Universidade de Lisboa Faculdade de Farmáciarepositorio.ul.pt/bitstream/10451/33996/1/TM_Catarina_Alves.pdf · interesse, licenciei-me no curso de Bioquímica pela Faculdade de Ciências

Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

O PARADIGMA DA INFEÇÃO POR PLASMODIUM FALCIPARUM EM

MULHERES GRÁVIDAS SEROPOSITIVAS PARA HIV: A PREVENÇÃO DA

TRANSMISSÃO VERTICAL E A INFEÇÃO CONGÉNITA

Catarina Rafaela Jacinto Alves

Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Quirina dos Santos Costa e

coorientado pela Doutora Isabel Moutinho e pela Doutora Teresa Porta Nova

Mestrado em Análises Clínicas

2017

Parte I

IX Mestrado Análises Clínicas Parte I

Catarina Alves Prefácio

v

Prefácio

Sabendo que as áreas da Biologia e Química eram as que mais me suscitavam

interesse, licenciei-me no curso de Bioquímica pela Faculdade de Ciências da

Universidade de Lisboa, que me deu bases nas mais variadas áreas da Ciência. Ao longo

dos três anos ganhei experiência laboratorial nos campos da Bioquímica e Química

analítica, Biologia celular e Microbiologia, bem como conhecimentos teóricos noutras

áreas como a Imunologia, Biologia molecular e Enzimologia. Como o plano de estudos

não engloba um estágio final curricular, decidi procurar estágios voluntários de modo a

ter um contacto direto com o mundo profissional, que me permitiram adquirir uma visão

mais real da área em que pretendia trabalhar, nomeadamente no Instituto Nacional de

Saúde Dr. Ricardo Jorge, onde ganhei bastante interesse na área da saúde. Desta forma,

ingressei no mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade

de Lisboa, cujo plano curricular é convidativo e enriquecedor, apresentando o que

necessito para complementar os meus conhecimentos e mais tarde trabalhar na área que

gosto e com que me identifico. O presente relatório diz respeito ao estágio curricular

realizado no âmbito do mestrado.

Quanto à organização, o presente relatório encontra-se dividido em quatro partes:

na Parte I apresentam-se o prefácio, o resumo em português e inglês, índices e lista de

abreviaturas; na Parte II expõe-se o relatório de estágio, em que é feito um resumo dos

locais de estágio, expondo os conhecimentos adquiridos nos mesmos, para as valências

de Pré-Analítica, Bioquímica, Microbiologia e Genética. A parte III diz respeito à

monografia, desenvolvida no âmbito da valência de Microbiologia, com o título “O

paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas

para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita”. Por último, na Parte

IV, apresentam-se as conclusões e perspetivas futuras.

Este relatório está de acordo com o disposto no Artigo 37.º do Regulamento Geral

do Ciclo de Estudos conducente ao Grau de Mestre da FFULisboa, nº 134/2016, DR, 2.ª

série — N.º 26, de 8 de fevereiro de 2016.


Catarina Alves Resumo

vi

Resumo

O estágio descrito neste relatório integra o plano de estudos do Mestrado em Análises

Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Foi realizado no

Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz relativamente às áreas de Pré-

Analítica, Microbiologia e Bioquímica. A valência de Genética foi desenvolvida no

Laboratório GenoMed – Diagnósticos de Medicina Molecular.

Este relatório de estágio resume a experiência e conhecimento adquiridos ao longo

de cerca de seis meses e expõe quais os produtos biológicos necessários à execução dos

respetivos parâmetros analíticos, bem como metodologias aplicadas aos mesmos. Refere

ainda como o Controlo de Qualidade Interno foi implementado e como a Avaliação

Externa da Qualidade foi interpretada nas várias áreas de estudo.

A realização e duração total do estágio permitiu-me não só colocar em prática os

conhecimentos obtidos nas unidades curriculares do mestrado, como realizar novas

aprendizagens fundamentais para a prática profissional.

Neste documento é também apresentada uma revisão bibliográfica acerca do tema:

o paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas

para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita.

Palavras-chave: Pré-Analítica; Microbiologia; Bioquímica, Genética, Qualidade


Catarina Alves Abstract

vii

Abstract

The internship described in this report integrates the study plan of the Masters in

Clinical Analysis by the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon. It was carried

out in the Laboratory of Clinical Pathology of Hospital da Luz with respect to the areas

of Pre-Analytical, Microbiology and Biochemistry. The Genetic valence was developed

in GenoMed – Diagnostics of Molecular Medicine.

This internship report summarizes the experience and knowledge acquired over

six months. It refers to the biological products needed to implement the respective

analytical parameters, as well as the applied methodologies. It refers also to how the

Internal Quality Control was implemented and how the External Quality Assessment was

interpreted in the various areas of study.

The execution and total duration of the internship has allowed me to not only put

into practice the knowledge obtained in the Master’s degree units, but also to obtain new

learning of great importance to the professional practice.

In this document is also presented a bibliographic reviw on the theme: The

paradigm of Plasmodium falciparum infection in HIV-positive pregnant women:

prevention of vertical transmission and congenital infection.

Keywords: Pre-Analytical, Microbiology, Biochemistry, Genetic, Quality


Catarina Alves Agradecimentos

viii

Agradecimentos

Inicialmente, agradeço a todos os docentes e convidados pelos conhecimentos

fornecidos ao longo do Mestrado em Análises Clínicas.

Expresso o meu especial agradecimento à Professora Doutora Quirina dos Santos

Costa pela sua orientação, disponibilidade, apoio e atenção dispensada.

Agradeço à Dra. Teresa Porta Nova pela oportunidade de realização do estágio na

GenoMed e aos técnicos das várias secções do laboratório, por tudo o que me ensinaram

e deram a conhecer. Da mesma forma, agradeço à Dra. Isabel Moutinho e aos

responsáveis e técnicos das várias áreas do laboratório de Patologia Clínica do Hospital

da Luz, por todo o apoio e contribuição para que o estágio resultasse numa excelente

experiência a nível de formação e pessoal.

Não podia deixar de agradecer à minha família e amigos por todo o carinho,

conselhos e apoio incondicional, com especial agradecimento aos meus pais por todo o

esforço que fizeram para que pudesse concluir os meus estudos. Sem vocês, nada disto

seria possível. Um grande Obrigado!

Catarina Alves Parte I

IX Mestrado Análises Clínicas Lista de Abreviaturas

ix

Lista de Abreviaturas

Parte II

Relatório de Estágio

ABL1 –Abelson murine leucemia viral oncogene homolog 1

ADA – Associação Americana de Diabetes (do inglês, American Diabetes Association)

ADN – Ácido desoxirribonucleico

ADNc – Ácido desoxirribonucleico complementar

ADP – Difosfato de adenosina

AE – Tampão de eluição

AEQ – Avaliação Externa da Qualidade

AgHBs - Antigénio de superfície do vírus da Hepatite B

AGJ - Anomalia da Glicemia de Jejum

AL – Tampão de lise

ALP – Fosfatase alcalina

ALT – Alanina aminotransferase

ARN – Ácido ribonucleico

AST – Aspartato aminotransferase

ATL – Tampão de lise tecidular

ATP – Trifosfato de adenosina

BCR – Breakpoint cluster region gene

BE – Excesso de bases

BHI - Caldo Coração – Cérebro

BNP - Péptido natriurético cerebral

BRAF – v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B

Ca2+ - Ião cálcio

CAM – Gelose Campylosel

Cl- - Ião cloro

CLED – Gelose Cistina Lactose Deficiente em Eletrólitos

CK – Creatina quinase

CK-MB – Isoenzima MB da creatina quinase

CNA - Gelose Columbia ANC + 5% de sangue de carneiro



x

CO2 – Dióxido de carbono

CPNPC - Carcinomas de pulmão de não pequenas células

CPPC - Carcinomas de pulmão de pequenas células

CQI – Controlo de Qualidade Interno

DAPI - 4,6-diamidino-2-fenilindol

DGF – Doenças Genéticas e Farmacogenética

DGS – Direção-Geral da Saúde

DMG – Diabetes mellitus gestacional

DMSO – Dimetilsulfóxido

dNTP –Desoxirribonucleótidos trifosfato

ddNTPs – Didesoxirribonucleótidos trifosfato

DRM – Doença residual mínima

DTT – Ditiotreitol

EAM – Enfarte agudo do miocárdio

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

EGFR – Epidermal growth factor receptor gene

EIA – Ensaio imunoenzimático (do inglês, enzyme immunoassay)

ELFA – Ensaio enzimático fluorescente (do inglês, enzyme linked fluorescent assay)

EMN - Rede Europeia do Mieloma (do inglês, European Myeloma Network)

EMQN - Rede Europeia de Qualidade Genética Molecular (European Molecular

Genetics Quality Network)

Fem – Força eletromotriz

FISH – Hibridação in situ de fluorescência (do inglês, fluorescence in situ hybridization)

GGT – γ-glutamil transferase

GHEP-ISFG - Grupo de Línguas Espanhola e Portuguesa da Sociedade Internacional de

Genética Forense

GN – Gram negativo(s)

GP – Gram positivo(s)

GS – Gelose Columbia + 5% de sangue de Carneiro

H2S – Sulfeto de hidrogénio

HAE2 - Gelose Chocolate Haemophilus 2

HBV – Vírus da hepatite B (do inglês, hepatitis B virus)

hCG - Gonadotropina coriónica humana

HCO3- - Ião bicarbonato



xi

HDL – Lipoproteína(s) de alta densidade (do inglês, high density lipoprotein)

HEKT – Gelose Hektoen

HFE – Proteína da Hemocromatose Hereditária

HH – Hemocromatose Hereditária

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês, Human Immunodeficiency Virus)

HK - Hexoquinase

HM – Módulo de imunoensaio heterogéneo

HRP-II – Proteína rica em histidina II (do inglês, histidine rich protein II)

IgG – Imunoglobulina G

IgM – Imunoglobulina M

iMM - Instituto de Medicina Molecular

IMT – Tecnologia do Multisensor Integrado (do inglês, Integrated Multisensor

Technology)

iQM – Controlo de Qualidade inteligente (do inglês, intelligent Quality Management)

ISCN - Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética Humana (do inglês,

International System for Human Cytogenetic Nomenclature)

ISO – Organização Internacional de Normalização (do inglês, International Organization

for Standardization)

K+ - Ião potássio

KCl – Cloreto de potássio

KRAS – Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

Lac - Lactose

LBA – Lavado bronco-alveolar

LCR – Líquido cefalorraquidiano

LDH – Lactato desidrogenase

LLA – Leucemia Linfocítica Aguda

LMC – Leucemia Mielóide Crónica

LOCI – Módulo de imunoensaios homogéneos de alta sensibilidade

MAP –Proteínas ativadas por mitogénios (do inglês, Mitogen Activated Protein)

MCK - Gelose MacConkey

MgCl2 – Cloreto de magnésio

MRSA - Staphylococcus aureus meticilina-resistentes (do inglês, methicillin-resistant

Staphylococcus aureus)

MS - Manitol Salgado (gelose Chapman 2)



xii

Na+ - Ião sódio

NAD - Nicotinamida adenina dinucleótido

NADH – Forma reduzida de nicotinamida adenina dinucleótido

NADPH - Forma reduzida de fosfato nicotinamida adenina dinucleótido

NCEP – ATP III – Programa Nacional de Educação sobre o Colesterol – Painel de

Tratamento de Adultos III (do inglês, National Cholesterol Education Program Adult

Treatment Panel III)

UK - NEQAS – Serviço Nacional de Avaliação Externa da Qualidade do Reino Unido

(do inglês, The United Kingdom National External Quality Assessment Service)

NS1 – Glicoproteína não estrutural 1

NT-proBNP - N-terminal pro-péptido natriurético cerebral

PBD – PBS + octilfenoxipolietoxietanol

PBS –Tampão fosfato-salino

ρCO2 - Pressão parcial de dióxido de carbono

PCR – Reação em cadeia da polimerase (do inglês, polymerase chain reaction)

pH – Potencial de hidrogénio

Ph – Cromossoma Filadélfia

pLDH – Lactato desidrogenase de Plasmodium

PNAEQ - Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade

ρO2 – Pressão parcial de oxigénio

PTGO – Prova de tolerância à glicose oral

PVX - Gelose Chocolate + PolyViteX

QCMD – Controlo de Qualidade para o Diagnóstico Molecular (do inglês, Quality

Control for Molecular Diagnosis)

RAS – Vírus do Sarcoma de Rato

RCLB –Tampão de lise de eritrócitos

RMM – Resposta Molecular Major

RN – Recém-nascido(s)

RQ-PCR – Reação em cadeia da polimerase em tempo real (do inglês, real time

polymerase chain reaction)

RSV – Vírus sincicial respiratório (do inglês, Respiratory Syncytial Virus)

RT-PCR – Reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (do inglês, reverse

transcriptase polymerase chain reaction)

SCS – Gelose Schaedler + 5% de sangue de carneiro



xiii

SIDA - Síndrome da imunodeficiência adquirida

SNC – Sistema nervoso central

SSC - Citrato sódio salino

T3 - Tiroxina

T4 - Triiodotironina

TA – Temperatura ambiente

Taq – Polimerase de ADN termo-estável

TBE – Tris-Borato-EDT

tcdB - Gene que codifica a toxina B de Clostridium difficile

TCO2 - Dióxido de carbono total

TDG - Tolerância diminuída à glicose

TE – Tris-EDTA

TFG – Taxa de filtração glomerular

TKI – Inibidor de tirosina quinase

TOOD - Caldo Todd-Hewitt + antibióticos

TPA - 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato

TSA – Teste(s) de suscetibilidade aos antibióticos

TSH – Hormona estimulante da tiróide

UFC – Unidades formadoras de colónias

UV – Ultravioleta

VCA - Gelose Chocolate PolyViteX VCAT3

VP6 – Proteína viral 6

VRE – Enterococcus spp. vancomicina-resistentes (do inglês, vancomycin-resistant

Enterococcus)

WHO – Organização Mundial de Saúde (do inglês, World Health Organization)



xiv

Parte III

O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas seropositivas

para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita

AMA – Antigénio de membrana apical

ACT – Terapia combinada com artemisina (do inglês, artemisinin-based combination

therapy)

ARN – Ácido ribonucleico

ART – Terapia antirretroviral (do inglês, antiretroviral therapy)

CCR5 – Recetor de quimiocinas tipo 5

CDC - Centro de Controlo e Prevenção de Doenças (do inglês, Centers for Disease

Control and Prevention)

CSA – Sulfato de condroitina A

CTX – Cotrimoxazole

DDT - Diclorodifeniltricloroetano

EBA – Antigénio de ligação ao eritrócito

GPI – Glicosilfosfatidilinositol

HAART - Terapia antirretroviral altamente ativa (do inglês, highly active antiretroviral

therapy)

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês, Human Immunodeficiency Virus)

IL – Interleucina

INF-γ – Interferão gama

IPT – Tratamento preventivo intermitente (do inglês, intermittent preventive treatment)

IPTp – Tratamento preventivo intermitente na gravidez (do inglês, intermittent preventive

treatment in pregnancy)

IRS – Pulverização residual intra-domiciliária (do inglês, indoor residual spraying)

ITNs – Redes tratadas com inseticidas (do inglês, insecticide-treated bednet)

LIF – Fator inibidor de leucemia (do inglês, leukemia inhibitory factor)

MIP - Proteína inflamatória de macrófagos (do inglês, macrophage inflammatory protein)

MSP - Proteína da superfície do merozoito (do inglês, merozoite surface protein)

(NANP)5 – 5 repetições da sequência de aminoácidos da proteína circunsporozoíta

NRTIs - Inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleótidos (do inglês, nucleoside

reverse transcriptase inhibitors)



xv

NNRTIs - Inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleótidos (do inglês, non

-nucleoside reverse transcriptase inhibitors)

PCR – Reação em cadeia da polimerase (do inglês, polimerase chain reaction)

PIs – Inibidores de protease (do inglês, protease inhibitors)

RANTES – Ligando do receptor de quimiocinas 5 (do inglês, Regulated on activation,

normal T cell expressed and secreted)

RAP - Proteína associada a róptrias (do inglês, rhoptry associated protein)

RDTs – Testes de diagnóstico rápido (do inglês, rapid diagnostic tests)

SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida

SP – Sulfadoxina-pirimetamina

TDF - Tenofovir disoproxil fumarato

TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa

VSAs – Antigénios variantes de superfície (do inglês, variant surface antigens)

WHO – Organização Mundial de Saúde (do inglês, World Health Organization)


Catarina Alves Índice Geral

xvi

Índice Geral

Parte I……………………………………………………………………..……iii

Prefácio ................................................................................................................. v

Resumo ................................................................................................................. vi

Abstract ............................................................................................................... vii

Agradecimentos ................................................................................................. viii

Lista de Abreviaturas .......................................................................................... ix

Índice Geral ........................................................................................................ xvi

Índice de Figuras ............................................................................................... xx

Índice de Tabelas ............................................................................................. xxii

Parte II…………………………………………………………………………..1

Relatório de Estágio…………………………………………………………….3

1.Introdução ......................................................................................................... 3

2.Fase Pré-Analítica ............................................................................................ 5

2.1.Procedimentos de colheita ...................................................................... 6

2.2.Triagem ................................................................................................. 10

2.3.Conservação das amostras .................................................................... 11

Gestão de Resíduos ............................................................................................ 13

3.Bioquímica ...................................................................................................... 14

3.1.Equipamentos ....................................................................................... 14

3.2.Metabolismo dos hidratos de carbono .................................................. 19

3.3.Metabolismo dos lípidos ....................................................................... 22

3.4.Proteínas ............................................................................................... 26

3.5.Resposta inflamatória ........................................................................... 27

3.6.Função renal .......................................................................................... 28

3.7.Função hepática .................................................................................... 34



xvii

3.8.Função pancreática e gastrointestinal ................................................... 41

3.9.Função cardíaca .................................................................................... 43

3.10.Função tiroideia .................................................................................. 49

3.11.Fármacos ............................................................................................. 50

3.12.Aparelho reprodutor ............................................................................ 57

3.13.Metabolismo ósseo e mineral ............................................................. 60

3.14.Equilíbrio ácido-base .......................................................................... 64

3.15.Equilíbrio hidro-eletrolítico ................................................................ 66

3.16.Sistema nervoso central ...................................................................... 68

3.17.Controlo de Qualidade em Bioquímica Clínica .................................. 70

4.Microbiologia .................................................................................................. 72

4.1.Equipamentos ....................................................................................... 72

4.2.Bacteriologia ............................................................................................ 74

4.2.1.Exame direto ...................................................................................... 75

4.2.2.Exame cultural ................................................................................... 76

4.2.3.Geradores de atmosfera e caixas de incubação .................................. 79

4.2.4.Procedimentos para diagnóstico bacteriológico ................................ 80

4.2.5.Identificação de bactérias .................................................................. 94

4.2.6.Testes de suscetibilidade aos antibióticos ........................................ 104

4.3.Micologia ............................................................................................... 105

4.3.1.Meios de cultura .............................................................................. 106

4.3.2.Procedimentos para diagnóstico micológico ................................... 107

4.3.3.Identificação de fungos e leveduras ................................................. 109

4.4.Parasitologia .......................................................................................... 111

4.4.1Procedimentos para diagnóstico parasitológico ................................ 112

4.5.Virologia ................................................................................................ 115

4.5.1.Procedimentos para diagnóstico virológico ..................................... 116

4.6.Controlo de Qualidade em Microbiologia .......................................... 122

5.Genética ......................................................................................................... 124

5.1.Doenças Genéticas ................................................................................ 124

5.1.1Métodos ............................................................................................ 125



xviii

5.1.2.Análise e relatório ............................................................................ 130

5.1.3.Exemplo de aplicação ...................................................................... 130

5.2.Citogenética ........................................................................................... 131

5.2.1.Métodos ........................................................................................... 132

5.2.2.Exemplo de aplicação ...................................................................... 139

5.3.Hemato-oncologia - Biologia Molecular ............................................. 140

5.3.1.Leucemia Mielóide Crónica ............................................................ 140

5.3.2.Métodos ........................................................................................... 141

5.4.Tumores Sólidos .................................................................................... 145

5.4.1.Cancro do pulmão ............................................................................ 146

5.4.2.Métodos ........................................................................................... 149

5.5.Controlo de Qualidade em Genética ................................................... 150

6.Bibliografia ................................................................................................... 152

Parte III……………………………………………………………………….161

O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas

seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção

congénita……………………………………………………………………...163

Resumo …………………………………………………..……….……….….163

Abstract…………………………………………………..……….………..….164

Objetivos …………………………………………………..……….…...…….165

Material e Métodos……………………………………………..………….….166

1.Introdução…………………………………………………………….…….167

2.Epidemiologia da Coinfeção……………………………….……………….170

3. Interações entre Malária e HIV na Gravidez………………………………173

3.1.Impacto do HIV na malária durante a gravidez……..……………………..173

3.2.Impacto da malária maternal no HIV…………………..…………………..176

3.3.Efeito da malária na transmissão vertical do HIV……………………..…...178

4.Implicações da Coinfeção na Mãe e no Recém-nascido……………..…..…181

5.Importância do Diagnóstico….………….………………….……………....183

6.Tratamento……………………………………………………..…….……..186

6.1.Tratamento da malária na gravidez…………………………..……………186



xix

6.2.Tratamento do HIV na gravidez…………………...…….………….………187

6.3.Anemia…………………………………………………………..……………189

7.Prevenção…………………………………………………………………...191

7.1.Tratamento preventivo intermitente…………………..……………...……191

7.2.Profilaxia com cotrimoxazole………………………………………………..193

7.3.Controlo do vetor…………………………..……………………..………….193

7.4.Estratégias de prevenção………………………..…………………………...196

8.Interações entre Fármacos e Efeitos Adversos………………………...…...199

9.Conclusão……………………………………………………………….…..201

10.Bibliografia……………………………………...………………………...203

Parte IV………………………………………………………….………...….211

Conclusões e Perspetivas Futuras…………………………………….……..213


Catarina Alves Índice de Figuras

xx

Índice de Figuras

Parte II


Figura 1. GEM Premier 3000……………………………………………...…..……....14

Figura 2. Dimension® Integrated Chemistry System…………………………..…...….16

Figura 3. Clinitek Atlas® com manipulador de amostras tipo carrossel………….……17

Figura 4. Aparelho VIDAS®…………………………………………………..…...…..18

Figura 5. Equipamento VITEK®2………………………………………………......….72

Figura 6. Equipamento BacT/ALERT® 3D………………………………………..…...73

Figura 7. Equipamento GenomEra CDX™ system………………………………..…..74

Figura 8. Esquema da sementeira das urinas………………………………………..….79

Figura 9. Eletroferograma do exão 2 do gene HFE. A troca de uma citosina por uma

guanina na posição 187 do exão 2 (c.187C˃G), leva a troca do aminoácido histidina pelo

aspartato no codão 63 (H63D)…………………………………………………………131

Figura 10. Exemplo de cariograma do sexo feminino (46,XX) com bandeamento

Giemsa………………………………………………………………………………...133

Figura 11. (Esquerda) FISH de interfase com sonda para o BCR-ABL1, que mostra dois

sinais verdes e dois vermelhos numa célula normal. (Direita) FISH de interfase, em que

a sonda para o BCR-ABL1 mostra a fusão com sinal amarelo numa célula com Ph

positivo………………………………………………………………………………..139

Figura 12. Gel de agarose para pesquisa do transcrito de fusão BCR-ABL1. Os poços 1-

3 correspondem a um controlo, para verificar se o ADNc amplificou. Os dois primeiros

são controlos positivos e o terceiro é um controlo negativo, sem ADNc. Os poços 4 e 10

correspondem ao marcador de massas moleculares. Os poços 5- 9 pesquisam o p190 e

correspondem a duas amostras, dois controlos positivos para o p190 e um controlo

negativo, respetivamente. Os poços 11-15 pesquisam o p210 e correspondem a duas

amostras, dois controlos positivos para o p210 e um negativo, respetivamente. A amostra

no poço 12 é positiva para o transcrito mais comum

(p210)…………………………………………………………………………….……143


Catarina Alves Índice de Figuras

xxi

Parte III



Figura 1. Gametócito e trofozoítos de P. falciparum num esfregaço de sangue……..167

Figura 2. Mosquito do género Anopheles. ……………………………………………167

Figura 3. Imagem de microscopia eletrónica da libertação de novas partículas víricas de

HIV a partir de linfócitos humanos em cultura (in vitro). ………………..…………..168

Figura 4. Distribuição mundial da malária. Países endémicos em 2016 (azul), países

endémicos em 2000, não endémicos em 2016 (verde).……………………………….170

Figura 5. Prevalência mundial do HIV entre os 15-49 anos em 2016…………………171

Figura 6. Modelo hipotético da ação da malária na transmissão vertical do HIV……..180

Figura 7. Esfregaço de sangue de um indivíduo com malária. O exame microscópico

revela a presença de trofozoítos de Plasmodium falciparum (setas) que infetam alguns

dos glóbulos vermelhos intracelularmente…………………………………………….184

Figura 8. Teste rápido de diagnóstico da malária…………………………………….184

Figura 9. Proporção da população em risco protegida por IRS ou ITNs na África

subsariana. Dados entre 2010-2015……………………………………………………194

Figura 10. Suscetibilidade a inseticidas por vetores da malária reportada entre 2010-

2015. Resistências confirmadas (vermelho), possíveis resistências (amarelo),

suscetibilidade (vede)……………………………………………………………...….196

Figura 11. Uma enfermeira explica o uso de ITNs a mães locais numa área endémica de

malária………………………………………………………………………………...197


Catarina Alves Índice de Tabelas

xxii

Índice de Tabelas

Parte II


Tabela 1. Classes de resíduos, segundo o Despacho nº242/96…………………………13

Tabela 2. Parâmetros determinados no exame físico-químico da urina tipo II e respetivo

significado clínico………………………………………………………………………33

Tabela 3. Elementos avaliados no exame microscópico da urina tipo II e respetivo

significado clínico………………………………………………………………………34

Tabela 4. Conjunto de parâmetros que definem o estado ácido-base……………..……65

Tabela 5. Intervalos de referência dos parâmetros ácido-base……………………..…..66

Tabela 6(a). Calibração e Controlo de Qualidade Interno dos equipamentos usados na

Bioquímica……………………………………………………………………………...70

Tabela 6(b). Calibração e Controlo de Qualidade Interno dos equipamentos usados na

Bioquímica………………………………………………………………………….…..71

Tabela 7. Meios de cultura sólidos não seletivos……………………………………….76

Tabela 8(a). Meios de cultura sólidos seletivos……………………………………...…77

Tabela 8(b). Parte II - Meios de cultura sólidos seletivos………………………………78

Tabela 9. Meios líquidos de enriquecimento…………………………………………...78

Tabela 10. Tipos de atmosferas para cultura microbiológica…………………………..79

Tabela 11(a). Cartas VITEK e antibióticos testados…………………………………..104

Tabela 11(b). Cartas VITEK e antibióticos testados…………………………………..105

Tabela 12. Características dos meios de cultura usados na Micologia………………..107

Tabela 13. Localizações das micoses mais frequentes………………………………..109

Tabela 14. Parasitas possíveis de observação em amostras de fezes………………….113


Catarina Alves Índice de Tabelas

xxiii

Parte III



Tabela 1. Recomendações para o tratamento de malária……………………………..186

Tabela 2. Recomendações da WHO para o tratamento de HIV na gravidez…………..188

Tabela 3(a). Fases clínicas do HIV em adultos e adolescentes segundo a WHO.…….188

Tabela 3(b). Fases clínicas do HIV em adultos e adolescentes segundo a WHO.…….189

Parte II

Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

Catarina Rafaela Jacinto Alves

Orientado pela Doutora Isabel Moutinho e pela Doutora Teresa Porta Nova

Mestrado em Análises Clínicas

2017

IX Mestrado Análises Clínicas Parte II

Catarina Alves Introdução

3

1.Introdução

O estágio descrito neste relatório faz parte do plano de estudos do Mestrado em

Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e foi realizado

no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz em Lisboa para seguintes

valências: Pré-Analítica, Microbiologia e Bioquímica, orientado pela Dra. Isabel

Moutinho e no Laboratório GenoMed – Diagnósticos de Medicina Molecular, para a

valência de Genética, orientado pela Dra. Teresa Porta Nova.

A Luz Saúde foi criada em 2000 e é um dos maiores grupos de prestação de

cuidados de saúde no mercado português. O Grupo presta serviços através de várias

unidades de saúde, na qual se insere o Hospital da Luz Lisboa. Em 2006, a General Lab

Portugal iniciou o seu percurso de gestão de laboratórios hospitalares, sendo o primeiro

parceiro o Grupo Espírito Santo Saúde, através do outsourcing do Serviço de Patologia

Clínica do Hospital da Luz. Este serviço tem como missão diagnosticar de forma rápida

e eficaz, no respeito pela individualidade do doente, através de práticas de excelência e

inovação. (1)

A GenoMed é uma spin-off do Instituto de Medicina Molecular (iMM), localizado

na Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, no campus do Centro Hospitalar

Lisboa Norte, que realiza prestação de serviços na área da Medicina Molecular e além

disso, investigação e desenvolvimento. A prestação de serviços inclui ainda testes não

clínicos, como a investigação biológica de paternidade e estudos de ancestralidade e

genealogia. (2) O estágio decorreu nas duas unidades e em todas as áreas com a duração

de 22 dias úteis.

Ambos os laboratórios adotaram um Sistema de Gestão da Qualidade, no qual são

aplicados e cumpridos os requisitos da Norma 9001 da Organização Internacional de

Normalização (ISO, do inglês, International Organization for Standardization), Normas

para o Laboratório Clínico da Ordem dos Farmacêuticos e do Manual de Boas Práticas

Laboratoriais.

Neste relatório faço um resumo da experiência e conhecimento adquiridos nas

diversas áreas, ao longo de cerca de sete meses, 1080 horas, divididas da seguinte forma:

110 horas na Fase Pré-Analítica, 446 horas na Microbiologia, 348 horas na Bioquímica e

176 horas na Genética.



4

Os objetivos da realização do estágio passam por promover a integração no meio

profissional, aplicando os conhecimentos adquiridos ao longo do mestrado e desenvolver

capacidades como organização, trabalho em equipa e capacidade crítica. Este relatório

descreve a metodologia utilizada em cada área, o controlo de qualidade e os parâmetros

analisados, bem como o seu significado clínico e a identificação dos produtos biológicos

necessários à sua execução.


Catarina Alves Fase Pré-Analítica

5

2.Fase Pré-Analítica

A fase pré-analítica engloba as seguintes fases: pedido da análise pelo médico,

preparação do paciente, identificação do mesmo, colheita da amostra biológica, triagem,

armazenamento e transporte. É a fase mais importante do processo analítico, pois também

é aquela em que ocorrem mais erros. São fontes comuns de erro na fase pré-analítica as

prescrições ilegíveis, má preparação do utente, amostras inadequadas, erros na

identificação de utentes ou na introdução de dados e erros na colheita, transporte, triagem

e armazenamento das amostras. Devem ser estabelecidos pelo laboratório métodos

efetivos para monitorizar e controlar estas variáveis. (3)

Nesta valência aprendi a diferenciar e identificar os contentores a colher, para os

diferentes produtos biológicos, verificar e identificar os tubos a colher com os respetivos

códigos de barras antes da colheita, bem como conferir a prescrição médica com a

inscrição do utente e envio das amostras para a triagem.

Os resultados dos exames dependem de uma análise correta, que passa desde

início por uma correta identificação da amostra. As amostras devem ser identificadas nos

recipientes que as contêm e nunca na tampa. Deve também ser colocado o nome do utente,

nº do processo, nº tubo ou código de barras, o serviço, tipo de produto biológico e data e

hora da colheita. (3,4)

A preparação do doente permite minimizar os fatores biológicos controláveis que

possam variar os analitos, nomeadamente o jejum (não realizado altera os valores de

glicose, triglicéridos, colesterol), postura, exercício, variação circadiana e influência de

certos estimulantes como a cafeína, nicotina ou álcool. É importante fornecer informações

ao utente, quando aplicável, para que a colheita seja feita com conformidade e verificar,

aquando da colheita, se estas indicações foram cumpridas. Caso o utente entregue

produtos, é necessário verificar que estes foram bem colhidos (exemplo: urina de 24h) e

conservados. (3,4)

Deve ser questionado, ou adicionado ao processo, informação sobre terapêutica

antimicrobiana em curso ou administrada nos dias anteriores à colheita, medicação que

possa interferir em análises como anticoagulantes, o estado imunológico do doente

(transplantado, imunodeprimido), presença de material protésico, nomeadamente

catéteres e algálias e local anatómico da colheita. (3,4)



6

Indiscutivelmente, o transporte e conservação das amostras são de igual

importância. (3,4)

2.1.Procedimentos de colheita

2.1.1.Aparelho urogenital

Urina

A amostra ideal para realização da análise de urina tipo II é a primeira urina da

manhã, que deve ser realizada em jejum, de modo a poderem ser detetadas substâncias

que poderão não estar presentes numa amostra aleatória. A urina para diagnóstico

microbiológico não necessita de jejum. A colheita deve ser feita após limpeza da zona

(sem antisséticos), desprezar o primeiro jato e colher 10-20 ml para recipiente estéril.

Nunca colher urina de arrastadeiras, urinol ou saco de algália. No caso do doente

algaliado, o procedimento passa por clampar a algália durante 10-15 minutos, desinfetar

a zona a puncionar (borracha do tubo coletor) e colocar a urina aspirada com seringa num

recipiente estéril. Nas crianças é aplicado um saco coletor estéril, após lavagem da zona

com soro fisiológico. Caso após 30 minutos ainda não tiver urinado, troca-se o saco. De

seguida, transfere-se a urina para recipiente estéril. No caso das urinas a tempo

determinado, durante 24h fazer toda a urina para um frasco de 24h. Começar na segunda

urina da manhã e terminar na primeira urina do dia seguinte. O transporte deverá ser

imediato ou até 2h à temperatura ambiente (TA). Se não for possível, refrigerar 2-8ºC até

24h. (4)

Exsudado vaginal e cervical

Para a realização desta colheita, a mulher não deve estar menstruada e deve evitar

colocar cremes vaginais no dia e no dia anterior e não efetuar irrigações vaginais nas 24h

que precedem a colheita. Após introdução do espéculo, com a mulher em posição

ginecológica, deve colher-se o exsudado da mucosa vaginal com 3 zaragatoas. A primeira

zaragatoa é introduzida em meio de transporte com carvão. As outras duas, introduzidas

em tubos sem meio de transporte. O transporte deve ser imediato ou a TA até 2h. Nunca

refrigerar. No caso do exsudado cervical, são colhidas secreções no canal

endocervical, com 2 zaragatoas secas que se introduzem cerca de 1cm no canal cervical,

com movimentos rotativos. A primeira zaragatoa é introduzida em meio de transporte

com carvão. A segunda num tubo sem meio de transporte. O transporte deve ser imediato



7

ou a TA até 2h (até 6h no caso de pesquisa de Mycoplasma hominis e Ureaplasma

urealyticum). (4)

Exsudado uretral

A colheita deve ser feita idealmente antes da primeira micção. Se não for possível,

2-4h após a última micção. A uretra é pressionada de modo a estimular a descarga

purulenta e são introduzidas duas zaragatoas finas e flexíveis de alumínio na uretra. A

colheita do exsudado é realizada com movimentos rotativos. A primeira zaragatoa é

colocada em meio com carvão e a segunda colocada em tubo seco. O transporte deve ser

imediato ou a TA até 2h (até 6h no caso de pesquisa de Mycoplasma hominis e

Ureaplasma urealyticum). (4)

2.1.2.Aparelho circulatório

Hemoculturas

Para a colheita de hemoculturas, após desinfetar a rolha de borracha do frasco de

hemocultura e a pele no local da punção com álcool a 70% e solução iodada, colhe-se

sangue de uma veia proximal periférica e introduz-se o sangue nos frascos. Faz-se

inversão dos frascos para misturar o sangue com o meio de cultura. Para os recém-

nascidos (RN) e crianças colhe-se sangue para frasco de aerobiose. Nos adultos, uma

hemocultura corresponde à colheita de sangue, para inoculação de um par de frascos

aeróbio/anaeróbio. Devem ser colhidas duas a três hemoculturas em 24h, com intervalo

de 1h, de locais de punção diferentes. O transporte deve ser imediato. Se não for possível,

conservar a TA até 2h. Nunca refrigerar. (4)

Sangue por punção venosa

A colheita realizada mais frequentemente é a punção venosa. O uso de sistemas

baseados em tubo de extração a vácuo para colheita de sangue, tornam mais fácil a

colheita de múltiplas amostras com uma única punção venosa, para além de reduzirem o

risco de exposição direta ao sangue. (5)

Após identificação do utente, faz-se a preparação do material necessário à punção:

luvas, algodão, álcool etílico a 70%, garrote, tubos etiquetados e adaptador para colheita

por vácuo, seringa ou butterfly. Os tubos mais usados são os de tampa amarela

(bioquímica), que possui um gel ativador da coagulação e de onde se obtém soro; tampa



8

roxa (hematologia), tubo que contem anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético

(EDTA) para se obter sangue total; e tampa de cor azul (coagulação), com anticoagulante

(citrato de sódio). Dependendo das análises a efetuar, pode ser necessário que o paciente

esteja em jejum ou não.

O procedimento de colheita por punção venosa é o seguinte: após aplicação do

garrote, selecionar a veia a puncionar. Desinfetar com algodão embebido em álcool,

associar a agulha ao adaptador e fazer a punção, adicionando os tubos um a um ao

adaptador sendo que a ordem correta de colheita de sangue em vácuo é: tubo de

coagulação, seguido de tubo de bioquímica e por fim de EDTA. Homogeneizar os tubos.

Desgarrotar quando o sangue começa a fluir, tendo o cuidado de não deixar o garrote mais

do que 30 segundos. Retirar a agulha e descartar. Pedir ao utente que faça pressão sobre

o local da punção com algodão e aplicar um penso rápido. Os tubos são levados para a

sala de triagem logo de seguida. (4,5)

2.1.3.Aparelho digestivo

Fezes

Evitando o contacto com a urina, é transferida uma pequena porção de fezes para

recipiente esterilizado de boca larga limpo e seco. Colher três amostras em dias

consecutivos, se possível. O transporte deve ser imediato. Se não for possível, refrigerar

a 2-8ºC, até 2h para coprocultura ou até 72h para exame parasitológico ou pesquisa de

antigénios bacterianos, parasitários e virais nas fezes. Para pesquisa de toxina do

Clostridium difficille (apenas em fezes diarreicas), refrigerar no máximo até 24h. (4)

2.1.4.Aparelho respiratório

Exsudado nasal

A colheita de exsudado nasal é feita através da inserção de uma zaragatoa estéril

nas fossas nasais (pode ser seca ou humedecida com soro fisiológico), rodando contra a

mucosa nasal. Com a mesma zaragatoa, repetir para a outra narina. Colocar a zaragatoa

em meio de transporte. O transporte deve ser imediato. Se não for possível manter as

amostras a TA até 2h. (4)



9

Exsudado orofaríngeo

Deve pedir-se ao doente para respirar fundo com a boca aberta e passar a zaragatoa

nas áreas de exsudação, membranas ou locais de evidente inflamação e nas criptas

amigdalinas, evitando tocar nas paredes laterais da boca. Tocar e rodar a zaragatoa nas

amígdalas e na parte posterior da faringe, se não se observar pús ou inflamação. Colocar

a zaragatoa em tubo com meio de transporte. O transporte deve ser imediato. Se não for

possível manter as amostras a TA até 2h. (4)

Expetoração/ Secreções brônquicas/ Aspirado brônquico

A colheita de expetoração, secreções brônquicas e aspirado brônquico deve ser

realizada sob vigilância do médico, do terapeuta ou enfermeiro e deve ser,

preferivelmente, colhida a primeira amostra da manhã em jejum, após higiene da boca. É

importante que o utente saiba que a colheita é de expetoração profunda e não de saliva

(neste caso, a amostra é desprezada). Recolher a amostra para recipiente estéril, evitando

contacto com a superfície exterior. O transporte é imediato. Se não for possível, refrigerar

(2 a 8ºC) até 24h. (4)

2.1.5.Pele e tecidos

Exsudado purulento superficial e aspirados subcutâneos

É necessário referir o local da colheita. Primeiramente é feita a limpeza do local

com soro fisiológico estéril. Separam-se os bordos da lesão (usando luvas) e removem-se

os exsudados superficiais e/ou tecidos desvitalizados. Faz-se a colheita do material

purulento ou exsudado da profundidade da ferida por aspiração com agulha e seringa ou

colhe-se com zaragatoa previamente humedecida com soro fisiológico estéril e é colocada

em tubo com meio de transporte. O transporte é imediato. Se não for possível manter a

TA até 2h. (4)

Exsudados oculares e auriculares

Para o exsudado ocular, é introduzida uma zaragatoa ao longo da conjuntiva, na

parte interna da pálpebra inferior e colhido assim o exsudado da mucosa oral. É colhida

uma zaragatoa para cada olho e colocada em meio de transporte (no RN, zaragatoa com

carvão para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae). A colheita deve ser realizada antes da

aplicação de antibióticos, colírios, ou outros produtos. O exsudado auricular deve ser



10

colhido ao nível do canal auditivo externo com zaragatoa colocada em meio de transporte.

A amostra deve ser transportada de imediato, ou mantida a TA até 2h. (4)

Pele e tecidos adjacentes para exame micológico

É feita a limpeza do local com soro fisiológico estéril. São recolhidos pedaços de

unha que apresentem lesão, ou é feita raspagem das zonas internas da lesão e por baixo

do leito ungueal. No caso do cabelo, com pinça são arrancados vários cabelos e raspadas

escamas da periferia da lesão. Para a colheita de pele (escama cutânea): com um bisturi

raspar o bordo da lesão e recolher as escamas cutâneas. Passar por toda a zona lesada com

zaragatoa humedecida e enviar sem meio de transporte. A amostra é colocada em

contentor estéril, devidamente identificado, com indicação do produto e localização e

deve ser enviada até 24h a TA. (4)

Para pesquisa de dermatófitos, aquando da colheita é preenchido um inquérito que

questiona o utente sobre a sua etnia, local de lesão, se teve contacto com animais ou

pessoas com lesões semelhantes e se está a tomar terapêutica antifúngica.

2.2.Triagem

Na área da triagem, são recebidas as amostras vindas das diversas unidades de

saúde do hospital, bem como de outros laboratórios do grupo.

O laboratório possui um sistema informático, Appolo. Esta rede informática

engloba todas as áreas. Todas as amostras que entram no laboratório são identificadas

através de etiquetas de código de barras, coladas nos tubos /recipientes e posteriormente

registadas no sistema informático Appolo. É também realizado um registo em papel,

dando-se entrada dos produtos nas folhas de receção de amostras, bem como indicação

das amostras em falta e é conferido se o produto colhido corresponde às análises pedidas.

A triagem engloba a receção das amostras, o processamento e a distribuição pelas

diversas áreas analíticas. (3)

O processamento das amostras passa pela centrifugação dos tubos, quando

aplicável. Os tubos de bioquímica, para obtenção de soro, são centrifugados a 3600-

3800rpm, durante 7-10 minutos. O coágulo deve estar totalmente formado antes da

centrifugação, para prevenir o aparecimento de fibrina nas amostras de soro. O tempo de

coagulação pode aumentar devido a terapêutica trombolítica ou anticoagulante.



11

As urinas são centrifugadas a 1500 rpm, 5 minutos. Para as urinas de 24h insere-

se o volume no sistema e reparte-se para contentores mais pequenos que são depois

enviados para o laboratório central.

Dos produtos recolhidos na área das colheitas (externos) apenas são realizadas

análises a produtos marcados como “urgentes”, os outros são enviados para a central, bem

como produtos do internamento e da urgência que tenham pedidas análises que o

laboratório não realiza.

É também responsabilidade da triagem fazer a rejeição de amostras, caso se

verifique que não estão conformes, de acordo com o manual de colheitas. As amostras

hemolisadas, em que ocorre rutura da membrana dos eritrócitos que libertam o seu

conteúdo para o plasma, podem originar de colheita mal executada ou agitação brusca e

alteram alguns resultados analíticos, como o lactato desidrogenase ou o potássio,

resultando numa amostra não representativa do estado do paciente. Amostras com

formação de coágulo (rede de fibrina que captura os elementos celulares do sangue),

devido a má homogeneização ou colheita difícil, podem entupir os equipamentos e

interferir nos resultados analíticos. Os critérios de rejeição definidos pelo Laboratório de

Patologia Clínica são os seguintes: amostras mal identificadas ou não identificadas;

amostras sem prescrição em papel ou/ e informática; colheitas que não obedeçam às

condições referidas no manual de colheitas; amostras cujo contentor esteja danificado,

conspurcado ou a extravasar produto biológico; pedidos de anaeróbios de amostras que

estiveram em contacto com o oxigénio ou que foram transportados em recipiente sem

meio de transporte adequado; produtos entregues com seringa e agulha (retirar a agulha

e fechar a seringa). (4)

2.3.Conservação das amostras

As amostras de plasma e soro podem ser refrigeradas a uma temperatura entre 2 –

8 °C durante alguns dias. Para conservar durante um período de tempo superior, as

amostras podem ser congeladas a uma temperatura de -20 °C ou inferior (até -70ºC). É

de evitar a congelação e descongelação repetidas. O tempo de armazenamento ocorre pelo

menos até à impressão do boletim de análises completo.

As alíquotas de urinas tipo II são conservadas refrigeradas durante 24h a 2-8ºC.

No caso de urinas para pesquisa de drogas de abuso são congeladas durante dois meses,

se positivas, caso contrário, refrigeradas até 4 dias.



12

Relativamente ao líquido cefalorraquidiano (LCR) para exame bioquímico, as

amostras conservadas a 2-8ºC permanecem estáveis durante quatro dias. Após esse

tempo, o LCR é congelado até 2 meses, se existir quantidade suficiente.

Produtos para exame microbiológico, exceto LCR e hemoculturas, são guardados

até validação, refrigerados a 2-8ºC.

LCR e hemoculturas para exame microbiológico são guardados na estufa a 37ºC,

até validação.


Catarina Alves Gestão de Resíduos

13

Gestão de Resíduos

A classificação dos resíduos encontra-se na tabela 1, de acordo com o Despacho

nº242/96 de 5 de Julho. (6)

Tabela 1. Classes de resíduos, segundo o Despacho nº242/96. Adaptado de (6).

Classes de resíduos Descrição

Grupo I - Resíduos equiparados a urbanos Não têm exigências especiais, são

resíduos provenientes de serviços gerais.

Grupo II - Resíduos hospitalares não

perigosos

Material não contaminado e sem vestígios

de sangue ou reagentes.

Grupo III - Resíduos com risco biológico Resíduos contaminados ou em que há

suspeita de contaminação provenientes de

salas de colheitas e salas de trabalho:

algodões com sangue, luvas, meios de

cultura, entre outros.

Grupo IV - Resíduos com elevado risco

biológico

Resíduos constituídos por materiais

cortantes ou perfurantes provenientes das

salas de colheitas e salas de trabalho,

nomeadamente agulhas e vidros.

Os resíduos do grupo I e II são eliminados para sacos pretos e colocados em

contentores de lixo comum. Os resíduos do grupo III são eliminados em contentores

revestidos por sacos brancos. Duas vezes por dia, os sacos são fechados e colocados num

contentor de resíduos do grupo III, recolhidos por pessoal autorizado. Os resíduos do

grupo IV são colocados diretamente em contentores de plástico específicos para o efeito,

devidamente identificados. Quando o conteúdo do contentor chega ao nível assinalado,

este é fechado e colocado num contentor de resíduos do grupo IV, que será depois

recolhido por empresa certificada na gestão de resíduos.


Catarina Alves Bioquímica

14

3.Bioquímica

A Bioquímica Clínica é uma das várias secções pertencentes à fase analítica, que

permite a determinação de variados parâmetros no soro, plasma, urina ou outros líquidos

biológicos, através de técnicas químicas, imunológicas e cinéticas, contribuindo para o

diagnóstico e monitorização de processos patológicos. É importante referir que os

parâmetros referidos neste capítulo são apenas aqueles determinados no laboratório em

que o estágio foi realizado.

3.1.Equipamentos

3.1.1GEM Premier 3000 – Gasimetrias

Trata-se de um equipamento (figura 1) que mede uma variedade de parâmetros

em sangue total heparinizado. Mede potencial de hidrogénio (pH), pressão parcial de

dióxido de carbono (ρCO2), ião sódio (Na+), ião potássio (K+) e ião cálcio (Ca2+) usando

sensores potenciométricos. (7) Para além destes, mede uma série de outros parâmetros

derivados dos referidos anteriormente, como é o caso do ião bicarbonato (HCO3-).

Figura 1. GEM Premier 3000. Adaptado de (8)

Os métodos potenciométricos medem a força eletromotriz (fem) de células

galvânicas, em que o potencial de um dos componentes do par eletrolítico é tomado como

resposta às concentrações de espécies iónicas presentes em solução. As condições

analíticas são controladas para que a fem dependa apenas da espécie iónica em estudo.



15

Consiste num método eletroquímico em que é medida a diferença de potencial elétrico

entre dois elétrodos em condições estáticas (sem passagem de corrente). É feita a medição

do potencial de um elétrodo indicador, o de interesse (cátodo) em relação a um elétrodo

de referência (ânodo), através de um potenciómetro. (9)

Através de um elétrodo amperimétrico mede também pressão parcial de oxigénio

(ρO2), glucose e lactato. (7) A amperometria é uma técnica eletroquímica em que ambos

os elétrodos estão ligados a uma fonte de tensão externa. Esta corrente é aplicada ao

elétrodo de medição, que faz com que as moléculas do analito em estudo sejam atraídas

para esse elétrodo, dando origem a uma reação química. A corrente da célula

eletroquímica é medida e é proporcional à concentração de analito presente na amostra.

(9)

O aparelho tem cartuchos com todos os componentes necessários para operar, que

inclui sensores, soluções, bolsa de descarte e agulha de aspiração. Para além disto,

apresenta um sistema de Controlo de Qualidade inteligente (iQM™, do inglês, intelligent

Quality Management) de modo a garantir que produz resultados fiáveis sem necessidade

de intervenções pelo usuário. (7) O modo de funcionamento é muito simples: após leitura

do código de barras, a amostra é aspirada da seringa pelo aparelho e os resultados vão

automaticamente para o software.

3.1.2.Dimension® Integrated Chemistry System

O laboratório usa um sistema de diagnóstico in vitro (figura 1) que mede uma

variedade de analitos nos fluidos humanos. O aparelho usa um sistema de cartuchos de

reagentes para operar e é constituído por quatro módulos: espetrofotometria, módulo de

imunoensaio heterogéneo (HM) módulo QuickLyte® para testar eletrólitos e o módulo

de imunoensaios homogéneos de alta sensibilidade (LOCI®). Utiliza técnicas de

espetrofotometria, turbidimetria, imunoturbidimetria, quimioluminescência e tecnologia

multisensor seletiva de iões para aplicações químicas e imunoquímicas de uso clínico em

urina, plasma, soro e LCR. (10)



16

Figura 2. Dimension® Integrated Chemistry System. Adaptado de (11).

A espetrofotometria é definida como uma medida da intensidade da luz a um

determinado comprimento de onda e baseia-se na capacidade de absorção da radiação. As

reações enzimáticas, de oxidação-redução ou colorimétricas, que provoquem uma

alteração na absorvância podem ser detetadas por espetrofotometria. (9)

Os imunoensaios baseiam-se na reação entre um antigénio e um anticorpo

específico para esse antigénio. O módulo HM realiza imunoensaios enzimáticos,

baseados no princípio de sandwich. LOCI® é um módulo automatizado de imunoensaios

associado à tecnologia quimioluminescente. (10)

A turbidimetria mede a luz dispersa, em que o aumento da turvação, causada pela

presença de partículas em suspensão, causa uma alteração na intensidade da radiação

incidente. Assim, a concentração do analito presente na amostra em estudo é tanto maior

quanto menor for a quantidade de luz medida. Pode ser utilizada associada a uma reação

de imunoprecipitação (imunoturbidimetria), medindo a quantidade de luz que consegue

atravessar a amostra na presença de imunocomplexos. (9)

As medições dos eletrólitos utilizam a Tecnologia do Multisensor Integrado (IMT, do

inglês, Integrated Multisensor Technology) de deteção indireta das amostras -

QuikLYTE® - para desenvolver um potencial elétrico proporcional à atividade de cada

ião específico presente na amostra. Os elétrodos estão incorporados no QuikLYTE®

Integrated Multisensor e são seletivos para os iões de sódio, potássio e cloreto. No

multisensor, é também incorporado um elétrodo de referência. Depois de uma amostra

ser posicionada no sensor, os iões estabelecem um equilíbrio com a superfície do elétrodo.

É gerado um potencial que é proporcional ao logaritmo da atividade da substância a

analisar na amostra. O potencial elétrico gerado numa amostra é comparado com o



17

potencial elétrico gerado numa solução padrão e é calculada a concentração dos iões

pretendidos. (12)

O sistema alerta para os índices de hemólise (pode ocorrer elevação de alguns

resultados analíticos como o potássio, magnésio, lactato desidrogenase e podem ocorrer

interferências analíticas devido à cor da hemoglobina), icterícia (tonalidade amarelada do

soro ou plasma devido à bilirrubina, que pode levar à alteração de alguns resultados

analíticos) e lipémia (leva à turvação do soro e pode interferir nas técnicas analíticas como

a turbidimetria).

As amostras são colocadas no suporte e o equipamento lê o código de barras e

processa os testes de modo aleatório. Não é necessário pré-tratamento de reagentes ou da

amostra. Os resultados são impressos automaticamente pela impressora acoplada ao

aparelho e também enviadas para o sistema de validação do laboratório.

3.1.3.Clinitek Atlas®

O equipamento Clinitek Atlas® (figura 3) é um espetrofotómetro de dispersão que

mede a luz refletida para realizar análise química e física da urina. Cada embalagem de

reagente contem um rolo de tiras de reagente com zonas reativas independentes,

impregnadas com substâncias químicas, que analisam os seguintes parâmetros: glicose,

bilirrubina, cetona (ácido acetilacético), sangue oculto, pH, proteínas, urobilinogénio,

leucócitos e nitritos. O equipamento analisa por espetrofotometria de refletância, a

comprimentos definidos, a cor e intensidade da luz refletida por uma zona reativa após a

reação. (13)

Figura 3. Clinitek Atlas® com manipulador de amostras tipo carrossel. Adaptado de (14).



18

A determinação da gravidade específica da amostra faz-se através do método do

índice de refração, em que é determinado o grau de desvio de um feixe de luz que

atravessa a solução (índice de refração), proporcional à concentração dos solutos da

amostra. A clareza é determinada através da medição da transmissão e dispersão da luz

que passa através da amostra. (13)

O scanner de código de barras lê as etiquetas e cada uma é lida no momento em

que a amostra no tubo é analisada.

3.1.4.VIDAS®

É um imunoanalisador automático (figura 4) composto por um módulo analítico

com cinco secções e com seis posições em cada uma, que permite a realização de diversos

testes e parâmetros em simultâneo.

Figura 4. Aparelho VIDAS®. Adaptado de (15).

Funciona da seguinte forma: após identificação do doente através da leitura do

código de barras, é inserido na posição da secção escolhida, o cone (fase sólida da reação,

sensibilizado com antigénios ou anticorpos) e a barrete de reagente, ao qual se adiciona o

soro a testar.

A tecnologia utilizada, que é adaptável a uma ampla gama de ensaios, combina

o método ensaio imunoenzimático (EIA, do inglês, enzyme immunoassay) com uma

leitura final de fluorescência: tecnologia conhecida como ELFA (do inglês, enzyme linked

fluorescent assay). Inicialmente, os anticorpos/antigénios presentes no soro ligam-se aos

anticorpos/antigénios fixados no cone. Após uma etapa de lavagem, o conjugado fixa-se

aos anticorpos/antigénios específicos presentes no cone, seguido de outra etapa de

lavagem que elimina o conjugado não fixado. Na etapa final, a enzima do conjugado



19

catalisa a reação de hidrólise de um substrato, resultando na emissão de fluorescência,

proporcional à quantidade analito presente na amostra. (16)

3.2.Metabolismo dos hidratos de carbono

Glicose

A fonte principal de energia do organismo, glicose, é originada através do

metabolismo dos glícidos. Nas células, a glicose é metabolizada para produzir trifosfato

de adenosina (ATP) e fornecer intermediários metabólicos que são necessários em vários

processos biossintéticos. Vários sistemas no organismo permitem que independentemente

da quantidade de glicose ingerida, a concentração se mantenha constante, não existindo

situações de carência ou excesso não compatíveis com a vida. No entanto, situações de

desequilíbrio ocorrem quando estes mecanismos falham. A patologia mais preocupante

originada do metabolismo dos hidratos de carbono é a diabetes mellitus, sendo a glicémia

o parâmetro fundamental do diagnóstico e monitorização. Esta doença metabólica causa

hiperglicemia, poliúria, polidipsia e polifagia e pode dar origem a complicações como

nefropatia e neuropatia. Outro desequilíbrio na concentração de glicose pode originar

hipoglicémia, caracterizada por baixas concentrações sanguíneas de glicose. (17)

A concentração de glicose no sangue varia entre limites estreitos e depende de

vários fatores, nomeadamente o estado físico, jejum, medicação. A glicose é filtrada pelos

glomérulos e quase totalmente reabsorvida pelos túbulos renais. Quando a sua

concentração atinge o limiar renal, aparece na urina. A glicosúria é também um parâmetro

importante, na medida em que em condições fisiológicas normais, a glicose não é

excretada na urina. (17)

Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System

Amostra: soro, plasma, urina e LCR.

Interferentes: a amostra hemolisada pode diminuir o resultado. Por outro lado, a lipémia

e bilirrubina não conjugada podem aumentar o resultado. Alguns medicamentos também

podem alterar o valor de glicose. A glicólise diminui os níveis séricos de glicose entre 5

a 7% por hora em sangue normal coagulado não centrifugado, à temperatura ambiente.

(18)

Método: ensaio enzimático



20

A determinação é realizada através do método da hexoquinase (HK). A

absorvância devida à forma reduzida de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), que

é proporcional à quantidade de glicose na amostra, é determinada utilizando uma técnica

bicromática de ponto final (340 e 383nm). (18)

HK

Glicose + ATP → Glicose-6-fosfato + ADP

Mg2+

Glicose-6-fosfato desidrogenase

Glicose-6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogliconato + NADH + H+

Legenda: hexoquinase (HK); trifosfato de adenosina (ATP); difosfato de adenosina

(ADP); ião magnésio (Mg2+); nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+); nicotinamida

adenina dinucleótido reduzido (NADH); ião hidrogénio (H+)

Valores de referência:

Soro: 74 – 106 mg/dL

LCR: 40 – 70 mg/dL

Urina, aleatória: 1 – 15 mg/dL

Valores críticos: valores de glicémia em idade superior a um ano ≤55 mg/dL ou ≥500

mg/dL ou em idade inferior a um ano ≤30mg/dL ou ≥200 mg/dL e um valor de < 40

mg/dlL no LCR, são comunicados de imediato ao médico.

A Associação Americana de Diabetes (ADA, do inglês, American Diabetes

Association) recomenda os seguintes critérios para o diagnóstico de diabetes: (19)

1. Sintomas de diabetes e glicose aleatória ≥ 200 mg/dL

OU

2. Glicose em jejum ≥ 126 mg/dL

3. Valores de prova de tolerância à glicose oral (PTGO) às 2h ≥ 200 mg/dL

Um parâmetro positivo não é suficiente, sendo necessário repetição do mesmo

para confirmação. Indivíduos que apresentem valores de glicose aumentados, mas não



21

superior ao valor de referência são incluídos noutra categoria que apresenta risco elevado

para diabetes e doenças cardiovasculares futuras, segundo a norma da DGS (Direção-

Geral da Saúde) (20):

a) Anomalia da Glicemia de Jejum (AGJ): glicemia de jejum ≥ 110 e < 126 mg/dl

b) Tolerância Diminuída à Glicose (TDG): glicémia às 2 horas na PTGO ≥ 140 e <

200 mg/dl.

A glicose também pode ser determinada em sangue arterial (sangue total

heparinizado) no equipamento GEM Premier 3000, com os seguintes valores de

referência: 60 – 95 mg/dL (7)

PTGO

A prova de tolerância à glicose oral avalia a clearance da glucose em circulação

após uma sobrecarga (administração oral de glucose) de 75gr de glucose anidra. A

medição de glicose é realizada às 0h, 1h e 2h após ingestão. É realizada para deteção de

diabetes mellitus gestacional (DMG) e para detetar a tolerância diminuída à glicose.

Apesar de ser mais sensível que a determinação da glicose em jejum, a prova é afetada

por vários fatores que resulta em pobre reprodutibilidade do teste. A prova deve ser

realizada novamente para confirmação de resultados anormais. (17)

Segundo a norma da DGS esta prova deve ser realizada a todas as grávidas,

excluindo aquelas a quem tenha sido previamente diagnosticada DMG ou provável

diabetes prévia. (21)

O diagnóstico de DMG faz-se quando um ou mais valores forem iguais ou

superiores aos valores de referência:

• Em jejum (mínimo 8h, máximo 14h) ≥92 mg/dL

• Na primeira hora ≥180 mg/dL

• Na segunda hora ≥153 mg/dL

A prova deve ser feita sem dieta restritiva, com atividade física regular nos três

dias anteriores e durante a prova, o paciente deve manter-se em repouso.



22

Lactato

O lactato, um intermediário no metabolismo dos hidratos de carbono, existe no

músculo esquelético, cérebro e eritrócitos. Cerca de 30% do lactato formado é utilizado

no fígado, principalmente para a produção da glicose, através da gliconeogénese. (7,17)

Privação severa de oxigénio nos tecidos devido a choque, descompensação

cardíaca, problemas hematológicos e insuficiência pulmonar, problemas hepáticos, entre

outras condições clínicas, leva a acidose láctica, associada com um aumento significativo

do lactato no sangue. (7)

Equipamento: GEM Premier 3000

Amostra: sangue arterial heparinizado

Método: amperometria

Valores de referência: 5 – 20 mg/dL

3.3.Metabolismo dos lípidos

Colesterol total

Cerca de 90% do colesterol endógeno é sintetizado no fígado e intestino e as

células e órgãos necessitam deste colesterol que lhes chega através das lipoproteínas.

Após a sua síntese, o colesterol é transportado no sangue, 2/3 sob a forma de éster e 1/3

na forma livre, pelas lipoproteínas. A sua determinação é muito importante, na medida

em que o colesterol total (livre e esterificado) está associado ao desenvolvimento de

doenças cardiovasculares, uma das principais causas de morte, através da sua deposição

nas paredes do endotélio vascular, formando placas de ateroma que podem originar um

enfarte agudo do miocárdio (EAM). (9)


Amostra: soro, plasma

Interferentes: oxalato de potássio, fluoreto de sódio e heparina de lítio podem diminuir os

resultados de colesterol total, bem como bilirrubina conjugada e não conjugada e uma

amostra hemolisada. (22)




23

O produto final da reação é um cromóforo que absorve a 540nm, cuja

concentração é proporcional à concentração de colesterol total. (22)

CE

Ésteres de colesterol → Colesterol + Ácidos gordos

CO

Colesterol + O2

→ Colest-4-eno-3-ona + H2O2

HPO

2 H2O2 + DEA-HCI/AAP → 4 H2O + DEA-HCI/AAP oxidada

Legenda: esterase do colesterol (CE); oxidase do colesterol (CO); oxigénio(O2); peróxido

de hidrogénio (H2O2); peroxidase de rábano silvestre (HPO); N,N-dietilanilina-HCl/4-

aminoantipirina (DEA-HCl/AAP); oxigénio (O2); peróxido de hidrogénio (H2O2); água

(H2O)


Segundo o Painel de Tratamento de Adultos III do Programa Nacional de Educação sobre

o Colesterol (NCEP – ATP III, do inglês, National Cholesterol Education Program Adult

Treatment Panel III) (22,23):

• Desejável <200 mg/dL

• Acima da média 200 – 239 mg/dL

• Elevado ≥240 mg/dL

Triglicéridos

São os ésteres do glicerol mais prevalentes da dieta e encontrados em

predominância no plasma. São hidrolisados a glicerol e ácidos gordos pelas lípases e

após absorção, são ressintetizados ao combinar-se com o colesterol e apolipoproteína B48

para formar as quilomicras. (9)

As medições obtidas são utilizadas no diagnóstico e tratamento de distúrbios

cardiovasculares, endócrinos, doenças do metabolismo dos lípidos, doentes com nefrose,

obstrução hepática. (24)



24


Amostra: soro, plasma

Interferentes: devido à lipólise natural, podem existir pequenas quantidades de glicerol

livre em amostras de sangue. O glicerol livre pode também sofrer aumentos devido a

stress ou doença. Uma amostra hemolisada e bilirrubina não conjugada aumentam o valor

dos triglicéridos. (24)


A concentração do produto final da reação, quinoneimina é proporcional à

quantidade de glicerol e percursores, e é medida através de medições de absorvância

utilizando uma técnica bicromática de ponto final (510, 700nm). (24)

LPL

Triglicéridos → Glicerol + Ácidos gordos

GK

Glicerol + ATP

→ Glicerol-3-fosfato + ADP

GPO

Glicerol-3-fosfato + O2 → Fosfato de Di-hidroxiacetona + H2O2

POD

2H2O2 + Aminoantipirina + 4-Clorofenol → Quinoneimina + HCl + 4H2O

Legenda: lipoproteína lípase (LPL); glicerol quinase (GK); trifosfato de adenosina (ATP);

difosfato de adenosina (ADP); glicerol-3-fosfato-oxidase (GPO); oxigénio (O2); peróxido

de hidrogénio (H2O2); peroxidase (POD); ácido clorídrico (HCl); água (H2O);


Quatro categorias foram estabelecidas pelo NCEP – ATP III (23,24):

• Normal < 150 mg/dL

• Acima da linha limite 150 – 199 mg/dL

• Elevada 200 – 499 mg/dL

• Muito alta ≥ 500 mg/dL



25

Colesterol ligado a lipoproteínas de alta densidade

O papel do processo do transporte inverso do colesterol, mediado pelas

lipoproteínas de alta densidade (HDL, do inglês, high density lipoprotein) é remover

colesterol em excesso de células e tecidos periféricos e transportá-lo para o fígado, onde

é metabolizado. Deste modo, as HDL assistem na homeostase do colesterol, pelo que os

doentes com baixos níveis desta lipoproteína, apresentam risco aumentado de doença

cardiovascular. (9,25)

A determinação do colesterol ligado a HDL pode ser usada como ajuda no

diagnóstico de patologias hepáticas, renais e na avaliação do risco de aterosclerose e

doença cardiovascular. (25)


Amostra: soro, plasma (heparina de lítio ou sódio)

Interferentes: situações de função hepática anormal podem afetar o metabolismo lipídico

pelo que o resultado do colesterol ligado a HDL pode ser significativamente diferente.

(25)


O produto final colorido é medido utilizando uma técnica bicromática de ponto

final (600/700nm) e as suas medições são diretamente proporcionais à concentração

sérica de colesterol ligado a HDL. (25)

Sulfato de dextrano, Sulfato de magnésio

HDL, LDL,VLDL, Quilomicra → LDL não reativa, VLDL, Quilomicra

+ Ésteres de Colesterol HDL

PEG – colesterol esterase

Ésteres de colesterol HDL + H2O → Colesterol HDL + Ácido Carboxílico

PEG – colesterol oxidase

Colesterol HDL + O2 → ∆4 Colestenona + H2O2

Peroxidase

2 H2O2 + 4-aminoantipirina + HSDA → Desenvolvimento de cor + 5 H2O

+ H+ + H2O



26

Legenda: lipoproteínas de alta densidade (HDL); lipoproteínas de baixa densidade (LDL);

lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL); polietileno glicol (PEG); água (H2O);

oxigénio (O2); peróxido de hidrogénio (H2O2); N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3.5-

dimetoxianilina sódica (HSDA); ião hidrogénio (H+)


O NCEP-ATP III fornece as seguintes classificações das concentrações de

colesterol ligado a HDL (23,25):

• Colesterol ligado a HDL < 40 mg/dL - Colesterol ligado às HDL baixo

• Colesterol ligado a HDL≥ 60 mg/dL - Colesterol ligado às HDL alto

3.4.Proteínas

Proteína Total

Parâmetro analítico que avalia no seu conjunto as proteínas do soro ou plasma. As

medições de proteína total são utilizadas no diagnóstico e tratamento de uma variedade

de doenças que envolvem o fígado, o rim ou a medula óssea, assim como perturbações

metabólicas ou nutricionais. (26)


Amostra: soro, plasma heparinizado

Interferentes: dextrano, imunoglobulina G e hemólise da amostra, podem aumentar o

resultado da proteína total. A bilirrubina não conjugada pode diminuir o resultado e a

lipémia pode também interferir. (26)

Método: ensaio cinético

O sistema usa o método do biureto. O complexo proteico de cobre (II) azul

formado é proporcional à concentração de proteína total na amostra, medido com uma

técnica bicromática de ponto final (540, 700nm). (26)

Hidroxilo (OH-)

Ião cobre (Cu++) + Complexo → proteína (absorve a 540 nm)

Valores de referência: 6.4 – 8.2 g/dL no soro.



27

Um intervalo de referência para o plasma seria 0.3 g/dL superior devido à presença

de fibrinogénio no plasma. (26)

3.5.Resposta inflamatória

Proteína C reativa

A proteína C reativa é uma proteína de fase aguda sintetizada no fígado. Durante

uma infeção grave, a síntese hepática de proteínas é alterada e a síntese desta proteína é

aumentada, sendo útil a sua determinação para deteção de infeções e distúrbios

inflamatórios. Apesar da sua função ser incerta, sabe-se que desempenha um papel na

inflamação tecidual. (27)

As concentrações de proteína C reativa no plasma aumentam bastante após afeção

do miocárdio, stress, trauma, infeção, inflamação, cirurgia ou proliferação neoplásica. O

aumento ocorre após 6-12 horas do início destas patologias e a concentração pode chegar

a 2000 vezes o valor normal. (9)


Amostra: soro e plasma (heparina de lítio)

Interferentes: não utilizar plasma com EDTA. Anticorpos heterofílicos em amostras de

doentes, podem reagir nos imunoensaios e produzir resultados falsos. Hemoglobina e

bilirrubina não conjugada podem aumentar os resultados. A lipémia também pode

influenciar os resultados. (28)

Método: imunoensaio turbidimétrico

Na presença de proteína C na amostra, partículas revestidas com anticorpos contra

esta proteína agregam-se e ocorre um aumento de turvação, que é medido e proporcional

à concentração de proteína C reativa. (28)

Proteína C + AbPR → Agregado (absorve a 340 nm)

Legenda: partículas revestidas com anticorpos contra a proteína C reactiva (AbPR)

Valores de referência: aproximadamente 0.3 mg/dL. (28)



28

3.6.Função renal

Creatinina

A creatinina é sintetizada endogenamente nos rins, fígado e pâncreas e libertada

nos fluidos corporais a um ritmo constante. A sua concentração no plasma é mantida entre

limites estreitos predominantemente pela filtração glomerular. Não é reabsorvida pelos

túbulos renais, e apenas uma pequena quantidade é secretada pelos túbulos. As medições

de creatinina no plasma e a sua clearance renal são usadas como indicadores de

diagnóstico da função renal e de patologias como glomerulonefrite aguda, insuficiência

renal aguda, insuficiência renal crónica, falência renal e obstrução renal em que ocorre

diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG). (9)

A TFG é um índice da função renal, que avalia a filtração dos rins, e que pode ser

determinada através da clearance da creatinina. (29)

Clearance (mL/min) = Creatinina Urinária (mg/L)

Creatinina Plasmática (mg/L) × diurese (mL/min)


Amostra: soro, plasma (heparina de lítio) e urina

Interferentes: no soro e plasma as substâncias que podem interferir com os resultados são

as seguintes: acetona, bilirrubina não conjugada, cefalotina, glicose, lipémia, piruvato,

triglicéridos. Na urina, ácido ascórbico. (29)


O método da creatinina usa uma modificação da reação cinética de Jaffe. O

aumento da absorvância devido à formação do cromóforo a 510nm, medida utilizando

uma técnica cinética bicromática (510, 600nm) é diretamente proporcional à

concentração de creatinina na amostra. (29)

NaOH

Creatinina + Picrato → Cromóforo vermelho (absorve a 510 nm)

Legenda: hidróxido de sódio (NaOH)



29


Soro e plasma:

Homens: 0.70 – 1.30 mg/dL

Mulheres: 0.55 – 1.02 mg/dL

Urina:

Homens: 0.95 – 2.49 g/24 h

Mulheres: 0.60 – 1.80 g/24 h

Ácido úrico

No humano, o ácido úrico é o maior produto do catabolismo das purinas,

adenosina e guanosina. É formado endogenamente e também consumido na dieta. O

tratamento renal do ácido úrico envolve quatro passos: filtração glomerular, reabsorção

no túbulo proximal, secreção no lúmen e reabsorção no túbulo distal. A excreção renal

de ácido úrico é cerca de 6 a 12% da quantidade filtrada. Esta determinação é útil no

diagnóstico de gota e patologias renais. No entanto, esta utilidade é diminuída devido à

existência de fatores não renais que influenciam a concentração plasmática de ácido úrico.

(9)


Amostra: soro, plasma e urina

Interferentes: as colheitas de urina de 24 horas devem ser efetuadas em recipientes com

hidróxido de sódio (para evitar a precipitação de urato). A xantina diminui o resultado,

bem como o formaldeído (formalina). A lipémia também interfere no resultado (30)


O método do ácido úrico usa uma modificação do método da uricase. O

desaparecimento de ácido úrico leva a uma alteração de absorvância, medida utilizando

uma técnica cinética bicromática (293, 700nm). (30)

Uricase

Ácido úrico + 2H2O + O2

→ Alantoína + H2O2 + CO2

(absorve a 293 nm) (não absorvente a 293 nm)



30

Legenda: água (H2O); oxigénio (O2); peróxido de hidrogénio (H2O2); dióxido de carbono

(CO2)


Soro:

Mulher 2.6 – 6.0 mg/dL

Homem 3.5 – 7.2 mg/dL

Urina

150 – 990 mg/24h

Azoto ureico

A ureia constitui o principal produto metabólico com azoto resultante do

catabolismo das proteínas nos humanos. Mais de 90% da ureia é excretada pelos rins. Ela

não é reabsorvida nem excretada pelos túbulos, mas é filtrada livremente pelo glomérulo.

A doença renal está associada com acumulação de ureia no sangue. Um aumento na

concentração de ureia no plasma, acompanhado de falência renal, caracteriza o estado

azotémico (urémico), que poderá ter origem pré-renal, renal ou pós-renal. (9)

A determinação do azoto ureico, em conjunto com a determinação de creatinina

em soro ou plasma, ajuda na discriminação entre a azotémia pré-renal e pós-renal. (31)



Interferentes: este método reage quantitativamente com iões de amónio. (31)


O desaparecimento de NADH na reação, leva a uma alteração de absorvância,

proporcional à concentração do analito, medida utilizando uma técnica cinética

bicromática (340, 383nm). (31)

Urease

Ureia + H2O

→ 2NH3 + CO2

GLDH

NH3 + α-KG + NADH → L-glutamato + NAD



31

Legenda: água (H2O); amoníaco (NH3); dióxido de carbono (CO2); α- cetoglutarato (α-

KG); glutamato desidrogenase (GLDH); nicotinamida adenina dinucleótido reduzido

(NADH); nicotinamida adenina dinucleótido (NAD)


Soro: 7 – 18 mg/dL

Urina: 7 – 20 g/24hr

Proteína urinária

A determinação quantitativa do conteúdo proteico na urina é utilizada no

diagnóstico e tratamento de doenças renais. Proteinúria é definida como a presença

excessiva de proteínas na urina, que pode ocorrer tanto nos vários tipos de doença renal,

como após exercício intenso ou desidratação. Proteinúria ocorre com permeabilidade

glomerular aumentada (proteinúria glomerular), em que a proteína urinária é

maioritariamente a albumina e reabsorção tubular defeituosa (proteinúria tubular), em que

as proteínas urinarias são maioritariamente proteínas de baixo peso molecular. Pode

também ocorrer, menos comumente, concentração aumentada no plasma de alguma

proteína anormal de baixo peso molecular ou secreção anormal de proteína no trato

urinário (proteinúria pós-renal). (9)


Amostra: urina

Interferentes: as amostras que contêm amicacina, gentamicina, canamicina e tobramicina

provocam um falso aumento dos resultados. (32)


É utilizada uma adaptação do método do vermelho de pirogalol-molibdato. A

absorvância a 600nm do complexo formado é diretamente proporcional à concentração

de proteína na amostra. (32)

PR-MO + proteína → complexo PR-MO-proteína

(absorve a 600nm)

Legenda: vermelho de pirogalol-molibdato (PR-MO)



32

Valores de referência: < 11.9 mg/dL, < 149.1 mg/dia

Exame sumário da urina

Este exame é indispensável na avaliação da função renal global. A amostra usada

deve ser a primeira urina da manhã e deve ser analisada até 2h após colheita, caso

contrário deverá ser refrigerada. Em alternativa poderá ser usada uma amostra colhida

aleatoriamente, com retenção urinária de pelo menos 4h, para evitar falsos resultados

diminuídos.

O exame à urina é o primeiro passo a realizar na suspeita de deterioração da função

renal. No laboratório, a urina é examinada visual, química e microscopicamente. A

aparência da urina pode ajudar nalgumas determinações, nomeadamente a turvação, que

poderá ser de origem patológica ou não. (9)

A avaliação química e física é semi-quantitativa, está automatizada e é realizada

no equipamento Clinitek Atlas®. A observação do sedimento urinário é realizada ao

microscópio, para visualização dos elementos figurados e avaliação semi-quantitativa.

Exame Físico-Químico

Equipamento: Clinitek Atlas®

Cada embalagem de reagente contem um rolo de tiras de reagente que analisam

os seguintes parâmetros: glicose, bilirrubina, cetona (ácido acetilacético), sangue oculto,

pH, proteínas, urobilinogénio, leucócitos e nitritos. O significado clínico dos respetivos

parâmetros encontra-se na tabela 2. Também são feitas as determinações da gravidade

específica e clareza da amostra. O aparelho apresenta os resultados de forma semi-

quantitativa. (13)



33

Tabela 2. Parâmetros determinados no exame físico-químico da urina tipo II e respetivo

significado clínico. Adaptado de (9).

Parâmetro Significado clínico

Glicose Glicosúria – poderá significar diabetes mellitus ou doença

renal.

Bilirrubina Presença de bilirrubina conjugada na urina que não existe em

condições normais. Pode ocorrer devido a elevados níveis de

bilirrubina na circulação sistémica que são excretados,

problemas hepáticos.

Cetona São produtos do catabolismo lipídico. A presença de corpos

cetónicos pode indicar diabetes descontrolada (cetoacidose),

jejum prolongado.

Sangue oculto Resultado positivo poderá ser devido à presença de glóbulos

vermelhos, hemoglobina ou mioglobina. Alterações a nível

renal, urinário, contaminação menstrual.

pH O pH varia consoante a dieta e fármacos. Um valor normal

situa-se entre os 5,5 e 6,0. Uma alteração pode significar

infeção do trato-urinário, dietas ricas em proteínas ou

vegetarianas, medicação.

Proteínas Importante na avaliação da função de filtração glomerular. A

presença de proteínas na urina poderá ser indicativo de lesão

renal ou outras patologias. A urina poderá apresentar-se

espumosa.

Urobilinogénio Produto de excreção avaliado com a bilirrubina, sendo um

produto resultante dos processos de redução da bilirrubina.

Valores elevados (>1,0mg/dL) poderão indicar doença

hepática.

Leucócitos Maioritariamente associado a infeção do trato urinário.

Nitritos Resultado positivo indica possível infeção por bactérias

redutoras de nitratos.

Gravidade específica Medida das substâncias químicas dissolvidas na urina,

dependente do poder de excreção e concentração dos rins. As

amostras aleatórias apresentam valores entre 1,015 – 1,025

dependendo do grau de hidratação.

Clareza A urina não patológica é clara. Urina turva indica presença de

material celular excessivo ou pode ser devida a medicação ou

alimentação.

Exame microscópico do sedimento

O exame microscópico do sedimento só é efetuado quando o seu resultado permite

acrescentar valor clínico face à idade (exemplo: crianças) e à história clínica do doente,

ou para confirmação, quando algum parâmetro do exame físico-químico está alterado.

Permite identificar e caraterizar os elementos figurados clinicamente

significativos: células epiteliais, leucócitos, eritrócitos, cilindros, cristais. O seu

significado clínico encontra-se descrito na tabela 3. É também avaliada a presença de



34

bactérias e elementos leveduriformes. A bacteriúria pode surgir devido a contaminação

fecal, vaginal e uretral ou devido a problemas patológicos como infeções urinárias. Como

alguns parâmetros não apresentam significado clínico e outros são considerados normais

a não ser que estejam presentes em quantidades elevadas, é realizada uma semi-

quantificação de acordo com a seguinte escala: raros (0-5 elementos); alguns (5-10

elementos); muitos (>10 elementos).

A observação semi-quantitativa é realizada no microscópio ótico na objetiva 40x.

Tabela 3. Elementos avaliados no exame microscópico da urina tipo II e respetivo

significado clínico. Adaptado de (9).

Elementos Significado clínico

Células

epiteliais

Refletem a descamação normal das células, a não ser que presentes

num número elevado ou morfologicamente alteradas. A presença de

células tubulares renais é indicativa de patologia renal.

Eritrócitos Podem estar presentes em casos de doenças renais e do trato urinário

ou apenas devido a condições fisiológicas normais, como

contaminação menstrual.

Leucócitos Presentes nas doenças renais e do trato urinário ou em condições

fisiológicas normais, em baixas quantidades.

Cilindros Aglomerados de proteínas Tamm-Horsfall presentes na urina na

forma solúvel, que em situação de estase urinária, precipitam. No

geral são patológicos e indicam doença renal.

Cristais Podem apresentar, ou não, significado clínico. São formados por

precipitações dos sais da urina por alterações na concentração, na

temperatura e no pH da urina.

3.7.Função hepática

Enzimas hepáticas

Os testes da função hepática incluem a determinação de substâncias que são

libertadas como resultado da ocorrência de dano tecidular, como as enzimas cujas

determinações são comumente utilizadas no diagnóstico de doença hepática que incluem

a aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina

(ALP) e γ-glutamil transferase (GGT). A determinação das enzimas hepáticas é muito

útil na deteção de lesões hepatocelulares que causam necrose celular, e na diferenciação

de patologias de origem funcional de patologias de origem obstrutiva. (9)

ALT e GGT estão presentes em vários tecidos, mas a sua concentração plasmática

reflete primariamente um fígado danificado. AST é encontrada no fígado, músculo e

eritrócitos. Por sua vez, a ALP existe em variados tecidos, mas normalmente reflete



35

problemas no fígado e nos ossos. ALP e GGT são úteis como marcadores de lesão

obstrutiva. Além disso, a interpretação das duas em conjunto é útil na distinção entre

doenças do esqueleto ou hepatobiliares. (9) As determinações de fosfatase alcalina são

úteis no diagnóstico de patologias ósseas, hepáticas, da paratiróide e intestinais. (33) A

GGT é uma enzima não específica da doença hepática, com aumento induzido por

medicamentos. Em pacientes com hábitos de alcoolismo, foram relatados níveis elevados

de γ-glutamil transferase. (34) Por outro lado, AST e ALT apresentam duas isoenzimas –

citosol e mitocondrial. Em dano celular moderado é a citosólica a mais elevada. Em dano

celular elevado, apresentam-se as duas aumentadas no plasma. No caso da ALT, a

mitocondrial é uma fração mínima, pelo que apenas a citosólica aparece no soro. Estas

enzimas são libertadas pelo tecido hepático danificado e a sua atividade aumenta no

plasma rapidamente. A razão entre as duas (AST/ALT) é usada para avaliar a extensão

das lesões. (9) Os níveis de AST podem apresentar-se elevados mesmo antes do

aparecimento clínico da icterícia, em doenças hepáticas, nomeadamente hepatites,

necrose, cirrose. (9,35) As determinações de ALT são utilizadas no diagnóstico e

tratamento de hepáticas e cardíacas. (36)

Aspartato aminotransferase


Amostra: soro e plasma

Interferentes: a hemólise eleva falsamente os resultados de AST. A lipémia também

poderá interferir. (35)


A conversão de NADH em nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) origina uma

alteração da absorvância que é diretamente proporcional à atividade da AST e é medida

utilizando uma técnica cinética bicromática (340, 700 nm). (35)

AST, pH 7.8

L-aspartato + ɑ-cetoglutarato → L-glutamato + oxaloacetato

MDH

Oxalacetato + NADH → Malato + NAD



36

Legenda: aspartato aminotransferase (AST); malato desidrogenase (MDH); nicotinamida

adenina dinucleótido reduzido (NADH); nicotinamida adenina dinucleótido (NAD)

Valores de referência: 15 – 37 U/L

Alanina aminotransferase



Interferentes: a bilirrubina não conjugada e conjugada reduz os resultados. Os

triglicéridos e a lipémia também podem interferir. (36)


A conversão de NADH em NAD origina uma alteração da absorvância que é

diretamente proporcional à atividade da ALT e é medida utilizando uma técnica cinética

bicromática (340, 700 nm). (36)

ALT, pH 7.4, tampão

L-alanina + ɑ-KG → L-glutamato + piruvato

LDH

Piruvato + NADH (H+) → Lactato + NAD+

Legenda: alanina aminotransferase (ALT); α-cetoglutarato (ɑ-KG); lactato desidrogenase

(LDH); nicotinamida adenina dinucleótido reduzido (NADH); nicotinamida adenina

dinucleótido (NAD)


Mulheres: 14 – 59 U/L

Homens: 16 – 63 U/L

Fosfatase alcalina





37

Interferentes: triglicéridos e lipémia poderão interferir no resultado. (33)


Este método responde a todas as isoenzimas de ALP. A variação da absorvância

a 405nm originada pela reação e medida com uma técnica de cinética bicromática (405,

510nm), é proporcional à atividade da enzima. (33)

ALP, pH 10.25, Mg/Zn

p-NPP + AMP → p-NP + AMP+ PO4

Legenda: fosfatase alcalina (ALP); magnésio (Mg); zinco (Zn); p-nitrofenilfosfato (p-

NPP); 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP); p-nitrofenol (p-NP); fosfato (PO4)


γ-glutamil transferase



Interferentes: os triglicéridos diminuem o resultado. A hemólise e a bilirrubina não

conjugada poderão interferir na determinação. (34)


O produto da reação, 5-amino- 2-nitrobenzoato, absorve a 405nm e a medida é

proporcional à atividade da GGT, utilizando uma técnica de cinética bicromática (405,

600nm). (34)

γ-glutamil-3-carboxi-4-nitranilida + glicilglicina → L- γ-glutamil-glicilglicina +

5-amino-2-nitrobenzoato


Mulheres 5 – 55 U/L

Homens 15 – 85 U/L



38

Bilirrubina direta (conjugada)

A bilirrubina, principal constituinte da bílis, é uma das principais substâncias

excretadas pelo fígado. Como a bilirrubina é insolúvel no plasma, esta é transportada para

o fígado ligada à albumina (bilirrubina não conjugada), onde vai ser conjugada com o

ácido glucorónico tornando-a hidrossolúvel (bilirrubina direta), sendo depois eliminada

pela bílis. (9)

A bilirrubina direta testa a capacidade do fígado para a conjugação e excreção de

bilirrubina. Este valor aumenta em obstruções hepáticas, cirrose, hepatite e ajuda no

diagnóstico de problemas metabólicos e hematológicos. (9,37)



Interferentes: a bilirrubina é fotossensível. A hemólise pode diminuir os resultados.

Várias substâncias podem interferir com o resultado, nomeadamente: albumina, ácido

ascórbico, colesterol, hemoglobina, lipémia, proteína total e algumas drogas. (37)


O cromóforo vermelho absorve a 540nm e é medido utilizando uma técnica

bicromática de ponto final (540, 700nm). (37)

Bilirrubina conjugada + Ácido sulfanílico diazotado → Cromóforo vermelho

(absorve a 540nm)

Valores de referência: 0.0 – 0.2 mg/dL

Bilirrubina total

O aumento da concentração de bilirrubina total deve-se quer a um aumento da

bilirrubina não conjugada, aumento da bilirrubina conjugada ou de ambas.

As determinações de bilirrubina direta são utilizadas no diagnóstico e tratamento

de problemas hepáticos, hemolíticos, hematológicos e metabólicos, incluindo hepatite e

doença da vesícula biliar. (38)

A determinação da bilirrubina indireta (não conjugada) é realizada pela diferença

entre a bilirrubina total e a bilirrubina direta.



39



Interferentes: a bilirrubina é fotossensível. Lipémia e algumas drogas podem interferir

com o resultado. (38)


O cromóforo formado absorve a 540nm e a medição é feita usando a técnica

bicromática de ponto final (540, 700nm). (38)

Bilirrubina solubilizada + Acido sulfanílico diazotado → Cromóforo vermelho

(absorve a 540nm)

Valores de referência: 0.2 – 1.0 mg/dL

Valores ≥18 mg/dL em RN são considerados críticos e comunicados ao médico de

imediato.

Amónia

Em condições normais, enzimas hepáticas metabolizam a amónia em ureia. Várias

doenças provocam um aumento na concentração de amónia (hiperamonémia). (9,39)

As causas mais comuns de hiperamonémia são doença hepática avançada e falha

renal. Doença severa do fígado ou doença crónica (como ocorre em hepatites fulminantes

e cirrose hepática, respetivamente), leva a uma deficiência do metabolismo da amónia.

Síndrome de Reye, uma desordem do sistema nervoso central (SNC) com disfunção

hepática associada, origina também hipernamonémia. (9,39)


Amostra: plasma (heparina de lítio ou EDTA)

Interferentes: não utilizar amostras hemolisadas. A bilirrubina não conjugada diminui os

resultados. O dextrano e a hemoglobina aumentam os resultados. A lipémia também

poderá alterar a determinação. (39)


A oxidação do cofator diminui a absorvância, que é proporcional à concentração

de amónia e é monitorizada a 340/700nm. (39)



40

GLDH

ɑ-cetoglutarato + NH4+ + cofator reduzido

→ L-glutamato + cofator + H2O

Legenda: glutamato desidrogenase (GLDH); amónia (NH4+); água (H2O)

Valores de referência: 19 – 54 μg/dL

Albumina

A albumina é sintetizada pelo fígado e é a proteína de maior concentração no

plasma. É usada como proteína de transporte e de ligação para o cálcio, os ácidos gordos,

a bilirrubina, as hormonas, as vitaminas e fármacos. (40)

Esta determinação encontra-se diminuída na doença hepática, resultando de

concentrações de imunoglobulinas aumentadas, perda para o espaço extravascular e

inibição direta da síntese por toxinas e álcool. O fígado é capaz de sintetizar elevadas

quantidades desta proteína até o dano hepático ser severo, com aproximadamente perda

de 95% de função. Valores diminuídos podem resultar de doença renal, que deixa escapar

a albumina para a urina, má nutrição ou por uma dieta pobre em proteínas. (9,40)



Interferentes: a heparina de lítio reduz o resultado. Tubos de colheita com oxalato de

potássio e fluoreto de sódio diminuem os resultados de albumina em 10%.

A lipémia também pode interferir no resultado. (40)


O método da albumina é uma adaptação do método púrpura de bromocresol. A

interferência da lipémia é diminuída através de um branqueamento de múltiplos

comprimentos de onda. A quantidade do complexo formado é diretamente proporcional

à concentração de albumina e é medida utilizando uma técnica policromática de ponto

final (600, 540, 700nm). (40)



41

pH 4.9

Albumina + Corante púrpura de → Complexo Albumina-Corante púrpura

bromocresol de bromocresol

(não absorvente a 600 nm) (absorve a 600 nm)

Valores de referência: 3.4 – 5.0 g/dL

3.8.Função pancreática e gastrointestinal

Amilase

A amilase pancreática é uma das enzimas excretadas pelo pâncreas. A atividade

da amilase no sangue e urina é fisiologicamente e constantemente baixa, no entanto,

aumenta bastante em casos de pancreatite aguda e inflamação das glândulas salivares,

podendo também ser utilizada no diagnóstico de carcinoma do pâncreas e outras lesões

pancreáticas. No entanto, apesar de ser uma determinação sensível, a amilase não é

específica da doença pancreática, apresentando-se elevada noutros casos como em

síndromes abdominais agudos sem lesão pancreática, pelo que é sugerido a realização do

doseamento combinado de amilase e lipase, de modo a aumentar a especificidade da

determinação. (9)

O método para a dosagem da amilase referido a seguir reage às isoenzimas

pancreáticas e salivares. (41)



Interferentes: os tubos de colheita de sangue com EDTA, citrato e oxalato inibem a

atividade da amilase. A amilase urinária é instável em urina ácida. A hemoglobina

diminui os resultados. A proteína total aumenta os resultados. A lipémia pode interferir.

(41)


A absorvância devida à formação de 2-cloro-4-nitrofenol é medida utilizando uma

técnica de cinética bicromática (405, 577nm). (41)



42

Amilase

CNPG3 → CNP + CNPG2 + G3 + glicose

Legenda: 2-cloro-4-nitrofenil-a-D-maltotriósido (CNPG3); 2-cloro-4-nitrofenol (CNP);

2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltósido (CNPG2); maltotriose (G3)


Soro:25 – 115 U/L

Urina: 59 – 401 U/24h

Um intervalo de referência para a urina em U/L não tem em consideração o

volume da amostra ou a eficiência renal. Colheitas de urina em 24h são utilizadas para

expressar o intervalo de referência para a urina em U/24h.

U/24h = Amilase urinária (U/L)

1000 x mL urina /24h

Lipase

A lipase pancreática degrada os triglicéridos da dieta em glicerol e ácidos gordos

e é outro exemplo de enzima excretada pelo pâncreas. A maioria da atividade desta

enzima no soro deriva do pâncreas, mas uma parte é também secretada pela mucosa

gástrica e intestinal. (42)

As medições de lipase pancreática usadas no diagnóstico de pancreatite aguda são

mais específicas que as medições de amilase. A lipase pancreática pode também

encontrar-se aumentada em doenças do trato biliar, como colecistite; obstrução do ducto

pancreático devido a cálculos ou carcinoma do pâncreas. (9)



Interferentes: o EDTA, o oxalato de potássio, o fluoreto de sódio e o citrato de sódio

inibem os resultados da lipase. A contaminação bacteriana da amostra pode aumentar

os valores da lipase. (42)




43

A taxa de produção de metilresorufina, proporcional à atividade de lipase,

é medida por uma reação bicromática a 577 e 700nm. (42)

Lipase, pH alcalino

Éster de 1,2-O-dilauril-rac-glicerol-3-ácido → 1,2-O-dilauril-rac-glicerol

glutárico-(6’-metilresorufina) + éster de ácido glutárico 6’-

metilresorufina (instável) + água

1,2-O-dilauril-rac-glicerol + éster de ácido → ácido glutárico + metilresorufina

glutárico-6’-metilresorufina (instável) (absorve a 577 nm)


3.9.Função cardíaca

Marcadores cardíacos

A avaliação e monitorização da função cardíaca é muito importante na deteção

das doenças cardiovasculares. O EAM está associado à falta de oxigénio no miocárdio

por insuficiência circulatória coronária. A recomendação Organização Mundial de Saúde

(WHO, do inglês, World Health Organization) para o diagnóstico de EAM baseia-se na

presença de dois dos seguintes critérios: dor pré-cordial, alterações eletrocardiográficas e

anomalias das enzimas/ marcadores cardíacos. (43)

A necrose celular causada pelo enfarte leva à libertação de enzimas na circulação,

pelo que analiticamente ocorre elevação da creatina quinase (CK), da isoenzima MB da

creatina quinase (CK-MB), lactato desidrogenase (LDH), troponinas e mioglobina. (44)

A CK é uma das principais enzimas do perfil cardíaco e existe no tecido muscular

esquelético e cardíaco e no cérebro. Possui 3 isoenzimas, sendo que a CK-MB é específica

do miocárdio. (9) A CK apresenta-se elevada noutras situações, para além do EAM,

nomeadamente lesões do tecido muscular ou após exercício físico intenso. (45) No caso

do enfarte agudo do miocárdio, tem um pico entre as 12 e 24h e regressa ao normal após

três ou quatro dias. A isoenzima CK-MB, atinge o pico entre as 12 e 20h e retorna à

normalidade após dois a três dias. (44) A massa de CK-MB constitui o marcador

bioquímico de eleição para o perioperatório de enfarte do miocárdio durante as primeiras

48 horas após o início da dor. As suas determinações são usadas também para avaliar a

extensão do EAM e subsequente reenfarte. Pode ser utilizado um índice relativo (CK-



44

MB/CK) para diferenciar as elevações de CK-MB devidas a lesão do músculo esquelético

ou devidas a EAM. (46)

A LDH apresenta baixa especificidade por se situar em vários tecidos, tendo

pouco valor de diagnóstico.(9) Uma pequena lesão nos tecidos pode provocar um

aumento na sua atividade, o que a torna útil no diagnóstico e monitorização de estados de

doença nos quais a renovação dos tecidos é acelerada, como em doenças do fígado, do

músculo cardíaco, dos músculos esqueléticos, dos rins e eritrócito. (47) No entanto, é

importante no diagnóstico do enfarte tardio, pois aumenta mais tardiamente e a sua

normalização é mais lenta. Tem o seu pico entre 24-48h após o EAM, normalizando após

o sétimo dia. (44)

A mioglobina é o marcador que se eleva mais rapidamente, entre 1 a 4 horas após

o início do enfarte, permanece elevada 6 a 7 horas e retorna à normalidade ao fim de 24h.

Devido ao seu baixo peso molecular e localização, é libertada mais precocemente para a

circulação do que os restantes marcadores de necrose. No entanto, é uma proteína

libertada na lesão de qualquer tecido. (44,48)

A troponina é o complexo da proteína reguladora contrátil do músculo estriado.

Este complexo é constituído por três componentes distintos, sendo um deles a troponina

I. (49) A troponina I tem um pico entre as 12 e 48h e volta a normalidade após cinco a

catorze dias. Dos marcadores específicos referidos, este é considerado o mais específico

e mantem-se elevado até duas semanas após o episódio. (44)

CK



Interferentes: as amostras muito hemolisadas não devem ser utilizadas. (45)


A taxa de formação da forma reduzida de fosfato nicotinamida adenina

dinucleótido (NADPH) é diretamente proporcional à atividade de CK na amostra e é

medida bicromaticamente a 340 e 540nm. (45)



45

CK, Mg++, NAC, EDTA

Fosfato de creatina + ADP → Creatina + ATP

HK, Mg++

ATP + Glicose → ADP + Glicose-6-fosfato

Glicose-6-fosfato desidrogenase

Glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-Fosfogliconolactona + NADPH + (H+)

Legenda: creatina quinase (CK); ião magnésio (Mg++); N-Acetilcisteína (NAC); ácido

etilenodiaminotetracético (EDTA); difosfato de adenosina (ADP); trifosfato de adenosina

(ATP); hexoquinase (HK); fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido (NADP+);

fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido reduzido (NADPH); ião hidrogénio (H+)

Intervalo de referência:



CK-MB massa

Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System – módulo HM


Interferentes: anticorpos heterofílicos potencialmente presentes nas amostras de doentes

podem reagir com os imunoensaios. Não deve ser usado sangue colhido na presença de

oxalato que pode provocar agregação das partículas de crómio. (46)

Método: imunoensaio enzimático em sandwich

Durante incubação da amostra com partículas de dióxido de crómio revestidas

com anticorpos monoclonais específicos e reagente conjugado (anticorpos monoclonais

específicos para a isoenzima CK-MB marcados com ß-galactosidase), forma-se uma

sandwich partícula/CK-MB/conjugado. A hidrólise de um substrato cromogéneo

combinado com a ß-galactosidase ligada à sandwich, liberta um cromóforo. A

concentração de CK-MB presente na amostra do doente é diretamente proporcional à taxa

de alteração de cor devido à formação do cromóforo. (46)



46

Cr02-Ab-CK-MB-F(ab')2 – β-gal

ß-d-galactopiranósido vermelho de clorofenol → Cromóforo (absorve a 577nm)

(não absorvente a 577nm)

Valores de referência: os níveis de CK-MB em indivíduos normais são baixos a

indetetáveis. 0 – 3.6 ng/mL

Lactato desidrogenase



Interferentes: devem ser efetuadas colheitas com cuidado para evitar a hemólise, visto

que a abundância de lactato desidrogenase nos glóbulos vermelhos pode contaminar essas

amostras. A dopamina aumenta os resultados. (47)


A atividade da lactato desidrogenase é medida através de uma reação cinética

a 340/700nm, que é proporcional à quantidade de lactato desidrogenase na amostra. (47)

LDH , pH 9.4

L–lactato + NAD+ → Piruvato + H+ + NADH

Legenda: lactato desidrogenase (LDH); nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+); ião

hidrogénio (H+); forma reduzida de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH)




Mioglobina

Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System - módulo HM

Amostra: soro e plasma heparinizado



47


podem reagir com os imunoensaios. Não deve ser usado sangue colhido na presença de

oxalato, que pode provocar agregação das partículas de crómio. (48)

Método: imunoensaio enzimático em sandwich



específicos para a mioglobina marcados com ß-galactosidase), forma-se uma sandwich

partícula/mioglobina/conjugado. A hidrólise de um substrato cromogéneo combinado

com a ß-galactosidase ligada à sandwich, liberta um cromóforo. A concentração de

mioglobina na amostra do doente é diretamente proporcional à taxa de alteração de cor

devido à formação do cromóforo. (48)

CrO2-Ab-mioglobina-F(ab')2- β-gal

ß-d-galactopiranósido vermelho de clorofenol → cromóforo

(não absorvente a 577nm) (absorve a 577nm)


Homem 16 – 96 ng/mL

Mulher 9 – 82 ng/mL

Troponina I cardíaca

Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System – módulo LOCI®

Amostra: soro e plasma (heparina de sódio ou de lítio).


podem reagir com os imunoensaios. (49)

Método: imunoensaio quimioluminescente em sandwich

Um reagente em forma de esfera (Sensibeads) é revestido com estreptavidina,

contendo um corante fotossensibilizante. Um segundo reagente em forma de esfera

(Chemibeads) é revestido com um anticorpo monoclonal anti-troponina I cardíaca e

corante quimioluminescente.

A amostra é incubada com o segundo reagente e um anticoropo monoclonal anti-

troponina I biotinilado, formando uma sandwich esfera – amostra – anticorpo biotinilado.



48

De seguida é adicionado o primeiro reagente que se liga à biotina para formar

imunocomplexos de pares de esferas. Ocorre uma reação quimioluminescente, após

iluminação do complexo a 680nm e o sinal resultante, medido a 612nm é diretamente

proporcional à concentração de Troponina I na amostra. (49)

Valores de referência: 0.000 – 0.056 ng/mL

Valores ≥0.5 ng/mL são considerados críticos e comunicados ao médico de imediato.

N-terminal pro-péptido natriurético cerebral

Foi comprovada a importância dos péptidos natriuréticos no controlo do

funcionamento do sistema cardiovascular. Em indivíduos com disfunção no ventrículo

esquerdo, as concentrações séricas e plasmáticas de péptido natriurético cerebral (BNP)

aumentam, assim como as concentrações da pro-hormona biologicamente inactiva,

proBNP, que é segregada pelo ventrículo esquerdo do coração e dissociada em BNP

fisiologicamente ativa e no fragmento N-terminal NT-proBNP. (50)

BNP tem uma multiplicidade de funções cardíacas e é libertado como uma

hormona contra-regulatória em resposta a stress cardíaco. O NT-proBNP apresenta níveis

elevados em doentes com doença cardiovascular. (9)

Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System - módulo LOCI®


Interferentes: amostras de doentes com anticorpos heterofílicos que reagem nos

imunoensaios. Em amostras de doentes com enfartes agudos do miocárdio e doentes

submetidos a diálise renal as concentrações de péptidos natriuréticos podem ser elevadas.

(50)

Método: imunoensaio quimioluminescente em sandwich

Um reagente em forma de esfera (Sensibeads) é revestido com estreptavidina,

contendo um corante fotossensível. Um segundo reagente em forma de esfera

(Chemibeads) é revestido com um anticorpo monoclonal específico para o NT-proBNP e

corante quimioluminescente.

A amostra é incubada com o segundo reagente e um anticoropo monoclonal

biotinilado que reconhece um epítopo localizado na parte N-terminal do proBNP,

formando uma sandwich esfera – NP-proBNP – anticorpo biotinilado. De seguida é



49

adicionado o primeiro reagente que se liga à biotina para formar imunocomplexos. Ocorre

uma reação quimioluminescente, após iluminação do complexo a 680nm e o sinal

resultante, medido a 612nm, é diretamente proporcional à concentração de NT-proBNP

na amostra. (50)


Doentes < 75 anos: 125 pg/mL

Doentes ≥ 75 anos: 450 pg/mL

3.10.Função tiroideia

Hormona estimulante da tiróide (TSH)

A TSH é uma glicoproteína produzida pelas células tirotróficas da hipófise

anterior e apresenta um ritmo circadiano que atinge o máximo durante as primeiras horas

da manhã. (51) Esta hormona regula a síntese das hormonas tiroideias tiroxina (T3) e

triiodotironina (T4) pelas células foliculares da tiróide e estimula o transporte de iodo.

(44)

Esta determinação é uma ajuda no diagnóstico das doenças da tiróide e da hipófise.

No geral, os níveis séricos desta hormona estão suprimidos no hipertiroidismo. No

hipotiroidismo, o doseamento da TSH ajuda no diagnóstico diferencial do hipotiroidismo

primário, onde os níveis estão aumentados, do hipotiroidismo secundário e terciário. (44)

Equipamento: VIDAS®

Amostra: 200 µL soro ou plasma (heparina de lítio)

Interferentes: o EDTA pode diminuir os valores medidos. (51)

Método: ELFA

A barrete tem 10 poços, em que o primeiro poço corresponde à introdução da

amostra, o último poço é uma cuvete que permite a leitura e os poços intermédios contém

os reagentes necessários à reação. O aparelho realiza o procedimento de modo

automático, colhendo a amostra para o poço que contem o anticorpo anti-TSH marcado

com fosfatase alcalina (conjugado). A amostra/conjugado é aspirada e depois dispensada

várias vezes no interior do cone (previamente sensibilizado com imunoglobulinas



50

monoclonais anti-TSH). Isto permite que o antigénio se ligue às imunoglobulinas fixadas

no cone e também ao conjugado, formando-se uma sandwich. Na etapa final, a enzima

do conjugado catalisa a formação do substrato dispensado no cone (4-metil-umbeliferil

fosfato) num produto (4-metil-umbeliferona), cuja fluorescência emitida é medida a

450nm e é proporcional à quantidade de antigénio presente na amostra. (51)


Eutiróide: 0,25 – 5 µlU/ml

Hipertiróide: < 0,15 µlU/ml

Hipotiróide: >7 µlU/ml

3.11.Fármacos

Os ensaios dos níveis plasmáticos dos fármacos a seguir descritos são úteis de

modo a estabelecer as dosagens apropriadas e avaliar possíveis efeitos colaterais tóxicos.

Carbamazepina

A carbamazepina é um fármaco anticonvulsivo útil no controlo de determinados

tipos de epilepsia. (52)



Interferentes: a lipémia poderá interferir no resultado. (52)


A taxa de agregação é diminuída quando a carbamazepina na amostra compete

com as partículas pelo anticorpo. Esta taxa é inversamente proporcional à concentração

de carbamazepina na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas

a 340nm e 700nm. (52)

Carbamazepina + PR + Ab → Complexo PR-Ab + Carbamazepina-Ab

(difunde luz a 340 nm)

Legenda: conjugado de partícula sintética-carbamazepina (PR); anticorpo monoclonal

específico da carbamazepina (Ab)



51

Intervalo terapêutico: o intervalo mais apropriado para cada doente deverá ser

determinado pelo médico. No entanto, concentrações superiores a 15.0 µg/mL são

frequentemente associadas a sintomas de toxicidade.

Gentamicina

A gentamicina possui um amplo espectro de atividade antibiótica e é eficaz contra

bactérias aeróbias Gram-negativas (GN). (53)



Interferentes: a lipémia pode interferir na determinação.


A taxa de agregação é diminuída quando a gentamicina na amostra compete com

as partículas pelo anticorpo. Esta taxa é inversamente proporcional à concentração de

gentamicina na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas a

340nm e 700nm. (53)

Gentamicina + PR + Ab → Complexo PR-Ab + Gentamicina-Ab


Legenda: conjugado de partícula sintética-gentamicina (PR); anticorpo monoclonal

específico da gentamicina (Ab)

Intervalo terapêutico: O intervalo mais apropriado para cada doente deverá ser

determinado pelo médico. Concentrações mínimas superiores a 2 µg/mL durante períodos

superiores a 10 dias foram associadas a toxicidade.

Fenobarbital

O fenobarbital pode ser utilizado em situações de convulsões causadas pela

desabituação do álcool ou barbitúricos e em situações de convulsões epiléticas

generalizadas e focais. (54)



52



Interferentes: a lipémia pode interferir no resultado. (54)


A taxa de agregação é diminuída quando o fenobarbital na amostra compete com


fenobarbital na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas a

340nm e 700nm. (54)

Fenobarbital + PR + Ab → Complexo PR-Ab + Fenobarbital-Ab


Legenda: conjugado de partícula sintética-fenobarbital (PR); anticorpo monoclonal

específico do fenobarbital (Ab)


determinado pelo médico, sendo que as concentrações terapêuticas de fenobarbital variam

significativamente, dependendo de cada doente. Concentrações superiores a 50.0 µg/mL

estão associadas a toxicidade.

Fenitoína

A fenitoína é eficaz em perturbações convulsivas, algumas crises epilépticas e

ocasionalmente no tratamento de arritmias cardíacas. (55)



Interferentes: amostras lipémicas podem interferir nos resultados. (55)


A taxa de agregação é diminuída quando a fenitoína na amostra compete com as

partículas pelo anticorpo. Esta taxa é inversamente proporcional à concentração de

fenitoína na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas a 340nm

e 700nm. (55)



53

Fenitoína + PR + Ab → Complexo PR-Ab + Fenitoína-Ab


Legenda: conjugado de partícula sintética-fenitoína (PR); anticorpo monoclonal

específico da fenitoína (Ab)


determinado pelo médico. As concentrações superiores a 30.0 µg/mL são frequentemente

associadas a sintomas de toxicidade.

Teofilina

A teofilina é uma xantina metilada, estruturalmente relacionada com as purinas e

o ácido úrico. É principalmente utilizada no tratamento da asma e outras patologias

pulmonares. A semivida biológica da teofilina é cerca de 8-9 horas na maioria dos adultos,

mas substancialmente prolongada na presença de doença hepática e/ou descompensação

cardíaca. (56)



Interferentes: em doentes urémicos é detetável um metabolito da teofilina, o ácido 1,3-

dimetil-úrico, que aumenta os valores da teofilina. A lipémia é outro interferente. (56)


A taxa de agregação é diminuída quando a teofilina na amostra compete com as

partículas pelo anticorpo. A taxa de agregação, proporcional à quantidade de teofilina, é

medida utilizando uma cinética turbidimétrica a 340 nm. (56)

Teofilina + PR + Ab → Complexo PR-Ab + Teofilina-Ab


Legenda: conjugado de partícula sintética-teofilina (PR); anticorpo monoclonal

específico da teofilina (Ab)



54


determinado pelo médico Concentrações superiores a 20.0 µg/mL são frequentemente

associadas a toxicidade.

Ácido valpróico

O ácido valpróico é um anticonvulsivo, que pode ser usado isoladamente ou em

conjunto com outros fármacos no tratamento de crises e convulsões. (57)



Interferentes: amostras lipémicas são interferentes. (57)


A taxa de agregação é diminuída quando o ácido valpróico na amostra compete

com as partículas pelo anticorpo. Esta taxa é inversamente proporcional à concentração

de ácido valpróico na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas

a 340nm e 700nm. (57)

Ácido valpróico + PR + Ab → Complexo PR-Ab + Ácido Valpróico-Ab


Legenda: conjugado de partícula sintética-ácido valpróico (PR); anticorpo monoclonal

específico do ácido valpróico (Ab)

Intervalo terapêutico: as concentrações terapêuticas de ácido valpróico variam

significativamente, dependendo de cada doente, por isso, deve ser o médico a estabelecer

quais as concentrações mais adequadas a cada doente.

Vancomicina

A vancomicina é um antibiótico, que atualmente está limitado ao tratamento de

infeções nos quais outros antibióticos não são eficazes. É ativo contra a maioria das

bactérias Gram-positivas (GP). (58)



55



Interferentes: a lipémia constitui um interferente nos resultados analíticos da

vancomicina. (58)


A taxa de agregação é diminuída quando a vancomicina na amostra compete com


vancomicina na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas a

340nm e 700nm. (58)

Vancomicina + PR + Ab → Complexo PR-Ab + Vancomicina-Ab


Legenda: conjugado de partícula sintética-vancomicina (PR); anticorpo monoclonal

específico da vancomicina (Ab)

Intervalo terapêutico: existe uma grande disparidade entre os intervalos terapêuticos da

vancomicina. Deve ser o médico a determinar qual o intervalo terapêutico de vancomicina

mais apropriado para cada doente.

Digoxina

É um glicosídeo cardíaco, é utilizado como agente antiarrítmico. Pode ser

administrada individualmente ou em conjunto com outros fármacos, no tratamento de

problemas cardíacos. (59)



Interferentes: fatores endógenos imunoreativos semelhantes à digoxina, presentes no soro

e no plasma de algumas pessoas, nomeadamente doentes com insuficiência renal e

hepática que aumentam os resultados. (59)

Método: imunoensaio enzimático

São utilizadas partículas magnéticas revestidas com um análogo da digoxina que

separam espécies anticorpo-enzima livres e ligadas à digoxina. O método encontra-se



56

otimizado para a medição da atividade da ß-galactosidase que catalisa a hidrólise de um

composto em vermelho de clorofenol. A variação de absorvância medida a 577, devido

ao aumento de vermelho de clorofenol é proporcional à atividade da enzima, que por sua

vez é proporcional à digoxina na amostra, e é medida utilizando uma técnica bicromática

(577, 700nm). (59)

Digoxina-F(ab')2-β-gal

CPRG (não absorvente a 577nm) → vermelho de clorofenol (absorve a 577nm)

Legenda: clorofenol-ß-D-galactopiranósido (CPRG)

Intervalo terapêutico: concentrações superiores a 2.00 ng/mL estão associadas a

toxicidade. O médico deverá indicar o intervalo terapêutico mais apropriado.

Teste para Drogas de Abuso em Um Só Passo

Consiste num teste rápido imunocromatográfico. As drogas, caso presentes na

urina, competem contra o respetivo conjugado da droga, em locais de ligação ao anticorpo

específico. (60)

Amostra: urina aleatória

Procedimento: são colocadas três gotas de urina no dispositivo de teste da droga a testar

e o resultado é lido passado 3-5 minutos. Se a amostra tiver precipitado, deve ser

centrifugada antes da realização do teste.

Se a droga estiver presente, aparece uma linha visível na zona da linha de teste,

devido às partículas revestidas de anticorpo, que são capturadas pelo conjugado da droga

imobilizado. No caso da amostra ser negativa para a droga em estudo, aparecerá uma

linha colorida na zona de controlo para garantir que o volume da amostra foi apropriado

e que a absorção da membrana ocorreu.

Barbitúricos depressivos

São agentes depressivos do sistema nervoso central. São usados terapeuticamente

como sedativos, hipnóticos e antiepiléticos. Uso crónico leva a tolerância e dependência

física. O teste produz um resultado positivo quando excedem 300ng/mL na urina. (60)

Benzodiazepinas



57

São prescritas no tratamento sintomático de ansiedade e alterações do sono.

Substituem os barbitúricos porque são mais seguros e eficazes. São também usadas no

tratamento da alteração da concentração e abstinência a do álcool. Há risco de

dependência física destas drogas, se forem tomadas regularmente. O teste produz um

resultado positivo quando excedem 300ng/mL na urina. (60)

Cocaína

É um estimulador do sistema nervoso central e um anestésico local. Inicialmente

origina energia extrema e gradualmente, sensibilidade excessiva, tremores e espasmos,

podendo mesmo originar inconsciência. O teste deteta o principal metabolito da cocaína,

benzoilecgonina, que pode ser detetado entre 24h-48h após a toma de cocaína. O teste

produz um resultado positivo quando o metabolito excede 300ng/mL na urina. (60)

Opiáceos

Opiáceo refere-se a qualquer droga derivada da papoila, nomeadamente morfina

e drogas semi-sintéticas como a heroína. Os recetores opióides são importantes na

regulação da dor, atuando sobre o SNC. O teste produz um resultado positivo quando o

metabolito excede 300ng/mL na urina. (60)

Anfetaminas

São quimicamente relacionadas com as catecolaminas do corpo humano:

epinefrina e norepinefrina. As anfetaminas pertencem a uma classe de potentes agentes

simpatomiméticos com aplicações terapêuticas. É uma droga estimulante do SNC, que

induz euforia, aumento de energia, aumento de pressão arterial, entre outros sintomas, em

doses elevadas. O teste produz um resultado positivo quando o metabolito excede

1000ng/mL na urina. (60)

Marijuana

Quando administrada, produz efeitos eufóricos, batimentos cardíacos rápidos,

desorientação, entre outros. O seu uso prolongado pode estar associado a distúrbios

comportamentais. O teste produz um resultado positivo quando o principal metabolito

excretado na urina excede 50ng/mL. (60)

3.12.Aparelho reprodutor

Gonadotropina Coriónica Humana

A gonadotropina coriónica humana (hCG) é uma glicoproteína produzida pela

placenta, após a implantação de um óvulo fertilizado na parede uterina. A hCG é



58

composta por duas subunidades não idênticas, α e β, ligadas entre si de forma não

covalente. Após a conceção, esta hormona aumenta a sua concentração no soro, tornando-

se um marcador para confirmação e monitorização da gravidez. (61) A hormona mantém

o corpo lúteo por um período de 8 a 10 semanas, até que a placenta tenha desenvolvido

completamente sua capacidade de produzir progesterona, nessa altura, os níveis caem.

(27)

Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System - módulo HM


Interferentes: não deve ser usado sangue colhido na presença de oxalato porque pode

provocar agregação das partículas de crómio. Níveis elevados desta hormona estão

associados a algumas patologias como a doença trofoblástica. Anticorpos heterofílicos

potencialmente presentes nas amostras de doentes podem reagir com os imunoensaios.

(61)

Método: imunoensaio enzimático, baseado no princípio de sandwich



específicos para a hCG marcados com ß-galactosidase), forma-se uma sandwich

partícula/hCG/conjugado. A hidrólise de um substrato cromogéneo combinado com a ß-

galactosidase ligada à sandwich, liberta um cromóforo (vermelho de clorofenol). A

concentração de hCG na amostra do doente é diretamente proporcional à taxa de alteração

de cor devido à formação do cromóforo. (61)

CrO2-Ab-hCG-F(ab')2-β-gal

CPRG (não absorvente a 577nm) → vermelho de clorofenol (absorve a 577nm)

Legenda: clorofenol-ß-D-galactopiranósido (CPRG)


Mulher não grávida com idades entre 22-87: 0 – 6 IU/L .

Níveis baixos de hCG >25 IU/L podem ser indicativos de uma fase inicial de

gravidez, mas os resultados devem sempre ser avaliados no contexto da situação clínica.



59

A concentração de hCG duplica a cada dois dias, aproximadamente, aumentando

rapidamente durante as primeiras semanas de gravidez. (61)

No laboratório, está também disponível um teste rápido para a determinação

qualitativa desta hormona em urina, para deteção da gravidez numa fase inicial. O teste

consiste numa técnica de imunoensaio cromatográfico. A linha de teste usa uma

combinação de anticorpos, incluindo um anticorpo monoclonal anti-hCG, para deteção

de níveis da hormona. O ensaio é realizado adicionando três gotas de amostra de urina ao

poço da amostra do dispositivo de teste e o resultado é lido 3-4 minutos depois. A amostra

migra por ação capilar ao longo da membrana para reagir com o conjugado colorido, e

um resultado positivo origina uma linha colorida na região de teste da membrana. Para

servir de controlo, aparece sempre uma linha colorida na região de controlo do dispositivo

de teste. Podem ocorrer falsos positivos e falsos negativos. (62)

Espermograma

Esta análise requer marcação prévia e serve para analisar a qualidade do esperma

do paciente, a partir de uma amostra colhida segundo os procedimentos referidos a seguir.

O espermograma é útil no estudo da fertilidade masculina e na monitorização no contexto

pós-vasectomia. Para a realização deste exame o laboratório segue as normas do manual

da WHO, de 2010. (63)

A colheita é efetuada por masturbação, de preferência de manhã. É necessária

abstinência sexual nos 3 a 5 dias anteriores ao exame. Para seguimento pós-vasectomia,

a colheita deverá ser efetuada apenas após 16 semanas do procedimento cirúrgico e pelo

menos 24 ejaculações. A colheita deverá ser efetuada com ausência de febre nos últimos

3 meses. Após desinfeção das mãos e glande, faz-se a colheita para recipiente estéril. Tem

de ser entregue no laboratório num período máximo de 30 minutos após a recolha do

esperma e este ser transportado à temperatura corporal. (4) Aquando da entrega é

preenchido um inquérito que questiona a razão da realização do exame, dias de

abstinência, se entrega a colheita completa do ejaculado e se teve febre nos últimos 3

meses.

Quando a amostra entra no laboratório, esta é colocada na estufa a 37ºC durante

30-60 minutos. Após esse tempo, é retirado da estufa e é realizado um estudo da amostra.

É realizado uma análise macroscópica que engloba as seguintes determinações:



60

• Volume - deverá ser superior a 1,5 mL;

• Aspeto - opalescente ou límpido (baixa concentração de espermatozóides);

• Cheiro - suis generis ou fétido;

• pH - deverá estar compreendido entre 7,2 e 7,8;

• Cor - esbranquiçada, amarelada (contaminação por urina, medicação),

acastanhada (presença de eritrócitos);

• Viscosidade da amostra - normal ou aumentada;

• Liquefação - completa, incompleta ou tardia aos 60 minutos.

Envolve também uma avaliação microscópica em ampliação 400x, com lâminas

colocadas na estufa a 37ºC, durante 30 minutos a 1h. São analisados os seguintes

parâmetros:

• Mobilidade - contagem de pelo menos 200 espermatozóides, em que é

atribuído um grau de mobilidade de 0 a 4: grau I (imóveis), grau II (não

progressivos), grau III (progressivos lentos), grau IV (progressivos

rápidos); valor de referência: progressivos móveis de grau III+IV >32%;

• Morfologia dos espermatozóides - cabeça, forma intermédia, restos

citoplasmáticos, cauda; valor de referência >4% formas normais;

• Vitalidade – são avaliados pelo menos 200 espermatozóides em que é feita

a distinção entre os imóveis e os mortos. A percentagem de mortos não

deve ultrapassar a dos imóveis. É reportada a percentagem de vivos (valor

de referência >58%).

É possível calcular o número total de espermatozóides no ejaculado, utilizando a

concentração (valor de referência >15x106/mL) dos espermatozóides e volume total da

amostra (total de espermatozóides no ejaculado = concentração x volume total amostra).

A contagem é realizada em câmara de Neubauer, utilizando uma diluição baixa com água

destilada. É também possível avaliar a presença de elementos celulares, como leucócitos

e células epiteliais, que poderão indicar dano testicular ou infeção. (63)

3.13.Metabolismo ósseo e mineral

Cálcio

No sangue, aproximadamente 50% do cálcio plasmático encontra-se na forma

livre, 40% encontra-se ligado às proteínas e 10% na forma de complexo iónico. A maioria

do cálcio ligado às proteínas encontra-se associado à albumina. Várias funções



61

fisiológicas dependem do cálcio intracelular, incluindo a contração muscular, secreção

hormonal, metabolismo do glicogénio e divisão celular. O cálcio extracelular é

importante entre outros, para a mineralização óssea e coagulação sanguínea. (9,64)

A hipocalcémia pode ser devida à redução do cálcio ligado à albumina ou da

fração livre, sendo a hipoalbuminémia a causa mais comum da diminuição de cálcio.

Outras causas são a insuficiência renal, hipoparatiroidismo, défice de vitamina D e

diminuição da concentração de magnésio. Causas de hipercalcémia são absorção

intestinal, retenção renal e reabsorção esqueletal aumentadas; excesso de vitamina D,

hiperparatiroidismo e neoplasias ósseas. (9)

A determinação do cálcio é útil no diagnóstico e tratamento de doença da

paratiróide, doenças ósseas e doenças renais crónicas. (64)



Interferentes: no caso das amostras urinárias de 24 horas, a colheita deve ser realizada

num recipiente com ácido clorídrico. A bilirrubina não conjugada, a presença de EDTA

e oxalato de potássio diminuem o valor do cálcio. A interferência devida ao magnésio é

insignificante relativamente aos níveis de magnésio normalmente encontrados em soro

humano. (64)


A medição do complexo púrpura formado, que é proporcional à concentração de

cálcio, é através de uma técnica bicromática de ponto final (577, 540nm). Os iões de

magnésio são removidos da reação através da formação de complexos com 8-quinolinol.

(64)

Ca++ + OCPC → Complexo Ca-OCPC

pH 9.7 (absorve a 577 nm)

Mg++ + 8-quinolinol → Quinolinato de magnésio

(não absorvente a 577 nm)

Legenda: ião cálcio (Ca++); o-cresolftaleína complexona (OCPC); ião magnésio (Mg++ )



62


Soro: 8.5 – 10.1 mg/dL

Urina:14 42 – 353 mg/24 hr

No soro, valores ≤6,0 ou ≥13 mg/dL são considerados críticos e comunicados ao

médico de imediato.

Cálcio ionizado

O cálcio ionizado é útil na avaliação do cálcio livre e no metabolismo do cálcio,

na medida em que pacientes com baixa concentração de albumina sérica, terão valores de

cálcio total baixos, mas poderão ter níveis normais de cálcio ionizado. (7)


Amostra: sangue arterial heparinizado

Método: potenciometria

Valor de referência: 4.6 – 5.4 mg/dL

Magnésio

É o quarto catião mais abundante no corpo humano. Nas células, a maioria do

magnésio está ligado a proteínas e moléculas carregadas negativamente, como o ATP. É

um cofator para muitas enzimas que participam em processos como a glicólise e síntese

de hidratos de carbono e lípidos. A deficiência de magnésio (hipomagnesémia) está

associada com perdas intestinais, perdas urinárias devido a problemas nos rins devido ao

alcoolismo e diabetes mellitus, entre outros. Excreção aumentada de cálcio e sódio

também diminuem os níveis de potássio, a nível renal. Hipermagnesémia é comum devido

à toma excessiva de medicação contendo magnésio e nas insuficiências renais onde há

diminuição da excreção sua excreção. (9)


Amostra: soro, plasma heparinizado e urina


num recipiente com ácido clorídrico. O uso de EDTA diminui o resultado. Por outro lado,



63

as amostras hemolisadas, bilirrubina não conjugada e lipémia aumentam os resultados.

(65)


A medição do complexo formado, que é proporcional à concentração de

magnésio, é feita através de uma técnica bicromática de ponto final (600, 510nm). Os iões

de cálcio são removidos da reação através da formação de complexos entre o cálcio e o

agente quelante. (65)

Mg++ + MTB → Complexo Mg-MTB

(absorve a 600 nm)

Ca++ + Ba-EGTA → Complexo

(não absorvente a 600 nm)

Legenda: ião magnésio (Mg++); azul de metiltimol (MTB); ião cálcio (Ca++); sal de bário

do ácido etilenobis (oxietilenonitrilo) tetracético (Ba-EGTA)


Soro: 1.8 – 2.4 mg/dL

Urina: 24 – 255 mg/24h

Valores <1.0 e >4.9 mg/dL são considerados críticos, pelo que o médico deve ser

avisado de imediato.

Fósforo

O fósforo encontra-se distribuído por todo o organismo, sendo parte constituinte

de várias moléculas e a maioria do fosfato no soro existe na forma inorgânica.

Aproximadamente 10% do fósforo no soro está ligado às proteínas, 35% encontra-se

complexado com sódio, cálcio e magnésio, e o restante, está na forma livre (55%).Os

fosfatos são muito importantes para a produção de energia, função muscular e nervosa e

crescimento ósseo. Hipofosfatémia pode ocorrer devido a perdas intracelulares, perda

renal, absorção intestinal reduzida. Algumas das causas de perda de fosfatos são

raquitismo, osteomalacia e hiperparatiroidismo. A hiperfosfatémia é normalmente



64

secundária à incapacidade dos rins de excretar fósforo, mas também pode ocorrer devido

a condições como o hipoparatiroidismo ou ingestão em excesso. (9)

A determinação de fósforo (inorgânico) é útil no diagnóstico e tratamento de

doença óssea, da paratiróide e renal. (66)




num recipiente com ácido clorídrico, para evitar a precipitação de complexos de fosfato.

Amostras lipémicas e hemolisadas, bem como a albumina, aumentam os resultados. (66)


O fosfato inorgânico reage com molibdato de amónio e o complexo formado é

medido a 340 nm. (66)

(NH4)2MoO4 + fosfato inorgânico → complexo de fosfomolibdato

pH 1.1

Legenda: molibdato de amónio ((NH4)2MoO4)


Soro e plasma: 2.6 – 4.7 mg/dL

Urina: 0.4 – 1.3 g/24h

3.14.Equilíbrio ácido-base

Gasimetria arterial


Amostra: sangue total heparinizado

Interferências: caso a amostra demore muito tempo a ser utilizada, pode ocorrer

contaminação com o ar ou alterações metabólicas. (7)

A gasimetria é um teste essencial para a avaliação de doenças cardio-respiratórias.

Permite a determinação de causas de acidose/alcalose metabólicas/respiratória. O pH e



65

gases são importantes de forma a ajudar a determinar o estado ácido-base, a eficiência

dos pulmões nas trocas gasosas e ajustar a terapia de oxigénio. (7)

Alcalose e acidose são estados patológicos que levam a alcalémia (pH >7.45) ou

acidémia (pH <7.35) respetivamente. O pH sanguíneo tem que ser devidamente

controlado, de modo a minimizar flutuações, para que as funções celulares ocorram em

condições normais. Este controlo é realizado pelo sistema respiratório (com ação rápida),

sistema renal (atuação lenta) e sistemas tampão, nomeadamente o sistema

bicarbonato/ácido carbónico, que é o mais importante sistema tampão do plasma. (7,9)

A maioria das desordens metabólicas desenvolvem-se lentamente. Os pulmões

são a forma mais eficiente de regulação, sendo que a tensão de CO2 pode ser alterada

rapidamente, através de alterações na ventilação. Apesar da resposta respiratória ser

imediata, pode ser necessário algum tempo para que a resposta se torne máxima. Os rins

também respondem a alterações no estado ácido-base, sendo que em caso de acidose, a

excreção de ácidos é aumentada e base conservada. No caso de alcalose, ocorre o oposto.

No entanto, a ação renal é mais lenta, demorando várias horas para alterar a quantidade

de bicarbonato a ser excretada, por exemplo. (7,9) Alguns parâmetros que definem o

estado ácido-base encontram-se na tabela 4 e os respetivos valores de referência na tabela

5.

Tabela 4. Conjunto de parâmetros que definem o estado ácido-base. Adaptado de (7,9).

Parâmetros

pH Indica o estado de acidez ou basicidade.

ρO2 Pressão parcial de oxigénio. Indica a qualidade das trocas de oxigénio.

HCO3- Ião bicarbonato. Segundo maior anião do compartimento extracelular.

A maioria do dióxido de carbono está presente nesta forma. Constituinte

do sistema bicarbonato/ácido carbónico.

ρCO2 Pressão parcial de CO2.Reflexo da função respiratória.

BE BE (excesso de bases) é um parâmetro que aproxima a quantidade de

ácido ou base necessária para atingir um valor de pH normal.

TCO2 TCO2 (dióxido de carbono total) indica a concentração total (livre e

ligado) de CO2 no plasma.

Situações clínicas associadas:

Acidose respiratória: causada por condições que diminuam a eliminação de CO2

pelos pulmões. Problemas respiratórios como doenças pulmonares obstrutivas, obesidade

extrema, que originem hipoventilação. (9)

pH ↓ ρCO2 ↑ HCO3- normal (aumenta como resposta compensatória)



66

Alcalose respiratória: a causa básica desta situação é a eliminação em excesso de

ácido pela via respiratória. Problemas respiratórios com perda excessiva de CO2, como

hipoxia, desordens pulmonares, hiperventilação induzida. (9)

pH ↑ ρCO2 ↓ HCO3- normal (diminui como resposta compensatória)

Acidose metabólica: pode ocorrer divido a produção de ácidos orgânicos que

excedem a taxa de eliminação (acidose diabética), perda excessiva de bicarbonato devida

excreção renal aumentada, diarreias. (9)

pH ↓ ρCO2 Normal (diminui como resposta compensatória) HCO3- ↓

Alcalose metabólica: ocorre quando base em excesso é adicionada, quando a

eliminação de bases diminui ou quando a excreção e ácidos está aumentada, originados

por problemas como vómito prolongado, excesso de mineralocorticóides ou fibrose

cística. (9)

pH ↑ ρCO2 Normal (aumenta como resposta compensatória) HCO3- ↑

Tabela 5. Intervalos de referência dos parâmetros ácido-base. Adaptado de (7).

Parâmetros Intervalos de Referência

pH 7.35 – 7.45

ρCO2 35 – 48 mmHg

HCO3- 18 – 23 mmol/L

ρO2 83-108 mmHg

TCO2 22 a 29 mmol/L

BE (-2) – 3 mmol/L

3.15.Equilíbrio hidro-eletrolítico

Iões Sódio (Na+), Potássio (K+) e Cloro (Cl –)

Os eletrólitos afetam a maioria dos processos metabólicos das células.

Anormalidades do estado ácido-base sanguíneo está sempre acompanhado por alterações

nas concentrações dos eletrólitos, especialmente em distúrbios metabólicos. Os iões de

hidrogénio não podem acumular sem acumulação de aniões, ou sem troca de catiões.

Deste modo, as concentrações de eletrólitos são normalmente medidas junto com as

determinações de pH e gases sanguíneos. (9)

O sódio é o principal catião do líquido extracelular. É crítico para a manutenção

da distribuição de água e pressão osmótica nos tecidos. O sódio tem um limiar renal, a

partir do qual é excretado na urina (110- 130 mmol/L). Se a sua concentração sérica

estiver diminuída, é reabsorvido pelos túbulos renais. Desordens na homeostase do sódio



67

podem ocorrer devido a perda, ganho ou retenção de sódio ou água. Um valor de sódio

acima do normal (hipernatrémia) pode ocorrer devido suor excessivo, desidratação,

doença renal, doença hormonal. Exemplos de causas de hiponatrémia são retenção de

água devido a secreção inadequada de hormona antidiurética e diarreia excessiva. (7,9)

O potássio é o principal catião intracelular. Atua em conjunto com o sódio para

manter o equilíbrio da água. Os rins excretam 80-90% do potássio ingerido, mesmo se

existir em pouca quantidade no soro, pois não existe limiar renal. Alterações na

homeostase do potássio tem consequências graves, na medida em que a sua diminuição

origina irritabilidade e fraqueza muscular, bem como paralisia. O seu aumento pode

originar efeitos cardíacos graves, bem como confusão mental. Hipocalémia pode ocorrer

devido a vómitos e diarreia, doença renal, alcalose. Hipercalémia ocorre em doença renal

aguda, obstrução renal, cetoacidose diabética. (7,9)

O cloro é o anião mais abundante no fluido extracelular, tendo como principais

funções a manutenção da osmolalidade, do volume sanguíneo e da neutralidade elétrica.

Flutuações no soro ou plasma tem poucas consequências clinicas, mas servem como

indicação de distúrbios na homeostase ácido-base e fluidos. Hipoclorémia ocorre, por

exemplo, devido a perda intestinal de bicarbonato, insuficiência adrenal, nefropatias.

Causas de hiperclorémia são desidratação, acidose tubular renal, insuficiência renal. Os

cloretos urinários são importantes na avaliação do tratamento da alcalose metabólica com

Cl-. (9)

Equipamento: Dimension® Integrated Chemistry System - módulo QuikLYTE®

Amostra: soro e plasma heparinizado e urina

Interferentes: amostras hemolisadas e o uso de citrato altera os resultados (diminui o

sódio, diminui o potássio e aumenta o cloreto). (12)

Método: potenciometria indireta

A amostra é posicionada no sensor e é gerado um potencial elétrico, proporcional

ao logaritmo da atividade de cada ião especifico presente na amostra. O potencial elétrico

gerado é comparado com uma solução padrão e é feito um cálculo das concentrações dos

iões. (12)



68


Soro/plasma (mmol/L) :

Na+: 136-145

K+: 3.5-5.1

Cl-: 98 – 107

Urina (mmol/24h):

Na+ : 40-220

K+: 25-125

Cl-: 98 – 110-250

No soro, valores de potássio ≤2,5 ou ≥6,0 mmol/L (exceto em amostras

hemolisadas) e sódio ≤125 ou ≥160 mmol/L são considerados críticos e o médico é

avisado de imediato.

As concentrações dos iões sódio e potássio também podem ser determinadas em

sangue arterial heparinizado, através de sensores potenciométricos, no aparelho GEM

Premier 3000. Os valores de referência são os seguintes: (7)

Na+: 136 – 145 mmol/L

K+: 3.4 – 4.5 mmol/L

3.16.Sistema nervoso central

Proteína do líquido cefalorraquidiano

A determinação do conteúdo proteico no líquido cefalorraquidiano é útil no

diagnóstico e tratamento de doenças do sistema nervoso central. Normalmente, proteínas

de baixa massa molecular predominam no LCR, tal como a albumina e transferrina.

O aumento da permeabilidade da barreira sangue-LCR às proteínas plasmáticas

poderá ser devido a pressão intracranial elevada originada de tumores cerebrais,

hemorragias ou trauma, meningite viral, encefalite, entre outras. (9,32)


Amostra: LCR



69

Interferentes: as amostras que contêm amicacina, gentamicina, canamicina e tobramicina

provocam um falso aumento dos resultados. A presença de sangue na amostra indica

contaminação com proteínas plasmáticas, invalidando o resultado. (32)

Método: o método é o mesmo já descrito para a proteína urinária. A amostra de LCR deve

ser centrifugada a 1500 rpm, 5 minutos antes de ser colocada no aparelho.

Valores de referência: 15 – 45 mg/dL

Valores superiores a 50mg/dL são considerados críticos e comunicados ao médico

de imediato.

Exame citoquímico do LCR

O exame citoquímico do LCR é útil no diagnóstico de patologias neurológicas

variadas, incluindo tumores, distúrbios imunes e doenças infeciosas. (67,68)

No laboratório, o exame do LCR é realizado tendo em conta os seguintes

parâmetros: aspeto, coloração, proteínas, glucose e leucócitos.

O aspeto e coloração são avaliados antes e após centrifugação. Um LCR não

patológico é límpido e incolor. A coloração do LCR pode significar presença de

hemoglobina, bilirrubina, proteínas, entre outros. Presença de turvação pode ser devida a

presença de células sanguíneas, microrganismos ou taxas elevadas de proteínas ou

lípidos. (67)

As proteínas e a glucose são avaliadas no equipamento, Dimension® Integrated

Chemistry System. Vários distúrbios neurológicos estão associados ao aumento de

proteínas no LCR, como já foi referido. Os níveis de glicose variam com a concentração

plasmática e com a taxa de metabolismo do LCR. Nas meningites por fungos ou

bacterianas ocorre consumo de glucose. (68)

A contagem diferencial de leucócitos, caso existentes, é fundamental para

identificar as linhagens celulares presentes e estabelecer uma terapêutica adequada, sendo

que deverá ser feita após coloração. (67,68)

A determinação do número de leucócitos é feita antes da centrifugação, em câmara

de Neubauer, após colocação num tubo 100µl de amostra e 100µl de reagente (solução

de Turk) durante 5 minutos, para ocorrer destruição dos eritrócitos.

No caso de um LCR patológico, o médico é notificado de imediato.



70

3.17.Controlo de Qualidade em Bioquímica Clínica

Controlo de Qualidade Interno (CQI)

O laboratório adotou o Sistema de Gestão da Qualidade (ISO 9001), Normas da

Ordem dos Farmacêuticos e Manual de Boas Práticas Laboratoriais.

O CQI avalia os métodos usados, através da análise de amostras controlo (com

valores conhecidos) com o objetivo de garantir a reprodutibilidade dos resultados, a

precisão das medições, monitorizar o estado do equipamento e reagentes. O CQI é

efetuado com base na construção de cartas de controlo, para os diferentes níveis de

controlo dos parâmetros, sendo que, para poder proceder à validação de um parâmetro

analisado, é necessário ter o controlo aceitável, de acordo com as regras de Westgard e

as necessidades do laboratório. Se os ensaios não cumprem com as regras definidas, o

programa produz alertas e neste caso é necessário proceder à identificação do problema

que pode ter a ver com lotes de reagentes, amostras degradadas, manutenção do

equipamento em falta, entre outros. (9,69)

O laboratório faz a monitorização do CQI através do programa Unity™, em que

avalia a performance de cada analito medido, com o objetivo de centralizar a informação

num único programa, para o qual todos os equipamentos exportam os dados. A calibração

e CQI dos equipamentos usados na Bioquímica encontram-se descritos na tabela 6.

Tabela 6(a). Calibração e CQI dos equipamentos usados na Bioquímica.

Equipamentos Calibração Controlo de Qualidade

Interno

GEM Premier 3000 Tem calibrações

automáticas, através do

sistema iQM™.

Quando se reinicializa um

analito desseleccionado

deve correr-se 2 níveis de

soluções de controlo.

Quando se muda o

cartucho passam-se 4

níveis. Tirando isso,

quando o equipamento

pede.

Clinitek ATLAS® Calibração com quatro

frascos de solução de

calibração quando se

introduz um novo rolo de

reagente e quando o

equipamento dá erro.

Há tiras de controlo

negativo e positivo para

todos os parâmetros,

passados todos os dias de

manhã.



71

Tabela 6(b). Calibração e CQI dos equipamentos usados na Bioquímica.

Avaliação Externa da Qualidade (AEQ)

A avaliação externa da qualidade avalia o desempenho dos sistemas analíticos de

um laboratório, por meio de programas interlaboratoriais realizados por uma entidade

externa. Ao participar nestes programas, o laboratório pretende assegurar que os

resultados que obtém para os diversos parâmetros analisados se aproximam do valor real,

através de comparação entre os laboratórios e promove a confiança nos resultados por

parte de todas as partes interessadas, nomeadamente pessoal do laboratório, utentes e

clínicos. (9,70)

O laboratório participa em programas de AEQ, nomeadamente o Esquema

internacional de Avaliação da Qualidade da Randox (RIQAS, do inglês, Randox

International Quality Assessment Scheme) e Programa Nacional de Avaliação Externa da

Qualidade (PNAEQ).

A execução dos ensaios é feita, sempre que possível, logo após receção das

amostras de modo a cumprir os requisitos de estabilidade e está sujeita aos mesmos

critérios de execução das amostras de rotina. Normalmente os resultados obtidos são

enviados por e-mail ou submetidos no site. Qualquer resultado inaceitável deve ser

investigado e as medições corretivas documentadas. (70)

Equipamentos Calibração Controlo de Qualidade

Interno

Dimension® Integrated

Chemistry System

Quando o lote de reagente

muda, quando a data de

calibração expira, quando

se adiciona um novo

método e quando a

lâmpada é mudada, para

alguns métodos

dependentes da luz.

System check diário. Todos

os dias, 1 nível de controlo

de manhã e outro diferente

no fim do turno.

Nas urinas, todos os dias 1

nível no inicio do dia.

São passados 3 níveis de

controlo após calibração.

VIDAS® Quando se muda o lote,

quando a validade expira.

Controlo semanal para

cada reagente (1 nível) e

quando há calibração.


Catarina Alves Microbiologia

72

4.Microbiologia

Sendo a Microbiologia uma área bastante vasta, os procedimentos, testes e

parâmetros a seguir referidos foram divididos de acordo com as seguintes áreas:

Bacteriologia, Micologia, Parasitologia e Virologia, sendo que o laboratório foca o

diagnóstico na área da Bacteriologia, pelo que as restantes áreas estão pouco

aprofundadas neste relatório.

É importante referir que as atividades realizadas nesta área requerem o uso de uma

Câmara de Segurança Biológica Classe II, que assegura a manutenção de ar na zona de

trabalho, protegendo o operador, o produto a analisar e o ambiente envolvente.

4.1.Equipamentos

4.1.1.VITEK®2

O VITEK®2 é um aparelho que realiza identificação de microrganismos e testes

de suscetibilidade aos antibióticos (TSA) in vitro, através de cartas VITEK (figura 5). O

sistema realiza uma combinação de reações químicas nas cartas de identificação, que

permite identificar o organismo em estudo. As cartas para TSA têm uma combinação de

fármacos para grupos de microrganismos, nomeadamente GP e GN. Após análise, as

estirpes são identificadas como sensíveis, intermédias ou resistentes. (71)

Figura 5. Equipamento VITEK®2. Adaptado de (71)

O TSA deve ser realizado para qualquer microrganismo que seja responsável por

um processo infecioso e em que seja necessária a toma de antibiótico, principalmente



73

quando a espécie em estudo é capaz de exibir resistência aos antimicrobianos utilizados

mais frequentemente. No caso das Pseudomonas, a carta é diferente da dos outros GP,

porque são bactérias produtoras de β-lactamases e já são resistentes a quase todos os β-

lactâmicos. (72)

Para a leitura das cartas é necessário realizar suspensões das colónias (com um

determinado valor da escala de MacFarland) em tubos colocados num suporte próprio,

que é depois colocado no aparelho.

4.1.2.BacT/ALERT® 3D

Aparelho utilizado para detetar a presença de microrganismos no sangue e fluidos

corporais estéreis. Os microrganismos metabolizam os substratos existentes no meio de

cultura, e se existir produção de CO2, a cor do fundo do frasco de hemocultura muda para

um tom mais claro. Caso a cor não se altere após 5 dias, a amostra é considerada negativa.

Caso positive, é realizada sementeira em meios de cultura apropriados.

Após leitura do código de barras, os frascos de hemocultura são colocados no

equipamento (figura 6), que contem quatro “gavetas” incubadoras, com capacidade de

incubação de 240 frascos de hemocultura. (73)

Figura 6.Equipamento BacT/ALERT® 3D. Adaptado de (73)

4.1.3.GenomEra CDX™ system

É um equipamento para testes rotineiros de ADN (ácido desoxirribonucleico) que

realiza testes de PCR (reação em cadeia da polimerase, do inglês, polymerase chain

reaction) em 50 minutos (figura 7). Não há necessidade de manipular reagentes de PCR



74

pois todos os reagentes estão incorporados nos chips de teste. O analisador lê

automaticamente os códigos de barras no inicio da análise. (74)

Figura 7. Equipamento GenomEra CDX™ system. Adaptado de (74).

No laboratório, o aparelho é utilizado para diagnosticar a presença de Clostridium

difficile toxinogénico em amostras de fezes.

Clostridium difficile é uma bactéria GP anaeróbia, formadora de esporos. Os

sintomas provocados pela bactéria são devido a duas toxinas, A e B. Este teste deteta de

forma rápida e específica o gene tcdB (gene que codifica a toxina B de Clostridium

difficile). (75)

4.2.Bacteriologia

As bactérias são organismos procariotas e unicelulares, que se reproduzem por

divisão assexuada. A parede celular bacteriana existe em duas formas: parede espessa

(GP) ou fina (GN) de peptidoglicano. Nas GN, a camada fina de peptidoglicano tem

sobreposta uma membrana externa. As bactérias têm 4 formas principais: redondas

(cocos), que se podem apresentar como única célula ou como aglomerados; alongadas

(bacilos), também como célula individual ou em cadeia; encurvadas (vibrião) ou

espiraladas. A relação entre a bactéria e o hospedeiro pode ocorrer como contaminação

ou colonização, devida a presença transitória ou contínua, respetivamente das bactérias

na superfície do organismo, sem invasão dos tecidos, ou pode ocorrer infeção, que implica

a colonização, multiplicação e invasão dos tecidos associada ou não a uma alteração do

estado normal do organismo. A maioria das bactérias não são sempre patogénicas,

estabelecendo doença sob circunstâncias bem definidas. A capacidade do laboratório no

diagnóstico das infeções está dependente das técnicas usadas, da qualidade da amostra

analisada, bem como dos meios de transporte da mesma até ao laboratório. (72,76)



75

4.2.1.Exame direto

Permite verificar a presença de elementos celulares e microrganismos. A amostra

é observada ao microscópio, após colocação da amostra entre lâmina e lamela. Este exame

pode ser realizado a fresco (observação em 40x) ou através do uso de corantes. Avalia

aspetos microscópicos, incluindo tamanho, forma e permite verificar as características

morfológicas através da afinidade para os corantes. (72,76)

Coloração pelo método de Gram

Gram é um método de coloração de microrganismos que ajuda no diagnóstico

rápido e presuntivo de uma doença infeciosa e consiste numa coloração diferencial que

separa os principais grupos de bactérias. (76,77)

Após fixação da lâmina com metanol, a amostra é exposta durante um minuto à

solução Violeta de Cristal, seguido de um minuto em solução Lugol, que forma complexo

com o anterior, devido à sua composição em iodo. O complexo iodo-violeta assim

formado é eliminado, durante a descoloração pelo álcool-acetona durante alguns

segundos, apenas para os GN, em função da composição química da parede (fina camada

de peptidoglicano). O último reagente, safranina, age como corante de contraste e atua

durante um minuto. Os GN coram de rosa/vermelho, os GP que não foram descorados

ficam violeta/roxo. Entre cada reagente, a lâmina deve ser passada por água. A sua

observação deverá ser feita na objetiva de 10x, para avaliar a qualidade geral da coloração

e presença de células. Os microrganismos devem ser observados em objetiva de 100x,

com óleo de imersão. (72,76,77)

Coloração pelo método de Kinyoun

Esta coloração é utilizada para identificar a presença de micobactérias ou outros

organismos álcool-ácido resistentes em amostras clínicas. Estas bactérias têm cadeias de

lípidos (ácidos micólicos) na sua parede, que as torna muito hidrofóbicas e lhes confere

impermeabilidade ao violeta de cristal e outros corantes básicos. (76)

Após fixação da lâmina com metanol, a fucsina fenicada é o primeiro reagente a

ser utilizado, que atua durante 5 minutos. É um corante vermelho que contem fenol e que

solubiliza os lípidos, de modo a ajudar o corante a penetrar nas células. De seguida é

usado um descolorante (álcool-acetona) durante 2 minutos. Apenas as bactérias álcool-

ácido resistentes coram de vermelho, pois o corante não é eliminado mesmo com



76

solventes álcool-ácidos. As outras bactérias ficam descoloradas, pois libertam o corante.

Estas últimas, são tratadas com azul de metileno, durante 2 minutos, corando de azul.

Entre cada reagente, a lâmina deve ser passada por água. A observação é realizada em

objetiva de 100x, com óleo de imersão. (72,76)

4.2.2.Exame cultural

A biologia das bactérias, a resposta imune do paciente à infeção, o local da infeção

e a qualidade dos meios de cultura utilizados influenciam o sucesso do exame cultural.

Os meios de cultura podem ser seletivos, não seletivos e diferenciais. Os meios seletivos

selecionam o tipo de bactéria a isolar, de acordo com as suas exigências nutricionais,

impedindo o desenvolvimento de outras bactérias e microrganismos. Os meios

diferenciais possibilitam a distinção entre bactérias, através de substâncias que alteram a

morfologia ou coloração das colónias, permitindo uma diferenciação presuntiva. São

também utilizados meios de enriquecimento, geralmente líquidos, com o objetivo de

enriquecer o conteúdo bacteriano da amostra. A sementeira deve ser realizada do meio

mais seletivo, para o menos seletivo. (72,76)

Os meios de cultura usados no laboratório de bacteriologia e respetivas

características, encontram-se em nas tabelas seguintes (tabelas 7,8 e 9).

Tabela 7. Meios de cultura sólidos não seletivos. Adaptado de (72,76).

Meio de cultura Características

CLED (Cistina-

Lactose -

Deficiente de

Electrólitos)

Meio diferencial usado para diferenciar microrganismos urinários

que fermentam a lactose (lac). Colónias lac(+) são amarelas.

Usado para cocos GP e bacilos GN, sendo que também podem

crescer leveduras. Além disso, limita a invasão por Proteus spp.,

devido à deficiência de eletrólitos.

Gelose Columbia

+ 5% de sangue de

Carneiro (GS)

Meio que facilita o crescimento de microrganismos exigentes e é

também usada para isolar organismos anaeróbios. O sangue

permite distinguir bactérias hemolíticas e não hemolíticas.

Gelose Schaedler

+ 5% de sangue de

carneiro (SCS)

Meio destinado à pesquisa de bactérias anaeróbias (estritas e

facultativas).

Gelose Chocolate

+ PolyViteX

(PVX)

Meio não seletivo obtido a partir da gelose Columbia, pelo

aquecimento da mistura com sangue (hemólise dos eritrócitos).

Crescimento de estirpes exigentes pertencentes aos géneros

Neisseria spp e Haemophilus spp. e Streptococcus pneumoniae.



77

Tabela 8(a). Meios de cultura sólidos seletivos. Adaptado de (72,76).


Gelose Chocolate

PolyViteX

VCAT3 (VCA)

Meio seletivo com antibióticos e antifúngicos na sua composição,

que permite o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria

meningitidis

Gelose

MacConkey

(MCK)

Meio seletivo e diferencial para isolamento de bacilos GN. É

observada a fermentação da lactose – colónias rosas ou vermelhas,

por vezes contornadas por um halo de sais biliares. As colónias lac

(-) são beges ou incolores. A seletividade em relação às GP é

conseguida pelos sais biliares e pelo cristal violeta.

Gelose Hektoen

(HEKT)

Meio diferencial para pesquisa de Salmonella spp. e Shigella spp.

nas fezes. Os sais biliares inibem os GP. Os microrganismos que

produzem sulfeto de hidrogénio (H2S) (a maioria das Salmonella)

originam colónias com centro negro. Os que fermentam um dos

açúcares presentes no meio originam colónias amarelas ou

amarelas-salmão, os que não fermentam, verdes ou azuis-

esverdeadas (Salmonella spp. e Shigella spp.)

Gelose Chapman

2 (MS)

Meio manitol salgado, destina-se ao isolamento seletivo de

Staphylococcus spp, que podem crescer na presença de

concentrações elevadas de sais como o cloreto de sódio. Os

microrganismos que fermentam o manitol originam colónias

amarelas por acidificação do meio (identificação presuntiva de

S.aureus).

Gelose

Campylosel

(CAM)

Meio seletivo com antifúngicos e antibióticos, para o isolamento

dos Campylobacter intestinais (C.jejuni e C.coli). Colónias,

achatadas, acinzentadas e irregulares, que crescem em atmosfera

de microaerofilia.

Gelose Chocolate

Haemophilus 2

(HAE2)

Isolamento seletivo de Haemophilus spp. Contém uma base

nutritiva, à qual são associados antibióticos e antifúngicos que

inibem a maioria das bactérias GP e leveduras.

Gelose Granada™

(GRAN)

Meio seletivo cromogénico usado na identificação de

Streptococus agalactiae nas mulheres grávidas e recém-nascidos.

Observação de colónias laranja, que se deve ao próprio pigmento

do microrganismo.

Gelose Columbia

ANC + 5% de

sangue de

carneiro (CNA)

Isolamento das bactérias exigentes. Contem ácido nalidíxico e

colistina, que inibem o crescimento das Enterobacteriaceae e

Pseudomonas spp., pelo que a maioria das GN são inibidas,

tornando o meio seletivo para GP. Deteção das hemólises devido

à presença do sangue de carneiro.



78

Tabela 8(b). Meios de cultura sólidos seletivos. Adaptado de (72,76).


Gelose

chromID®MRSA

SMART (MRSA)

Meio cromogénico destinado à pesquisa de estirpes de S.aureus

resistentes à meticilina (colónias rosa a vermelho). A mistura

seletiva permite inibir a maioria das bactérias GN e GP não

pertencentes ao género Staphylococcus, bem como leveduras e

bolores.

Gelose

chromID™ VRE

(VRE)

Meio cromogénico seletivo, destinado à deteção de Enterococcus

faecium e E.faecalis, nos doentes de risco que apresentam uma

resistência adquirida à vancomicina, bem como a distinção entre

os dois. E.faecium apresenta colónias violeta (estirpes produtoras

de β-galactosidase. E.faecalis apresenta colónias verdes (estirpes

produtoras de α-glucosidase).

Tabela 9. Meios líquidos de enriquecimento. Adaptado de (72,76).


Caldo Coração –

Cérebro (BHI)

Caldo de enriquecimento, crescimento de microrganismos

exigentes.

Caldo Todd-

Hewitt +

Antibióticos

(TODD)

Caldo de enriquecimento seletivo para a deteção de estreptococos

do grupo B na mulher grávida. Após enriquecimento, deve ser

repicado em meios destinados à deteção dos estreptococos.

Caldo Selenito Caldo de enriquecimento para Salmonella spp. a partir das fezes.

O selenito de sódio inibe a maioria das Enterobacteriaceae,

incluindo algumas estirpes de Shigella spp. Após o

enriquecimento, deve ser repicado em meios destinados à deteção

da Salmonella spp. (Hektoen)

Meio seletivo para

Trichomonas

Meio rico em nutrientes que oferece as condições de crescimento

ideais para Trichomonas vaginalis.

Todas as placas semeadas devem estar devidamente identificadas no verso com o

nome e número do doente, tipo de produto e data da sementeira.

Todos os produtos à exceção das urinas são semeados dividindo a placa em quatro

quadrantes: é realizado o inóculo no primeiro quadrante e de seguida preenchem-se os

restantes três quadrantes com a ansa de plástico descartável. Nas urinas, é utilizada uma

ansa de 10µl, que é mergulhada na urina e a gota é depositada na placa. É feita uma estria

vertical e depois 8-10 estrias horizontais começando onde a gota foi depositada (figura

8).



79

Figura 8. Esquema da sementeira das urinas.

4.2.3.Geradores de atmosfera e caixas de incubação

Nalguns casos, como por exemplo, na incubação de gelose Schaedler + 5% de

sangue de carneiro (SCS), é necessário utilizar saquetas que produzem atmosfera

adequada ao crescimento dos microrganismos que crescem na gelose. Os geradores

utilizados, GENbox, permitem obter as diferentes atmosferas necessárias para a cultura

de microrganismos patogénicos em laboratório (tabela 10). As concentrações de

compostos gasosos obtidos nas caixas, são ajustados pelas quantidades de compostos

químicos que absorvem o oxigénio e libertam o dióxido de carbono contido em cada

saqueta. (78)

Tabela 10. Tipos de atmosferas para cultura microbiológica. Adaptado de (78).

Anaerobiose Microaerofilia Atmosfera de

CO2

Concentração de

Oxigénio

<0,1% após 2.5h De 6,2% a 13,2%

após 1h

Indisponível

Concentração em

dióxido de carbono

>15% após 24h De 2,5% a 9,5% após

24h

De 3,5% a 9,0%

após 24h



80

4.2.4.Procedimentos para diagnóstico bacteriológico

4.2.4.1Aparelho urogenital

Urina

A amostra a ser utilizada é a urina do jato médio. As bactérias potencialmente

patogénicas colonizam a uretra, pelo que o primeiro jato de urina deve ser descartado.

(76) Também pode ser analisada amostra de punção supra-púbica, tubo de algália ou saco

coletor pediátrico.

Procedimento

É colocada amostra num tubo de centrifuga, e após centrifugação durante 5

minutos a 1500 rpm, é feita observação do sedimento urinário, colocando uma gota entre

lâmina e lamela. A observação é feita com objetiva 40x. O exame corado pode ser

realizado se solicitado.

Através de uma ansa calibrada de 1µL é realizada sementeira em gelose Cistina

Lactose Deficiente em Eletrólitos (CLED), com incubação a 37ºC, 18-24h em aerobiose.

Valorização dos resultados

As infeções urinárias mais comuns são pielonefrites (infeção do parênquima renal)

e cistites (infeção das vias urinárias baixas), sendo que as infeções agudas do aparelho

urinário são geralmente causadas por flora saprófita que invade por via ascendente através

da uretra. Vários fatores podem contribuir para a infeção das vias urinárias,

nomeadamente a suscetibilidade do hospedeiro devida a diabetes, gravidez, estase ou

obstrução urinária, doenças sexualmente transmissíveis, entre outros. O organismo mais

comumente associado a estas infeções, é a Escherichia coli, apesar de outros

microrganismos também poderem ser responsáveis, nomeadamente Pseudomonas spp.,

Staphylococcus aureus e Enterococcus spp. (72,76)

Na valorização dos resultados, deve ter-se em conta o método pelo qual a urina

foi colhida, o tipo de doente, idade, entre outros parâmetros. A observação do sedimento

é muito importante, sendo que a leucocitúria constitui o principal marcador da infeção.

(72)

São avaliados em vários campos a presença de eritrócitos (apenas mencionados se

vistos), leucócitos e células, com os seguintes níveis:



81

0-5 Raras

5-10 Algumas

>10 Muitas

No exame cultural é feita a observação das placas e efetuada a valorização das

amostras de acordo com o número de células epiteliais, de leucócitos e com a contagem

de colónias:

<104UFC/ml

104 UFC/ml –105UFC/ml

>105 UFC/ml

Valores superiores a 105 são sempre valorizados, valores entre 104 –105 são

valorizados de acordo com o sedimento: no caso de culturas mistas, faz-se ou não o estudo

das colónias, dependendo do número de leucócitos e células e do tipo de amostra. Em

culturas polimicrobianas com alguns ou muitos leucócitos, aconselha-se repetição de

colheita, se clinicamente justificável. No caso das crianças, o exame bacteriológico da

urina pode originar resultados falsamente positivos, devido à urina colhida por saco

coletor. Se necessário, pede-se nova colheita, para confirmação de resultados. No caso de

placa negativa com muitos leucócitos, realiza-se coloração do sedimento por Gram para

verificar a presença de bactérias, caso positivo, volta-se a semear a placa. A presença de

células indica colonização/contaminação, por outro lado, a presença de leucócitos indica

infeção. Qualquer desenvolvimento bacteriano em cultura pura, que não seja resultante

de contaminação pela flora comensal, de amostras colhidas por punção supra-púbica, são

valorizados. A estirpe valorizada é isolada em cultura pura para posterior identificação e

TSA.

Exsudado vaginal

Procedimento

Com a zaragatoa colocada em meio de transporte com carvão:

o É semeado gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro (GS) – Incubação

a 37ºC, aerobiose, 48h, observação diária (OD)

o É semeado gelose Chocolate PolyViteX VCAT3 (VCA) – Incubação a

37ºC, 5% CO2, 72h, OD



82

Com a zaragatoa seca é realizado um esfregaço e este é corado por Gram.


Os agentes bacteriológicos mais comumente pesquisados nas secreções vaginais

são Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma

hominis e Ureaplasma urealyticum. Nas mulheres, estas infeções podem causar secreções

mucosas e ulcerações, desconforto, dor e ardor e inserem-se em duas categorias

principais: infeções por organismos patogénicos de transmissão sexual, nomeadamente

Neisseria gonorrhoeae (visíveis no Gram como diplococos GN e com crescimento no

VCA) e Chlamydia trachomatis (causadoras de uretrite) e infeções por microrganismos

endógenos, que se tornam patogénicos devido a desequilíbrio da fora saprófita, como a

vaginose provocada por Gardnerella vaginalis que se apresenta no Gram como células

epiteliais com “pontinhos” e ausência de bacilos de Doderlein. (72,79)

Streptococcus agalactiae, colonizam a mucosa genito-urinária, e provocam

infeções urinárias na mulher grávida e meningite no recém-nascido pelo que são

valorizados em mulher em idade fértil, quando isolados da GS. (72)

No esfregaço corado por Gram valorizam-se células epiteliais (observação de

muitas células significa que o esfregaço foi bem feito), bacilos de Doderlein (observados

em mulheres em idade fértil) e leucócitos, segundo os níveis:

0-5 Raras

5-10 Algumas

>10 Muitas

A estirpe valorizada, em função do exame direto corado e do crescimento em

cultura, é isolada para posterior identificação e TSA.

Exsudado uretral

Procedimento

Com a zaragatoa colocada em meio de transporte com carvão:

o É semeado VCA – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 72h, OD

Com a zaragatoa seca é realizado um esfregaço e este é corado por Gram.




83

À semelhança da mulher, os agentes Neisseria gonorrhoeae (visíveis no Gram

como diplococos GN e com crescimento em VCA), Chlamydia trachomatis, Mycoplasma

hominis e Ureaplasma urealyticum, são responsáveis por causar infeções genitais, sendo

que os dois primeiros originam a maioria dos casos de uretrite nos homens. Nos homens,

a infeção pode causar secreção uretral, dor na micção e inchaço doloroso. (79)

A estirpe valorizada é isolada, identificada e é realizado o TSA.

Rastreio de Streptococcus agalactiae na gravidez

Os S.agalactiae colonizam a mucosa genito-urinária e são responsáveis por

infeções graves no recém-nascido (meningite) e septicémia neonatal, pelo que a sua

deteção é muito importante para a prevenção e tratamento da infeção. Grávidas

colonizadas fazem antibiótico. (72,76)

A amostra a analisar consiste numa zaragatoa vaginal e numa zaragatoa retal, sem

meio de transporte.

Procedimento

As duas zaragatoas são colocadas em caldo Todd-Hewitt + antibióticos (TODD)

com antibióticos na estufa a 37ºC. Após 18-24h, é feita passagem para meio Granada

anaerobiose e incubado a 18-24h.


São inspecionadas as colónias sugestivas (laranjas) no meio Granada. Se

estiverem presentes, é necessário reisolamento para gelose Columbia ANC + 5% de

sangue de carneiro (CNA) pois não se faz TSA do meio cromogéneo.

Teste rápido para pesquisa de Clamydia trachomatis

A Clamydia trachomatis é uma das maiores causas de infeção transmitida

sexualmente. A transmissão vertical da bactéria tem complicações graves no recém-

nascido, nomeadamente conjuntivite e pneumonia. A maioria das infeções na mulher são

assintomáticas, mas podem ser sintomáticas e originam cervicite, endometrite e uretrite,

entre outras manifestações clínicas. No homem, muitos casos de uretrite e epididimite são

causados por Clamydia trachomatis e cerca de 25% das infeções no homem são

assintomáticas, sendo que os pacientes assintomáticos constituem um problema para a

disseminação da doença. É utilizado um dispositivo de teste rápido imunocromatográfico



84

para deteção qualitativa do antigénio da bactéria em amostras de esfregaços vaginal,

uretral e urina masculina. (76,79,80)

Procedimento

A amostra é adicionada a um tubo contendo dois reagentes. No caso de ser uma

zaragatoa, esta é introduzida e rodada contra a parede. São colocadas três gotas no

dispositivo de teste.

O teste contem o anticorpo específico do antigénio da bactéria a revestir a região

da linha de teste e partículas revestidas com o anticorpo. Durante o teste, a solução do

antigénio extraído reage com as partículas e a mistura migra para reagir com o anticorpo

sobre a membrana na linha de teste. Após 10 minutos é lido o resultado, que será positivo

quando aparecem duas linhas coloridas, uma no controlo e outra na região da linha de

teste. (80)

Teste para pesquisa de micoplasmas urogenitais

O trato genital é colonizado com espécies de Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp.

M. hominis pode causar pielonefrite, febre pós-parto e infeções sistémicas em pacientes

imunocomprometidos. U. urealyticum pode causar uretrite, pielonefrite e aborto

espontâneo ou parto prematuro. No entanto, a deteção de micoplasmas no trato genital

não é necessariamente equivalente a infeção, devendo ser tida em conta a situação clínica

do paciente. (76)

Este kit permite a identificação de Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma

hominis em amostras endocervicais e uretrais colhidas com zaragatoa, urinas e sémen e

baseia-se em propriedades metabólicas especificas das espécies e resistências. No caso

do U. urealyticum, testa a hidrólise da ureia e resistência à lincomicina e no M. hominis,

a hidrólise da arginina e resistência à eritromicina. (81)

Procedimento

Regenera-se um meio de cultura do kit com o meio de transporte inoculado e

adiciona-se esta mistura aos poços do teste que correspondem a um controlo de

crescimento, identificação de U. urealyticum, identificação de M. hominis, teste de

resistência à lincomicina e teste de resistência à eritromicina. É adicionada parafina aos

poços e o teste é colocado na estufa a 37ºC durante pelo menos 24h. O crescimento destas



85

espécies é visualizado por mudança de cor do indicador de pH de amarelo-laranja para

vermelho ou rosa (alcalino). (81)

4.2.4.2.Aparelho circulatório

Hemoculturas

Uma hemocultura corresponde a sangue colhido por punção venosa de veia

periférica, para dois frascos de hemocultura, um de aerobiose e outro de anaerobiose.

Procedimento

O frasco é conservado em estufa a 37ºC ou à TA até ser colocado no bacT/ALERT

(permanece neste equipamento durante 5 dias), até um máximo de 2h. No caso do

resultado dado pelo equipamento ser positivo, com uma agulha na tampa do frasco, são

colocadas duas gotas em lâmina (corada posteriormente por Gram) e duas gotas no meio

de cultura (GS), com incubação a 37ºC durante 24h. Este passo é sempre repetido ao 5º

dia, caso o frasco tenha positivado antes, independentemente do resultado obtido na

primeira passagem. Se for o frasco de anaerobiose que positivou, para além da GS, é

semeado SCS, com incubação a 37ºC, aerobiose, 24h.


As doenças infeciosas podem decorrer com bacterémia transitória, intermitente

(infeções localizadas) ou persistente (infeções intravasculares como endocardite).

Septicémia corresponde a bacterémia acompanhada de um estado infecioso grave,

condicionada por descargas massivas e repetidas de bactérias no sangue. Como o sangue

é um produto biológico estéril, o isolamento de um microrganismo a partir de uma

hemocultura é quase sempre valorizado. (72,76,79)

Os bacilos GN entéricos são as causas mais comuns de choque sético, apesar de

poder ocorrer devido a uma gama ampla de microorganismos. Endocardite pode ocorrer

devida a Streptococcus viridans, Enterococcus spp e Staphylococcus aureus, sendo que

este último é o agente mais comum de miocardite e pericardite. (76,79)

O fator mais importante que determina o sucesso deste teste é o volume de sangue

colhido, porque a concentração dos microrganismos é baixa na maioria das bacterémias,

principalmente se o doente está a tomar antibiótico. A colheita não deve ser efetuada no

pico febril e a assepsia da pele do paciente é importante, para não ocorrer contaminação

com bactérias que colonizam a pele, como Staphylococcus coagulase negativos, pelo que



86

estes podem contaminar o sangue, se a hemocultura não for colhida em condições de

assepsia. (72,76)

Podem ocorrer falsos positivos no aparelho, pelo que apenas se dá um resultado

positivo quando se verifica também crescimento na placa e bactérias no Gram. No

esfregaço corado por Gram, os Staphylococcus apresentam-se de cor roxa/azulada (são

GN) e em “cacho”. Faz-se um teste da coagulase para distinguir entre Staphylococcus

aureus ou Staphylococcus coagulase negativos (presentes à superfície da pele). Estes

últimos apenas são valorizados se presentes nos quatro frascos de hemocultura (2 pares),

caso contrário, indicam contaminação. Caso seja observada qualquer outra bactéria no

esfregaço, o médico é logo notificado. A estirpe valorizada é isolada e procede-se à

identificação e TSA de uma das placas.

Cateteres vasculares

Normalmente o cateter vem a acompanhar a hemocultura e pretende-se avaliar

a possibilidade deste ser responsável por um quadro de bacterémia. (72)

Procedimento

O cateter é colocado na superfície de uma placa de GS e com o auxílio de uma

pinça esterilizada, é rodado na superfície do meio, de modo a que a ponta passe por todo

o meio de cultura. A incubação é feita a 37ºC, 48h, em aerobiose.


Se apenas o primeiro frasco de hemocultura (colhido antes da retirada do cateter)

e o cateter estiverem positivos, significa que o cateter estava infetado.

Se o crescimento for superior a 15 colónias de apenas um tipo, é valorizado e

identificado com realização de TSA. Apenas não se valorizam contaminantes da pele,

como S. coagulase negativos, a não ser que as quatro hemoculturas que o acompanham

sejam positivas para esta bactéria. Não se valoriza quando estão presentes mais do que

dois tipos diferentes de colónias.

4.2.4.3.Aparelho digestivo

Fezes

Procedimento



87

A amostra é semeada nos seguintes meios:

o gelose MacConkey (MCK): incubação a 37ºC, 48h, aerobiose

o gelose Hektoen (HEKT): incubação a 37ºC, 48h, aerobiose

o gelose Campylosel (CAM): incubação a 37ºC, 5 dias, microaerofilia

o Caldo Selenito: Incubação a 37ºC, 18-24h, aerobiose – Após 24h de

incubação, são efetuadas subculturas do meio de selenito para HEKT

(caldo Selenito é meio de enriquecimento de Salmonella)


Uma grande variedade de bactérias pode causar infeções gastrointestinais, que têm

uma alta incidência na população em geral, principalmente em crianças e idosos. (67)

Os agentes bacteriológicos mais comuns causadores de gastroenterite são

Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., E. coli, Vibrio cholerae e Bacillus

cereus. Staphylococcus aureus e Bacillus cereus são responsáveis por intoxicações

alimentares. (76)

Muitas bactérias patogénicas e não patogénicas estão presentes nas fezes, pelo que

os antecedentes epidemiológicos, presença de sinais e sintomas clínicos e o tipo de

diarreia, são fatores que devem orientar na pesquisa do agente. Pode ocorrer diarreia

aquosa devido a enterotoxinas de bactérias como Escherichia coli enterotoxigénica ou as

fezes podem apresentar-se sangrentas e mucoides devido a bactérias invasivas como

Shigella spp. (72,76,79)

No meio MCK são valorizadas colónias que não fermentam a lactose (incolores),

que poderão ser Shigella ou Salmonella. No meio HEKT é valorizada a presença de

colónias azuis esverdeadas (não fermentam os açúcares presentes no meio) e colónias

com centro negro (bactérias que produzem sulfeto de hidrogénio), que identifica

presuntivamente Shigella e Salmonella. No meio CAM, a presença de colónias achatadas,

pequenas, acinzentadas que crescem em atmosfera de microaerofilia, identifica

Campylobacter intestinais (C.jejuni e C.coli).

A estirpe valorizada é isolada para posterior identificação e TSA.

Teste sangue oculto fecal

Na secção de microbiologia é também realizado um teste rápido

imunocromatográfico para pesquisa de sangue oculto fecal, que ajuda ao diagnostico de



88

doenças gastrointestinais que não apresentam sintomas visíveis, como colites ou cancro

do cólon.

Procedimento

Desenroscar e retirar o bastão da recolha da amostra e mergulhar o bastão em seis

lugares diferentes na amostra de fezes. Em seguida, colocar o bastão no dispositivo da

amostra e enroscar. Agitar, quebrar a ponta e colocar 3 gotas da amostra na cassete.

A amostra irá reagir com a membrana na região da linha de teste, que é coberta

com anticorpo anti-hemoglobina. A mistura migra cromatograficamente, por cima da

membrana, para reagir com o anticorpo, gerando uma linha colorida. (82)

Teste rápido C. Difficile

Este teste rápido consiste num ensaio imunoenzimático para a deteção simultânea

do antigénio glutamato desidrogenase e das toxinas A e B do Clostridium difficile, em

amostras de fezes. (83)

Este agente constitui uma causa significativa de doença gastrointestinal e apesar

de poder ser cultivado em cultura, a maneira mais específica para diagnosticar a infeção

é através da deteção de toxinas responsáveis pela doença. Muitos casos das formas mais

leves de doença gastrointestinal e a maioria dos casos de colite pseudo-membranosa são

causadas por estirpes toxinogénicas desta bactéria. (76,83)

As estirpes toxinogénicas produzem as duas toxinas, ou apenas a toxina B. O

glutamato desidrogenase é um bom marcador pois é produzido em grandes quantidades

por todas as estirpes. (83)

Procedimento:

É adicionada amostra ao tubo com os reagentes (diluente e conjugado composto

por anticorpos da enzima e das toxinas com peroxidase de rábano) com incubação durante

15 minutos à temperatura ambiente. Durante este tempo, a glutamato desidrogenase ou

toxinas na amostra ligam-se aos conjugados e ocorre migração para uma membrana onde

são capturados pelos anticorpos imobilizados na linha de teste. Uma linha na janela do

antigénio significa que bactéria está presente na amostra e as linhas na área das toxinas

indica se a estirpe é toxinogénica. Para validação do resultado, é necessário a visualização

da linha também na janela do controlo. (83)



89

4.2.4.4.Aparelho respiratório

As infeções das vias respiratórias são muito frequentes, mas nem sempre são de

origem bacteriana. O aparelho respiratório superior apresenta uma flora bacteriana

comensal abundante, constituída por aeróbios e anaeróbios. Vários agentes patogénicos

como S.pneumoniae podem estar presentes e ser isolados como flora transitória ou em

pequeno número. (72)

Exsudado faríngeo

Procedimento

A sementeira é realizada em GS e a placa colocada na estufa a 37ºC, em atmosfera

com CO2, com observação às 24h e 48h.


O agente bacteriológico causador principal de faringite bacteriana é o

Streptococcus pyogenes (S. β-hemolítico do grupo A), mas outras bactérias podem causar

faringite, nomeadamente Neisseria gonorrhoeae, Corynebacterium diphtheriae e

Mycoplasma pneumoniae, que normalmente necessitam de técnicas ou meios especiais

para o seu isolamento. (72,76,79)

A estirpe valorizada é isolada para posterior identificação e TSA.

Expetoração /Secreções brônquicas/LBA

Procedimento

Para exame direto é selecionada uma porção purulenta da amostra e são realizados

dois esfregaços, em que um é corado por Gram e outro por Kinyoun (no caso do LBA, a

amostra deve ser centrifugada durante 15minutos a 1500 rpm e usado o sedimento). O

primeiro deve ser observado ao microscópio em objetiva de 10x, de modo a avaliar a

qualidade da amostra em cerca de 10 campos, tendo em conta a presença de células

epiteliais da orofaringe e leucócitos. Este procedimento normalmente não é necessário no

LBA.

Para exame cultural, devem ser semeados os seguintes meios:

o GS – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 48h;

o gelose Chocolate Haemophilus 2 (HAE2) - Incubação a 37ºC, 5%CO2,

48h;



90

o MCK - Incubação a 37ºC, 48h.


As amostras do trato respiratório inferior devem ser analisadas

microscopicamente, pois pode ocorrer contaminação por bactérias das vias aéreas

superiores. (76)

O exame bacteriológico de secreções respiratórias purulentas deve ser sempre

realizado em casos de bronquite aguda. Os agentes bacterianos mais comuns que causam

bronquite são a Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae e Streptococcus

pneumoniae. Os agentes mais comuns de pneumonia são Streptococcus pneumoniae,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. (76,79)

No caso da expetoração e secreções brônquicas é feita primeiramente a verificação

da qualidade da amostra, através do exame direto corado por Gram (na objetiva de 10x).

Uma má amostra (maioritariamente saliva) é caracterizada por várias células epiteliais

(>10/campo) e bactérias diferentes. Neste caso, é uma amostra conspurcada, e sugere-se

repetição de colheita, independentemente do que se encontrar. A presença de leucócitos

é a favor de infeção bacteriana e um tipo de bactéria em predomínio na cultura deve ser

isolada e identificada. Na lâmina corada por Kinyoun é avaliada a presença de bacilos

álcool-resistentes, nomeadamente Mycobacterium.

A valorização do crescimento bacteriano é realizada em função da história clínica

do doente, dos exames corados e do crescimento em cultura. A estirpe valorizada é isolada

em cultura pura, para posterior identificação e TSA.

4.2.4.5.Líquidos orgânicos

LCR

Procedimento

A amostra é centrifugada 15 minutos a 2000rpm. O sedimento é utilizado para

preparar dois esfregaços, um corado por Gram e outro por Kinyoun e semear:

o GS – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 72h, com observação diária,

o gelose Chocolate + PolyViteX (PVX) – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 72h,

com observação diária,



91

o caldo Coração-Cérebro (BHI) – Incubação a 37ºC, 72h, aerobiose, com

observação diária. Caso apresente turvação, fazer passagem para meio

sólido (GS).


Normalmente, o LCR para diagnóstico microbiológico, é analisado quando há

desconfiança de meningite ou encefalite, sendo que esta última é principalmente

provocada por agentes virais. Os principais agentes de meningite bacteriana são

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis. Outros

agentes como Streptococcus do grupo B e Listeria monocytogenes são também

comumente observados. A meningite bacteriana não tratada é geralmente fatal, pelo que

o diagnóstico e determinação do agente bacteriano é urgente. Geralmente, bactérias

aeróbias causam esta infeção, mas se existir um abcesso cerebral o agente etiológico pode

ser uma bactéria anaeróbia. (76,79)

Na valorização dos resultados, deve ter-se em conta o exame citoquímico, se é

patológico ou não, nomeadamente a presença de leucócitos. Todas as bactérias presentes

no meio de cultura devem ser identificadas, sendo que o LCR é um líquido estéril, com

posterior realização de TSA. A observação de esfregaço corado é importante, e qualquer

resultado positivo deve ser comunicado ao médico imediatamente.

Outros líquidos orgânicos (pleurais, ascíticos, pericárdicos, sinoviais, bílis)

Procedimento

Os líquidos límpidos devem ser concentrados por centrifugação (15 minutos a

1500 rpm) e as amostras purulentas podem ser inoculadas diretamente nos meios de

cultura. Do sedimento preparar dois esfregaços, corados por Gram e Kinyoun e semear:

o GS – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, com observação diária;

o MCK (líquido ascítico ou bílis) – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, com

observação diária;

o BHI – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, com observação diária (passagem

para os meios sólidos se apresentar turvação),

o PVX (líquido pleural) – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 48h.

Se o produto for enviado em meio de transporte adequado para anaeróbios, deve

ser feito exame cultural, com sementeira em SCS e incubação a 37ºC, em anaerobiose, 5

dias, com observação de 48/48h.



92

O produto poderá também ser enviado em frasco de hemocultura, mas este deve

ser acompanhado de outra amostra colhida para recipiente esterilizado seco, com tampa

de rosca ou em meio de transporte próprio, de modo a poder ser realizado o exame direto.

Do frasco de hemocultura, são feitas passagens às 48h:

o GS – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, OD;

o MCK (líquido ascítico ou bílis) – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, OD;

o VCA e HAE2 (líquido auricular) – Incubação a 37ºC, 5% CO2, 48h, OD;

o HAE2 (liquido pleural) - Incubação a 37ºC, 5% CO2, 48h, OD.


Uma variedade de fluidos, normalmente estéreis, podem ser colhidos para a

cultura bacteriológica. Tal como no LCR, estes líquidos são estéreis, pelo que quaisquer

microrganismos encontrados devem ser estudados e comunicado ao médico de imediato.

Muitos microrganismos estão associados a infeções nestes locais, incluindo misturas

polimicrobianas de organismos aeróbios e anaeróbios, pelo que a coloração é útil para

identificar os organismos responsáveis pela infeção. (72,76)

A estirpe valorizada é isolada em cultura pura, para posterior identificação e TSA.

4.2.4.6.Pele e tecidos

Exsudado purulento

Procedimento

No caso de amostra colhida com seringa, faz-se exame direto corado com Gram e

Kinyoun.

Para amostra colhida com seringa e amostra em zaragatoa são semeados:

o GS -Incubação a 37ºC, 48h, aerobiose;

o Manitol Salgado (gelose Chapman 2) (MS) - Incubação a 37ºC, 48h,

aerobiose;

o MCK - Incubação a 37ºC, 48h, aerobiose

o BHI - Incubação a 37ºC, 48h, aerobiose, OD e com passagem para CNA,

MCK e MS se apresentar turvação.

o SCS – Incubação a 37ºC, 5 dias, anaerobiose (se for solicitado exame

cultural de anaeróbios)



93


Da amostra colhida em zaragatoa não se faz exame direto, porque é difícil obter

uma amostra representativa sem contaminação por organismos colonizadores da

superfície, nomeadamente Staphylococcus coagulase negativos. (76)

Muitos são os agentes bacterianos que podem ser detetados em infeções da pele e

tecido celular subcutâneo, nomeadamente Enterobacteriaceae, Enterococcus spp,

Staphylococcus aureus, entre outros. (72) Como existem muitos organismos envolvidos

na formação de exsudados purulentos, é importante ter em conta o local da infeção, a

história clinica, o tipo de infeção e o tipo de colheita. (72,76)


Exsudado auricular ou ocular

Procedimento

São semeados:

o Os meios anteriores (exsudado purulento);

o HAE2 – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 48h;

o Recém-nascido: acrescentar VCA com incubação a 37ºC, 5% CO2, 48h.


O canal auditivo externo reflete os microrganismos existentes na pele. As infeções

do ouvido externo são normalmente causadas por P.aeruginosa ou S.aureus. Infeções do

ouvido médio são normalmente causadas por S.pneumoniae, H.influenzae (com

crescimento no meio HAE2) e M.catarrhalis. (76)

Os agentes mais comuns de infeção da conjuntiva ocular são S. aureus,

S.pneumoniae, H.influenzae, P. aeruginosa, que causam infeções externas como

conjuntivite ou querarite, infeções das estruturas internas (endoftalmite) e infeções do

sistema lacrimal. No recém-nascido, Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae

(com crescimento no VCA) são agentes de conjuntivite. (72,76)


4.2.4.7.Estudos de colonização

Quando doentes entram no hospital para ser internados, mas nos últimos três

meses tiveram contacto com instituições de saúde, é realizado um estudo para verificar



94

se estão colonizados com microrganismos multirresistentes, que são uma preocupação

para os cuidados de saúde, sendo responsáveis por infeções nosocomiais. A deteção de

portadores destas bactérias é importante para a prevenção e seguimento epidemiológico

destas infeções. (76,79)

Para este teste são colhidas duas zaragatoas, uma de exsudado nasal e outra de

exsudado perianal, colocadas em meio de transporte.

Procedimento

A zaragatoa nasal é semeada em meio cromogénico MRSA (Staphylococcus

aureus meticilina-resistentes, do inglês, methicillin-resistant Staphylococcus aureus) e as

zaragatoas perianais são semeadas em MRSA, meio cromogénico VRE (Enterococcus

spp. vancomicina-resistentes, do inglês, vancomycin-resistant Enterococcus) e MCK,

com incubação a 37ºC em aerobiose, durante 48h.


Para pesquisa das estripes MRSA são valorizadas as colónias rosa; em caso de

dúvida, efetua-se o teste da coagulase para confirmar a identificação de S.aureus. No meio

VRE são valorizadas as colónias roxas (Enterococcus faecium) e colónias verdes

(Enterococcus faecalis), que apresentam resistência adquirida à vancomicina. No MCK,

é valorizada a presença de Acinetobacter spp multirresistentes (colónias beges ou

incolores que não fermentam a lactose). Neste caso, a estirpe valorizada é isolada em

cultura pura para posterior identificação e TSA. (76,79)

4.2.5.Identificação de bactérias

Teste da Catalase

A catalase é uma enzima que catalisa a formação de água e oxigénio, a partir de

peróxido de hidrogénio. A presença ou ausência da atividade desta enzima é um teste

usado para subdividir os vários géneros de cocos GP. A presença da enzima pode ser

verificada através da colocação de uma gota de peróxido de hidrogénio em cima de uma

colónia e observar a formação de bolhas de ar. (72,76)



95

Teste da Coagulase

É uma enzima produzida principalmente pelo S.aureus. (72,76) Este teste é usado

na identificação presuntiva desta espécie, diferenciando-a das outras espécies não

produtoras de coagulase, a partir de colónias isoladas.

No laboratório é utilizado um kit, em que o precipitado formado pela junção do

reagente com a colónia, indica a presença da enzima.

Teste da Oxidase

As bactérias que produzem esta enzima apresentam um sistema de transporte de

eletrões e as enzimas atuam como elo final na cadeia de respiração aeróbia transferindo

eletrões para o oxigénio. É utilizado para diferenciar o género Neisseria (oxidase positivo)

de outros cocos GN e para distinguir a família das Enterobacteriáceas (oxidase negativo)

de outros bacilos GN. (72,76) É utilizado um corante que substitui o oxigénio como

aceitador artificial de eletrões, colocado sobre as colónias, que desenvolvem uma cor

azulada caso tenham a atividade da enzima.

Teste da Optoquina

Esta substância inibe o crescimento de Streptococcus pneumoniae. A estirpe em

estudo é inoculada numa placa com meio agar sangue e um disco saturado com optoquina,

colocado no centro do inóculo. Após incubação, durante cerca de 18h, verifica-se a

presença de um halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco. (72,76)

4.2.5.1.Identificação de cocos GP

Staphylococcus spp.

São cocos GP que se apresentam normalmente em cacho/tétradas, mas podem

também aparecer como células únicas, pares ou cadeias curtas. São catalase positivos. A

maioria dos Staphylococcus são imóveis, anaeróbios facultativos. Estas bactérias estão

presentes na pele e membranas mucosas e são importantes patogéneos na medida em que

causam um amplo espectro de doenças sistémicas, da pele, intoxicações alimentares,

tecidos, trato urinário e infeções oportunistas. Os Staphylococcus crescem rapidamente

em meios não seletivos com sangue de carneiro, apresentando colónias grandes e lisas e

brilhantes, com cor entre o branco e o amarelo, produzindo hemólise; os meios seletivos



96

como o manitol-salgado, podem ser usados para isolar S.aureus (a espécie fermenta o

manitol, mas não a maioria das outras espécies). (72,76,79)

As estirpes MRSA produzem infeções graves em pacientes hospitalizados e são

identificados no laboratório através do uso de um meio cromogéneo específico

(valorização de colónias rosa).

O teste da coagulase é usado para distinguir e identificar a espécie S.aureus

(coagulase positivo) dos Staphylococcus coagulase negativos. Estes últimos são

identificados através de cartas VITEK para Gram positivos (carta GP).

Streptococcus spp.

Apresentam-se aos pares ou em cadeiras. A maioria das espécies é anaeróbia

facultativa e algumas só crescem em atmosfera enriquecida de CO2. São catalase

negativos, o que os distingue do género Staphylococcus. (72,76,79)

A identificação das espécies dentro deste género é complicada, pelo que se

utilizam as propriedades serológicas-Grupos de Lancefield- que diferencia as estirpes de

Streptococcus β-hemolíticos, padrões de hemólise e propriedades bioquímicas. A maioria

dos β-hemolíticos e algumas espécies α-hemolíticas possuem antigénios específicos, que

podem ser identificados por ensaios imunológicos como o Streptococcus pyogenes (grupo

A), causador de faringite e amigadalite bacteriana. Este género é responsável por casos

de faringite, infeções da pele, síndrome do choque tóxico estreptocócico, pneumonia,

doença neonatal, meningite, entre outras. S. pneumoniae são diplococos Gram positivos

com aspeto lanceolado, que podem ser identificados através da prova da optoquina

sensível ou através da deteção de antigénio. No exame corado por Gram, a presença de

GP aos pares e cadeias em associação com leucócitos é um achado importante. Em

cultura, o seu crescimento é ótimo em agar sangue, em que são observadas colónias

transparentes ou translúcidas, lisas, com formação de hemólise. (72,76,79)

É utilizado um meio cromogéneo são utilizados para a deteção de S.agalactiae

(Grupo B), que não necessita de carta para identificação.

Teste rápido para S.pneumonia

Consiste num teste imunocromatográfico para a deteção do antigénio de S.

pneumoniae na urina de pacientes com pneumonia e LCR de pacientes com meningite.

(84) A doença pneumocócica ocorre quando a bactéria que coloniza a nasofaringe e



97

orofaringe se espalha para os pulmões, seios paranasais, orelha ou meninges. S.

pneumoniae constitui a causa principal de pneumonia adquirida na comunidade, tendo

uma taxa de mortalidade elevada, dependendo da idade e outras infeções associadas. A

meningite provocada por esta bactéria, leva a danos cerebrais permanentes ou morte e

pode ocorrer ou não, como complicação. (76,84)

Uma zaragatoa molhada na amostra de urina ou LCR é inserida no cartão de

teste, ao qual se adiciona um reagente. De seguida o cartão é fechado, de modo a colocar

a amostra em contacto com a tira de teste. O antigénio presente na amostra reage com o

conjugado e estes complexos são capturados pelo anticorpo imobilizado na tira teste,

originando a formação de uma linha nesta zona. O resultado é lido após 15 minutos,

através da presença ou ausência da linha de teste. A linha controlo deverá ser observada,

para validar o resultado. (84)

Teste rápido para Streptococcus do grupo A

Realiza a deteção qualitativa de antigénios de Streptococcus β-hemolíticos do

grupo A, em zaragatoas faríngeas, que são a causa principal de infeções do trato

respiratório superior, como amigdalite e faringite. (76,85)

O antigénio é extraído da zaragatoa usando os reagentes do kit e esta solução é

adicionada ao poço de amostragem da cassete. O antigénio reage com o conjugado para

formar complexos, que se deslocam cromatograficamente através da membrana em

direção ao anticorpo imobilizado na linha de teste. Caso o antigénio esteja presente,

forma-se uma sanduíche (anticorpo/antigénio/conjugado) e é visível uma linha colorida.

Deve também ser visível uma linha de controlo para se poder validar o resultado. (85)

Enterococcus spp.

São cocos GP dispostos em cadeias curtas ou aos pares, com morfologia idêntica

aos S.pneumoniae. Uma forma de os distinguir é utilizando o teste da optoquina

(S.pneumoniae é sensível, os enterococos são resistentes). São catalase negativos e

crescem tanto em aerobiose como em anaerobiose. Crescem em meios comuns e não

seletivos, nomeadamente no meio com agar sangue de carneiro, apresentando colónias

com α, β ou ausência de hemólise, de cor branca ou acinzentada. São responsáveis por

bacterémia, endocardite, infeções do trato urinário e feridas, assim como infeções

nosocomiais. Algumas estirpes apresentam já resistência múltipla aos antibióticos



98

(vancomicina). Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium são as espécies mais

importantes e mais frequentemente isoladas, colonizadoras do trato intestinal que se

podem disseminar para outras superfícies mucosas. (72,76,79)

No laboratório é utilizado um meio cromogéneo seletivo, destinado à deteção de

Enterococcus faecium e E.faecalis nos doentes de risco que apresentam uma resistência

adquirida à vancomicina. E.faecium apresenta colónias violeta e E.faecalis apresenta

colónias verdes. A identificação das colónias isoladas em meios não cromogéneos é

realizada através de cartas VITEK para Gram positivos (carta GP).

4.2.5.2.Identificação de bacilos GN

Enterobacteriáceas

A família das Enterobacteriáceas é composta por dezenas de géneros de bacilos

GN. A maioria destes organismos são ubiquitários, habitando no aparelho gastrointestinal

humano e de outros animais e no meio ambiente. São responsáveis por bacterémias,

infeções do trato urinário e gastrointestinais, entre outras patologias e estão associados a

infeções nosocomiais. Os membros desta família podem ser ou não, móveis com flagelo

ou produtores de esporos. No exame direto apresentam-se como cocobacilos ou bacilos

retos, com extremidades arredondadas. Podem ser anaeróbios ou aeróbios facultativos.

São catalase positiva e oxidase negativa e podem crescer numa variedade e meios

seletivos e não seletivos. As características das colónias em diferentes meios são usadas

para distinguir membros da família. Por exemplo, Escherichia e Klebsiella são

fermementadoras da lactose, visível pela mudança de cor no meio agar MCK, ao contrário

de Proteus, Salmonella, Shigella e Yersinia (colónias incolores). (72,76,79)

Nas cropoculturas são usados meios seletivos, como o meio Hektoen que permite

pesquisar Salmonella e Shigella. A identificação das colónias isoladas destas bactérias

realiza-se através das cartas VITEK GN.

Caso o género Salmonella spp. seja identificado, é feito um teste de aglutinação

com soro polivalente para fazer a distinção entre “Typhi” e “não-Typhi” e é

posteriormente enviado para o laboratório central para identificação do serotipo.



99

Campylobacter

O género Campylobacter consiste em bacilos GN pequenos, móveis, em forma de

“S”. São catalase e oxidase positivos. A maioria das espécies necessitam de atmosfera

reduzida de oxigénio (microaerofilia) e a cultura requer o uso de um meio seletivo com

vários dias de incubação. As espécies mais comumente isoladas são Campylobacter jejuni

e Campylobacter coli, responsáveis por gastroenterites e septicémias. (76,79)

No laboratório, é utilizado o meio CAM. Neste meio, as colónias são não

hemolíticas, achatadas, acinzentadas e irregulares. Caso estas colónias estejam presentes,

é realizado um esfregaço corado com fucsina durante 10 segundos, para observação das

formas espiraladas. A identificação das colónias através do sistema automatizado não é

realizada no laboratório; caso se verifique crescimento de colónias características, a placa

é enviada para o laboratório central.

Pseudomonas spp.

Organismos oportunistas, associados a infeções nosocomiais, em que a

P.aeruginosa é a espécie mais importante. São bacilos GN, pequenos, oxidase positivo,

normalmente dispostos aos pares, não fermentadores da lactose. São aeróbios com

necessidades nutricionais simples, crescendo em meios usuais como CLED, agar sangue

e MCK. A sua morfologia em colónia, pigmentação, odor, tamanho, e alguns testes

bioquímicos como a oxidase são suficientes para a sua identificação preliminar.

Provocam patologias como infeções do trato respiratório, urinário, pele e tecidos, ouvido

e olhos, assim como bacterémia e endocardite e são resistentes a muitos antibióticos

(produtoras de β-lactamases). (72,76,79)

A identificação das colónias isoladas realiza-se através das cartas VITEK GN.

Vibrio spp.

Bacilos GN com morfologia curva, anaeróbios facultativos, fermentadores. Ao

contrário das Enterobacteriáceas, são oxidase positivos. A espécie mais importante que

causa doença em humanos é o Vibrio cholerae, que origina gastroenterite e bacterémia.

São diagnosticados através da microscopia e cultura de fezes, podendo crescer numa

variedade de meios simples como agar sangue e MCK (não fermentadores da lactose).

(72,76,79)

As colónias isoladas são identificadas no sistema VITEK.



100

4.2.5.3.Identificação de cocobacilos GN

Haemophilus spp.

São bacilos GN pequenos ou cocobacilos, anaeróbios facultativos. As espécies

deste género fazem parte da flora habitual do aparelho respiratório superior humano e dos

animais. A maior parte necessita de exigências nutricionais fastidiosas. Haemophilus

influenzae, a espécie mais comum, é responsável por quadros de meningite, epiglotite,

pericardite e pneumonia principalmente em crianças. Podem ser identificados em

microscopia e a cultura é realizada em agar chocolate. Podem ter reação variável nos

testes da oxidase e catalase. (72,76,79)

A sua identificação é feita através de um Api-NH.

Moraxella spp.

Agente mais comum é a Moraxella catarrhalis, que causa infeções pulmonares

na comunidade, estando também descritos casos de endocardite e meningite. São

diplococos GN, aeróbios, oxidade e catalase positivos. O seu isolamento faz-se em gelose

chocolate em atmosfera de CO2. A maioria dos isolados produz β-lactamases e são

resistentes às penicilinas. (72,79)

A sua identificação é feita através de um Api-NH.

Neisseria spp.

São diplococos GN, fastidiosos, em pares ou cadeias curtas. Crescem melhor em

atmosfera suplementada com CO2 (capnofilia). São oxalase e catalase positivas. O género

Neisseria é composto por várias espécies, sendo duas delas organismos patogénicos

estritos em humanos, Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, A primeira é

responsável por uma doença transmitida sexualmente (gonorreia) e a segunda é a segunda

maior causadora de meningite em adultos, sendo este género responsável também por

outro tipo de patologias, nomeadamente conjuntivite, faringite, uretrite. A coloração de

Gram assiste no diagnóstico, mas a cultura é sensível e específica. Estas espécies crescem

em agar chocolate ou meios seletivos com o VCA. (72,76,79)



101

API®NH

Corresponde a um sistema padronizado para identificação de Neisseria,

Haemophilus e Moraxella catarrhalis. Estas bactérias apresentam exigências nutritivas e

são cultivadas em gelose chocolate em atmosfera enriquecida em CO2.

A galeria de identificação é composta por microtubos, que efetuam testes de

identificação (reações enzimáticas ou fermentações de açúcares). Durante o período de

incubação, ocorrem mudanças de cor espontâneas ou que são reveladas através da adição

de reagentes. (86)

Procedimento

É necessário um inóculo ajustado a 4 de McFarland, pelo que se efetua uma

suspensão com as colónias a estudar. A partir da suspensão, enchem-se os poços da

galeria de identificação e é adicionada parafina aos poços indicados. A galeria é fechada

numa caixa e incubada a 37ºC em aerobiose. Para observar os resultados, é necessário ler

as reações espontâneas, em que pode ser necessário adicionar reagentes. Através da

atribuição de (+) ou (-), consoante as cores obtidas em cada reação, obtém-se um perfil

numérico, que corresponde a uma identificação na lista do folheto informativo. (Ex: o

perfil numérico 1001 corresponde a Neisseria gonorrhoeae). (86)

Acinetobacter spp.

Grupo de bacilos GN, aeróbios estritos, oxidase positiva, não fermentativos, que

como as Pseudomonas, utilizam carbohidratos, álcoois e aminoácidos como fontes de

energia. Acinetobacter baumanni é a espécie mais comum e são responsáveis por infeções

nosocomiais (infeções urinárias, respiratórias, bacterémia, feridas e tecidos). No Gram

apresentam-se como cocobacilos. Crescem em meios culturais como MCK e GS.

(72,76,79)

As colónias isoladas são identificadas usando cartas VITEK.

Género Legionella

Bacilos GN finos ou cocobacilos curtos, pleomórficos. São nutricionalmente

fastidiosos e são difíceis de corar por Gram. Causam infeções hospitalares e são

responsáveis pela doença dos legionários (pneumonia severa) e febre de Pontiac

(semelhante à gripe). O teste de diagnostico de escolha requer o uso de meios de cultura



102

com L-cisteína e sais de ferro. Os imunoensaios são utilizados para detetar antigénios

específicos do sorotipo 1 de Legionella excretados na urina de pacientes infetados.

(76,79)

Teste rápido para Legionella

Teste rápido imunocromatográfico para a deteção qualitativa do antigénio de

Legionella pneumophila (serogrupo 1), em urina de pacientes com sintomas de

pneumonia. Esta patologia é caracterizada por pneumonia grave com quadro febril, que

pode ser fatal. (76,87)

O procedimento passa por molhar uma zaragatoa na amostra de urina e inseri-la

no cartão de teste. É adicionado um reagente e o cartão é fechado, de modo a colocar a

amostra em contacto com a tira de teste com os anticorpos. O resultado é interpretado

após 15 minutos, através da presença ou ausência das linhas de teste. A linha de controlo

também deverá ser observada. (87)

Género Brucella

Composto por organismos zoonóticos que ocasionalmente causam doença em

seres humanos. São cocobacilos GN muito pequenos, oxidase positivos, aeróbios, que

requerem incubação prolongada, podendo crescer em meios de cultura enriquecidos com

sangue. A brucelose pode ser difícil diagnosticar porque tem sintomas iniciais não

específicos e pode progredir para envolvimento sistémico (trato gastrointestinal, ossos,

articulações, trato respiratório e outros órgãos). A serologia é utilizada para confirmação

do diagnóstico. (72,76)

No laboratório, é utilizado um teste de aglutinação em carta (Antigénio Rosa

Bengala) para a confirmação serológica do género Brucella em amostras de soro. Num

dos círculos de uma carta, é colocado antigénio homogeneizado e amostra a testar,

misturando e agitando a carta durante 4 minutos. No caso de uma reação positiva, é

verificada aglutinação, indicando a presença de anticorpos específicos no soro testado.

(88)

4.2.5.4.Identificação de bacilos GP

Género Clostridium

São organismos ubiquitários e fazem farte da flora gastrointestinal. A maioria é

saprófita, mas alguns provocam patologias como diarreias, colite, tétano, septicémias.



103

São bacilos GP grandes, móveis ou não, produtores ou não de toxinas. As espécies mais

isoladas são C.perfringens e C.difficile, causadores de patologias gastrointestinais. Estes

organismos podem ser identificados microscopicamente e crescem rapidamente em meios

de cultura usuais. (76,79)

No laboratório está disponível um teste rápido que consiste num ensaio

imunoenzimático para a deteção simultânea do antigénio glutamato desidrogenase (para

avaliar a presença da bactéria) e das toxinas A e B do Clostridium difficile em amostras

de fezes. (83)

Caso este teste tenha um resultado duvidoso, é utilizado o aparelho GenomEra

CDX™ system, que realiza um teste de PCR para identificar a presença de Clostridium

difficile toxinogénico numa amostra de fezes. Este teste deteta de forma rápida e

específica o gene tcdB, que codifica a toxina B. (75)

Género Bacillus

São bacilos GP, longos e finos, isolados ou em cadeia. São aeróbios e anaeróbios

facultativos, formadores de esporos e toxinas. O Bacillus cereus é a espécie mais isolada,

que provoca gastroenterites, infeções oculares, sepsis e doença pulmonar. Estas espécies

crescem rapidamente e são facilmente detetadas pela coloração de Gram. (76,79)

Género Listeria

A espécie mais comum é a L.monocytogenes, presentes na flora intestinal do

homem e na flora comensal de outros animais e no ambiente. São bacilos GP, móveis à

temperatura ambiente, anaeróbios facultativos, que podem ocorrer isolados, em pares ou

em cadeia curta. São catalase positiva. A microsocopia não é sensível, pois podem ser

confundidos com S. pneumoniae e Enterococcus. Quando cultivado em placa de agar

sangue de carneiro apresenta β-hemólise fraca. Esta espécie é causadora de meningite,

doenças neonatais e sépsis. Causa infeções mais frequentemente na mulher grávida,

recém-nascidos e imunocomprometidos. (72,76,79)

4.2.5.5.Género Mycobacterium

Este género consiste em bacilos aeróbios, imóveis, não formadores de esporos.

São bactérias muito fastidiosas e crescem muito lentamente, sendo a cultura ainda o

método de referência para o diagnóstico de infeções provocadas por este organismo. M.



104

tuberculosis será a espécie patogénica mais conhecida, responsável não só, mas

principalmente por infeção pulmonar grave. A parede celular é rica em lípidos, o que

torna a superfície hidrofóbica e a micobactéria resistente a várias colorações comuns de

laboratório, como Gram. (76,79)

Para a pesquisa deste género de bactérias é realizado exame direto corado com

Kinyon, em que as amostras podem ser variadas (expetoração, urina, LBA, etc.).

Amostras com pedido de exame cultural são enviadas para fora.

4.2.6.Testes de suscetibilidade aos antibióticos

São utilizadas cartas diferentes de TSA para:

• Staphylococcus spp.

• Enterococcus spp. e Streptococcus agalactiae

• Streptococcus spp.

• Bacilos GN

• Bacilos GN nas urinas

• Pseudomonas spp.

Os antibióticos testados em cada carta VITEK encontram-se na tabela 11.

Tabela 11(a). Cartas VITEK e antibióticos testados.

Staphylococcus

spp

AST-P648

Ácido fusídico, Eritromicina, Fosfomicina, Gentamicina, Linezolida,

Oxacilina, Tigeciclina, Rifampicina, Teicoplanina, Tetraciclina,

Daptomicina, Trimetoprim-sulfametoxazol, Vancomicina,

Benzilpenicilina, Cefoxitina Screen, Levofloxacina, Clindamicina,

Moxifloxacina, Mupirocina, Nitrofurantoína

Enterococcus

spp;

Streptococcus

agalactiae

AST-P586

Clindamicina, Eritromicina, Gentamicina 500, Imipenemo,

Levofloxacina, Linezolida, Moxifloxacina, Nitrofurantoína,

Quinopristina-dalfopristina, Estreptomicina 1000, Teicoplanina,

Tetraciclina, Trimetoprim-sulfametoxazol, Vancomicina,

Amipicilina/Sulbactam, Ampicilina, Benzilpenicilina, Cefuroxime,

Tigeciclina

Streptococcus

pneumoniae;

Streptococcus

pyogenes;

outros

Streptococcus

AST-ST01

Ampicilina, Benzilpenicilina, Cefotaxima, Ceftriaxona, Clindamicina,

Eritromicina, Levofloxacilina, Linezolide, Tetraciclina, Trimetoprim-

sulfametoxazol, Vancomicina, Resistência induzida à Clindamicina



105

Tabela 11(b). Cartas VITEK e antibióticos testados.

Bacilos GN

fermentativos

(outros

produtos)

AST-N355

Amoxicilina-ácido clavulânico, Ampicilina, Cefalotina, Ciprofloxacina,

Gentamicina, Nitrofurantoína, Tobramicina, Amicacina, Cefotaxima,

Ceftazidima, Cefuroxima, Levofloxacina, Meropenem, Ertapenem,

Trimetoprim-sulfametoxazol, Piperacilina/tazobactam, ESBL

Bacilos GN

fermentativos

(urinas)

AST-359

Amicacina, Amoxicilina-ácido clavulânico, Ampicilina, Cefalotina,

Cefepime, Cefotaxima, Cefoxitina, Ceftazidima, Cefuroxima,

Ciprofloxacina, Ertapenem, Fosfomicina, Gentamicina, Imipenem, Ácido

Nalidixico, Nitrofurantoína, Tobramicina, Trimetoprim-sulfametoxazol,

ESBL

Pseudomonas AST-N222

Amicacina, Aztreonam, Cefepima, Ceftazidima, Ciprofloxacina,

Gentamicina, Imipenem, Pefloxacina, Piperacilina, Piperacilina-

tazobactam, Ticarcilina, Ticarcilina-Ácido clavulânico, Trimetoprim-

sulfametoxazol, Colistina, Meropenem, Rifampicina, Tobramicina,

Minociclina

No caso dos géneros Haemophilus, Moraxella e Neisseria, as colónias isoladas

são enviadas para o laboratório central para se proceder à realização de um antibiograma.

O TSA de organismos anaeróbios também não é realizado no laboratório.

4.3.Micologia

A micologia representa um grupo diversificado de organismos, cujo papel

principal é degradar a matéria orgânica. Os fungos podem ser saprófitas, simbiontes,

comensais e parasitas. São organismos eucariotas com parede celular rígida, unicelulares

ou pluricelulares. Nas últimas décadas têm crescido em importância clínica, sendo

responsáveis por patologias humanas, com especial importância nos

imunocomprometidos ou hospitalizados. O espectro das doenças fúngicas abrange desde

infeções cutâneas superficiais, a processos altamente invasivos associados a patogéneos

sistémicos clássicos e oportunistas. (76,79)

A taxonomia clássica dos fungos baseia-se na morfologia e no modo de produção

de esporos. Da maneira mais simples e baseada na morfologia, podem dividir-se em

leveduras ou fungos filamentosos. As leveduras são normalmente unicelulares, dividem-



106

se por gemulação e as células-filhas podem alongar-se e produzir pseudo-hifas. No meio

de cultura produzem colónias arredondadas e mucóides. Os fungos filamentosos são

multicelulares e são formados por hifas, que podem ser septadas ou cenocíticas. As

colónias formadas por estes fungos são normalmente filamentosas ou algodoadas. Muitos

fungos clinicamente importantes são dimórficos, podendo existir na forma de levedura

ou fungo filamentoso. (76,77,79)

No geral as infeções fúngicas dividem-se nas seguintes categorias: as infeções

sistémicas normalmente começam no trato respiratório e disseminam para outros órgãos.

As micoses subcutâneas são frequentemente secundárias a trauma cutâneo e raramente

disseminam. As micoses superficiais estão confinadas às camadas ceratinosas da pele,

unhas e cabelo. Existem ainda as micoses oportunistas, normalmente em pacientes

imunocomprometidos. (76,77,79)

O tipo de micose e amostra biológica podem ajudar no diagnóstico porque existem

localizações preferenciais dos fungos e, assim, pode-se orientar a pesquisa para

determinado género ou espécie. (76,79)

4.3.1.Meios de cultura

Os meios de cultura para diagnóstico micológico devem permitir o crescimento

da maioria dos fungos de interesse clinico, inibindo a flora bacteriana. O meio não

seletivo permite o crescimento de leveduras e fungos filamentosos que crescem

rapidamente, como também os fungos mais exigentes de crescimento mais lento. Os

fungos crescem em muitos meios utilizados para bactérias, mas normalmente, o

crescimento é mais lento e um meio mais enriquecido, como o agar Sabouraud é

recomendado. (76)

Os meios de cultura usados na Micologia e as suas características estão

representados na tabela 12.



107

Tabela 12. Características dos meios de cultura usados na Micologia. (76)

Meios de cultura Caraterísticas

Gelose Sabouraud Meio não seletivo para isolamento de

fungos. Incubação a 30ºC. Peptonas e

glucose, bem como o pH ligeiramente

ácido, favorece o seu desenvolvimento.

Gelose Sabouraud Cloranfenicol 2 Meio seletivo para cultura de fungos em

amostras polimicrobianas. Cloranfenicol

inibe o crescimento bacteriano.

Gelose Sabouraud Cloranfenicol

Actidiona

Cultura seletiva de dermatófitos.

Cloranfenicol inibe o crescimento

bacteriano. Actidiona inibe algumas

espécies de leveduras e fungos

filamentosos.

4.3.2.Procedimentos para diagnóstico micológico

4.3.2.1. Exame direto

O exame microscópico é importante no diagnóstico micológico, numa situação de

emergência e quando os agentes infeciosos não podem ser cultivados. A deteção

microscópica das leveduras ou hifas pode ser efetuada em menos de uma hora. Nalguns

casos, o fungo pode mesmo ser identificado desta forma devido à sua morfologia distinta.

Deste modo, a observação do fungo na amostra tem grande valor diagnóstico porque

demonstra a invasão do fungo no tecido e permite uma resposta rápida para que seja

determinada a melhor terapia para o doente. No laboratório são utilizadas as preparações

coradas usadas na bacteriologia, nomeadamente a coloração de Gram. No caso das

colheitas das mucosas (digestivas, genitais), amostras de expetoração e urinas, esta

coloração é suficiente para deteção das leveduras. Quando se tratam de amostras mais

profundas, onde as leveduras e filamentos podem ser raros, os elementos fúngicos são

mais difíceis de detetar e o Gram pode não ser suficiente. (76,79)

Dependendo da amostra em que foi também pedido exame micológico, esta pode

ter uma lâmina Gram associada ao exame bacteriológico. Neste caso, caso se verifique a

presença de fungos na lâmina, como por exemplo, a presença de leveduras no exsudado

vaginal, deve ser indicado na folha de trabalho. O mesmo acontece para o exame a fresco

do sedimento urinário.



108

4.3.2.2.Exame cultural

A obtenção do fungo em cultura é o procedimento de eleição pois permite

diagnosticar a micose, mesmo que o exame direto seja negativo, e caso seja positivo,

confirma esse resultado. Ainda que a aparência morfológica de uma Candida possa levar

ao diagnóstico do tipo de infeção, a espécie atual do fungo permanece desconhecida sem

realização de cultura. (76,79)

Para além do exame bacteriológico (mais comum no laboratório), o pedido médico

pode incluir diagnóstico micológico. Neste caso, é realizada sementeira em meio

Sabouraud, com incubação a 30ºC durante 48h- 5 dias (dependendo se a amostra é mais

ou menos profunda) em aerobiose, com observação diária.

A sementeira realiza-se da mesma forma que a sementeira dos meios para cultura

bacteriana. No caso do LBA e LCR, a amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado

para a inoculação do meio. Os fragmentos de unhas devem ser cortados em pedaços antes

da sementeira. No caso de se verificar crescimento de leveduras no exame bacteriológico

em meio CLED, estas devem ser repicadas para Sabouraud, para posterior identificação.

Na análise das hemoculturas, o procedimento é idêntico ao da bacteriologia, sendo

que o aparelho BacT/ALERT 3D também faz deteção de fungos. As Candidas só crescem

no frasco de aerobiose. Os líquidos límpidos devem ser concentrados por centrifugação,

enquanto as amostras purulentas podem ser inoculadas diretamente no meio de cultura.

Líquidos orgânicos estéreis como líquido pleural, ascítico, pericárdico, sinovial, bílis

também podem ser enviados em frasco de hemocultura e este caso, é feita passagem para

Sabouraud após 48h de incubação do aparelho e é realizado um exame corado com Gram.

Exame cultural para pesquisa de dermatófitos

O termo dermatofitose refere-se a doenças causadas por quaisquer das várias

espécies de fungos filamentosos taxonomicamente relacionados com os géneros

Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Estes fungos são conhecidos como

dermatófitos. Todos têm a capacidade de invadir a pele, pelos ou unhas. Nas infeções da

pele, os dermatófitos invadem só a camada exterior. As várias formas de dermatofitose

são classificadas de acordo com o local anatómico e são comumente chamadas de “tinha”

(por exemplo, tinha dor couro cabeludo). (76,79)

Para este exame são colhidos cabelos, unhas, escamas de pele, consoante a

situação clínica e colhidos de acordo com os procedimentos referidos no início deste



109

relatório e é realizada uma sementeira em dois meios de cultura em tubo: Sabouraud com

clorofenicol e Sabouraud com clorofenicol e actidiona. A incubação é feita até 30 dias, a

30ºC, em atmosfera de aerobiose, com visualização semanal. Se ocorrer crescimento,

procede-se à identificação. Estes meios são em tubo, pelo que a sementeira é feita

utilizando uma ansa que é molhada na superfície do meio, de seguida, com a ansa molhada

são adicionados pedaços da amostra a analisar na rampa do meio de cultura. As tampas

não devem ficar completamente fechadas pois os fungos são organismos aeróbios.

Micoses mais frequentes

A localização das micoses mais frequentes e alguns organismos relacionados

encontram-se na tabela 13.

Tabela 13. Localizações das micoses mais frequentes. Adaptado de (76).

4.3.3.Identificação de fungos e leveduras

Os meios Sabouraud com crescimento são enviados para o laboratório central,

após isolamento das colónias, porque o laboratório não possui cartas VITEK ou outros

meios para identificar estes microrganismos. Desta forma, a identificação dos fungos e

leveduras, bem como procedimentos posteriores como suscetibilidade a antifúngicos são

realizados no laboratório central do grupo.

Muitas vezes é difícil identificar o género e espécie, pelo que nestes casos,

identificar o grupo de fungos (levedura, dermatófitos, zigomicete…) é suficiente. É

Dermatófitos H.

capsulatum

P.

brasiliensis

S.

schenckii

Aspergillus

spp.

Candida

spp.

C.

neoformans Zigomicetes

Trato

urinário X X X X

Mucosas X X X

Sangue X X X X X X X

Trato

respiratório X X X X X X

LCR X X X X

Pele e unhas X X

Pelo X

Olho X X X X

Ouvido X X X

Tecido

subcutâneo X X X X



110

importante referir que o isolamento de um fungo em cultura não significa que ele é o

agente da infeção (Candida spp. na flora normal ou Aspergillus spp. no meio ambiente).

No entanto, em casos específicos como pacientes imunodeprimidos, micose cutânea,

amostras com exame microscópico positivo, devem ser valorizados. (76,79)

Identificação de Leveduras

A morfologia das leveduras não apresenta muita diversidade, o que não ajuda por

si só à sua identificação. As leveduras aparecem nos meios padrão de isolamento como

colónias lisas, mais ou menos cremosas ou mucóides, a maioria de cor branca. O exame

microscópico permite a observação de elementos unicelulares, redondos ou ovais, com

gemulação. Certas características macroscópicas, sobretudo o pigmento, permitem, por

vezes, orientar a identificação para o género (Rhodotorula) ou espécie. Se a levedura

apresenta pseudohifas, é sugestivo do género Candida. No entanto, na maioria dos casos

é necessário e importante recorrer a outros testes como perfis de assimilação de fontes de

carbono ou presença de certas enzimas para confirmar a identificação. As colónias de

leveduras obtidas só devem ser identificadas quando estiverem em cultura pura. (76,77)

Devem ser identificadas todas as leveduras isoladas quando presentes em amostras

de doentes de alto risco ou em não imunocomprometidos quando as colheitas provêm de

locais fechados ou normalmente estéreis, ou quando se identifica um fungo num local

pouco comum. (76)

As principais leveduras de interesse clínico são Candida spp., Malassezia furfur,

Rhodotorula rubra, Trichosporon spp., Cryptococcus neoformans e Saccharomyces

cerevisiae. (76,79)

Identificação de Fungos Filamentosos

Macroscopicamente, são fáceis de reconhecer face às leveduras, devido ao seu

aspeto penugento, associado ao desenvolvimento aéreo do micélio. Fatores como a

origem da colheita, tempo de crescimento das colónias, aspeto e coloração, características

microscópicas e provas bioquímicas permitem orientar a identificação, sendo que poderá

tratar-se de um bolor, um dermatófito ou um fungo dimórfico. Os fungos devem ser

identificados dependendo do contexto clínico, da colheita e da abundância de colónias. À

semelhança das leveduras, devem ser sempre valorizados em doentes imunodeprimidos



111

e imunocompetentes em colheitas mais internas. Muitos são os fungos de interesse

clínico, com especial interesse para Aspergillus spp. e zigomicetes.

No caso dos dermatófitos devem ser sempre identificados, pois são sempre

parasitas, pelo que mesmo isolado em pequena quantidade, será a causa das lesões

observadas. Como já foi referido, os dermatófitos são fungos filamentosos pertencentes

aos géneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. (76,79)

Por outro lado, os fungos dimórficos, fungos filamentosos que podem, sob

determinadas condições, assumir forma de levedura, normalmente possuem uma

repartição geográfica particular, sendo pouco frequentes na Europa. Normalmente, o

isolamento destes fungos deve-se a pesquisa dirigida, devido a uma desconfiança do

clínico. Estes fungos são de cultivo muito lento. A identificação é feita pela comprovação

do dimorfismo e pelo aspeto microscópico característico de cada fase. Os fungos

dimórficos de principal interesse são Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum,

Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Sporotrix schenkii e Penicillium

marneffei. (76,79)

4.4.Parasitologia

A parasitologia médica inclui o estudo de três grandes grupos: protozoários,

helmintas e artrópodes que atuam como vetores de vários agentes patogénicos. Os

parasitas podem ser obrigatórios (não sobrevivem fora do hospedeiro), facultativos,

acidentais (como a ingestão acidental de larvas). Podem causar ou não danos no

hospedeiro. Os parasitas são quase todos exógenos, pelo que a entrada no hospedeiro

ocorre através de ingestão ou penetração nas barreiras anatómicas. (76,79)

As doenças parasitárias constituem problemas para a saúde humana (por exemplo,

cerca de 30% da população mundial está infetada com Ascaris lumbricoides),

principalmente com o aumento de outras patologias como a síndrome da

imunodeficiência adquirida (SIDA). Particularmente em áreas com más práticas de

higiene, os parasitas estão entre as maiores causas de doença e morte. Pessoas que vivem

em países desenvolvidos podem adquirir estas doenças viajando para países de risco.

(76,77,79)

Estes organismos normalmente passam por vários estadios de desenvolvimento

durante a vida, que envolve mudanças não só na estrutura, mas também na composição



112

bioquímica e antigénica. Muitas infeções parasitárias são transmitidas pelos animais

(infeções zoonóticas), em que a doença humana pode ou não assemelhar-se à doença

causada no animal e podem passar de condições assintomáticas para patologias

potencialmente fatais. Deste modo, a compreensão das caraterísticas da infeção

parasitária (faixa geográfica, epidemiologia, ciclo de vida, doença clínica) e o uso de

procedimentos diagnósticos adequados, tornam-se muito importantes, bem como

reconhecer as limitações da informação fornecida ao médico. O exame direto do material

clínico é usualmente o melhor método para o diagnóstico parasitológico, mas outros

métodos como a serologia ou biologia molecular também podem ser utilizados.

(76,77,79)

4.4.1Procedimentos para diagnóstico parasitológico

4.4.1.1.Aparelho genital

Um dos agentes etiológicos das secreções vaginais é a Trichomonas vaginalis, que

provoca doença urogenital comum em mulheres. Nos homens, é geralmente

assintomática. Nas mulheres pode provocar vaginite, descargas com mau odor, pequenas

lesões e micção dolorosa. Este parasita é um protozoário flagelado com uma única forma

de trofozoíto, que se divide por fissão binária no trato urogenital, podendo ser transmitido

de pessoa para pessoa. (76,79)

Para a pesquisa deste parasita é utilizada uma colheita de exsudado vaginal com

zaragatoa seca colocado em meio de enriquecimento seletivo para Trichomonas, que

consiste num meio líquido rico em nutrientes que oferece as condições de crescimento

ideais para o parasita. Este meio é colocado na estufa a 37ºC e após 48h, é realizado

exame a fresco.

4.4.1.2.Aparelho gastrointestinal

No laboratório é comum a pesquisa de parasitas nas fezes. Normalmente, são

colhidas três amostras de fezes em dias diferentes, de modo a aumentar a probabilidade

de encontrar o parasita. Os protozoários intestinais podem ser flagelados (Giardia

lamblia), ciliados (Balantidium coli), amibas ou coccídeos. Em todos estes podem

observar-se quistos ou trofozoítos. Os helmintas intestinais podem ser tremátodos

(observação de ovos), nemátodos (observação de ovos ou larva no caso de Strongyloides

stercoralis) ou céstodos (observação de ovos ou proglótis de Taenia). (76,77)



113

É utilizado um kit, em que se recolhe uma pequena amostra de fezes para um tubo

em que é adicionado reagente. O tubo contem um sistema de filtro integrado, que realiza

a separação dos parasitas. A mistura é centrifugada 5 minutos a 1500g, e obtém-se o

concentrado de parasitas que é suspendido em solução salina fisiológica. (89)

Para a realização do diagnóstico, são colocadas duas gotas de concentrado de fezes

por lâmina. É também realizado exame a fresco da amostra utilizando soro fisiológico.

Na tabela 14 encontram-se os parasitas possíveis de identificação em amostras de fezes.

Durante o estágio, nenhum parasita foi observado.

Tabela 14. Parasitas possíveis de observação em amostras de fezes. Adaptado de (76).

Protozoários intestinais flagelados Giardia lamblia

Protozoários intestinais ciliados Balantidium coli

Protozoários intestinais: Amibas Entamoeba histolytica

Entamoeba coli

Iodamoeba butschlii

Protozoários intestinais: Coccídeos Cryptosporidium parvum

Cyclospora cayetanensis

Enterocytozoon bieneusi

Isospora belli

Helmintas intestinais: Tremátodos Fasciola hepática

Schistosoma japonicum

Schistosoma mansoni

Schistosoma haematobium

Helmintas intestinais: Nemátodos Ascaris lumbricoides

Trichuris trichiura

Enterobius vermicularis

Ancilostomídeo

Necator americanus

Strongyloides stercoralis

Helmintas intestinais: Céstodos Hymenolepis nana

Hymenolepis diminuta

Taenia sp

Diphyllobotrium latum

Pesquisa de Giardia lamblia

É utilizado um teste rápido de diagnóstico para a deteção de Giardia lamblia em

fezes. A multiplicação de trofozoítos ocorre por fissão binária no intestino e os quistos

formados são excretados nas fezes. A ingestão dos quistos resulta em infeção. É um

protozoário intestinal mais comumente responsável por provocar diarreia severa,

particularmente em imunodeprimidos. (76,79,90)



114

Procedimento

O teste consiste numa membrana de nitrocelulose, com anticorpo dirigido contra

o parasita intestinal. A especificidade do teste é assegurada pelo uso de um anticorpo

especifico para um antigénio da Giardia que é conjugado com ouro coloidal, colocado

numa membrana. A amostra é diluída num tubo com uma solução do kit e homogeneizada

para ficar em suspensão. Coloca-se a tira-teste no tubo e o resultado é lido ao fim de 15

minutos. Se a amostra contem o antigénio da Giardia, o complexo conjugado – antigénio

migra e liga-se ao anticorpo presente na membrana, aparecendo uma linha colorida na

zona de teste. De modo a validar o teste, uma linha na região do controlo também deve

ser visualizada. (90)

4.4.1.3.Malária

A malária é uma doença potencialmente fatal causada por parasitas protozoários

do género Plasmodium transmitidos entre humanos através da picada de um mosquito

Anopheles infetado. Existem quatro parasitas que podem provocar malária (P.falciparum,

P.vivax, P.ovale e P.malariae). Nos humanos, os parasitas, na forma de esporozoítos,

migram para o fígado, onde amadurecem e são libertados noutra forma (merozoítos), que

invade os glóbulos vermelhos. É uma doença grave, começando por apresentar sintomas

de febre, calafrios, dores, fraqueza e podendo evoluir para anemia grave, insuficiência

renal, falência de órgãos e alteração de consciência. (76,79)

No laboratório é utilizado um teste rápido para deteção da proteína rica em

histidina II (HRP-II do inglês, histidine rich protein II) de P.falciparum e lactato

desidrogenase de Plasmodium (pLDH), de P.vivax em sangue total, para diagnóstico

diferencial. A HRP-II é uma proteína localizada na superfície da membrana do eritrócito

infetado. A LDH é a enzima final na via glicolítica do parasita. (91)

Procedimento

A tira-teste consiste numa membrana, pré-revestida com anticorpos monoclonais.

Um dos dois tipos de anticorpos monoclonais é específico para o HRP-II do P.falciparum

e o outro para a lactato desidrogenase do Plasmodium vivax, que originam duas linhas

separadas. (91)



115

São adicionados 5µL de sangue ao poço da amostra do dispositivo de teste e

adicionado diluente ao poço de diluente do dispositivo. Após 15 minutos procede-se à

leitura do resultado. É necessária a visualização da linha controle para se poder validar o

resultado. No caso de se visualizarem duas bandas, o resultado é positivo para a banda

específica do tipo de Plasmodium; caso de visualizem 3 bandas, significa infeção mista.

(91)

4.5.Virologia

Os vírus são a causa mais comum de doença humana, tanto em países

desenvolvidos como em não desenvolvidos. São pequenos e incapazes de se multiplicar

fora de uma célula hospedeira. O virião (partícula viral) é composto por apenas um tipo

de ácido nucleico revestido por proteínas (cápside), que protegem o ácido nucleico e

permitem a ligação do virão à membrana da célula hospedeira. Se é envolvida por

glicoproteínas e uma membrana lipídica, estamos então na presença de um vírus com

invólucro. Na superfície da cápside, os vírus apresentam proteínas antigénicas

específicas que são essenciais para a infecciosidade e especificidade do vírus. A partir

do momento em que o genoma viral penetra na célula hospedeira, esta é usada pelo vírus

para as suas exigências energéticas e replicação. (76,77,79)

Os vírus causam doença quando atravessam as barreiras naturais, escapam ao

sistema imune e matam as células de tecidos importantes ou desencadeiam uma resposta

imune grave. Alguns vírus podem estabelecer infeções silenciosas das células, mas no

geral, a sua multiplicação causa danos ou morte, sendo que tanto fatores do vírus (estirpe,

tamanho do inóculo) como do hospedeiro (estado de saúde geral) podem interferir na

gravidade da infeção. O conhecimento das propriedades e dos mecanismos patogénicos

do vírus (entrada, disseminação e saída do hospedeiro) é crítico para o correto diagnóstico

e tratamento da doença. Métodos de diagnóstico usando reagentes com anticorpos e

técnicas de biologia molecular, tornam o diagnóstico viral mais fácil e rápido, sendo que

a história do paciente e sintomas são a primeira dica no diagnóstico de uma infeção viral.

(76,77,79)



116

4.5.1.Procedimentos para diagnóstico virológico

4.5.1.1.Aparelho gastrointestinal

Rotavírus

Vírus de ARN (ácido ribonucleico) entérico que provoca diarreia e gastroenterite

em humanos, sendo a principal causa de gastroenterite em crianças com menos de cinco

anos. É transmitido pela via fecal-oral e é altamente contagioso, com um período de

incubação de 2-3 dias. Os Rotavírus do grupo A são os principais agentes patogénicos

em humanos e animais e infetam a maioria das pessoas pelo terceiro ano de vida. VP6

(proteína viral 6) é uma proteína da cápside do vírus. (76,79)

Procedimento

É utilizado um teste rápido em amostras de fezes que consiste numa membrana

com partículas de ouro coloidal sensibilizada com anticorpos dirigidos contra o vírus. A

especificidade do teste é devida a um anticorpo monoclonal dirigido contra proteínas VP6

do vírus que é conjugado com as partículas de ouro, e este conjugado é colocado numa

membrana. (92)

Quando a tira-teste é colocada na suspensão fecal (fezes diluídas em diluente do

kit), os conjugados solubilizados migram com a amostra por difusão passiva e ficam em

contacto com o anticorpo na membrana que origina uma linha vermelha após 10 minutos.

A linha de controlo também deverá ser visível de modo a confirmar que o teste foi bem

realizado. (92)

Adenovírus

O Adenovírus é um vírus de ADN que representa a segunda causa principal de

gastroenterite viral em crianças com menos de dois anos. Podem ser divididos em grupos

de A a F, sendo que o grupo F é o mais envolvido na gastroenterite pediátrica. A infeção

ocorre predominantemente pela via fecal-oral e o vírus infeta as células epiteliais do

sistema gastrointestinal. O período de incubação dura entre 5-8 dias. (76,79) É utilizado

um teste rápido de diagnostico de gastroenterite por Adenovírus em amostras de fezes. O

método e procedimento utilizado são idênticos aos referidos para o diagnóstico de

gastroenterite por Rotavírus. A especificidade deste teste é conseguida pelo uso de



117

anticorpos monoclonais dirigidos contra proteínas especificas do Adenovírus humano.

(93)

Norovírus

Os Norovírus incluem os vírus do tipo Norwalk, e outros pequenos vírus que

causam gastroenterite, provocando diarreia aguda e vómitos. Não possuem invólucro e

são vírus de ARN. Tal como o Rotavírus e Adenovírus, a sua transmissão ocorre por via

fecal-oral. Os vírus crescem no intestino, causando lesões na mucosa intestinal e

libertados nas fezes. O período de incubação dura cerca de 12-48h. A infeção por

Norovírus ocorre em todo o mundo, sendo mais comum em crianças mais velhas e

adultos. (76,79)

No laboratório, o diagnóstico é feito através de um teste rápido

imunocromatográfico para deteção qualitativa de Norovírus em fezes. (94)

Procedimento

Este teste é baseado em anticorpos monoclonais, que permite detetar antigénios

em amostras de fezes de forma rápida. Os reagentes do kit e a amostra são adicionados a

um tubo de ensaio. A mistura é agitada e deixada a sedimentar, de modo a se poder

adicionar cerca de 150µL do sobrenadante ao dispositivo de teste. A leitura do resultado

é feita após 15 minutos. O vírus estará presente caso se verifique a existência da banda

do teste e do controlo, para garantir confiança no resultado. A intensidade da cor depende

da quantidade de antigénio presente na amostra. (94)

4.5.1.2.Aparelho respiratório

Adenovírus

É realizado um teste rápido de diagnóstico para a deteção de Adenovírus

respiratório em secreções nasofaríngeas.

O alvo principal dos Adenovírus é o trato respiratório, pelo que são responsáveis,

entre outras, por patologias no trato respiratório e infetam maioritariamente crianças. A

infeção ocorre pela inalação de aerossóis e por contato direto, originado uma forte

resposta imunitária, podendo ser fatal em pacientes imunocomprometidos. (76,79)



118

Procedimento

O teste é baseado numa membrana com partículas de ouro coloidal com anticorpos

dirigidos contra o vírus. Quando a amostra entra em contacto com a tira-teste, o conjugado

(anticorpo monoclonal dirigido contra antigénios do vírus/partículas de ouro) migra com

a amostra e entram em contacto com o anticorpo anti-Adenovírus adsorvido na membrana

de nitrocelulose da tira-teste. Se a amostra contem o vírus, será visível uma banda na tira.

Uma banda controlo também deverá ser visível para validar o teste. (95)

Influenza A+B

O vírus Influenza provoca uma infeção viral aguda e altamente contagiosa do trato

respiratório. Há três tipos de vírus Influenza. O tipo A é o mais prevalente e associado a

epidemias mais graves. O tipo B produz patologias geralmente menos graves. Os vírus

desta família têm um genoma de ARN segmentado e possuem invólucro. A transmissão

do vírus dá-se por via aérea, através de aerossóis, e o vírus multiplica-se nas mucosas do

aparelho respiratório causando inflamação celular e originando síndrome febril, garganta

dorida, mialgias, tosse entre outros sintomas que duram cerca de 5 dias. Complicações

podem originar pneumonia.(76,79)

Para o diagnóstico diferencial dos tipos A e B do vírus é usado um teste rápido

para deteção qualitativa dos antigénios dos vírus Influenza tipo A e tipo B em amostras

nasais ou nasofaríngeas. Os antigénios podem ser detetados por imunoensaio, que utiliza

anticorpos monoclonais específicos para os antigénios do vírus. (96)

Procedimento

A amostra é colocada num tubo com reagente e as partículas do vírus expõem as

nucleoproteínas internas. Depois, é colocada a tira teste dentro do tubo, com a qual as

nucleoproteínas vão reagir. Caso a amostra contenha antigénios do vírus, uma linha irá

aparecer na tira teste, correspondente ao tipo de vírus, juntamente com a linha de controlo,

de modo a confirmar que o teste foi realizado corretamente. (96)

Vírus Sincicial Respiratório

É utilizado um teste rápido que consiste num imunoensaio cromatográfico para

deteção qualitativa do Vírus Sincicial Respiratório (RSV, do inglês, Respiratory Syncytial

Virus) em aspirados nasofaríngeos.



119

O RSV como o nome indica, infeta células do trato respiratório e dissemina-se

localmente. A sua transmissão dá-se por inalação de aerossóis. É o vírus mais comum em

bebés e crianças pequenas. Provoca sintomas idênticos aos da constipação comum, mas

também pode provocar infeções graves ou ser fatal. (76,79)

Procedimento

O teste é imobilizado com anticorpos monoclonais específicos. É adicionada

solução tampão e amostra ao tubo de ensaio. Após homogeneizar e repousar 10 minutos,

insere-se a tira-teste imobilizada com anticorpos no tubo de ensaio e o resultado é lido

passado 15 minutos. Se a amostra contem o vírus, será visível uma banda na tira. Uma

banda controlo também deverá ser visível para validar o teste. (97)

4.5.1.3.Mononucleose infeciosa

A mononucleose infeciosa é causada pelo vírus Epstein-Barr, que pertence à

família dos vírus Herpes, vírus grandes de ADN com invólucro. É transmitido através da

saliva e os sintomas incluem febre, dores de garganta, faringite e inflamação das glândulas

linfáticas e linfocitose atípica nos jovens e adultos; nas crianças a doença normalmente é

assintomática ou ligeira. (76,79)

No laboratório é utilizado um teste rápido de imunoensaio que deteta a presença

de anticorpos heterófilos - classe IgM (imunoglobulina M), presentes na maioria dos

casos de mononucleose infeciosa aguda. A amostra utilizada é sangue total, soro ou

plasma. (98)

Procedimento

O antigénio é imobilizado na região da linha de teste e a amostra reage com

partículas revestidas de antigénio. Esta mistura migra cromatograficamente e interage

com o antigénio imobilizado. Caso a amostra contenha anticorpos heterófilos, aparece

uma linha colorida na região da linha de teste. Aparece também uma linha colorida que

serve de controlo. (98)



120

4.5.1.4.Dengue

Dengue é uma doença tropical infeciosa causada pelo Vírus da Dengue, um

arbovírus do género Flavivírus (vírus de ARN). O Vírus da Dengue é transmitido por

mosquitos do género Aedes. Existem quatro serotipos do vírus (1-4). No geral, a infeção

é subclínica. Se o paciente é infetado duas vezes com um serotipo diferente, ocorre doença

severa. O indivíduo hospedeiro deste vírus, tem manifestações cutâneas e febre; mais

grave se for febre hemorrágica por Dengue. (76,79)

A glicoproteína não estrutural 1 (NS1) é uma glicoproteína presente no soro dos

pacientes em altas concentrações. No caso do resultado ser positivo para o antigénio IgM

indica que a infeção é primária. Se o anticorpo detetado for IgG (imunoglobulina G)

indica infeção secundária. No caso de serem os dois detetados, é uma indicação de infeção

tardia primária ou infeção secundária precoce. (99)

Procedimento

É realizado um teste que consiste num ensaio imunocromatográfico que deteta o

antigénio NS1 do vírus e deteta e diferencia os anticorpos IgM e IgG em soro, plasma ou

sangue total em dois dispositivos de teste isolados. Para isso, a amostra é adicionada nos

poços respetivos dos dispositivos de teste e o resultado é lido passado 15 minutos. A

presença de duas linhas (teste e controlo) nas janelas de resultados indicam positividade

do teste. (99)

4.5.1.5.Vírus da Imunodeficiência Humana

Os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) são retrovírus de ARN, com

envelope, transmitidos principalmente por via sexual, parental, perinatal e

transplacentária, que podem causar SIDA. Existem duas espécies de HIV que infetam

humanos: HIV-1 e HIV-2. O tropismo deste vírus para as células T CD4+ é determinante

para a patogénese do vírus, que compromete o funcionamento do sistema imunitário. No

período inicial da infeção, o paciente pode manifestar sintomas de fase aguda,

nomeadamente febre, suores, mialgias, dores de garganta, lingadenopatias, náuseas,

diarreias e erupções cutâneas, seguindo-se um longo período de latência clínica, em que

normalmente ocorrem infeções oportunistas. (76,79)

É utilizado um teste automatizado, de rastreio, baseado na deteção combinada de

uma proteína estrutural (antigénio p24) do HIV-1 e das imunoglobulinas totais anti-HIV-



121

1 e anti-HIV-2, que permite reduzir a janela serológica (intervalo de tempo entre a

contaminação e o diagnóstico da infeção). (100)

Amostra: soro ou plasma (heparina de lítio ou EDTA).


Método: ensaio imunoenzimático com deteção final em fluorescência

Primeiramente, a amostra e o anticorpo anti-p24 presentes na barrete são aspirados

para dentro do cone, o vírus é lisado e os antigénios são libertados e ligam-se aos

anticorpos anti-p24 fixados no cone. Simultaneamente, os anticorpos anti-HIV 1 e 2 vão

fixar-se à glicoproteína 160 de HIV-1 e péptidos específicos de HIV-1 e HIV-2 presentes

na parte inferior do cone. Uma segunda incubação com antigénios presentes na barrete é

efetuada na parte inferior do cone, e estes antigénios fixam-se aos anticorpos anti-HIV

presentes.

Uma terceira incubação com estreptavidina marcada com fosfatase alcalina é

efetuada na totalidade do cone, que se fixa aos anticorpos anti-p24 e aos antigénios.

O substrato (4-metil-umbeliferil fosfato) é inicialmente incubado na parte inferior

do cone, e é feita uma primeira leitura de fluorescência a 450nm. A intensidade da

fluorescência é proporcional à presença de anticorpos anti-HIV. De seguida, o substrato

é incubado na totalidade do cone e é efetuada uma segunda leitura que é proporcional à

concentração de antigénio p24 do HIV-1 presente na amostra. (100)


Negativo: valor <0,25 (para a deteção antigénio e anticorpo)

Positivo: valor ≥0,25 (para a deteção antigénio ou anticorpo)

4.5.1.6.Hepatite B

O Vírus da Hepatite B (HBV, do inglês, hepatitis B virus) pertence a uma família

de vírus com tropismo para as células do fígado. São vírus de ADN com invólucro. A

infeção por este vírus pode conduzir a uma hepatite aguda ou crónica. A hepatite aguda

pode ser assintomática ou apresentar sintomas de gravidade variável que podem conduzir

a hepatite fulminante. O vírus pode ser transmitido por via parenteral, perinatal e sexual.

Os marcadores serológicos são essenciais para a determinação do estadio da doença.

(76,79)



122

O antigénio de superfície do HBV (AgHBs) aparece vários dias a semanas, após

uma exposição ao vírus e pode persistir vários meses. A presença deste antigénio durante

mais de 6 meses define serologicamente a infeção crónica. (101)

Amostra: soro ou plasma (heparina de lítio)


Método: ensaio imunoenzimático com deteção final em fluorescência

Este teste permite a deteção qualitativa do antigénio de superfície do HBV. O

antigénio da amostra liga-se simultaneamente ao anticorpo monoclonal fixado no cone e

ao anticorpo conjugado com biotina. Este complexo é colocado em contacto com a

estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina, que se liga à biotina. Na etapa final, o

substrato (4-metil-umbeliferil fosfato) é dispensado pelo cone e a enzima do conjugado

catalisa a reação de hidrólise num produto que emite fluorescência a 450nm. O valor

medido é proporcional à concentração do antigénio na amostra. (101)


Negativo: <0,10

Positivo: ≥0,10

4.6.Controlo de Qualidade em Microbiologia

Controlo de Qualidade Interno

O conceito de Qualidade em Microbiologia deve ser encarado como parte do

conceito mais vasto da Qualidade dos Serviços de Saúde, com o objetivo de fornecer

resultados válidos, que assistam ao estabelecimento do diagnóstico pelo clínico. As

práticas de trabalho e equipamentos utilizados devem ser monitorizadas continuamente.

Todos os equipamentos, incluindo estufas e frigoríficos devem ter programas de

manutenção e funcionar corretamente. No entanto, ao contrário de outras áreas analíticas,

não é necessária a monitorização diária de todos os reagentes, meios de cultura e técnicas

usados.(72)

No laboratório, todas as semanas são feitos reisolamentos de estirpes definidas

(estirpes de referência) em GS: E.coli, E.faecalis, S.aureus, P.aeruginosa, K.



123

pneumoniae, S. pneumoniae. Estes reisolamentos são utilizados para fazer identificação

(uma estirpe GN e outra GP uma vez por mês) e TSA (todas as semanas) no VITEK.

O laboratório de microbiologia deve recusar a requisição de exames que não

permitam obter resultados clinicamente fiáveis, como por exemplo, amostras de

expetoração para cultura de anaeróbios. Por outro lado, a qualidade das amostras colhidas

é de extrema importância para a qualidade dos resultados obtidos, pelo que se devem

seguir as normas do manual de colheitas e na mesma ordem de ideias, o manual de

procedimentos, devidamente atualizado, para diminuir a possibilidade de ocorrência de

erros e melhorar a qualidade dos resultados obtidos. (72)

Avaliação Externa da Qualidade

Consiste na avaliação do desempenho do laboratório por terceiros através da

análise dos resultados obtidos em amostras “fictícias”, que devem ser analisadas como

todas as outras amostras que entram no laboratório de microbiologia. O laboratório

participa nestas atividades através de diversas entidades externas, nomeadamente do

Serviço Nacional de Avaliação Externa da Qualidade do Reino Unido (UK-NEQAS, do

inglês, United Kingdom National External Quality Assessment Service), da qual recebe

amostras mensalmente.


Catarina Alves Genética

124

5.Genética

A GenoMed organiza-se em duas grandes unidades: Doenças Genéticas e

Farmacogenética (DGF) e Oncologia, sendo que esta última está dividida nas áreas de

Biologia Molecular, Citogenética e Tumores Sólidos. O laboratório processa pedidos de

todo o país, recebendo diferentes tipos de amostras biológicas enviadas por inúmeras

entidades de saúde ou fazendo diretamente a colheita ao utente nas suas instalações, por

exemplo de amostras como sangue periférico por punção venosa, sangue capilar em

“blood stain card” ou esfregaços bucais em zaragatoas.

Assim que recebidas as amostras para diagnóstico molecular, estas são sujeitas a

triagem pela secretária clínica, que possui informação acerca dos critérios de rejeição de

amostras definidos pelo laboratório, nomeadamente no que se refere ao tipo de amostra,

condições em que é entregue, correta identificação do utente ou ausência da

documentação exigida (por exemplo, requisição com pedido, termo de responsabilidade

ou consentimento informado, quando aplicável). Todas estas informações são

disponibilizadas aos clínicos através do documento controlado “Manual de Colheitas”,

que se encontra disponível para consulta, por exemplo, no website institucional da

GenoMed, assim como as requisições das diferentes áreas.

A confidencialidade dos dados dos doentes é assegurada pela sua codificação,

através da atribuição de um número de caso à amostra, sequencial, seguido das iniciais

do seu nome.

5.1.Doenças Genéticas

As mutações podem ocorrer em grande escala, envolvendo anomalias

cromossómicas, ou em pequena escala (doenças monogénicas ou mendelianas), que

podem ser agrupadas em substituições de bases, deleções ou inserções. Podem ocorrer

nas células germinativas em que o indivíduo afetado poderá transmitir a mutação à

descendência ou nas células somáticas, que estão na origem de certos cancros e não são

transmitidas à descendência. A taxa de mutação no organismo humano é baixa, pelo que

a maioria da variação alélica é herdada e não o resultado de mutações de novo. (102)



125

Na área das Doenças Genéticas são diagnosticadas patologias com origem em

mutações germinais.

Os procedimentos aqui descritos são aqueles com que tive contacto, sendo apenas

uma pequena parte de todos os procedimentos e técnicas realizadas tanto nas Doenças

Genéticas, como na Biologia Molecular, Citogenética e Tumores Sólidos.

A marcha geral realiza-se da seguinte forma:

5.1.1Métodos

5.1.1.1Extração ADN genómico

A amostra de partida é sangue periférico obtido por punção venosa, em tubo com

EDTA, pois a heparina interfere com a reação em cadeia da polimerase. Todo o

procedimento é realizado na câmara de segurança biológica de classe II.

Os glóbulos vermelhos são lisados com uma solução hipotónica, tampão de lise

de eritrócitos (RCLB) e os tubos colocados em gelo durante cerca de 20 minutos. Após

centrifugação obtêm-se os leucócitos (precipitado branco). Despreza-se o sobrenadante e

adiciona-se Solução de Lise Celular para lisar os leucócitos. Adiciona-se solução de

precipitação de proteínas e realiza-se nova centrifugação, da qual se obtém um precipitado

castanho composto pelas proteínas. O sobrenadante obtido é transferido para novos tubos

contendo isopropanol, nos quais, após inversão, se observa a formação de um “novelo”

de ADN. É adicionado etanol a 70% de modo a lavar o ADN e é realizada nova

centrifugação. Após secagem do ADN, este é ressuspendido em tampão Tris-EDTA (TE),

com volume dependente da quantidade de ADN obtido, de modo a hidratar.

Extração do ácido nucleico

PCR EletroforesePurificação dos

produtos de PCR

Sequenciação Sanger

Análise dos resultados

Relatório



126

5.1.1.2.Quantificação de ADN

Os ácidos nucleicos absorvem radiação ultravioleta (UV), entre os 220nm e os

320nm, devido às duplas ligações conjugadas nos anéis heterocíclicos das bases azotadas,

sendo o pico de absorção máxima aos 260nm. (9,103)

É utilizado um espectrofotómetro - NanoDrop® - que permite realizar a

quantificação, a partir de pequenos volumes de amostra (1µl).

Primeiramente, é adicionado 1µl do branco (TE), sendo que o valor obtido deverá

estar entre os -0,5 e 0,5 ng/µl. Aplicam-se as amostras a quantificar, e no fim é lido o

branco novamente.

São também realizadas medições aos 230nm e 280nm, de modo a obter as

seguintes razões:

𝑅1 =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑣â𝑛𝑐𝑖𝑎 260𝑛𝑚

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑣â𝑛𝑐𝑖𝑎 280 𝑛𝑚 ≈ 1.8 𝑅2 =

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑣â𝑛𝑐𝑖𝑎 260𝑛𝑚

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑣â𝑛𝑐𝑖𝑎 230𝑛𝑚 ≈ 1.8 – 2.2

Estes valores oferecem indicações acerca da pureza do ADN e caso sejam

diferentes do esperado, poderá significar que a amostra está contaminada com proteínas

ou outros contaminantes que absorvam próximo do comprimento de onda medido.

(9,103) Após quantificação, as amostras são armazenadas a +4ºC.

5.1.1.3Reação em cadeia da polimerase

A técnica de PCR consiste numa reação que amplifica determinada região do

ADN que se pretende estudar. Para que esta ocorra são necessários primers de ADN

desenhados especificamente para a região de interesse, bem como o molde de ADN,

tampão, magnésio (necessário para o eficaz funcionamento da polimerase),

desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) e a enzima polimerase de ADN. (104)

Inicialmente, a sequência conhecida é usada para desenhar dois oligonucleótidos

sintéticos de ADN, complementares a cada uma das cadeias da dupla hélice de ADN e

situados em lados opostos da região a ser amplificada (primers). Estes oligonucleótidos

determinam as extremidades do fragmento a amplificar. A reação é catalisada por uma

polimerase de ADN termo-estável (Taq) e consiste em ciclos repetidos de diferentes fases,

a diferentes temperaturas. Após uma desnaturação inicial (95-96ºC), segue-se a

desnaturação da cadeia molde de ADN (94-96ºC). A desnaturação permite que os primers

hibridem com as suas sequências complementares na fase de annealing, cuja temperatura



127

depende dos primers usados. Segue-se uma fase de extensão a 72ºC em que atua a

polimerase de ADN, terminando com um passo de extensão final (72ºC). (9,104,105)

A amplificação origina um aumento exponencial de cadeias formadas, sendo que

a quantidade da sequência alvo duplica a cada ciclo. É usado um termociclador, aparelho

que realiza os ciclos de temperaturas necessários para a realização da reação, variando a

temperatura de forma rigorosa. São realizados, normalmente, 35 ciclos.

Algumas variáveis podem interferir na reação de PCR, nomeadamente o número

de ciclos, a temperatura, o tempo que dura cada ciclo, bem como os primers usados, a sua

especificidade e tamanho. Compostos como a heparina, fenol também inibem a reação.

A temperatura de annealing deve ser otimizada: se for muito elevada, os primers não se

irão ligar ao ADN e se for muito baixa, poderão ocorrer ligações inespecíficas. No caso

de se observarem produtos inespecíficos da reação, podem ser usados adjuvantes,

desnaturantes e outros reagentes, nomeadamente dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol,

formamida. Estes compostos podem estabilizar a polimerase e aumentar a especificidade

das ligações dos primers. (104)

Procedimento:

São identificados tubos de acordo com o número de amostras a estudar, bem como

os respetivos controlos negativos.

Prepara-se a mistura de PCR - água, tampão, dNTPs, cloreto de magnésio

(MgCl2), primers, Taq polimerase - para o número de amostras a estudar e para cada exão

e reparte-se pelos tubos. Adiciona-se o ADN ao tubo da amostra e ao do controlo negativo

adiciona-se água. Colocam-se as amostras no termociclador com o programa definido.

Depois da amplificação por PCR, corre-se um gel de agarose, de modo a observar

a qualidade da amostra ou armazena-se a +4ºC.

5.1.1.4.Eletroforese em gel de agarose

Esta técnica é usada de modo a avaliar a qualidade dos produtos de PCR e baseia-

se na separação dos fragmentos de ADN de acordo com a sua massa molecular, quando

sujeitos a corrente elétrica. Sendo que estes estão carregados negativamente, ocorre

migração do polo negativo para o polo positivo. (9,104)

O tampão usado é Tris-Borato-EDTA (TBE) 0.5X que separa fragmentos de ADN

entre 100pb e 1kb. Para preparar o gel, a agarose é misturada com solução tampão (TBE).



128

Após fundir, é adicionado Gel Red ou Green Safe Premium, corantes que emitem

fluorescência quando ligados ao ácido nucleico e expostos ao UV, de modo a que o ADN

possa ser visualizado.

Após adição de Gel loading dye blue 6X, as amostras e controlos respetivos, são

aplicadas nos poços do gel, não esquecendo o marcador de bandas moleculares, de modo

a verificar o tamanho dos fragmentos.

O gel é visualizado num transiluminador de luz UV e é tirada uma fotografia aos

resultados, que é colada na folha de trabalho.

Como foi referido anteriormente, a eletroforese permite avaliar a qualidade do

produto amplificado por PCR e caso se verifique a presença de várias bandas indica

inespecificidade da reação. A presença de uma banda no controlo negativo indica

contaminação.

Alguns aspetos podem interferir na boa resolução do gel, nomeadamente o corante

utilizado (Gel Red é mais sensível, mas a resolução não é tão boa, pode usar-se quando a

concentração de amostras é baixa. O Green Safe é o mais usado, menos sensível), a

concentração de tampão e gel, voltagem e a quantidade de ADN aplicada, sendo que estes

parâmetros devem ser otimizados.

5.1.1.5.Purificação dos produtos de PCR

A purificação dos produtos de PCR é necessária para remover componentes da

reação que possam interferir com a sequenciação, como primers ou dNTPs em excesso.

Os produtos são colocados numa placa de purificação de 96 poços com membrana,

à qual é aplicada uma bomba de vácuo, com o objetivo de separar os fragmentos

amplificados da solução. Após todo o líquido atravessar as membranas, é feita

ressuspensão com água nuclease free e a placa é colocada em agitação. Os produtos são

recuperados para novos poços e armazenados a +4ºC.

Sequenciação de Sanger

O método usado para determinar as sequências nucleotídicas é a sequenciação

pelo método de terminação em cadeia, ou sequenciação de Sanger. Parte-se dos produtos

de ADN genómico amplificados por PCR, previamente purificados.

São sintetizadas cadeias a partir do fragmento de ADN em estudo, pela polimerase

de ADN, que incorpora nucleótidos terminadores de cadeia, didesoxirribonucleótidos



129

trifosfato (ddNTPs), marcados com fluorocromos diferentes, que ao contrário dos dNTPs,

não possuem o grupo 3’-OH, pelo que quando são incorporados terminam a cadeia. Cada

reação de sequenciação é feita para cada primer, num tubo e origina moléculas de ADN

de tamanho variável, cada uma terminando numa base diferente com fluorescência

diferente. Tal como na reação de PCR, ocorrem ciclos de desnaturação, hibridação e

extensão; no entanto, é utilizado um único primer. (9,102,104)

Faz-se a mistura com os reagentes necessários à reação e distribui-se pelos

microtubos devidamente identificados, aos quais se adiciona o produto de PCR respetivo,

previamente purificado, um com o primer forward e outro com o primer reverse. Os

produtos são colocados no termociclador com um programa pré-definido e depois devem

ser armazenados a -20ºC ou purificados antes de serem colocados no sequenciador

automático.

A purificação pode ser feita pelo método de vácuo (mais rápido) ou por

etanol/acetato de sódio (mais eficiente). Na primeira, os produtos são colocados numa

placa de purificação de 96 poços com membrana, à qual é aplicada bomba de vácuo.

Como tampão de lavagem é utilizado TE e após duas lavagens o produto é ressuspendido

em EDTA e transferido para placa de sequenciação. Na segunda, é adicionada uma

mistura de reagentes (etanol, acetato de sódio e água) a cada reação de sequenciação. A

placa é selada e após 15 minutos, é centrifugada e as amostras ressuspendidas em etanol

70%. Após centrifugações, seca-se os produtos e armazenam-se a -20ºC (pode adicionar-

se formamida) ou parte-se para sequenciação. A formamida é um agente desnaturante,

mas pode interferir na reação de sequenciação, na medida em que altera o sinal de

fluorescência devido à sua capacidade de absorver água do ar e originar outros produtos,

criando picos extra de guanina nas sequências obtidas.

Após purificação, as amostras são colocadas no sequenciador automático, que

consiste num sistema de eletroforese capilar, que realiza a separação dos fragmentos e

num detetor de fluorescência. Neste tipo de eletroforese, o capilar é o suporte sólido que

contém a fase estacionária (polímero) que permite a separação. As cadeias de ADN

formadas passam através de um capilar migrando do cátodo para o ânodo devido a uma

diferença de potencial que é gerada pelo aparelho. A sequência do fragmento é

determinada e registada num electroferograma. Uma quantidade elevada de ADN pode

originar “ruído de fundo” no electroferograma e em contrapartida, pouca quantidade de

amostra pode não ser detetada, originando baixo sinal de fluorescência. (9)



130

5.1.2.Análise e relatório

A sequência do fragmento de ADN de interesse é determinada e comparada com

a sua sequência de referência, sendo de extrema importância conhecer bem o gene com

que se está a trabalhar. Geralmente a sequência é analisada nos dois sentidos, o que

aumenta a exatidão da sequenciação. Usando programas informáticos de comparação, é

possível identificar diferenças entre as sequências. O Sequencher (106) identifica tudo o

que está diferente da sequência original. Através da consulta de várias bases de dados

(107–109) pesquisa-se acerca do significado da variante encontrada que poderá ser

patogénica, se já conhecida e descrita como tal, de significado desconhecido ou uma

alteração nova. Todas as variantes já descritas como benigna ou provavelmente benigna,

não são reportadas.

5.1.3.Exemplo de aplicação

A Hemocromatose hereditária (HH) é uma doença autossómica recessiva

caracterizada pelo aumento da absorção intestinal de ferro, que resulta na sua acumulação

no organismo. A classificação da HH depende de fatores como causa genética e idade de

início da doença. A HH do tipo 1 é a mais comum, inicia na vida adulta e está associada

ao gene que codifica a proteína da Hemocromatose Hereditária (HFE) (110,111). A

função da proteína codificada por este gene, expressa nos enterócitos e hepatócitos, terá

como função o controlo do ferro no organismo, regulando a sua absorção, transporte e

armazenamento, mas ainda não se conhece totalmente este mecanismo. (110) Mutações

neste gene prejudicam o controlo da absorção de ferro na digestão, bem como a

distribuição deste para outras partes do corpo, que se acumula em tecidos e órgãos. (111)

O teste genético molecular para a hemocromatose hereditária ajuda no diagnóstico

da patologia ou prevenção do risco da sua existência. A presença de mutação no gene

HFE indica a existência de alteração genética relacionada à HH e maior predisposição ao

desenvolvimento do fenótipo da doença. (112)

A maioria dos pacientes são homozigóticos para a mutação missense C282Y no

exão 4 do gene HFE, que leva a substituição do aminoácido cisteína por uma tirosina na

posição 282. Para além desta, outras mutações foram identificadas e estudadas,

nomeadamente a mutação H63D (histidina substituído por aspartato na posição 63), no

exão 2 do gene HFE (figura 9).



131

Figura 9. Eletroferograma do exão 2 do gene HFE. A troca de uma citosina por uma

guanina na posição 187 do exão 2 (c.187C˃G), leva a troca do aminoácido histidina pelo

aspartato no codão 63 (H63D).

Esta normalmente não está associada à sobrecarga de ferro, a não ser que a C282Y

esteja também presente (heterozigóticos compostos). Os homozigóticos para C282Y têm

maior risco de sobrecarga de ferro do que os heterozigóticos compostos. (113,114)

5.2.Citogenética

Na área da citogenética é feita a pesquisa de anomalias adquiridas, em contexto

tumoral, através do estudo dos cromossomas. Estas anomalias também podem ser

estudadas na biologia molecular (descrito no capítulo seguinte), sendo que são usadas

diferentes técnicas com diferentes sensibilidades.

A citogenética auxilia no diagnóstico, prognóstico e escolha da terapêutica, em

que determinadas anomalias são candidatas a determinado fármaco e na monitorização

de resposta à terapêutica. (115)

Muitas anomalias cromossómicas causam alterações nas funções das células e do

organismo. A maioria destas anomalias decorre de alterações no número ou posição dos

genes. Nalguns casos, as anomalias resultam da quebra dos cromossomas, alterando a sua

estrutura, o que pode levar a alterações funcionais dos genes. No caso dos rearranjos

cromossómicos, podem originar vários eventos; uma parte do cromossoma pode ser

eliminado, originando uma deleção; pode ser duplicado; podem ocorrer alterações na



132

orientação dos cromossomas, ou um segmento pode ser inserido noutro cromossoma,

criando uma translocação. (102,116)

Na citogenética convencional é realizada uma análise da totalidade do cariótipo.

A análise do cariótipo é uma técnica menos específica, mas com pouca sensibilidade, na

medida em que apenas se analisam 20 ou 30 células em cada amostra, e as células

necessitam de estar em divisão. As células estudadas podem ser células normais e não

clones malignos, ou podem estar presentes anomalias não visíveis pelo cariótipo. Para

além destas limitações, a citogenética convencional é uma técnica dispendiosa, na medida

em que ocupa muito tempo ao operador. (115)

Algumas alterações citogenéticas não são detetáveis pela citogenética

convencional. Na citogenética molecular é utilizada a técnica de hibridação in situ de

fluorescência (FISH, do inglês, fluorescence in situ hybridization).

Esta é uma técnica mais sensível que o estudo do cariótipo, na medida em que são

analisadas cerca de 200 células, contrariamente às 20 células analisadas no estudo do

cariótipo e uma técnica mais específica uma vez que são se procura uma anomalia

específica. Em contrapartida, o custo dos reagentes utilizados é elevado e ocorre

deterioração das sondas após alguns meses. (115,117)

As amostras usadas na citogenética são sangue medular, sangue periférico

(amostra de menor qualidade) ou parafinas (no caso de tumor sólido).

5.2.1.Métodos

5.2.1.1.Citogenética convencional - estudo do cariótipo

Os cariogramas são preparados usando procedimentos padronizados de coloração

que revelam características estruturais em cada cromossoma. Na figura 10 observa-se um

exemplo de cariograma do sexo feminino, com bandeamento Giemsa, o mesmo utilizado

no laboratório. (116)



133

Figura 10. Exemplo de cariograma do sexo feminino (46,XX) com bandeamento

Giemsa. Adaptado de (116).

Das várias fases que constituem a mitose, é na metafase que os cromossomas

atingem o máximo de condensação e o centrómero e os dois cromatídeos são visíveis ao

microscópio ótico, sendo nesta altura que a citogenética clássica é aplicada. Cada

cromossoma tem um padrão de bandas distinto e vão pesquisar-se alterações nesses

padrões. Estas alterações podem ser razoavelmente fáceis de identificar, nomeadamente

alterações no número de cromossomas; ou mais difíceis, como alterações estruturais.

(102)

No caso dos mielomas, é difícil as células entrarem em divisão celular, pelo que

o operador pode facilmente identificar um cariótipo normal por não estar a ver as células

alvo. (115)

Os procedimentos para o estudo do cariótipo passam pela cultura das células,

colheita das metafases, espalhamento e coloração para posterior observação

microscópica. O tipo de cultura a utilizar depende do diagnóstico e devem ser

estabelecidas culturas múltiplas de modo a maximizar a probabilidade de obter células

anormais em divisão. As células da linhagem mieloide normalmente necessitam de menos

tempo em cultura do que a linhagem linfoide para obter maior rendimento. Alguns

compostos podem ser adicionados às culturas, de modo a induzir a divisão celular, como

a fitohemaglutinina à linhagem T ou o 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) à

linhagem B. (115)



134

Cultura de células

A amostra utilizada é sangue medular em heparina, que é colocada em meio

completo com antibióticos e nutrientes. Após centrifugação, são retirados os leucócitos

para as diferentes culturas, adicionados os respetivos mitogénios de acordo com a

patologia a estudar e estas são colocadas na estufa com atmosfera de CO2 a 37ºC e

ambiente húmido.

Após o período de incubação é adicionado colcemid, composto que trava a divisão

em metafase, sendo que o tempo até à sua adição também depende do diagnóstico. A ação

prolongada da colcemid na cultura é citotóxica. Adicionada logo, aumenta a

probabilidade de encontrar o clone anormal, mas piora a morfologia dos cromossomas.

Adicionando após 24h, a morfologia dos cromossomas é melhor, mas poderão existir

menos metafases. (115)

Colheita das metafases

Os tubos retirados da estufa são centrifugados e é adicionado cloreto de potássio

(KCl, solução hipotónica) que origina um choque osmótico para promover a libertação

das metáfases quando o sedimento é espalhado. É adicionado fixador (metanol e acido

acético 3:1) e os tubos são guardados no congelador.

Espalhamento

O espalhamento dos cromossomas é afetado pela temperatura e humidade. Para

cada cultura fazem-se sempre duas lâminas. Após centrifugação dos tubos, é adicionado

fixador para obter a densidade celular adequada. Com pipeta de Pasteur, deixa-se cair

algumas gotas de sedimento celular nas lâminas previamente identificadas e mergulhadas

em água de modo a formar um filme aquoso. Imediatamente a seguir, é adicionada uma

gota de fixador e as lâminas são colocadas a secar verticalmente e de seguida, na estufa a

60ºC para envelhecerem durante cerca de 3 dias.

Coloração

Inicialmente, são realizados dois testes com tripsina para testar as lâminas antes

da coloração final, de modo a otimizar o tempo de tripsina. Esta enzima permite que haja

bandeamento dos cromossomas para haver ligação do corante.



135

Para isso, as lâminas são retiradas da estufa e mergulhadas individualmente na

solução de trabalho de tripsina e logo de seguida mergulhadas na solução de metanol para

inativar a ação da enzima. De modo a corar o material genético, é utilizada solução de

trabalho de Leishman. Após secagem das lâminas, estas são montadas com lamela,

usando Entellan como meio de montagem. As preparações são observadas num

microscópio ótico de campo claro com uma ampliação de 1000x.

5.2.1.2.Interpretação do cariótipo

A análise do cariótipo requer muita experiência e alerta. É tão fácil detetar uma

anomalia simples, como é falhar a identificação de uma anomalia mais subtil. É utilizado

um software que captura imagem da metafase e permite trabalhar a imagem (apagar o

lixo e alterar a orientação dos cromossomas) de modo a obter o cariograma. Cada

cromossoma é identificado pelo operador, a partir dos seus padrões de bandas.

Na interpretação do cariótipo obtido, é tido em conta o número de cromossomas

de cada célula, a composição dos cromossomas sexuais e a identificação de anomalias

cromossómicas, se existentes. Em cada amostra são analisadas pelo menos 20 metafases

na pesquisa de anomalias. Em diagnóstico inicial, se for encontrada anomalia, basta ver

10 metafases. No caso de ser uma amostra de follow-up, para monitorizar resposta a

terapêutica, devem ser sempre analisadas 20 metafases na pesquisa da presença ou

ausência de anomalias. Nas anomalias clonais, basta identificar 2 cromossomas com a

mesma anomalia estrutural ou ganho do mesmo cromossoma; ou 3 metafases com perda

do mesmo cromossoma.

No relatório final, o cariótipo obtido é reportado de acordo com a nomenclatura

do Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética Humana (ISCN, do inglês,

International System for Human Cytogenetic Nomenclature), que permite que as

anomalias reportadas sejam reconhecidas em qualquer laboratório.

É importante referir que a observação de um cariótipo normal não significa a

ausência de um clone maligno, sendo que este pode estar presentes em níveis demasiado

baixos.



136

5.2.1.3.Separação de células mononucleadas

Este procedimento consiste no isolamento das células mononucleadas de sangue

periférico ou sangue medular para uso posterior nas técnicas de FISH normal (fixação

com metanol /ácido acético) e FISH de mieloma (fixação com metanol /acetona). O

gradiente que separa o sangue consoante a densidade das células é o gradiente Ficoll.

Procedimento

Após identificação dos tubos necessários, pipeta-se solução de gradiente. O

volume da amostra é diluído com tampão fosfato-salino (PBS) (sangue: igual volume de

PBS, medula: dobro do volume de PBS) e transfere-se sobre a solução de gradiente com

posterior centrifugação.

O anel de células mononucleadas formado é removido e transferido para novo

tubo, onde ocorre a lavagem das células com PBS. De seguida, o pellet é ressuspendido

em fixador. Para FISH normal, o fixador usado é metanol/ácido acético 3:1. Para FISH

mieloma, o fixador usado é metanol/acetona 1:1. Os tubos são guardados a -20ºC.

5.2.1.4.Citogenética molecular - FISH

A citogenética molecular permite localizar sequencias especificas de ADN no

cromossoma através do uso de sondas fluorescentes. A análise é feita em núcleos

interfásicos (100-200 núcleos) e é realizada uma interpretação dos padrões de hibridação.

(115)

A técnica de FISH tem diferentes procedimentos consoante a amostra de partida

é sangue/medula ou parafina. A parafina é a amostra utilizada quando se estuda um tumor

sólido. É também realizado de diferente forma para os mielomas múltiplos, porque a

infiltração celular é muito reduzida. As células do mieloma dividem-se mais lentamente

em comparação com as outras células presentes e há dificuldade em encontrar metafases

devido ao baixo índice mitótico do clone anormal, pelo que o cariótipo não é indicado

para o diagnóstico. A marcação citoplasmática permite selecionar as células alvo,

plasmócitos, e é nesses que se contam os sinais de hibridação. (115)

O procedimento geral da técnica de FISH passa pela separação das células, que

são fixadas e espalhadas em lâmina, seguido de um passo de desnaturação que permite

que possam ocorrer novas ligações durante a hibridação.



137

Existem vários tipos de sondas comerciais usadas na área da citogenética

molecular, que correspondem a fragmentos de ADN de uma região de interesse marcados

com fluorocromo. As sondas usadas dependem da patologia a estudar e podem identificar

o cromossoma inteiro, partes do cromossoma, centrómeros, genes e podem ser usadas

combinações de sondas de modo a melhor investigar a anomalia. (117)

1. FISH

Parte-se do procedimento de separação de células mononucleadas para FISH

normal. Após descongelar os tubos, a concentração celular é ajustada com fixador

(metanol/ácido acético 3:1). O sedimento é espalhado numa lâmina identificada com nº

da amostra, sonda a usar, data e deixado secar. As lâminas são colocadas na estufa a 37ºC

para envelhecerem. Após este tempo, é pipetada mistura de hibridação na região da

lâmina a hibridar. Após colocação da lamela e selagem com cola de borracha, é realizada

uma desnaturação a 72ºC e as lâminas são colocadas na estufa a 37ºC durante a noite, em

câmara húmida.

2. FISH mielomas – marcação por imunofluorescência

Parte-se do procedimento de separação de células mononucleadas para FISH

mieloma. Após descongelar os tubos, a concentração celular é ajustada com fixador

(metanol/acetona 1:1). O sedimento é espalhado numa lâmina identificada com o número

da amostra, sonda a usar e data. A lâmina é observada num microscópio de contraste de

fase e, se necessário, a concentração celular é ajustada. Depois da secagem das lâminas,

estas são lavadas com PBS e é adicionado o anticorpo primário (anticorpo anti-λ +

anticorpo anti-k + tampão diluição de anticorpos). Após incubação em câmara húmida,

as lâminas são lavadas com solução de PBS 1X + octilfenoxipolietoxietanol (PBD) e é

adicionada solução de anticorpo secundário (anticorpo anti-IgG + tampão diluição de

anticorpos). É realizada nova lavagem com PBD e as lâminas são fixadas em solução de

paraformaldeído a 2%. Após lavagem com PBS, são permeabilizadas em fixador e

deixadas a secar. Por fim, é aplicado o volume de mistura de hibridação necessário na

região a hibridar. Após colocação da lamela e selagem com cola de borracha, é realizada

uma desnaturação com temperatura variável, consoante as sondas utilizadas e as lâminas

são colocadas na estufa durante a noite em câmara húmida a 37ºC.



138

É sempre realizada uma lâmina teste para aferir as condições da marcação, para

otimizar a quantidade de permeabilização necessária para a sonda entrar, mas para não

destruir a célula e saber se a marcação é suficiente. Para o estudo do mieloma, pela

citogenética molecular, são utilizados painéis de sete sondas que estudam as sete

anomalias principais que permitem caracterizar o mieloma.

3. FISH parafinas

3.1. Extração de núcleos de cortes de parafinas

Os cortes de parafinas são colocados em tubos resistentes ao xileno, corretamente

identificados, aos quais é adicionado xileno (degrada a parafina). Os tubos são

centrifugados e os sedimentos ressuspendidos em xileno. De seguida, são realizadas

várias lavagens com etanol absoluto e etanol a 96%, é adicionada água destilada de modo

a diluir a amostra e após nova centrifugação, o sedimento é ressuspendido em PBS. É

adicionada solução de incubação ao sedimento (PBS + protease) e os tubos são colocados

em banho-maria a 37ºC, com agitação manual de 10 em 10 minutos. No fim da digestão,

deverá observar-se um sedimento turvo com poucos fragmentos visíveis. De modo a

bloquear a ação da protease, quando os tubos são retirados do banho é adicionado PBS

gelado. Após centrifugação, é adicionado fixador e os tubos são armazenados a -20ºC.

3.2. FISH em núcleos extraídos de cortes de parafina

Após descongelar os tubos, a concentração celular é ajustada com fixador

(metanol/ácido acético 3:1). O sedimento é espalhado numa lâmina identificada com o

número da amostra, sonda a usar e data. A lâmina é lavada com citrato de sódio salino

(SSC) e PBS, é colocada em pepsina ácida e depois desidratada numa série de álcoois. A

mistura de hibridação é aplicada na região da lâmina a hibridar. Após colocação da lamela

e secagem com cola de borracha, é realizada a desnaturação. As lâminas são colocadas

na estufa durante a noite.

Lavagem e observação das lâminas de FISH

Após remoção da cola e lamela, é feita uma lavagem das lâminas (SSC,

octilfenoxipolietoxietanol) para retirar o excesso de sonda, tudo o que não hibridou e

lixos. De seguida, antes da colocação da lamela, é adicionada solução de vectashield com



139

4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que marca os núcleos a azul na área hibridada. Este

procedimento é idêntico para o FISH normal e parafinas.

No caso dos mielomas, é utilizada solução sem DAPI, porque a marcação dos

plasmócitos é realizada de forma mais específica, com anticorpos. As lâminas são

guardadas a 4ºC até à sua observação em microscópio de fluorescência em sala escura.

A eficiência da hibridação pode variar ao longo da amostra a visualizar, pelo que

se deve escolher uma área espaçada de células, pouco ruído de fundo e sinais de

fluorescência visíveis. Utilizando uma objetiva de 100x, deve fazer-se a análise da área

escolhida e registar o padrão de hibridação em cada núcleo observado.

A análise é confirmada por um segundo operador e é feita a interpretação dos

padrões de hibridação registados. A informação pode ser descrita usando o sistema de

nomenclatura do ISCN.

5.2.2.Exemplo de aplicação

A citogenética pode ser utilizada, por exemplo, no estudo da Leucemia Mielóide

Crónica (LMC). Nesta patologia, em mais de 90% dos casos, ocorre uma translocação

t(9;22)(q34.1;q11), conhecida como translocação de Filadélfia. Nos casos em que não se

detete esta translocação por cariótipo ou por FISH, o diagnóstico pode ser auxiliado por

métodos moleculares, por serem mais sensíveis. (115)

O gene de fusão BCR-ABL1 (do inglês, Breakpoint cluster region - Abelson

murine leucemia viral oncogene homolog 1) pode ser detetado por citogenética

molecular, usando sondas de cor diferente para os dois genes, o que permite a visualização

da fusão (figura 11).

Figura 11. (Esquerda) FISH de interfase com sonda para o BCR-ABL1, que mostra dois

sinais verdes e dois vermelhos numa célula normal. (Direita) FISH de interfase, em que

a sonda para o BCR-ABL1 mostra a fusão com sinal amarelo numa célula com Ph

(cromossoma Filadélfia) positivo. Adaptado de (117).



140

Num paciente com possível diagnóstico de LMC, se as primeiras 20 células todas

mostram a fusão BCR-ABL1, não é necessária uma análise mais profunda para confirmar

o diagnóstico. No entanto, analisar mais células pode detetar a presença de uma outra

anormalidade secundária que tenha significado clinico. (115,117)

5.3.Hemato-oncologia - Biologia Molecular

A biologia molecular e a citogenética são complementares. A citogenética

convencional permite a visualização do genoma no seu todo, mas a biologia molecular é

mais específica e sensível estudando o genoma ao nível do gene ou parte deste. Além

disso, algumas alterações podem não ser visíveis através da citogenética; uma leucemia

pode ter cariótipo normal, mas ter alterações a nível molecular, por exemplo. (115)

Muitas destas técnicas já foram referidas nas Doenças Genéticas, sendo que a

Hemato-Oncologia – Biologia Molecular, pesquisa mutações somáticas em contexto

tumoral, que não estão presentes em todas as células, ao contrário das mutações

hereditárias.

Devido ao número elevado de procedimentos e técnicas usados na Hemato-

Oncologia - Biologia Molecular, o estágio nesta área focou-se nos procedimentos

utilizados para o estudo da Leucemia Mielóide Crónica.

5.3.1.Leucemia Mielóide Crónica

A LMC é uma doença mieloproliferativa e foi a primeira leucemia associada a um

rearranjo cromossómico específico, o cromossoma Filadélfia (Ph). O Ph resulta da

translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomas 9 e 22, transpondo o

segmento 3' do gene ABL1 para o segmento 5' do gene BCR. O gene resultante (BCR-

ABL1) é transcrito e traduzido em proteínas quiméricas com atividade de tirosina-quinase

aumentada, de tamanhos variados, consoante os pontos de quebra nos respetivos genes.

A proteína formada pode ter 210 kDa (p210, mais comum) ou 190 kDa (p190, mais

comum em pacientes com Leucemia Linfocítica Aguda (LLA)). (118,119)

O desenvolvimento de fármacos inibidores de tirosina quinase (Imatinib, por

exemplo) veio modificar o tratamento desta patologia, sendo que a resposta ao tratamento

é avaliada através da normalização dos valores hematológicos no sangue periférico, pela



141

análise citogenética de metafases Ph-positivas e pela resposta molecular descrita neste

capítulo. (118,120)

Normalmente, a LMC inicia-se na fase crónica, podendo após alguns anos

transformar-se numa fase aguda ou fase blástica, caraterizada pelo aumento do número

de blastos circulantes no sangue periférico e medula óssea. (119)

5.3.2.Métodos

5.3.2.1.Separação de células mononucleadas e/ou granulócitos

Este procedimento consiste no isolamento das células mononucleadas e/ou

granulócitos, de sangue periférico ou sangue medular. A primeira parte do procedimento

é idêntico ao realizado na citogenética. No entanto, na biologia molecular, as células não

são fixadas, mas armazenadas em TriZol ou pellet de células seco.

Após identificação dos tubos necessários, pipeta-se solução de gradiente. O

volume da amostra é diluído com PBS e transferido sobre a solução de gradiente com

posterior centrifugação.

O procedimento seguinte varia consoante o tipo celular que se pretende obter. Os

linfócitos, monócitos e macrófagos formam um anel separado dos granulócitos e

eritrócitos que se apresentam na zona inferior do tubo. Para obter as células

mononucleadas, o anel formado é removido e transferido para novo tubo, onde ocorre

lavagem das células com PBS. No caso do precipitado apresentar a cor vermelha, é

ressuspendido em RCLB incubado a 4ºC, durante 20 minutos, promovendo a lise as

células e centrifugado. Por outro lado, se os granulócitos forem necessários ao estudo a

realizar, ao sedimento vermelho formado na parte inferior do tubo aquando da

centrifugação adiciona-se RCLB, com incubação a 4ºC, centrifugação e posterior

lavagem com tampão PBS. Após lavagem das células lisadas, o sobrenadante é removido

e faz-se uma estimativa do número de células presente no precipitado celular. Esta

estimativa é necessária para ressuspender as células num volume adequado de tampão

PBS, sendo que cada ml de suspensão celular deve ter a concentração celular adequada

ao tipo de extração a efetuar: para extração de ARN 5x106 a 10x106 células/ml e para

extração de ADN até 5x106 células/ml. O número de células obtido é avaliado e registado.

Para a extração de ARN, o pellet de células é lisado e preservado com solução de

TriZol, que conserva o ácido nucleico. Armazenar a amostra a -80ºC ou prosseguir para

extração.Para extração de ADN armazenar em pellet seco a -80ºC ou seguir para extração.



142

5.3.2.2.Extração de ARN total com o reagente TriZol

Partindo do procedimento anterior, são identificados novos tubos eppendorf por

amostra e é adicionado clorofórmio, para o ARN se soltar do TriZol. Após incubação à

temperatura ambiente e centrifugação, a fase aquosa é transferida para tubos com

isopropanol, que agrega o ARN. O precipitado obtido por centrifugação é lavado com

etanol a 75%, centrifugado e o pellet de ARN após secar é ressuspendido em água

RNAse-free e incubado a 56ºC, durante 10 minutos, para ocorrer hidratação. Prossegue-

se para quantificação ou armazenamento a -80ºC.

A quantificação é realizada no NanoDrop® e é utilizada água RNAse-free como

branco da amostra. A avaliação da qualidade da extração é feita através da medição da

absorvância a 260nm e 280nm. A razão entre as absorvâncias a 260nm e 280nm

(Absorvância 260/Absorvância 280) deverá originar valores entre 1,8 e 2,0 para o ARN

e permite avaliar a presença de contaminantes. (103)

5.3.2.3.Síntese de (ADNc) a partir de ARN total

Para a análise do ARN é necessário converter este ácido nucleico em ADN

complementar (ADNc), através da ação da transcriptase reversa. Este método é vantajoso

na medida em que o ARN não contém os intrões que o ADN possui, sendo amplificada

uma zona mais pequena. (104,105)

Para a síntese de ADN complementar, parte-se de 100-200 ng/µL de ARN. Antes

de juntar os reagentes necessários à reação: transcriptase reversa, ditiotreitol (DTT),

inibidor RNAses, dNTPs, tampão, oligonucleótidos random (de sequencia aleatória que

atuam como primers), o ARN é desnaturado no termociclador, de modo a quebrar as

ligações. Depois a mix é adicionada e a reação prossegue no termociclador com o

programa definido para o efeito.

5.3.2.4.Pesquisa e caracterização do transcrito de fusão BCR-

ABL1

De modo a confirmar o diagnóstico de LMC, é feita a pesquisa e caraterização do

transcrito de fusão BCR-ABL1 por reação em cadeia da polimerase com transcriptase

reversa (RT-PCR, do inglês, reverse transcriptase polymerase chain reaction).



143

Para verificar a presença de transcrito, os produtos de PCR são analisados por

eletroforese em gel de agarose. O transcrito é o marcador molecular da doença e a

identificação do tipo de transcrito presente é feita pela pesquisa dos principais pontos de

quebra associados à t(9;22), sendo que os transcritos que originam a proteína p190 estão

mais associados às LLAs e a p210 às LMCs. (118,119)

A figura 12 representa um gel de agarose, com uma amostra positiva para o

transcrito mais comum (p210).

Figura 12. Gel de agarose para pesquisa do transcrito de fusão BCR-ABL1. Os

poços 1-3 correspondem a um controlo, para verificar se o ADNc amplificou. Os dois

primeiros são controlos positivos e o terceiro é um controlo negativo, sem ADNc. Os

poços 4 e 10 correspondem ao marcador de massas moleculares. Os poços 5- 9 pesquisam

o p190 e correspondem a duas amostras, dois controlos positivos para o p190 e um

controlo negativo, respetivamente. Os poços 11-15 pesquisam o p210 e correspondem a

duas amostras, dois controlos positivos para o p210 e um negativo, respetivamente. A

amostra no poço 12 é positiva para o transcrito mais comum (p210).

5.3.2.5.Quantificação de transcritos de fusão t(9;22) BCR-ABL1

(p210)

Saber o número de transcritos é importante para determinar como o doente está a

responder à terapêutica. É também importante na monitorização da doença residual

mínima (DRM), presença de células leucémicas residuais sem evidência clínica de doença

e deve ser feita de 3 em 3 meses, até se atingir e confirmar a resposta molecular major

(RMM). (118,120)

1 2 3 4 5 6 7

8 9 10

0

11 12

2

13 14 15



144

A resposta molecular é avaliada de acordo com a escala internacional, como a

razão entre o número de transcritos BCR-ABL1 e ABL1 (gene controlo) e é expressa numa

escala logarítmica através de 5 níveis de resposta. Uma expressão BCR-ABL1 ≤0,1%

corresponde à resposta molecular major. Esta resposta molecular é traduzida numa

resposta à terapêutica. (120)

A determinação número de transcritos é feita por reação em cadeia da polimerase

em tempo real (RT-PCR, do inglês, real time polymerase chain reaction) que associa a

metodologia de PCR a um sistema de deteção e quantificação de fluorescência produzida

durante os ciclos de amplificação. É um método quantitativo em que a quantidade de

fluorescência é proporcional à quantidade de transcrito. (9,118)

O sistema utilizado usa sondas Taqman, que contêm um fluorocromo numa

extremidade e um Quencher na outra extremidade que absorve essa fluorescência.

Enquanto ocorre a reação, a polimerase sintetiza novas cadeias a partir dos primers e cliva

as sondas correspondentes, aumentando o sinal fluorescente. (118)

A partir de certo número de ciclos, a reação atinge uma intensidade de

fluorescência detetada pelo aparelho. Quanto maior a quantidade de ADNc presente,

maior a fluorescência emitida e menor o número de ciclos necessários para atingir esta

fase. O ciclo em que a amostra atinge este nível designa-se por Cycle Threshold.

Procedimento

É utilizada uma placa de 96 poços, em que metade da placa corresponde ao ABL

e a outra metade ao transcrito de fusão, como se fossem realizados ensaios isolados, sendo

utilizadas duas mix. São adicionados a todos os tubos os reagentes necessários à reação:

primers, água, reagente que normaliza a fluorescência, sondas, Taq polimerase, tampão.

Consoante o tubo é adicionado ainda amostra de ADNc, calibrador ou controlo. São

também utilizadas amostras com concentrações conhecidas que ocorrem na reação ao

mesmo tempo e nas mesmas condições da amostra, de modo a construir uma reta de

calibração que permita calcular a quantidade de transcritos.

5.3.2.6.Pesquisa de mutações no gene BCR-ABL

Apesar do sucesso dos inibidores de tirosina quinase no tratamento da LMC,

nalguns casos ocorre resistência ao tratamento ou mesmo recaída da doença,

particularmente em doentes em fase acelerada ou fase blástica. Nestas alturas, ou quando



145

se pretende mudar de terapêutica, é feita a pesquisa de mutações que possam originar

resistência a esses fármacos, sendo que o mecanismo mais frequente da reativação da

atividade quinase do gene é o aparecimento de mutações pontuais no domínio quinase

ABL do gene de fusão, como é o exemplo da mutação T315I, que resulta da substituição

de uma treonina por uma interleucina na posição 315 da proteína. (119,120)

A metodologia utilizada é RT-PCR Nested e sequenciação direta bidirecional. O

RT-PCR Nested consiste em duas reações. Usando um par de primers externos numa

primeira reação (um primer desenhado para o gene ABL e outro para o BCR), obtém-se

um produto que será utilizado numa segunda reação, em que se utilizam primers mais

internos (a região de interesse é o domínio ABL do transcrito). Este processo permite

aumentar tanto a sensibilidade, como a especificidade da reação de amplificação e é útil

na amplificação de pequenas quantidades de material. (104)

Após a reação de PCR, os produtos são analisados em gel de agarose, purificados

e sequenciados através do método de Sanger. Estes procedimentos são idênticos aos

referidos para as Doenças Genéticas.

5.4.Tumores Sólidos

Os tumores ou neoplasias sólidas são caraterizados por um crescimento anormal

de células de um tecido, que normalmente não contêm áreas líquidas. Podem ser benignos

ou malignos (cancerosos).(121) Usualmente, estes tumores apresentam vantagem

proliferativa e resistência à apoptose adquiridas devido a uma mutação inicial ou driver

mutation. Ocorre mistura de células normais e células do tumor, em que normalmente

apenas um dos alelos se encontra mutado. (102,122)

Nesta área é realizada a caracterização molecular de alguns tumores sólidos, para

os quais existem marcadores moleculares com relevância clínica, quer de predição de

resposta à terapêutica quer de prognóstico. Alguns destes marcadores poderão ser

transversais a diferentes patologias, no entanto o significado para a decisão terapêutica

poderá ser diferente. À semelhança da área de Hemato-Oncologia - Biologia Molecular,

o foco do relatório nesta área é dirigido a uma patologia específica, o cancro do pulmão.

A maior parte das amostras processadas é tecido tumoral fixado em formaldeído

tamponado e embebido em parafina. São necessários cerca de 5 a 10 cortes de parafina

com 10µm, dependendo da quantidade de células neoplásicas presentes na amostra,



146

podendo esta ser peça cirúrgica ou biópsia. As amostras são caracterizadas por um

anatomopatologista que determina, entre outros parâmetros, a percentagem de infiltração

tumoral, permitindo ajustar os procedimentos realizados posteriormente, tal como a

metodologia utilizada.

5.4.1.Cancro do pulmão

Mundialmente, o cancro do pulmão é a principal causa de morte por cancro. É

composto por dois subtipos histológicos, os carcinomas de pulmão de não pequenas

células (CPNPC) e os carcinomas de pulmão de pequenas células (CPPC). O CPNPC é o

subtipo mais prevalente, dividindo-se em adenocarcinomas, carcinomas de células

escamosas ou carcinomas de grandes células, e sendo responsável por 85% dos cancros

do pulmão, onde o tabagismo representa uma das principais causas. Salienta-se, no

entanto, que a prevalência deste tipo de cancro tem vindo a aumentar em não fumadores.

(123–125)

Os CPNPC podem ser caracterizados a nível molecular por mutações recorrentes

que ocorrem em oncogenes, EGFR, BRAF e KRAS (do inglês, Epidermal growth factor

receptor, v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B e Kirsten rat sarcoma viral

oncogene homolog, respetivamente), entre outros. O acompanhamento do doente envolve

estudos moleculares, quer a nível do diagnóstico, quer do prognóstico, seleção da terapia

mais adequada ao doente e deteção de recaídas atempadamente. A gestão do doente com

CPNPC pressupõe a correta caracterização dos genes, pois existem terapias dirigidas que

apenas estão disponíveis em determinado contexto molecular. Foram desenvolvidos

inibidores de tirosina quinase (TKIs), que adiam a progressão da doença. (124,125)

No entanto, durante o tratamento destes doentes, o tumor poderá adquirir

mutações de resistência aos efeitos dos fármacos que limitam a eficácia da quimioterapia.

Assume-se geralmente que os tumores que são misturas heterogéneas de células sensíveis

e resistentes à quimioterapia podem responder inicialmente ao tratamento, mas depois

surgem recaídas, com a predominância das células resistentes. Deste modo, é fundamental

a análise mutacional dos genes em questão. (121)



147

5.4.1.1.Pesquisa de mutações no gene EGFR (exões 18,19,20 e 21)

O gene EGFR codifica o recetor do fator de crescimento epidérmico

representando o principal alvo terapêutico em CPNPC. Este receptor encontra-se

frequentemente sobre-expresso na maioria dos CPNPC devido à presença de mutações

ativadoras que resultam no crescimento do tumor, maior proliferação celular, proteção

em relação à apoptose e aumento da capacidade de metastização. A presença de

determinadas mutações ativadoras neste gene é preditiva de resposta aos TKIs (gefitinib,

erlotinib e afatinib), fármacos que inibem o sinal proliferativo e anti-apoptótico

produzido. (123)

No CPNPC, estão descritas diferentes mutações somáticas no domínio quinase do

gene EGFR, que abrange os exões 18, 19, 20 e 21 e aumentam a atividade do recetor

EGFR. (123,125)

As mutações mais frequentes são deleções no exão 19 e a mutação pontual L858R

no exão 21, sendo que a primeira ocorre com uma frequência de aproximadamente 48%

em tumores do pulmão mutados no EFGR. A mutação L858R corresponde a uma

substituição de uma leucina por uma arginina no codão 858 do EGFR e ocorre com uma

frequência de aproximadamente 43% nos tumores do pulmão com EGFR mutado.

(123,125)

O codão 861 corresponde a outro hotspot do exão 21, apesar de ocorrer com muito

menos frequência (cerca de 2%), em que uma leucina é substituída por glutamina

(L861Q). No exão 18, a mutação G719A resulta da substituição de uma glicina por uma

alanina (frequência de 2-3%). (125)

No entanto, nem todas as mutações no domínio de tirosina quinase conferem

sensibilidade do recetor aos TKIs. Na maioria dos casos, as mutações no exão 20, que

incluem inserções, estão associadas com resistência primária a estes fármacos, em

particular na presença da mutação T790M, que será descrita mais à frente. (123,125)

5.4.1.2.Pesquisa de mutações no gene BRAF

Já foi referido que as vias de sinalização associadas ao EGFR estão envolvidas na

proliferação celular. BRAF pertence a uma família de proteínas quinases que são

mediadores centrais na cascata de sinalização MAP (proteína ativada por mitogénios, do

inglês, Mitogen Activated Protein) na qual são observadas com alguma frequência

mutações nos genes que codificam para esta via, estando envolvidas em muitos processos



148

celulares, incluindo proliferação celular, diferenciação e regulação transcricional. A

presença de mutações no gene BRAF traduz-se na ativação constitutiva da via e são

observadas em 1-3% dos CPNPC. (123,125)

A maioria dos casos BRAF mutados apresenta a mutação V600E no exão 15, onde

a valina é substituída pelo ácido glutâmico. A pesquisa desta mutação é necessária para

determinar se o paciente é elegível para terapia direcionada com inibidores do BRAF,

constituindo uma alternativa quando as terapias anti-EGFR não são uma opção. (125)

5.4.1.3.Pesquisa de mutações no gene KRAS

As proteínas ‘Vírus do Sarcoma de Rato’ (RAS) são mediadores centrais a jusante

da sinalização do EGFR e como tal, são críticas para a proliferação, sobrevivência e

diferenciação celular. (125)

Aproximadamente 15-25% dos pacientes com adenocarcinoma do pulmão têm o

gene KRAS mutado. Na maioria dos casos, correspondem a mutações missense que

introduzem uma substituição de aminoácido nos codões 12 e 13 (exão 2) e codão 61 (exão

3). O resultado destas mutações é ativação constitutiva das vias de sinalização KRAS.

(123,125)

Tal como no caso anterior, a deteção destas mutações em pacientes com tumor no

pulmão constitui uma ferramenta para selecionar os pacientes com maior probabilidade

de não responder aos fármacos disponíveis, sendo que, as mutações no gene KRAS

diminuem a sensibilidade aos TKIs. Atualmente, não existem terapias direcionadas para

KRAS disponíveis. (123,125)

5.4.1.4.Progressão após terapêutica com TKIs em 1ªlinha

A mutação T790M no exão 20 do gene EGFR, que resulta na troca de uma

treonina por uma metionina na posição 790, para além de conferir resistência primária

aos TKIs, surge como mutação de resistência adquirida em cerca de 50% dos tumores

mutados no gene EGFR em diagnóstico inicial, após tratamento com TKIs (erlotinib,

gefitinib ou afatinib) como primeira linha terapêutica. Normalmente, esta mutação é

pesquisada quando deixa de existir resposta à terapêutica, para determinar elegibilidade

para outro tipo de terapêutica. (123,125)

Para pesquisar esta mutação, a GenoMed está a testar o conceito de biópsia

líquida, em que se trabalha com ADN das células tumorais presente no sangue periférico.



149

Ao contrário de biópsias de tecido tumoral, a biópsia líquida apresenta risco mínimo para

o paciente, sendo um método minimamente invasivo. O laboratório está na fase de

implementação deste teste.

5.4.2.Métodos

5.4.2.1.Extração de ADN

É utilizado um kit que permite a extração em coluna de ADN total de pellet seco,

sangue total, tecido fresco ou conservado em parafna.

Neste caso, a amostra de partida é parafina e o processo de desparafinação é

realizado através da incubação da amostra com xileno, para dissolver a parafina e

recuperar os tecidos. Os restos de xileno são eliminados através de lavagens com etanol

absoluto. De seguida, a amostra é incubada com enzima (proteinase K) que digere os

tecidos na presença de tampão tampão de lise tecidular (ATL) em banho seco a 56ºC

durante a noite. Após a primeira incubação, se já não existir tecido por digerir, adicionar

tampão de lise (AL) e incubar durante 1h a 90ºC no banho seco. Se a amostra for escassa

podem ser adicionados carriers de ADN (caudas poli-A que se agregam ao ADN para o

tornar mais compacto). É adicionado etanol que precipita o ADN, de modo a que este

fique adsorvido numa membrana sílica-gel da coluna durante a centrifugação. São

adicionadas duas solução-tampão de lavagem de modo a remover quaisquer

contaminantes e impurezas. De seguida, o ADN é eluído com tampão de eluição (AE).

A quantificação da amostra é feita no NanoDrop®.

5.4.2.2.Sequenciação ou PCR em tempo real

A deteção das mutações referidas anteriormente pode ser realizada por PCR e

Sequenciação de Sanger ou por PCR em tempo real, sendo que a escolha da técnica a usar

depende da qualidade da amostra e da percentagem de células neoplásicas presentes na

amostra.

Na primeira, ocorre amplificação dos exões seguida de sequenciação a partir de

ADN extraído de tecido tumoral, segundo procedimentos já descritos neste trabalho. A

purificação do produto de PCR é realizada por vácuo e a purificação dos produtos para

sequenciação é através do método de etanol/acetato de sódio. Utilizando esta técnica é

possível detetar a maioria das mutações somáticas se a percentagem de células mutadas

for superior a 20 ou 30 % da totalidade das células da amostra. É o método recomendado



150

porque permite a identificação de mutações conhecidas ou não descritas em toda a região

codificante testada.

A técnica de PCR em tempo real é realizada num equipamento, Idylla™ da

Biocartis, que permite a deteção das mutações mais frequentes, designados por hotspots.

É a melhor opção quando as amostras têm baixa infiltração tumoral (até ao mínimo de

10% de células tumorais) e/ou baixo conteúdo celular. Este aparelho totalmente

automatizado, realiza a extração e genotipagem dos genes pretendidos. A amostra é

colocada num cartucho e o procedimento demora apenas duas horas. No entanto, não

deteta mutações raras na população do cancro do pulmão, só mutações com uma

frequência >1%. (126)

5.5.Controlo de Qualidade em Genética

Controlo de Qualidade Interno

A GenoMed é um laboratório certificado pela norma ISO 9001. A política de

gestão do laboratório tem como principais objetivos a melhoria contínua da qualidade dos

serviços prestados e a promoção da satisfação do cliente. Para garantir a sua concretização

aposta numa estratégia de garantia da qualidade, nomeadamente através de

procedimentos de CQI e da participação em programas de avaliação externa da qualidade,

realizados por entidades apropriadas. Todo o trabalho desenvolvido tem ainda por base

guidelines e recomendações emitidas por instituições internacionais prestigiadas e de

referência nas respetivas áreas, tais como Best practice guidelines – Rede Europeia de

Qualidade Genética Molecular (EMQN, do inglês, European Molecular Genetics Quality

Network) ou Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance – EuroGentest.

Com vista ao controlo da qualidade, os procedimentos encontram-se

implementados em pontos-chave ao longo de todo o processo, desde a fase pré-analítica,

passando pela fase analítica e finalmente pós-analítica.

Todos os laboratórios necessitam de ter implementado um sistema que garanta

que os resultados obtidos são fiáveis, que passa primeiramente por garantir que uma

amostra é atribuída ao paciente certo. Deste modo, e para garantir uma menor taxa de

erro devido ao operador, todos os procedimentos de identificação de amostras e tubos de

ensaio são confirmados por um segundo operador, bem como alguns procedimentos

realizados na citogenética como a avaliação das lâminas de FISH. O sucesso ou fracasso



151

das técnicas utilizadas também depende da qualidade dos reagentes em uso. É essencial

manter registos dos lotes usados, meios de cultura e reagentes, bem como a data em que

foram colocados a uso ou preparados. Também é mantido um registo da pessoa

responsável pelo processamento da amostra e procedimentos posteriores.

Todas as técnicas são otimizadas, de modo a garantir resultados reprodutíveis e

fiáveis e são realizados tratamentos estatísticos dos resultados, de modo a identificar

possíveis erros e verificar se há capacidade de melhoria, sendo que qualquer mudança na

taxa de sucesso das técnicas, deve ser estudada prontamente.

Avaliação Externa da Qualidade

Relativamente à AEQ, a GenoMed participa em programas promovidos por várias

entidades: Controlo de Qualidade para o Diagnóstico Molecular (QCMD do inglês,

Quality Control for Molecular Diagnosis), EMQN, Rede Europeia do Mieloma (EMN,

do inglês, European Myeloma Network), UK-NEQAS e GHEP-ISFG (Grupo de Línguas

Espanhola e Portuguesa da Sociedade Internacional de Genética Forense). Os resultados

obtidos na prestação de serviços são desta forma validados ao mais alto nível e

internacionalmente e o conhecimento daí obtido é incorporado no trabalho desenvolvido

na GenoMed, permitindo uma actualização e inovação constante.


Catarina Alves Bibliografia

152

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Parte III

IX Mestrado Análises Clínicas Parte III

Catarina Alves Resumo

163

Resumo

O paradigma da infeção por Plasmodium falciparum em mulheres grávidas

seropositivas para HIV: a prevenção da transmissão vertical e a infeção congénita

Segundo a Organização Mundial de Saúde, o impacto da interação entre

Plasmodium falciparum e Vírus da Imunodeficiência Humana é mais aparente em áreas

com epidemia generalizada deste vírus e transmissão estável de malária. Cerca de um

milhão de grávidas anualmente sofrem complicações devido à coinfeção entre malária e

Vírus da Imunodeficiência Humana, sendo particularmente importante na África

subsariana. A coinfeção está associada a morbidez da mãe e do recém-nascido, parto

prematuro, baixo peso ao nascer, atraso no crescimento intrauterino e mortalidade pós-

natal. O estudo da infeção placentária pelo Plasmodium falciparum na gravidez apresenta

resultados conflitantes em que o parasita poderá ou não exercer um efeito protetor

relativamente à transmissão vertical do Vírus da Imunodeficiência Humana.

A Organização Mundial de Saúde recomenda o uso de tratamento preventivo

intermitente e redes tratadas com inseticidas a todas as mulheres grávidas em áreas de

transmissão de Plasmodium falciparum, bem como testes para diagnóstico do vírus e

terapêutica antirretroviral, se indicado. No entanto, a eficácia dos fármacos poderá ser

reduzida, estando dependente da resposta imunológica do hospedeiro, que é alterada com

a coinfeção e, as interações entre antirretrovirais e antimaláricos são um dilema na

profilaxia e tratamento das duas patologias. Além disso, a redução da coinfeção e

vigilância de efeitos adversos nas mulheres grávidas depende do acesso e qualidade dos

serviços de saúde das localidades.

Na presente monografia é feita uma revisão acerca das interações entre os dois

agentes de infeção na mulher grávida, referindo fármacos e estratégias utilizados na

prevenção da transmissão da coinfeção.

Palavras-chave: Plasmodium falciparum, Malária, Vírus da Imunodeficiência Humana,

Coinfeção, Gravidez.


Catarina Alves Abstract

164

Abstract

The paradigm of Plasmodium falciparum infection in HIV-positive pregnant women:

prevention of vertical transmission and congenital infection

According to the World Health Organization, the impact of the interaction

between Plasmodium falciparum and Human Immunodeficiency Virus is mainly

observable in areas of generalised epidemics of this virus and stable transmission of

malaria.

Annually, about a million pregnant women suffer from complications due to the

coinfection of malaria and Human Immunodeficiency Virus, which is particularly crucial

in Sub-Saharan Africa. The coinfection is associated with the mother and the newborn

morbidity, delay in the intrauterine growth, premature labor, decrease in the newborn’s

weight and postnatal mortality. The study of the Plasmodium falciparum placental

infection reveals conflicting results since the parasite may or may not have a protective

effect on the vertical transmission of the Human Immunodeficiency Virus.

The World Health Organization recommends the use of intermittent preventive

treatment and insecticide treated nets to all pregnant women in areas of possible

transmission of Plasmodium falciparum, moreover, Immunodeficiency Virus tests and

anti-retroviral therapy if required. Nevertheless, the efficacy of drugs may be reduced

depending on the host’s immune response, which is altered with the coinfection.

Moreover, the interaction between antiretroviral and antimalarial drugs are a serious

problem in the prophylaxis and treatment of both pathologies. In addition, the reduction

of the coinfection and surveillance of adverse effects in pregnant women depends on the

free access and quality of local health services.

In the present monography, a review is made taking into account the interactions

between these two agents in pregnant women, specifying the antiviral and antimalarial

drugs and strategies needed to control and prevent the transmission of this coinfection.

Keywords: Plasmodium falciparum, Malaria, Human Immunodeficiency Virus,

Coinfection, Pregnancy.


Catarina Alves Objetivos

165

Objetivos

O objetivo da presente monografia passa por analisar a situação da coinfeção por

Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV, do inglês, Human Immunodeficiency Virus) e

Plasmodium falciparum no contexto da gravidez e compreender o efeito do parasita na

transmissão vertical do vírus. Pretende-se também indicar de que forma a infeção

congénita pode ser prevenida, revendo abordagens e fármacos utilizados para este efeito.


Catarina Alves Material e Métodos

166

Material e Métodos

Para a elaboração desta monografia foi realizada uma consulta de páginas na

internet e foram analisados e interpretados vários artigos científicos originais e de revisão,

publicados entre 1991 e 2017.

A pesquisa bibliográfica foi realizada no período compreendido entre Janeiro e

Outubro de 2017. Como fontes de pesquisa foram utilizados a plataforma Pubmed

(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) e as páginas de internet do Centro de Controlo e

Prevenção de Doenças (CDC, do inglês, Centers for Disease Control and Prevention)

(www.cdc.gov) e Organização Mundial de Saúde (WHO, do inglês, World Health

Organization) (http://www.who.int/en/). Para iniciar a procura bibliográfica foram

utilizadas as seguintes palavras-chave: Malária, Plasmodium falciparum, HIV,

Coinfeção, Gravidez, Revisão.



167

1.Introdução

A coinfeção entre o Plasmodium falciparum e Vírus da Imunodeficiência Humana

(HIV) é prevalente em zonas onde estes dois gigantes se sobrepõem. Isto é

particularmente relevante na África subsariana, onde a malária é endémica e a infeção por

HIV afeta até 40% das mulheres grávidas. (1,2)

Estas mulheres estão particularmente vulneráveis às consequências da infeção

causada pelo parasita mais predominante e letal causador de malária, Plasmodium

falciparum (figura1), transmitido por mosquitos fêmea do género Anopheles (figura 2).

(3)

A infeção aguda originada pelos estadios do parasita no sangue causam febres,

arrepios de frio (malária não complicada), podendo em casos mais graves comprometer

o cérebro e outros órgãos e levar à morte (malária severa ou complicada). Mulheres que

desenvolveram imunidade contra o parasita tendem a perde-la aquando da gravidez e a

patologia torna-se grave, não só para a mãe, como para o feto e recém-nascido. A malária

associada à gravidez pode resultar em aborto, anemia e baixo peso ao nascer, originado

por restrição no crescimento intrauterino e parto prematuro. (4–6)

Figura 1. Gametócito e trofozoítos de Figura 2. Mosquito do género

P. falciparum num esfregaço de sangue. Anopheles. Adaptado de (4).

Adaptado de (5).

Por sua vez, infeção com o HIV resulta na depleção de linfócitos TCD4+, células

preferenciais para a replicação do vírus, o que torna os indivíduos infetados vulneráveis

a infeções oportunistas (figura 3). (8,9)



168

A coinfeção com HIV é a principal causa de morte entre as mulheres em idade

reprodutiva. Em 2013, 54% das gravidezes de mulheres em países de baixo e médio

rendimento não foram testadas para o HIV, algo necessário à prevenção, cuidados e

tratamento da infeção. (10)

No caso da mulher grávida, a carga viral materna é o melhor fator preditivo de

transmissão perinatal do HIV. Existe uma relação diretamente proporcional entre maiores

cargas virais e o maior risco de transmissão, apesar de esta poder ocorrer com quaisquer

valores de carga viral detetáveis pelas técnicas de diagnóstico presentemente

disponíveis.(11)

As mulheres grávidas seropositivas para HIV estão mais suscetíveis a

complicações, tais como: partos prematuros, limitação do crescimento uterino,

desenvolvimento de anemia severa, morte fetal intrauterina (e consequente aborto) e taxa

de mortalidade materna e neonatal superiores, quando comparadas com mulheres não

infetadas com este vírus. (12)

Figura 3. Imagem de microscopia eletrónica da libertação de novas partículas víricas de

HIV a partir de linfócitos humanos em cultura (in vitro). Adaptado de (13).

Na grávida, a coinfeção entre P. falciparum e HIV está associada a elevada

morbidez da mãe e da criança. (8) Existe também um risco aumentado de ocorrência de

parto prematuro, baixo peso ao nascer e atraso no crescimento intrauterino. (14–17)

Foi sugerido que a infeção pelo HIV em grávidas aumenta o risco de infeções

placentárias, periféricas e do cordão umbilical, para além de originar aumento na



169

densidade parasitária, mortalidade pós-natal e morte maternal como resultado de infeções

severas e frequentes devidas à malária. (1,16,18) Contudo, ainda não é certo se a

suscetibilidade aumentada ao parasita é originada pelo impacto do HIV na imunidade

humoral e celular em relação à malária ou se é devido à imunossupressão originada

exclusivamente pelo vírus. (16)

Por outro lado, a parasitémia nas grávidas estará associada a um aumento das

cargas virais do HIV e este valor poderá ter impacto nas taxas de transmissão e na sua

transmissão vertical. (5,14) A Organização Mundial de Saúde (WHO) estima que na

África subsariana, no ano de 2003, pelo menos 440 000 mulheres foram infetadas com

Plasmodium falciparum na gravidez devido a estarem previamente infetadas com

HIV.(17)

Uma fraca resposta ao tratamento da infeção por Plasmodium falciparum durante

a gravidez e a práticas profiláticas podem ser atribuídas à presença da infeção por HIV.

(17) Os efeitos do tratamento da malária em grávidas infetadas com HIV são uma

preocupação, devido à alteração da imunidade induzida pelo vírus que pode afetar a

resposta ao tratamento antimalárico padrão. (19) Além disso, existem dados

contraditórios sobre o efeito da terapêutica antirretroviral (ART, do inglês, antiretroviral

therapy) no resultado da gravidez (11,12) e o tratamento e prevenção da coinfeção é um

desafio devido à potencial interação entre os diferentes fármacos. (20,21)

É também preocupante o facto das mulheres que vivem nos países designados de

subdesenvolvidos, onde a coinfeção é prevalente, se apresentarem tardiamente para

cuidados pré-natais, o que torna difícil a aplicação de serviços preventivos. (22) É

necessário que as abordagens dos cuidados de saúde nestes países sejam direcionadas

para o aconselhamento destas mulheres, para o diagnóstico correto e para a melhoria dos

serviços prevenção como controlo vetorial através, por exemplo, do uso de redes tratadas

com inseticidas (ITNs, do inglês, insecticide-treated bednets), profilaxia com

antimaláricos, bem como acesso a tratamentos de modo a prevenir as elevadas taxas de

mortalidade e morbidade associadas à coinfeção e à transmissão vertical do vírus.


Catarina Alves Epidemiologia da Coinfeção

170

2.Epidemiologia da Coinfeção

A transmissão de malária ocorre em áreas tropicais e subtropicais, onde o vetor da

sua transmissão sobrevive e se multiplica e, onde o parasita pode completar o seu ciclo

no mosquito. (4) Além disso, é dependente de fatores climáticos (humidade e

temperatura), de fatores inerentes ao parasita, ao vetor e ao hospedeiro humano. (23)

Os efeitos e complicações da infeção por Plasmodium falciparum na gravidez são

também dependentes da carga parasitária aquando da transmissão de malária e assim, da

imunidade pré-existente, adquirida pela mulher grávida. Neste sentido, em locais

instáveis de transmissão, onde esta é pouco frequente, a imunidade não é adquirida, pelo

que a malária causa manifestações de infeção aguda febril, que podem levar à morte e à

perda do feto. Por outro lado, em locais onde a taxa de transmissão é estável e elevada,

as grávidas são normalmente assintomáticas, apesar da malária placentária originar

normalmente algumas complicações, tais como alteração do peso ao nascer que, por sua

vez originam risco aumentado de mortalidade. (3,15,20)

No início de 2016, a malária foi considerada endémica em 91 países, diminuindo

dos 108 existentes no ano 2000 (figura 4). No entanto, esta infeção continua a ter um

efeito devastador na vida e saúde das pessoas, particularmente na África subsariana. (24)

Figura 4. Distribuição mundial da malária. Países endémicos em 2016 (azul), países

endémicos em 2000, não endémicos em 2016 (verde). Adaptado de (24).



171

Segundo a WHO, estima-se que mundialmente 0,8% das pessoas entre os 15 e 49

anos são seropositivos para HIV (figura 5). A África subsariana é a área mais afetada,

com aproximadamente 1 em cada 24 adultos (4,2%) a viverem com HIV e tornando-se

cerca de dois terços, mundialmente. (25)

Existem dois tipos de Vírus da Imunodeficiência Humana, o HIV-1 e o HIV-2,

sendo o primeiro responsável pela maioria dos casos de SIDA. O HIV-2 apresenta o seu

epicentro na África Ocidental e comparativamente ao HIV-1, é menos transmissível e está

associado a uma menor carga viral plasmática e taxa de progressão mais baixa. Para além

disso, a escolha da terapêutica antirretroviral difere nos dois tipos, o que revela clara

importância na diferenciação entre HIV-1 e HIV-2. (17,26)

A transmissão vertical do HIV pode ocorrer em qualquer altura na gravidez,

durante o parto ou amamentação. No entanto, se a mulher fizer terapêutica antirretroviral

na fase inicial na gravidez, o risco de transmissão vertical pode ser reduzido quase na

totalidade. Segundo uma estimativa do CDC em 2006, aproximadamente 8,500 mulheres

infetadas dão à luz anualmente e, entre 1994 e 2010, foram prevenidos cerca de 21,000

casos de transmissão vertical. (9)

Figura 5. Prevalência mundial do HIV entre os 15-49 anos em 2016. Adaptado de (25).

A distribuição geográfica das duas patologias difere: a malária é mais comum em

áreas rurais, atingindo mais facilmente mulheres grávidas e crianças. Em contraste, as

taxas de HIV são geralmente mais elevadas em áreas urbanas e entre jovens adultos. (20)



172

No entanto, a análise das figuras 4 e 5 revelam uma clara sobreposição entre as

áreas mais afetadas por HIV e malária. A prevalência da coinfeção é mais elevada na

África subsariana, existindo também no Sudoeste Asiático, América Latina e Caraíbas,

sendo o impacto das interações mais aparente em áreas com epidemia generalizada do

vírus e transmissão estável de malária. No entanto, esta distribuição varia a nível local e

regional, mesmo em países com alta prevalência de ambas as infeções. Na América

Latina, Caraíbas, Belize, El Salvador, Honduras, Guiana e Brasil ocorrem sobreposições

de infeção por P. falciparum e HIV. Por outro lado, os países do Sudoeste Asiático, como

Myanmar e Tailândia, apresentam epidemia generalizada de HIV, mas a distribuição de

malária é heterogénea. Dada a sobreposição das áreas de ocorrência e a resultante

coinfeção, a interação entre as duas patologias terá grandes implicações, estimando-se,

por exemplo, que um bilião de pessoas no Sudoeste Asiático estando exposto a malária,

pequenas sobreposições entre malária e HIV nessas zonas terão um elevado impacto na

saúde pública. (17)

Na África subsariana, anualmente cerca de um milhão de grávidas sofrem

complicações devido à coinfeção entre malária e HIV. (27) Segundo a WHO, em 11 dos

43 países da África subsariana endémicos para malária, nomeadamente Moçambique,

Malawi e Uganda, pelo menos 10% das mulheres grávidas que realizam consultas pré-

natais estão infetadas com HIV. (17)

As infeções por HIV e malária interagem em diferentes áreas geográficas, tendo

como resultado efeitos na transmissão, manifestações clínicas, resposta a fármacos de

prevenção e tratamento.


Catarina Alves Interações entre Malária e HIV na gravidez

173

3.Interações entre Malária e HIV na Gravidez

3.1.Impacto do HIV na malária durante a gravidez

Tem sido descrito que o HIV está associado a um aumento na prevalência da

infeção por Plasmodium falciparum na gravidez. (28,29) Um estudo em Ruanda refere

que a presença do HIV (mas não o título de células T CD4+) está relacionado com risco

aumentado de desenvolver malária. (30)

No geral, a informação sobre o impacto do HIV na mulher com malária indica que

a infeção pelo vírus prejudica a habilidade da grávida de controlar a infeção pelo parasita.

Alguns estudos revelam que as mulheres grávidas infetadas com HIV estão em maior

risco de sofrerem infeções placentárias e periféricas pelo P. falciparum, relativamente a

grávidas seronegativas para este vírus. (1,16,18)

A infeção pelo HIV aumenta complicações da infeção causada pelo parasita e

origina um maior risco de evolução do quadro clínico de malária nas grávidas.

(3,15,17,18) O quadro clínico de malária é definido como febre documentada ou um

historial de febre, na presença de parasitémia detetada pela análise microscópica do

esfregaço de sangue. (31)

Nas mulheres seronegativas para HIV, ocorre o desenvolvimento de imunidade

adquirida à malária. No entanto, esta imunidade poderá estar comprometida em grávidas

seropositivas, resultando numa menor capacidade de limitar a infeção pelo P.

falciparum.(15–17,32) Isto poderá explicar a razão pela qual o risco referido

anteriormente ser mais marcado em mulheres com gravidezes múltiplas, pois

independentemente do número de gravidezes, as mulheres continuam suscetíveis à

infeção pelo parasita. (1,15–17) Por outro lado, a suscetibilidade aumentada nestas

mulheres poderá ser também devido a uma exposição mais longa ao vírus, originando

uma maior imunodeficiência.(1,16,31)

Em mulheres coinfetadas também se verificam aumentos nas densidades

parasitárias do cordão umbilical, placenta e sangue periférico, em comparação com

grávidas não infetadas com HIV, o que explica os riscos aumentados (anemia, baixo peso

ao nascer) nestas mulheres, mais uma vez, evidenciados em mulheres com mais do que

duas gravidezes. (1,5,16,31) No entanto, outros estudos mais antigos referem não existir

relação entre a infeção por HIV e parasitémia em mulheres grávidas. (5,33)


Catarina Alves Interações entre Malária e HIV na Gravidez

174

Um estudo realizado em Malawi com mulheres entre o segundo trimestre de

gravidez e o parto, concluiu que em primigrávidas, não houve diferença entre a taxa de

parasitémia entre mulheres com e sem a presença de HIV. No entanto, em mulheres com

mais do que duas gravidezes e, com infeção pelo HIV, o risco de parasitémia é duas vezes

superior aquelas que são seronegativas e é constante ao longo da gravidez. Estes dados

podem significar que o vírus altera a proteção adquirida pelas mulheres anteriormente

descrita. Os autores referem que os dados obtidos para a primeira gravidez podem ser

devidos a comportamentos preventivos superiores em primigrávidas. (34) Segundo

Verhoeff et al, nas grávidas infetadas com HIV que não tomaram medicação contra a

malária, a prevalência da parasitémia aumentou desde o início da gravidez até ao

momento do parto e, que nesta altura, mesmo as que receberam duas doses de

antiparasitários apresentavam parasitémia elevada. (28)

O aumento da parasitémia na placenta pode ser devida à ação do vírus em diversos

locais, originando baixos títulos de anticorpos ou através da infeção de macrófagos que

ficam impedidos de fagocitar eritrócitos infetados na placenta. (5) Este impedimento (de

realizar a fagocitose dos eritrócitos infetados) pode explicar porque é que as populações

de macrófagos se alteram durante a coinfeção na gravidez. (16)

A imunidade humoral contra a malária na gravidez é mediada através da aquisição

de anticorpos contra antigénios expressos na superfície de eritrócitos infetados. A infeção

placentária pela malária pode ocorrer quando as grávidas são infetadas por parasitas que

produzem antigénios variantes de superfície (VSAs, do inglês, variant surface antigens)

na superfície dos eritrócitos infetados, que possuem afinidade para recetores nas células

placentárias, nomeadamente o recetor sulfato de condroitina A (CSA). (34) Estes

anticorpos encontram-se em menor número em grávidas coinfetadas, sendo mais notado

naquelas com contagens mais baixas de células T CD4+. (1,35) Segundo Jaworowski et

al., a função de opsonização dos anticorpos anti-VSA na clearance dos eritrócitos

infetados terá um papel mais importante do que o bloqueio de adesão do parasita ao

recetor. No entanto, a infeção pelo vírus em mulheres grávidas não foi associada à menor

atividade de opsonização. (35) O contrário é demonstrado por Keen et al, usando ensaios

de citometria de fluxo, em que mulheres grávidas infetadas com HIV apresentam níveis

mais baixos de atividade de opsonização do que as seronegativas. (36) O mesmo é

observado nos estudos em grávidas coinfetadas em Malawi e no Quénia. No entanto,

apesar de as mulheres infetadas com o HIV apresentarem níveis de atividade de

opsonização mais baixos no plasma (níveis mais baixos associados a imunodeficiência),



175

não detinham uma diminuição da inibição de ligação ao recetor pelos eritrócitos infetados.

(5) Deste modo, a possibilidade do vírus afetar este mecanismo de clearance dos

eritrócitos infetados, aumenta a suscetibilidade da grávida à infeção pelo Plasmodium

falciparum.

Um dos antigénios mais referidos é o antigénio variante de superfície VAR2CSA,

um antigénio de superfície do eritrócito infetado que permite a ligação à placenta através

do CSA. Esta adesão dos eritrócitos infetados ao recetor na placenta é bloqueada pelos

anticorpos anti-VAR2CSA. (5,16) A função destes anticorpos é assistir na eliminação dos

parasitas, através da opsonização dos eritrócitos infetados para posterior fagocitose pelos

macrófagos. (5) Alguns estudos indicam que mulheres infetadas com o HIV têm títulos

mais baixos destes anticorpos, contribuindo para o elevado número de parasitas ao nível

da placenta. (5,16) Além disso, esta diminuição estará relacionada com o grau de

imunodeficiência (associado ao número de células T CD4+). (5)

Ayisi JG et al. avaliaram o efeito da infeção por HIV nas respostas dos anticorpos

contra P. falciparum em sangue maternal e do cordão umbilical e, determinaram que o

vírus diminuiu a resposta humoral contra a proteína da superfície do merozoito-2 (MSP,

do inglês, merozoite surface protein) no sangue maternal e de um antigénio

imunodominante que consiste em 5 repetições da sequência de aminoácidos da proteína

circunsporozoíta, (NANP)5, cujos anticorpos anti-NANP impedem os esporozoítos de P.

Falciparum de infetar as células do fígado, no sangue maternal e cordão. Não foram

observadas as mesmas respostas diminuídas para os anticorpos contra MSP-1, antigénio

de ligação ao eritrócito 175 (EBA-175), MSP-3, e proteína associada a róptrias 1 (RAP-

1 do inglês, rhoptry associated protein). O autor refere que período assintomático da

infeção pelo HIV não afeta os títulos de anticorpos contra antigénios da malária em

mulheres grávidas. (37)

Mount A M. et al. estudaram o efeito da imunossupressão causada pelo HIV nas

respostas de anticorpos ao VSA associados à gravidez e a dois antigénios do merozoíto

com papéis na invasão dos eritrócitos, MSP-1e antigénio de membrana apical 1 (AMA-

1) e concluíram que o HIV bloqueia a capacidade das grávidas de criar respostas de

anticorpos contra estes antigénios. No caso do VSA, foi feita uma associação direta com

o numero de células T CD4+ e inversa com a carga viral do HIV. (38)

Deste modo, o HIV terá um papel importante na imunidade mediada por

anticorpos contra a malária na grávida. Não se conhece a causa, mas sendo que afeta as



176

respostas de alguns anticorpos contra antigénios da malária, mas não todos, não será

devida a uma alteração geral na resposta humoral em relação à malária.

Para além de inibir a fagocitose, o HIV atua alterando a estimulação de secreção

de citocinas, contribuindo para diminuir a proteção contra a malária placentária. Sendo o

P. falciparum um parasita intracelular, a sua eliminação requer respostas imunológicas

celulares que envolvam macrófagos. Os níveis de interferão-gama (INF-γ), uma citocina

com papel protetor de ativação de macrófagos para eliminar parasitas da malária, estão

reduzidos em mulheres coinfetadas, relativamente a seronegativas, sugerindo que o HIV

reduz a produção desta citocina. Para além disso, esta redução na produção de INF-γ está

associada ao número de células T CD4+. (1,16,29)

Outras citocinas, nomeadamente a IL (interleucina) -12 (reguladora do INF-γ)

também se encontra em níveis mais baixos. (1,16,31) No entanto, outro estudo indica que

a IL-18, outra citocina reguladora do INF-γ, não tem os seus níveis alterados pela

presença de HIV. (1,31) Estes dados indicam que o processo pelo qual o vírus infere na

patologia parasitária pode passar pela desregulação de citocinas, bloqueando a resposta

imunológica contra a malária placentária.

3.2.Impacto da malária maternal no HIV

Existe disponível pouca informação acerca do impacto da infeção por P.

falciparum na ação do HIV durante a gravidez.

Um estudo antigo em grávidas em Ruanda indica que a infeção pela malária

poderá facilitar a infeção pelo HIV, pois o vírus replica-se mais facilmente em linfócitos

estimulados pelos antigénios da malária.(33)

Resumidamente, estudos realizados em mulheres grávidas indicam que a

parasitémia periférica está associada a um aumento na carga viral periférica do HIV e que

a malária placentária está associada a um aumento nas concentrações de ácido

ribonucleico (ARN) do vírus na placenta e no sangue periférico, sendo mais ou menos

evidente, tendo em conta a densidade parasitária na placenta. (1,14–16,20,31,32) Estes

níveis serão independentes da contagem de células CD4+ e do grau de imunossupressão.

(15,17,31) O aumento da carga viral plasmática do HIV, originada pela infeção por P.

falciparum é parcialmente reversível com aplicação de tratamento antimalárico em

mulheres grávidas. (17)



177

Segundo Franke MF et al, a parasitémia está associada ao aumento de carga viral

em gestantes infetadas com HIV, no entanto, o estudo não encontrou uma forte associação

entre a parasitémia e a progressão da patologia viral, apesar desta progressão ser superior

em indivíduos mais imunodeprimidos e com menor parasitémia. (39)

Segundo Ivan E. e seus colegas, em grávidas infetadas com HIV, a presença de

malária não está associada a baixos títulos de células TCD4+. (30) No entanto, o oposto é

observado por num estudo que caracterizou os padrões de citocinas na coinfeção na

gravidez, indicando que a presença da infeção pelo parasita está associada a baixas

contagens de células T CD4+ por parte dos sujeitos de teste. (40)

Outros estudos não encontram nenhuma associação entre os efeitos da infeção por

P. falciparum na carga viral de HIV e na progressão da patologia. (1,15,16)

Um ensaio realizado in vitro revelou que a ligação de uma adesina recombinante

do parasita ao recetor CSA em células humanas placentárias aumentou a replicação do

HIV nessas células, possivelmente devido a estimulação com fator de necrose tumoral

alfa (TNF-α). (14)

O aumento de antigénios do parasita na placenta, resultam em expressões

inflamatórias aumentadas de monócitos e macrófagos, que por sua vez, aumentam a

expressão de citocinas como o TNF-α. (31,40) Além disso, foi demonstrada uma indução

da produção de TNF-α por trofoblastos, quando estes são ativados por um antigénio de

P.falciparum. Foi também referido que o pigmento da malária (hemozoína) aumenta a

produção da citocina por células mononucleares em mulheres infetadas com HIV,

aumentando a replicação do vírus. Um outro mecanismo envolve o

glicosilfosfatidilinositol (GPI), a âncora de antigénios de merozoítos ligados

covalentemente, como MSP-1 e MSP-2, que também podem induzir a produção da

citocina pelos macrófagos. (41)

O TNF-α está envolvido na transmissão viral transplacentária e a replicação do

HIV é mediada por esta citocina (40)

Em contradição, o parasita induz também a expressão de IL-10 (citocina que

regula negativamente a resposta inflamatória na gravidez), suprimindo a resposta

inflamatória e desta forma, reduz a carga viral do HIV e consequentemente a replicação

do vírus. (40)



178

3.3.Efeito da malária na transmissão vertical do HIV

Observações por parte de vários autores têm implicado a malária como potencial

fator de risco na transmissão vertical do HIV. Um estudo realizado em Uganda em

mulheres seropositivas revela taxas de 40% de transmissão vertical do HIV em mães com

malária placentária e 15,4% em mães sem malária placentária. (1) No Gâmbia, onde a

transmissão de malária ocorre quase exclusivamente na estação chuvosa, as taxas de

transmissão vertical do HIV-1 e HIV-2 que foram 14,8% e 1,7%, respetivamente, subiram

para 29,4% e 7,1%, respetivamente, durante a estação chuvosa, altura em que transmissão

de malária ocorre quase exclusivamente. No entanto, a possibilidade de atribuição deste

aumento à malária não foi comprovado, sendo que as parasitémia nas mães não foram

avaliadas. (42) Um estudo realizado no Quénia, com o objetivo de avaliar a transmissão

perinatal do HIV, numa área endémica de malária, revelou que 20% das crianças nascidas

de mães seropositivas ficaram infetadas pelo HIV pelos quatro meses de idade. No

entanto, as mulheres com malária placentária tinham taxas mais baixas de transmissão,

comparativamente aquelas sem malária placentária. Por outro lado, mulheres com

elevadas densidades parasitárias apresentavam taxas elevadas de transmissão. No entanto,

apenas foram estudadas mulheres infetadas com o HIV, e consideradas saudáveis, sem

síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) ou patologias crónicas, que poderiam

estar medicadas com fármacos antimaláricos. (2)

Um ensaio clinico realizado em Malawi, Zâmbia e Tanzânia não associou a

malária placentária à transmissão vertical do HIV, apesar de as grávidas com menor

numero de células T CD4+ e maiores cargas virais plasmáticas terem maior risco de

transmissão vertical do HIV. (43)

Deste modo, a observação de que a malária placentária aumenta o risco de

transmissão vertical do HIV não é certa, existindo resultados contraditórios indicando não

existir nenhuma associação (31,44), ou mesmo indicando que a malária diminui o risco

de transmissão do vírus da mãe para o feto. (17) As diferenças no número de células T

CD4+, cargas virais e estado imunológico da mãe, podem explicar a discrepância nos

resultados.

Para além do aumento das concentrações do vírus, encontrados em mães

coinfetadas, é possível que as células fetais expostas ao P. falciparum estejam num estado

elevado de ativação, sendo mais permissivas à replicação do vírus. (16) Além disso, um

aumento na carga viral na placenta, devido à presença dos parasitas, poderá estar



179

associado com excreção aumentada do vírus no trato genital, aumentando desta forma o

risco de transmissão vertical do HIV. (44)

Também tem sido referida uma associação entre a malária placentária e um

aumento na expressão dos recetores de quimiocinas tipo 5 (CCR5), co-recetor da entrada

viral, em macrófagos na placenta, indicando que a infeção pelo parasita na placenta pode

levar a um aumento da transmissão vertical do HIV. (14,15,18,20,21,42) Segundo Ter

Kuile e colaboradores, a expressão deste co-recetor está naturalmente aumentada em

macrófagos placentários e células fetais. (31) O mesmo é reportado num estudo que

comparou a expressão de CCR5 em grávidas com e sem malária placentária, que refere

que citocinas pro-inflamatórias presentes na placenta devido à malária poderão induzir a

expressão deste recetor indiretamente (42)

Foi referido que a infeção pelo Plasmodium falciparum provoca alterações nos

padrões de citocinas inflamatórias na placenta e que também interferem com a

transmissão vertical (16). Este parasita aumenta a produção de citocinas pelos linfócitos

ativados (IL-6 e TNF-α) que estimulam a replicação do HIV. (14)

Por outro lado, foi também relatado que a malária poderá favorecer produção de

INF-γ, diminuindo a replicação do vírus. (2,14) Além disso, os antigénios da malária

podem induzir a produção de fator inibidor de leucemia (LIF, do inglês, leukemia

inhibitory factor), que é um inibidor da replicação do vírus. (1,14) Este fator está

aumentado em placentas de mulheres que não transmitem o HIV. (2)

Em mulheres com imunossupressão devida ao HIV foram descritas diminuições

na produção de INF-γ e aumento na expressão de TNF-α. (16) Em grávidas

imunocomprometidas, com níveis baixos ou não de T CD4+, a capacidade de criar uma

resposta protetora à infeção pelo Plasmodium falciparum na placenta é reduzida, pelo que

a infeção pode favorecer o aumento de certas citocinas como o TNF-α, aumentando a

replicação do HIV. (1)

Em mulheres com HIV imunocompetentes, existe um aumento na produção de

certas quimiocinas: proteína inflamatória de macrófagos-1 (MIP, do inglês, macrophage

inflammatory protein) e ligando do recetor de quimiocinas 5 (RANTES, do inglês,

Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), que inibem a entrada do

vírus nas células, bloqueando a ligação do vírus ao CCR5, pois possuem o mesmo recetor

e atuam competitivamente. (1,14,16,31) Nestas mulheres, os títulos de células T CD4+

são normais e quando infetadas com malária, são capazes de criar respostas imunológicas

protetoras. (1)



180

Risco Proteção

Imunocompetência

↑ MIP-1

↑ RANTES

↑ INF-γ

↑ LIF

↓ Replicação HIV

Imunossupressão

↑ TNF-α

↓ INF-γ

↑ IL-6

↑ CCR5

↑ Replicação HIV

Deste modo, artigos contraditórios referem que as alterações no padrão de

citocinas são devidas a variações na imunocompetência maternal, que estando

imunocomprometidas devido à gravidez terão menor capacidade de respostas

imunológicas protetoras, logo maiores cargas parasitárias e virais, estando diretamente

associado a um maior risco de transmissão vertical. (14) Segundo Ayisi e seus colegas, a

ação da malária na transmissão vertical do vírus poderá ser de proteção ou de aumento do

risco dependendo da parasitémia na placenta e da cronicidade da patologia, bem como

outros fatores da infeção placentária. (41)

No entanto, existem estudos que não revelam uma associação causal direta entre

a malária e a transmissão do HIV indicando, por exemplo, que a malária placentária

danifica a integridade da placenta, devido à resposta inflamatória à infeção, e assim

aumenta o risco de transmissão vertical, ou que pode existir uma alteração na estrutura da

placenta, que permite a mistura de sangue materno e fetal. (14)

Podemos observar na figura 6 um modelo hipotético da ação da malária na

transmissão vertical do HIV.

Transmissão vertical do HIV

Figura 6. Modelo hipotético da ação da malária na transmissão vertical do HIV.

Grávidas com malária

placentária infetadas com HIV


Catarina Alves Implicações da Coinfeção na Mãe e no Recém-nascido

181

4.Implicações da Coinfeção na Mãe e no Recém-nascido

A coinfeção entre P. falciparum e HIV está associada não só a elevada morbidez

da mãe e da criança, como também ao risco aumentado de ocorrência de parto prematuro,

baixo peso ao nascer e atraso no crescimento intrauterino. (14–17) Além disso, a

exposição do feto a ambas as patologias, malária placentária e HIV, poderá aumentar o

risco de mortalidade pós-natal, relativamente à exposição apenas ao HIV. (15,29,31,45)

A infeção pelo HIV em grávidas pode originar infeções severas e frequentes

devidas à presença do P. falciparum, que resultam em risco aumentado de mortalidade

pós-natal e morte maternal, sendo mais comum em mulheres com gravidezes múltiplas,

provavelmente devido a alterações nos mecanismos imunológicos de memória e maior

imunossupressão originada por uma infeção por HIV mais duradoura. (1,16)

As crianças que nascem de mães com ambas as patologias apresentam risco

aumentado de desenvolver anemia, aumentando o risco de mortalidade pós-natal. (41)

Sendo que o HIV e malária são duas causas conhecidas de anemia maternal, não é de

estranhar que a combinação das duas infeções origine efeitos prejudiciais nas

concentrações de hemoglobina maternal, existindo um risco aumentado de

desenvolvimento de anemia severa. (14,15,17,31,45) Estudos realizados no Quénia e em

Malawi indicam que as mulheres com a dupla infeção apresentam maior risco de anemia

severa quando comparadas com as infeções isoladas, provavelmente devido às elevadas

densidades parasitárias e maior duração da infeção. (31) Segundo Orish et al, que realizou

um estudo acerca do efeito da coinfeção no aumento do risco de anemia em grávidas no

Gana, estas mulheres apresentam duas vezes mais risco de anemia do que aquelas com

apenas uma das patologias. (46) O mesmo é observado numa análise em mulheres

grávidas coinfetadas na Nigéria, em que os autores demonstram uma associação entre a

coinfeção e uma diminuição nos níveis de hemoglobina. (47)

A infeção pelo HIV na placenta pode interferir na capacidade de transferência de

anticorpos protetores da malária da mãe para o feto, nomeadamente anticorpos contra

(NANP)5, MSP-3, AMA-1 e VSA. (31) Segundo Ayisi et al, o vírus afeta a transferência

de mãe para filho de anticorpos contra alguns antigénios da malária, nomeadamente MSP-

2 e (NANP)5. Contudo, a transferência de anticorpos contra EBA-175 era superior. Além

disso, os autores referem que a transferência de anticorpos não é afetada quando a infeção

pelo HIV é assintomática. (37) Outro estudo indica que o vírus afeta a transferência de

EBA-175, MSP-1, AMA-1 e que a transferência dos anticorpos contra a malária da mãe


Catarina Alves Implicações da Coinfeção na Mãe e no Recém-nascido

182

para o feto poderá não estar associado a proteção, mas a um risco aumentado de incidência

da malária no primeiro ano de vida. (48) Deste modo, não é claro qual o papel do HIV na

transferência vertical de anticorpos da classe G e na capacidade de proteção do recém-

nascido à malária.


Catarina Alves Importância do Diagnóstico

183

5. Importância do Diagnóstico

Em indivíduos infetados pelo HIV, basear o diagnóstico de malária apenas nos

episódios de febre, que podem ser devidos a uma ampla gama de infeções, pode induzir

o técnico de saúde à recomendação de cuidados inadequados em indivíduos infetados

pelo HIV, pelo que o diagnóstico parasitológico é de extrema importância,

particularmente em áreas com elevada prevalência de HIV. (17) O diagnóstico clínico,

não necessitando de nenhum equipamento especial e não sendo caro, poderá apresentar-

se como a única opção em áreas onde faltam instalações laboratoriais como na África

subsariana, apesar de estar bem estabelecido que um diagnóstico baseado apenas em

critérios clínicos não é confiável por várias razões. (6) Desta forma, a todos os casos de

suspeita de malária deve ser realizado diagnóstico parasitológico. Os dois métodos

rotineiramente utilizados são exame microscópico ou testes de diagnóstico rápido (RDTs,

do inglês, rapid diagnostic tests) imunocromatográficos (figuras 7 e 8, respetivamente).

(24,49) Em quase todos os casos de malária sintomática, o exame de esfregaços de sangue

por microscopia ótica bem realizado, revela parasitas da malária. Os RDTs detetam

antigénios ou enzimas específicas do parasita, sendo que estes últimos deverão ser usados

se a microscopia não estiver prontamente disponível. Por outro lado, os RDTs podem ser

úteis em indivíduos infetados que receberam tratamento antimalárico incompleto e em

que os esfregaços de sangue podem ser falsamente negativos, o que é provável se o

indivíduo recebeu uma dose recente de um derivado de artemisina. (49) Uneke et al.

estudou a prevalência de malária na gravidez na África subsariana, e revelou ser um

desafio, isto porque a prevalência de malária em grávidas nesta região difere muito, de

acordo com os critérios de diagnóstico usados. Nesta área, o gold standard do diagnóstico

é a clínica e o exame microscópico do esfregaço de sangue, apresentando-se os RDTs

como excelente alternativa no diagnóstico rápido de malária na gravidez, que sendo

tratada de imediato, reduz a mortalidade e incidência de efeitos graves no feto. No

entanto, apresentam desvantagens: uma delas é a possibilidade de apresentarem resultado

positivo até duas semanas após o tratamento, tornando-se confusa a relação com falha no

tratamento ou resistência aos fármacos. Técnicas moleculares de reação em cadeia da

polimerase (PCR, do inglês, polimerase chain reaction) podem ser também usadas no

diagnóstico da infeção, apesar do seu uso na África subsariana ser irrealista. (6)



184

Figura 7. Esfregaço de sangue de um indivíduo com malária. O exame

microscópico revela a presença de trofozoítos de Plasmodium falciparum (setas) que

infetam alguns dos glóbulos vermelhos intracelularmente. Adaptado de (50).

Figura 8. Teste rápido de diagnóstico da malária. Adaptado de (51)

O diagnóstico correto nas áreas endémicas de malária é particularmente

importante nos grupos populacionais mais vulneráveis, tais como as grávidas e

populações não imunizadas, em que a malária por P. falciparum pode ser potencialmente

fatal. Além disso, o diagnóstico reduz o tratamento desnecessário com medicamentos

antimaláricos, que também limita a propagação das resistências. No entanto, em

indivíduos infetados com suspeita de malária grave e altos grupos de risco,

nomeadamente grávidas coinfetadas com HIV, a ausência ou atraso no diagnóstico não

deve atrasar o início do tratamento antimalárico. (49)



185

Todas as mulheres grávidas devem ser testadas para o HIV na medida em que se

a mulher fizer terapêutica antirretroviral precocemente no período de gravidez, o risco de

transmissão vertical pode ser reduzido. Uma variedade de testes está disponível no

mercado. Os testes de ácidos nucleicos que pesquisam o vírus no sangue são caros e não

usados rotineiramente no screening de indivíduos infetados. Os testes de serologia

pesquisam anticorpos e antigénios do vírus. Existem também disponíveis testes rápidos

de pesquisa de anticorpos, com resultados prontos em cerca de 30 minutos ou menos.

(9,11) A sensibilidade e especificidade do teste rápido são próximas de 100%, enquanto

o valor preditivo positivo depende da prevalência da patologia na população em geral

testada. Em populações onde a prevalência do HIV é elevada, será notado um maior valor

preditivo positivo. (11)

Segundo a WHO, a cobertura global dos testes e aconselhamento de HIV

permanece insatisfatoriamente baixa. Pesquisas demográficas e de saúde realizadas em

12 países com prevalência na África subsariana, indicam que as mulheres na população

em geral que foram testados para o HIV e receberam os resultados foi de 10%. Além

disso, dados recolhidos em 2015 indicaram que na África subsariana, a percentagem de

mulheres grávidas que realizou um teste de HIV foi 9%, contra 46% na América Latina

e Caraíbas e 75% na Europa Oriental e Ásia Central, indicando uma menor cobertura de

testes em países com maior número estimado de mulheres infetadas com HIV. (52) Estes

dados são preocupantes na medida em que os testes são essenciais para identificar as

mulheres que poderão beneficiar de forma imediata do tratamento ou intervenções para

prevenir a transmissão vertical aos filhos.


Catarina Alves Tratamento

186

6.Tratamento

6.1.Tratamento da Malária na Gravidez

Os efeitos do tratamento da malária em grávidas infetadas com HIV são uma

preocupação, na medida em que a imunidade é alterada pelo vírus e pode afetar a resposta

ao tratamento antimalárico padrão. (19) O tratamento da malária tem como objetivo

principal minimizar a transmissão da infeção e maximizar a probabilidade de cura clínica

e parasitológica com elevada rapidez, pelo que os regimes de dosagem devem ter

concentrações efetivas de fármacos antimaláricos e serem aplicados por tempo suficiente

de modo a curar a infeção em todas as populações alvo. (49)

Atualmente, o tratamento de malária utiliza terapêutica combinada com artemisina

(ACT, do inglês, artemisinin-based combination therapy) (49,53). Segundo as

recomendações da WHO (tabela 1), o tratamento de malária não complicada em grávidas

(exceto grávidas no primeiro trimestre) deve utilizar ACT durante 3 dias. No caso das

grávidas no primeiro trimestre, deve ser utilizado quinina + clindamicina durante 7 dias.

Em indivíduos coinfetados com HIV, deve ser evitado artesunato + sulfadoxina-

pirimetamina (SP), se estiverem a ser tratados com cotrimoxazole (CTX) e evitar

artesunato + amodiaquina, se estiverem a ser tratados com efavirenz ou zidovudina. (49)

Tabela 1. Recomendações para o tratamento de malária. Adaptado de (49)

Malária não complicada

Regimes de ACT para o tratamento

de malária não complicada em

grávidas no segundo e terceiro

trimestres

• Artesunato + amodiaquina

• Artesunato + mefloquina

• Artemeter + lumefantrina

• Dihidroartemisina + piperaquina

• Artesunato + SP

Grávidas no primeiro trimestre

• Quinina + clindamicina

Grávidas coinfetadas com HIV • Evitar artesunato + SP, caso tratados

com CTX

• Evitar artesunato + amodiaquina, caso

tratados com efavirenz ou zidovudina

Malária complicada

Grávidas em todos os trimestres • Artesunato intravenoso ou

intramuscular

• Artemeter como alternativa



187

O tratamento de malária severa para grávidas em todos os trimestres passa pela

utilização de artesunato intravenoso ou intramuscular (como alternativa usar artemeter)

durante pelo menos 24h até que possam tolerar medicação oral. A partir do momento em

que mulher grávida recebe pelo menos 24h de terapêutica parentérica, se puder tolerar a

terapêutica sob a forma oral, o tratamento deve ser completado com 3 dias de ACT. (49)

6.2.Tratamento do HIV na gravidez

A WHO recomenda a realização de testes de HIV e terapêutica antirretroviral, se

indicado, a todas as mulheres grávidas em áreas estáveis de transmissão de Plasmodium

falciparum. (27) No entanto, existem dados contraditórios sobre o efeito da ART no

resultado da gravidez, apesar do consenso indicar o seu benefício na prevenção da

transmissão vertical. (11,12) Segundo Dadhwal e seus colegas, mulheres grávidas

infetadas com HIV e a tomar ART têm uma incidência diminuída de nascimento

prematuro e restrição de crescimento intrauterino. (12)

Os antirretrovirais existem em cinco categorias: inibidores da transcriptase

reversa análogos de nucleótidos (NRTIs, do inglês, nucleoside reverse transcriptase

inhibitors), inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleótidos (NNRTIs, do

inglês, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors), inibidores de protease viral (PIs,

do inglês, protease inhibitors), inibidores da integrasse e inibidores de entrada

(enfuvirtide, antagonistas do co-recetor CCR5). (16,21) O tratamento padrão consiste

numa combinação de pelo menos três fármacos, antigamente chamada de terapêutica

antirretroviral altamente ativa (HAART, do inglês, highly active antiretroviral therapy),

que suprime a replicação do HIV e reduz a probabilidade de resistências. (53,54)

A ART de primeira linha deve conter um NNRTI (nevirapina ou efavirenz) e

dois NRTIs, um dos quais deve ser lamivudina ou emtricitabina e o outro zidovudina ou

TDF (tenofovir disoproxil fumarato). Os PIs estão incluídos em terapêuticas de segunda

linha. (17,18,55)

As recomendações da WHO para o tratamento de HIV na gravidez (tabela 2)

permitem que o tratamento seja iniciado o mais precocemente possível, de forma a

melhorar a saúde maternal e do feto e, a evitar a transmissão vertical do HIV. Estas

recomendações dependem da contagem de linfócitos T CD4+ das mulheres grávidas e da

sua fase clínica (tabela 3). (55)



188

Tabela 2. Recomendações da WHO para o tratamento de HIV na gravidez. Adaptado de

(55).

Grávidas com HIV e

contagem de células ≤ 350

células/mm3

Iniciar ART, independentemente dos sintomas clínicos.

Grávidas com HIV e

estadio clínico 1 ou 2

Testar a contagem de células T CD4+, para determinar se

necessitam de iniciar tratamento com antirretrovirais ou

profilaxia antirretroviral para prevenção da transmissão

vertical.

Grávidas com estadio

clínico 3 ou 4

Iniciar ART, independentemente do número de células T

CD4+.

Nas mulheres elegíveis para tratamento ART

▪ Zidovudina + lamivudina + efavirenz ou

▪ Zidovudina + lamivudina+ Nevirapina ou

▪ TDF + lamivudina (ou emtricitabina) + nevirapina ou

▪ TDF + lamivudina (ou emtricitabina) + efavirenz

Tabela 3(a). Fases clínicas do HIV em adultos e adolescentes segundo a WHO.

Adaptado de (55).

Estadio clínico 1 Assintomático, linfadenopatia generalizada persistente.

Estadio clinico 2

Perda de peso inexplicável moderada, infeções recorrentes do trato

respiratório, família Herpesviridae, Varicella zoster, queilite angular,

ulcerações orais recorrentes, erupções pruriginosas papulares,

dermatite seborreica, micoses nas unhas.

Estadio clinico 3

Perda de peso severa inexplicada, diarreia crónica inexplicada por mais

de 1 mês, febre persistente inexplicada, candidíase oral persistente,

leucoplasia pilosa oral, tuberculose pulmonar, infeções bacterianas

graves, estomatite ulcerativa necrosante aguda, gengivite ou

periodontite, anemia inexplicável (abaixo de 8 g/dL), neutropenia

(abaixo de 0,5x109/L) e/ou trombocitopenia crónica (abaixo de

50x109/L).



189

Tabela 3(b). Fases clínicas do HIV em adultos e adolescentes segundo a WHO.

Adaptado de (55).

Estadio clinico 4

Síndrome de desperdício de HIV (síndrome de Wasting), pneumonia

bacteriana grave recorrente, pneumonia por Pneumocystis jiroveci,

infeção crónica pelo herpes simples, candidíase esofágica, de traqueia,

brônquios ou pulmões, tuberculose extrapulmonar, sarcoma de Kaposi,

infeção por citomegalovírus, toxoplasmose do sistema nervoso central,

encefalopatia de HIV, criptococose extrapulmonar incluindo

meningite, infeção por micobactérias não tuberculosa disseminada,

leucoencefalopatia multifocal progressiva, criptosporidiose e

isosporíase crónica, micose disseminada, septicemia recorrente,

linfoma, carcinoma cervical invasivo, leishmaniose disseminada

atípica, nefropatia sintomática ou cardiomiopatia associada ao HIV.

O regime preferencial é zidovudina + lamivudina + nevirapina, tendo fácil

acessibilidade, baixo custo e já apresentar experiência no seu uso. (55)

A nevirapina é o NNRTI preferido no primeiro trimestre de gravidez, apesar de

existir alguma informação acerca da sua hepatotoxicidade maternal. (11,55) O efavirenz,

por sua vez, pode ser usado no segundo e terceiro trimestres de gravidez, mas é mais caro

e menos acessível que a nevirapina. O seu uso é contraindicado no primeiro trimestre pois

nesta altura da gravidez tem toxicidade associada ao sistema nervoso central e erupções

cutâneas.(55)

6.3. Anemia

O tratamento da anemia na coinfeção é complicado devido ao HIV. Mulheres

grávidas infetadas com HIV estão em maior risco de anemia devido à possível supressão

da eritropoiese por infeções oportunistas e pelo HIV em si. (27) Além disso, o ferro é

importante nas funções imunológicas, mas é também necessário em enzimas envolvidas

na replicação do HIV, podendo mesmo estimular a sua replicação. Alguns estudos

mostram que os suplementos de ferro e a inadequada quelação do excesso de ferro estão

associados à progressão do vírus. (31) Isto é importante na medida em que um efeito

prejudicial da suplementação com ferro na infeção por HIV terá implicações graves no

tratamento antenatal.



190

A anemia não necessita de ser grave para ser um risco na gravidez. Os parasitas

podem estar presentes na placenta e contribuir para a anemia materna mesmo na ausência

de parasitémia periférica documentada. Desta forma, segundo a WHO, as mulheres

grávidas com anemia grave numa área endémica de malária, devem ser tratadas com um

fármaco antimalárico eficaz, com ou sem parasitémia periférica ou antecedente de

febre.(3)

Por outro lado, estando as mulheres grávidas em risco elevado de anemia, a sua

prevenção e tratamento é de extrema importância de modo a minimizar potenciais

transfusões de sangue, o qual poderá não estar adequadamente rastreado para o HIV.

(14,31)


Catarina Alves Prevenção

191

7.Prevenção

7.1.Tratamento preventivo intermitente

Se as mulheres com malária placentária e infetadas com HIV estão em risco

aumentado de transmitir o vírus aos filhos, a prevenção da malária durante a gravidez é

uma prioridade urgente e premente.

A todas as mulheres grávidas em áreas estáveis de transmissão de Plasmodium

falciparum, é recomendado tratamento preventivo intermitente (IPT, do inglês,

intermittent preventive treatment) na gravidez (IPTp, do inglês, intermittent preventive

treatment in pregnancy). (3,27,56) O IPT resulta na administração de uma dose de um

fármaco antimalárico num intervalo de gestação definido, com o objetivo de reduzir o

risco de malária placentária. SP (Sulfadoxina-pirimetamina) é o fármaco antimalárico de

preferência para o tratamento preventivo intermitente, pois apresenta baixo custo, é de

fácil administração e não é considerado perigoso após o primeiro trimestre de gravidez.

(27) O uso de SP tem demonstrado diminuir o risco de parasitémia periférica e placentária

e diminuir os riscos associados à gravidez na mãe e no bebé como anemia maternal e

baixo peso ao nascer. (19)

A WHO recomenda o uso de IPTp com SP a todas as mulheres grávidas como

cuidado pré-natal em zonas endémicas de malária em África, com a primeira dose a ser

administrada no segundo trimestre de gravidez e as doses seguintes administradas com

pelo menos um mês de intervalo, com o objetivo de atingir pelo menos três doses. (49,57)

Alguns estudos indicam uma fraca resposta à medicação por parte das mulheres

coinfetadas. (16,20,45,53) Isto ocorre provavelmente devido aos níveis elevados de

parasitémia placentária e periférica originados pelo HIV. (16,20) Além disso, foi referido

que durante a gravidez, a infeção pelo vírus interfere com a imunidade do hospedeiro à

malária e a resposta à medicação estará depende da imunidade do hospedeiro. (15,16)

Deste modo, doses mais frequentes de IPT serão necessárias em mulheres

seropositivas para HIV, para reduzir o risco de malária placentária, relativamente às

grávidas não infetadas com HIV. (16,20,27,56) Foi indicado que uma administração

mensal pode melhorar a eficácia de SP na malária placentária em mulheres com HIV.(19)

Outros autores referem que duas doses de SP poderão ser eficazes em áreas com baixa

prevalência de HIV, mas que deve ser aplicada uma administração mensal em gravidezes

mais avançadas e em áreas de alta prevalência do vírus. (15) Numa revisão sistemática de



192

ensaios realizados em várias áreas endémicas em África, incluindo Quénia e Malawi,

entre 1996 e 2008, revelou que três ou mais doses, em comparação com apenas duas doses

de SP, tem efeitos positivos no peso dos recém-nascidos, na redução da parasitémia

placentária em cerca de 50% e da parasitémia maternal em cerca de 33%. (49)

No entanto, já existem resistências a este fármaco. (58) Um estudo indica que

mulheres coinfetadas, com imunidade fragilizada contra a malária, apresentam maior

número de parasitas com marcadores moleculares de resistência ao SP, após IPT com SP,

relativamente às não infetadas com HIV. (16) Algumas conclusões de um estudo na

Nigéria indicam que a taxa de resistência a fármacos antimaláricas é superior em mulheres

grávidas coinfetadas do que em mulheres grávidas apenas com malária, sugerindo que a

infeção por HIV aumenta o risco de resistência. No entanto, o número de sujeitos de teste

era muito reduzido neste ensaio. (47)

Por outro lado, Naniche e seus colegas estudaram o impacto do tratamento

preventivo intermitente na prevenção da transmissão vertical em Moçambique e

concluíram que o uso de duas doses em mulheres que usam redes com inseticidas

diminuiu a parasitémia periférica e placentária, mas não teve impacto na diminuição do

risco de transmissão vertical de HIV. (59) Este resultado é consistente com as observações

anteriores de que a malária placentária poderá ter um efeito protetor na transmissão

vertical do HIV e que deste modo, o tratamento, diminuindo a malária placentária,

diminui o efeito protetor na transmissão vertical do vírus.

A cloroquina é um outro fármaco antimalárico usado na gravidez nos países

Africanos. É também de baixo custo e de fácil administração, mas apresenta já

resistências marcadas. (56,58) Além disso, a presença do HIV origina uma fraca resposta

a este fármaco. (17,31)

Por fim, um estudo conduzido por Serra-Casas e colegas revela que o IPTp com

SP em mulheres infetadas com HIV tem efeito na redução de anticorpos contra a malária

(VSA, AMA-1), mas o mesmo não acontece em mulheres não infetadas pelo vírus.

Provavelmente porque o fármaco resulta na diminuição da exposição a antigénios da

malária e devido à imunossupressão do HIV. No entanto, a redução de anticorpos não foi

associada a risco aumentado de morbidade e problemas associados em crianças em

recém-nascidos, pelo que os autores sugerem que outros mecanismos existam para

proteger mãe e filho contra os efeitos adversos. (60)



193

7.2.Profilaxia com cotrimoxazole

É também recomendada para prevenção de infeções oportunistas, profilaxia diária

com CTX, independentemente do título de células T CD4+ das grávidas. Este fármaco é

benéfico a todas as mulheres infetadas com HIV, para prevenir infeções oportunistas,

reduzindo a incidência de malária em indivíduos seropositivos para HIV. (16,55,57) Mas

o uso de SP não é recomendado a mulheres que tomam cotrimoxazole, devido às

interações entre estes fármacos. (16,53,57,58) O seu uso está recomendado como

alternativa a IPT com SP em mulheres imunocomprometidas com HIV, ou quando

existem resistências ao SP. (27,53)

Foi referido que o uso generalizado deste fármaco pode acelerar o

desenvolvimento de resistências do parasita a SP. (31) Deste modo, a eficácia do seu uso

deve ser monitorizada relativamente à aplicação do tratamento preventivo intermitente

nos programas de controle de HIV e malária.

O uso de CTX mostrou que apresenta propriedades contra a malária, apesar de

ainda não existir informação acerca da sua eficácia na prevenção da malária em mulheres

grávidas. (19,41)

7.3.Controlo do Vetor

O controlo vetorial é a principal maneira de prevenir e reduzir a transmissão da

malária. A WHO recomenda o controlo efetivo de vetores da malária como proteção para

todas as pessoas em risco de adquirir a patologia, através do uso de redes tratadas com

inseticidas e pulverização residual intra-domiciliária (IRS, do inglês, indoor residual

spraying). (23,24)

A proporção da população na África subsariana protegida relativamente ao

vetor de transmissão foi estimada em 57% em 2015, comparativamente a 37% (figura 9)

em 2010 e ultrapassou 80% em três países em 2015: Cabo Verde, Zâmbia e Zimbabué.

(24)



194

Figura 9. Proporção da população em risco protegida por IRS ou ITNs na África

subsariana. Dados entre 2010-2015. Adaptado de (24).

A todas as mulheres grávidas em áreas estáveis de transmissão de Plasmodium

falciparum, a WHO recomenda o uso de ITNs. (49) Esta é a segunda forma de

intervenção, a seguir ao tratamento preventivo intermitente, para a prevenção da infeção

pelo Plasmodium falciparum e passa pela utilização de redes tratadas com inseticidas, nas

áreas endémicas de malária que repelem ou matam os vetores, reduzindo assim o seu

contacto com os humanos. Devido ao seu efeito protetor, as redes estão a ser indicadas

para o seu uso em países africanos.(3)

Um estudo revela que o uso de redes tratadas com inseticidas origina um efeito

protetor de 41,6% em primigrávidas e a associação entre o uso destas redes e o tratamento

preventivo com SP origina um efeito protetor de 55,8%. No entanto, muitas famílias na

África subsariana poderão não ter acesso as estas redes, pois são caras e não totalmente

subsidiadas. (27)

Segundo Boene et al, as redes são a escolha preferencial de prevenção, no entanto,

poucas mulheres estão conscientes das consequências da malária na gravidez,

especialmente no recém-nascido. (61)

A distribuição destas redes com altos níveis de cobertura na comunidade é um

desafio e as estratégias aplicadas localmente deverão ser mais bem-sucedidas,

nomeadamente indicações acerca dos seus efeitos como barreira protetora colocadas em

clinicas pré-natais em zonas endémicas e outras instalações de cuidados de saúde. (3)

As estratégias de controlo do vetor de transmissão evoluíram a partir da descoberta

do diclorodifeniltricloroetano (DDT) como inseticida, que até aos anos 70 levou a uma



195

redução dramática na transmissão de malária em vários locais do mundo. No entanto, o

aparecimento de resistências levou à ressurgência da patologia. (62)

Nos anos 80, os piretróides, uma nova classe de inseticidas, começaram a ser

utilizados na IRS. A sua introdução nas ITNs ganhou um impacto elevado, diminuindo a

abundância das populações de mosquitos do género Anopheles e consequentemente,

reduzindo a mortalidade e morbidade associada à malária nos países africanos.

Infelizmente, nos últimos anos, surgiram resistências dos mosquitos a esta classe de

inseticidas em vários países. (23,24,62) Em áreas endémicas de malária na África

subsariana e na Índia estão a causar algumas preocupações neste sentido, devido aos

elevados níveis de transmissão da malária e aos relatórios generalizados de indicação de

resistência aos inseticidas. (23) Outros grupos de inseticidas utilizados para o controlo

vetorial são os organofosfatos, organoclorados e carbamatos. Estas classes, juntamente

com os piretróides visam recetores do sistema nervoso do mosquito ou inibem enzimas

envolvidos na transmissão de impulsos nervosos, causando a paralisia e morte dos

mosquitos. (62)

O desenvolvimento de redes com dois inseticidas diferentes poderá apresentar

uma oportunidade para amenizar a propagação das resistências. (23) Um estudo da WHO,

apresentado na figura 10, revela a elevada resistência a várias classes de inseticidas pelos

vetores da malária, com os pontos a vermelho a indicar resistências confirmadas. (63)

Caso a maioria das casas em áreas específicas de malária sejam pulverizadas

com inseticidas, a IRS é uma maneira rápida de redução da transmissão de malária. A

pulverização interna é eficaz por 3 a 6 meses, dependendo da formulação do inseticida

utilizado e do tipo de superfície em que é pulverizada. O uso rotatório de diferentes

classes de inseticidas para IRS é recomendado de forma a gerir as resistências aos

inseticidas. (23)



196

Figura 10. Suscetibilidade a inseticidas por vetores da malária reportada entre 2010-

2015. Resistências confirmadas (vermelho), possíveis resistências (amarelo),

suscetibilidade (vede). Adaptado de (63).

7.4.Estratégias de prevenção

Apesar destas patologias serem duas das causas principais de mortalidade e

morbidade nos países africanos, o acesso a tratamento e serviços de prevenção e

aconselhamento é fraco.

Em Uganda, apenas 16,6% das mulheres tem acesso a tratamento preventivo

intermitente na gravidez e 11,3% dormem com redes tratadas com inseticidas. Da mesma

forma, 28% das mulheres grávidas recebem aconselhamento acerca do vírus e 6%

realizam testes ao HIV. (64) Num estudo em Malawi, 90% das mulheres grávidas têm

informação acerca da recomendação do tratamento preventivo intermitente, mas apenas

36% o receberam. Da mesma forma, no Quénia, apenas 5% das grávidas entrevistadas

receberam IPT apesar da maioria ter consciência das suas vantagens. (22)

Estudos em Uganda revelam que apesar de as pessoas terem consciência da

existência de tratamentos e serviços de prevenção, o acesso a estes serviços não é fácil,

maioritariamente devido a custos elevados, longa distância até aos serviços de saúde e

pouco apoio por parte de familiares e conhecidos. (64) Além disso, as mulheres podem

ter conhecimento acerca do SP, mas como um medicamento que cura a malária e não



197

como uso preventivo durante a gravidez, pelo que o treino dos profissionais de saúde em

como aconselhar estas mulheres é muito importante. (22)

Existindo algum progresso neste sentido, a maioria dos países em

desenvolvimento já apresenta cuidados para as mulheres grávidas infetadas com HIV,

que incluem acesso a fármacos antirretrovirais, profilaxia com cotrimoxazol e

aconselhamento. Existem também junções de programas de prevenção de transmissão

vertical do vírus e programas de controle da malária, que se foca nestas mulheres serem

tratadas com redes com inseticidas. (56) No entanto, apesar do regime de IPT ter sido

implementado nalguns países, as mulheres apresentam-se tardiamente para os cuidados

pré-natais e desta forma, a aplicação do tratamento preventivo intermitente tem sido fraca.

(22)

Segundo K.Singh et al, que avaliou em 2014 o HIV e malária como causas

importantes de mortalidade maternal em Moçambique (área endémica de malária), refere

que poucas mulheres nesta região têm acesso a IPTp ou ITNs, bem como ao acesso a

instalações de saúde aquando do parto e, em muitas províncias mais mulheres são

aconselhadas acerca do HIV do que sofrem intervenções acerca do IPTp ou ITNs (figura

11). (65)

Figura 11. Uma enfermeira explica o uso de ITNs a mulheres grávidas locais numa área

endémica de malária. Adaptado de (27).



198

É, portanto, necessário que os cuidados de saúde nestes países com fraca cobertura

por parte dos media e abordagens globais, se foquem: na prevenção de grávidas que vivem

infetadas com o Vírus da Imunodeficiência Humana, com possibilidade de se coinfetarem

com o Plasmodium falciparum (malária) e desta forma piorar a sua situação e a do recém-

nascido; oferecendo uma maior gama de serviços e estratégias de prevenção, que incluam

maximizar a saúde, realização de testes de rastreio, ter acesso a terapêuticas e prevenir

infeções como a malária, através do uso de terapêutica preventiva e redes com inseticidas.

(3,52) É também de extrema importância que os serviços de saúde tenham em conta as

preocupações acerca da sobrecarga de prestadores de cuidados pré-natais e apostem na

sua formação, de modo a que possam melhor aconselhar os indivíduos (co)infetados. (61)


Catarina Alves Interações entre Fármacos e Efeitos Adversos

199

8.Interações entre Fármacos e Efeitos Adversos

O tratamento e prevenção da coinfeção é um desafio devido à potencial interação

entre os fármacos.

O uso de fármacos antirretrovirais apresenta implicações no controlo da infeção

pela malária, na medida em que estes medicamentos poderão apresentar efeitos no P.

falciparum e alterações no sistema imunológico. (20,21) A associação de ART aos

antimaláricos poderá causar toxicidade imprevista ou a redução da exposição aos

fármacos, criando risco de falha no tratamento e seleção e parasitas resistentes. (19)

Os NNRTIs têm sido associados a uma diminuição na incidência da malária, mas

poderá ser devido a alterações no sistema imunitário e não devido à existência de

atividade antimalárica especifica. (20) A diminuição na incidência de malária é mais

notada quando os NNRTIs são associados ao CTX. (16) A maioria dos inibidores de

protease tem atividade antimalárica, no entanto, ainda não foi demonstrado impacto

clínico na malária e tendo um preço elevado, não são comumente usados em áreas

endémicas de malária. (20)

Por outro lado, o tratamento antimalárico também pode afetar a farmacocinética

dos medicamentos usados na ART, no entanto, será menos preocupante, uma vez que a

terapêutica antimalárica é de curta duração. (19) Fármacos antimaláricos podem ter

atividade anti-HIV direta, nomeadamente a cloroquina. (17,20,21,31) Esta foi proposta

como componente útil na terapêutica combinada com antirretrovirais, particularmente na

prevenção da transmissão vertical do vírus, devido ao seu efeito na redução de produção

de novos viriões maduros e porque se acumulam em células do leite materno. No entanto,

as resistências elevadas da cloroquina são já um problema a considerar. (21)

Já foi referido que a infeção pelo HIV diminui a eficácia do IPTp com SP e que a

profilaxia com CTX tem sido recomendada pela WHO para prevenir infeções

oportunistas em grávidas que vivem com HIV. A sua associação origina aumento de

toxicidade e efeitos adversos. (21,27) Felizmente, o CTX tem sido referido como redutor

da prevalência de malária placentária em mulheres gravidas com HIV. (21)

Para além das interações entre os fármacos, a sua toxicidade complica a gestão

conjunta dos casos de coinfeção. Por exemplo, a zidovudina tem como efeito colateral a

anemia, o que é uma preocupação óbvia nestes casos. (20) O período de maior risco de

anemia associado à malária coincide com o risco elevado de anemia associado ao uso de


Catarina Alves Interações entre Fármacos e Efeitos Adversos

200

zidovudina e com o parto, aumentando a vulnerabilidade da mulher a hemorragias. Além

disso, a administração de SP e zidovudina tem sido associada com aumento de

mortalidade em coinfetados em ensaios clínicos, particularmente em indivíduos com

anemia. (27) A coadministração de cotrimoxazol e lamivudina são outro exemplo, que

resulta na diminuição da depuração da lamivudina. (31) Artesunato + amodiaquina estão

associados a neutropenia severa, particularmente em indivíduos coinfetados com HIV,

especialmente aqueles a tomar zidovudina e ou cotrimoxazole. (49) Ambos SP e

nevirapina podem causar falha hepática fatal e toxicidade associada a reações cutâneas.

Caso a mulher grávida apresente algum destes efeitos, o clínico não saberá qual dos

fármacos é responsável, pelo que terá que descontinuar os dois. (27) Interações entre

NNRTIs e derivados de artemisina também têm sido descritas, por exemplo, a toma de

nevirapina ou efavirenz poderá reduzir as concentrações de artemeter ou lumefantrina,

aumentando o risco de falha no tratamento. (18)

Várias são as possíveis interações entre os fármacos utilizados na coinfeção e os

seus efeitos dependem do tipo de fármaco e das combinações usadas, que são

influenciadas pela farmacocinética e farmacodinâmica características de cada um. (20,27)

O estudo dos riscos da coadministração de derivados de artemisina e antirretrovirais é

muito indispensável devido à importância da terapêutica combinada baseada em

artemisina no tratamento da malária na gravidez. As artemisinas não parecem apresentar

importante toxicidade quando coadministradas com antirretrovirais, no entanto, mais

estudos nesta área são necessários. (27)


Catarina Alves Conclusão

201

9.Conclusão

Dada a sobreposição das áreas de ocorrência de malária e infeção por HIV, a

interação entre as duas patologias tem grandes implicações para a saúde pública, sendo

que os dois microrganismos interagem em diversas áreas, com efeitos na transmissão, na

clínica e na resposta a fármacos utilizados nas suas profilaxias e tratamentos.

Apesar da informação obtida sugerir que o HIV aumenta os efeitos adversos da

malária, nomeadamente favorecendo cargas parasitárias superiores, malária grave e

infeções placentárias, os mecanismos pelos quais isto acontece ainda não estão bem

estabelecidos. Mais estudos são também necessários para estudar o efeito da malária na

infeção por HIV, existindo ainda dúvidas acerca do seu efeito na severidade da patologia

e transmissão vertical do vírus.

Os resultados conflitantes sobre as interações entre os dois agentes refletem a

relação complexa entre as respostas imunológicas maternais à malária, que podem ter um

efeito protetor ou aumentar o risco de transmissão vertical e, esta situação pode depender

do grau de imunossupressão induzida pelo HIV, da gravidade da infeção por Plasmodium

falciparum e deste modo, afetar a imunidade celular e mediada por anticorpos. A infeção

placentária está diretamente relacionada com a transmissão vertical do HIV e o seu

impacto na transmissão do vírus da mãe para o filho poderá depender de um balanço entre

as citocinas que inibem a entrada do vírus e aquelas que favorecem a sua replicação. É

necessário avaliar este impacto tendo em consideração o estado biológico da mãe,

nomeadamente a contagem de células T CD4+ e o subtipo de HIV.

Por outro lado, a prevenção da transmissão vertical é difícil por várias razões,

nomeadamente os efeitos que a malária tem no vírus e a parca percentagem de mulheres

que são testadas para o HIV em áreas endémicas de malária. Para além disso, a eficácia

da profilaxia com SP é reduzida em grávidas coinfetadas, provavelmente porque o efeito

dos fármacos está dependente da resposta imunológica do hospedeiro. Sendo que o SP

não pode ser administrado com cotrimoxazole, devido a reações entre os dois, é

necessário estudar a eficácia de outros fármacos em grávidas coinfetadas, principalmente

pelo surgimento de resistências aos medicamentos utilizados atualmente.

É também importante realizar o estudo das interações entre os antimaláricos e

antirretrovirais usados na prevenção e tratamento, colocando ênfase nos seus efeitos

adversos e tratamento da coinfeção nas mulheres grávidas. Desta forma, são necessários


Catarina Alves Conclusão

202

mais estudos que analisem a farmacocinética e farmacodinâmica destas interações, como

por exemplo, programas para mulheres grávidas que devem incorporar os sistemas de

vigilância para efeitos adversos.

A redução da coinfeção e efeitos adversos nas mulheres grávidas depende do

acesso e qualidade dos serviços de saúde das localidades. A comunidade, a mobilização

social e os serviços de saúde, devem produzir mudanças no comportamento da população

afetada, através do uso dos meios de comunicação disponíveis e adequados ao efeito, com

ênfase no aconselhamento destas mulheres acerca do controlo do vetor de transmissão da

malária, através do uso de ITNs, profilaxia com antimaláricos e testes de rastreio para

HIV.

É também importante referir que os programas de vigilância atuais e os estudos

realizados acerca da coinfeção, não relatam o subtipo de infeção pelo HIV. É

particularmente importante, sendo a infeção por HIV-2 mais prevalente em áreas onde a

malária é endémica, apresentando diferenças em termos de fármacos a utilizar no seu

tratamento e podendo apresentar diferenças na epidemiologia da coinfeção.



203

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Parte IV

IX Mestrado Análises Clínicas Parte IV

Catarina Alves Conclusões e Perspetivas Futuras

213

Conclusões e Perspetivas Futuras

Através do estágio efetuado no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da

Luz, adquiri conhecimentos acerca das condições de colheitas exigidas para obter os

diferentes produtos biológicos, o seu transporte e armazenamento. Aprendi a identificar

quais os produtos necessários à execução de cada parâmetro analítico, bem como executar

as metodologias aplicados aos mesmos.

Por outro lado, o estágio realizado no GenoMed possibilitou-me a observação das

diferenças entre as técnicas de diagnóstico de rotina relativamente às técnicas aplicadas

ao diagnóstico genético e molecular, mais complexas e demoradas, apesar da curta

duração do estágio não permitir uma abordagem muito profunda destas técnicas.

Para além disso, aprendi como interpretar o Controlo de Qualidade Interno e

Avaliação Externa da Qualidade.

Considero que os objetivos da realização do estágio, que passam por adquirir a

capacidade de trabalhar em equipas multidisciplinares, bem como promover a integração

no meio profissional, aplicando os conhecimentos adquiridos ao longo do mestrado,

foram cumpridos. Estes conhecimentos foram também úteis no desenvolvimento da

monografia apresentada neste trabalho. A realização e duração total deste estágio

permitiu-me não só colocar em prática os conhecimentos obtidos nas unidades

curriculares do mestrado, como realizar novas aprendizagens fundamentais para a prática

profissional, nomeadamente a organização das atividades diárias do laboratório, pelo que

considero ter sido uma mais valia para a minha formação pessoal e para o meu futuro na

profissão.

Documents

Universidade de Lisboa Faculdade de Farmáciarepositorio.ul.pt/bitstream/10451/33996/1/TM_Catarina_Alves.pdf · interesse, licenciei-me no curso de Bioquímica pela Faculdade de Ciências