas las fracciones

74

que presentaron aumento en las milli unidades de absorbancia a 280 nm visualizadas en el

cromatograma (fracciones desde la 14 hasta la 63).

III.20.1 Ensayo de actividad lipolítica en medio líquido de las fracciones obtenidas mediante la

purificación por cromatografía de filtración en gel de la lipasa nativa

Se midió la actividad en medio líquido a las fracciones desde la 14 hasta la 63,

utilizando el sustrato ρ-nitrofenilcaprato a pH 8 y 20ºC. Además se midió la actividad al

sobrenadante concentrado sin purificar de la cepa E5 crecida en medio marino con 1% de aceite

de oliva y al sobrenadante sin purificar ni concentrar. Se calcularon las unidades de actividad

lipasa y el resultado obtenido se presenta en la figura 32.

Unidades de Actividad Lipasa

Fracciones Eluídas Cromatografía de Exclusión

Figura 32. Gráfico actividad lipasa que presento cada fracción de la cromatografía en filtración en gel del sobrenadante de la cepa E5. Unidades de actividad lipasa v/s Fracciones obtenidas.

En la figura 32 se puede observar que se obtuvo la actividad lipasa en las primeras

fracciones correspondientes a las fracciones desde la número 15 a la 26, encontrándose la mayor

actividad lipasa entre las fracciones 21 a la 24 con un máximo en la fracción nº 24.

Para conocer el tamaño aproximado de las proteínas purificadas en las fracciones que

presentaron mayor actividad lipasa, se utilizó la curva de calibración de la cromatografía de

filtración en gel (Anexo VII.1.4) que relaciona el tamaño de proteínas estándares de masa

molecular conocida con el volumen de su respectiva elución. El resultado de este análisis se

observa a continuación en la tabla 11, donde se puede observar que las fracciones que

presentaron mayor actividad eluyeron en un volumen que corresponde con el tamaño esperado

de la proteína lipasa nativa de alrededor de 42 kDa.

75

Tabla 11. Resultado de la determinación del peso molecular aproximado según volumen de elución de las fracciones 21 a 24 de la purificación mediante cromatografía de filtración en gel.

Fracción Nº Volumen de Elución Tamaño Esperado kDa 21 5 ml 51,6 22 5,25 ml 47,5 23 5,5 ml 43,5 24 5,75 ml 39,4

Estas fracciones además, se corrieron en un gel SDS-PAGE al 12,5%, cargando el

mismo volumen de cada una (20 uL) y el gel se tiño con nitrato de plata debido a la baja

concentración de proteínas. El resultado se presenta en la figura 33.

kDa 117 85

50

34

M 19 20 21 22 23 24

Figura 33. Análisis electroforético de las fracciones 19 a la 24, obtenidas de la purificación

mediante cromatografía por filtración en gel del sobrenadante concentrado de la cepa E5 crecido en 1% de aceite de oliva en gel SDS -PAGE 12,5%. M= Marcador preteñido de peso molecular de proteínas.

A pesar de la baja concentración de proteínas, se puede distinguir una banda del tamaño

esperado (alrededor de 42 kDa) en las fracciones 21 a 24, también se observan otras proteínas

en las fracciones 19 a 22, las que disminuyen en la fracción 23 y no se observan prácticamente

en la fracción nº 24.

III.20.2 Ensayo de actividad lipolítica in situ de las fracciones obtenidas mediante la

purificación por cromatografía de filtración en gel de la lipasa nativa

Se realizó un ensayo de actividad in situ a temperatura ambiente, el cual consistió en

correr un gel en condiciones denaturantes y posteriormente se renaturó in situ. Éste es un ensayo

cualitativo donde la actividad lipasa se detectó mediante la reacción del producto de la hidrólisis

del sustrato α-naftilacetato reaccionó con la sal Fast Garnet GBC obteniéndose un precipitado

negro sobre el gel.

76

Se cargaron las fracciones que presentaban mayor actividad (fracciones desde la 18

hasta la 24) más la fracción del sobrenadante concentrado sin purificar. El resultado de este

ensayo se presenta en la figura 34.

kDa 117 85

50 34

25

M 1 2 3 4 5 6 7 8

1. Fraccion 18 2. Fraccion 19 3. Fraccion 20 4. Fraccion 21 5. Fraccion 22 6. Fraccion 23 7. Fraccion 24 8. Sobrenadante E5

medio de cultivo con 1% aceite de oliva, sin purificar

Figura 34. Ensayo de actividad lipolítica in situ de las fracciones 18 a la 24 obtenidas por cromatografía de filtración en gel y la fracción extracelular sin purificar. Se utilizó como sustrato α-naftilacetato. M= Marcador preteñido de peso molecular de proteínas.

En la figura 34 se volvió a observar una banda del tamaño esperado (42 kDa) en todas

las fracciones, aunque debido a que las proteínas no son denaturadas con calor antes de cargar el

gel (con el fin de renaturarlo posteriormente) también se observa una leve diferencia en su

migración.

Con éste ensayo se corroboró la presencia de actividad lipasa en la fracción extracelular

de la cepa psicrófila nativa crecida en medio marino suplementado con 1% de aceite de oliva y

purificada parcialmente mediante la cromatografía de filtración en gel.

La fracción que presenta mayor actividad es la correspondiente al sobrenadante de la

cepa E5 sin purificar y se observa un aumento creciente de la actividad entre las fracciones 18 a

la 24, lo que concuerda con los resultados obtenidos en el ensayo de actividad en medio líquido

(Figura 32).

III.20.3 Ensayo de actividad en medio líquido a distintas temperaturas de la proteína lipasa

nativa purificada.

A la fracción n°24 que presentó la mayor actividad lipasa en los ensayos realizados

anteriormente, y se observó más pura en el análisis electroforético SDS-PAGE efectuado

(Figura 33) se le realizó ensayo de actividad en medio líquido a distintas temperaturas utilizando

el sustrato ρ-nitrofenilcaprato. Este ensayo se efectuó en triplicado a temperaturas entre los 5ºC

77

y 80ºC, a las unidades de absorbancia obtenidas a 405 nm se les restó la absorbancia de una

fracción que no presentó actividad lipasa (n°63), luego se calcularon las unidades de actividad

lipasa (los valores negativos se asignaron como 0). Los resultados se muestra a continuación en

la figura 35.

Unidades de Actividad Lipasa

Temperatura ºC

Figura 35. Gráfico ensayo de actividad en medio líquido de la fracción n°24, realizado a distintas temperaturas, utilizando como sustrato ρ-nitrofenilcaprato. Unidades de actividad lipasa v/s Temperatura.

En la figura 35 se puede observar la alta actividad enzimática de la lipasa nativa

obtenida a partir del cultivo de la cepa psicrofila E5 con 1% de aceite de oliva. Se observa una

mayor actividad a las temperaturas entre 18° y 23°C y comienza a disminuir a los 25°C,

perdiéndose completamente a los 30ºC. Ésta termolabilidad es característica de las enzimas

activas a bajas temperaturas (Marshall, 1997; Feller, 2003).

Al comparar las unidades de actividad lipasa de la proteína nativa con la proteína

recombinante (Tabla 10) se puede notar que el máximo de actividad de esta última era

equivalente a 56,8 unidades de actividad lipasa a los 25ºC, valor que sobrepasa escasamente a la

actividad lipolítica que presenta la lipasa nativa a los 5°C, correspondiente a 40,4 unidades de

actividad lipasa.

III.20.4 Ensayo de actividad en medio líquido a distintos pH de la proteína lipasa nativa

purificada

A la fracción n°24 se midió la actividad en medio líquido a 20°C a diferentes pH

utilizando el sustrato ρ-nitrofenilcaprato. Este ensayo se efectuó en triplicado utilizando 6

distintos tampones de ensayo según el pH. A las unidades de absorbancia obtenida a 405 nm se

78

les restó la absorbancia de una fracción que no presento actividad lipasa (n°63), luego se

calcularon las unidades de actividad lipasa (los valores negativos se asignaron como 0) y el

resultado se muestra a continuación en la figura 36.

Unidades de Actividad Lipasa

pH

Figura 36. Ensayo de actividad en medio líquido de la fracción n°24, realizado a distintos pH, , utilizando como sustrato ρ-nitrofenilcaprato. Unidades de actividad lipasa v/s pH.

En la figur 36 se puede observar una mayor actividad enzimática de la lipasa nativa

parcialmente purificada cuando ésta fue ensayada a pH 8. La enzima, también, presenta

actividad a los pH 7, 9 e incluso pH 10, aunque en este último su actividad disminuye a menos

de la mitad de laactividad obtenida a pH 8. Tambien se observa que a pHs más extremos tanto

básicos como de ácidos, no se observa actividad lipasa. Estas características son comunes a la

mayoría de las lipasas bacterianas activas a bajas temperaturas descritas en la literatura (Joseph

y col., 2008). Cabe destacar que de acuerdo a la literatura (Zivkovic y col., 2009) los ensayos de

actividad lipolítica se realizaron utilizando tampón de ensayo a pH 8.

III.21 Análisis bioinformático de de las características estructurales y funcionales de la

lipasa codificada por el gen aislado de la cepa E5

Con objeto de caracterizar estructural y funcionalmente la lipasa codificada por el gen

aislado de la cepa E5, se utilizó la herramienta computacional I-TASSER (Zhang, 2008), para

obtener un modelo tridimensional de la proteína codificada por el gen codificante de lipasa

aislado de la cepa E5. Dicha simulación presentó una disposición estructural característica de

las enzimas lipolíticas, el plegamiento α/β hidrolasa que consiste en ocho hebras β centrales

dispuestas en forma paralela a excepción de la segunda hebra β dispuesta en sentido

antiparalelo. Las hebras paralelas desde la β3 hasta la β8 están conectadas por α- hélices.

79

En la figura 37, se representa la simulación estructural propuesta para la proteína

codificada por el gen de lipasa de la cepa E5, donde se puede observar la dispocision estructural

característica de las proteínas lipasas, el modelo de plegamiento α/β hidrolasa.

Figura 37. Modelo tridimensional propuesto para la proteína codificada por la secuencia

obtenida del codificante de lipasa de la cepa E13. En la figura: láminas β en amarillo, hélices α en rojo, resto de la cadena en verde, residuos del sitio catalítico en azul.

La herramienta I-TASSER evaluó el modelo propuesto para la proteína codificada por

el gen de lipasa de la cepa E5 con parámetros de precisión diseñados para estimar la similitud

estructural entre modelos y proteínas resueltas en función y estructura (Zhang y Skolnick,

2004). En la tabla 12 se exponen las tres primeras proteínas descritas en la base de datos de

NCBI y Protein Data Bank, relacionadas estructuralmente con el modelo propuesto para la

secuencia del gen codificante de lipasa de la cepa E5.

Tabla 12. Proteínas descritas en base de datos PDB, relacionadas estructuralmente con el modelo

propuesto para la secuencia de la proteína lipasa obtenida de la cepa E5. TM-Scorea RMSDb IDENc Cov.d Fuente Enzima 0,7947 2,57 0.2 0.87 Bacillus subtilis Esterasa Brefeldina A 0,7909 1,39 0.32 0.82 Pirobaculum Calidifontes Esterasa 0,7849 1,81 0.31 0.83 Archaeoglobus fulgidus Carboxilesterasa

a Valor que mide similitud estructural entre dos estructuras, en este caso la estructura del modelo y la estructura resuelta de otra proteína (utilizada como molde, proteína de última columna). b Distancia promedio entre dos residuos correspondientes, que pertenecen a diferentes estructuras comparadas. c Porcentaje de identidad en secuencia, de la región alineada estructuralmente. d Representa la cobertura del alineamiento. Es igual al número de residuos alineados cercanos, dividido por la completa extensión del modelo.

80

Como se muestra en la tabla 12, el análisis del modelo propuesto para la proteína

codificada por la secuencia aislada del gen codificante de lipasa de la cepa E5, exhibe una

cercanía estructural con la esterasa brefeldina A de la bacteria Bacillus subtilis (Wei y col.,

1999), por lo que se realizó una superposición de las estructuras tridimensionales de estas dos

enzimas (Figura 38).

Figura 38. Superposición estructural entre el modelo propuesto para la lipasa codificada

por el gen aislado de la cepa E5 (en rojo) con el molde PDB de la proteína brefeldina A de Bacillus subtilis (Código PDB: 1JKM) (en verde).

En la figura 38 se puede observar la superposición casi perfecta del modelo construído

con el molde proveniente de la proteína esterasa brefeldina A de la bacteria Bacillus subtilis

cristalizada. Ésta última no presenta actividad enzimática a bajas temperaturas pero si posee una

homología con las lipasas sensibles a hormonas de mamíferos (HSL) al igual que las lipasas

bacterianas de la familia IV (Arpigny y Jaeger, 1999) a la que pertenece la lipasa codificada por

el gen de la cepa E5.

Adicionalmente, como se puede observar en la figura 39, el sitio activo del modelo

estructural de la cepa E5 (triada catalítica S202-H338-D308) es prácticamente idéntico al sitio

activo descrito para la lipasa de la esterasa brefeldina A de Bacillus subtilis (triada catalítica

S215-H345-D315).

81

Figura 39. Orientación de residuos del sitio activo para los diferentes modelos estructurales A.- Residuos del sitio activo de la proteína lipasa de la cepa E5. B.- Residuos del sitio activo de la proteína brefeldina de Bacillus subtilis.

Sin embargo a pesar de el gran parecido que poseen a nivel estructural, las secuencias

aminoacídicas de estas dos proteínas presentan baja identidad entre sí, tal como se puede

observar en el alineamiento múltiple de la figura 40.

Figura 40. Alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídica de la proteína brefeldina A esterasa de la bacteria Bacillus subtilis con la secuencia aminoacídica codificada por el gen de lipasa de la cepa E5.

Con estos resultados se puede concluir que pese a la distancia filogenética de la

secuencia de la proteína lipasa de la cepa E5 con respecto a las demás lipasas desctiras, su

estructura y sitio activo si se corresponde con las lipasas descritas, sobretodo con la que ya se

encuentra cristalizada que es la lipasa esterasa brefeldina A de Bacillus subtilis.

82

IV. DISCUSIÓN

IV.1 Análisis filogenético de la secuencia parcial del ADNr 16S de las bacterias marinas

antárticas

Cuando se aislaron las bacterias marinas antárticas que constituyen el cepario antártico

del laboratorio CIByB, las cepas fueron clasificadas e identificadas como distintas en base a sus

características fenotípicas. De acuerdo a esto, se determinó que las 5 cepas bacterianas marinas

antárticas seleccionadas como productoras de lipasas correspondían a especies diferentes. Sin

embargo, las secuencias parciales de sus genes codificantes de lipasas indicaron que tenían una

alta identidad, superior al 90%, con la proteína lipasa codificada en el genoma de la bacteria

Shewanella frigidimarina.

Para establecer molecularmente que las 5 cepas bacterianas marinas antárticas,

realmente correspondían a especies diferentes, se decidió realizar un análisis filogenético

mediante la amplificación de su ADNr 16s utilizando la técnica de PCR, ya que comúnmente se

utiliza esta metodología para caracterizar especies bacterianas (Clarridge, 2004). El ADNr 16S,

como propuso y describieron Olsen y Woese (1993), es utilizado como un cronómetro

molecular debido a sus particulares características: tiene una distribución universal, cumple una

función homóloga en todos los organismos, posee una mínima presión selectiva, sus secuencias

tienen zonas altamente conservadas, posee cantidad de información suficiente lo que minimíza

fluctuaciones estadísticas, no se transfiere horizontalmente y por último, dado a que es

relativamente fácil secuenciarlo, existen amplias bases de datos disponibles y en contínuo

crecimiento (Woese 1987).

Las cepas bacterianas antárticas se cultivaron, se les extrajo el ADN genómico y se

procedió a amplificar una región perteneciente al ADNr 16S mediante PCR. El análisis de las

secuencias obtenidas indicó que las secuencias de ADNr 16S de las cepas A19 y B2 mostraron

un 99% de identidad con la especie Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 perteneciente a la

familia Pseudoalteromonadaceae del orden Alteromonadales. La secuencia de ADNr 16S de la

cepa B9 mostró un 98% de identidad con la especie Psychrobacter arcticus 273-4 perteneciente

a la familia Moraxellaceae del orden Pseudomonadales. Por último, las secuencias de ADNr

16S de las cepa E5 y E13 mostraron un 98% de identidad con la especie Shewanella

83

frigidimarina NCIMB 400 perteneciente a la familia Shewanellaceae tambien del orden

Alteromonadales.

Al construir el árbol filogenético (Figura 7) fue posible visualizar más fácilmente que

pese a que existen muy pequeñas diferencias a nivel de secuencia nucleotídica del ADNr16S

entre las 5 cepas bacterianas de origen marino antártico (Anexo VII.2.6 ), efectivamente se

trataba de 5 especies diferentes que tienen en común ser gammaproteobacterias psicrófilas. Por

este motivo, se decidió seguir trabajando con las 5 especies en la búsqueda de las secuencias

completas de sus genes codificantes de lipasas.

IV.2 Búsqueda de las secuencias de genes codificantes de lipasa mediante Genome Walking

El método de Genome Walking consiste en la identificación sistemática de regiones

desconocidas adyacentes a una secuencia de ADN conocida (Nthangeni y col., 2004; Rishi y

col., 2004). El aislamiento de estas regiones desconocidas se puede obtener mediante la

búsqueda en una librería genómica con una sonda de ADN conocida. Sin embargo, el

procedimiento requiere mucho tiempo. El uso de técnicas de PCR para aislar regiones

adyacentes desconocidas de una secuencia de ADN conocida se ha hecho popular debido a la

eficiencia y rapidez del método y a que son técnicas menos laboriosas (Kilstrup y Kristiansen,

2000; Nthangeni y col., 2004; Rishi y col., 2004).

La técnica de Genome Walking estandarizada en el laboratorio (Acevedo y col., 2008),

es una técnica que ha demostrado ser efectiva para obtener las secuencias completas de

diferentes genes codificantes de proteasas, xilanasas y lipasas (Acevedo y col., 2008; Parra y

col., 2008), y es por esta razón se decidió utilizarla en este trabajo de tesis.

La base de este método se encuentra en la ligación de un oligo-adaptador con una

timidina desapareada en su extremo 3’ a fragmentos de ADN genómico con una adenina

desapareada en el mismo extremo. Se utiliza la técnica de PCR para la amplificación del gen de

interés, usando partidores específicos diseñados a partir de una secuencia parcial conocida desde

donde se amplifican los extremos río arriba (5’) y río abajo (3’) con el fin de completar el gen.

La amplificación resultante fue bastante deficiente y para poder optimizar los productos

de PCR que se obtuvieron mediante esta técnica, se realizaron gradientes de temperaturas. Las

bandas de amplificación obtenidas se mandaron a secuenciar y de las 40 secuencias analizadas,

solamente 4 correspondían efectivamente a fragmentos de genes codificantes de lipasas, los que

fueron amplificados solo a partir de las cepas E5 y E13 (Tabla 6).

84

Con estas secuencias obtenidas mediante la técnica de Genome Walking, junto a las

secuencias parciales conocidas, se pudo obtener el 100% de la secuencia completa del gen

codificante de lipasa proveniente de la cepa E13 y el 89% de la secuencia completa del gen de la

cepa E5 (Anexo VII.3.1). Cabe destacar que estas dos cepas son las que coincidían tanto en su

ADNr 16S como en sus genes codificantes de lipasas en tener una alta identidad (más del 90%)

con la especie Shewanella frigidimarina NCIMB 400, mientras que para las otras 3 cepas

bacterianas (A19, B2 y B9) solo las secuencias parciales de sus genes codificantes de lipasas

presentaban una alta identidad con el codificado por Shewanella frigidimarina NCIMB 400. El

ADNr 16S no se correspondía e indicaba especies diferentes y quizás siguiendo esta

metodología fue más fácil obtenerlo de las cepas más cercanas filogenéticamente a la que

provenía.

Si se quisiera intentar obtener las secuencias de los genes codificantes de lipasas

correspondientes a las otras especies, se podrían utilizar las enzimas de restricción identificadas

para cada cepa en las pruebas de digestión con el fin de aumentar las posibilidades de obtener el

gen íntegramente desde las cepas de las que no se logró amplificar. Esas enzimas fueron

descartadas por razones de tiempo, pero tienen el potencial para ser efectivas al ser utilizadas en

la técnica de Genome Walking. Estas son, para el caso de la cepa A19 la enzima KasI, para la

cepa B2 la enzima PvuII, mientras que para la cepa B9, tendrían que realizarse nuevas pruebas

de digestión con enzimas que dejen extremos romos o cohesivos 5’, ya que esta sólo fue

eficientemente digerida con la enzima HindIII con la que no se obtuvieron resultados.

IV.3 Clonamiento del gen codificante de lipasa de la cepa E13

Para poder expresar la lipasa, se decidió utilizar simultáneamente dos distintos sistemas

de expresión pET22(b+) y pMAL-c2E, con el fin de aumentar las posibilidades de obtener una

lipasa funcional.

El vector pET-22b(+) de Novagen, utiliza el sistema promotor T7-LacI el cual posee un

doble sistema de regulación de la expresión, inducción por IPTG y represión por glucosa.

Además, este vector posee un gen de resistencia a ampicilina para su selección, y se caracteriza

por poseer una secuencia para la expresión de un hexapetido C-terminal de histidinas que

permite su posterior purificación mediante cromatografía de afinidad por metales utilizando una

resina de níquel-NTA. Este vector también contiene una secuencia señal N-Terminal pelB para

una potencial localización periplasmática de la proteína, la producción en el periplasma tiene

85

variadas ventajas ya que las proteínas allí producidas se encuentran protegidas frente a la acción

de proteasas citoplasmáticas, se favorece la correcta formación de los puentes disulfuro porque

el espacio periplasmático entrega el ambiente oxidativo necesario y la purificación de la

proteína recombinante es simplificada, puesto que el periplasma contiene menor cantidad de

proteínas (Choi y col., 2006).

El vector pMAL-c2E en cambio utiliza el sistema promotor tac, un híbrido que combina

la región -35 del promotor trp y la -10 del promotor lac (de Boer y col.,1983), el cual es

inducido por IPTG y reprimido por glucosa. Este vector, también, posee un gen de resistencia a

ampicilina para su selección y se caracteriza por producir una proteína recombinante fusionada

a la proteína de unión a maltosa MBP que permite la estabilización de la proteína, ya que podría

asistir el plegamiento de la proteína recombinante actuando como chaperona. La unión a MBP

facilita su posterior purificación mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de

amilosa, además, este vector tiene una deleción en la secuencia señal malE, lo que resulta en la

expresión citoplasmática de la proteína de fusión.

Para amplificar y posteriormente clonar el gen, se diseñaron partidores utilizando la

secuencia de los extremos del gen aislado. Estos partidores incluían los sitios de restricción

necesarios para ser clonados en cada vector de expresión. Estos sitios de restricción cambian

algunos aminoácidos en la secuencia, en el caso de pET22(b+) esta se inicia correctamente pues

el sitio de restricción de la enzima NcoI codifica para la metionina inicial y una G que coincide

con la primera letra del siguiente aminoácido en la secuencia. Finaliza intercambiando el

penúltimo aminoácido en la secuencia ya que el sitio de corte de la enzima XhoI codifica para

una leucina y un ácido glutámico, mientras la secuencia final de la lipasa corresponde a una

asparragina seguida por un ácido glutámico, además el codón de termino se ubica después de la

cola de 6 histidinas. En el caso de pMAL-c2E, la proteína de unión a maltosa MBP ya contiene

la metionina inicial, la secuencia codificante de la lipasa se inicia con los aminoácidos valina y

prolina correspondientes al sitio de restricción de la enzima KpnI y finaliza correctamente pues

el codón de término se incluye antes del sitio de restricción de la enzima PstI.

Cuando se amplicó el gen mediante PCR, se logró obtener bandas del tamaño esperado,

estas se cortaron, purificaron, digirieron, ligaron a sus respectivos vectores y se mandaron a

secuenciar. Luego, el resultado de la secuenciación se analizó utilizando BLASTn (Altschul y

col, 1990) e indicó que se clonó exitosamente parte del gen de cysteine/glutathione ABC

86

transporter membrane/ATP-binding component de Shewanella frigidimarina (código de acceso

NCBI YP_751888.1). La secuencia nucleotídica completa de este gen es de 1.791 pb, pero al

tratar de explicar el por qué se amplificaron alrededor de 1.000 pb, utilizando los partidores

específicos para clonar el gen codificante de lipasa de la cepa E13, se buscó en la secuencia del

gen de este transportador. Como resultado los partidores utilizados E13pET22F y E13pMALF

alinearon parcialmente desde los 566 pb mientras los partidores E13pET22R y E13pMALR

alinearon parcialmente desde los 1.493 pb. Tal como se puede observar en la figura 40, este

alineamiento parcial de los partidores amplificó una secuencia de 927 pb con lo que se explica

el producto de PCR obtenido (Figura 12).

Figura 41. Alineamiento de la secuencia nucleotídica del gen de cysteine/glutathione ABC transporter membrane/ATP-binding component, de Shewanella frigidimarina con los partidores E13pET22F, E13pET22R, E13pMALF y E13pMALR.

La proteína codificada por el gen de cysteine/glutathione ABC transporter

membrane/ATP-binding component no está descrita para Shewanella frigidimarina y solo se

predice su función en base a la secuenciación del genoma de esta bacteria (Copeland y col.,

2006). Sin embargo, ya que esta proteína en Escherichia coli funciona como un transportador

que exporta cisteína y glutatión dentro del periplasma para mantener el balance redox, siendo

importante para el citocromo b,d y c (Pittman y col., 2005) se podría deducir que debido a este

rol regulador, existen más copias de este gen que del gen codificante de lipasa buscado. Por esta

razón, bajo las condiciones del PCR realizado, a pesar de que los partidores no fueran

87

específicos para amplificar esta secuencia, el producto de PCR obtenido se vio enriquecido en

este transportador de cisteína/glutatión en vez del gen de interés codificante de lipasa.

En base a estos resultados, fue necesario buscar otra estrategia para lograr obtener el

gen y la proteína lipasa.

IV.4 Análisis de las secuencias de lipasas obtenidas

Para analizar las diferencias y similitudes entre las secuencias, se realizó un

alineamiento múltiple mediante ClustalW de las secuencias aminoacídicas de los genes

codificantes de lipasas obtenidos de las cepas A19, B9, E5, junto a la secuencia aminoacídica

del gen codificante de lipasa de la E13 obtenido mediante Genome Walking y la secuencia de la

proteína lipasa de Shewanella frigidimarina. El resultado de este alineamiento se muestra en la

figura 17. Cabe destacar que el alineamiento múltiple de estas secuencias a nivel nucleotídico

(Anexo VII.3.3) muestra varias mutaciones puntuales que a nivel de secuencia aminoacídica son

cambios conservativos ya que se traduce el mismo aminoácido o con las mismas propiedades y

por esta razón, en la figura 17 se pueden observar mucho menos mutaciones y por ende solo

leves diferencias entre las secuencias obtenidas a pesar de provenir de cepas de especies

diferentes. También se realizó un análisis filogenético en el que se pudo observar la cercanía

evolutiva ya establecida de las 4 secuencias obtenidas con la proteína lipasa de Shewanella

frigidimarina, y a su vez, se observa la distancia filogenética con todas las demás lipasas activas

a bajas temperaturas descritas.

Lo interesante de esto, es que al gen codificante de lipasa de Shewanella frigidimarina

se le asocia una putativa actividad lipasa, pero esta actividad es solo una predicción ya que

cuando se realiza un análisis exhaustivo utilizando distintas bases de datos de proteínas como

BRENDA o UNIPROT (Figura 41), las propiedades de la enzima lipasa perteneciente a la

bacteria Shewanella frigidimarina no se encuentran referenciadas, y la probable actividad lipasa

de la proteína se presume a partir de su secuencia, y la secuencia del gen codificante de lipasa se

conoce debido a que el genoma completo de esta bacteria fue secuenciado en el año 2006

(Copelan y col., 2006), pero hasta la fecha no existen publicaciones que den cuenta de estudios

efectuados a la proteína nativa de Shewanella frigidimarina ni tampoco en sus formas

recombinantes, por lo que no se sabe nada de las propiedades y características de esta

importante enzima, con lo que resulta aún más interesante poder obtener resultados que puedan

aportar al estudio y mayor conocimiento de esta lipasa que se distingue en su secuencia y es

88

distante evolutivamente de las demás lipasas descritas, así como las 4 secuencias de genes

codificantes de lipasas obtenidas a partir de las cepas bacterianas marinas antárticas, que

presentan baja identidad con respecto a las otras lipasas ya caracterizadas con respecto a su

función.

Figura 42. Análisis mediante UNIPROT de la secuencia del gen codificante de lipasa de la cepa Shewanella frigidimarina, se puede observar que no existen referencias asociadas a la proteína lipasa codificada por este gen, solo se predice la existencia de la proteína a partir de la secuencia del genoma completo conocido de esta bacteria.

IV.5 Expresión recombinante del gen codificante de lipasa de la cepa E5

El huésped heterólogo utilizado fue la bacteria Escherichia coli. Para el sistema de

expresión pET22(b+) se utilizó la cepa BL21(DE3) que es una cepa lisógena del fago λDE3,

que incorpora el gen de T7-ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV. Para el sistema

de expresión pMAL-c2E, primeramente se utilizó la cepa TB1 recomendada por el proveedor

New England Biolabs, pero al tener dificultades, probablemente debido a la contaminación de

las bacterias almacenadas con las que se contaba, se decidió trabajar con la cepa BL21(DE3)

puesto que en literatura se describen proteínas recombinantes expresadas en este sistema

pMAL-c2E/BL21(DE3) (Stancombe y col., 2003; Masterson y col., 2008). Se transformaron

las células electrocompetentes con los plasmidios LipE5pET22 y LipE5pMAL y como control

se transformaron las mismas bacterias con cada vector sin inserto.

89

Con el fin de aumentar las probabilidades de obtener la correcta expresión de la proteína

recombinante, se analizaron diversos factores involucrados en esta, como la temperatura de

crecimiento e inducción, densidad óptica a 600 nm (cantidad de células) al momento de la

inducción, concentración del inductor y tiempo de inducción.

A continuación se analiza el porqué y cómo estas variables influyen en la producción de

proteínas recombinantes:

- Temperatura. En variados estudios, la temperatura de crecimiento y la de inducción

son los factores de mayor significancia estadística en la producción de proteínas recombinantes.

Esto se debe a que la temperatura es un factor importante en los procesos metabólicos ya que

afecta la velocidad de transcripción y de traducción de proteínas (Salazar y col., 2001).

La temperatura óptima de crecimiento del huésped mesófilo Escherichia coli es 37°C, la

cual coincide con la temperatura de máxima actividad de la T7 ARN polimerasa, pero no es

necesariamente la temperatura óptima de producción de proteínas heterólogas. Se ha

demostrado que la sobreproducción de proteínas recombinantes en E. coli a 37°C induce a la

formación de cuerpos de inclusión, mientras que a bajas temperaturas se genera un incremento

en el plegamiento correcto de las proteínas producidas y la ubicación en los compartimentos

deseados (Chen y col., 2003; Novagen, 2006). Ésto es debido a que se reduce la sobrecarga en la

maquinaria transcripcional (Gordon y col., 2008), disminuyendo respuestas metabólicas

indeseables para la síntesis de proteínas foráneas y, como consecuencia, se mejora el

rendimiento y/o la solubilidad de la proteína de interés (Donovan y col., 1998). Sin embargo,

hay que considerar también, que un decrecimiento pronunciado de la temperatura genera

múltiples cambios celulares en respuesta, lo cual se conoce como “cold-shock adaptation” que

provoca ineficiencias en el plegamiento de las proteínas (Gordon y col., 2008).

Dado que se busca obtener la correcta expresión de una enzima lipasa activa a bajas

temperaturas por parte de un huésped mesófilo, se determinó que en vez de crecer las células a

37ºC e inducir a 18ºC como se describe ampliamente en la literatura (Parra y col, 2008, Larsen y

col., 2008, Gordon y col., 2008). El crecimiento del cultivo se realizó a 25ºC y la inducción a

15ºC siendo el objetivo favorecer el buen plegamiento de la proteína recombinante y disminuir

el shock térmico causado cuando se baja drásticamente la temperatura en el momento de

inducción, el crecimiento del cultivo se realizó

90

-Densidad óptica a 600 nm al momento de la inducción. Con el fin de obtener una

eficiente producción de proteínas recombinantes, es necesario inducir dentro de un rango de

densidad celular apropiado. Se han desarrollado estudios que revelan la estrecha relación que

existe entre la densidad celular en el punto de inducción y la produccion específica que se lográ

para cada proteína. Sin embargo los resultados para cada estudio son completamente diferentes,

por lo cual, no es posible establecer cuál es la densidad celular indicada para inducir la

producción de todas las proteínas recombinantes. Esto se debe a que cada sistema de expresión,

en conjunto con la proteína recombinante que expresa, posee condiciones óptimas específicas,

para la producción de la proteína de interés (Lee y Keasling, 2008).

En general, es recomendado alcanzar altas densidades celulares para inducir, ya que así

se disminuye el efecto nocivo de la concentración de inductor sobre la densidad final alcanzada

por el cultivo (Babaeipour y col., 2007; Lee y Keasling, 2008). No obstante, no se debe llegar a

la etapa estacionaria, puesto que allí existen condiciones desfavorables, tales como: agotamiento

de nutrientes, reducción drástica de la actividad metabólica, utilización de proteínas celulares no

esenciales como fuente de carbono y actividad proteasa aumentada.

Por otra parte, la inducción a una alta velocidad específica de crecimiento (fase

exponencial) entrega condiciones metabólicas más favorables como el alto contenido de

ribosomas, mayor disponibilidad de nutrientes y menor concentración de subproductos tóxicos.

Adicionalmente, al no encontrarse en una etapa de limitación de nutrientes se puede reducir la

respuesta de estrés antes y después de la inducción (Babaeipour y col., 2007).

Por razones de tiempo, en este trabajo de tesis se probó con 3 distintas densidades

celulares, correspondientes a 2 distintas etapas del crecimiento exponencial: temprana

DO600 = 0,6, e intermedia DO600= 1 y DO600= 1,3.

- Concentracion del inductor. El compuesto IPTG, suele utilizarse como inductor del

operón lac, ya que es capaz de unirse al represor lacI e inactivarlo, pero no es sustrato para la β-

galactosidasa, y al no ser metabolizado por la bacteria permite que su concentración en el medio

permanezca constante. Además, el IPTG es transportado eficientemente al interior de las

bacterias en ausencia de la proteína de membrana permeasa lacY mediante un transporte pasivo

por difusión.

Los inconvenientes del uso de IPTG son: su alto costo, formación de proteínas en

agregados insolubles o cuerpos de inclusión, crecimiento retardado como consecuencia del

desvío del metabolismo celular hacia procesos de producción del ADN plasmidial y expresión

91

de la proteína recombinante. Cuando esto último sucede, la carga metabólica termina inhibiendo

el crecimiento y la sobreexpresión de proteínas recombinantes provoca una rápida respuesta a

estrés incrementando la actividad de proteasas, con la consecuente lisis y/o muerte celular.

Por ello, es necesario balancear la producción de la proteína recombinante con el

crecimiento celular, con el fin de maximizar los niveles de producción (Lee y Keasling, 2008).

En la literatura se describe concentraciones de 1 mM del inductor IPTG (Becker y col.,

2005; Parra y col. 2008; Larsen y col. 2008; Rahman y col., 2003) para la expresión

recombinante de lipasas, y una concentración de 0,5 mM es ampliamente utilizada. En este

trabajo, en primera instancia, se probaron concentraciones del inductor IPTG dentro de un rango

de 0,1 mM hasta 1 mM.

- Tiempo de Inducción. La cantidad de horas que permanece un cultivo en inducción

también es un factor que afecta la producción de la proteína recombinante. Se han descrito

distintos tiempos de inducción efectivos para la correcta expresión y producción de proteínas

recombinantes. Estos tiempos van desde las 2 horas hasta las 20 e incluso 48 horas, todos

dependen de la proteína en particular, la cepa a utilizar, la temperatura, y el interés particular de

encontrarla en alguna fracción subcelular entre otros factores. Por este motivo, conviene hacer

un estudio de optimización en cada caso, en los estudios de expresión de lipasas recombinantes

activas a bajas temperaturas producidas hasta la fecha se han utilizado 2, 3 y 4 horas como un

tiempo de inducción suficiente (Alquati y col., 2002; Rahman y col., 2003; Parra y col., 2008).

Aunque en otros estudios se ha establecido que el número de horas de inducción se correlaciona

estrictamente con la temperatura a la que se induce, obteniendo una alta producción de lipasas

recombinantes si la inducción es hecha a 37ºC y permanece por 3 horas a 25ºC durante 20 horas

y a 16ºC si es mantenida durante 24 horas (Larsen y col., 2008). El problema es que cultivos de

larga duración pueden afectar la localización en los compartimientos subcelulares de las

proteínas recombinantes que poseen una secuencia señal de exportación al periplasma, ya que

una mayor cantidad de horas puede debilitar la membrana externa liberando las proteínas

contenidas en el periplasma al espacio extracelular (Bass y Yang., 1997). Además, en cultivos

mayores a 16 horas se tiende a perder la selección debido a la acción de las β-lactamasas

secretadas.

En este trabajo se probaron dos distintos tiempos de inducción, 3 horas, con la intención

de que la proteína producida no se trasloque al sobrenadante y 16 horas con el fin de favorecer

la expresión ya que la temperatura de inducción es de 15ºC, y como no es la temperatura óptima

92

para el huesped mesófilo Escherichia coli, la expresión podía tomar más tiempo. Habría sido

interesante poder probar un tiempo de inducción intermedio como por ejemplo 6 u 8 horas, pero

en base a las curvas de crecimiento establecidas y debido a razones de tiempo y disponibilidad

del laboratorio esto no fue posible.

Lamentablemente, con ninguno de los dos sistemas de expresión se logró la obtención

de la proteína lipasa recombinante

IV.6 Toxicidad del gen codificante de lipasa de la cepa E5

Debido a la imposibilidad de obtener la expresión de la proteína recombinante, se

decidió analizar la probabilidad de que la lipasa psicrófila fuera tóxica para las células

hospederas, disminuyendo su viabilidad y por esta razón no se observaron diferencias al analizar

los patrones electroforéticos de las distintas fracciones celulares.

Luego de realizar un ensayo de toxicidad se pudo establecer que la expresión del gen

codificante de lipasa de la cepa E5 a las concentraciones de inductor ensayadas en primera

instancia (rango entre 0,1 mM y 1 mM) resultó ser tóxica para las células hospederas. Se ha

descrito que los genes de lipasas son difíciles de aislar debido a varios factores, incluyendo la

alta toxicidad de la expresión en huéspedes heterólogos (Bell y col., 2002). Por ejemplo, la

expresión de genes de lipasas provenientes tanto de bacilos mesófilos como de termófilos han

sido tóxicos para el microorganismo hospedero Escherichia coli (Bell y col., 1999; Kim y col.,

1998; Dartois y col., 1992) y la expresión recombinante de la lipasa de Staphylococcus hyicus

resultó ser tóxica para dos huéspedes heterólogos Lactococcus lactis y Bacillus subtilis (Droualt

y col., 2000)

Una forma de obtener lipasas recombinantes ha sido a partir de cuerpos de inclusión

(Suzuki y col., 2003, De Santi y col., 2010). Se han descrito ventajas sobre la formación de los

cuerpos de inclusión como: la proteína es protegida de degradación proteolítica resultando en

mayor proporción y resguarda a la célula contra la toxicidad de la proteína recombinante,

debido a que los cuerpos de inclusión no tienen actividad biológica. Además, pueden ser

acumulados en el citoplasma en una mayor proporción que cuando se produce de forma soluble

(Mattsson y Tenhunen, 2003). Luego, los cuerpos de inclusión han sido solubilizados y despues

de someterse a un proceso de renaturacion (el que no siempre es efectivo) se ha conseguido la

93

lipasa recombinante de forma activa sin dañar al hospedero (Georgiou y col., 1999). Sin

embargo, no siempre se obtienen buenos resultados y la etapa de renaturacion suele ser bastante

laboriosa. Debido a que la bacteria Escherichia coli BL21(DE3) se creció a 25ºC y la inducción

se realizó a 15ºC, con el fin de favorecer el buen plegamiento de la proteína psicrófila, esta se

expresó de forma activa siendo tóxica para el huésped. Es probable que si la temperatura de

crecimiento e inducción hubiese sido de 37ºC, temperatura óptima para el crecimiento de el

huésped mesófilo, la lipasa psicrofila recombinante probablemente se hubiese producido en

forma inactiva formado agregados proteicos en la forma de cuerpos de inclusión.

Existen varias estrategias para poder expresar genes que son tóxicos, las que recaen en

minimizar la expresión basal con el fin de estabilizar el plasmidio recombinante ya que a pesar

de que los plasmidios derivados de pBR322 como pET22(b+) y pMAL-c2E, son relativamente

estables y pueden ser altamente retenidos por las células hospederas incluso después de crecer

por muchas generaciones o en ausencia de la presión selectiva del antibiótico. Cuando el

producto de un gen clonado en este tipo de vectores resulta ser tóxico para la célula hospedera,

tienen lugar problemas de inestabilidad del plasmidio, lo que se traduce en la pérdida de este por

parte de la célula huésped (Novagen, 2006). A veces, dependiendo del nivel de expresión, el

plasmidio puede ser mantenido pero el crecimiento de las células se ve afectado, ya que células

que han perdido el plasmidio pueden crecer más rápido que las que lo conservan. Esto se debe a

que las células bacterianas sin plásmidos tienden a acumularse más rápidamente que las células

que si los tienen. Una razón para este aumento de tasa de acumulación es que la transcripción y

la traducción de genes insertados en los vectores de expresión imponen una carga metabólica

que provoca que el crecimiento celular sea más lento y da a las células sin plasmidios una

ventaja competitiva (Galen, 2006). Además, cuando los productos génicos son tóxicos para la

célula huesped, las células que son capaces de expresarlos mueren, como ocurrió en las primeras

pruebas de inducción de la expresión de la lipasa recombinante realizada en esta tesis.

Para evitar esto, se pueden optimizar algunas de las condiciones del medio de cultivo

como por ejemplo:

- Inhibidor de la inducción. La forma más sencilla de disminuir los niveles de expresión

basal de proteínas cuando los genes son tóxicos es utilizar medios suplementados con glucosa,

ya que esta es consumida por las células como la primera fuente de carbono, reprimiendo la

94

inducción de la expresión de la proteína recombinante y manteniendo estable el plasmidio

(Novagen, 2006). Para esto, las cepas deben cultivarse en medio que contenga el represor, y

antes de la inducción este debe ser cambiado por medio fresco sin represor.

- Alta concentración de antibiótico. Como se mencionó anteriormente, en cultivos de

varias horas la secreción de β-lactamasas puede degradar el marcador de selección, y no se

recomienda utilizar ampicilina ya que este antibiótico es susceptible a la hidrólisis bajo

condiciones del medio ácidas creadas por el metabolismo bacteriano. Esto se traduce finalmente

en que las células que han perdido el plasmidio sobreviven mientras que las células que lo

conservan son cada vez menos y como no queda ampicilina remanente, se sobrepuebla el

cultivo con bacterias que no tienen el vector y solo una mínima fracción de las células tendrá el

plasmidio con el gen de interés. Estos problemas pueden llevar a deducir conclusiones erróneas

pensando que los genes son pobremente expresados cuando en realidad solo una pequeña

fracción de células del cultivo realmente contenía el plasmidio. Para evitar esta situación se

recomienda tener algunas precauciones para maximizar la retención del plasmidio, por ejemplo,

remplazar el medio por uno que contenga ampicilina fresca o usar un antibiótico relacionado

como la carbenicilina, el cual es menos sensible y más estable a bajos pH. Además, resulta

apropiado aumentar la concentración del antibiótico al doble o quíntuple con el fin de asegurar

la presión selectiva conferida por este (Novagen, 2006).

-Concentración del inductor. La concentración del inductor está estrechamente

relacionada con el rendimiento de la producción de proteínas recombinantes y la toxicidad para

la célula hospedera (Saïda y col., 2006). Por lo que se recomienda determinar empíricamente

cual resulte ser la concentración de inductor ideal a utilizar.

El ensayo de toxicidad realizado determinó que la concentración de IPTG en la que

existió un balance entre la expresión de la lipasa recombinante y la viabilidad de las células que

la expresan es de 0,01 mM.

Estas tres condiciones fueron las utilizadas en esta tesis para conseguir la expresión de

la lipasa recombinante, sin embargo esto no fue lo más eficiente para optimizar la expresión de

la proteína tóxica, pero sí fue lo más rápido, ya que si no hubiese sido necesario cambiar todo el

sistema de expresión recombinante del gen codificante de lipasa.

95

IV.7 Obtención de una lipasa recombinante funcional y activa a bajas temperaturas

utilizando el sistema de expresión E.coli BL21(DE3)/ pET22(b+)

La correcta expresión del gen codificante de lipasa pudo obtenerse mediante el sistema

de expresión BL21(DE3)/pET22(b+). La lipasa recombinante se produjo en muy baja

concentración, pero correspondía al tamaño esperado y presentó actividad lipolítica a bajas

temperaturas frente a los sustratos tributirina (ensayo en medio líquido efectuado a 15°C) y ρ-

nitrofenolcaprato (ensayo en medio sólido, presentando actividad entre los 10° y 30°, con un

máximo a los 25°C en las condiciones del ensayo).

Utilizando el sistema de expresión pMAL-c2E, no se logró producir la lipasa

recombinante por lo que este sistema de expresión fue descartado. A pesar de estar descrito en

la literatura que la cepa Escherichia coli BL21(DE3) puede expresar este vector (Stancombe y

col., 2003; Masterson y col., 2008), el proveedor recomienda utilizar cepas hospederas que no

tengan la T7 ARN polimerasa ya que el vector pMAL utiliza la ARN polimerasa de E. coli

(New England Biolabs, 2007) y quizás pudo haber afectado la expresión de la proteína

recombinante ya que la habilidad de transcribir de la T7 ARN polimerasa es ocho veces mayor

que la de ARN polimerasa de E. coli (Lee y Keasling, 2008). Adicionalmente, la alta toxicidad

del gen codificante de lipasa puede haber llevado a una inestabilidad del plasmidio LipE5pMAL

que no pudo ser superada con las condiciones establecidas para mejorar la expresión de la

proteína tóxica, las que si fueron suficientes para el sistema de expresión del vector pET22(b+).

IV.8 Estudio de la lipasa nativa E5

Debido a que hasta la fecha no se han descrito estudios sobre la proteína lipasa de

Shewanella frigidimarina, y con el fin de comparar los resultados obtenidos con la expresión

recombinante del gen codificante de lipasa de esta cepa, se procedió a cultivar la cepa psicrófila

para poder obtener la lipasa nativa. Al realizar una búsqueda bibliográfica sobre la obtención de

lipasas activas a bajas temperaturas, se encontró que muchas de ella eran producidas después de

7 días de cultivo a 4°C (Joseph y col., 2008). En algunos casos, se utilizaban lípidos como

trioleína, tributirina, entre otros y diversos aceites: de oliva, de coco, de castor, de maravilla, de

palma, de maíz, de sesamo, de poroto de soya, etc., con el objetivo de inducir la expresión de los

genes codificantes de lipasas (Akhtar y col., 1980, Maia y col., 2001). En este trabajo de tesis

se probaron dos medios de cultivos uno sin inductor y otro suplementado con el 1% de aceite de

oliva.

96

Se analizaron las fracciones celulares mediante el ensayo de actividad en medio sólido a

15°C frente al sustrato tributirina, y como resultado se obtuvo actividad lipasa en el

sobrenadante, lo que concuerda ya que las lipasas son enzimas extracelulares. Se determinó que

la enzima nativa presentó mayor actividad cuando fue inducida con aceite de oliva y por esta

razón se concentró este sobrenadante para su purificación.

Para la purificación de enzimas lipasas, así como para la mayoría de las proteínas, no es

suficiente un solo paso cromatográfico para alcanzar el nivel de pureza deseado, por lo que se

necesita una combinación de pasos de purificación. La cromatografía de intercambio iónico es

la más comúnmente utilizada para la purificación de lipasas (Saxena y col. 2003) donde el

fundamento de la separación es el punto isoeléctrico de la proteína (pI). Primero la proteína se

une a una serie de cargas fijas y luego es eluída por una solución que desplaza a la proteína, esta

técnica se ha aplicado con éxito en el campo de las lipasas (Wu y col., 1996). El segundo

método de purificación más ampliamente utilizado es la cromatografía de filtración en gel

(Saxena y col., 2003). El fundamento de esta purificación es el tamaño relativo de las proteínas,

ya que utiliza un lecho poroso como soporte de la columna que tiene un volumen interno y uno

externo, las moléculas más grandes no penetran el volumen interno y eluyen rápidamente,

mientras que las más pequeñas si son capaces de pasar al volumen interno y eluyen más

lentamente.

Debido a que se obtuvo la secuencia del gen codificante de la proteína lipasa de la cepa

E5 y se contaba con su secuencia aminoacídicas, utilizando el programa ProtParam de Expasy

se obtuvieron los valores teoricos de su punto isoeléctrico y su peso molecular, los que fueron

de 9,15 y 41,589 kDa respectivamente. Con estos datos se podía realizar cualquiera de las

cromatografías mencionadas anteriormente, pero por disponibilidad de la columna

cromatográfica, se decidió utilizar como primer paso de purificación la cromatografía de

filtración en gel, con la que se logró purificar parcialmente la lipasa nativa. Esta enzima

presentó actividad a temperatura ambiente frente a los sustratos ρ-nitrofenilcaprato (ensayo en

medio líquido) y α-naftilacetato (ensayo de actividad in situ). En todos los casos, la actividad

enzimática de la lipasa nativa fue superior a la actividad lipolítica de la lipasa recombinante.

Cuando se analizó la concentración de proteínas totales, también se obtuvo una muy

baja cantidad por lo cual no se prosiguió con un segundo paso de purificación.

97

IV.9 Proyecciones y alcances de este trabajo de tesis

A lo largo de esta tesis se logró obtener y caracterizar una nueva lipasa en sus formas

nativa y recombinante, a partir de una cepa bacteriana aislada desde el mar antártico chileno.

Esta especie, según su análisis de secuencia ADNr 16S, presenta un 98% de identidad con la

bacteria Shewanella frigidimarina perteneciente a la familia Shewanellaceae del orden

Alteromonadales.

Resulta interesante que, como se mencionó anteriormente, ésta nueva lipasa obtenida

posee alta identidad con la proteína lipasa codificada en el genoma de la bacteria Shewanella

frigidimarina, de la que hasta la fecha (Octubre 2010), no se encuentran estudios publicados en

literatura, ya sean sobre la proteína nativa o en su forma recombinante. Razón por la cual, todos

los conocimientos generados mediante este trabajo de tesis, son un aporte al estudio de esta

enzima.

Adicionalmente, esta lipasa tiene la particularidad de ser distante filogenéticamente a

todas las demás lipasas activas a bajas temperaturas descritas hasta el momento, pero a la vez,

su estructura tridimensional y sitio activo corresponde a las lipasas que ya se encuentran

cristalizadas, sobretodo con la proteína esterasa brefeldina A de la bacteria Bacillus subtilis.

Ésto precisamente, es lo que la hace novedosa y con un alto potencial biotecnológico

susceptible de ser aprovechado en estudios posteriores, para los que esta tesis puede servir como

una base, que aporte la información preliminar para luego optimizar la obtención de esta

enzima.

La nueva lipasa obtenida en esta tesis, ya sea en su forma nativa o recombinante,

presentó, frente a diferentes sustratos, alta actividad lipolítica a bajas temperaturas, alcanzando

su máximo a temperatura ambiente entre 20º-25ºC. Ésta actividad enzimática resulta muy

promisoria en caso de ser producida a gran escala y en un futuro comercializada, pues

representaría un beneficio para las industrias que quisieran utilizarla en sus procesos en

remplazo de las lipasas que hoy se encuentran disponibles comercialmente como: Lipomax® y

Lumufast® de Danisco, Genencor, Lipolase® y Lipozyme® de Novozymes, cuya actividad

máxima la alcanzan alrededor de los 50ºC.

98

Como proyección, se puede aventurar que, como se determinó que la proteína nativa

presentaba mayor actividad que la recombinante, su obtención podría ser mejorada a través de la

determinación de nuevas condiciones de cultivo que permitan aumentar la expresión de la

enzima. Sin embargo, como no es posible obtener una producción a gran escala a partir de

microorganismos psicrófilos, la expresión recombinante por parte de la bacteria Escherichia coli

resulta ser una opción más atractiva y susceptible de ser optimizada.

El inconveniente que presentó la expresión recombinante de esta nueva lipasa fue su

alta toxicidad, pero este problema puede ser superado mediante la utilización de diversas

estrategias (las cuales involucran cambiar el sistema de expresión utilizado en esta tesis), que

permitan la correcta expresión de genes tóxicos, como por ejemplo: utilizar células hospederas

especialmente diseñadas para la expresión de proteínas tóxicas como las bacterias Escherichia

coli OverExpress C41(DE3) y C43(DE3), en las que la eficiente expresión de proteínas tóxicas

ha sido demostrada en más de 350 publicaciones (Miroux y Walker 1996, Dumon-Seignovert y

col., 2004), o la cepa BL21(DE3)NH seleccionada empíricamente por tolerar la expresión de

genes tóxicos por un mecanismo no conocido; también se puede utilizar plasmidios con bajo

numero de copias como el vector es el vector pETcoco de Novagen, que ha resultado ser estable

para la expresión de genes tóxicos con promotores altamente regulados (Sektas and Szybalski,

2002); otra opción son los plasmidios con promotores débiles o los plasmidios con promotores

altamente regulados como por ejemplo los que contengan, el promotor araBAD, reprimible por

glucosa e inducible por arabinosa (Saïda y col., 2006) o el promotor rhaB reprimible por

glucosa e inducible por rhamnosa (Giacalone y col., 2006); finalmente la expresión

recombinante de una proteína toxica puede ser llevada a cabo utilizando plasmidios que

reduzcan la expresión basal, perjudial para expresar correctamente proteinas tóxicas, estos

pueden ser el vector pLys, que codifica para producir una pequeña cantidad de la enzima

lisozima T7, inhibidor natural de la T7 ARN polimerasa, que reduce la expresión basal

permitiendo altos niveles de expresión después de la inducción (Dubendorff and Studier, 1991)

o también, algún plasmidio que contenga el represor lacIq, ya que el represor endógeno a veces

no es suficiente (Gruber y col., 2008).

Siguiendo estas sugerencias podría obtenerse una mayor producción de esta nueva

proteína lipasa de origen bacteriano marino antártico con actividad enzimática a bajas

temperaturas, ya sea en su forma nativa o recombinante. Lo que va a depender del interés y los

fines que se tengan para llevar a cabo nuevos estudios acerca de esta proteína.

99

V. CONCLUSIONES

� El análisis filogenético del ADNr 16S estableció que las 5 cepas bacterianas marinas antárticas

A19, B2, B9, E5 y E13, pertenecen a especies diferentes.

� Se logró obtener la secuencia completa del gen codificante de lipasa de la cepa E13 y el 89% de

la secuencia del gen de la cepa E5 utilizando la técnica de Genome Walking.

� Se consiguió obtener otras 3 secuencias completas de genes codificantes de lipasas

correspondientes a las cepas A19, B9 y E5 utilizando partidores diseñados desde la secuencia

del gen codificante de la proteína lipasa/esterasa de la bacteria Shewanella frigidimarina.

� El análisis de las secuencias de lipasas obtenidas dieron cuenta que a pesar de provenir de

distintas especies, sus secuencias son todas muy parecidas entre sí y presentan una alta identidad

con la lipasa de Shewanella frigidimarina, pero son distantes filogenéticamente de todas las

demás lipasas activas a bajas temperaturas descritas en la literatura.

� Se seleccionó el gen codificante de lipasa de la cepa E5 para la expresión recombinante de la

proteína, este fue clonado en dos distintos vectores de expresión: pET22(b+) y pMAL-c2E.

� Se determinó que la expresión de la lipasa recombinante es tóxica para la célula y

concentraciones mayores a 0,03 mM del inductor IPTG disminuyen drásticamente la viabilidad

de las células capaces de expresar la proteína recombinante.

� Mediante el sistema de expresión E. coli BL21(DE3)/pET22(b+), induciendo a una DO600 = 1,

con 0,01 mM de IPTG, por 16 horas a 15ºC, se obtuvo una proteína lipasa del tamaño

esperado, que se expresa diferencialmente en el periplasma, fracción que presentó actividad

lipolítica a bajas temperaturas frente a los sustratos tributirina (15°C) y ρ-nitrofenilcaprato (10°

a 25°C). Con el sistema pMAL-c2E no se expresó la proteína.

� Se comprobó la hipótesis planteada en esta tesis: Una lipasa funcional y activa a bajas

temperaturas, puede ser expresada en forma recombinante por un huésped mesófilo.

100

� Adicionalmente, se estudió la proteína lipasa nativa de la cepa bacteriana marina antártica E5.

Esta se cultivó durante 7 dias a 4°C, y se determinó que suplementando el medio de cultivo con

1% de aceite de oliva, se induce la expresión de la proteína lipasa extracelular, y ésta presenta

actividad lipolítica frente al sustrato tributirina a 15°C.

� El sobrenadante de la cepa psicrófila E5 cultivada con 1% de aceite de oliva, se purificó

mediante cromatografía de filtración en gel. La lipasa nativa parcialmente purificada presentó

actividad a temperatura ambiente frente a los sustratos ρ-nitrofenilcaprato y α-naftilacetato. Se

determinó que la lipasa nativa era activa entre los 5° y 25°C presentando un máximo de

actividad entre los 15° y 20°C bajo las condiciones del ensayo realizado, entre los pH 7 y 9.

� Mediante análisis bioinformático, se construyó un modelo tridimensional de la proteína lipasa,

que mostró gran semejanza a nivel estructural y de sitio activo con la proteína lipasa brefeldina

A de Bacillus subtilis que se encuentra cristalizada.

� Se concluye que este estudio y los resultados obtenidos en esta tesis son un aporte al

conocimiento de esta enzima, ya que hasta la fecha no existen referencias acerca de la proteína

lipasa de la bacteria Shewanella frigidimarina, ya sea en su forma nativa o recombinante. Así,

este trabajo puede ser utilizado como base para estudios posteriores que busquen optimizar la

producción de la nueva lipasa bacteriana de origen marino antartico, activa a bajas temperaturas,

obtenida en esta tesis.

101

VI. BIBLIOGRAFÍA

− Acevedo JP, Reyes F, Parra LP, Salazar O, Andrews BA, Asenjo JA. Cloning of complete genes for novel hydrolytic enzymes from Antarctic sea water bacteria by use of an improved genome walking technique. J Biotechnol. 2008; 133:277-86.

− Akhtar MW, Mirza AQ, Chughtai MI. Lipase Induction in Mucor hiemalis. Appl Environ Microbiol. 1980; 40(2):257-63.

− Alquati C, De Gioia L, Santarossa G, Alberghina L, Fantucci P, Lotti M. The cold-active lipase of Pseudomonas fragi. Heterologous expression, biochemical characterization and molecular modeling. Eur J Biochem. 2002; 269(13):3321-8.

− Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402.

− Araujo K, Paez G, Marmol Z. Efecto de la concentración de lactosa sobre la cinética de crecimiento de Kluyveromyces marxianus var. marxianus y la producción de β-D-galactosidasa (E.C. 3.2.1.23). Rev. Téc. Ing. Univ. Zulia, 2007; 30: 64-73.

− Arpigny JL, Jaeger KE. Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties. Biochem J. 1999; 343:177-83.

− Arroyo M. Síntesis enantioselectivas catalizadas por lipasas microbianas. Anales RSEQ 2000; 19-24.

− Babaiepour V, Shojaosadati SA, Robatjazi SM, Khalilzadeh R, Maghsoudi N. Over-production of human interferon –γ by HCDC of recombinant Escherichia coli. Process Biochemistry. 2007; 42:112-117.

− Bass S, Yang M. Expressing cloned genes in Escherichia coli. Folding proteins. Protein Function. 1997; 29-55.

− Becker S, Theile S, Heppler N, Michalczyk A, Wentzel A, Wilhelm S, Jaeger K.E, Kolmar H. A generic system for the Escherichia coli cell-surface display of lipolytic enzymes. Federation of European Biochemical Societies.2005; 579(5): 1177-1182.

− Beisson F, Tiss A, Riviere C, Verger R. Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur J Lipid Sci Technol 2000; 2:I33–53.

− Bell PJL., Nevalainen H, Morgan HW, Bergquist PL. Rapid cloning of thermoalkalaophilic lipases from Bacillus spp. Biotechnol Lett.1999; 21: 1003-1006.

− Bell PJ, Sunna A, Gibbs MD, Curach NC, Nevalainen H, Bergquist PL. Prospecting for novel lipase genes using PCR. Microbiology. 2002; 148: 2283-91.

− Bollag DM, Rozycky MD, Edelstein SJ. 1996. Protein Methods. Wiley-Liss, New York. Second Edition.

− Bornscheuer UT, Bessler C, Srinivas R, Krishna SH. Optimizing lipases and related enzymes for efficient application. Trends Biotechnol. 2002; 20:433-7.

− Bozal N, Montes MJ, Tudela E, Jiménez F, Guinea J. Shewanella frigidimarina and Shewanella livingstonensis sp. nov. isolated from Antarctic coastal areas. Int J Syst Evol Microbiol. 2002; 52:195-205.

− Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-due binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254.

− Brahimi-Horn MC, Guglielmino ML, Gaal AM, Sparrow LG. Nondenaturing protein electrotransfer of the esterase activity of lipolytic preparations. Anal Biochem 1991; 196:76–9.

− Chen Y, Song J, Sui S, Wang D. DNAK and DNAJ facilitated the folding process and reduced inclusion body formation of magnesium transporter CorS overexpressed in Escherichia coli. Protein expression and Purification. 2003; 32: 221-23.

102

− Choi JH, Keum KC, Lee SY. Production of recombinant proteins by high cell density culture of Escherichia coli. Chemical Engineering Science. 2006; 61: 876-885.

− Clark MS, Clarke A, Cockell CS, Convey P, Detrich Iii HW, Fraser KP, Johnston IA, Methe BA, Murray AE, Peck LS, Römisch K, Rogers AD. Antarctic genomics. Comp Funct Genomics. 2004; 5:230-8.

− Clarridge JE 3rd. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin Microbiol Rev .2004; 17:840-862.

− Copeland A, Lucas S, Lapidus A, Barry K, Detter J.C, Glavina del Rio T, Hammon N, Israni S., Dalin E, Tice H, Pitluck S, Fredrickson JK, Kolker E, McCuel L.A, Di Christina T, Nealson KH, Newman D, Tiedje JM, . Complete sequence of Shewanella frigidimarina NCIMB 400.Submitted August-2006.

− D'Amico S, Collins T, Marx JC, Feller G, Gerday C. Psychrophilic microorganisms: challenges for life. EMBO Rep. 2006; 7:385-9.

− D'Amico S, Claverie P, Collins T, Georlette D, Gratia E, Hoyoux A, Meuwis MA, Feller G, Gerday C. Molecular basis of cold adaptation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002; 357:917-25.

− Dartois VA, Baulard K, Schanck K, Colson C. Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of a lipase gene from Bacillus subtilis 168. Biochim Biophys Acta. 1992; 1131:253-260.

− De Boer HA, Comstock LJ, Vasser M. The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 1983; 80:21–25.

− Donovan RS, Robinson CW, Glick BR. Optimizing inducer and cultura conditions for expression of foreing proteins under control of lac promoter. Journal of Industrial Microbiology. 1996; 16:145-154.

− Drouault S, Corthier G, Ehrlich SD, Renault P. Expression of the Staphylococcus hyicus lipase in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol. 2000;66 (2):588-98.

− De Santi C, Tutino ML, Mandrich L, Giuliani M, Parrilli E, Del Vecchio P, de Pascale D. The hormone-sensitive lipase from Psychrobacter sp. TA144: new insight in the structural/functional characterization. Biochimie. 2010; 92(8):949-57.

− Dubendorff JW, Studier FW. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 1991; 219(1):45-59.

− Dumon-Seignovert L, Cariot G, Vuillard L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expression and Purification. 2004; 37:203-206.

− Feller G, Narinx E, Arpigny JL, Aittaleb M, Baise E, Genicot S, and Gerday C. Enzymes from psychrophilic organisms. FEMS Microbiol. Rev. 1996; 18:189-202.

− Feller G, Gerday C. Psychrophilic enzymes: molecular basis of cold adaptation. Cell Mol Life Sci. 1997; 53:830-41.

− Feller G. Molecular adaptations to cold in psychrophilic enzymes. Cell Mol Life Sci. 2003; 60:648-62.

− Feller G, Gerday C. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation. Nat Rev Microbiol. 2003; 1:200-8.

− Galen J. Plasmid maintenance system for antigen delivery, 2006; US. Patent:7138112. − Georgiou G, Valax P. Isolating inclusion bodies from bacteria. Methods Enzymol.1999;

309:48-58. − Gerday C, Aittaleb M, Arpigny JL, Baise E, Chessa JP, Garsoux G, Petrescu I, Feller G.

Psychrophilic enzymes: a thermodynamic challenge. Biochim Biophys Acta. 1997; 1342:119-31. − Giacalone MJ, Gentile AM, Lovitt BT, Berkley NL, Gunderson CW, Surber MW. Toxic

protein expression in Escherichia coli using a rhamnose-based tightly regulated and tunable promoter system. Biotechniques. 2006; 40(3):355-64.

− Gianese G, Argos P, Pascarella S. Structural adaptation of enzymes to low temperatures. Protein Eng. 2001; 14:141-8.

103

− Gomes J, Steiner W. The biocatalytic potential of extremophiles and extremozymes. Food Technol Biotechnol 2004; 42:223–35.

− Gordon E, Horsefield R, Swars H, De Pont J, Neutze R, Snijder A. Effective high-throughput overproduction of membrane proteins in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 2008; 62:1-8.

− Gruber DF, Pieribone VA, Porton B, Kao HT. Strict regulation of gene expression from a high-copy plasmid utilizing a dual vector system. Protein Expr Purif. 2008; 60(1):53-7.

− Gupta R, Gupta N, Rathi P. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties. Appl Microbiol Biotechnol. 2004; 64:763-81.

− Hall TA. Bioedit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT, Nucl Acids Symp Ser, 1999, 95–98.

− Hou WC, Chen HJ, Chang CF, Lin YH. Purification and properties of fatty acid esterases from yam (Dioscorea batatas Decne) tuber Bot. Bull. Acad. Sinica, 1999; 40: 305-310.

− Hoyoux A, Blaise V, Collins T, D'Amico S, Gratia E, Huston AL, Marx JC, Sonan G, Zeng Y, Feller G, Gerday C. Extreme catalysts from low-temperature environments. J Biosci Bioeng. 2004; 98:317-30.

− Izrael-Zivkovic LT, Gojgic-Cvijovic GD, Gopcevic KR, Vrvic MM, Karadzic IM. Enzymatic characterization of 30 kDa lipase from Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. J Basic Microbiol. 2009;49:452-62.

− Jaeger KE, Ransac S, Dijkstra BW, Colson C, van Heuvel M, Misset O. Bacterial lipases. FEMS Microbiol Rev. 1994; 15:29-63.

− Jaeger KE, Dijkstra BW, Reetz MT. Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipases. Annu Rev Microbiol. 1999; 53:315-51.

− Jaeger KE, Eggert T. Lipases for biotechnology. Curr Opin Biotechnol. 2002; 13:390-7. − Jonasson P, Liljeqvist S, Nygren PA, Stahl S. Genetic design for facilitated production and

recovery of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnology and Applied Biochemistry. 2002; 35: 91-105.

− Joseph B, Ramteke PW, Thomas G. Cold active microbial lipases: some hot issues and recent developments. Biotechnol Adv.2008; 26:457-70.

− Kanwar S, Kaushal R, Jawed A, Gupta R, Chimni S. Methods for inhibition of residual lipase activity in colorimetric assay: A comparative study. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics. 2005; 42: 233-237.

− Kilstrup M, Kristiansen KN. 2000. Rapid genome walking: a simplified oligo-cassette mediated polymerase chain reaction using a single genome-specific primer. Nucleic Acids Res. 28:E55.

− Kim HY, Park SY, Lee JK, Ho TK. Gene cloning and characterization of thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus L1. Biosci Biotechnol Biochem. 1998; 65: 66-71.

− Kim HK, Jung YJ, Choi WC, Ryu HS, Oh TK, Lee JK. Sequence-based approach to finding functional lipases from microbial genome databases. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 235: 349-355

− Kouker G, Jaeger KE. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases. Appl Environ Microbiol. 1987; 53:211-3.

− Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5.

− Larsen MW, Bornscheuer UT, Hult K. Expression of Candida antartica lipase B in Pichia pastoris and various Escherichia coli systems. Protein Expression Purification. 2008; 62:90-97.

− Leary D, Vierros M, Hamon G, Arico S, Monagle C. Marine genetic resources: A review of scientific and commercial interest. Marine Policy. 2009; 33:183-194

− Lee SK, Keasling JD. Heterologous protein production in Escherichia coli using the propionate inducible pPro system by conventional and auto-induction methods. Protein Expression and Purification. 2008; 61: 197-203.

104

− Maia MM, Heasley A, Camargo de Morais MM, Melo EH, Morais Jr MA, Ledingham WM, y col. Effect of culture conditions on lipase production by Fusarium solani in batch fermentation. Bioresour Technol 2001; 76:23–7.

− Marchler-Bauer A, Anderson JB, Chitsaz F, Derbyshire MK, DeWeese-Scott C, Fong JH, Geer LY, Geer RC, Gonzales NR, Gwadz M, He S, Hurwitz DI, Jackson JD, Ke Z, Lanczycki CJ, Liebert CA, Liu C, Lu F, Lu S, Marchler GH, Mullokandov M, Song JS, Tasneem A, Thanki N, Yamashita RA, Zhang D, Zhang N, Bryant SH. CDD: specific functional annotation with the Conserved Domain Database. Nucleic Acids Res. 2009; 37:D205-10.

− Marshall CJ. Cold-adapted enzymes. Trends Biotechnol. 1997; 15: 359-64. − Marx JC, Collins T, D'Amico S, Feller G, Gerday C.Cold-adapted enzymes from marine

Antarctic microorganisms.Mar Biotechnol (NY). 2006; 9:293-304. − Masterson LR, Bortone N, Yu T, Ha KN, Gaffarogullari EC, Nguyen O, Veglia G.

Expression and purification of isotopically labeled peptide inhibitors and substrates of cAMP-dependant protein kinase A for NMR analysis.Protein Expr Purif. 2009; 64(2):231-6.

− Mattsson P, Tenhunen T. 2003. Purification of His-tagged proteins from inclusion bodies using QuickPickTM IMAC. Nota técnica, protein chemistry.

− Mayordomo I, Randez-Gil F, Prieto JA. Isolation, purification, and characterization of a cold-active lipase from Aspergillus nidulans. J Agric Food Chem. 2000; 48:105-9.

− Miroux B, Walker JE. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 1996; 260(3):289-298.

− Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol.1987; 155:335-50.

− Nardini M., Dijkstra BW. α/β hydrolase fold enxymes: the family keeps growing. Curr. Opin. Struct. Biol. 1999; 9: 732-737.

− New England Biolabs. pMAL Protein Fusion and Purification System. 5.3 version. U.S.-Canadá- Alemania-Reino Unido-Japon-China. 2006.

− Novagen. pET System Manual. 10ª Edición. U.S.-Canadá- Alemania-Reino Unido. 2006. − Nthangeni MB, Ramagoma F, Tlou MG, Litthauer D. Development of a versatile cassette for

directional genome walking using cassette ligation-mediated PCR and its application in the cloning of complete lipolytic genes from Bacillus species. J. Microbiol. Methods. 2004; 61: 225-34.

− Olsen GJ, Woese CR. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB J 1993; 7 : 1 1 3-2 3 − Page RDM. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers.

Comput. Appl. Biosci. 1996; 12:357-358. − Pandey A, Benjamin S, Soccol CR, Nigam P, Krieger N, Soccol VT The realm of microbial

lipases in biotechnology. Biotechnol Appl Biochem. 1999; 29: 119-31. − Parra LP, Reyes F, Acevedo JP, Salazar O, Andrews BA, Asenjo JA. Cloning and fusion

expression of a cold-active lipase from marine Antarctic origin. Enzyme and Microbial Technology. 2008 42, 371-377.

− Pittman MS, Robinson HC, Poole RK. A bacterial glutathione transporter (Escherichia coli CydDC) exports reductant to the periplasm. J Biol Chem. 2005; 280(37): 32254-61.

− Pleiss J, Fischer M. and Schmid RD. Anatomy of lipase binding sites: the scissile fatty acid binding site. Chem. Phys. Lipids. 1998 93: 67–80.

− Pleiss J, Fischer M, Peiker M, Thiele C, Schmid RD. Lipase Engineering Database—understanding and exploiting sequence-structure-function relationships. J. Mol. Catal. B-Enzym. 2000; 10: 491–508.

− Rahman RN, Chin JH, Salleh AB, Basri M. Cloning and expression of a novel lipase gene from Bacillus sphaericus 205y. Mol Genet Genomics. 2003; 269(2):252-60.

− Rishi AS, Nelson ND, Goyal A. Genome walking of large fragments: an improved method. J. Biotechnol. 2004; 111:9-15.

105

− Rose TM, Schultz ER, Henikoff JG, Pietrokovski S, McCallum CM, Henikoff S. Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences. Nucleic Acids Res. 1998; 26:1628-35.

− Saïda F, Uzan M, Odaert B, Bontems F. Expression of highly toxic genes in E.coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 2006; 7(1):47-56.

− Saito K, Nishiwaki A, Sugawara K. Nested PCR Amplificationof Arbuscular Mycorrhizal Fungal 18S rRNA Genes from Field-collected Roots. Grassland Science. 2001; 47(1): 1-8.

− Salazar O, Molitor J, Lienqueo ME, Asenjo JA. Overproduction, Purification, and Characterization of β-1,3-Glucanase Type II in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 23; 219-225. 2001

− Sambrook J, Fristsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press. Second edition.

− Saxena RK, Sheoran A, Giri B, Davidson WS. Purification strategies for microbial lipases. J Microbiol Methods. 2003; 52:1-18.

− Sektas, M. and Szybalski, W. Novel single-copy pETcocoTM vector with dual controls for amplification and expression. Innovations. 2002; 14:6–8.

− Schmidt-Dannert C, Pleiss J, Schmid RD. A toolbox of recombinant lipases for industrial applications. Ann N Y Acad Sci. 1998; 13;864:14-22.

− Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnol Adv. 2001; 19:627-62.

− Sheridan PP, Panasik N, Coombs JM, Brenchley JE. Approaches for deciphering the structural basis of low temperature enzyme activity. Biochim Biophys Acta. 2000; 154:417-433.

− Sierra G. A simple method for the detection of lipolytic activity of micro-organisms and some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates. Antonie Van Leeuwenhoek. 1957; 23:15-22.

− Stancombe PR, Alexander FC, Ling R, Matheson MA, Shone CC, Chaddock JA. Isolation of the gene and large-scale expression and purification of recombinant Erythrina cristagalli lectin. Protein Expr Purif. 2003; 30(2):283-92.

− Suzuki T, Nakayama T, Choo DW, Hirano Y, Kurihara T, Nishino T, Esaki N. Cloning, heterologous expression, renaturation, and characterization of a cold-adapted esterase with unique primary structure from a psychrotroph Pseudomonas sp. strain B11-1. Protein Expr Purif. 2003; 30(2):171-8.

− Starr MP. Spirit Blue agar: a medium for the detection of lipolytic microorganisms. Science. 1941; 93:333-334.

− United Nations. The Convention on Biological Diversity (Article 2. Use of Terms). 1992. − Villeneuve P, Muderhwa JM, Graille J, Haas MJ, Customizing lipases for biocatalysis: a

survey of chemical, physical and molecular biological approaches. J Mol Catal B Enzym. 2000; 9:113–148.

− Warburg O, Christian W. Isolation and crystallization of enolase. Biochem. Z. 1942; 310:384-421.

− Wei Y, Contreras JA, Sheffield P, Osterlund T, Derewenda U, Kneusel RE, Matern U, Holm C, Derewenda ZS. Crystal structure of brefeldin A esterase, a bacterial homolog of the mammalian hormone-sensitive lipase. Nat Struct Biol. 1999; 6(4):340-5.

− Welply JK, Fowler AV, Zabin I. beta-Galactosidase alpha-complementation. Effect of single amino acid substitutions. J Biol Chem. 1981; 10;256(13):6811-6.

− Woese CR. Bacterial evolution. Microbiol Rev 1987;51:221-7. − Wu XY, Seppälä J, Linko YY. Lipase-catalyzed polyester synthesis. Biotechnol. Tech. 1996;

10: 793–798. − Zhang Y, Skolnick J. Scoring function for automated assessment of protein structure

template quality. Proteins. 2004; 57:702-710. − Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics. 2008;

9:40.

106

VII. ANEXO

VII.1 Curvas de calibración

VII.1.1 Curvas de calibración de crecimiento de biomasa

Figura 43. Curva de calibración de masa seca de bacterias E. coli BL21(DE3) /

LipE5pET22. Unidades de absorbancia a 600 nm v/s peso seco de bacterias (mg/mL).

Figura 44. Curva de calibración de masa seca de bacterias E. coli BL21(DE3) /

LipE5pMAL-c2E. Unidades de absorbancia a 600 nm v/s peso seco de bacterias (mg/mL).

Figura 45. Curva de calibración de masa seca de cepa bacteriana marina antártica E5.

Unidades de absorbancia a 600 nm v/s peso seco de bacterias (mg/mL).

107

VII.1.2 Curva de calibración ensayo de Bradford

Figura 46.. Curva de calibración de concentración de BSA. Razon unidades de absorbancia a

DO465 / DO595 – Blanco v/s Concentración de BSA (mg/mL). VII.1.3 Curva de calibración ensayo de actividad lipolítica en medio líquido

Figura 47. Curva de calibración concentración de ρρρρ-nitrofenol. Unidades de absorbancia a

405 nm v/s ρ-nitrofenol (mM).

VII.1.4 Curva de calibración cromatografía por filtración en gel

Figura 48. Curva de calibración determinación de tamaño molecular.

Peso Molecular (kDa) v/s Volumen de elución (mL).

108

VII.2 Secuencias nucleotídicas parciales de ADNr 16S

VII.2.1 Cepa A19 >ADNr 16S A19

ATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA

GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA

AAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGCGTGGTGGTTAATACCCATCATGTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGGAG

CCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGC

TCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAA

GGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCC

ACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAGGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAA

GGTCAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGAC

ATACAGAGAACTTACAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGT

TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT

GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGCAAGC

GAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC

VII.2.2 Cepa B2 >ADNr 16S B2

GCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCACTTTAAGTGATTCGCTTACTCTCGCGAGTT

CGCAGCACTCTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTAT

CACCGGCAGTCTCCTTAGAGTTCTCAGCATTACCTGCTAGCAACTAAGGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACAAC

ACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAACCATCTCTGGTAAGTTCTCTGTATGTCAAGTGTAGGTAAG

GTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCC

CAGGCGGTCTACTTAATGCGTTAGCTTTGAAAAACAGAACCGAGGCTCCGAGCTTCTAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCGGGGTATC

TAATCCCGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTACATGAGCGTCAGTGTTGACCCAGGTGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTTCAGATCTCTACGCA

TTTCACCGCTACACCTGAAATTCTACCACCCTCTATCACACTCTAGTTTGCCAGTTCGAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACA

TCTCGCTTAACAAACCGCCTGCGTACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCAGCTGGCACGGAGTT

AGCCGGTGCTTCTTCTGTCAGTAACGTCACAGCTAGCAGGTATTAACTACTAACCTTTCCTCCTGACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCT

TCTTCACACATGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGT

CCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAAACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCCTACCAACTAGCTAAT

VII.2.3 Cepa B9 >ADNr 16S B9

GATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCC

GGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGT

AAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACTCCGTGGTTAATACCCACGGACGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

TACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGCTCTATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGG

GAGCTGCATCTGAAACTGTAGAGCTAGAGTATGTGAGAGGAAGGTAGAATTCCAGGTATAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCG

ATGGCGAAGGCAGCCTTCTGGCATAATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA

ACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAA

CTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAG

AATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC

CGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACG

ACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTC

AAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGAATCA

VII.2.4 Cepa E5 >ADNr 16S E5

TCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGGAGTCGAGTTGCAGACTCCGATCCGGACTACGACGTACTTTGTGAGATTAGCTCCACCTCGCGG

CTTTGCAACCCTCTGTATACGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTT

TATCACCGGCAGTCTCCCTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAAATAAGGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCAC

AACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACAAGTCCATCTCTGGTCTCTTCTGTGGATGTCAAGAGTAGGT

AAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACT

CCCCAGGCGGTCTACTTAATGCGTTAGCTTGGGAGCCCAGTGACTAAGTCACCAAACTCCGAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGG

TATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATATCTA

CGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGTTCGCCAGTTCCAAATGCAATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTT

CACATCTGGCTTAACAAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGGACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGG

AGTTAGCCGGTCCTTCTTCTGTAGGTAACGTCACAATAACGTGCTATTAACACGCTACCTTTCCTCCCTACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAG

GCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCT

CAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGAACAGCTAGGAATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCCTACCAACTAGCTAATC

109

VII.2.5 Cepa E13 >ADNr 16S E13

ATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA

GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA

AAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGTGATGTGTTAATAGCACATTGCTGTGACGTTACCTACAGAAGAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG

CCGCGGTAATACGGAGGGTCCGAGCGTTAATCGGAGTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGCCAGATGTGAAATCCCCGGGC

TCAACCTGGGAATTGCATTTGGAACTGGCGAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGA

GGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC

ACGCCGTAAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGACTTAGTCACTGGGCTCCCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCA

AGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAGTTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGA

CATCCACAGAAGAGACCAGAGATGGACTTGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGG

GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAATTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAG

GTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAGAGGGTTGCAAAGCCGCGAGGTGGA

GCTAATCTCACAAAGTACGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGAATC

VII.2.6 Alineamiento Secuencias nucleotídicas parciales del ADNr 16S

Figura 49. Alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas parciales del ADNr 16S de

las 5 cepas bacterianas antárticas.

110

VII.3 Secuencias de genes codificantes de lipasas obtenidos

VII.3.1 Mediante Genome Walking

VII.3.1.1 Secuencia nucleotídica parcial (89%) del gen codificante de lipasa de la cepa E5

>E5 GW

AAGCGAAACAATTAATGGTCGCCAAGTGGTTGTCATTAGCGCCGTTATACAAGTTACCAGTCACATTATTCAGATATGTATTTCTAGCGATGGA

CCGAGTACTTGGGCTGACTAAAATTGAAATGGATAAGGTGATTAATTTAACGGTTCCGGTGAGCACTGGCACTCCTCTTATGGGCACTATTCCT

TTGAACGGACATAGCGCCAGTGATAGCAGCCATACCATCGCTAACAGAATAAAGCTTCGCATCTACCATCCTAGCTCCACCAAACCTCAAAAAA

CCTTAGTGTACTTTCACGGTGGCGGCGGCGTTATTGGGAGTATTAACACTCACGATCACTTTTGCCGCTATCTGGCTAAACATGGCAACATGAA

CATTATCTCAGTCGGGTATCGACTGGCTCCAGAACATAAATTCCCCATCCCGATTTGTGATGCCATCGAAGCGTGGAACTATATCAACACTAAC

CATCAACAACTTAATATTAATCCACAGCACATTGGCGTGGGTGGTGACAGCGCAGGTGGGTATTTAGCATGTATCATCGGTTTACATTCACTGC

AAACATCACTGCCAGTACAGGCAAAAGTAAAACCCGCATTTCAGTTTTTAATCTACCCAATGGTAGATTTACAAGGCTTAACCGAGTCTTATCG

CCGTTTCAATAAACAGTTAATACTCACCCGCGATTTAATGGATTATTTCAGGTTAAAATATTTACACTCTCTCGACGAAGTCACTCTGCCATTA

GTGAGTCCACTGCAAGCAGCAGACATTAGCGAATCGCCAAAAAGCTACATATTAACCCTAGGTTACGATCCATTAAGGGATGATGGCATTGCAT

ATGCGCAGCGCCTAAAAGCGGCAGGCATCAATACACAACATCAGCATTTGGATGATTGCATGCATGGCTTTATTTCAATCACAAAACTCAGCCC

GCGCGCCAAACAAGCCACTCATAACATAGCAATGGGATTAAACAGCTTTAATGAA

VII.3.1.2 Secuencia nucleotídica del gen codificante de lipasa de la cepa E13

>E13 GW

ATGGATAACCTTAATAAACCAACATCATTGTCACAAGACAAATCAACAACTGACAAGCCATCACTAAACCAACCACTGCAAGGCGAGCCGCTAC

AAGGCAAACGTCTACAAGCACCCAAGCTTGAAGCGAAACAATTAATGGTCGCCAAGTGGTTATCATTAGCGCCGCTATACAAGTTGCCGGTCAC

ATTATTCAGATATGTATTTCTAGCGATGGGCCGAGTACTGGGGCTGACTAAAATTGAAATGGATAAAGTGATTAATTTAACGGTTCCGGTGAGT

ACTGGCACTCCTCTTTTGGGCACTATTTCTTTGAACGAACATAGCGCCAGCGATAGCAGCCATACCATCGCTAACGGAATAAAGCTTCGCATCT

ACCATCCTAGCGCCAGCAAACCGCAAAAAACCTTAGTATACTTTCACGGTGGCGGCGGCGTTATTGGCAGTATTAACACTCACGATCACTTTTG

CCGCTATCTGGCTAAACATGGCAACATGAACATTATCTCCGTAGGTTATCGGCTGGCTCCAGAACATAAATTCCCCATCCCGATTTGTGATGCC

ATCGAAGCGTGGAACTATACTAATATCAATCATCAACAACTTAATATTAACCCACAACACATAGGCGTGGGTGGTGACAGCGCAGGTGGGTATT

TAGCATGTATCATCGGTTTACATTCACTGCAAACATCACTGCCAGTACAGGCAAAAGTAAAACCCGCATTTCAGTTTTTAATCTACCCAATGGT

AGATTTACAAGGCTTAACCGAGTCTTATCGCCGTTTCAATAAACAGTTAATACTCACCCGCGATTTAATGGATTATTTCAGGTTAAAATATTTA

CACTCTCTCGACGAAGTCACTCTGCCATTAGTGAGTCCACTGCAAGCAGCAGACATTAGCGAATCGCCAAAAAGCTACATATTAACCCTAGGTT

ACGATCCATTAAGGGATGATGGCATTGCATATGCGCAGCGCCTAAAAGCGGCAGGCATCAATACACAACATCAGCATTTGGATGATTGCATGCA

TGGCTTTATTTCAATCACAAAACTCAGCCCGCGCGCCAAACAAGCCACTCATAACATAGCAATGGGATTAAACAGCTTTAATGAATGA

VII.3.2 Mediante partidores diseñados en base a secuencia del gen codificante de lipasa de

Shewanella frigidimarina

VII.3.2.1 Cepa A19

>A19 Shew

ATGGATAACATTAATAAGCCAACACCATTGTCACAAGATAAATCACCATCTGACAAGCCGTCGCAAAACGAACTACCACAAGACGAACCGCGAC

AAGGCAAACGTCTACAAGCGTCCAAGCTTGAAGCGAAACAATTAATGGTCGCCAAGTGGTTGTCATTAGCGCCGTTATACAAGTTACCAGTCAC

ATTATTCAGATATGTATTTCTAGCGATGGACCGAGTACTTGGGCTGACTAAAATTGAAATGGATAAGGTGATTAATTTAACGGTTCCGGTGAGC

ACTGGCACTCCTCTTATGGGCACTATTCCTTTGAACGGACATAGCGCCAGTGATAGCAGCCATACCATCGCTAACAGAATAAAGCTTCGCATTT

ACCATCCTAGCTCCACCAAACCTCAAAAAACTTTAGTGTACTTTCACGGTGGCGGCGGCGTTATTGGCAGTATTAACACTCACGATCACTTTTG

CCGCTATCTGGCTAAACATGGCAACATGAACATTATCTCAGTCGGGTATCGACTGGCTCCAGAACATAAATTCCCCATCCCGATTTGTGATGCC

ATCGAAGCGTGGAACTATATCAACACTAACCATCAACAACTTAATATTAATCCACAGCACATTGGCGTGGGTGGTGACAGCGCAGGTGGGTATT

TAGCATGTATCATCGGTTTACATTCACTGCAAACATCACTGCCAGTACAGGCAAAAGTAAAACCCGCATTTCAGTTTTTAATCTACCCAATGGT

AGATTTACAAGGCTTAACCGAGTCTTATCGCCGTTTCAATAAACAGTTAATACTCACCCGCGATTTAATGGATTATTTCAGGTTAAAATATTTA

CACTCTCTCGACGAAGTCACTCTGCCATTAGTGAGTCCACTGCAAGCAGCAGACATTAGCGAATCGCCAAAAAGCTACATATTAACCCTAGGTT

ACGATCCATTAAGGGATGATGGCATTGCATATGCGCAGCGCCTAAAAGCGGCAGGCATCAATACACAACATCAGCATTTGGATGATTGCATGCA

TGGCTTTATTTCAATCACAAAACTCAGCCCGCGCGCCAAACAAGCCACTCATAACATAGCAATGGGATTAAACAGCTTTAATGAA

111

VII.3.2.2 Cepa B9

>B9 Shew

CCGGATAACATTAATAAGCCAACACCATTGTCACAAGATAAATCATCATCTGACAAGCCATCGCAAAACGAACTACCACAAGACGAACCGCGAC

AAGGCAAACGTCTACAAGCGTCCAAGCTTGAAGCGAAACAATTAATGGTCGCCAAGTGGTTGTCATTAGCGCCGTTATACAAGTTACCAGTCAC

ATTATTCAGATATGTATTTCTAGCGATGGACCGAGTACTTGGGCTGACTAAAATTGAAATGGATAAGGTGATTAATTTAACGGTTCCGGTGAGC

ACTGGCACTCCTCTTATGGGCACTATTCCTTTGAACGGACATAGCGCCAGTGATAGCAGCCATACCATCGCTAACAGAATAAAGCTTCGCATCT

ACCATCCTAGCTCCACCAAACCTCAAAAAACCTTAGTGTACTTTCACGGTGGCGGCGGCGTTATTGGCAGTATTAACACTCACGATCACTTTTG

CCGCTATCTGGCTAAACATGGCAACATGAACATTATCTCAGTCGGGTATCGACTGGCTCCAGAACATAAATTCCCCATCCCGATTTGTGATGCC

ATCGAAGCGTGGAACTATATCAACACTAACCATCAACAACTTAATATTAATCCACAGCACATTGGCGTGGGTGGTGACAGCGCAGGTGGGTATT

TAGCATGTATCATCGGTTTACATTCACTGCAAACATCACTGCCAGTACAGACAAAAGTAAAACCCGCATTTCAGTTTTTAATCTACCCAATGGT

AGATTTACAAGGCTTAACCGAGTCTTATCGCCGTTTCAATAAACAGTTAATACTCACCCGCGATTTAATGGATTATTTCAGGTTAAAATATTTA

CACTCTCTCGACGAAGTCACTCTGCCATTAGTGAGTCCACTGCAAGCAGCAGACATTAGCGAATCGCCAAAAAGCTACATATTAACCCTAGGTT

ACGATCCATTAAGGGATGATGGCATTGCATATGCGCAGCGCCTAAAAGCGGCAGGCATCAATACACAACATCAGCATTTGGATGATTGCATGCA

TGGCTTTATTTCAATCACAAAACTCAGCCCGCGCGCCAAACAAGCCACTCATAACATAGCAATGGGATTAAACAGCTTTAATGAA

VII.3.2.3 Cepa E5

>E5 Shew

ATGGATAACATTAATAAGCCAACACCATTGTCACAAGATAAATCATCATCTGACAAGCCGTCGCAAAACGAACTACCACAAGACGAACCGCGAC

AAGGCAAACGTCTACAAGCGTCCAAGCTTGAAGCGAAACAATTAATGGTCGCCAAGTGGTTGTCATTAGCGCCGTTATACAAGTTACCAGTCAC

ATTATTCAGATATGTATTTCTAGCGATGGACCGAGTACTTGGGCTGACTAAAATTGAAATGGATAAGGTGATTAATTTAACGGTTCCGGTGAGC

ACTGGCACTCCTCTTATGGGCACTATTCCTTTGAACGGACATAGCGCCAGTGATAGCAGCCATACCATCGCTAACAGAATAAAGCTTCGCATCT

ACCATCCTAGCTCCACCAAACCTCAAAAAACCTTAGTGTACTTTCACGGTGGCGGCGGCGTTATTGGGAGTATTAACACTCACGATCACTTTTG

CCGCTATCTGGCTAAACATGGCAACATGAACATTATCTCAGTCGGGTATCGACTGGCTCCAGAACATAAATTCCCCATCCCGATTTGTGATGCC

ATCGAAGCGTGGAACTATATCAACACTAACCATCAACAACTTAATATTAATCCACAGCACATTGGCGTGGGTGGTGACAGCGCAGGTGGGTATT

TAGCATGTATCATCGGTTTACATTCACTGCAAACATCACTGCCAGTACAGGCAAAAGTAAAACCCGCATTTCAGTTTTTAATCTACCCAATGGT

AGATTTACAAGGCTTAACCGAGTCTTATCGCCGTTTCAATAAACAGTTAATACTCACCCGCGATTTAATGGATTATTTCAGGTTAAAATATTTA

CACTCTCTCGACGAAGTCACTCTGCCATTAGTGAGTCCACTGCAAGCAGCAGACATTAGCGAATCGCCAAAAAGCTACATATTAACCCTAGGTT

ACGATCCATTAAGGGATGATGGCATTGCATATGCGCAGCGCCTAAAAGCGGCAGGCATCAATACACAACATCAGCATTTGGATGATTGCATGCA

TGGCTTTATTTCAATCACAAAACTCAGCCCGCGCGCCAAACAAGCCACTCATAACATAGCAATGGGATTAAACAGCTTTAATGAA

VII.3.3 Alineamiento multiple de las secuencias nucleotídicas de los genes codificantes de lipasas de las cepas A19, B2,B9, E5, E13 y Shewanella frigidimarina

Figura 50. Alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas de los 4 genes codificantes de lipasas obtenidos y el de Shewanella frigidimarina.