Universidade de São PauloInstituto de Física

Grupo de Fluídos Complexos

Relatório de Atividades referentes ao período de Dezembro de 2016 à Dezembro de 2017.

Dr. Wagner Wlysses Araújo

São Paulo, Dezembro de 2017.

1

Parte I.1­Introdução.

Os fenômenos de óptica não­linear,  são assim denomindados,  porque ocorrem quando a

resposta de um material na presença de um campo eléctrico aplicado, se dá de uma forma não­linear

em  relação  á  magnitude  do  campo.  Os   ferrofluidos  pertencem a  uma classe  de  materiais   que

apresentam propriedades  ópticas  não­lineares.  Os ferrofluidos  (FF) são suspensões  coloidais  de

nanopartículas   magnéticas   de   domínio   único   (dimensões   típicas   da   ordem   de   10   nm).   Essas

nanopartículas   são   mantidas   dispersas   em   um   líquido   portador.   Para   evitar   a   aglomeração   as

nanopartículas   de   ferrofluidos   são   revestidas   ou   com   moleculas   ou   com   grupos   carregados

eletricamente de materiais apropriados [1].

Os   ferrofluidos   são   materiais   importantes   tanto   do   ponto   de   vista   acadêmico   quanto

tecnológico.   Um   ramo   de   conhecimento   em   que   as   propriedades   estão   sendo   empregadas   é

optofluídica.   A   optofluídica   combina   em   um   microdispositivo   características   de   microfluidica

aliadas às propriedades ópticas do fluído a ser empregado [2­7]. Alguns exemplos de dispositivos

optoflu dicos com ferrofluidos já foram propostos e implementados. Por exemplo, fibras ópticası ı

com núcleo preenchido com ferrofluido são empregadas na construção de moduladores magneto­

ópticos, que controlam, com um campo magnético, a intensidade da luz transmitida [7­10]. Além

disso, os ferrofluidos são utilizados na biomedicina como contraste para imagem por ressonância

magnética   (MRI)  [11­13].   Existem   ainda,   estudos   no   tratamento   do   câncer   por   termoterapia

utilizando ferrofluidos, bem como no revestimento das part culas por moléculas biológicas para oı ı

carregamento de fármacos para uma região espec fica do corpo ı ı [11]. 

2 Materiais e Métodos.

2.1 Materias.

Os materiais estudados foram ferrofluídos cedidos em colaboração pela Drª Kinnari Parehk

do  Charotar  University  of  Science  & Technology   (CHARUSAT).  As   amostras   são   ferrofluídos

monodispersas obtidas pelo método de substituição (Re = Ho3+ Mn0.5Zn0.5Fe2­2xRe2xO4) que ao longo

do texto será adota a nomenclatura MZH. Foi adotado como referência a amostra sem a dopagem

com (Re = Ho3+) Mn0.5Zn0.5Fe2O4 . Ao longo do texto será adota a nomenclatura MZ para a amostra

de referência. Essas amostras Foram analisadas por Microscopia Elêtronica de Transmissão.

2

Foram estudados também dois  ferrofluidos que apresentam nanopartículas de magnetitas

(Fe3O4)  obtidas comercialmente da empresa ChemiCell.  Os ferrofluidos obtidos  são  fluidMAG­

UC/A e   fluidMAG­UC/C ambos  estão  dispersos  em água.  As  nanopartículas   fluidMAG­UC/A

apresentam cargas aniônica, enquanto que e as nanopartículas fluidMAG­UC/C apresentam cargas

catiônicas. Esses materiais foram estudados por espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).

Neste   trabalho   foram   sintetizados   3   amostras   de   ferrofluidos   pelo   método   de   co­

precipitação. Amostra de magnetita (Fe3O4), amostra de magnetita dopada com 3% de Neodímio

(Nd) e  uma amostra de magnetita  sintetitazada na presença de campo magnético para se gerar

nanobastões. Estas amostras foram caracterizadas quanto a sua morfologia e a sua estrutura.

2.2 Sínteze de nanopartículas de magnetita.

As nanoparticulas foram preparadas pelo método de coprecipitação. 25 mL de solução

aquosa de FeCl3:6H2O (4 mmol), FeCl2:4H2O (2 mmol), 8 ml de cis-9-octadecenóico e 2,5 mL de

HCl foram rapidamente adicionados a 150 mmol de NaOH a 80 ºC com agitação vigorosa. O

precipitado de cor marrom escura foi lavado 10 vezes em água deionizada para se ter o pH 8. O

mesmo procedimento foi adotado para ser obter a amosra de magnetita de nanobastõe. A diferença é

que neste caso o béquer estava imerso numa região de um campo uniforme de 2kG.

A amostra de magnetita dopada com 3% de Nd foi obtida pelo mesmo processo acima

descrito, mas neste caso, a solução aquosa é composta de FeCl3:6H2O (3,88 mmol), NdCl3:6H2O

(0,12 mmol), FeCl2:4H2O (2 mmol), 8 ml de cis-9-octadecenóico e 2,5 mL de HCl. Esta solução

aquosa foi rapidamente adicionada a 150 mmol de NaOH a 80 ºC com agitação vigorosa formando

o precipitado de cor marrom escura. Este precipitado foi lavado 10 vezes em água deionizada para

se ter o pH 8.

2.3 Microscopia eletrônica de Transmissão.

As micrografias de TEM, HR­TEM e padrão de difração de elétrons de área selecionada

(SAED) das nanopartículas de nanocubos foram obtidos usando um elétron de transmissão de alta

resolução num microscópio (TEM ­ Tecnai G2 F20) operando numa tensão de 200 kV. Amostras

foram 

A   morfologia,   o   tamanho   e   a   distribuição   de   tamanho   foram   investigados   utilizando

microscopia eletrônica de transmissão. O ferrofluido foi diluído 1000 vezes em Hexano e depois

mantido num banho de ultrassônico durante o período de 30 min. Uma gota da dispersão obtida foi

depositada em uma grade de cobre revestida de carbono e o excesso de fluido foi seco com papel

filtro antes de examinar a amostra no microscópio. 

3

2.4­ O Espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).

Os experimentos de espalhamento a baixos ângulos podem­se iniciar com uma partícula fixa

no espaço. Conforme ilustrado na Figura 1 onde uma onda incidente com vetor de onda k0  incide

nos pontos O e P separados por um vetor r [14].

Figura 1 – Esquema ilustrativo do processo de espalhamento por uma partícula fixa. 

O espalhamento ocorrido é assumido como elástico (primeira aproximação de Born), dessa

forma a onda espalhada com vetor de onda k possui o mesmo módulo da onda incidente e então a

diferença entre os feixes incidentes e espalhados é dado por [14]:

(1)

sendo q o vetor transferência de momento do espaço recíproco. A amplitude do espalhamento ƒ(q) é

dada   pela   transformada   de   Fourier   da   densidade   de   comprimento   de   espalhamento   do   centro

espalhador, ρ r( )[14].

(2)

A grandeza mensurável no espalhamento de raios X a baixos ângulos é a intensidade de

espalhamento, I(q) que é dada pelo modulo quadrático da amplitude de espalhamento, [14]

(3)

4

Para um sistema de partículas em solução, a intensidade espalhada pode ser representada

pela seguinte expressão,

(4)

onde NS o número de partículas iluminadas pelo feixe incidente, ƒ2(q) é o fator de forma da particula

espalhadora, com ƒ(q) sendo a amplitude de espalhamento e S(q) é o fator de estrutura do sistema

[14]. 

Para uma análise quantitativa, a intensidade espalhada de raios X a baixos ângulos I(q) foi

modelada.   A   intensidade   de   espalhamento   pode   depender   do   formato   das   nanopart culas,   daı ı

interação entre elas e da possível formação de agregados. O formato das part culas geralmente éı ı

modelado como um fator de forma no cálculo de I(q), enquanto a contribuição dos agregados e da

interação entre as part culas é modelado como fatores de estrutura no cálculo de ı ı I(q) [15].

Utilizando um modelo de part culas esfericas homogeneas de raio ı ı R, a amplitude do fator

de forma, F (q, R), e dada pela equacao [14­16]:

(6)

Outro   fator   importante   que   deve   ser   levado   em   consideração   é   que   dependendo   da

concentracao de nanopart culas do sistema espalhador, as intensidades espalhadas pelas diferentesı ı

part culas podem sofrer interferencia entre si. Esse comportamento, pode ser descrito por um fatorı ı

de estrutura, que contem tambem informacoes sobre a interacao entre as part culas. Foi utilizado oı ı

modelo de esferas r gidas interagentes [17] dados por:ı ı

(7)

onde RHS é o raio de esferas r gidas interagentes e ı ı φHS é a fracao volumetrica das esferas. O subscrito

HS é utilizado para se referir a esfera r gida (ı ı Hard­Sphere) ao longo do texto. O modelo final,

portanto,  foi o do espalhamento por um sistema de esferas r gidas interagentes de raio  ı ı R,  com

polidispersidade σ.  Esse modelo e descrito pela equacao:

5

(8)

onde as constantes IF e Sc representam a intensidade de fundo e o fator de escala, respectivamente.

D(R) e a distribuicao numerica dos raios das esferas dada por uma distribuição Log­normal.

As   medidas   experimentais   de   SAXS   das   amostras   de   LDL   foram   realizadas   em   um

equipamento NanoStar da Bruker, que está localizado no Laboratório de Cristalografia do IF­USP.

O arranjo é formado por uma fonte de raios X com radiação CU­k  (1,54  Å). Os porta­amostras

utilizados foram capilares de quartzo de 1 mm de diâmetro. O intervalo de q medidos na faixa de 9

 e 3,5 ­1 Å­1.

2.5­ A distribuição Log­Normal.

As nanopartículas magnéticas exibem uma geometria quase esférica, com uma distribuição

de forma não uniforme. A distribuição  P(D)  de diâmetros  D, geralmente é dado por uma função

log­normal, conforme a equação:

(9)

onde D e σ são o diâmetro médio e desvio padrão de ln D, respectivamente.

3 Resultados.

3.1 Resultados para as micrografias de eletrônica transmissão.

Na Figura 2 são apresentados as micrografias para as amostras de Ferrofluídos MZ e MZH.

Para a amostra MZ, as partículas são de natureza esférica, com o diâmetro dado por D0 = 11,4 nm e

σ  = 0,096. Para a amostra de MZH, as partículas são de forma cúbica/quadrada, de modo que a

largura dos cubos foi medida. O valor esperado para o comprimento do lado do nanocubo é de 10,9

nm e σ = 0,07.

6

Figura 2: Micrografias TEM e a distribuição do número de partículas encontrado para as nanopartículas as MZ (Esferas)

e MZH (Cubos).

Na figura 3 são apresentados a micrografia MET de alta resolução para a amostra MZH (ver

Figura  3­a)   (nanocubos)  e  o  correspondente  padrão  da  análise  de  difração de  elétrons  de  área

selecionada (SAED)(ver Figura 3­b). A partir da microscopia de alta resolução foi possível calcular

o valor de 0,829 nm para o parâmetro de rede. Este valor é comparável ao valor de 0,836 nm obtido

por difração de raios X fornecido pelo fabricante. Na Figura 3­b, a difração de elétrons de área

selecionada (SAED) mostra que indexação do aneis de difração está  de acordo com o resultado

obtido pela difração de raios X.

a                                                                                                    b

7

Figura 3: a­Micrografia MET de alta resolução obtida para a amostra MZH, barra de 2 nm. b­ Padrão de difração de

elétrons de área selecionada (SAED) obtido para amostra MZH. 

3.2 Resultados para as análises de SAXS das amostras fluidMAG­UC/A e fluidMAG­UC/C.

Nas figuras 4­a e 4­b, são apresentados as curvas de intensidade espalhada I(q) das amostras

fluidMAG­UC/A e   fluidMAG­UC/C,   respectivamente.  O ajuste   foi   realizado  de  acordo  com a

equação 8  e  é   apresentado  nas  Figuras  4­a  e  4b  com a   linha  vermelha.  A partir  do  ajuste   as

distribuições de raios foram obtidas, conforme é apresentado nas Figuras 4­c e 4d para as amostras

fluidMAG­UC/A e fluidMAG­UC/C, respectivamente. As distribuições de raios obtidas são do tipo

Log­normal. A partir das distruições Log­normal determinou­se o valor dos raios esperados para as 

amostras   fluidMAG­UC/A e   fluidMAG­UC/C.  Para  a   amostra   fluidMAG­UC/A obtivemos  um

valor de raio esperado de 17,28 ± 7,13 Å. Enquanto que para a amostra fluidMAG­UC/C obtivemos

um valor de raio esperado de 18,84 ± 7,56 Å, este valor é ligeiramente maior quando comparado

com   a   amostra   fluidMAG­UC/A   mas   dada   a   incerteza   de   ambos,   pode­se   concluir   que   essa

diferança não é significativa.

8

ab

cd

Figura 4: a­ Curvas de intensidade espalhada I(q) e o ajuste teórico realizado. b­ Curvas de intensidade espalhada I(q) eo ajuste teórico realizado. c­ Distribuições de raios obtido a partir do ajuste teórico para a amostra fluidMAG­UC/A.  d­

Distribuições de raios obtido a partir do ajuste teórico para a amostra fluidMAG­UC/C.

3.3 Resultados para as análises de MET das amostras sintetizadas.Na figura 5 é  apresentado as micrografias MET para as amostras de magnetita  (Fe3O4),

amostra de magnetita dopada com 3% de Neodímio (Nd) e uma amostra de magnetita sintetitazadana presença de campo magnético para se gerar nanobastões. Estas amostras foram caracterizadaspor   MET   quanto   a   sua   morfologia.   A   amostra   de   magnetita   apresenta   predominantemente   ageometria esferica enquanto que a amostra de magnetita dopada com Nd apresenta poliedros. Apresença  do  dopante   induz  o   facetamento  das  nanopartículas.  As  amostras  de  Nanobastões  demagnetita apresentam uma geometria de elipsoides. As distruições de tamanhos mostram que asnanopartículas de magnetita apresentam tamanho modal de <Dm> =7,73 nm e desvio padrão de σ=5,58 nm. As nanopartículas de magnetita dopada co Nd apresentam distribuição de tamanhos demodal de <Dm> =5,54 nm e desvio padrão de   =6,58 nm, enquanto que as amostras de nanobastõesσde magnetita apresentam distribuição de tamanhos de modal de <Dm> =7,54 nm e desvio padrão de

 =6,58 nm.σ

9

A

B

C

D

E

FFigura 5: A, C e E micrografias de MET das amostras de Magnetita, Magnetita dopada com Nd e Nanobastões de

magnetita. As figuras B, D e F são as respectivas  distribuições de tamanhos.

10

3.4 Resultados para as análises de DRX das amostras sintetizadas.Na   figura   6   é   apresentado   o   difratograma   para   as   amostras   de   magnetita   que   foram

sintetizadas. Para todas as amostras é possível verificar que há uma boa correspondência entre ospicos da referencia JCPDF 88­0315 em vermelho e os picos experimentais em preto.

A

B

CFigura 6: A­ Difratograma para a amostra de magntetita. B­ Difratograma para a amostra de magnetita dopada com 3%

de Nd. C­ Difratograma para a amostra de nanobastões de magnetita.

11

3.5 Resultados para as análises de SAXS das amostras sintetizadas.

Na   figura   7   é   apresentado   as  curvas   de   intensidade   espalhada  I(q)  e   o   ajuste   teóricorealizado. As Distribuições de raios foram obtidas a partir do ajuste teórico. As curvas foram ajustascom modelo de esferas rígidas não interagentes de acordo com a equação 8. As distribuições detamanhos corroboram os valores para os diâmetros obtidos por MET.

Figura 7: Curvas de intensidade espalhada I(q) e o ajuste teórico realizado. b­  Distribuições de raios obtido a partir doajuste teórico. REF corresponde a amostra de magnetita, RC corresponde a amostra de nanobastões de magnetita e ND

corresponde a amostra de magnetita dopada com 3% de Nd.

4­ Conclusões.

Através da microsocopia MET foi possível determinar a morfologia da nanopartículas paras

as amostras MZH e MZ. Obteve­se também o padrão de difração de elétrons de área selecionada da

amostra MZH.

Através do espalhamento de raios X a baixos ângulos obtivemos a intensidade de raios X

espalhada para as amostras de ferrofluido fluidMAG­UC/A e fluidMAG­UC/C. A partir do ajuste

teórico realizado nas curvas de intensidade espalhados determinou­se a distribuição de raios das

nanopartículas presentes nas amostras.

Amostras de magnetita foram sintetizadas e caracterizadas por MET, difração de raios X e

SAXS. Os resultados de difração de raios X mostram que o material sintetizado é realmente de

magnetita.   Através   de   SAXS   obteve­se   a   distribuição   de   tamanhos   e   a   morfologia   das

nanopartículas.

5­ Referências Bibliográficas.[1] M. G. Papadopoulos, A. J. Sadlej and J. Leszczynski, Non­Linear Optical Properties of Matter: FromMolecules to Condensed Phases, Springer 2006.[2] Google Acadêmico [online] [citado em junho de 2017 ]. Disponível em: https://scholar.google.com.br/[3] Qingkun Liu, Paul J. Ackerman, Tom C. Lubensky, and Ivan I. Smalyukh, PNAS, 113(38), 10479–10484(2016)

12

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(2007)[11] V. K. Sharma, A. Alipour, Z. Soran­Erdem, Z. G. Aykut and H. V. Demi, Nanoscale, 7, 10519, (2015)[12]Saheel Bhana , Yongmei Wang & Xiaohua Huang, Nanomedicine (Lond.) 10(12), 1973–1990 (2015)[13]   Gooneratne   CP,   Kurnicki   A,   Yamada   S,   Mukhopadhyay   SC,   Kosel   J   (2013),   PLoS   ONE   8(11):

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[14] Oliveira, C. L. P. de, Tese de Livre Docencia, Instituto de Física da Universidade de São Paulo, São Paulo, (2016).

[15] [16] D. Espinosa, E. S.Gonçalves, A. M. Figueiredo Neto. J. App. Phys. 121, 043103 (2017)

[16] Pedersen, J. S. . Advances in Colloid and Interface Science 70, 171–210 (1997).

[17] Kinning, D. J.; Thomas, E. L. Macromolecules, ACS Publications 17(9), 1712–1718 (1984).

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Parte II.1 – Introdução

A área de processamento de imagens vem sendo objeto de crescente interesse por permitir

viabilizar grande número de aplicações em duas categorias bem distintas: (1) o aprimoramento de

informações extraídas de uma figura para posteriormente ser interpretada por um ser humano; e (2)

a análise automática por computador de informações extraídas de uma figura. Ao longo deste texto,

reservaremos a expressão 'processamento de imagens' para designar a primeira categoria. Já para a

segunda categoria os termos 'análise de imagens', 'visão por computador' (ou 'visão computacional')

e 'reconhecimento de padrões' seriam igualmente válidos. Ao longo deste texto não faremos uso de

visão computacional [1­3].

O   uso   de   técnicas   computacionais   de   aprimoramento   de   imagens   teve   início   no  Jet

Propulsion Laboratory (Pasadena, California­EUA) em 1964, quando imagens da lua transmitidas

por uma sonda Ranger eram processadas por computador para corrigir vários tipos de distorções

inerentes à câmera de TV acoplada à sonda [1­3]. 

De 1964 aos dias atuais, a área de processamento de imagens vem apresentando crescimento

expressivo e suas aplicações permeiam quase todos os ramos da atividade humana. Em Medicina, o

uso de   imagens  no diagnóstico  médico   tornou­se  rotineiro  e  os  avanços  em processamento  de

imagens vêm permitindo tanto o desenvolvimento de novos equipamentos quanto a maior facilidade

de interpretação de imagens produzidas por equipamentos, como por exemplo o de raio X. Em

Biologia,   a   capacidade   de   processar   automaticamente   imagens   obtidas   de   microscópios,   por

exemplo   contando   o   número   de   células   de   um   certo   tipo   presente   em   uma   imagem,   facilita

sobremaneira a execução de tarefas laboratoriais com alto grau de precisão e repetibilidade []. 

Neste   relatório   será   descrito   os   procedimentos   utilizados   para   a   caracterização   de

micrografias de MET de Lipoproteínas de baixa densidade por processamento de imagens. Para o

processamento de imagens foi utilizado o  software  ImageJ 1.51J8 [3­6]. O ImageJ é distribuído

livremente [7] e apresenta diversas ferramentas de operações morfológicas [8] em imagens que

apresentam escala de cinza, tal como as micrografias registradas no MET.

2 – Materiais e Métodos

2.1.1 Amostras de LDL Nativas e Oxidadas com Cobre e Ferro.

O plasma é  composto por  várias  substâncias,  dentre elas  podemos citar  as  lipoproteínas

VLDL, IDL, LDL e HDL. A separação de cada tipo de lipoproteína do plasma é feita por diferença

14

de   densidade,   em   sucessivos   processos   de   ultracentrifugação   [9].   A   oxidação  in   vitro  das

lipoproteínas tem o objetivo de mimetizar aquela que ocorre in vivo [9]. As oxidações in vitro da

LDL com Cobre e Ferro foram realizadas pelas Drªs Andreia M. Monteiro (Pós­Doutorado, 2010)

[9­10] e Priscila Ribeiro dos Santos (Doutorado, 2009­2013) [10,11]. Para obter­se as partículas de

LDL oxidadas por íons de cobre (LDL­Cu). As partículas de LDL foram dialisadas durante a noite

com   PBS   sem   EDTA.   Após   a   diálise   as   LDL   foram   incubadas   na   concentração   de   1mg   de

proteína/mL com CuSO4 20 μM por 18 h a 37°C. Já as partículas de LDL oxidado por íons de ferro

(FeLDL)   foram   produzidas   pela   diálise   da   LDL   na   concentração   de   1   mg   de   proteína/mL

adicionados a 2 μm de FeSO4∙7H2O adicionados em PBS a pH 7,2, durante 48 h a temperatura

ambiente. As oxidações foi interrompida pela adição de EDTA (1 mM) [9­13]. Mais informações

sobre  os  processos  de  oxidação   com Cobre   e  Ferro  podem serem encontradas  em  [9­13].  As

micrografias foram realizadas pela Drª Sylvia M. Carneiro do Instituto Butantã. Neste relatório será

apresentado apenas o processamento de imagens realizado nestas micrografias.

2.1.2­Amostras de LDL Nativas, Oxidadas e Glicadas e Oxidadas.

As análises de MET foram realizadas para as amostras de LDL nativa, LDL oxidada e LDL

glicada e oxidada in vitro.

A partir do sangue de doadores, foi separado o plasma, e por meio da ultracentrifugação

sequencial a LDL foi isolada [14­16]. Em adição, por meio da cromatrografia de troca iônica foi

isolada   as   subfrações   de   LDL   nativa   e   eletronegativa.   E   posteriormente,   a   LDL   nativa   foi

subdividade   em   alíquotas   para   serem   glicadas   e   glicadas   e   oxidadas.   Nesta   etapa,   foi   feita   a

incubação   da   LDL   nativa   em   2   soluções   diferentes:   i)   Solução   1   ­   PBS,   na   presença   de

antioxidantes (hidroxitoluenobutilado ­ BHT e ácido etilenodiamino tetra­acético ­ EDTA), que irá

funcionar como controle. ii) Solução 2 ­ 8mM de glicolaldeído (Glycolaldehyde dimer®; Sigma­

Aldrich,   Fluka­Buchs,   Alemanha)   em   PBS   por   mg   de   proteína   da   solução   de   LDL,   com

antioxidantes, para favorecer a glicação isolada, à 37oC, por 4 dias [17]

O processo de separação, glicação e oxidação das lipoproteínas é realizado pela Drª Ana P.

Q Mello, Pós­Doutoranda (2017) do Gruplo de fluidos complexos. A preparação das lipoproteínas

para Microcospia Eletrônica de Transmissão, a visualização no microscopio e posteriormente o

processamento das micrografias são realizados pelo candidato/proponente. 

15

2.1.3­ Microscopia Eletrônica de Transmissão.

Para a análise da microscopia eletrônica de transmissão foi realizado o procedimento de

constratação negativa das partículas de LDL nativas, e LDL modificadas. Um volume de 15 µL da

suspenção de LDL, com uma concentração de proteína de 0,1 mg/mL, foi aplicados sobre uma

grade   de   microscopia.   Utilizaremos   uma   grade   de   cobre   com   200   campos   e   a   mesma   estará

revestida com filme fino de formvar®  (60­70 nm). A suspenção de LDL permanecerá por 1 min

sobre a grade de cobre e depois, o excesso de líquido será retirado com papel filtro deixando uma

pequena quantidade de fluído residual da supensão de LDL. A constratação negativa será realizada

com ácido fosfotúngstico 2% (m/v ­ pH 7,2) durante o tempo de 1 min e em seguida seca­se o

excesso de líquido residual. As grades serão analisadas num microscópio eletrônico de transmissão

FEI­TECNAI G2 Twin (Fei, Holanda) ou JEOL 1010 (Jeol, Japão) com uma tensão de aceleração

de 80 kV. As micrografias serão adquiridas por uma câmera CDD Gatan Bioscan 782 de 1K x 1K

pixels. Serão registradas de 10 a 15 micrografias em magnificiações de 150.000 ou 300.000 vezes

para posterior análise da morfologia das partículas e de suas distribuições de tamanhos [9].

2.2­ Descrição geral do processo de binarização de Imagens.

O princípio da limiarização consiste em separar as regiões de uma imagem quando esta

apresenta duas classes (o fundo e o objeto). Devido ao fato da limiarização produzir uma imagem

binária à saída, o processo também é denominado, muitas vezes, binarização. A forma mais simples

de limiarização consiste na bipartição do histograma, convertendo os pixels cujo tom de cinza é

maior ou igual a um certo valor de limiar (T) em brancos e os demais em pretos, como ilustra a

Figura 1. No caso de níveis de cinza divididos basicamente em duas classes, onde o histograma

apresenta dois picos e um vale, a limiarização é trivial [1­3]. 

16

Figura 1:

Matematicamente,   a   operação   de   limiarização   pode   ser   descrita   como   uma   técnica   de

processamento de imagens na qual uma imagem de entrada I=f(x,y) de N níveis de cinza produz à

saída uma imagem g(x,y), chamada de imagem limiarizada, cujo número de níveis de cinza é menor

que N [1­3]. Normalmente, g(x,y) apresenta 2 níveis de cinza, sendo:

onde   os   pixels   rotulados   com   1   correspondem   aos   objetos   e   os   pixels   etiquetados   com   0

correspondem  ao   fundo   (background)   e  T  é   um  valor   de   tom  de   cinza  pré­definido,   ao   qual

denominamos limiar [1­3].

Pelo exposto até aqui, assumiu­se que a escolha do valor de limiar é arbitrária e subjetiva.

Sabendo   que   o   histograma   é   um   representador   gráfico   da   distribuição   de   probabilidade   de

ocorrência do nível de cinza em uma imagem, é lícito imaginar a possibilidade de uso de técnicas de

cálculo do valor ótimo de limiar com base nas propriedades estatísticas da imagem. Uma destas

técnicas, denominada limiarização ótima, parte de uma imagem da qual se conhecem as principais

propriedades estatísticas (supondo que sua distribuição de probabilidade é normal ou gaussiana), a

saber:

17

μ1 : média dos tons de cinza da região de interesse

μ2 : média dos tons de cinza da região de fundo (background)

σ1, σ2: desvios padrão

P1, P2 : probabilidade de ocorrência dos pixels pertencentes às regiões 1 e 2, respectivamente.

Pode­se mostrar [1­3] que existe um valor ótimo de limiar, T, dado

por uma das raízes da equação:

onde:

Duas raízes reais e positivas indicam que a imagem pode requerer dois valores de limiarpara  obter   uma   solução   ótima.  Se   as   variâncias   forem   iguais   ( =σ σ1=σ2),   um   único  valor  T  énecessário:

Se, além disso, as duas classes forem equiprováveis:

o que está em acordo com o conceito intuitivo de que o valor ótimo de limiar quando as classes

apresentam a mesma distribuição de probabilidade (os lóbulos são exatamente iguais) é o ponto

médio entre as médias das classes.

2.3­ Processamento imagens aplicados às Micrografias de MET

Uma micrografia típica de MET de LDL Nativa (ver Figura 2) foi carregada no  software

ImageJ e o programa foi calibrado para trabalhar na escala da barra da micrografia, neste caso de

100 nm. Para tal,  utiliza­se a ferramenta de linhas e  traça­se uma linha reta sobre a barra para

18

sabermos o seu tamanho em pixel, conforme a Figura 3. Em seguida, no menu de  Analyze>Set

Scale  abrirá  uma janela em que será  utilizada para indicar ao  software  que a distância medida

(Know distance) corresponde ao tamanho da barra, neste caso de 100 nm. Deste modo, o software

ImageJ passa a trabalhar nas dimensões da micrografia (nm) ao invés de pixel.

Figura 2: Micrografia Caracteristica de LDL Nativa.

Figura 3: Ilustração do procedimento utilizado para calibrar o software ImageJ para que o mesmo passe a trabalhar nasdimensões da micrografia ao invés de pixel.

Uma vez  que  o  software  esteja   calibrado,    pode­se   realizar  operações  para  melhorar  o

contraste   nas   micrografias.   Estas   operações   são   necessárias   para   que   quando   for   realizado   o

processo de binarização da micrografia as partículas de LDL sejam resolvidas individualmente sem

que   haja   perda   de   informação.   Neste   caso,   o   pré­processamento   de   imagem   necessário   foi   a

subtração   do   fundo   (Process>   Subtract   Background>Rolling   ball   150)   e   a   equalização   do

19

histograma   da   distribuição   de   frequência   de   pixel   (Process>   Enhance   Contraste>   Saturated

Pixels=0,5%>Equalize   Histogram).   Em   seguida,   no   menu  image>adjust>threshold,  o

algoritmo/método de limiar (threshold) utilizado foi o método Huang [18] numa faixa de 30 a 50 do

histograma de pixels. Após estas etapas, as micrografias foram binarizadas [1­3]. A binarização é

um   processo   de   conversão   de   uma   imagem   com   níveis   de   cinza   para   uma   imagem   com

representação   binária   (dois   tons)   e   é   importante   para   uma   série   de   objetivos,   tais   como:   (i)

identificar objetos e separá­los do fundo da imagem; (ii) quando analisar a forma da imagem é mais

importante   que   a   intensidade   dos   pixels.   Para   realizar   a   binarização   no   ImageJ,   vamos   ao

menu>Process>Binary>Make Binary.  Uma que vez que a micrografia esteja  binarizada iremos

separar   as   LDL  que  possam   ter   permanecido   conectadas,   para   tanto,   vamos  utilizar   a   função

watershed  (menu>Process>Binary>Watershed).   Através   destes   passos,   obtêm­se   uma

micrografia/imagem binária  em que a partícula apresenta  valor  1  e  o  fundo valor  0,  conforme

ilustrado na Figura 3. Para a caracterização das partículas de LDL com relação à forma/geometria,

no   ImageJ   devemos   selecionar   no  menu>Analyze>Set   Measurements>Shape   descriptors.

Finalmente,   a   caracterização  das  partículas   de  LDL  será   realizada  no  menu>Analyze>Analyze

Particles>Size(150­800)>Circularity(0.0­1.0)>Show(Outilines)>ok.  Uma   tabela   com   diversos

parâmetros  para cada partícula encontrada será  gerada.  Nesta  tabela estaremos  interessados nas

grandezas: Feret (Diâmetros), Circ. (Circularidade) e AR (Aspect Ratio ou Razão de Aspecto) [8].

Figura 4: Micrografia binarizada da LDL Nativa.

2.4­ A distribuição Log­Normal.

As partículas de LDL exibem uma geometria quase esférica, com uma distribuição de forma

não uniforme [15]. A distribuição  P(D)  de diâmetros  D, geralmente é dado por uma função log­

normal, conforme a equação:

20

onde D0 e σ são o diâmetro médio e desvio padrão de ln D, respectivamente.

3 Resultados.

3.1-Resultados para Micrografias de LDL Nativas e Oxidadas com Cobre e Ferro.

A partir   dos  dados  obtidos  no   ImageJ;     os  Diâmetros   (Feret),   a  Circularidade   [Circ  =

4πArea/(Perimetro2)] e a AR (Aspect Ratio ou Razão de Aspecto = Eixo Maior/Eixo Menor) deram

origem aos histogramas com as distribuições de frequências, conforme apresentado nas Figuras 5, 6

e 7. Estes histogramas foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para cada

uma das 5 micrografias/imagens/regiões de cada amostra. As amostras analisadas foram partículas

de LDL Nativas (LDL­Nat), partículas de LDL oxidadas in vitro com Cobre (Cu; LDL­Cu) e Ferro

(Fe;  LDL­Fe). 

Figura 5: Histogramas das distribuições de Feret (Diâmetros) de cada partícula de LDL nativa.

21

Figura 6: Histogramas das distribuições de Razão de Aspecto de cada partícula de LDL nativa.

Figura 7: Histogramas das distribuições de Razão de Circularidade de cada partícula de LDL nativa.

Nas Figuras 8, 9 e 10, são apresentados os histogramas das distruibuições de frequências em

função   dos  diâmetros   para   as   partículas   de   LDL­Nat,  LDL­Cu   e   LDL­Fe.  Estas   distribuições

apresentam valores esperados de 23,16 ± 2,53 nm; 25,30 ± 2,73 nm e 27,14 ± 3,20 nm para as

partículas   de   LDL­Nat,   LDL­Cu   e   LDL­Fe,   respectivamente.   Nas   Figuras   11,   12   e   13   são

apresentados os histogramas das distribuições de frequências em função da circularidade para as

partículas de LDL­Nat, LDL­Cu e LDL­Fe. Estas distribuições apresentam valores esperados de

0,83 ±   0,01;    0,70  ±   0,02  e  0,60  ±   0,05  para  as  partículas  de  LDL­Nat,  LDL­Cu e  LDL­Fe,

respectivamente.   Nas Figuras 14, 15 e 16 são apresentados os histogramas das distribuições de

frequências   em   função   da   AR   para   as   partículas   de   LDL­Nat,   LDL­Cu   e   LDL­Fe.   Estas

22

distribuições apresentam valores esperados de 1,23 ±  0,02;   1,44 ±  0,01 e 1,40 ±  0,02 para as

partículas de LDL­Nat, LDL­Cu e LDL­Fe, respectivamente.

Figura 8: Histogramas das distruibuições de frequências de diâmetros para as particulas de LDL-Nat.

Figura 9: Histogramas das distribuições de frequências de diâmetros para as partículas de LDL-Cu.

Figura 10: Histogramas das distribuições de frequências de diâmetros para as partículas de LDL-Fe.

23

Figura 11: Histogramas das distribuições de frequências de circularidade para as partículas de LDL­Nat.

Figura 12: Histogramas das distribuições de frequências de circularidade para as partículas de LDL-Cu.

Figura 13: Histogramas das distribuições de frequências de circularidade para as partículas de LDL-Fe.

24

Figura 14: Histogramas das distribuições de frequências de AR para as partículas de LDL-Nat.

Figura 15: Histogramas das distribuições de frequências de AR para as partículas de LDL-Cu.

Figura 16: Histogramas das distribuições de frequências de AR para as partículas de LDL-Fe.

25

Nas Figuras 17, 18 e 19 são apresentados os gráficos de caixa (box­plot) para as grandezas

Diâmetro, Circularidade e Razão de Aspecto para o conjunto de amostra de LDL­Nat, LDL­Cu e

LDL­Fe. Nestes gráficos foram realizados o teste estatístico ANOVA com intervalo de confiança

(CI= 95%) e o resultado para a probabilidade p é apresentado nos gráficos de caixa. Estes gráficos

foram gerados para um número de partículas de LDL N= 275 em cada uma das amostras LDL­Nat,

LDL­Cu e LDL­Fe.

Figura 17: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza Diâmetro do conjunto de amostra de LDL-Nat, LDL-Cu e LDL-Fe.

Figura 18: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza Circularidade do conjunto de amostra de LDL-Nat, LDL-Cu eLDL-Fe.

26

Figura 19: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza Razão de Aspecto do conjunto de amostra de LDL-Nat, LDL-Cu e LDL-Fe.

3.2- Resultados para Micrografias de LDL Nativas, Oxidadas e Glicadas e Oxidadas.

3.2.1­ Resultados para Micrografias de LDL Nativas.

Na Figura 20­a é apresentado uma micrografia característica da LDL Nativa. A micrografia

foi binarizada e a partir da imagem binarizada foi possível obter as distribuições de diâmetro, razão

de aspecto (AR) e circularidade. Essas distribuições para as grandezas diâmetro, razão de aspecto

(AR) e circularidade podem serem visualizadas nas Figuras 20­b, 20­c e 20­d, respectivamente.

27

ab

28

cd

Figura 20 a- Micrografia característica da amostra de LDL Nativa. b- Distribuição de diâmetros (azul) ajustados comuma distribuição log-normal (vermelho). c- Distribuição de razões de aspecto (azul) ajustados com uma distribuiçãolog-normal (vermelho). d- Distribuição de circularidades (azul) ajustados com uma distribuição log-normal (vermelho).

Nas Figuras 21, 22 e 23 são apresentados os gráficos de caixa (box­plot) para as grandezas

diâmetro, circularidade e AR (Razão de Aspecto) para a amostra de LDL Nativa.  Estes Gráficos de

caixa (box­plot) foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para cada uma das

15 micrografias/imagens/regiões micrografadas nesta amostra. 

Figura 21: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza diâmetro do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLNativa. Os diâmetros apresentam unidade de nm e os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3

desvio padrão).

29

Figura 22: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza AR do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLNativa. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).

Figura 23: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza cicurlaridade do conjunto de 15 regiões diferentes da amostraLDL Nativa. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).

Nas   Figuras   21   e   22   foi   possível   observar   que   os   diâmetros   e   as   razões   de   aspectos

apresentam distribuições uniformes para cada região com seus valores médios (indicado pela linha

horizontal dentro da caixa) oscilando em torno de 25 nm e 1,25, respectivamente. Note que para os

valores de circularidades existe uma mais alta variabilidade nas distribuições de cada região com os

valores médios oscilando entre 0,65 e 0,75, conforme pode ser observado na Figura 22.

30

3.2.2­ Resultados para Micrografias de LDL Oxidadas.

Na   Figura   24­a   é   apresentado   uma   micrografia   característica   da   LDL   Oxidada.   Esta

micrografia   também   foi   binarizada   e   a   partir   da   imagem   binarizada   foi   possível   obter   as

distribuições   de   diâmetro,   razão   de   aspecto   (AR)   e   circularidade.   Essas   distribuições   para   as

grandezas diâmetro, razão de aspecto (AR) e circularidade podem serem visualizadas nas Figuras

24­b, 24­c e 24­d, respectivamente.

31

ab

32

cd

Figura 24 a- Micrografia característica da amostra de LDL Oxidada. b- Distribuição de diâmetros (azul) ajustados comuma distribuição log-normal (vermelho). c- Distribuição de razões de aspecto (azul) ajustados com uma distribuiçãolog-normal (vermelho). d- Distribuição de circularidades (azul) ajustados com uma distribuição log-normal (vermelho).

Nas Figuras 25, 26 e 27 são apresentados os gráficos de caixa (box­plot) para as grandezas

diâmetro, circularidade e AR (Razão de Aspecto) para a amostra de LDL Oxidada.  Estes Gráficos

de caixa (box­plot) foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para cada uma

das 15 micrografias/imagens/regiões de micrografadas nesta amostra. 

Figura 25: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza diâmetro do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLOxidada. Os diâmetros apresentam unidade de nm e os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que

3 desvio padrão).

33

Figura 26: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza AR do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLOxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).

Figura 27: Gráficos de caixa (box­plot) para a grandeza cicurlaridade do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra

LDL Oxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão). 

Nas   Figuras   25   e   26   foi   possível   observar   que   os   diâmetros   e   as   razões   de   aspectos

apresentam distribuições uniformes para cada região com seus valores médios (indicado pela linha

horizontal dentro da caixa) oscilando em torno de 22,5 nm e 1,25, respectivamente. No entanto,

para os valores de circularidades existe uma mais alta variabilidade nas distribuições de cada região

com os valores médios oscilando entre 0,65 e 0,70, conforme pode ser observado na Figura 27.

34

Neste caso os diâmetros e as circularidades apresentam variações ligeiramente menores quando

comparados com as amostras de LDL Nativas.

3.2.1­ Resultados para Micrografias de LDL Glicadas e Oxidadas.

Na Figura 28­a é apresentado uma micrografia característica da LDL Glicada e Oxidada.

Esta  micrografia   também foi  binarizada e  a  partir  da   imagem binarizada   foi  possível  obter  as

distribuições   de   diâmetro,   razão   de   aspecto   (AR)   e   circularidade.   Essas   distribuições   para   as

grandezas diâmetro, razão de aspecto (AR) e circularidade podem serem visualizadas nas Figuras

28­b, 28­c e 28­d, respectivamente.

35

ab

36

cd

Figura 28 a- Micrografia característica da amostra de LDL Nativa. b- Distribuição de diâmetros (azul) ajustados comuma distribuição log-normal (vermelho). c- Distribuição de razões de aspecto (azul) ajustados com uma distribuiçãolog-normal (vermelho). d- Distribuição de circularidades (azul) ajustados com uma distribuição log-normal (vermelho).

Nas Figuras 29, 30 e 31 são apresentados os gráficos de caixa (box­plot) para as grandezas

diâmetro, circularidade e AR (Razão de Aspecto) para a amostra de LDL Glicada e Oxidada.  Estes

Gráficos de caixa (box­plot) foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para

cada uma das 9 micrografias/imagens/regiões de micrografadas nesta amostra. 

Figura 29: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza diâmetro do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLGlicada e Oxidada. Os diâmetros apresentam unidade de nm e os circulos representam os outliers (dados com valores

maiores que 3 desvio padrão).

37

Figura 30: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza AR do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLGlicada e Oxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).

Figura 31: Gráficos de caixa (box­plot) para a grandeza cicurlaridade do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra

LDL Glicada e Oxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão). 

Nas   Figuras   29   e   30   foi   possível   observar   que   os   diâmetros   e   as   razões   de   aspectos

apresentam distribuições uniformes para cada região com seus valores médios (indicado pela linha

horizontal dentro da caixa) oscilando em torno de 24,5 nm e 1,3, respectivamente. Note que para os

valores de circularidades existem uma mais alta variabilidade nas distribuições de cada região com

os valores médios oscilando entre 0,65 e 0,70, conforme pode ser observado na Figura 31. Neste

38

caso   os   diâmetros   e   as   circularidades   apresentam   variações   ligeiramente   menores   quando

comparados com as amostras de LDL Nativas.

Nas Figuras 32, 33 e 34 são apresentados os gráficos de caixa (box­plot) para as grandezas

Diâmetro, Circularidade e Razão de Aspecto para o conjunto de amostra de LDL­Nativa, LDL­

Oxidada e LDL­Glicada e Oxidada. Estes gráficos foram gerados para um número de partículas de

LDL N= 150 em cada uma das amostras LDL­Nativa, LDL­Oxidada e LDL­Glicada e Oxidada.

Nestes gráficos foram realizados o teste estatístico ANOVA com intervalo de confiança (CI= 95%)

e o resultado para a probabilidade p > 0,15 foi obtido. Este valor de p indica que não há diferença

estatistica significativa entre os valores obtidos para diâmetro, razão de aspecto e circularidade. 

Figura 32: Gráfico de caixa (box­plot) para a grandeza Diâmetro do conjunto de amostra de LDL­Nativa (NAT), LDL­

Oxidada (OX) e LDL­Glicada e Oxidada (GLD).

39

Figura 33: Gráfico de caixa (box­plot) para a grandeza AR do conjunto de amostra de LDL­Nativa (NAT), LDL­

Oxidada (OX) e LDL­Glicada e Oxidada (GLD).

Figura 34: Gráfico de caixa (box­plot) para a grandeza Circularidade do conjunto de amostra de LDL­Nativa (NAT),

LDL­Oxidada (OX) e LDL­Glicada e Oxidada (GLD).

4- Conclusões.

Através da microscopia MET foi possível determinar variações ocorridas na morfologia da

lipoproteínas. As maiores variações na morfologia obtidas foram devido ao processo de oxidação da

lipoproteínas com Cobre e Ferro.

5- Artigo aceito para publicação.

40

O artigo com o título "On the influence of PDMS (polydimethylsiloxane) substrate surface

energy   in   wrinkling   of   DLC   (diamond­like   carbon)   thin   films"   ­  Manuscript   [JR17­2595R1]

005739JAP  foi   aceito   para   publicação   na   revista  “Journal   of   Applied   Physics”.  Esta   revista

apresenta   fator   de   impacto   de   2.103   e   classificação  qualis  B1   pela   CAPES.   DOI:

10.1063/1.5006609.

6-Participação em congressos, eventos e reuniões cientificas.

O candidato participou da 1st  SPSLNX (São Paulo School on Scattering: Difraction and

Imaging using Light, Neutrons and X­rays) ocorrido entre os dias 17 e 21 de julho de 2017.

O candidato participou do 1º Encontro de Pós­doutorandos da Universidade de São Paulo. O

evento foi promovido pela Pró­reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo e ocorreu nos dias

29 e 30 de Junho de 2017 na Comissão de Cooperação International (CCInt).

7 - Referências Bibliográficas

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[8] M. R Cox, M Budhu, Engineering Geology 96  1­16 (2008).

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41

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