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UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
INGENIERÍA AGRONÓMICA
Título del Proyecto de Investigación:
Multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con
plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca (Ocimum basilicum)
en condiciones de invernadero.
Autor:
Mayra Alejandra Bustamante Ochoa
Director del Proyecto de Investigación:
Dr. Fernando Abasolo Pacheco
Quevedo – Los Ríos – Ecuador
2019
Proyecto de Investigación
Previo a la Obtención del Título
de Ingeniera Agrónoma.
ii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y SESIÓN DE DERECHOS
Yo, Mayra Alejandra Bustamante Ochoa, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi
autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación
profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este
documento.
La Universidad Técnica Estatal de Quevedo, puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual,
por su Reglamento y por la Normativa Institucional vigente.
Atentamente;
-------------------------------------------------
Mayra Alejandra Bustamante Ochoa
C.I: 0503924896
iii
CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO
DE INVESTIGACIÓN
El suscrito Dr. Fernando Abasolo Pacheco, Docente de la Universidad Técnica Estatal de
Quevedo, certifica que el estudiante Mayra Alejandra Bustamante Ochoa, realizó el
Proyecto de Investigación titulado “Multiplicación de micorrizas en tres diferentes
sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca
(Ocimum basilicum) en condiciones de invernadero”, previo a la obtención del título de
Ingeniera Agrónoma, bajo mi dirección, habiendo cumplido con las disposiciones
reglamentarias establecidas para el efecto.
Atentamente;
-------------------------------------------------
Dr. Fernando Abasolo Pacheco
Director del Proyecto de Investigación
iv
REPORTE DE LA HERRAMIENTA DE PREVENCIÓN
DE COINCIDENCIA Y/O PLAGIO ACADÉMICO
-------------------------------------------------
Dr. Fernando Abasolo Pacheco
Director del Proyecto de Investigación
v
UNIVERSIDAD TECNICA ESTATAL DE QUEVEDO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
TÍTULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
Multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de
sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca (Ocimum basilicum) en condiciones de invernadero.
Presentado a la Comisión Académica como requisito previo a la obtención del título
de:
Ingeniera Agrónoma
Aprobado por:
Dr. Hayron Canchignia Martínez
Presidente del Tribunal
Quevedo – Los Ríos – Ecuador
2019
Dr. Pablo Ramos Corrales
Miembro del Tribunal
Dr. Favio Herrera Eguez
Miembro del Tribunal
vi
AGRADECIMIENTO
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a Dios, por estar cuidándome en cada
momento de mi vida, guiándome por el camino del bien, brindándome la sabiduría para
realizar cada actividad como estudiante, inteligencia para terminar con éxito esta etapa de
mi vida universitaria y poder como profesional servir a la sociedad. Al concluir un trabajo
lleno de dificultades como un proyecto de investigación, del cual te exige tu mayor
esfuerzo y voluntad. Sin embargo este aporte de gran magnitud fue posible gracias a la
participación de personas que de una u otra manera se han hecho presentes en consejos,
motivación y ayuda.
Dr. Fernando Abasolo mi más sinceros agradecimiento por permitir que este proyecto de
investigación se realice, poniendo su confianza en mí y facilitando todos los medios
posibles. Quiero expresar mi agradecimiento a la Dra. Carmita Suarez Capello por
brindarme sus conocimientos, la ayuda necesaria y sobre todo ser una gran maestra y
amiga. También expresar mi agradecimiento a la Fundación Maquita - Buena Fe y a sus
colaboradores, por permitirme realizar el proyecto de investigación, brindando
infraestructura y materiales posibles, en especial al Ing. Carlos Zambrano por su
amabilidad, paciencia y las ideas oportunas orientadas en el proyecto.
Y por último mi más sentido y profundo agradecimiento en especial a mi amada familia
Bustamante Ochoa, quienes son lo fundamental en mi vida, gracias por su apoyo en esta
larga y ardua experiencia universitaria. A mis padres José David y Cecibel Angélica por
cada esfuerzo que realizaron para culminar mi formación profesional y enseñarme que todo
lo que me proponga lo puedo lograr, a mi hermana Vanessa Estefanía por su capacidad de
superación e inteligencia, a mi hermana María José por su paciencia y el empeño a cada
cosa que realiza y a mi hermana Leylis Eliana por ser valiente, inteligente y tener la
capacidad de las palabras adecuadas para cada momento.
¡Gracias familia!
vii
DEDICATORIA
Mi Proyecto de Investigación lo dedico llena de amor,
esperanza y mucho sacrificio, en primer lugar a Dios
por guiarme y cuidarme durante mi carrera y a mis
seres amados, de manera especial a mi padre José
David Bustamante Chichandi por su sacrificio,
confianza, esfuerzo y esmero siendo el pilar
fundamental en mi formación profesional, a mi madre
Cecibel Angélica Ochoa Montiel por su amor,
paciencia y la motivación en cada actividad que
realice, y a mis hermanas: Vanessa Estefanía
Bustamante Ochoa, María José Bustamante Ochoa y
Leylis Eliana Bustamante Ochoa por ser consideradas
y tenerme paciencia.
Por el tiempo y esfuerzo a mis queridos maestros por
compartir cada conocimiento durante estos cinco años
de estudiante, permitiendo que llegue a esta última
etapa de formación profesional.
Mayra Alejandra Bustamante Ochoa
viii
RESUMEN
Los hongos micorrízicos son exigentes para colonizar y multiplicase, lo cual requieren
sustratos pobres, es decir, bajos en fósforo, permitiéndoles que las micorrizas se
multipliquen en condiciones de estrés. El objetivo de la presente investigación es la
obtención del mejor sustrato para la multiplicación de micorrizas provenientes de suelos
tropicales del Ecuador. Inoculados con cepas de micorriza LMSSK, obtenidas con fines de
investigación del Instituto Canario de Investigaciones Agrarias ICIA de las Islas Canarias -
España y la micorriza nativa obtenida de la huerta de cacao nativa de la Fundación
Maquita. Se realizó tres mezclas de sustratos utilizando tierra, turba de coco y picón
“piedra”. Las semillas se desinfectaron antes de la siembra, inoculando directo al hoyo,
durante 90 días en las macetas. El experimento consistió en 6 tratamientos más un testigo
(tierra sin esterilizar), en cuatro repeticiones. Las variables a evaluar fueron el nivel de
colonización de la micorriza nativa y LMSSK en plantas trampa, determinación del
volumen y peso del sistema radicular de las plantas trampa, bajo el efecto de las
micorrizas, multiplicación de esporas para micorriza nativa y LMSSK en planas trampa y
el efecto de la micorrizas a los cambios morfológicos de sorgo (Sorghum bicolor L) y
albahaca (Ocimum basilicum). Los resultados obtenidos fueron que el sustrato más
adecuado para la multiplicación de micorrizas está dado por el sustrato tierra + turba de
coco + picón, con porcentajes de colonización entre 80 y 99 %, registrando la cepa nativa
de la huerta de cacao con 2350 esporas en 100 g/suelo y la cepa LMSSK con 2390 esporas
en 100 g/suelo, teniendo ambas cepas igual capacidad de colonización y multiplicación.
Palabras claves: Sustrato, planta trampa, inoculación, micorriza.
ix
ABSTRACT
Mycorrhizal fungi are demanding to colonize and multiply, which requires poor substrates,
that is, low phosphorus, allowing mycorrhizal infections to multiply under stressful
conditions. The objective of this research is to obtain the best substrate for the
multiplication of mycorrhizal from tropical soils of Ecuador. Inoculated with mycorrhizal
strains LMSSK, obtained for research purposes from the Canary Institute of Agricultural
Research ICIA of the Canary Islands - Spain and native mycorrhizal obtained from the
native cocoa garden of the Maquita Foundation. Three mixtures of substrates were made
using earth, coconut peat and "stone" picon. The seeds were disinfected before sowing,
inoculating directly to the hole, for 90 days in the pots. The experiment consisted of 6
treatments plus one control (unsterilized soil) in four repetitions. The variables to be
evaluated were the level of colonization of native mycorrhizal and LMSSK in trap plants,
determination of the volume and weight of the root system of trap plants, under the effect
of mycorrhizal, multiplication of spores for native mycorrhizal and LMSSK in flat trap and
the effect of mycorrhizal to the morphological changes of sorghum (Sorghum bicolor L)
and basil (Ocimum basilicum). The results obtained were that the most suitable substrate
for mycorrhizal multiplication is given by the substrate soil + coconut peat + picon, with
colonization rates between 80 and 99 %, recording the native strain of the cocoa orchard
with 2350 spores in 100 g/soil and the strain LMSSK with 2390 spores in 100 g/soil,
having both strains equal colonization and multiplication capacity.
Keywords: Substrate, trap plant, inoculation, mycorrhiza.
x
TABLA DE CONTENIDO
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y SESIÓN DE DERECHOS ii
CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN iii
REPORTE DE LA HERRAMIENTA DE PREVENCIÓN DE COINCIDENCIA Y/O
PLAGIO ACADÉMICO iv
AGRADECIMIENTO vi
DEDICATORIA vii
RESUMEN viii
ABSTRACT ix
ÍNDICES DE TABLAS xiv
INDICES DE FIGURAS xv
ÍNDICE DE ANEXOS xvi
CÓDIGO DUBLÍN xvii
INTRODUCCIÓN 1
CAPÍTULO I. CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
1.1. Problema de la Investigación 3
1.1.1. Planteamiento del problema 3
1.1.2. Formulación del problema 3
1.1.3. Sistematización del problema 3
1.2. Objetivos 4
1.2.1. Objetivo General 4
1.2.2. Objetivos Específicos 4
1.3. Justificación 5
CAPÍTULO II. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN
2.1. Marco Teórico 7
2.1.1. El suelo 7
2.1.2. La rizósfera 7
2.1.3. Simbiosis planta-hongo 8
2.1.4. Micorrizas 8
2.1.4.1. Descubrimiento de las micorrizas 9
xi
2.1.4.2. Origen de las micorrizas 9
2.1.4.3. Importancia de las micorrizas en la agricultura 9
2.1.4.4. ¿Son benéficas o dañinas? 10
2.1.4.5. Taxonomía de hongos micorrízicos 10
2.1.4.6. Ciclo de vida de hongos micorrízicos arbusculares 11
2.1.4.7. Estructuras y etapas de desarrollo. 12
2.1.4.8. Red de hifas 14
2.1.4.9. Fenología 15
2.1.4.10. Funcionamiento de las micorrizas 15
2.1.4.11. Micorrizas y crecimiento de las plantas 16
2.1.5. Producción de inóculo 16
2.1.6. Método cuantitativo de hongos micorrízicos arbuscular en raíces de las plantas 17
2.1.7. Multiplicación de hongos micorrízicos en plantas "trampa" 18
2.1.7.1. Plantas trampa 18
2.1.7.2. Selección de la planta "trampa" 18
2.1.7.3. Plantas hospederas para la reproducción de inoculante micorrízico 18
2.1.7.4. Sorgo (Sorghum bicolor L.) 19
2.1.7.5. Albahaca blanca (Ocimum basilicum) 20
CAPÍTULO III. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1. Localización 23
3.2. Tipo de investigación 23
3.3. Método de investigación 23
3.4. Fuente de recopilación de información 23
3.5. Material y equipos 23
3.5.1. Material del laboratorio 24
3.5.2. Equipos de laboratorio 24
3.5.3. Material Biológico 25
3.5.4. Material de campo 25
3.5.5. Reactivos e insumos 25
3.6. Diseño de la investigación 26
3.7. Factor de estudio 26
3.8. Tratamientos Estudiados 26
3.9. Esquema del Análisis de Varianza 27
xii
3.10. Manejo del Experimento 27
3.10.1. Obtención de cepas micorrizadas y sustratos. 28
3.10.2. Preparación de los sustratos. 28
3.10.3. Distribución de la mezcla de sustratos en las macetas 29
3.11. Datos Registrados y Formas de Evaluación. 30
3.11.1. Protocolo de tinción de raíces. 30
3.11.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60% en plantas
trampa de S. bicolor L. y O. basilicum. 30
3.11.3. Determinación del volumen y peso del sistema radicular de S. bicolor L. y O.
basilicum, bajo el efecto de las micorrizas. 31
3.11.4. Determinación del número de esporas en los tratamientos con micorriza
nativa y LMSSK, en plantas de S. bicolor L. y O. basilicum. 31
3.11.4.1. Aislamiento de esporas. 31
3.11.4.2. Calculo de la cantidad de esporas observadas por tratamiento. 32
3.11.5. Efecto de la micorriza en el desarrollo vegetativo de sorgo (S. bicolor L) y
albahaca (O. basilicum). 33
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Resultados 35
4.1.1. Determinación del nivel de colonización micorrízica en las plantas trampa S.
bicolor L. y O. basilicum. 35
4.1.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60% en plantas
trampa de S. bicolor L. y O. basilicum. 36
4.1.3. Efecto de las micorrizas en el volumen del sistema radicular de S. bicolor L.
y O. basilicum. 37
4.1.4. Determinación del peso del sistema radicular de S. bicolor L. y O. basilicum,
bajo el efecto de las micorrizas. 38
4.1.5. Multiplicación de esporas proveniente de dos tipos de micorrizas nativa y
LMSSK 60% en plantas trampa. 39
4.1.6.1. Altura y diámetro del sorgo (S. bicolor L). 41
4.1.6.2. Altura y diámetro de la albahaca (O. basilicum). 42
4.2. Discusión 43
4.2.2. Porcentaje de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60% en plantas
trampa de S. bicolor L. y O. basilicum. 44
xiii
4.2.3. Efecto de las micorrizas en el volumen y peso del radicular de S. bicolor L.
y O. basilicum. 45
4.2.4. Producción de esporas proveniente de dos tipos de micorriza: nativa y
LMSSK 60% en plantas trampa. 45
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones 48
5.2. Recomendaciones 49
CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA
6.1. Literatura Citada 51
CAPÍTULO VII. ANEXOS
xiv
ÍNDICES DE TABLAS
Tabla 1. Taxonomía de micorrizas. 11
Tabla 2. Taxonomía del sorgo. 20
Tabla 3. Taxonomía de la albahaca. 21
Tabla 4. Identificación de los tratamientos a estudio. 27
Tabla 5. Esquema del ADEVA (Análisis de varianza). 27
Tabla 6. Pesos de los componentes de la mezcla de los tratamientos. 28
Tabla 7. Composición de la soluciones madre de Hewitt (1969). 29
Tabla 8. Efecto del volumen de raíces en la multiplicación de micorrizas en
tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S.
bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en condiciones de
invernadero, 2019.
38
Tabla 9. Peso de raíces en la multiplicación de micorrizas en tres diferentes
sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y
albahaca (O. basilicum) en condiciones de invernadero, 2019.
39
Tabla 10. Número de esporas de micorrizas en tres diferentes sustratos en
simbiosis con plantas trampa de sorgo (S bicolor L.) y albahaca (O.
basilicum) en condiciones de invernadero, 2019.
40
Tabla 11. Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de
micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas
trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en
condiciones de invernadero, 2019.
42
Tabla 12. Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de
micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con plantas
trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en
condiciones de invernadero, 2019.
43
xv
INDICES DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo del hongo micorrízico. 12
Figura 2. Asociaciones formadas por especies. 12
Figura 3. Estructuras de los hongos de micorriza arbuscular. Arbúsculo,
esporas de Glomus sp., y vesículas en raíces de capirona
(Calycophyllum spruceanum).
13
Figura 4. Esquema de las características morfológicas inter-radicales de los
hongos AM. (a) = apresoria; (ar) = arbúsculos de AM intercelular
de tipo Arum; (ar-c) = arbuscular y (c) = bobina de AM intracelular
de tipo París; (s) = espora inter-radical; (v) = vesículas.
14
Figura 5. Forma de colocar el sustrato en la maceta. 17
Figura 6. Obtención de micorriza nativa del cultivo de cacao. 35
Figura 7. Aspecto del tejido colonizado en raíces de Sorgo (s) y Albahaca (a)
con aumento de objetivo 10X.
36
Figura 8. Observación de las diferentes estructuras de micorrizas: hifas en
“pelotón” (a = objetivo 40X), vesículas (b = objetivo 10X),
arbúsculos (c = objetivo 10X) y esporas (d = objetivo 40X).
36
Figura 9. Porcentaje de colonización de los tratamientos. Las barras de error
indican ±ES; letras diferentes indican diferencias significativas
entre los promedios a p<0.05 (Prueba de Tukey).
37
xvi
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Croquis de cada unidad experimental. 57
Anexo 2. Croquis del área de estudio. 57
Anexo 3. Obtención de la cepa micorrízica nativa. 58
Anexo 4. Recolección y esterilización de los sustratos. 58
Anexo 5. Protocolo de la técnica de tinción de raíces. 58
Anexo 6. Observación de las estructura de micorrizas. 59
Anexo 7. Toma de datos de los tratamientos. 59
Anexo 8. Peso y volumen de raíces. 59
Anexo 9. Obtención y observación de esporas. 60
Anexo 10. Protocolo de tinción de raíces descrita por (Phillips y Hayman,
1970); (Gemma y Koske, 1989), con modificaciones de Mayra
Bustamante 2019.
60
Anexo 11. Análisis de suelo. 61
xvii
CÓDIGO DUBLÍN
Título: “Multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en
simbiosis con plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L.) y
albahaca (Ocimum basilicum) en condiciones de invernadero”.
Autor: Mayra Alejandra Bustamante Ochoa.
Palabras claves: Sustrato, planta trampa, inoculación, micorriza.
Fecha de
publicación:
Editorial: Quevedo UTEQ 2019.
Resumen: Los hongos micorrízicos son exigentes para colonizar y
multiplicase, lo cual requieren sustratos pobres, es decir, bajos en
fósforo, permitiéndoles que las micorrizas se multipliquen en
condiciones de estrés. El objetivo de la presente investigación es
la obtención del mejor sustrato para la multiplicación de
micorrizas provenientes de suelos tropicales del Ecuador.
Inoculados con cepas de micorriza LMSSK, obtenidas con fines
de investigación del Instituto Canario de Investigaciones Agrarias
ICIA de las Islas Canarias - España y la micorriza nativa obtenida
de la huerta de cacao nativa de la Fundación Maquita. Se realizó
tres mezclas de sustratos utilizando tierra, turba de coco y picón
“piedra”. Las semillas se desinfectaron antes de la siembra,
inoculando directo al hoyo, durante 90 días en las macetas. El
experimento consistió en 6 tratamientos más un testigo (tierra sin
esterilizar), en cuatro repeticiones. Las variables a evaluar fueron
el nivel de colonización de la micorriza nativa y LMSSK en
plantas trampa, determinación del volumen y peso del sistema
radicular de las plantas trampa, bajo el efecto de las micorrizas,
multiplicación de esporas para micorriza nativa y LMSSK en
planas trampa y el efecto de la micorriza a los cambios
morfológicos de sorgo (Sorghum bicolor L) y albahaca (Ocimum
basilicum). Los resultados obtenidos fueron que el sustrato más
adecuado para la multiplicación de micorrizas está dado por el
sustrato tierra + turba de coco + picón, con porcentajes de
colonización entre 80 y 99 %, registrando la cepa nativa de la
huerta de cacao con 2350 esporas en 100 g/suelo y la cepa
LMSSK con 2390 esporas en 100 g/suelo, teniendo ambas cepas
igual capacidad de colonización y multiplicación.
Descripción: Hojas: 80 dimensiones, 29 x 21 cm + CD-ROM 6162.
URL
1
INTRODUCCIÓN
Los hongos existentes en el suelo realizan interacciones con las raíces de las plantas,
encontrándose en un 80 % de plantas terrestre son micorrizadas, pero el 95% de las plantas
micorrizadas son colonizadas por la especie de micorriza arbuscular, aportándoles
múltiples beneficios, en la absorción de murientes, resistencia a patógenos y condiciones
de estrés biótico y abiótico. Las micorrizas son organismos del suelo que viven
simbióticamente con la mayoría de plantas, ellos les aportan beneficios, dándoles ventajas
con respecto a las plantas no micorrizadas, por ejemplo, facilitándole a la planta la toma de
nutrientes de baja disponibilidad o de poca movilidad en el suelo, evitando la acción de
microorganismo patógenos en la raíz, aumentando la tolerancia de la planta a condiciones
de stress abiótico en el suelo, entre otros beneficios (Berdugo, 2009). Siendo una
tecnología amigable con el ambiente contra el uso indiscriminado de productos
agroquímicos y la sobre fertilización, donde se degradan y los microorganismos existentes
desaparecen.
Motivo por el cual se realizó esta investigación orientada a multiplicar hongos benéficos
formadores de micorrizas (nativa – LMSSK 60%) en asociación con plantas trampas de
sorgo (Sorghum bicolor L.) y albahaca (Ocimum basilicum), que faciliten la colonización y
la multiplicación en los diferentes sustratos.
La importancia de conocer las condiciones de colonización y multiplicación de las
micorrizas, se estableció el sustrato adecuado en asociación a sorgo y albahaca para la
obtención de inoculo y su posterior aplicación a los cultivos (maíz, frejol, hortalizas, cacao,
café, cítricos, etc.), sea en el campo o en viveros para su mayor supervivencia.
CAPÍTULO I
CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
3
1.1. Problema de la Investigación
1.1.1. Planteamiento del problema
Los sectores de producción del Ecuador son extensos y diversos, donde existen suelos
pobres, infértiles por el uso indiscriminado de productos químicos, la sobre fertilización,
incendios, inundaciones, la introducción de otras especies a diferentes ecosistemas. Esto
hace que se degraden y la microbiota del suelo se reduce. Eliminando interacciones que
existe entre los microorganismos del suelo especialmente de los hongos que realizan una
simbiosis con las raíces y al no realizarse esta simbiosis, los cultivos tienen bajo desarrollo
vegetativo, poca floración y por ende pocos rendimientos afectando la economía del
agricultor.
1.1.2. Formulación del problema
¿Qué sustrato con planta trampa permitiría una colonización y multiplicación de hongos
micorrízicos para obtener inóculos?
1.1.3. Sistematización del problema
Después de revisar la problemática se planean las siguientes directrices:
¿Cuál sustrato es óptimo para multiplicar hongos micorrízicos?
¿Cuál es la mayor simbiosis entre micorriza nativa y LMSSK en la zona de estudio?
4
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo General
Determinar el mejor sustrato para la multiplicación de micorrizas provenientes de
suelos tropicales del Ecuador.
1.2.2. Objetivos Específicos
Validar el protocolo de cuantificación de las micorrizas.
Identificar el tipo de inoculo que presenta mayor capacidad micorrízica.
Establecer el sustrato más adecuado para la multiplicación de micorrizas.
Establecer la mejor combinación sustratos-planta trampa para la multiplicación de
micorrizas.
5
1.3. Justificación
La presente investigación es una alternativa racional, biológica, amigable con el ambiente
y sostenible ante el uso indiscriminado de agroquímicos como pesticidas, tipos de estrés y
aplicaciones excesivas de fertilizantes altos en fósforo sin un previo análisis de suelo. Se
realizó la siguiente investigación para la multiplicación de cepas micorrizadas (nativa –
LMSSK) en asociación a sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum). Esta simbiosis
obligatoria es fundamental entre el hongo y la planta trampa, adquiriendo interés en los
suelos degradados, para la toma de murientes y la resistencia a diversos factores bióticos y
abióticos, optimizando el nivel de colonización, multiplicación y aplicación.
Es necesario realizar la multiplicación de cepas micorrizadas por medio de sustratos
esterilizados y pobres, en especial bajos en fósforo, estos brindan las condiciones
adecuadas para realizar la simbiosis utilizando plantas trampas, que son apetecidas por esta
clase de hongos micorrízicos, para la obtención de múltiples beneficios tanto para la planta
como para el suelo. Con el fin de implementar esta tecnología, los beneficiarios serían los
agricultores para que obtengan mejores rendimientos, productores de plántulas en viveros
para la resistencia a patógenos y trasplantes, las empresas para la venta de inóculos, y los
investigadores para estudios relacionados al tema.
CAPÍTULO II
FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN
7
2.1. Marco Teórico
2.1.1. El suelo
De acuerdo a Marconi (2011), la palabra suelo proviene del latín solum, que significa
suelo, tierra o parcela, es la capa superficial que está formada por materia orgánica e
inorgánica de la tierra donde se realizan actividades bioquímicas y físicas, a causa de las
relaciones entre el suelo, los organismos y el medio ambiente. Del cual dependen las
actividades de la agricultura y la ganadería. En el suelo se identifican un gran número de
organismos los cuales desempeñan un papel clave en los procesos del suelo, tanto en lo
natural como en los sistemas agrarios. Sin embargo, las prácticas agrícolas convencionales,
por ejemplo; la labranza, la fertilización mineral, la aplicación de productos químicos, han
demostrado ser perjudicial para muchos grupos de microorganismos. La agricultura es
utilizar los servicios ecosistémicos del suelo natural (González, 2007).
2.1.2. La rizósfera
Las poblaciones microbianas del suelo están inmersas en las interacciones que afectan en
el desarrollo de las plantas y la calidad del suelo, las actividades fundamentales que
aseguran la estabilidad y la productividad. Investigaciones estratégicas y aplicadas han
demostrado el interés de ciertas actividades de la cooperación microbiana para ser
explotadas como una biotecnología de bajo impacto y costo para contribuir con las
prácticas agro - tecnológicas sustentables y amigables con el medio ambiente (Richardson
et al., 2009).
De acuerdo a Pedraza et al. (2010), ha sido ampliamente demostrado que los
microorganismos del suelo interactúan con las raíces de las plantas y los constituyentes del
suelo, en la interfase entre la raíz y el suelo. Esto es un gran conjunto de interacciones
entre el suelo, las raíces y los microorganismos que da lugar al desarrollo de un ambiente
dinámico conocido como la rizósfera. Donde una variedad de formas microbianas pueden
desarrollarse activamente y en equilibrio. El tipo de simbiosis más extendido en la
biosfera, el hongo ayuda al huésped a la absorción de los murientes - minerales del suelo y
a cambio le cede compuestos carbonados derivados de la fotosíntesis.
8
2.1.3. Simbiosis planta-hongo
El crecimiento del hongo de manera asimbiótica se da entre una o dos semanas hasta que
hace contacto con la raíz, formando una estructura llamada apresorio por donde penetrarán
las hifas a las células corticales de la raíz, para formar arbúsculos e incrementar el área de
contacto entre planta y hongo iniciando su fase simbiótica (Koide y Dickie, 2002). Los
arbúsculos son hifas que se dividen dicotómicamente y presentan periodos de vida cortos,
las vesículas son estructuras de almacenamiento, se forman en la parte terminal de las
hifas. Las hifas externas pueden ser de tres tipos según su morfología y funciones: Las
hifas infectivas, inician puntos de colonización en una o varias raíces; hifas absorbentes
exploran el suelo para la extracción de nutrientes y las hifas fértiles llevan esporas. Se
reconocen dos tipos básicos de colonización hifal: En el tipo morfológicos de colonización,
“Arum”, las hifas presentan crecimiento intercelular y los arbúsculos se encuentran dentro
de las células corticales de la raíz; en el tipo “Paris” las hifas presentan crecimiento
intracelular al igual que los arbúsculos, pero forman enrollamientos cuando están dentro de
la célula (Berdugo, 2009).
De acuerdo a Ferrera y Alarcón (2005), la mayoría de los simbiontes que forman
ectomicorriza, pertenecen al grupo de los hongos basidiomicetos, por formar cuerpos
fructíferos, durante períodos de lluvia. Este tipo de simbiosis es importante, ya que la
presencia del hongo en el sistema radicular es obligada, favoreciendo el crecimiento y el
desarrollo de las plantas.
2.1.4. Micorrizas
La palabra micorriza proviene de los vocablos griegos Mykos (hongo) y rhiza (raíz). Una
micorriza es una simbiosis no patogénica; una asociación obligada entre raíces de plantas y
hongos especializados, que pueden desarrollarse en un ambiente natural y medios de
cultivo (Quimí et al., 2001). El nombre de hongo se ha designado a organismos que
parecen morfológicamente entre sí, pero que no están filogenéticamente relacionados y por
lo tanto forman un grupo heterogéneo de seres vivos. Siendo ubicuitas, son el segundo
organismo más abundante en el suelo, constituidos por las estructuras somáticas
filamentosas llamadas “hifas” cuyo conjunto forman el micelio (Ferrera y Alarcón, 2005).
9
2.1.4.1. Descubrimiento de las micorrizas
Investigaciones sobre la manera en que otras especies de trufas (hongos comestibles que
pertenecen a los géneros Elaphomyces y Tuber; reino Fungi, clase Ascomycetes), se
relacionaban con las raíces de algunas especies de encinos (Quercus sp.) y otras plantas
vasculares. Hoy la conocemos como una ectomicorriza, y la describió como hifas del
hongo Elaphomyces se asocian a pequeñas raíces secundarias de ciertos árboles,
envolviéndolas completamente (Antonio y Torres, 2010). La simbiosis suele mejorar la
captación de agua y nutrientes minerales de la planta trampa a cambio de carbono
fotosintéticamente fijo. La inoculación con micorrizas puede ayudar a la planta huésped
para la absorción de nutrientes minerales, especialmente fósforo, promover el crecimiento
de plantas y mejorar la tolerancia de estrés abióticos y bióticos. Además son un
componente importante de ecosistemas naturales y agrícolas, que influyen en plantas (Cao
et al., 2013).
2.1.4.2. Origen de las micorrizas
Numerosos estudios paleobotánicos, morfoanatómicos y filogenéticos basados en técnicas
moleculares evidencian que la coevolución mantenida entre hongos micorrízicos y raíces
de plantas se remonta al Paleozoico, hace más de 400 millones de años, con el origen de
las primeras plantas terrestres. De hecho, los ancestros de los actuales briófitos y helechos
ya presentaban asociaciones que recuerdan a las ahora conocidas como micorrizas
arbusculares (García, 2009). La aparición de primeras plantas terrestres en unos 480 - 460
millones de años de antigüedad, basadas en análisis moleculares de secuenciación
proteómica sugieren una mucho más temprana terrestrialización (Heckman et al., 2001).
La colonización habría tenido lugar hace unos 600 millones de años y tanto las algas
verdes como hongos “superiores” habrían aparecido en la tierra hace más de 900 millones
de años, habiendo surgido entre la escala de tiempo geológico y evolutivo basada en el
registro fósil y basada en el “reloj molecular” (García, 2009).
2.1.4.3. Importancia de las micorrizas en la agricultura
Las micorrizas cumplen una función clave en la agricultura sostenible. En el prefacio del
libro “Mycorrhizae in sustainable agricultura” (Bethlenfalvay y Linderman, 1992),
10
concluyen que "si el objetivo es reducir los insumos químicos por razones ambientales y de
salud, entonces se necesita reestablecer hongos micorrízicos y otros microbios benéficos a
un alto nivel de la efectividad para compensar la reducción de los insumos. Esta estrategia
coincide con el punto de vista donde el grado de empobrecimiento o la desaparición de la
microflora micorrízica es un indicador del descenso en la estabilidad del sistema de planta-
suelo (Bethlenfalvay, 1993). La importancia de los hongos micorrizógenos no estriba sólo
en que pueden representar la fracción mayor de la biomasa del suelo, alcanzando hasta
20% del total de la masa seca (Bethlenfalvay, 1993). Su función clave radica en que, su
abundante micelio intra y extraradical, constituye un enlace o un puente entre las plantas
(huésped) y el suelo (Bethlenfalvay y Linderman, 1992). Cuando se forma la micorriza, se
altera la fisiología y exudación de los radicales, lo que a su vez cambia la población
microbiana (Linderman, 1992).
2.1.4.4. ¿Son benéficas o dañinas?
La micorriza no se trata solamente de una interacción entre la raíz de una planta y una
especie de hongo, sino de una comunidad muy compleja formada por diferentes especies
de hongos y la raíz de una planta trampa (huésped). Fueron cruciales para que las plantas
pudieran colonizar el medio terrestre y responder a las condiciones ambientales
cambiantes. Genera una extensa red de micelio externo que explora el suelo en búsqueda
de recursos e interconecta a las raíces de plantas de la misma especie e, incluso, de
especies diferentes. Las plantas interconectadas por la red micorrízica pueden transferir
carbono entre ellas. Actualmente, la asociación micorrízica es fundamental en las prácticas
agrícolas sostenibles y programas de restauración ambiental (Camargo et al., 2012).
2.1.4.5. Taxonomía de hongos micorrízicos
De acuerdo a Willis et al. (2013), la taxonomía de los hongos micorrízicos arbusculares se
describen 214 especies en cuatro órdenes, 13 familias y 19 géneros, en la clase
Glomeromycetes del phylum Glomeromycota. El phylum está representado en casi todos
los principales biomas terrestres, en bryophytes (musgos), hepáticas, pteridofitas, las
gimnospermas y angiospermas. Las plantas tropicales son típicamente micotróficas
arbusculares, el fenómeno que puede estar relacionado con la descomposición y
consecuente alta rotación de los ecosistemas.
11
Tabla 1: Taxonomía de micorrizas
Dominio: Eukarya
Reino: Fungi
División: Glomeromycota
Clase: Glomeromycetes
Orden: Archeosporales – Diversisporales –
Paraglomales – Glomerales.
Familia:
Archaeosporaceae y
Geosiphonaceae
Acaulosporaceae, Diversisporaceae
y Gigasporaceae
Paraglomaceae
Glomeraceae, Glomus - grupo A y
Glomus tipo B.
Fuente: (Willis et al ., 2013).
2.1.4.6. Ciclo de vida de hongos micorrízicos arbusculares
De acuerdo a Velandia (2006), este proceso es independientemente de la planta trampa,
que solo requiere condiciones de temperatura y humedad. Los hongos micorrízicos se
originan a partir de las hifas que proceden de las raíces existentes en el suelo sea de
esporas, raicillas o de las plantas trampa (Huésped), con presencia de micorrizas que se
desarrollan en un ecosistema. Cuando la hifa penetra en la capa de una célula epidérmica
de la raíz, esta forma un apresorio que producirá seguidamente una hifa colonizadora
atravesando el espacio intercelular. Las hifas crecen regularmente de forma longitudinal en
los espacios intercelulares en la zona media; mientras que en la zona interna las hifas
penetran intercelularmente y forman los arbúsculos por ramificación dicotómica repetida
(Figura 1), a niveles de los cuales se produce el intercambio de los nutrimentos (Velandia,
2006). Cuando el hongo no encuentra una raíz para colonizarla se produce un micelio
reducido, que se mantiene en crecimiento tan solo unos días tras la producción del tubo de
germinación y transcurrido este tiempo, comienza a retraer el citoplasma de las hifas hacia
la espora entrando en reposo (Azcón et al., 1998).
12
Figura: 1: Ciclo del hongo micorrízico
Fuente: (Velandia, 2006)
2.1.4.7. Estructuras y etapas de desarrollo.
De acuerdo a Brundrett (2008), las asociaciones se forman cuando las raíces del
hospedador (Planta trampa) y los hongos micorrízicos compatibles están activos en las
proximidades y las condiciones del suelo son favorables. Las etapas en la colonización de
la raíz por hongos micorrízicos (Figura 2). Se muestran las asociaciones formadas por
especies de Glomus, Gigaspora, Scutellospora y Acaulospora.
Figura: 2: Asociaciones formadas por especies
Fuente: (Brundrett, 2008)
13
a.- Estructuras en el suelo
Hifas: Una red de hifas se forma en el suelo con hifas más gruesas que funcionan
como conductos.
Hifas de absorción: Hifas finas altamente ramificadas que se cree que absorben
nutrientes.
Esporas: Estructuras esféricas asexuales grandes (para un hongo) (20 - 1000 + µm
de diámetro) formadas en hifas especializadas en el suelo o en las raíces.
b.- Estructuras en las raíces
Hifas: Estos no son septados cuando son jóvenes y se ramifican dentro de la
corteza.
Arbúsculos: Haustoria intrincadamente ramificada en las células de la corteza.
Vesículas: Estructuras de almacenaje formadas por muchos hongos
De acuerdo a Ruiz et al. (2011), los hongos de las micorrizas arbustivas son simbiontes
obligados ya que para completar su ciclo de vida deben estar asociados con raíces vivas
que las provean de carbono así como de los factores necesarios para su desarrollo y
esporulación. Dentro de la corteza de la raíz y expandiéndose hacia el suelo, los HMA
forman estructuras (Figura 3) con distintas funciones simbióticas.
Figura: 3: Estructuras de los hongos de micorriza arbuscular. Arbúsculo, esporas de
Glomus sp., y vesículas en raíces de capirona (Calycophyllum spruceanum).
Fuente: (Brundrett et al., 1984)
14
2.1.4.8. Red de hifas
Las células de la corteza están conectados a una red micelial por hifas inter e intracelulares.
Otros taxones distintos de las especies de las familias Gigasporaceae, Paraglomaceae y
Archaeosporaceae producen vesículas inter y/o intracelulares ricas en lípidos. Estos actúan
como temporales órganos de almacenamiento, que a veces se convierten en estructuras de
paredes gruesas, y las vesículas (Figura 4), pueden ser importantes en la eficacia de los
fragmentos de raíz como propágulos. Se ha demostrado que las redes miceliales de muchas
especies mantienen viabilidad si los suelos permanecen intactos, incluso después de secar,
aunque el potencial de inóculo disminuye con tiempo (Willis et al., 2013).
Figura: 4: Esquema de las características morfológicas inter-radicales de los hongos AM.
(a) = apresoria; (ar) = arbúsculos de AM intercelular de tipo Arum; (ar-c) = arbuscular y
(c) = bobina de AM intracelular de tipo París; (s) = espora inter-radical; (v) = vesículas.
Fuente: (Willis et al., 2013).
De acuerdo a Willis et al., (2013), estas redes pueden ser extensas, que representa el
0,002% del volumen en el suelo basado en un diámetro promedio de micelio de 5 µm. Hay
evidencia de transferencia de nutrientes, fósforo, nitrógeno y agua, entre los tejidos sobre
el suelo de la planta hospedadora (Planta trampa) inter e intraespecífica a través de las
hifas de hongos micorrízico, una función facilitadora que puede afectar profundamente las
relaciones entre plantas. De manera similar, el carbono translocado permanece dentro de
las estructuras fúngicas en las raíces del huésped receptor.
15
2.1.4.9. Fenología
De acuerdo a Willis et al. (2013), las espora pueden crecer hasta 20 – 30 mm, en un plazo
de 15 a 20 días. En la etapa pre-simbiótica, el exudado de la raíz fomenta el crecimiento
del tubo germinal hacia la raíz y desencadena la ramificación del tubo germinal en forma
de abanico estimulando múltiples puntos de entrada en la raíz. Los arbustos se desarrollan
dentro de 1 a 6 días de penetración en células de la corteza. Después de 4 a 15 días, se
degeneran y la célula huésped vuelve a su estado original.
El porcentaje total de la longitud de la raíz ocupada por arbúsculos varía con las especies
de hongos, la estación, los factores edáficos, la hidrología de suelo y la temperatura del
suelo. El grado de colonización de la raíz también varía con interacciones de la biota del
suelo y con la planta huésped, de los estados fenológicos del huésped y la asignación del
carbono (Willis et al., 2013).
2.1.4.10. Funcionamiento de las micorrizas
De acuerdo a Allen et al. (2003), cuando los recursos del suelo, como fósforo o nitrógeno,
limitan la fotosíntesis, el carbono está en exceso. Las hifas de hongos micorrízicos
exploran el suelo para que el fósforo y nitrógeno, transporten el nutriente a cambio del
exceso de carbono en la planta. Mientras fósforo o nitrógeno son limitantes, las plantas
huésped soportarán a los hongos micorrízicos. Las raíces de las plantas se distribuyen
horizontalmente y se extienden verticalmente en el sustrato del suelo y la roca. La energía,
forma compuestos de carbono. Estas conexiones ocurren en la membrana (del hongo):
interespacio: (planta trampa).
Las micorrizas, al aumentar la captación del fósforo y nitrógeno, crean carbono. También
aumentan la recepción de agua abriendo las estomas. Estos aumentan las tasas de carbono
con un total de ganancias del 10% al 40%. En el campo, esta mayor fijación del Dióxido de
carbono (CO2), está asociado con el cambio ambiental, como la sequía, o como una función
particular de combinaciones entre las especies de hongos y las plantas trampa (huésped).
De igual modo, con un elevado nivel de Dióxido de carbono o también llamado Anhídrido
carbónico (CO2) atmosférico, las demandas de nitrógeno y fósforo van incrementando una
mayor necesidad de micorrizas (Allen et al., 2003).
16
2.1.4.11. Micorrizas y crecimiento de las plantas
De acuerdo a Agrios (2002), las raíces de las angiospermas que crecen en la naturaleza son
siempre infectadas por hongos simbióticos que benefician a las plantas hospedantes. Las
raíces infectadas se transforman en estructuras morfológicas únicas denominadas
micorrizas, es decir, "raíces fungosas". Que son comunes en los árboles forestales,
considerando como las raíces nutricias normales de la mayoría de las plantas, incluyendo
los cereales, las hortalizas, las plantas ornamentales y los árboles. Las micorrizas no causan
enfermedad, pero la ausencia de ellas en ciertos campos ocasiona achaparramiento.
Asimismo, la fumigación de los suelos con frecuencia da como resultado la erradicación de
los hongos micorrízicos y hace que las plantas, permanezcan más pequeñas. Mejoran el
crecimiento de la planta huésped al aumentar la superficie de absorción del sistema radial;
al absorber selectivamente y al acumular ciertos nutrientes, especialmente el fósforo; al
solubilizar y hacer disponibles para la planta huésped algunos minerales.
2.1.5. Producción de inóculo
De acuerdo a Blanco y Salas (1996), los hongos micorrízicos son simbiontes obligados la
cual representa la mayor dificultad para producir un inoculo. El principal impedimento
contra la difusión del uso de los hongos micorrizados entre los productores. El método más
común de producir un inoculo es por medio de macetas, en un suelo esterilizado. Otros
medios hacen uso de la perlita, la turba de coco o de algas, el corcho, la arcilla expandida,
los sistemas hidropónicos, la técnica de película de nutrientes o cultivo axénicos de
órganos de raíz.
La inoculación puede dar resultados beneficiosos cuando el suelo es pobre en calidad o
cantidad de los hongos micorrízicos y las plantas huésped (Planta trampa) responden en
forma significativa a la colonización por micorrizas o cuando se esteriliza total o
parcialmente el medio. La mayor viabilidad económica de la inoculación, sin duda se
presenta en los cultivos (Plantas huésped) que tienen una fase de semillero o de vivero
(arboles - hortalizas), en la cual los costos de inoculación son menores y la colonización de
las raíces por los hongos micorrízicos introducidos, una vez establecida, puede mantenerse
y desarrollarse en las fases posteriores del cultivo (Blanco y Salas, 1996).
17
2.1.6. Método cuantitativo de hongos micorrízicos arbuscular en raíces
de las plantas
De acuerdo a Sieverding (1983), para obtener las diferentes cepas se usan plantas huésped
con abundantes raíces, libres de suelo y de materia orgánica, del campo a suelo esterilizado
en macetas. Por este método se obtiene, en las macetas, después de cierto tiempo (4 a 6
meses), las cepas de los hongos con las cuales la planta estaba inicialmente infectada.
Debido a que algunas cepas del hongo no están esporulando en el campo, o a que hay
pocas esporas de un tipo dado, se requiere multiplicar las cepas nativas en el invernadero,
antes del aislamiento.
El método de multiplicación es sencillo, que se lo observa en la figura 5. Se inocula, con
una muestra de suelo más raíces del campo, en macetas que tengan suelo esterilizado y se
siembra una planta hospedera (Sieverding, 1983).
Figura: 5: Forma de colocar el sustrato en la maceta.
Fuente: (Sieverding, 1983).
Para la multiplicación se utiliza suelo (sustrato) esterilizado en autoclave que tenga
aproximadamente las mismas características químicas que el suelo del campo. Se
recomienda mejorar la estructura del suelo mezclándole con arena, antes de la
esterilización. No se debe aplicar tanto fósforo al suelo “sustrato” (se recomienda un
máximo de 25 kg P/ha). Los otros elementos nutritivos nunca se aplican en abundancia
(dependiendo del contenido inicial del suelo se recomienda dosis de 50 kg N/ha, 50 kg
K/ha, 25 kg Mg/ha (Sieverding, 1983).
18
2.1.7. Multiplicación de hongos micorrízicos en plantas "trampa"
De acuerdo a García et al. (2000), cuando la cantidad de esporas presentes en una muestra
de suelo proveniente del campo es muy reducida, se recomienda reproducir los hongos en
condiciones controladas empleando plantas micotróficas y sustratos estériles. Este sistema,
conocido como cultivo en planta trampa, permite lograr dos cosas: multiplicar hongos
nativos (indígenas) colectados en el campo aumentando así la cantidad de esporas del
hongo, o promover la esporulación de hongos "escondidos" en la muestra. Las esporas en
muestras de campo no están, razón para recomendar la multiplicación de hongos en plantas
trampa, pues permite obtener esporas en todos los estadios de desarrollo y con todos los
atributos morfológicos necesarios para la identificación taxonómica.
2.1.7.1. Plantas trampa
El conocimiento de la fenología en diferentes fechas de siembra y en distintas condiciones
agroecológicas constituye uno de los aspectos agronómicos fundamentales para el cultivo y
la producción de cualquier vegetal (Barroso y Jerez, 2000). Son especies vegetales
altamente sensibles a determinados organismos ejemplo micorrizas que generalmente no
pueden vivir bien sin estar asociados.
2.1.7.2. Selección de la planta "trampa"
De acuerdo a Cuenca et al. (2003), sugieren criterios para elegir esta planta debe ser
micotróficas, de buen crecimiento, debe estar adaptado al clima (temperatura, luz, etc.) del
sitio donde los hongos serán cultivados, debe ser compatible con un amplio rango de
hongos micorrízicos, de fácil manejo de la semilla, la poda, ser tolerante a las plagas y las
enfermedades y debe crecer bien en el sustrato seleccionado.
2.1.7.3. Plantas hospederas para la reproducción de inoculante micorrízico
De acuerda a Fernández (2003), otro de los aspectos importante a la hora de la
reproducción de estos hongos es el genotipo del hospedante (Planta trampa). Con relación
a esto se debe seleccionar una especie con dependencia micorrízica, preferentemente una
19
planta de ciclo corto (4 - 6 meses), que posea a su vez un sistema radical que garantice una
adecuada producción de propágulos micorrízicos. Entre las especies que han demostrado
ser buenas hospedantes se encuentran: Brachiaria decumbens, Arachis hypogaea, Plantago
lanceolata, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Medicago sativa, Paspalum notatum,
Fragaria sp., Zea mays y Allium cepa. Las características de las plantas hospederas para
reproducir hongos micorrízicos sorgo (S. bicolor) y albahaca (O. basilicum), estudios
recientes han informado de efectos positivos en el crecimiento propiedades promotoras de
la albahaca inoculadas con hongos micorrízicos, en particular sobre su crecimiento, la
fisiología, el contenido y la calidad de los aceites esenciales (Aslani et al., 2014); (Zhou et
al., 2015).
2.1.7.4. Sorgo (Sorghum bicolor L.)
De acuerdo a Ramírez (2012), el sorgo (S. bicolor L.) es originario de ciertas regiones de
África y Asia, se cultiva desde más de cinco mil años, ocupa el ercer lugar en volumen e
producción a nivel mundial. En Ecuador, existen zonas potenciales donde se adapta muy
bien el cultivo de sorgo, desarrollarse en áreas marginales con escasas precipitaciones,
como Provincias de: Guayas, Manabí y El Oro. También se cultiva en suelos que
permanecen en descanso después de la época lluviosa, en los que antes se ha sembrado
arroz como cultivo principal; tal es el caso de los suelos de la Provincia de Los Ríos, que
aprovechan la humedad residual para toda clase de cultivos de verano.
El sistema radical adventicio fibroso se desarrolla de los nudos más bajos del tallo. La
profundidad de enraizado es generalmente de 1 a 1.3 metros, con 80% de las raíces en los
primeros 30 centímetros. El número de pelos absorbentes puede ser el doble 20 que en
maíz, las raíces de soporte pueden crecer de primordios radicales, pero no son efectivas en
la absorción de agua y nutrientes (Hernández y Roque, 2017).
Cuando la planta ya tiene establecido el sistema de raíces y comienza a absorber los
nutrientes más rápidamente. Contribuyendo a mejorar la estructura del mismo, ayudando a
mejorar las condiciones físicas, químicas y biológicas. Debido a sus cualidades, el sorgo se
presenta como una alternativa muy propicia para aquellos sistemas en que se desee
mantener las buenas condiciones de fertilidad, como así también es un cultivo ideal para
sistemas de producción bajo siembra directa (Carrasco et al., 2011).
20
Tabla 2: Taxonomía del sorgo
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Subdivisión Pteropsidae
Clase Liliopsida
Subclase Liliidae
Orden Poales
Familia Poaceae
Subfamilia Panicoideae
Tribu Androgoneae
Género Sorghum
Especie S. bicolor L.
Fuente: (Trinidad, 2003)
2.1.7.5. Albahaca blanca (Ocimum basilicum)
El género Ocimum está representado por más de 150 especies y tiene una amplia
distribución geográfica por todas las regiones de clima tropical y subtropical. Perteneciente
a la familia de las Labiadas es uno de los representantes del género que se obtiene de
extensiones cultivadas para su comercialización en diferentes partes del mundo (Govín et
al., 2000).
De acuerdo a Govín et al. (2000), la albahaca blanca (O. basilicum L.) es una especie que
presenta variabilidad en la tolerancia a distintos tipos de estrés abiótico y se considera una
planta sensible a la salinidad en las etapas iniciales de su crecimiento. Es una planta
herbácea, anual, de tallos erectos y ramificados, frondosa, que alcanza de 30 a 50 cm de
altura. Suelos drenados con textura franca – arenosa o franca arcillosa presentando mejor
crecimiento y desarrollo de las raíces. Las hojas tienen de 2 a 5 cm, hojas suaves, oblongas,
opuestas, pecioladas, aovadas, lanceoladas y ligeramente dentadas.
Las flores son blancas dispuestas en espigas alargadas, en la parte superior del tallo o en
los extremos de las ramas, lampiñas de color verde intenso con pequeñas flores blanco
21
azuladas dispuestas en forma de largos ramilletes terminales. Para la cosecha el corte es a
la altura de 10 a 15 cm sobre la superficie del suelo (Marrero et al., 2004).
Tabla 3: Taxonomía de la albahaca
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Subreino Tracheobiona
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Lamiales
Familia Lamiaceae
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Ocimum
Género Ocimeae
Especie O. basilicum
Fuente: (Reyes, 2010)
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
23
3.1. Localización
La presente investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Innovación Agrícola de la
Fundación Maquita, ubicada en el Km. 3 vía a Santo Domingo, situada en el Cantón de
Buena Fe de la Provincia de Los Ríos, sector Los Limones, cuyas coordenadas geográficas
son las siguientes: 00°50'53.9" de latitud Sur y 79°29'23.1" de longitud Oeste. Se encuentra
a una altura promedio de 162 msnm, con una textura de suelo franco-arcilloso, y de clima
Tropical Megatérmico semi-húmedo, con temperatura media anual es de 24.9 °C. La
precipitación promedio anual es de 2265 mm, su humedad relativa media de 84%
promedio anual.
3.2. Tipo de investigación
Se llevó a cabo una investigación de tipo experimental, implementando un ensayo en el
laboratorio y en el invernadero para determinar el efecto de la multiplicación de micorrizas
por medio de plantas trampa de sorgo (Sorghum bicolor L) y albahaca blanca (Ocimum
basilicum) en diferentes sustratos.
3.3. Método de investigación
La metodología que se utilizó es el método deductivo partiendo de los objetivos planteados
y de la información obtenida sobre la colonización y la multiplicación de micorrizas para
identificar el sustrato eficaz para la reproducción de micorrizas nativas y LMSSK 60% en
condiciones de invernadero.
3.4. Fuente de recopilación de información
La presente investigación recopiló información de varias fuentes primarias a través de
observaciones directas, mediante la medición variable dependiente, así también como
fuentes secundarias de libros, publicaciones, revistas e internet.
3.5. Material y equipos
Equipos y materiales que se utilizaron en el desarrollo de la investigación.
24
3.5.1. Material del laboratorio
Porta objeto
Cubre objeto
Ependor
Erlenmeyer
Pipetas
Probetas
Pinzas
Micropipetas
Puntas para micropipetas de 1ml
Vasos de precipitación 200-500 ml
Luna de reloj
Platos de pesar
Bisturí
Mango de bisturí
Cajas petri de vidrio
Guante quirúrgico talla M
Tubos falcón de 15-50 ml
Tamices 250-125-53 micras
3.5.2. Equipos de laboratorio
Baño María
Cocina eléctrica
Autoclave 12 °C
Balanza de precisión
Agitador magnético
Centrifuga
Nevera 20 °C
Microscopio compuesto
Microscopio óptico
Cámara
Computador
25
3.5.3. Material Biológico
Cepas micorrizadas nativa.
Cepas micorrizadas LMSSK 60%.
Semillas de sorgo (S. bicolor L.).
Semillas de albahaca blanca (O. basilicum).
Tierra.
Turba de coco.
Piedra “Picón”.
3.5.4. Material de campo
Macetas de 2Kg
Pala
Carretilla
Marcadores
Machete
Regadora
Tijeras
Fundas de papel
Metro
Tamices de 5-3-2 mm
Bandejas
Tarrina
3.5.5. Reactivos e insumos
Agua destilada
Agua de la llave
Etanol
Glicerol acidificado
Trypan Blue
Hipoclorito sódico
Hidróxido de potasio
26
Ácido clorhídrico
Hexametafosfato
Sacarosa al 60%
Alcohol
3.6. Diseño de la investigación
Se empleó el Diseño Completamente al Azar (DCA) con arreglo factorial 2x3 + 1 en 4
repeticiones, usando cuatro unidades experimentales por tratamiento. La unidad
experimental consistió en una maceta de 25 cm de diámetro, de plástico con un contenido
de 2kg aproximadamente del sustrato; lo que significa que el Factor A está compuesto por
2 niveles (micorriza nativa y LMSSK 60%) y el factor B compuesto de 3 niveles
(sustratos) en evaluación, con la cual se evaluó 6 tratamientos más el testigo (control) a
nivel de condiciones controladas (invernadero).
Todas las variables fueron sometidas al análisis de varianza y se empleó la prueba de
Tukey al 95% de probabilidad. Para establecer las diferencias entre las medias de los
tratamientos. Para el análisis estadístico se utilizó Infostat.
3.7. Factor de estudio
Se estudió dos factores:
Factor A (Micorrizas) Factor B (Sustratos)
Micorriza nativa
Micorriza LMSSK al 60%.
Tierra + picón
Turba de coco + picón
Tierra + picón + Turba de coco
3.8. Tratamientos Estudiados
Para identificar a las cepas micorrizadas (nativa y LMSSK al 60%) y los sustratos
considerados en la presente investigación, se detallan en la siguiente tabla.
27
Tabla 4: Identificación de los tratamientos a estudio
Tratamientos Factor A Factor B
T1 Micorriza LMSSK 60%. Sustrato 1
T2 Micorriza Nativa Sustrato 1
T3 Micorriza LMSSK 60%. Sustrato 2
14 Micorriza Nativa Sustrato 2
T5 Micorriza LMSSK 60%. Sustrato 3
T6 Micorriza Nativa Sustrato 3
T0 Testigo (control) Suelo natural
Elaborado por el autor: Mayra Bustamante.
3.9. Esquema del Análisis de Varianza
En la tabla se presenta el esquema del ADEVA
Tabla 5: Esquema del ADEVA (Análisis de varianza)
Fuentes de variación Grados de libertad
A: Micorriza 1
B: Sustratos 2
Interacción AxB 2
Error experimental 19
Total 23
Elaborado por el autor: Mayra Bustamante.
3.10. Manejo del Experimento
Se realizaron las prácticas y las aplicaciones de las soluciones nutritivas para el adecuado
desarrollo del cultivo (sorgo - albahaca) y para así efectuar de forma correcta la toma de
los datos y la evaluación correspondiente a cada uno de los tratamientos.
28
3.10.1. Obtención de cepas micorrizadas y sustratos.
La cepa en estudio de LMSSK al 60%, del Instituto Canario de Investigaciones Agrarias
ICIA. Islas Canarias – España se la obtuvo como donación a la Fundación Maquita –
Buena Fe con fines de investigación. La cepa nativa se la obtuvo de la huerta de la
Fundación Maquita – Buena Fe, de cacao nacional nativo. En este caso, se realizaron
muestreos de plantas sanas, recolectando muestras a los 30 cm de profundidad de la planta.
Para el sustrato, se recolecto tierra en barbecho del Cantón Palenque que se conoce como
pobre en fósforo, lo que se verificó posteriormente mediante un análisis de suelo (Anexo
11). El picón se lo obtuvo de la orilla del río San Pablo, del Cantón La Maná, utilizando
tamices de numeraciones 3 y 2 mm. La turba de coco se adquirió en el Cantón El Empalme
en el Agroquímico AGROMASA.
3.10.2. Preparación de los sustratos.
Tanto la cepa nativa obtenida de la huerta antigua de cacao y la cepa LMSSK al 60%, se
las dejo secar en una maceta cubierta por un papel toalla bajo sombra (invernadero) por 4
días. El picón de 3 mm y 2 mm obtenidos del río, se lavaron bien, cada uno por separado,
luego se esterilizaron en autoclave dos veces en días sucesivos; la fracción de tierra tenía
bajo contenido de humedad y solamente, se la esterilizó de forma similar al picón; la turba
que se utilizó es de fibra de coco, pulverizada, se usó sin esterilización. Después de tener
cada uno de los sustratos listos, se prepararon los tratamientos usando igual volumen de
cada uno de los componentes.
Tabla 6: Pesos de los componentes de la mezcla de los tratamientos
Mezcla de sustratos
(Tratamientos)
Peso por componente de la mezcla de
materiales
Cantidad
Vol : Vol
1 Tierra 250 g + picón fino 450 g. 2:2
2 Turba de coco 60g + picón fino 450g. 3:3
3 Tierra 250 g + picón fino 450 g + Turba
de coco 60 g.
2:2
Elaborado por el autor: Mayra Bustamante.
29
3.10.3. Distribución de la mezcla de sustratos en las macetas
Después de realizar las mezclas de cada uno de los sustratos, se colocaron en capas en las
maceta de 2 kg: primero una capa de picón grueso (3mm) para asegurar buen drenaje,
seguidamente una capa de la mezcla del sustrato 1 (Tierra + picón de 2mm), sobre ésta se
realizaron cuatro pequeños hoyos aproximadamente de 2 – 3 cm de profundidad, donde se
colocaron las semillas y por último se cubrieron con los inóculos correspondientes. Previa
a la siembra, las semillas de las plantas trampa se desinfectaron con hipoclorito de sodio al
1%, y se depositaron las semillas, en los hoyo y finalmente se cubrieron con
aproximadamente 20 g de inoculo en cada hoyo. La siembra se realizó el 21 de septiembre
del 2018. El raleo se realizó 7 días después de la siembra para las plántulas de sorgo (S.
bicolor L.) y 15 días en plántulas de albahaca (O. basilicum), dejando las plántula con
mayor vigor, dos de cada especie. El control de maleza se realizó manualmente cortando
los tallos de las malezas (especialmente en el testigo) con una tijera y estuvo sujeta solo al
tratamiento control. Las micorrizas son muy exigentes en cuanto a su nutrición es por eso
que se procedió a aplicaciones semanales de soluciones nutritivas, cuidando que estas
fueran bajas en fósforo. A continuación la tabla 7 muestra la cantidad de cada sustancia
usada para elaborar la solución madre y la cantidad de cada solución que integran la
solución nutritiva-madre. En cada maceta se aplicó la solución nutritiva en las siguientes
proporciones: 5 ml a los 15 días de la siembra, 15 ml, diez días después; 30 ml, a los 35
días de la siembra y de ahí en adelante, cada 10 días, hasta los 90 días de edad, se aplicó 50
ml/maceta.
Tabla 7: Composición de la soluciones madre de Hewitt (1969).
Tipo Composición Cantidad g/l Cantidad (ml) de solución/1litro
de Sol. Madre
I NO3K 40.44 10
II NO3Ca. 4 H2O 47.23 20
III SO4Mg. 7 H2O 36.97 10
IV SO4Mn. 4 H2O
BO3H3
SO4Zn. 2 H2O
2.23
3.09
0.288
1
Elaborado por el autor: Mayra Bustamante.
30
El control fitosanitario se realizó de forma manual o utilizando una tijera, cortando las
hojas que se encontraron enfermas. La cosecha de las raíces se realizó después de tres
meses a partir de la siembra.,
3.11. Datos Registrados y Formas de Evaluación.
Para estimar el efecto de los tratamientos y a su vez estudiar el comportamiento de los
sustratos para la multiplicación de micorriza nativa y LMSSK 60%.
3.11.1. Protocolo de tinción de raíces.
A los 90 días después de la siembra, las plantas se sometieron a un stress hídrico de 4 a 6
días, cuando la planta muestre estrés, se recolecto 4 g de raíces de cada unidad
experimental, cortando con una tijera y se conservó las raíces en un tubo falcón de 50 ml,
previamente lavadas con agua de llave y después sumergiéndolas en etanol al 50% para
luego proceder a determinar la colonización. Las observaciones se realizaron siguiendo el
protocolo de tinción de raíces descrito por Phillips y Hayman (1970); Gemma y Koske
(1989), (Anexo 10). En los casos en que no se pudieron observar los tejidos
adecuadamente, se realizaron pruebas con el proceso de teñido para conseguir los
resultados esperados.
3.11.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60%
en plantas trampa de S. bicolor L. y O. basilicum.
A los 90 días después de la siembra, las plantas se sometieron a un stress hídrico de 4 a 6
días y seguidamente, de cada maceta se recogió una muestra de 4 g de raíces para realizar
la tinción de raíces con Trypan blue. De cada muestra se prepararon dos placas y en cada
una se colocaron 10 trozos de 1 cm de raíces teñidas. Las raíces se observaron utilizando
un microscopio de luz con objetivo 10X para determinar las raíces colonizadas, a la vez se
detectaron el tipo de estructuras de micorrizas dentro del tejido de las raíces (hifas,
arbúsculos y vesículas), se requirió utilizar objetivo 40X observar las diferentes estructuras
presentes. El porcentaje de colonización se determinó dividiendo el número de raíces
colonizados por el total de raíces observadas y multiplicando el resultado por 100 (Aguilar
31
et al., 2016). Fórmula para la obtención del porcentaje de colonización en raíces de S.
bicolor L. y O. basilicum.
% 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑟𝑎í𝑧 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎𝑠
𝑟𝑎𝑖𝑧 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 ∗ 100
3.11.3. Determinación del volumen y peso del sistema radicular de S.
bicolor L) y O. basilicum, bajo el efecto de las micorrizas.
Para determinar el volumen y peso del sistema radicular de las raíces de S. bicolor L y O.
basilicum, se realizó el corte en la base del tallo (Planta trampa) de las cuatro macetas que
conforman cada unidad experimental por tratamiento. Se separó el sustrato de las raíces,
tratando de no dañarlas. Seguidamente, se las colocó en un vaso de precipitación aforado
250 ml o 500 ml y se estableció el volumen del sistema radicular/planta, luego, de cada
uno se midió el peso, usando una balanza analítica. El volumen y peso final resulta de la
media de cada unidad experimental por tratamiento y de las cuatro repeticiones.
3.11.4. Determinación del número de esporas en los tratamientos con
micorriza nativa y LMSSK, en plantas de S. bicolor L. y O.
basilicum.
Para cosechar las esporas, los sustratos se dejaron sin regar 3 semanas, cuando estuvieron
totalmente secos (entre 10% y el 15% de humedad), se eliminó todo residuo aéreo y se
homogenizó el contenido de las cuatro macetas que componían la unidad experimental,
pasándolas a través de una zaranda, finalmente se colocaron en fundas plásticas para
conservación. Una alícuota de 100 g, de esta mezcla se usó luego para extraer las esporas
mediante la técnica de decantación en gradiente de sacarosa al 60% y se realizó el contaje
de esporas como se indica a continuación:
3.11.4.1. Aislamiento de esporas.
Se extrajeron esporas de hongos micorrízicos de los tratamientos (suelo) de 100 g seco de
la muestra de cada una y con 100 g de muestra ya tratada del suelo de cada maceta
32
utilizando centrifugado de tamizado húmedo y gradiente de sacarosa (Daniels, 1982). Para
el aislamiento de esporas los 100 g de suelo previamente secado a temperatura ambiente,
se pasó por un tamiz de 2 mm, se pulverizó con un mortero y se volvió a pasar por el
tamiz. Se pesaron 20 g y se mezcló con 5 g de hexametafosfato sódico y se suspendió en
100 ml de agua destilada, agitándose con un agitador magnético, durante 2 min y luego se
dejó por 15 min en reposo.
Posteriormente la mezcla se decantó a una serie de tamices de 250 µm, 125 µm y 53 µm,
finalmente el residuo de los tamices se lavó con abundante agua ayudada con una piseta. El
sedimento sobrante se resuspendió en 100 ml de agua y repetir los 2 min de agitación
seguido de los 15 min de reposo inclinado y pase por el nido de tamices (Aguilar et al.,
2016).
Las fracciones obtenidas en los tamices de 125 µm y 53 µm se recogieron 2ml (con la
menor cantidad de agua posible), se colocaron en el tubo falcón, seguidamente, usando una
pipeta de 10 ml, se agrega, al fondo del tubo, 4 ml de agua y se lleva a centrifugación a
4000 rpm por 1 min. Eliminamos el sobrenadante.
Al precipitado se añadió 4 ml de sacarosa al 60 %. Se agita bien y se vuelve a centrifugar a
4000 rpm por 2 min, las esporas están ahora en suspensión. El sobrenadante obtenido se
conservó en refrigeración hasta el contaje de esporas. (Aguilar et al., 2016). Las esporas
extraídas se observaron bajo un microscopio de luz y la identificación de especies
utilizando criterios taxonómicos actuales
3.11.4.2. Calculo de la cantidad de esporas observadas por tratamiento
De acuerdo a Rodríguez y Rodríguez (2017), el contaje de esporas se realizaron
depositando 0,5 ml de la suspensión en un porta objeto, donde se contabilizaron el total de
las esporas con la ayuda de un el microscopio estereoscopio (LEITZ, MODELO XY)
(Objetivo de 10X). Aquellas que se observaban saludables, intactas y con colores vivos
se contaron y separaron por grupos teniendo en cuenta tamaño, color y forma. El contaje
se efectuó por triplicado, con ese promedio se aplicó la siguiente fórmula para determinar
el número de esporas presentes en los 100 g de suelo. La siguiente fórmula se utilizó para
la obtención de esporas en 100g/suelo (Rodríguez y Rodríguez, 2017).
33
#𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 =𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗𝑝𝑖
𝑝𝑓∗ 100
Dónde:
pi = peso inicial de la muestra.
pf = peso final usado
3.11.5. Efecto de la micorriza en el desarrollo vegetativo de sorgo (S.
bicolor L) y (O. basilicum).
El efecto de la micorrización en el desarrollo vegetativo de las plantas trampa en cada
tratamiento se efectuó por medio de evaluación de las variables altura de plantas y
diámetro del tallo. Estos resultados se los obtuvo realizado mediciones de la altura de cada
planta tomada desde la base del tallo hasta el ápice de la hoja y el diámetro del tallo a la
altura del primer nudo con una regla.
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
35
4.1. Resultados
4.1.1. Determinación del nivel de colonización micorrízica en las
plantas trampa S. bicolor L. y O. basilicum.
Del muestreo de suelos nativos no intervenidos con el empleo de agroquímicos se verifico,
la presencia de micorrizas nativas de raíces de cacao (Figura 6), por el proceso de tinción
en raíces descrito por Phillips y Hayman, (1970); Gemma y Koske, (1989) con ajustes para
las condiciones locales, principalmente en periodos de tiempo o secuencia de pasos, que se
ajustaron por ensayo y error hasta conseguir una visión clara de las estructuras (Anexo 10).
A partir de estas muestras de micorrizas nativas de suelo con raíces fue posible rescatarlas
realizando la inoculación en plantas trampa. Se observaron un buen proceso de
colonización en las plantas de sorgo y albahaca asegurando el futuro de estas micorrizas
para uso posterior en suelos de cacao mediante inoculación.
En las figuras siguientes se presenta los resultados de las imágenes observadas bajo el
microscopio del tejido colonizado en raíces de las plantas trampa y las observaciones de las
diferentes estructuras provenientes tanto de micorriza nativa como de la LMSSK 60%
Figura: 6: Obtención de micorriza nativa del cultivo de cacao.
36
Figura: 7: Aspecto del tejido colonizado en raíces de Sorgo (s) y Albahaca (a) con
aumento de objetivo 10X.
Figura: 8: Observación de las diferentes estructuras de micorrizas: hifas en “pelotón” (a =
objetivo 40X), vesículas (b = objetivo 10X), arbúsculos (c = objetivo 10X) y esporas (d =
objetivo 40X).
4.1.2. Niveles de colonización de la micorriza nativa y LMSSK 60%
en plantas trampa de S. bicolor L. y O. basilicum.
El mejor sustrato y el que permitió la mayor colonización y multiplicación de las
micorrizas fue tierra + turba de coco + picón. En esta mezcla obtuvo entre 80 y 99 % de
colonización micorrízica, independientemente del tipo de micorriza originalmente usado
como inoculo. El incremento de micorrización se observó en todos los tratamientos,
inclusive se observaron que el control que no fue inoculado. Considerando que este último
sustrato no fue previamente esterilizado, se deduce que contenía sufriente presencia de
hongos micorrízicos como para presentar un 42% de colonización, demostrando que
existen micorrizas nativas en los suelos aunque con bajos niveles de colonización (Figura
9). La presencia de micorriza en el control nos indica que las plantas se desenvuelvan con
37
algún nivel de eficiencia en los suelos bajo estudio, sin embargo requieren, para mayor
efectividad, de la inoculación de los sustratos pobres, para conseguir un incremento de la
absorción y translocación de nutrientes.
Figura: 9: Porcentaje de colonización de los tratamientos. Las barras de error indican ±ES;
letras diferentes indican diferencias significativas entre los promedios a p<0.05 (Prueba de
Tukey).
4.1.3. Efecto de las micorrizas en el volumen del sistema radicular de
S. bicolor L. y O. basilicum.
El efecto de las micorrizas en el volumen del sistema radicular, para el factor micorriza no
se encontraron diferencias significativas, es decir tanto la micorriza nativa como la
LMSSK al 60% generaron igual volumen radicular, con valores de 129,27 y 128,96 cm3
respectivamente (Tabla 8). En el factor sustrato, si se presentaron diferencias significativas,
con el sustrato formado por tierra + turba de coco + picón presentando el valor más alto,
168,44 cm3. Aparentemente, a mayor cantidad de nutrientes, mayor aumento del sistema
radicular y consecuentemente mayor capacidad de colonización de la micorriza, que se
refleja en las distintas combinaciones micorriza sustrato. Entre las interacciones se
observaron también diferencias significativas, destacando que la micorriza nativa de la
huerta de cacao tuvo un efecto semejante al de LMSSK al 60% en relación al aumento de
volumen del sistema radicular, cuando interactúa con la mezcla completa, variando
comportamiento cuando faltaba uno de los componentes.
38
Tabla 8: Efecto del volumen de raíces en la multiplicación de micorrizas en tres diferentes
sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum)
en condiciones de invernadero, 2019.
TRATAMIENTOS Volumen de
raíces (cm3) N° Detalles
Micorrizas
M1 Micorriza LMSSK 60% 128,96 a
M2 Micorriza nativa 129,27 a
Sustratos
S1 Tierra + Picón 97,19 c
S2 Turba de coco + Picón 121,72 b
S3 Tierra + Turba de coco + Picón 168,44 a
Tratamientos
M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 90,00 abcd
M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 127,19 ab
M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 169,69 a
M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 104,38 abc
M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 116,25 abc
M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 167,19 a
Testigo Tierra 54,06 d
Promedios 13,30
CV % 34,92
4.1.4. Determinación del peso del sistema radicular de S. bicolor L. y
O. basilicum, bajo el efecto de las micorrizas.
Al analizar el peso del sistema radicular, los resultados son consistentes con lo encontrado
en volumen. No hubo diferencias en cuanto al tipo de micorriza tanto la nativa como la
LMSSK 60% presentaron pesos similares. El factor sustrato si se dio lugar a diferencias
significativas, el mayor peso del sistema radicular estuvo dado por el sustrato más
completo tierra + turba de coco + picón, con un valor de 11,57 g. En las interacciones
igualmente se observaron diferencias significativas, entre los tratamientos con las dos
39
combinaciones de micorriza y el sustrato más completo dando el valor más alto (11,96 y
11,19 g para la micorriza LMSSK al 60% y nativa respectivamente) del peso radicular
(Tabla 9).
Tabla 9: Peso de raíces en la multiplicación de micorrizas en tres diferentes sustratos en
simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en
condiciones de invernadero, 2019.
TRATAMIENTOS Peso de
raíces (g) N° Detalles
Micorrizas
M1 Micorriza LMSSK 60% 8,88 a
M2 Micorriza nativa 8,98 a
Sustratos
S1 Tierra + Picón 6,67 abc
S2 Turba de coco + Picón 8,55 ab
S3 Tierra + Turba de coco + Picón 11,57 a
Tratamientos
M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 6,09 abcd
M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 8,61 abc
M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 11,96 a
M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 7,25 abc
M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 8,50 abc
M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 11,19 ab
Testigo Tierra 3,38 abcd
Promedios 8,14
CV % 16,40
4.1.5. Multiplicación de esporas proveniente de dos tipos de
micorrizas nativa y LMSSK 60% en plantas trampa.
La producción de esporas estuvo a favor de la micorriza nativa que generó la mayor
cantidad de esporas con un valor de 1960 esporas en 100g/suelo, siendo significativamente
diferente a la LMSSK 60% (Tabla 10). En el factor sustrato, se observó que mientras más
enriquecido hubo mejor producción de esporas, con diferencias significativas entre ellos
(Tabla 10), la mezcla de tierra + turba de coco + picón produjo 2370 esporas en
100g/suelo, seguida por las otras dos mezclas con 1500 esporas y 1510 respectivamente; es
decir, a mayor cantidad de nutrientes, mayor generación del sistema radicular y capacidad
40
de colonización la micorriza y producción de esporas. Entre las interacciones se
observaron diferencias significativas, la producción de esporas en los sustratos de tierra +
picón y turba de coco más picón fue a favor de la micorriza nativa produciendo 420 y 620
más esporas que cuando se mezcló con la LMSSK al 60 %. El sustrato más rico, tierra +
turba de coco + picón en cambio, aparentemente disminuyo esa diferencia presentando
valores casi similares, con apenas 40 esporas de diferencia, a favor de la LMSSK al 60%
(Tabla 10). La producción de esporas de hongos es un mecanismo que tienen para asegurar
su supervivencia, lo que explica que la producción de esporas sea menor en el sustrato más
rico, como se aprecia en la tabla.
Tabla 10: Número de esporas de micorrizas en tres diferentes sustratos en simbiosis con
plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O. basilicum) en condiciones de
invernadero, 2019.
TRATAMIENTOS Número de
esporas N° Detalles
Micorrizas
M1 Micorriza LMSSK 60% 1626 ab
M2 Micorriza nativa 1960 a
Sustratos
S1 Tierra + Picón 1510 ab
S2 Turba de coco + Picón 1500 ab
S3 Tierra + Turba de coco + Picón 2370 a
Tratamientos
M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 1300 abcd
M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 1190 abcde
M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 2390 a
M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 1720 abc
M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 1810 ab
M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 2350 a
Testigo Tierra 800 abcde
Promedios 1651,43
CV % 13,14
41
4.1.6. Efecto de la micorrizas en los caracteres morfológicos de S.
bicolor L. y O. basilicum.
4.1.6.1. Altura y diámetro del sorgo (S. bicolor L.).
Los parámetros de altura y diámetro que corresponden al aspecto morfológico de las
plantas trampa presentaron efecto variable, con algunos tratamientos alcanzando valores
incluso menores al del testigo. Sobre el sorgo, el efecto de las micorrizas fue visible tanto
en la altura como en el diámetro, que alcanzaron las plantas.
Para el factor micorriza se pudo determinar que no existieron diferencias significativas
para ninguno de estos dos parámetros (Tabla 11), es decir, que la micorriza nativa tiene
igual capacidad que la LMSSK al 60%, para que las plantas trampa alcancen su mejor
desarrollo.
Si se observaron diferencias significativas con los sustratos y las combinaciones,
observándose que la turba + tierra + picón y la mezcla de los tres elementos da mejores
resultados que si solo se usa tierra + picón solamente.
Dentro las interacciones se si se encontraron diferencias significativas, con alturas de entre
133 -123 cm (Tabla 11). Bajo las condiciones de invernadero en sitio con baja nubosidad
en que se realizó este experimento, los resultados obtenidos en los caracteres morfológicos
de las plantas son consistentes con los resultados obtenidos en el proceso de micorrización.
Tabla 11: Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de micorrizas en tres
diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O.
basilicum) en condiciones de invernadero, 2019.
42
TRATAMIENTOS
N° Detalles
Diámetro
/tallo
(mm)
Altura
/planta
(cm)
Micorrizas
M1 Micorriza LMSSK 60% 6,83 ab 112 a
M2 Micorriza nativa 7,64 a 112 a
Sustratos
S1 Tierra + Picón 5,38 ab 88 ab
S2 Turba de coco + Picón 7,77 a 126 a
S3 Tierra + Turba de coco + Picón 8,55 a 122 a
Tratamientos
M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 5,26 abcd 81 abc
M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 7,16 abc 133 a
M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco +
Picón 8,06 ab 122 ab
M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 5,5 abcd 95 abc
M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 8,38 ab 95 abc
M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 9,03 a 123 ab
Testigo Tierra 6,75 abcd 101 abc
Promedios 7,16 110
CV % 10,56 11,96
4.1.6.2. Altura y diámetro de la albahaca (O. basilicum).
Los parámetros de altura y diámetro que corresponden al aspecto morfológico de las
plantas trampa presentaron efecto variable, con algunos tratamientos alcanzando valores
incluso menores al del testigo. Al igual que el sorgo, sobre la albahaca, el efecto de las
micorrizas fue visible tanto en la altura como en el diámetro, que alcanzaron las plantas.
Para el factor micorriza se pudo determinar que no existieron diferencias significativas
para ninguno de estos dos parámetros (Tabla 12), es decir, que la micorriza nativa tiene
igual capacidad que la LMSSK al 60% para que las plantas trampa alcancen su mejor
desarrollo. Si se observaron diferencias significativas con los sustratos y las
combinaciones, observándose que la turba de coco con picón y la mezcla de los tres
43
elementos da mejores resultados que si solo se usa tierra y picón solamente. Dentro las
interacciones se si se encontraron diferencias significativas, con alturas de 0,21 cm (Tabla
12).
Tabla 12: Diámetro del tallo y altura de planta en la multiplicación de micorrizas en tres
diferentes sustratos en simbiosis con plantas trampa de sorgo (S. bicolor L.) y albahaca (O.
basilicum) en condiciones de invernadero, 2019.
TRATAMIENTOS
Diámetro
/tallo
(mm)
Altura
/planta
(cm)
N° Detalles
Micorrizas
M1 Micorriza LMSSK 60% 3,75 a 14 a
M2 Micorriza nativa 3,75 a 12 b
Sustratos S1 Tierra + Picón 1,67 Ac 5 c
S2 Turba de coco + Picón 4,13 ab 18 a
S3 Tierra + Turba de coco + Picón 5,44 a 14 ab
Tratamientos M1S1 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Picón 1,47 Ac 4 A c
M1S2 Micorriza LMSSK 60% - Turba de coco + Picón 4,13 ab 21 a
M1S3 Micorriza LMSSK 60% - Tierra + Turba de coco + Picón 5,66 a 16 abb
M2S1 Micorriza nativa - Tierra + Picón 1,88 Ac 6 c
M2S2 Micorriza nativa - Turba de coco + Picón 4,13 ab 16 ab
M2S3 Micorriza nativa - Tierra + Turba de coco + Picón 5,22 ab 13 ab
Testigo Tierra 1,57 Ac 7 c
Promedios 3,44 29
CV % 19,28 18,46
4.2. Discusión
4.2.1. Determinación del nivel de colonización micorrízica en las
plantas trampa S. bicolor L. y O. basilicum.
La simbiosis mutualista existente entre un hongo y la raíz de un hospedero (Planta trampa),
logran resultados eficientes en la rizósfera, entre las interacciones de hongo-planta se
requirieron estudios de suelos donde no hayan sido intervenidos con el empleo de
maquinarias, productos agroquímicos o sobre fertilizaciones y para la obtención de
micorrizas nativas se verifico la presencia de aspectos de tejidos colonizados y las
diferentes estructuras (hifas , vesículas, arbúsculos y esporas) por medio del proceso de
44
tinción en raíces descrito por Phillips y Hayman (1970); Gemma y Koske (1989), de
acuerdo a este tipo de organismos, el uso de fuentes nativas tiene la ventaja de estar
adaptado a las condiciones edafoclimáticas y por lo tanto su eficiencia puede ser de
intereses locales. Se demostraron que los suelos nativos mantiene un buen proceso de
colonización, los cuales permitieron rescatar realizando la inoculación en plantas trampa.
Según González y Ferrera (1996); Álvarez y Ferrera (2006), como ejemplo, se ha
demostrado que la inoculación con hongos micorrízicos arbusculares aislados de fincas
cafetaleras favorece significativamente el crecimiento de plantas de café en comparación
con cepas de hongos micorrízicos de diferente origen. No obstante, estos trabajos no
consideraron la identidad taxonómica ni aspectos ecológicos de donde fueron recolectados
los hongos micorrízicos.
4.2.2. Porcentaje de colonización de la micorriza nativa y LMSSK
60% en plantas trampa de S. bicolor L. y O. basilicum.
La micorriza arbuscular nativa y LMSSK 60% para obtener el mayor porcentaje de
colonización y multiplicación se requiere de la inoculación con raíz-suelo, la eficiencia de
sustratos pobres y esterilizados, donde se observaron un incremento de todos los
tratamientos. Según Monroy (2004), la colonización se produce rápidamente a partir de
raíces previamente micorrizadas que a partir de esporas, ya que en la raíz tienen mayor
viabilidad y desarrollo de estructuras. Independientemente del tipo de micorriza que
consignan entre 80 y 99% de colonización micorrízica, inclusive se observaron que el
control que no fue inoculado y debido a que el sustrato no fue previamente esterilizado y
presentaron un 42% de colonización.
Según Roveda et al. (2007), la colonización de HMA en los tratamientos testigo es causada
por la presencia de cepas nativas de micorrizas, debido a que los sustratos utilizados no
fueron previamente desinfectados. Sin embargo, los niveles de colonización en los
tratamientos testigos son bajos, menores que aquellos inoculados, lo que demuestra la
importancia de la práctica de selección de suelos con mayor riqueza de hongos
micorrizógenos para inoculación y la mayor eficiencia de las cepas inoculadas con relación
a las cepas presentes en el sustrato. Igualmente es de destacar el comportamiento de la cepa
nativa, cuya eficiencia fue comparativamente igual que la cepa LMSSK al 60% utilizada.
45
Una de las razones para ello, además de lo ya expuesto es la diversidad encontrada en la
nativa, frente a la LMSSK 60 % en la que solamente había dos géneros de hongos.
4.2.3. Efecto de las micorrizas en el volumen y peso del radicular de S.
bicolor L. y O. basilicum.
Al analizar el sistema radicular respecto al peso y volumen, los resultados son consistentes,
es decir tanto la micorriza nativa como la LMSSK al 60% generaron igual peso y volumen
del sistema radicular. Donde se encontraron diferencias en los sustratos, el mayor peso y
volumen del sistema radicular estuvo dado por tierra + turba de coco + picón, con un valor
de 11,57 g y 129,27 cm3 respectivamente. Igualmente se observaron diferencias en las
interacciones, entre la micorriza y el sustrato completo dando el valor más alto del peso y
volumen del sistema radicular. Según Galindo (2008), en un estudio en frejol determinó
que la edad de la planta afecta la masa radical obtenida y que varía con el estado de
desarrollo del cultivo, con lo cual se obtuvieron valores mayores en las plantas cosechadas
a los 60 días que en plantas evaluadas a los 30 días, en donde los tratamientos no
influenciaron la masa radical de las plantas de frejol. Consecuentemente, las observaciones
en este estudio realizadas a los 90 días de edad de las plantas trampa, se hicieron en un
tiempo suficiente como para obtener un desarrollo micorrízico adecuado a las necesidades
de este estudio.
4.2.4. Producción de esporas proveniente de dos tipos de micorriza:
nativa y LMSSK 60% en plantas trampa.
La multiplicación o producción de esporas estuvieron a favor de la micorriza nativa
arbuscular de la huerta nativa de cacao generó la mayor cantidad de esporas con un valor
de 1960 esporas en 100g/suelo. Se observaron que mientras más enriquecido el sustrato
hubo mejor producción de esporas con la mezcla de tierra + turba de coco + picón
produjeron 2370 esporas en 100g/suelo, seguida por las otras dos mezclas con 1500 - 1510
esporas respectivamente, es decir, a mayor cantidad de nutrientes, mayor generación del
sistema radicular y capacidad de colonización la micorriza y producción de esporas. Según
Habte y Osorio (2001), en el proceso de multiplicación el carácter de simbionte obligado
por parte del hongo implica el uso de plantas hospedadoras con las cuales pueda completar
46
su ciclo de vida y finalmente producir abundantes esporas y/u otros propágulos. La planta
hospedadora debe sembrarse en un sustrato adecuado, buscando obtener alta versatilidad,
buena capacidad de intercambio catiónico, aireación y retención de humedad. Los
elementos están realmente disponibles en el país a costos relativamente bajos. Según
Duchicela (2001), quien sugiere que para ver el efecto benéfico de la simbiosis se requiere
de la esterilización del sustrato y/o desinfección (solarización, fumigación, vaporización)
con el fin de evitar daños posibles por la presencia de microorganismos fitopatógenos que,
además de ser una fuente de diseminación de enfermedades también pueden influir en la
capacidad de los hongos micorrízicos de colonizar el sistema radical.
4.2.5. Efecto de la micorrizas en los caracteres morfológicos de S.
bicolor L. y O. basilicum.
Los efectos micorrízicos en los caracteres morfológicos sobre sorgo y albahaca presentaron
efecto variable con algunos tratamientos. Siendo visibles en diámetro y altura que
alcanzaron las plantas. El efecto micorrízico se pudo determinar que no existieron
diferencias para ninguno de estos dos parámetros, es decir, que la micorriza nativa tiene
igual capacidad que la LMSSK al 60%, para que las plantas trampa alcancen su mejor
desarrollo.
Según Aravena y Marcelo (2007), en plantas de aguacate y cítricos se observó que ninguna
de las variables (altura, diámetro, materia seca radicular y aérea) afectó el crecimiento final
de las plantas, conociendo que las respuestas a la micorrización tienden a ser menores en
suelos ricos en fósforo, también otro factor que se debe tener en consideración, y que
eventualmente podría explicar la falta de diferenciación en el crecimiento de las plantas, es
el tiempo transcurrido entre la inoculación y las mediciones realizadas. Plantas que se
encuentran en condiciones de invernadero, con fertilización y riego controlados, y pese a
porcentajes de colonización adecuados, pueden no expresar respuestas en el crecimiento
debido al tiempo de exposición a la acción de las micorrizas. Según Van der Heijden et al.
(1998); Klironomos et al. (2000), lo que el efecto benéfico de hongos micorrízico
arbuscular (definida como efectividad) en la promoción del crecimiento y/o nutrición de
las plantas parece estar definido por la riqueza de especies y por la procedencia de su
aislamiento, hecho que también fue posible apreciar en este estudio.
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
48
5.1. Conclusiones
La validación del protocolo de la técnica de tinción de las raíces, requirió ajustes en
las temperaturas a baño María y las secuencias de tiempos, para conseguir una
absorción de las soluciones, permitiendo que las raíces micorrizadas se aclaren y se
adhiera el tinte, facilitando la observación de las diferentes estructuras
colonizadoras.
La determinación del tipo de cepa que presenta mayor capacidad micorrízica tanto
la micorriza nativa, como la LMSSK al 60%, alcanzaron valores 99% de
colonización, es decir, ambas tienen capacidad de colonización. Existieron
diferencias entre las interacciones en la producción de esporas de la micorriza
nativa con 1960 esporas/100 g de suelo y la micorriza LMSSK al 60% con 1626
esporas/100 g de suelo y combinación con el sustrato tierra + turba de coco + picón
con 2370 esporas/100 g de suelo.
El mejor sustrato con el 99% de colonización y 1960 esporas/100 g de suelo
independientemente del tipo e inoculo, fue el que contiene la mezcla tierra + turba
de coco + picón.
El mejor con 8.55 mm – 122 cm del sorgo y 5.44 mm – 14 cm de la albahaca en el
efecto de la micorrización en las plantas trampa se obtuvieron con la mezcla de
turba de coco + picón y la de tierra + turba de coco + picón. Las observaciones de
colonización fueron más claras y extensivas en la albahaca.
49
5.2. Recomendaciones
Es recomendable para multiplicar micorrizas nativas de manera artesanal utilizar el
sustrato tierra + turba de coco + picón, previamente esterilizado e inoculado con
suelo y raíces, que brinda las condiciones favorables para que la masa radicular se
desarrolle adecuadamente obteniendo mayor cepas micorrizadas.
Realizar estudio de suelos de huertas antiguas de cacao y otros cultivos similares
para determinar fuentes de micorrizas nativas para multiplicación.
Realizar pruebas en vivero o campo con inoculo proveniente de micorrizas nativas
para establecer su eficiencia y efecto en condiciones de cultivos de interés local
(cacao, maíz, plátano).
Para una siguiente investigación es recomendable evaluar otras especies de plantas
locales (ejemplo: maíz, frejol, albahaca de monte) como planta trampa para
multiplicación o producción de inóculos nativos, teniendo en cuenta de estudiarlas
independientemente medir su capacidad micorrízica de colonización y
multiplicación.
CAPÍTULO VI
BIBLIOGRAFÍA
51
6.1. Literatura Citada
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CAPÍTULO VII
ANEXOS
57
Anexo 1: Croquis de cada unidad experimental.
* * * * * * * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * * * * * *
Distancia entre macetas: 30cm
Anexo 2: Croquis del área de estudio.
0,40m IV 0,40m I 0,40m II 0,40m III 0,40m
0,80m 0,80m 0,80m 0,80m
1.20m
T3 T0 T5 T1
1,20m
T2 T4 T3 T0
T5 T1 T2 T5
T1 T3 T4 T4
T6 T5 T6 T6
T4 T6 T1 T2
T0 T2 T0 T3
4,40m
58
Anexo 3: Obtención de las cepa micorrízica nativa.
Anexo 4: Recolección y esterilización de los sustratos.
Anexo 5: Protocolo de la técnica de tinción de raíces.
59
Anexo 6: Observación de las estructura de micorrizas.
Anexo 7: Toma de datos de los tratamientos.
Anexo 8: Peso y volumen de raíces.
60
Anexo 9: Obtención y observación de esporas.
Anexo 10: Protocolo de tinción de raíces descrita por (Phillips y Hayman, 1970); (Gemma
y Koske, 1989), con modificaciones de Mayra Bustamante 2019.
Se recolectó 4 gramos de raíces de cada unidad experimental que conformó el
tratamiento (Anexo 5), se conservó hasta su procesamiento en un tubo falco de 15 ml,
con Etanol al 50%, previamente lavado con agua de llave (Anexo 7).
Seguido se eliminó el Etanol, se enjuagó con agua de llave, se añade una solución de
Hidróxido de potasio (KOH) al 2.5%, hasta cubrir las raíces, se dejó 1 hora a 70 ºC en
baño maría y 24 horas a temperatura ambiente.
Se eliminó el Hidróxido de potasio (KOH), se enjuagó con agua de llave y se dejó por
10 minutos con Hipoclorito sódico (NaClO) cubriendo las raíces.
Se eliminó el Hipoclorito sódico, se enjuagó con agua de llave, se añadió el Ácido
clorhídrico (HCl) al 1% hasta cubrir las raíces, aquí permanecen 1 hora a 70 ºC en
baño maría y 24 horas más temperatura ambiente (Anexo 7).
Se eliminó el Ácido clorhídrico (HCl) y se tiñen con Trypan Blue al 0.05% en glicerol
acidificado (500 ml de glicerol + 450 ml de H2O + 50 ml de Ácido clorhídrico (HCl)
al 1%), cubriendo las raíces, igualmente permanecen por 1 hora a 70 ºC en baño maría
y 24 horas a temperatura ambiente (Anexo 7).
Se eliminó el Trypan Blue, se enjuagó con glicerol acidificado 3 veces y se las deja en
el último enjuague, donde pueden permanecer en refrigeración hasta su observación.
61
Anexo 11: Análisis de suelo.
62
63