UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA ......Jane Mary Lafayette Neves Gelinski que muito fez por mim. Aos meus colegas e amigos que fizeram parte desta trajetória acadêmica. MUITO

UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA

NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA

TATHIANA CARLA GELINSKI

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E CICATRIZANTE TÓPICA DE BASES DERMATOLÓGICAS EM FERIDAS CUTÂNEAS ABERTAS EM RATOS.

VIDEIRA 2016

1

TATHIANA CARLA GELINSKI

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E CICATRIZANTE TÓPICA DE BASES DERMATOLÓGICAS EM FERIDAS CUTÂNEAS ABERTAS EM RATOS.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e

Biotecnologia, da Universidade do Oeste de Santa Catarina, como requisito parcial para a obtenção do t ítulo de Mestre em Ciência e Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Geisson Marcos Nardi

Área: Biotecnologia Aplicada á Agroindústria e Saúde. Linha de Pesquisa: Bioprospecção, produção e processamento de matéria-prima e

bioproduto.

VIDEIRA 2016

2

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos, que de uma maneira ou outra se fizeram presentes auxiliando e

contribuindo para a realização deste trabalho, especialmente:

A Deus pela minha vida, por me guiar em minhas escolhas, pois sem ele, nada disso

seria possível.

Ao meu orientador, Professor Dr. Geisson Marcos Nardi, pela orientação, pela

paciência, pelos sábios ensinamentos, pelos conselhos, pela dedicação. Por ser um

profissional de respeito, agradeço pelo incentivo e confiança no meu crescimento

profissional.

A minha família, ao meu pai José Carlos e minha mãe Wilma, a minhas irmãs Denise

e Jéssica, pelo carinho e AMOR, suporte e apoio, por compreender a minha

ausência em muitas ocasiões.

Ao meu namorado Eduardo, pelo carinho, companheirismo, por fazer parte desta

etapa, me apoiando sempre com seu otimismo e por estar ao meu lado me

incentivando.

Ao Professor Dr. Osmar Damasceno Ribeiro pelas contribuições dadas para a

elaboração deste trabalho.

À Professora Dra. Estela Nunes que me guiou em muitas escolhas e com seus

conselhos me ajudou a prosseguir.

Ao Professor Jean Carlo Salomé dos Santos Menezes que muito me ensinou pela

sua experiência nestes anos.

A Professora Mestre e amiga Patrícia dos Santos a qual tenho como exemplo, me

acompanhou desde o início e estivemos juntas nos momentos difíceis que

passamos.

Aos professores do programa de Pós-graduação do Mestrado em Ciência e

Biotecnologia pelos ensinamentos transmitidos.

Aos colegas e amigos de mestrado Marta, Sally, Elis, Viviane, Gislaine, Marlene,

Evandro, Deise, Auro, Adriana e Camila, pela companhia, pelas divertidas aulas

práticas, pelas dificuldades que passamos e pelo bom humor que sempre nos

rodeava.

3

Aos colaboradores e á coordenação do Programa de Mestrado em Ciência e

Biotecnologia da UNOESC em especial a Professora Dra. Jane Mary Lafayette

Neves Gelinski que muito fez por mim.

Aos meus colegas e amigos que fizeram parte desta trajetória acadêmica.

MUITO OBRIGADA!

4

'' A cura é uma questão de tempo, mas às vezes é também uma questão de

oportunidade. ''

Hippocrates

RESUMO

A cicatrização de feridas consiste em um conjunto e sucessão de eventos

bioquímicos e celulares complexos que levam a reconstituição tecidual. O processo

5

cicatricial é dividido em fases distintas que são: inflamatória, proliferativa e

remodelativa, as quais compreendem intervalos de tempos e acontecimentos.

Muitas substâncias e estratégias têm sido utilizadas para a melhora dos sintomas e

estimulação da cicatrização de lesões. As bases de pomadas são recursos

terapêuticos bastante empregados pelas suas características oclusivas e de

absorção de ativos. Na presente pesquisa foram avaliadas as atividades anti-

inflamatória e cicatrizante tópica de bases dermatológicas em feridas cutâneas

abertas em ratos investigando os possíveis mecanismos envolvidos. Foi utilizado

método de dano epitelial induzido em animais para testar as bases de pomadas

hidrofílicas PP, PPII, PHA e lipofílicas PH e PLV, comparando com os controles

positivo dexpantenol e negativo de solução salina 0,9%. Para avaliar a retração da

ferida o software ImajeJ® mensurou em pixels através da imagem da lesão e

converteu em cm2 a área nos intervalos de 0, 3, 7, 14 e 21 dias. As análises

histomorfológicas foram realizadas nos tecidos utilizando coloração HE e tricômio de

Masson, para avaliar colagenização, reepitelização, vascularização e presença de

PMNs e neutrófilos. Na segunda fase os ensaios bioquímicos para a MPO e as

interleucinas IL-6 e TNF-α avaliaram os níveis destes mediadores inflamatórios. Os

resultados mostraram que a base lipofílica PH demonstrou de maneira efetiva a

melhor área de retração da ferida. A análise histológica permitiu verificar que a base

lipofílica PH obteve a vascularização, reepitelização e colagenização superior às

demais bases aplicadas e ao dexpantenol. A deposição de colágeno observada pela

coloração do Tricômico de Masson foi mais intensa no grupo PH, determinando

melhor cicatrização no tecido. Os níveis enzimáticos de MPO foram mais reduzidos

no grupo tratado com a base lipofílica PLV no plasma evidenciando quantidade de

infiltrado de neutrófilos baixa. O grupo tratado com a base lipofílica PH apresentou

altas concentrações de IL-6 no plasma coletado no período inflamatório agudo 8

horas após a lesão ao contrario do grupo PLV com concentrações baixas neste

período e aumentando sua concentração 24 horas após a lesão, sugerindo uma

inflamação crônica. Para o ensaio de TNF-α, o grupo PLV obteve concentrações

aumentadas desta citocina em relação ao grupo Controle e demais grupos tratados,

o que sugere uma alteração negativa no processo de cicatrização. Em contrapartida

os grupos PHA e PH apresentaram níveis baixos de TNF-α demonstrando um

fechamento da ferida acelerado. A base farmacológica de natureza lipofílica PH

6

apresentou melhor atividade anti-inflamatória e cicatrizante tópica quando

comparada a pomada dexpantenol e aos animais sem tratamento.

Palavras-chave: Bases dermatológicas. Cicatrização. Feridas. Inflamação.

ABSTRACT

7

Wound healing consists of a series and succession of complex cellular and

biochemical events that lead to tissue reconstitution. The healing process is divided

into distinct phases which are: inflammatory, proliferative and remodelate, which

comprise time intervals and events. Many substances and strategies have been used

for symptom improvement and stimulation of wound healing. Ointments bases are

quite therapeutic resources employed by its occlusive characteristics and absorption

of assets. In the present study we evaluated the anti-inflammatory activities and

topical healing of dermatological bases in open wounds in rats investigating the

possible mechanisms involved. It was used method of epithelial damage induced in

animals to test the basis of hydrophilic ointments PP, PPII, PHA and lipophilic PH

and PLV, compared to dexpanthenol and positive negative controls 0.9% saline

solution. To evaluate wound contraction of the software ImajeJ® measured in pixels

across the image of the lesion and become cm2 area at intervals of 0, 3, 7, 14 and 21

days. The morphometric analyzes were performed HE staining tissues using Masson

trichrome and to assess collagen deposition, reepithelialization, vascularisation and

the presence of PMNs and neutrophil. In the second phase biochemical assays for

MPO and IL-6 and TNF-α interleukins assessed the levels of these inflammatory

mediators. The results showed that the base lipophilic PH demonstrated effectively

the best area of retraction of the wound. Histological analysis has shown that the

base lipophilic PH obtained vascularity, epithelialization and higher colagenous

applied to other bases and dexpanthenol. The collagen deposition observed by

staining the Masson trichrome was more intense in the PH group, determining better

healing in tissue. The enzyme MPO levels were lower in the group treated with the

lipophilic base PLV plasma infiltrates showing amount of low neutrophils. The treated

group to the lipophilic basic pH showed higher IL-6 concentrations in plasma

collected in the acute inflammatory period 8 hours after injury unlike the PLV group

with low concentrations in this period and increasing its concentration 24 hours after

injury, suggesting inflammation chronic. For TNF-α assay, PLV group received

increasing concentrations of this cytokine compared to the control and other groups

treated group, suggesting a negative change in the scarring process. In contrast the

PHA groups and PH showed low levels of TNF-α showing a lock of accelerated

wound. The pharmacological basis of the lipophilic nature PH showed better anti -

inflammatory activity and topical wound healing when compared with dexpanthenol

ointment and the animals without treatment.

8

Keywords: Dermatologic bases. Wound healing. Injuries. Inflammation.

LISTA DE ABREVIATURAS

9

A/O – água em óleo

AA – ácido araquidônico

ANOVA – análise de variância

AP-1 – proteína ativadora-1

CD18 – integrina beta 2

CEUA – Comitê de Ética em Pesquisa

CO2 – dióxido de carbono

CONSEA – Conselho Nacional de Controle Animal

D.O. – densidade óptica

DEX – dexpantenol

E.P.M. – erro padrão das médias

EGF – fator de crescimento epidermal

EPA – ácido eicosapentaenóico

FGF – fator de crescimento fibroblástico

GM-CSF – fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos

H2O2 – peróxido de hidrogênio

H2SO4 – ácido sulfúrico

HDR – grande alcance dinâmico

HE – hematoxilina–eosina

HTAB – hexadeciltrimetilamônio

IL-1 – interleucina 1

IL-1β – interleucina 1 beta





ILGF – fator de crescimento insulínico

NF-kB – factor nuclear kappa B

NK – exterminadoras naturais

LPS – lipopolissacarídeo

MEC – matriz extracelular

MMP – metaloproteinase da matriz

MPO – mieloperoxidase

10

PMN – polimorfonucleares

NO – óxido nítrico

O/A – óleo em água

PDGF – fator de crescimento derivado de plaquetas

PH – petrolato hidrofílico

PHA – pomada hidrofílica

PLV – pomada de lanolina e vaselina

PMSF – fenilmeti lsulfonilflúor

PP – pomada de polietilenoglicol

PPII – pomada de polietilenoglicol II

PVPI – iodopovidona

ROS – espécies reativas de oxigênio

SBTI – inibidor de serino tripsina Kunitz

TBARS – ácido tiobarbitúrico

TGFB1 – fator de crescimento transformante beta 1

TIMP – inibidores de metaloproteinase da matriz

TM – tricômio de Masson

TMB – tetrametilbenzidina

TNF-α – fator de necrose tumoral alfa

LISTA DE FIGURAS

11

Figura 1: Estrutura da pele humana demonstrando as duas camadas (epiderme e

derme) e a fáscia subcutânea (hipoderme). ..................................................................... 22

Figura 2: Sequência do procedimento do dano epitelial em animais.......................... 43

Figura 3: Avaliação da cicatrização por planimetria digital no software ImageJ® .... 44

Figura 4: Evolução cicatricial do grupo Controle. ........................................................... 55

Figura 5: Evolução cicatricial do grupo DEX (controle positivo). ................................. 55

Figura 6: Evolução cicatricial do grupo PP, base farmacêutica hidrofílica................. 55

Figura 7: Evolução cicatricial do grupo PPII, base farmacêutica hidrossolúvel. ....... 56

Figura 8: Evolução cicatricial do grupo PHA, base farmacêutica hidrofílica. ............. 56

Figura 9: Evolução cicatricial do grupo PH, base farmacêutica lipofílica. .................. 56

Figura 10: Evolução cicatricial do grupo PLV, base farmacêutica lipossolúvel. ........ 57

Figura 11: Fotografia da derme superficial e papilar do dorso de rato, corada pelo

Tricômio de Masson para análise da colagenização. ..................................................... 63

Figura 12: Identificação de fibras colágenas na pele cicatrizada de ratos após

tratamento com as bases farmacêuticas no 21º dia (coloração de Tricômico de

Masson em aumento de 40X) ............................................................................................. 64

Figura 13: Identificação de fibras colágenas na pele cicatrizada de ratos após

tratamento com as bases farmacêuticas no 21º dia (coloração de Tricômico de

Masson em aumento de 40X) ............................................................................................. 65

Figura 14: Análise da colagenização pela intensidade da cor azul resultante da

coloração por Tricômio de Masson em tecidos cicatrizados de ratos após 21 dias. . 66

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

12

Fluxograma 1: Distribuição dos grupos de animais para aplicação dos controles e

bases dermatológicas .......................................................................................................... 41

Fluxograma 2: Procedimentos de coleta do tecido cicatrizado e extração da amostra

por trituração para os ensaios bioquímicos de 2ª Etapa ................................................ 48

Fluxograma 3: Procedimentos realizados para determinação das citocinas Il-6 e

TNF-α em amostras de tecido cicatrizado e plasma....................................................... 51

LISTA DE TABELAS

13

Tabela 1: Base para pomada hidrossolúvel..................................................................... 38

Tabela 2: Base para pomada hidrossolúvel..................................................................... 38

Tabela 3: Base para pomada hidrofílica tipo emulsão O/A ........................................... 38

Tabela 4: Base para pomada de absorção tipo emulsão A/O ...................................... 39

Tabela 5: Base graxa para pomada de absorção ........................................................... 39

Tabela 6: Preparação das placas para adição das soluções da curva padrão e

amostras de sangue de 8 e 24 hs e tecido 24 hs ............................................................ 49

Tabela 7: Intensidade da vascularização, colagenização e reepitelização em

amostras de tecidos dos grupos controle, dexpantenol e tratados com as bases

farmacêuticas hidrofílicas e lipofílicas em ratos............................................................... 63

Tabela 8: Avaliação Histológica em amostras de tecidos dos grupos controle,

dexpantenol e tratados com as bases farmacêuticas hidrofílicas e lipofílicas em

ratos. ....................................................................................................................................... 67

LISTA DE GRÁFICOS

14

Gráfico 1: Variação dos valores em cm2 das áreas excisadas em ratos dos grupos

nos dias 0, 3, 7, 14 e 21....................................................................................................... 58

Gráfico 2: Variação dos valores em % das áreas excisadas em ratos dos grupos

nos dias 3, 7, 14 e 21. .......................................................................................................... 59

Gráfico 3: Efeito das bases hidrofílicas PP, PPII e PHA, bases lipofílicas PH e PLV,

DEX sobre a atividade enzimática da mieloperoxidase em plasma de ratos

excisados. As atividades enzimáticas nos plasmas foram mensuradas 8 horas após

o dano epitelial induzido com tratamento das bases e dexpantenol. Todos os dados

apresentados são média ± S.E.M. de 4-6 animais por grupo. Teste T de

Students................... ............................................................................................................ 69


DEX sobre os níveis de citocina IL-6 em plasma de ratos excisados. As dosagens no

plasma foram mensuradas 8 horas após o dano epitelial induzido em animais

tratados com as bases e dexpantenol............................................................................... 71


DEX sobre os níveis de citocina IL-6 em tecido de ratos excisados. As dosagens no

plasma foram mensuradas 24 horas após o dano epitelial induzido em animais



DEX sobre os níveis de citocina TNF-α em plasma de ratos excisados. As dosagens

no plasma foram mensuradas 8 horas após o dano epitelial induzido em animais



DEX sobre os níveis de citocina TNF-α em tecido de ratos excisados. As dosagens

no plasma foram mensuradas 24 horas após o dano epitelial induzido em animais

tratados com as bases e dexpantenol ............................................................................... 74

SUMÁRIO

15

1 INTRODUÇÂO............................................................................................................17

2 OBJETIVOS................................................................................................................19

2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................19

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................19

3 JUSTIFICATIVA .........................................................................................................20

4 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................21

4.1 MORFOFISIOLOGIA DA PELE ..............................................................................21

4.2 CICATRIZAÇÃO CUTÂNEA .....................................................................................24

4.2.1 Fase inflamatória - 1 a 3 dias ................................................................................25

4.2.2 Fase proliferativa - 4 a 21 dias .............................................................................26

4.2.3 Fase de remodelamento – 21 dias a 1 ano dias...............................................28

4.3 CITOLOGIA DA INFLAMAÇÃO E CICATRIZAÇÃO ............................................29

4.3.1 Polimorfonucleares (PMNs, Neutrófilos) ...........................................................29

4.3.2 Macrófagos/Monócitos ...........................................................................................30

4.3.3 Colágeno ....................................................................................................................31

4.4 BIOQUÍMICA E PERMEABILIDADE CUTÂNEA ..................................................32

4.5 BASES DERMATOLÓGICAS ..................................................................................33

5 MATERIAL E MÉTODOS .........................................................................................37

5.1 ANIMAIS ......................................................................................................................37

5.2 TÉCNICAS EXPERIMENTAIS .................................................................................37

5.2.1 Bases dermatológicas ............................................................................................37

5.2.2 Grupos experimentais ............................................................................................40

5.2.3 Indução do Dano epitelial .....................................................................................42

5.2.4 1ª Etapa - Avaliação da cicatrização ...................................................................43

5.2.5 Avaliação Histológica – Reepitelização, colagenização, vascularização,

presença de neutrófilos e polimorfonucleares ...........................................................44

5.2.6 2ª Etapa - Avaliação das bases dermatológicas sobre os mediadores

inflamatórios no processo de cicatrização...................................................................45

5.2.7 Modelo de coleta de sangue pela técnica de punção caudal ......................45

5.2.8 Modelo de coleta de sangue pela técnica de punção cardíaca ...................46

5.2.9 Modelo de coleta do tecido cicatrizado e extração da amostra por

trituração ................................................................................................................................46

16

5.2.10 Dosagem de Proteínas Totais via espectrofotometria em tecido

cicatrizado .............................................................................................................................47

5.2.11 Dosagem das citocinas inflamatória IL-6 e TNF-α no tecido de

cicatrização e sangue .........................................................................................................49

5.2.12 Dosagem da Atividade da Enzima Mieloperoxidase (MPO) ........................52

5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...........................................................................................52

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................................53

6.1 AVALIAÇÃO DA EVOLUÇÃO CICATRICIAL ........................................................54

6.1.1 Evolução da área de retração da lesão cicatricial ..........................................54

6.2 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DA REEPITELIZAÇÃO, COLAGENIZAÇÃO,

VASCULARIZAÇÃO, POLIMORFONUCLEARES E MONONUCLEARES .................61

6.2.1 Histopalogia de tecidos coletados .....................................................................61

6.3 AVALIAÇÃO DO ENSAIO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE

(MPO) EM PLASMA DE RATOS.........................................................................................68

6.4 AVALIAÇÃO DA DOSAGEM DE CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS IL-6 E

TNF-α .......................................................................................................................................70

7 CONCLUSÕES............................................................................................................77

REFERÊNCIAS......................................................................................................................79

ANEXO ....................................................................................................................................94

1 INTRODUÇÂO

17

Cicatrização é um processo pelo qual um tecido lesado é substituído por

tecido conjuntivo vascularizado. A cicatrização constitui conjunto dinâmico de

alterações teciduais importantes na manutenção da integridade do organismo, que

envolve inflamação, quimiotaxia, proliferação celular, diferenciação e remodelação.

(CARRICO et al., 1984; HATANAKA; CURI, 2007).

No processo de cicatrização estão envolvidos os componentes da matriz

extracelular, células residentes (queratinócitos, fibroblastos), leucócitos (neutrófilos,

macrófagos/monócitos), bem como mediadores de natureza protéica (citocinas e

fatores de crescimento) É uma resposta tecidual às lesões, sejam induzidas por

traumatismo ou por procedimentos cirúrgicos (HATANAKA; CURI, 2007).

A pele desempenha papel importante de proteção e manutenção da defesa,

pois é ela quem faz a delimitação com o meio externo e protege nosso organismo

aos agentes invasores e agressões físicas. Uma ferida ou uma lesão geram

estímulos inflamatórios e podem provocar a perda da integridade cutânea e até

mesmo um desequilíbrio na fisiologia do tecido ou órgão se não houver um reparo

adequado.

No entanto, quando o estímulo inflamatório não pode ser eliminado ou

removido, desencadeia- se uma resposta complexa, envolvendo todo o organismo e

levando a processo inflamatório crônico, o qual muitas vezes pode ser deletério

(CONTRERA et al., 1985).

A instalação de um processo inflamatório crônico tem sido considerada a

base de muitas doenças, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes e algumas

doenças dermatológicas (ROBERT; KUPPER, 1999; DEBENEDICTIS et al., 2001;

MUELLER, 2006).

Existe uma grande variedade de agentes anti-inflamatórios disponíveis no

mercado, mas, alguns fatores comprometem a adesão do paciente ao tratamento

como a posologia, efeitos adversos indesejáveis, custo elevado do tratamento, baixa

eficácia entre outros (LEUNG et al., 2004; GOTTLIEB, 2005).

Com o objetivo de acelerar o processo de cicatrização, muitos estudos têm

sido direcionados para entender os eventos que envolvem a inflamação e sua

relação com a cicatrização. O conhecimento das bases dermatológicas de uso

tópico e de suas características na aplicação em processos de cicatrização é

18

importante para que estas sejam inseridas como veículos eficazes para ativos no

tratamento e possíveis agravos de patologias.

Diversas afecções dermatológicas estão relacionadas com o desenvolvimento

de inflamações que podem evoluir a patologias letais. O combate efetivo a

inflamação ocasionada por lesões de pele pode ser evidenciada por uma rápida e

ativa cicatrização. Na maior parte dos casos o uso de anti -inflamatórios e

cicatrizantes tópicos, como as pomadas, acarreta reações adversas e indesejadas,

piora no quadro e muitas vezes não apresenta bons resultados.

Para uma substância penetrar na pele, é preciso atravessar duas barreiras: a

camada córnea como a película lipídica que a reveste exteriormente e as

assentadas da epiderme. Algumas substâncias lipossolúveis são absorvidas através

da pele. Esta propriedade embora não necessariamente uma “função” no sentido de

ter uma finalidade biológica, é aproveitada na administração de certos agentes

lipossolúveis terapêuticos para a pele (ROSS; ROWRELL, 1999; LACHMAN;

LIEBERMAN; KANING, 2001).

O uso de formulações tópicas na cicatrização, principalmente bases

dermatológicas com características similares a pele, minimiza as decorrências dos

medicamentos alopáticos e por ser de fácil preparo e aplicação oferece um valor

acessível para a comunidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar se as bases

possuem alguma propriedade que facilite a cicatrização, determinando sua possível

aplicação em formulações como veículo com atividade anti-inflamatória e cicatrizante

tópica em feridas cutâneas abertas em ratos. Investigando os possíveis mecanismos

envolvidos com a atividade anti-inflamatória e cicatrizante destas preparações

através das técnicas bioquímicas e farmacológicas “in vivo” e “in vitro”.

19

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade anti-inflamatória e cicatrizante tópica de bases

dermatológicas em feridas cutâneas abertas em ratos investigando os possíveis

mecanismos envolvidos com a atividade anti-inflamatória e cicatrizante destas

preparações através das técnicas bioquímicas e farmacológicas in vivo e in vitro.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar a atividade cicatrizante das diferentes formulações de bases

dermatológicas em lesões dorsocostais de ratos pela da área de retração nos

intervalos de dias através do software ImajeJ;

Determinar histologicamente a proliferação fibroblástica (colagenização),

reepitelização, presença de neutrófilos e polimorfonucleares bem como a

vascularização nos tecidos cicatriciais após a aplicação das bases;

Avaliar a capacidade das formulações modularem as citocinas inflamatórias -

através de testes bioquímicos de dosagem de TNF-alfa e IL-6;

Determinar o efeito das formulações sobre a peroxidação lipídica nos tecidos

de cicatrização através das substâncias que reagem com o ácido

tiobarbitúrico (TBARS);

Avaliar os níveis de mieloperoxidase, indicativo da presença de

polimorfonucleares, nas lesões dos grupos tratados com as formulações.

20

3 JUSTIFICATIVA

Agressões físicas e a exposição ao meio ambiente geram estímulos

inflamatórios e podem provocar a perda da integridade cutânea e até mesmo um

desequilíbrio na fisiologia do tecido e ou órgão se não houver um reparo adequado.

A cicatrização compreende uma série de eventos que envolvem células e

mediadores ao quais tornam esse processo muito importante para a manutenção da

homeostasia do órgão cutâneo.

Muitas formas dermatológicas podem ser aplicadas para acelerar o

fechamento da lesão e impedir o agravamento que pode gerar uma disfunção

crônica. Dentre as formas mais utilizadas, destacam-se as pomadas de uso tópico.

As bases para pomadas geralmente possuem caráter lipossolúvel ou hidrossolúvel e

são desenvolvidas para receber ativos medicamentosos.

Este trabalho foi realizado para testar as bases dermatológicas de pomadas

analisando seu potencial anti-inflamatório e cicatrizante e demonstrar qual tipo de

base é mais eficaz na cura da lesão. Justifica-se pela importância de se evidenciar

quais compostos, e sua natureza química, modulam os eventos bioquímicos e

histológicos de maneira mais ativa, bem como sua sinérgica utilização para

incorporar princípios ativos com propriedades medicamentosas.

21

4 REVISÃO DE LITERATURA

4.1 MORFOFISIOLOGIA DA PELE

A pele é o maior órgão do corpo humano com uma área de extensão de

aproximadamente 2m2 e representa 16% do peso corpóreo. A estrutura, as

propriedades e a sua composição variam de forma considerável em cada organismo.

A pele e seus anexos desempenham diversas funções, dentre elas: proteger contra

lesões físicas, químicas e biológicas, impermeabilização, promover os sentidos,

sintetizar certos hormônios e vitaminas, regular a temperatura corporal, metabolizar

xenobióticos e excretar substâncias (HAAKE; SCOTT; HOLBROOK, 2001; CHUONG

et al., 2002).

O contato direto com o meio ambiente, faz da pele uma barreira protetora que

impede que agressores externos interfiram com a homeostasia do organismo. Sua

principal função é a proteção primária do organismo, contra estímulos provenientes

do meio externo. A pele é ainda o componente periférico do sistema imune, sendo

capaz de iniciar uma resposta imune primária frente a um patógeno. É na verdade

um órgão complexo que envolve diversos tipos celulares e estruturas (SPELLBERG,

2000; DEBENEDICTIS et al., 2001; MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007).

Na classificação histológica a pele faz parte do sistema tegumentar composta

por duas principais camadas - a epiderme e a derme – e uma fáscia subcutânea

chamada hipoderme (Figura 1) que se encontra profundamente na derme, ainda que

tenha a mesma origem da derme, não é componente da pele, apenas desempenha

função de suporte e união com os órgãos subjacentes (GRATIERI, GELFUSO,

LOPEZ, 2008; ARDA; GÖKSÜGÜR; TÜZÜN, 2014).

22

Fonte: Adaptado de Macneil (2007).

A epiderme, camada superior da pele, é relativamente fina (0,1-0,2 mm de

profundidade) e está firmemente ligada à derme pela membrana basal (MACNEIL,

2007). Esta membrana possui funcionalidades como permeabilidade seletiva de

nutrientes, pois a epiderme é avascularizada. É dividida em cinco camadas com

funções distintas: estrato córneo, camada lúcida, granulosa, espinhosa e basal (DE

JESUS; DA SILVA FERREIRA; MENDONÇA, 2006; KUHNEN; SILVA, 2010).

O estrato córneo é uma barreira cutânea e tem um papel na resposta

inflamatória, com ativação de melanócitos, angiogênese e fibroplasia, cuja

intensidade depende, basicamente, da intensidade da agressão (ADDOR; AOKI,

2010).

Na camada espinhosa encontram-se os queratinócitos que são responsáveis

pela produção dos filamentos de queratina (queratinização) e principalmente síntese

de agentes antioxidantes (glutationa redutase, peroxidase, catalase), citocinas,

quimiocinas, queratohialina, entre outros (ALVES et al., 2005).

Cerca de 95% da epiderme é constituída de queratinócitos em diferenciação,

e os 5% restantes por melanócitos, células de Langerhans, com função imunológica,

Figura 1: Estrutura da pele humana demonstrando as duas camadas (epiderme e derme)

e a fáscia subcutânea (hipoderme).

23

e células de Merkel, com função sensória (KOSTER; ROOP, 2004; SCHAEFER;

REDELMEIER, 1996, apud PÓVOA; DINIZ, 2011).

A derme varia de espessura, dependendo do seu local no corpo, e é

composta principalmente de colágeno I, com inclusões dérmicas de fios de cabelo e

glândulas sudoríparas, que são revestidas com queratinócitos epidérmicos. A derme

é bem vascularizada e também contém receptores para o tato, temperatura e dor.

Os queratinócitos perdem seus núcleos e, eventualmente, tornar-se uma folha de

queratina. As camadas epidérmicas queratinizadas superiores tornam-se uma

barreira, que resiste à entrada de bactérias e impede a perda de fluidos (SORREL;

CAPLAN, 2004).

A derme é constituída de polissacarídeos (hialuronidatos e condroitinsulfatos),

substância fundamental (glicoproteínas, proteoglicanas e glicosaminoglicanas),

material fibrilar (fibras colágenas, fibras elásticas e fibras reticulares), receptores

sensoriais (corpúsculos de Meissner, corpúsculos de Pacini), fibroblastos, que

sintetizam macromoléculas de colágeno e elastina (SAMPAIO; RAE; HENRIQUES,

2000; HAAKE; SCOTT; HOLBROOK, 2001; RYAN, 2004).

Na derme os vasos sanguíneos e linfáticos permitem que ocorra infiltração de

células migratórias importantes no processo de resposta de defesa inata ou imune e

de cicatrização, como os macrófagos, linfócitos, eosinófilos, neutrófilos e outros

(RYAN, 2004).

A hipoderme possui espessura variável e é composta exclusivamente de

tecido adiposo (metade da gordura do corpo está localizada na hipoderme), também

tem função no estoque energético, isolamento térmico e proteção contra injúria

(SAMPAIO; RAE; HENRIQUES, 2000).

Nesse contexto, a pele é muito mais do que simplesmente uma barreira física

passiva entre o meio externo e interno, mas também uma extensão do sistema

imunológico (WILLIAMS; KUPPER, 1996).

Na manutenção e desenvolvimento da defesa contra agentes i nvasores ou

lesões a pele desencadeia um processo inflamatório que é mantido pela interação

de diversos tipos celulares como: terminações nervosas, queratinócitos, mastócitos,

fibroblastos, macrófagos, células endoteliais e células migratórias como neutrófilos,

eosinófilos, monócitos e linfócitos. Estas células liberam, ativam e sintetizam

moléculas e susbtâncias chamadas de pró-inflamatórias como as citocinas

24

(BUCKLE; HEDGECOCK, 1997; PUIGNERO; QUERALT, 1997; BHAGWAT et al.,

1999; CRUVINEL et al., 2010).

Na epiderme humana pelo menos 5 tipos diferentes de células (melanócitos,

queratinócitos, células de Langerhans, linfócitos T e NK) fazem a defesa da

epiderme e derme subjacente ao ataque a agentes biológicos, químicos, energia

solar ou agentes hostis (CHUONG et al., 2002).

4.2 CICATRIZAÇÃO CUTÂNEA

Processos anatomopatológicos podem ocorrer na pele como: degenerações,

alterações metabólicas, proliferações, malformações, disfunções e inflamações.

Estas alterações são decorrentes a diversos estímulos nocivos como ação de

toxinas, organismos patogênicos, radiação ultravioleta, extremos de temperatura,

agentes mecânicos, agentes químicos e resposta auto-imune. Imediatamente estes

estímulos desencadeiam respostas com função protetora (resposta inflamatória) cuja

finalidade é eliminar o agente agressor, para impedir sua disseminação a outras

regiões do organismo, promover o reparo tecidual e restabelecer a homeostasia da

pele (WILLIAMS; KUPPER, 1996; SAMPAIO; CASTRO; RIVITTI, 2000; CHUONG et

al., 2002; FIRESTEIN, 2004).

A perda da integridade da pele, decorrente de alguma lesão ou doença, pode

potencializar o aparecimento de um desequilíbrio fisiológico, que se não tratado

devidamente poderá resultar numa perda de viabilidade do tecido ou até mesmo na

morte do indivíduo (LANZA; LANGER; VACANTI, 2011).

A resposta inflamatória é caracterizada, a nível clínico, por quatro sinais

clássicos, que incluem calor, eritema, edema e dor. Porém, uma resposta

inflamatória exacerbada pode promover uma descompensação fisiológica, levando a

perda de função do tecido e/ou órgão (SERHAN; SAVILL, 2005).

Após uma agressão ou estimulo cutâneo ocorre uma resposta inflamatória e

em seguida a cicatrização. Esta envolve reações cruzadas entre as células da

epiderme e derme incluindo substâncias como as citocinas e fatores de crescimento.

O processo de cicatrização envolve três fases: inflamação (fase exudativa),

reconstrução ou formação (fase proliferativa) e remodelação tecidual (fase

25

regenerativa) (EMING; KRIEG; DAVIDSON, 2007; MARTINS et. al., 2006; PÓVOA;

DINIZ, 2011).

4.2.1 Fase inflamatória - 1 a 3 dias

Na fase inflamatória, haverá um aporte de células sanguíneas no local em

resposta a inflamação, devido ao aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos

(vasodilatação), o que facilita o deslocamento de células como leucócitos

polimorfonucleares (neutrófilos e PMN) e plaquetas até o local lesionado (CLARK;

GHOSH; TONNESEN, 2007).

Durante esta fase inicia-se a cascata da coagulação. A trombina e o colágeno

formados durante o combate a hemorragia ativam a agregação plaquetária. A

trombina atua sobre o fibrinogênio originando fibrina, esta, conjuntamente, com a

fibronectina, irá formar uma matriz contrácti l essencial à cicatrização. Nesta matriz

irão multiplicar-se e crescer monócitos, fibroblastos, neutrófilos e queratinócitos que

migram através da ferida para iniciar a reepitelização . Estas células fazem a

remoção e desinfecção inata do tecido morto, por fenômenos de fagocitose,

libertação de enzimas proteolíticas e radicais livres. O processo de fagocitose é

realizado pelos monócitos que se transformam em macrófagos. Os macrófagos são

grandes células que no processo inflamatório produzem inúmeras citocinas, radicais

livres e enzimas (FALABELA; FALANGA, 2001; HARDING; MORRIS; PATEL, 2002;

CLARK; GHOSH; TONNESEN, 2007).

O coágulo é formado por colágeno, trombina e plaquetas e servem de reserva

proteica energética para a síntese de citocinas e fatores de crescimento aumentando

seus efeitos. Assim a resposta inflamatória se inicia com vasodilatação e aumento

da permeabilidade vascular, ocasionando a quimiotaxia, quando os neutrófilos

migram para a ferida (CAMPOS; BORGES-BRANCO; GROTH, 2007).

Os mediadores pró-inflamatórios liberados tanto pelas células residentes do

tecido cutâneo quanto pelas células transientes (neutrófilos, linfócitos, monócitos),

incluem os metabólitos do ácido araquidônico (AA), histamina, serotonina,

substância P, citocinas, óxido nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio, entre

outras (KUPPER, 1990; SIMMONS, 2006).

26

Vinte e quatro horas após a lesão, Broughton, Janis e Attinger (2006), relatam

que os neutrófilos estão em maior concentração e são as primeiras células atraídas

por substâncias quimiotáticas (liberadas pelas plaquetas) para a ferida. As ROS são

produzidas pelos neutrófilos e auxiliam na destruição bacteriana.

Os neutrófilos são substituídos por macrófagos gradativamente. Infiltração de

macrófagos no local da ferida é regulada por fatores quimiotáticos, incluindo fatores

de crescimento, citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. Após 48-96 horas da

lesão os macrófagos migram para a ferida antes dos fibroblastos. Tem função de

terminar a remoção do tecido desvitalizado e secretar citocinas e fatores de

crescimento (DIPIETRO et al., 1998; FRANK et al., 2000; WETZLER et al., 2000;

WERNER; GROSE, 2003; BROUGHTON; JANIS; ATTINGER, 2006).

Os monócitos aderidos a matriz se transformam em macrófagos, onde as

citocinas essenciais para a cicatrização liberadas por estes são PDGF, TGF-α, FGF,

ILGF, TGF-β, interleucinas 1 (IL-1), EGF e TNF-α (BEANES et. al., 2003;

BROUGHTON; JANIS; ATTINGER, 2006).

4.2.2 Fase proliferativa - 4 a 21 dias

A partir dos bordos da ferida vai ocorrendo a epitelização, ou reepitelização

dos anexos cutâneos, ou dos restos de tecidos que ainda existem na lesão (CLARK;

GHOSH; TONNESEN, 2007).

Ainda nesta fase se inicia os processos de angiogênese, fibroplasia e

contração da cicatriz. A angiogênese ou neovascularização caracteriza-se pelo

crescimento de capilares a partir dos vasos adjacentes a lesão, onde este

crescimento será induzido pelas citocinas de células vizinhas e matriz extracelular. A

fibroplasia que é migração até o local lesionado de fibroblastos que é induzida pela

trombina, pelo pH ácido no local e pelos fatores quimiotáticos. Estes fibroblastos

segregam substancias que fazem parte da matriz extracelular como o colágeno,

elastina, fibronectina, proteoglicanos e outros (CLARK; GHOSH; TONNESEN, 2007).

As citocinas são mediadores protéicos, compõem um grupo heterogêneo de

polipeptídeos, cujas ações envolvem o desenvolvimento da resposta imune celular e

humoral, indução da inflamação, controle da proliferação e diferenciação celular,

27

bem como a indução da cicatrização (WILLIAMS; KUPPER, 1996; UCHI et al., 2000;

SOMMER, 2001; VARELLA; FORTE, 2001).

As citocinas primárias (IL-1 e TNF- α) resulta na ativação de algumas vias de

sinalização e promovem a ativação de fatores de transcrição como fator de

transcrição nuclear Kappa B (NF-kB) e proteína ativadora-1 (AP-1). Estes fatores de

transcrição quando ativados induzem a transcrição gênica de diversas citocinas

(TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, TGFB1 - fator de crescimento tumoral).

Geralmente as citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-18, estão

envolvidas no início e amplificação da resposta inflamatória (BARNES; KARIN, 1997;

DELHASE, 2003; WINYARD, 2003; CALIXTO et al., 2004; PASCUAL; GLASS, 2006;

LAWRENCE; GILROY, 2007).

A IL-6 pode ser produzida por vários tipos celulares, sendo as células B, T e

monócitos as principais fontes. Os estímulos para a sua síntese são IL-1, LPS e

TNF-α. É uma citocina pleiotrópica que influencia respostas imuno-antígeno

específicas e reações inflamatórias, sendo um dos maiores mediadores da fase

aguda da inflamação. Portanto quando o processo inflamatório precisa ser reparado,

IL-6 é um dos primeiros mediadores a agir. É responsável pela substituição de PMN

ou eosinófi los por monócitos e macrófagos fagocíticos. Tem ainda ação importante

na atração de eosinófilos para o local de inflamação (HEINRICH; CASTELL;

ANDUS, 1990; ROTHEWELL, 1991 apud VARELLA; FORTE, 2001; WILLOUGHBY

et al., 2000; LAWRENCE; GILROY, 2007).

A angiogênese é estimulada pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e é

caracterizada pela migração de células endoteliais e formação de capilares,

essencial para a cicatrização adequada (CAMPOS; BORGES-BRANCO; GROTH,

2007).

O TNF-α também tem um papel importante no processo de remodelação do

tecido após um dano, pois atua como fator angiogênico e como fator de crescimento

dos fibroblastos (BURBACH; ANSEL; ARMSTRONG, 2000).

Os fibroblastos e as células endoteliais são as principais células da fase

proliferativa. Os fibroblastos dos tecidos vizinhos migram para a ferida e são atraídos

quimiotaticamente por fatores de crescimento como o PDGF e TGFβ e sintetizam

colágeno tipo I, e especialmente o colágeno do tipo III. Essa grande produção e

deposição do colágeno é influenciada pelo TGFβ que também é responsável pela

28

contração da cicatriz junto com os miofibroblastos (KARUKONDA et. al., 2000;

BROUGHTON; JANIS; ATTINGER, 2006; LI; CHEN; KIRSNER, 2007).

4.2.3 Fase de remodelamento – 21 dias a 1 ano

A remodelação consiste em reformulação da matriz extracelular. Tem a

função de reestabelecer a integridade total da derme e epiderme no local da lesão.

Queratinócitos, fibroblastos e macrófagos vão produzir enzimas colagenases e

proteases que irão permitir uma reposição e consolidação do colágeno juntamente

com a maturação da cicatriz. O aparecimento dos fibroblastos é dominante e estes

liberam colágeno tipo I e III (BEANES et. al., 2003; CLARK; GHOSH; TONNESEN,

2007).

A característica mais importante desta fase é a deposição de colágeno de

forma organizada. As colagenases agem de forma a equilibrar a deposição do

colágeno novo e a lise do colágeno velho. Com o tempo o colágeno tipo III é

substituído pelo colágeno tipo I que é mais espesso. Ocorre uma diminuição da

angiogênese e os macrófagos começam a desaparecer. Os principais fatores de

crescimento envolvidos nesta fase são o TNF-α, PDGF e TGF-β (KARUKONDA et

al., 2000; BEANES et al., 2003; BROUGHTON; JANIS; ATTINGER, 2006; LI; CHEN;

KIRSNER, 2007).

As metaloproteinases da matriz (MMP) e os inibidores de metaloproteinase da

matriz (TIMP) são enzimas extremamente importantes na remodelação do tecido

conjuntivo durante o desenvolvimento, homeostase e cicatrização. O TGF-β também

regula positivamente a expressão de TIMP, diminui a produção de MMP, e aumenta

a expressão de proteínas de adesão de tecido. A produção de TIMP também é

regulada positivamente pela IL-6. O TNF-α estimula a liberação de IL-6 pelos

fibroblastos, aumentando ainda mais a produção de TIMP (BROUGHTON; JANIS;

ATTINGER, 2006; FRANCO et al., 2009).

Quando a deposição de colágeno é maior, a cicatrização obteve êxito. Após

um ano a ferida apresentará um colágeno menos organizado que a pele saudável.

Todas estas alterações resultam na contração da ferida e a formação de um tecido

cicatricial. O processo de remodelação pode continuar indefinidamente, e o tecido

29

cicatricial não atingir a força tênsil da pele ilesa, podendo chegar a 80% desta força

em 3 meses (SINGER; CLARK, 1999; BROUGHTON; JANIS; ATTINGER, 2006).

4.3 CITOLOGIA DA INFLAMAÇÃO E CICATRIZAÇÃO

4.3.1 Polimorfonucleares (PMNs, Neutrófilos)

Estas células são recrutadas para iniciar o desbridamento do tecido

desvitalizado e fagocitar os agentes infecciosos. Para executar esta tarefa, os

neutrófilos liberam uma grande variedade de substâncias antimicrobianas altamente

ativas (espécies reativas de oxigênio (ROS), peptídeos catiônicos, eicosanóides) e

enzimas proteases (WEISS; 1989). Theilgaard-Mönch et al. (2004), cita que a

migração de PMNs para lesões da pele induz uma grande ativação da transcrição,

que pode regular o destino e a função celular e promover a cura de feridas.

Algumas quimiocinas e seus receptores são os mais prováveis mediadores

cruciais para o recrutamento de neutrófi los durante o reparo tecidual (GILLITZER;

GOEBELER, 2001; ESCHE; STELLATO; BECK, 2005).

Apesar do conhecimento detalhado sobre a síntese de mediadores liberados

por PMNs e mecanismos envolvidos e seu papel na defesa, essas células podem

ser benéficas ou prejudiciais para a cicatrização. Experimentos na década de 1970

mostraram que a depleção de neutrófilos por anti-soro de cobaias não afetaram

significativamente a reparação tecidual de feridas incisionais em condições estéreis

(SIMPSON; ROSS, 1972).

Um estudo recente da Dovi, He e DiPietro (2003), uti lizando uma abordagem

semelhante de depleção de neutrófilos, confirmou parcialmente esses estudos

iniciais. Embora os parâmetros de reparação por via cutânea não foram afetados

pela neutropenia, a reepitelização foi significativamente acelerada. No entanto, neste

estudo, não fica claro se a falta de PMNs tem, um efeito benéfico direto sobre a

reepitelização ou se o aumento relativo em outros subconjuntos de células

inflamatórias tais como os macrófagos, pode ser responsável pela acelerada

epitelização.

30

Estudos in vitro recentes demonstraram que os neutrófi los isolados a partir de

sítios de reparação podem modular a expressão fenotípica e perfil de citocinas de

macrófagos, regulando assim a resposta imune inata durante a cicatrização (DALEY

et al., 2005). Além disso, um estudo mostra que a contração de feridas de excisão

em ratos com depleção de heterodímero de CD18, que codifica a cadeia comum das

proteínas beta-2-integrinas, foi significativamente retardada, provavelmente devido à

diferenciação de miofibroblastos prejudicada (PETERS et al., 2005). Os autores

especularam que em feridas deficientes de CD18, as quais estão desprovidas de

neutrófilos, a falta destes no local da ferida priva macrófagos da sua principal função

que é o estímulo de secreção de TGF-β1, um mediador chave envolvido na

diferenciação de miofibroblastos. Além disso, a cura de feridas prejudicada é uma

característica importante de doenças humanas que são caracterizadas por uma

deficiência na função de PMN (ROOS et al., 1993; KUIJPERS et al., 1997).

4.3.2 Macrófagos/Monócitos

Estas células constituem a primeira linha de defesa e atuam no processo de

reparo cutâneo em diferentes fases. Estão em grande quantidade na fase

inflamatória, tendo seu pico durante a fase de granulação decrescendo durante a

fase de maturação. Atuam na estimulação de secreção de fatores de crescimento e

citocinas que são importantes na síntese de colágeno e na fibrose. Macrófagos tipo

M1 produzem TNF-α e IL-6 (DELAVARY et al., 2011).

Os macrófagos proveem continuamente citocinas pró-inflamatórias

importantes para o estímulo de fibroblastos (WERNER; GROSE, 2003).

Em um estudo com modelo animal de cicatrização, mostrou que em ratos

modificados geneticamente sem o gene para a produção de IL-6, a lesão levou até

três vezes mais tempo para curar do que os dos animais controle. Desta forma a IL-6

é essencial para a resposta de cicatrização e também através do seu efeito

quimiotáxico sobre os neutrófilos (GALLUCCI et al., 2000).

Alguns estudos mostraram a importância de macrófagos na cicatrização, onde

a depleção de macrófagos em camundongos resultou num atraso significativo da

31

cicatrização e uma redução da proliferação de fibroblastos (LEIBOVICH; ROSS,

1975; MIRZA; DIPIETRO; KOH, 2009).

Estudos mais recentes têm apoiado e estendido estas observações

(NAGAOKA et al., 2000; MORI et al., 2002) têm demonstrado um atraso drástico no

fechamento da lesão em ratos associado com uma redução significativa na

infiltração de neutrófilos e macrófagos.

4.3.3 Colágeno

A proteína mais abundante do tecido conectivo em fase de cicatrização é o

colágeno. As formas diferenciadas da composição química determinam as suas

funções biológicas. Foram descritas até o presente 19 isoformas (tipos) de colágeno,

codificadas por um único gene. O colágeno é sintetizado pelos fibroblastos os quais

entram em mitose apenas por sobrecarga funcional ou em resposta a lesões

(ROBSON; STEED; FRANZ, 2001; RODRIGUES, 2009).

Os tipos de fibras colágenas do tecido conjuntivo são helicoidais, com

sequência tripeptídica repetitiva composta de glicina-X-Y, sendo X representada pelo

aminoácido prolina e Y pelo aminoácido hidroxiprolina. Os tipos mais comuns de

colágeno são do Tipo I, II e III. A derme sã contém aproximadamente 80% de

colágeno tipo I e 20 % de colágeno tipo III. Já o tecido de granulação expressa 30 a

40 % de colágeno do tipo III, sendo considerado colágeno imaturo (ROBSON;

STEED; FRANZ, 2001).

Os colágenos são as principais proteínas da matriz extracelular (MEC)

perfazendo aproximadamente 25% da massa protéica total do organismo, sendo os

componentes estruturais primários da MEC, tendo papel fundamental na arquitetura

tecidual, na resistência dos tecidos e em uma ampla variedade de interações célula-

célula e célula-matriz (BAYNES; DOMINICKZAC, 2000).

A formação da matriz extracelular é, pois, resultante de um balanço entre a

deposição (síntese) e degradação de colágeno. A degradação do colágeno se inicia

precocemente e é muito ativa durante o processo inflamatório (CAMPOS; BORGES-

BRANCO; GROTH, 2007).

32

Com o passar do tempo, os fibroblastos se diferenciam em miofibroblastos,

que induzirá a ferida a se contrair 0,60 a 0,75 mm por dia. Por volta do décimo dia, à

ferida terá a aparência de massa fibrótica característica da cicatriz. Com a evolução

do processo, as fibras de colágeno do tipo III vão sendo substituídas por fibras do

tipo I que é mais resistente e a maioria das células desaparecem forma ndo

finalmente a cicatriz (COELHO; REZENDE; TENÓRIO, 1999; BALBINO; PEREIRA;

CURI, 2005).

4.4 BIOQUÍMICA E PERMEABILIDADE CUTÂNEA

A bioquímica da pele é composta por substâncias orgânicas e inorgânicas.

Tais compostos são responsáveis pelas inúmeras reações químicas e metabolismo

cutâneo que incluem a síntese de moléculas e homeostasia. Os compostos

inorgânicos incluem a água e os sais minerais. Os compostos orgânicos estão

divididos em quatro classes: Carboidratos, Lípideos, Proteínas e Ácidos Nucleicos. A

água é o composto mais abundante do organismo humano e representa cerca de

70% da constituição da pele, encontrando-se distribuída entre a epiderme e a

derme. A hidratação da pele aumenta nas camadas mais profundas, onde a maior

quantidade de água está na derme. A água é fundamental em toda a fisiologia dos

tecidos e no transporte de substâncias entre as células (COHEN; WOOD, 2002;

PRISTA et al., 2008).

A permeabilidade da pele está relacionada tanto ao material cornificado dos

queratinócitos como ao material intercelular, principalmente o conteúdo lipídico

deste. Sendo assim, as diferenças regionais de permeabilidade estão associadas

principalmente ao conteúdo lipídico, e em segundo plano à espessura do estrato

córneo (ARCHER, 2010).

O principal fator condicionante da absorção cutânea de fármacos é o seu

coeficiente de partição óleo/água, pois é fundamental que este penetre bem através

da pele e se dissolva perfeitamente nos fluidos aquosos (solubilidade em água) do

organismo e se correlacione com suas características físico-químicas (TALREJA et

al., 2001).

33

Michaels, Chandrasekaran e Shaw, (1974) propuseram um modelo da

estrutura básica para explicar a permeabilidade cutânea conhecido como “brick and

mortar”, ou seja, “tijolo e cimento”, onde os “tijolos” são os corneócitos e o “cimento”

é o conteúdo lipídico extracelular. No decorrer dos anos, este modelo foi revisado e

confirmado, sendo o mais aceito até hoje e o mais adequado para a compreensão

do arranjo celular e dos trajetos para a permeabilidade cutânea (ADDOR; AOKI,

2010; TROMMER; NEUBERT, 2006).

O estrato córneo é composto por diversas camadas de células achatadas e

queratinizadas (corneócitos) suspensas em matriz lipídica extracelular. Os

corneócitos são células anucleadas repletas de filamentos de queratina ligados a um

envelope periférico cornificado, composto por ligações cruzadas de proteínas.

Enquanto isso na superfície externa desse envelope essas proteínas estão ligadas

de forma covalente a hidroxiceramidas formando o envelope lipídico.

Resumidamente o estrato córneo é composto por uma emulsão epicutânea

conhecida como manto hidrolipídico, naturalmente formada por substâncias

hidrofílicas e lipofílicas (MADISON, 2003).

A hidratação da camada córnea é uma das principais estratégias usadas para

aumentar a penetração cutânea. A abertura da estrutura compacta da camada

córnea é estimulada pela água. O teor de água na camada córnea pode ser

aumentado pelo fornecimento de água do veículo à pele (hidratação) ou pelo

impedimento da perda de água da pele (oclusão), aplicando formulações

parcialmente oclusivas sobre esta (DANIELS, 2010; WILLIAMS; BARRY, 2012).

4.5 BASES DERMATOLÓGICAS

Nas preparações de bases para aplicação cutânea os veículos usados são

geralmente constituídos por diversos excipientes, formando uma mistura com as

caraterísticas pretendidas (SILVA et al., 2010).

Dentre as diversas formas farmacêuticas existentes para veicular ativos

cicatrizantes, destacam-se as pomadas, as quais podem ser definidas como

preparações semi-sólidas, estáveis, de média consistência, para uso externo

(aplicadas sobre a pele ou sobre certas mucosas), constituídas pelos princípios

34

ativos e por excipientes com características lipofílicas ou hidrofílicas. Com a

finalidade de exercer uma ação local ou de realizar a penetração percutânea de

princípios ativos, a base de pomada deve apresentar aspecto homogêneo. Elas são

constituídas basicamente por excipientes e prontas para veicular os princípios ativos

(FONSECA, FERREIRA, 2004; THOMPSON; SILVEIRA, 2006; RANG et al., 2012;

ALLEN JR; ANSEL; POPOVICH, 2013; KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).

As bases de pomadas são utilizadas por seus efeitos físicos como proteção,

emoliência ou lubrificação, ou como veículo para pomadas medicamentosas. Assim

sendo, tais bases são úteis para incorporar ativos cicatrizantes, pois além do ativo

auxiliar na cicatrização, a base também tem função protetora e emoliente,

protegendo o local, que geralmente está sensibilizado pela lesão (ALLEN JR;

ANSEL; POPOVICH, 2013).

Por não possuírem grande quantidade de água e conter grandes

concentrações de agentes espessantes lipofílicos, as bases para pomadas

geralmente são oclusivas, pois formam um fi lme espesso sobre a pele, protegendo a

mesma de agentes externos agressivos que possam agravar a lesão. Além disso, os

neutrófilos são mais ativos em ambientes ocluídos (BETTES, 2003; SANTOS;

VIANNA; GAMBA, 2007; ALLEN JR; ANSEL; POPOVICH, 2013).

As pomadas proporcionam uma boa hidratação da pele e aumentam a

penetração cutânea de princípios ativos veiculados a estas. Deste modo, o uso

dessas bases pode auxiliar na ação do ativo cicatrizante. A matéria-prima lanolina,

presente em muitas bases de pomadas, por ser de origem animal, auxilia na

permeação e hidratação da pele (ALLEN JR; ANSEL; POPOVICH, 2013).

Devido às suas propriedades hidratantes, o petrolato branco (vaselina), uma

mistura de hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa, por muito tempo foi

considerado hidratante padrão em formulações. Os unguentos são utilizados por

formar uma camada oclusiva na superfície do estrato córneo bloqueando a perda de

água transcutânea (FLESCH, 1963).

Porém um estudo feito por Ghadially, Halkier-Sorensen e Elias (1992)

comprovou que o petrolato branco não age como uma membrana epicutânea

impermeável. Em vez disso, ela permeia todos os interstícios subcutâneos

acelerando a cicatrização apesar de suas propriedades oclusivas.

A lanolina é um composto lipofílico, utilizada como veículo em algumas

preparações farmacológicas para tratamento de feridas, devido a sua propriedade

35

oclusiva, de penetração e manutenção da hidratação da pele. Ela é composta por

uma mistura de ésteres e poliésteres de álcoois de cadeia longa e por ácidos

graxos, com predominância dos insaturados, representados por uma proporção

elevada dos ácidos eicosapentaenóico (EPA), linoléico e docosa-hexaenóico

(STONE, 2000; MARTINS et al., 2005).

Na pesquisa de Martins et al. (2005), com aplicação de lanolina em feridas de

ratos, observou-se um aumento médio de 14% da área, imediatamente após a

cirurgia, porém após o terceiro dia as lesões tiveram uma regressão até o final do

experimento.

Os polietilenoglicóis (PEG) são substâncias que apresentam características

tipicamente hidrófilas, sendo utilizados em formulações hidrossolúveis, pois são

excelentes emulsivos de óleo em água. Os polietilenoglicol 4000 e polietilenoglicol

400 são estáveis e não irritantes para a pele (FLECK; DE SOUZA TIMM, 2006;

BRASIL, 2012).

O PEG é utilizado em cosméticos e preparações tópicas como agente

espessante, estabilizante e emulsificante tanto em emulsões A/O quanto O/A,

estáveis em grande faixa de pH. Também é utilizado para melhorar as propriedades

emolientes de pomadas e é um agente oclusivo que retarda a perda de água

(FAGRON, 2008).

Já se conhece que durante a resposta inflamatória, os polimorfonucleares

(neutrófilos) são as primeiras células a aparecerem e produzem fatores quimiotáticos

para monócitos/macrófagos e linfócitos T (ZIJLSTRA et al., 2006).

A cicatrização de feridas é um processo dinâmico que envolve eventos

fisiológicos e bioquímicos com o objetivo de promover e garantir a restauração

vascular e tissular. O principal fator desencadeante da cicatrização é a própria lesão

local, com ou sem perda tecidual. Entretanto, quanto mais precoce for o processo de

reparação da área lesada maior o benefício, pois a ferida da pele representa uma

porta de entrada para os mais variados agentes agressores (vírus, bactérias, fungos,

protozoários), colocando em risco a integridade física do indivíduo e podendo

inclusive causar sua morte. Muitas variáveis, tanto de ordem local como sistêmica,

influenciam a cicatrização, entre elas destacam-se algumas bases dermatológicas

que podem acelerar o processo de reparação e cicatrização (DE SOUSA et al.,

2015).

36

O processo de cicatrização de feridas abertas ocorre a partir das bordas da

lesão para o centro. A explicação para isso se deve ao fato das feridas abertas

serem submetidas a um processo de contração da lesão na tentativa de diminuir a

área de exposição e propiciar a reparação. (DE SOUSA et al., 2015).

37

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 ANIMAIS

Para a realização desta pesquisa foram utilizados Rattus norvegicus,

variedade Wistar albinos, machos com idade de 3 a 4 meses, pesando entre 200g e

250g. Os animais foram adquiridos da Universidade Federal de Santa Catarina

(UFSC) e aclimatados durante 15 dias no Biotério da Universidade do Oeste de

Santa Catarina (UNOESC) campus Joaçaba, anterior ao início dos experimentos. Os

animais foram mantidos em ciclo claro-escuro natural (12/12 h), controlados

automaticamente e em temperatura de (22 + 2º C). Os animais foram alimentados

(ração comercial Presence®) e água filtrada ad libitum. Aproximadamente 1 hora

anterior a realização dos experimentos os animais foram transportados até o

laboratório de Farmacologia, onde permaneceram sob condições controladas de luz

e temperatura para ambientação. Os experimentos serão realizados de acordo com

as normas éticas de cuidados do CONSEA - Conselho Nacional de Controle Animal.

Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEUA) da mesma

Universidade e aprovado de acordo com parecer número 009/2014 (Anexo A).

5.2 TÉCNICAS EXPERIMENTAIS

5.2.1 Bases dermatológicas

As formulações das bases dermatológicas foram escolhidas de acordo com o

Formulário Nacional (Farmacopéia Brasileira) de 2005 e 2012, seguindo os critérios

de ser todas da mesma forma farmacêutica pomada. As formulas sofreram

mudanças retirando os conservantes e antioxidantes e as quantidades ajustadas. As

bases de pomadas receberam denominações (siglas) para facilitar a identificação.

38

Tabela 1: Base para pomada hidrossolúvel

POMADA DE POLIETILENOGLICOL (PP)

FÓRMULA

Componentes Quantidade

Macrogol 400 (polietilenoglicol 400) 33,3 g


Propilenoglicol 33,3 g

Fonte: Adaptado de Brasil (2012, p.190).

Tabela 2: Base para pomada hidrossolúvel

POMADA DE POLIETILENOGLICOL II (PPII)

FÓRMULA




Álcool cetílico 5 g


Tabela 3: Base para pomada hidrofílica tipo emulsão O/A

POMADA HIDROFÍLICA (PHA)

FÓRMULA


Fase aquosa

Laurilsulfato de sódio 1 g

Propilenoglicol 12 g

Fase oleosa

Álcool estearílico 25 g

Vaselina sólida 25 g

Água q.s.p. 100 g


39

Tabela 4: Base para pomada de absorção tipo emulsão A/O

PETROLATO HIDROFÍLICO (PH)

FÓRMULA


Colesterol 3 g

Álcool estearílico 3 g

Cera branca de abelha 8 g

Petrolato branco q.s.p 100 g


Tabela 5: Base graxa para pomada de absorção

POMADA DE LANOLINA E VASELINA (PLV)

FÓRMULA


Lanolina anidra 30 g

Petrolato líquido q.s

Petrolato branco q.s.p 100 g


O controle positivo foi utilizado a pomada dermatológica com principio ativo

dexpantenol, nome comercial Cicatenol® (Laboratório EMS S/A) na seguinte

composição:

Cada g da pomada dermatológica contém:

Dexpantenol (vitamina B5).................................................................................. 50 mg

Excipiente* qsp......................................................................................................... 1 g

* álcool cetoestearílico, álcool cetoestearílico etoxi lado, propilenoglicol,

monoisoestearato de glicerila, lanolina, óleo de amêndoas, palmitato de isopropila,

petrolato branco, água purificada (BRASIL, 2014).

O controle negativo foi aplicado solução salina 0,9% com movimentos

semelhantes ao utilizados com as bases.

40

5.2.2 Grupos experimentais

Os experimentos foram realizados em 2 etapas para cada base e os animais

distribuídos nos seguintes grupos:

1ª Etapa: Avaliação das bases dermatológicas sobre a Cicatrização

Após a excização do epitélio dorsal, os animais foram avaliados no 0, 3º, 7º,

14º e 21º dias mediante a mensuração da área de retração do ferimento. Cada

grupo foi composto por 6 animais (+20% de perda devido a anestesia profunda)

conforme Fluxograma 1.

41

Fonte: O Autor

Fluxograma 1: Distribuição dos grupos de animais para aplicação dos controles e bases

dermatológicas

42

2ª Etapa: Avaliação das bases dermatológicas sobre os mediadores

inflamatórios no processo de cicatrização

Após a excização do epitélio dorsal, os animais foram avaliados no 2º dia.

Cada grupo foi composto por 6 animais conforme Fluxograma 1.

5.2.3 Indução do Dano epitelial

O modelo de indução do dano epitelial foi conduzido conforme método

descrito por Ram et al. (2014), com algumas modificações. Os experimentos foram

realizados no Laboratório de Farmacologia da Universidade do Oeste de Santa

Catarina-UNOESC Campus Joaçaba.

Para indução do dano epitelial, cada animal foi anestesiado com cloridrato de

ketamina (Dopalen®) e cloridrato de xilazina (Anasedan®) adquiridos de Ceva

Saúde Animal Ltda, na concentração de 80/20 mg/kg, por via intramuscular. Os

animais foram submetidos à epilação na região dorsal, em área de 24 cm² (6 cm de

comprimento x 4 cm de largura), localizada caudalmente a uma linha imaginária que

passa pelos membros anteriores. Após epilação os animais foram posicionados em

decúbito dorsal. O local epilado recebeu assepsia com iodopovidona 10% (PVPI).

No centro da área epilada foi realizada demarcação na pele de cada animal por

rotação da borda cortante de demarcador (punch) metálico com 2 cm de diâmetro.

Com bisturi, foi excisado o fragmento cutâneo no centro da área epilada, até a

exposição da fáscia muscular dorsal (Figura 2). A hemostasia foi realizada por

compressão digital, utilizando-se gaze esterilizada. Logo após o ato operatório, os

animais foram reacondicionados nas caixas específicas, divididos de acordo com os

seus respectivos grupos. Todos os animais, 6 horas após o procedimento cirúrgico

receberam analgesia subcutânea com citrato de fentanila (Fentanest®) (adquirido de

Cristália) na concentração de 20 µg/kg, de 12/12hs por 3 dias. Após o procedimento

cirúrgico e verificação da hemostasia, os animais receberam a primeira aplicação

tópica das bases dermatológicas na ferida cutânea onde este procedimento foi

repetido diariamente. No subgrupo controle sem tratamento (C), não foi aplicado

nenhum tratamento. E o controle positivo foi tratado com pomada contendo

43

dexpantenol (Cicatenol® concentração 50mg/g) Todos os ratos foram examinados

diariamente quanto à sua mobilidade, receberam o tratamento com as bases

dermatológicas conforme Fluxograma 1 e feita à avaliação macroscópica da ferida

operatória.

Legenda: A- punch metálico para demarcação da área; B- área epilada e assepsia com PVPI; C-

técnica cirúrgica da área demarcada; D- área excizada de aproximadamente 2 cm com exposição da

fáscia muscular.

5.2.4 1ª Etapa - Avaliação da cicatrização

Para avaliação da cicatrização todos os animais foram novamente

anestesiados diariamente, conforme descrito no item 5.2.3, e tiveram suas lesões

fotografadas por câmera digital Motorola 13 megapixels, HDR. Para conversão da

escala de pixels em centímetros uma régua calibrada, em intervalo de centímetros,

foi posta imediatamente a margem da lesão e as imagens tanto da lesão quando da

escala da régua foram obtidas na mesma imagem. Os dados assim obtidos do

processo de cicatrização, no 0, 3º, 7º, 14º e 21º dias, foram registrados em protocolo

para posterior comparação, por planimetria digital, mediante aplicação do software

ImageJ® (RASBAND, 1997). A avaliação da cicatrização foi realizada em todos os

A B C D

Figura 2: Sequência do procedimento do dano epitelial em animais.

44

animais mediante a mensuração da área de retração do ferimento, importando-se a

imagem da fotografia digital da lesão para o software ImageJ® (Figura 3).

Legenda: A- conversão de pixels para escala em centímetros; B- mensuração e leitura da área da

lesão; C- Aproximação computadorizada da linha para demarcação da borda da lesão.

5.2.5 Avaliação Histológica – Reepitelização, colagenização, vascularização,

presença de neutrófilos e polimorfonucleares

No dia pré-estabelecido para o sacrifício dos animais da primeira etapa de

experimentos (21 dias), os ratos foram anestesiados e sacrificados através de

sedação com diazepam (10 mg/Kg peso), e colocados em câmara de CO2. Em

seguida fixados à mesa cirúrgica para a coleta de dados morfológicos e do espécime

cirúrgico. A amostra da ferida excisada foi retirada com margem de 1 cm de pele

íntegra em torno da lesão, em profundidade até a fáscia muscular. Cada peça foi

identificada individualmente, fixadas em solução e conservadas em formalina

tamponada 10% (formalins de Carlson) por 7 dias e posteriormente inclusas em

parafina Paraplast Plus® (Sigma-Aldrich), submetidas a cortes transversais de 4μ,

com micrótomo, e coradas com hematoxilina–eosina (HE), para avaliação global dos

cortes de tecido, e pelo Tricômio de Masson (TM) (Easypath), conforme instruções

do fabricantes, para avaliar a presença de fibras colágenas existentes nos locais de

fibrose do interstício. Foram avaliadas a proliferação fibroblástica (colagenização),

A B

C

Figura 3: Avaliação da cicatrização por planimetria digital no software ImageJ®

45

reepitelização, presença de neutrófilos e polimorfonucleares bem como a

vascularização. Para a avaliação dos escores foram atribuídas cinco graduações:

ausente (0), discreta (+), moderada (++), acentuada (+++) e aspecto normal da pele

(++++).

5.2.6 2ª Etapa - Avaliação das bases dermatológicas sobre os mediadores

inflamatórios no processo de cicatrização

Para os estudos de avaliação sobre os mediadores inflamatórios os animais

foram preparados conforme o item 5.2.3 e foram submetidos aos mesmos

tratamentos com as bases dermatológicas. No 2º dia após o dano epitelial os

animais foram sacrificados como descrito acima e tiveram os tecidos das áreas em

cicatrização retirados, acondicionados em tubos plásticos a -80 Cº, e amostras de

sangue para posterior quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias (IL-6 e

TNF-), mieoloperoxidase como descritos abaixo.

5.2.7 Modelo de coleta de sangue pela técnica de punção caudal

Esta técnica para coleta das amostras de sangue para posteriores ensaios foi

realizada segundo descrita por Weiss et al. (2000) com algumas adaptações e

realizada após 8 horas após indução do dano epitelial.

Os animais foram anestesiados conforme o item 5.2.3 e foram colocados sob

placa aquecida a 37º C por 10 minutos. Após a adaptação da temperatura a cauda

foi seccionada a 3 mm da ponta e a cauda foi espremida na direção base-

extremidade onde o sangue foi coletado em eppendorf previamente preparado com

coquetel de inibidores de proteases (Inibidor de serino tripsina Kunitz (SBTI- soy

bean tripsin inhibitor), inibidor de serina protease (PMSF-

phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluoride) aprotinina e

leupetina) e anticoagulante heparina. As amostras foram centrifugadas por 5 minutos

46

e o plasma retirado e posteriormente congelado a -80º C. Os animais foram

acondicionados em suas caixas até a próxima coleta de material.

5.2.8 Modelo de coleta de sangue pela técnica de punção cardíaca

Esta técnica para coleta das amostras de sangue para posteriores ensaios foi

realizada segundo descrita por Machado et al. (2003) com algumas adaptações e

realizada após 24 horas após indução do dano epitelial.

Os animais foram anestesiados conforme o item 5.2.3 e foram colocados no

campo cirúrgico em posição ventral e em seguida foi aberta a cavidade torácica,

exposto o coração, e o sangue foi coletado através de punção no ventrículo

esquerdo com seringa de volume 5 ml. Os animais obtiveram óbito por

exsanguinação. As amostras sanguíneas foram acondicionadas em eppendorf

previamente preparado com coquetel de inibidores de proteases (Inibidor de serino

tripsina Kunitz (SBTI- soy bean tripsin inhibitor), inibidor de serina protease (PMSF-

phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluoride) aprotinina e

leupetina) e anticoagulante Heparina sódica (Cristália® Produtos Químicos

Farmacêuticos). As amostras foram centrifugadas por 5 minutos e o plasma retirado

e posteriormente congelado a -80º C.

5.2.9 Modelo de coleta do tecido cicatrizado e extração da amostra por

trituração

Após 24 horas da indução do dano epitelial, os animais foram sacrificados e

as amostras das feridas excisadas, utilizando bisturi, foram retiradas com margem

de 1 cm de pele íntegra em torno da lesão, em profundidade até a fáscia muscular

reservadas em tubos eppendorf para preparação das mesmas. As amostras de

tecido foram pesadas em balança analítica (Shimadzu® modelo AX200) com peso

padrão de aproximadamente 100 mg de cada amostra. Após pesagem, os tecidos

foram triturados em triturador de tecido (tipo Potter de vidro com capacidade de 10

47

ml) adicionados no momento da homogeneização os inibidores de proteases

(Inibidor de serino tripsina Kunitz (SBTI- soy bean tripsin inhibitor), inibidor de serina

protease (PMSF- phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluoride)

aprotinina e leupetina) e solução tampão pH 7,4 mantidos sob refrigeração em

isopor com gelo durante todo o procedimento. O homogenato de tecido foi

transferido para eppendorf e centrifugado sob refrigeração a 4º C por 30 minutos

10.000g (Fluxograma 2). O volume de sobrenadante retirado para os ensaios

bioquímicos foi de 100 µL para cada amostra

5.2.10 Dosagem de Proteínas Totais via espectrofotometria em tecido

cicatrizado

Para dosagem de proteínas totais (Fluxograma 2) foram retiradas 40 µL de

cada amostra de homogenato e adicionadas 1960 µL de água pura (Milli-Q Milipore-

Bedford, MA, EUA) em cubeta de quartzo e levadas para leitura em

espectrofotômetro digital Shimadzu® modelo UV- Vis 1280 em comprimento de

onda de 280 nm.

48

Tecido

• Pesagem (± 0,1000 g)

Triturar

• 30 µL Solução tampão pH 7,4 + Aprotinina e Leupetina

• Tecido pesado

• 1,5 µL de Solução tampão + 5 µL de SBTI

• Resfriados em isopor com gelo

Centrifugar

• Refrigeração -20o C

• Tempo 30 min

Cubeta

• 1960 µL água pura (Milli-Q Milipore-Bedford, MA, EUA) + 40 µL amostra

Dosagem

Proteína

• Espectofotômetro Shimadzu® UV-Vis 1280

• Leitura a 280 nm

Fonte: O Autor

Fluxograma 2: Procedimentos de coleta do tecido cicatrizado e extração da amostra por

trituração para os ensaios bioquímicos de 2ª Etapa

49

5.2.11 Dosagem das citocinas inflamatória IL-6 e TNF-α no tecido de

cicatrização e sangue

Amostras de 100 µL do sobrenadante de tecido e plasma foram uti lizadas

para avaliação dos níveis de IL-6 e TNF-α através de kits comerciais (ELISA; R&D

Systems, Minneapolis, USA) segundo orientações do fabricante.

As placas High-Binding de 96 poços foram preparadas (imunização da Placa)

com 100 µL de Anticorpo de captura (anti rat-IL-6 e anti rat-TNF-α) em PBS e

cobertas imediatamente e incubadas overnight á temperatura ambiente.

Posteriormente o Anticorpo de captura foi retirado dos poços através de aspiração

com sugador e lavadas com a Solução de lavagem num total de três vezes. As

placas foram bloqueadas com 300 µL de soro albumina Bovina e incubadas a

temperatura ambiente por 1 hora. O procedimento de lavagem foi repetido conforme

anteriormente e as placas receberam 100 µL dos padrões, e as amostras de sangue

(8 e 24 hs), e tecido (24 hs), conforme Tabela 6. As placas foram cobertas e

incubadas por 2 horas em temperatura ambiente em mini agitador de placas

(Agimaxx® Modelo AG-1PS).

Tabela 6: Preparação das placas para adição das soluções da curva padrão e amostras de

sangue de 8 e 24 hs e tecido 24 hs

Poço Padrão (pg/mL) Tubos

A1 4000 1 (100 µL)

A2 2000 2 (100 µL)

A3 1000 3 (100 µL)

A4 500 4 (100 µL)

A5 250 5 (100 µL)

A6 125 6 (100 µL)

A7 62,5 7 (100 µL)

A8 0 100 µL diluente de reagentes

A-H/9-96 Amostras 100 µL de cada (sangue-8 e 24 hs e tecido-24 hs)

Fonte: O Autor

50

Após incubação das placas com as amostras estas foram aspiradas e lavadas

repetindo este procedimento num total de três vezes. Com a remoção completa do

líquido as placas receberam 100 µL do Anticorpo de Detecção Diluído em cada poço

onde foram incubadas por 2 horas em agitador rotatório em temperatura ambiente e

cobertas para evitar a luz direta. A lavagem foi repetida três vezes e as placas

receberam 100 µL de Solução de trabalho de streptavidina a cada poço e após

cobertas com alumínio e incubadas durante 20 minutos a temperatura ambiente no

agitador. O processo de lavagem foi repetido novamente por três vezes e

acrescentado em cada poço 100 µL de Solução de substrato de reação (tetrametil

benzidina + H2O2), cobertas as placas com alumínio e incubadas por 20 minutos em

temperatura ambiente no agitador. Seguindo, foram acrescentadas as placas 100 µL

da Solução de parada a cada poço (H2SO4 1M) e agitadas para homogeneização. A

densidade óptica foi determinada usando um leitor de microplacas (Microplate

Reader Model 680 Bio-Rad® Laboratories) em 450 nm (Fluxograma 3).

51

Imunização da Placa

overnight

Bloqueio da Placa

Amostras e padrões

100 µL

Anticorpo de Detecção

100 µL

Solução de estreptavidina

100 µL

Substrato de reação

100 µL

Solução de parada

100 µL

Leitura em 450 nm

Lavar 3 x

Lavar 3 x

Lavar 3 x

Lavar 3 x

Lavar 3 x

Incubar

1 h

Incubar

2 h-Agitador

Incubar

2 h-Agitador

Incubar

20 min-Agitador

Incubar

20 min-Agitador

Agitar suavemente

Tecido

plasma

IL-6 e

TNF-α

Fonte: O Autor

Fluxograma 3: Procedimentos realizados para determinação das citocinas Il-6 e TNF-α em

amostras de tecido cicatrizado e plasma.

52

5.2.12 Dosagem da Atividade da Enzima Mieloperoxidase (MPO)

O recrutamento de neutrófilos foi quantificado indiretamente através da

determinação da atividade da MPO no sangue (8 hs) e no tecido cicatricial (24 hs). O

homogenato de tecido e o plasma foram preparados em tampão fosfato de sódio (80

mM; pH 5,4), contendo brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB; 0,5%, p/v), com

o auxílio de um homogeneizador do tipo Ultra-Turrax. O homogenato resultante foi

centrifugado (20 min., 10.400 x g, 4º C) e uma alíquota de 30 μL do sobrenadante

utilizada para o ensaio da MPO. A reação enzimática foi desenvolvida na presença

de tetrameti lbenzidina (TMB) (1,6 mM) e H2O2 0,5 mM (em solução tampão fosfato

80 mM; pH 5,4) em volume final de 200 μL. Após o período de incubação (3 min, 37º

C) a absorbância foi medida em um leitor de microplacas (Microplate Reader Model

680 Bio-Rad® Laboratories) em 630 nm. A quantidade de proteína total foi estimada

pelo método de Bradford e a atividade da MPO expressa como unidades de

densidade óptica (D.O.) por mg de proteína.

5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como média + erro padrão das médias

(E.P.M.) dos respectivos índices analisados. As diferenças estatísticas entre os

grupos experimentais foram detectadas com análise de variância (ANOVA) seguida

pelo teste post hoc de Dunnett’s (quando comparado grupo controle versus grupos

tratatdos) ou teste T student (quando realizado a comparação entre dois grupos).

Valores de p menores que 0,05 (p < 0,05) foram considerados como indicativos de

significância. A análise estatística será realizada através do software GraphPad

Prisma® versão 6.0, direitos autorais pertencentes à Graph Pad Software®.

53

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A cicatrização de feridas é um processo dinâmico que envolve eventos

fisiológicos e bioquímicos com o objetivo de promover e garantir a restauração

vascular e tissular. O principal fator desencadeante da cicatrização é a própria lesão

local, com ou sem perda tecidual. No entanto, quanto mais precoce for o processo

de reparação da área lesada, maior o benefício, pois a ferida da pele representa

uma porta de entrada para agentes agressores como vírus, bactérias, fungos e

protozoários, colocando em risco a integridade física do indivíduo podendo até

desenvolver patologias infecciosas e inclusive causar sua morte (DE SOUSA et al.,

2015).

O modelo in vivo de dano epitelial induzido utilizado neste estudo vem sendo

aplicado em outras pesquisas (MARTINS et al., 2006; LEITE et al., 2015) como

método efetivo para avaliar o efeito cicatrizante de muitas substâncias e também

estas incorporadas a bases dermatológicas como as pomadas. De Jesus (2012)

utiliza este modelo para avaliar o efeito cicatrizante de uma pomada a base de

extrato de açaí apresentando resultado eficaz no processo.

A aplicação tópica de substâncias ou incorporadas a bases em estudos que

utilizaram este modelo obtiveram bons resultados quando o objetivo foi avaliar a

cicatrização (DE CASTRO GARROS et al., 2006; ROGALSKI, 2008; DE BARROS et

al., 2010; DE FARIAS MARTORELLI et al., 2011; DE SOUSA et al., 2015;

MONTEIRO et al., 2015).

De Farias Martorelli et al. (2011) testou a atividade cicatrizante do extrato de

aroeira, usando o dexpantenol, que possui efeito cicatrizante tópico, como

comparativo. Os resultados evidenciaram que o extrato de aroeira é mais eficaz no

fechamento da lesão do que o dexpantenol.

Não foram encontrados estudos comparativos de bases de pomadas em

modelos de cicatrização in vivo. Apenas que o uso da vaselina como veículo em

modelos de cicatrização, Fernandes et al. (2014) comprovou sua ação cicatrizante

no tratamento de feridas onde sua presença favoreceu o fechamento da lesão em

ratos.

54

6.1 AVALIAÇÃO DA EVOLUÇÃO CICATRICIAL

6.1.1 Evolução da área de retração da lesão cicatricial.

Este modelo de estudo mostrou a evolução da cicatrização de lesões em

ratos tratados com bases farmacêuticas de natureza hidrofílica (PP, PPII, PHA) e

lipofílica (PH e PLV), através da aplicação com auxílio de espátula de madeira

comparando com os grupos tratados com as bases, dexpantenol (DEX) e grupo

controle, este último recebeu o movimento de aplicação com a espátula e irrigação

com solução salina 0,9% semelhante aos grupos tratados.

No presente estudo os animais mantiveram-se saudáveis e apresentaram

propriedades de cicatrização sem evidências clínicas e/ou macroscópicas de

infecção. Nos animais dos grupos tratados e grupo controle (Figura 4), observou-se

o fechamento quase completo da lesão ao vigésimo primeiro dia na maioria dos

animais.

Nos grupos controle, DEX, PP, PPII, PH e PHA houve o desenvolvimento de

uma crosta necrótica (escara), que foi desenvolvendo uma maior espessura até

entre o terceiro e sétimo dia.

A maioria dos animais do grupo PLV não teve formação de escara (Figura

10). Após o sétimo dia os animais dos grupos PHA (Figura 8), PH (Figura 9) e PPII

(Figura 7) começaram a desprender a escara, debridando a mesma até o vigésimo

primeiro dia. Já nos grupos controle e PP as escaras destacaram-se após o décimo

quarto dia (Figuras 4 e 6). Nos grupos DEX e PLV a crosta necrótica permaneceu

até o vigésimo primeiro dia.

A análise macroscópica das lesões demonstrou que os grupos PPII e PHA

que são hidrofílicos, e o grupo PH que é lipofílico, apresentaram um processo

cicatricial mais acelerado quando comparados ao controle positivo-grupo DEX

(Figura 5), no entanto estas diferenças não foram significativas. O grupo DEX não

apresentou uma cicatrização tão rápida quanto às bases PPII, PHA e PH.

Desta forma, nem o tratamento com as bases e o dexpantenol acelerou de

maneira significativa a cicatrização, apenas as bases PPI e PH, apresentaram uma

55

tendência a cicatrização mais intensa. Já a base PLV piorou o processo de

cicatrização.

Legenda: Animais tratados apenas com água destilada; A) Dia da excisão (0 dia); B) Terceiro dia (3º dia); C) Sétimo dia (7º dia); D) Décimo quarto dia (14º dia); E) Vigésimo primeiro dia (21º dia).

Legenda: Animal tratado com pomada Dexpantenol; A) Dia da excisão (0 dia); B) Terceiro dia (3º dia);

C) Sétimo dia (7º dia); D) Décimo quarto dia (14º dia); E) Vigésimo primeiro dia (21º dia).

Legenda: Animal tratado com base pomada de polietilenoglicol; A) Dia da excisão (0 dia); B) Terceiro dia (3º dia); C) Sétimo dia (7º dia); D) Décimo quarto dia (14º dia); E) Vigésimo primeiro dia (21º dia).

A B C D E

C

A B C D E

C

A B C D E

C

Figura 4: Evolução cicatricial do grupo Controle.

Figura 5: Evolução cicatricial do grupo DEX (controle positivo).

Figura 6: Evolução cicatricial do grupo PP, base farmacêutica hidrofílica.

56

Legenda: Animal tratado com base pomada de polietilenoglicol II; A) Dia da excisão (0 dia); B) Terceiro dia (3º dia); C) Sétimo dia (7º dia); D) Décimo quarto dia (14º dia); E) Vigésimo primeiro dia

(21º dia).

Legenda: Animal tratado com base pomada hidrofílica; A) Dia da excisão (0 dia); B) Terceiro dia (3º dia); C) Sétimo dia (7º dia); D) Décimo quarto dia (14º dia); E) Vigésimo primeiro dia (21º dia).

Legenda: Animal tratado com base pomada petrolato hidrofílico; A) Dia da excisão (0 dia); B) Terceiro dia (3º dia); C) Sétimo dia (7º dia); D) Décimo quarto dia (14º dia); E) Vigésimo primeiro dia (21º dia).

A B C D E

C

A B C D E

C

A B C D E

C

Figura 7: Evolução cicatricial do grupo PPII, base farmacêutica hidrossolúvel.

Figura 8: Evolução cicatricial do grupo PHA, base farmacêutica hidrofílica.

Figura 9: Evolução cicatricial do grupo PH, base farmacêutica lipofílica.

57

Legenda: Animal tratado com base pomada de lanolina e vaselina; A) Dia da excisão (0 dia); B) Terceiro dia (3º dia); C) Sétimo dia (7º dia); D) Décimo quarto dia (14º dia); E) Vigésimo primeiro dia

(21º dia).

Para aplicação do teste estatístico a avaliação da retração da ferida foi

representada em cm2, e em percentagem. Porém, em ambos os casos não existiu

diferença significativa nas lesões (Gráficos 1 e 2). Os resultados da área média de

retração em cm2 do grupo PH foram mais expressivos. Contudo os grupos das

bases hidrofílicas PP, PPII e PHA apresentaram resultados satisfatórios para área

de retração da ferida quando comparados aos do grupo controle. A área de retração

da lesão do grupo DEX, controle positivo, obteve resultado positivo em relação ao

controle negativo. O grupo PLV, base lipofílica, mostrou uma área de retração

menos significativa que os demais grupos (Grafico 1).

A B C D E

C

Figura 10: Evolução cicatricial do grupo PLV, base farmacêutica lipossolúvel.

58

14 dias

Controle DEX PP PPII PHA PH PLV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Grupos

Áre

a e

m c

m2

3 dias


0

2

4

6

Grupos

Áre

a e

m c

m2

7 dias


0

2

4

6

Grupos

Áre

a e

m c

m2

0 dias


0

2

4

6

Grupos

Áre

a e

m c

m2

21 dias


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Grupos

Áre

a e

m c

m2

Na avaliação da retração da ferida em percentual, o grupo PH demonstrou

promover melhor cicatrização, apresentando área relativa cicatrizada de 94,3%

quando comparada ao grupo controle negativo (90,68%). O grupo PPII também

obteve alterações significativas para a cicatrização (93,82%). No grupo DEX

(controle positivo) foi observado uma resposta positiva (93,86%) quando comparado

Gráfico 1: Variação dos valores em cm2 das áreas excisadas em ratos dos grupos nos dias

0, 3, 7, 14 e 21.

59

3 dias


0

50

100

150

Grupos

Áre

a %

lesão

7 dias


0

50

100

150

Grupos

Áre

a %

lesão

14 dias


0

10

20

30

40

50

Grupos

Áre

a %

lesão

21 dias


0

5

10

15

20

25

Grupos

Áre

a %

lesão

*

aos demais grupos. O menor percentual de retração da ferida foi observado no

grupo PLV (83,43%) que possui características lipofílicas (Gráfico 2).

O processo de cicatrização de feridas abertas ocorre a partir das bordas da

lesão para o centro. A explicação para isso se deve ao fato das feridas abertas

serem submetidas a um processo de contração da lesão na tentativa de diminuir a

área de exposição e propiciar a reparação (DE SOUSA et al., 2015).

Muitos fatores influenciam a cicatrização, entre eles destacam-se algumas

bases farmacológicas que podem acelerar o processo de reparação e cicatrização

(DE SOUSA et al., 2015).

O dexpantenol é análogo do ácido pantotênico, auxilia a cicatrização de

lesões de pele por estimular a epitelização e escoriações de pouca gravidade, pois

não possui ação anti-inflamatória (KOROLKOVAS; FRANÇA, 2015).

Gráfico 2: Variação dos valores em % das áreas excisadas em ratos dos grupos nos dias

3, 7, 14 e 21.

60

O tratamento com DEX demonstrou não ser tão regenerativo contra a lesão

produzida em ratos quanto à maioria das bases, sendo que a propriedade de

regeneração do epitélio foi relativamente insuficiente para os animais tratados com o

dexpantenol.

No experimento realizado por Presto et al. (2001), testou-se a propriedade de

regeneração da pele in vivo, utilizando preparações tópicas com 5% de d-pantenol,

As aplicações foram feitas sobre a oclusão da epiderme durante cinco dias. Uma

significativa aceleração da regeneração e da barreira epidérmica foi observada com

as preparações de d-pantenol, quando comparada com o placebo.

O estudo realizado por Giusti (2004) demonstrou a aceleração no processo de

cicatrização utilizando d-pantenol, com concentração de 10% em gel de carbopol, na

regeneração tegumentar de rato, promovendo a regeneração celular, estimulando a

epitelização precoce e age também como umectante devido às suas características

higroscópicas.

A permeabilidade da pele dos animais é superior à humana e, por esse

motivo muitos estudos feitos em pele de animais pode originar resultados distintos

quando aplicados em humanos (GHAFOURIAN et al., 2004; WILLIAMS; BARRY,

2012).

Embora a histologia da pele humana apresentar diferenças do rato (a derme

do rato é mais espessa e não apresenta tecido gorduroso subcutâneo nem tela

muscular subcutânea), os vasos sanguíneos responsáveis pela irrigação cutânea

são sub-dérmicos em ambos, e apresentam as mesmas alterações de perfusão de

macro e microvascularização (DA SILVA SANTOS et al., 2006). Desta forma, pode-

se realizar um estudo onde se observa a cicatrização na pele de um rato, e fazer a

analogia com a pele de um humano.

Em um estudo feito por Roman et al. (2004), as bases lipofílicas quando

comparadas com as hidrofílicas fornecem um melhor resultado quando se refere à

cicatrização de feridas em ratos. Segundo Prista et al. (2008), as pomadas de base

lipofílica formam películas oclusivas na área lesada, aumentando o conteúdo hídrico

e favorecendo a cicatrização.

Rogalski (2008) afirmou que a pomada base lipofílica (controle negativo)

também apresentou reparação cicatricial, embora mais lenta que os grupos

experimental e positivo. Esta reparação provavelmente ocorreu devido ao fato da

61

pomada empregada servir como uma camada protetora, reduzindo a vulnerabilidade

do organismo a possíveis complicações e agravamento da lesão.

Um vasto número de substâncias lipofílicas, que possuem ácidos graxos e

seus ésteres, tem sido usado como promotores de absorção cutânea, pois são

consideradas substâncias seguras, mas apresentam o inconveniente de poderem

causar irritabilidade na pele (MARTINS; VEIGA, 2002).

Vieira et al. (2008) utilizando cremes bases e com ativos de plantas em

feridas abertas em ratos, verificou total cicatrização no décimo quinto dia de

experimento em todos os grupos visto que as lesões tratadas com solução salina

0,9% cicatrizaram na mesma proporção das lesões tratadas com as pomadas testes.

Tais estudos corroboram com os dados desta pesquisa que demonstra a eficácia

das bases na cicatrização quando comparadas ao grupo controle positivo tratado

com dexpantenol.

6.2 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DA REEPITELIZAÇÃO, COLAGENIZAÇÃO,

VASCULARIZAÇÃO, POLIMORFONUCLEARES E MONONUCLEARES.

6.2.1 Histopalogia de tecidos coletados

Durante a resposta inflamatória, os polimorfonucleares (neutrófilos) são as

primeiras células a chegar à ferida, com maior concentração 24 horas após a lesão e

produzem fatores quimiotáticos para monócitos/macrófagos e linfócitos T. Após 48-

96 horas os neutrófilos são gradativamente substituídos por mononucleares

(macrófagos) os quais são as principais células antes dos fibroblastos. A maior

contribuição dos macrófagos é a secreção de citocinas e fatores de crescimento,

além de contribuírem na angiogênese e fibroplasia (BROUGHTON; JANIS;

ATTINGER, 2006; ZIJLSTRA et al., 2006).

Na fase proliferativa, em torno do quarto dia após a lesão, iniciando com a

angiogênese (proliferação vascular). A reepitelização ocorre precocemente e as

camadas normais da epiderme são restauradas em três dias. O processo continua

62

se estendendo até o décimo quinto dia após a lesão com a produção de colágeno

pelos fibroblastos (LAWRENCE; DIEGELMANN, 1994).

A fase de remodelação acontece aproximadamente após o vigésimo primeiro

dia após a lesão e consiste em reformular a matriz extracelular e a característica

mais importante desta fase é a deposição de colágeno (BEANES et. al., 2003;

CLARK; GHOSH; TONNESEN, 2007).

A análise histopatológica (Tabela 7) das amostras de tecidos possibilitou a

verificação da atividade angiogênica (vascularização), colagenização e

reepitelização justamente no final do experimento (21 dias). O grupo DEX

apresentou intensa vascularização, seguida dos grupos das bases hidrofílicas PP,

PPII, PHA e com moderada e grupo da base lipofílica com moderada

vascularização. O grupo controle e o grupo PLV da base lipofílica obtiveram fraca

angiogênese demonstrando que o dexpantenol possui propriedades de intensificar a

vascularização em lesões corroborando com o estudo feito por De Farias Martorelli

et al. (2014).

O grupo PH, caráter lipofílico, apresentou melhor resultado em relação a

deposição de colágeno, vascularização e reepitelização quando comparado ao

grupo controle. O grupo PH demonstrou resultado superior para colagenização e

intensidade de epitelização ao do grupo DEX (Tabela 7). Segundo Eckersley e

Dudley (1988) apud Balbino; Pereira; Curi (2005), a neovascularização é essencial

no processo de cicatrização, permitindo a troca de gases e a nutrição das células

metabolicamente ativas. Este resultado demostra que mesmo não obtendo

resultados significativos na redução da retração, as bases apresentaram melhora

nas avaliações histopatológicas superior ao grupo controle, favorecendo a

cicatrização.

63

Tabela 7: Intensidade da vascularização, colagenização e reepitelização em amostras de

tecidos dos grupos controle, dexpantenol e tratados com as bases farmacêuticas hidrofílicas

e lipofílicas em ratos.

Grupos Vascularização Colagenização Reepitelização

Controle + ++ ++ DEX +++ + + PP ++ ++ + PPII ++ + + PHA ++ ++ + PH ++ +++ ++

PLV + + + Legenda: (-) ausente; (+) fraca; (++) moderada; (+++) intensa; (++++) tecido normal

Para avaliar o grau de colagenização nos grupos estudados, as amostras de

tecidos receberam a coloração de Tricômico de Masson (Figura 11) e de acordo com

a intensidade da cor azul claro/escuro, foram classificados (Figuras 12 e 13).

O grupo PH apresentou a maior intensidade de colagenização entre todos os

grupos estudados e quando comparado ao grupo controle (Figura 12D) que teve

quantidade moderada de colágeno. Os grupos PP e PHA, de natureza hidrofílica,

demonstraram deposição de fibras colágenas moderadas (Figura 12B e Figura 12C).

Legenda: A) Identificação do colágeno pela coloração azul claro e escuro em corte de tecido de

animal tratado com base PH; aumento de 10x; B) Identificação das fibras colágenas pela coloração

azul escuro em corte de tecido de animal tratado com base PH; au mento de 40x.

A B

Figura 11: Fotografia da derme superficial e papilar do dorso de rato, corada pelo Tricômio

de Masson para análise da colagenização.

64

Legenda: intensa (+++); moderada (++); (+) fraca; A) Colagenização (+++) de tecido animal com a

base PH. B) Colagenização (++) de tecido animal tratado com a base PP. C) Colagenização (++) de

tecido animal tratado com a base PHA. D) Colagenização (++) de tecido animal controle.

Fonte: O Autor

Os grupos PPII, PLV e DEX apresentaram intensidade fraca para a deposição

do colágeno das amostras de tecidos (Figura 13).

A B

C D

Figura 12: Identificação de fibras colágenas na pele cicatrizada de ratos após tratamento

com as bases farmacêuticas no 21º dia (coloração de Tricômico de Masson em aumento de

40X)

65

Legenda: intensa (+++); moderada (++); (+) fraca; E) Colagenização (+) de tecido animal tratado com

a base PPII. F) Colagenização (+) de tecido animal tratado com a base PLV. G) Colagenização (+) de

tecido animal tratado com a pomada dexpantenol.

Fonte: O Autor

Para uma melhor avaliação da intensidade da coloração pelo Tricômico de

Masson, as imagens foram tratadas com balanço de temperatura e demonstraram

um resultado comparativo entre os grupos mais expressivos. O grupo PH teve uma

intensidade de coloração azul mais intensa. O grupo controle revelou uma coloração

azul moderada. O grupo tratado com dexpantenol, controle positivo, obteve uma

coloração azul fraca caracterizando pouca deposição de colágeno (Figura 14).

E F

G

Figura 13: Identificação de fibras colágenas na pele cicatrizada de ratos após tratamento

com as bases farmacêuticas no 21º dia (coloração de Tricômico de Masson em aumento de

40X)

66

Legenda: A) Coloração azul intensa em tecido de animal tratado com base PH. B) Coloração azul

moderada em tecido animal sem tratamento (grupo controle). C) Coloração azul quase inexistente em

tecido animal tratado com a pomada de dexpantenol.

Fonte: O Autor

O colágeno é proteína mais abundante do tecido conectivo em fase de

cicatrização, e é mais produzido pelos fibroblastos em resposta a lesões

(RODRIGUES, 2009; ROBSON; STEED; FRANZ, 2001).

Segundo Amaral e Solari (2009), o colágeno representa o principal elemento

presente na matriz extracelular, estando envolvido, principalmente, em processos de

renovação e cicatrização tissular.

Os resultados obtidos com o histológico demonstram que a base lipofílica PH

apresentou uma atividade superior de reepitelização e colagenização às demais

bases farmacêuticas, inclusive sobre a pomada com dexpantenol. De acordo com

Prista et al. (2008), as pomadas de base lipofílica fazem oclusão na área lesada

A B

C

Figura 14: Análise da colagenização pela intensidade da cor azul resultante da coloração

por Tricômio de Masson em tecidos cicatrizados de ratos após 21 dias.

67

estimulando a reparação cicatricial, corroborando com os dados de outras pesquisas

(ROMAN et al., 2004; ROGALSKI, 2008).

Os animais do grupo controle obtiveram melhores resultados do que o grupo

DEX. Este, por sua vez, obteve resultados insatisfatórios quando comparados ao do

grupo sem tratamento, justificando que o dexpantenol auxilia a cicatrização de

lesões de pele por estimular a epitelização e escoriações de pouca gravidade, não

se aplicando neste caso onde o tamanho da lesão é significativo (PRESTO et al.,

2001; KOROLKOVAS; FRANÇA, 2015).

A intensidade de fibras colágenas apresentadas pelo grupo tratado com a

base farmacêutica lipofílica PH, revelou que quando a deposição de colágeno é

maior a cicatrização obteve êxito. Tal alteração resulta na contração da ferida e a

formação de um tecido cicatricial e o processo de remodelação pode continuar

indefinidamente (SINGER; CLARK, 1999; BROUGHTON; JANIS; ATTINGER, 2006).

Na análise da presença de células mononucleares, que se caracterizam pelos

linfócitos e macrófagos, os grupos controle, dexpantenol, PPII, PHA e PLV

apresentaram intensidade moderada. Os grupos PP e PH apresentaram intensidade

fraca para presença de mononucleares. Quanto à presença de polimorfoucleares, os

neutrófilos, foram ausentes em todos os grupos (Tabela 8).

Tabela 8: Avaliação Histológica em amostras de tecidos dos grupos controle, dexpantenol e

tratados com as bases farmacêuticas hidrofílicas e lipofílicas em ratos.

Grupos Células Mononucleares Neutrófilos

Controle ++ (-) DEX ++ (-) PP + (-) PPII ++ (-) PHA ++ (-) PH + (-)

PLV ++ (-) Legenda: (-) ausente; (+) fraca; (++) moderada; (+++) intensa; (++++) tecido normal

Fonte: O Autor

68

A ausência de neutrófilos nos tecidos analisados se justifica pelas amostras

serem coletadas no vigésimo primeiro dia após o dano epitelial induzido, onde já

havia o desbridamento da crosta necrótica. Os neutrófilos são mais ativos em

ambientes ocluídos e em maior concentração nas vinte e quatro horas após a lesão

(BETTES, 2003; BROUGHTON; JANIS; ATTINGER, 2006).

Estudos histológicos mais recentes (NAGAOKA et al., 2000; MORI et al.,

2004) têm demonstrado um atraso drástico no fechamento da lesão em ratos

associado com uma redução significativa na infi ltração de neutrófilos e macrófagos.

No experimento de Mori et al. (2002) apesar de uma redução significativa na

infiltração de leucócitos no local da ferida, estas apresentaram um aumento na

angiogênese, teor de colágeno, reepitelização corroborando com os dados

apresentados nesta pesquisa.

A análise histológica das amostras de tecidos coletados no vigésimo primeiro

dia após o dano epitelial induzido, não foi satisfatória para os achados celulares de

neutrófilos e macrófagos. Algumas pesquisas mostraram a importância de

macrófagos na cicatrização, onde a depleção de macrófagos em camundongos

resultou num atraso significativo da cicatrização e uma redução da proliferação de

fibroblastos (LEIBOVICH; ROSS, 1975; MIRZA; DIPIETRO; KOH, 2009).

6.3 AVALIAÇÃO DO ENSAIO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE

(MPO) EM PLASMA DE RATOS

Os polimorfonucleares quando recrutados ao local da lesão, liberam uma

variedade de substâncias, como EROS, mediadores pró-inflamatórios e enzimas

proteolíticas, como a MPO, colaborando significativamente na manutenção do

processo inflamatório (BRADLEY et al., 1982).

A MPO é um marcador enzimático da infiltração de leucócitos

polimorfonucleares (neutrófilos) no tecido inflamado (LLORET; MORENO,1995). Os

grupos PLV e PP promoveram uma diminuição significativa na atividade da MPO em

73,47% (1.07 ± 4.16) e 62,15% (5.93 ± 0.73) respectivamente da D.O/mg quando

comparados ao grupo controle. Os grupos PHA, DEX e PH diminuíram a atividade

enzimática em 56,72% (6.77 ± 0.77), 46,49% (8.37 ± 1.22) e 43,8% (8.79 ± 1.29)

69

respectivamente. O grupo PPII não reduziu a atividade da MPO de forma

significativa 30,7% (10.84 ± 2.34) quando comparado ao grupo controle (Gráfico 3).


dexpantenol sobre a atividade enzimática da mieloperoxidase em plasma de ratos

excisados. As atividades enzimáticas nos plasmas foram mensuradas 8 horas após o dano

epitelial induzido com tratamento das bases e dexpantenol. Todos os dados apresentados

são média ± S.E.M. de 4-6 animais por grupo. Teste T de Students.

Legenda: Controle – controle negativo salina a 0,9%; DEX-controle positivo pomada dexpantenol; PP-

base pomada de propilenoglicol; PP-base pomada de propilenoglicol II; PHA-base pomada hidrofílica;

PH-base petrolato hidrofílico; PLV-base pomada lanolina e vaselina. Diferença significativa em

relação ao grupo controle, sem tratamento (*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001).

Fonte: O Autor

A administração de compostos, como as bases farmacêuticas PLV, PP e PHA

utilizadas neste estudo, reduziram a atividade da MPO, a qual pode ser ocasionada

principalmente pela diminuição da infiltração de neutrófilos no tecido inflamado, pela

inibição direta desta enzima ou até mesmo pela redução da disponibilidade de seu

substrato peróxido de hidrogênio (H2O2), porém esta diminuição de infiltrado celular

pode desacelerar o processo de cicatrização (ARNHOLD, 2003).

8hs


0

5

10

15

20

***

*

*****

**

Grupos

D.O

. m

ielo

/mg p

rote

ina

70

A base lipofílica PLV promoveu a maior inibição significativa da atividade

enzimática da MPO, sugerindo que pode estar ocorrendo diminuição substancial no

número de neutrófilos infiltrados no tecido. O aumento do número de

polimorfonucleares na lesão está relacionado com algumas doenças inflamatórias

cutâneas e a inibição excessiva da infiltração destas células ocasionada pela base

PLV pode estar contribuindo para um atraso da regeneração do tecido (SCHAERLI

et al., 2004; RANG et al, 2012).

As demais bases, destacando as bases hidrofílicas PP e PHA, mostraram-se

eficazes para o tratamento de afecções inflamatórias cutâneas quando comparadas

ao grupo controle, pela redução a atividade enzimática da MPO, considerando que

estas podem ser potentes no combate ao processo inflamatório atuando sobre a

infiltração de polimorfonucleares que caracterizam a presença de uma inflamação.

6.4 AVALIAÇÃO DA DOSAGEM DE CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS IL-6 E

TNF-α

As células mononucleares (macrófagos) atuam na estimulação de secreção

de fatores de crescimento e citocinas que são importantes na fibrose. Macrófagos

tipo M1 produzem TNF-α e IL-6 (DELAVARY et al., 2011).

As citocinas pró-inflamatórias, TNF-α e IL-6, modulam a iniciação e a

intensidade do processo inflamatório. Assim, neste estudo a dosagem das citocinas

permitiu avaliar quais bases tiveram uma melhor resposta para esta modulação

(CALIXTO et al., 2004).

A dosagem de IL-6 foi avaliada após 8 horas do dano epitelial. O grupo

controle apresentou níveis de interleucina IL-6 de 29,51 ± 10,90 Pmol/mg. O grupo

PLV apresentou quantidade significativamente baixa de IL-6, 5,13 ± 2,89 Pmol/mg

quando comparado ao grupo Controle. O tratamento com a base PH, mostrou níveis

elevados de citocina IL-6 de 59,78 ± 7,44 Pmol/mg quando comparado ao grupo

Controle. Os demais grupos, principalmente o grupo das bases hidrofílicas,

obtiveram níveis relativamente baixos de IL-6 (Gráfico 4).

71

Gráfico 4: Efeito das bases hidrofílicas PP, PPII e PHA, bases lipofílicas PH e PLV, Dex

sobre os níveis de citocina IL-6 em plasma de ratos excisados. As dosagens no plasma

foram mensuradas 8 horas após o dano epitelial induzido em animais tratados com as bases

e dexpantenol.


0

20

40

60

80

*

*

8hs

*

Grupos

Pm

ol d

e IL

-6

/mg d

e p

rote

ina




relação ao grupo controle, sem tratamento (*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001). Todos os dados

apresentados são média ± S.E.M. de 4-6 animais por grupo. Teste T de Students.

Fonte: O Autor

Vinte e quatro horas após o dano epitelial, a dosagem de IL-6 ficou elevada

em todos os grupos tratados com as bases e com o dexpantenol. O grupo controle

apresentou 2,03 ± 0,49 Pmol/mg de interleucina. O grupo tratado com a base PH

obteve uma de concentração de 6,5 ± 1,74 Pmol/mg, e o grupo DEX com 6,69 ± 2,38

Pmol/mg de IL-6 representando um resultado baixo entre as demais bases quando

comparados ao grupo controle. Os grupos das bases hidrofílicas PP (14,10 ± 4,259

Pmol/mg), PHA (14,93 ± 3,75 Pmol/mg) e PPII (9,77 ± 0,92 Pmol/mg) tiveram níveis

significativamente elevados da citocina em comparação ao grupo controle. A

concentração de IL-6 no grupo tratado com a base lipofílica PLV apresentou

72

resultado significativamente alto de 18,57 ± 2,99 Pmol/mg em comparação ao grupo

controle (Gráfico 5).

Gráfico 5: Efeito das bases hidrofílicas PP, PPII e PHA, bases lipofílicas PH e PLV, Dex

sobre os níveis de citocina IL-6 em tecido de ratos excisados. As dosagens no plasma foram

mensuradas 24 horas após o dano epitelial induzido em animais tratados com as bases e

dexpantenol.


0

5

10

15

20

25

**

*

***

*

24hs

Grupos

Pm

ol d

e IL

-6

/mg d

e p

rote

ina




relação ao grupo c ontrole, sem tratamento (*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001). Todos os dados


Fonte: O Autor

A concentração de citocina TNF-α em plasma no período de 8 horas após

dano epitelial induzido foi significativamente baixa em todos os grupos de bases

quando comparados ao grupo controle. O grupo controle apresentou nível de TNF-α

de 15,18 ± 3,23 Pmol/mg. O grupo PLV obteve a menor concentração de citocina de

0,0247 ± 0,0247 Pmol/mg em relação ao grupo controle (Gráfico 6).

73

Gráfico 6: Efeito das bases hidrofílicas PP, PPII e PHA, bases lipofílicas PH e PLV, DEX

sobre os níveis de citocina TNF-α em plasma de ratos excisados. As dosagens no plasma

foram mensuradas 8 horas após o dano epitelial induzido em animais tratados com as bases

e dexpantenol.


0

5

10

15

20

****

** **

**

8hs

Grupos

***

Pm

ol de T

NF

-

/mg d

e p

rote

ina




relação ao grupo c ontrole, sem tratamento (*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001). Todos os dados


Fonte: O Autor

O efeito das bases sobre os níveis de TNF-α nas amostras de tecido dos

grupos, não teve diferenças significativas no tempo de vinte e quatro horas após a

lesão induzida em ratos. O grupo controle obteve 0,69 ± 0,17 Pmol/mg de TNF-α.

Neste período, o grupo PHA, base hidrofílica, apresentou a menor concentração de

0,61 ± 0,24 Pmol/mg da citocina quando comparado ao grupo controle. O grupo que

apresentou a maior concentração de TNF-α foi o grupo tratado com a base lipofílica

PLV com 0,98 ± 0,069 Pmol/mg de citocina TNF-α. As demais bases não

apresentaram concentrações significativas para a citocina (Gráfico 7).

74

Gráfico 7: Efeito das bases hidrofílicas PP, PPII e PHA, bases lipofílicas PH e PLV, DEX

sobre os níveis de citocina TNF-α em tecido de ratos excisados. As dosagens no plasma

foram mensuradas 24 horas após o dano epitelial induzido em animais tratados com as

bases e dexpantenol


0.0

0.5

1.0

1.5

24hs

Grupos

Pm

ol de T

NF

-

/mg d

e p

rote

ina



PH-base petrolato hidrofílico; PLV-base pomada lanolina e vaselina. Todos os dados apresentados

são média ± S.E.M. de 4-6 animais por grupo. Teste T de Students.

Fonte: O Autor

As citocinas são mediadores pró-inflamatórios da fase aguda da inflamação

entre o primeiro e o terceiro dia após a lesão, destacam-se a IL-6 e o TNF-α. Os

neutrófilos são fonte destes mediadores inflamatórios como a IL-6 que influencia

respostas imuno antígeno específicas e reações inflamatórias, sendo um dos

maiores mediadores da inflamação aguda. Portanto quando o processo inflamatório

precisa ser reparado, IL-6 é um dos primeiros mediadores a agir (DINARELLO,

1991; RICH; WHITTAKER, 2005).

75

Após 48 a 96 horas os neutrófilos são fagocitados pelos macrófagos que são

células importantes para a regulação da cicatrização de feridas, de modo que

substâncias tópicas que ativam macrófagos podem gerar estímulo pró-inflamatório,

proliferação celular e progressão do processo cicatricial (THOMAS; HARDING;

MOORE, 2000).

A base lipofílica PH apresentou níveis de IL-6 elevados nas primeiras vinte e

quatro horas, e após este período a concentração se manteve até obter uma

diminuição em comparação ao grupo controle, o que sugere uma atividade

inflamatória modulada influenciando na melhora da cicatrização. Corroborando com

estes dados um estudo com modelo animal de cicatrização, mostrou que em ratos

com depleção do gene para a produção de IL-6, a lesão levou até três vezes mais

tempo para curar do que os dos animais controle. Desta forma a IL-6 é essencial

para a resposta de cicatrização e também através do seu efeito quimiotáxico sobre

os neutrófilos (GALLUCCI et al., 2000).

Porém o grupo PLV apresentou valores de IL-6 muito abaixo em comparação

ao grupo controle nas primeiras oito horas, e obteve um aumento muito expressivo

nos níveis de IL-6 no período de vinte e quatro horas quando comparado aos demais

grupos, sugerindo que este excesso pode gerar um atraso na cicatrização em

decorrência a um quadro inflamatório.

O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória sintetizada por muitos tipos celulares

diferentes, em resposta a estímulos infecciosos ou inflamatórios. Ele tem papel

adaptativo na resposta imune e na cicatrização de feridas em níveis fisiológicos. Seu

excesso pode levar a sérias consequências (AZEVEDO et al., 2012).

Em ensaios de cicatrização de ferida de pele em camundongos, os maiores

níveis de TNF foram encontrados entre quarenta e oito e setenta e duas horas, o

que permite comprovar através do aumento da TNF-α observada nas vinte e quatro

horas após a lesão (SATO; OHSHIMA, 2000),

O grupo PLV obteve concentrações aumentadas de TNF-α em relação ao

grupo controle e demais grupos tratados, o que sugere uma alteração negativa no

processo de cicatrização conforme dados de Azevedo et al. (2012).

O grupo PHA e PH apresentaram níveis baixos de TNF-α quando

comparados ao grupo controle, reforçando com Mori et al. (2002) em sua pesquisa

demonstrou que a deficiência de receptores TNF-α, onde a falta de sinalização desta

citocina resultou em acelerado processo de fechamento da ferida.

76

Células como os neutrófilos e macrófagos são importantes para avaliar o

processo inflamatório e os níveis de citocinas que estes liberam para a modulação

da inflamação aguda. Desta forma, alguns estudos têm estendido estas observações

da redução destes tipos celulares demonstrando um atraso significativo no processo

de cicatrização (LEIBOVICH; ROSS, 1975; MIRZA; NAGAOKA et al., 2000; MORI et

al., 2004; DIPIETRO; KOH, 2009).

Portanto a presença destes tipos celulares na fase de remodelamento, no

vigésimo primeiro dia após a lesão, não permitiu a correlação com os dados da

dosagem de citocinas em oito e vinte e quatro horas após o dano epitelial induzido. A

partir dos dados apresentados observou-se que as bases dermatológicas de

pomadas, mesmo sem a adição de princípios ativos são capazes de melhorar os

parâmetros de cicatrização e modular alguns eventos celulares inflamatórios.

77

7 CONCLUSÕES

Após a realização de todos os experimentos para análise do potencial de

cicatrização das bases farmacêuticas hidrofílicas e lipofílicas, os resultados obtidos

sugerem que:

As bases farmacológicas de natureza lipofílica possuem melhor atividade anti-

inflamatória e cicatrizante tópica quando comparadas a pomada dexpantenol

e aos animais sem tratamento.

A base lipofílica PH demonstrou de maneira efetiva a melhor área de retração

da ferida.

As bases hidrofílicas PPII e PHA e a base lipofílica PH apresentaram

melhores resultados no fechamento da lesão.

A análise histológica permitiu verificar que a base lipofílica PH obteve a

vascularização, reepitelização e colagenização superior às demais bases

aplicadas e ao dexpantenol.

As presenças de neutrófilos e mononucleares não foram representativas nas

amostras de tecidos coletadas no vigésimo primeiro dia após o dano epitelial

induzido.

A deposição de colágeno observada pela coloração do Tricômico de Masson

foi mais intensa no grupo tratado com a base lipofílica PH, determinando

melhor cicatrização no tecido.

O grupo DEX apresentou coloração mais fraca para a deposição de colágeno

entre os grupos tratados.

Os níveis enzimáticos de MPO foram mais reduzidos no grupo tratado com a

base lipofílica PLV no plasma coletado 8 horas após o dano induzido, o que

sugere pouca quantidade de infiltrado de neutrófi los.

O grupo tratado com a base lipofílica PH apresentou altas concentrações de

IL-6 no plasma coletado no período inflamatório agudo 8 horas após a lesão.

Estes níveis caíram 24 horas após o dano epitelial.

78

No período inflamatório agudo (8 horas após a lesão) o grupo tratado com

base lipofílica PLV apresentou níveis de IL-6 baixos aumentando sua

concentração 24 horas após a lesão, sugerindo uma i nflamação crônica.

Portanto, de maneira geral o grupo PH, que possui característica lipofílica,

obteve os melhores efeitos na cicatrização de feridas abertas.

Os grupos PLV e DEX apresentaram os resultados menos significativos em

relação a cicatrização das lesões, sendo que o grupo PLV induziu uma piora

no quadro inflamatório afetando o fechamento da ferida.

.

79

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94

ANEXO

95

Anexo A – Aprovação da Comissão de Ètica no Uso de Animais

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Documents

UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA ......Jane Mary Lafayette Neves Gelinski que muito fez por mim. Aos meus colegas e amigos que fizeram parte desta trajetória acadêmica. MUITO