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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA
NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA
MARLENE RAIMUNDA ANDREOLA PERAZZOLI
EFEITO HEPATOPROTETOR DO ÁCIDO GÁLICO E DODECIL GALATO NO DANO
HEPÁTICO PROMOVIDO POR TETRACLORETO DE CARBONO
Videira – SC,
2015
MARLENE RAIMUNDA ANDREOLA PERAZZOLI
EFEITO HEPATOPROTETOR DO ÁCIDO GÁLICO E DODECIL GALATO NO DANO
HEPÁTICO PROMOVIDO POR TETRACLORETO DE CARBONO
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito parcial para obtenção do título de MESTRE.
Orientadora: Prof. Dra. Claudriana Locattelli
Co-Orietador: Prof. Dr. César Milton Baratto
Videira – SC,
2015
Sou uma sonhadora, sou uma lutadora e não posso desistir, quero ser cada dia melhor.
Quero sonhar, quero acreditar que quem luta sabe fazer acontecer, e faz acontecer.
Tenho medo, mas sigo enfrente, por que acredito em mim e acima de tudo em Deus.
Quando me deparo com caminhos tortuosos e dias difíceis, olho sempre para frente
e nunca para os obstáculos, porque preciso ultrapassá-los.
Abro os olhos e o coração para lutar pelas vitórias e sempre com humildade, nos
erros me torno forte e com eles eu aprendo.
É preciso acreditar, é preciso sonhar, é preciso lutar.
O importante é continuar.
Marlene Raimunda Andreola Perazzoli
MARLENE RAIMUNDA ANDREOLA PERAZZOLI
EFEITO HEPATOPROTETOR DO ÁCIDO GÁLICO E DODECIL GALATO NO DANO
HEPÁTICO PROMOVIDO POR TETRACLORETO DE CARBONO
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito para obtenção do título de MESTRE.
Aprovada em: / / .
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. Claudriana Locattelli
Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Videira
Prof. Dr. César Milton Baratto
Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Videira
Prof.Dr. Geisson Marcos Nardi
Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Joaçaba
Prof.Dr. Glauber Wagner
Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Joaçaba
Suplente Prof.Dra. Elisandra Minotto
Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC - Videira
Prof. Dra Jane Mari Lafayette Neves Gelinski
Coordenadora PPGC&B da Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC
Dedico este trabalho a minha família,
Pelo incentivo companheirismo durante
toda a minha caminhada, em especial
meus filhos Tamara e Ari Junior.
AGRADECIMENTOS
Neste momento em que este projeto se encerra, cabe ressaltar que ele só foi
possível através de um ideal, somado aos meus esforços, às minhas necessidades
e aos objetivos que tanto buscava. Agradeço a Deus, por ter me dado forças interior
para superar as dificuldades, e me guiado mostrando os caminhos nas horas de
incerteza nos momentos de desanimo. À minha família a qual amo muito, pelo
carinho e paciência em especial meu esposo Ari Antônio, aos meus filhos Tamara e
Ari Junior que entenderam a minha ausência. Agradeço aos meus pais Hilda e
Itamar Andreola, por me ensinarem a permanecer na simplicidade e na humildade
porque sinto que sem isso não teria chegado ao fim. Aos meus irmãos Marilene,
Izair, Marilúcia e Valdecir Andreola, que sempre torceram por mim. À minha
orientadora Drª Claudriana Locatelli pela insistência, me mostrando o caminho da
ciência. Ao meu co- orientador Dr. Milton Cesar Barato sempre disponível quando
procurado e disposto a ajudar. A coordenadora do Curso de mestrado DrªJane
Gelinski por ter dado oportunidade com sua insistência para que o curso fosse
implantado na universidade. Vocês não foram somente orientadora, co-orientadora e
coordenadora, em alguns momentos, foram conselheiras, (o) confidentes, e amigas
(o). Vocês são referência profissional e pessoal. Obrigada por estarem ao meu lado
e acreditarem em mim. Gostaria também de agradecer aos professores do
Mestrado, todos aqueles os quais tive a honra de poder compartilhar de seus
conhecimentos, em especial Dr. Prof. Geison Nardi e Drª Elisandra Minotto seja
durante as disciplinas, nos seminários, palestras e corredores. Aos meus colegas do
mestrado em especial ao Cássio G. Freri, Marta Buss, Fernanda Megiollaro, Sallis D.
Narloch, Elis R. D. Schutz, Schelen Rapp, Ketlin Schneider, Auro Schwab e
Marcelina M. Debiasi, Adriana Genuario, Deise F. de Sousa, por compartilharem às
dificuldades, os risos, as angustias e pelas amizades construídas. Agradeço aos
meus chefes Dr. Marcelo Fabricius Andreani e a Drª Claúdia Pinz Baungarthem da
Clínica Gastrocare por me liberar para que pudesse fazer as pesquisas, por me
incentivar e acreditar em mim. A minha Colega de trabalho Fernanda Dambroz
Iurkevicz por trabalhar sozinha na minha ausência.
Obrigada.
“Tenho em mim todos os sonhos do mundo, cujo pensamento sintetiza o meu sonho
agora realizado”.
(Fernando Pessoa)
RESUMO
As doenças hepáticas constituem um dos maiores problemas de saúde pública no
mundo, a fibrose hepática e a cirrose representam as manifestações patológicas
mais comuns e as maiores causas de morte humana. O tetracloreto de carbono
(CCI4) é um composto químico, capaz de promover danos hepáticos, uma vez que
durante seu processo de metabolização gera espécies reativas. Compostos
fenólicos como o ácido gálico e seus derivados apresentam atividade antioxidante
anti-inflamatória, antitumoral, antiviral ente outras, sendo assim, este estudo teve
como objetivo investigar o efeito hepatoprotetor do ácido gálico (GA) e do dodecil
galato (DGA) contra o estresse oxidativo, induzido pelo tetracloreto de carbono
(CCl4) em modelo experimental in vivo, e seu papel na expressão do gene p53. No
presente estudo foram utilizados ratos machos albinos Wistar com 18 semanas de
idade. O dano hepático foi induzido pela administração de CCl4 intraperitoneal, o
tratamento foi realizado com GA ou DGA nas doses de 50 e 100 mg/Kg. No final do
tratamento os animais foram sacrificados, o sangue coletado para investigação dos
marcadores séricos de função hepática (ALT, AST, -GT, Bilirrubina total, albumina)
e lipídeos. O tecido hepático foi pesado e processado para análise histopatológica,
dos marcadores de estresse oxidativo (TBARS, GSH, GPx, GST e CAT) e gene p53.
Os resultados demonstraram claramente que o GA e DGA apresentam proteção
contra o dano hepático agudo e crônico induzido pelo CCl4 com redução significativa
nos níveis séricos das enzimas ALT, AST e da concentração de bilirrubina total,
observou-se também uma redução significativa na peroxidação lipídica hepática e
um aumento nos níveis hepáticos de glutationa. Além disso, verificou-se uma
redução nas enzimas antioxidantes hepáticas; catalase, glutationa peroxidase,
glutationa-S-transferase e glutationa redutase, enquanto o gene p53 foi aumentado
com o tratamento de GA e DGA. Os dados histológicos revelaram uma diminuição
na progressão da fibrose hepática nos animais tratados com GA e DGA. Estes
resultados indicam que o GA e DGA promovem um aumento da expressão do gene
p53, o que induz uma regulação das enzimas antioxidantes, sugerindo um efeito pró-
oxidativo do GA e DGA que parece ser seletivo para hepatócitos danificados. Assim,
estes resultados sugerem que a GA e DGA tem o potencial para prevenir a fibrose
hepática induzida por drogas como o tetracloreto de carbono.
Palavras-chave: enzimas antioxidantes, hepatotoxicidade, gene p53
ABSTRACT
Liver diseases are one of the major public health problems worldwide, liver fibrosis
and cirrhosis are the most common pathological manifestations and the major
causes of human death. Carbon tetrachloride (CCl4) is a chemical compound
capable of promoting liver damage, since during its metabolization process it
generates reactive species. Phenolic compounds such as gallic acid and its
derivatives have anti-inflammatory, antioxidant, antitumor and antiviral activities,
among others, and therefore, this study aimed to investigate the hepatoprotective
effect of gallic acid (GA) and dodecyl gallate (DGA) against oxidative stress induced
by carbon tetrachloride (CCl4) in in vivo experimental model, and its role in the
expression of the p53 gene. In the present study, Wistar albino male mice of
approximately 8 weeks-old were used. The liver damage was induced by CCl4
intraperitoneal administration and the treatment was performed with GA or DGA at
doses of 50 and 100 mg/kg. After the treatment the animals were sacrificed and their
blood was collected for serum markers investigation of the liver function (ALT, AST,
y-GT, total bilirubin, albumin), and lipids. The liver tissue was weighed and processed
for histopathological analysis of markers of oxidative stress (TBARS, GSH, GPx,
GST and CAT) and p53 gene. The results clearly demonstrate that GA and DGA
show protection against acute and chronic liver damage induced by CCl4 with a
significant reduction in serum levels of the enzymes ALT, AST and total bilirubin
concentration; it was also observed a significant reduction in hepatic lipid
peroxidation and an increase in glutathione liver levels. Moreover, there is a
reduction in liver antioxidant enzymes; catalase, glutathione peroxidase, glutathione-
S-transferase, and glutathione reductase, while the p53 gene was increased by
treatment with GA and DGA. The histological data showed a decrease in the
progression of hepatic fibrosis in animals treated with GA and DGA. These results
indicate that DGA and GA promote an increase in the expression of the p53 gene,
which induces the regulation of antioxidant enzymes, suggesting a pro-oxidative
effect of GA and DGA, which seems to be selective for damaged hepatocytes. Thus,
these results suggest that GA and DGA have the potential to prevent liver fibrosis
induced by drugs such as carbon tetrachloride.
Keywords: antioxidant enzymes, hepatotoxicity, p53 gene.
LISTA DE SIMBOLOS E ABREVIATURAS
AG Ácido gálico
ANOVA Análise de Variança
AST Aspartatoamonotransferase
ALT Alanina Aminotransferase
CAT Catalase
CCI4 Tetracloreto de Carbono
CCI3 Triclorometil
CDNB 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
CEH Células Estreladas Hepáticas
COOH Ácido Carboxílicos
DEPC Dietilpirocarbonato – inibidor de RNAase
DGA Dudecil galato
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DPPH 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil
DGA Dodecilgalato
DTNB Ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico
EPM Média Padrão de Erro
ERNs Espécies Reativas de Oxigênio
EROS Espécies Reativas de Oxigênio
FA Fosfatase Alcalina
FAD Flavina-Adenina-Dinucleotídeo
FADH2 Flavin Adenina Dinucleotide
GA Ácido Gálico
GPx Glutationa peroxidase
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa Reduzida
GSSG Glutationa Oxidada
GST Glutationa trasferase
GSTS Glutatina-s- transferase
H&E Hematoxilina e Esonina
HDN Hesperidin
H2O Água
HO2
•
Radical Hidroperoxil
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HOOC Ácidos Dicarboxílicos
I.p. Intraperitoneal
53KDA Peso Molecular
µmol Micromol
µl Microlitro
mM Milimol.
MAD Malonaldeido
MEC Matriz Extracelular
NaCI Cloreto de Sódio
NADP+
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (forma oxidada)
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (forma reduzida)
NH2 Amina
nM Nanômetro
OH Hidroxila
OOCCI Triclorometilperoxil
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
PDGE Fator de Crescimento de Plaquetas
PH Potencial Hidrogeniônico
PHGPX Hidroperoxido de Fosfolipídio Glutations Peroxidase
P53 Proteína Citoplasmática
P450 Citocromo
RPM Rotação por minuto
RO2H Peróxidos Orgânicos
ROH Proteína Procariótica
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
RNAS Ácido Ribonucleico
RT- PCR Transcrição reversa da reação em cadeia da polimerase
TA Temperatura ambiente
TBA Ácido Tiobarbitúrico
TBARS Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA Ácido Tricarboxilo
TG Triglicerídeo
TNB Ácido 5-tio-2-nitrobenzóico
TNF-a- Fator de necrose tumoral alfa
TGF-B- Fator de crescimento beta
SH Tiol
SOD Superóxido Dismutase
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul
VHC Vírus Hepatite C
GT Gama Glutamiltransferase
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1 – Representação esquemática das principais funções hepáticas. ......... 21
Esquema 2 – Mecanismo de toxicidade do CCl4 no organismo. .............................. 27
Esquema 3 - Equilíbrio pró-oxidante-antioxidante. .................................................... 28
Esquema 4 – Sistema enzimático Antioxidante. ........................................................ 30
Esquema 5 – Mecanismo de ação do complexo glutationa. ..................................... 31
Esquema 6 – Interações do p53 com o sistema imune. ............................................ 36
Esquema 7 – Análises realizadas na indução do dano hepático agudo. ................... 41
Esquema 8 – Análises realizadas na indução do dano hepático crônico. ................. 43
Esquema 9 – Possível mecanismo do efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecil
galato em modelo de fibrose hepática induzida pelo tetracloreto de
carbono. ............................................................................................. 69
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fórmula molecular do ácido gálico e dudecil galato. ................................ 33
Figura 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas
hepáticas em ratos intoxicados com CCl4. ............................................... 55
Figura 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas
hepáticas em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ................... 60
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso
relativo do fígado em ratos intoxicados com CCl4. ................................ 51
Gráfico 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA na indução da peroxidação lipídica
e redução da concentração de glutationa hepática reduzida promovida
pela administração de dose única de CCl4. ........................................... 53
Gráfico 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas
antioxidantes em ratos intoxicados com CCl4. ....................................... 54
Gráfico 4 – Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso
relativo do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ..... 56
Gráfico 5 – Efeito do tratamento com GA e DGA na peroxidação lipídica (TBARS) e
concentração de glutationa reduzida hepática em ratos com fibrose
hepática induzida por CCl4. ................................................................... 58
Gráfico 6 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas
antioxidantes em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ........... 59
Gráfico 7 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato na expressão do gene p53 em
ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ....................................... 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR. .................................. 49
Tabela 2 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalatono dano hepático agudo induzido
por CCl4. ................................................................................................ 52
Tabela 3 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato nos parâmetros séricos de ratos
com fibrose hepática induzida pelo tratamento crônico com CCl4. ........ 57
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 18
2 REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................... 20
2.1 FÍGADO – IMPORTANTE ÓRGÃO ENVOLVIDO NA
BIOTRANSFORMAÇÃO DE XENOBIÓTICOS ............................................ 20
2.2 FIBROSE HEPÁTICA ................................................................................... 22
2.3 TETRACLORETO DE CARBONO (CCI4), COMO MODELO
EXPERIMENTAL DE INDUÇÃO DE FIBROSE HEPÁTICA. ........................ 25
2.4 ESTRESSES OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES ......................... 27
2.5 ÁCIDO GÁLICO E DERIVADOS .................................................................. 32
2.6 GENE P53 E O PROCESSO DE ESTRESSE OXIDATIVO ......................... 34
3 OBJETIVOS ................................................................................................. 38
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 38
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 38
4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 39
4.1 REAGENTES ............................................................................................... 39
4.2 ANIMAIS ....................................................................................................... 39
4.3 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE AGUDA E TRATAMENTO ............... 40
4.4 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE CRÔNICA E TRATAMENTO ........... 42
4.5 PARÂMETROS AVALIADOS APÓS A INDUÇÃO DO DANO HEPÁTICO ... 43
4.5.1 Avaliação do Ganho de Peso (GP) dos Animais ...................................... 43
4.5.2 Peso Relativo (PR) do Fígado .................................................................... 44
4.5.3 Análises de Parâmetros Bioquímicos no Soro ........................................ 44
4.5.3.1 Análise Laboratorial de Lipídios Sérico ......................................................... 44
4.5.3.2 Análise de Biomarcadores Séricos de Dano Hepático ................................. 44
4.5.4 Marcadores de Estresse Oxidativo Hepático ........................................... 44
4.5.4.1 Preparação dos homogenatos ...................................................................... 44
4.5.4.2 Lipoperoxidação - Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) . 45
4.5.4.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) ..................... 45
4.5.4.4 Medida da Atividade da Catalase ................................................................. 46
4.5.4.5 Medida da Atividade da Glutationa Peroxidase ............................................ 46
4.5.4.6 Medida da Atividade da Glutationa Redutase ............................................... 46
4.5.4.7 Medida da Atividade da Glutationa-S-transferase ........................................ 47
4.5.5 Dosagem de Proteínas ............................................................................... 47
4.5.6 Preparo da Amostra para realização do ensaio da Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) e análise de transcrição do P53. ................................ 47
4.5.6.1 Extração de RNA .......................................................................................... 47
4.5.6.2 Síntese de cDNA .......................................................................................... 48
4.5.6.3 Curva de eficiência da reação de PCR ......................................................... 48
4.5.6.4 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) ............................ 49
4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ................................................................... 50
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 50
4.8 DESENHO EXPERIMENTAL ....................................................................... 50
5 RESULTADOS ............................................................................................. 51
5.1 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO
AGUDO CAUSADO PELO CCL4 .................................................................. 51
5.2 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO
CRÔNICO CAUSADO PELO CCL4 .............................................................. 55
6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 62
7 CONCLUSÃO............................................................................................... 68
8 PERSPECTIVAS FUTURAS ........................................................................ 70
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 71
18
1 INTRODUÇÃO
O fígado é um orgão vital que desempenha um papel importante na
conjugação de fármacos e desintoxicação. Sua função é prejudicada, geralmente
por exposição excessiva à xenobióticos ou infecções, as quais levam a cirrose ou
lesão maligna em casos não tratados. Milhões de pessoas sofrem de lesões
hepaticas induzida por álcool, produtos químicos e infecções (DONG et al., 2013).
As doenças hepáticas constituem um dos maiores problemas de saúde
pública no mundo, a fibrose hepática e a cirrose representam as manifestações
patológicas mais comuns e figuram entre as maiores causas de mortalidade humana
(ELSHARKAWY, OAKLEY; MANN, 2005,LOTERSZTAJN et al., 2005,SCHUPPAN,
AFDHAL, 2008). A apresentação clínica varia desde a ausência de sintomas até a
falência total do órgão, que é determinada pela natureza e gravidade da
hepatotoxidade subjacente e da magnitude da fibrose estabelecida, a qual pode
progredir para cirrose e deterioração irreversível do órgão (TSUKADA, PARSONS,
RIPPE, 2006).
Estudos experimentais com tetracloreto de carbono (CCl4) tem mostrado que
um dos principais fatores indutores da fibrose hepática, é o aumento de espécies
reativas no fígado, em especial, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, que são
as responsáveis por danos a proteínas, lipídios e ao DNA, resultando na injuria
hepática (KHAN, KHAN, SAHREEN, 2012). O comprometimento do sistema
antioxidante está relacionado com a evolução de algumas doenças hepáticas como
a fibrose hepática, o emprego de agentes antioxidantes em especial os compostos
fenólicos são sugeridos como tratamento em doenças crônicas hepáticas
(ALMEIDA, 2009)
Os antioxidantes são substâncias capazes de inibir a oxidação, podendo ser
de natureza enzimática e não enzimática, como os α-tocoferóis (vitaminas E), β-
caroteno, ascorbato (vitamina C) e os compostos fenólicos (flavonóides)
(HALIWELL, 2001; SOUSA et al., 2007). Os compostos fenólicos estão presentes
em um grande número de plantas e retardam a formação de radicais livres,
substâncias reativas associadas a doenças causadas pelo estresse oxidativo, que
geram dano celular. (DROGE, 2002). Dentre os compostos fenólicos o 3,4,5-ácido
trihidroxibenzóico ou ácido gálico e seus derivados, apresenta um potencial para o
19
uso terapêutico em doenças hepáticas crônicas, embora não tenham sido realizados
muitos estudos clínicos em pacientes (FIGUEIREDO, 2012).
O ácido gálico (GA), um trifenol natural encontrado em plantas, e os seus
derivados têm sido estudados extensivamente quanto sua atividade antitumoral,
antimicrobiana, antiviral e antioxidante(OW; STUPANS, 2003; LOCATELLI et al.,
2009). Alguns derivados do GA, tais como metil, propil, octil e dodecil galatos são
amplamente utilizados na indústria de alimentos, farmacêutica e cosmética devido
ao seu potencial antioxidante (OW; STUPANS, 2003; LOCATELLI et al., 2009).
A ação antioxidante do ácido gálico e seus derivados está associada ao fato
de que estes compostos induzem o aumento intracelular na atividade das enzimas
antioxidantes como a catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e
glutationa redutase, essas enzimas são responsáveis pela metabolização de
espécies reativas, transformando-as em outras substâncias mais estáveis e menos
reativas ou oxidativas (CHUANG et al., 2010).
Diante disso, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito do ácido gálico
(GA) e dodecilgalato (DGA) contra o estresse oxidativo induzido pelo tetracloreto de
carbono (CCl4) em modelo experimental in vivo e seu papel na expressão gene p53.
20
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 FÍGADO – IMPORTANTE ÓRGÃO ENVOLVIDO NA BIOTRANSFORMAÇÃO
DE XENOBIÓTICOS
O fígado, um dos maiores órgãos do corpo humano, pesa cerca de 1,2 a 1,5
kg, está situado na cavidade abdominal, abaixo do diafragma. Suas unidades
morfológicas, os lóbulos hepáticos direito e esquerdo são separados por uma prega
do peritônio denominado ligamento falciforme (SHERLOCK et al., 2004), este é um
órgão hematopoiético com capacidade regenerativa e que possui microambientes
imunológicos exclusivos (WATANABE et al., 2008).
O fígado tem mais de 250 funções distintas, das quais as mais importantes
(Esquema 1) são o armazenamento e a liberação de açúcar no sangue (glicose)
para produção de energia; a classificação e processamento de vitaminas e minerais,
decomposição de toxinas em substâncias menos nocivas; reciclagem de células
sanguíneas e a formação de plaquetas que contribui no processo de coagulação
(GUYTON, 2002).
A principal função é a biotransformação de substâncias não polares que são
excretadas através da bile e da urina. O envolvimento do fígado na toxicidade
induzida por drogas se deve a sua localização anatômica que é a principal porta de
entrada para as drogas ingeridas (GRATTAGLIONO et al.,2009)
Essas substâncias são transformadas em formas inativas por reações que
ocorrem nos hepatócitos. O retículo endoplasmático liso dos hepatócitos contém
uma variedade de enzimas e co-fatores que são responsáveis pela transformação
química de substâncias. Enzimas, no reticulo endoplasmático, catalisam compostos
como ácido glicurônico, glicina ou glutationa. As transformações tornam compostos
mais hidrossolúveis (BERNE M. R. LEVY N. MATTHEUS, 2000).
O fígado sintetiza todos os aminoácidos não essenciais, além de sintetizar as
principais proteínas plasmáticas incluindo as lipoproteínas, albumina, globulinas,
fibrinogênio e outras proteínas que participam da coagulação sanguínea. Além disso
faz o armazenamento do ferro e das vitaminas lipossolúveis A, D, E e K, excreta e
transforma hormônios, medicamentos (drogas) e toxinas (GUYTON, 2002).
21
Esquema 1 – Representação esquemática das principais funções hepáticas.
Fonte: adaptado Renz (2003).
As reações de biotransformação se dividem em dois grupos, de oxidação e
redução (fase I), e de conjugação e hidrólise (fase II). Nas reações de oxidação que
acontece na fase I da biotransformação na qual o composto é oxidado a uma
substância mais polar, pela adição ou exposição dos grupos funcionais polares,
como hidroxila (OH), tiol (-SH) ou amina (-NH2). As enzimas da fase I catalisam
reações que geralmente resultam na introdução de um grupo funcional na molécula
de substrato. As enzimas envolvidas nas reações da fase I são as monooxigenases
do citocromo P450 (SCHROER et al.; 2010). As citocromo P450 monooxigenases,
75% desempenham papel importante no metabolismo de drogas, mediado pelas
22
enzimas P450. Esses metabólitos são mais reativos e podem ser secretados sem
erro qualquer modificação (GUENGERICH FP. 2006).
As reações de biotransformação na fase II seguem o processo de
detoxificação, resultando em metabólitos inativos (WILLIAMS et al.; 2002). As
reações da fase II modificam os compostos através da ligação de grupamento
hidrofílicos, como os ácidos glicurônico, criando conjugados mais polares
(SCHROER et al., 2010). Fatores intrínsecos e extrínsecos, como a combinação de
idade, sexo, genética, hormônios, doenças hepáticas e fatores ambientais, resultam
em resposta que influenciam a células a um dano tóxico (ZIMMERMANN, 1999). Um
equilíbrio entre a bioativação, detoxificação e os mecanismos de defesa, determinam
se um composto irá provocar um efeito tóxico ou não (WILLIAMS et al., 2002)
O fígado está preparado para eliminar as toxinas e evitar ou minimizar os
danos causados por intermediários reativos tóxicos. Apesar de muitas vias
enzimáticas e não enzimáticas de bioativação estarem presentes no fígado;
intermediários reativos podem escapar do processo de desintoxicação e dar início a
reações em cadeia de radicais. A relação entre a bioativação e a ocorrência de lesão
hepática não é simples. Estas espécies reativas podem ser diretas e indiretas, que
causam uma lesão tóxica na célula e iniciam uma reação imunológica (LEE, 2003b;
WALGREN et al., 2005).
2.2 FIBROSE HEPÁTICA
A fibrose hepática é o resultado das doenças crônicas que afetam o fígado,
causando desequilíbrio entre a síntese e a degradação da matriz extracelular,
incluindo o colágeno, as glicoproteínas, os polissacarídeos e as aminas
(FRIEDMAN, 2003), e faz parte do processo cicatricial no fígado e ocorre na
tentativa de conter a agressão, consistindo no acúmulo de componentes da matriz
extracelular (MEC). Os mecanismos que regulam a deposição do tecido fibroso no
fígado têm sido elucidados nos últimos anos graças à evolução nos conceitos do
binômio inflamação-fibrogêneses. A fibrogênese hepática é um processo dinâmico
que envolve a síntese, a remodelação e a degradação da matriz extracelular
(TOROK N. J. 2008), os elementos celulares envolvidos na fibrogêneses
(Brown 2000). O fígado produz vários elementos celulares capazes de sintetizar e
depositar os componentes da matriz extracelular fibroblastos, miofibrosplastos e até
23
os próprios hepatócitos (GEERTS 2001). A fibrose é uma resposta evolutiva
altamente conservada para limitar o dano tecidual e serve como uma resposta
genérica à lesão hepática crônica independente da etiologia (FALLOWFIELD e
IREDALE 2004). Evidências de regressão de fibrose tem sido estudas em uma série
de hepatopatias crônicas, como hepatites auto-imunes, hepatites virais, obstrução
biliar, sobrecarga de ferro e esteato-hepatite não alcoólica (FRIEDMAN; BANSAL,
2006).
A fibrose é a via final da maioria das lesões que acometem o fígado e ocorre
em resposta a quase todas as agressões crônicas hepáticas (TOROK NJ. 2008).
Elas desencadeiam uma cascata de eventos, que, se mantidos de forma crônica,
podem resultar em diferentes graus de fibrose, sendo a cirrose o estágio mais
avançado (FRIEDMAN, 2008). A fibrose acontece com a destruição tecidual
substancial decorrente de um desequilíbrio entre as atividades hepáticas
fibrogênicas e fibrolíticas (KUMAR et al.;2008b). Essa condição caracteriza-se pela
presença de fibrose grave com distorção da arquitetura lobular hepática, septos,
nódulos de regeneração, além de alteração no fluxo sanguíneo. (FRIEDMAN, 2008).
Indiretamente à etiologia da cirrose, a regressão da fibrose envolve mecanismos de
inativação a apoptose das principais células precursoras da fibrogênese hepática, as
células estreladas hepáticas (CEH) RAPPAPORT et al;1954). Essas células
correspondem aproximadamente 15% das células hepáticas que tem sua origem na
crista neural (FRIEDMAN, 2000).
A matriz extracelular do fígado tem características diferentes nos espaços
porta, no interior dos lóbulos e na região em torno da veia centrilobular. Os
componentes da matriz extracelular são sintetizados pelos fibroblastos portais (nos
espaços porta), pelas células perisinusoídais armazenadoras de gordura (células de
Ito ou células estreladas) e pelas células endoteliais dos sinusóides, nos espaços de
Disse (FRIEDMAN, 2000). O fígado cronicamente doente, as células de Ito
proliferam e adquirem características de miofibroblastos, com ou sem as inclusões
lipídicas (GEERTS, 2001). Está célula é armazenadora de gordura e vitamina A, que
sob a ação de citocinas fibrogênicas, (TGF-b, TNF-a,), se diferencia em
miofibroblasto e fibroblasto, ativa síntese dos elementos da matriz, colágenos,
elastina, proteoglicanos e proteínas inibindo fatores fibrogênicos, mas os melhores
resultados, até o momento, e a possibilidade de regressão da fibrose são quando a
causa é removida (ANDRADE, 1989; ARTHUR, 2002). Sob tais condições, estas
24
células são observadas próximo aos hepátocitos lesionados causando a fibrose
(BOGLIOLO, 1981).
A apoptose de hepatócitos pode induzir a fibrose hepática, que é uma
importante forma de morte celular desencadeada através da ativação das proteases
de cisteína durante a progressão da doença hepática crônica (JEULIN et al., 2013).
A apresentação clínica da doença hepática varia desde a ausência de
sintomas até a falência total do órgão, que são determinadas pela natureza e
gravidade da hepatotoxidade subjacente e da magnitude da fibrose estabelecida
(FRIEDMAN, 2003; TSUKADA; PARSONS; RIPPE, 2006).
O tratamento é outro problema crucial da fibrose hepática (ARTHUR, 2002).
Muitos fármacos têm sido estudados, mas nenhum com eficácia comprovada
(ARTHUR, 2002).
A compreensão das bases fisiopatológicas da fibrogênese está levando a
novas abordagens terapêuticas, sendo a estratégia mais eficaz para reversão da
fibrose com uso de substâncias antifibróticas, que inibe a deposição de matriz, a
síntese de colágeno e a modulação da ativação de células estreladas, reforçando a
degradação da matriz, ou a estimulação da morte celular ou apoptose das células
estreladas hepáticas (ÖZÇELIK, 2011). Em virtude do grande problema hepático,
muitas pesquisas a respeito desta doença são realizadas em todo mundo,
objetivando testar substâncias e técnicas que possam converter em tratamento e
busca da cura, ou ao menos aumentar a sobrevida dos pacientes, evitando a
progressão da doença. Procedimentos em seres humanos são limitados por
considerações éticas, reforçando a necessidade de modelos em animais que
reproduzem o quadro patológico da fibrose e da cirrose (LALEMAN et al., 2006).
A cirrose hepática é uma doença crônica que provoca dano permanente na
formação do tecido cicatrizal, levando ao dano na estrutura do fígado, bloqueando o
fluxo de sangue diminuindo a capacidade do fígado de processar nutrientes,
hormônios, fármacos e toxinas (GUYTON, 2002).
Nos países ocidentais, a etiologia mais comum de cirrose é o abuso de álcool,
seguido por hepatite e alterações das vias biliares. Alguns pacientes afetados são
assintomáticos, sendo identificados por testes de função hepáticos anormais
(BRANDÃO et al., 2006).
Outros fatores que podem desencadear doenças hepáticas são as reações
severas a medicamentos, ou exposição a toxinas ambientais, um exemplo é o
25
tetracloreto de carbono usado nas indústrias de lavagem a seco, esse composto é
reativo, que age nas membranas do retículo endoplasmático rugoso, causando
dispersão dos ribossomos, inibindo a síntese proteica e a esteatose hepática
(LALEMAN et al., 2006).
A cirrose hepática é um processo difuso, decorrente de ação continuada e
mantida por uma agressão ao órgão, caracterizado por fibrose progressiva e
substituição da arquitetura hepática normal por nódulos estruturalmente anormais,
uma condição terminal que o fígado é levado por variadas etiologias (GUYTON,
2002). O que faz a peculiaridade da cirrose é um processo generalizado de
regeneração nodular do parênquima, acompanhado de um complexo de alterações
vasculares (POPPER, 1977, FRIEDMAN, 2000).
2.3 TETRACLORETO DE CARBONO (CCI4), COMO MODELO EXPERIMENTAL
DE INDUÇÃO DE FIBROSE HEPÁTICA.
O tetracloreto de carbono (CCI4) é um composto quimico, hidrocarboneto
halogenado e toxico, que ocasiona dano hepático, gera radicais livres formados
durante a sua metabolização. O primeiro estudo realizado para avaliar o dano
hepático causado pelo (CCl4) foi descrito em 1936 por Cameron e Karunarate,
utilizando como modelo animais (BASU, 2003).
Estudos tem mostrado que a toxicidade do (CCl4) é devido a formação de
metabólitos halogenados produzidos durante a biotransformação, causando dano na
estrutura celular via estresse oxidativo (EL-HALAWANY 2014, DINE, et al., 2014).
O tetracloreto de carbono é uma molécula pequena, lipofílica e, distribui-se
facilmente nos compartimentos lipídicos do corpo, é metabolizado no fígado, o
mecanismo para a sua toxicidade envolve a bioativação do CCl4, que é mediada
pelo P450 (CYP) e a indução de peroxidação dos lipídios na membrana
(BOELSTERLI, 2007). O fígado apresenta aparência inchada e macia, com elevação
dos níveis séricos de bilirrubina e enzimas hepáticas como aspartato
aminotransferase (AST), e redução dos níveis séricos de proteínas como albumina e
fibrinogênio. Além destes efeitos, causa esteatose hepática, que induz um processo
de inflamação, e necrose com maior progressão para fibrose no tecido formador do
órgão (MURIEL; ESCOBAR, 2003). Promove alterações nucleares, às quais estão
26
associadas ao desenvolvimento de genotoxicidade, neoplasia, hiperplasia e no
desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (KHAN; KHAN; SAHREEN, 2012b).
A solubilidade do CCI4 em lipídios faz com que atravesse a membrana celular,
atingindo órgãos como, fígado, rins, coração, pulmões, testículos, cérebro e sangue
(BASU, 2003). Os primeiros sinais de lesão hepatocelular em ratos abrange a
dissociação de polissomas e ribossomas do reticulo endoplasmático rugoso,
desorganização do reticulo endoplasmático liso, inibição da síntese proteica e
acumulação de triglicerídeos. A necrose celular ocorre entre as 24 e 48 horas
(TIRKEY et al., 2005). A hepatoxicidade induzida pelo CCI4 interfere com moléculas
celulares, tendo como consequência alterações na fisiologia celular, aumento da
peroxidação lipídica, redução da quantidade de glutationa e consequentemente dano
ou morte celular. Alterações proliferativas no órgão resultam em esteatose hepática,
necrose celular, fibrose e cirrose, podendo levar ao câncer (LIMA; FERNANDES-
FERREIRA; PEREIRA-WILSON, 2007).
A quantidade de CCl4 metabolizado em determinado órgão está relacionada
com a expressão de CYP2E1 no tecido. No fígado, os metabólitos do CCl4
acumulam-se em uma concentração maior na região centrilobular, que possui altos
níveis de expressão desta enzima (BERGMAN, 1983). O dano hepático agudo por
CCl4 se caracteriza histologicamente por marcada necrose de região centrilobular,
esteatose microvesicular e forte presença de infiltrado inflamatório no tecido
hepático (RAHMAN, HODGSON, 2000). A principal consequência da toxicidade do
CCl4 está relacionada a peroxidação lipídica que causa rompimento da membrana
celular, resultando na perda da sua integridade. Estudos mostraram que após
tratamento com CCl4 observam-se mudanças extensivas na morfologia do fígado,
incluindo esteatose, inflamação, balonização dos hepatócitos, dilatação dos
sinusóides e da veia centrolobular do fígado e necrose, além de infiltração celular
(ROY et al., 2011).
27
Esquema 2 – Mecanismo de toxicidade do CCl4 no organismo.
Fonte: U. S. Enviromental Protection Agency (2010).
2.4 ESTRESSES OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES
Oxidação é um processo metabólico que leva à produção de energia
necessária para as atividades essenciais das células, no entanto durante este
processo metabólico uma quantidade significativa de espécies reativas é gerada, as
quais podem desencadear o surgimento do estresse oxidativo (SOARES, 2002).
O estresse oxidativo é definido como um estado de desequilíbrio entre a
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a capacidade antioxidante
28
endógena como representado no (Esquema 3), sendo que tal desequilíbrio está
associado ao desenvolvimento de doenças crônicas, incluindo danos em órgãos
essenciais como o fígado, além de estar associado ao surgimento de doenças
neurodegenerativas e câncer (REIS et al. 2008).
As espécies reativas de oxigênio (ROS) mais comuns são: os radicais
superóxido (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio singlet (1O2) os quais
apresentam uma capacidade de oxidação superior ao oxigênio molecular em seu
estado fundamental, esses compostos formam-se durante as reações metabólicas
dos organismos, sendo inevitáveis para o metabolismo dos organismos aeróbicos
(ANGELOVA et al., 2000).
Esquema 3 - Equilíbrio pró-oxidante-antioxidante.
Fonte: Trauma Ozono (2005).
Os fatores que induzem o estresse oxidativo dividem-se em externos e
internos, físicos e químicos (STOCKER, KEANEY, 2004). Os fatores físicos incluem
variação de temperatura, luz e radiação. Os químicos envolvem compostos que em
contato com o organismo causam aumento nos níveis de espécies reativas. Os
fatores internos estão relacionados com o processo metabólico que o organismo
realiza diariamente (STOCKER, KEANEY, 2004).
O processo conduz a oxidação de biomoléculas e consequente perda de suas
funções biológicas, cuja manifestação são o dano oxidativo contra células e tecidos,
levando a desenvolver um processo etiológico de inúmeras enfermidades crônicas
(GREEN, BRAND, MURPHY, 2004).
Os antioxidantes são substâncias presentes em menores quantidades que as
do substrato oxidável, capazes de atrasar ou inibir a oxidação de maneira eficaz,
29
podem agir diretamente, neutralizando a ação dos radicais livres e espécies não
radicais e participando indiretamente dos sistemas enzimáticos (HALLIWELL,
WHITEMAN, 2004).
O sistema de defesa antioxidante é formado por antioxidantes enzimáticos e
não enzimáticos, protegendo o organismo dos danos causados por espécies
reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN) e, portanto,
aumentam a defesa imunológica, atenuando o risco de desenvolvimento de doenças
relacionadas às espécies reativas (CHATTERJEE et al., 2007).
Os antioxidantes não enzimáticos são substâncias naturais produzidas por
plantas, estes compostos fenólicos têm sido estudados extensivamente devido a sua
capacidade de sequestrar os radicais livres (DECKER, 1997. BARREIROS,
et.al.,2006. STUMPF et.al., 2012). Dentre os compostos fenólicos os mais estudados
devido a sua ação, principalmente sobre a peroxidação lipídica encontram-se os
ácidos cafeico, elágico e gálico (HARTMAN, SHANKEL, 1990; HALLIWELL et al.,
1995).
O mecanismo de ação dos compostos fenólicos pode inibir os processos da
oxidação em alguns sistemas, mas a sua utilização não protege os tecidos de todos
os tipos de danos oxidativos, podendo causar efeito pró-oxidante em alguns
sistemas (DECKER, 1997. BARREIROS, et.al.,2006. STUMPF et.al., 2012).
O sistema enzimático age evitando o acumulo de ânion radical superóxido e
do peróxido de hidrogênio (Esquema 4) que é formado pelas enzimas, destacando
superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), e a glutationa peroxidase (BELLÓ
2002).
30
Esquema 4 – Sistema enzimático Antioxidante.
Fonte: Adaptado de RENZ (2003)
No Esquema 4, a atividade protetora da glutationa é expressa pela redução
de espécies oxidantes, e consequentemente oxidação da glutationa reduzida (GSH)
à glutationa dissulfeto ou glutationa oxidada (GSSG) (BELLÓ 2002). A GSH pode
ser considerada um dos agentes mais importantes do sistema de defesa
antioxidante da célula, protegendo-a contra a lesão resultante da exposição a
agentes tóxicos, diminuindo a suscetibilidade à lesão decorrente da ação oxidativa
da célula ou promovida por substâncias administradas exógenamente como os
medicamentos quimioterápicos, portanto, participa da detoxificação de agentes
químicos e da eliminação de produtos da lipoperoxidação (FERREIRA;
MATSUBARA, 1997).
A glutationa (GSH) tem um importante papel na biotransformação e
eliminação de xenobióticos, atuando na defesa das células contra o estresse
oxidativo, sua quantificação no tecido hepático é importante para avaliar o dano
celular (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
As glutationa transferases (GSTs), também conhecida como glutationa-S-
transferases, compreendem uma família de enzimas multifuncionais que catalisam o
ataque nucleofílico da forma reduzida da glutationa (GSH) a compostos que
apresentam um carbono, um nitrogênio ou um átomo de enxofre eletrofílico. As
GSTs geralmente se encontram no meio biológico como homo ou heterodímeros
(outros complexos também podem existir), apresentando dois sítios ativos por
31
dímero cujas atividades são independentes uma da outra. Glutationa-S-Transferase
(GST) enzima de ligação, sua atividade encontra-se em níveis apreciáveis apenas
nos rins, pâncreas, fígado, baço e no intestino delgado, alem de participar na
transferência de aminoácidos através da membrana celular e no metabolismo da
glutationa (MOTTA, 2000).
A glutationa GSH e GSSG são interconvertidas pela ação de enzimas, a
glutationa peroxidase GSH-PX e a glutatina redutase GSH-R respectivamente,como
mostra a (Esquema 5). A GSSSG é reduzida por regenerar GSH em uma reação
catalizada pela enzima GSH-R, está reação necessita de NAPH como doador de
hidrogenio.
Esquema 5 – Mecanismo de ação do complexo glutationa.
Fonte: RENZ (2003)
A Glutationa redutase GSH é uma enzima responsável pela redução da
GSSG a GSH. Os sítios ligantes para GSSG estão situados na interface das duas
subunidades que constituem a estrutura quaternária da glutationa redutase, sendo
que cada uma tem um domínio, com um sitio ligante para NADPH (AVILEZ, et al.,
2008).
Outro importante sistema enzimático de defesa contra radicais livres envolve
as glutationas peroxidases GSH-PX encontradas em muitos tecidos de origem
animal. Estas enzimas são bastante particulares no que se refere à sua constituição,
32
pois incorporam um resíduo de seleno cisteína no seu sítio ativo (AVILEZ, et al;
2008).
A catalase é uma proteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a
H2O e O2, encontrada no sangue, na medula óssea, mucosas, nos rins e no fígado,
sua atividade é dependente de NADPH. A catalase exógena previne a oxidação da
GSH e inibe as lesões oxidativas do DNA (BELLÓ 2002). O estresse oxidativo
decorrente de agressões térmica nos eritrócitos diminui a atividade da catalase
durante o processo hemolítico termo dependente (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
2.5 ÁCIDO GÁLICO E DERIVADOS
Ervas, plantas e chás são alvos mais importantes na busca por antioxidantes
naturais. O homem tem usado estes produtos desde a época pré-histórica não
somente para aromatizar os alimentos, mas também devido as suas propriedades
anti-sépticas e medicinais (DELAPORTE, 2002). A utilização de plantas medicinais
e seus componentes ativos estão se tornando uma alternativa cada vez mais
atraente para o tratamento terapêutico de várias doenças entre pacientes que não
respondem ao tratamento com medicamento convencional. As plantas contêm um
grande número de substâncias de natureza polifenólica com capacidade de reduzir
processos inflamatórios, consequentemente aumentar a resistência a determinadas
enfermidades incluindo o câncer (BENGMARK, MESA, GIL, 2008).O
desenvolvimento de fármacos a partir de fontes naturais tem se tornado um alvo
promissor para a indústria farmacêutica a nível mundial (PANDEY 1998). Entre os
compostos fenólicos mais estudados encontram-se, o ácido gálico, e seus
derivados, devido ao potencial antioxidante, parece reduzir a incidência de doenças
como a aterosclerose e o câncer, sendo assim, pode-se investigar a ação
hepatoprotetora do ácido gálico e seus derivados (LOCATELLI et al., 2009). O ácido
gálico foi usado como protótipo para a síntese de vários análogos simples com
potencial para estudos em Química Medicinal (KROES,1992).
Os flavonóide presente nos vegetais, frutas, chás, vinho tinto, representa um
antioxidantes de origem vegetal com maior potencial antioxidante (DAJAS et al.,
2003), em sua estrutura química possui grupos hidroxila fenólicos, o que lhes
conferem uma ação antioxidante com importante potencial terapêutico, contra muitas
doenças como doenças isquêmicas do coração, arterosclerose, fibrose hepática,
33
lesão renal e obstrução biliar crônica. O ácido gálico, que apresenta capacidade
antioxidante, pode impedir ou diminuir a progressão da fibrose, reduzindo a ação
dos radicais livres, que estão relacionados com o estresse oxidativo, causando dano
hepático. (PERES et al., 2000b, MORALES et al., 2006, TOKYOL et al., 2006).
O ácido gálico (Figura 1) consiste em uma estrutura fenólica tri-hidroxilada, é
um intermediário do metabolismo vegetal secundário, e é frequentemente um
componente de taninos hidrolisáveis em plantas. (GRUNDHÖFER et al., 2001). O
ácido gálico é encontrado na noz-de-galha, no sumagre, na hamamélis, nas folhas
de chá, no súber do carvalho (GRUNDHÖFER et al., 2001).
Figura 1 – Fórmula molecular do ácido gálico e dudecil galato.
Fonte: Cordova (2011). Universidade Federal de Santa Catarina.
Os n-alquil ésteres conhecidos como galatos, em especial o galato de propila,
octila e dodecila, são amplamente utilizados como antioxidante pelas indústrias de
alimentos, cosméticos e medicamentos. (ABDELWAHED A, 2007).
Os avanços na compreensão das bases fisiopatológicas da fibrogênese estão
levando a novas abordagens terapêuticas, sendo a estratégia mais eficaz para
reversão da fibrose com uso de substâncias antifibróticas, inibindo a deposição de
matriz, síntese de colágeno, a modulação da ativação de células estreladas,
reforçando a degradação da matriz, ou a estimulação da morte celular ou apoptose
das células estreladas hepáticas (ÖZÇELIK B, 2011).
Estudos têm mostrado que o ácido gálico possui uma variedade de ações
farmacológicas, incluindo as atividades antioxidantes, anti-inflamatórias,
antimicrobiana, antiviral e antitumoral (LOCATELLI et al., 2009). Em modelos
animais, ácido gálico reduz o estresse oxidativo e melhoram os níveis de glutationa
34
(GSH), peroxidase de GSH, GSH redutase e GSH-S-transferase em tecido hepático,
bem como catalase (BRUN, 2005).
O ácido gálico é conhecido por induzir a morte celular ou parada do ciclo
celular em várias linhagens de células tumorais (HAZRA S, 2004).
2.6 GENE P53 E O PROCESSO DE ESTRESSE OXIDATIVO
O DNA, lipídeos, proteínas e açúcares, são as principais moléculas que
sofrem ataque das ERO, os fatores que determinam a preferência do ataque podem
ser o local onde a espécie reativa é gerada, a habilidade relativa de uma
biomolécula ser oxidada e a disponibilidade de íons metálicos associados a essa
biomolécula (EVANS, et. al., 2004. BERRA et. al., 2006).
No DNA, a indução dos danos oxidativos ocorre assim que as bases
nitrogenadas reagem com EROS. A oxidação direta dos ácidos nucleicos pode levar
a formação de quebras em uma das cadeias do DNA, ou quebras simples em
posições aproximadamente simétricas nas duas cadeias do DNA. Durante a fase de
replicação celular as quebras simples geradas pelo estresse oxidativo podem gerar
quebras duplas. Foram identificados mais de 20 tipos de danos nas bases do DNA,
quando a biomolécula é exposta a diferentes formas de extresse oxidativo, induzidos
tanto in vitro quanto in vivo (SLUPPHAUG, et.al. 2003).
Entre as bases nitrogenadas a guanina exibe o menor potencial de ionização,
sido estudada preferencialmente nas reações de oxidação, sendo utilizada como
modelo no estudo da oxidação de bases nitrogenadas. A guanina pode reagir com o
radical hidroxila (•OH) e com o oxigênio Singlete (1O2), a hidratação de radicais
catiônicos da guanina leva, predominantemente, à formação de 8-oxodGuo
(OLINSKI, et.al. 2003; CADET, et.al. 2008).
A importância biológica da guanina oxidada é relacionada ao
emparelhamento errôneo com a adenina, gerando uma transversão de GC para TA,
o 8-oxodGuo parece ser capaz de bloquear a transcrição. O reparo do DNA está
interligado ao ciclo celular e a regulação dos mecanismos de transcrição e
replicação utiliza em partes fatores comuns (EVANS, et. al., 2004).
Quando a capacidade de reparo é superada pelo tipo e quantidade de danos
os mecanismos celulares essenciais podem ser afetados seriamente, caso as lesões
não sejam removidas podem levar a morte celular, incorporação de mutações no
35
genoma, provocar efeitos genotóxicos severos até o aparecimento do câncer
(COSTA, et.al. 2005; CADET, et.al. 2008).
Estudos realizados com diferentes linhagens celulares têm demonstrado que
a utilização de compostos antioxidantes como o ácido gálico e seus derivados
promovem a citotoxidade, (ALBINI, 2007, LOCATELLI, 2009).
O ácido gálico por ser um composto doador de elétrons é capaz de neutralizar
os radicais livres, sendo capaz também de intervir na ativação de proteínas que
atuam nas vias de sinalização e nas proteínas de supressão tumoral como as
proteínas p53, atuando como inibidores da transformação do ciclo celular (KASTAN,
et.al.1991; LARSEN, 1994; KIM, 2007).
O gene p53 é uma proteína sintetizada pela própria célula. As mutações
somáticas no gene supressor tumoral p53 são encontradas em aproximadamente
50% de todos os tumores humanos (MORI T. 2002).
Um dos genes supressores mais estudados em tumores humanos é o p53.
Este gene codifica uma fosfoproteína nuclear (p53) que tem papel ativo na parada
do ciclo celular e indução da expressão de genes de reparo de DNA lesado. Quando
há lesão no DNA o nível de p53 na célula aumenta e após o reparo o nível diminui.
Dependendo da intensidade do agravo, o p53 pode induzir a morte das células
geneticamente alteradas (NAKAMURA S, 2002).
Os genes supressores de tumores estão localizados no braço curto do
cromossomo humano 17, é codificado pela fosfoproteína p53, sendo hoje a principal
linha de pesquisa para descoberta de novos tratamentos contra o câncer
(ROBERTIS Jr., 2003).
A proteína codificada pelo gene p53, atua como um freio que impede o
agente carcinogênico que é ativado por situações de estresse como o estresse
oxidativo (EROs e ERNs), através dos raios ultravioletas, raios gama, hipóxia, perda
de contato entre as células. Quando detectado dano no DNA, o p53 interrompe o
ciclo celular para reparar ou se não for possível leva a apoptose (SOUSSI et al.,
1994).
36
Esquema 6 – Interações do p53 com o sistema imune.
Fonte: Adaptado de Lowe, et.al. (2013).
O gene p53 como mostra a (Esquema 6) é ativado quando o sistema imune
recebe sinais exógenos como danos ao DNA, infecções por vírus e doenças,
também é ativado por fatores endógenos como a geração de EROs e ERNs, hipóxia
e proliferação celular fora do controle, ativando a rede transicional levando a
resposta imune inata no organismo (redox e sinalização) e a imunidade adaptativa
acontece levando a ativação das células T e NK. A expressão do gene p53 pode
afetar o crescimento e morte de células envolvidas diretamente na formação de
tumores, modificar a imunidade do organismo e provocar melhoras em casos de
inflamações (LOWE, et.al.; 2013). O gene p53 atua em todas as fases da
carcinogênese, além dessa função de proteger, funciona como fator de transcrição,
produzindo micro RNAs, essas moléculas regulam negativamente a expressão de
outros genes. O p53 atua na regulação da atividade metabólica e exerce um
importante papel na fixação do embrião no útero e na diferenciação de tecidos
37
embrionários. Um dos desafios encontrados pelos pesquisadores é aplicar o
conhecimento adquirido do p53 na prática, para diagnóstico, como para prognóstico
do câncer (WU et al., 2002). O p53 mutado é observado em 75% das famílias, a
uma possível associação entre etnia e polimorfismos constitucionais do p53, que
confere um risco aumentado para câncer de pulmão por afetar a função da proteína
p53 (WU et al., 2002).
O mecanismo de ação da proteína p53, durante a fase G1 da divisão celular,
faz uma verificação quanto a mutações na sequência do código genético decorrente
de um eventual erro de replicação, caso seja encontrado o erro de pareamento de
bases, é função da proteína p53, através do desdobramento de uma cascata de
reações químicas no interior da célula impedir que ocorra a mitose e se complete a
divisão de uma célula mutante (ROBERTIS Jr., 2003).
Dois caminhos podem ser seguidos, a correção da mutação através das
proteínas de reparo do DNA ou, na impossibilidade de correção, a indução da
apoptose celular. Na correção ou indução da morte celular, a proteína p53 é
considerada um elemento chave na prevenção e desenvolvimento de tumores,
sendo gene codificador classificado como gene supressor de tumor. (ALVES et al.,
2004).
A importância da p53 e a compreensão dos mecanismos da função desta
proteína é um dos principais desafios (BAI; ZHU, 2006).
38
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecilgalato contra o
estresse oxidativo induzido pelo tetracloreto de carbono (CCl4) em modelo
experimental in vivo.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a integridade hepática após administração de CCl4, ácido gálico ou
dodecilgalato em ratos através da análise das enzimas séricas,
aspartatoamonotrasferase (AST), alanina aminotransferas (ALT), gama
glutamiltransferase (-GT), bilirrubina e por meio de análise histopatológica;
Avaliar o efeito protetor do ácido gálico e dodecilgalato contra o estresse
oxidativo induzido pelo CCl4 em ratos através da determinação dos níveis de
peroxidação lipídica, determinação de glutationa e da atividade das enzimas
Glutationa peroxidase, glutationa redutase, glutationa-S-transferase e
Catalase;
Investigar o efeito do tratamento com tetracloreto de carbono, ácido gálico e
dodecilgalato na expressão do gene p53 após administração de CCl4 em
ratos.
39
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 REAGENTES
Os conjuntos de reagentes para as determinações do colesterol total,
triglicerídeos, alaninaaminotransferase (ALT) e aspartatoaminotransferase (AST),
gama-glutamiltransferase (GGT), bilirrubina total e albumina foram obtidos da
empresa Labtest Diagnóstica S.A. (Lagoa Santa – MG).
Os reagentes relacionados a seguir foram adquiridos da Sigma (Steinheim,
Alemanha ou St. Louis, EUA): reagente de Folin-Ciocalteau, bicarbonato de sódio,
ácido tiobarbitúrico (TBA), albumina sérica bovina, ácido 5,5-ditio-bis (2-
nitrobenzóico) (DTNB), glutationa reduzida (GSH), ácido tricloroacético (TCA),
glutationa redutase, ácido gálico, dodecilgalato, hidróxido de sódio, ácido clorídrico,
butanol, clorofórmio, ácido ortofosfórico, ácido metafosfórico, peróxido de hidrogênio
e fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) foram adquiridos da empresa VETEC
(Rio de Janeiro, RJ); ácido perclórico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ,
hidroperóxido de tert-butil, fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.H2O), sulfato de
magnésio (MgSO4).
Carbonato de sódio, hidróxido de sódio, sulfato de cobre, tartarato de sódio e
potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio, peroxido de hidrogênio, tampão Pi,
tampão TRIS-HCl, NADPH, Tris-HCl, Etanol absoluto, NONIDET P 40, cloreto de
sódio, T.E., buffer, RNase, agarose, ácido acético, brometo de etídio, reagentes
adquiridos de outras marcas nacionais.
Todas as soluções foram preparadas com água ultrapura (Milli-Q Direct-Q 3
UV-R, Millipore - Billerica, MA, Estados Unidos), com sais de pureza analítica.
4.2 ANIMAIS
Para realização do estudo foram utilizados ratos da espécie Rattus
norvergicus linhagem Wistar, adultos, machos, pesando aproximadamente 250
gramas, advindos do biotério central da Universidade Federal de Santa Catarina –
UFSC. Os animais foram mantidos no biotério da Universidade do Oeste de Santa
Catarina/Campus Videira durante o período experimental, em caixas plásticas com 3
ratos em cada uma, de 47x34x18cm, forradas com maravalha. Os animais foram
40
mantidos em ambiente climatizado 22 ± 3ºC com ciclo de doze horas claro/escuro,
com alimentação e água fornecidas ad libitum. Os animais foram submetidos à
ambientalização por 30 dias antes do início dos experimentos. Ao final do
experimento foram anestesiados com éter para coletada de sangue via punção
ocular e eutanasiados para retirada do fígado. O estudo foi aprovado pelo Comitê de
Ética no Uso de Animais da Universidade do Oeste de Santa Catarina, parecer
CEUA no 004/2014 respeitando-se todas as regras e utilizando de meios para
garantir o estresse mínimo dos animais assegurando assim seu bem-estar durante o
período experimental.
4.3 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE AGUDA E TRATAMENTO
A lesão hepática aguda foi induzida pela administração de CCl4 (0,5ml/Kg de
peso em óleo de oliva, injetado intraperitonealmente (i.p) de acordo com o método
descrito por CARBONARI et al., 2006. Os ratos foram aleatoriamente divididos em
quatro grupos experimentais com seis animais cada grupo. O tratamento com
veículo (1% de DMSO (dimetilsulfóxido) em solução salina), ácido gálico (GA) ou
dodecilgalato (DGA) foi realizado através de gavagem oral conforme segue:
Grupo controle: tratado com veículo diariamente durante 7 dias;
Grupo CCl4 (tetracloreto de carbono): tratado com o veículo diariamente
durante 7 dias, seguido da administração i.p de CCl4 no sétimo dia, 30
minutos após a última administração do veículo;
Grupo GA: tratado com 100mg/Kg de GA diariamente durante 7 dias, seguido
da administração i.p de CCl4 no sétimo dia, 30 minutos após a última
administração de GA;
Grupo DGA: tratado com 100mg/Kg de DGA diariamente durante 7 dias,
seguido da administração i.p de CCl4 no sétimo dia, 30 minutos após a última
administração de DGA.
A dose de GA ou DGA foi escolhida com base em estudos prévios in vivo,
sendo a dose de 100mg/Kg escolhida, pois não mostrou alterações nas enzimas
hepáticas alanina aminotransferase (ALT) e aspartatoaminotransferase
(AST)(RASOOL et al., 2010;KARTKAYA et al., 2013).
Vinte e quatro horas após a administração i.p. de CCl4, o sangue foi coletado
para as análises dos marcadores séricos de função hepática. As amostras de
41
sangue foram centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos, o soro imediatamente
recolhido e armazenado a -20ºC até as análises. Após os animais foram
eutanasiados, a cavidade abdominal dos animais foi aberta, expondo o fígado, que
foi rapidamente incisado, lavado com solução de cloreto de sódio a 0,9%, seco
cuidadosamente em gaze estéril, pesado e em seguida, o lóbulo central foi retirado e
imediatamente fixado por imersão em solução de formalina a 10% tamponada com
tampão fosfato de sódio 100 Mm pH 7.4 para a avaliação histológica. O restante do
fígado foi processado para análise dos marcadores de dano oxidativo e ensaio das
enzimas antioxidantes.
Esquema 7 – Análises realizadas na indução do dano hepático agudo.
42
4.4 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE CRÔNICA E TRATAMENTO
A indução do dano hepático crônico foi realizado através da administração de
uma dose subletal de CCl4 i.p. aos animais durante 4 semanas de acordo com
método estabelecido por KHAN; KHAN; SAHREEN, 2012.Os ratos foram
aleatoriamente divididos em seis grupos experimentais com seis animais cada
grupo. O tratamento com veículo (1% de DMSO (dimetilsulfóxido) em solução
salina), ácido gálico (GA) ou dodecilgalato (DGA) foi realizado através de gavagem
oral (v.o) conforme segue:
Grupo Controle: recebeu somente o veículo (1ml/Kg v.o) e óleo de oliva
(3ml/Kg i.p) duas vezes por semana por 4 semanas;
Grupo CCl4: recebeu o veículo (1ml/Kg v.o) duas vezes por semana por 4
semanas 30 minutos antes da administração de CCl4 i.p. (30% em óleo de
oliva, 3ml/Kg) para indução do dano hepático crônico;
Grupo GA 50mg/Kg: recebeu uma dose de GA de 50mg/Kg v.o duas vezes
por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de CCl4i.p
(30% em óleo de oliva, 3ml/Kg);
Grupo GA 100mg/Kg: recebeu uma dose de GA de 100mg/Kg v.o duas
vezes por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de
CCl4i.p (30% em óleo de oliva, 3ml/Kg);
Grupo DGA 50mg/Kg: recebeu uma dose de DGA de 50mg/Kg v.o duas
vezes por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de
CCl4i.p (30% em óleo de oliva, 3ml/Kg);
Grupo DGA 100 mg/Kg: recebeu uma dose de DGA de 100 mg/Kg v.o duas
vezes por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de
CCl4i.p (30% em óleo de oliva, 3ml/Kg).
Vinte e quatro horas após o último tratamento, o sangue foi coletado para as
análises dos marcadores séricos de função hepática. As amostras de sangue foram
centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos, o soro imediatamente recolhido e
armazenado a -20ºC até as análises. Após os animais foram eutanaziados, a
cavidade abdominal dos animais foi aberta, expondo o fígado, que foi rapidamente
excisado, lavado com solução de cloreto de sódio a 0,9%, seco cuidadosamente em
gaze estéril, pesado e em seguida, o lóbulo central foi retirado e imediatamente
43
fixado por imersão em solução de formalina a 10% tamponada com tampão fosfato
de sódio 100 Mm pH 7.4 para a avaliação histológica. O restante do fígado foi
processado para análise dos marcadores de dano oxidativo, ensaio das enzimas
antioxidantes e do gene p53.
Esquema 8 – Análises realizadas na indução do dano hepático crônico.
4.5 PARÂMETROS AVALIADOS APÓS A INDUÇÃO DO DANO HEPÁTICO
4.5.1 Avaliação do Ganho de Peso (GP) dos Animais
Os animais submetidos à indução da toxicidade hepática crônica foram
pesados no início e término do tratamento e determinou-se então o ganho de peso
dos animais através da seguinte equação: GP= (Peso final - Peso inicial).
44
4.5.2 Peso Relativo (PR) do Fígado
O fígado dos animais submetidos ao tratamento crônico foi pesado após ser
submergido em solução cloreto de sódio 0,9% para retirada do excesso de sangue.
Em seguida, utilizou-se a gaze para retirada do excesso de liquido do órgão. O PR
do fígado, expresso por 100g de animal, foi calculado a partir da seguinte equação:
PR= (peso do fígado/peso corporal) x100).
4.5.3 Análises de Parâmetros Bioquímicos no Soro
4.5.3.1 Análise Laboratorial de Lipídios Sérico
As concentrações séricas de colesterol total (CT) e dos triglicerídeos (TG)
foram determinadas pelos métodos automatizados e colorimétricos (reação de
Trinder), utilizando-se kits reagentes da Labtest Diagnóstica S.A.®, conforme
especificações do fabricante (Labtest, Lagoa Santa-MG).
4.5.3.2 Análise de Biomarcadores Séricos de Dano Hepático
A função hepática foi avaliada por meio das determinações dos níveis séricos
de aspartatoaminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT), gama
glutamiltransferase (-GT) por método cinético e da concentração de albumina por
reação de ponto final. Em tais determinações, foram utilizados kits reagentes da
Labtest Diagnóstica S.A.®, conforme especificações do fabricante (Labtest, Lagoa
Santa-MG).
4.5.4 Marcadores de Estresse Oxidativo Hepático
4.5.4.1 Preparação dos homogenatos
Os homogenatos foram obtidos em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7.4
contendo 0,1% de Triton X-100 e 150mM de cloreto de sódio na proporção de 1:10
(p/v). A homogeneização foi mantida a 4oC, com cerca de 20 impactos em
homogeneizador, seguidos de centrifugação a 4ºC, em 10000 rpm durante 10
45
minutos. Os sobrenadantes foram mantidos a -20ºC até a sua utilização para a
dosagem da atividade da catalase, glutationa redutase, glutationa peroxidase e
glutationa-S-transferase através de espectrofotometria. A avaliação da
lipoperoxidação foi realizada em homogenato fresco, ou seja, logo após a sua
preparação, assim como a determinação da glutationa reduzida (GSH) através de
espectrofotometria.
4.5.4.2 Lipoperoxidação - Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
A avaliação da peroxidação lipídica no fígado foi realizada através da
detecção dos derivados dos produtos de oxidação, substâncias que reagem com o
ácido tiobarbitúrico, destacando-se o malondialdeído (MDA), conforme procedimento
descrito por BIRD; DRAPER, 1984. Alíquotas de 250µl de homogenato foram
misturadas com 1 ml de ácido tricloroacético 12%. Ácido tiobarbitúrico 1,0% (1ml),
recém-preparado, foi adicionado e a mistura foi incubada a100ºC, por 60 min. Após
resfriamento em água com gelo, centrifugados a 10000 rpm por 5 min. As
absorbâncias do sobrenadante foram lidas em 532 nm. Os resultados foram
expressos em µmol/mg de proteína.
4.5.4.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH)
Para determinação da mesma foi retirado 0,1 g de fígado, o qual foi
submetido à ação do ácido tricloroacético (TCA) a 12%. O TCA promove a
precipitação de proteínas deixando no sobrenadante o tripeptídeo glutationa, o qual
foi quantificado utilizando-se o ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico (DTNB) conforme
método descrito por TIETZE, 1969. Nesse método, os grupamentos sulfidrilas da
GSH interagem com o DTNB, originando a GSTNB (forma oxidada de GSH).
Concomitantemente à formação de GSTNB e GSH, há liberação de ácido 5-tio-2-
nitrobenzóico (TNB), um composto de coloração amarela. Sendo assim, a
intensidade de cor produzida pelo TNB é diretamente proporcional aos níveis de
GSH intracelular, a qual foi monitorada espectrofotometricamente em 412 nm. Os
resultados foram expressos em mmol/mg de proteína.
46
4.5.4.4 Medida da Atividade da Catalase
A atividade da catalase foi quantificada através do monitoramento da
decomposição do H2O2 durante 2 min em 240 nm (AEBI, 1984). O sistema de
reação continha tampão fosfato50 mM pH 7,0, H2O2 0,3 M e amostra (homogenato).
Uma unidade de catalase equivale à quantidade de enzima que hidrolisa 1 mol de
substrato por minuto e por miligrama de proteína. Os resultados foram expressos em
mmol/mg de proteína/minuto.
4.5.4.5 Medida da Atividade da Glutationa Peroxidase
A atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi avaliada pelo método de
FLOHÉ; GÜNZLER, 1984. O sistema de reação continha tampão fosfato 0,1M pH
7,0, ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) 0,005M, glutationa redutase (GR)
0,1U/ml, glutationa reduzida (GSH), t-butilhidroperóxido (t-BuOOH), NADPH e
amostra (homogenato). Neste ensaio a GPx presente na amostra dismuta o t-
BuOOH do ensaio, gerando para isso uma ponte dissulfeto entre duas GSH, que por
sua vez volta ao estado reduzido por ação da GR. A GR age mediante a oxidação
de NADPH, assim o ensaio é uma medida indireta que consiste em registrar a
diminuição de NADPH. Os resultados foram expressos em µmol/mg de
proteína/minuto.
4.5.4.6 Medida da Atividade da Glutationa Redutase
O método utilizado para análise da atividade desta enzima foi proposto por
CARLBERG; MANNERVIK, 1985, onde se verifica, durante 60 segundos, em 340
nm, a taxa de oxidação do NADPH devido à redução da GSSG pela GR presente na
amostra. O sistema de reação continha tampão fosfato 0,1M pH 7,0, ácido
dietilenotriaminopentaacético (DTPA) 0,005M, NADPH, glutationa oxidada (GSSG) e
amostra (homogenato). Os resultados foram expressos em µmol/mg de
proteína/minuto.
47
4.5.4.7 Medida da Atividade da Glutationa-S-transferase
A atividade da glutationa-s-transferase (GST), foi estimada pelo método de
HABIG; PABST; JAKOBY, 1974. O sistema de reação continha 0,5 M de tampão
fosfato (pH 6,5), 30 mM de 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB), 30 mM de GSH e
amostra (homogenato) a absorbância foi avaliada em 340 nm durante 60 segundos.
A atividade foi expressa em mmol/mg de proteína/minuto.
4.5.5 Dosagem de Proteínas
A dosagem de proteína no homogenato de fígado foi realizada pelo método
de LOWRY et al., 1951. O método baseia-se numa mistura contendo molibdato,
tungstato e ácido fosfórico (Folin-Ciocalteau), o qual na presença do catalisador
cobre (II) em meio alcalino, reage com proteínas sofrendo uma redução e
produzindo um composto com absorção máxima em 750nm. Na determinação da
concentração de proteína amostra (diluídas 1:4 (v/v) em água foi adicionada a um
meio contendo solução alcalina, carbonato de sódio, hidróxido de sódio, tartarato de
sódio e sulfato de cobre). Após um período de incubação de 10 minutos em
temperatura ambiente, foi adicionado o reagente de Folin previamente diluído e
incubado por mais 30 minutos. A leitura foi realizada em 750 nm e as concentrações
foram obtidas através de uma curva padrão utilizando albumina sérica bovina (BSA).
4.5.6 Preparo da Amostra para realização do ensaio da Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) e análise de transcrição do P53.
4.5.6.1 Extração de RNA
O RNA total da amostra de fígado foi extraído com de TRIZOL® (Invitrogen)
logo após sua retirada. Após incubação à temperatura ambiente (TA), às amostras
foi adicionado clorofórmio e as mesmas foram agitadas e incubadas por 3 minutos a
TA. As amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 12000 rpm (2-8ºC). A fase
aquosa foi coletada e transferida para um novo tubo onde adicionou-se mais álcool
isopropílico. Agitou-se, incubou-se por 10 minutos a TA e centrifugou-se por 10
minutos a 12000 rpm.O sobrenadante foi removido, o decantado foi lavado com
48
etanol 75% e posteriormente centrifugados por 5 minutos a 7500 rpm (2-8ºC). O
sobrenadante foi removido, o decantado foi seco a TA e o RNA foi dissolvido em 20
µL de água DEPC. O RNA extraído foi quantificado por leitura espectrofotométrica e
a pureza foi avaliada através da razão 260/280 e 260/230. Dois microgramas de
RNA foram tratados com DNAse 1 (Invitrogen) segundo protocolo do fabricante.
4.5.6.2 Síntese de cDNA
A síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada utilizando
o kit High-Capacityc DNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster City,
CA, EUA). Em um microtubo de 0,2 mL o volume de RNA correspondente à
concentração de 2 µg foi acrescido de 2 μl de iniciadores randômicos e água até o
volume final de 10 μl. A reação foi incubada a 65°C por 5 minutos. Em seguida, o
microtubo foi mantido em gelo e foram acrescentados 8μl da mistura da reação
contendo 2 μl de tampão 10X, 0,8 μl de 25X dNTP (100mM), 1,0 μl da enzima
transcriptase reversa MultiScribeTM, 0,4 μl de Inibidor de RNAse (RNAsin;Promega,
Madison, WI, EUA) e 3,8 ul de água. A reação foi incubada a 25°C por 10 minutos,
seguido por 37°C por 2 h e finalmente a 85°C por 5 minutos. Assim foi obtido um
volume final de 20 μl de cDNA armazenado a -20°C até sua utilização para as
reações de amplificação por reação em cadeia da polimerase quantitativo (qPCR).
Todas as incubações foram realizadas em termociclador Biocycler.
4.5.6.3 Curva de eficiência da reação de PCR
Visando determinar a eficiência da reação de PCR em tempo real,
uma curva foi feita com diferentes concentrações de cDNA (1/25, 1/125,
1/625, 1/3125) para os pares de oligonucleotídeos (tabela 1). A amplificação foi
realizada utilizando o Power SYBR-Green PCR MasterMix (AppliedBiosystems,
Foster City, CA, EUA), conforme recomendação do fabricante. A análise da
regressão linear dos valores de Cts em função do logarítmo da respectiva diluição
forneceu o coeficiente angular da reta (a, em y=ax+b) que foi utilizado para o cálculo
da eficiência da amplificação dos produtos.
49
Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR.
Gene Senso Antisenso Produto
p53 5´GTAAACGCTTCGAGATGTCC-3´ 5´-GACTGGCCCTTCTTGGTCT-3´ 123
GAPDH 5´-GTGTCCGTCGTGGATCTGAC-3 ´5´-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3´ 132
4.5.6.4 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR)
A análise da expressão gênica foi realizada através da quantificação relativa
de cada gene em relação a um gene de expressão constitutiva. Esta quantificação
foi possível de ser realizada já que todos os oligonucleotídeos apresentaram
eficiências semelhantes ao controle endógeno e próximas a 100%. A quantificação
relativa descreve mudanças de nível de expressão de um gene de interesse em uma
amostra teste, relacionando esses valores a uma amostra utilizada como calibrador.
Este calibrador pode, por exemplo, ser uma amostra que não recebeu o tratamento
em estudo. A partir destes critérios, pode-se utilizar o método comparativo 2–ΔΔCt
(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). A quantificação relativa permite uma acurada
comparação dos níveis de expressão de gene de interesse em uma amostra em
relação à outra amostra.
A expressão do gene p53 foi quantificada por meio do método de PCR
quantitativo (qPCR) utilizando GAPDH como controle endógeno e o kit Power SYBR-
GreenPCR Master Mix® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) conforme
indicações do fabricante. O ensaio de PCR em tempo real foi realizado em
termociclador ABI 7900HT (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA), nas seguintes
condições: 50°C por 2 m, 95 °C por 10 minutos, 40 ciclos de 15s a 95°C para
término do processo de desnaturação e por fim anelamento e elongação dos
oligonucleotídeos a 57°C por 1 minuto. Para todos os experimentos, o limiar de
amplificação (Ct) foi determinado automaticamente pelo software. Após o processo
de amplificação, as amostras foram submetidas acurva de dissociação dos
amplicons que representa a relação entre a temperatura e a quantidade de emissão
de fluorescência da reação de PCR. Acurva de dissociação permite verificar a
formação de dímeros de oligonucleotídeos, amplificações inespecíficas, possíveis
erros e contaminações.
50
4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Os tecidos de fígado foram processados por técnicas histopatológicas padrão
e seccionados em pedaços de 5-8 m de largura com um micrótono rotatório a
temperatura ambiente e fixados a uma solução de formalina a 10 % preparada em
tampão fosfato a pH neutro. As amostras foram então coradas com hematoxilina e
eosina (H & E) e observados pelo patologista em microscópio ótico de maneira
“cega” com magnificação de 400 X.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM).
Para a análise estatística, foram utilizados os programas GraphPadPrism 5. Foi
utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA), seguido do pós-teste de
Dunnett (fixando 1 grupo controle). As diferenças observadas durante a análise
foram consideradas estatisticamente significativas quando a probabilidade foi menor
que 0,05 (5%).
4.8 DESENHO EXPERIMENTAL
O efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecilgalato foi avaliado em ratos
intoxicados com CCl4 (Esquema 7 e 8). Os parâmetros avaliados incluíram a
variação do peso corporal, peso relativo do fígado, avaliação sérica da função
hepática, dosagens de lipídios plasmáticos, avaliação anatomopatológica, de
estresse oxidativo e investigação do gene p53.
51
5 RESULTADOS
Visto que o dano hepático causado pelo CCl4 está associado a presença de
EROs neste estudo verificamos a capacidade do ácido gálico e dodecilgalato,
importantes antioxidantes, em reverte ou prevenir o dano hepático agudo e a fibrose
hepática causada pelo CCl4 em ratos.
5.1 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO
AGUDO CAUSADO PELO CCL4
No modelo de dano agudo os animais receberam durante 7 dias uma dose de
100mg/Kg de ácido gálico ou dodecilgalato e no 7 dia, trinta minutos após a última
administração, uma dose única i.p de CCl4. Neste modelo observou-se que os
animais tratados com GA, DGA ou CCl4 não tiveram variação significativa no ganho
de peso (Gráfico 1A), no entanto, a administração de uma única dose de CCl4 foi
capaz de levar a um aumento de aproximadamente 40% no peso relativo do fígado,
o qual foi prevenido pelo pré tratamento com DGA 100mg/Kg (Gráfico 1B).
Gráfico 1 - Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso relativo do fígado em ratos intoxicados com CCl4.
Os animais foram tratados durante 7 dias com GA (ácido gálico) ou DGA (dodecilgalato) na dose de 100 mg/Kg e no 7º dia 30 minutos após a última dose de GA ou DGA receberam uma dose de CCl4. (A) Ganho de peso corporal em 7 dias de tratamento; (B) Peso relativo do fígado. Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.
52
A avaliação bioquímica do soro (Tabela 2), mostrou alterações significativas
nos valores de bilirrubina total, ALT, AST e -GT nos animais tratados com dose
única de CCl4, quando estes foram comparados com os animais controle (sem
tratamento). O pré-tratamento dos animais com GA ou DGA foi capaz de prevenir a
lesão aguda causando uma redução significativa nos marcadores de dano hepático
(Tabela 2). Os valores de triglicerídeos, colesterol total e albumina não mostraram
alterações significativas em relação ao grupo controle em nenhum dos tratamentos
realizados.
Tabela 2 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalatono dano hepático agudo induzido por CCl4.
Grupo TGmg/dl CTmg/dl Albumina g/dl
BTmg/dl ALT (U/L)
AST (U/L)
-GT (U/L)
Controle 59,7 ± 4,21
115 ± 15 2,88 ± 0,15
0,34 ± 0,021
48,7 ± 3,98
104 ± 2,32
37,5 ± 0,5
CCl4 78 ± 8,9 91,8 ± 6,06
2,70 ± 0,04
0,8 ± 0,045*
335,2 ±
28,5*
426,2 ± 72,4*
171,2 ± 19,5*
CCl4 + GA 100mg/Kg
86 ± 7,2 93,6 ± 6,43
2,83 ± 0,070
0,5 ± 0,056#
202,7 ± 65*#
289 ± 86,6*#
142 ±20*
CCl4+ DGA 100
mg/Kg
55,2 ± 8,3
84 ± 7,3 2,7 ± 0,11 0,58 ± 0,057#
195 ± 13,7*#
293 ± 46*#
47,2 ± 5,32#
GA (ácido gálico), DGA (dodecilgalato), TG (triglicerídeos), CT (colesterol total), BT (bilirrubina total),
AST (aspartatoaminotransferase), ALT (alanina aminotransferase), -GT (gama glutamiltransferase); *p< 0,05 diferença significativa em relação ao controle; # p<0,05 diferença significativa em relação ao CCl4.
No (Gráfico 2) pode-se verificar que o tratamento prévio com GA e DGA
100mg/Kg foi capaz de inibir a peroxidação lipídica causada no fígado de ratos
tratados com dose única de CCl4 e impedir a depleção na concentração de
glutationa hepática reduzida (GSH).
53
Gráfico 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA na indução da peroxidação lipídica e redução da concentração de glutationa hepática reduzida promovida pela administração de dose única de CCl4.
Os animais foram tratados durante 7 dias com GA (ácido gálico) ou DGA (dodecilgalato) na dose de 100 mg/Kg e no 7º dia 30 minutos após a última dose de GA ou DGA receberam uma dose de CCl4. (A) Concentração de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico); (B) Concentração de GSH (glutationa reduzida). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.
Os animais intoxicados com CCl4 e tratados com GA 100mg/Kg mostram um
aumento significativo na atividade da catalase (Gráfico 3A), enquanto os animais
tratados com DGA 100mg/Kg mostraram aumento significativo na atividade das
enzimas GR e GST (Gráfico 3B e C).
54
Gráfico 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas antioxidantes em ratos intoxicados com CCl4.
Os animais foram tratados durante 7 dias com GA (ácido gálico) ou DGA (dodecilgalato) na dose de 100 mg/Kg e no 7º dia 30 minutos após a última dose de GA ou DGA receberam uma dose de CCl4. (A) Atividade da catalase; (B) Atividade da GR (Glutationa redutase) ;(C) Atividade da GST (Glutationa-S-Transferase). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.
A análise histológica mostrou que todos os animais tratamentos com CCl4
apresentaram necrose de coagulação centro a médio lobular, circundada por
hepatócitos totalmente vacuolizados (Figura 2B). O grupo que recebeu tratamento
prévio com GA 100 mg/Kg mostrou necrose de coagulação centro médio lobular, no
entanto, com número variável de hepatócitos vacuolizados, sendo que um animal
apresentou necrose coagulativa individual (Figura 2C e D). Os animais que
receberam tratamento prévio com DGA 100 mg/Kg três apresentaram necrose de
coagulação individual com degeneração vacuolar difusa do citoplasma dos
hepatócitos; dois necrose coagulativa centro a médio lobular e outros dois além de
necrose coagulativa centro a médio lobular apresentaram vacuolização nos
hepatócitos (Figura 2 E e F).
55
Figura 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas hepáticas em ratos intoxicados com CCl4.
As alterações histológicas são mostradas capôs coloração com hematoxilia/eosina (H&E 40x). (A) Foto representativa do fígado do grupo controle; (B) Foto representativa do fígado do grupo tratado com CCl4 (0,5 ml/Kg em óleo de oliva); (C) e (D) Fotos representativas do grupo tratado com GA 100 mg/Kg 7 dias e co-tratados com CCl4 0,5 ml/Kg em óleo de oliva no 7º dia; (E) e (F)) Fotos representativas do grupo tratado com DGA 100 mg/Kg 7 dias e co-tratados com CCl4 0,5 ml/Kg em
óleo de oliva no 7º dia. necrose coagulativa; hepatócitos vacuolizados.
5.2 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO
CRÔNICO CAUSADO PELO CCL4
Neste modelo os animais foram tratados com CCl4 duas vezes por semana
durante 4 semanas, juntamente com GA ou DGA (50 ou 100mg/Kg). O (Gráfico 4A)
mostra que os animais que receberam CCl4 tiveram uma perda significativa de peso
quando comparados ao grupo controle, enquanto os animais tratados com CCl4
56
associado ao GA (50 e 100mg/Kg) ou DGA (50 e 100mg/Kg) mostraram um
aumento no peso corporal, embora menor do que o grupo controle.
Gráfico 4 – Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso relativo do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.
Os animais foram expostos ao CCl4duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg) (A) Ganho de peso corporal em 4 semanas de tratamento; (B) Peso relativo do fígado. Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.
O (Gráfico 4B) mostra que os animais tratados com CCl4 tiveram um aumento
significativo no peso relativo do fígado de aproximadamente 26% quando
comparados ao grupo controle, enquanto o tratamento com GA 50 e 100 mg/Kg e
DGA 50 mg/Kg foi capaz de inibir o aumento relativo deste órgão, no entanto, o
tratamento com DGA 100 mg/Kg não conseguiu impedir o efeito do CCl4 no aumento
do fígado.
A (Tabela 3) mostra os parâmetros séricos de lipídios, albumina, bilirrubina
total, transaminases (ALT e AST) e gama-glutamiltransferase (-GT) de animais com
fibrose hepática induzida por CCl4 e tratados com GA e DGA nas doses de 50 e 100
mg/Kg. O grupo tratado com CCl4 e que não recebeu nenhuma dose de GA ou DGA
mostrou alterações significativas nos valores de triglicerídeos, bilirrubina total (BT),
ALT, AST e -GT quando comparado ao grupo controle. Os animais que receberam
57
GA nas doses de 50 e 100 mg/Kg mostraram redução significativa nos valores das
transaminases (ALT e AST) e -GT quando comparados aos animais tratados
somente com CCl4, embora os valores de BT nos animais tratados com GA 100
mg/Kg mostrem alterações significativas em relação ao grupo controle. O tratamento
com DGA 50 mg/Kg parece ter sido mais efetivo do que o tratamento com a dose de
100 mg/Kg, visto que os valores de triglicerídeos, BT, ALT, AST e -GT mostram
reduções significativas quando comparado ao grupo tratado somente com CCl4,
chegando a valores séricos destes parâmetros comparáveis ao grupo controle.
Tabela 3 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato nos parâmetros séricos de ratos com fibrose hepática induzida pelo tratamento crônico com CCl4.
Grupo TG mg/dl
CT mg/dl
Albumina g/dl
BT mg/dl ALT (U/L)
AST (U/L) -GT (U/L)
Controle 66 ± 1,88
90,5 ± 3,92
2,86 ± 0,056
0,31 ± 0,029
57,6 ± 3,88
113 ± 2,3 52 ± 5,46
CCl4 101 ± 7,7*
75,5 ± 5,23
2,75 ± 0,13 0,99 ± 0,11*
324 ± 30*
445,2 ± 16*
161,8 ±25*
CCl4 + GA
50mg/Kg
92 ± 9,4
84,8 ± 5,6
2,95 ± 0,12 0,51 ± 0,081#
138,2 ± 25*#
147,2 ± 44#
99,2 ± 20,2#
CCl4+ GA 100
mg/Kg
91 ± 11
81,5 ± 9,7
2,87 ± 0,102
0,87 ± 0,15*
82,5 ±12,4#
61,7 ± 3,52#
95,2 ± 11,65#
CCl4 + DGA
50mg/Kg
48 ± 2,31#
84,5 ± 7,19
2,93 ± 0,025
0,48 ± 0,058#
99 ± 13,4#
97,7 ± 13,5#
164,7 ± 13*
CCl4+ DGA 100
mg/Kg
107 ± 16*
105 ±4,91
2,71 ± 0,22 1,02 ± 0,13*
154,7 ± 65*#
175,2 ± 13,9#
161 ± 5,26*
GA (ácido gálico), DGA (dodecilgalato), TG (triglicerídeos), CT (colesterol total), BT (bilirrubina total),
AST (aspartatoaminotransferase), ALT (alanina aminotransferase), -GT (gama glutamiltransferase); *p< 0,05 diferença significativa em relação ao controle; # p<0,05 diferença significativa em relação ao CCl4.
O (Gráfico 5) mostra que o tratamento com CCl4 durante 4 semanas foi capaz
de depletar os níveis hepáticos de GSH e induzir um significativo aumento da
peroxidação lipídica, efeito este revertido pelo tratamento com GA e DGA nas doses
de 50 e 100 mg/Kg.
58
Gráfico 5 – Efeito do tratamento com GA e DGA na peroxidação lipídica (TBARS) e concentração de glutationa reduzida hepática em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.
Os animais foram expostos ao CCl4duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg) (A) Concentração de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; (B) Concentração de GSH (glutationa reduzida). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.
O (Gráfico 6) mostra o efeito do tratamento com GA e DGA 50 ou 100 mg/Kg
na atividade das enzimas antioxidantes de ratos com fibrose hepática induzida por
CCl4. Observa-se neste gráfico que com exceção ao tratamento com GA 50 mg/Kg
na atividade da GR (Gráfico 6C) todos os tratamentos incluindo o tratamento com
CCl4 induziram redução significativa na atividade das enzimas antioxidantes quando
comparados ao grupo controle.
59
Gráfico 6 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas antioxidantes em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.
Os animais foram expostos ao CCl4duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg) (A) Atividade da catalase; (B) Atividade da GPx (Glutationa peroxidase); (C) Atividade da GR (Glutationa redutase); (D) Atividade da GST (Glutationa-S-transferase). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.
A (Figura 3) mostra a análise histológica do fígado dos animais expostos ao
CCl4 e tratados com GA e DGA nas doses de 50 e 100 mg/Kg duas vezes por
semana durante 4 semanas. Observou-se formação de acentuada fibrose hepática;
degeneração gordurosa e hiperplasia de ductos biliares moderada, além de discreta
megalocitose e necrose no fígado dos animais que receberam somente CCl4 (Figura
3B). No grupo tratado com GA 50 e 100 mg/Kg foi observado em ambas as doses
uma discreta fibrose, hiperplasia de ductos biliares e megalocitose, no entanto, foi
possível observar com maior frequência a incidência de mitose no tratamento com
GA 50 mg/Kg e leve degeneração gordurosa em ambos os tratamentos (Figura 3 C
e D respectivamente). O tratamento com DGA na dose de 50 e 100 mg/Kg mostrou
discreta fibrose e hiperplasia de ductos biliares, com presença de degeneração
gordurosa e mitose moderada, sem observar-se nestes grupos a presença de
megalocitose (Figura 3 E e F respectivamente).
60
Figura 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas hepáticas em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.
Os animais foram expostos ao CCl4 duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg). As alterações histológicas são mostradas após coloração com hematoxilia/eosina (H&E 40x). (A) Foto representativa do fígado do grupo controle (sem alterações); (B) Foto representativa do fígado do grupo tratado com CCl4; (C) Foto representativa do fígado do grupo tratado com GA 50 mg/Kg; (D) Foto representativa do fígado do grupo tratado com GA 100 mg/Kg; (E) Foto representativa do fígado do grupo tratado com DGA 50 mg/Kg; (F) Foto representativa do fígado do grupo tratado com DGA
100 mg/Kg. fibrose hepática; megalocitose; mitose.
O (Gráfico 7) mostra que o tratamento com GA e DGA nas doses de 50 e 100
mg/Kg foi capaz de promover um aumento significativo na expressão do gene p53
quando comparado aos grupos controle e tratado com CCl4.
61
Gráfico 7 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato na expressão do gene p53 em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.
Os animais foram expostos ao CCl4 duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (50 ou 100mg/Kg) ou com DGA (50 ou 100mg/Kg). A avaliação da expressão gênica foi realizada por PCR quantitativo em tempo real utilizando GAPDH como controle endógeno. Cada barra representa a Média ± EPM (n=6). Os dados foram expressos em relação ao controle animais sem tratamento considerado como 100%. Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.
62
6 DISCUSSÃO
O fígado regula importantes funções metabólicas do organismo, sendo assim,
injurias hepática estão associadas com alterações metabólicas resultando em sérios
problemas de saúde. Entre os principais fatores que podem desencadear doenças
hepáticas encontram-se drogas como o álcool, infecções virais e produtos químicos
como o tetracloreto de carbono. Neste contexto o tetracloreto de carbono (CCl4) é
amplamente utilizado como modelo animal de injuria hepática na busca de
compostos com atividade contra toxinas hepáticas.
Estudos mostram claramente que a clivagem da ligação carbono-cloro (C-Cl)
na molécula de tetracloreto de carbono leva a formação do radical triclorometil
peroxido (CCl3.O2-), o qual está envolvido na patogênese da injúria hepática Slater;
Cheeseman; Ingold, (1985). A hepatotoxicidade causada pelo CCl4 é caracterizada
por vários graus de degeneração do hepatócito e morte celular, os quais resultam da
formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), incluindo o radical hidroxil e
superóxido que são conhecidos pela capacidade de promover a fibrose hepática Wu;
Danielsson; Zern, (1999); Na et al., (2015).
Dinçer et al.,(2002) e Miyazaki et al., (2005), mostram que a administração de
uma única dose de CCl4 em ratos induz um dano hepático agudo sem causar
fibrose, enquanto a administração de doses repetidas por um período de no mínimo
quatro semanas pode levar ao desenvolvimento de fibrose hepática. Nossos
resultados mostram claramente que a administração de CCl4 foi capaz de promover
injúria hepática com alterações nos valores séricos das transaminases (ALT e AST)
e -GT e bilirrubina total (Tabelas 2 e 3) e que estas alterações estão relacionadas a
capacidade do CCl4 induzir um estresse oxidativo evidenciado pelos resultados de
TBARS e GSH (Gráfico 2 e 5).
Um dos mais sensíveis marcadores de injúria hepática é a liberação das
enzimas transaminases (ALT e AST), -GT e BT na circulação. O aumento destes
marcadores hepáticos séricos indicam uma perda da integridade da membrana
celular do fígado, o que pode estar diretamente relacionado com o aumento das
EROs induzido pelo tratamento com CCl4 Cequera, (2014); Al-rasheed et. al., (2015).
Sendo assim, o uso de substâncias antioxidantes pode auxiliar no tratamento de
doenças hepáticas associadas ao excesso de produção de EROs.
63
Neste contexto vários estudos vêm sendo realizados com extrato de plantas
ou com substâncias antioxidantes isoladas na tentativa de encontrar um tratamento
efetivo para as doenças hepáticas associadas ao dano oxidativo, em especial a
fibrose hepática.
Estudo realizado por Khan; Khan; Sahreen, (2012) utilizando a rutina no
tratamento da hepatotoxicidade induzida por CCl4 mostrou resultados similares aos
nossos, com redução significativa nos valores das enzimas séricas ALT, AST e -
GT, da lipoperoxidação hepática evidenciada pelos valores de TBARS e um
aumento de GSH no fígado dos animais tratados com rutina nas doses de 50 e 70
mg/Kg. Tirkey et al.,(2005), utilizou como tratamento a hesperidina nas doses de 100
e 200 mg/Kg evidenciando resultados semelhantes em relação as enzimas séricas e
valores de TBARS e GSH. Estes resultados evidenciam que o uso de substâncias
antioxidantes pode auxiliar no tratamento do dano hepático agudo ou em casos de
fibrose visto que, a maioria dos danos hepáticos induzidos por drogas ou toxinas
está associado ao aumento nos níveis de EROs.
O tratamento com CCl4 em ambos os modelos mostrou redução significativa
na atividade das enzimas antioxidantes CAT, SOD, GPx, GR e GST (Gráfico 3 e 6).
Estes resultados colaboram com os encontrados por outros autores que
evidenciaram tanto na indução do dano hepático agudo quanto da fibrose hepática
uma redução expressiva na atividade das enzimas antioxidantes hepáticas (Ferreira
et al., (2010); Wang et al., (2014). No entanto, Al-rasheed et al., (2015) verificou que
o tratamento com CCl4 é capaz de promover um aumento na atividade da GR do
tecido hepático após 8 semanas de tratamento, fato este não observado em nosso
estudo com 4 semanas de tratamento.
Embora ocorra uma redução expressiva na atividade das enzimas
antioxidantes, o que possivelmente resulte no dano hepático, principalmente a
promoção da fibrose após exposição ao CCl4, vários trabalhos mostram que o
tratamento com substâncias antioxidantes são capazes de reverter este quadro
(Dinçer et al., (2002); Khan; Khan; Sahreen, (2012);Al-sayed et al., (2014); El-sayed
et al., (2015). Nossos resultados são semelhantes a estes estudos com
antioxidantes, o GA e DGA impedem a lipoperoxidação e redução de GSH
provocada pelo CCl4 (Gráfico 2 e 6), no entanto, somente no modelo de dano agudo
nas doses de 100 mg/Kg são capazes de aumentar a atividade da CAT, GR e GST
significativamente em comparação ao tratamento com CCl4 (Gráfico 3). No modelo
64
de fibrose hepática ambos os tratamentos 50 mg/Kg e 100 mg/Kg foram incapazes
de reverter o efeito que o tratamento com CCl4 provocado na atividade das enzimas
CAT, GPx, GR e GST (Gráfico 6).
Conforme se pode verificar no (Gráfico 5) com exceção ao tratamento com
GA 50 mg/Kg que aumentou a atividade da GR, todos os demais tratamentos não
foram capazes de reverter o efeito do CCl4. O aumento na atividade da GR induzido
pelo GA 50 mg/Kg pode melhorar o status antioxidante evitando um dano hepático
mais expressivo, isto é evidenciado pelos resultados da análise histopatológica
(Figura 3 C). A GR apresenta efeito antioxidante visto que esta atua no ciclo de
redução da GSSG (Glutationa oxidada). O aumento de EROs leva um consumo de
GSH para rápida eliminação destas espécies reativas resultando na formação de
GSSG, a qual pode ser rapidamente convertida em GSH (glutationa reduzida) pela
atividade da GR Czeczot et al., (2006).
Neste estudo em ambos os modelos testados verificamos que o peroxidade
lipídica foi significativamente aumentada no tecido hepático dos animais expostos ao
CCl4 indicando a oxidação de lipídios que resulta na injuria do tecido. O conteúdo de
GSH constitui a primeira linha de defesa contra as EROs. A redução de GSH
observada com o tratamento com CCl4 está provavelmente relacionada a diminuição
na síntese deste tripeptideo provocada pela doença hepática ou pode estar
associada ao seu rápido consumo para eliminação das EROs no fígado fibrótico, Al-
rasheed et al., (2015).
A SOD (superóxido dismutase) é uma enzima de defesa extremamente
importante que converte o aníon superóxido em peróxido de hidrogênio, o qual pode
ser degradado pela atividade da CAT ou da GPx que além do peróxido de
hidrogênio metaboliza outros hidroperóxidos a produtos não tóxicos bloqueando a
reação em cadeia de formação de lipoperóxidos e consequentemente o dano da
membrana celular, Al-rasheed et al., (2015).
Além destas enzimas antioxidantes a GST apresenta papel fundamental na
detoxificação de xenobióticos principalmente no tecido hepático. Devido ao seu
papel na biotransformação, a GST é considerada um potente antioxidante que
apresenta elevada capacidade de proteção contra o estresse oxidativo. No presente
estudo observamos uma redução significativa nos valores de GST do grupo tratado
com CCl4, o qual foi revertido pelo tratamento prévio com GA ou DGA 100 mg/Kg, no
65
entanto, no modelo de fibrose não observamos a reversão do efeito de CCl4 (Gráfico
3 e 6).
Em estudo realizado por Vijaya Padma et al., (2011) a administração de GA
50 mg/Kg associado ao lindano durante 30 dias, foi capaz de reverter o efeito tóxico
do lindano aumentando significativamente os valores de GST quando comparado ao
grupo tratado somente com lindano 100 mg/Kg, os autores sugerem que isto pode
ter acontecido devido ao alto poder antioxidante do GA. Apesar de termos utilizado
as doses de 50 e 100 mg/Kg não observamos este efeito, no entanto, visto que o GA
e DGA apresentam grupos hidroxila fenólicos, os quais são eficazes para atividade
antioxidante da molécula a eliminação das EROs pode ter ocorrido diretamente pela
ação do GA e DGA sem alterar a atividade da GST e das outras enzimas
antioxidantes especialmente no modelo de fibrose onde observamos uma redução
expressiva nos valores de CAT, GPx, GR e GST.
A redução na atividade das enzimas antioxidantes pode ter ocorrido, visto que
a presença de substâncias antioxidantes (GA e DGA) pode suprimir a produção de
EROs resultando na diminuição da atividade destas enzimas, Kim et al., (2013)
mostrou resultados semelhantes quando os animais foram submetidos ao
tratamento com extrato de fruta rico em compostos fenólicos, neste estudo os
autores verificaram uma redução na atividade da SOD.
Estudos recentes com antioxidantes mostram que o efeito hepatoprotetor
destes compostos está associado a capacidade de aumentar a concentração
hepática de GSH e a atividade das enzimas antioxidantes principalmente CAT e
SOD Al-olayan et al., (2014); Al-sayed et al., (2014); li, (2015); Liang et al., (2015);
Vladimir-knežević et al., (2015), resultados estes não observados neste estudo, visto
que o tratamento com GA e DGA no modelo de fibrose não foi capaz de reverter o
efeito do CCl4 na atividade das enzimas antioxidantes CAT, GPx, GR e GST. No
entanto, o tratamento foi efetivo na redução do dano hepático promovido pelo CCl4.
O efeito hepatoprotetor do GA e DGA, portanto, pode não estar associado a
capacidade antioxidante mas sim ao aumento na expressão do gene p53, resultado
do aumento de cálcio intracelular, visto que alguns trabalhos mostram que o cálcio
modula a expressão de p53. Chang et al., (2015); Van Ginkel et al., (2015).
Sabe-se que o p53 está envolvido em várias funções biológicas, incluindo a
parada do ciclo celular, senescência celular e apoptose. É por isso que é chamado
de o guardião celular Lane, (1992). Mesmo assim, como p53 determina o destino
66
das células continua a ser uma questão importante. Muitos estudos tem relatado
ligações entre p53 e EROs, Ahmed et al., (2014); Hussain et al., (2004); Kang et al.,
(2012); Vurusaner; Poli; Basaga, (2012). Um aumento celular de EROs favorece a
expressão do p53 que induz a transcrição de genes pró-oxidantes contribuindo
assim, para a morte celular. No entanto, outros trabalhos relatam que o p53 está
associado à expressão de genes antioxidantes tais como o da GPx e SOD,
mostrando que o p53 também tem função protetora e participa no sistema de defesa
antioxidante. Sendo assim o p53 pode apresentar um efeito tanto pró-oxidante como
antioxidante e o que determina isso é a quantidade de EROs presente na célula Tan
et al., (1999).
No presente estudo observamos um aumento significativo na expressão do
gene p53 nos grupos tratados com GA ou DGA associado ao CCl4, sendo este
aumento mais expressivo nas doses menores de 50 mg/Kg (Gráfico 7). Associado
ao aumento do gene p53 observamos uma redução significativa na atividade das
enzimas antioxidantes CAT, GPx e GST e um aumento no conteúdo hepático de
GSH nos grupos de fibrose. No entanto, na indução de dano agudo não observamos
estas alterações. Estes resultados podem ser explicados pelo conteúdo de EROs
gerado durante cada tratamento, visto que quanto maior o conteúdo de EROs maior
será a expressão do p53 e menor a expressão de genes antioxidantes relacionados
a transcrição das enzimas SOD, GPx e CAT Ahmed et al., (2014); Hussain et al.,
(2004); Rhee et al., (2013); Vurusaner; Poli; Basaga, (2012).
Estudos realizados por Hussain et al., (2004); Kodydková et al., (2014); Rhee
et al., (2013); Sablina et al., (2005), mostram que o efeito pró-oxidante ou
antioxidante do gene p53 está diretamente relacionado com seus níveis
intracelulares. Uma supressão no gene p53 associado ao aumento no conteúdo
celular de EROs, apresenta um efeito pró-oxidante aumentando a expressão de
proteínas como a Bax favorecendo o processo de apoptose. Níveis basais normais
de p53 associado à presença de EROs favorece a expressão das enzimas
antioxidantes, entretanto, alta expressão do gene p53 associado ao excesso de
EROs favorece o efeito pró-oxidante inibindo a expressão das enzimas SOD e GPx,
mas em contrapartida aumenta o conteúdo celular de GSH protegendo a célula da
peroxidação lipídica.
Nossos resultados são, portanto, condizentes com os estudos apresentados
por Hussain et al., (2004); Rhee et al., (2013); Sablina et al.,(2005), pois observamos
67
um aumento expressivo do gene p53 com redução na atividade das enzimas
antioxidantes GPx, GST e CAT e um aumento significativo no conteúdo hepático de
GSH. Diante disso, podemos supor que o efeito hepatoprotetor do GA e DGA está
relacionado com o aumento do gene p53, o qual pode levar a apoptose seletiva
induzida pelo GA e DGA, visto que a análise histopatológica mostra morte celular
associada a um aumento na mitose nos grupos tratados com GA e DGA.
O efeito seletivo do GA e DGA na morte celular em nosso estudo é
condizente com os resultados apresentados por Chang et al., (2015) o qual relata
que o tratamento com GA de células hepáticas estreladas ativadas induz a morte
das mesmas, entretanto quando hepatócitos normais são tratados com GA a
viabilidade é cerca de 10 vezes maior, este efeito pode estar associado a menor
atividade do sistema antioxidante nas células estreladas, visto que os autores
sugerem que o GA exerce um efeito pró-oxidante aumentando a quantidade de
EROs.
Van Ginkel et al., (2015) mostra que produtos antioxidantes naturais como o
resveratrol e a quercetina exercem um efeito pró-oxidante em células tumorais,
efeito este não observado em células não alteradas. O aumento de EROs iduzido
pelos antioxidantes naturais em células tumorais leva a uma liberação de cálcio do
reticulo endoplasmático resultando no acúmulo de cálcio na mitocôndria e
consequentemente um desequilíbrio no potencial de membrana o que provoca a
apertura do poro mitocondrial e liberação do citocromo c resultando em apoptose.
Os mesmos autores também mostram que o aumento de cálcio intracelular modula a
expressão do gene 53 o que pode induzir tanto a parar no crescimento celular
quanto a apoptose.
Sendo assim, a partir dos resultados obtidos neste estudo pode-se dizer que
o GA e DGA parecem exercer um efeito antioxidante quando administrado por
períodos curtos (7 dias) aumentando a atividade das enzimas antioxidantes
reduzindo assim o estresse agudo induzido pelo CCl4. Quando administrado por um
período de 4 semanas parecer exercer um efeito pró-oxidante o que induz um
aumento na expressão do gene p53 resultando na diminuição da atividade das
enzimas antioxidantes.
68
7 CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho nos permitem concluir que:
A indução de dano hepático promovida pelo tratamento com CCl4 está
diretamente associada a presença de espécies reativas geradas durante a
sua biotransformação, sendo que o tratamento com doses repetidas durante 4
semanas pode induzir a fibrose hepática evidenciada pelas alterações nos
parâmetros bioquímicos séricos e na análise histopatológica;
O tratamento prévio com GA e DGA na dose de 100 mg/Kg foi capaz de
prevenir o dano hepático agudo promovido pelo CCl4, sendo este efeito
associado ao poder antioxidante destes compostos;
O tratamento dos animais com GA e DGA no modelo de fibrose hepática
permite-nos inferir que estes compostos são capazes de inibir o dano
hepático promovido pelo CCl4 evidenciado pelos parâmetros bioquímicos
séricos e pela análise histológica. No entanto, esta atividade não está
relacionada necessariamente ao potencial antioxidante destes compostos,
visto que observamos uma redução na atividade das enzimas antioxidantes
CAT, GPx e GST. Este efeito, no entanto, pode ter relação com o aumento na
expressão do gene p53 que foi evidenciado com o tratamento com GA e DGA
neste modelo. No entanto, mais estudos moleculares são necessários para
comprovar o potencial do GA e DGA no tratamento do dano hepático em
especial os quadros de fibrose.
O Esquema 9 pode resumir de maneira mais clara as conclusões obtidas a
partir dos resultados encontrados neste estudo e relacionados a estudos
prévios realizados por outros autores utilizando modelos de cultura celular.
69
Esquema 9 – Possível mecanismo do efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecil galato em modelo de fibrose hepática induzida pelo tetracloreto de carbono.
70
8 PERSPECTIVAS FUTURAS
A partir dos resultados obtidos e estudos prévios realizados por outros
autores pretende-se continuar investigando o mecanismo de hepatoproteção
do ácido gálico e dodecil galato visto que observamos que o efeito protetor
não está ligado ao efeito antioxidante, mas sim ao seu potencial pró-oxidante.
Sendo assim, pretende-se verificar se o aumento na expressão do gene p53
está relacionado com a capacidade do GA e DGA aumentar os níveis
hepáticos de EROS em especial nas células lesadas ou isso ocorre pelo
aumento nas concentrações intracelulares de Ca2+ como relatado em outros
estudos;
Pretende-se também verificar se a diminuição na atividade das enzimas CAT,
GPx, GR e GST no modelo de fibrose hepática está associado ao aumento do
p53 ou ao aumento de EROs promovido pelo GA e DGA;
Outras perspectivas são verificar o efeito do GA e DGA no modelo de fibrose
na expressão das proteínas p53, Bcl2, BclX, Bax, Bad e Bak, citocromo c,
assim como o potencial de membrana mitocondrial.
71
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