UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE … · A malária, doença infecciosa, nãocontagiosa e parasitária, de caráter agudo, - de evolução crônica quando não tratada,

MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM INDIVÍDUOS DE UMA COMUNIDADE DE MANAUS, AMAZONAS, BRASIL

MARLI STELA SANTANA MACIEL

MANAUS 2007

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

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MARLI STELA SANTANA MACIEL

MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM INDIVÍDUOS DE UMA COMUNIDADE DE MANAUS, AMAZONAS, BRASIL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientadora: Profª. Drª. MARIA DAS GRAÇAS COSTA ALECRIM

MANAUS 2007

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Santana, Marli Stela

Malária e deficiência da glicose-6-fosfato desidrogenase em indivíduos de uma comunidade de Manaus, Amazonas, Brasil/ Marli Stela Santana Maciel.-Manaus, AM;UEA; FMTAM, 2007. 79 p.: il.

Dissertação – Universidade do Estado do Amazonas (UEA), Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical - Mestrado

Orientadora: Maria das Graças Costa Alecrim

1. Doenças Tropicais e Infecciosas. 2. Malária. 3. Hematologia. 4. G6PD. II. Título

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FOLHA DE JULGAMENTO

MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO

DESIDROGENASE EM INDIVÍDUOS DE UMA COMUNIDADE DE MANAUS, AMAZONAS, BRASIL

MARLI STELA SANTANA MACIEL “Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.

Banca Julgadora:

____________________________________ Profª. Maria das Graças Costa Alecrim, Dra.

Presidente

__________________________________ Profª. Maria das Graças Vale Barbosa, Dra

_______________________________ Profª. Ivete de Araújo Roland, Dra

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Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Estela e José Cândido de Santana (in memorian), que tanto se esforçaram para proporcionar aos seus filhos uma vida digna.

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AGRADECIMENTOS

Ao concluir mais esta etapa da minha formação acadêmica, desejo aqui registrar minha gratidão: A Deus, pelo sustento espiritual, neste momento de grandes lutas e alegrias, pois “nEle tudo subsiste” Colossenses 1:17b. À minha família, na figura de minha doce mãe, Maria, pelas orações enviadas.

Ao meu companheiro José Alves, por apoiar meus estudos. À Professora Dra. Maria das Graças Costa Alecrim, que orientou este trabalho com confiança. À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, por apoiar-me no exercício de “fazer ciência”, desde a iniciação científica, PAIC, através do Dr. Wilson Alecrim. Ao Dr. Marcus Lacerda, pela colaboração neste trabalho.

Às funcionárias do laboratório de Malária, Ericilda Silva e Maria Raimunda Silva, pela amizade e valiosa colaboração na coleta de sangue e procedimentos no trabalho de campo. À secretária da Gerência de Malária, Rosemary Viana, por colaborar na entrega de resultados de exames aos pacientes do projeto. À Sra. Laurendina Batalha, pela serviço de lavagem das vidrarias do laboratório.

Aos acadêmicos do curso de Farmácia, Lisele Brasileiro, Suzy Silva, Pricila Santos, Walber Araújo Brandão, Carmem Oliva, Jason Brune, Sabrina Silva, Glória Silva, pelo grande apoio na coleta de amostras e auxílio no laboratório. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA) pelo apoio financeiro. Ao Érico Silva, pela colaboração na análise estatística dos resultados. Ao médico Dr. Ricardo Faria, pelo apoio no trabalho de campo. À Dra. Flor Martinez pela rica contribuição nas questões epidemiológicas.

À Dra. Leíla Coelho, pela valiosa colaboração na execução da técnica de eletroforese.

À Dra. Monica Costa e Marly Marques pelo apoio logístico na execução deste trabalho.

À bibliotecária Melquizeth de Almeida, pelo empenho na pesquisa bibliográfica.

http://www.capes.gov.br/

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Às queridas Marília Fernandes e Rubenita Costa, do HEMOAM, pela grande colaboração no laboratório de Química.

Aos amigos da Igreja Adventista de Manaus, Áurea Costa, Socorro Fernandes, Cheila Bentes, Sara de Faria, pela amizade incondicional. Às queridas amigas dos Ministérios da Mulher pelo apoio através do Ministério da Oração Intercessória.

À Universidade do Estado do Amazonas, com a coordenação do programa de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas, através da Dra. Maria das Graças Barbosa e seus acessores Conceição Tufic, Lucilene Guerra e Marcos Castro. Às Dras. Margarida Athayde e Viviane Maia, pelo carinho com que me receberam no estágio em docência na Escola Superior de Ciências da Saúde (UEA). A todos os que embora não nomeados, têm parte neste trabalho, a certeza da minha gratidão.

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“Deus quer, o Homem sonha, a Obra nasce”.

Fernando Pessoa

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LISTA DE ABREVIATURAS ATP Nucleotídeo de adenosina tri-fosfato NADP Dinucleotídeo fosfatado de adenina NADPH Dinucleotídeo fosfatado de adenina nicotinamida reduzido G6P Glicose6-fosfato G6PD Glicose-6-fosfato desidrogenase GSH Glutatião reduzido GSSG Glutatião oxidado DNA Ácido desoxirribonucléico FMT-AM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas MTT 3(4,5-dimetiltiazolil-2-2,5-difenil tetrazolio) - Azul de tiazol PMS Metassulfato de fenazina

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LISTA DE FIGURAS Figura 1 Ciclo do Plasmodium vivax................................................................... 5

Figura 2 Atuação da G6PD na remoção dos peróxidos..................................... 7

Figura 3 Mapa da Cidade de Manaus, em destaque, a Comunidade Ismail

Aziz........................................................................................................

18

Figura 4 Dosagem qualitativa da G6PD............................................................. 22

Figura 5 Resultados da eletroforese em gel de agarose.................................... 24

Figura 6 Distribuição dos indivíduos conforme procedência.............................. 27

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LISTA DE TABELAS Tabela 1 Distribuição dos indivíduos quanto à faixa etária, freqüência da

deficiência da G6PD e diagnóstico da malária.....................................

23 Tabela 2 Distribuição dos indivíduos conforme origem étnica e deficiência da

G6PD....................................................................................................

24

Tabela 3 Distribuição das amostras enzimopênicas conforme padrões de eletroforese...........................................................................................

25

Tabela 4 Distribuição dos indivíduos conforme antecedente de malária e deficiência da G6PD.............................................................................

25

Tabela 5 Distribuição dos indivíduos segundo história clínica de malária.......... 26

Tabela 6 Distribuição conforme reação adversa e deficiência da G6PD............ 26

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RESUMO

Os dados epidemiológicos atuais são indicadores importantes na confirmação de elevada incidência de malária na Amazônia Brasileira, sendo essas infecções causadas com maior freqüência pelo Plasmodium vivax. Apesar de sua baixa mortalidade, os aspectos de gravidade relacionados a esta espécie de malária abordados neste estudo, consistem no possível risco de hemólise desenvolvida a partir da utilização do antimalárico primaquina, em indivíduos geneticamente deficientes da glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD). A G6PD é uma enzima que catalisa o primeiro passo da via das pentoses fosfato, produzindo NADPH, um cofator importante para a proteção das células contra o estresse oxidativo. A G6PD é expressa em todos os tecidos, mas a sua deficiência manifesta-se essencialmente nas hemácias. Cerca de 400 milhões de pessoas da população mundial são afetadas pela deficiência da G6PD, com maior morbidade em indivíduos do sexo masculino, devido ao caráter recessivo da herança ligada ao sexo. Este estudo teve como objetivo estudar a malária e a deficiência da G6PD, em indivíduos de uma comunidade da cidade de Manaus, Amazonas, Brasil, através da inclusão de 200 indivíduos do gênero masculino, não consangüíneos residentes na comunidade Ismail Aziz. Do total, 6 (3%) indivíduos apresentaram deficiência da G6PD, tendo a deficiência enzimática confirmada por meio da técnica de eletroforese em gel de agarose, que definiu cinco amostras com deficiência do tipo A- e uma com padrão de eletroforese não esperado, a ser esclarecido num estudo futuro. Cinco indivíduos eram enzimopênicos e apresentaram história de primoinfecção, sugerindo assim uma possível vantagem seletiva (χ2 = 9,98; P = 0,0015) entre os indivíduos enzimopênicos que moram em áreas de risco da doença. Na análise das variáveis definidas por indivíduos enzimopênicos que relataram transfusão sanguínea após infecção por Plasmodium, encontrou-se significância estatística (P < 0,05) tanto na relação entre os que utilizaram o antimalárico primaquina, quanto entre os que relataram história de colúria e icterícia, sugerindo história de hemólise pelo antimalárico, assim como os sinais de colúria e icterícia serem dois marcadores clínicos importantes da deficiência da G6PD. Palavras-chaves: Deficiência da G6PD. Malária. Fenotipagem.

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ABSTRACT The current epidemiologic datas are indicating important, in the confirmation of raised incidence of malaria in the Brazilian Amazon, being the infections caused more frequently for the P. vivax. Although its low mortality, the aspects of severity related to this species of malaria to be boarded in this study, consists of the possible risk of hemolisys developed from the use of the primaquine antimalarial, in genetic deficient individuals of the G6PD. G6PD is an enzyme that catalyzes the first step of the pentoses fosfato pathway, producing NADPH, an important cofator for the protection of the cells against oxidative stress. G6PD is express in all the tissues, but its manifest deficiency essentially in the blood red cells. About 400 million people of the world-wide population they are affected by the deficiency of the G6PD, with bigger morbidity in individuals of the masculine sex, had to the recessive character of on inheritance to the sex. Until the moment, it has not given referring to the prevalence of the deficiency of the G6PD in the population of Manaus, that in the past received great contingents from Caucasian immigrants and that it presents in its geography endemic areas of malaria. This study had as scope to study malaria and the G6PD deficiency in individuals of a community in the city of Manaus, State of Amazon, Brazil, through the inclusion of 200 male non-consanguineous individuals residing in the community Ismail Aziz. From the total, 6 (3%) individuals presented deficiency of the G6PD, having the enzymatic deficiency confirmed by means of the technique of electrophoresis in agarose gel, which defined five samples with deficiency of the “A” type and one with pattern of unexpected electrophoresis, to be clarified by a future study. Five individuals were malaria first-infectioned and enzymopenic ones, thus suggesting a possible selective advantage among enzymopenic individuals who live in areas of risk for said disease (χ2 = 9,98; P = 0,0015). In the analysis of the variables defined by enzymopenic individuals who reported blood-transfusions after infection by Plasmodium, a significant statistics was found (P > 0,05) both in the relationship between those who utilized the anti-malaria primaquine, and those who reported a history of dark urine and jaundice, suggesting being two important clinical markers of the G6PD deficiency. Key-words: G6PD deficiency. Malaria. Fenotypic.

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 1

1.1 A Malária ...................................................................................................... 1 1.2 Transmissão................................................................................................ 1 1.3 Suscetibilidade e Imunidade........................................................................ 3 1.4 Diagnóstico da Malária................................................................................ 3 1.5 Epidemiologia da Malária............................................................................. 3 1.6 Ciclo Biológico............................................................................................. 5 1.7 A Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PD)............................................... 6 1.7.1 Bioquímica e Fisiopatogenia da Deficiência da G6PD............................. 6 1.7.2 Manifestações Clínicas............................................................................. 7 1.7.3 Genética.................................................................................................... 8 1.7.4 Diagnóstico da Deficiência........................................................................ 9 1.7.5 Epidemiologia da Deficiência da G6PD.................................................... 10 1.7.6 Malária e Deficiência da G6PD................................................................. 12 1.7.7 A Comunidade.......................................................................................... 14 2 OBJETIVO ...................................................................................................... 16 2.1 Geral............................................................................................................ 16 2.2 Específicos 16 3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 17 3.1 Área de Estudo............................................................................................ 17 3.2 Tipo de Estudo............................................................................................. 17 3.3 Aspectos Éticos........................................................................................... 17 3.4 População de Estudo................................................................................... 17 3.5 Tamanho da Amostra.................................................................................. 19 3.6 Seleção de Indivíduos.................................................................................. 19 3.7 Critérios de Inclusão.................................................................................... 19 3.8 Critérios de Exclusão................................................................................... 20 3.9 Análises Laboratoriais.................................................................................. 20 3.10 Banco de Dados e Análise Estatística....................................................... 21 4 RESULTADOS .............................................................................................. 22 4.1 Características da População de Estudo Quanto à Faixa Etária e Freqüência da Deficiência da G6PD..................................................................

22

4.2 Resultados da Gota Espessa...................................................................... 23 4.3 Origem Étnica e Freqüência da Deficiência da G6PD................................. 23 4.4 Resultados da Eletroforese.......................................................................... 24 4.5 Aspectos Epidemiológicos e Clínicos da Malária........................................ 25 4.6 Dados Sócio-Epidemiológicos..................................................................... 27 5 DISCUSSÃO................................................................................................... 28 6 CONCLUSÕES............................................................................................... 36 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 37 8 ANEXOS......................................................................................................... 45

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1 INTRODUÇÃO 1.1 A Malária

A malária, doença infecciosa, não-contagiosa e parasitária, de caráter agudo,

de evolução crônica quando não tratada, tem como agente etiológico o protozoário

do gênero Plasmodium. A transmissão se dá através do repasto sangüíneo das

fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles, podendo haver ainda, com infreqüência,

a transmissão transfusional, acidental e congênita. No homem, a doença é

caracterizada por um quadro clínico caracterizado pela tríade: febre, calafrio e

cefaléia (Mutis et al., 2005).

1.2 Transmissão Além das condições geográficas, socioeconômicas e culturais, os principais

fatores determinantes da transmissão da malária estão relacionados à população

vulnerável, levando-se em consideração os projetos de assentamentos, construção

de hidroelétricas, agropecuários e de extrativismo vegetal e mineral, implantados na

Região Amazônica a partir da década de 70, os quais estimularam a migração de

massas populacionais, sem exposição prévia à malária, para as áreas endêmicas.

Esse movimento na busca pelo desenvolvimento tem provocado desmatamento de

vastas áreas, desorganização espacial, afetado a distribuição e densidade de

vetores e concentração de pessoas sob condições sanitárias inadequadas, propícias

para a transmissão da doença (Tadei et al., 1998, Gil et al., 2003; Gonçalves e

Alecrim, 2004).

Deve-se também considerar como fator determinante da transmissão da malária

o seu agente etiológico, que se mantém na cadeia epidemiológica devido à

ocorrência de atraso e inadequação do diagnóstico e tratamento da doença,

ocasionados tanto pela sua resistência às drogas, quanto pela fragilidade

operacional dos órgãos competentes de saúde. No entanto, o Governo Federal,

através do Ministério da Saúde, em parceria com a Organização Panamericana de

Saúde (OPAS), têm despendido esforços no sentido de avaliar os esquemas

terapêuticos com antimaláricos padronizados no Brasil, por meio do Projeto da Rede

2

Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas - RAVREDA

(Brasil, 2005).

São parasitos pertencentes à Ordem Coccidiida, Sub-Ordem Haemosporidiidea,

Família Plasmodiidae, Gênero Plasmodium. As espécies de Plasmodium capazes de

infectar o homem de modo natural são: Plasmodium vivax (Grassi e Feletti, 1890),

Plasmodium falciparum (Welch,1897), Plasmodium malariae (Laveran, 1881) e

Plasmodium ovale (Stephens,1922), sendo esta última espécie não encontrada no

Brasil (Mutis et al., 2005)

Um terceiro e importante fator determinante da infecção malárica está na

presença do vetor da doença, conhecido como carapanã, pernilongo e mosquito-

prego, o transmissor da malária é um inseto culicídeo do gênero Anopheles, cujos

sub-gêneros são: Anopheles Meigen, 1918, Cellia Theobald, 1902, Nyssorhyncus

Blanchard, 1902 e Kertezia Theobald, 1905. Há cerca de 400 espécies de mosquitos

do gênero Anopheles no mundo, cerca de 60 delas são vetoras sob condições

naturais e, destas, em torno de 30 apresentam importância epidemiológica (Sallum

et al., 2000).

No Brasil, as espécies mais importantes na transmissão da doença são:

Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi (Root,1926), Anopheles (Nyssorhynchus)

albitarsis (Lynch Arribalzaga, 1878), Anopheles (Nyssorhynchus) deaneorum (Rosa-

Freitas, 1989), Anopheles (Nyssorhynchus) aquasalis (Curry, 1932), Anopheles

(Kerteszia) cruzii (Dyar e Knab, 1908), Anopheles (Kerteszia) bellator (Dyar e Knab,

1908). Mesmo na absoluta ausência das espécies acima apontadas, é importante

notar que outras espécies de Anopheles podem apresentar importância regional ou

transitória (Donnelly et al., 2002).

Tadei e Dutary-Thatcher (2000), em estudo dos fatores determinantes da

transmissão da malária, observaram que das 33 espécies de Anopheles que

ocorrem na Região Amazônica, apenas oito estavam infectadas pelo Plasmodium,

destacando o Anopheles darlingi como o principal vetor, considerado o mais

antropofílico e eficiente da Amazônia Brasileira. Quanto ao subgênero, o

Nyssorhynchus é o de maior ocorrência.

3

1.3 Suscetibilidade e Imunidade

Inicialmente, todo ser humano é suscetível à malária, mesmo aqueles que já

tiveram a infecção várias vezes, uma vez que a imunidade não confere uma

proteção total, ocorrendo apenas um abrandamento dos sintomas, muito freqüente

em áreas endêmicas da doença. Diante de características individuais pode ocorrer

uma resistência natural à doença, as quais representam formas de proteção apenas

parcial, mas suficientes para evitar quadros mais graves, como as

hemoglobinopatias (traço falciforme) em que a invasão pelo P. falciparum é bastante

reduzida; a ausência de antígeno Duffy nos eritrócitos, que os torna refratários à

invasão pelo P. vivax; enzimopatias, como a deficiência em glicose-6-fosfato

desidrogenase, em que os parasitos não apresentam um bom desenvolvimento no

interior dos eritrócitos; fagocitose de hemácias parasitadas com formas anelares

(trofozoítos) também representa um mecanismo de defesa para a malária, em

indivíduos “não imunes” (Ayi et al., 2004; Suzuki et al., 2007).

1.4 Diagnóstico da Malária

O diagnóstico laboratorial pode ser realizado através do exame parasitológico

de sangue (gota espessa) (OMS, 1975), métodos imunocromatográficos (teste em

fita: ParaSight™-F, OptiMal®), sorológicos (imunofluorescência indireta, ELISA)

(Ferreira e Sanchez, 1988; Voller et al., 1974) e de biologia molecular (PCR)

(Tirasophon et al., 1991).

1.5 Epidemiologia da Malária

A Organização Mundial de Saúde considera a malária a doença tropical mais

importante, por apresentar alto índice de morbi-mortalidade, atuando como

promotora de problemas sócio-econômicos, superada em número de mortes apenas

pela AIDS, principalmente em regiões da África. Cerca de 350-500 milhões de novos

casos ocorrem anualmente nas áreas tropicais e subtropicais do globo, sendo a

maioria destas infecções causadas por P. vivax e P. falciparum, e 90% registradas

na África tropical. Os óbitos variam entre 1,5 e 2,7 milhões de casos/ano,

principalmente entre crianças menores de 2 anos (WHO, 2005).

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A doença encontra-se amplamente distribuída pelo Continente Africano,

Asiático e Americano, sendo uma das mais importantes doenças infecto-parasitárias,

transmitida por vetor, com altos índices de morbidade. De acordo com a

Organização Panamericana de Saúde, cerca de 36% da população do continente

americano vive em áreas de risco de transmissão de malária. Em 2000 foram

notificados nas Américas 1,4 milhão de casos da doença, sendo 82,2% dos casos

causados por P. vivax (PAHO, 2004).

1.5.1 Malária no Brasil

Através da intensificação das políticas de controle da malária no Brasil,

resultados positivos foram alcançados, ao comparar o ano de 2004 em relação ao

de 1999, havendo redução significativa de casos da doença, diminuição dos

municípios de alto risco, com IPA (Incidência Parasitária Anual) acima de 49,9 casos

por 1000 habitantes, do número de internações, assim como de óbitos por malária

(Brasil, 2005).

No entanto, tem sido relatados surtos epidêmicos de malária em regiões não-

Amazônicas, destacando-se o Estado do Ceará, que em 2002 registrou 402 casos

autóctones de malária por P. vivax, e do Estado do Paraná com 106 casos da

doença. No ano de 2006 foram registrados surtos importantes da doença nos

estados do Piauí, com 89 casos, e no Espírito Santo, com 81 casos (SIVEP, 2007a).

Tais dados são preocupantes, pois em regiões não-Amazônicas, há áreas

desprovidas de ações capazes de enfrentar o problema (Brasil, 2005).

1.5.2 Malária na Amazônia

Aproximadamente 99,5% dos casos de malária ocorrem na região

Amazônica, que compreende os estados do Acre, Amazonas, Roraima, Amapá,

Rondônia, Pará, Mato Grosso, Tocantins e porção ocidental do Maranhão. As áreas

de maior transmissão são aquelas onde há condições precárias de habitação e

trabalho, e encontram-se próximas a florestas e a coleções de água (Brasil, 2005).

5

No ano de 2006, a região Amazônica apresentou 544.615 casos positivos de

malária, e dos nove estados que compõem essa região, o Amazonas notificou

181.973 casos da doença, o que representa 33,4% do total de casos. Em Manaus,

apesar do melhoramento das condições sócio-econômicas e urbanização da

periferia, neste mesmo ano foram registrados 51.228 casos, sendo 40.679 (79,4%)

causadas por P. vivax, 9.845 (19,2%) pelo P. falciparum e 702 (1,3%) infecção mista

(F+V) (SIVEP, 2007b).

A manutenção da alta incidência de malária no município de Manaus está

relacionada a fatores ambientais e sócio-econômicos que incluem altas

temperaturas, umidade relativa do ar, ciclo das chuvas, topografia, densidade de

vetores, a expansão desordenada da periferia urbana e exploração ambiental

predatória (Alecrim et al., 1999; Gonçalves e Alecrim, 2004).

1.6 Ciclo Biológico Segundo com Mutis et al., (2005), o ciclo assexuado do parasito da malária

inicia-se com a inoculação de esporozoítos no ato hematofágico do mosquito do

gênero Anopheles. Tais formas alcançam as células parenquimatosas do fígado,

que eclodem liberando inúmeros merozoítas, os quais se fixam nos eritrócitos,

transformando-se aí em trofozoítos, podendo alcançar a forma de esquizonte (Figura

1).

Figura 1. Ciclo do Plasmodium vivax Fonte: Richie e Saul, 2002. Adaptado

Hipnozoítos

ΘΘ

6

Os merozoítos diferenciam-se nas formas sexuadas do parasito,

denominadas gametócitos, e quando ingeridos pelo mosquito, dão origem ao ciclo

de vida do parasito no invertebrado. Nas infecções causadas por P. vivax e P. ovale,

alguns esporozoítos permanecem nos hepatócitos, formando hipnozoítos,

responsáveis pelas recaídas da doença (Mutis et al., 2005).

A fim de se obter a cura radical sob as formas parasitárias do fígado, e

eliminação de formas sexuadas de todas as espécies de Plasmodium, a Fundação

Nacional de Saúde, em seu manual de terapêutica, preconiza a utilização da

primaquina, uma droga do grupo químico das 8-aminoquinolinas. Administrada por

via oral, a primaquina é bem absorvida, e metabolizada rapidamente no fígado, com

meia-vida de cerca de cinco horas. Tem como efeitos indesejáveis vômito, náusea,

anorexia e metemoglobinemia com cianose (FUNASA, 2001; Santana et al., 2007).

Entretanto, a primaquina é contra-indicada para indivíduos que sejam deficientes da

enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e durante a gravidez, pois os fetos

são fisiologicamente deficientes em G6PD (WHO, 1990).

1.7 A Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PD) 1.7.1 Bioquímica e Fisiopatogenia da Deficiência da G6PD

A G6PD é uma enzima presente no citoplasma de todas as células, atuando

especialmente na manutenção da integridade dos eritrócitos, evitando a oxidação da

hemoglobina e de outras proteínas celulares. Assim, o eritrócito maduro, em seu

metabolismo, utiliza glicose como principal fonte para gerar energia (ATP) e

potencial redutor (NADP e NADPH), metabolizada por meio da via glicolítica e pela

via das pentoses-fosfato. A enzima G6PD oxida G6P a 6-fosfoglucolactona,

reduzindo NADP a NADPH. Os produtos finais desta via são a pentose D-ribose-5-

fosfato, utilizada na síntese de nucleotídeos, e a coenzima NADPH, principal

doadora de hidrogênio em diversas reações enzimáticas de redução (Luzzatto,

2006).

NADPH irá atuar nas reações de detoxificação celular, eliminando radicais

livres e peróxidos (H2O2). A remoção destes peróxidos é catalisada pela enzima

7

glutatião peroxidase, que ao conjugar-se com o glutatião reduzido (GSH), torna-o

oxidado (GSSH), e na seqüência, recebe um átomo de hidrogênio do NADPH,

retornando a seu estado reduzido. O NADPH então é oxidado a NADP, que na

presença da G6PD, é reduzido novamente a NADPH (Figura 2) (Luzzatto, 2006).

Figura 2. Atuação da G6PD para remoção dos peróxidos

Estudos dos últimos anos demonstram um comportamento diversificado do

sistema de defesa antioxidante do GSH em relação ao envelhecimento. Ao contrário

do esperado, não se observa, necessariamente, deficiência do sistema conforme o

indivíduos envelhece. No entanto os resultados mostram que idosos apresentam

níveis menores de GSH e diminuição da atividade de GSH-Rd e GSH-Px

eritrocitários em relação aos jovens. Observações sugerem ainda que a doenças

degenerativas como Alzeimer e Parkinson podem estimular o sistema antioxidante

eritrocitário em idosos (Benzi et al., 1989; Nohl, 1993).

1.7.2 Manifestações Clínicas

A primaquina foi a primeira droga a ser abordada em estudo, por desencadear

resposta hemolítica em indivíduos com hemácias com deficiência enzimática (Alving

et al., 1956). No estudo das anemias, Llanos et al., (2004), em trabalho realizado em

Cali, Colômbia, discutiram os mecanismos envolvidos na produção de anemia na

infecção malárica, citando a deficiência da G6PD como fator agravante da anemia,

devido ao uso de primaquina.

GSH

GSSH NADP

NADPH

H2O2

G6PD

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Segundo Prchal e Gregg (2005), indivíduos com deficiência da G6PD podem

apresentar sintomas a partir dos primeiros dias de vida ou mais tardiamente. As

principais conseqüências dessas alterações metabólicas são a hemólise,

desencadeada pelo uso de drogas: Nitrofurantoína; Primaquina; Sulfacetamida;

Fenazopiridina; Sulfanilamida; Sulfapiridina; Sulfametoxazol; Sulfonas; Azul de

Toluidina; Trinitrotolueno; Fenilhidrazina; Acetanilida; Furazolidona; Azul de

Metileno; Ácido Naldíxico; Naftaleno; Niridazol; Dapsona, e outros elementos como

feijão fava e produtos alimentícios contendo nitrito. Além disso, pode ocorrer

hemólise devido a processos infecciosos, na icterícia neonatal, na anemia hemolítica

não esferocítica crônica e na condição de metemoglobinemia (Beutler, 1994;

Santana, 2007).

1.7.3 Genética

A deficiência da G6PD é hereditária, transmitida como caráter recessivo

ligado ao cromossomo X, pelo que os homens têm a deficiência da enzima, e as

mulheres são transmissoras genéticas da doença, podendo também apresentar

deficiência, numa condição rara, em que herdem dois genes que codifiquem a

proteína anormal (Luzzato, 2006).

Os indivíduos do gênero masculino hemizigotos afetados (assim

denominados por possuírem apenas um exemplar do cromossomo X) e homozigotos

do gênero feminino (isto é, dupla expressão de um gene) têm uma atividade

enzimática reduzida, enquanto os heterozigotos do gênero feminino têm uma

expressão variável ou moderada da enzima, dependendo da inativação (lyonização)

do cromossomo X (Takizawa et al., 1986).

De acordo com Beutler (1994), indivíduos heterozigotos apresentam duas

populações de eritrócitos, as quais apresentam a mesma variante de deficiência. No

entanto, metade das células são normais e metade são deficientes, podendo ainda,

em algumas mulheres heterozigotas, apresentar a maioria das células com

deficiência ou a maioria com atividade normal. O diagnóstico da deficiência da

enzima nestes indivíduos pode ser realizado com maior segurança através da

detecção da mutação no DNA genômico.

9

Dentre as variantes da G6PD com atividade deficiente, as que têm maior

relevância epidemiológica são as variantes Africana ou A-, que ocorre em

descendentes do continente africano, assim como no Sul da Itália, Espanha,

Portugal e Península Arábica, e a variante Mediterrânea, que é encontrada

normalmente entre os italianos, gregos, judeus orientais, árabes e persas (Compri et

al., 2000a).

No Brasil, com o advento das técnicas de biologia molecular, têm sido

desenvolvidos vários estudos para a caracterização das mutações causadoras da

deficiência de G6PD, com a predominância das variantes Africana ou A- e

Mediterrânea (Compri et al., 2000a). Novas mutações têm sido descritas, como as

variantes Campinas, Sumaré, Lages, São Borja, Farroupilha e Anaheim (Saad et al.,

1997; Weimer et al., 1998). Compri et al. (2000a) em um estudo genético em uma

comunidade de Bragança Paulista, Estado de São Paulo, comprovaram a

predominância da variante Africana ou A-, e da Mediterrânea em menor proporção.

Hamel et al., (2002) relataram variação molecular do gene G6PD em 196

indivíduos do gênero masculino, doadores de sangue da Cidade de Belém (PA). A

variante da G6PD com maior frequência foi a G6PD A- (202G --> A, 376A --> G)

observada em 161 indivíduos (82,1%), ocasião esta em que também foram descritas

quatro novas variantes causadoras da deficiência, provavelmente devido à grande

miscigenação, que caracteriza fortemente a população da Região Amazônica.

1.7.4 Diagnóstico da Deficiência

Testes de diagnóstico laboratorial da deficiência da G6PD têm sido descritos

e padronizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Brewer et al., (1962)

padronizaram o método fenotípico para rastreio da enzimopatia, o qual apresenta

sua interpretação pela indicação da presença ou ausência de atividade enzimática

na amostra, através da redução da metemoglobina. Por ser este um teste de baixo

custo e de simples execução, pode ser facilmente implantado na rotina dos

laboratórios que prestam atendimento, público ou privado, em áreas endêmicas de

malária.

10

O diagnóstico in vitro da deficiência da G6PD pode ser realizado por teste

quantitativo, através de adição de um hemolisado a uma mistura que contenha

substrato (glicose-6-fosfato) e cofator (NADP); a quantidade de NADPH formado é

medido espectrofotometricamente (Komberg e Horecker, 1955; Lohr e Waller, 1974). O método rápido de “spot test” por fluorescência foi classificado pela OMS

como teste de escolha, devido sua alta sensibilidade e especificidade, e é baseado

na fluorescência de NADPH após se adicionar G6P e NADP a um hemolisado.

Ocorre fluorescência se a G6PD está ausente no hemolisado empregado em papel

de filtro (Beutler e Mitchell, 1968).

Técnicas laboratoriais baseadas nas características bioquímicas e genéticas

da enzima G6PD, são essenciais na identificação de mais de 400 variantes, de

mutações causais e diagnóstico em indivíduos heterozigotos, através da mobilidade

eletroforética de proteínas e de técnicas de caracterização molecular (Forbes et al.,

1991; Jefrey et al., 1993). A identificação das variantes tem função decisiva

principalmente na condução da terapêutica com drogas oxidantes, demonstrando

assim, aquelas variantes cujas características são determinantes do grau de anemia

hemolítica a ser manifestada (Beutler, 1994).

1.7.5 Epidemiologia da Deficiência da G6PD

Cerca de 400 milhões de pessoas da população mundial são afetadas pela

deficiência da enzima G6PD, e apenas uma parcela de indivíduos enzimopênicos

apresenta manifestações clínicas (Luzzatto e Notaro, 2001). A deficiência da G6PD

ocorre mais freqüentemente em indivíduos da África, 3,6 a 28% (Badens et al., 2000;

De Araujo et al., 2006), ocorrendo na Ásia, de 6 a 15,8% (Iwai et al., 2001;

Louicharoen et al., 2005), na Índia, uma média de 10.5% (Sukumar et al., 2004) e na

Península Arábica, 3 a 29% (Al-Rivami e Ebrahim, 2003; Usanga e Ameen, 2000).

Estudos desenvolvidos entre populações do gênero masculino, de diferentes

regiões do Brasil, demonstraram prevalências dessa enzimopenia em torno de 10%

11

entre indivíduos da raça negra. Já entre caucasóides dos Estados de São Paulo e

do Rio Grande do Sul, foram encontradas freqüências de deficientes de G6PD entre

1% e 3% (Lewgoy e Salzano, 1965; Saldanha et al., 1969; Barreto, 1970; Azevêdo e

Azevedo, 1974; Ramalho, 1981).

Quanto à avaliação de morbidade da deficiência da G6PD no Brasil, os

primeiros estudos foram realizados em indivíduos do gênero masculino por Marques

e Campos (1975), em hospitais de Belo Horizonte (MG), registrando deficiência em

7,8%, e por Azevedo et al., (1978), em 815 pacientes de um hospital de Salvador

(BA), encontrando 11,3% de deficientes entre os da raça negra, 7,8% entre os

mulatos escuros e 6,9% entre os mulatos médios.

Ramalho e Beiguelman (1976), precursores do rastreamento da deficiência

em doadores de banco de sangue, verificaram deficiência enzimática em 10,4% dos

negróides e 2,5% em caucasóides, em estudo realizado na Cidade de Campinas

(SP). Mais recentemente, em pesquisa realizada em 4.621 doadores de sangue do

gênero masculino, encontrou-se deficiência em 1,7%, (Compri et al., 2000b).

Na região Norte do país, na busca pela freqüência dessa enzimopenia em

indivíduos residentes em áreas endêmicas de malária, Santos et al., (2002), através

de ensaios por Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), detectaram freqüência de

12% da deficiência de G6PD em populações susceptíveis à malária, no município de

Porto Velho. Katsuragawa et al., (2004), numa análise de 122 indivíduos de ambos

os gêneros, 21 destes apresentando diagnóstico positivo para malária, residentes

em uma região de Rondônia, encontrou-se enzimopenia em 5,8% entre os homens,

e 3,3% do total analisado.

Tem sido relatados ao longo dos anos casos de hemólise por administração

do antimalárico primaquina, na Fundação de Medicina Tropical (FMTAM), através de

estudos conduzidos em programas de iniciação científica e mestrado. O resultado de

um destes estudos demonstrou que dentre 71 indivíduos com diagnóstico clínico de

metemoglobinemia pós uso de primaquina, 51,4% apresentaram deficiência da

G6PD (Santana et al., 2007). Em um outro estudo realizado na FMTAM com

12

indivíduos com malária e tratados com primaquina, através da dosagem qualitativa

da enzima encontrou-se 3,5% de deficiência, do total analisado (Sardinha, 2006).

1.7.6 Malária e Deficiência da G6PD

Estudos sobre a deficiência da enzima em áreas malaríngenas demonstram

evidências de que a enzimopenia tem sido associada à proteção, em torno de 50%

contra infecção grave pelo Plasmodium falciparum. Roth et al., (1983), através da

cultura do P. falciparum in vitro demonstraram que o crescimento do parasito é

inibido na presença de hemácias deficientes de G6PD tanto de indivíduos

heterozigotos quanto em hemizigotos.

Esta resistência se deve ao fato de que nas hemácias deficientes da G6PD,

um metabolismo essencial para a sobrevivência do parasito encontra-se em deficit.

Isto se deve à atividade diminuída da G6PD dentro das hemácias, o que conduz à

morte do parasito. Todavia, devido à ineficiência do mecanismo antioxidante em

células deficientes da G6PD, pode ocorrer ainda danos à membrana celular seguida

de fagocitose das hemácias parasitadas (Cappadoro et al., 1998).

A teoria de que a resistência à malaria grave esteja baseada na alta

freqüência da deficiência da G6PD em áreas endêmicas de malária e que

hemizigotos e heterozigotos encontram-se em situação de vantagem foi estabelecida

por Rwende et al., (1995), através de dois estudos de caso-controle realizados com

mais de 2.000 crianças africanas. Concluiu-se que a variante enzimática da

deficiência comum na África (G6PD A-) estava associada a 46 a 58% da redução do

risco de malária grave, tanto em heterozigotos do gênero feminino, quanto em

hemizigotos masculinos.

No entanto, Guindo et al., (2007) realizaram estudo com 3.197 crianças de

ambos os sexos, sendo 2.765 com malária não-complicada e 432 com malária

grave, e proveniente de duas regiões do Máli, África. O estudo revelou que dentre as

crianças com malária-não complicada, a presença da mutação no gene G6PD*A,

que leva à deficiência da G6PD, consiste em fator de proteção contra a malária

grave quando presente em indivíduos do gênero masculino (hemizigoto) e não no

gênero feminino (heterozigoto).

13

Recentemente, uma revisão da literatura apresentou a hipótese de seleção

natural relacionada à proteção contra a malária. Grande parte dos estudos

epidemiológicos, tanto in vivo quanto in vitro, relatam seleção pela deficiência da

G6PD. A análise do gene G6PD também revela que os alelos da deficiência

demonstram alguns sinais de seleção. No entanto, a questão de como tal

polimorfismo tem sido mantido permanece obscuro, visto que os diferentes

genótipos da deficiência nos dois gêneros humanos ainda não foram estabelecidos

(Tripathy e Reddy, 2007).

Quanto ao tema malária vivax e deficiência da G6PD, há poucos dados atuais

na literatura, visto que as atenções em saúde quanto à malária estão voltadas às

regiões da África, em que há maior freqüência de infecções pelo P. falciparum.

Todavia, a malária é um sério problema de saúde pública nas regiões tropicais do

mundo como é o caso da Amazônia Brasileira, onde a transmissão se mantém

devido às condições ambientais propiciatórias, e predomina a infecção pelo P. vivax.

Além do impacto econômico produzido em áreas endêmicas de infecção por

P. vivax, o tema não deve ser subestimado visto que os principais desafios dessa

espécie de malária relacionam-se ao seu tratamento, também pela escassez de

estudos clínicos para a padronização de novos protocolos de antimaláricos análogos

à primaquina em seu efeito hipnozoiticida. Mais estudos deveriam ser desenvolvidos

a fim de prover maiores esclarecimentos direcionados à sua patogênese e

mecanismos de resistência às drogas (Lacerda et al., 2007).

Os dados epidemiológicos apresentados na revisão da literatura são

indicadores importantes, na confirmação de elevada incidência de malária na

Amazônia Brasileira, sendo essas infecções causadas com maior freqüência por P.

vivax. Apesar de sua baixa mortalidade, os aspectos de gravidade relacionados ao

P. vivax abordados neste estudo consistem no possível risco de hemólise

desenvolvido a partir da utilização do antimalárico primaquina, em indivíduos

geneticamente deficientes da G6PD.

Considerando-se também que a deficiência da G6PD é determinada pela

etnia, constitui elemento útil para o estudo da composição genética das

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Tripathy%20V%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Reddy%20BM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

14

comunidades brasileiras, que foram incorporando ao longo de sua história, povos de

várias origens e com diversos graus de miscigenação, como é o caso de Manaus,

Capital do Estado do Amazonas.

Manaus é uma cidade marcada pelos traços étnicos herdados dos

ameríndios, que iniciaram a ocupação humana na Amazônia. Outro elemento

passou a predominar, mesclando as várias raças que marcaram sua presença,

portugueses, espanhóis, franceses, sírio-libanes, e firmando-se como herança dos

que descenderam da miscigenação entre o elemento branco e o indígena, o caboclo

(Benchimol, 1999). A cidade também possui em sua geografia áreas endêmicas de

malária, o que constitui fator de risco à essa população, considerando que indivíduos

afetados por essa condição genética podem sofrer hemólise por uso do antimalárico

primaquina, tornando assim necessária a realização deste estudo em indivíduos

residentes em áreas de risco de transmissão de malária, como é o caso da

população da comunidade Ismail Aziz.

1.7.7 A Comunidade

A comunidade Ismail Aziz está localizada na BR 174, em Manaus, capital do

Estado do Amazonas, reúne condições propícias para a implantação de um projeto

de levantamento epidemiológico da malária e da deficiência da G6PD, devido às

condições ambientais, sociais e econômicas que favorecem a manutenção da

malária no local.

Como tantas comunidades manauaras, Ismail Aziz teve sua origem a partir de

loteamento por invasão de terras, no ano de 2000 por migrantes vindos de várias

regiões do Estado, e até de outras regiões do país, em busca de oportunidades de

emprego no pólo industrial de Manaus, na Zona Franca e construção de moradias,

gerando o desmatamento da periferia urbana e como conseqüência o surgimento

de grandes epidemias de malária no local (Assad, 2005).

Possui em sua estrutura uma igreja católica, uma igreja de ramificação

evangélica, a igreja Assembléia de Deus, vários pontos comerciais onde são

vendidos em sua maioria produtos alimentícios e bebidas. A principal atividade

15

econômica do local é a economia informal, de vendedores autônomos, artesãos e

em segundo lugar representada por trabalhadores das indústrias de

eletroeletrônicos do Pólo Industrial da cidade.

16

2 OBJETIVO

2.1 Geral

Estudar a ocorrência de malária e deficiência da G6PD em indivíduos de uma

comunidade da Cidade de Manaus (AM).

2.2 Específicos

• Estimar a prevalência da deficiência da G6PD na população estudada.

• Identificar variantes enzimáticas por fenotipagem.

• Estimar a freqüência de malária na população estudada.

• Associar a ocorrência de malária e deficiência da G6PD.

17

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Área de Estudo

Este estudo foi realizado na comunidade Ismail Aziz, localizada na BR 174

Km 2, pertencente à Zona Norte do Município de Manaus (AM) (Figura 3), a qual

possui em torno de 1.500 habitantes. O clima é tropical e as residências encontram-

se próximas à floresta. A área apresentou uma oficial taxa de incidência de malária,

no ano de 2006, um tanto elevada, com registro de 351 casos positivos, IPA=

234/1000 pessoas (SIVEP, 2007b).

3.2 Tipo de Estudo

Trata-se de um estudo de base populacional, do tipo transversal, para

detecção de prevalência.

3.3 Aspectos Éticos O projeto foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de

Medicina Tropical do Amazonas, com o nº do processo 2398/2006 – FMT/AM e

CAE-0050.0.114.000-06 (ANEXO 9.1).

3.4 População de Estudo

Indivíduos que concordaram em participar do estudo, residentes na

comunidade Ismail Aziz, Manaus (AM), assinaram um termo de consentimento livre

e esclarecido (ANEXO 9.2 e 9.2.1), e entrevistados para obtenção de dados

epidemiológicos (ANEXO 9.3).

18

Figura 3. Mapa da Cidade de Manaus, em destaque, a Comunidade Ismail Aziz.

19

3.5 Tamanho da Amostra A amostra foi calculada em programa estatístico Epi Info®, versão 2004, com

precisão de 80%; prevalência estimada de 3%; intervalo de confiança de 95%,

tamanho da população masculina de 700 indivíduos, foi de n= 200.

3.6 Seleção dos Indivíduos

O método de captação de sujeitos da pesquisa consistiu primeiramente de

abordagem do colaborador através de explanação dos objetivos da pesquisa,

destacando a importância da participação destes num estudo que iria beneficiá-los

individualmente, ao receberem o resultado dos exames de sangue (ANEXO 9.5) e

informação a respeito da deficiência da G6PD, através de folheto explicativo

(ANEXO 9.6).

Após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, foi aplicado

um questionário sócio-epidemiológico, através de linguagem acessível, para melhor

compreensão dos entrevistados.

A população estudada foi constituída de uma amostra aleatória, estratificada

desproporcionalmente, por residência. Das 350 residências existentes na

comunidade, foram escolhidas duas consecutivamente, intercaladas por uma

abstenção, e assim sucessivamente, até atingir o n= 200. Caso não fosse

estabelecido contato ou o indivíduo não atendesse aos critérios de inclusão da

pesquisa, foi escolhida a residência da seqüência. De cada residência foi

selecionado um indivíduo, evitando assim consangüinidade entre os sujeitos da

pesquisa.

3.7 Critérios de Inclusão Foram convidados a participar do estudo:

• Indivíduos do gênero masculino, entre 1 (por serem fisiologicamente

deficientes da G6PD) a 65 anos (devido ao decréscimo da atividade

20

enzimática na fase senil) e não consangüíneos (para haver uma melhor

representatividade da deficiência da enzima) (Benzi et al., 1989; Nohl,

1993; WHO, 1991) . A amostra composta apenas por indivíduos do sexo

masculino baseia-se no fato da G6PD ser uma enzima cujo loco inativado

encontra-se no cromossomo X, freqüentemente encontrada em indivíduos

do gênero masculino, eliminando-se a análise de fenótipos heterozigotos

que ocorrem com infreqüência na população feminina, em virtude da

inativação casual da mesma região do par de cromossomos X.

• Indivíduos residentes na comunidade Ismail Aziz, Manaus (AM).

3.8 Critérios de Exclusão

• Indivíduos do gênero feminino;

• Indivíduos do gênero masculino com idade inferior a 1 ano e superior a 65

anos.

• Não residentes na comunidade (em trânsito).

3.9 Análises Laboratoriais

Foram coletadas amostras de sangue de cada indivíduo:

a. Por punção venosa: 8 mL em tubo com ACD (ácido citrato dextrose) para a

dosagem qualitativa da G6PD e eletroforese e 5 mL em tubo com EDTA (ácido

etilenodiaminotetracético) para estudos futuros em genotipagem, a serem realizados

no desenvolvimento do projeto contemplado no EDITAL MS/CNPq/FAPEAM N.

014/2006 - PPSUS (ANEXO 9.4) e aprovado pelo CEP da FMTAM.

b. Por punção digital: para diagnóstico da malária, na confecção da gota

espessa. As determinações laboratoriais foram conduzidas nos Laboratórios de

Malária e de Leishmaniose da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

(FMTAM), e as técnicas laboratoriais encontram-se descritas nos ANEXOS (9.7).

http://www.fapeam.am.gov.br/editais/edital_972.html


21

3.10 Banco de Dados e Análise Estatística

Os resultados obtidos foram registrados em banco de dados, e processados

através de análise estatística descritiva através de tabelas e figuras, e análise

inferencial utilizando-se o programa Epi Info (2004), de distribuição gratuita pelo

CDC/Atlanta e o Minitab (2000). Houve busca de freqüências das variáveis, de

associações estatísticas entre a deficiência da G6PD e as demais variáveis, usando

o testes: qui-quadrado, exato de Fisher, analisadas em nível de significância de 0,05

e intervalo de confiança de 95%.

22

4 RESULTADOS 4.1 Características da População de Estudo Quanto à Faixa Etária e Freqüência da Deficiência da G6PD

Foram avaliados 200 indivíduos não-consangüíneos do gênero masculino, de

1 a 65 anos, com predominância de indivíduos da faixa dos 31 a 40 anos (Tabela 1).

Do total, 6 (3% - IC 95%) apresentaram positividade para o teste de Brewer et al.,

(1962) (Figura 4), tendo a deficiência enzimática confirmada por meio da técnica de

eletroforese em gel de agarose (Figura 5).

Figura 4. Representação do método da dosagem qualitativa da G6PD.

Tubo 1: Teste; Tubo 2: Controlo positivo; Tubo 3: Controle negativo

23

Tabela 1. Distribuição dos indivíduos quanto à faixa etária, freqüência da deficiência

da G6PD e diagnóstico da malária.

G6PD normal

G6PD deficiente

Total analisado

N % N % Faixa etária

1 a 10 27 100 - - 27 11 a 20 37 94,8 2 5,1 39 21 a 30 39 95,1 2 4,8 41 31 a 40 43 97,7 1 2,2 44 41 a 50 21 100 - - 21 51 a 65 27 96,4 1 3,5 28 Total 194 100 6 100 200

Observou-se maior predominância de indivíduos deficientes na faixa etária

dos 11 a 20 e dos 21 a 30 anos. A faixa dos 31 a 40 apresentou a maior

concentração de indivíduos com atividade enzimática normal.

4.2 Resultados da Gota Espessa

Todas as 200 amostras de sangue foram examinadas através do método da

gota espessa, identificadas 3 amostras com diagnóstico positivo para Plasmodium

através do método da gota espessa, de forma clínica assintomática, sendo duas com

parasitos do Plasmodium vivax (3V e 4V) e uma apresentando formas trofozoítos

anelares e formas sexuadas do Plasmodium falciparum (+F/Fg).

4.3 Origem Étnica e Freqüência da Deficiência da G6PD

Dentre os 194 indivíduos normais, 25 (96,1%) eram da raça branca, 11 eram

negros), 157 (96,9%) da raça parda, e apenas 1 representante da raça amarela.

Houve predominância de deficientes da G6PD (3%) entre os indivíduos pardos

(Tabela 2).

24

Tabela 2. Distribuição dos indivíduos conforme origem étnica e deficiência da G6PD.

4.4 Resultados da Eletroforese

A investigação eletroforética realizada nas amostras positivas para o teste de

Brewer revelou que 5 indivíduos apresentavam a deficiência do tipo A- ou Africana

(Figura 5), por terem migração rápida e banda de intensidade fraca, em relação às

bandas das variantes normais, sendo considerada forma moderada da doença. Uma

amostra com deficiência da G6PD apresentou migração normal e banda fraca no gel

de agarose, com padrão de variante não-esperado (Tabela 3).

Figura 5. Resultado da eletroforese em gel de agarose. Bandas fortes: G6PD B ( 2ª , 3ª, 4ª e 5 ª da direita para a esquerda); Banda fraca: G6PD A- (1ª banda, da esquerda para a direita).

G6PD normal

G6PD deficiente

Total analisado

N % N % Origem étnica Branca 25 96,1 1 3,8 26 Negra 11 100 - - 11 Parda 157 96,9 5 3,0 162 Amarela 1 100 - - 1 Total 194 - 6 - 200

25

Tabela 3. Distribuição das amostras enzimopênicas conforme padrões de

eletroforese.

G6PD Deficiente/Total

Migração eletroforética

Intensidade da banda

Variante

5/200 Rápida Fraca A- (Africana)

1/200

Normal

Fraca

Não- Identificada

4.5 Aspectos Epidemiológicos e Clínicos da Malária

Através de um questionário epidemiológico, dentre os 194 indivíduos normais,

31 não relataram antecedente de malária; 27 (87%) relataram primoinfecção; 24

(96%) relataram antecedente de duas infecções e 113 (99,1%) relataram

poliinfecções, o que representa a maioria da amostra. Dos 6 enzimopênicos, 4

(12,9%) relataram primoinfecção (Tabela 4).

Tabela 4. Distribuição dos indivíduos conforme antecedente de malária e deficiência

da G6PD.

G6PD normal

G6PD deficiente

Total analisado

P

N % N % Antecedente de malária

Nenhum 31 100 - - 31 >0,05 Uma infecção* 27 87,0 4 12,9 31 0,03 Duas infecções 24 96,0 1 4,0 25 >0,05 Três ou mais 112 99,1 1 0,8 113 >0,05

Total 194 - 6 - 200

Quanto aos aspectos clínicos da malária, dos 194 indivíduos normais, 48

(90,5%) relataram antecedente de icterícia (P < 0,05); 65 (92,8%) relataram colúria

(P < 0,05); 33 relataram cianose e 39 (97,5%), não apresentaram antecedente de

26

clínica da malária. Dos 6 indivíduos enzimopênicos, 5 (9,4%) relataram icterícia e 4

relataram medida de transfusão sanguínea após infecção malárica, (P < 0,05), o que

indica história de hemólise (Tabela 5).

Tabela 5. Distribuição dos indivíduos segundo história clínica de malária.

G6PD normal

G6PD deficiente

Total analisado

P

N % N % Antecedente

Icterícia/malária* 48 90,5 5 9,4 53 0,026 Colúria/malária* 65 92,8 5 7,1 70 0,011 Cianose/malária 33 100 - - 33 > 0,05

Transfusão/malária* - - 4 100 4 0,004 Nenhum 39 97,5 1 2,5 40 >0,05

Total 194 - 6 - 200

Em relação à história de reação adversa por drogas oxidantes, dentre os 194

indivíduos normais 38 (90,4%) dos entrevistados relataram alguma reação adversa

mediante utilização do antimalárico primaquina e 155 (99,3%) indivíduos não

apresentaram nenhuma história de reação adversa aos medicamentos investigados.

Dos 6 indivíduos enzimopênicos, 4 (9,5%) relataram reação adversa na ingestão de

primaquina e 1 relatou reação na utilização de sulfonamida, e 1 não apresentou

nenhuma reação adversa (Tabela 6).

Tabela 6. Distribuição conforme reação adversa e deficiência da G6PD.

G6PD normal

G6PD deficiente

Total analisado

P

N % N % Reação adversa

Primaquina* 38 90,4 4 9,5 42 < 0,001 Dapsona 4 100 - - 1 >0,05

Sulfonamidas - - 1 100 1 >0,05 Nenhuma 155 99,3 1 0,64 156 >0,05

Total 194 - 6 - 200

27

4.6 Dados Sócio-Epidemiológicos Quanto à procedência dos indivíduos, 132 (66%), eram do Estado do

Amazonas, enquanto os outros 68 (34%) eram: 37 (18,5%) do estado do Pará, 11 do

Maranhão (5,5%), 5 (2,5%) do Ceará, 3 (1,5%) da Bahia; 2 (1%) de Rondônia; 2

(1%) do Paraná; 2 (1%) do Piauí; 1 (0,5%) do Acre; 1 (0,5%) do Tocantins; 1 (0,5%)

do Pernambuco; 1 (0,5%) do Mato Grosso; 1 (0,5%) de Minas Gerais e 1 (0,5%) do

Espírito Santo. Todos os seis indivíduos enzimopênicos eram procedentes do

Estado do Amazonas, e ascendência materna de mesma origem (Figura 6).

Figura 6. Distribuição dos indivíduos conforme procedência.

Na análise das variáveis definidas por indivíduos enzimopênicos que

relataram transfusão sanguínea após infecção por Plasmodium sp., encontrou-se

significância estatística (P < 0,05) tanto na relação entre os que utilizaram o

antimalárico primaquina, quanto entre os que relataram história de colúria.

A investigação de possível vantagem seletiva foi realizada agrupando-se

enzimopênicos e indivíduos gota espessa positiva, não encontrando-se nenhuma

relação entre estas variáveis pois nenhum dos dois indivíduos enzimopênicos tinha

malária. A partir dos dados da história de manifestações clínicas foi demonstrado

que os indivíduos enzimopênicos parecem apresentar-se menos susceptíveis a

infecção malárica (χ2 = 9.98; P= 0.0015) do que os normais. No entanto, há

AM; 132; 66%

Outros Estados; 68;

34%

28

necessidade de investigar outros fatores como idade, tempo de residência na área,

antes de concluir-se acertadamente neste sentido.

5 DISCUSSÃO

O primeiro ponto a ser discutido no presente trabalho diz respeito aos sujeitos

abordados na população em estudo. É certo que poderiam ter sido escolhidos tanto

indivíduos do gênero masculino quanto do feminino. No entanto, a conveniência

prática de realizar triagem somente em indivíduos do gênero masculino consiste no

fato da deficiência da G6PD ser transmitida como caráter recessivo ligado ao

cromossomo X, ocorrendo com maior freqüência em indivíduos do gênero masculino

do que no gênero feminino. Vários estudos desenvolvidos entre indivíduos do

gênero masculino, de diferentes regiões do Brasil, demonstraram esse fato (Lewgoy

e Salzano, 1965; Saldanha et al., 1969; Barreto, 1970; Azevêdo e Azevedo, 1974;

Ramalho, 1981; Compri et al., 2000b).

Outro aspecto a ser considerado é o da falha na acurácia dos testes de

triagem usuais da deficiência da G6PD, no que diz respeito à heterozigose, citando o

caso da eletroforese, devido à complexidade na interpretação das amostras (a

inativação casual do cromossomo X presente na deficiência da G6PD heterozigota,

o que pode levar a ampla variabilidade de padrões eletroforéticos, quanto à

intensidade das bandas, dependentes da quantidade da proporção de cromossomo

X normal e inativados), requerendo assim grande habilidade do examinador.

Ampla variedade de testes diagnósticos podem ser empregados na triagem

da deficiência da G6PD, tais como o teste de redução da metemoglobina (Brewer et

al., 1962), do ascorbato cianeto (Jacob e Jandl, 1966) e da fluorescência (Beutler,

1966). A facilidade do diagnóstico da enzimopenia deste estudo se deve ao fato da

amostra ser composta por homens assintomáticos, tornando o teste utilizado na

triagem da deficiência da G6PD suficientemente sensível. No presente trabalho

utilizou-se o teste de redução da metemoglobina (teste de Brewer), considerado um

método simples que utiliza reagentes de baixo custo, ou seja, nitrito de sódio, glicose

hidratada e azul de metileno, e apesar de ser um método qualitativo, oferece

resultados satisfatórios, tendo sido amplamente utilizado em vários estudos de

29

triagem populacional (Compri et al., 2000a; Garlipp e Ramalho, 1988; Ramalho,

1981; Silva et al., 2004).

Na análise do aspecto da triagem dos indivíduos verificou-se que a população

estudada mostrou-se adequada, tendo sido possível analisar 200 indivíduos do

gênero masculino, identificando-se famílias não-consangüíneas cujos

representantes enzimopênicos conduzem à produção de índices adequados para

uma população de 1.500 habitantes.

No Brasil, estudos populacionais em diferentes grupos étnicos do gênero

masculino têm mostrado variadas freqüências da G6PD. Em Bragança Paulista,

São Paulo, foram selecionados 4.621 doadores de sangue do sexo masculino

atendidos no Setor de Hematologia Clínica e Laboratorial da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade São Francisco, quando o índice de positividade na

amostra de doadores foi igual a 1,7% (80/4.621). Dentre os casos confirmados, 70

indivíduos não-consangüíneos (60 euro-descendentes e 10 afro-descendentes)

sendo submetidos à análise molecular, todos sem antecedentes clínicos de

hemólise (Compri et al., 2000a).

Em Belém, Estado do Pará, Silva et al., (2004) estudaram as reações

adversas da primaquina, numa dosagem de 0,50 mg/kg/dia, quando foram

investigados em 11 indivíduos com infecção pelo P. vivax, dentre os quais 3

apresentaram a deficiência da G6PD. Alterações clínico-laboratoriais indicaram

presença de processo hemolítico somente nos indivíduos deficientes enzimáticos, e

o tratamento foi interrompido. Ainda sugerem que triagem da deficiência da G6PD

deve ser realizada em pacientes com malária vivax, a fim de evitar complicações

decorrentes do uso de primaquina.

A fim de determinar a prevalência da deficiência da G6PD no sul do Brasil,

Castro et al., (2006) examinaram amostras de sangue de 2.799 recém-nascidos

através de técnica molecular (PCR), no Estado do Rio Grande do Sul. As análises

das amostras demonstraram que 39 (1,4%) tiveram deficiência total, 178 (6,4%)

tiveram deficiência intermediária e 2.582 (92,2%) foram normais. No entanto, ao se

estudar a deficiência da G6PD em neonatos, deve-se levar em consideração que

30

neles, há uma condição de deficiência de G6PD fisiológica, o que contribui para

freqüências um tanto elevadas de deficiência, o que limita estes tipos de estudos de

serem comparados com aqueles onde são analisados indivíduos adultos, mas não

negligenciando sua importância, pois a enzimopatia deve ser investigada,

principalmente no curso de uma icterícia neonatal, que dentre uma das causas está

a deficiência da G6PD, e que se não bem diagnosticada pode acarretar

conseqüências graves como dano neurológico, e, em alguns casos, chegar ao óbito.

A freqüência da deficiência da G6PD encontrada também demonstrou

concordância com aquelas encontradas em outros grupos populacionais brasileiros.

No entanto, a fim de buscar um padrão de qualidade, foi empregado ainda o método

da eletroforese em gel de agarose, uma metodologia um tanto antiga, mas que se

mostrou bastante eficiente na confirmação da deficiência enzimática, visto que o

resultado da análise qualitativa foi compatível com o diagnóstico obtido na

eletroforese, assim como na obtenção dos vários fenótipos, estabelecidos a partir do

padrão de migração e intensidade das bandas.

Desde a identificação da deficiência da G6PD e a sua ligação com o

cromossomo X, assim como descrição de padrões eletroforéticos determinado por

variantes da enzima, ampla variabilidade de polimorfismos têm sido identificados,

através de mais de 400 variantes (Carson et al., 1956; Yoshida et al., 1971;

Luzzatto, 2006).

A caracterização bioquímica permitiu demonstrar que o fenótipo eletroforético

predominante (G6PD) encontrado concorda com os resultados de estudos

realizados em populações com características antropo-epidemiológicas similares

àquelas descritas no presente estudo. Hamel et al., (2002), analizou 196 indivíduos

deficientes enzimáticos assintomáticos, do gênero masculino, doadores de sangue

de Belém (Pará). A deficiência foi confirmada através de eletroforese em gel de

agarose e analisadas através de métodos moleculares, o que demonstrou a

presença da variante G6PD A-, ou Africana em 161 indivíduos (82,1%). Ainda em

Belém, Silva et al., (2004), ao estudarem 11 pacientes com malária vivax,

encontraram a variante G6PD A- nos três deficientes enzimáticos da amostra.

31

Na análise dos resultados obtidos, chama a atenção a presença de uma

variante de G6PD com mobilidade eletroforética normal e intensidade da banda

fraca, diferente do padrão eletroforético da variante encontrada (G6PD A-), a ser

analisado posteriormente, juntamente com as outras 5 amostras, através do projeto

de caracterização molecular, aprovado no edital do Programa de Pesquisa para o

Sistema Único de Saúde - PPSUS/2006, EDITAL MS/CNPq/FAPEAM N. 014/2006 -

PPSUS (ANEXO 9.4).

Outro aspecto a ser considerado neste estudo é que, na comunidade

analisada, a variante G6PD A- não parece estar relacionada a indivíduos da raça

negra, diferente dos resultados encontrados em populações afro-descendentes. Dos

5 indivíduos com essa variante, 4 foram identificados como pardos e 1 como branco

levando-se em consideração a cor da pele, a textura do cabelo e os traços

fisionômicos. Presume-se então que o fenótipo eletroforético em questão constitui

resultado da herança da miscigenação entre o branco e o índio e o pardo.

Faz-se também necessário atentar para o fato da população negra ser

representada por apenas 11 indivíduos da população estudada, reflexo de sua baixa

presença na população do Amazonas. De acordo com o último censo do Instituo

Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2000), a população do Estado do

Amazonas tem a seguinte composição no quesito cor/raça: 24,8% brancos, 3,7%

negros, 65,7% pardos e 4,4% amarelos e indígenas. Atentando para a baixa

presença do elemento negro e elevada presença do elemento pardo nessa

população se faz necessário analisar a contribuição de outros grupos étnicos na

formação da população do Amazonas, como portugueses, espanhóis, e árabes.

Weimer et al., (1993) e Luzzatto e Mehta (1995) sugerem que a variante

G6PD A- não encontra-se restrita somente a indivíduos de descendência Africana,

mas pode ser encontrada com freqüência em populações do sul da Itália, Espanha,

Portugal e Península Arábica. Portanto, a prevalência desta variante na população

em estudo deve ser investigada a fim de se encontrar concordância de sua

distribuição entre os grupos étnicos que compõem esta população.



32

Na verificação da ascendência materna, em se tratando de caráter recessivo

ligado ao cromossomo X, o gene da deficiência de G6PD é transmitido aos

indivíduos do gênero masculino por intermédio de suas mães, houve presença da

ascendência brasileira em sua totalidade, apresentando ainda uma elevada

freqüência, 132 (66%), de indivíduos de naturalidade do Estado do Amazonas,

demonstrando que os dados encontrados parecem representar as características da

deficiência da G6PD em uma população predominantemente amazônida, pois todos

os enzimopênicos são desta origem, numa investigação até da 2ª geração.

A maioria dos indivíduos enzimopênicos permanecem assintomáticos, embora

possam apresentar crises agudas de hemólise, presentes no favismo, pela

sensibilidade gerada pela primaquina e a outras drogas oxidantes, as quais são

capazes de induzir anemia e icterícia em neonatos, assim como anemia hemolítica

não-esferocítica crônica, após 48 a 72 horas do início da ingestão de uma

determinada droga. Existem ainda outros fatores capazes de influenciar a disposição

e o grau de hemólise desencadeados por drogas oxidantes, tais como a dose, a

absorção, metabolização, excreção relacionados ao princípio ativo ou de metabólitos

gerados, e ainda do tipo de variante da G6PD (Luzzatto et al., 2001).

Entre os cinco enzimopênicos com a variante G6PD A- encontrou-se

significância estatística (P < 0,05) na relação entre os que utilizaram primaquina,

relataram história de colúria, de icterícia e receberam transfusão sanguínea após

infecção por Plasmodium sp., demonstrando evidências de processo hemolítico pelo

uso do antimalárico, trazendo mais uma vez à tona a importância da realização de

estudos sobre a deficiência da G6PD em indivíduos provenientes de áreas onde há

risco de infecção malárica e possível crise hemolítica por primaquina, como é o caso

da população envolvida neste trabalho.

No entanto a escassez de estudos sobre o tema da deficiência da G6PD e

malária, ocorre principalmente pelo fato do foco de atenção em saúde pública

mundial estar voltado às vastas regiões endêmicas da África, onde a maior parte das

infecções são causadas pelo P. falciparum, o que limita a utilização do antimalárico

primaquina. A análise dos resultados do presente estudo indica a necessidade do

33

desenvolvimento de estudos relacionados ao tratamento da malária vivax, pois a

ampla distribuição da deficiência da G6PD tem sido um ponto importante de

discussão no processo de desenvolvimento de novos antimaláricos com potencial de

causar hemólise (Beutler et al., in press).

Na análise das possíveis drogas causadoras de reações adversas, além da

primaquina, foram investigadas as sulfonamidas e a dapsona, pois o Estado do

Amazonas notificou de janeiro a maio de 2007, 188 novos casos de hanseníase,

sendo uma doença importante no estudo da deficiência da G6PD, relacionado à

utilização de dapsona (FUAM, 2007).

A dapsona (DDS; 4, 4'- Diamino-Difenil-Sulfona) encontra-se no centro de

toda terapêutica anti-hansênica e age através da competição com o ácido para-

aminobenzóico (PABA), diminuindo ou bloqueando a síntese do ácido fólico

bacteriano. Vários efeitos colaterais são atribuídos à dapsona, entre os quais:

gastrite, cefaléia, fotodermatite, metahemoglobinemia, anemia hemolítica,

agranulocitose, hepatite, síndrome sulfona, neuropatia periférica e síndrome

nefrótica (Jopling, 1985).

Goulart et al., (2002) revisaram prontuários de 187 pacientes tratados com

poliquimioterapia (PQT/OMS) - composta pelas drogas dapsona, clofazimina e

rifampicina - para a cura da hanseníase com registro de efeitos colaterais em 71

pacientes (37,9%). Sobre a dapsona, os resultados apontaram-na como a principal

droga causadora de efeitos indesejáveis com 80 (70,8%) casos, destacando-se 15

(13,3%) casos de anemia hemolítica e 6 (5,3%) de metemoglobinemia. A anemia

hemolítica mereceu destaque, pois acarreta sérios efeitos, principalmente em

crianças, idosos e pessoas com deficiência G6PD (Yawalkar, 1992). No presente

estudo, apesar de haver relato de antecedente de reação tanto às sulfonamidas

quanto à dapsona, não foram encontradas significâncias estatísticas para os

mesmos.

A ausência de parasitemia por Plasmodium sp. na maioria dos indivíduos

pode refletir o sucesso das políticas de controle à malária na cidade de Manaus, o

qual pode ser evidenciado pela comparação do número de casos positivos da

doença relatados no ano de 2005 (71 casos), com os do ano vigente (31 casos),

34

ocorridos no mesmo período de Abril/Maio (SIVEP, 2007b). No entanto é importante

notar que os únicos três casos de malária diagnosticados, apresentaram-se sob a

ausência de sintomas, estando um deles apresentando formas sexuadas do P.

falciparum na verificação microscópica, o que representa uma fonte de manutenção

da infecção, característica de indivíduos que vivem em áreas endêmicas de malária

(Roshanravan et al., 2003; Suarez-Mutis e Coura, 2007).

A apresentação clínica da infecção por Plasmodium sp. pode variar tanto

entre a forma assintomática e a forma grave da doença. Infecções e imunidade

prévias têm um papel importante no desfecho da doença. O portador de Plasmodium

assintomático é freqüentemente encontrado em regiões de alto risco de transmissão

da África e Sudoeste da Ásia, onde a doença permanece intensamente endêmica ao

longo do ano e indivíduos permanecem expostos ao parasito (Bottius et al., 1996;

Bruce et al., 2000; Owusu-Agyei, 2002).

A malária foi diagnosticada pelo método da gota espessa, o qual tem sido

tradicionalmente empregado, capaz de identificar a espécie do parasito,

quantificação da parasitemia e informar o estádio evolutivo do Plasmodium sp. No

entanto, o método apresenta baixa sensibilidade em situações de baixa parasitemia

(menos de 10 parasitos por μL de sangue) ou quando há presença de infecção por

mais de uma espécie do parasito, o que pode limitar a busca do agente etiológico

(Alves et al., 2002).

Métodos diagnósticos têm sido utilizados na busca por maior sensibilidade na

detecção da malária, principalmente na forma assintomática. Monteiro et al., (2002),

ao analisarem amostras de sangue de indivíduos assintomáticos para malária,

encontraram os resultados para presença de Plasmodium sp. numa positividade de

3% para a gota espessa, 5% para o QBC®, 32% para a PCR. Tais dados

demonstram que caso a triagem da malária nas amostras do estudo tivessem sido

analisadas por um método mais sensível como o da PCR, a freqüência de casos de

malária assintomática poderia ter sido maior que o encontrado (Manso, et al., 2005)

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a deficiência da G6PD sugere

proteção contra a malária pelo P. falciparum (Roth, 1983; Greene, 1999). Dados de

35

estudos clínicos realizados na África demonstraram haver algum tipo de proteção

contra a forma grave da malária tanto em indivíduos enzimopênicos heterozigotos e

homo/hemizigotos (Rwuende, 1995; Guindo, 2007). No entanto, o mecanismo de

proteção permanece desconhecido.

Dados da WHO (2005) demonstram que 95% dos óbitos de malária que

ocorrem no mundo são decorrentes de infecções pelo P. falciparum, o que indica a

importância desse provável mecanismo seletivo em relação às condições genéticas

(traço falciforme, talassemia e deficiência da G6PD), que conferissem aos

portadores algum nível de resistência contra o P. falciparum. Cabe ainda ressaltar

que a perpetuação de indivíduos geneticamente deficientes da G6PD frente ao P.

falciparum pode ser pelo fato dessa espécie de parasito ter predileção por infectar

hemácias mais velhas, e caso também estejam em indivíduos que apresentem a

variante A-, são as hemácias que apresentam maior deficiência da enzima (Balgir,

2006; Ayi et al., 2004).

Não foi encontrada nenhuma possível vantagem seletiva para a malária entre

os indivíduos enzimopênicos, visto que não houve entre eles positividade no exame

da gota espessa. No entanto, na relação dos enzimopênicos que relataram história

de colúria, de icterícia e antecedente de apenas uma infecção por Plasmodium sp.,

os dados são sugestivos de que os indivíduos enzimopênicos podem apresentar-se

menos susceptíveis a infecção malárica (P < 0,05) do que os indivíduos normais.

36

6 CONCLUSÕES

• A prevalência da deficiência da G6PD encontrada concorda com dados de

outros estudos realizados no norte do país. No entanto, difere-se dos outros

quanto à estratégia epidemiológica por ter sido um trabalho de base

populacional.

• Na população estudada há predominância da variante G6PD A- ou Africana, a

variante mais frequentemente encontrada em outros grupos humanos do

Brasil. Daí a necessidade de continuidade em estudos numa abordagem da

variabilidade genética desta população.

• Apesar da baixa freqüência de malária entre os indivíduos estudados, verifica-

se que os dados são sugestivos de que os indivíduos enzimopênicos parecem

apresentar-se menos susceptíveis à infecção malárica do que os indivíduos

normais. Porém, há necessidade de investigar outros fatores relacionados a

tal susceptibilidade como idade, tempo de residência na área estudada, a fim

de obter conclusão mais acertada.

37

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alecrim MG, Alecrim WD, Macedo V. Plasmodium vivax resistance to chloroquine (R2) and mefloquine (R3) in Brazilian Amazon region. Rev Soc Bras Med Trop 1999; 32: 67-8. Al-Riyami A, Ebrahim GJ. Genetic Blood Disorders Survey in the Sultanate of Oman. J Trop Pediatr 2003; 49: 1-20. Alves FP, Durlacher RR, Menezes MJ, Krieger H, Silva LHP, Camargo EP. High prevalence of asymptomatic Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum infections in native Amazonian populations. Am J Trop Med Hyg 2002; 66: 641-48. Alving AS, Carson PE, Flanagan CL, Ickes CE. Enzymatic deficiency in primaquine sensitive erythrocytes. Science 1956; 124: 484-5. Assad TM. A Problemática das “Invasões” na Cidade de Manaus: Perspectivas de Legalização Fundiária à Luz do Estatuto da Cidade. Acesso em 25 de março de 2007. Disponível em: http://www.conpedi.org/manaus/arquivos/anais/manaus/novos_desafios_tamera_maciel_assad.pdf. Azevêdo ES, Azevedo TFS. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and neonatal jaundice in Bahia. Cien Cult 1974; 26: 1044-47. Azevedo WC, Silva MLF, Grassi MCB, Azevedo ES. Deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase em pacientes de um hospital geral de Salvador, BA, Brasil. Rev Bras Pesq Med Biol 1978; 49-52. Ayi K, Turrini F, Piga A, Arese P. Enhanced phagocytosis of ring-parasitized mutant erythrocytes: a common mechanism that may explain protection against falciparum malaria in sickle trait and beta-thalassemia trait. Blood 2004; 104:3364-71. Badens C, Martinez di Montemuros F, Thuret I, Michel G, Mattei JF, Cappellini MD, Lena-Russo D. Molecular basis of haemoglobinopathies and G6PD deficiency in the Comorian population. Hemat J 2000; 1: 264-68. Balgir RS. Do tribal communities show an inverse relationship between sickle cell disorders and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in malaria endemic areas of Central-Eastern India? Homo 2006; 57: 163-76. Barreto OC. Erytrocyte glucose-6-phosphate dehidrogenase deficiency in São Paulo, Brasil. Rev Bras Pesq Med Biol 1970; 3: 61-5. Benchimol S. Amazônia: Formação Social e Cultural. Ed. Valer. Manaus (AM); 1999. Benzi G, Pastoris O, Marzatico F, Villa RF. Age-related effect induced by oxidative stress on the cerebral glutathione system. Neurochem Res 1989; 14: 473-81.

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45

8 ANEXOS 8.1 Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa

46

8.2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM INDIVÍDUOS DE UMA COMUNIDADE DA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS,

BRASIL – COMUNIDADE ISMAIL AZIZ Patrocinador: Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA)

Equipe responsável: Maria das Graças Costa Alecrim (Orientadora) Marli Stela Santana Maciel (Orientanda)

Descrição do projeto: Este é um estudo que estamos fazendo no Hospital Tropical

(FMTAM), através da Universidade do Estado do Amazonas (UEA), com o objetivo de

estudar a malária e a deficiência da glicose-6-fosfato desidrogenase em indivíduos da

comunidade Ismail Aziz, Manaus (AM). Para isso, é preciso que seja feita retirada de

amostra de sangue do paciente, sendo uma parte da amostra reservada a estudos futuros.

Riscos associados ao estudo: Depois de colher sangue do braço, pode ficar com uma

mancha roxa e doer um pouco. Em casos de danos/despesas que venham ocorrer

mediante a participação nesse estudo há garantia de indenização/ressarcimento de nossa

parte. Benefícios: Participando desse estudo não será recebido qualquer benefício

adicional, nem dinheiro, mas estará contribuindo para o conhecimento científico da malária.

Confidencialidade: A participação nesse estudo será confidencial. Os resultados dos

exames serão mostrados às pessoas do Hospital Tropical que trabalham com malária ou

pesquisadores de outras cidades ou países, mas o nome da pessoa que participa nunca

será revelado. Direito à retirada do estudo: A pessoa que participa da pesquisa tem todo

o direito de fazer qualquer pergunta referente aos riscos potenciais ou conhecidos, ou de

dizer que não quer participar dela. Participação voluntária: A participação é voluntária. Se

houver qualquer recusa em participar neste estudo, não ocorrerá qualquer perda de

benefícios. Em caso de dúvida ou nova informação relacionada ao estudo, serei capaz de contatar a Dra. Marli (Bioquímica) no número de telefone 8807-1243. Eu,..............................................................................................................................., recebi a

devida informação sobre o conteúdo deste termo, livremente, sem qualquer pressão por

parte dos pesquisadores, expresso meu consentimento em participar desta pesquisa:

......................................................................... Data...../...../..... Pesquisador que conversou com o paciente

.........................................................................

Assinatura do paciente

47

8.2.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (pais ou responsável)

MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM INDIVÍDUOS DE UMA COMUNIDADE DA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS,

BRASIL – COMUNIDADE ISMAIL AZIZ Patrocinador: Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA)

Equipe responsável: Maria das Graças Costa Alecrim (Orientadora) Marli Stela Santana Maciel (Orientanda)

Descrição do projeto: Este é um estudo que estamos fazendo no Hospital Tropical

(FMTAM), através da Universidade do Estado do Amazonas (UEA), com o objetivo de

estudar a malária e a deficiência da glicose-6-fosfato desidrogenase em indivíduos do sexo

masculino da comunidade Ismail Aziz, Manaus (AM). Para isso, é preciso que seja feita

retirada de amostra de sangue dele, sendo uma parte da amostra reservada a estudos

futuros. Riscos associados ao estudo: Depois de colher sangue do braço, pode ficar com

uma mancha roxa e doer um pouco. Em casos de danos/despesas que venham ocorrer

mediante a participação nesse estudo há garantia de indenização/ressarcimento de nossa

parte. Benefícios: Participando desse estudo, ele não receberá qualquer benefício

adicional, nem dinheiro, mas estará contribuindo para o conhecimento científico da

deficiência da G-6-PD. Confidencialidade: A participação nesse estudo será confidencial.

Os resultados dos exames serão mostrados às pessoas que trabalham neste projeto ou

pesquisadores de outras cidades ou países, mas o nome de quem participa do estudo

nunca será revelado. Direito à retirada do estudo: Você tem o direito de fazer qualquer

pergunta referente aos riscos potenciais ou conhecidos, ou de dizer que não quer que ele

participe dela. Participação voluntária: A participação dele é voluntária. Se houver

qualquer recusa em participar neste estudo, não ocorrerá qualquer perda de benefícios. Em caso de dúvida ou nova informação relacionada ao estudo, serei capaz de contatar a Dra. Marli (Bioquímica) no número de telefone 8807-1243. Eu,..................................................................................................recebi a devida informação

sobre o conteúdo deste termo, sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores,

expresso meu consentimento que:...........................................................................................

........................................................................................................, participe desta pesquisa.

......................................................................... Data...../...../..... Pesquisador que conversou com o responsável

.........................................................................

Assinatura do responsável

48

8.3 Ficha Cadastral MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM INDIVÍDUOS DE UMA COMUNIDADE DA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS – BRASIL COMUNIDADE ISMAIL AZIZ

Data:....../....../...... nº........................

Nome:..................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

Endereço:Rua..............................................................................................nº...................

Fone res.:..................................................cel:......................................................

Idade: 1-6( ) 6-11( ) 11-16( ) 16-21( ) 21-26( ) 26-31( ) 31-36( ) 36-41( )

41-46( ) 46-51( ) 51-56( ) 56-61( ) 61-65( )

Escolaridade: Fundamental( ) Médio( ) Superior( ) Pós-grad.( ) Analfabeto( )

Profissão/ocupação: funcionário público( ) comerciante( ) comerciário( )

autônomo( ) aposentado( ) estudante( ) desempregado( ) outros( )

Raça: 1.Branca( ) 2.Negra( ) 3.Parda( ) 4.Amarela( )

Ascendência materna: italiana( ) espanhola( ) portuguesesa( ) sírio-libanesesa( )

brasileira( ) origem desconhecida( ) outra origem:........................................................

Naturalidade: município: ................................................................................

Estado: AC ( ) AL ( ) AM( ) AP( ) BA( ) CE( ) DF ( ) ES( ) GO ( )

MA( ) MG( ) MS( ) MT( ) PA( ) PB( ) PE( ) PI( ) PR( ) RJ( )

RN( )RO( ) RR( ) RS( ) SC( ) SE( ) SP( ) TO( )

País:Brasil( ) Outros:......................................

Antecedente de malária: ( )0 ( )1X ( )2X ( )3X ou +

Gota espessa: ( )P. vivax ( )P. falciparum ( )<+ ( )+ ( )++ ( )+++ ( )Fg

Já teve icterícia? S( ) N( ) Já fez transfusão após malária? S( ) N( )

Escurecimento da urina S( ) N( ) Lábios e/ou pontas dos dedos roxos S( ) N( )

Teve reação a algum destes agentes: primaquina( ) dapsona( ) naftalina( ) sulfas( )

nitrofurantoína( ) alimentos com nitratos e nitritos ( ) fenilhidrazina( ) azul de toluidina( )

analgésico(acetanilida)( ) vitamina K ( ) feijão fava( )

G-6-PD: ( )atividade normal ( )atividade deficiente Variante:.A( ) B( )

Outra........................... Obs.:......................................................................................

.........................................................................................................................................

Preenchido por:........................................................................................................

49

8.4 Edital do projeto do PPSUS

Pesquisa sobre malária possibilita teste de G6PD em todo o SUS

Uma comunidade de 1.500 habitantes, na zona Oeste de Manaus, serve de campo para um estudo sobre malária, coordenado pela farmacêutica bioquímica Mônica Regina Farias Costa, 29. A comunidade é fruto de invasão e está próxima da floresta, na BR-174, o que a caracteriza como área endêmica da doença. Só nos primeiros quatro meses deste ano já foram registrados 55 casos de malária nessa comunidade.

Intitulado “Caracterização Molecular da Deficiência da G6PD em População de área endêmica de Malária de Manaus”, o estudo pretende estimar a prevalência e identificar as variantes da deficiência de G6PD no universo de pessoas pesquisadas.

A G6PD é uma enzima contida nas células humanas cuja função é protegê-las, mas parte dos indivíduos, por uma condição genético-hereditária é deficiente dessa enzima. Durante o tratamento da malária do tipo vivax, um dos medicamentos obrigatórios (a Primaquina) causa o rompimento dos glóbulos vermelhos. “Aqueles com deficiência de G6PD têm um fator agravante ao tomar o medicamento”, explica Mônica Regina.

O resultado da pesquisa, segundo Mônica Regina, vai auxiliar no tratamento dos pacientes e possibilitar o teste de G6PD em toda a rede do Sistema Único de Saúde. O teste já é feito na Fundação de Medicina Tropical, onde foi realizada a primeira pesquisa em pacientes com malária vivax para identificar a deficiência de G6PD. No universo pesquisado por uma equipe coordenada pelo médico Wilson Alecrim, em 2005, metade dos 300 pacientes apresentaram problema.

A pesquisadora explica que já está descrito na literatura a existência de cerca de 130 mutações relacionadas à deficiência da enzima G6PD. “Isso significa que essas mutações estão relacionadas diretamente com o grau de intensidade que a hemólise (a destruição dos glóbulos vermelhos) se manifesta, que vai desde uma manifestação moderada até a mais grave”. Ao tentar identificar essas mutações, nos pacientes pesquisados, o estudo promete informações mais consistentes para auxiliar os médicos na hora do tratamento dos pacientes com plasmodium vivax.

50

O grupo de pesquisa coordenador por Mônica Regina fez a seleção de 283 pessoas, por sorteio, na comunidade, e está coletando amostras de sangue para análise. A previsão é que o trabalho seja concluído até o final deste ano.

A pesquisa foi uma das selecionadas do Programa Pesquisa para o SUS: gestão compartilhada em saúde (PP-SUS), com financiamento do Ministério da Saúde, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (Fapeam). Foram disponibilizados R$ 112 mil para o estudo.

Valmir Lima - Decon/Fapeam

Publicado em : 09/05/2007

51

8.5 Formulário do Resultado dos Exames

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS PROJETO:

MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM

INDIVÍDUOS DE UMA COMUNIDADE (ISMAIL AZIZ) DA CIDADE DE

MANAUS, AMAZONAS - BRASIL

DATA:_____/_____/_____ REGISTRO Nº:______________ NOME:_________________________________________________________

IDADE:__________

ENDEREÇO:____________________________________________________

RESULTADO DA G6PD: ( ) NORMAL ( ) *DEFICIENTE

VARIANTE: COMUM_____________ RARA______________

OBS.:

*Indivíduos deficientes da enzima G6PD devem evitar utilizar a seguinte lista de produtos: Acetanilida; Furazolidona; Azul de Metileno; Ácido Naldíxico;

Dapsona; Naftaleno; Niridazol; Nitrofurantoína; Primaquina; Sulfacetamida;

Fenazopiridina; Sulfanilamida; Sulfapiridina; Sulfametoxazol; Sulfonas; Azul de

Toluidina; Trinitrotolueno; Fenilhidrazina; feijão fava; alimentícios contendo nitritos. Caso seja necessária a utilização de qualquer um destes elementos citados, deve fazê-lo sob supervisão médica.

52

8.7 Técnicas Laboratoriais A. Determinação qualitativa da G6PD

A atividade da G6PD foi verificada através do teste da redução da

metemoglobina, descrita por Brewer et al., (1962). O teste baseia-se no princípio de

que a hemoglobina se oxida pelo nitrito de sódio, para metemoglobina, e há

reconversão enzimática desta na presença do azul-de-metileno. Estima diretamente

a formação de NADPH pela transferência de íons hidrogênio do NADPH para um

aceptor. No teste de redução da metemoglobina o azul de metileno é usado para

transferir hidrogênio do NADPH para a metemoglobina, o qual promoverá sua

redução.

Em um tubo de ensaio foram adicionados 0,1 mL de solução de glicose e a

mesma quantidade de solução de nitrito de sódio e de azul de metileno. A esta

mistura, foi adicionado 2 mL do sangue total a ser investigado, e em seguida

homogeneizado. Dois tubos controles serão utilizados: um incubado apenas com

sangue, glicose e azul de metileno e o outro incubado com sangue, glicose e nitrito

de sódio. Os tubos foram incubados à 37oC durante 3 horas.

Após o período de incubação, é feita a homogeneização e a transferência de

0,2 mL para tubos com 10 mL de água destilada. A leitura é baseada na

comparação da coloração exibida pela amostra com as amostras dos tubos

controles. A cor vermelho vivo indica normalidade e a castanho escuro, deficiência

da enzima.

B. Eletroforese da G6PD A triagem por eletroforese foi realizada nas amostras que apresentarem

positividade no teste de redução da metemoglobina (Brewer et al., 1962). Esse teste

permite a detecção inespecífica de deficiência de várias enzimas que atuam na via

das pentose-fosfato, dentre elas, a G6PD. Desta maneira, uma vez identificada

sugestão de deficiência de alguma dessas enzimas, será realizada a eletroforese

horizontal em gel de amido, um teste específico para a G6PD. A técnica de

53

eletroforese utlizidada foi a de Forbes et al., (1991), com algumas adaptações.

1. Reagentes 1. Solução estoque de tampão TEB pH 9,1

a) Tampão para o gel

Solução estoque 10 mL

Água destilada q.s.p. 100 mL

b) Tampão dos compartimentos da cuba

Utiliza-se a solução estoque. No cátodo se adiciona NADP até uma concentração

final de 10-5M.

2. NADP

3. Solução corante (1 mL de cada componente)

G6PD sal Na+ 4 mmol

NADP 10 mmol

MTT 12 mmol

PMS 0,196 mmol

2. Material 1. Aparelho para eletroforese

2. Placa para o gel, medindo 19 x 10 cm

3. Papel absorvente

4. Papéis de filtro cortados em pedaços de 1 x 0,3 cm

5. Pinça para manipular os papéis de filtro

3. Procedimento 1. Preparar o gel a 0,9%, usando agarose. Dissolvê-lo por meio de aquecimento,

utilizando Erlenmeyer e fogareiro. Despejar o gel na placa. Evitar a formação de

bolhas de ar. Adicionar NADP até uma concentração final de 10-5 M. Deixar esfriar à

temperatura ambiente por uma hora.

2. As amostras se obtêm a partir de eritrócitos lavados com solução de NaCl a 0,8%.

Prepara-se um hemolisado a partir de eritrócitos em partes iguais com solução de

NADP (1mg/10 mL de H2O). Congela-se e descongela-se 3 vezes, centrifuga-se

para eliminar o estroma.

3. Inserem-se o gel as amostras, a 4 cm do cátodo.

54

4. A placa com gel, e as amostras inseridas, é colocada na cuba de eletroforese e

suas extremidades colocadas em contato com os compartimentos eletrolíticos, por

meio de pontes feitas com papel absorvente.

5. Passar 200/250 volts por 40 minutos.

6. Coloração: corta-se longitudinalmente o gel, sua parte inferior é coberta com a

solução corante. A coloração se processa por uma hora a 37ºC. Lavar o gel com

solução de ácido acético a 0,87M.

4. Resultado A G6PD normal migra logo à frente da Hb A, e é designada tipo “B”. A

mobilidade eletroforética da enzima deficiente encontrada nos africanos e seus

descendentes é designada tipo “A”, e migra mais rápido que a do tipo “B”. A

mobilidade eletroforética da G6PD de pessoas afetadas, de origem mediterrânea,

não difere do padrão normal. Atualmente existem mais de uma centena de variantes

consideradas raras, que foram caracterizadas pelas suas posições eletroforéticas,

associadas ou não com deficiências enzimáticas.

C. Diagnóstico de malária – Gota espessa pelo método de Walker, segundo as normas da Organização mundial de Saúde (OMS/OPAS, 1975) 1. Desengordurar a lâmina e identificá-la com iniciais do paciente.

2. Fazer punção digital, preferencialmente do dedo médio, com lanceta, depositando

pequena quantidade de sangue na lâmina.

3. Confeccionar, com auxílio de outra lâmina, um pequeno quadrante com o sangue.

4. Deixar secar a amostra da lâmina em temperatura ambiente ou estufa a 37ºC.

5. Proceder a coloração:

a. Imergir a lâmina em azul de metileno fosfatado (1 segundo).

b. Escorrer o excesso, lavar rapidamente em água tamponada.

c. Cobrir a lâmina com solução alcoólica de Giemsa, por 6 a 10 minutos.

d. Lavar o excesso em água tamponada.

e. Secar e fazer microscopia com objetiva de imersão de 100X.

Obs.: Deve-se usar uma gota do corante alcoólico de Giemsa para cada mL de água

tamponada.

Projeto de Pesquisa

MALÁRIA E DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO-DESIDROGENASE EM INDIVÍDUOS DE UMA

COMUNIDADE DA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS- BRASIL

Mestranda: Marli Stela S. Maciel Orientadora: Mª das Graças C. Alecrim Em caso de dúvida: Tel.: (92) 2127-3443 (92) 8807-1243 Imagem da capa: http:// www.esa.int/images/bloodcell400.jpg

Apoio:

DEFICIÊNCIA DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE

SEM MITOS

Soluções para sua vida

8.6 Folheto Informativo

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O QUE VOCÊ PRECISA SABER SOBRE A DEFICIÊNCIA DA G6PD

O que é a G6PD?

A glicose-6-fosfato desidrogenase ou G6PD é uma enzima que está presente em todas as células do corpo humano, e tem como finalidade auxiliar na produção substâncias que as protegem de serem destruídas. As células sanguíneas dependem exclusivamente desta enzima para serem protegidas.

Como alguém tem deficiência da

enzima G6PD?

A deficiência da G6PD é uma condição hereditária, que não se pega em contato direto com alguém que tenha a deficiência. Como posso saber se tenho deficiência da enzima G6PD? Através de um exame de sangue simples, pedido pelo médico.

Quais as chances que uma pessoa tem de ter deficiência da G6PD? A) Se o pai é saudável e a mãe é portadora assintomática: - Um entre dois filhos poderá ser deficiente B) Se o pai é deficiente da G6PD e a mãe é saudável: - Todos os filhos serão saudáveis C) Se o pai é deficiente da G6PD e a mãe é portadora assintomática: - Uma entre duas filhas será deficiente - Um entre dois filhos será deficiente D) Se o pai é saudável e a mãe é deficiente: - Todos os filhos serão deficientes E) Se tanto o pai quanto a mãe forem deficientes: - Todas as filhas serão deficientes - Todos os filhos serão deficientes

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Quais os cuidados que uma pessoa com deficiência da G6PD deve ter? Não tomar nenhum dos medicamentos listados* a seguir sem consultar um medico. Também deve sempre lembrar de informar na primeira consulta ao medico que tem deficiência da G6PD.

Como saber se uma pessoa com deficiência da G6PD está tendo uma reação? A pessoa fica cansada, com dificuldade de respirar, pele e branco dos olhos amarelados, lábios e pontas dos dedos roxos, batimentos cardíacos irregulares, e a urina pode ficar escura. Quem tem deficiência da G6PD pode doar sangue? Não. Normalmente os bancos de sangue não aceitam doação de pessoas com

deficiência da G6PD.

*Acetanilida; Dapsona; Furazolidona; Azul de

Metileno; Ácido Naldíxico; Naftaleno; Niridazol;

Nitrofurantoína; Primaquina; Sulfacetamida; Azul de

Toluidina; Trinitrotolueno; Fenilhidrazina;

Fenazopiridina;Sulfanilamida; Sulfapiridina; Sulfametoxazol;

S lf

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8.8 Artigo da Dissertação Malaria and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in Manaus (Brazilian Amazon) Marli Stela Santanaa,*, Marcus Vinicius de Guimarães Lacerdaa,b,c,1, Maria das Graças Vale Barbosa a,b,c,1, Wilson Duarte Alecrimb,1, Maria das Graças Costa Alecrima,b,c,2 a University of the State of Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil b Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil c Nilton Lins Universitary Center, Manaus, Amazonas, Brazil Short title: Malaria and G6PD deficiency Summary This study had as scope to study malaria and the glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in individuals of a community in the city of Manaus, State of Amazon, Brazil, through the inclusion of 200 male non-consanguineous individuals residing in the community Ismail Aziz. From the total, 6 (3%) individuals presented deficiency of the G6PD, having the enzymatic deficiency confirmed by means of the technique of electrophoresis in agarose gel, which defined five samples with deficiency of the “A” type and one with pattern of unexpected electrophoresis, to be clarified by a future study. Five individuals were malaria primo-infectioned and enzymopenic ones, thus suggesting a possible selective advantage among enzymopenic individuals who live in areas of risk for said disease (χ2 = 9.98; P = 0.0015; α = 0.05). In the analysis of the variables defined by enzymopenic individuals who reported blood-transfusions after infection by Plasmodium, a significant statistics was found (P > 0.05) both in the relationship between those who utilized the anti-malaria primaquine, and those who reported a history of dark urine and jaundice, suggesting being two important clinical markers of the G6PD deficiency. Keywords Malaria; G6PD deficiency; Fenotypic *Corresponding author. Present adress: Gerência de malária/Fundação

de Medicina Tropical do Amazonas/FMTAM, Avenida Pedro Teixeira 25,

Bairro D. Pedro I, 69040-000 Manaus, AM, Brasil. Tel: 55 92 2127-1243.

E-mail adress: [email protected] (Marli S. Santana). 1 Present adress: Gerência de malária/Fundação de Medicina Tropical do Amazonas/FMTAM, Avenida Pedro Teixeira 25, Bairro D. Pedro I, 69040-000 Manaus, AM, Brasil. 2 Present adress: Gerência de malária/Fundação de Medicina Tropical do Amazonas/FMTAM, Avenida Pedro Teixeira 25, Bairro D. Pedro I, 69040-000 Manaus, AM, Brasil.

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1. Introduction Malaria remains the most important tropical disease in tropical and sub-tropical areas of the world. In Brazil, approximately 99.5% of the cases of malaria occurred within the Amazon Region which, in 2006, presented 544.615 positive cases of malaria and, of the nine states that compose that region, the State of Amazonas notified 181.973 cases of that disease, what represented 33.4% of the total. In Manaus, the capital of the state, despite the improvement of the social-economic conditions and the urbanization of the surrounding areas, 51.228 cases were notified in that same year, 40,679 (79.4%) being caused by Plasmodium vivax (SIVEP, 2006). The maintenance of the high incidence of malaria in the Municipality of Manaus is related to environmental and social-economic factors that include high temperatures, humidity, vectors density, the unplaned expansion of the urban peripheral areas, the predatory environmental exploration and the resistance to antimalarials (Alecrim et al., 1999; Ferreira and Alecrim, 2004). In order to obtain the radical cure of vivax malaria, primaquine is prescribed for all patients (FUNASA, 2001). Despite its low mortality, P. vivax infection may lead to severe clinical complications related to the side effects of the drugs, such as the hemolysis induced by primaquine in individuals genetically deficient for G6PD. The worldwide spread deficiency is an important point of quarrel in the process of development of new antimalarials with the potential of causing hemolysis (Beutler et al., in press). G6PD is an enzyme present in the cytoplasm of all cells, acting specially in the maintance of the integrity of the erythrocytes, avoiding the oxidation of the hemoglobin and other cellular proteins (Luzzato et al., 1995). G6PD deficiency is an X-linked trait and the degree of drug-induced hemolysis may be determined by the G6PD variants involved, grouped in five classes, identified according to the activity of the enzyme, electrophoretic and molecular characteristics (Beutler and Vulliamy, 2002; Yoshida et al., 1971). G6PD deficiency occurs most frequently in individuals of Africa, 3.6 and 28% (Badens et al., 2000; De Araujo et al., 2006) , Asia, 6 and 15.8% (Iwai et al., 2001; Louicharoen et al., 2005), India, range 10.5% (Sukumar et al., 2004) and Middle East, 3 and 29% (Al-Rivami and Ebrahim, 2003; Usanga and Ameen, 2000). In Brazil, studies have evidenced frequencies ranged between 1.7 and 5.5% and the predominance of the variant African or “A” and the Mediterranean variant, being that new mutations have been described (Castro et al., 2006; Saad et al.,1997; Weimer et al., 1993). To date, there is no community-based estimation of the frequency of G6PD deficiency in Manaus, as well as the major enzymatic variants predominating in this population, in one of the major endemic areas for malaria in Brazil. 2. Materials and methods 2.1. Area and population The study was carried out in the Municipality of Manaus, latitude of 03º08' S and longitude of 60º00' W to the 21m altitude of above sea level to the left edge of the Black river, named Ismail Aziz, with an estimated population of 1,500 inhabitants.

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The community was chosen due to a high annual parasite index in 2006 (234/1,000 persons) (Silva, 2001; SIVEP, 2006). 2.2. Study design Two-hundred non-consanguineous men between 1 and 65 years-old were randomly enrolled in the survey. Informed written consent was obtained from all the participants. 2.3. Methods Ten mililiters of venous blood was collected from each person using EDTA tubes (BD Vacutainer®). A qualitative G6PD screening test by methemoglobin reduction method was performed (Brewer et al., 1962). Hemolyses sample were prepared for accomplishment of eletrophoresis from all those initially G6PD deficiency for the method of Forbes et al., (1991) and separate one pellet of leukocytes through centrifugation and frozen to -70C, for future studies for molecular characterization of the found enzymatic deficiency in the samples. Selection of the malaria through the method of the thick blood smear by Walker and examinateds directly to the optic microscope, according to norms of the World Health Organization, was carried through in all the individuals (OMS, 1975). 2.4. Statistical analysis The statistical analyses was performed in Epi Info® (CDC, 2007). The difference of frequencies were determined by chi-square (χ2) and Fisher exact test, with a 5% significance level and 95% confidence interval. 3. Results Of the total (Table 1), 6 (3%) individuals had presented positivity for the Brewer test, having had the confirmed enzymatic deficiency by means of the technique of eletrophoresis in agarose gel, carried out in the positive samples for the test of Brewer. Five samples with G6PD deficiency presented standard of eletrophoresis, of the type “A-”. Two samples of asymptomatic people were positive for P. vivax with low parasitemia (thick blood smear) and one person was positive for P. falciparum. 4. Discussion The practical convenience of realizing a selection only in male individuals consists of the fact that the G6PD deficiency be transmitted with a recessive character linked to the chromosome X, occurring with a major frequency in individuals of the sex masculine than in individuals of the sex feminine. The test of reduction of the metemoglobin it’s a simple method that utilizes low-cost reagents and, although being a qualitative method, offers satisfactory results and has been widely utilized in various studies of populational selection (Compri et al., 2000; Hamel et al., 2002). The easiness of diagnosis of the enzymopeny in this study is due to the fact of the sample be composed by asymptomatic men, as in a period posterior to a hemolytic crisis the number of reticulocytes in the circulating blood becomes high, and they are rich in G6PD, and they may cause a result of false enzymatic activity. In the

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selection of the enzymatic deficient individuals was employed further the method of the electrophoresis in agarose gel, a somewhat old methodology, but that has shown to be sufficient enough, once that the result of the qualitative analysis was compatible with the diagnosis obtained in the electrophoresis, as well as in the obtaining of the various electrophoretic phenotypes, established from the pattern of migration and intensity of the bands (Forbes et al., 1991). The biochemical characterization permitted to demonstrate that the frequency of the G6PD and the predominant electrophoretic phenotype (G6PD “A-”) found, agree with results of studies completed in populations with anthropo-epidemiologic characteristics similar to those described in this study (Hamel et al., 2002; Silva et al., 2004). Upon analyzing the results obtained, the presence of a variant of G6PD with electrophoretic mobility (normal) and band intensity (weak) is relevant, different from the pattern of the predominating variant, and it may be identified in a future study of molecular characterization. Another aspect to be considered in this study is that, in the community analyzed, the variant G6PD “A-” doesn´t seem to be related to individuals of the black race, but to a group that constitutes the result of the miscegenation heritage between the White and the Indian: the Brunette. Among 5 individuals with that variant, 4 were identified as brunettes and one as white, taking into consideration the color of the skin, the texture of the hair and the physionomic traces. Besides this study presents a frequency of the enzymatic deficiency found in a population predominantly from the Amazonian region, it is also assumed that the individuals with the variant G6PD “A-” received such heritage by account of miscegenation, that non-necessarily of the black race, because this ethnic group represents only 5.5% of the population studied, concordant with its scarce presence in the population of Amazon. Hence, the need to verify in a future study the contribution of other ethnic groups in the formation of the population, such as: Portugueses, Spaniards and Arabs, once that the variant G6PD “A-” is also frequently found in those populations (Luzzato et al., 1995; Weimer et al., 1993). Epidemiologic studies have shown that the G-6-PD deficiency suggests protection against malaria by P. falciparum (Greene et al., 1993; Guindo et al., 2007; Roth, Jr. et al., 1983), remaining unknown such a mechanism of protection. It was not found any possible protection against the grave malaria among the enzymopenic individuals in this study, once that among them there was not positivity in the exam of the blood thick smear. However, 16% reported history of primo-infection, among which five were enzymopenic individuals, what suggests a possible selective advantage to malaria and the enzymopenic individuals can be less susceptible to the disease. Still in the analysis of the variables defined by enzymopenic individuals who reported blood-transfusion after infection by Plasmodium, a statistical significance (P<0.05) was found, both in the relation between those who utilized the anti-malaria primaquine, and those who reported history of dark urine and jaundice, suggesting history of hemolysis by the said anti-malaria medicine, as well as signs of urine and jaundice are two important clinical markers of the G6PD deficiency.

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The absence of parasitemia by Plasmodium in the majority of the individuals reflects the success of the policies of control to malaria in the city of Manaus, being outlined the program of vectorial control, what can be evidenced by the comparison of the number of positive cases of the disease in the year 2007 (31 cases) and the ones of the year 2005 (71 cases), reported in the same period (April/May) in which the study in the community has been made (SIVEP, 2007). However, it is important to notice that the only 3 cases of malaria diagnosed presented under the absence of symptoms, being one of them presenting sexed forms of the P. falciparum in the microscopic verification, what represents a source of maintenance of the infection characteristic of individuals who live in endemic areas of malaria (Roshanravan et al., 2003; Suarez-Mutis and Coura, 2007). 5. Conclusions According to results obtained and considering the importance of the diagnosis of the G6PD deficiency, it becomes relevant the selection of deficient individuals in our population, once that exposed to the action of the antimalaria medicine primaquine, those may present hemolysis. In the population studied, the predominance of the variant G6PD “A-” or African does not seem to be related to the black race, once that this population received a higher contribution in its formation from other ethnic groups, such as: Portugueses, Spaniards and Arabs. In view of the significance in the report of history dark urine and jaundice, there is the suggestion to be two important clinical markers of the G6PD deficiency. Data is suggestive that enzymopenic individuals demonstrate to be less susceptible to malaria infection than normal individuals. 6. Ethical clearance The study was approved by the Ethics Committee of the Tropical Medicine Foundation of Amazonas. 7. Conflicts of interest statement The authors have no conflicts of interest concerning the work reported in this paper. 8. Authors' contributions M. G. C. Alecrim and W. D. Alecrim participated in the design of the study and have given final approval of the version to be published. M. V. G. Lacerda and M.G.V. Barbosa have been involved in revising and critical it. M. S. Santana conceived the study, participated in its design, acquisition, analysis and interpretation of data, and draft the manuscript. 9. Acknowledgements Special thanks to Pricila Santos, Suzi Silva, Walber Brandão, Sabrina Silva, Carmem Oliva, Glória Silva, Jason Brune, Ericilda Araújo, Raimunda Silva, Marli Marques, Monica Costa, Jose Alves Jr, Ricardo Faria, Marilia Fernandes, Rubenita Costa and Leíla Coelho who helped in the field and laboratory activities. The study was supported by Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA),

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM).

10. References Alecrim, M. G., Alecrim, W. D., Macedo, V., 1999. Plasmodium vivax resistance to chloroquine (R2) and mefloquine (R3) in Brazilian Amazon region. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 32, 67-68. Al-Riyami, A., Ebrahim, G. J., 2003. Genetic Blood Disorders Survey in the Sultanate of Oman. J. Trop. Pediatr. 49, 1-20. Badens, C., Martinez di Montemuros, F., Thuret, I., Michel, G., Mattei, J. F., Cappellini, M. D., Lena-Russo, D., 2000. Molecular basis of haemoglobinopathies and G6PD deficiency in the Comorian population. Hemato. J. 1, 264-268. Beutler, E., Duparc, S., G6PD deficiency Working Group. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and antimalarial drug development. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg, in press. Beutler, E., Vulliamy, T. J., 2002. Hematologically important mutations: glucose- 6-phosphate dehydrogenase. Blood. Cells. Mol. Dis. 28, 93-103. Brewer, G. J., Tarlov, A. R., Alving, A. S., 1962. The methemoglobin reduction test for primaquine-type sensitivity of erythrocytes. A simplified procedure for detecting a specific hypersusceptibility to drug hemolysis. JAMA 180, 386-388. Castro, S., Weber, R., Dadalt, V., Tavares, V., Giugliani, R., 2006. Prevalence of G6PD deficiency in newborns in the south of Brazil. J. Med. Screen. 13, 85-86. CDC, 2007. EpiInfo Atlanta, GA, U.S.A. Compri, M. B., Saad, S. T., Ramalho, A. S., 2000. Genetico-epidemiological and molecular investigation of G-6-PD deficiency in a Brazilian community. Cad. Saude Publica 16, 335-342. De Araujo, C., Migot-Nabias, F., Guitard, J., Pelleau, S., Vulliamy, T., Ducrocq, R., 2006. The role of the G6PD AEth376G/968C allele in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in the seerer population of Senegal. Haematologica. 91, 262-263. Ferreira Goncalves, M. J., Alecrim, W.D., 2004. Non-planed urbanization as a contributing factor for malaria incidence in Manaus-Amazonas, Brazil. Rev. Salud Publica (Bogota.) 6, 156-166. Forbes, J., Steytler, J. G., van, H. R., 1991. Agarose gel electrophoresis of glucose-6-phosphate-dehydrogenase isoenzymes. Clin. Chim. Acta. 199, 279-282.

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE … · A malária, doença infecciosa, nãocontagiosa e parasitária, de caráter agudo, - de evolução crônica quando não tratada,