UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE F!SICA E QUíMICA DE SÃO CARLOS

i "INTERAÇÃO DE PEQUENAS MOL:t:CULAS~

COM PROTEINAS: UM ESTUDO USANDO

M~TODOS CONVENCIONAIS E TRANSFE

R~NCIA DE SATURAÇÃO DE R.P.E."

JOÃO RUGGIERO NETO

Tese apresentada ao Instituto

de Física e Química de são

Carlos, para obtenção do tí­

tulo de Doutor em Física A­

plicada.

Orientador:Prof. Dr. Mareel Tabak

são Carlos

1984

BIBLIOTECA DO iNSTifiJTO DE FlS!CA E oulMICA DE SÃO CARLOS. USI'

FI S I (A

MEMBROS DA COMISSAO JULGADORA DA TESE DE DOUTORADO DE

JOÃO RUGGIERO NETO

APRESENTADA AO INSTITUTO DE FrSICA E QUfMICA DE SAO CARLOS, DA

UNIVERSIDADE DE SAO PAULO, EM 20 DE

COMIssAO JULGADORA:

junho DE 1984.

Dr. - Orientador

Dr. OTACIRO RANGEL NASCIMENTO

T). ~ '--_ -l (~ yY) O ~ -... >. ~'} '-- r c S,

~ d .Dr. Rosemary anches

\-~ ~ I; .•••klÀ ''li d<2\A-u,-.Jx \. c..\.,'-.d .....~: \'9'''' -.'I..·Lo

Dr.Y SaNIA R.WANDERLEY LOURO I '

~ ~ - ~ -1 ~----J_//~. MAR IA TERESA LA}.1)'FREUND

DEDICO Â:

minha esposa Marta, e a meus

filhos Milena e Giovanni.

lembranças

AGRADECIMENTOS

Durante a realização desse trabalho, várias pessoas, com

as quais convivemos, estiveram envolvidas com as minhas angustias

e alegrias, frutos dos êrros e acertos a que estamos sujeitos du­

rante o trabalho científico. Essas pessoas souberam dar apoio na

hora exata para que êsse trabalho chegasse a um bom têrmo.

Particularmente, a convivência com o pessoal do Laborat~

rio de Biofísica Molecular e Dosimetria , foi uma experiência al-

tamente benéfica e gratificante, que sempre me trará

agradáveis. A êles os meus agradecimentos.

Devo agradecer a algumas pessoas que tiveram maior envol

vimento na realização desse trabalho:

Ao Prof. MareeI Tabak, pela orientação constante e segu­

ra, amizade e apoio nos momentos mais difíceis.

Ao Prof. Otaciro R. Nascimento, co-orientador e amigq,

que deu todo apoio possível na realização do trabalho, cujas dis­

cussoes foram muito importantes.

 Prof~ Rosemary Sanches, pelas discussões, e incentivo,

auxílio na preparação das amostras e amizade demonstrada.

Aos amigos Oswaldo Baffa e Mareio Colombo pelas discus-

sões e incentivo, amizade.

Aos amigos da Biofísica: Ana, Laura, Ladislau, Washing­

ton , Crestana e Cidão pelo apoio e amizade demonstrados.

Aos amigos de Rio Preto: José Roberto, Luiz Carlos, Mar­

eio, Eikite, Ceron, Laerte e Espada pelo apoio, amizade e incenti

VOe

Ao Sanches e à Isabel, do Laboratório de Biofísica pelo

apoio técnico e pelo tratamento muito humano que me deram.

Ao Valdecir e Valdir, técnicos do computador, sem o auxí

lio dos quais a parte de computação desse trabalho teria ficado

muito difícil.

A Marta por ter transformado meus manuscritos ilegíveis,

nesse excelente trabalho de datilografia.

Ao Augusto pela confecção dos desenhos.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

INDICE

......................................... iRESUMO ...................................................... iiABSTRACT

INTRODUÇÃO

CAPITULO I

..................................................

..................................................

FUNDAMENTOS TEÓRICOS •••••••••..•••

1. Química dos Radicais Nitróxido

2. Propriedades Físicas de Radicais Nitrª

xidos e Sondas de Spin •••••...••••••.•••

3. Interações Magnéticas •.•••••..•••..•••.•.••.

3.1.' Interação de Zeeman •••.••.•.•.•••.•.•••

3.2. Interação com o Campo Eletromagn~

iii

iv

11

2

6

6

4.

5.

tico .3.3. Interação Hiperfina

3.4. Outras Interações

Análise dos Espectros de RPE

4.1. Espectros em solução,4.2. Espectro em Cristais Orientados

Reorientação de Radicais em Soluções

Viscosas .

10

1113

14

14

16

17

CAPITULO 11- MATERIAIS E ~TODOS •••••••••••••••.•

1. Preparação dos Marcadores de spin

2. Preparação das amostras ••

3. Medidas de RPE •••.••••

4. Análise dos Espectros •.••••••••••••.•••

4.1. Ajuste das Curvas de variação an-

...

.....

36

36

36

39

41

4.2.

4.3.

guIar .Análise de Espectros Rígidos ••.

Análise dos Espectros na região

de estreitamento devido ao movi -

41

42

men to •••••••••••••••••••••••••••••.•••• 43

4.3.1. Análise através da largura de linhas

.......................43

4.3.2. Medida da largura de linha ••••••

45

4.3.3.

Simulação dos espectros.........45

5. Análise dos Espectros de ST-RPE

.............45

CAPiTULO 111 - RESULTADOS EXPERIMENTAIS •••••••••••••••.•••.• 47

1. variação Angular em monocristais à Te~

peratura ambiente .. ' 47

2. variação Angular à Temperatura de N2~ ..

l1quido 59

2.L Variação Térmica no Monocristal •.•••. 67

3. Simulação dos Espectros de TEMPO em M~

nocristais de Hb ã Temperatura ambien-

te 68

4. Amostras de Hb policristalinas e liofi

1i z a da s.••••••••••••••••••••••••••••••••••• 72

4.1. RPE convencional •••••..•.•..•.•••.•.. 72

4 • 2. ST- RPE .......•...•................... 78

5. Solução Aquosa 80o

5.1. Temperaturas menores que -22 C 80

5.2. Temperaturas maiores que -3,50C .••... 82

6. Estudos de Hidratação de Proteínas •••••.•. 86

CAPiTULO IV - DISCUSSÕES E CONCLUSÕES ••••••.••.•.••••••••.. 92

CONCLUSÔE S ••.••••••••.•••••••••.••••••.•••••••••..•.....•••• 108

.................................................AP11:NDICEI

AP11:NDICE11AP11:NDICE111

BIBLIOGRAFIA

................................................

...............................................

110

120

125

147

i

LISTA DE ABREVIAÇÕES

RPE - Ressonância Paramagnética de Elétrons.

ST-RPE - Ressonância paramagnética de Elétrons - Transferência de

Saturação.

Hb

HbA

HbS

Mb

Xg/g

Sol

- Hemoglobina.

- Hemoglobina Normal.

- Hemoglobina Siclemica.

- Mioglobina.

- Xgramas de água/grama de proteina.

- solução.

TEMPO-N-l-oxil-2,2,6,6 - tetrametilpiperidino.

PD-TEMPOL-N-l-oxil-2,2,6,6 - tetrametilpiperidino - perdeuterado.

NEM*-2,2,6,6 - tetrametilpiperidinoxil-4-maleimido.

ii

RESUMO

Neste trabalho, analisamos a interação de pequenas molé­

culas, marcadores hidrofôbicos, com hemoglobina, em diferentes es

tados: monocristal, pô e solução aquosa. Os métodos de análise em

pregados, são baseados nas teorias de relaxação em líquidos e tec

nicas nao lineares de ressonância ST-RPE (transferência de satura

ção), fornecendo informações sobre mudanças locais nas vizinhan-

ças desses marcadores.

Um dos marcadores hidrofõbicos, o TEMPO, mostrou uma ani

sotropia considerável nos espectros de RPE do monocristal de hemo

globina que está relacionado com o empacotamento molecular da pr~

teina no cristal.

A associação desses métodos de análise conduziu a impo,E

tantes informações sobre mudanças na camada de hidratação em-

va-

rias proteinas: hemoglobina, mioglobina e lisozima, monitoradas

pelo marcador covalente derivado da maleimida, e induzidas pela

temperatura, sob diferentes condições de hidratação. Desta forma

o uso da espectros copia de RPE especialmente com simulação espe~

trai e ST-RPE mostrou ser um método potente e ainda não explorado

no estado de hidratação de proteinas.

BIBLlOTE(A DO iNSTITUTO OE Fi:;:(,A, E QUIM!C." f)" ..:-·0 (ARLOS. USP

FI S ICA

iii

ABSTRACT

In this work, the interactions of small molecules, hydr~

phobic spin labels, with hemoglobin, under different states was

analysed: single crystal, powder and aqueous solution. Themethods

of analysis emploied, are based in relaxation theory in liquids

and non-linear techniques, saturation transfer (ST-EPR), giving

informations on the local changes in the neighbourhood of the

labels.

One of the hydrophobic labels, TEMPO, showed a consider~

ble anisotropy in the hemoglobin single crystal spectra, a result

related to the molecular packing in the protein single crystal.

The association of the techniques of analysis alI together

lead to important informations an temperature induced changes in

the hydration layer in several porteins: hemoglobin, myoglobin and

lysozyme, displayed by the covalent spin label, NEM*, a maleimide

derivated, in different conditions of hydration.

In this way the use of EPR spectroscopy andparticullarly

with spectral simulations and ST-EPR, proved to be a powerful and

not yet very much explored.method to study the problem of protein

hydration.

iv

INTRODUÇÃO

o método de marcadores de spin, tem sido usado intensi­

vamente em Biofísica e Bioquímica, com o objetivo de obter infor­

maçoes sobre o estado de movimento e propriedades locais, no am­

biente vizinho ao marcador nos sistemas biológicos estudados, paE

ticularmente proteínas e membranas.

Essas informações, são detalhadas através de mudanças

na forma das linhas espectrais, que são bastante sensíveis ao mo­

vimento do marcador.

Seu uso teve início a partir de meados da década de 60

e, embora com aplicações imediatas em uma ampla gama de problemas

de Bioquímica e Biofísica, seu sucesso foi relativamente pequeno

pois somente informações qualitativas eram obtidas dos esPeCtros,

o que conduzia à interpretações ambíguas e imprecisas sobre o sis­

tema em estudo.

Métodos mais acurados de análise da forma das linhas ,

utilizando as teorias de relaxação magnética em líquidos, desenvo!

vidos no fim da década de 60, possibilitaram que as informações ob­

tidas com o método de marcadores de spin fosse também quantitati ­

vas, tornando assim mais precisas as interpretações.

Esses métodos de análise, inicial~ente limitaram à re­

gião de movimento rápido dos marcadores, onde a análise quantitati

va é mais simples e parâmetros dos espectros experimentais forne ­

cem diretamente informação sobre o tempo de correlação rotacional.

A partir de meados da década de 70, um esforço muito grande foi di

rigido no sentido de interpretar, de maneira mais precisa, os es­

pectros na região de movimento lento. Nessa região, é muito difí ­

cil, e até mesmo impreciso, obter informações sobre o estado de mo

vimento do marcador através deparâmetros medidos diretamente dos

espectros experimentais, como na região de movimento rápido.

v

Com esse intuito, os trabalhos desenvolvidos pelo grupo

do Dr. J.H. Freed (Universidade de Cornell), deram uma contribui

ção decisiva no estudo de movimento de marcadores na região de mo­

vimento lento.

Esses métodos têm sido aplicados com bastante :;::sucesso

no estudo de transição de fase em cristais líquidos, e em alguns

sistemas especiais de membranas artificiais.

Esse método de análise tem como recurso principal a si­

mulação matemática dos espectros de marcadores em sistemas visco­

sos, o que permite uma interpretação mais precisa sobre o fenômeno

estudado.

Mais recentemente um grande desenvolvimento no método

de marcação de spin foi obtido através de técnicas não lineares de

ressonância paramagnética eletrônica (ST-RPE). Essa técnica nao

convencional fornece informações sobre o movimento do marcador,

quando esse movimento é muito lento, para o qual, o RPE convencio­

nal não permite interpretações precisas devido a insensibilidade

da forma de linha espectral a pequenas variações no movimento mole

cular. Essa técnica tem sido usada com sucesso no estudo de pro­

priedades hidrodinâmicas de macromoléculas e membranas biológicas.

O objetivo do presente trabalho é utilizar esses méto ­

dos modernos de análise espectral tanto de RPE convencional quanto

de transferência de saturação (ST-RPE) para ~studar a interação de

marcadores pequenos com proteínas em diferentes estados físieos: mo

nocristais, pó e solução.

Em particular a interação do marcador TEMPO com a hemo­

globina em diferentes estados físicos é estudada. Este marcador em

bora não se ligue covalentemente a proteína apresenta anisotropia

considerável nos espectros de RPE em monocristais de Hb. O uso dos

métodos de relaxação através da simulação espectral permite uma

interpretação mais segura dos fenômenos estudados.

vi

Esses estudos possibilitaram obter informações sobre as

mudanças que ocorrem na vizinhança do marcador, principalmente no

que concerne a hidratação das proteínas estudadas. Verificou-se que

de modo geral as propriedades relacionadas com a hidratação-

sao

bastante comuns às várias proteínas tais como a lisozima, mioglob!

na e hemoglobina.

Para esses estudos foi importante a implantação dos pr~

gramas desenvolvidos pelo grupo de Cornell para simular espectros

do marcador com movimento, e também o programa para simular espec-

tros rígidos.

o Capítulo I apresenta um resumo dos fundamentos teóri-

cos do método de marcagem de spin e dos métodos de análise de es­

pectros. No capítulo 11 são apresentados os métodos de preparaçao

de amostras, técnicas experimentais utilizadas na obtenção dos es-

pectros e aproximações causadas na análise espectral. No capítulo

111 são apresentados os resultados experimentais obtidos, e no Ca-

pítulo IV esses resultados são discutidos e as conclusões sao apre

sentadas. No Apêndice I o programa para simular espectros rígidos

é apresentad~no Apêndice 11 uma breve explicação sobre o programa

utilizado para simular os espectros com movimento é oferecida sen-

do este programa apresentado no Apêndice 111.

I

CAPiTULO I

FUNDAMENTOS TEORICOS

1. Química dos Radicais Nitróxido

A estrutura química de um radical estável NO e dada pe-

Ia fórmula geral:

De acordo com a teoria dos orbitais moleculares, a .es-

trutura eletrônica do NO é dada por:

*portanto, tendo o elétron desemparelhado no orbital TI doz

NO.

grupo

Esses radicais podem se ligar à molécula que se quer es

tudar através dos fragmentos AI e A2.

Radicais com essa estrutura podem ser armazenados por

meses, sob condições ordinárias. Esta estabilidade caracterizada

por uma energia de ligações de 100 kcal é devido parcialmente-a

proteção estérica da ligação NO pelos quatro grupos metil adjace~

tes (1 ).

Estericamente protegido, o grupo NO é tão inerte que as

outras partes da mesma molécula (isto é, os substituintes AI e A2)

111 11'11111~I jlll'I~IIII' ,I 111111, li, J , l ,11 I tl~ .j II I'~' 'I "~'I;I'I,IIIII,l ,hll , ~. I 'III'~'" I

2

podem ser facilmente modificados sem o envolvimento do elétron de

semparelhado.

Devido aos trabalhos pioneiros dos grupos do

Rozantsev na URSS (2 ), e do Prof. Rassatt na França (3),

Prof.

um gran-

de n~mero de mono a polirradicais nitróxidos são conhecidos, in-

clusive comercializados. Esses radicais são usados como sondas p~

ramagnéticas de duas maneiras:

A primeira possibilidade é ligar o NO ao sistema de in-

teresse por meio de uma reação química, um exemplo típico é do ra

dical iodoacetamida que se liga ao grupo -SH de proteinas( 4), es

ta reação é chamada marcagem de spin.

A segunda possibilidade é simplesmente difundir o marca

dor no sistema que se deseja estudar. Neste caso a molécula pode

ser chamada "sonda de spin" desde que n~o ~ ligada covalentemente

ao sistema hospedeiro, por exemplo: o uso de marcadores hidrofóbi

cos em membranas.

Os nitróxidos são muito sensíveis a valores extremos de

. o (2 )pH, e decompostos a temperaturas superlores que 80 C ,ou qua~

do irradiado por poucas horas(2) , e facilmente reduzidos por

ácido ascõrbico( 6 ). Esta propriedade importante foi aplicada na

investigação de difusão transversal de fosfolipídeos

2. propriedades Físicas de Radicais Nitróxidos e Sondas de Spin

O espectro de absorção da radicais nitróxidos possui

_ ( 2duas bandas de absorçao ~240 rnrn a ~460 mm . No espectro de in

fra-vermelho, absorção à ~1350 cm-l é produzida por vibração do

grupo NO( 2 ). A geometria molecular de um número de radicais ni-

tróxido, foi investigada por meio de difração de raios X em seu

estado cristalino( 7 ). O comprimento da ligação NO é 1.25 à 1.30

R e das ligações adjacentes N-C é ~1.5 R. OS átomos de nitrogênio

e oxigênio e os dois carbonos terciários vizinhos são coplanares.

Desvios dessa coplanaridade foram observados ( 8 ). O orbital 2pn

do nitrogênio contém o elétron desemparelhado e,..

e

3

perpendicular

ao plano dos quatro átomos, como pode ser visto na figura abaixo

1.

Fig. ] - Espectro de l..llTI radicalnitIÓxido livre em solução.As linhas externassão si.nétricasà linha central.

Um sistema de coordenadas cartesianas (x,y,z) e então

usualmente fixo no radical NO, sendo que o eixo x é escolhido na

direção da ligação NO; o eixo z na direção do orbital 2pTI e o ei-

xo y perpendicular a x,z.

Nos experimentos de RPE o momento magnético dos elétrons~

interagem com o campo magnético H e também o campo magnético 10­o

cal H~ criado no elétron pelo núcleo próximo no caso doradical

NO, pelo núcleo de nitrogênio (número quântico de spin nuclear do

N14 1=1).

O espectro básico de um radical NO livre em solução di-

luída, consta de três linhas, de igual altura e igual

como mostrado na figo (1).

separaçao

constante

4

A separaçao entre duas linhas adjacentes é chamada cons

tante de desdobramento hiperfino isotrópico, aN(aN=13-17,SG, para

muitos marcadores), enquanto o chamado fator g determina o valor

do campo magnético correspondendo ao centro do espectro. Esses p~

râmetros serão melhor definidos nas próximas seções.

Resultados experimentais ( 9 ) , mostram que a

hiperfina isotrópica tem seu valor aumentado em mais de 10% ao

passar de um solvente hidrofóbico para um hidrofílico correspon-

dentemente o fator g isotrópico decresce . Esses efeitos podem

ser compreendidos qualitativamente em termos de interações especi

ficas de solventes polares com os pares de elétrons do oxigênio.

Como visto, com base na teoria de orbitais moleculares,

o elétron desemparelhado do radical nitróxido está em um orbital

TI* (anti-ligado) e o par de elétron compartilhado está no orbital

TI (ligado).

Esses orbitais podem ser descritos por uma

linear de orbitais p do nitrogênio e do oxigênio:

a e b sao constantes.

combinação

Na presença de um meio polar, a afinidade _ eletrônica

do oxigênio é aumentada, acarretando um aumento no caráter O do

orbi tal ligado,e um aurrentono caráterN do orbital anti-ligado (10 )

ou em outras palavras, os elétrons desemparelhados não só se

deslocam para o átomo de N, o que pode ser medido pelo aumento de

aN, como ficam mais simétricos em relação ao núcleo de N, o que

é medido pela diminuição no fator g.

Assim, os radicais nitróxido são bastante sensíveis a

polaridade do meio e à sua hidrofobicidade.

5

Experimentos em sistemas hidrofóbicos tais como membra

nas, vesículas, etc., objetivando as medidas das variaçoes do tem

po de correlação de radicais nitróxido em função da temperatura

dão importantes informações sobre transição de fase nesses siste

mas, sendo que um gráfico tipo Arrhenius dará a medida da energia

. ~ (11)de atlvaçao para o processo •

No caso de marcadores pequenos em solução aquosa com

substâncias hidrofóbicas, devido às diferenças de polaridades en-

tre os dois solventes temos um desdobramento na linha de campo aI

to, como pode ser visto na figura (2).

,O~

Fig. 2 - Espectro de um radicalnitróxidohidrofóbicoÇt0aIJOpulaçãoestá dividida entre um rreiopolar e outro apolar.Na regiao de carrpoalto há umãseparaçãodas linhas correspondentesno ambientepolar (P)e apolar(H).

A linha mais interna é devido aos marcadores presentes no

meio hidrofóbico e a mais externa é devido aos marcadores no meio

polar (água), pois devido ao fato de radicais em meio polar ter2

I \)!( O) I grande no núcleo, a. polar> a. apolar.1S0 1S0(11 ). ~

McConnel e colaboradores defin1ram urna funçao de

partição:

f = H/H+P

Esta função nos dá a porcentagem de marcador no meio hidrofóbico.

As interações hidrofóbicas são fortemente

6

dependentes

de temperatura além de apresentarem uma anomalia em relação à ca-

pacidade calorífica e entropia. Dessa maneira as medidas da .fun-

ção partição com a temperatura, podem trazer importantes

mações sobre esses aspectos, que são complementados pela

infor-

medida

da "liberdade" do marcador girar (tempo de correlação) com o au-

mento da temperatura, isto é, quando a interação hidrofóbica está

mais forte.

o uso dessa função pode ser extremamente útil para a o~

tenção de diagramas de fase em misturas de espécies hidrofóbicas.

3. Interações Magnéticas.

3.1. Interação de Zeeman

Devido ao fato de possuir um elétron desemparelhado, os

radicais nitróxido possuem um momento angular de spin diferente

de zero e assim um momento magnético eletrônico, dado por

-+ :t -+ :tl1=-Y ::; = -g B ::;e e e

-+

onde g é o fator de desdobramento espectroscópico eletrônicoeB é o magneton de Bohr eletrônico e é dado por:e

(1)

e

B = klÉ. (2)e 2mc

A energia de interação entre o momento magnético -e o- -+ ~-

campo magnetico externo H=H k e dada por um operador, queo opera

somente nas variáveis de spin. Tal operador é chamado Hamiltonia

no de spin, e nesse caso de interação de Zeeman é dado por:

- -+ :tH = g B H.::;= g B H Sz e e e e o z (3)

-+

Os valores dos componentes do momento angular de spin S

ao longo da direção do campo magnético são denotados por M , e ossoutros estados do operador 9 sao:z

= g B H me e o s

7

( 4)

Para um sistema de somente um elétron desemparelhado,

5=1/2 e m pode assumir dois valores ±1/2. A diferença em energias

entre os dois níveis produzida pelo campo magnético é:

l\E = geSeHo

h~=gBH

.- Ms'-Io : ~

-H

Primeira derivadada Absorção de RPE

(5 )

Fig. 3 - Efeito da aplicaçãodo carrpomagnéticoexterno a um sistema de spin.

Como visto na figura 3, o efeito do campo magnético ex-

terno é separar os elétrons em dois níveis de energia cuja separ~

ção é dada pela expressão acima. Como veremos com mais clareza a

seguir, em experimentos de RPE, transições entre essas duas popu-

lações de elétrons são obtidas, devido a absorção de um quantum

de radiação eletromagnética incidente; assim podemos escrever:

esta relação é conhecida como condição de ressonância e,

(5a)

define

um parâmetro extremamente importante; o fator g, como segue:

g =eh\J

B He o

=0.7144 \J

Ho

8

No caso de radicais nitróxidos, esse fator dá a posiçao

da linha central de ressonância.

Quando a molécula está sujeita a um campo magnético ex-

terno, o efeito combinado do campo e do acoplamento spin órbita

leva a uma pequena contribuição do momento angular orbital ao es-

tado fundamental do sistema. Desta maneira, as propriedades magné

ticas do sistema não são devidas somente ao momento angular de

spin. Isto causa um desvio no fator g sendo definido assim um fa-

tor g efetivo para o sistema. Desvios do fator g do valor para o

elétron livre são pequenos (~l%) para radicais aromáticos, mas

podem ser grandes em moléculas que contém metais de transição.

A magnitude dessa correção depende da orientação do cam

po magnético em relação ao sistema de eixos moleculares. Isto im-

plica que o fator g da molécula não pode ser representado por uma

grandeza escalar, mas por um tensor de segunda ordem.

As componentes desse tensor podem ser escritas como (l2)

gij =geOij =2ÀI <1/JoILil1/Je><1/JeILjl1/Jo>E - Ee O

( 6)

onde o .. é o delta de Kronecker, que é igual a 1 se i=j e zero em1J

caso contrário, À é a constante de acoplamento spin órbita e 1/JO

e 1jJsão funções de onda que representam os estados fundamental ee

excitado, respectivamente, e EO e Ee são as correspondentes ener­

gias.

Usando notação tensorial, temos:

fi =6 HgSz e

A observável física correspondendo ao operador Hamilto-

niano, é a energia que não depende do sistema de referência. Se-

9

gue que a escolha do sistema de referência é completamente arbi-

trária. Entretanto existem duas possibilidades convenientes a se-

rem consideradas:

a) Os eixos do laboratório (x,y,z) com z coincidindo com a dire-

~ ~ ~çao do campo. Neste sistema H = H k, e os operadores deo

~ ~bem definidos, visto que a direçao de H corresponde ao

spin são

eixo da

quantização. No sistema de laboratório a Hamiltoniana de Zeeman

fica:

( 7)

b) Sistema de eixos moleculares (p,q,r) no qual o tensor g é dia-

gonal. Neste caso obtém-se:

li = S (g H S +g H S +g H S ) (8)z e pp p p pp q q rr r r

Para o caso em que a molécula está orientada com um de

seus eixos principais paralelo à direção do campo a condição de

ressonância se dá para os seguintes valores de campo:

hvO

Segqq

Para uma orientação arbitrária da molécula, o campo res

sonante será dado pela relação:

onde o fator g efetivo é dado por:

( 9)

- ~(l,m,n) sao cossenos diretores de H no sistema de eixos molecula-

res.

10

Sejam (a,B,y) ângulos de Euler que levam o sistema de

eixos do laboratório (x,y,z) ao sistema de eixos moleculares (p,

q,r). Estes ângulos são definidos por três rotações sucessivas:

a) rotação de a ao redor do eixo z levando à (x',y' , z ); b) rota-

ção de B ao redor de y' levando à (x",y' ,z'); c) rotação de y ao

redor de x" levando à (x",y" , z") •

De acôrdo com essas convençoes, encontra-se:

2 2 2 2 2 222 2g f = g sen SC0S y+g sen Ssen y+g cos Se pp qq rr

(10)

A análise da dependência angular do fator g para radi-

cais em cristais, conduz à determinação dos valores principais do

tensor g e a disposição espacial da molécula paramagnética em re­

lação aos eixos do cristal.

3.2. Interação com o Campo Eletromagnético

o campo mangético externo, separa os elétrons em dois

níveis de energia dada por (4), sendo que as populações dos

veis é dada pela Lei de Boltzman:

..'ll'l-

Na = egeSeHoms/kT (11)

onde Na e Na sáo os nGmeros de elétrons nos estados a e 8.

O campo eletromagnético de microonda é responsável pe-

Ias transições de RPE.

O campo magnético associado à radiação oscila ao longo

do eixo x perpendicular à direção do campo estático, de modo que

suas componentes são:

= O (12)

11

o hamiltoniano da interação com o momento magnético do

spin desprezando a anisotropia do fator g é:

H I = g B H S cos 18te e 1 x

Como geralmente Hl é muito menor que o campo

(13 )

estático

HO' RI pode ser tratado como perturbação dependente do ~ atuag

do sobre estados próprios de li . Podemos verificar então que oz

efeito de RI é o de induzir transições entre os estados <aI e

Ia'>, autoestados de li (com autovalores E e E ,). A probabiliz a a -

dade de transição é dada por:

Waa, (14)

onde õ é a função delta de Dirac que impõe a condição: E -E ,=hw.a a

A condição para que <aIS Ia'> não seja zero pode ser obx

tida se usarmos os operadores S+ = S ± iS •_ x y

As transições devem obedecer à regra de seleção:~ =±l.s

3.3. Interação Hiperfina

o valor de g discutido anteriormente não é um bom parâ-

metro para caracterizar espécies de radicais livres individuais

já que eles diferem muito pouco do valor para o spin livre. Muito

mais importante para a investigação de moléculas paramagnéticas é

a estrutura de multipletes, ou estrutura hiperfina frequentemente

presente no espectro de RPE.

A estrutura hiperfina é causada pela interação do momen

to magnético do spin eletrônico, com os momentos magnéticos de nú

cleos que possuem momento de spin nuclear, tais como o hidrogênio

(IH = 1/2), o nitrogênio (IN= 1), e o fluor (Ip= 1/2). O carbono e

. - .. "'t 12 16 - t d .o oX1gen1o nos seus 1SO opos comuns C e O tem momen o e sp1n

nuclear zero, porém os isótopos 13c (é de abundância natural 1%)

12

e 170 (abundância de 0.04%) tem spins nucleares 1/2 e 5/2, respe.s:

tivamente.

A estrutura de multipleto do espectro de RPE se deve ao

fato que o momento magnético eletrônico interagindo com o núcleo

"sente" um campo total diferente dependendo de qual das 21+1 pos-

síveis orientações do momento de spin nuclear tem lugar no campo

magnético estático,

As interações magnéticas entre os spins eletrônico e

nuclear são representadas pela hamiltoniana:

8n (i.s) o (~)

3(15)

onde r é a dist~ncia elétron-núcleo e 8(~)é a funç~o delta de

Dirac. O primeiro termo na expressão descreve a interação elé-

tron-núcleo dipolar e o segundo termo, a interação de contato de

Fermi.

Nota-se que o primeiro termo depende da orientação rela

tiva no espaço. O hamiltoniano pode ser apresentado de uma forma

mais compacta, como segue:

onde A é um tensor de segunda ordem, que pode ser decomposto em

duas partes:

A = A' + a

ond2 os elementos de AI são dados por:

(17)

2 -5A,' . = 9 i3 9 i3 < (r 8, , - 3x. x , ) r >lJ e e n n lJ l J

(18)

e o símbolo <> denota integração pela distribuição eletrônica. Es

te termo é simétrico, e tem traço nulo.

o segundo termo da expressão (17) é devido ao termo de

13

contato, e nao depende da orientação da molécula em relação ao

campo magnético, sendo um termo isotrópico e é dado por:

8rr 2a=- g S g S I~(O) I

3 eenn

onde W(o) é o valor da função de onda do elétron

(19)

desemparelhado

na posição do núcleo. O termo a é a média aritmética dos valores

principais do tensor A.

Se a distribuição eletrônica tem simetria esférica, is-

to é, é representada por uma onda do estado S, então a integração

do operador dipolar em relação às coordenadas eletrônicas é zero.

Portanto, somente se o elétron desemparelhado estiver

num estado p,d,f, ..• , a interação dipolar estará presente.

o termo isotrópico de contato requer densidade eletrôn!

ca finita na posição do núcleo o que só pode ser oferecido

função de onda do tipo S.

3.4. Outras Interaçõe~

pela

Duas outras interações, importantes na interpretação dos

resultados com radicais nitróxidos são: interação elétron-elétron

dipolar e interação de troca, causadas pelas interações magnéti -

cas entre os nitróxidos.

A interação dipolar é análoga ao acoplamento dipolar

spin-núcleo. O hamiltoniano neste caso, desprezando anisotropia do

tensor g é:

(2 O)

onde r é a distância intereletrônica. Para essa expressão é poss!

vel derivar um hamiltoniano de spin dipolar Hd, através de um pr~

cedimento similar à interação dipolar hiperfino

+=+Hd = S D S

BIBLIOTECA DO I~l:;m Ul i) DE FI ..,,', E UU;M:C~ i, t, (hkLCS - ,'s.r

FI'; I ( A

(21)

14

-+- -+- -+-

onde S = SI +S2 e os elementos do tensor D sao dados por:

r

D ..J.J

I 222 5= - g S «r õ .. -3x.x.)/r >

2 e e 1J 1 J(22)

o símbolo < > indica média sobre funções de onda eletrônicas.

A interação de troca ocorre quando as funções de

eletrônicas se misturam. Pode ser descrita pelo operador:

onda

(23)

Os efeitos destes termos são importantes para birradi-

cais(13) .

4. Análise dos Espectros deRPE

4.1. Espectros em solução

Para um radical livre para o qual o spin eletrônico in-

terage através do acoplamento hiperfino com N núcleos de spin Ik.

O hamiltoniano magnético é:

N

H = S HgS + I S A(k) Ie k=l

(24)

Se as espécies paramagnéticas sao diluidas em um solven

te de baixa viscosidade, então as reorientações moleculares rápi-

das devido ao movimento térmico fazem uma média nos termos aniso

trópicos da hamiltoniana de spin.

A posição do espectro no campo e a grandeza dos desdo-

bramentos hiperfinos são então determinados por valores médios

dos elementos diagonais dos tensores g e A.

Os níveis de energia do sistema podem ser obtidos em

termos do hamiltoniano isotrópico:

N

HO = gB HOS + L ak (S Ik +s Ik +s Ik )e z k~l x x y y z z(25)

15

Para o caso particular de um marcador de spin, em que o

elétron interage com apenas um núcleo, que é o nosso caso, temos:

ao= gB HOS + a (S I + S I + SI)e z x x y y z z(26)

1a = -3 (A +A +A )xx yy zz

Como as interações hiperfinas são sempre muito menores

que a energia da interação Zeeman, podemos usar teoria da pertur-

bação para calcular os níveis de energia, sendo que o termo de i~

teração hiperfina é usado como perturbação. As energias em primei

ra ordem são:

(27)

com Ms = ±1/2 e M1 = -I, ••• ,+I

o campo de microondas induz transições de RPE, entre es

ses níveis obedecendo às regras de seleção: llMs= ±l, llM1= O.

As diferenças ~tre os níveis de energia entre os quais

ocorre transição é:

Os espectros consistem de 21 + 1 linhas igualmente espa-

çadas por uma distância a/h (em unidade de frequência

unidades de campo).

ou -a/gB eme

A figura (4a) mostra os diagramas de níveis de energia

no caso de um elétron interagindo com um núcleo de spin I=l como

.. d" 1 d 14 d'" t ...d t b'"e o caso o nuc eo e N em ra lcalS nl rOXl o. Na par e e mos

trado o espectro de RPE correspondente.

16

Absorç ão

---------- H de RPE

Primeira

Derivado do Absor­

ção de RPE

ms

.1­2

--'­2

ml

+1

O

- 1

-Io

+ I

I

I

i

I

g

E

dA

dH

Fig. 4 - a) Diagramados níveis de energia para t.nn elétron interagindooom umnúcleo de 14 N, oom spin nuclear 1=1.

b) Espectro da derivadada absorçãopara esse sisterra.

4.2. Espectro em cristais orientados

Para obter a dependência angular do espectro dos radi-

cais livres orientados em monocristais temos que calcular os ní­

veis de energia do hamiltoniano completo (14). Novamente consider~

remos o caso particular de radicais nitróxidos para os quais k=l.

A aproximaçao IA..1«gB HO permite o uso da teoria de1J eperturbação de primeira ordem para calcular os níveis de energia,

e o valor encontrado para a diferença entre os níveis de energia:

'3 Ht e o + A f Me I (28)

17

onde g f e A f são dados em relação aos eixos moleculares, usandoe e J."

- 1 . (15)os angulos de Eu er como anterlormente •

2 2 222 2 222g f = g sen B cos y + g sen B sen y + g cos B (29 )e pp gg rr

Utilizando microonda de frequência fixa vo'

absorções em valores de campo dados por:

-ocorrerao

(31)

apenas

o espectro consiste de 2I+l linhas, igualmente espaça­

das com separação A f/g fS , e distribuidas simetricamente em re­e e e

lação ao centro do espectro definido por gef.

A medida experimental de ~E(15) pode determinar

os valores absolutos dos componentes principais do tensor hiperf~

no. Eles estão ligados à constante isotrópica pela relação:

1a = -3(A +A +A ) (32)pp qq rr

A comparaçao entre o valor de a medido em solução e os

valores princ~pais do tensor permite-nos determinar o sin~l rela-

tivo da parte isotrópica e da parte puramente anisotrópica. Esses

dados conduzem a cálculos teóricos que permitem avaliar as densi­

dades de carga nos eixos do radical nitróxido(16).

5. Reorientação de Radicais em Soluções Viscosas

Quando radicais paramagnéticos são diluidos em uma solu

ção viscosa, e imersos em um campo magnético externo, devido~a

flutuações térmicas do meio, esses radicais estão sujeitos a col!

sões com moléculas do solvente, e dessa forma, estão se reorien-

tando constantemente.

18

Suponhamos que a orientação de um spin, quando o campo

magnético externo é ligado, seja paralelo à ê1e. Devido às coli-

sões sofridas com moléculas do meio, depois de um intervalo de

tempo o spin não está mais paralelo ao campo externo.

Essa reorientação, no tempo, é feita de maneira aleató-

rla. Depois desse mesmo intervalo de tempo a distribuição de spins

em relação ao campo externo aplicado, é dada,

figura (5).

corno mostra a

H

(a)

r:t(t)

H

pap.

(b)

Fig. 5 - a) Trajetóriaseguidapela magnetizaçãof: seg depois que o campo foidesligado.

b) Distribuiçãode spin ao redor do campo magnéticoexterno, t segdepois que o campo foi ligado.

o elétron desemparelhado do radical livre está sujeito

a um campo externo constante, e a um campo, originado na intera

ç~o dipolar com os nGcleos, que depende da orientaç~o do radical.

Pode-se portanto escrever a hamiltoniana de spin, como

composta por duas partes:

( 33)

onde H parte constante, que é composta pelo termo de Zeeman e ino -

teração hiperfina isotrópica, e é responsável por linhas epectrais

19

finas, e o termo Ri (t)é a parte dependente 'do tempo, que é compo~

ta pelo termo dipolar anisotrópico. Este termo é responsável pela

relaxação, e alargamento das linhas.

r

Como a intensidade da interação dipolar é muito

~ ~ ~que a do termo estatico, pode-se trata-ia como perturbaçao.

menor

Em medidas de ressonância magnética, a

transversal, M , induz uma voltagem no detetor.X

Para uma amostra, na qual existe número grande de spin&

a voltagem no detetor será induzida pelo valor médio da magnetiz~

ção transversal, <M >, sendo que essa média é sobre todo o siste­x

ma de spins.

A magnetização transversal, pode ser dada por meio das

~ h (12 , I 7) ... d . d .equaçoes de Bloc , ou atraves o uso de matrlz ensldade,

o que é mostrado de maneira bastante didática em(18) .

Usando as definições e argumentos desse livro(18) ,

magnetização transversal média é dada por

<M > = T {pM }x r x

onde p é a matriz densidade e é dada por:

-E./kT1ep =

-E./kTL:e 1i

a

(34)

(35)

no estado de equilIbrio, os elementos da diagonal da matriz de~

sidade dão as populações para os diferentes auto-estados da hamil

toniana li na equação (33).o

No sistema de referência giratório, a variação da popu-

lação dos autoestados no tempo é dado pela equação:

*dp .-- = 1dt h r;- * *iL~ (t),p J (36)

20

...*onde H (t) é a parte anisotrópica da hamiltoniana (33), no siste

ma giratório e varia aleatoriamente no tempo; essa variaçao alea­

*tória obedece às leis da probabilidade, e p é a matriz densidade

nesse sistema.

Essa variaçao aleatória, no tempo, faz com que a comp~

nêntê transversal da magnetlzaç~o <M > decaia no tempo, devidox

relaxaç~o.

,a

Pode-se correlacionar os valores médios da magnetização

transversal no instante t=1 e no instante t=O, atravês da função

de correlação:

G(T) = «M (o)><M (1)» = treM (o)M (T)]x x x x (37)

onde a barra significa média em todo conjunto de spin.

~ oportuno definir a densidade espectral, como a trans-

formada de Fourier da função de correlação:

00 00

f f -iwTj(~ = 2 G(T) cos(wT)dT = G(T) e dr

o -00

( 38)

Substi tuindo (37)em (38),obtérn-sea densidade espectral para o sis

terna estudado.

o sinal detetado em experimentos de RPE é a

que e a parte imaginária da susceptibilidade magnética.

al?sorção,

"X =

NX Ü)o

2j (w) (39)

Dessa maneira, pode-se simular matematicamente os espectros de ab

sorção magnética, conhecendo-se as funções de correlação para o

sistema e fazendo a transformada e Fourier representada na eq.

(38). A função de autocorrelação é fortemente dependente do mode-

10 adotado para a reorientação dos radicais.

Os modelos mais usados para explicar reorientação de

21

radicais em um meio viscoso são:

a) Difusão rotacional browniana, no qual a molécula se reorienta

continuamente no tempo;

b) Difusão livre, no qual a molécula gira livremente no tempo T e

depois reorienta instantaneamente. Este modelo leva em conta que

T a I/B onde I é o momento de inércia da molécula e B é o

ciente de fricção do meio(19) •

coefi-

nova

c) Difusão por saltos no qual as moléculas têm uma orientação fi­

xa por um tempo T e então salta instantaneamente para uma

. ~ (20)orlentaçao •

Para reorientação isotrópica, os tempos de

. d - (28)nos respectlvos mo elos sao dados por :

cor:relação

a)

b)

-1T =.Q,(.Q,+l)Dc

J'TT

-1 -1 -1Te = T {1-(2.Q,+1)

O

d8w (8) Isen (.Q,+1/2) 8/sen8/2/ }

onde w(8) é urna função distribuição para passos difusivos por ân-

gulos 8 e é normalizada para f'TT w (8) de = 1 .o

c) T~l= .Q,(.Q,+1)D//l+.Q,(.Q,+1)DT/l/2

D é a constante de difusão e no caso de movimento Browniano é da-

da pela relação de Stokes-Einstein.

Como foi dito anteriormente, os marcadores de spin po-

dem ser usados corno sondas paramagnéticas quando são

no sistema que se deseja estudar, ou são usados corno

difundidos

marcadores

propriamente ditos quando são ligados ao sistema através de rea-

ção química. O movimento do anel paramagnético para esse segundo

tipo de marcador, depende entre outras coisas da flexibilidade e

. ~ ~ (21)tamanho da llgaçao entre o anel e a macromolecula . Quando

o marcador está ligado à macromolécula através de uma ligação lon

22

ga e flexível, ele possui bastante liberdade de movimento em con-

dições de baixa viscosidade, assim como quando o marcador é usado

como sonda, pode-se dizer que seu movimento é rápido e seu tempo

- , -9de corre1açao e menor que 10 sego O espectro desses marcadores

consiste de linhas finas quando em solução corno mostra a figura

( 6a ) :

... '-II-- I5G

III-----1

"- 2Amax=32.6x2G-----

Fig. 6 a e b) Espectrosde RPE de um radicalnitróxido:

a) fracamenteimobilizado

b) fortementebuobilizado

o marcador cujo anel que contém o nitróxido está ligado

a macromolécula por ligações rígidas, possuem movimento mais len-

to que os anteriores quando nas mesmas condições de viscosidade co

mo pode ser mostrado na figura (6b). O espectro mostrado na fig~

ra (6a) é dito fracamente imobilizado ou "livre" e o da figura

23

(6b) é fortemente imobilizado. Como mostrado anteriormente, o

movimento do marcador depende não só da ligação entre o marcado r

e a macromolécula, mas também da viscosidade e temperatura.

De maneira geral, o estado de movimento do marcador de

spin, pode ser estudado em três regiões de movimento.

A definição dessas regiões é feita em função da magnit~

de das interações magnéticas I HI(t)\ , como segue:

a) I RI (t) TI« I - Região de movimento rápido

Nessa região, o campo magnético local "sentido" pelo

elétron flutuará rapidamente no tempo, e somente seu valor médio

TI

tomado em um intervalo de tempo longo comparado com as durações

das flutuações será observado, e esta média é muito menor que o

valor instantâneo do campo local, causando um estreitamente das

linhas do espectro. Por esta razão, essa região é chamada de re­

gião de estreitamento devido ao movimento.

Quando o sistema é observado em um intervalo de tempo

t '\,T, as variaçoes na matriz densidade (36) são muito pequenas

pois TI' T2 »T •

Nessa região, de movimento, sao importantes as contri -

buições de transições que ocorrem em diferentes frequências:

i - termos seculares, comutam com H (33) na aproximação deo

alto campo. são originados de termos r e S e seus produtos,z z

e a frequência dessas transições é w = O.

ii - termos pseudo seculares, tem origem em termos de HI (t) que- - _I --...

comutam com H , embora HI (t) nao comute com H • Sao termoo o

em r±, e as transições obedecem regras de seleção ~ =±l e ±2

As frequências para essas transições são dadas por:

w = 1'1 H ± ly ãl± n o 2 e

onde y e y são razões giromagnéticas nuclear e eletrônican e

e a, é a constante de acoplamento hiperfino isotrópico

24

iii - têrmos não seculares, resultam de têrmos que possuem S± e

diferentes combinações S± I+, S± I± e S± I+ e as transições

obedecem a regras de seleção ~mS = ±l, ~mI = 0, ±l, +1 e as

frequências de transição são dadas por:

e transições referentes a esses três têrmos podem ser vis

tas na fig. (7).

Redfield (22), Fraenkel e Freed(23), equacionaram essas

'b . - - d 1 d l' h (15)contrl UlÇoeS em termos e argura e ln a :

onde mI e o nUmero quântico de spin nuclear, e A,B,C sao

por:

(40)

dados

h y2B=R {~

e 82e

(~g+ôa)(4j(0» + 3j(w »}e

~g(4j(o)+ 3j(We» + ~g(4j(0)+ 3j(wJ )}

(4la)

(4lb)

H2 ~g(4j(0)+3j(w» + ôg(4j(0)+3j(w »}o o o (4lc)

onde y 8e Ho tem significado usual, ~ a = Azz -21 (A +A )e . xx yy

oa = -21(A -A ), ~g e ôg.são dados por expressões similares, e j (w)xx yy

é a densidade espectral (38) e é dada por:

0;1+.+> b: \-t .0)c~\+, •..), 110., .( ~,'1\

•.. , ~..., , ,I, ••.1

I' .•. ,..

4\ /5,, Zr'7','6,, •..,\

, 1

.•.,,\ I

",•.. ,\

I \•..

...

\....•.,

\I \ ..•.,

I\ ~ 8 " I,

I

,....

~ ,.(\'" I "',,,_o "

,,\

~,•.

...~• .Q': \., .•.> b\ \-)0)c': \-,-)

W2=Wb'b=We

W3 = W , = W + Y a = W + 2bc c e e e

25

12 ya+w =w +b+we n e n

wa = w , = w + 2wa c e n

onde we= \Ye\Ho -frequência de Larmor do spin eletrônico

w = h IH -

frequência de Larmor do spin nuclearn n o - desdobramento isotrópicoa -

constante de

FIG. 7 - Níveis de energia para S = 1/2, I = L A

notação dos níveis é \MS' MI> , com as

9 transições possíveis. As frequências

w. para as i transições possíveis.1

j (w) = ( T2 '"')l+w T

26

Os têrmos pseudo seculares e não seculares, causam alaE

gamento nas linhas espectrais e, dependendo da precisão com que os

espectros são obtidos, suas contribuições tornam-se muito

tantes.

impor

~ importante notar ainda, que nessa regiao de movimento,

os tempos de correlação são independentes do modêlo de reorienta -

çao escolhido.

b) I RI (t) TI -1 - Região de movimento intermediário:

Nessa regiao, as observações são realizadas em interva

10 de tempo praticamente igual a duração das flutuações do campo

magnitico local "sentido" pelo elitron.

Dessa forma, o campo local i grande, e seu efeito i si~

nificativo não só na larg~ra da linha, mas tambim na posição das

linhas hiperfinas externas (mr = ±l) em relação à linha central.

(mr = O) •

Nos espectros característicos dessa região as linhas hi

perfinas externas não são simitricas à linha central.

A solução proposta por Redfield, Fraenkel e Freed, nao

i mais válida, pois, Rl(t) não pode ser usado como perturbação.

,- d ' (24,25,26,27,28)Para essa reglao e movlmento, Freed e coL

propuseram um tratamento estocástico para equação de Liouville

(36), no sentido de simular os espectros para determinação dos

- (29) "'. -tempos de correlaçao • No apendlce rr e apresentado um resumo

desse procedimento e no apêndice rrr o programa desenvolvido pelo

Dr. C.F. Polnaszeck, para simular espectros na região de tempo de

- -11 -7correlaçao de 10 < e < 10 sego A necessidade de simular os

espectros nessa região de movimento deve-se a que não i possivel

obter-se o tempo de correlação com precisão, atravis da medida

27

de parâmetros diretamente dos espectros experimentais e a simu-

lação permite além da obtenção de T uma avaliação do modelo dec

reorientação do marcador.

Neste caso os espectros são sensíveis ao modelo de reo-

rientação escolhido. Na verdade a reorientação molecular depende

nao somente de 1 , mas do tamanho relativo e forma das moléculasc

de soluto e solvente.

A difusão browniana descreve satisfatoriamente os espe~

~ - ~ -7tros de uma macromolecula em soluçao aquosa (ate mesmo para 1 >10c

seg.) enquanto que a difusão por saltos é favorecida quando os ta

manhos do soluto e solvente são comparáveis.

Um método bastante interessante para medir tempo de cOE

relação, é proposto por Goldman e colab. (30). Este método utiliza

uma calibração empírica onde se usa a função:

S = A IA'z z

onde A é a metade distância entre as linhas hiperfinas externasz

dos espectros na condição estudada e A' é a mesma medidaz para

uma situação de imobilização completa do marcador.

O tempo de correlação é obtido através da relação:

TC=a(l-s)b (42)

onde a e b são constantes cujos valores serao obtidos do ajuste

da curva experimental (l-S) x T com a equaçao acima.c

Um método semelhante é baseado na calibração usando a

- (31)relaçao

w=i'.h.li'.h,i

onde i'.h. são as larguras das linhas hiperfinas externas, medidasl

na meia altura em relação à linha de base, para os espectros na

28

N N

condiçao estudada, e 6h~ sao as larguras das mesmas linhas para o1espectro totalmente imobilizado. Os índices i se referem às li-

nhas de campo baixo e alto.

o tempo de correlação é dado por:

Te = a (1 - w ) b

as constantes a e b são obtidas do ajuste da curva

(l-w) x T~, com a equaç~o acima.~

1- () I ~ .. (32,33)c) I H 1 t T, »1 - Eeglao de mOVlmento lento

(43)

experimental

Em medidas de tempo de correlação no intervalo de

10-11 <. < 10-7 - d ~ d I' ,~, 'd. '[ sao usa os meto os lneares, lStO e, a lntensl a- c -

de do sinal é proporcional ao campo da microonda, e a perda de

coerencia de fase do sistema de spin, isto é, a relaxação spin

spin, é o processo de relaxação mais importante.

- -7Para medir tempos de correlaçao maiores que 10 seg, o

processo de relaxação spin rêde torna-se muito importante. Os es-

pectros obtidos com métodos convencionais para tempos de correla-

ção dessa ordem, são tipicamente rígidos. As técnicas propostas

usam efeitos não lineares, e a população dos níveis de energia

não são mais dados pela lei de distribuição de Boltzmann, isto é,

o sistema de spin est~ parcialmente ou totalmente saturado. Para

que o sistema de spin retorne ao seu estado de equilíbrio, e ne-

cessârio entregar energia para as moléculas do meio (rêde) e, es-

sa taxa de troca de energia é modulada pelo movimento das molé-

culas, ou então trocar a posição entre diferentes pacotes de spin

no espectro de ressonância, que é conhecido como difusão espec-

traI e é devida a mudanças no nfirneroquântico de spin nuclear, e

~ interaç6es magnéticas anisotr5picas.

Um fato importante a ser levado em conta, ~ que sob con-

29

- ." ~ --

diçoes saturantes, o slstema e senslvel a taxa na qual a varredu-

ra passa pela posiç~o de resson~ncia. A taxa de varredura ~ deter

minada pela condição de passagem adiabática:

2

dH «yHldt

onde H ~ o campo magn~tico externo, y razão giromagn~tica do elé-

I

tron e Hl ~ campo magnético da microonda.

Experimentalmente, a passagem rápida pela resonância,

foi resolvida com o emprego do campo de modulação, que al~m da

função de deteção do sinal, passou a ser responsável pela criação

de uma taxa própria de passagem de H pela ressonância, satisfazeg

do assim a condição de passagem rápida adiabática que pode agora

ser escrita como:

dHaw H

dt m m

onde w e H frequência e intensidade do campo de modulação.m m

Para radicais cujo movimento é muito lento, e o tempo de

correlação é da ordem do tempo de relaxação spin rêde, torna-se

interessante usar frequência de modulação da ordem de TI' satis­

fazendo wmTI~I.

Vamos considerar o sistema de spin na base giratória.Ne~-+ ••• -f-. ••

sa base, HI, campo da microonda e paralelo a X e lio campo estati-

co e paralelo à z.

- ~ - -Alem de H , na direçao Z, o observador ve um campo na dio -

- - + - --reçao oposta a H , cujo valor e w/y, onde w e a frequencia de Laro

moro Na ressonância no sistema giratório o campo estático li eo

compensado pelo campo w/y, ficando na direção do eixo Z apenas o

campo de modulação H . A direção do campo H num ciclo de modula-m m

ção muda da direção +Z para a direção -Z.

No sistema giratório, a magnetização precessa em torno

30

do campo efetivo e a condição de passagem adiabática requer que

•• J -+ -+ " (14 )o angulo formado entre os vetares M e Hef seJa mUlto pequeno .

Dessa forma, se a varredura do campo dc for suficiente-

mente lenta para satisfazer a condição de passagem rápida adiabá-

. (dH 2 ) ~ . d - dH Hm)tlca dE«yH1 I mas, for rapl a em comparaçao com TI (dt 'V T I eg1tão, na base giratória, a magnetização resultante cai ao longo do

campo efetivo num tempo correspondente ao ciclo de varredura.

Se a condição LUmT 1~1 é válida, o sistema de spin relaxa,

isto é, volta ao equilíbrio, no fim da varredura, a magnetização-+

M volta a apontar para +Z, e será antiparalela ao campo efetivo,

como mostra a fig. ( 8 ) (34) :

Z Hm

x

Z

M

Hm

x

Fig. 8- Representação esquemática do sistema de referência giratório, o campode microonda Hl, campode modulação H e canpo efetivo H f" Durante avarredura, sob condições adiabáticas, ma magnetização M e segue o campoefetivo.

31

o sinal detetado, será a projeção de M sobre -x. Assim,

o sinal do pacote de spin estará 900 fora de fase em relação ao

campo de modulação. Os pacotes de spin, com movimento muito lento,

e que por causa disso, não acompanham o campo de modulação, deve-

riam ser detetados fora de fase. Esses pacotes de spin estão en-

tre os pontos de retorno, e são os mais sensíveis à difusão espe~

traI, e ã transferência de saturação.

Para se compreender melhor o que sejam esses pontos de

retorno, vamos supor que o marcador de spin fará um ângulo e com

a direção do campo magnético.

30res

<lH

ãã 20

(r~dt

3350G Ie=o

-I

: 3450G9=0

Fig. 9 - a) na parte superior, é mostrado umespectro de RPEoonvencional, para ummarcador comtempode oorrelação TC« 10-7 seg.e, b) a variaçãõdo camr::ode ressonância emrelação ao ângulo rrolecular, em relaçãoao ~ rragnétioo externo. As posições 8=0e 7T2 definem os pontosde retorno.

32

Consideremos, como visto acima que as interações aniso -

trópicas sejam dadas pela parte dipolar do termo hiperfino. Os va

lares do campo de ressonância H são dados por:res

Hres = Ho - nã[ - J cos2a -}] (44 )

onde H , campo central, n número quântico de spin-nuclear, ã oonso

tante hiperfina e e é o ângulo de orientação da molécula com o

campo magnético externo. A posição do campo de ressonância varia

com o ângulo de orientação (8) sendo que os valores máximo e míni

mo de variação do campo de ressonância com e são dados por:

3H

-~ = -3 a cose senede (45)

quando e = o

quando e = TI /2

dH /de = ores

3H /ae=ores

Nesses dois pontos, a variação do campo de ressonância

com o ângulo de orientação da molécula é nulo. Isso ocorre quando

a molécula é paralela ao campo externo e quando a molécula é per-

pendicular a ele.

~ -7O espectro de um marcador com tempo de cnn:elaçaoT<lO seg

e tipicamente um espectro rígido, como mostra a figo ( 9 a). A v~

riação do campo de ressonância em função do ângulo de orientação

da molécula (3H 1(0) é dada na figo ( 9 b).res

Na figo ( 9 b) é mostrada a variação do campo de resso-

nância (dHres/dO) em função do campo de ressonância H . Os pon­resres ~ -

tos onde (dH Ide) = O sao chamados pontos de retorno e que sao

vistos na figura quando e = o e TI/2. :g interessante notar que en-

d d d resl ~ ~. ~tre os pontos e retorno, on e H de e maxlmo, um pequeno acrE~

cimo no ângulo e causa grandes variações nos campos de ressonân -

cia. Essas regiões são melhores indicadores de difusão rotaciona~

33

se existe substancial intensidade do sinal de EPR, nessa região,

Dalton e col. (35)rnostramque o movimento do marcador é lento, e à

medida que o movimento do marcador aumenta, a intensidade nessas

regiões diminui.

Esses pesquisadores mostraram que os melhores modos de

- - - I ".... I -

deteçao sao dispersao prImeiro harmonlco fora de fase e absorçao

segundo harmônico fora de fase. Esses espectros mostram mudanças

dramáticas entre os pontos de retorno.

Em geral os espectros de ST-RPE são obtidos para um sis­

tema modelo no qual o tempo de correlação é obtido por exemplo u­

sando a relação de Debye

T =C

(46)

e variando a viscosidade e/ou temperatura e obtendo-se então o

valor de T naquela condição. Thomas et al(3S) fizeram esse estu­c

do para o caso de hemoglobina marcada com NEM*. Desta maneira ob-

têm-se uma calibração dos parâmetros de ST-EPR em função de T pac -ra o sistema modelo e comparando esses parâmetros com os obtidos

para o sistema que se quer investigar, pode-se obter uma estimati

va de T nesse sistema.c

Espectro rígido - caracterizado por não apresentar movimento. Cog

sideramos um sistema de spin, ao qual ê aplicado um campo magnêti

co estático H.

Suponhamos que a distribuição de spins em relação ao cam

po magnético seja dado pela figo (10 a):

34

~" ()I~I

"11I'--1

Q.~M1 \ •••

; ...

~. rr :._". __ "_,

(a) (b)

Fig. 10 - a) rrostraurnasem.i!2sfera,representandoesta clistribuiç~o.A faixa es­

cura corresP<':lD~ea pacotes de spin, cujc;tS orientaçõessão 81 e e2 comO campo rr.agnetlCo.

b) rrostraa distribuiçãode spin em relação ao campo magnéticoexterno.

um pacote de spins que se oriente formando um ângulo 01 com o cam

po estático I ressona em I\, bem como o pacote de spins formando

ângulo 82 com H ressona em H2.

A distribuição de spin pode ser dada sobre uma esfera/ao, -mo mostra a figo (1Gb). Os pacotes de spins são representados p~

Ias faixas escuras da figura.

De maneira semelhante, o espectro de pó pode ser pensado

corno originado de urna coleção de monocristais muito pequenos, cada

um ressonando em um valor de campo magnético. A distribuição dos

rnonocristais pode ser feita sobre a superfície de uma esfera, sen

do que cada monocristal contribui para o sinal total. A componen-

te de cada monocristal pode ser dada por:

1 [2]1/2 2 2Fk (H, e , rp ) '\, - - e xp { - 2 (H- Hk (e , rp )) / À } •o o \ . o o/\ ir

(47)

sendo 8 e rp as coordenadas polares que descrevem um setor da eso o

fera, Hk é o valor do campo de ressonância para o k-ésimomono-

cristal, À é a lar9ura da distribuição entre os pontos de máxi.mo

e mlnimo da derivada.

Os spins "sentem" não só o campo magnético externo, mas

também o campo devido a núcleos próximos.

A superposição, poderada, das componentes, sobre

os núcleos no monocristal é dada por.

todos

F(H,8 ,~ ) =o o Fk(H,8 ,~ ) Ik(S ,~ )o o o o

35

(48)

. r···

sendo Nk o fator de normalização, e Ik é o valor da intensidade

da linha devido ao k-ésimo núcleo.

Para uma amostra policristalina, a soma de todas as su-

perposições, sobre uma esfera conduz ao espectro de absorção:

F(H) sen 8 F(H,8 ,~ )o o o(49)

No programa para simular o espectro de pó, desenvolvido por Lefe­

bre e Maruani (36), a forma de Fk pode ser gaussiana ou lorentiana

(Apêndice I).

36

CAPITULO 11

MATERIAIS E ~TODOS

1. ~aração dos M~rcadores de s~

O marcador de spin 2,2,6,6-tetrametil-piperidina-l oxil

(TEMPO) foi obtido utilizando o método descrito por Rozantrev( 5 ),

que consiste na oxidação do precursor 2,2,6,6-tetrametil-piperid~

na obtido da Aldrich Chem. Co.

Os marcadores 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-piperidina-l

oxi l-per-denterado (PD-TEMPOL) e 4-maleimido-2, 2,6,6 - tetrametil­

-piperidina-l oxil (NEM*) foram obtidos da Merck Co. e Aldrich

Chem. Co. respectivamente.

Solução estoque desses marcadores foram preparadas di­

luindo-se o NEM* em acetona e os outros marcadores em metanol. Es

sa solução foi usada em amostras líquidas. Solução estoque de TEM

PO diluída em sulfato de amônia 4M foi usada para marcação das

monocristais. Na figo 11 as estruturas dos marcadores são mostra-

das.

2. preparação das amostras

Solução de Hemoglobinas (Hb) A e S, foram obtidos de

sangue de portadores homozigotos dessas esp~cies de hemoglobinas.

O plasma foi retirado e em seguida centrifugou-se as hem~ceas v~­

rias vezes em soluçâo salina isot6nica (0,9% de NaCl), aspirando

o sobrenadante e desprezando-o. Os eritrocitos assim obtidos, fo­

ram lizados por congelamento, e as membranas separadas da solução

de hemoglobina, por centrifugação ã 20.000 rpm por 40 minutos. A­

pós essa etapa, o sobrenadante (solução de hemoglobina) é aspira­

do e utilizado, sendo desprezadas as membranas.

37

OH

oI•O

I 11 111

Fig. 11 - Marcador de spin usadas nesse trabalho:I - TEMPO;-11 - PD-TEMI?OL111 - TEMPo-MALEIMIDA(NEM*)

Soluções de mioglobina de baleia (Mb) e lisozima foram

preparadas dissolvendo essas proteínas, adquiridas da Sigma Chem.

Co. em tampão fosfato 0,05M pH 7.0 de modo que as concentrações

das soluções ficaram em torno de 10%.

A marcação das soluções de hemoglobina com TEMPO e PD-

-TEMPOL, foram realizadas de acordo com o seguinte procedimento :

uma alíquota da solução estoque do marcador em metanol, foi seca,

sob fluxo de N2' e posteriormente diluída por adição da solução

de proteina. A concentração final de marcador foi de 2 x lÓ-4M no

-4caso de PD-TEMPOL e 8 x 10 M no caso do TEMPO.

A marcagem das soluções de hemoglobina, mioglobina e l~

sozima com NEM*, foram realizadas como segue: uma alíquota do mar

cador em acetona, foi seca em fluxo de N2, e diluída posteriormeg

te, adicionando a solução de proteina. A reaçao do marcador com a

proteina foi feita à temperatura de 40C, por 48 horas, sob agita-

ção constante. O excesso de marcador foi retirado, passando a so-

lução de proteina com marcador em uma pequena coluna da Sephadex

G-25,que é centrifugada, como descrito em(37,38). Desta maneira a

38

concentraçao da proteína marcada praticamente não se altera.

Monocristais de Hb - Cristais de Hb foram crescidos à temperatura

ambiente, pelo método de Perutz(39), utilizando solução prepara-

da com 2 volumes de K2HP04(4M) e 1 volume de NaH2P04(4M). Os mono

cristais assim obtidos são tetragonais e têm a forma externa de

bipiramides, e pertencem ao grupo cristalográfico P4121 ( 40, 41),

com quatro moléculas por cela unitária, e eixo C coincidente com

o eixo maior da bipiramide.

Os monocristais foram marcados por difusão, incubando-

-os em solução concentrada de sulfato de amonio, contendo o marc~

dor à 4üoC, por um tempo suficiente para que os monocristais apre

sentassem final tratável.

Depois do período de incubação, os monocristais foram

lavados em solução de sulfato de amonio, para remover os marcado-

res na superficie do cristal.

Amostras poli cristalinas de Hb foram obtidas secando os

monocristais, previamente marcados com TEMPO, sob fluxo de nitro-

gêniO seco, e então triturando-os e secando novamente. Devido~a

baixa pressão de vapor do marcador, a secagem a vácuo não foi rea

lizada.

Amostras liofilizadas de mioglobina e lisozima

marca das previamente com NEM*, e Hb marcado com TEMPO e PD-

-TEMPOL foram obtidas em liofilizador construido juntamente com o

Prof. Márcio Francisco Colombo no Campus da UNESP em são José do

Rio Preto, cujo diagrama é mostrado na figo (12), e cujo fundamen

to físico é a sublimação da água de microcristais da proteina, que

ocorrem abaixo do ponto eutético da solução.

Amostras de lisozima e mioglobina em diferentes

graus de hidratação foram obtidos através da secagem com -

pleta das proteínas liofilizadas, seguida da hidratação gradual

39

em soluções salinas concentradas, de umidades conhecidas. A quan-

d ~ b . ~ ;:]~t . d . t' (61 ,62)tida e de agua a sorvida e \...t ermma a gravime ricamente .

Compress0L-de gás -

a~Valvulo I

vacuoBomba-de vacuo (mecânica)

B

Condensador

A

Dessecador

Amostra

Fig. 12 - Esquema representandoas partes principaisdo liofilizadorconstruído. A é urnacâmaraonéE é colocadaa amostra,B é um "trap" Parãágua. Este "trap"é refrigeram por um compressorde geladeira. Osistemaé ligado a uma lxmIDade vácuo (rrecânica).

3. Medidas de RPE

Os espectros de RPE convencional foram obtidos em um es

pectrômetro Varian modelo E-I09. Para medidas de variaçao angular

dos monocristais foi utilizada cavidade cilindrica Varian E-233 •

Nessas medidas, utilizou-se potência de 10 mW e campo de modula-

ção de 1,6G., e frequência de modulação de 100 Khz. Espectros de

variação angular foram obtidos também, com ponte de microondas em

banda Q. Para essas medidas, os monocristais foram colocados na

extremidade de uma haste de cobre, encapsulada com uma luva de te

40

flon, com uma gota do líquido mae, para evitar que os cristais se

cassem e sofressem danos. A extremidade dessa haste metálica,..e

inclinada 15° com a horizontal. Esse ângulo é idêntico ao formado

entre as faces do cristal e seu eixo maior, permitindo dessa ma-

neira, mesmo sem usar goniometro, que o erro na orientação dos mo

nocristais seja pequeno.

Espectros de variação angular à temperatura de N2 líqu~

do, foram obtidas utilizando criostato, cuja construção está des­

crita em (42) • Nessas medidas, foi muito importante congelar pr!

meiro a amostra, e só depois então fazer vácuo no sistema. Este

procedimento evita que os cristais sejam desidratados e danifica-

dos.

As medidas de variação térmica de monocristais, solução

e amostras policristalinas e liofilizadas, foram obtidas com cav~

dade retangular Varian E-248, munido de acessório controlador de

temperatura Varian E-257. A temperatura foi monitorada com Termo-

par cobre-constantan, conectado a um potenciômetro Fluck. A prec!

são das medidas foi de ± O,sOe. A potência usada nessas

foi de 2 mW, e campo de modulação de 1,O G.

medidas

Os espectros de transferência de saturação foram obti-

dos, primeiro ajustando a fase do sinal do 29 harmônico obtido com

campo de modulação de 5,OG, modulação de 50 KHz e detecção de

100 KHz e 1800 defasado em relação ao sinal de RPE convencional e

1 mW de potência. Esse ajuste de fase é realizado, minimizando o

sinal da própria amostra (self-null) (35), isto é, usando potência

baixa, lmW, onde não ocorre saturação do sinal. Os espectros são

obtidos com os mesmos parâmetros, do espectrômetro, utilizados no

ajuste de fase, mas com potência de 63 mW.

Para os espectros de ST-RPE de Hb liofilizada .,marcada

com TEMPO e PD-TEMPOL, os espectros foram obtidos também na potê~

cia de 30mW, e o ajuste da fase foi feito com potência de O.lmw

41

uma vez que a baixa temperatura a amostra satura mais facilmente

(TI é mais longo).

4. Análise dos Espectros

4.1. Ajuste das curvas de variação angular

o àjuste das curvas de variação angular dos marcadores

em monocristais de Hb , foram feitas através do método descrito

( li )por Farach e Poole .

Este usa as funções descritas nas equações (44)e (45)p~

ra gerar as curvas da dependência angular:

2 2 2 2 2g(O) = p, cos O + Q. sen O + 2 N. sen8 cosO (44)111

2 2 2 2 2K(O) = pl, cos e + Q'. sen O + 2 N! senO cose (45)111

onde: i = 1,2,3, correspondeaos 3 planos geradospela rotação de Eu-

Hr

ler para o

valores de

. - 2cr1stal, P. sao os valores de g1g2 para e = 900 ambos medidos dos

em e = o. Q. sao os1gráficos de H x e. N.1

é um valor tentativa, e corresponde àquele que dá o melhor ajus-

te entre as curvas teórica, gerados com equações (44) e a exp~

rimental. De maneira similar são obtidos os valores para P!, Q!.1 11e N'i.

Esses valores nos três planos, determinam uma matriz

que corresponde ao tensor g2 não diagonal, mas simétrica.

A diagonalização da matriz g2, conduz aos valores dos

três componentes principais do tensor g2

( 2OO

gxx

2Igdiag =

Og~x

O= R g2 R-I =

O

Og~x

42

~2=Q3J N3N2

= R I

I~)3 ::Q1JN1

-1( 46)N3

R

N2

NlI~1::Q2J

onde: R ê a matriz dos cossenos diretores do sistema de coorde-

nadas eristalográfico abe, em relação ao sistema de eixos princi-

pais xyz fixo na mol~cula de marcador.

De modo similar, a matriz K2, construida com os valores

p~, Q~ e N' da equação (45), fornece a matriz na diagonal A2, quan1 1" -

do operado ã esquerda e a direita com a inversa da diagonal, como

segue:

N'3

N'2

N'3

N'1

N'2

N'1 ( 47)

e a matriz A2 pode ser diagonalizada por um processo idêntico ao

descrito acima

( 48)

onde RI ~ a matriz dos cossenos diretores do sistema cristalográ-

fico abc, em relaçâo ao sistema de eixos principais xyz, fixo na

mol~cula do marcador.

4.2. Análise de Espectros Rígidos

A análise dos espectros rígidos foi realizada atrav~s de

simulaç~o dos espectros de radicais paramagn~ticos diluidos em ma

triz rígida. Essa simulaç~o ~ necessária para se obter as com-

43

ponentes dos têrmos magnéticos do marcador em diversas soluções,

e compará-Ias com os valores obtidos da variação angular. O méto­

do usado nessassimulações é o proposto por Lefebvre e Maruani (36)

que consiste basicamente da suposição de uma distribuição gaussia

na ou lorentzianas de spins ressonantes sobre uma esfera ou parte

dela. O sinal de RPE neste caso corresponde à soma de todas as

f '

possíveis orientações obtida através da integração que é

usando a regra de Simpson. Os limites desta integração

da orientação dos tensores g e A.

feita

dependem

No apêndice I o programa usado neste modelo está apre-

sentado. Como pode-se notar neste caso não existe nenhum movimen-

to dos radicais nitróxidos.

4.3. Análise dos Espectros na regiáo deestreitamento devido ao

movimento.

Essa região de movimento é caracterizada pela simetria

das linhas hiperfinas externas em relação à linha central(44). De

acôrdo com Carrington e MCLachlan(12), as linhas individuais nes-

sa regiao, são lorentzianas. As análises dos espectros nessa re-

gião do movimento foram realizadas baseada na teoria de estreita­

mento devido ao movimento desenvolvida por Redfield(22) e Freed e

k (23) - ~Fraen el . Nesse caso, dos espectros de RPE e posslvel obter-se

diretamente parâmetros que determinam o tempo de correlação.

4.3.1. Análise através da largura de linhas.

A largura das linhas hiperfinas para um radical em solu

ção está relacionado com as densidades espectrais para frequ~ncia

- 1 (23,15 )seculares, nao seculares e pseudo secu ares, eXlITO nostrado em

e para o movimento isotrópico, é dada por:

2L'lH(m)= A+ Bm+ Cm (49)

44

onde os m são as projeções do momento magnético nuclear na dire-

ção z, ié, m = O,±l, e 6H as larguras de linha pico a pico, medi-

das dos espectros. Os têrmos B e C, são definidos em relação•.a

largura central e das amplitudes da m-ésima linha hiperfina, como

segue:

(5 O)

c = 1. l1H2 o (51)

Uma outra maneira de se definir os parâmetros B e C

através das den sidades espectrais como nas equaçõE~s (40-b, c) .

~e

o

uso das equações 50 e 51 contém um erro na determinação de

devido ao alargamento não homogêneo de protons. As equações (41-b

e c) também contém um erro uma vez que os tensores g e A são de-

terminados com imprecisão especialmente devido a pouca resolução

na região central do espectro rígido. Devido a esses erros as cons

tantes B e C são aproximadas por (45).

(52)

C = O, 18 x 1O6\-(L'1 a)2 + 3 (Lia)2] (j (o) - ~ j ([u) - i j (w e) J

- (53)

onde Lia, 6a, Lig, 6(g) e j(w) foram definidos no capitulo anterior

para as equaç6es (40-a,b,c).

As componentes do tensor hiperfino, medidas em Gauss, e

as do tensor g são determinadas da simulação do espectro rígido ,

(J)a= 8,8 x 106 aN e aN é a constante de desdobrament~o isotrópico

medido diretamente do espectro e [0 = 2 TI \! , sendo que \! é a fre-e e e

45

Dessa maneira, obtém-se um valor de tempo de correlação

para o parâmetro B (TB) e um tempo de correlação para o parâmetro

C (TC) que podem ou não serem iguais.

4.3.2. Medida da largura de linha

A linha central do espectro de RPE, foi registrada com

varredura de 10 G.

o erro na medida é de 3 centésimos de Gauss. A modula-

ção usada foi menor ou igual à um décimo da largura de linha pico

à pico. Esse campo de modulação, não deve introduzir alargamento

devido à sobre modulação (46)• A potência utilizada foi de lmW,

bem abaixo da potência necessária para maximizar o sinal.

o estudo da forma da linha foi feito por simulação, u-

sando um programa que gera linha de forma lorentziana e/ou gaussi

ana.

4•3.3. SimUlação dos esp'ectros

Simualação dos espectros com tempos de correlação nas

regiões de movimento rápido e intermediário foram realizados atr~

vésdo método proposto por Freed e cols (29) para o qual foi

desenvolvido programa pelo Dr. C.F. Polnaszeck, (ApêndiceslI. III).

5. Análise dos Espectros de ST-RPE

A análise dos espectros de RPE, usando a técnica de

transferência de saturação, foram realizadas, através de medidas

dos parâmetros definidos nos pontos de retorno e nas regiões en­

tre os pontos de retorno, como definidos por Thomas e cols(3S).

Na região de campo baixo e central, os parâmetros usa­

dos sao: L"/L e C'/C respectivamente, sendo L", L, C' e C são de-

finidos na figura (13) a seguir:

BIBLIOTECADO iNSTITUTODE F!S!(A E aulMICA DE SÃO (ARLOS. usr

FIS/CA

h'L

1.5,-- ~Ib)

101 /r~4'~/0

~J'O0.51 \. ' o

"••••. o r/ A '

O j.* . j, )"'=--.10..8 --r----r---10-r. -I()-" .--f

7:2 IsecJ. 10"2

C'C

----I.Or-·~-- ----1<1

o

__-11-- - - •. - -- -- -;"-

,~ ~j~20L~~-~-~;: ;'-~.

IO~' ~- ~~r . ~~10-6 -::t" -- r-//0-2 00

H"H

•

46

Fig. 13 - Curvas de calibração_dos parârretrosrredicbsnSB espectros de ST-RPE(35)e teInpJsde mrrelaçao mrrespondentes. ExtralCb de Thomas e e mls

A posição de L" ~ definida arbitrariamente, e neste tra

balho foi usada definição de Robinson e Dalton(47). L" está há

1/3 da distância entre L e a região m~dia dos pontos de intercâm-

bio entre componentes x e y dos tensores g e ~ na região central

do espectro. Usando as curvas de calibração de Thomas e cols(35 )

apresentadas na figura abaixo, podemos ver como os parâmetros me-

didos experimentalmente mudam em função do tempo de correlação Te.

47

CAPITULO III

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

1. Variação Angular em monocristais à Temperatura ambiente

Os espectros de variação angular do monocristal de he-

moglobina S, marcado com TEMPO, em algumas orientações, nos pla­

nos ac e bc, são mostrados nas figs. (14a,b). Nota-se, dos espec-

tros, a existência de três populações de marcadores, com estrutu-

ra bem resolvida na região de baixo campo, mas com má

na regiao de campo alto.

Da análise dos espectros de RPE e da variação angular

Hx 8, não foram observadas diferenças entre monocristais de HbS e

HbA marcados com TEMPO. Por isso a análise dos parâmetros foi fei

ta em detalhe para cristal de HbS.

Dessas três populações, duas são anisotrópicas, ao pas-

so que uma terceira, apresenta comportamento isotrópico. A rela-

ção entre as intensidades do sinal isotrópico e dos anisotrópicos

é de 3:1 em boa parte das orientações. Em algumas orientações, e~

tá presente uma quarta população, mas sua intensidade é muito pe-

quena em relação às demais e além disso devido as linhas serem

largas a resolução não é suficiente para acompanhar o seu compor-

tamento angular. Esse sinal não foi analisado em detalhe.

A constante de acoplamento hiperfino para o sinal iso -

trópico, medida nos espectros é de l6,5G e g. = 2,004.1S0

As figs. (15a,b,c) mostram os pontos experimentais e aju~

tes teóricos das dependências angulares de H x 8 nos três planos

cristalográficos. As curvas, cheias, das figuras foram obtidas a-

través de ajustes das equações (50) e(51), para os tensores g e A,

usando o método dos mínimos quadrados.

Esses ajustes fornecem os valores das componentes dos

I

raI\

I

I I

II

I

I

I

i

~

!

I

I

I

II

, \I \f'- +900I

IIf \II I ,II

I

I

Ir-I

!

~

I v \ -1_ \ f\ J

-

~ +300

I

\

- I I11 I

-100

'-----.-----------.--.----------.----------------------.----_._---------~

Fig. 14a

49

•

•

•

•

•

•

Fig. 14b

Fig. 14 ab) - Espectros de funocristal de HbS. (TEMPO,banda X,

para algumas orientações: ~, no plano ac, e ~,no plano bc.

50

Hc------

10 G

DPPHHo Cr

xe,II li A•

1/'\2 r•'\1

I' \,\

e

eto \

e

•

e

e

e

\~ le'

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•• I. I

•

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•

•

-50

-€O

10

20

-30

-40

40

50

-70

30

-20

-10

o

e 90 l80 lI

70 -I

60 -1I

3401 G

Fig. 15a

a

Cr

I

10 G

o

o

,

•

,,,

\ :II.II'

X/.. , ..{ \.

••

•

••

o

Ho DPPH

: 1'\ I •

• I •

•

o 90 l80170 -

60

50

51

b

H

•

•

, -----------i10 G•

••

2

2

••

:3410 G

Fig. 15c

Ho OPPH\.,1 C

'\ 1'1 \1 ';' '\

~

· " [I" · V

• I ( •. I I 12 • ~.1. I r I \ •

/ •

o

10

20

40

30

-60

-70

-80

-90

70

60

50

-10

-20

-30

-40

-50

e 9080

Fig. 15 abc) - Pontos experirrentais e aj ustes de Hx8, (linha cheia) ,

obtidos para rronocristal de HbS-TEMPO,~, plano ca,

.e., plano ab e !:., plano bc.

52

tensores g2 e A2 no sistema de coordenadas cristalográfico abc.

Nesse sistema s~o montadas as matrizes (52) , que diago-

nalizadas pelo método de Jacobi, fornecem os valores diagonais p~

ra o tensor g.

A matriz do tensor g2 no sistema abc obtida desta forma

é a seguinte:

2 _gabc -

4.0127

-0.004

0.004

-0.004

4.0148

0.008

0.004

0.008

4.0149

Diagonalizando esta matriz obtemos a matriz do

g2 diagonal no sistema principal xyz:

tensor

2 _

gxyz -

4.0120

O

O

o

4.0240

O

o

O

4.0320

e também as matrizes dos cosseno diretores utilizados para diago-

1, t' 2na lzar a ma rlZ g

zyx

a

[ 0.520

-0.8540.002

b

0.6050.3700.704 I = Rg

c

-0.602-0.3650.710

A matriz que diagonaliza os tensores g2 e g e a mesma.

Por isso os valores principais do tenso r g são

das dos valores de g2 , ou seja:xyz

gxx = 2 , O O 8 ± O, O O 1

g =2,006+0001yy - ,

gzz = 2,003 ± 0,001

gi so = ~ ( gxx + gyy + gz z] = 2 , O056

as raizes quadra-

53

Através da matriz diagona1 g e da matriz K2, obtida dos

ajustes usando (51) obtém-se os valores principais de A. A matriz

do tensor A2 no sistema abc obtida foi a seguinte:

T

21.197

15.241

-16.984

15.241

18.623

-13.257

-16.984

-13.257

21.204

Diagonalizando essa matriz obtém-se A2 diagonal:

[ 50.815

A2 = Oxzy

O

o

3.612

O

o

O

6.597

A matriz dos cossenos diretores que diagonaliza a matriz

C \ -0.588

a

b

z

0.610

0.531

y

0.792

-0.385

0.474

x

-0.025

0.755

0.655= RA

Os valores principais do tensor A obtidos de forma análoga ao g-

sao:

A =7,6G ±1,0 Gxx

A = 10,4 G ± 1, O GyyA =28,5G±1,OGzz

A. = a = 1. (A + A + A 1 = 15 4 G1S0 3 xx yy zz. '

Os eixos principais do tensor g são: z na direção do

orbi tal 2pn, x paralelo à ligação N - O, e y perpendicular à x e z.

Os ângulos formados entre as componentes de g e A sao

dados pelo produto escalar entre os componentes dos eixos princi-

pais obtidos das metrizes Rg e RA• No nosso caso ternos:

54

gxx - AXX = 86,40

g - A - 88 °yy yy - ,2

g - A - 10 ozz zz- ,5

e sao mostrados na figura (16

A gzz zz\

\

\

\

/gxx

\

\

\

\

\

rroo\

\•\

\

\

\

\

\

\\

86,4° ------Axx

Fig. 16 - Orientaçãorelativaentre os eixos principaisdos

tensoresg e A.

A fim de melhorar a resolução na regiao espectral do

campo alto foram realizadas medidas em banda Q. Na figo ( 17 )-

sao

mostrados os espectros de RPE para algumas orientações no plano

ac. Esses espectros mostram uma maior separação das linhas corres

pondentes a Mr= -1 em relação ao resto do espectro e também uma

melhor resolução na região central (Mr= O) em relação aos espec-

Fig. 17 - Espectros de rronocristal de HbS.-TEMPO, bandaX para

algumas orientações do plano ac.

55

56

tros em banda X. De uma maneira mais clara as diferenças em rela-

ção a banda X podem ser observadas nos gráficos da variação angu-

lar nos três planos cristalográficos (figs.18 a,b,c). Nessas fig~

ras nota-se claramente que o.sinal isotrópico deslocou-se para

campo baixo, isto é, para valores de g maiores. Isso faz com que

os sinais anisotrópicos em campo alto fiquem bem separados do si-

nal isotrópico. Esse efeito deve-se ao fato de que em banda Q a

separação em g é maior enquanto que a separação hiperfina não de-

ve mudar (em comparação com o valor em banda X). Desta forma po-

de-se ver claramente que g. - g . > O. Por outro lado a passa­1S0 an1SO

gem de banda X para banda Q produz um alargamento nas linhas de

RPE que no nosso caso já são bastante largas em banda X. Devido a

esse efeito a resolução dos sinais anisotrópicos em alto campo-e

pior do que em banda X. No caso de linha central (MI = O) a separ~

ção do sinal isotrópico dos anisotrópicos também fica bem eviden-

te. Por outro lado a variação angular nessa região espectral dos

sinais anisotrópicos é relativamente pequena sugerindo que a ani-

sotropia do g é muito pequena e/ou que o alargamento das linhas

é comparável com essa anisotropia impedindo uma maior resolução .

Finalmente a componente de campo baixo (Mr=+l) praticamente nao

muda passando de banda X a banda Q.

A constante de acoplamento hiperfino para o sinal i60-

trópico neste caso é 15,75 gauss e g. = 2,010.lS0

As variações angulares em banda Q foram ajustadas de ma

neira análoga ao caso de banda X. Os valores principais para os

tensores g e A obtidos são:

g = 2,005 ± 0,001xx

gyy = 2 I O O 4 ± O, O O 1

gzz = 2,004 ± 0,001

giso = ~ (gxx+ gyy+ gzzJ = 2,004

A = 10 16 ± 2 gaussxx

A = 13,7 ± 2 gaussyy

A = 30,6 ± 2 gausszz

1( IA. = -3 A + A + A J = 18,3 gausslS0 xx yy zz

57

G

100-lHO

90-

••• •o•80-

••• •• ••70-

••••• ••80

• ••• • •50

• ••••• •

60~

• •• •• •50

• • ••a20

• ••• •

10-'

• •Ir

,I'O

tI

-I~jI ,•, , •

••

.. ~.•

~ .:

•I -?O-i

"•• •• •<. I

-30-1•••• •••• •

·40J•••• • • •

I

~ .-50 " 10 G11• • "• • •••

-60-'•• t;••• •

u __ b-70 '

•••• •-80--i

•• •

-90-L

••• ••-100- --

.---------....-.-_. u ____ ~._

•• --------~ --- ._-,-H12560 G

Fig.

18a

elHO100 90

•• • .,.•••80

•• •••• •70

••••••• ••60

• • c• • •50

•• •••• •40

•• ••• •30

•••• ••20

• •••• • •10

•••• •o

••••• •-10

••• ••-20

••• •• •-30

•••• • •b

-401-------<••••• • •

-5010G• •• • •

-60• •• •

-70•• •• •••• •

-80•••• • •

-90• •• •••

100--------__.___-A. ___________________lL.._--•

H12560 G

Fig.

18b

58

oHo

1100•

:~•

90• •••

j• •

80

••• •II • •

70

•••• • • I •60

•

:f•• • •

50

••• • "•_._c

40 lfi•• Ii I

30

•II ••

20

•••• • •

10-1

•

:f•• •••t

••

O -j

• •• • li

-IOJ•

••• •I

-20-j

• •• •

30-1 ·

••• •-40 •

•··50 iõG-'

__ o

••

..60-1 •

•I•• •I

.. -r 0--1

• •• I• •

-80 -l

• •• •• •

-90-1

•~ _____._-'.:IL._:

••

loo_L..-.."' ....• ---.. -- ._-_.. __ .,~.......-.-.--

1112560 G

Fig. 18e

Fig. 18 abe) - Pontos experimentais, obtidos das variaçocs angulres,

para o ITDnocristal de HbS. TEMPO, banda O, em algt.nPas

orientaçÕes. A linhas cheias representam o IlBrcador

isotrópiro~, plano ab, (.e/, plano be e(~), plano ae.

59

Como pode-se notar a anisotropia em g é muito pequena e

isto pode-se dever a má resolução sendo que os valores do desdo -

bramento hiperfino são maiores do que os valores obtidos em banda

x.

Considerando a imprecisão no vaIare medido de a. cer-1SO

ca de 1 gauss obtemos que a passagem de banda X a banda Q não afe

ta esse valor que é igual a a. = 16,1 gauss. Por outro lado g,ISO 1SO

aumenta de 2,004 para 2,010 ao passar de banda X para banda Q. No

caso do sinal anisotrópico temos que o desdobramento hiperfino mé

dio aumenta ao passar de banda X para banda Q enquanto que o va-

lor de g médio praticamente mantém-se ao mesmo.

Embora não tivessemos encontrado diferença no comporta-

mento dos monocristais de HbA e HbS marcados com TEMPO, um fato

muito interessante foi a constatação de anisotropia na depend~n-

cia angular para duas populações de marcadores. Considerando que

o marcador usado foi difundido no cristal, e não está ligado cova

lentemente.

2. Variação Angular à temperatura de N2 líquido

No sentido de estudar essa anisotropia na dependência

angular de TEMPO em monocristais, espectros foram obtidos à 770K.

Na figo (19), são mostrados espectros em algumas orien

tações no plano bc. ~ possível observar a presença de dois sinais:

um isotropico, intenso e que dá um espectro de pó, misturado a um

sinal ligeiramente anisotrópico, a resolução é prejudicada porque

a largura da linha do espectro isotrópico é muito maior que o de~

locamento das linhas devido à diferença em g para os dois marcado

res. Essa resolução pobre, impede que se faça o ajuste dos pontos

experimentais H x e .

Enquanto os espectros monocristal à temperatura ambien­

te tem largura de linha que varia de 3,O à 5,O G, os espectros a

60

j

""'~d ••.•~J

I

I~~I

I

I

Ii

II

I

--..../' ..•... ~Ii

I II I

l ~_~ ----~- --------------.--- ----------~

Fig. 19 - ESJ:Jectros do monocristal de HbS (TEMPO),em banda X, à 77oK, para

algumas orj entaçc1es do plano bc.

7,0

6,0

5.0

o

o

oo 0o

o

o

o

o

o

61

-r~

4.0

-100

c

L-1---L--~1-80 -60 -40

1

-20 o

00

0

00

0O B

I

IILL-L.II20

406080100e

Fig. 20 - Grãfiro da área sob a região de baixo carrpo, em ftm­ção de e, dos espectros de rronocristal de HbS-TEMPO,77~.

62

770K mostram que a largura da linha para a mesma orientação aumen

ta para 10,0 à 12,0 G, sendo essa mudança reversível, evidenciando

um processo de estreitamento devido ao movimento.

A variação angular da ârea aproximada, sob a li-

nha na regiao de baixo campo, para o plano bc é mostrada na figo

( 2 O ) •

A área sob o sinal foi calculada através do prod~

to da intensidade da linha em relação à linha de base pelo quadra

do da largura tornada na meia altura. Esse gráfico mostra um máxi-

mo próximo de C, indicando um maior número de marcadores nessa 0-

rientação, sendo que a distribuição é do tipo cos 28 •

o espectro para o monocristal à 770K, na orienta-

ção onde os sinais se sobrepoem, foi simulado pelo método de Le­

febvree Maruani (36) .

Apesar da má resolução na região central do espeE

tro, devido ao alargamento não homogêneo, e superposiçao nessa re

giao foi possível, usando forma de linha gaussiana, simular os es

pectros, e determinar os componentes dos tensores g e A:

gxx=2,008

gyy = 2,006

gzz = 2,001

giso = 2,005

A =6,OGxx

A = 7,3 Gyy

A =36,5Gzz

A. =16,6G1S0

Na figo (2la) é mostrado o espectro simulado pelo

método de Lefebre-Maruani, usando forma de linha gaussiana, e os

componentes de g e A acima, e na figo (21b) o espectro simulado

com o mesmo procedimento mas usando componentes g e A obtidos da

.......... ".'.' ." •....

.. ... .. .. ...• .. .. .. ..,. " .

63

FIG. 21a - Espectro rígido simulado(16) com par-ªmetros: g = 2,009, g = 2,006, g =

XX yy zz= 2, O01, A = 6 , 3 .(G ).~ A =- 7 , 3 (G)xx yyA = 36,5 (G) e forma de linha gaussi­zzana.

l.v

I

64

('

-/00.00---'.

-,---------r--- 0.00T

100.00

FIG. 21b - Espectro rígido simulado (16) usando

mesmos parâmetros obtidos da varia­

ção angular do monocristal à tempe­

ratura ambiente - forma de linha

gaussiana.

as ..•.clI

IIi

Fig. 22 - Espectros monocristal de HbS à várias tem­

peraturas em uma orientação qualquer.

65

T~

66

o••

17 .-

•••

•-fi)o

"Co-+-

.o'-O

-•

•o

o o o o

•

I o o!O

o o_-L.

20

o

1

30L_.__ .. _

40 T (OC)

Fig. 23 - Gráfiro da variação da área sob cada um dos três sinais na regÚlo .de

campobaixo, dividido pela área total à terrperatura inicial. Círculoscheios representam os marcadores anistrópioos (1) e (3) e círculos vazios ffi3.rcadoresisotropicos (2).

67

variação angular do monocristal à temperatura ambiente. ~ nítido

que, esse último espectro é bastante diferente do espectro exper~

mental.

Os valores das componentes dos tensores g são muito pró-

ximos, mas as componentes do tensor A mudam consideravelmente. O

valor médio da constante hiperfina para os espectros congelados

(A. = 16,6 gauss) aumenta em relação ao valor médio da constante1S0

hiperfina para o sinal anisotrópico do monocristal à temperatura

ambiente (A. = 15,4 gauss).1S0

2.1. Variação Térmica no Monocristal

Espectros do monocristal marcado, em uma orientação des-

conhecida, e para temperaturas entre lOoe e 40oe, sao mostrados

na figo (2L). Pode ser visto que o aumento de temperatura aumenta

a intensidade das quatro linhas, até a temperatura de aproximada­

mente 30°C. Para temperaturas maiores que 30°C a intensidade da

linha que possui desdobramento hiperfino de 16,5 G, portanto cor-

respondente ao sinal isotrópico, aumenta, ao passo que as intensl

dades das demais linhas diminuem, e para temperaturas maiores que

360e somente o sinal isotrópico é bem resolvido, sendo que as ou-

tras linhas praticamente somem.

° gráfico da área medida sob cada um dos sinais, é pro -

porcional à população de spins que dá origem ao sinal. A fim de

minimizar o erro causado pela variação do fator Q da cavidade, de

. d' . - t t (46) ~ d d .V1 o a var1açao na empera ura a area a curva, para ca a Sl-

nal, na região de baixo campo, em cada temperatura, foi dividida

pela área total em cada temperatura , e esse valor é mostrado

em gráfico em função de T (fig. 23 ). Para temperaturas maiores

que 30oe, a população relativa dos sinais anisotrópicos caem, i­gualmente, enquanto que a população relativa do sinal isotrópico

aumenta.

valores

68

3. Simulação dos espectros de TEMPO em Inonocristais de Hb à tem

Eeratura ambiente

Na tentativa de entender a diferença entre os

dos tensores g e A para o monocristal, obtidos nas duas variações

angulares (temperatura ambiente e 770K) os espectros à temperatu-

ra ambiente, foram simulados utilizando o método de Freed e cola­

boradores(28,29). Para essas simulações, foi escolhido o espectro

na orientação em que os três marcadores devem estar

obtido das curvas de variação angular (H x e) •

superpostos

Nessas simulaç~es, foram usados os par~metros do marca -

dor anisotrópico, obtidos dos ajustes da variação angular à temp~

ratura ambiente.

O tempo de correlação utilizado foi de 2 xIO-9seg. O nú-

mero de termos na expansão em funç~es ortogonais (Apêndice 11 ) ,

foi L = 14, e o valor de corte K = 6. Não houve diferença entre es

ses espectros e os obtidos com os mesmos parâmetros e L = 16 e K =: 6.

Devido ao tempo de computação envolvido foram usados L = 14 e K:::6

para todos os espectros.

Para introduzir uma correção na largura de linha, devido

ao alargamento não homogêneo, causado por estrutura hiperfina de

protons não resolvidos, foi introduzido uma componente de largura

de linha, invariante com a rotação, de 1,8G. Outros valores foram

tentados, mas o que forneceu o melhor ajuste foi esse.

A anisotropia nos espectros de RPE do TEMPO no monocris-

tal de Hb sugere que o sítio de ligação do marcador no cristal ou

a região que o marcador "vê" deve ser anisotr6pica. Esse fato, e

levado em consideração, supondo que o marcador de spin tem um ten

sor difusão rotacional anisotrópico. Na figo (24) são mostrados

os espectros simulados para vários valores de N = RIIIR 1 (RIi e R1

são as componentes paralela e perpendicular do tensor de difusão

rotacional) .

1

IX

,ti

x

x

69

0,00 0.00H( G ) 80.00

FIG. 24 - (-) Espectro experirrentalno plano ab, e

Espectros simulados (28) com parâme­

tros obtidos da variação angular ,

temperatura ambiente, com modelo de- -9

difusao por saltos T=2 x 10 s. e

(x) N=l,Oi (fi) N=3,O; (O) N=6,0

70

I

•.......................-J 00~ ..

r---. I ••

E~ I

~ I'-' I

r~~~I~

io

o

~~O

6• O•

o • •

.........................

o

..,~ -l---- ----,---------,-----'-----I---'·-T

·rGl.~r.l .r,'I.~r.l ·'JP.~r.l -32.r.lr.l -1".~Gl Gl.GlGl

X

,------r-------,,- --------, >-' <.r,)3<'. ~r.l 'IP. GlGl fi'l. GlGl fGL CC

FIG. 25 - Espectros simulados(28) com os parâ­

metros obtidos n~_ variação angular-9

temperatura ambiente, 1';:::2X 10 s.,

N=6,0 (o) movimento browniano,

6 - difusão livre (*) difusão por

saltos.

IOG -

ÔH=160G

ÔH-160G

ÔH=160G

ÔH=160G

16 GaussI •.

71

Fig. 26 - Espectros da amostra policristalina, marcada com

TEMPO,em várias te.rrperaturas.

Como pode ser visto dessa figo 24

72

, o aumento na anisq--

tripia do movimento (aumento de N) faz com que apareça uma ligei-

ra inflexão na região de baixo campo, ao passo que na região de

alto campo, entre as duas linhas bem resolvidas começa a S'Llrgir

uma terceira linha mais fraca. Em relação à linha de baixo campo,

quando se aumenta o valor de N de 1 para 15, a inflexão aparece

quando N = 6 e para valores maiores que N = 9,O, essa inflexão nao

aumen ta I mas os espectros ficam mui.to distorci<bs.

Como os tempos de correlação nessa faixa de movimento

sao fortemente dependentes do modelo de reorientação adotado, fo-

raro simulados espectros para três tipos de reorientação:

orientação browniana; b) reorientação por difusão livre

a) re-

e;

para

c) reorientação por saltos fortes. Na fig. (2 ~) são mostrados es

pectros obtidos com N = 6 e para os três modelos usados. Em rela-

ção à região de campo baixo não há diferença sensível entre os mo

delos mas na região de campo alto existe uma pequena diferença es

pecialmente nas regiões indicadas pelas setas nas figuras. Para o

modelo de reorientação browniana, não aparece uma terceira linha,

de intensidade muito pequena, como ocorre com os dois modelos de

difusão por saltos; esses modelos fornecem espectros que se asse-

melham muito aos espectros experimentais.

4. AJno'st:rasde Hh policris'talina's e 'liofilizadas

4.1.RPE convencional

Na figo (26) são mostrados espectros de amostras poli ­

cristalinas de Hb, em várias temperaturas, de 190C à -1200C.

Os espectros à 190C não são similares aos obtidos

amostras congeladas, mas, se assemelham à espectros de marcadores

que possuem movimento.

Para temperaturas de 19 à -400C,notam-se mudanças na fOE

ma da linha, mas para temperaturas menores que -400C, essas mudan

73

ças são muito pequenas, ou até mesmo ineperseptíveis.

Embora não haja mudança na forma de linha, para tempera-

o ~turas menores que -40 C, ha um aumento na constante de desdobra-

mento hiperfino observado, 2A • Um gráfico de 2A x T é mostradozz zz

na figo (27). A variação total em

-l20oC é característico de amostra

Para temperaturas menores

2A é de 8. O G. O espectrozz

congelada (espectro de pó).

o - ~-que -40 C, nao ha variaçao

.•.

a

na

largura da linha, medida na meia altura, em relação à linha de ba

se em ambas as regiões de baixo e alto campo. A medida da largura

de linha para a região de baixo campo tem maior precisão e por

esse motivo, nos outros experimentos, foram consideradas essas me

didas.

A medida da largura de linha em função da temperatura

mostra que o RPE convencional não dá informação sobre o movimento

na região de -120oe a -ssoe (figura 26).

No gráfico de Ahrreni us de 2A x 1/ T , mostrado na figuzz -

ra (2B) nota-se um ponto de inflexão em -23. oOe. No segmento de

reta, correspondente à temperaturas maiores que -23.0oe, o marca-

dor apresenta mudança significativa na forma da linha, e portanto

movimento de difusão rotacional, enquanto que para o segmento cOE... 0-

respondente a temperaturas menores que -23.0 e, o marcador nao a-

presenta movimento detectável pelos métodos convencionais 'de RPE.

Nessa região portanto, deve apresentar movimento residual.

O espectro à -150oe foi simulado pelo método de Lefebvre

e Maruani. Embora a resolução na região central do espectro fosse

pobre devido ao alargamento não homogêneo e à superposição nessa

região, o uso de forma de linha Gaussiana, simulou relativamente

bem o espectro experimental (fig. 29 ). Para essa simulação, fo-

ram usadas as seguintes componentes de g e A:

111, ••

2Azz

(G)

I -rI ,

70+----..~~-'/l~--I .1. ..I

I

>lll I ~

74

60 l··----r------ , .--r-.-----150 " iOO -50 O Toe

Fig. 27 - Grán co do desdobrarrento hirerfino 2A x T, para Xzz

solução aquosa de Hbe arrostra policristalina.

2Azz 10(G)

9

8

7

6

5

4

~r X X X X

/- .-e- -0- - --0- __ -0- -0--- - -0----0-•....•

••••.."..

~

~ L ....._,.. l....., ._L__ .. I ._..•..

3,5 4,0 4,:; 5,0 5,5 6,0_.L_

6,5 .---I/T XI03

Fig. 28 - Gráfico de Arrhenius de 2A x 1/1' para x-soluçãozz

aquosa e amostra ?Dlicristalina.

75

'.~.

l'-V/...,'<

".;,'

t~u;X

­u~·x'

•

~..•.zo'"m. ---.·r-'.m-.-- r

!í'I.II'" "HI. "'''' J.'. 'J'"I' ,-1'-·------1- ..._--" IIti.IJ'" "'.00 16.Gll3 3.!.IJiJ

EIXO - X

FIG. 29 - Espectro rígido sirnulado(16) com:

9 =2,009, 9 =2,006 e 9 =2,001,xx yy zzA =6,OG, A=7,4G e A =35,5Gxx YY" ..' , ZZ 'Forma de linha gaussiana.

76

gxx = 2,0088

gyy = 2, 0060

gzz = :2,0018

A =60Gxx '

A ==74Gyy ,

A = 35 5 Gzz '

A. = 16 6 G180 '

Os mesmos valores que foram utilizados na simulaçâo

espectro do monocristal à 77oK. O valor da constante hiperfina

praticamente a mesma que para o sinal isotr6pico.

do

~e

No sentido de saber se a variaç~o na constante de desdo-

bramento hiperfino em funç~o da temperatura (2A xT), ~ devida ã. zz

polaridade do meio, foram realizadas medidas de amostras liofili-

zadas de Hb marcada com TEMPO. Na figo (30) é mostrado o gráfico

de 2A xT para essas amostras, no mesmo intervalo de temperaturazz

que para a amostra policristalina. O comportamento das curvas e

parecido, embora, para a amostra policristalina, o valor de 2Azz

cai mais rapidamente com a temperatura, do que para a amostra lia

filizada.

Os espectros de RPE convencional para a amostra liofili-

zada, s~o muito semelhantes em forma de linha ao obtido para o p~

Jicristal, embora os valores de 2A sejam maiores que para o po­zz

licristal.

O gr~fico da largura de linha, medido na meia altura, p~

ra regi~o de campo baixo, ~ mostrado na figo (31).

A forma dos espectros em função da temperatura pratica -

mente nao varia, embora a largura de linha apresente urna pequena

variação t~rmica.

Para se saber se a contribuição para a variaçao na lar-

gura da linha de baixo campo é devido ao alargamento não homogê -

neo, medidas foram realizadas com amostra liofilizada de Hb marca

-N:i 75N

77

°A06O A

O

A

OO

O Ot:. 6

O OO OO4 4

70 ~•• A

4 O

•6

••• 6• •• •I

I•

65 r•

I IIIIII,

i60 ,_____---1. _______ L _____ L_____ "_________.L

,I--L--_I---L II-120

-110-100-90-80-70-60-50-40-;30-20-10oT, °C

Fig. 30 - Gráfico de 2A x T, para(o)Hb-PD TEMPOL0,12g/g (Ll) Hb-TEMPO0,12g/gzz

(.) anostra poli cristalina de Hb-TEMPO.

6

6

:t<J 10

9

8

7

6

6

6

AA

t.t.t.t.ââ

• •• •• • •• •• • • • •• •

5

o o oo o o o o

o o 00 o o o o oo o o

4[

IL ,__---L - - -503 -------- -100-150

jO

I40

T,oC

Fig. 31 - Gráfico da largura de linha na região de campo baixo L:ili x T.

(6.) amostras poli cristalina. ( .) Hb-TEMPO0,12 g/g. (o) Hb-PD-TEMPOL

0,12 g/g.

78

da com marcador deuterado (PD-TEMPOL). Esse marcador possui deu -

terons substituindo os protons do anel de piperidina e devido ao

momento magnético nuclear dos deuteronsser menor que o momento dos

protons, é de se esperar que as interações super hiperfinas com

protons diminua, causando assim menor alargamento não homogêneo.

De fato isso pode ser observado da figo (31). A largura

de linha para essa amostra é 2,5 G menor que a amostra liofiliza-

da marcada com TEMPO, na mesma temperatura.

o compOrtamentO do gráfico 2Azz x T , para Hb liofiliza­

da marcado com PD-TEMPOL, é mostrado na figo (3U) e é muito seme

lhante à Hb-TEMPO liofilizada.

Para avaliar a ordem de grandeza do movimento do marca-

dor, espectros foram obtidos atrav~s de t~cnica n~o linear de

transferência de saturação.

4.2. ST-HPE

Os espectros de ST-RPE foram obtidos à duas potencias de

63.mW e 30.mW sendo esta Gltima pot~ncia usada para evitar exces-

so de saturação, a baixa temperatura. O ajuste da fase foi reali-

zado com pot~ncias de 1 mW e O.lmW, respectivamente.

Observou-se que a fase do sinal do 29 harmonico 1800 com

o campo de modulação é fortemente dependente da temperatura. A c~

da temperatura é realizado o ajuste de fase (pelo método de "self-

-null" descrito no Capítulo 11). Um pequeno erro no ângulo de fa

.. ( 48)se, pode ocaSlonar grande erro nos espectros .

Comparando os espectros obtidos para Hb TEMPO liofiliza-

da, à várias temperaturas com o espectro à -150oC, totalmente im~

bilizado, pode-se concluir que com o aumento na temperatura, o m~

vimento do marcador aumenta (Tabela I) , mas mesmo assim o tempo

_ - ~ -4de correlaçao nao e menor que 10 . sego Isto pode ser constatado

através de medidas c10 parâmetro L"/L (Capitulo 11). O valor de

79

TABELA I

VALORES DOS PARÂMETROS EXTRAíDOS DOS ESPECTROS DE ST-RPE

iIb-PD-TEMPOL (0,12 g/g),

,/

T (oC)

* *L"/L

(63,OmW)LlljL(30rrW)c'/c(63,OmW)C'jC (30,ornW)

- 156

1,641,820,671,12

- 115

1,601,700,531,13

85

1,481,750,471,14

- 66,1

1,481,630,500,86

- 45,0

1,361,610,470,91

8,2

1,601,280,590,81

+ 22,9

1,551,200,290,69

Hb TEMPO(0,12 g/g)

T (oC)

L"/L (63,OmW)LIl/L(30,OnW)C'/C (63,0mW)C' jC (30,OnW)

- 81,3

1,602,200,600,86

- 50,8

1,571,940,580,84

- 23,5

1,32-0,35

1,8

1,101,350,230,71

Liof

-132

-113

-90,7

-71,1

-63,0

-54.2

-39,0

-33,0

-27,2

- 21,4

-17,5

-12,2

Mb NEM

LIl/L

1,43

1,31

1,31

1,10

0,96

0,93

0,88

0,79

0,79

0,74

0,73

0,69

SOL

C'/C

0,35

0,34

0,33

0,15

0,07

0,04

0,12

0,14

0,10

0,06

0,02

-0,07

Mb

-154, °-99,5

-83,5

-69,3

-52,2

-32,2

- 8,1

23,7

NEM

LIl/L

1,29

1,22

1,32

1,45

1,45

1,35

1,20

1,04

C'jC

0.,32

0,23

0,21

0,43

0,43

0,38

0,28

0,22

(*) L"/L é mais sensível à região de movimento lento enquanto asensibilidade de C l/C é maior para movimento mais rápido.

80

L" mantêm-se sempre maior que L, sendo que o valor de L"/L a tem­

peratura indicando taxa de movimento muito mais alta (230C) é de

cerca de 1,2. Comparando esse valor com a curva de calibração (f~

gura 13) vemos que praticamente não há movimento.

Resultados semelhantes foram obtidos para amostra de Hb

PD-TEMPOL liofilizada.

Na Tabela I os dados obtidos para L"/L em funç~o da tem-

peratura são apresentados para Hb liofilizada-TEMPO e Hb liofili-

zada-PD-TEMPOL.

5.

5.1.

Solução Aquosa

oTemperaturas menores que -22 C

Para avaliar a importância da polaridade do meio na va-

realizadosriaçao de 2A com a temperatura, experimentos foramzz

com solução aquosa de Hb, marcada com TEMPO.

Na figo (32) são mostrados espectros de solução aquosa

~ ~. d 200 ~ 12 ode Hb a varlas temperaturas, des e C a - O C. Notam-se três

regiões de movimentos: a) região de movimento rápido no intervalo

de temperatura de 30°C à -Soc; b) região de movimento intermediá-

rio; c) região de movimento lento, a temperaturas menores que

A análise das formas de linha mostram que da mesma manei

ra que para as amostras policristalina e liofilizada, a forma da

linha muda até uma determinada temperatura (-39°C), a partir da

qual, não há mudança perceptível. Da mesma maneira que

para as outras amostras, há variação na constante de desdobramen-

to hiperfino, com a temperatura, o que pode ser visto da fig. ('27)

que compara os comportamentos com a amostras policristalina e

solução.

o comportamento das curvas é muito parecido embora o va-

lor de 2A caia mais rapidamente com a temperatura, para soluçãozz

~Lj"~H:~

--·--2Azz

-39°C

-120°C

81

Fig. 32 - Espectros de Hb-TEMPO,solução aquosa, em várias

de - otemperaturas +20 a -120 c.

32

aquosa do que para a amostra policristalina.

Os gráfi cos de 2A x l/T em escala logarí tmi ca,Zz para

amostra policristalina e solução aquosa, são mostrados na figura

(28 ). A amostra policristalina mostra ponto de inflexão em -230C

- oe a soluçao aquosa em -40 c.

5.2. Temperaturas maiores que -J,Soc

Nessa região de temperatura, os espectros de ressonância

são constituídos por linhas finas, simétricas em relação à linha

central e são caracterizadas pelo estreitamento devido ao movimen

to. O estudo do tempo de correlação nessa região, permite concluir

com precisao, se o movimento do marcador é isotrópico ou anisotró

pico.

Para determinar os tempos de correlação das eqs.(50,5l )

é necessário conhecer os parâmetros do marcador. Isto foi obtido,

simulando o espectro da solução aquosa·à ~l500C. Da mesma maneira

que para a amostra poli cristalina congelada há um alargamento na

região central do espectro. Apesar disso, foi possível com o uso

de uma forma de linha gaussiana, simular os espectros, obtendo-se

um bom ajuste do espectro experimental, figo (33). O método usa­

do foi o de Iefebvre-Haruani (36) •

Os parâmetros g e A usados na simulação foram:

g - 2xx - ,008

gyy = 2.006

gzz=2,001

A = 6, 2Gxx

A = 8 OGyy ,

A =37,2Gzz

A. =17,lG1S0

O valor da constante isotrópica está muito próximo ao

valor do marcador na agua.

.~N

>-"","m

OC\lX·w

<.C

,o

\1.U)

83

'32.',\1) ·16.~0 ~.~~EIXO X

FIG. 33 _ Espectro rtgido simulado (36) com:

9 =2,008, 9 =2,006 e 9 =2,001,xx yy zzA =8,OG, A =6,2G e A =37,2G u-xx yy zzsando forma de linha gaussiana.

BIBLIOTECA 00 J)<iSm\J10 llE FiSKA E OU_1I. IDi SAO CAIU.OS • USP

flSlCA

C(G) I

0,1

•

84

0,01

x•

I(

x'x •

iJO

)( .•

0,1 I I

B(G) i

Fig. 34 - Gráfico de BxC,rredidos diretarrente dos espectros

experirrentais (x)e, calculados através das equações(52,53)(.), a pequena diferença entre os valoresde B e C calculado e e.xperirrental, se deve a queno valor calculado não foi levado ema:mta N = 1,5.

>

,,

f_t..,

.. ,..-. , . ............... .

••

........ ~•..........•.•... ,..

85

•

"'.-,

-50.00I , .1 I ,H(4)

. ~.'~ lI). f."~ ~7-.~'! 10.00

FIG. 35 - Esp~ct~o na região 4e movimento rápi~

do simulado com os parâmetros: 9 =...... JCX.

=2,008, 9 =2,006 e g ==2,001, A··; =yy zz ~ xx

=6 ,2G, A'i,l=l8, OG e AC=3'7,2G, N=4,0 ,yy zz'[=3,O x 10-11seg (o) difusão por s'al

tos, /).-difusão livre, (*) brownia-

no.

86

Numa tentativa de melhorar a resolução na região central

do espectro, foi usada numa amostra de Hb liofilizada, dissolvida

em água deuterado, mas isso não melhorou a resolução. Outra tent~

tiva sem sucesso aparente foi de abaixar a temperatura com o cam-

po magnético desligado.

Os espectros à temperatura acima de -3,SoC mostram linhas

finas, (1, 2G de largura) que não são lorentzianas perfeitas. O er-

ro na determinação da largura ou linha foi de 0,5% e na intensida

de foi de 1%.

Os cálculos de valores de B e C, através da largura in-

trínseca das linhas f silomostrados em gráficos de B x C ambos em

escala 10garItmica

de (60,61) variou de

(fig.34 ). O tempo de correlação,

-11 ~ -106 x ] Oseg a 2 x 10 seg.

determinado

A relação entre B e C obtida ficou no intervalo 1,2~ B /

C~1,6.

O valor dos tempos de correlação, dos parâmetros g e A ,

foram usados, para simular os espectros nessa regiao de movimento.

Para diminuir o erro devido à interação hiperfina de protons nao

resolvida, usou-se urna largura de linha residual de O,2G. Os me-

lhores ajustes aos resultados experimentais foram obtidos com-N(R///R1) = 1,5. Esse valor não é suficientemente grande para que

a anisotropia do movimento seja significativa. Nessas simuiações,

observam-se que para tempos de correlação dessa ordem, os espec-

tros independem do modelo de reorientação escolhido figo 35).

6. Estudos de Hidratação de Proteinas

A fim de verificar com mais cuidado o efeito da polarid~

de na variaçao de 2A com a temperatura foram realizadas medidaszZ .

experimentais de amostras liofilizadas e em vãrios graus de hidra

tação.

A fig. (36) mostra as curvas de 2A x T parazzlisozima

II

rSr0

0(\l

G

~

<::) 0 00• (:v ••e,~ 3• G

70 l x

x

x)( )( x

xx

o

•x •

X x x

37

40T. 0_

65 L -- ---- • --L.. ---L-- •-150 -100 -50 O

Fig. 36 - Gráfim de 2A x T, para lisozima marcada comNEM*.zz

(0) solução aquosa. (.) hidratação 0,45 g/g. (x) 0,07 g/g.

_h --.1 ..1... -1--so o 50

T.oc

s+ 64e

0J»

GA

:x: I

o c A

<l I

00806 6

!

0· 6

0te

i

5 r-

i

I

I

I

I

Io L ---

-150 -1(:)

~6~ 0 0 0600006 • 666,

6~

6•• •• • •

Fig. 37 - Gráfieü da largura de linha na região de campobaixo

lillXI' para lisozima - NEM*.( .) solução aquosa. (6) 0,45

g/g e (é) 0,07 g/g.

88

marcada com NEM*, nas Jmidades 0,07gH20jg proteína; 0,45gH20j g~ -

prote1na e soluçao aquosa.

A forma das linhas de RPE, convencional para as amostras

liofilizadas, são muito semelhantes à solução aquosa. Para

essas amostras as variações na forma de linha com a temperatu-

para

ra são muito pequenas, e nota-se que para temperaturas maiores que

0---50 C, ha urna melhor resoluçao nas componentes paralela e perpen-

dicular do tensor g (região central dos espectros).

° comportamento das curvas 2A x T são diferenteszz

as três amostras. A mais seca, tem comportamento linear com a tem

peratura, e sua variação total é de 1,OG. A amostra em solução

mostra comportamento semelhante à sOlução aquosa de Hb-TEMPO, e a

variação total em 2A é de 6,OG na mesma faixa de temperatura quezz

a amostra mais seca.

° comportamento da amostra com hidratação intermediária

0,45gH20jg proteína, é intermediário entre as duas amostras (seca

e aquosa). Sua variação em 2A , é de aproximadamente 2,OG, e azz

forma de curva 2A xT é mais semelhante à da solução.zz

As medidas de largura de linha, na região de baixo cam -

po, para as três amostras, são mostradas em gráfico contra a tem-

peratura figo (37). Corno pode ser visto, para temperaturas meno-

•

res que -800C, o aumento no grau de hidratação causa um aumento

na largura da linha. Para temperaturas maiores que -800C, um au-

mento no grau de hidratação, faz com que as larguras das

se tornem cada vez menores.

linhas

Experimentos de ST-RPE realizados para essas amostrasi~

dicam da comparação com o espectro totalmente imobilizado, e tam­

bém de comparação das formas das linhas, que não há aumento no mo

vimento com a temperatura. Na figo (38) e (39) os espectros de

ST-RPE para amostra de lisozima-NEM* totalmente hidratada (so-

lução) são mostrados em função da temperatura. As relações L"jL e

-149.5°C

-9,8°C

Fig. 38 - Espectro de RPEronvencional de lisozirna - NEM*solução aquosa - à várias t.errperaturas

Fig. 39 - Espectro de ST-RPE de lisozima - NEM*solução aquosa ã várias temperaturas. Para terrperaturas­rrenores que -9, 80e o rnarcador possui terrpo decorrelação maior que 10-5 sego

C9

90

;; 7J~ r ••••••~ I A A

•••

• e

A A

AA

A A

••••••••• A •••••· · . ·.A

65

,...L.-__ 30

.-. - - O T.OC-50

. ._" ....__._1-100

60-150

Fig. 40 - Gráfiro de 2A x T para Mioglobina rnarcada cnmNEM*.zz

(6)solução aquosa e (.) 0,12 g/g •

•(!)

r<J

10

5

A

A A

e e Ú Aee • A A• e A

• • •• Ae •••

4' A 6 ••••••• ••A AA

O30 T.oC

Fig. 41 - Gráfico de largura de linha thXI' para Mioglobina rnarcada

cnmNEM*.0.) solução aquosa. (e)0,12 g/g.

91

C'/C quando comparadas com as curvas de calibração (Capítulo 11),

- --4nao mostram movimento com tempo de correlaçao maior que 10 seg.,

com excessão da amostra líquida para temperaturas maiores que

Resultados semelhantes para o gráfico 2A xT foram ob­zZ

tidos para Mb-NEM* liofilizada (ü,12gH20/g proteína) e solução a-

quosa, bem como para soluç~o aquosa de Hb-NEM* e são mostrados na

(40) •

o comportamento de Mb-NEM* liofilizada é linear tal co-

mo da lisozima (O,07gH2ü/g). A variação total de 2A foi de 1,SGzz

e da Mb-NEM* solução foi de 4.0G. A curva de 2A xT para Hb-NEM*zz

(sol.) é do mesmo tipo que Mb-NEM* (sol.), e a variação total foi

de 3,SG na mesma faixa de temperatura. O comportamento da curva

de largura da linha com a temperatura é semelhante ao da lisozi­

ma: à temperaturas abaixo de -700C, a largura de linha aumenta e

é maior para a amostra mais hidratada, enquanto que para tempera­

turas maiores que -700c a amostra menos hidratada tem largura de

linha maior que a amostra líquida (fig. 41).

Apesar das variações nas larguras das linhas, a análise

dos espectros de ST-RPE não mostrou mudança no estado de movimen-

to sendo os tempos de correlação maiores-5

que 10 sego exceto para

- ~ osoluçoes aquosas a temperaturas maiores que -20 C.

92

CAPITULO IV

DISCUSSÕES E CONCLUSÕES

o processo de marcagem de monocristais de HbA e HbS, por

difusão do marcador, mostrou um aspecto ~astante interessante que

é a existência de sinais bastante anisotrópicos, em relação ao

campo magnético externo.

Outros pesquisadores ( 49), tem encontrado espectros bas-

tante anisotrópicos de monocristais de Hb, ligando um marcador co

1 ..•. (4,50, 51) . t . f' b dva entemente a protelna • Essa an1SO rop1a 01 o serva a

também com marcadores hidrofobicos em monocristais de a-quimotri­

( 42)pina \ .

A anisotropia observada da constante hiperfina é de apr~

ximadamente 22, OG [A - -21(A + A )J. O erro na determinação doszz xx yy

tensores g e A é relativamente grande e se deve principalmente po~

ca resolução dos espectros e ao erro na orientação do monocristal

no campo magnético devido ao tamanho e fragilidade do mesmo.

O fator responsável pela pouca resolução é o alargamento

das linhas, que é devido à: a) alargamento não homogêneo causado

por interação hiperfina, não resolvida, de protons intra e inter

moleculares; b) ao possível não alinhamento dos tensores g e A ;

c) anisotropia dos parâmetros magnéticos e d) um grau considerá -

vel de movimento dos marcadores.

· r·

Os parâmetros magnéticos dos dois sítios anisotrópicos

sao iguais, o que pode ser explicado pelo fato de existirem qua-

tro moléculas de Hb por cela unitária nesse sistema cristalográfi

co(41), com a unidade assimétrica constituída de duas moléculas.

Assim deve existir um lnarcador de spin por molécula de Hb, e como

existem duas unidades assimétricas na cela, dois sítios anisotró-

93

picos são observados.

A dependência angular dos espectros, para o monocristal

marcado, obtidos à 770K deveriam mostrar três linhas,razoavelmen-

te bem resolvidas, se o marcador estivesse rigidamente ligado•..a

prote!na. Isso n~o foi observado experimentalmente e somente duas

linhas estão presentes, uma mais intensa, bastante larga, e iso-

trópica, e uma outra, bem menos intensa e anisotrópicai o alarga-

mento adicional nesta temperatura torna a resolução ainda

que a temperatura ambiente.

pior

Alguns fatores contribuem para essa pouca resolução. O

fenômeno de alargamento devido ao movimento é bastante importante

aqul.

Quando a temperatura da amostra é abaixada os marcadores

têm seu movimento restrito ao redor de uma direção. Esse movimen-

to é muito lento em relação à escala de tempo de RPE, e o sistema

de spins é observado em um intervalo de tempo muito curto em rela

ção ao tempo necessário para que haja mudança na distribuição de

spins no sistema.

Esse sistema, no tempo de observação, se comporta como

se estivesse distribuído em um cone de ângulo sólido ~, sendo que

dentro deste cone, os diferentes pacotes de spin estão distribuí-

dos em orientações preferenciais, e à cada orientação corresponde

um valor do campo de ressonância. O espectro de ressonância, se-

ria portanto a soma das linhas de ressonância correspondente àca

da pacote de spin, sobre o ângulo ~. O efeito de abaixamento de

temperatura seria um aumento em ~ e portanto a um alargamento das

linhas de ressonância.

Quando a temperatura aumenta, o ângulo sólido Sl diminui,

e as interações magnéticas são promediadas pelo movimento. Os pa-

cotes de spin ressonam em valores muito próximos de campo, e, o

espectro observado é constituído, assim, de linhas mais finas. Es

94

se fenômeno deve ser responsável pelo alargamento das linhas, e

portanto, a pouca resoluç~o espectral, quando a temperatura é abai

.xada.

Nó hÓSso caso, os tr~s marcadores apresentam alargamento

devido ao congelamento. Os marcadores isotrópicos, quando congel~

dos se distribuem sobre uma esfera, ocasionando assim alargamento

das linhas da ressonância. Os marcadores anisotrópicos, ~ra não

estejam ligados covalentemente à proteína, provavelmente estão em

um sítio que restringe o seu movimento anisotropicamente. Nesse

sítio, eles já possuem liberdade de movimento ao redor de uma di-

reção. Quando são congelados se distribuem ao redor de um cone,

causando também alargamento das linhas, embora menor que no caso

do sinal isotrõpico. Em adição a esses Bfeitos de alargamento, as

intensidades dos sinais anisotrõpicos são menores que a intensida

de do sinal isotrõpico, contribuindo assim para que a resolução

seja diminuída.

O espectro obtido à 770K, na orientação em que os sinais

ese

se superpoem, é praticamente o espectro do marcadorisotrõpico. Es

espectro foi simulado pelo método de Lefebvre e Maruani (36),

os resultados indicam que as componentes do tensor A do marcador

isotrõpico são diferentes das componentes, de A, para o marcador

anisotrõpico, obtidos da variação angular. Os valores médios, das

componentes de A, nos dois casos são diferentes, mas isso nao~e

conclusivo devido ao erro na determinação das componentes de A em

ambos os casos, especialmente para o sinal anisotrópico.

A análise dos tensores hiperfinos mostra que a componen-

te maior do tensor A, do marcador isotrõpico (medido a 77 K) cujo

valor é 36,5 G é maior que a mesma componente para o marcador ani

sotrõpico (28,5 G). Ao mesmo tempo as componentes perpendiculares

dos marcadores isotrópicos (6,0 G e 7,3 G) são menores do que dos

anisotrõpicos (7,6 G e 10,3 G). Isto pode ser explicado pelo fato

95

de que no caso do marcador anisotrópico ocorre um movimento axial

e por isso 2A 11 < 2A enquanto que 2Al > 2A~ zz xx,yy

O elétron desemparelhado do radical nitróxido..

esta no

orbital rr* (antiligante), formado pelos orbitais 2pz do nitrogê -

nio e 2pz do oxigênio. Essa diferença nas componentes paralela, e

perpendicular de A, para os dois marcadores, indica que a densida

de eletrônica do orbital rr* para o marcador isotrópico é maior

que para o marcador anisotrópico, que pode ser explicado de duas

maneiras: a) pela diferença de polaridade entre os ambientes nos

quais se encontram os marcadores, ou b) porque'o sítio onde se en

contra o marcador anisotrópico tem simetria tal que distorce a nú

vem eletrônica do orbital rr* do radical nitróxido definindo por

exemplo um eixo de simetria aproximadamente axial.

Isto fornece uma explicação razoável para as mudanças

nas populações dos sítios anisotrópico e isotrópico, observadas

nos experimentos de variação térmica do monocristal.

A diminuição da população dos sítios anisotrópicos, e

consequente aumento da população do sítio isotrópico, para tempe­

raturas maiores que 300C, pode ser explicada levando em conta o

fato que o marcador no sítio anisotrópico sente uma simetria que

faz com que o orbital rr* esteja distorcido.

Estudos sobre a acessibilidade de solvente em hemoglobi-

. 1 b' (52,53) •.t . d .•..na e mlog o lna mostraram que os Sl 10S lsponlvels, para

solvente tem dimensões menores que a molécula de marcador (~).

É mais provável então que o marcador esteja na região de I contato

intermolecular, que tem espaço suficiente (54,55 ). Quando a tempe-

ratura aumenta, deve haver uma intensificação de interações hidr~

fóbicas, o que faz com que o sítio onde se encontra o marcador,

se torne maior, e o marcador deixe de "sentir" a simetria que des

torce a distribuição eletrônica no orbital rr* do radical e o si­

nal detetado seja idêntico ao isotrópico. Além disso deve ser fa-

96

cilitada a migraçao do bolso onde ele se encontra.

Isto explica também o porcesso de marcagem. Á 40°C, o

marcador é difundido no monocristal. Os marcadores que estão na

regiao dos contatos intermoleculares são aprisionados nessas re-

gioes, quando a temperatura abaixa. Devido à simetria própria do

empacotamento molecular, nesse sistema cristalográfico, o resulta

do ~ o sinal anisotr~pico observado.

O espectro simulado, usando os parâmetros do marcador

anisotrópico, obtidos da variação angular do monocristal, são bas

tante semelhantes aos espectros experimentais da variação angular,

na orientação em que os sinais estão bastante superpostos.

Apesar dessa semelhança, esses dados não são conclusivos

pois existem várias fontes de incerteza nessas simulações.

Dentre as fontes de incerteza que existem nas simulaçõe~

certamente a mais importante, provem da impossibilidade de obten-

ção de dados experimentais na região de movimento rápido. Veja-

mos de que maneira, os espectros nessa região auxiliam na simula--

çao .

Os dados de entrada para o programa que gera espectros

com movimento são (Apêndices 11 e 111): as componentes dos tenso-

res g e A, número de termos da expansão em funções ortogonais (L),

valor de corte para essas expansoes (K) , modelo de reorienta-

ção do marcador, tempo de correlação, largura de linha, largura

de linha residual, anisotropia do tensor de difusão rotacional

(N = RII IRl) já definido no texto. Desses parâmetros, as componen­

tes dos tensores g e A são determinadas da orientação do marcador

no monocristal (nosso caso), ou de simulação do espectro rígido ,

L e K , são definidos de maneira empírica (veja Apêndice 11)

largura de linha é obtida de espectros experimentais. Tempo de

correlação, largura de linha residual, e tensor de difusão rota -

cional são valores tentativos, mas que podem ser obtidos de manei

97

ra satisfatória se exi.stirem dados espectrais na regiao de movi-

mento rápido.

Nessa regiao, o gráfico em escala logarítmica de B x C

obtidos das equações (56,57 ), fornece o tempo de correlação(56) ,

e, a relação C/B fornece a anisotropia do tensor de difusão rota-

cional. Além disso, pode-se medir com precisão a largura da li-

nha, e por simulação uma das linhas dos espectros, pode-se deter-

minar a contribuição do alargamento não homogêneo devido às inte­

rações hiperfinas não resolvidas de protons(56} (largura residual).

Dessa forma para se simular um espectro na região inter-

mediária, pOde-se usar a mesma relação para N que foi obtida do

espectro na região de movimento rápido, diminuindo assim a incer-

teza na simulação do espectro.

o possível não paralelisrroentre os tensores Si e A contribui

para um erro de interpretação pois o programa utilizado (Apêndice

rrr) é desenvolvido na suposição que esses tensores sejam parale-

lo~.

Essas fontes de erro, não permitem que a comparaçao en-

tre os espectros simulados e experimentais sejam conclusivas.

Os espectros da amostra policristalina seca deveriam,~

do simulados, conduzir a melhores parâmetros do marcador anisotró

pico.

 temperatura ambiente os espectros dessas amostras têm

linhas largas. Com a diminuição da temperatura as linhas se tor­

nam mais estreitas (efeito produzido pela variação do tempo de re

laxação TI) e a separação hiperfina (2Azz) aumenta.

Essa variação em 2A pode ser devido a dois fatores prinzz -

cipais: a) diminuição do movimento do marcadori b) formação de

ponte de hidrogênio entre o radical e sua vizinhança.

A diminuição do movimento faz com que maior número de

marcadores tenham seu orbital 2pTI orientado paralelamente em rela

ç~o ao campo magn~tico externo, acarretando com isso um

gradativo em 2A com a diminuição de temperatura ... zz .

98

aumento

A formação de ponte de hidrogênio, ou a polaridade do

meio, podem deslocar os el~trons emparelhados do orbital (liga~

te) para o átomo de oxigênio do radical N-O, enquanto o elétron

mo

desemparelhado no orbital n* (antiligante) é deslocado para o átQ

d . ~,(10 ,5758) t d . d .d d 1 t • ,e nltrogenlo " aumen an o aSSlm a enSl a e e e ronl

ca sobre o átomo de nitrogênio e portanto o valor de 2A observazz

do.

A amostra de solução aquosa de Hb marcada com TEMPO, mo~

trou o mesmo tipo de comportamento de 2A xT obtido para a amos-77ww

tra policristalina, embora 2A (solução) > 2A (amostrazz zz poli-

cristalina evidenciando assim a importância do efeito da pola-

ridade induzida pela temperatura (vide figo 28 ).

As amostras liofilizadas de Hb marcada com TEMPO, cuja

hudrataç~ofoi determinada em O, 12gH20/gHb (O, 12g/g) não apresentam

comportamento nitidamente semelhantes às amostras policristalina

oe aquosa. Para temperaturas bem menores que -100 C, a amostra po-

licristalina apresenta menor valor de 2A do que para amostrazz

liofilizada o que certamente deve ser porque na preparação da

amostra poli cristalina devem estar presente urna quantidade razoá-

vel de sulfato de amônio, que imobiliza o marcador de spin e dimi

nui efeitos de polaridade sobre o marcador(59).

Embora a variaçao de 2A com a temperatura seja pequenazz

para a amostra liofilizada quando comparado com as amostras pol!

cristalina e solução aquosa, a largura de linha da amostra liofi-

lizada varia bastante com a temperatura, mesmo para temperaturas

menores que -50oC, o que não é observado para amostra policrista-

lina, pois a largura de linha se mantém constante para temperatu-

ras menores que -SOoc, certamente devido ao fato que na amostra

policristalina o marcador já esteja imobilizado pelo sulfato de

TABELA II

VALORESDE g e A PARA AMOSTRASDE Hb

Banda X l20K

rronocristalBanda X (a)

mnocristal

Banda Q (a)

mnocristal 77K(b)

arrostra policris­talina l20K (b)

solução aquJsa(b)

g 2,008± 0,001 2,005± 0,001 2,008 2,009 2,008xx

g 2,006 ± 0,001 2,004 ± 0,001 2,006 2,006 2,006IT .

g 2,003±0,001 2,004±0,001 2,001 2,002 2,00lzz

g = gxx ~IT gzz

A (G)xx

2,006

7,6 ± 1,0

2,0043

10,6±2,0

2,005

6,0

2,005

6,0

2,005

6,2

AyY (G) 10,3±1,0 13,7±2,0 7,3 7,4 8,0A (G) 28,5±1,0 30,6±2,0 36,5 35,5 37,2zz

- AxxAAA=

Y'/zz(G)15,4 ± 1,0 18,3± 2,016,6l6,3 l7,l3Caracter p do

48% 60%60%65%

orbital NO

(c)0,47 0,6020,6020,647

(a)

(b)

(c)

Obtidos através do ajuste das curvas de dependência angular Hxe ,

(44,45) do Capítulo lI •

Obtidos por simulação dos espectros através do método de Lefebvre e

Calculado pelo método proposto por Goodman e Raynor(16).

com uso das equaçoes

. (40)Maruanl • 1...01...0

--.

100

amÔnio.

A variaçao na largura de linha da amostra liofilizada, d~

ve ser devido a pelo menos três mecanismos: a) alargamento não ho

mogêneo de prótons intra e intermoleculares; b) anisotropia das

interações magnéticas, sendo que essas interações são mediadas p~

10 movimento causando redução na largura de linha;

dipolar entre os marcadores.

c) interação

Espectros da amostra de Hb liofilizada e marcada com mar

cador deuterado (PD-TEMPOL), e cuja hidratação foi O,l2g/g, mostraram

que a contribuição de alargamento não homogêneo é importante mas

nao é responsável pelo comportamento da curva 6hxT (fig. 31).

Embora haja variação na largura de linha e na-

separaçao

hiperfina, não há mudança na forma das linhas e não foi possível

detetar movimento com tempo de correlação interior à lO-4seg, a­

través do método de ST-RPE, o que mostra que deve-se usar com cau

tela o método empírico proposto por Goldman e cOlaboradores(30),

para medir tempo de correlação.

Os espectros congelados da amostra policristalina e solu

ção aquosa são muito semelhantes. Em ambos, não há resolução na

região central do espectro. ~sta resolução pobre, se deve ao alar

gamento não homogêneo e à superposição dos pacotes de spin que

tem orbital 2pn paralelos e perpendiculares ao campo magnético e~

terno. Apesar dessa má resolução, foi possível simular os espec -

~ ~ f b . ( 36 ) -tros atraves do metodo de Le e vre e Maruanl , obtendo-se par~

metros muito semelhantes (ver Tabela +1) .

~ esperado que os parâmetros obtidos da simulação do es

pectro congelado de amostra policristalina seca, sejam os mesmos

que os obtidos para o marcador anisotrópico no monocristal. Esses

dados (Tabela 11) mostram que esses parâmetros não são iguais. O

processo de secagem da camada de hidratação da proteína, pode ser

muito drástico para a proteína, danificando sua estrutura terciã-

ria.

Nota-se que mesmo na amostra policristalina, os

tros sao diferentes dos obtidos da variação angular do

101

.•.

parame-

monocris

r··"'

tal sendo próximos dos tensores utilizados para simular o

tro isotrópico.

espe~

Isto reforça a hip~tese de que o marcador anisotrópico

deve estar em um sítio intermolecular, e sente a simetria desse

sítio. Quando o monocristal é triturado, essa simetria é perdida

resultando no espectro de pó.

Os resultados dessas simulações mostram ainda que o mar-

cador isotrópico deve estar na camada de hidratação da proteína.

A simulação dos espectros de TEMPO em solução aquosa de

IIb, confirmam a import5ncia da existência de dados espectrais na

região de movimento rápido para fornecer alguns parâmetros de en­

trada para o programa utilizado(28), (apêndice 11 e 111).

A relação entre as larguras intrinsicas de linha ~I/~I e

também entre os tempos de correlaçãoTB/TC varia entre 1,2 e 1,5.

Estas variações são muito pequenas para se tirar conclusões sobre

a anisotropia do movimento do marcador ou à anisotropia da visco-

sidade da solução.

Como mostrado por Hwang e colaboradores(60) e Polnas

k (44 ) .. - / - I VI Izec , para pequenas falxas de varlaçao de TB TC a relaçao C C e

nao e suficiente para definir se o movimento é ou não anisotrópioo.

Embora os valores de C e B fornecessem tempos de correl~

ção em uma faixa relativamente pequena, isto não representou pro-

blema, pois o maior interesse esta na anisotropia do movimento, e

simulação espectral é suficiente para estudar esse problema.

Na simulação dos espectros, o melhor ajuste aos resulta

dos experimentais foi obtido com valores de N=I,S; o que implica

que o movimento do marcador é praticamente isotrópico. Dessa for-

ma, a anisotropia detetada no monocristal deve ser devido ao emp~

cotamento molecular que não existe na solução aquosa.

102

Os valores de g e A usados nessas simulações foram obti-

dos da simulação do espectro da solução aquosa congelada.

Os estudos de hidrataçâo de lisozima e mioglobina marca-

dos com NEM* vem mostr~r a importância da quantidade de água na

amostra, no comportamento da curva 2A x T.zz

A lisozima com hidrataçãode 0,07 gH20/g lisozima (O,07g/g),

apresentou um comportamento linear de 2A em relação à temperatuzz -

ra, sendo que esse comportamento é bem diferente daquele para so-

lução aquosa. Nessa umidade há hidratação de grupos carregados de

oroteinas, e ainda n~o dos grupos polares, pois

com Yu e Jo(61), a partir de 0,08 g/g começa a haver

ele acôrdo

hidrataçao

desses grupos. o valor de 2A obtido para a amostra liofili­zz

zada (0,07 g/g) é bem menor que 2A para solução aquosa.zz

Em uma hidrataçãointermediária, 0,45 g/g, o comportamento

umidadeé mais semelhante ao da amostra em solução aquosa. Nessa

os grupos aromáticos da superfície da mo1ecu1a de lisozima

hidratados(62) .

-sao

Apesar de não haver mudança na forma das linhas dos es-

o -pectros para temperaturas menores que -50 C, e de nao ser consta-

tado, em experimentos de ST-RPE movimento com tempo de correlação

menor de 10-5 seg, a largura de linha varia com a temperatura.

~ interessante notar que a forma da curva de 6h x·T para

a amostra sêca (0,07 gJg) é bem diferente quando comparada com a

curva da solução aquosa figo (36).

Nesta mesma figura, pode-se estudar o comportamento de

6h x T em cada humidade, para temperaturas menores e maiores que

Para temperaturas menores que - 80oc, ao aumentar a hi-

dratação há um aumento na largura de linha de campo baixo.

Como mencionado acima, há varios fatores que contribuem

para o alargamento da linha, e nesse caso, além do alargamento

não homogêneo de prótons, a que todas as amostras estão sujeitas,

103

as contribuições da interação dipolar spin-spin, e da anisotropia

dos parâmetros magnéticos são muito importantes.

A lisozima liofilizada (0,07 gJg) , não apresenta ativida

de enzimatica(62).

Aumentando a hidratação da amostra para valores de hidra

tação acima de 0,20 gjg, a proteína retorna à sua forma nativa(63),

e quando a hidratacãofôr de 0,45 g/g os grupos aromáticos expostos

estao cobertos por água (62).

Embora a diferença entre os valores da largura das li-

nhas nas diferentes amostras seja pequena, e para algumas temp~

raturas essa diferença seja pouco maior que o êrro cometido na

medida, pode-se constatar a diferença de comportamento entre a

amostra com hidratação ,O 7 gjg e as amostras com humidade suficiente

para fazer com que a proteína retorne à forma ativa.

Em cada uma das três amostras com hidrataçãodiferente, qua!!,

do a temperatura varia de -150oC para -60oC, os espectros de ST-

RPE mostram que não há movimento com tempo de correlação menor

-4que 10 sego

Na região de temperaturas maiores que -600C, o comporta-

mento das larguras de linha com a temperatura são opostas, isto é,

quanto maior a umidade menor a largura de linha.

Observações similares à lisozima foram obtidas para mio

globina (Mb) liofilizada, e cuja umidade foi de (0,12 gjg) , e so-

lução aquosa. O comportamento das curvas óh x T figo (41), e o

mesmo que para lisozima, refletindo um estado não ativo da mio-

globina (0,12 gjg) e um estado ativo (solução).

Esse tipo de comportamento de óh x T, observado para li-

sozima e mioglobina é semelhante ao comportamento da curva de tem

po de relaxação spin-rêde TI' para prótons, medidas em amostra de

1 .. ( 64).lSOZlma •

Os estudos da dependência térmica de 2A e de óh, con­zz

duzem a uma observação importante, a de que as mudanças

104

nesses

dois parâmetros corr:a temperatura, são sensíveis à mudanças na c~

- ~ .,. •.mada de hidrataçao de protelnas que por sua vez e responsavel pe-

1 t t ,.... d •. (62 ) .a es ru ura terclarla a protelna • Para um determInado grau

de hidratação, quando a temperatura aumenta, o gelo cstruturado

ao redor da proteína se funde, permitindo que a proteína tenha

maior mobilidade, e também o marcador, acarretando uma diminuição

na largura de linha e uma diminuição na separação hiperfina.

Portanto o abaixamento da temperatura induz no marcador

11mefeito de polaridade. Esse efeito é detetado inclusive nos ex-

perimentos realizados com TEMPO em Hb liofilizada, solução aquo-

sa e policristal.

Conforme mencionada acima nas dependências de 2A e ~hzz

com a temperatura pode-se notar duas regiões com um comportamento

bem definido. Para temperaturas abaixo de -80oC as amostras úmi-

das tem

giao de

2A e ~h maiores do que as amostras sêcas. Como nessa rezz -

temperatura o movimento do marcador é bem restrito (T :::lO-5seg)G

esta observação pode ser explicada pelo fato de que através do

efeito de polaridade a anisotropia em à da amostra úmida é maior

do que na amostra sêca sendo a determinante tanto para o valor de

2A quanto ~h. No caso da relaxação de prótons, nessas temperatu­zz

ras o movimento dos prótons está congelado e apenas o efeito de

polaridade sobre o tensor A é observado. Na região acima de -8üoc

o aumento do grau de hidratação contribui, além da polaridade, para

o efeito de facilitar o movimento do marcador. Neste caso o ten-

sor A é mediado de forma mais efetiva do que na amostra seca e

por isso 6h torna-se menor na amostra úmida nessa faixa de tempe-

ratura. Desta maneira estas duas regiões de temperatura observa ­

das nas experiências de medida de Tl dos prótons(64) também sao

observadas em nossas experiências nas medidas de 6h x T (fig. 41).

Como a maleimida (NEM*) está covalentemente ligada a pro-

teína, um possível mecanismo de movimento libracional é a torsão

105

ao redor da ligação entre o anel pararnagnético, e a rnaleirnida.

Este modelo foi proposto por Gellin e Karplus(65) , para

calcular barreiras de energia torsional em peptIdeos, e foi usado

por Johnson(66) para estudar o movimento libracional dos marcado-

res.

Esse efeito de torsão, bem como de flutuélção na orienta-

ção da ligação N-Q em relação ao plano da ligação C-N-C, podem ser

estudados quantitativamente através do modelo de Gellin e Karplu&

De acordo com esse modelo, as variações da constante hiperfina

~ (65)2A com a temperatura sao dados por .zz

2A (T) = AO (1 + cos G )zz zz

onde

e = f:T] 1/2~ A

o é lnetade do ângulo de oscilação, EA é um parâmetro caracteri ­

zando a barreira de energia torsional e 2Ao é a separação hiper­zz

fina na ausência de movimento.

r

A expressão ainda mostra que 2A (T) variazz linearmente

com a temperatura, podendo ser usado para ajustar matematicamente

os resultados experimentais obtidos com amostra liofilizada com

umidade bem inferior à necessária para obter o estado nativo.

Através dessa expressão calculamos o meio ângulo de rot~

ção para amostra de lisozima (0,07 g/g) e mioglobina (0,12 g/g) •

Os ângulos obtidos e as energias de ativação calculadas são mos-

trados na Tabela IIr

Os dados da Tabela II~ mostram que os ângulos de rotação

calculados para lisozima e mioglobina são diferentes, indicando

que o método é sensível à molécula. Além disso, o ângulo de rota-

ção para NEM* na mioglobina, cresce em uma taxa ligeiramente maior

que na lisozima quando a temperatura passa de -lOOoC à 200C.

106

TABELA 111

VALOR DA METADE DO ÂNGULO DE ROTACÃO PARA AMOSTRAS_______ • __ ,. __ ..l _

LIOFILIZi\DAS, E ENERGIA DE ATIVAÇÃO

Lisozima

o

E]\(Kcal/mol) Mioglobina EA(Kcal/mol)8

-100 6,8I ,86 11,32,69

- 50

9,7L,17 14,91,99

O

12,6() , 55 1ô,51,5 Ô

+ 20

13,60,83 19,71,50

107

Os resultados obtidos com amostras em vários graus de h~

dratação, para 2A e 6h, com a temperatura, mostram que a aplicazz -

ção dos métodos de calibração empírica de Goldman e colo (30,31) e_ (24 26 27 28 J ••

mesmo os metodos de Freed e cols. ' , , ., preclsam ser apl~

cados com cuidado na ;ll1á lise de espectros de marcddor em.,.

protel-

na I pois enquanto llh x T e 2A x T variam, os experimentos de ST­ZZ

-RPE não indicam um grau considerável de movimento.

Os resultados ainda mostram que o uso do método de marca

dor de spin, associando técnicas de RPE convencional e ST-RPE,of~

recem um importante método, e ainda não explorado, não so para e~

tudar hidratação, mas tamb~m mudanças din5micas que ocorrem indu-

zidas pela temperatura e sob diferentes graus de hidratação, e es

tudar mudanças na polaridade induzidas pela temperatura na camada

de hidratação da proteína.

108

CONCLUSÕES

1) O método de marcag(IInde spin para difusão mostrou-se sensivel

ao empacotamento mulecular no monocristal de Hb, e às mudan-

cas termo-induzidas quo ocorrem nesse sistema.

2) Das duas possíveis explicações para as mudanças bas componen-

tes dos tensores A Dara o marcador TEMPO em monocristais de Hb,

(isotrópico e anisutrópico), a hipótese de movimento é mais

plausível, pois uma distorção no orbital '11* do radical NO, im-

plicaria em um camno cristalino intenso, o que acarretaria mu-

dança significativ(! no tensor g.

3) A camada de hidratação de Hb, desempenha função importante no

empacotamento molecular no monocristal, e seu rearranjo ao re

dor da proteína, é importante nas mudanças induzidas pela tem-

peratura.

4) o método de anãlisc espectral, baseado nas variaçóes de forma

e largura de linha, indicam mudancas locais nas vizinhancas do> >

marcador.

5) Para o uso dos métodos de simuçação na região de 10-9<1c ~ lÕ7

sego e importante que se obtenha espectros na região de movi-

rneJ:torãpido paril.Cll.l'? 0,::; parâmetros de simulaçiío se] arn

precisos.

malS

6) Cuidados especiais devem ser t,omados ao se usar os métodos de

(30) (31) .-Goldrnan e Mason na deterrnlnaçao dos temDOS de correla-, ,

çao para movimento lento na região de temperatura de +100C a

o-150 C.

109

7) Os métodos de estudo de forma de linha associados com técnicas

não lineares (SF-RPE) formam uma ferramenta potente, ainda mui

to pouco explorada, para estudar hidratação de proteinas.

8) Esses métodos são bastante sensíveis ao congelamento da camada

de hldrataç~o, e mudanças que a! ocorrem com a temoeratura.

APÊNDICE I

Programa para simular espectros

rígidos. Método de Lefebvre e. (36)

Maruanl .

110

, 111

9NMAY-19aa 06:36:508-MAH~lq83 10:18;31

C. R ( •.,lU t.I~1IT P"·UGr(.t\:'C

C TiilS l~ ESSEIITItIIJ.Y 1 dt::. l fFt:.lh'RE - ~1ARUANI P~O(,R'\M ,..,00C IfltO Uy' C,FC

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C 1-1,,.,~MUL,I.\ FOR ORTHURHOI'!dIC SYMMtTRY f'ROM MARUANI f:r Al..C !II, t" f'J H y' S • 1C L!f1l:5 NOT lNCl.UDE \)(1EbACN) TtRMSC

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• I,P t ,\t. , G Y A Y) , ({;Pf~ W, 6Z .••n', lGP1AR'P, GE~) I (APt::H-NI, GE"'N2) , ('lt.\p!\lINl ,1l!\lAlCl), (APl:HN2,rlNA~ 1), (A.PAHN2,HNAZ1,G)(U)(<!l, (G,11 A ~ , (, p t. q b i.j , H N A )( 2 , r- '( i.#, Y i::' , Z ;''11 N ) , (A I • 3 5 , G fi A 4 C S I H N A Y 2 , l'I I l.) 5

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120

APt:NDICE 11

Como exposto no Capítulo 11, é possível simular matema-

ticamente O espectro de RPE de um radical nitróxido em um líquicb .. (24 25 29 )

Os trabalhos desenvolvldos pelo grupo do Dr. J.H. Freed ' ,

são importantes para melhor compreensão da simulação espectral.

~ N

Esse espectro e dado pela equaçao ( 39 ), sendo que a

evolução temporal da magnetização transversal, entre dois esta-

dos, inicial (i) e final (f), é dada pela equação de Liouville:

[~ MxL= (A.I)

As diferenças de energia envolvidas nas transições de

spin eletrônico e nuclear, são muito menores (1 cm-l) que a ener-

- - -1gia de translaçao e rotaçao molecular (200 cm ). Isto permite se

parar o movimento molecular das interações de spin, tratando as

transições de spin isoladamente. Devido ao decaimento aleatório ,

a magnetização transversal em um instante t qualquer pode ser es-

crita em função da orientação da molécula do radical:

(M U2, t) ) .f . P W, t)x 1 (A. 2 )

(lnde P (.C~,t)é a probabilidade de encontrar a molécula na orienta-

-çao ~~,no instante teM (~,t) é a magnetização quando a molécu­x

la tem orientação ~. A evolução temporal de P(~,t) é dada pela e-

quaçao de difusão.

8P(ll,t) = DV2~p(~,t)t

121

onde D é a constante de difusão rotacional e V2~ é o Laplaciano

o efeito da orientação molecular no espectro é dado pela

de Liouville, que na forma matricial é:

-equaçao

d [ •.•. ] - -

- M P (~;., t ) = i L un Mdt X X

(A. 3)

onde o simbolo (-) é usado para representar matriz e L(~) é o op~

rador de Liouville:

-A transformada de Fourier de M (n,t) .p(n,t) conduz ax

uma função que depende das frequências espectrais e da orientação

molecular: f(w,n), e o espectro é dado por:

I (w)1

-- I <M (o) f(w,~»TI m x

o programa aprsentado no Apêndice III, e elaborado pelo

Dr. C.F. Polnaszeck, utiliza para solução do sistema (A.3)" a ex­

pansão de f(w,n) em funções ortogonais:

f(w,n) = L: [c~(w)J . <pm(n)i <pm(n)'V~W)m

L ) - - 2 ~ . - .sendo que ~kM(n sao autofunçoes de V n: harmonlcos esferlCOS ge-

neralizados ou matrizes de wigner(28,68).

o sistema (A.3) é um conjunto de equaçoes acopladas pe-

10s termos pseudo similares, e tem dimensões r:

Esse sistema pode ser escrito de maneira compacta por:

- - -(A + lk) C = U (A. 4)

onde A é a matriz r x r, formada pelos coeficientes de cn (w)=m

,~ - 2 - -(A = L (rt) + D V n), C é uma matriz coluna de dimensao r, formada p~

122

los Cn(w) e Ü é uma matriz coluna cujos termos são dados por:m

UL == 8(L,0) sendo 8, o delta de Kroenecker. A solução do sistema

envolve portanto a diagonalização de A.

A dimensão da matriz A, isto é, o número de-

equaçoes

acopladas é dada pelo número de termos L e K da expansão em fun-

ções ortogonais:

r=3+[3L(L+6) - (L-K),(L+K+2)] /4

Os valores de L e K s~o determinados pelo valor do tem­

po de correlação, através da relação IRI (t)T 11\;1,sendo que IRl(t)lI\;

"uIA - A I (anisotropia de Ã), sendo A e A medidos em rd/s.'zz xx zz xx

P 1 k (44) -"'t d ~. d t .o naszec , propos um me o o emplrlco para e erml-

nar L, para o movimento browniano, através da relação:

I fi 1 (t) 1< L (L + 1) D

sendo D a constante de difusão, dada pela relação de Stokes-Eins

tein, para uma partícula de raio a sofrendo difusão browniana em

um líquido de viscosidade ~, à temperatura T:

D= kTSna3 1l

De uma maneira geral, para movimento rápido (T < 10-10I\;

seg) L I\;2, para movimento intermediário 10-9::,T'S..10-Sseg L1\;1O ,

-7 - ...e para movimento lento T:: 10 seg, L I\;20. A expansao em K e trun-

cada para valores bem menores que L (K<,<L).

o programa (Apêndice 111) é composto de três partes:

a) construção da matriz coluna C: - - -b) construção da matriz de coeficientes de C=(A + lk), nessa parte

é necessário construir as matrizes de Wigner, para a expansão.

A relação de recorrência é encontrada no livro de Edmonds(6S).

123

Nessa parte também é calculado o espectro;

c) Subrotina para diagonalizar A.

Essa subrotina, usa o algoritmo QR de Rutishauser(32) ,

e foi desenvolvida PO]' Gordon e Messenger (33), e o principal obj~~

tivo é transformar a matriz banda A, em uma matriz tridiagonal, a

través da aplicação de: rotações de Jacobi:

sen~1cos~ )

todo elemento Ajt de A com t=j+l ~ reduzido ã zero por meio das~ ~((!+l)

rotaçoes de Jacobi J. (~), que satisfazem a equaçao

= O

o algoritmo usa a eliminação sequencial da subdiagonal,

iniciando pela que contém elementos diferentes de zero e que

mais distante da diagonal principal, e o faz através de três pas-

sos:

a) ~ introduzida, em urna subdiagonal, a matriz de Jacobi, que eli

mina o primeiro elemento diferente de zero;

b) a matriz transformada é calculada. Esta operação pode gerar e-

lementos diferentes de zero fora da matriz banda;

c) uma nova rotação de Jacobi é introduzida para eliminar os ele-

mentos, diferentes de zero, fora da banda. O algoritmo retorna

ã (b), at~ o último elemento da matriz, fora da tridiagonal, d!

ferente de zero.

O programa inclui uma expansão em valores pares e ímpa-

res. Os termos ímpares são importantes para tempo de correlação

maior que 5 x 10-8seg, sendo que seu efeito é o de diminuir a in-

tensidade na região de campo baixo.

Além dos parâmetros L e K, os outros parâmetros de en-

124

trada são: componentes de g e Ã, obtidos por simulação do espec-

tro rígido, ou variação angular do monocristal, largura de linha,

largura de linha residual, modelo de reorientação, e asnisotropia

do tensor difusão rotacional (N = RII IRl)·

O modelo de reorientaç~ol depende da relaç~o entre ta-

~ ~manhos de molecula de solvente e soluto. Quando a molecula de so-

luto for muito maior que a molécula do solvente, o modelo de re­

orientação serã browniano(

A largura de linha, e largura de linha residual podem

ser bem determinadas se houver a possibilidade de obter espectros

na regiao de movimento rápido.

Dessa forma, se L,K,ij,Ã, largura de linha, e contribui-

ção de alargamento não homogêneo para a largura de linha forem d~

terminados de maneira adequada, obtém-se maior precisão na deter-

minaçao dos espectros simulados.

convém notar ainda, que é muito importante para a simu-

lação espectral obter-se espectros experimentais com parâmetros

adequados do espectrômetro a fim de evitar distorções das linhas

causadas pelo instrumento.

APÊNDICE 111

Programa para simular espectros

de RPE com movimento (29).

125

126

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128

Y-MAY-1984 ~8:37:3b2/-JUL-1963 09:~2:14

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129

~-MAY-1984 0H:j1:36~/-JUL-1983 09:~2:14

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