UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES Departamento de … · La denominación de los agrupamientos y algunos ejemplos se citan en el cuadro siguiente: Diplococos (pares de cocos) Cadenas

Microbiología General

UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES Departamento de Ciencia y Tecnología MICROBIOLOGÍA GENERAL

Trabajo Práctico Nº 1: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología. Técnicas de Esterilización. Las prácticas de laboratorio de este curso requieren la manipulación de organismos vivos, por lo que a efectos de proteger a las personas de posibles infecciones y al material contra contaminaciones, es fundamental la implementación de técnicas microbiológicas apropiadas.

Considerar que todas las muestras son peligrosas (los microorganismos son

potencialmente patógenos dependiendo de las circunstancias y la dosis) y como tales hay que tratarlas.

Las siguientes consideraciones deben tenerse siempre presentes en cualquier tipo de manipulación de material biológico:

Las manos toman contacto con distintas fuentes de infección, y sin que tengamos noción clara de sus movimientos las llevamos a la boca o a los ojos. Debe eliminarse la costumbre de morder lápices que se apoyan en cualquier superficie debe eliminarse.

El laboratorio no es un lugar apto para el consumo de alimentos o bebidas, ya que

existe la posibilidad de ingerir sustancias contaminadas por accidente. DENTRO DEL LABORATORIO: - NO FUMAR - NO BEBER - NO COMER - NO MAQUILLARSE

No pipetear jamás con la boca ningún medio de cultivo (inoculado o no) o reactivo químico. Para esta tarea se deberá hacer uso de propipetas.

Cuando se ingresa al laboratorio sólo deberán llevar guardapolvos, cuadernos de

apuntes, guía de trabajos prácticos, lápices y rotuladores. Por ningún motivo se deben dejar libros, mochilas o bolsos sobre las mesadas.

Las mesadas deben decontaminarse al comenzar y al finalizar el trabajo práctico y

en caso de derrame de cualquier sustancia potencialmente peligrosa.

Se deben lavar las manos con jabón o detergente líquido y secarlas con toallas de papel al inicio del práctico, después de haber manipulado material infeccioso y al abandonar el laboratorio.

Si la tarea lo requiere, se deben utilizar guantes quirúrgicos que disminuyen la

posibilidad de contaminación o lastimaduras.

El uso del guardapolvo debe estar restringido únicamente al interior del laboratorio. El guardapolvo debe lavarse periódicamente y, a fin de evitar el contacto con la ropa de calle, se debe guardar en bolsas de polietileno limpias.

Las puertas y ventanas del laboratorio se deberán mantener siempre cerradas para

evitar la contaminación proveniente de corrientes de aire.


No colocar los instrumentos contaminados (tales como ansas y pipetas), directamente sobre las mesadas. Las ansas deben esterilizarse por incineración en la llama del mechero. Las pipetas y las puntas de las micropipetas deberán colocarse, una vez utilizados, en los recipientes de descarte que contienen hipoclorito.

Todos los materiales se decontaminarán antes de eliminarlos o de limpiarlos para

su reutilización.

Una vez finalizado el trabajo práctico todo el material utilizado debe colocarse en bateas plásticas con desinfectante para luego lavarse con detergente y enjuagarse con agua corriente.

Bajo ningún concepto se debe dejar material contaminado sobre las mesadas. Al

finalizar el práctico el encargado del grupo deberá ubicar las botellas con medio de cultivo y el resto de los materiales en el lugar donde le indicará el instructor.

Siempre se deberá trabajar con el cabello recogido, para mayor seguridad se

recomienda el uso de cofias.

Cuando sea necesario transportar tubos de ensayo hacerlo siempre en gradillas, para evitar posibles accidentes y la contaminación de los mismos.

Si se rompen frascos o cajas que contienen cultivos cubrir inmediatamente estos

con toallas de papel absorbente y saturarlas con solución desinfectante, luego de 15 minutos remover las toallas y desechar los residuos envolviéndolos en papel y colocarlos en las bolsas de residuos adecuadas para su posterior inactivación en autoclave.

Para rotular el material deberán utilizarse etiquetas o cintas adecuadas. El rótulo

sobre vidrio comúnmente desaparece en el proceso de autoclavado del material.

Durante el práctico se debe hablar sólo lo imprescindible, ya que la saliva es una fuente importante de contaminantes. Por la misma razón se debe reducir al mínimo el movimiento en el laboratorio.

Si se trabaja con cultivos de hongos u otros microorganismos esporulantes, la

manipulación de los mismos deberá ser rápida y eficiente para evitar la diseminación de esporas en el ambiente del laboratorio.

USO DEL AUTOCLAVE

Esterilización por calor húmedo: Este procedimiento se lleva a cabo en aparatos denominados autoclaves. Se utiliza el vapor de agua como agente conductor del calor y es el método más empleado en Microbiología. La operación puede llevarse a cabo a presión atmosférica (100ºC) o a presiones superiores, lográndose así temperaturas más elevadas. En el manómetro del autoclave el cero corresponde a la presión atmosférica. Cuando el manómetro marca una atmósfera, a esa presión hay que sumarle la presión atmosférica para obtener la presión real. La relación entre la presión que marca el manómetro y la temperatura alcanzada en el autoclave, esta dada en la siguiente tabla:

Temperatura (ºC) Presión (atm) 100 0 114 3/4 121 1 135 2


La esterilización se logra a temperaturas superiores a los 100ºC. Generalmente se emplea una atmósfera por encima del la presión normal, lo que corresponde a una temperatura de 121ºC. El poder de penetración del vapor a esta temperatura es muy elevado, lo suficiente como para destruir las esporas dentro de los 15 y 20 minutos. El tiempo del proceso depende del volumen a esterilizar. Existen varios tipos de autoclave; durante el trabajo práctico se utilizará el autoclave de Chamberland. AUTOCLAVE DE CHAMBERLAND Consiste en una caldera de cobre sostenida por una camisa externa metálica de forma cilíndrica en cuya parte inferior y por debajo de la caldera, se encuentra la fuente de calor (mechero a gas o resistencia eléctrica). La caldera lleva en su interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el material a esterilizar. La parte superior se cierra con una tapa de bronce que ajusta perfectamente mediante una junta de amianto grafitado o goma siliconada y una serie de tornillos de bronce. La tapa presenta tres elementos que comunican con el interior de la caldera: el manómetro, la válvula de seguridad y la llave de salida de vapor o espita. Instrucciones para su uso: 1) Colocar agua destilada en la caldera procurando que su nivel no alcance los

objetos que se colocarán en su interior. Al material a esterilizar sólo debe llegar vapor.

2) Colocar dentro de la caldera el material a esterilizar debidamente acondicionado. 3) Cerrar el autoclave ajustando los tornillos de su tapa, en posición cruzada, a fin de

asegurar un cierre parejo y hermético. De esta manera se prolonga la vida útil de la junta de la tapa, cuyo espesor debe ser homogéneo en todo su recorrido.

4) Abrir la espita y encender la fuente de calor. 5) Asegurar el correcto estado de la válvula de seguridad. La espita (permite la salida

de vapor) debe estar abierta para desalojar el aire interior, hasta que salga un chorro continuo y abundante de vapor (la temperatura de trabajo, por ejemplo 121ºC, se alcanzará a la presión de 1 atm sobre la normal si dentro del autoclave existe solamente vapor en equilibrio con líquido). Todo el aire que hubiese originalmente en el recinto debe eliminado y reemplazado por vapor. Si queda aire dentro de la cámara de esterilización, la presión de vapor será mas baja que la indica el manómetro y por lo tanto la temperatura resultará inferior a 121ºC.

6) Purgar el aparato abriendo y cerrando tres veces la espita para eliminar totalmente los restos de aire.

7) Cerrar la espita. El agua se calentará en el interior del autoclave y la presión de vapor aumentará hasta el valor deseado. Una vez alcanzada la temperatura y presión, el vapor saldrá por la válvula de seguridad.

8) Cuando se alcanza la temperatura de trabajo, debe regularse la fuente de calor para estabilizar la presión. A partir de ese momento se comienza a contar el tiempo de esterilización.

9) Al finalizar el periodo de esterilización, apagar la fuente de calor y dejar que el manómetro marque cero (presión atmosférica), recién en ese momento se puede abrir la llave de salida de vapor y luego la tapa del autoclave, para retirar el material.



Trabajo Práctico Nº2: Microscopía I. Preparación de extendidos. Manejo del microscopio óptico.

Figura 1: Componentes del microscopio óptico compuesto

Debido a que los microscopios son aparatos económicamente costosos, es necesario utilizarlos con mucho cuidado y responsabilidad. Por lo tanto desde el comienzo se deben respetar las siguientes reglas:

1. Remover todos los materiales innecesarios de la mesa de trabajo. 2. Conectar correctamente todos los cables del aparato. 3. Limpiar el sistema de lentes: Las partículas de polvo disminuyen la eficiencia

del microscopio. Los oculares deben limpiarse varias veces con papel especial para lentes; nunca deben utilizarse toallas de algodón. Si la lente de inmersión se encuentra muy sucia con aceite, limpiarla utilizando papel para lentes

A- Oculares B- Objetivos C- Condensador D- Platina E- Tornillos macro y micrométrico F- Fuente lumínica


embebido en xilol. El xilol debe removerse inmediatamente con papel para lentes embebido con etanol al 95% y luego se debe secar. El cumplimiento de los siguientes pasos aseguran un uso correcto y eficiente

del microscopio: 1. Ubicar el portaobjetos con la muestra en los clips de la platina y moverlo hacia el

centro, directamente sobre la fuente de luz. 2. Poner en posición la lente de menor aumento. Bajar el cuerpo del microscopio

hasta la distancia de trabajo apropiada. 3. Observar a través de los oculares. Con el tornillo macrométrico enfocar la muestra.

Para definir la imagen y poder observar en detalle, ajustar la misma con el tornillo micrométrico.

4. Rutinariamente también se ajusta la fuente de luz mediante una perilla o diafragma que gradúa la intensidad de la fuente lumínica.

5. La mayoría de los microscopios son bifocales, es decir que cuando una de las lentes está en foco, la otra también lo estará.

6. Una vez que se enfoca correctamente la muestra con la lente de baja resolución, la preparación puede observarse con el objetivo de inmersión. Para ello se debe colocar una gota de aceite sobre el portaobjetos, directamente sobre el área a visualizar. A continuación se ubicará el objetivo de inmersión.

7. Elevar el condensador para poder observar óptimamente la muestra. 8. Durante la observación microscópica, siempre es necesario observar varias áreas

del preparado. Esto se logra recorriendo el mismo con la lente de menor resolución, para luego realizar la observación con el objetivo de inmersión. Durante este procedimiento se deberá ir ajustando la definición de la imagen con el tornillo micrométrico. Luego de la observación es necesario limpiar todas las lentes con papel seco.

La morfología bacteriana puede examinarse de dos formas:

observando las bacterias vivas (sin coloración o utilizando colorantes muy diluidos).

observando las bacterias fijadas, como células muertas, las que se deben colorear.

MORFOLOGIA BACTERIANA La formas bacterianas básicas son tres:

Las formas mencionadas se pueden encontrar en organismos individuales o agrupados. La denominación de los agrupamientos y algunos ejemplos se citan en el cuadro siguiente:

Diplococos (pares de cocos) Cadenas de cocos Racimos (cúmulos de cocos) Tétradas (cuatro cocos) Sarcinas (paquetes cuboidales) Estreptobacilos (bacilos en cadena) Empalizada (bacilos paralelos al eje longitudinal)

Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Staphylococcus Aerococcus Sarcina Lactobacillus Corynebacterium

CocosBacilos Espirilos


La visualización de los microorganismos vivos es más difícil pues la mayoría de éstos son incoloros y carecen del contraste suficiente con el medio en el cual se encuentran.

COLORANTES Los colorantes se pueden definir químicamente como compuestos orgánicos que contienen anillos de benceno más un grupo cromóforo (grupo químico portador de color pero que no tiñe) y un grupo auxocromo (grupo químico que tiñe).

La capacidad de un colorante de unirse a componentes macromoleculares celulares, tales como proteínas o ácidos nucleicos, depende de la carga eléctrica que posee el grupo cromóforo y de la carga eléctrica del componente celular a ser coloreado.

Los colorantes ácidos son compuestos aniónicos; es decir el grupo cromóforo

exhibe carga negativa y por lo tanto se unirán fuertemente a los componentes celulares que posean carga positiva. Las proteínas celulares que poseen carga positiva se unirán al cromóforo aniónico del colorante ácido. Como ejemplo podemos citar al ácido pícrico el cual produce un cromóforo aniónico.

Los colorantes básicos son catiónicos, la ionización del grupo cromóforo exhibe

carga positiva y por lo tanto posee una alta afinidad por los componentes celulares cargados negativamente. Los ácidos nucleicos, y diferentes proteínas celulares poseen esta carga y podrán unirse al cromóforo catiónico del colorante básico. Como ejemplo se puede citar al azul de metileno, el cual produce un cromóforo catiónico. Los colorantes básicos son los que comúnmente se utilizan para las coloraciones bacterianas. La presencia de cargas negativas en la superficie bacteriana produce repulsión electrostática con la mayoría de los colorantes ácidos evitando que los mismos penetren a las células.

PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE BACTERIAS PARA COLORACIÓN

El material a ser observado debe fijarse sobre el portaobjetos. Si este procedimiento no se realiza, las células se lavarán durante los distintos pasos de la coloración. La técnica a emplear utiliza calor para adherir las células al portaobjetos, matándolas. 1. Con un ansa colocar una gota del cultivo sobre el portaobjetos. Si se trata de un

cultivo sólido, primero se coloca una gota de agua y luego se toma la muestra tocando apenas con el ansa una colonia aislada..

2. Esparcir la muestra, formando un film delgado. 3. Secar el portaobjetos al aire o manteniéndolo a 60 cm de la llama de un mechero. 4. Cuando el film esté seco, pasar el portaobjetos tres veces por la llama del mechero

rápidamente.

El agente de fijación ideal es aquél que preserva las estructuras de las células en sus respectivas formas y posiciones sin producir la aparición de artefactos. Aunque el calor es el agente de fijación más utilizado, también se pueden emplear alcoholes y otros compuestos químicos.

TINCION SIMPLE

En este tipo de coloración el extendido bacteriano se colorea con un único reactivo. Por medio de la coloración simple se puede visualizar la morfología y disposición de las células bacterianas. los colorantes más utilizados son: azul de metileno, cristal violeta y carbol fucsina.


PROTOCOLO EXPERIMENTAL Se utilizarán cultivos líquidos y sólidos de distintos microorganismos que han sido incubados durante 24-48 hs. Los reactivos a emplear serán los siguientes:

Azul de metileno Cristal violeta Carbol fucsina

PROCEDIMIENTO 1. Preparar extendidos de los organismos según la técnica descripta anteriormente.

Todos los extendidos deben ser fijados al calor. 2. Rotular con etiqueta todos los portaobjetos. 3. Ubicar el portaobjetos en la cubeta de tinción y cubrir el extendido con el colorante

indicado durante el tiempo que se menciona: Carbol fucsina: 15 a 30 segundos Cristal violeta: 20 a 60 segundos Azul de metileno: 1 a 2 minutos 4. Lavar el extendido con agua destilada para remover el exceso de colorante.

Durante este paso, mantener el portaobjetos en forma paralela al chorro de agua a fin de reducir la pérdida de microorganismos por lavado a partir de la preparación.

5. Dejar secar los extendidos al aire. 6. Observar los extendidos bajo el microscopio utilizando el objetivo de inmersión. TINCIÓN NEGATIVA La tinción negativa requiere el uso de un colorante ácido como la tinta china o la nigrosina. Este colorante posee un cromóforo cargado negativamente. Debido a que la superficie celular también posee carga negativa, el colorante no penetrará a las células. De esta forma las células no teñidas son fácilmente discernibles contra el fondo coloreado. La aplicación práctica de este tipo de tinciones es permitir la observación de forma y tamaño natural de los microorganismos ya que no se realiza fijación del material, y las células no están sujetas a los efectos del calor ni agentes químicos fijadores. Mediante esta técnica es posible ver bacterias difíciles de teñir, como algunos espirilos. PROCEDIMIENTO 1. Coloque una ansada de nigrosina cerca del borde de un portaobjetos limpio. 2. Usando técnica estéril, coloque una ansada de cultivo en la gota de nigrosina y

mezcle bien. 3. Utilizando el borde de otro portaobjetos y en ángulo de 30º empuje para formar un

extendido delgado. 4. Seque al aire sin fijación. Examine los extendidos bajo objetivo de inmersión. OBSERVACIONES Y RESULTADOS 1. Elegir un campo representativo para cada organismo. 2. Dibujar la morfología y disposición que se observó a escala. 3. Presentar un informe con los diagramas, descripciones y conclusiones obtenidas.



Trabajo Práctico Nº3: Microscopía II: Coloraciones simples, diferenciales y especiales. TINCIONES DIFERENCIALES Las coloraciones diferenciales requieren el uso de al menos tres reactivos químicos que se aplican secuencialmente al extendido fijado. El primer reactivo se conoce como colorante primario. Su función es la de impartir color a todas las células. El segundo reactivo es el agente decolorante y para establecer contraste se utiliza como tercer reactivo, un segundo colorante. 1) TINCION DE GRAM La coloración diferencial más importante utilizada en bacteriología es la tinción de Gram, llamada así en honor al investigador que la desarrolló. Esta coloración divide a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas, clasificación es de importancia para la diferenciación e identificación de las bacterias. La coloración de Gram utiliza cuatro reactivos. COLORANTE PRIMARIO: CRISTAL VIOLETA: es un colorante básico que tiñe a las células de color violeta. MORDIENTE: IODURO DE GRAM (LUGOL): Este reactivo forma un complejo insoluble cuando se une al colorante primario. AGENTE DECOLORANTE: ALCOHOL–ACETONA: Este reactivo sirve tanto como solvente de lípidos y como agente deshidratante. CONTRACOLORANTE: SAFRANINA: Este es el reactivo final, se utiliza para colorear de rojo o rosado a aquellas células que fueron previamente decoloradas. Unicamente las Gram negativas podrán tomar éste color, en tanto que las Gram positivas retendrán el color púrpura del colorante primario. Las diferencias observadas entre bacterias Gram positivas y Gram negativas se deben a la naturaleza física de sus paredes celulares. El peptidoglucano en sí mismo no se tiñe, sino que actúa aparentemente como barrera de permeabilidad previniendo la pérdida de cristal violeta. Durante el procedimiento las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se tratan con ioduro para promover la retención del colorante. En las Gram positivas, el decolorante encoge los poros de la gruesa capa de peptidoglucano, de forma que el complejo cristal violeta- ioduro es retenido durante la decoloración y las bacterias permanecen púrpura. En cambio el peptidoglucano de las Gram negativas es muy delgado, con menor número de puentes peptídicos y tiene poros de mayor tamaño que las Gram positivas. El tratamiento con decolorante también puede extraer suficientes lípidos de la membrana externa de la pared Gram negativa e incrementar aún más la porosidad de la pared. Por estas razones la solución decolorante remueve más fácilmente el complejo colorante- mordiente a partir de las bacterias Gram negativas. 1. El paso más crítico en el procedimiento de esta tinción, es la decoloración, en la

cual el complejo CV-I será liberado de las células. Una sobre decoloración puede resultar en la pérdida del colorante primario, apareciendo las bacterias Gram positivas como Gram negativas. Una decoloración ineficiente no removerá por


completo el complejo CV-I, produciendo que los organismos gram-negativos aparezcan como Gram positivos.

2. Es necesario que los extendidos se laven con agua entre las aplicaciones de los

reactivos. Esto remueve el exceso de los mismos y prepara al extendido para el próximo paso de coloración.

3. Las mejores preparaciones de Gram se obtienen a partir de cultivos frescos, es

decir, a partir de cultivos que no exceden las 48 horas de incubación. Cuando los cultivos son viejos, especialmente si se trata de bacterias Gram positivas, los microorganismos tienen la tendencia de perder su capacidad de retener el colorante primario y pueden aparecer como Gram variables, esto quiere decir que bajo el microscopio algunas células aparecerán púrpuras y otras rosadas o rojas.

PROCEDIMIENTO 1. Limpiar adecuadamente los portaobjetos en los cuales se realizarán los

extendidos. 2. Mediante técnica estéril, preparar extendidos de cada uno de los microorganismos

en forma separada. 3. Preparar un extendido que consista en una mezcla de una bacteria Gram positiva

y Gram negativa, esto se realiza colocando una gota de agua sobre el portaobjetos y luego transferir una ansada de cada uno a la gota de agua. Mezclar y expandir el inóculo con movimientos circulares del ansa.

4. Secar los extendidos al aire y fijarlos por calor. 5. En la batea de coloración, cubrir el extendido con cristal violeta durante 1 minuto. 6. Lavar con agua, recordando que el chorro de la misma debe correr en forma

paralela a la superficie del extendido. 7. Cubrir el extendido con solución lugol durante 1 minuto. 8. Lavar nuevamente con agua. 9. Decolorar con la solución etanol/acetona. 10. Lavar con agua. 11. Cubrir con safranina durante 45 segundos. 12. Dejar secar el extendido al aire. 13. Examinar en el microscopio con objetivo de inmersión. OBSERVACIONES Y RESULTADOS 1. Dibujar las observaciones realizadas, indicando la amplificación total utilizada. Describir las observaciones de acuerdo a la morfología y disposición de las células. 2. Describir el color observado en cada caso. 3. Clasificar los microorganismos observados en Gram positivos y Gram negativos.

Escherichia coli

Diagrama de un campo representativo


Morfología celular: Forma Arreglo celular Color Reacción de Gram

2) TINCION DE BACTERIAS (bacilos) ACIDO ALCOHOL RESISTENTES (BAAR) TECNICA ZIEHL-NEELSEN La mayoría de las bacterias se colorean por tinción simple o por tinción de Gram, pero existen algunas especies de los géneros Mycobacterium y Nocardia que son resistentes a estas coloraciones y pueden teñirse calentándolos con carbolfucsina. El calentamiento permite la entrada del colorante dentro de las células. Una vez que las mismas han tomado la carbolfucsina, resisten la decoloración aún aplicando una mezcla de ácido-alcohol como agente decolorante. Como consecuencia de esta propiedad, estos organismos se clasifican como ácido-alcohol resistentes y se visualizan de color rojo, en tanto que si el colorante puede ser extraído por el decolorante, los microorganismos se clasifican como acido-alcohol no resistentes y utilizando esta técnica aparecerán celestes debido a la contracoloración con azul de metileno. Esta diferencia característica entre las micobacterias y los otros microorganismos se debe al alto contenido lipídico de la pared celular de las primeras, en la que el peptidoglucano está unido mediante enlaces covalentes a un polímero de ácido micólico- galactosa- arabinosa. M.tuberculosis y M. leprae representan bacterias que son patogénicas para los humanos, esta técnica es de vital importancia para el diagnóstico y la identificación de estos organismos. COLORANTE PRIMARIO: CARBOL FUCSINA: La carbol fucsina es un colorante fenólico que es soluble en la cera de las paredes de las micobacterias, por lo tanto puede penetrarlas y permanecer retenida en ellas. La penetración de este colorante es intensificada mediante tratamiento con calor. Todas las células aparecerán rojas. AGENTE DECOLORANTE: ACIDO-ALCOHOL (HCl 3%-Etanol 95%): Antes de la decoloración el extendido debe enfriarse, esto permite que la cera solidifique. Una vez aplicado el agente decolorante, las células ácido-alcohol resistentes resisten la decoloración, debido a que el colorante primario es más soluble en la cera de la pared que en el agente decolorante. Por lo tanto el colorante primario será retenido y las micobacterias permanecerán rojas. Este no será el caso con los organismos ácido-alcohol no resistentes los cuales carecen de la pared de cera. El colorante primario será fácilmente removido y las células quedarán incoloras. CONTRACOLORANTE: AZUL DE METILENO: Este colorante es utilizado como el reactivo final que colorea a las células incoloras. Las células ácido-alcohol resistentes, debido a la composición de su pared no serán teñidas por este colorante, estas se verán color fucsia ya que previamente fueron teñidas con el colorante primario.


PROCEDIMIENTO 1) Limpiar adecuadamente los portaobjetos en los cuales se realizaran los

extendidos. 2) Mediante técnica estéril, preparar extendidos de cada uno de los microorganismos

en forma separada. 3) Secar al aire y fijar por calor. 4) Cubrir el extendido con carbol fucsina e incubar bajo calor durante 5 minutos.

Precaución: Se debe evitar que el colorante se evapore, agregar más si es necesario. También se debe evitar que el colorante hierva. Esto se logra controlando la temperatura de calentamiento.

5) Lavar el extendido con agua. Enfriar el extendido. 6) Decolorar con ácido-alcohol. Este reactivo se agrega gota a gota hasta que los

restos de carbol fucsina desaparezcan del extendido. 7) Lavar con agua. 8) Cubrir el extendido con azul de metileno durante 2 minutos. 9) Lavar con agua. 10) Secar al aire y observar al microscopio bajo objetivo de inmersión. TINCIONES ESPECIALES Este tipo de procedimientos se utiliza para poner en evidencia algunas estructuras subcelulares. La mayoría de las técnicas utilizan más de un colorante en forma secuencial.

a) Técnicas para tinción de esporas

TÉCNICA SCHAEFFER-FULTON COLORANTE PRIMARIO: VERDE DE MALAQUITA: Las cubiertas de las esporas no aceptarán fácilmente el colorante primario. Para que este pueda penetrar, es necesario aplicar calor. Luego de cubrir con el colorante primario, se debe calentar el extendido, tanto las células vegetativas como las esporas aparecerán de color verde. AGENTE DECOLORANTE: AGUA: Una vez que las esporas aceptan el colorante verde de malaquita, no podrán ser decoloradas con agua. Las esporas permanecerán verdes. Por otro lado, el colorante no muestra una alta afinidad por los componentes de las células vegetativas, el agua lo remueve y las células quedarán incoloras. CONTRACOLORANTE: SAFRANINA: Este colorante se utiliza como contraste para teñir las células vegetativas incoloras, éstas absorben el colorante y aparecerán rojas. Las esporas retendrán el color verde del colorante primario. PROCEDIMIENTO 1. Limpiar adecuadamente los portaobjetos en los cuales se realizarán los

extendidos.


2. Mediante técnica estéril, preparar extendidos de cada uno de los microorganismos en forma separada.

3. Secar los extendidos al aire y fijarlos por calor. 4. Cubrir el extendido con papel de filtro 5. Cubrir cada extendido con verde de malaquita e incubar en calor durante 2 a 3

minutos. Precaución: No se debe evaporar el colorante. Se debe evitar que el colorante hierva.

6. Enfriar los extendidos, lavar cuidadosamente con agua. 7. Cubrir cada extendido con safranina durante 30 segundos. 8. Lavar cuidadosamente con agua. 8. Secar al aire y examinar al microscopio bajo objetivo de inmersión. TÉCNICA de DORNER Esta es una técnica muy similar a la anterior y los principios teóricos son los mismos. En este caso se utiliza carbol fucsina como colorante primario, agua como decolorante y nigrosina como contracolorante. Las esporas se verán de color rojo, el resto de la bacteria incolora, sobre un fondo negro. PROCEDIMIENTO 1. Limpiar adecuadamente los portaobjetos en los cuales se realizarán los

extendidos. 2. Preparar una suspensión del cultivo a examinar en 1 ml de agua destilada. 3. Añadir 1 ml de carbol fucsina. 4. Colocar en baño de agua hirviendo durante 10 minutos. 5. Colocar una ansada de la suspensión sobre el portaobjetos. 6. Colocar una ansada de nigrosina. Mezclar y extender. 7. Dejar secar el extendido al aire. 8. Observar al microscopio bajo objetivo de inmersión.

b) Técnica de Anthony para tinción de cápsula:

La composición química de la cápsula así como su grosor, varía de acuerdo a la especie bacteriana. Por lo general, están compuestas de polisacáridos, polipéptidos y glicoproteínas. La presencia de cápsula se relaciona con la virulencia de la cepa bacteriana, ya que esta estructura protege al microorganismo de la actividad fagocítica de las células del huésped. PROCEDIMIENTO

1. Limpiar adecuadamente los portaobjetos en los cuales se realizarán los extendidos.

2. Transferir una ansada de cultivo al portaobjetos, dejar secar al aire. NO FIJAR POR CALOR

3. Colocar cristal violeta durante 4- 7 min. 4. lavar con sulfato de cobre al 20 %. 5. Dejar secar el extendido al aire. 6. Observar al microscopio bajo objetivo de inmersión.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS


1. Dibujar a escala las observaciones realizadas. Indicando la amplificación total utilizada.

2. Describir el aspecto y la localización de la cápsula

Diagrama de un campo representativo

Morfología celular: Forma Arreglo celular Color Reacción de Gram

TINCIÓN CON COLORANTE NARANJA DE ACRIDINA El colorante Naranja de Acridina es altamente carcinogénico porque se intercala en el ADN y además tiene afinidad por las cadenas de ARN mensajero. Esta propiedad se usa para determinar si una bacteria u otro organismo están metabólicamente activos o no. La producción de ARN mensajero que posteriormente se convertirá en proteínas es una medida de que el microorganismo presenta un metabolismo activo por tanto se deduce que está vivo. Si por el contrario la cantidad de ARNm es baja el colorante se une mayoritariamente al ADN dando una coloración verde lo que quiere decir que está muerto o se encuentra en un estado fisiológico metabólicamete inactivo. Al unirse al ARNm da una coloración naranja. PROTOCOLO 1. Las bacterias se lavan por centrifugación con un buffer fosfato 1M. 2. Se coloca una alícuota de 25µl de buffer fosfato 1M en un microtubo que contiene la muestra y se adiciona una alícuota igual de Naranja de acridina 0,025 %. 3. Se incuba por 10 minutos a temperatura ambiente. 4. Se colocan 10µl sobre un porta objeto se cubre con un cubre objetos y se observa

en fresco bajo microscopio de fluorescencia con luz UV. OBSERVACIONES Y RESULTADOS Dibujar a escala las observaciones realizadas. Indicando la amplificación total utilizada.



Trabajo Práctico Nº4: Técnicas para cultivo de micro organismos Objetivos: El alumno deberá familiarizarse con: 1. El equipamiento de laboratorio y los medios de cultivo necesarios para obtener y

mantener cultivos puros. 2. El manejo de material estéril y el procedimiento necesario para obtener subcultivos

de microorganismos. 3. El aislamiento de microorganismos a partir de una muestra mixta. 4. Las características morfológicas de los microorganismos crecidos en cultivos

puros.

Subcultivo: técnica aséptica

a) Flamear el ansa de inoculación. b) Quitar las tapas a los tubos y flamear la boca de los mismos. c) Enfriar el ansa y sumergirla en el caldo a fin de tomar las bacterias. Con este

inóculo, estriar la superficie de un agar inclinado; colocar las bacterias sobre un portaobjetos, distribuirlas sobre una placa de Petri o transferirlas a otro tubo con medio líquido.

d) Flamear nuevamente la boca de los tubos e) Taparlos. f) Flamear nuevamente el ansa.


En la naturaleza los microorganismos existen como poblaciones mixtas. A pesar de esto, nuestro conocimiento en microbiología se ha llevado a cabo estudiando especies aisladas, las cuales se cultivan en ambientes libres de contaminación por otras formas de vida. Los microorganismos necesitan nutrientes adecuados y un medio ambiente favorable. El medio de cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento microbiano y se deben aportar las condiciones óptimas para el mismo (pH, presión osmótica y oxigenación). Si consideramos la gran cantidad de sustratos que los microorganismos pueden metabolizar, tendremos una idea de la variedad de sustancias que se pueden utilizar como medios de cultivo. Ya que la mayoría de los estudios de laboratorio deben llevarse a cabo con cultivos puros o axénicos, debemos ser capaces de esterilizar medios y mantenerlos en dicha condición y de inocular un medio estéril con un cultivo sin contaminarlo (técnica aséptica). Debido a que los microorganismos están siempre presentes en el aire y en las superficies de los instrumentos, equipamiento y mesadas del laboratorio, pueden servir como fuente de contaminación externa e interferir con los resultados experimentales, a menos que se utilicen las técnicas apropiadas durante la manipulación del material estéril. Para la obtención de un cultivo, se transfiere un determinado número de células (inóculo) a un medio estéril. En el procedimiento de inoculación el ansa en anillo o en punta debe ser esterilizada al rojo mediante flameo en la llama del mechero, inmediatamente antes y después de la transferencia del inóculo. Este procedimiento destruye los microorganismos de la superficie de estos instrumentos. Se debe calentar completamente el ansa, y la porción inferior del mango de la misma, sobre la llama oxidante del mechero. Las bocas de los frascos y tubos que contienen medio o cultivos de microorganismos deberán flamearse inmediatamente después de abrirlos y antes de cerrarlos. Frascos y tubos no deben permanecer abiertos más de lo necesario y, mientras estén abiertos, siempre deben mantenerse cerca de la llama del mechero. Además de destruir los microorganismos que se encuentran en la boca de los frascos y tubos, la llama del mechero crea corrientes de convección hacia afuera que disminuyen la chance de contaminación. Después de la inoculación, el cultivo se incuba en un ambiente adecuado, en condiciones apropiadas para el crecimiento. Se entiende por crecimiento al desarrollo de una población de células a partir de unas pocas (crecimiento de la población por reproducción). La masa de células hijas se vuelve visible como turbidez en medio líquido o como una población aislada (colonia) en el medio sólido. Se entiende por colonia a un gran número de células bacterianas que crecen sobre la superficie de un medio sólido y que resultan visibles al ojo desnudo como una entidad discreta. Se asume que una colonia deriva de una sola célula y por lo tanto representa un clon de la misma, constituyendo una fuente de cultivo puro. Una forma fácil de preparar medios sólidos es mediante el agregado de un agente solidificante a un caldo, el cual se endurecerá al enfriarse. El agente que se utiliza comúnmente es el agar-agar. Este compuesto se obtiene a partir de determinadas especies de algas rojas marinas y es un poligalactósido cuyos grupos hidroxilos están parcialmente esterificados con ácido sulfúrico. La gran mayoría de los microorganismos son incapaces de degradarlo por lo que, excepto para algunas bacterias marinas, el agar no es un nutriente, sólo un agente solidificante. Comercialmente se encuentra disponible purificado y en forma deshidratada. Se puede mezclar con los nutrientes antes de la


esterilización. Es de fácil manejo en el laboratorio y aunque los diferentes tipos comerciales tienen distintas propiedades físicas según el método de purificación utilizado, el agar comúnmente funde entre 97ºC-100ºC. Durante el enfriamiento, se solidifica entre 40ºC-42ºC. Por lo tanto, se pueden incubar microorganismos en un amplio intervalo de temperaturas, sin riesgo que el medio se licúe. Usualmente se utiliza en una concentración de 1,5% -1,8% que otorga al medio la dureza suficiente como para impedir un crecimiento confluente. Otro agente solidificante que puede utilizarse para fines específicos es la gelatina (colágeno hidrolizado) en concentraciones de 12%-15%, pero ésta se licúa a temperaturas superiores a los 25ºC y muchas bacterias la hidrolizan, utilizándola como fuente de nutrientes (aminoácidos). La sílica gel se utiliza como agente solidificante en cultivos de microorganismos autótrofos, para los cuales la materia orgánica debe ser excluida del medio. Este sólo sirve como medio de soporte para el crecimiento de los microorganismos. Comúnmente se utilizan dos tipos de medios de cultivo: a) Medios definidos: Se preparan adicionando cantidades precisas de los distintos

componentes orgánicos e inorgánicos de alta pureza. En estos medios, se conoce la concentración de c/u de los componentes, variando la composición de los mismos en función del microorganismo a aislar.

b) Medios complejos: Contienen los ingredientes necesarios para el crecimiento de la

mayoría de los microorganismos, aunque no se conocen todos los componentes del medio ni sus cantidades exactas; muchos son productos de digestión ácida o enzimática de tejidos vegetales, carne, caseína, levaduras, etc. que proporcionan aminoácidos, vitaminas y minerales. En estos compuestos también están presentes algunos glúcidos, aunque en muchos casos se suplementa los medios con algún azúcar en particular.

Los extractos más utilizados en los caldos nutritivos son los siguientes: Extracto de carne: Preparado a partir de carne desprovista de tendones y grasa, que se somete a una ligera proteólisis. Este extracto constituye una base de alto valor nutritivo. Extracto de levadura: Se obtiene por extracción acuosa de levadura de cerveza autolisada. Por su elevado contenido en vitaminas ofrece excelentes condiciones de crecimiento. Peptona de carne: Se obtiene por degradación proteolítica de carne mediante tripsina o pepsina. Peptona de caseína: Se obtiene por la degradación proteolítica de caseína mediante tripsina. Por su elevado contenido de triptofano es adecuada para los medios de cultivo destinados para el ensayo de indol. TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS EN FORMA ASEPTICA (Subcultivo) Para realizarla se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones:


El ansa de inoculación debe esterilizarse flameándola en el mechero. Una vez realizado este paso, NUNCA SE DEBE APOYAR EL ANSA SOBRE LA MESADA, ésta debe mantenerse cerca de la llama para permitir que se enfríe. Si la transferencia se realizara a partir de un stock de microorganismos que se encuentra en tubos, los pasos a seguir son: 1. Desajustar las tapas sin abrir los tubos. 2. El tubo con el cultivo y el tubo que será inoculado deberán sostenerse con la palma de

la mano que no sostiene el ansa. Ambos tubos se mantendrán separados en forma de V (ver figura).

3. Destapar los tubos tomando las tapas entre los dedos meñique y medio. Evitar que los bordes de las tapas toquen las manos.

4. Removidas las tapas, mantenerlas siempre en la mano que sostiene el ansa. JAMÁS DEBEN APOYARSE LAS TAPAS SOBRE LA MESADA.

5. Flamear los cuellos de los tubos. 6. Enfriar el ansa estéril tocando la pared interna del tubo, antes de tomar el inóculo. 7. Dependiendo del medio de cultivo se utilizará un ansa en punta o en anillo. El ansa en

anillo se utiliza para tomar una muestra de cultivo proveniente de un medio líquido. Se pueden utilizar cualquiera de las dos para la obtención del inóculo proveniente de un agar recto o inclinado, tocando cuidadosamente la superficie del medio sólido. El ansa en punta se utiliza para transferir microorganismos a un agar recto, por punción profunda, provenga el inóculo de un medio sólido o líquido. El ansa se introduce dentro del tubo a inocular: • En el caso de un medio líquido, el ansa se agita para resuspender los

microorganismos que contiene el anillo; • En un agar recto, el ansa en punta se introduce en línea recta (punción), sin llegar

a tocar el fondo del tubo, y se retira siguiendo la línea de inserción. • En un agar inclinado (pico de flauta), se siembra sobre la superficie, deslizando

suavemente el ansa en zigzag. 8. Después de la inoculación, se flamean los cuellos de los tubos y se colocan las tapas

en el mismo orden en que se removieron. 9. El ansa se flamea, nuevamente, para la destrucción de los microorganismos

remanentes. CULTIVO EN CALDO Una forma simple de obtener un cultivo de bacterias, es hacerlas crecer en un medio líquido. El crecimiento bacteriano en caldo se puede visualizar de diferentes formas: a) Turbidez: Se visualiza como una opalescencia. b) Formación de película: Una pequeña masa de células flota en la parte superior del

medio. c) Sedimento: Un depósito de células descansa en la parte inferior del medio, pero se

puede resuspender si se agita cuidadosamente. d) Manto: Es un sedimento de células que no se resuspenden por agitación.


Si hay gas disuelto en el caldo, aparecerán burbujas cuando éste se agite o al introducir el ansa. Otra forma de detectar producción de gas es colocar un pequeño tubo de vidrio, en forma invertida, dentro del caldo. El gas se observará como una burbuja dentro del tubo invertido. Este método se utiliza generalmente cuando se llevan a cabo pruebas de fermentación de hidratos de carbono, para comprobar la producción de gas. Procedimiento 1. Rotule con una etiqueta dos tubos estériles y dos frascos de penicilina, sin retirar la

tapa. 2. Agregue, a cada tubo, 5 ml de caldo nutritivo y 10 ml a los frascos de penicilina, con

pipeta estéril y en condiciones de asepsia. 3. Inocule cada tubo o frasco con un cultivo puro que se le suministrará al inicio del

práctico. 4. Incube los tubos y frascos a 37ºC, durante 24-48 hs. 5. Examine los cultivos en caldo buscando evidencias de crecimiento. Observe si existe

formación de película o sedimento antes de agitar el tubo o frasco. Algunas células pesadas, como levaduras, sedimentan completamente dejando la parte superior del caldo prácticamente estéril, por ello y como precaución de rutina durante las transferencias, hay que asegurarse que el inóculo esté en suspensión.

AGAR INCLINADO Un agar inclinado también llamado agar en pico de flauta, es un tubo con medio agarizado que se coloca en ángulo para enfriarse. De esta forma endurece con una superficie fácilmente inoculable con un ansa, en la que es posible cultivar microorganismos aeróbicos y anaeróbicos facultativos. Los tubos con agar (inclinado o recto) son formas comunes de mantener un stock de cultivos. Los tubos con agar recto resultan ventajosos cuando se necesitan condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Procedimiento 1. Fundir el Agar Nutritivo a Baño María. 2. Agregar Agar Nutritivo fundido a dos tubos estériles y enfriarlos en posición inclinada. 3. Cuando el medio esté sólido, inocular la superficie de un tubo con Escherichia coli

utilizando un ansa, moviéndola en zigzag desde la parte inferior del tubo hacia la superior. Inocular la superficie del segundo tubo con Micrococcus luteus.

4. Incubar los tubos a 37 ºC durante 24-48hs. 5. Examinar y describir el tipo de crecimiento desarrollado en la superficie del agar. (ver

figura) SIEMBRA EN PROFUNDIDAD EN AGAR BLANDO (TOP AGAR) Esta técnica es útil para visualizar movilidad microbiana. Se utiliza Agar Nutritivo, pero en concentración de 0,6%. Procedimiento


1. Fundir el Agar Nutritivo 0,6% a Baño María. 2. Agregar aproximadamente 10 ml de medio fundido a cada uno de los tubos y dejar

enfriar en posición vertical. 3. Una vez solidificado el medio, flamear el ansa en punta, tomar con ella el cultivo e

introducirla en línea recta (punción) sin llegar a tocar el fondo del tubo, luego retirarla siguiendo la línea de inserción.

4. Cerrar el tubo y flamear nuevamente el ansa. 6. Incubar los tubos a 37ºC durante 24-48hs. 7. Examinar y describir el tipo de crecimiento. TECNICAS PARA AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS Los cultivos puros deben contener una única especie de microorganismo. De esta manera son adecuados para el estudio de sus propiedades morfológicas y bioquímicas. AISLAMIENTO DE COLONIAS La técnica requiere una reducción del número de microorganismos en el inóculo inicial. La disminución del tamaño de la población asegura que, después de la inoculación, las células individuales estén suficientemente separadas entre sí, en la superficie del agar, como para obtener el aislamiento de las diferentes especies presentes.

Agotamiento por estría en placa: Técnica de dilución en superficie que implica esparcir el inóculo, con un ansa, sobre la superficie de una placa con medio sólido. Existen varios procedimientos. En particular realizaremos las estrías en cuadrante (ver figura). 1. Flamear y enfriar el ansa. Colocar una ansada del cultivo en la superficie del agar

(área 1), dispersar rápida y suavemente el inóculo sin arar el agar. Cerrar la placa. 2. Flamear y enfriar nuevamente el ansa, rotar la caja de petri 90º. Tocar con el ansa 2 o

3 veces un extremo del área 1 y hacer varias estrías a través del área 2. En ningún momento el ansa deberá tocar nuevamente el área 1.

3. Flamear y enfriar nuevamente el ansa y rotar la caja de petri 90º. Repetir el procedimiento anterior estriando el área 3.

4. Rápidamente, sin cerrar la caja, y sin volver a flamear el ansa, girar la caja de petri 90º y realizar la última estría (área 4), en forma abierta. Evitar que el ansa toque cualquiera de las áreas previamente estriadas.

5. Rotular la base de cada placa de petri con rotulador indeleble, indicando: medio de cultivo, microorganismo inoculado, fecha y nombre.

6. Incubar en estufa a 30ºC-37ºC durante 24-48 hs. 7. Una vez obtenidas las colonias observar la morfología de las mismas y describirlas. El flameo del ansa, en los puntos indicados, es para efectuar la dilución del cultivo a fin que unos pocos microorganismos se encuentren estriados en cada área.

Siembra con Espátula de Drigalsky: 1. Tomar 0,1 ml de cultivo con micropipeta y puntas estériles, depositarlos sobre la

superficie del agar. Tomar la espátula de Drigalsky del recipiente con alcohol y pasar


por la llama para esterilizarla. Una vez fría, esparcir uniformemente el inóculo sobre el agar, con movimientos rotatorios, hasta que se absorba completamente el líquido.

2. Cerrar la placa y volver la espátula al recipiente con alcohol. 3. Incubar en estufa a 30ºC-37ºC durante 24-48 hs. 4. Una vez obtenidas las colonias, observar la morfología de las mismas y describirlas. Técnicas de diluciones seriadas. Recuento de viables en placa. Considerando que una colonia bacteriana se desarrolla a partir de una única célula, la técnica de recuento de viables en placa permite determinar el número de bacterias o UFC (unidades formadoras de colonia) presentes originalmente en una muestra a analizar. Para asegurar un recuento exitoso, el numero de colonias no debe ser mayor a 250, ya que las colonias están demasiado cercanas una de otra como para distinguirlas claramente, ni menor a 25 colonias por razones estadísticas. Con el objeto de garantizar una cantidad aceptable de colonias se hacen diluciones seriadas de la muestra, y una alícuota de las diluciones se siembra en placas con medio de cultivo sólido. La posterior incubación de las mismas permitirá el desarrollo de colonias que puedan contarse. La técnica que utilizaremos implica esparcir el inóculo sobre la superficie del agar con ayuda de la espátula de Drigalsky. PROCEDIMIENTO: 1. Rotular los tubos de ensayos estériles desde 10-1 hasta 10-6. 2. Rotular la placas con agar nutritivo con el valor de la última dilución que se siembra

(considerar el factor de dilución aportado por la alícuota que se toma de la última dilución).

3. Medir la DO a 600 nm de una alícuota del cultivo (considerar que una DO de 0,1 equivale aproximadamente 5.107 UFC/ml para los cultivos de E. coli). Estimar la concentración del cultivo inicial. Considerar que el volumen de la cubeta es 1 ml. Utilizar una cubeta con medio de cultivo sin inóculo como blanco.

4. Realizar los cálculos para las diluciones seriadas las cuales permitan a partir de la siembra de 100 μl de la última dilución obtener entre 30 a 300 colonias.

5. Realizar las diluciones seriadas según los cálculos. 6. Sembrar 100 μl de la última dilución por duplicado. 7. Incubar a 37ºC durante 24 – 48 horas. 8. Contar las colonias y realizar los cálculos necesarios para obtener la concentración

bacteriana en la muestra original. PRESERVACION DE CULTIVOS MICROBIANOS Los cultivos microbianos pueden preservarse para evitar la necesidad de subcultivarlos periódicamente. Los principales métodos utilizan congelación o desecación. La preservación a corto plazo se puede lograr mediante un número variado de técnicas las que dependerán de la especie de microorganismo que se desea preservar. Los microorganismos aerobios pueden mantenerse durante un par de meses en agar inclinado refrigerado. Algunos anaerobios facultativos, para los cuales el oxígeno puede resultar perjudicial, son preservados en agar recto refrigerado. Para eliminar el oxígeno y evitar evaporación se aplica una capa de aceite mineral o vaselina estériles sobre la superficie del agar, una vez inoculado. Los cultivos refrigerados permanecen viables durante meses, pero la refrigeración no es apropiada para la conservación a largo plazo debido a que los stocks de microorganismos


deben repicarse periódicamente. Además, los cultivos refrigerados durante largos períodos pueden mutar. La conservación de las bacterias a largo plazo se puede lograr por congelación o deshidratación. La mayoría de los cultivos sobreviven bastante bien si son congelados en una mezcla 1:20 con glicerol estéril, manteniendo la temperatura a –20ºC o -80ºC. También se pueden conservar dentro de viales sellados, manteniéndolos desde -100ºC a –200ºC en nitrógeno líquido. Uno de los métodos más utilizados para conservar a largo plazo es la técnica de congelación-desecación llamada liofilización. El cultivo se resuspende en alguna sustancia que lo proteja (por ejemplo, una solución de glucosa al 30% en caldo nutritivo y suero comercial de caballo o bien, leche estéril fortificada con sacarosa al 5%), dentro de un vial o tubo de vidrio; se congela rápidamente con una mezcla de hielo seco-alcohol, se deseca por evaporación bajo vacío, y finalmente se sella el vial. Los cultivos procesados de esta forma pueden conservarse durante años. Un alto porcentaje de la población microbiana sobrevive a la liofilización, por lo cual prácticamente no existe selección de variantes genéticas más resistentes. La elevada tasa de supervivencia, comparada con los otros métodos de preservación, asegura la estabilidad y homogeneidad genética de la población microbiana. ATCC (American Type Culture Collection) posee un gran número de microorganismos y virus que se encuentran comercialmente disponibles en forma liofilizada. American Type Culture Collection: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA.

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37 °C, 24hs



Trabajo Práctico Nº5: Actividades bioquímicas utilizadas para identificación de microorganismos Objetivos: Que los alumnos se familiaricen con las técnicas bioquímicas básicas para la identificación de microorganismos y que desarrollen el criterio que les permita seleccionar los ensayos adecuados para la caracterización de un microorganismo determinado. Introducción: El estudio de las interrelaciones de los microorganismos y su medio ambiente bajo determinadas condiciones físicas, químicas y biológicas, se llama ecología microbiana y su objetivo práctico es lograr un conocimiento tal que contribuya al control de especies patógenas en medicina, a mejorar el rendimiento de las reacciones fermentativas y a mejorar y aumentar la producción en la industria alimenticia. Para determinar que microorganismos viven en un hábitat dado, cada especie presente debe ser aislada en un cultivo puro para su posterior identificación. Esta tarea puede ser simplificada probando características particulares como requerimientos nutricionales o de temperatura, productos metabólicos, etc. Los microbiólogos han encontrado ventajoso imponer combinaciones particulares de condiciones ambientales en muestras con flora mixta, con el objetivo de favorecer el desarrollo de un microorganismo sobre sus competidores. Por ejemplo: ajustar el pH del medio alrededor de 4 previene el crecimiento de la mayoría de las bacterias, promoviendo el de levaduras y mohos. Excluir el oxígeno del medio ambiente, impide el desarrollo de los aerobios estrictos. Si tanto oxígeno como nitrógeno son excluidos (pero el gas N2 está presente) sólo desarrollará los anaerobios fijadores de N2. El número de combinaciones de condiciones selectivas es muy grande, sin embargo, más de un tipo de microorganismo puede crecer en cualquier medio selectivo, por lo que para asegurar cultivos puros, frecuentemente se estría un medio sólido con un inoculo procedente de un medio líquido de enriquecimiento. Una o dos transferencias del cultivo a través de un medio líquido eliminan la mayoría de los microorganismos competidores, capaces de sobrevivir algunas generaciones con los nutrientes que estaban presentes en la muestra original. La transferencia de cultivo en desarrollo a un segundo frasco de medio selectivo diluye los nutrientes contaminantes. Como regla general, los medios selectivos y los de enriquecimiento deben aproximarse a los requerimientos nutricionales mínimos de una especie. De esta forma se puede limitar y definir el tipo de desarrollo más precisamente que si se incluyen sustancias orgánicas complejas que estimulen el crecimiento de una población heterogénea. Como mencionamos antes, las razones para separar e identificar microorganismos son variadas: 1. Determinación de los patógenos responsables de las enfermedades infecciosas. 2. Selección y aislamiento de cepas de microorganismos fermentativos necesarios para

la producción industrial de alcoholes, solventes, vitaminas, ácidos orgánicos, antibióticos, etc.


3. Aislamiento y desarrollo de cepas adecuadas para el mejoramiento de la industria de ciertos alimentos como yoghurt, queso, etc.

4. Comparación de actividades bioquímicas con propósitos taxonómicos. Los esquemas de identificación de bacterias están basados en una variedad de características que incluyen: morfología, fisiología, patogenicidad, serología e información molecular. Uno de los primeros pasos en la identificación es la tinción diferencial. Una de ellas es la tinción de Gram (ya vista). Otra es la de Ziehl-Nielsen (ácido-alcohol resistente), la que se utiliza para un grupo más limitado de microorganismos (los pertenecientes a los géneros Mycobacterium y Nocardia). La apariencia de los cultivos en los medios de laboratorio (forma de las colonias y pigmentación) es una herramienta taxonómica valiosa. También lo es la capacidad de un microorganismo de utilizar ciertas sustancias (sustratos) para producir cambios y productos químicos que pueden ser testeados o reconocidos. Los test serológicos se utilizan principalmente en la identificación de especies o grupos dentro de los géneros Streptococcus y Salmonella, evidencian las respuestas inmunes que ocurren con el suero sanguíneo. Por ejemplo, el procedimiento denominado Prueba de Aglutinación, ensayos de ELISA y Western blot. Es fundamental reconocer el hecho de que en condiciones naturales existe un equilibrio entre las células de una especie y su ambiente, tal que favorece la continuación de ésa dada especie en ése ambiente en particular. Esta suposición es la base de nuestro esquema de identificación pues se asume que, a pesar de la gran variabilidad de especies, ciertos microorganismos se encontraran en ciertos hábitats y que sus reacciones serán lo suficientemente consistentes como para permitir su identificación. Cabe mencionar que una cepa vieja puede perder algunas de sus características distintivas en el laboratorio; por ejemplo, los Streptococcus pierden la capacidad de fermentar ciertos azúcares, las Pseudomonas la de producir pigmentos, las Salmonellas su patogenicidad. Estos cambios hacen atípico al microorganismo e imposibilitan una descripción rígida. Con frecuencia también se aíslan microorganismos atípicos de ambientes naturales, pero esta variación entre individuos y poblaciones es la regla entre las especies vivas. Así, aunque resulte conveniente usar para el diagnóstico ciertos aspectos fácilmente reconocibles, éstos no son suficientes para una completa separación taxonómica. Con este objetivo los microbiólogos comparan una gran cantidad de caracteres diferentes o similares. El conjunto de todas las reacciones químicas es el metabolismo celular y las transformaciones bioquímicas que ocurren dentro y fuera de la célula están gobernadas por las enzimas. Las actividades enzimáticas son ampliamente utilizadas para identificar bacterias ya que mediante las pruebas bioquímicas se pueden separar en especies distintas que se encuentran muy relacionadas. EXOENZIMAS (Enzimas extracelulares) Actúan sobre sustancias fuera de la célula. La mayoría de las sustancias de alto peso molecular no son capaces de atravesar las membranas celulares por lo que deben ser degradadas y luego transportadas dentro de la célula. (Polisacáridos, lípidos complejos y proteínas). Las enzimas extracelulares


generalmente son hidrolíticas, degradan las macromoléculas a sus bloques constituyentes de menor peso molecular. ENDOENZIMAS (Enzimas intracelulares) Funcionan dentro de la célula y son responsables de la síntesis de los constituyentes protoplasmáticos y la producción de energía a partir de las sustancias asimiladas. Esta transformación es necesaria para la supervivencia celular y el funcionamiento constituyendo por lo tanto la base del metabolismo celular. Como resultado del proceso metabólico, los productos son excretados hacia el medio extracelular, la determinación de estos productos permite la identificación de sistemas enzimáticos específicos así como la identificación y clasificación de microorganismos. ENZIMAS EXTRACELULARES 1. ENSAYO DE HIDRÓLISIS DE ALMIDON El almidón es un polímero de alto peso molecular compuesto de unidades repetidas de glucosa unidas entre sí por puentes glicosídicos. La degradación de esta macromolécula requiere primero la presencia de amilasa que lo hidroliza a polisacáridos más cortos llamados dextrinas y por último a moléculas de maltosa. La hidrólisis final de este disacárido, catalizada por la acción de la enzima maltasa, da moléculas de glucosa solubles que pueden ser transportadas dentro de la célula y por medio de la glucólisis producir energía. En el ensayo se utiliza agar almidón para verificar la acción o no de la amilasa El medio está compuesto de agar nutritivo suplementado con almidón como sustrato, la detección de la actividad hidrolítica, luego del periodo de crecimiento, se determina verificando la ausencia o presencia del sustrato en el medio. El almidón en presencia de iodo imparte una coloración azul indicando la ausencia de amilasa (resultado negativo). Si el mismo ha sido hidrolizado, se verá una zona clara alrededor de las colonias (resultado positivo). 2. ENSAYO DE HIDROLISIS DE LIPIDOS Los lípidos son componentes de alto peso molecular. La degradación de éstos se lleva a cabo por enzimas extracelulares (las lipasas), que clivan los puentes éster adicionando una molécula de agua para formar glicerol y ácidos grasos. Una vez asimilados dentro de la célula, estos componentes pueden ser metabolizados para producir energía o ingresar a diferentes vías metabólicas para la síntesis de diversos componentes citoplasmáticos. Experimentalmente, para demostrar la actividad hidrolítica de las lipasas, se utiliza un agar tributirina. Este es un agar nutritivo suplementado con el triglicérido tributirina el cual sirve de sustrato. El mismo forma una emulsión que opalece el medio. Luego de la inoculación e incubación mostrará áreas claras alrededor de las colonias (lipólisis positiva) si el microorganismo es capaz de secretar lipasas. 3. ENSAYO DE HIDROLISIS DE CASEINA La caseína es la proteína principal de la leche. Antes de la asimilación por las bacterias, las proteínas deben ser degradadas a peptonas, polipéptidos, dipéptidos y finalmente a aminoácidos, proceso conocido como proteólisis o peptonización y es llevado a cabo por


enzimas extracelulares (proteasas). De esta forma, los aminoácidos solubles de bajo peso molecular, pueden ser incorporados y utilizados por los microorganismos para la síntesis de diferentes proteínas. Experimentalmente, para demostrar la actividad hidrolítica de las proteasas, se utiliza agar-milk. Este es un agar nutritivo suplementado con leche en polvo que contiene el sustrato caseína. Este medio resulta ser opaco, que luego de la inoculación e incubación mostrará áreas claras alrededor de las colonias (proteólisis positiva) si el microorganismo es capaz de secretar proteasas. 4. ENSAYO DE HIDROLISIS DE GELATINA La gelatina es una proteína producida por la hidrólisis del colágeno, un componente importante del tejido conectivo y tendones en los animales. Por debajo de los 25ºC la gelatina se mantiene sólida. Por encima de dicha temperatura, se licúa. La licuefacción es llevada a cabo por algunos microorganismos capaces de producir gelatinasas (enzimas que hidrolizan a la gelatina a aminoácidos), una vez que ha ocurrido esta degradación, no se restablece la solidificación aún a 4ºC. Experimentalmente, se utiliza agar –gelatina. Este es un caldo nutritivo suplementado con gelatina al 12% la cual sirve como sustrato a la vez que opalece y solidifica el medio. Luego de la inoculación e incubación durante 48 horas, los cultivos se colocan en baño de hielo durante 40 minutos, los cultivos que permanecen líquidos demuestran actividad gelatinasa positiva. ENZIMAS INTRACELULARES 1. DEGRADACION DE HIDRATOS DE CARBONO Los microorganismos degradan hidratos de carbono de diferentes formas, dependiendo de las enzimas con que cuentan. Algunos son capaces de fermentar azúcares, como la glucosa, mientras que otros sólo usan la vía aeróbica. Los anaerobios facultativos son enzimáticamente competentes para usar ambas vías (aeróbica y anaeróbica). Finalmente existen microorganismos que carecen de la capacidad de oxidar glucosa por cualquier vía. De esta forma, la capacidad, o falta de ella, de un organismo para degradar un azúcar simple, una combinación de azúcares o algún otro carbohidrato, proporciona información para la clasificación de las especies bacterianas. En el proceso fermentativo, los hidratos de carbono sufren degradación anaeróbica con producción de ácidos orgánicos (láctico, fórmico o acético) que puede ir acompañada por la producción de gases tales como hidrógeno o dióxido de carbono. La degradación de la glucosa por fermentación ocurre mediante la vía Embden-Meyerhof o también conocida como la vía glicolítica. En esta vía un mol de glucosa es convertido en dos moles de piruvato, el cual es el principal intermediario de esta vía de degradación. Posteriormente la degradación final del piruvato dependerá del tipo de microorganismo. La variedad de los productos finales resultantes definen las diferentes capacidades fermentativas del microorganismo. Si se incluye un indicador de pH en el medio de crecimiento, se puede detectar fácilmente la formación de ácidos. Los indicadores más utilizados son el Rojo fenol, que vira al amarillo a un pH≤ 6,9 o el azul de bromotimol que lo hace a un pH≤ 5,2.


La producción de gas puede detectarse mediante la aparición de burbujas en un vial invertido (campana de Durham) si el microorganismo se encuentra en un medio líquido, o por rupturas del agar si éste se encuentra en medio sólido. Los microorganismos oxidativos, los cuales son incapaces de fermentar los hidratos de carbono, forman ácido sólo en la superficie del agar, bajo condiciones aeróbicas. El ensayo de OXIDO/FERMENTACION se lleva a cabo inoculando dos tubos de agar OF, el cual contiene un determinado azúcar y un indicador de pH. Uno de los dos tubos se cubre con una fina capa de vaselina estéril. Después de la incubación, los cultivos fermentadores producirán el viraje del indicador al amarillo en ambos tubos, mientras que los cultivos oxidativos, sólo en los primeros milímetros de la superficie del agar que no está completamente cubierto por la vaselina. La incapacidad de fermentar u oxidar un hidrato de carbono no significa que no exista crecimiento. El microorganismo puede utilizar, como fuente de energía, otros nutrientes del medio, por ejemplo las peptonas. Estas son degradadas a aminoácidos, los cuales posteriormente sufrirán un proceso de desaminación oxidativa que les permitirá proporcionar el esqueleto carbonado para su ingreso en el Ciclo de Krebs y participar en la producción de energía. Estas reacciones liberan amoníaco, el cual se acumula en el medio aumentando el pH del mismo. Cuando esto ocurre, el indicador rojo fenol vira al rojo. 2. ENSAYO HIERRO -TRIPLE AZUCAR (TSI) Básicamente este ensayo se utiliza para discriminar entre miembros de Enterobacteriaceae y de otros bacilos intestinales Gram negativos. La diferenciación se fundamenta en las diferencias en los patrones de fermentación de carbohidratos y la producción de sulfuro de hidrógeno que presentan los diferentes grupos de microorganismos intestinales. Para facilitar la observación de los patrones de utilización de carbohidratos, comúnmente se utilizan agar TSI inclinado los cuales contienen lactosa y sacarosa al 1% y glucosa al 0,1%, para la detección de la utilización de estos sustratos. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol el cual permite detectar la fermentación de carbohidratos mediante el viraje de rojo-naranja a amarillo en presencia de ácidos. El agar inclinado se inocula en profundidad con un ansa recto sólo en la superficie recta, en tanto que sobre la superficie inclinada se siembra en zigzag. Luego del periodo de incubación, se determinan las actividades fermentativas de los microorganismos de la siguiente forma: 1. Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie recta ácida (amarilla) con o sin

producción de gas (ruptura o no del agar): Unicamente fermenta glucosa. El microorganismo primero degrada la glucosa. Debido que este sustrato se encuentra en una concentración mínima, la pequeña cantidad de ácido producido en la superficie del agar es oxidada rápidamente. Las peptonas del medio también son utilizadas en la producción de álcali. En la porción recta del agar, la reacción ácida se mantiene debido a que en esta región la tensión del oxígeno es reducida.

2. Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie recta alcalina (roja) o sin cambios: No ocurre fermentación de carbohidratos. De esta forma para obtener energía, los microorganismos utilizan las peptonas las cuales son catabolizadas bajo condiciones anaeróbicas y aeróbicas, resultando en la producción de amoníaco y su consecuente aumento del pH. La reacción alcalina sólo se evidencia en la superficie del agar inclinado. Si hay una utilización aeróbica y anaeróbica de las peptonas, la reacción


alcalina se encuentra presente tanto en la superficie inclinada como en la superficie recta.

3. Agar inclinado ácido (amarillo) y superficie recta ácida (amarilla) con y sin producción de gas: En este caso puede ocurrir la fermentación de la lactosa o de la sacarosa o de ambas. Debido a que estas sustancias se encuentran en mayor concentración, sirven de sustrato para las actividades fermentativas en forma continua durante el periodo de incubación lo cual se evidencia por el mantenimiento de la acidez del medio en ambas superficies.

Para la obtención de resultados precisos es importante observar los cultivos dentro de las 18 a las 24 horas de incubación. Esto es para asegurarse que el microorganismo utilizó por completo los carbohidratos como sustrato y luego comience a utilizar las peptonas teniendo lugar al final del periodo la producción de amoníaco. El agar TSI contiene tiosulfato de hierro, éste se utiliza como sustrato para la producción de sulfuro de hidrógeno, y sulfato ferroso. Después de la incubación, únicamente los cultivos que son capaces de producir sulfuro de hidrógeno producirán un precipitado oscuro, sulfuro ferroso, que se forma por la reacción entre el sulfuro de hidrógeno y el sulfato ferroso presente en el medio. Para la diferenciación de los bacilos intestinales de acuerdo con las reacciones en agar TSI ver la figura correspondiente. 3 ENSAYO I M V i C La identificación de los bacilos entéricos es de vital importancia para controlar las infecciones intestinales producidas por contaminación alimenticia o aguas servidas. Los grupos de bacterias que se pueden encontrar en el tracto intestinal de los humanos y mamíferos inferiores se clasifican como miembros de la familia Enterobacteriaceae, los cuales son bacilos cortos, gramnegativos, no formadores de esporas y fermentadores de glucosa. Los miembros más comunes de esta familia son: 1. Patógenos: Miembros de los géneros Salmonella y Shigella. 2. Patógenos ocasionales: Miembros de los géneros Proteus y Klebsiella. 3. Flora intestinal normal: Miembros del género Escherichia y Enterobacter, los cuales

son habitantes saprófitos del tracto intestinal. Los organismos entéricos además pueden subdividirse en fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa. (Ver gráfico correspondiente). Para la diferenciación de los principales grupos de Enterobacteriaceae comúnmente se utilizan las propiedades bioquímicas y las reacciones enzimáticas en presencia de ciertos sustratos. Uno de los ensayos más utilizados es el I M V i C el cual incluye los siguientes test: Indol –Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y la utilización de Citrato (Citrato Simmons). a) TEST DE PRODUCCION DE INDOL Este test se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de degradar el aminoácido triptófano.


El triptófano es un aminoácido esencial el cual puede oxidarse mediante las actividades enzimáticas de ciertas bacterias. La conversión del triptófano a indol, piruvato y amoníaco está mediado por la enzima triptofanasa, esta reacción es característica de algunos microorganismos y por lo tanto sirve como un marcador bioquímico. Experimentalmente se utiliza agar SIM, este medio contiene triptófano como sustrato. La presencia de indol se detecta mediante el agregado de reactivo de Kovac el cual reacciona produciendo un color rojo cereza característico. El reactivo de Kovac contiene p-dimetilamino benzaldehído, butanol y ácido clorhídrico. Este reactivo extrae el indol del medio por acción del butanol acidificado y reacciona formando un complejo con el p-dimetilaminobenzaldehído producto de color rojo cereza. Triptofanasa Triptofano Indol + Acido Pirúvico + amoniaco Butanol Indol + p-dimetilaminobenzaldehido Halo rojizo en la superficie del tuvo HCl

Reactivo de Kovac Los cultivos que producen coloración roja después del agregado del reactivo de Kovac son indol positivos. La ausencia de coloración roja demuestra que el sustrato triptófano no es hidrolizado. b) TEST ROJO DE METILO Este ensayo se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar glucosa con producción de altas concentraciones de ácidos. Sirve para diferenciar entre los microorganismos entéricos como E. coli de Enterobacter aerogenes. El medio utilizado es un caldo nutritivo con glucosa al 10% como sustrato. La glucosa es un monosacárido principal sustrato oxidado por los organismos entéricos para producir energía. Los productos finales del proceso dependerán de las vías enzimáticas específicas utilizadas por las bacterias. El indicador de pH utilizado es el rojo de metilo, el cual detecta la presencia de grandes concentraciones de productos ácidos. Aunque todos los microorganismos entéricos fermentan glucosa con producción de ácidos orgánicos, este ensayo resulta útil para la separación de E. coli y E. aerogenes ya que el pH bajo, producto de la acidificación del medio, resulta estabilizado y mantenido sólo por E. coli hasta el final de la incubación. Durante el periodo final de incubación E. aerogenes convierte los ácidos en productos finales neutros como 2,3-butanediol y acetoína (acetilmetilcarbinol) lo que resulta en una elevación del pH en un valor aproximado de 6. El indicador rojo de metilo a pH 4 vira al rojo (test positivo). A pH 6 sigue indicando la presencia de ácido pero a una de concentración insuficiente para producir el viraje. c) TEST DE VOGES-PROSKAUER Este ensayo determina la capacidad de algunos microorganismos de producir productos finales neutros tales como acetil-metilcarbinol (acetonia) a partir de los ácidos formados durante el metabolismo de la glucosa. Este test resulta positivo particularmente para E. aerogenes.


El reactivo utilizado es el Reactivo de Barrit el cual es una solución alcohólica de α-naftol e hidróxido de potasio al 40%. La detección de la acetilmetilcarbinol requiere que este sea oxidado a un compuesto diacetilo reacción que ocurre en presencia de α-naftol y de un grupo guanidinio presente en la peptona del medio de cultivo. Como resultado de esta reacción se forma un complejo de color rosado. (Ver gráfico correspondiente). El resultado positivo (color rosado) se registras luego de agregar el Reactivo de Barrit, incubar unos minutos y agregar el reactivo de O´Meara. Reactivo BARRIT: Solución alcohólica al 5% de 1-naftol (en etanol absoluto). Reactivo O'MEARA: Solución acuosa al 40% de KOH y 0,3% de creatina monohidratada (40 gr de KOH y 0,3 gr. de creatina monihidratada). Glucosa + O2 piruvato α-acetolactato acetoina 2,3 butanodiol 40 % KOH Acetoina + α-naftol Complejo rozado (creatina + diacetilo) Etanol Absoluto d) TEST UTILIZACION DE CITRATO Este ensayo sirve para diferenciar entre microorganismos en función de su capacidad de utilizar citrato como única fuente de carbono. Esta capacidad dependerá de la presencia de una enzima (citrato permeasa) que facilita el transporte del citrato dentro de la célula. El citrato es el primer y principal intermediario en el Ciclo de Krebs. Se produce por la condensación del aceti-CoA con el oxalacetato. La citrasa actúa sobre el citrato produciendo oxalacetato y acetato, estos productos posteriormente son convertidos en piruvato y dióxido de carbono. Durante la reacción el medio se torna alcalino, ya que el dióxido de carbono generado reacciona con el sodio, que se libera luego de que el citrato ingresa a la célula, y agua produciendo carbonato (producto alcalino que produce el viraje de verde a azul del indicador azul de bromotimol incorporado al medio). Luego de la incubación, los cultivos citrato positivos son identificados por el crecimiento en la superficie del medio acompañado de color azul. Citrato permeasa Citrato de Sodio Acido pirúvico + Acido oxalacético + CO2 Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3 (producto alcalino que eleva el pH )


4 ENSAYO DE SULFURO DE HIDROGENO Este ensayo se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir sulfuro de hidrógeno a partir de sustratos como aminoácidos y de compuestos inorgánicos que contienen azufre. Existen dos posibles vías fermentativas para esta producción. Vía 1: El sulfuro gaseoso se produce por hidrogenación (reducción) del azufre orgánico en el aminoácido cisteína presente en las peptonas del medio. Este aminoácido en presencia de la enzima cisteína desulfurasa pierde el átomo de azufre y se reduce por la adición de iones hidrógeno produciendo sulfuro de hidrógeno. Vía 2: El sulfuro gaseoso puede producirse por reducción de compuestos inorgánicos como tiosulfatos, sulfatos o sulfitos. El medio utilizado es SIM (sulfil-indol-movilidad) contiene peptona y tiosulfato de sodio como sustrato y sulfato ferroso que actúa como indicador de sulfuros. (Ver ensayo TSI). 5 ENSAYO DE UREASA Este ensayo se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de degradar la urea. La enzima ureasa es producida por algunos microorganismos, principalmente por Proteus vulgaris, aunque algunos otros también la producen, la acción de ésta sobre el sustrato urea, es menor a la observada en las especies de Proteus. Por lo cual este ensayo sirve para distinguir a los miembros de este género de otros microorganismos entéricos no fermentadores de lactosa. La ureasa ataca el puente carbono-nitrógeno de la urea formando amoníaco. La presencia de la ureasa se detecta cuando los microorganismos crecen en un caldo urea que contiene el indicador de pH rojo de fenol, la presencia de amoníaco aumenta el pH produciendo el viraje del indicador a un rosa oscuro (reacción positiva). 6 ENSAYO DE REDUCCION DE NITRATO Este ensayo permite determinar la capacidad de los microorganismos de reducir el nitrato a nitrito, amoníaco o nitrógeno molecular. La reducción del nitrato ocurre en anaerobiosis (ausencia de oxígeno molecular), en los organismos cuya respiración anaeróbica es un proceso oxidativo, en el cual la célula utiliza diferentes sustratos inorgánicos (nitratos o sulfatos) como aceptores de electrones. La reducción del nitrato puede determinarse cultivado el microorganismo en un caldo nutritivo que contiene nitrato de potasio al 0,1%, además posee agar al 0,1%. El medio semisólido impide la difusión del oxígeno. Luego de la incubación del cultivo la capacidad reductora del microorganismo se determina agregando dos reactivos: a) Determinación de Nitrito NO2

-: Reactivo GRIESS-ILOSVAY 1. Solución A: ácido sulfanílico 2. Solución B: α-naftilamina b) Determinación de Amonio (NH4+): Reactivo de NESSLER


La reacción positiva se evidencia mediante la aparición instantánea de una coloración rojo cereza. Los cultivos que resultan negativos, sugieren dos posibilidades: 1. El microorganismo es incapaz de reducir el nitrato. 2. El microorganismo posee una nitrato reductasa muy potente capaz de reducir los

nitritos a amoníaco e incluso nitrógeno molecular. Para diferenciar ambas posibilidades se adiciona una pequeña cantidad de polvo de zinc, éste reduce los nitratos a nitritos, por lo tanto el desarrollo de color rojo verifica que los nitratos no han sido reducidos por el microorganismo. Si la adición del zinc no produce la aparición del color, obviamente los nitratos del medio habían sido reducidos a nitrito, y posteriormente, a amoníaco y nitrógeno molecular. 7 ENSAYO DE CATALASA Este ensayo permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir la enzima catalasa capaz de degradar el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada). Durante la respiración aeróbica, los microorganismos producen peróxido de hidrógeno y también iones superóxido. La acumulación de estas formas altamente reactivas del oxígeno resultan tóxicas a menos que puedan ser degradadas enzimáticamente. Los organismos capaces de producir catalasa degradan rápidamente el peróxido de hidrógeno. (Ver figura correspondiente). La superóxido dismutasa es la enzima capaz de degradar los iones superóxidos en aquellos organismos aeróbicos catalasa negativos. La incapacidad de los anaerobios estrictos para sintetizar catalasa, peroxidasa o superóxido dismutasa explica por que el oxígeno resulta tóxico para estos microorganismos. La producción de catalasa puede evidenciarse añadiendo agua oxigenada sobre una muestra del cultivo a analizar, la reacción química correspondiente a la presencia de catalasa se pone de manifiesto por la aparición de burbujas de oxígeno gaseoso (resultado positivo). 8 ENSAYO DE OXIDASA Este ensayo permite determinar la actividad de la citocromo oxidasa con el fin de establecer diferencias dentro de ciertos grupos de bacterias. La citocromo oxidasa cataliza la oxidación mediada por oxígeno de un citocromo reducido, lo que resulta en la formación de agua o peróxido de hidrógeno. Las bacterias aeróbicas, algunos anaerobios facultativos y los microaerófilos exhiben actividad oxidasa. El ensayo de oxidasa permite la diferenciación de los miembros de los géneros Neisseria y Pseudomonas, los cuales son oxidasa positivos de las enterobacterias las cuales son oxidasa negativas. La capacidad de las bacterias de producir citocromo oxidasa puede evidenciarse mediante el agregado del reactivo oxalato de p-aminodimetilanilina en una muestra del cultivo. Este reactivo rosado sirve como sustrato para donar electrones y se oxida formando un complejo oscuro en presencia de oxidasa y oxígeno libre. La formación de coloración oscura es indicativo de la producción de citocromo oxidasa por parte del microorganismo.



TRABAJO PRÁCTICO Nº 6 y 7: AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ORGANISMOS

BACTERIANOS DESCONOCIDOS

Objetivos: Los alumnos deberán ser capaces de: Obtener un cultivo puro de un microorganismo de interés aislándolo de una mezcla de

microorganismos Identificar el microorganismo aislado.

PRINCIPIOS: Los trabajos prácticos realizados hasta el momento permiten desarrollar las habilidades necesarias para llevar a cabo la identificación de bacterias desconocidas, una de las principales responsabilidades del microbiólogo. En este sentido, los estudiantes deberán recurrir a los conocimientos adquiridos en métodos de tinción, técnicas de aislamiento, nutrición microbiana, actividades bioquímicas y características generales de microorganismos. A partir de material bibliográfico proporcionado por los docentes, los estudiantes deberán confeccionar un diagrama de flujo o esquema de identificación que muestre los ensayos principales usados para distinguir entre distintos géneros bacterianos. Existen varias maneras de presentar esos esquemas pero se prefieren los que consignan los resultados posibles de las pruebas utilizadas con más frecuencia y que son accesibles a la mayoría de los laboratorios bacteriológicos. Las pruebas empleadas y sus resultados son aquéllos aplicables a la identificación de una especie particular dentro de un género. A pesar de esto se debe tener en cuenta que en Microbiología se trabaja con sistemas vivientes y que no todos los miembros de una determinada especie reaccionarán a una prueba dada de la misma manera. Esto habrá que recordarlo al interpretar los resultados obtenidos. Cuando se comparan los mismos con un grupo tabulado de resultados patrón, utilizar el criterio de “aproximación máxima”; si un organismo se desvía de lo normal en uno o dos resultados de una prueba, según el cuadro, ello no supone que necesariamente haya que descartarlo de esa especie. La ubicación de una prueba bioquímica antes que otra no indica prioridad, cada una de las pruebas tiene igual valor. Cuando ello sea factible, es preferible obtener más de un resultado para separar los organismos en categorías o géneros o para identificar especies. El uso de los resultados de varias pruebas permite la confirmación, ya que siempre existe la posibilidad de error en la ejecución de una técnica. Sin embargo, si se realizan controles de calidad periódicos, éstos se podrán minimizar. Los estudiantes deberán realizar un listado de las características más significativas de los microorganismos de interés, a partir de los datos proporcionados por la bibliografía recomendada. MUESTRAS: Los conceptos de enriquecimiento selectivo y aislamiento se aplican siempre que se desee aislar un cierto tipo de organismo a partir de una muestra natural. Esto incluye, por ejemplo, bacterias Gram negativas de una hamburguesa, bacterias lácticas de un alimento fermentado, Staphylococcus aureus del cuerpo o coliformes de una muestra de agua. Cualquiera de estas muestras pueden contener muchas clases específicas de


microorganismos, y se requerirá la creación de un ambiente artificial en el laboratorio tal que favorezca el crecimiento del microorganismo buscado sobre los microorganismos competidores. Tanto en la formulación del medio de cultivo, la elección de las condiciones de incubación y el posible tratamiento previo de la muestra original, se pueden explotar características morfológicas y/o fisiológicas de los microorganismos buscados que les otorguen ventajas sobre los microrganismos competidores. Lo que se pretende con esto es inhibir a los microorganismos acompañantes tanto como sea posible de modo que no interfieran con el aislamiento de los microorganismos deseados. ESQUEMA DE FLUJO DE UN ENSAYO DE AISLAMIENTO Y CARACTERZACION DE UN MICROORGANISMO: Enriquecimiento y aislamiento

Muestra (fuente de material) (1) ⇒ enriquecimiento (2) ⇒ siembra en estrías para

. aislamiento (3) Caracterización e identificación cultivo stock

cultivos puros (1) Tener en cuenta qué organismos pueden o no estar presentes en la misma y si resulta

necesario un tratamiento previo de la muestra (Ej. shock térmico). (2) Se realiza en medio líquido, generalmente selectivo. Puede omitirse. (3) Generalmente en medios selectivos o selectivos-diferenciales, aunque no siempre. CONSIDERACIONES QUE AYUDAN A DETECTAR Y AISLAR UN CIERTA CLASE DE ORGANISMOS Y MINIMIZAN LAS INTERFERENCIAS CON OTROS: ♦ Elección de la muestra adecuada, con mayor probabilidad de que contenga el

microorganismo buscado. ♦ Tratamiento especial de la muestra (considerar si es o no de ayuda). Ejemplos:

secado de muestras de suelo para búsqueda de esporulantes, filtración de muestras de agua, centrifugación de muestras clínicas, etc.

♦ ¿Enriquecimiento o siembra directa?. Cuando se deban llevar a cabo recuentos de microorganismos o, en el caso que el microorganismo deseado sea relativamente abundante en la muestra, ésta no se somete a un enriquecimiento previo y se siembra directamente en placa. Con frecuencia, la muestra se inocula en un medio líquido, procedimiento que se denomina enriquecimiento. Si ese medio líquido tiene condiciones que supriman el crecimiento de los competidores no deseados, se denomina enriquecimiento selectivo. Este aumenta la probabilidad que las colonias del microorganismo deseado puedan aislarse en subsiguientes siembras en placa. El enriquecimiento selectivo es útil cuando los organismos buscados están en bajo número.


♦ Formulación adecuada del medio de aislamiento. Se llama así al medio en el cual se obtienen colonias aisladas del microorganismo buscado. La técnica de aislamiento se repetirá tantas veces como sea necesario hasta obtener un cultivo puro o axénico de microorganismo buscado. El medio de aislamiento es generalmente selectivo. La selectividad puede alcanzarse: 1) agregando un agente selectivo que impida el crecimiento de microorganismos no deseados o, 2) haciendo al medio restrictivo, ya sea por inclusión de un nutriente que sólo unos pocos organismos sean capaces de utilizar o excluyendo nutrientes.

♦ Condiciones de incubación. Se tendrán en cuenta la temperatura, la presencia o ausencia de oxígeno, de luz, o de una atmósfera incrementada en dióxido de carbono.

DETECCION DE LOS MICROORGANISMOS BUSCADOS DURANTE EL PROCESO DE ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO: Características observables: ♦ Apariencia de las colonias ♦ Presencia de endosporas por observación microscópica ♦ Forma, tamaño y distribución de las células al microscopio ♦ Presencia o ausencia de movilidad por observación en montaje húmedo ♦ Presencia o ausencia de pigmentos difusibles al medio PROCEDIMIENTO: Las muestras a procesar son. ♦ Arroz cocido para búsqueda de Bacillus cereus ♦ Agua de pozo para a) búsqueda de coliformes como indicadores de contaminación

fecal y b) búsqueda de Pseudomonas aeruginosa. ♦ Crema de leche batida para búsqueda de Staphylococcus aureus Bacillus cereus Día 1: Hacer una suspensión de 1 gramo de la muestra en 10 ml de caldo nutritivo y sembrar un inóculo denso del sobrenadante en una caja de medio Mossel, agar selectivo para B. cereus. Incubación 24-48 h a 30-37 ºC. Este medio se ajusta a las características de B. cereus. 1) Este bacilo es manitol negativo por lo cual el contenido en manitol del medio posibilita

la separación de la flora acompañante, manitol positiva, que se caracteriza por un viraje al amarillo del indicador de pH rojo fenol.

2) La flora usual de acompañamiento es inhibida por el agregado de polimixina al medio, a la que B. cereus es relativamente resistente. La adición de polimixina sólo es necesaria cuando se supone que la flora acompañante es abundante.

3) B. cereus produce lecitinasa. Esta enzima degrada la lecitina de la yema de huevo y los productos de degradación, insolubles, se acumulan alrededor de las colonias formando un precipitado blanco.

Composición en gramos/litro: peptona de carne: 10; extracto de carne: 1; D (-) manitol: 10; NaCl: 10; rojo fenol: 0,025; aditivos: emulsión yema de huevo: 100 ml y sulfato de polimixina B: 0,01 a 0,1 gramo. Día 2:


Observar las colonias obtenidas. Seleccionar aquéllas que se presenten como manitol negativo lecitinasa positivo. Observar, al microscopio óptico, extendidos de las mismas teñidos por la técnica de Gram. Buscar bacilos Gram positivos, esporulantes. Repicar las colonias que reúnan las características mencionadas en un medio no selectivo como agar nutritivo. Incubar 24-48 h a 30-37 ºC (obtención de cultivo puro). Día 3: Caracterización bioquímica del cultivo puro obtenido e identificación presuntiva del microorganismo buscado.

Coliformes

Día 1: Filtrar de 100 a 250 ml de la muestra a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa (0,2 μm de diámetro de poro). Retirar el filtro con pinza estéril y colocarlo en la superficie de una caja de agar EMB, cuidando de mantener hacia arriba la cara que estuvo en contacto con el agua. Incubar 24-48 h a 37 ºC. Día 2: Observar las características de las colonias obtenidas y seleccionar aquéllas que se presenten como lactosa positivas. Observar, al microscopio óptico, extendidos de las mismas teñidos por la técnica de Gram. Búscar bacilos Gram negativos. Repicar las colonias que reúnan las características mencionadas en un medio no selectivo. Incubar 24-48 h a 37 ºC. Obtención de cultivo puro. Día 3: Caracterización bioquímica del cultivo puro obtenido e identificación presuntiva del microorganismo buscado.

Pseudomonas aeruginosa

Día 1: Tomar 10 ml de la muestra de agua y sembrarlos en 100 ml de medio R3A para Pseudomonas, Incubar 18-24 h, a 30-37 ºC (enriquecimiento). Sembrar un inóculo denso del caldo de enriquecimiento en la superficie de una placa con agar Cetrimide. El añadido de Cetrimide (bromuro de cetiltrimetilamonio) en una concentración de 0,3 g/l inhibe a los microorganismos acompañantes, perjudicando mínimamente el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Día 2: Observar las características de las colonias obtenidas, a la luz visible y a la luz UV. La presencia de pigmentos fluorescentes es indicativo de Pseudomonas aeruginosa.


Observar, al microscopio óptico, extendidos de las bacterias coloreados por la técnica de Gram. Buscar bacilos Gram negativos. Observar movilidad en montaje húmedo. Pseudomonas aeruginosa es móvil por flagelos polares. Repicar las colonias que reúnan las características mencionadas en agar nutritivo. Obtención de cultivo puro. Día 3: Caracterización bioquímica del cultivo puro obtenido e identificación presuntiva del microorganismo buscado.

Staphylococcus aureus

Día 1: Realizar una suspensión de 1 g de muestra en 10 ml de medio de cultivo y sembrar un inóculo denso del sobrenadante en medio Baird-Parker. Este medio contiene LiCl y telurito para la inhibición de la flora acompañante, en tanto que el piruvato y la glicina actúan favoreciendo el crecimiento de Staphylococcus. Debido a la reducción del telurito a teluro, se desarrollan colonias negras. Incubar las cajas 24-48 h a 37 ºC. Día 2: Observar las características de las colonias obtenidas, seleccionando las que presenten pigmentación negra. Observar preparados de las mismas al microscopio óptico, buscando cocos Gram positivos dispuestos en racimo. Realizar un repique de las colonias seleccionadas en agar nutritivo. Incubar 24-48 h a 37 ºC. Obtención de cultivo puro. Día 3: Caracterización bioquímica del cultivo puro obtenido e identificación presuntiva del microorganismo buscado.


Desinfección de nódulos radículares inoculados con Rhizobia. El nitrógeno es un elemento esencial para la vida en nuestro planeta, sin embargo alrededor 80 % se encuentra en forma gaseosa, solo algunos géneros bacterianos son capaces de transformarlo en formas del nitrógeno metabólicamente utilizable por el resto de los organismos vivos. Rhizobia es una bacteria fijadora de nitrógeno que hace simbiosis con plantas leguminosas. Una vez dentro de la raíz, Rhizobia es capaz de inducir la deformación de raíces laterales en las plantas formando una estructura denominada nódulo radícular. Dentro de estos nódulos la bacteria encuentra un nicho adecuado para vivir utilizando hidratos de carbono que le provee la planta y por su parte Rhizobium por medio de la enzima nitrogenasa reduce el N2 atmosférico en NH3 metabólicamente utilizable por las plantas. De esta forma se establece una simbiosis Planta-bacteria que puede ser utilizada para la recuperación de suelos y en la agricultura. Metodología Separar con un bisturí el nódulo de la raíz. Colocarlo en una caja de petri estéril y cubrirlo con una solución de H2O2 al 30 % v/v (desinfectante) durante 15 minutos. Pasarlo a otra caja de petri utilizando una pinza flameada y cubrirlo con H2O destilada y estéril durante 20 minutos para detener el tratamiento. Pasarlo a una caja de petri seca para cortar el nódulo. Con una pinza y bisturí estéril cortarlo por la mitad y tomar con tip estéril del interior del nódulo. Sembrar haciendo una estría en una caja de petri que contiene medio YMB (diferencial) donde Rhizobium crece de color rojo debido a la presencia de rojo congo en el medio de cultivo y usando como fuente carbonada mannitol.

MANITOL 10g/L EXTRACTO DE LEVADURAS 0,5g/L MgSO4 7H2O 0,2g/L K2HPO4 0,5g/L NaCl 0,1g/L Agar 15 g/L Rojo Congo (adicionar 10ml de solución stock)

A partir de las colonias obtenidas preparar una suspensión en solución salina 0.9 %. Inocular plantas con 200 μl de suspensión de Rhizobium, recorriendo con el inoculo la raíz desde el ápice hacia el tallo.



Anexo TP Nº 6 y 7 : Medios de cultivo Agua Peptonada Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interés sanitario. Fundamento: Recomendado para ser utilizado en lugar de solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por procesos fisicoquímicos a que ha sido sometido el alimento.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de carne 10.0 Cloruro de sodio 5.0

Suspender el polvo en agua destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

pH final: 7.2 ± 0.2

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento

Escherichia coli Bueno Staphylococcus aureus Bueno

Pseudomonas aeruginosa Bueno Características del medio: Medio preparado: ámbar claro Agua Peptonada Alcalina Utilizado para el enriquecimiento de las muestras clínicas y alimentos en la búsqueda de Vibrio parahemolyticus y cholerae. Fundamento: La viabilidad de los vibrios se mantiene intacta a pH alcalino, y ha sido recomendada por numerosos autores para incrementar la recuperación de los mismos en materia fecal y otras muestras, incubando de 5 a 8 h a 37° C antes de la siembra en TCBS.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de carne 10.0

Cloruro de sodio 10.0


pH final: 8.6 ± 0.2 Siembra Como pre-enriquecimiento: • Heces: suspender 1 g de materia fecal o el contenido del hisopo en 10 ml de agua peptonada alcalina. • Alimentos: 25 g del alimento en 225 ml de agua peptonada alcalina. • Agua: filtrar 1 a 10 l. Sembrar en un tubo de agua peptonada la membrana. • Microorganismos: sembrar una colonia del microorganismo en 10 ml.

Interpretación de Resultados

Microorganismos Crecimiento V. cholerae Bueno

V. parahaemolyticus Bueno V. fluvialis Bueno

V. vulnificus Bueno


Agua Peptonada Bufferada Medio de preenriquecimiento usado antes del enriquecimiento selectivo y para que facilite el aislamiento de Salmonella a partir de alimentos.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de carne 10.0 Cloruro de sodio 5.0

Fosfato disódico 3.5

Fosfato monopotásico 1.5


pH final: 7.2 ± 0.2


Escherichia coli Bueno Staphylococcus aureus Bueno

Pseudomonas aeruginosa Bueno Salmonella enteritidis Bueno

Salmonella typhimurium Bueno Características del medio: Medio preparado: ámbar claro Agua triptona Medio líquido recomendado para enriquecimiento y para verificar la producción de indol por los microorganismos.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Triptona 10.0 Cloruro de sodio 5.0

Suspender el polvo en agua destilada. Mezclar bien y distribuir.Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

pH final: 7.5 ± 0.2 Interpretación de Resultados

Microorganismos Producción de indol Crecimiento Escherichia coli Positivo Bueno

Staphylococcus aureus Negativo Bueno Pseudomonas aeruginosa Negativo Bueno

Salmonella enteritidis Negativo Bueno Enterococcus faecalis Negativo Bueno

Streptococcus pyogenes Negativo Bueno

Características del medio: Medio preparado: beige claro Antibióticos Medio para Ensayo Preparado de acuerdo a normas internacionales: Farmacopea de los Estados Unidos de América, Farmacopea Británica y otros trabajos de referencia, por ejemplo el libro de Grove y Randall.

Medio de Ensayo Fórmula (en gramos por litro) N° 1 N° 2 N° 3

N° 11

N° 12

N° 19

Instrucciones

Peptona de carne 6.0 6.0 5.0 6.0 10.0 9.4 Tripteína (Pep. de caseína) 4.0 0.0 0.0 4.0 0.0 0.0 Extracto de levadura 3.0 3.0 1.5 3.0 5.0 4.7

Disolver la cantidad necesaria (ver tabla) en un litro de agua

destilada. Homogeneizar y hervir


Extracto de carne 1.5 1.5 1.5 1.5 2.5 2.4 Glucosa 1.0 0.0 1.0 1.0 10.0 10.0 Cloruro de sodio 0.0 0.0 3.5 0.0 10.0 10.0 Fosfato dipotásico 0.0 0.0 3.68 0.0 0.0 0.0 Fosfato monopotásico 0.0 0.0 1.32 0.0 0.0 0.0 Agar 15.0 15.0 0.0 15.0 25.0 23.5

pH final 6.5 6.5 7.0 7.9 6.1 6.1Dosificación (gramo-litro) 30.5 25.5 17.5 30.5 62.5 60.0

un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C.

Características del medio: Medio preparado: ámbar

Bacillus Cereus Selectivo Agar Medio diagnóstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus en alimentos. Fundamento: Este microorganismo ha sido implicado en toxoinfecciones alimentarias, particularmente por el consumo de arroz contaminado. Además, ha sido implicado en algunos procesos infecciosos humanos. En la formulación de este medio de cultivo -Agar selectivo para Bacillus cereus- el contenido de peptona es bajo 0.1% y la adición de piruvato de sodio y emulsión de yema de huevo mejora el aislamiento y esporulación de esta bacteria. Para verificar la utlización del manitol se usa un indicador de pH, azul de bromotimol. Este medio se hace selectivo por el agregado del suplemento para Bacillus cereus (código B03-606-32) que da una concentración final de 100 U de Polimixina B por ml de medio.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 1.0 Manitol 10.0 Cloruro de sodio 2.0 Sulfato de magnesio 0.1 Fosfato disódico 2.5 Fosfato monopotásico 0.25 Azul de bromotimol 0.12 Piruvato de sodio 10.0 Agar 14.0

Suspender el polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 5 a 10 minutos. Calentar con agitación frecuente hasta completar disolución. Esterilizar por autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y asépticamente agregar el contenido de 1 vial de suplemento selectivo para Bacillus cereus reconstituido con 2 ml de agua destilada estéril. Luego agregar 50 ml de Emulsión yema de huevo. Mezclar bien y distribuir en placas de Petri estériles.

pH final: 7.2 ± 0.2 Siembra Homogeneizar 10 g de la muestra de alimento en 90 ml de agua peptonada 0.1%. Efectuar diluciones y sembrar sobre la superficie del medio. Incubar las placas 24 h a 37°C. Examinar para buscar colonias típicas de Bacillus cereus y confirmar su presencia por coloraciones. El diagnóstico primario se basa en la apariencia de la colonia, precipitación de la lecitina hidrolizada y en la falta de utilización del manitol por Bacillus cereus. Las colonias típicas de B. cereus son crenadas, cerca de 5 mm de diámetro y tienen un color azul brillante tornasol (peacock blue) rodeado por un precipitado de yema de huevo del mismo color. Estos hallazgos diferencian B. cereus de otras especies de Bacillus excepto B. thuringiensis. Otros microorganismos que crecen bien en el medio dando reacción sobre la yema de huevo, incluyen a Staphylococcus aureus, Serratia marcescens y Proteus vulgaris que se diferencian de B. cereus por la forma de la colonia y el color. Estos microorganismos producen una reacción de aclaramiento sobre la yema de huevo en contraste al precipitado que produce B. cereus. Además se recomienda un examen microscópico para evaluar la presencia de glóbulos de lípidos en las células vegetativas que es una prueba rápida y confirmatoria de B. cereus.


Microorganismos Crecimiento

Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Staphylococcus aureus Serratia marcescens

Proteus mirabilis Bacillus cereus

El diagnóstico primario se basa en la apariencia de la colonia, precipitación de la lecitina hidrolizada y en la falta de utilización del manitol por Bacillus cereus. Las colonias típicas de B. cereus son crenadas,cerca de 5 mm de diámetro y tienen un color azul brillante tornasol (peacock blue) rodeado por unprecipitado de yema de huevo del mismo color. Estos hallazgos diferencian B. cereus de otras especies


de Bacillus excepto B. thuringiensis. Otros microorganismos que crecen bien en el medio dandoreacción sobre la yema de huevo, incluyen a Staphylococcus aureus, Serratia marcescens y Proteusvulgaris que se diferencian de B. cereus por la forma de la colonia y el color. Estos microorganismosproducen una reacción de aclaramiento sobre la yema de huevo en contraste al precipitado queproduce B. cereus. Además se recomienda un examen microscópico para evaluar la presencia de glóbulos de lípidos en las células vegetativas que es una prueba rápida y confirmatoria de B. cereus.

Características del medio: Medio preparado: verde manzana Baird Parker Medio Base Medio de alta especificidad diagnóstica y selectividad para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos. Fundamento: El medio preparado y completo contiene cloruro de litio y telurito de potasio para inhibir el desarrollo de la flora microbiana acompañante, mientras que el piruvato de sodio y la glicina estimulan selectivamente el crecimiento de estafilococos. El agregado de yema de huevo permite visualizar colonias convexas de color negro rodeado de una zona transparente debido a la lipólisis y proteólisis. Las mismas deben ser confirmadas por la prueba de coagulasa.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de caseína 10.0 Extracto de carne 5.0 Extracto de levadura 1.0 Cloruro de litio 5.0 Agar 17.0 Glicina 12.0 Piruvato de sodio 10.0

Suspender el medio deshidratado en 940ml de agua destilada. Dejar en reposo 5 a 10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras) durante 15 minutos. Enfriar a 45°-50°C y agregar 50 ml de la emulsión de yema de huevo y 10ml de la solución de telurito Homogeneizar y distribuir en cajas de Petri.

pH final: 6.8 ± 0.2 Siembra Dejar secar la superficie de la placa preparada y extender 0.1 ml de la dilución de la muestra a analizar. Incubar 24-48 h a 37°C.

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Apariencia

E. coli Ninguno Ninguno P. mirabilis Bueno Marrón S. aureus Bueno a excelente Negras con borde blanco, rodeado de una zona clara.

S. epidermidis Escaso o bueno negra, tamaño irregular. Zona opaca alrededor de la colonia sin zona clara alrededor.

E. faecium Escaso Igual al anterior Micrococcus Escaso Colonias marrón a negro.

Característica del medio: Medio preparado: ámbar claro opalescente Cetrimida Agar Base Este es un medio para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y otras especies de este género. Fundamento: La fórmula de este medio está desarrollada para favorecer la selección de P. aeruginosa y estimular la formación de pigmentos. Es éste un medio muy semejante al King A, en el cual el cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formación de piocianina, pioverdina y piomelanina de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catiónico que actúa como agente inhibidor, libera el nitrógeno y el fósforo de las células de casi toda la flora acompañante, aunque inhibe también algunas especies de Pseudomonas.


Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de gelatina 20.0 Cloruro de magnesio 1.4 Sulfato de potasio 10.0 Agar 13.6 Cetrimida 0.3

Suspender el polvo en agua destilada. Mezclar bien y distribuir.Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

pH final: 7.2 ± 0.2 Siembra En superficie a partir de un caldo de enriquecimiento (caldo Cerebro Corazón o tripteína soja), o bien directamente de la dilución de la muestra. Incubación De 24 a 48 horas a 35°C.


Pseudomonas aeruginosa Bueno - excelente Pseudomonas fluorescens Bueno

Pseudomonas putida Bueno Pseudomonas stutzeri Inhibido

Escherichia coli Inhibido Staphylococcus aureus Inhibido

Características del medio Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado. E.M.B. Agar Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento: Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.


Peptona 10.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Fosfato dipotásico 2.0 Agar 13.5 Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065

Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.

pH final: 7.2 ± 0.2 Siembra En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.


Incubación De 24 a 48 horas a 35°C

Interpretación de Resultados Microorganismos Tipo de Colonia

Escherichia coli Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado Enterobacter, Klebsiella spp. Mucosas, rosadas, confluentes Proteus, Salmonella, Shigella Incoloras Enterococcus Incoloras, pequeñas, puntiformes Candida spp. Incoloras o rosadas, secas, puntiformes Acinetobacter spp Azul lavanda, pequeñas a medianas. Características del medio Medio preparado: verde con matiz naranja, puede tener un ligero precipitado. Placas preparadas: púrpura anaranjado verdoso. Lactosado Caldo Se recomienda como prueba presuntiva para investigar la presencia de bacterias del grupo coliformes en agua, leche, etc. Actualmente también está indicado para el preenriquecimiento no selectivo en la búsqueda de Salmonella spp. Fundamento Es un medio rico libre de inhibidores, la fermentación de la lactosa está demostrada por la presencia de gas en las campanas Durham.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 3.0 Peptona 5.0 Lactosa 5.0

Suspender 13 g por litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir en tubos con campanitas de Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

pH final: 6.9 ± 0.2 Siembra Para volúmenes pequeños (1 ml) usar caldo simple concentración. Para volúmenes grandes (10 ml) usar doble concentración. Cuando se emplea como preenriquecimiento no selectivo en la búsqueda de salmonella se siembra 25 g en 225 ml de caldo lactosado. Incubación Incubar a 35°C por 24-48 h cuando se utiliza para detectar la fermentación de lactosa y 24 h para preenriquecimiento de salmonella.

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Producción de gas

Enterobacter aerogenes Bueno + Enterococcus faecalis Bueno -

Escherichia coli Bueno + Características del medio Medio preparado: ámbar claro, transparente sin precipitado. Lisina Hierro Agar Este medio, basado en la decarboxilación y desaminación oxidativa de la lisina, la fermentación de la glucosa y la formación de sulfuros, se usa para diferenciar las especies de Salmonella y Arizona de especies de Citrobacter.


Fundamento La lisina presente en el medio es decarboxilada a cadaverina y dióxido de carbono; en el proceso interviene la lisina decarboxilasa y el medio aumenta de pH haciendo virar el indicador hacia el púrpura, en la totalidad del tubo. En aquellas cepas en que el proceso es de desaminación (Proteus, Providencia, Morganella spp.) se produce un color rojo sobre el pico de flauta, por el uso de las peptonas. Los organismos que no decarboxilan la lisina, producen una zona alcalina en la zona inclinada y una zona ácida en el fondo del tubo. El sulfhídrico producido ennegrece el medio.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de gelatina 5.0 Extracto de levadura 3.0 Glucosa 1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y amonio 0.5 Tiosulfato de sodio 0.04 Púrpura de bromocresol 0.02 Agar 15.0

Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción.

pH final: 6.7 ± 0.2 Siembra Por punción profunda con aguja de inoculación. Incubación 24 horas a 35°C.


Microorganismos Color en el pico de flauta

Color en el base tubo SH2

Salmonella spp. Púrpura Púrpura + Arizona spp. Púrpura Púrpura +

Edwardsiella spp. Púrpura Púrpura + Proteus mirabilis Rojo Amarillo -

Citrobacter freundii Púrpura Amarillo + Providencia Rojo Amarillo -

Morganella spp. Rojo Amarillo - E. coli Púrpura Púrpura -

Shigella Púrpura Amarillo - Mac Conkey Agar Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Fundamento: La mezcla de sales biliares y el cristal violeta inhiben gran parte de la flora Gram positiva. Las colonias lactosa positivas son rojas debido a la caída de pH que produce la absorción del rojo neutro con un halo turbio debido al precipitado de las sales biliares. Las colonias lactosa negativas son incoloras. Este medio corresponde a la fórmula recomendada por la APHA para la siembra directa en placas de muestras de agua para el recuento de coliformes. Además es usado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella en variedad de muestras clínicas. La siembra en medio Mac Conkey permite además, diferenciar bacilos Gram negativos facultativos u oxidativos de difícil desarrollo (Haemophilus, Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, etc.).


Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 17.0 Pluripeptona 3.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 1.5 Cloruro de sodio 5.0 Agar 13.5 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.001

Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

pH final: 7.1 ± 0.2 Siembra e incubación Sembrar en superficie un inóculo ligero e incubar de acuerdo a la muestra a procesar.

Interpretación de Resultados Microorganismos Colonias

Escherichia coli Rojas con halo turbio Klebsiella spp., Enterobacter spp. Rosadas mucosas

Salmonella spp., Shigella spp. Incoloras, transparentes Proteus spp. Enterococcus spp. Diminutas, opacas

Características del medio Medio preparado: rojo púrpura Mac Conkey con Sorbitol Agar Medio selectivo y diferencial usado para facilitar el aislamiento de Escherichia coli 0157:H7. Fundamento La fórmula es similar al Agar Mac Conkey pero la lactosa ha sido reemplazada por sorbitol. E. coli 0157:H7 no fermenta el sorbitol dando colonias transparentes mientras que la mayoría de E. coli la fermenta dando colonias rosadas.


Peptona 20.0 Sorbitol 10.0 Sales biliares N° 3 1.5 Cloruro de sodio 5.0 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.001 Agar 15.0

Suspender 51,5 g de polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos, llevar a ebullición hasta disolución total. Esterilizar por autoclave a 121°C por 15 minutos.

pH final: 7.1 ± 0.2 Siembra Sembrar en superficie la suspensión del alimento, heces, etc., de manera tal de lograr colonias aisladas. Incubar a 37°C por 24 h.


Microorganismos Crecimiento Características de la colonia Escherichia coli 0157:H7 Bueno Transparente

Escherichia coli ATCC 25922 Bueno Rosado Características del medio Medio preparado: rojo púrpura


Mac Conkey Caldo Este medio selectivo se utiliza para la investigación orientativa de microorganismos coliformes en aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento Los microorganismos capaces de utilizar lactosa, acidifican este caldo que vira al amarillo; los coliformes además, producen generalmente gas a partir de la lactosa. La bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes, mientras que inhibe a gran parte de la flora gram positiva.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Bilis de buey 5.0 Peptona 20.0 Lactosa 10.0 Púrpura de bromocresol 0.01

Suspender 35 g de polvo por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

pH final: 7.3 ± 0.2 Siembra A partir de diluciones de la muestra, sembrar: Este esquema es orientativo, ya que las diluciones dependerán de la contaminación de la muestra.

Dilución Número de tubos

Volúmen medio

Concentr. del medio

1° 3 10 ml Doble 2° 3 10 ml Simple 3° 3 10 ml Simple

Incubación Durante 48 horas a 35°C.

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Ácido Gas

Escherichia coli Excelente + + Enterobacter spp. Excelente + +

Staphylococcus aureus Inhibido - - Características del medio Medio preparado: púrpura Manitol Salado Agar Medio selectivo recomendado por Chapman para el aislamiento de estafilococos presuntamente patógenos a partir de alimentos. Fundamento Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa. Este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 1.0 Pluripeptona 10.0 d-Manitol 10.0 Cloruro de sodio 75.0 Agar 15.0 Rojo fenol 0.025

Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

pH final: 7.4 ± 0.2


Siembra Sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra. Incubación 36 horas a 37°C (la American Public Health Assoc. recomienda 3 días de incubación a 32°C).

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Características de la colonia

Staphylococcus aureus Amarilla Excelente Staphylococcus epidermidis Roja Escaso - Bueno

Escherichia coli --- --- Enterobacter, Klebsiella spp. --- ---

Vibrio parahemolyticus Amarilla Excelente Características del medio Medio preparado: rojo M.R.S. agar El Agar M.R.S. fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe para proveer un medio que pudiera evidenciar un buen crecimiento de lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Proteosa peptona Nº3 10.0 Extracto de carne 8.0 Extracto de levadura 4.0 Glucosa 20.0 Monoleato de sorbitan 1 ml Fosfato dipotásico 2.0 Acetato de sodio 5.0 Citrato de amonio 2.0 Sulfato de magnesio 0.2 Sulfato de manganeso 0.05 Agar 13.0

Suspender 64 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 ó 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC.

pH final: 6.4 ± 0.2


Lactobacillus fermentum ATCC 9338 Bueno Lactobacillus gasseri ATCC 33323 Bueno

M.R.S. Caldo El Agar M.R.S. fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe para proveer un medio que pudiera evidenciar un buen crecimiento de lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas.


Proteosa peptona Nº3 10.0 Extracto de carne 8.0 Extracto de levadura 4.0 Glucosa 20.0 Monoleato de sorbitan 1 ml Fosfato dipotásico 2.0 Acetato de sodio 5.0 Citrato de amonio 2.0

Suspender 51 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 ó 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC.


Sulfato de magnesio 0.2 Sulfato de manganeso 0.05

pH final: 6.4 ± 0.2


Lactobacillus fermentum ATCC 9338 Bueno Lactobacillus gasseri ATCC 33323 Bueno

m-Caldo Triptona Glucosa Extracto de Carne (m-T.G.E.) Medio de cultivo no selectivo usado para evaluar recuentos bacterianos por el método de filtración por membrana.


Extracto de carne 6.0 Tripteina bacteriológica 10.0 Glucosa 2.0

Suspender 18 g del polvo en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Una vez disuelto, distribuir y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC.

pH final: 7.0 ± 0.2


Escherichia coli ATCC 25922 Bueno Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bueno

Presencia - ausencia caldo Este medio se utiliza para determinar la presencia o ausencia de bacterias coliformes en aguas tratadas.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 3 Peptona de carne 5 Lactosa 7.5 Tripteina 10.0 Fosfato dipotásico 1.375 Fosfato monopotásico 1.375 Cloruro de sodio 2.5 Lauril sulfato de sodio 0.05 Púrpura de bromocresol 0.0085

Suspender 92.4 g del polvo en un litro de agua destilada para preparar un caldo de triple concentración. Distribuir 50 ml de caldo en frasco de tapa a rosca de 250 ml de capacidad. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

pH final: 6.8 ± 0.2

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Resultados

Escherichia coli ATCC 25922 Bueno Amarillo con gas Enterococcus faecalis ATCC 29212 Moderado Ligero cambio de color

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Pobre o moderado Sin cambio de color


Pseudomonas agar F Este medio con el agregado de glicerina se usa para detectar y diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras pseudomonas basado en la producción de fluoresceína. Conocido también como medio King B.


Tripteina 10.0 Peptona de carne 10.0 Fosfato dipotásico 1.5 Sulfato de magnesio 1.5 Agar 15.0

Suspender 38 g del polvo en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerina. Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 ºC.

pH final: 7.2 ± 0.2

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Producción de pigmento

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bueno Verde amarillento Pseudomonas cepacia Bueno No pigmenta

Pseudomonas agar P Este medio con el agregado de glicerina se usa para detectar y diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras pseudomonas basado en la producción de piocianina. Conocido también como medio King A.


Peptona de gelatina 20.0 Sulfato de potasio 10.0 Cloruro de magnesio 1.4 Agar 15.0

Suspender 46.4 g del polvo en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerina. Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 ºC.

pH final: 7.0 ± 0.2


Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bueno Azul

Pseudomonas cepacia Bueno No pigmenta Recuento en Placa Agar Medio recomendado para el recuento de colonias en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. Fundamento La productividad de este medio está basada en el alto contenido nutricional de sus componentes que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. Cuando se analiza leche y productos lácteos algunos autores recomiendan suplementarla con leche descremada estéril de uso bacteriológico en una proporción de 1 g por litro.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de levadura 2.5 Tripteína 5.0 Glucosa 1.0 Agar 15.0

Suspender 23,5 g en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición con agitación constante. Distribuir. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C.

pH final: 7.0 ± 0.2


Siembra Preparar las diluciones de la muestra a analizar. Sembrar 1 ml y agregar 15 ml de agar recuento en placa por placa de Petri. Incubar 24-48 horas a 32-35°C según el alimento.


Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bueno Bacillus cereus Bueno

Escherichia coli ATCC 25922 Bueno Lactobacillus spp. Regular

Streptococcus agalactiae Bueno Características del medio Medio preparado: ámbar claro. Salmonella Shigella Agar

Es este un medio diferencial para el aislamiento de Salmonella spp. y algunas Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Fundamento La selectividad de este medio se basa en la elevada concentración de tiosulfato, citrato, sales biliares y el verde brillante, que inhibe las bacterias coliformes. Este medio diferencia los pocos microorganismos fermentadores de lactosa que son capaces de desarrollar, de los no fermentadores de lactosa. Los primeros acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH. Las colonias son rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, dan colonias transparentes. Los microorganismos formadores de sulfhídrico a partir de tiosulfato dan colonias con centro negro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en caldo Selenito (B02-120-05).

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 8.5 Citrato de sodio 8.5 Tiosulfato de sodio 8.5 Citrato férrico 1.0 Agar 13.5 Verde brillante 0.00033

Rojo neutro 0.025

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

pH final: 7.0 ± 0.2 Siembra Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones: se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar EMB (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05). Incubación 24 horas a 35°C.


Salmonella spp. (SH2 -), Shigella spp. Incoloras Salmonella spp. (SH2 +), Proteus spp. Transparentes, centro negro

Escherichia coli Rosadas a rojas Enterobacter, Klebsiella spp. Rosadas cremosas y mucosas

Enterococcus spp. Incoloras, de muy escaso crecimiento Características del medio Medio preparado: rojo naranja.


Selenito Cistina Caldo Medio de enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella spp. en alimentos, productos lácteos y otras materias de importancia sanitaria. Fundamento El selenito inhibe el crecimiento de coliformes y enterococos. La adición de L-cistina fue propuesta por la FDA para el aislamiento de salmonella en productos alimenticios incrementando la recuperación por reducción de la toxicidad del selenito.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 5.0 Lactosa 4.0 Fosfato de sodio 10.0 Selenito de sodio 4.0 L-Cistina 0.01

Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta disolución completa. Evite el calentamiento excesivo y no esterilice en autoclave.

pH final: 7.0 ± 0.2 Siembra Puede realizarse la siembra partiendo de un caldo de preenriquecimiento o en forma directa conservando la proporción 1:10. El medio debe prepararse el mismo día en que se usa. Incubación 24-48 horas a 37°C.


Salmonella thyphymurium Buena Salmonella cholerasuis Buena

Salmonella typhi Buena E. coli Sin incremento o incremento muy pequeño.

Características del medio Medio preparado: ámbar muy claro de transparente a ligeramente opalescente. Tetrationato Caldo La base de tiosulfato, con el agregado de una solución iodo iodurada, da lugar a la producción de tetrationato que actúa como medio selectivo para el aislamiento de Salmonella spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento Las salmonellas reducen el tetrationato y crecen abundantemente en este medio, mientras que gran parte de la flora acompañante queda inhibida. Para evitar la proliferación de especies de Proteus, se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada. Este caldo se recomienda como medio de enriquecimiento para muestras de aguas y alimentos sospechosos de contener salmonelas.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 5.0 Sales biliares 1.0 Carbonato de calcio 10.0 Tiosulfato de sodio 30.0

pH final: 8.4 ± 0.2 Solución iodo iodurada

Iodo 6.0 Ioduro de potasio 5.0 Agua 20.0

Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullición. Enfriar a 45°C o menos. Agregar 20 ml de solución iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en tubos estériles. No debe calentarse luego de agregar la solución iodada. El medio base puede mantenerse a 4°C , dura varios meses, pero una vez agregada la solución iodada debe usarse en el mismo día.


Siembra Puede realizarse la siembra partiendo de un caldo de preenriquecimiento o en forma directa conservando la proporción 1:10. El medio debe prepararse el mismo día en que se usa. Incubación 24-48 horas a 37°C.

Interpretación de Resultados Microorganismos Colonias Salmonella typhi Bueno-excelente

Salmonella typhimurium Bueno-excelente Escherichia coli Escaso

Características del medio Medio preparado: suspensión blanco lechosa. Verde Brillante Agar Medio altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp. excepto S. typhy y S. paratyphy y Shigella spp. Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas. Fundamento La selectividad de este medio se basa en el efecto inhibidor de la bilis y el verde brillante sobre microorganismos Gram positivos; S. typhi, S. paratyphi, Shigella y algunos Proteus también son inhibidos. Las colonias típicas de Salmonella spp. son rosadas o transparentes sobre un fondo rojo brillante, mientras que los microorganismos fermentadores de lactosa acidifican el medio, que vira al amarillo.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 10.0 Extracto de levadura 3.0 Cloruro de sodio 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Rojo fenol 0.08 Verde brillante 0.0125 Agar 20.0

Suspender 58 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 2 o 3 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. Secar la superficie del medio por unos minutos en la estufa.

pH final: 6.9 ± 0.2 Siembra Sembrar en superficie por estriado a partir de una dilución del material a investigar o de un cultivo previo en un medio de enriquecimiento selectivo, como caldo Selenito (B02-120-05) o caldo Tetrationato (B02-145-05). Para el tratamiento de materia fecal se recomienda hacer cultivo primario en medios menos selectivos, como agar Salmonella Shigella (B02-138-05), o agar Mac Conkey (B02-114-05). Incubación Incubar 24 horas a 37°C.


Salmonella spp., Organismos lactosa (-) Rosa, blancas o transparentes sobre fondo rojo E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp. Verde amarillento sobre fondo amarillento

Características del medio Medio preparado: verde. Verde Brillante Bilis 2% Caldo Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del número más probable.


Fundamento Los componentes de este medio favorecen el crecimiento de bacterias coliformes, mientras que la bilis al 2% y el verde brillante inhiben gran parte de la flora acompañante. La fermentación de la lactosa con producción de gas caracteriza a los coliformes.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Bilis de buey deshidratada 20.0 Lactosa 10.0 Peptona 10.0 Verde brillante 0.0133

Suspender 40 g del polvo deshidratado por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Preparar además, el medio a doble concentración. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

pH final: 7.2 ± 0.2 Siembra Para recuento de coliformes totales: Sembrar los tubos de verde brillante y bilis 2% con las diluciones de la muestra a analizar. Si se presume baja concentración de coliformes sembrar diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Si la contaminación es mayor sembrar diluciones mayores.

Número de tubos

Volúmen muestra

Volúmen medio

Concentr. del medio

3 10 ml 10 ml Doble 3 1 ml 10 ml Simple 3 0.1 ml 10 ml Simple

Incubación Incubar los tubos a 32°C por 24-48 horas. Resultados Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas. Siembra Para recuento de coliformes fecales: a partir de los tubos con gas de coliformes totales, sembrar una alícuota en verde brillante y bilis al 2% fresco y otra en caldo tripteína para detectar la producción de indol. Incubación Incubar los tubos a 45,5°C por 24-48 horas. Resultados Considerar como coliformes fecales positivos aquellos que producen gas (lo hacen a partir de la lactosa) y dan reacción de indol positivo.

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Gas Indol#

Escherichia coli + +* +* Enterobacter spp. + + -*

Klebsiella spp. + +* -* Salmonella spp. + - -

No fermentadores de lactosa + - Variable Staphylococcus aureus - - -

+* ó -* 10-25% de cepas negativas o positivas # a partir de caldo de tripteína

Características del medio Medio preparado: verde esmeralda, transparente


Violeta Rojo y Bilis Agar Este es un medio selectivo para la investigación presuntiva de coliformes en alimentos y productos lácteos. Fundamento Los coliformes que fermentan la lactosa, forman en este medio colonias color rojo púrpura de 1 a 2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada. El rojo neutro en el medio indica una producción de ácido, mientras que las sales biliares y el cristal violeta son agentes inhibidores de la flora Gram positiva.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de levadura 3.0 Peptona 7.0 Sales biliares 1.5 Lactosa 10.0 Cloruro de sodio 5.0 Agar 15.0 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.002

Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45°C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.

pH final: 7.4 ± 0.2 Siembra • Para recuento: Sembrar 1 ml de la dilución y añadir 10 a 15 ml del medio a 45°C. Mezclar con movimientos de vaivén. Una vez solidificado, agregar una sobrecapa de medio para crear condiciones anaeróbicas y evitar el crecimiento invasivo tipo Proteus. • Para confirmación: Sembrar en superficie, una ansada a partir de los tubos con gas de un medio para coliformes. Incubación Incubar 24 horas a 32°C. Recomendaciones: Se recomienda interpretar los resultados entre las 18-24 horas de incubación, ya que posteriormente pueden desarrollar aquellos microorganismos que resistieran a los agentes inhibitorios.


Enterobacterias fermentadoras de lactosa Rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de recipitación rojizo

Enterobacterias no fermentadoras de lactosa Incoloras Enterococcus spp. Rosadas como punta de alfiler

Características del medio Medio preparado: púrpura rojizo. Violeta Rojo y Bilis Glucosa Agar Fue desarrollado para detectar las enterobacterias totales, por consiguiente, posee amplia aplicación en la evaluación microbiológica de los alimentos. Fundamento La presencia de violeta cristal y las sales biliares inhiben la flora acompañante. Las enterobacterias fermentan la glucosa con la consiguiente formación de ácido haciendo virar el medio a rojo y eventualmente la precipitación de ácidos biliares alrededor de la colonia.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de carne 7.0 Extracto de levadura 3.0 Cloruro de sodio 5.0 Glucosa 10.0 Mezcla de sales biliares 1.5 Rojo neutro 0.03 Violeta cristal 0.002 Agar 15.0

Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta disolución total. NO AUTOCLAVAR.

pH final: 7.3 ± 0.2


Siembra Preparar una serie de diluciones de la muestra de tal forma que se incluya al menos una que proporcione entre 20-200 UFC/ml a partir de una alícuota de 1 ml. Sembrar 1 ml de cada una de las diluciones a placa de Petri de 9 cm de diámetro. Añadir 15 ml de medio a 47°C, girar las placas sobre la mesa de trabajo para homogeneizar. Una vez que se haya solidificado el medio cubrirla con 10 ml del mismo medio y dejar solidificar. Esta nueva capa de agar asegura la existencia de condiciones anaeróbicas que suprime el crecimiento de las bacterias gram negativas no fermentadoras y estimula la fermentación de la glucosa. También puede ser usado en superficie, en tal caso verter 15 ml de medio por placa, dejar solidificar y antes de sembrar secar las placas. Incubación A 30-37°C por 18-24 horas.


Escherichia coli Bueno Rojo púrpura Salmonella Bueno Rojo púrpura

Staphylococcus aureus Inhibido --- Características del medio Medio preparado: púrpura rojo. Caldo de Enriquecimiento para Enterobacterias (según Mossel) Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de todas las Enterobacteriaceae, a partir de alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de carne 10.0 Glucosa 5.0 Bilis de Buey 20.0 Verde brillante 0.015 Fosfato disódico 6.45 Fosfato monopotásico 2.0

Suspender 43.5 g del polvo en un litro de agua destilada. Distribuir 100 ml en frascos de 300 ml y calentar a 100º C durante 30 minutos. Enfriar rapidamente en agua corriente. El medio es muy sensible al calor, NO AUTOCLAVE

pH final: 7.2 ± 0.2


Escherichia Coli + Shigella flexneri +

Salmonella typhimurium + Proteus mirabilis +

Staphylococcus aureus - Bacilius cereus -

Enterococcus faecalis - Características del medio Medio preparado: rojo naranja.


Suplementos para medios de cultivo Emulsión Yema de Huevo Emulsión estabilizada y estéril de yema de huevo para incorporar a medios de cultivos para múltiples propósitos. Permite la identificación de Clostridium, Bacillus y especies de Staphylococcus por su actividad lecitinásica.

Para ser usado en el medio Baird-Parker que le confiere una opacidad adecuada para discernir las zonas de aclaramiento por proteólisis.

Como fluido neutralizante de las muestras: en el caso de su utilización junto al tween 20 como neutralizante de las muestras para investigar pinturas bactericidas y en el caso de medios de cultivo muy inhibidores.

Sol. de Telurito de Potasio Es una solución estéril al 1% de telurito de potasio. Se utiliza en la preparación del medio Baird-Parker y del Giolitti Cantoni. También se puede utilizar en medios de identificación microbiana, una reacción positiva se nota por un color negro que es de reducción de telurito a teluro. Suplemento Selectivo para Bacillus Cereus La polimixina B es utilizada en el medio para Bacillus cereus como agente inhibidor de la flora acompañante.

Fórmula por vial Instrucciones

Polimixina B 100.000 UI Reconstituir el contenido del vial con 2 ml de agua destilada estéril. Cada vial sirve para preparar 1 litro de medio de cultivo.

Medios preparados para filtración por membrana Caldo M-Endo Desarrollado para el recuento de coliformes totales en agua, bebidas y otras muestras por medio de la técnica de filtración por membrana. Fundamento Las bacterias fermentadoras de lactosa producen durante la fermentación aldehidos, que en combinación con la fucsina y el sulfito presentes en el medio le confieren a la colonia un brillo metálico, mientras que las colonias de las no fermentadoras son rosadas.

Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona 10.0 Peptona 5.0 Tripteína 5.0 Extracto de levadura 1.5 Lactosa 12.5 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato dipotásico 4.375 Fosfato monopotásico 1.375 Lauril sulfato de sodio 0.05 Desoxicolato de sodio 0.1 Sulfito de sodio 2.1 Fucsina básica 1.05

pH final: 7.2 ± 0.2


Siembra Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación de la muestra. Embeber la almohadilla con el caldo M-ENDO hasta la saturación (la cantidad de medio de cultivo depende del grado de absorción de la misma). Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo. Incubación Incubar las placas a 35°C por 24 horas. Ocasionalmente, los microorganismos no coliformes pueden producir brillo metálico. Para confirmar las colonias sospechosas, transferirlas a tubos con caldo lactosado verde brillante bilis al 2%, con campanitas de Durham. Incubar los tubos por 24-48 horas a 25°C. Los coliformes habrán producido gas por fermentación de la lactosa, al cabo de ese período.

Interpretación de Resultados Microorganismos Crecimiento Color colonias

Escherichia coli Bueno Brillo metálico Citrobacter freundii Bueno Brillo metálico Proteus mirabilis Bueno Incoloro

Staphylococcus aureus Inhibido ------ El recuento debe realizarse en aquellas placas que contengan entre 20 y 80 colonias y no más de 200, ya que se trata de un medio selectivo. La concentración microbiana debe expresarse como el número de microorganismos presentes en 100 ml de muestra.

N° de colonias X 100

Recuento de colonias = ml de muestra filtrada

Características del medio El medio puede presentar turbidez y/o un ligero precipitado. Cada ampolla sirve para una determinación. Las ampollas deben conservarse en frío entre 4 y 8°C; en estas condiciones son estables a lo largo de 18 meses. Caldo M-Recuento Total Medio de cultivo desarrollado para el recuento total de microorganismos en aguas, bebidas y otras muestras, por medio de la técnica de filtración por membrana. Fundamento El alto valor nutritivo de este medio se basa en la presencia de nutrientes y cofactores que permiten la recuperación de una gran variedad de microorganismos.

Fórmula (en gramos por litro)

Extracto de levadura 5.0 Tripteína 10.0 Glucosa 2.0

pH final: 7.0 ± 0.2 Siembra Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación. Embeber la almohadilla con el Caldo M-Recuento Total hasta la saturación. (La cantidad de medio de cultivo depende del grado de absorción de la misma.) Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo. Incubación Las placas se incuban a la temperatura y el tiempo adecuado para grupo de microorganismos.

Microorganismos mesófilos 35°C 24-48 h Termófilos 55°C 24-48 h Psicrófilos 07°C 10 días

Interpretación de resultados Por tratarse de un medio no selectivo, el recuento debe hacerse en aquellas placas que contengan entre 20 y 200 UFC. Un conteo inferior escapa a los límites de error del método.


N° de colonias X 100

Recuento de colonias = ml de muestra filtrada

Incubación Incubar las placas a 30°C durante 72 horas.

Caldo M-Recuento De Hongos Y Levaduras Interpretación de resultados El recuento debe hacerse en aquellas placas que contengan entre 20 y 200 UFC. Un conteo inferior escapa a los límites de error del método. La concentración microbiana debe expresarse como el número de Hongos y Levaduras presentes en 100 ml de la muestra.

N° de colonias X 100 Recuento de hongos y levaduras =

ml de muestra filtrada


Escherichia coli Bueno Staphylococcus aureus Bueno Enterococcus faecalis Bueno

Características del medio El medio debe presentar color ámbar claro, transparente, sin precipitado. Cada ampolla sirve para una determinación. Conservar las ampollas en frío entre 4-8°C. En estas condiciones el medio es estable por 18 meses.

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