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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE BIOATIVIDADE IN VITRO
E IN VIVO DE
Raulinoa echinata
ROSANGELA WESTERLON
Itajaí- 2006
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE EDUAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE
BIOATIVIDADE IN VITRO E IN VIVO DE
Raulinoa echinata
Dissertação submetida
à Universidade do Vale do Itajaí
como parte dos requisitos para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
ROSANGELA WESTERLON
Itajaí, junho de 2006
ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE BIOATIVIDADE
IN VITRO E IN VIVO DE
Raulinoa echinata
Rosangela Westerlon
“Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, e aprovada em forma final pelo programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas de Universidade do Vale do Itajai”
_________________________________
Maique Weber Biavatti, Profa. Dra em Química Orgânica- UFSCAR
Orientadora
___________________________________
Tânia Maria Bellé Bresolin, Profa. Dra. Em Bioquímica- UFPR
Coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentando a Banca Examinadora composta pelos professores:
_____________________________________
Maique Weber Biavatti (UNIVALI)
Presidente
____________________________________
Ângela Malheiros (UNIVALI)
Membro
_____________________________________
Moacir Geraldo Pizzolatti (UFSC)
Membro
Itajaí (SC), junho de 2006.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Alzira e João (in memoriam) minha gratidão por todo o amor,
ensinamentos, esforços e compreensão incondicionais.
Mãe, obrigada por sempre acreditar em mim e por tanto ter me ajudado em
momentos tão difíceis de minha vida.
Pai, sinto muitas saudades, seu amor me faz falta. Sei que onde estiver
continuará torcendo por mim.
AGRADECIMENTOS
Meu especial agradecimento à minha orientadora e amiga Maique pela excelente
orientação, pela imensa paciência e constante incentivo durante tantos momentos
que pensei que não iria conseguir, por sua compreensão devido à minha limitação
de tempo disponível.
À Profª Márcia, que tanto contribuiu com a parte farmacológica. Seu conhecimento e
auxílio foram fundamentais.
Ao meu namorado José pelos momentos agradáveis e por sua companhia que
serviram como estímulo na fase de conclusão deste trabalho.
Às amigas Cristina Wöhlke e Sheila meu muito obrigada por tanto me ouvirem, me
incentivarem, me entenderem. Cada uma à sua maneira e ao seu tempo
contribuíram para o fim deste trabalho.
Às colegas Juliana Ardenghi, Juliana Pretto, Cristine Bordini por tantos momentos
legais compartilhados durante o curso. Juli, obrigada pelos experimentos
microbiológicos.
A todos os docentes do programa que contribuíram para meu aprendizado.
Ao Prof. Antônio G. Ferreira (UFSCar) responsável pelos equipamentos de RMN
utilizados neste trabalho, à Luciana Vizzoto pela obtenção dos espectros.
Ao professor Paulo Cezar Vieira (UFSCar) pelo valioso apoio e discussão
espectroscópica.
Ao professor Javier Ellena (IFSC-USP- São Carlos) pelos espectros de difração de
raios-X.
À Fernanda Penaflor (UNESP-Rio Claro) pelos testes com as formigas.
E a todos aqueles que contribuíram de forma direta ou indireta para conclusão deste
trabalho.
ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE BIOATIVIDADE
IN VITRO E IN VIVO DE Raulinoa echinata
Rosangela Westerlon
Junho/2006.
Orientadora: Maique Weber Biavatti, Drª em Química Orgânica Área de concentração: Fitoquímica Número de Páginas: 87
No presente trabalho investigou-se fitoquimicamente a fração metanólica dos galhos e os extratos, hexano e metanol, das raízes de R. echinata. No processo fitoquímico, tanto para separação e purificação, quanto para identificação e elucidação de compostos isolados recorreu-se a técnicas fitoquímicas tradicionais de isolamento e caracterização espectroscópica (CCD, CCD comparativa, CC, RMN1 H, RMN 13C e espectometria de massas). Dos galhos isolou-se os triterpenos em mistura isomultiflorenol/isobaurenol, os alcalóides furoquinolínicos maculina e flindersiamina e o alcalóide alquil-quinolínico, 2-n-nonil- 4 quinolona e o ácido limonéxico, um limonóide. Das raízes três limonóides degradados foram isolados, fraxinelona, fraxinelonona e epóxifraxinelona. Os dois primeiros são inéditos nesta espécie. Já o último, epóxifraxinelona, não estava definida sua conformação absoluta, mas desta vez, por se obter um monocristal, foi possível definir por difração de raios-X. Durante todo o experimento fitoquímico houve biomonitoramento com Artemia salina, porém todas as frações, sub-frações e compostos isolados testados apresentaram-se inativos, o que também pode ser interessante sob o aspecto de citoxicidade. No screening antimicrobiano as frações e subfrações testadas contra bactérias gram-positivas e gram-negativas e contra o fungo Cândida albicans, não inibiram os microorganismos nas concentrações testadas. A Concentração Inibitória Mínima foi >1000 µg/mL. No ensaio para avaliação de atividade inseticida sobre formigas cortadeiras Atta sexdens rubropilosa, o limonóide ácido limonéxico inibiu significativamente a longevidade da formigas (11 dias), quando comparado com o controle (22 dias). A propriedade antinociceptiva do ácido limonéxico (10, 30 e 60 mg/Kg i.p.) também foi testada. Em modelos de dor induzida quimicamente com: ácido acético (0,6 %), formalina (2,5 %), capsaicina (1,6 µg/pata) e glutamato (30 mmol/pata) obsevou-se inibição no processo doloroso de forma significativa, com DI50s (dose que inibe 50 % do efeito nociceptivo) calculadas em mg/Kg respectivamente de 21,74 (11,91- 39,69), 13,66 ( 9,35- 19, 61) (segunda fase), 11,67 (8,51- 16,0) e (36,51- 60,95). Conclui-se portanto que as substâncias inéditas isoladas foram fraxinelona e fraxinelonona e que a conformação absoluta do epóxifraxinelona foi definida .e ainda que ácido limonéxico mostrou resultado promissor Palavras Chave: Raulinoa echinata, bioatividade, limonóides, limonóides degradados
PHYTOCHEMICAL ANALYSIS, EVALUATIONS OF IN VITRO
AND IN VIVO BIOACTIVITY OF Raulinoa echinata
Rosangela Westerlon
June/2006.
Supervisor: Maique Weber Biavatti, PhD in Organic Chemistry Area of Activity : Phytochemistry Number of Pages: 87
In this work, methanol extract of stems, and hexane and methanol extracts of roots of R. echinata, were investigated using traditional phytochemical techniques. In the phytochemical process, both for isolation and purification, traditional techniques of phytochemical isolation and spectroscopic characterization were used (TLC, comparative TLC, CC, 1H and 13C NMR, MS). From the stems, the triterpenes isomultiflorenol/isobaurenol, the furoquinoline alkaloids maculine and flindersiamine, the alkylquinoline 2-n-nonil- 4 quinolone, and the limonoid limonexic acid were isolated. From the roots, three degraded limonoids were isolated: fraxinellone, fraxinellonone and epoxyfraxinellone. The former two are isolated here for the first time in this species. The latter was monocristalysed and the absolute configuration was established by X-ray diffraction. Biomonitoring with Artemia salina was carried out throughout the experiment, however all its isolated fractions, sub-fractions and test compounds were inactive, which could be relevant in relation to cytotoxicity. The antimicrobian screening, fraction and subfractions tested against gram-positive and gram-negative bacteria and the fungus Cândida albicans were inactive. The MIC was >1000 µg/mL. In the study carried out to evaluate the insecticide activity against the leaf-cutter ants Atta sexdens rubropilosa, the limonoid limonexic acid significantly inhibited the longevity of the ants (11 days), compared with the control group (22 days). The antinociceptive activity of limonexic acid (10, 30 and 60 mg/Kg i.p.) was also tested. In models of chemically induced pain: in the acetic acid model (0.6 %), formalin (2.5 %), capsaicin (1.6 µg/pata) and glutamate (30 mmol/paw), significant inhibition of pain was observed, with DI50S values of 21.74 (11.91- 39.69), 13.66 (9.35- 19, 61) (second phase), 11.67 (8.51- 16.0) and (36.51- 60.95), respectively. It is therefore concluded that the new substances isolated were fraxinellone and fraxinellonone, that the absolute configuration of epoxyfraxinellone was established, and that limonexic acid showed a promising result. Key Words: Raulinoa echinata, bioactivity, limonoids, degraded limonoids
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………………….10
LISTA DE TABELAS .................................................................................................12
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS……………………………………………..13
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................15
2 OBJETIVOS............................................................................................................17
2.1 OBJETIVO GERAL..............................................................................................17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................18
3.1 Aspectos Gerais sobre Plantas............................................................................18
3.2 Raulinoa echinata Cowan....................................................................................21
3.3 Limonóides...........................................................................................................28
3.4 Alcalóides.............................................................................................................30
4. MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................32
4.1 Material botânico..................................................................................................32
4.2 Fracionamento fitoquímico...................................................................................32
4.3 Obtenção das frações .........................................................................................34
4.3.1 Sub-fração metanol dos galhos (RGM) ............................................................34
4.3.2 Extrato das raízes .............................................................................................36
4.4 Ensaios de Toxicidade.........................................................................................38
4.4.1 Ensaio com Artemia salina ...............................................................................38
4.4.2 Bioensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens............................................39
4.5 Avaliação Microbiológico.....................................................................................40
4.5.1 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para bactérias.....................40
4.5.2 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para fungos........................41
4.6 Avaliação da atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico.....................41
4.6.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético......................................................42
4.6.2 Modelo de dor induzida pela formalina.............................................................42
4.6.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina...........................................................42
4.6.4 Modelo de dor induzida pelo glutamato............................................................43
4.7 Análise estatística dos testes in vivo....................................................................43
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES..........................................................................45
5.1 Triterpenos em mistura.........................................................................................45
5.2 Alcalóides.............................................................................................................46
5.3 Limonóides...........................................................................................................49
5.3.1 Limonóides Degradados ..................................................................................52
5.4 Ensaio de citoxicidade com Artemia salina .........................................................61
5.5 Ensaio com formigas Atta sexdens......................................................................62
5.6 Ensaio microbiológico..........................................................................................65
5.7 Atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico..........................................67
5.7.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético.......................................................68
5.7.2 Modelo de dor induzida pela formalina.............................................................69
5.7.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina...........................................................71
5.7.4 Modelo de dor induzido pelo glutamato.............................................................73
6 CONCLUSÕES.......................................................................................................77
7REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................78
LISTA DE FIGURAS
Figura. 1: Foto da planta em estudo Raulinoa echinata (BIAVATTI, 2001)...............23
Figura 2: Esquema ilustrativo do fracionamento da fração metanol dos galhos de R.
echinata. ...................................................................................................................34
Figura 3. Esquema ilustrativo do preparo extrato das Raízes de R. echinata e
posterior obtenção das frações..................................................................................36
Figura 4: Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) da mistura de triterpenos
isomultiflorenol/isobaurenol (7 e 8)............................................................................46
Figura 5 . Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3) do alcalóide 2n- Nonil-4-quinolona
(25).............................................................................................................................49
Figura 6: Espectro de RMN 1H (400 MHz) do ácido limonéxico (13) (CDCl3 + DMSO-
d6) ..............................................................................................................................50
Figura 7: Espectro de RMN 13C BBD para o ácido limonéxico (100 MHz, CDCl3 +
DMSO-d6)...................................................................................................................51
Figura 8: Espectro RMN 1H (400 MHz, CDCl3) do limonóide degradado fraxinelona
(28).........................................................................................................53
Figura 9: Espectro de massas da fraxinelona (28) obtido por impacto eletrônico...54
Figura 10: Espectro RMN 1H (200 MHz, CDCl3) do limonóide degradado
fraxinelonona (29) ....................................................................................................55
Figura 11:Espectro de massas da fraxinelonona (29) obtido por impacto eletrônico.56
Figura 12: Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3) do limonóide degradado
epóxifraxinelona (15).................................................................................................57
Figura 13: Projeção ORTEP 3 da epóxifraxinelona com numeração cristalográfica
Elipsóides dos átomos não hidrogenados com 50% de probabilidade......................56
Figura 14: Formação dos limonóides degradados.....................................................60
Figura 15: Espectro de massas da epóxifraxinelona (15) obtido por impacto
eletrônico....................................................................................................................60
Figura 16: Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, Atta sexdens
rubropilosa frente aos compostos epóxifraxinelona (painel A) e ácido limonéxico
(painel B)....................................................................................................................63
Figura 17: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente
sobre a nocicepção induzida pelo ácido acético (0,6%) em camundongos..............68.
Figura 18: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrada sistemicamente
sobre nocicepção induzida pela formalina em camundongos...................................70
Figura 19:Efeito do ácido limonéxico (10-60mg/Kg) administrado sistemicamente
sobre nocicepção induzida pela injeção intraplantar da capsaicina em
camundongos ............................................................................................................72
Figura 20: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente
sobre a nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos................................73
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Ranking dos 35 produtos éticos derivados de produtos naturais mais
comercializadas no período de 2000 – 2002............................................................19.
Tabela 2: Dados de RMN 1H (400 MHz, CDCl3 + DMSO-d6) do ácido limonéxico (13)
isolado em comparação com a literatura...........................................................51
Tabela 3: Dados de RMN 1H (200 MHz, CDCl3) da fraxinelonona isolada em
comparação com a literatura......................................................................................56
Tabela 4: Interações geométricas intramolecular e intermolecular (Ǻ) do
epóxifraxinelona.........................................................................................................59
Tabela 5: Efeitos de extratos, sub-frações e compostos isolados de Raulinoa
echinata no screening de citotoxidade de Artemia salina.........................................61
Tabela 6: Resultados de Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) de frações e sub-
frações de Raulinoa echinata através da diluição em agar........................................65
Tabela 7: Comparação dos valores das DI50s para atividade do ácido limonéxico, do
paracetamol e da aspirina no modelo do ácido acético........................................69
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
BBD- Broad Band Declouping
CCD- Cromatografia em Camada Delgada
CC- Cromatografia em Coluna
CIM- Concentração Inibitória Mínima
CGRP- Peptídeo Relacionado ao gene-calcitonina
δ- Deslocamento químico (ppm)
DL50- Dose Letal 50%
DI50- Dose Inibitória 50%
DMSO- Dimetilsulfóxido
IM- Inibição Máxima
IV- Infra-vermelho
J- Constante de acoplamento
m/z- Relação massa carga
m – Multipleto
[M+]- Íon molecular
NMDA- n-Metil-D-aspartato
NKA- Neurocinina-A
NKB- Neurocinina B
RMN1H- Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN13C- Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
RGM- Fração Metanol dos Galhos
RGM-H- Sub-fração hexano da fração metanol dos galhos
RGM-D- Sub-fração diclorometano da fração metanol dos galhos
RGM-A- Sub-fração acetato de etila da fração metanol dos galhos
RRH- Extrato hexano das raízes
RRM- Extrato metanol das raízes
RRH-H- Fração hexano do extrato hexano das raízes
RRH-A- Fração acetato de etila do extrato hexano das raízes
RRM-H- Fração hexano do extrato metanol das raízes
RRM-D- Fração diclorometano do extrato metanol das raízes
RRM-A- Fração acetato de etila do extrato metanol das raízes
SNC- Sistema Nervoso Central
SP- Substância P
s- Singleto
sl- Singleto largo
UV- Ultra Violeta
15
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento sobre as plantas medicinais sempre tem acompanhado o
homem através dos tempos. As primitivas civilizações cedo se aperceberam da
existência, ao lado das plantas comestíveis, de outras dotadas de maior ou menor
toxicidade que, ao serem experimentadas no combate às doenças, revelaram,
embora empiricamente, o seu potencial curativo.
Há séculos, substâncias químicas derivadas de fontes naturais (plantas,
animais, organismos marinhos e microorganismos) têm sido utilizadas pela
humanidade no tratamento de enfermidades (KOEHN E CARTER, 2005). Apesar da
descoberta de novos fármacos por diversos outros métodos, a pesquisa com
produtos naturais ainda apresenta-se como meio importante para o surgimento de
novas substâncias utilizadas na clínica médica. Tal feito foi recentemente
demonstrado por Cragg, Newmam e Snader que analizaram em 1996, do total de
drogas lançadas entre 1981 a 2002, as que são derivadas de produtos naturais. Os
autores concluíram que as substâncias analizadas representaram uma significante
fonte de novas drogas, especialmente na terapia anticâncer e antihipertensiva.
Dos 250 medicamentos considerados como básicos e essenciais pela
Organização Mundial de Saúde (OMS), 11% são exclusivamente obtidos de plantas
medicinais e um número significativo são de fármacos sintéticos obtidos a partir de
fonte natural. O potencial das plantas como fonte de pesquisa na busca de novos
medicamentos, com novos modos de ação, alta seletividade e atividade é ainda
muito pouco explorado, uma vez que, entre as cerca de 250.000 espécies de plantas
existentes no mundo, somente uma pequena porcentagem tem sido investigada
fitoquímica e biologicamente, e menos de 2500 tem sido caracterizadas com relação
aos metabólitos secundários (CECHINEL E BRESOLIN, 2003).
O Brasil é o país com uma das maiores diversidades genética vegetal do
mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado
entre 350.000 e 550.000 (SIMÕES et al., 2003), há portanto, um riquíssimo arsenal
botâncio a ser investigado sob o ponto de vista fitoquímico, biológico e
farmacológico. São as plantas uma fonte importante de produtos naturais
biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para síntese de
um grande número de fármacos. Pesquisadores da área de produtos naturais
16
mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na natureza
revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade em termos de estrutura
e de propriedades físico-químicas e biológicas. Apesar do aumento de estudos
nessa área, os dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das plantas foram
estudadas quanto ao seu potencial medicinal (SIMÕES et al., 2003) e isto demonstra
o grande potencial para descoberta de novas substâncias a partir de plantas.
Vários métodos têm sido descritos e empregados para seleção de plantas a
serem estudadas sob o ponto de vista químico e biológico, objetivando o
desenvolvimento de novos fármacos. Papel importante nisto desempenha a
etnofarmacologia, ou seja, o conhecimento popular do uso terapêutico de plantas,
que oferece valiosas informações que constituem um importante critério para o
estudo fitoquímico de plantas as quais poderiam se transformar em novos
medicamentos
(CECHINEL E BRESOLIN, 2003).
Raulinoa echinata não apresenta nenhum uso na medicina popular, porém a
investigação fitoquímica e biológica de seus galhos e raízes, proposta deste
trabalho, é pertinente tendo em vista a raridade da planta e os promissores
resultados fitoquímicos e de bioatividade obtidos em pesquisa anterior das folhas e
caules. Além disso, os ensaios farmacológicos se mostraram promissores
evidenciando também um possível potencial terapêutico da planta.
17
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
� O presente trabalho teve como objetivo analisar fitoquimicamente a fração
metanólica dos galhos e as raízes de Raulinoa echinata, bem como avaliar
sob o ponto de vista biológico frações e compostos isolados da planta.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
� Preparar e fracionar extratos das raízes e sub fracionar a fração metanólica
dos galhos
� Testar extratos, frações, sub-frações e compostos isolados no screening com
o micro-crustáceo Artemia salina e quanto à atividade antimicrobiana.
� Identificar compostos isolados
� Testar extratos e frações quanto à atividade microbiana
� Analisar efeito antinociceptivo in vivo do ácido limonéxico, utilizando ensaios
com ácido acético, formalina, glutamato e capsaicina
� Avaliar atividade inseticida sobre formigas cortadeiras Atta sexdens
rubropilosa dos compostos isolados ácido limonéxico e epóxifraxinelona.
18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Aspectos Gerais sobre Plantas
As plantas, desde o início dos tempos, são importantes tanto na alimentação
quanto na cura de doenças. A utilização delas na cura de doenças é prática
difundida por diversas populações e portanto, cada vez mais estudos quanto ao seu
perfil químico e quanto ao seu potencial biológico são necessários, comprovando
assim sua segurança e eficácia terapêutica. As plantas medicinais continuam a ser
utilizadas pela população e jamais foram completamente substituídas pelos
fármacos sintéticos (COSTA, 1994; SIMÕES et al, 2003).
Ao se estudar uma planta com relação às suas características fitoquímicas,
considera-se a existência de dois grupos de metabólitos, os primários e os
secundários. Os metabólitos primários são essenciais ao crescimento e à vida do
vegetal, como por exemplo os aminoácidos, monossacarídeos, lipídeos etc. Já os
metabólitos secundários são produtos de metabolismo específico, relacionados aos
processos adaptativos e muitas vezes característicos de um dado gênero ou
espécie. Os metabólitos secundários apresentam uma grande diversidade química,
como por exemplo os alcalóides, esteróides, terpenóides, flavonóides, etc
(CECHINEL E BRESOLIN 2003). Os metabólitos secundários são constituídos por
uma variedade de substâncias bioativas, e nos dias atuais o interesse científico por
esses constituintes tem aumentado, devido a busca por novos medicamentos
(BASILE et al., 1999 e 2000; SATO et al., 2002; PAIVA et al., 2003). Medicamentos
derivados de produtos naturais foram bem representados entre as drogas mais
vendidas em 2000, 2001 e 2003, em percentagem 40%, 24% e 26%
respectivamente (tabela 1) (BUTLER, 2004).
Segundo Magistretti (1980), a pesquisa sistemática para obtenção de novos
compostos com finalidade terapêutica pode ser executada por meio de vários
processos. Alguns princípios podem ser utilizados para planejar a seleção das
plantas que serão objeto de estudo, como por exemplo, a seleção aleatória ou
randômica seguida de bioensaios. Para Maciel et al (2002), a pesquisa conduzida
por meio de abordagem randômica aumenta a probabilidade de “novas descobertas”
19
de substâncias inéditas, pois a cada 10.000 diferentes tipos de plantas existe a
possibilidade de obtenção entre 50.000- 100.000 estruturas.
Tabela 01: Ranking dos 35 produtos éticos derivados de produtos naturais mais comercializadas no período de 2000 – 2002.
2000/ Ranking 2001/ Ranking 2002/ Ranking
Atorvastatina/ 2º Atorvastatina/ 1º Atorvastatina/ 1º
Sinvastatina/ 3º Sinvastatina/ 3º Sinvastatina/ 2º
Estrogênio/ 16º Estrogênio/ 16º Estrogênio/ 25º
Amoxicilina+ ácido
clavulânico/ 17º
Amoxicilina+ ácido
clavulânico/ 17º
Amoxicilina+ ácido
clavulânico/ 27º
Enalapril/ 18º ______ ______
Pravastatina/ 19º Pravastatina/ 15º Pravastatina/ 15º
Placlitaxel/ 25º ______ ______
Azitromicina/ 27º Azitromicina/ 29º Azitromicina/ 33º
Gabapentina/ 30º Gabapentina/ 23ª Gabapentina/ 14º
Propionato de fluticasona/
31º
Propionato de fluticasona/
33º
______
Claritromicina/ 32º ______ ______
Cicllosporina/ 34º ______ ______
Lisinopril/ 35º ______ ______
______ ______ Propionato de fluticasona/ +
salmoterol 13º
Fonte: Adaptado de BUTLER 2004
O grande crescimento da pesquisa de produtos naturais nos últimos anos
deve-se principalmente ao rápido avanço de técnicas de isolamento e análise dos
compostos bioativos em plantas, e pela facilidade da busca de informações em
vários sistemas de bases de dados (WRIGLEY et al. ,1997).
Na fitoquímica, a extração dos constituintes da planta é realizado com o uso
de diferentes solventes sob as mais variadas condições como tempo e temperatura
de extração. Após a extração bruta procede ao isolamento dos diferentes
constituintes do extrato bruto obtido. O procedimento de isolamento pode envolver
desde uma simples cristalização, até separações sucessivas com partições em
solventes de polaridades diferentes e extensivas técnicas cromatográficas. Assim
20
sendo, técnicas cromatográficas têm destaque no que concerne à separação,
identificação e quantificação de compostos. A cromatografia é um método físico de
separação, na qual os compostos a serem separados são distribuídos entre duas
fases (HOUGHTON E RAMAN, 1998).
Após a extração e isolamento, procede-se à determinação estrutural que
envolve o acúmulo de dados de numerosas fontes, cada qual fornece alguma
informação estrutural e a assimilação destes dados leva à determinação da
estrutura química.
Existe uma variedade de técnicas espectroscópicas disponíveis tais como
Ultra-violeta (UV), Infravermelho (IV), RMN de hidrogênio ( RMN 1H) e de carbono 13
(RMN 13C) e Espectroscopia de massas. O processo espectroscópico para
determinação estrutural deve estar muito bem aliado com a literatura científica. Caso
o composto encontrado ainda não tiver sido descrito, o mesmo pode ser similar a
outros já descritos, o que ajudará na interpretação dos dados (BUCKINGHAM E
THOMPSON, 1997).
Quando a análise dos dados do composto desconhecido não é conclusiva e
este possuir uma estrutura cristalina, pode-se fazer o estudo de difração de raios X.
Isto é possível quando um simples cristal é irradiado com raios X. A correta
interpretação dos dados resultará numa figura tri-dimensional da molécula, incluindo
a estereoquímica relativa se a molécula for opticamente ativa e em alguns casos a
estereoquímica absoluta também pode ser determinada (HAMBURGER E
HOSTETTMANN, 1991)
Dando continuidade a pesquisa por compostos ativos, parte-se a seguir para
análise biológica que pode ser tanto in vitro quanto in vivo. Dependendo do que se
deseja investigar faz-se a escolha do modelo mais apropriado levando em conta
custos, disponibilidade de material, características e quantidade da amostra,
reprodutibilidade e rapidez. Mas principalmente, deve-se levar em consideração o
uso popular da planta (para que serve na medicina popular) ou na falta deste, para a
espécie em estudo, o uso popular de espécies do mesmo gênero e/ou família.
Geralmente, as triagens iniciais são realizadas com modelos experimentais menos
complexos e, após a seleção das substâncias puras ativas, estas são avaliadas em
ensaios mais específicos, para posteriormente serem submetidos à análise do
mecanismo de ação biológica (YUNES E CALIXTO, 2001)
21
3.2 Raulinoa echinata Cowan
A família Rutaceae constitui o maior grupo de Rutales (ENGLER, 1931) e
caracteriza-se por uma grande diversidade de metabólitos secundários não comuns
nas demais famílias da ordem (SILVA et al., 1988; WATERMAN, 1983). Os
metabólitos mais representativos são os alcalóides derivados do ácido antranílico,
cumarinas (GRAY, 1983) e limonóides (DREYER, 1983). A diversificação dos
alcalóides e cumarinas é maior nas subfamílias Rutoideae e Toddalioideae. A
similaridade química entre estas duas subfamílias é muito pronunciada (SILVA et al.,
1987).
Raulinoa é gênero monoespecífico da espécie Raulinoa echinata Cowan
(Rutaceae). Trata-se de uma espécie endêmica no vale do Itajaí. Raulinoa inclui-se
na subtribo Pilocarpinae, pertencente a Cuspariae (Gallideae), que é uma das cinco
tribos da subfamília Rutoideae. Pilocarpus, Esenbeckia, Metrodorea e Raulinoa são
os quatro gêneros inseridos em Pilocarpinae, e estão dispersas pelo Neotrópico (sul
dos USA até norte da Argentina). Os gêneros Pilocarpus e Esenbeckia possuem
espécies com atribuídas propriedades medicinais. O primeiro era originalmente
usado como sudorífero, sialogogo devido a presença de pilocarpina (alcalóide
imidazólico), que atualmente é utilizado para tratamento do glaucoma. O segundo
tinha indicações como estomáquico e febrífugo (BIAVATTI, 2001).
Considera-se morfologicamente o gênero Esenbeckia o mais primitivo da
subtribo, o qual é bastante semelhante a Metrodorea, seguido de Raulinoa. Ao
contrário, Pilocarpus é considerado altamente especializado devido à presença de
alcalóides imidazólicos (KAASTRA,1982).
Raulinoa echinata (figura1), denominada “Cutia-de-espinho” ou “sarandi”, é
um arbusto de tronco fino e flexuoso caracterizado pela presença de espinhos,
pertencente ao grupo dos sarandis, (vegetação arbustiva característica e exclusiva
das margens rochosas dos rios que são freqüentemente inundadas durante as
cheias). Quando indentificada pela primeira vez, Raulinoa echinata foi apenas
encontrada como parte integrante da vegetação que se desenvolve ao longo das
margens do rio Itajaí-açu, apenas em um pequeno trecho (1000 m) no município
de Apiúna, em Santa Catarina (KAASTRA, 1982).
22
Recentemente, em estudos sobre os possíveis impactos ambientais que a
obra de construção da Usina de Salto Pilão traria aos 15 quilômetros de construção
entre os municípios de Apiúna, Lontras e Ibirama, se descobriu a presença da
espécie R. echinata em uma região bastante extensa às margens do rio Itajaí-açu,
chegando próxima a Blumenau, o que segundo os defensores da construção da
usina não prejudicaria a perpetuação da espécie (FERRI, 2006). Apesar disso, a
Associação de Preservação do Meio Ambiente do Alto Vale do Itajaí e o Grupo Pau
Campeche, recorreram ao Tribunal Regional Federal, em Porto Alegre, com pedido,
anteriormente negado pela Justiça Federal de Rio do Sul, para suspender as obras
de construção da usina, com alegação entre outras de que,quando da elaboração do
estudo de impacto ambiental, não se teria observado corretamente a principal obra
de referência no que diz respeito à flora da região, onde consta que o citado
espécime é exclusivo das margens dos rios e das ilhas atingidas. Tal pedido foi
negado pelo juiz relator que alegou que pelo exame dos documentos acostados
houve, anteriormente ao licenciamento da obra, um alentado estudo do impacto
ambiental, e mesmo das condições ambientais da região, dedicando-se um capítulo
inteiro destes estudos à populações naturais de Raulinoa echinata, que culminariam
com recomendações relativas à conservação da espécie, aduzindo, o grupo de
estudiosos, que a amostragem e as avaliações realizadas foram superiores as
previstas, tanto em número de plantas como em número de populações,
identificando a presença da planta fora da área que será impactada pelo
empreendimento, afastando, assim, o risco de extinção da espécie, até porque,
conforme consta nos autos, é possível seu replantio em outras áreas bem como qa
reprodução em cativeiro (LIMA, 2006).
Raulinoa diferencia-se dos outros membros de Pilocarpinae devido a
presença de espinhos, veias intramarginais nas folhas e pelas flores levemente
zigomorfas. Arbusto com 2-3 m de altura, glabro, exceto para os pecíolos jovens,
ramos com 2-5 mm de diâmetro, freqüente presença de espinhos com 8-21 mm de
comprimento, delgados, que sustentam flores e folhas perto da base. Folhas firme-
cartáceas, opostas, simples, ápice arredondado, às vezes levemente retuso, lâminas
com 23-60 mm de comprimento e 6-15 mm de largura; pecíolos 3-5 mm de
comprimento, sésseis, flores tetrâmeras, pétalas escuro-vermelhas, largamente
ovais. Frutos 10 mm de comprimento se 7 mm de largura, oblongo-obovados, 1 por
infrutescência, 3-4 cápsulas loculares (COWAN e SMITH, 1973; KAASTRA, 1982).
23
Figura. 1 Foto da planta em estudo Raulinoa echinata (BIAVATTI, 2001)
Anatomicamente, a lâmina foliar apresenta-se dorsiventral, hipoestomática,
com feixes vasculares colaterais e mesofilo constituído por parênquimas, paliçádico
e esponjoso, e cavidades secretoras contendo óleos. Análises estruturais e ultra-
estruturais revelaram características dos estômatos, da cutícula e do mesofilo que
devem ter relevante importância na adaptação da planta às peculiaridades
ambientais. Tais características, ora mostram-se xeromorfas (átrio entre poro e
ostíolo, cutícula espessa), ora hidromorfas (células-guarda acima das demais células
epidérmicas, parênquima esponjoso com amplos espaços intercelulares). As
paredes periclinais espessas das células-guarda podem estar associadas com a
manutenção do fechamento estomático durante as cheias do rio, quando as folhas
permanecem submersas. A cutícula espessa, em ambas as faces, é fator que pode
evitar a desidratação interna durante a vazante (quando as folhas estão expostas à
intensa irradiação solar) e o encharcamento interno durante as cheias do rio (quando
as folhas estão submersas) (TAGIANE E VOLTOLINI, 2005)
Raulinoa echinata já teve seus caules e folhas analisados fitoquimicamente
em pesquisa de doutorado (BIAVATTI, 2001). Na pesquisa realizada, isolou-se
vários compostos típicos de Rutaceae e alguns inéditos nesta família. Verificou-se
24
também com este estudo características químicas de metabolismo secundário
bastante próximas daquelas apresentadas pelos gêneros Metrodorea e Esenbeckia,
os quais estão morfologicamente posicionados na mesma subtribo (Pilocarpinae) da
subfamília Rutoideae.
Foram isolados por Biavatti (2001) 44 substâncias pertencentes a diversas
classes de metabólitos secundários, das quais, cita-se as isoladas dos caules e
folhas de Raulinoa echinata: a) sesquiterpenos: Germacreno (1), Eudesmendiol (2),
Oplopanona (3), b) triterpenos: Esqualeno (4), Friedelina (5), β-sitosterol (6),
Isomultiflorenol (7), Isobaurenol (8), c) protolimonóides: Melianona (9), Melianodiol
(10), 21α, 25- Dimetilmelianodiol (11), triterpenos esterificados, d) limonóides:
Limonina (12), Ácido limonéxico (13), Kiadalactona (14), 8,14 Epóxifraxinelona (15),
e) cumarinas: Escopoletina (16), Aiapina (17) e Lomatina (18), f) alcalóides:
Esquimianina (19), Kokusaginina (20), Maculina (21) Flindersiamina (22), 4,8-
Dimetoxi-furol [2,3-b] quinolina-5,7 diol (23), 2-Fenil-1-metil-4-quinolona (24), 2-n-
Nonil-4-quinolona (25), 1-Metil-2-n-nonil-4quinolona (26), 1-Metil-2-[Tridecenil]-4-
quinolona (27).
São exemplos de compostos inéditos e bioativos isolados de R. echinata os
alcalóides furoquinolínicos e os alcalóides alquil-quinolínicos, os quais revelaram boa
atividade antifúngica sobre Leucoagaricus gongylophorus. No biomonitoramento
com micro-crustáceo Artemia salina, foi confirmada a atividade citotóxica do
protolimonóide (melianona) (BIAVATTI, 2001).
OH
HOH
O
HOH
H
1 2
3
25
H H
O
4 5
H
HO
HH
6
7 8
HO
HO
26
O
O
OHOH
H
O
O OH
HO
HO
H
H
9 10
11
12 13
O
O OMe
HO
MeO
H
H
O
O
O
H
O
O
O
O
O
O
O
HO
O
O
H
O
O
O
O
O
27
14 15
O O
MeO
HO
16 17
O OO
OH
N O
OMe
OMe
MeO
18 19
N O
OMe
MeO
MeO
N O
OMe
O
O
20 21
O
O
OAc
OAc
O
O
O
O
O
O
O O
O
O
28
N O
OMe
O
O
OMe
N O
OMe
OMe
OH
HO
22 23
H
N
O
24 25
N
O
N
O
26 27
3.3 Limonóides
Os limonóides são triterpenos modificados com 26 átomos de carbono
(tetranortriterpenóides), produzidos em plantas pertencentes à ordem Rutales, mais
freqüentemente encontrados em Meliaceae e em Rutaceae e com menos freqüência
em Cneoraceae. O termo limonóide foi derivado de limonina (12), o primeiro
tetranortriterpenóide isolado (ROY E SARAF, 2006)
A produção desta classe de metabólitos secundários é considerada uma
resposta da planta à herbivoria, tendo sido revelados diversos efeitos inseticidas,
N
O
29
seja interferindo no crescimento, seja através da inibição da alimentação
(JAYAPRAKASHA et al., 1997; VIEIRA et al., 2001).
Mais recentemente, têm sido estudadas as atividades antitumorogênica,
anticarcinogênica, antimicrobiana, antiviral e ainda outras atividades farmacológicas
para os limonóides (CHAMPAGNE et al., 1992; JUNG et al., 2000, ROY E SARAF,
2006).
O estudo fitoquímico dos caules e folhas de R. echinata já levou ao
isolamento de quatro limonóides e um limonóide degradado, sendo a limonina (12)
o mais abundante em ambas as partes da planta. A literatura relata que plantas
produtoras de limonóides em Rutaceae não são capazes de acumular intermediários
biossintéticos, tendendo a serem dominadas pela presença de limonina (12)
(DREYER et al., 1972). Os outros limonóides encontrados em R. echinata
apresentaram poucas modificações estruturais no anel A conforme o esperado para
Rutaceae, porém o anel furânico apresenta-se oxidado. Da degradação biológica
derivam os limonóides degradados em que os anéis C-D e também o anel furano
são mantidos intactos, o que provavelmente preserva grande parte de sua atividade
intacta.Os limonóides degradados são encontrados principalmente em Rutaceae e
raramente em Meliaceae (NAKATANI et al. ,1998).
A limonina causou uma pronunciada diminuição na atividade do citocromo
P450, o que foi verificado em um estudo in vitro conduzido com substâncias isoladas
dos frutos de Evodia rutaecarpa e Evodia officinalis, pertencentes à família
Rutaceae, sobre atividade do citocromo P450 do fígado de humanos (IWATA, et al.,
2004). Resultados de estudos sobre os efeitos da suplementação da dieta com os
limonóide limonina (12) e nomilina, sobre o metabolismo de enzimas do fígado e
intestino delgado de ratos levam à conclusão de que estes compostos induzem a
detoxificação da enzima Glutation Transferase S (KELLY, 2003).
Testou-se os limonóides, limonina (12), ácido limonéxico (13), Ac. 21-metil-
limonéxico, Kiadalactona (14), 8,14 Epóxifraxinelona (15), nos modelos biológicos de
citoxicidade sobre Artemia salina, inibição antiparasitária, forma tripomastigota de
Trypanossoma cruzi, inibição da atividade da enzima GAPDH- gliceraldeído-3-
fosfato-desidrogenase de Trypanossoma cruzi e atividade antifúngica sobre
Leucoagaricus gongylophorus, porém não apresentaram nenhuma atividade
potencial, apenas uma moderada inibição da forma tripomastigota de Trypanosoma
cruzi. Sabe-se que alguns limonóides de Meliaceae (derivados da gedunina)
30
apresentam boa atividade anti-malárica (MACKINNON et al., 1997; BICKII et al.,
2000).
3.4 Alcalóides
A família Rutaceae é considerada atípica na diversidade de produção de
alcalóides. Os alcalóides estão classificados em cinco tipos diferentes de acordo
com a sua origem biogenética, sendo que os alcalóides derivados do ácido
antranílico são tidos como eminentes marcadores quimiotaxonômicos. Mesmo
famílias próximas de Rutaceae (ordem Rutales) são praticamente incapazes de
produzir estes alcalóides (WATERMAN, 1999).
Dentre os derivados do ácido antranílico, os alcalóides furoquinolínicos são de
ocorrência ubíqua dentro da família, juntamente com alcalóides acridônicos e
piranoquinolínicos. Apesar de ocorrerem amplamente mas não universalmente,
ainda não foi encontrado um padrão quimiotaxonômico elusivo para estes alcalóides.
Os gêneros Esenbeckia e Metrodorea, filogeneticamente próximos de
Raulinoa, também apresentaram os mesmos tipos de alcalóides, em diversas
espécies estudadas: E. belizencis (RIOS e DELGADO, 1992), E. grandiflora
(OLIVEIRA et al., 1996), E. almawilla (GUILHON et al., 1994), E. leiocarpa
(NAKATSU et al.,1990), M. nigra (MÜLLER et al., 1995) e M. flavida (BAETAS et al.,
1999). Diferentemente, os alcalóides imidazólicos isolados do gênero Pilocarpus não
são derivados do ácido antranílico, mas possuem uma origem biogenética ainda
discutida.
O estudo dos extratos das folhas e caules de Raulinoa echinata levou ao
isolamento de alcalóides furoquinolínicos, bem conhecidos e característicos de
Rutaceae, em grandes quantidades: esquimianina (19), kokusaginina (20), maculina
(21) e flindersiamina (22) e também alguns quinolônicos: 2-fenil-1-metil-4-quinolona
(24), 2-n-nonil-4-quinolona (25), 1-metil-2-n-nonil-4-quinolona (26) Os alcalóides
isolados demonstraram atividade antifúngica contra o fungo simbionte de formigas
cortadeiras Leucoagaricus gongylophorus. Quando testados in vitro contra formas
tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, os alcalóides foram inativos ou parcialmente
ativos (BIAVATTI, 2001).
31
A literatura cita diversas atividades biológicas para estes alcalóides,
principalmente antimicrobiana contra os patógenos de plantas Cladosporium
cucumerinum (ZHAO et al., 1998) e Phytophthora spp (MOON et al., 1996).
Alcalóides furoquinolínicos foram ativos in vitro contra os parasitas Leishmania spp
(FOURNET el al., 1993) e Plasmodium falciparum (BASCO el tal., 1994).Um
alcalóide quinolônico (3-dimetilalil-4-metoxi-2-quinolona) demonstrou atividade
antihelmíntica (PERRET e WHITFILED, 1995), entre outras.
Os alcalóides flindersiamina, kokusoginina, maculina e esquimianina
apresentaram, quando testados sobre linhagens de células tumorais ovarianas, fraca
atividade citotóxica (PRAKASH et al., 2003)
32
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material botânico
Os galhos (5,7 Kg) de Raulinoa echinata foram coletados no município de
Apiúna, Santa Catarina, à margem esquerda do rio Itajaí-açu, na localidade de
Subida, perto do porto de rafting, em julho de 1998. O material coletado foi
identificado pelos professores Ademir Reis (Universidade Federal de Santa Catarina)
e José R. Pirani (Universidade de São Paulo). Exsicatas do material coletado foram
depositadas no Herbário Barbosa Rodrigues (HBR) [A Reis & M. Biavatti 2.570
(26/07/98)], Itajaí, Santa Catarina.
As raízes de Raulinoa echinata foram coletadas em maio de 2001 em Apiúna
(SC), dos mesmos espécimes vegetais e na mesma localidade em que os galhos e
folhas coletados anteriormente.
4.2 Fracionamento fitoquímico
4.2.1 Suportes Cromatográficos
4.2.1.1 Cromatografia em Coluna - CC
Sílica gel Aldrich/Merck 70-230 mesh (sem pressão) e 230-400 mesh (com
pressão).
4.2.1.2 Cromatografia em Camada Delgada-CCD
Cromatoplacas Merck sílica gel GF 254 0,25 µm, como reveladores utilizou-se
anisaldeído sulfúrico, reagente Dragendorff, câmera de Iodo (I2) e luz UV em 365 e
254 nm (WAGNER E BLADT, 1996)
4.2.1.3 Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
Cromatoplacas Merck sílica gel 60 F254 = 366 2mm
4.2.2 Solventes
33
Hexano, diclorometano, acetona, acetato de etila, metanol e benzeno
comercial (grau técnico).
Hexano, etanol, acetona, metanol, isopropranol grau HPLC.
4.2.3 Equipamentos
4.2.3.1 Ressonância Magnética Nuclear- RMN
Espectrômetros Bruker DRX-400, 400,13 MHz para 1H e 100,62 MHz para 13C
e ARX-200, 200,13 MHz para 1H e 50,32 MHz para 13C. Foram utilizados tempos de
relaxação de 1 s e 30 ms, sendo 32 o número de transientes em todos experimentos
(Universidade Federal de São Carlos).
4.2.3.2 Espectro de Massas de Impacto Eletrônico
Shimadzu GC-17 A acoplado com MSQP 5000 e equipado com coluna DB-1
(J& W Scientific, 30m x 0,25 mm i.d. x0,25 µm espessura), modo split, volume de
injeção de 1µL e programação de temperatura variada, com fluxo inicial de 2,6
mL/min e com temperaturas párea detector/injectopr de 300 °C/280 °C
respectivamente. A energia de colisão utilizada de 1,5 e V, modo impacto eletrônico,
e scan de 50 à 500 u. m. a . Gás de arraste Hélio.
4.2.3.6 Difração de RAIOS-X
Foram realizados no IFSC/USP pelo professor Dr. Javier Ellena, utilizando
baixa temperatura (120 K) em um difratômetro Enraf- Nonius Kappa-CCD. Os dados
foram coletados usando programa COLLECT e a estrutura resolvida com SHELXS-
97 (BIAVATTI et al., 2005). Dados cristalográficos adicionais estão depositados no
Cambridge Crystallographic Data Centre sob número: CCDC 265853. CCDC, 12
Union Roade, Cambrigde CH2 1EZ, UK (fax: +44-1223-336-033 ou e-mail:
[email protected] ou http://www.ccdc.cam.ac.uk).
4.3 Obtenção das frações
4.3.1 Sub-fração metanol dos galhos (RGM)
34
Em pesquisa anterior obteve-se a fração MeOH (RGM, 80 g) (BIAVATTI,
2001). Do fracionamento de RGM, (previamente diluído com metanol e água, por
partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente) obteve-se as sub-
frações: hexano (RGM-H, 6 g), CH2Cl2 (RGM-D, 9 g), AcOEt (RGM-A, 3 g) e
MeOH/ H2O (RGM-M), (Figura 2)
Partição líquido-líquido
Hexano CH2Cl2 AcOEt MeOH/
H2O
Figura 2 – Esquema ilustrativo do fracionamento da fração metanol dos galhos de R. echinata.
As sub-frações acima foram tratadas com diferentes técnicas cromatográficas.
Sendo que, a sub-fração hexano dos galhos, RGM-H (6 g) foi fracionada por CC em
sílica gel (70-230 mesh), utilizando como eluente inicial hexano-diclorometano na
proporção de 7:3 seguido de aumento gradativo da polaridade. Esta sub-fração
forneceu nove sub-frações (A-I 5,4 g). De acordo com o perfil observado por CCD as
amostras B (510 mg) e C (2,6 g) foram semi purificadas em separado por CC em
sílica gel, utilizando como fase móvel hexano-diclorometano. Da semi-purificação
da amostra B obteve-se oito sub-frações (A-H 325 mg ). A purificação da amostra H
(9 mg) por CC, fase móvel hexano-acetona resultou no isolamento dos triterpenos
em mistura isomultiflorenol/isobaurenol (6 mg), previamente identificado por CCD
com padrão conhecido e confirmado posteriormente com o espectro de RMN.
Com a semi- purificação da amostra C obteve-se oito sub-frações (A-H 2 g). A sub-
fração B foi purificada em sílica- gel (70-230 mesh) e fase móvel hexano- acetona,
resultando na identificação por CCD com padrão conhecido do esteróide β- sitosterol
RGM-H
(6 g)
RGM-D
(9 g)
RGM-A
(3 g)
RGM-M
Peso não
disponível
RGM(80 g)
35
(146 mg) e novamente dos triterpenos em mistura isomultiflorenol/isobaurenol (140
mg).
A sub-fração diclorometano dos galhos, RGM-D (9 g) foi fracionada por CC em
sílica gel (70-230 mesh), utilizando como eluente inicial hexano-acetona na
proporção de 95:5 com aumento gradativo da polaridade. Desta fração obteve-se
dezessete sub-frações (A-Q), dentre estas quatro apresentaram um perfil em CCD
interessante D, E, F, G (4,1 g). Estas quatro sub-frações foram agrupadas e semi-
purificadas por CC em sílica gel e como fase móvel o sistema hexano-acetona na
proporção inicial 95:5 com gradativo aumento de polaridade foi utilizado. Esta semi-
purificação resultou em vinte sub-frações (A-T 3,5 g), sendo que na sub-fração I
(167 mg) foi isolado e identificado o alcalóide flindersiamina, encontrado, em
pesquisa anterior, nos caules da planta R. echinata. Na sub-fração F (18 mg) foi
isolado e identificado por RMN1 H o alcalóide furoquinolínico maculina, também já
isolado dos caules e folhas. Na sub-fração M (53mg) encontrou-se o alcalóide
quinolínico 2-n-nonil-4 quinolona. A sub-fração T (1,2 g) obtida com um rendimento
de 34,28%, apresentou um perfil “confuso” em CCD. Recorreu-se, na tentativa de
purificação, à cromatografia em coluna aberta com e sem pressão, CLAE fase
normal e reversa, mas nenhuma dessas atendeu ao objetivo. Decidiu-se então
recorrer à CCD Preparativa, como eluente a mistura de hexano- benzeno 1:1 foi
utilizada, pois apenas neste sistema de eluição houve a separação efetiva dos
compostos da mistura. A substância isolada e identificada por RMN1H, RMN13C foi o
ácido limonéxico (650 mg).
A sub-fração acetato de etila, RGM-A (2,12 g) foi fracionada por CC em sílica
gel (70-230 mesh) usando como eluente clorofórmio em gradiente de polaridade
crescente com metanol obtendo-se treze sub-frações.
As sub-frações F, G, H (130 mg) foram reunidas e cromatografadas por CC em
sílica gel com o intuito de isolar o composto majoritário detectado por meio de CCD.
O sistema de eluente utilizado foi hexano-acetona na proporção inicial 9:1. O
resultado obtido foram seis sub-frações (A-F), sendo que a sub-fração C (47 mg)
As sub-frações K, L, M, N (1,3 g) foram agrupadas e cromatografada por CC,
como suporte foi utilizado celulose e como eluentes utizou-se hexano, clorofórmio,
clorofórmio-acetato de etila (1:1), acetato de etila, acetato de etila-metanol (1:1) e
metanol.
36
Na sub-fração RGM-A não foi isolada nenhuma substância provavelmente
devido a mistura de compostos muito polares, o que requer técnicas específicas.
4.3.2 Extrato das raízes
As raízes (397,21 g) secas e moídas foram maceradas, por um período de 3
a 5 dias, com hexano e após com metanol, o que resultou nos extratos: hexano
(RRH, 4 g) MeOH (RRM, 20 g) respectivamente (Figura 3).
Maceração exaustiva a frio
Hexano Metanol
Partição líquido-líquido
Hexano CH2Cl2 ACOEt
CH2Cl2
Figura 3. Esquema ilustrativo do preparo extrato das Raízes de R. echinata e posterior obtenção das
frações.
4.3.2.1 Extrato hexano (RRH)
Raízes de R.
echinata
(397,21 g)
RRH
(4 g)
RRM
(20 g)
RRH- H (576 mg) RRM-H (6,3 g)
RRM-D (5,1 g)
RRH-A (2 g) RRM-A (2,6 g)
Resíduo aquoso
37
O extrato hexano das raízes de R. echinata (RRH, 4 g), foi fracionado por
partição líquido-líquido com hexano (RRH-H, 576 mg) e acetato de etila (RRH-A,
2 g).
A sub-fração de hexano, RRH-H (576 mg), foi cromatografada por CC (17 x 2
cm) usando-se como fase estacionária sílica-gel (70-230 mesh) e fase móvel
hexano e acetona de acordo com um gradiente de polaridade. Quatorze sub-frações
(A-N 366mg), foram obtidas. Por CCD observou-se que nas sub-frações C (37,1mg)
e D (76mg) havia sido isolado duas substâncias que revelavam de marrom intenso
ao reagir com anisaldeído sulfúrico, e portanto, de acordo com este perfil, diferente
das demais substâncias isoladas até o momento, o que foi confirmado após análise
por RMN1H e espectroscopia de massas. Com a análise do resultado destas duas
técnicas identificou-se os compostos fraxinelona e epóxifraxinelona respectivamente,
limonóides degradados. A sub-fração E (30 mg) foi purificada por CC (11 x 1 cm),
adsorvente sílica-gel (70-230 mesh) e eluente hexano/acetona 99:1 em gradiente de
polaridade crescente. Sete sub-frações foram obtidas (A-G 24 mg). Na sub-fração B
(3 mg) novamente foi isolado o epóxi-fraxinelona. Na sub-fração C (6 mg) o
composto fraxinelonona, também um limonóide degradado, foi isolado e identificado
por RMN1H.
A sub-fração de acetato de etila , RRH-A (2,12 g), foi semi-purificada por
cromatografia em coluna sob pressão, sílica-gel (230- 400 mesh) como fase móvel
e hexano e acetona como fase estacionária em polaridade crescente, o que resultou
em treze sub-frações (A-M 1,5 g). Na sub-fração F (34 mg) isolou-se o limonóide
degradado fraxinelona, identificado por comparação por CCD. Na fração H (147 mg)
estava presente novamente o epóxi-fraxinelona. A fração I (56 mg), por apresentar
um perfil em CCD intesessante foi cromatografada por CC, adsorvente sílica-gel (70-
230 mesh) e fase móvel hexano, acetona. Cinco sub-frações foram obtidas (A-E
31mg). Na sub-fração D (6 mg) o limonóide degradado fraxinelonona foi isolado
novamente.
Na literatura não há descrição da configuração absoluta do epóxi-fraxinelona,
o que já havia sido experimentado sem êxito por técnicas espectroscópicas usuais.
Tal determinação seria possível por difração de raios-X, para isto porém, precisava-
se de um monocristal. A primeira tentativa de obter o cristal foi reunir as sub-frações
H (147 mg) e D (76 mg) resultantes, respectivamente,de RRH-A e RRH-H e
cromatografá-las por CC com pressão, sílica-gel como adsorvente, e hexano e
38
acetona como fase móvel em gradiente de polaridade crescente. Com este
fracionamento vinte sub-frações (A-R 198 mg) foram obtidas. Na sub-fração G o
epóxi-fraxinelona foi isolado. Os cristais formados apresentaram-se como finas
agulhas, parecendo uma lã de vidro, impróprios para raios-X. Recorreu-se a
sucessivas recristalizações com diferentes misturas de solvente. Logrou-se êxito da
mistura de acetato de etila-acetona 1:1 seguido de algumas gotas de água. Por meio
da difração de raios-X foi possível determinar a configuração absoluta do
epóxifraxinelona.
4.3.2.2 Extrato metanol (RRM)
O extrato MeOH das raízes de R echinata (RRM, 20 g), previamente diluído
com MeOH/H2O, foi fracionado por partição líquido-líquido com hexano (RRM-H, 6,3
g), CH2Cl2 (RRM-D, 5,1 g), AcOEt (RRM-A, 2,6 g) restando a fração MeOH/H2O
(RRM-M). A fração hexano, RRM-H (6,3 g) foi fracionado por CC em sílica gel,
utilizando como eluente hexano-acetato de etila em polaridade crescente. Desta
cromatografia foram obtidas vinte e cinco sub-frações (A-Y 4,9 g). Na sub-fração F
(18 mg) houve a formação do ftalato ρ-dimetilftalato, provavelmente devido
impurezas existentes nos solventes utilizados. Na sub-fração H (111 mg) isolou-se
os triterpenos pentacíclicos em mistura isomultiflorenol e isobaurenol . As sub-
frações J e L (116 mg) foram unidas e purificadas por CC em sílica e como fase
móvel utilizou-se hexano-acetato em gradiente crescente de polaridade. Coletou-se
dez (A-J 96 mg) sub-frações, sendo que na A foi identificado o composto β-sitosterol,
também encontrado no caule e folhas
4.4 Ensaios de Toxicidade
4.4.1 Ensaio com Artemia salina
Após o preparo da água do mar sintética (Sera premium), (pH deve estar
entre 8-9) os ovos de Artemia salina são colocados para eclosão por um período de
48 horas em temperatura entre 24 e 26 °C. A solução estoque da amostra a ser
testada foi obtida pesando-se 8 mg e adicionou-se até 10% do volume final de
39
DMSO para facilitar a dissolução e então lentamente adicionou-se água do mar
sintética até completar 10 mL, a concentração final obtida é de 800 µg/mL. Quando
necessário, deixou-se alguns minutos no ultrassom para total dissolução da amostra.
As baterias com diversas concentrações dos extratos brutos (500 – 8 µg/mL) foram
preparadas da seguinte maneira: Pesou-se 8 mg de amostra e adicionou-se até 1ml
de DMSO (até 1% do volume final) para facilitar a dissolução do extrato e a seguir
adicionou-se lentamente água do mar sintética até completar um volume final de 10
mL. Desta solução estoque tomou-se em triplicata: 1250, 620, 310, 120, 60 e 20 µL
que correspondem respectivamente às concentrações finais de 500, 248, 124, 48,
24 e 8 µg/mL da amostra a ser testada, completou-se com água marinha para um
volume final de 2 mL.
Como controle positivo utilizou-se solução de dicromato de potássio nas
concentrações de: 400, 600 e 800 µg/mL. Para o preparo de tais concentrações,
pesou-se 16 mg de dicromato de potássio que foi dissolvido em 20 mL de água
marinha sintética. Desta solução estoque tomou-se em triplicata: 2,0, 1,5 e 1,0 ml e
completou-se quando necessário o volume para 2 mL com água do mar sintética,
resultando em soluções com as respectivas concentrações de 800,600 e 400 µg/mL.
Como controle negativo utilizou-se 2 mL de água do mar sintética.
Adicionou-se, com auxílio de uma micropipeta, de 8-10 micro-crustáceos por
experimento. Para facilitar a micropipetação das larvas uma luminária fluorescente
foi utilizada, pois houve uma migração das larvas para o local onde havia incidência
de luz. Após 24 horas a uma temperatura entre 24 a 26°C contou-se o número total
x número de mortos para cada experimento (em triplicata) (SAM, 1993)
4.4.2 Bioensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens
A toxicidade dos compostos sobre fromigas cortadeiras Atta sexdens
rubropilosa foi determinada por bioensaio de ingestão de acordo com protocolo
estabelecido e descrito por Bueno et al (1997).
Cada tratamento constitui de 50 formigas distribuídas em 5 placas de Petri. As
formigas foram isoladas de seus ninhos e alimentadas com uma dieta artificial. As
formigas do tratamento receberam uma dieta adicionada com epóxifraxinelona e/ou
40
ácido limonéxico, até uma concentração de 200 µg. As formigas do tratamento
controle receberam uma dieta sem os compostos.
Durante 25 dias o número de formigas mortas em cada placa foi contada e as
sobreviventes eram alimentadas com mais uma porção da dieta. A curva de
sobrevivência foi estimada para cada tratamento e calculada a longevidade
mediana.
4.5 Avaliação Microbiológico
4.5.1 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para bactérias
Os valores da CIM foram determinados conforme descrito por NCCLS, 1993.
Em frascos de vidro de 5 mL, os compostos foram dissolvidos em solução DMSO e
água 1:1. Após dissolução, os compostos foram adicionados em séries de dez
frascos, em diferentes concentrações juntamente com 1mL do meio de cultura ágar
Mueller-Hinton. Após homogeneização da mistura e solidificação dos meios de
cultura, os microrganismos previamente ativados foram inoculados nas séries
correspondentes, sendo então incubados a 35°C por 18 a 24 horas. Após o período
de incubação foram realizadas leituras da concentração inibitória mínima através da
verificação do crescimento microbiano (BARON e FINEGOLD 1990 ). A CIM foi
determinada como a mais baixa concentração do composto teste que inibiu
completamente o crescimento do microrganismo.
Durante os testes foram realizados controles com solventes utilizados na
solubilização dos compostos, a fim de se verificar seu efeito sobre os
microrganismos testados.
Os testes foram realizados em duplicata. Soluções estoques do controle
negativo foram separados com solvente. Suspensões estoques do inóculo
bacteriano, foram ajustadas para 1,5 x106 UFC/mL, através de leitura em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 530 nm, transmitância de 80%.
Como branco utilizou-se salina estéril (T=100%).
4.5.2 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para fungos
41
Em frascos de vidro de 5 mL, os compostos foram dissolvidos em DMSO e
água 1:1. Após dissolução, os compostos foram adicionados em séries de dez
frascos, em diferentes concentrações juntamente com 1mL do meio de cultura ágar
Sabouraud. Após homogeneização da mistura e solidificação dos meios de cultura,
os microrganismos previamente ativados foram inoculados nas séries
correspondentes, sendo então incubados a temperatura ambiente por 7-15 dias para
fungos filamentosos e 24-48 horas para fungos leveduriformes.
Afim de ajustar o inóculo, foi medida a transmitância da solução (95%),
lendo-se em comprimento de onda de 610 nm em espectrofotômetro. Como branco,
foi utilizado água destilada estéril ajustando-se a transmitância para 100%. Também
foi realizado a contagem de microrganismos em câmara de Neubauer. Obteve-se a
concentração desejada entre 10 5 e 10 6 células. Como controle positivo utilizou-se
um tubo contendo meio de cultura e solvente e como controle negativo meio de
cultura e 30 µg/mL.
Após solidificação do meio de cultivo, foi inoculado o fungo com alça calibrada
estéril (5 µL), sobre a superfície do ágar. Os tubos foram incubados a 28ºC o tempo
necessário de acordo com o microorganismo testado. A leitura dos resultados foi
válida quando houve crescimento do fungo no controle positivo e não no negativo.
4.6 Avaliação da atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico
Em todos os modelos no ensaio para avaliação da atividade antinociceptiva
foram utilizados camundongos “Swiss” machos pesando entre 25 a 35 g Os animais
provenientes do Biotério da UNIVALI, foram mantidos à temperatura controlada
(entre 20 a 23 ° C), tratados com água e ração ad libitum. Antes da realização do
experimento os animais foram mantidos por 4 horas ou mais no laboratório para
adaptação. Os procedimentos foram realizados de acordo com orientações
específicas referente aos cuidados com animais de laboratório e considerações
éticas para investigações da dor experimental em animais conscientes
(ZIMMERMANN, 1983).
4.6.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético
42
Embora o modelo do ácido acético seja simples e pouco específico permite
avaliar a atividade antinociceptiva de várias substâncias que atuam tanto em nível
central quanto periférico. A resposta nociceptiva foi induzida pela injeção
intraperitonial de ácido acético (0,6%) diluído em solução salina (0,9%). As
contorções abdominais, observadas durante um período de 20 ou 30 minutos,
consistem na contração da musculatura abdominal juntamente com a extensão de
uma das patas posteriores. O grupo controle recebeu somente veículo salina
(0,9%), utilizado para dissolver o composto Após injeção do ácido acético os animais
foram transferidos sob funil de vidro e o número de contorções foi quantificado
cumulativamente durante um período de 20 minutos.(COLLIER et al., 1968).
4.6.2 Modelo de dor induzida pela formalina
Neste modelo o procedimento adotado foi semelhante ao descrito por
HUNSKAAR E HOLE (1987). Três grupos de 6 animais cada foram tratados com
ácido limonéxico pela via i.p. ( 10, 30 e 60 mg/Kg) diluído com salina e, após 30
minutos, receberam 20 µl de formalina a 2,5% (0,92% de formaldeído) na região
plantar da pata posterior esquerda. No grupo de animais controle injetou-se solução
de salina ao invés do composto teste.
Após injeção de formalina, os animais foram colocados, dois a dois, sob um
funil de vidro invertido, próximo a espelhos para facilitar a observação. O tempo em
que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina foi
cronometrado, sendo este período considerado como indicativo de dor. Com este
modelo há possibilidade de evidenciar duas fases da dor. A primeira fase, ocorre
durante os 5 minutos após a injeção da formalina corresponde à dor neurogênica, e
a segunda fase, ocorre entre 15 a 30 minutos após injeção da formalina corresponde
à dor inflamatória.
4.6.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina
SAKURADA (1992), propôs este modelo para investigar a possível ação
modulatória de compostos, em estudo sobre a dor neurogênica induzida pela
43
capsaicina. Ao injetar capsaicina ocorre estimulação direta de receptores específicos
localizados nos neurônios nociceptivos, causando a liberação de vários
neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa, incluindo principalmente as
taquicininas. (SAKURADA, 1996)
Durante este procedimento cada animal recebeu 20 µl de solução de
capsaicina (1,6 µg/pata) na pata posterior direita, sendo que o tempo que o animal
permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com capsaicina foi
cronometrado por um período de 5 minutos e considerado como indicativo de dor
(SAKURADA, 1992) Grupos de 6 animais cada foram pré-tratados com ácido
limonéxico pela via i.p. ( 10, 30 e 60 mg/Kg) diluído com salina 30 minutos antes da
injeção de capsaicina. O grupo controle recebeu somente solução salina (0,9%),
veículo utilizado para dissolver o composto.
4.6.4 Modelo de dor induzida pelo glutamato
Modelo este proposto por Beirith et al. (1998) é aplicado para o estudo de
substâncias que atuam sobre o sistema glutamatérgico envolvido na transmissão
nociceptiva. A injeção de glutamato induz a estimulação direta dos neurônios
nociceptivos, causando a liberação de vários mediadores inflamatórios e
neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa.
Cada animal recebeu 20 µl de solução de glutamato (30 mmol/pata), injetada
na região intraplantar da pata posterior direta, imediatamente foram colocados , dois
a dois, sob funil de vidro transparente. O tempo que o animal lambeu ou mordeu a
pata injetada foi cronometrado durante 15 minutos. Este tempo é considerado
indicativo de dor. Grupos de 6 animais cada foram pré-tratados com ácido
limonéxico pela via i.p. (10, 30 e 60 mg/Kg) diluído com solução salina 30 minutos,
antes da injeção de glutamato. O grupo controle recebeu somente solução salina
(0,9%), veículo utilizado para dissolver o composto (BEIRITH et al., 1998)..
4.7 Análise estatística dos testes in vivo
44
Para o screening com Artemia salina a obtenção do valor de DL50% foi
através da análise estatística (probitos) do n° de micro-crustáceos mortos em cada
experimento e o intervalo de confiança 95%.
Para o ensaio com formigas cortadeiras teste estatístico utilizado para análise
dos dados foi o Log rank-test (α= 0,05)
Para analgesia os resultados foram apresentados como a média padrão mais
ou menos erro padrão para cada grupo de animais, exceto as DI 50s (dose do ácido
limonéxico que reduz a resposta em 50% em relação ao grupo controle) que foram
apresentadas como médias geométricas acompanhadas de seus respectivos limites
de confiança, em nível de 95%.As análises estatísticas foram realizadas por meio de
análise da variância seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se método
de Dunnet. As DI 50s foram estimadas a partir de experimentos individuais utilizando-
se o método de regressão linear através do programa GraphPad (Prism).
45
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Triterpenos em mistura
Triterpenos são substâncias abundantes em todos os vegetais e portanto
comumente encontrados em estudos fitoquímicos.
De R. echinata já foram isolados por Biavatti (2001) dos caules e fohas o
esqualeno (4), O esteróide β- sitosterol (6) e três triterpenos pentacíclios, pouco
comuns em Rutaceae, friedelina (5), isomultiflorenol (7) e isobaurenol (8), estes dois
últimos em mistura.
Neste trabalho os triterpenos pentacíclicos isolados em mistura da fração
metanólica dos galhos e das raízes de R. echinata foram o isomultiflorenol (3β-
Hidroxi-D:C-friedoolean-8-eno) (7) e o isobaurenol (3β- Hidroxi-D:C-friedours-8-eno)
(8), substâncias pouco comuns em espécies de Rutaceae, sendo mais comuns em
espécies de Celastraceae. A identificação destes triterpenos foi realizada pela
comparação dos dados espectrais de RMN 1H obtidos com a literatura, e ainda por
CCD com padrão conhecido
O espectro de RMN 1H (figura 4) da mistura é caracterizado pela presença de
um duplo-dubleto em δ 3,23 (J= 11,6 e 5,2 Hz), referente H-3α além da presença de
doze sinais para metilas, 8 singletes e 2 dubletes, na região 0,8 a 1,08 ppm
podendo-se observar assim que o espectro refere-se a uma mistura, apesar da
condição cristalina (agulhas brancas) da amostra que apresenta apenas uma
mancha em CCD.
4
210
14
17
19
22
30
27
28
26
25
2423
HO6
8
9
12
29
7
29
12
9
8
6HO
23 24
25
26
28
27
30
22
19
17
14
102
4
8
8 7
46
Figura 4: Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) da mistura de triterpenos isomultiflorenol e
isobauerenol (7 e 8).
Maiores informações sobre a mistura dos triterpenos pentacíclicos foram
fornecidas pelos espectros de RMN 13C BBD e DEPT 135 realizados anteriormente
(BIAVATTI et al., 2001).
Na literatura pesquisada, nenhuma referência de atividade biológica foi
encontrada para estes triterpenos.
5.2 Alcalóides
47
Através de CCD com padrão conhecido e Dragendorff como revelador foi
verificado que na fração metanólica dos galhos estavam presentes os alcalóides
furoquinolínicos maculina (21) e flindersiamina, (22), o primeiro também encontrado
nos caules e folhas e o segundo somente nos caules de R. echinata. Além de serem
amplamente isoladas de Rutaceae os Rfs das amostras e dos padrões foram muito
próximos, assim como a coloração das manchas do padrão e da amostra após
revelação. Os espectros de RMN 1H obtidos confirmaram a proposta.
Os alcalóides maculina (21) e flindersiamina (22) apresentaram boa atividade
antifúngica quando avaliados contra o fungo Leucoagaricus gongylophorus, obtendo-
se uma inibição de 60% e 80% respectivamente (BIAVATTI, 2002). Apresentaram
ainda, fraca atividade citotóxica quando testados em células tumorais ovarianas
(PRAKASH, et al., 2003).
O alcalóide flindersiamina vem sendo isolado em espécies de Rutaceae
desde 1957 (OKOGUN e AYAFOR, 1977).
O alcalóide alquil-quinolínico, 2-n-nonil-4 quinolona (25), estava também
presente na fração metanólica dos galhos, e já foi isolado das folhas.
Quinolonas contendo longas cadeias alquílicas em C-2 foram primeiramente
isoladas de microrganismos (Pseudomonas, sendo também chamados de
pseudanos (REISCH et al., 1975). Também já foram isolados em vários gêneros de
Rutaceae, principalmente Evodia (TANG et al., 1996), Boronia (SARKER et al.,
1995), Ruta (GRUNDON e OKELY, 1979) e Esenbeckia (GUILHON et al., 1994).
Algumas espécies do primeiro gênero são utilizadas na medicina tradicional chinesa
e os alcalóides isolados demonstraram atividade inibitória contra a bactéria
Helicobacter pilori (RUO et al., 1999 e HAMASAKI et al., 2000). Recentemente, foi
testada a atividade antimicobactericida de alcalóides quinolonicos de Evodia, sendo
bastante promissores (ADAMS et al., 2005)
N O
OMe
O
O
OMe
87
65
8a
4a4
8b
3a
2
3
27
N O
OMe
O
O8
7
65
8a
4a4
8b
3a
2
3
2621 22
48
N
O
H
2
3
5
44a6
7
88a
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9'
30
O alcalóide 2-n-nonil-4-quinolona (25) apresentou sinais para cadeia alquílica
saturada pela presença de metila terminal Me- 9’ (δ 0,84 t J = 7Hz), hidrogênios
metilênicos em δ 1,25 sl, para H- 3’, H- 4’, H- 5’, H-6’, H-7’, H-8’, δ 2,69 t para H-1’
(J= 8,0 Hz) e δ1,65 quinteto para H-2’ (J = 7,5 Hz); além dos sinais para hidrogênios
aromáticos do núcleo quinolínico não substituído na região de δ 8,36 - 7,72 e para
hidrogênio H-3 de dupla conjugada trissubstituída em δ 6,22 s (figura 10). Os dados
espectrais foram comparados com descritos na literatura (KAN-FAN et al., 1970 e
GRUNDON E OKELEY, 1979). O tamanho da cadeia alquíca (formada por nopve
carbonos) ligada ao C2 foi determinado por espectroscopia de massas.
Atividade antifúngica contra o fungo L. gongylophorus com 50% de inibição
também foi obtida com o alcalóide 2-n-nonil-4-quinolona (BIAVATTI et al., 2002).
Nenhuma outra atividade foi encontrada na literatura pesquisada.
25
49
Figura 5 . Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3) do alcalóide 2-n- Nonil-4-quinolona (25)
5.3 Limonóides
Das raízes de R. echinata foram isolados o ácido limonéxico (13) que
diferencia-se da limonina (12) apenas pela oxidação do anel furano da molécula,
está também presente no extrato metanólico das folhas.
O ácido limonéxico já foi isolado de Dictamnus angustifolius (WU et al., 1999),
uma planta tradicional da China, das raízes de Tetradium trichotomum (QUADER et
al., 1990) e ainda é um dos principais constituintes dos frutos de Citrus nippokoreana
(CONOLLY et al., 2001). Apesar de ser encontrado desde 1948 (KONDO et al.,
1985), nenhuma referência significante de bioatividade foi encontrada para este
limonóide.
50
O
OO
H O
O
O
O
O
O
HO
H
3
2
1
5
12
14
17
20
21
22
23
18
19
30
28 29
9
7
17
No espectro de RMN 1H (figura 6 e tabela 2) observa-se singletos para o anel
furano em δ 6,24, H-22 e δ 6,01, H-21. Estes sinais estão de acordo e indicam um
sistema diidrofuranona com hidroxila em C-21. Isto é confirmado pelo espectro de
RMN 13C (figura 7) o qual apresenta ressonâncias em δ 97,3, C- 21 e δ121,7, C-22 e
em δ 168,2, C-23 e δ162,6 C-20 indicando a presença de 2 carbonos quaternários
O
OO
H O
O
O
O
O
O
HO
H
3
2
1
5
12
14
17
20
21
22
23
18
19
30
28 29
9
7
Figura 6: Espectro de RMN 1H (400 MHz) do ácido limonéxico (13) (CDCl3 + DMSO- d6)
13
51
Figura 7: Espectro de RMN 13C BBD para o ácido limonéxico (100 MHz, CDCl3 + DMSO-d6). Tabela 02: Dados de RMN 1H (400 MHz, CDCl3 + DMSO-d6) do ácido limonéxico (13) isolado em comparação com a literatura.
Ácido limonéxico (13) ( 400 MHz CDCl3 + DMSO- d6)
Ácido limonéxico (NG et al., 1987)
(250 MHz, DMSO- d6)
H
δ (ppm), J (Hz) δ (ppm), J (Hz) 1 4,14 sl 4,06 d (3,6) 2 2
2,90 dd (16,7; 3,6) 2,79 d (16,9)
2,72 d (16,1) 2,60 dd (16,1, 3,6)
5 2,34 dd (15,9, 2,8) 2,27 dd (15,0, 3,0) 6ax 6eq
3,01 t (15,0) 2,41dd (14,1; 3,0)
3,11 t (15,0) 2,53-2,41 m
9 2,54 dd (10,5; 3.7) 2,53-2,41 m 11 1,95 m 12 1,70 m 15 3,87 s
4,10 s
17 5,32 s 5,24 s 18 1,17 19 4,49 d (13,0)
4,86 d (13,0) 4,92/4,47 d (13,0)
21 6,01 s 6,08 s 22 6,24 s 6,28 s 28 1,29 s 4xMe 1,19, 1,15, 1,01, 1,01 29 1,16 s 30 1,04 s
52
5.3.1 Limonóides Degradados
Das raízes de R.echinata isolou-se os limonóides degradados fraxinelona
(28), fraxinelonona (29) e epóxifraxinelona (15), sendo os dois primeiros são inéditos
na espécie pesquisada., já o último é também encontrado nas folhas e caules.
Existem apenas uma dezena de limonóides degradados isolados
principalmente de Rutaceae principalmente (BOUSTIÉ et al., 1995) e também de
Meliaceae (NAKATANI et al., 1998), os quais mantém grande parte da atividade
biológica inicial dos limonóides; essencialmente porque mantém os anéis C-D e
também o anel furano intacto, sendo estes parte essencial para algumas ações
biológicas, mais pronunciada a atividade inseticida.
O
O
OO
As estruturas dos compostos 28 e 29 foram elucidadas baseado-se nos dados
espectrais de RMN 1H e massas, dados estes que estão de acordo com a literatura
(NAKATANI et al., 1998; LIU et al., 2002)
FRAXINELONA (28)
A fraxinelona é um produto natural com um anel furano β-substituído,
registrada primariamente na família Rutaceae (Dictamnus albus, D. dasycarpus ) e,
posteriormente na família Meliaceae. A fraxinelona apresenta várias atividades
biológicas, dentre as quais podemos citar sua atividade anti-agregação plaquetária
significante, vaso relaxante e antifertilizante (NAKATANI et al., 1998)
O
O
O
O
8
9
11
13
15
17
30
18
21
2023
12
20O
O
O
20a28 29
15
53
O espectro de RMN1 H (figura 8) apresentou dois sinais de metilas em δ 0,85
e 2,13 correspondentes à Me –18 e Me-30, respectivamente; os sinais dos
hidrogênios do anel furânico como um duplo dubleto em δ 6,35 atribuído a H-22, um
tripleto em δ 7,44, atribuído a H-23 e um duplo dubleto em δ 7,47 atribuído a H-21.
O espectro ainda apresentou um singleto largo em δ 4,88 (H-17). Dados de RMN 1H
foram concordantes com a literatura (OKAMURA et al., 1997; BLAISE E
WINTERNITZ, 1985)
O espectro de massas (figura 9) para fraxinelona (28) obtido por impacto
eletrônico [M+]= 232 (C14H16O3) mostra o sinal 136, formado principalmente pela
expulsão consecutiva do aldeído-3-furano [M-96], formando assim o pico base
(100%). Observa-se ainda a saída de CO, formando o fragmento m/z 108. A saída
de metila (CH3) dos fragmentos anteriores é evidenciada pela formação do
fragmento m/z 93.
Figura 08 - Espectro RMN 1H (400 MHz, CDCl3 )do limonóide degradado Fraxinelona (28)
54
Figura 09: Espectro de massas da fraxinelona (28) obtido por impacto eletrônico
FRAXINELONONA (29)
O espectro de RMN 1H (figura 10) apresentou singletos em δ 1,09 e 2,18
correspondentes à Me- 18 e Me- 30, respectivamente. Os sinais dos hidrogênios do
anel furano aparecem como duplo dubleto em δ 6,36 atribuído a H-22, multipletos
em δ 7,49 atribuído a H- 23 e em δ 7,53 atribuído a H-21. O espectro ainda
apresentou um singleto largo em δ 5,12 (H-17) (tabela 03).
O espectro de massas (figura 11) obtido por impacto eletrônico apresenta o
pico do íon molecular [M+]= 246 (C14H14O4) compatível e o pico base em 150
formado principalmente pela expulsão consecutiva do aldeído-3-furano [M-96].
Observa-se ainda a saída de CO, formando o fragmento m/z 122. A saída de metila
(CH3) dos fragmentos anteriores é evidenciada pela formação do fragmento m/z
107.
O
O
O
20a28
55
Figura 10: Espectro RMN 1H (200 MHz, CDCl3) do limonóide degradado Fraxinelonona (29)
O
O
OO
29
56
Figura 11: Espectro de massas da fraxinelonona (29) obtido por impacto eletrônico
Tabela 03: Dados de RMN 1H (200 MHz, CDCl3 ) da fraxinelonona isolada em
comparação com a literatura.
H
Fraxinelonona (29) (200 MHz, CDCl3)
δ (ppm), J (Hz)
Fraxinelonona (OKAMURA et al., 1997; BLAISE E WINTERNITZ, 1985) (400 MHz, CD3OD)
δ (ppm), J (Hz)
11 2,64 m 2,70 ddd (5,5, 14,3, 18,3)
12 2,10 m 2,53 ddd (2,2, 5,1, 18,3)
17 5,12 s 5,24 s
21 7,53 m 7,60 s
22 6,36 dd (2,0, 0,92) 6,48 d (1,1)
23 7,49 m 7,57 dd (1,5, 1,8)
2,22 ddd (5,1, 13,0 14,3)
2,02 ddd (2,2, 5,5, 13,0)
Me- 18 1,09 s 1,07 s
Me- 30 2,18 s 2,09 s
EPÓXIFRAXINELONA (15)
O espectro de RMN 1H com poucos sinais, mostrou a presença de metilas
terciárias (singletes) em δ 0,89 (Me-18), e δ 1,60 (Me-30), de um grupo furano [δ
57
7,48 m, 7,47 m e � 6,35 m] e um singleto para H-17 (δ 5,19) (FIGURA 12). Também
confirmou-se o isolamento do epóxifraxinelona ao realizar uma CCD com padrão.
Figura 12: Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3 )do limonóide degradado Epóxifraxinelona (15)
A
O
O
O
O
8
9
11
13
15
17
30
18
21
2023
12
2015
58
A principal diferença observada entre fraxinelona (28) , fraxinelonona (29) e
epóxifraxinelona (15) pode ser verificada no espectro de RMN 13C para o
epóxifraxinelona, onde há presença de sinais para epóxi quaternário (δ 66,1 e 65,7)
ao invés de C de dupla ligação como para as duas primeiras substâncias. Para
fraxinelona cita-se os valores de δ 127,2 e 148,2 (BIAVATTI, 2001).
Há portanto neste limonóide degradado um grupamento epóxi ligado ao C8-
C14. Porém os dados espectrais publicados (BIAVATTI et al., 2001) em
concordância com os encontrados não fornecem clara evidência da configuração
espacial deste grupo. Em tentativa para confirmar a conformação espacial do grupo
epóxi Biavatti (2001) realizou nOe diferencial, mas os sinais foram sobrepostos,
frustrando conclusões precisas. Para esclarecer e confirmar a posição do grupo
epóxi uma análise de raios-X foi realizada (figura 13).
Figura 13: Projeção ORTEP 3 da epóxifraxinelona com mumeração cristalográfica. Elipsóides dos
átomos não hidrogenados com 50% de probabilidade.
Um monocristal de epóxi-fraxinelona foi obtido por recristalização seguido de
um processo de melhoramento do cristal. A recristalização envolveu a dissolução do
material em quantidade adequada de uma mistura de acetato de etila e acetona e
gotas de água. Os monocristais melhores foram selecionados e analisados por
difração de raios-X que estabeleceu indubitavelmente a estrutura do
epóxifraxinelona.
59
A figura 13 mostra uma projeção Ortep (FARRUGIA 1997) para
epóxifraxinelona. Este estudo mostra que a conformação molecular de
epóxifraxinelona é fixada pela presença de três principais interações
intramoleculares e intermoleculares (tabela 4) (BIAVATTI et al., 2005).
Tabela 04: Interações geométricas intramolecular e intermolecular (Ǻ) do
epóxifraxinelona
D-H....A D-H D.....A H......A D-H.......A Interações Intramoleculares
C8-H8A...O2 1.03(2) 2.909(2) 2.66(2) 93(1)
C14-H14B...O2 0.99(2) 2.980(2) 2.74(2) 94(1)
C11-H11B...O3 0.98(2) 3.246(2) 2.50(2) 131(1)
Interações Intermoleculares
C4-H4…O3i 0.93(2) 3.140(2) 2.35(2) 142(1)
C9-H9a…O2i 1.00(2) 3.309(2) 2.54(2) 133(1)
C5-H5…O3i 1.03(2) 3.546(2) 2.70(2) 139(1)
Códigos simétricos : (i) -y+1,+x,+z+1/4
Estes estudos evidenciaram que a configuração da metila 30 no limonóide
degradado é a mesma que a da limonina, sustentando a proposta de degradação
apresentada na figura 14.
Ainda o espectro de massas [M+248] (figura 15) da epóxifraxinelona
apresenta como fragmentos principais em m/z 161 (60), 137 (100), 124 (50).
60
O
O
O
O
O
O
O
H
OH
O
O
OO-co2
O
O
OH
O
O
O
O
O
OO
O
O
OO
oxidação isomerização
[O]
[O]fraxinelona
epoxifraxinelona
fraxinelonona
Figura 14: Formação dos limonóides degradados
Figura 15: Espectro de massas da epóxifraxinelona (15) obtido por impacto eletrônico
61
5.4 Ensaio de citoxicidade com Artemia salina
No ensaio de citotoxicidade com Artemia salina os extratos, sub-frações e
compostos isolados que foram analisados, não apresentaram atividade sobre este
micro- crustáceo (tabela 05), ou seja, não foram letais. Apresentaram valores de
DL50 maiores que 1000µg/ mL. Segundo Meyer et al., (1982) considera-se que um
composto é bioativo neste modelo quando encontra-se valores de DL50 menores que
1000µg/ mL. Como controle positivo, 100% de letalidade, utilizou-se o dicromato de
potássio e água marinha como controle negativo onde não houve letalidade;.
Tabela 05: Efeitos de extratos, sub-frações e compostos isolados de Raulinoa
echinata.no screening de citotoxidade em Artemia salina.
AMOSTRA DL50 (µg/mL)
RGM > 1000
RGM-H > 1000
Isomultiflorenol/ isobaurenol > 1000
RGM-D > 1000
Maculina,Flindersiamina,
2-n-Nonil-4-quinolona
> 1000
RRH > 1000
Epóxifraxinelona > 1000
Fraxinelonona > 1000
Fraxinelona > 1000
Acido limonéxico > 1000
A investigação da toxicidade de substâncias bioativas isoladas de plantas
deve ser viável, de fácil execução e que não necessite de uma grande infra-
estrutura, pois muitos laboratórios são desprovidos de tais condições. Animais,
cultura celular, avaliação de sistemas bioquímicos podem ser utilizados, porém
requerem laboratórios adequadamente equipados (CAVALCANTE et al., 2000).
O screening com Artemia salina é barato, não é complicado de ser
estabelecido e simples de executar, não requer equipamentos especiais ou técnicas
assépticas, e pequenas quantidades de substâncias são suficientes (micro-escala).
62
Por apresentar sensibilidade a substâncias tóxicas é utilizado para
biomonitorar o isolamento de compostos oriundos de plantas (HARTL E HUMPF,
2000). Este ensaio fornece informações para determinar a toxicidade de produtos
naturais e químicos, também fornece indícios de uma possível correlação com
atividade anti-tumoral e anti-Trypanossoma cruzi (CAVALCANTE et al., 2000;
SANTOS PIMENTA et al., 2003; MAcLAUGHILIN, 1991; ZANI et al., 1995).
Com tal embasamento da literatura sugere-se que os extratos, sub-frações e
compostos isolados testados no ensaio com Artemia salina não apresentem
citoxicidade, e portanto, é possível que não sejam dotados de atividade anti-tumoral
e anti Trypanossoma cruzi. Ainda sugere-se uma suposta ausência de toxidade
levando-se em conta o resultado obtido por PARRA et al., (2001) em seu
experimento, no qual, para determinação de valores de DL50 para 20 extratos de
plantas realizou um estudo de toxicidade em que comparou os resultados obtidos no
ensaio com Artemia salina e entre o ensaio com ratos. Uma boa correlação foi
verificada entre as DL50 obtidas nos testes in vivo e in vitro (PARRA et al., 2001).
5.5 Ensaio com formigas Atta sexdens
No ensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens testou-se dois compostos
isolados de Raulinoa echinata, o ácido limonéxico e o epóxifraxinelona, ambos
limonóides. De acordo com as curvas de sobrevivência mediana (figura 16), o
epóxifraxinelona não mostrou ser tóxico contra as formigas, já o ácido limonéxico
reduziu significativamente o tempo de vida das formigas (11 dias) quando
comparado com ao grupo controle (22 dias).
63
Figura 16: Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, Atta sexdens rubropilosa frente aos
compostos epóxifraxinelona (painel A) e ácido limonéxico (painel B).
As saúvas, formigas cortadeiras Atta spp, pertencem à tribo Attini, subfamília
Myrmicinae, família Formicidae compreendem cerca de 215 espécies dentro de 13
gêneros (BUENO, 2003). Elas são consideradas causadoras de grandes danos
econômicos, estimam-se perdas da ordem de $1 bilhão/ano, devido principalmente
ao desfolhamento que causam nas plantas, onde cortam e transportam fragmentos
Controle Epóxi-fraxinelona
A
B
64
vegetais para seus ninhos subterrâneos, onde cultivam o fungo Leucoagaricus
gongylophoros, do qual se alimentam, por este motivo também são chamadas
cultivadoras de fungo Elas distribuem-se mundialmente do norte do Texas (EUA) até
a Argentina central. O Brasil é o país que possui maior número de espécies de
formigas cortadeiras, compreendendo 200 espécies do gênero Atta (BUENO, 2003).
Um formigueiro contém várias entradas e pode atingir uma área de 200 m2 e 25
metros de profundidade, onde vivem cerca de 5-8 milhões de formigas.
Tradicionalmente, os inseticidas mais utilizados têm sido os organoclorados
e/ou fosforados. Estes inseticidas têm amplo espectro de ação e exterminam
indiscriminadamente insetos considerados pestes como também aqueles benéficos
ao homem. Além disso, os insetos podem adquirir resistência a estes inseticidas,
significando a aplicação de maiores quantidades, causando danos ecológicos e
poluição do meio ambiente (FERREIRA et al., 2001). Os inseticidas derivados de
produtos naturais já foram muito utilizados até 1940, sendo principalmente utilizado
o alcalóide nicotina extraído das folhas de Nicotiana tabacum e Nicotiana rustica
(Solanaceae) associado a nornicotina e anabasina. O surgimento dos inseticidas
sintéticos desenvolvidos a partir da II Guerra Mundial acabou substituindo por
completo os agentes naturais por serem muito mais potentes.
É sabido que os limonóides, isolados apenas de plantas pertencentes à
família Rutaceae, Meliaceae e Cneoraceae apresentam atividade em insetos seja
interferindo no crescimento, seja através da inibição de alimentação (CONNOLY et
al., 1973). Cita-se como exemplo de limonóide com ação inseticida o azadirachtina,
extraído da A. indica . Entre os limonóides mais comuns na família Rutaceae estão a
limonina e o obacunona, cuja atividades contra insetos estão sendo avaliadas.
(FERREIRA et al., 2001).
Um grande desafio tem sido encontrar um produto inseticida contra as
formigas cortadeiras que não cause danos ao ser humano e ao meio ambiente,
neste contexto é interessante avaliar produtos de origem natural no combate a este
inseto. O resultado obtido com o ácido limonéxico no ensaio com formigas foi
significativo, pois inibiu a longevidade destes insetos, se comparado ao controle, em
11 dias. Sugere-se que este limonóide, isolado de Raulinoa echinata, exerça uma
ação inseticida, talvez por apresentar uma atividade fagoinibidora, ou seja, inibe a
alimentação, mas não mata diretamente, portanto não apresentaria uma ação tóxica
sobre as formigas. Esta possível ação fagoinibidora seria mais plausível uma vez
65
que no ensaio com Artemia salina o ácido limonéxico não apresentou-se tóxico,
importante considerar que são modelos distintos, portanto para confirmação ou
refutação desta hipótese são necessários mais estudos.
5.6 Ensaio microbiológico
Algumas frações e sub-frações de Raulinoa echinata foram testadas
microbiologicamente com bactérias gram-positivas, bactérias gram-negativas e com
o fungo Cândida albicans. Conforme exposto na tabela 06 , os resultados obtidos
foram superiores a 1000µg/mL.
Tabela 06: Resultados de Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) de frações e sub-
frações de Raulinoa echinata através da diluição em ágar
Fração/ Sub-fração
B.c S.s S.a St.a E.co E.c P.m Ps.a S.t Ca
RGM >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
RGM-H >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
RGM-A >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
RGM-D >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
RRH >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
RRM >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
Bactérias Gram-positivas: Bacilus cereus (B.c), Staphylococus aureus (S.a), S. saprophyticcus (S.s), Streptococcus agalactie (St.a), Bactérias Gram-negativas Enterobacter cloacae (E.co) , Escherichia coli (E.c), Proteus mirabilis (P.m) Pseudomonas aeruginosa (Os.a) Salmonella tiphymurium (S.T), Fungo: Candida albicans
O homem e os microorganismos partilham uma vida em comum que se perde
na sombra do tempo, e certamente, desde a pré-história provocam doenças ao
homem. Entretanto as causas dessas doenças só começaram a ser descobertas
séculos atrás, a partir de 1878, graças aos trabalhos de Pasteur e Koch, que
demonstraram a origem infecciosa de várias enfermidades do homem e animais
(TAVARES, 1999; MIMS et al., 1999).
As bactérias são os mais simples organismos encontrados na maioria dos
ambientes naturais. Elas são células esféricas ou em forma de bastonetes curtos
66
com tamanhos variados, alcançando à vezes micrômetros linearmente. A célula
bacteriana apresenta várias estruturas, algumas das quais estão presentes apenas
em determinadas espécies, enquanto outras são essenciais, e portanto encontradas
em todas as bactérias (MIMS et al., 1999; SCHAECHTER et al., 2002).
A manutenção da forma bacteriana (bacilo, coco, etc.) é devido a presença da
parede celular bacteriana. De acordo com a constituição da parede, as bactérias
podem ser divididas em dois grandes grups: Gram-negativas e Gram-positivas. As
diferenças entre esses dois grupos residem principalmente nas suas propriedade de
permeabilidade e nos componentes de superfície. As principais diferenças reveladas
pela coloração de Gram estão relacionadas a presença de uma membrana externa
nas bactérias Gram-negativas e de uma espessa camada de peptideoglicano nas
bactérias gram- positivas (SCHAECHTER et al., 2002).
Os fungos podem causar no homem doenças denominadas micoses, das
mais variadas classificações. As micoses ocupam lugar de destaque na patologia
tropical. O termo micose foi empregado pela primeira vez por Virchow, em 1856
(TRABULSI et al., 1999). Vários dos fungos que podem causar micoses viem em
associação com o homem como comensais ou estão presentes no ambiente. Nos
últimos anos houve um aumento crescente das infecções fúngicas sistêmicas, não
apenas por fungos patogênicos conhecidos, mas também por fungos considerados
inócuos (RANG E DALE, 2004; MIMS et al., 1999).
Diversos fungos, presentes no meio ambiente ou integrantes da flora normal,
podem em determinadas situações passarem de saprófitos a patogênicos,
provocando quadros clínicos variáveis, desde processos febris benignos, a
septicemias algumas vezes fatais (LACAZ et al., 2002).
Dentre as principais patologias fúngicas oportunistas pode-se citar entre
outras a candidíase que são infecções provocadas por leveduras do gênero
Candida, principalmente Cândida albicans. A maior parte dessas infecções são de
origem endógena, ou seja são causadas por microorganismos que fazem parte da
microbiota normal do ser humano (LACAZ et al., 1998; TRABULKSI et al., 1999).
Os principais grupos de compostos com propriedade antimicrobianas,
extraídas de plantas incluem: terpenóides e óleos essenciais, alcalóides, lecitinas e
polipeptídeos, substâncias fenólicas e polifenólicas (GONÇALVES et al., 2005)
No ensaio microbiológico realizado com as frações e sub-frações, RGM,
RGM-H, RGM-A, RGM-D, RRH E RRM oriundas de Raulinoa echinata os valores de
67
CIM foram superiores a 1000 µg/mL, valor este irrelevante, pois possivelmente seria
necessário, para obtenção de uma possível atividade antimicrobiana, nas cepas
avaliadas, uma elevada concentração de compostos, o que inviabilizaria sua
utilização na terapêutica. Para classificar a atividade antimicrobiana das frações e
sub-frações de Raulinoa echinata, utilizou-se como parâmetros o seguinte: CIM
menor que 100 µg/mL foram considerados com boa atividade antimicrobiana, os que
apresentaram CIM entre 100 e 500 µg/mL foram considerados fracos e quando a
CIM for maior que 1000 µg/mL o produto foi considerado inativo (HOLETZ et al.,
2002). O emprego deste justifica-se devido ao fato da grande maioria dos
antimicrobianos de uso clínico serem ativos contra microorganismos sensíveis em
concentração de até 10 µg/mL. Segundo Mitscher et al. (1972), caso um composto
puro não apresente atividade até a concentração de 100 µg/mL, é pouco provável
que esse seja candidato a uso clínico, a menos que seja ativo contra um
microorganismo resistente ou ainda seja comparativamente atóxico.
A família Rutaceae tem se distinguido pela sua alta variedade de metabólitos
secundários tais como cumarinas, lignanas e terpenóide. Estas classes de
compostos apresentam grande variedade de atividade biológica, como por exemplo
antifúngica, bactericida, antiviral e inseticida (GUERREIRO et al., 2005).
Não há na literatura pesquisada nenhuma citação de atividade antimicrobiana
para Raulinoa echinata e nem para os compostos isolados das frações e sub-frações
testadas. Esta inatividade de ação antimicrobiana era esperada, uma vez que no
ensaio com Artemia salina também não houve morte dos micro-crustáceos. Estes
dois experimentos podem ser considerados concludentes, pois há trabalhos em que
os compostos selecionados a serem testados contra bactérias e fungos são
escolhidos se apresentarem letalidade sobre Artemia salina (YANG, 2001).
5.7 Atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico
Para efeitos de melhor compreensão dos resultados que passaremos a
descrever e discutir, as barras escuras das figuras referem-se ao grupo de animais
tratados com o veículo no qual o ácido limonéxico foi diluído, enquanto as barras
mais claras referem-se ao tratamento com o referido composto.
68
5.7.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético
Conforme mostra a figura 17 o ácido limonéxico exerceu efeito antinociceptivo
estatisticamente significante nos animais tratados com doses de 30 e 60 mg/Kg. Não
se observou efeito significativo para a dose de 10 mg/Kg. A DI50 calculada para o
modelo foi de 21,74 (11,91- 39,69) mg/Kg e a IM foi de 58,80%.
Figura 17: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente sobre a nocicepção
induzida pelo ácido acético (0,6%) em camundongos. Cada barra representa a média de resultados
de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças estatísticas quando
comparadas com o controle, representado pela barra fechada ** P <0,01.
Apesar de ser relativamente simples e com possibilidade de pouca
especificidade, este modelo de dor é de fácil observação, apresenta boa
sensibilidade à várias analgésicos e antiinflamatórios não esteroidais, bem como a
drogas semelhantes à morfina e outros analgésicos que atuam centralmente. Além
disso, os resultados obtidos com as várias classes de drogas analgésicas neste
modelo mostram boa correlação com a ação analgésica encontrada em outros
modelos pré-clínicos, bem como em estudos clínicos (KOSTER et al., 1959; BLANE
et al., 1967; BLUMBERG et al., 1965; SIEGMUND et al., 1957a,b). Postulou-se por
Whittle (1964) que o ácido acético atua indiretamente, causando a liberação de
mediadores endógenos envolvidos na modulação da dor, incluindo a bradicinina, a
0
25
50 ControleÁcido Limonéxico
Tratamento (mg/kg i.p)
**
C 60
IM = 58.80%
10 30
**
DI50= 21.74 (11.91- 39.69)mg/kg
Nú
mer
o d
e co
nto
rçõ
es
69
serotonina, histamina e as prostaglandinas. Além disso, Ribeiro et al. (2000)
mostraram que a nocicepção induzida pelo ácido acético depende da liberação de
citocinas, como a IL- 1β, TNF- α e a IL-8, a partir de macrófagos e basófilos
residentes na cavidade abdominal, e que em conjunto, com outros mediadores
podem induzir a dor característica observada neste modelo. Portanto, a dor
abdominal induzida pelo ácido acético pode ser previnida por vários fármacos,
destacando-se entre esses os antiinflamatórios não esteroidais (WHITTLE, 1964).
Tendo sido a DI50 calculada para o modelo modelo do ácido 21,74 (11,91-
39,69) mg/Kg e a IM 58,80%, sugere-se que o ácido limonéxico esteja atuando nos
mediadores da dor inflamatória ora, diminuindo sua liberação ora, atuando como
antagonista dos receptores desses neurotransmissores.
A tabela 07 mostra a comparação do efeito antinociceptivo do ácido
limonéxico com fármacos analgésicos utilizados terapeuticamente no modelo do
ácido acético, onde é possível verificar que o ácido limonéxico apresenta um efeito
antinociceptivo três vezes mais potente que o paracetamol e a aspirina
Tabela 07: Comparação dos valores das DI50para atividade do ácido limonéxico, do
paracetamol e da aspirina no modelo do ácido acético
Tratamento (i.p) DI50 (mg/Kg) DI50 (µmol/Kg)
Ácido limonéxico 21,74 (11,91- 39,69) 43 (2,3- 79)
Paracetamol 19,0 (16- 23) 125,80 (105-9- 152,08)
Aspirina 24,00 (13- 44) 133,00 (72,2- 244)
5.7.2 Modelo de dor induzida pela formalina
No modelo de dor induzida pela formalina demonstrado na figura 18 pode-se
observar que o ácido limonéxico exerceu efeito antinociceptivo em ambas as fases
do processo doloroso representado no modelo. Entretanto observou-se um efeito
mais pronunciado na segunda fase, a qual corresponde à dor inflamatória (dor
crônica). As IMs calculadas para ambas as fases foram respectivamente 34,24% e
78,69%. Somente foi possível calcular a DI50 para a segunda fase (DI50 13,66 ( 9,35-
19, 61) mg/Kg, uma vez que na primeira fase em todas as três doses utilizadas a
70
resposta antinociceptiva foi equivalente. Também verificou-se que o ácido limonéxico
inibiu o edema de pata induzido pela formalina (dados não mostrados), confirmando
assim, seu possível efeito sobre mediadores do processo inflamatório responsáveis
por dois dos sinais cardinais da inflamação que são: a dor e o edema.
Figura 18: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrada sistemicamente sobre nocicepção
induzida pela formalina em camundongos. Cada barra representa a média de resultados de 6 a 8
animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças estatísticas quando
comparadas com o controle, representado pela barra fechada .* P< 0,1 e ** P<0,01. O Painel A indica
a 1° fase do teste e o painel B a 2ª fase do teste
Descrito inicialmente em gatos e em ratos por Dubuisson e Dennis (1977), o
modelo da formalina consiste na injeção intraplantar de formaldeído diretamente na
pata do animal causando intensa dor por estimulação direta dos nociceptores. A dor
causada pela formalina é caracterizada por vigorosas lambidas, mordidas e batidas
0
60
120 ControleÁcido Limonéxico
Tratamento (mg/kg i.p)
**
C 60
IM = 33.90%
10 30
****
A
Tem
po
de
Rea
ção
(s)
0
125
250 ControleÁcido Limonéxico
Tratamento (mg/kg i.p)
**
C 60
IM = 78.65%
10 30
*
B
DI50= 13.66 (9.35-19.96)mg/kg
Tem
po
de
Rea
ção
(s)
71
na pata injetada com o irritante. Este teste é caracterizado por apresentar duas fases
distintas de nocicepção, que parecem envolver diferentes mediadores (DUBUISSON
e DENNIS, 1977; HUNSKAAR et al., 1985; HUNSKAAR e HOLE, 1987; ROSLAND,
1991), além de ser considerado atualmente o modelo que mais se aproxima da dor
clínica inflamatória. A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de
formalina, estendendo-se pelos primeiros 5 minutos, o que acredita-se ser devido à
estimulação química direta dos nociceptores (DUBUISSON E DENNIS, 1977;
HUNSKAAR et al., 1985), predominantemente das fibras aferentes do tipo C e, em
parte, as do tipo Aδ (HEAPY et al., 1987). A segunda fase desse modelo ocorre
entre 15- 30 minutos após a injeção de formalina e está relacionada principalmente
com a liberacão de vários mediadores pró-inflamatórios (HUNSKAAR E HOLE,
1987)
Resultados descritos na literatura indicam que vários mediadores químicos
como a substância P e o glutamato estão envolvidos com a primeira fase (dor
neurogênica), enquanto que a histamina, a serotonina, as prostaglandinas e a
bradicinina participam da segunda fase (dor inflamatória) da dor induzida pela
formalina (CORRÊA E CALIXTO, 1993; HUNSKAAR E HOLE, 1987; SHIBATA et al.,
1989).
Muitos pesquisadores têm mostrado que a primeira fase, por ser causada
pela estimulação direta dos nociceptores, é normalmente sensível aos opióides,
enquanto que a segunda fase desse modelo está associada a resposta inflamatória
e envolve a produção de prostagalandinas e outros mediadores inflamatórios, sendo
controlada por drogas antiinflamatórias não esteroidais (HUNSKAAR E HOLE, 1985;
HUNSKAAR E HOLE, 1987; HOLE, 1997).
O resultado mais significativo neste modelo foi obtido na segunda fase a qual
corresponde à dor inflamatória, com DI50 13,66 ( 9,35- 19, 61) mg/Kg e IM 78,69%.
Pode-se com este resultado sugerir que o ácido limonéxico esteja inibindo a dor
crônica (inflamatória), resultado este que corobora com o resultado obtido no modelo
do ácido acético.
5.7.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina
72
Também verificou-se que o ácido limonéxico exibe efeito antinociceptivo de
forma estatisticamente significante em dose dependente sobre a nocicepção
induzida pela capsaicina, (figura 19) Neste modelo a IM e a DI50 calculadas foram
respectivamente 60,06% e 11,67 (8,51- 16,0) mg/Kg.
Figura 19: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sitemicamente sobre a nocicepção
induzida pela injeção intraplantar da capsaicina em camundongos. Cada barra representa a média de
resultados de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças
estatísticas quando comparadas com o controle, representado pela barra fechada ** P <0,01.
O modelo da capsaicina foi proposto inicialmente por SAKURADA et al.
(1992) onde demonstraram que a injeção intraplantar de capsaicina na pata
posterior de camundongos, causava vigorosa dor, caracterizada por lambidas e
mordidas na pata injetada, sendo esse efeito relacionado com a dor de origem
neurogênica.
A capsaicina é uma amina neurotóxica extraída da pimenta vermelha que,
quando aplicada na pele ou injetada em animais, produz irritação caracterizada por
reação dolorosa e subseqüente dessenbilizacão para a dor induzida quimicamente
(JANCSÓ et al., 1981). Recentemente, foi demonstrado que a capsaicina atua
através da ativação de receptores específicos, que foram chamados de receptores
vanilóides do tipo 1 (VR1)., esses receptores estão presentes principalmente nos
gânglios da raiz dorsal da medula espinhal e no gânglio trigêmio (CATERINA et al.,
1997).
0
30
60
90 ControleÁcido Limonéxico
Tratamento (mg/kg i.p)
**
C 60
IM = 60.06%
10 30
DI50= 11.67(8.51- 16.0) mg/kg
**
**
Tem
po
de
Rea
ção
(s)
73
Sakurada (1996) evidenciou que a nocicepção induzida pela injeção
intraplantar ou intratecal de capsaicina pode ser mediada, pelo menos em parte,
pela produção de óxido nítrico, glutamato e aspartato além dos neuropeptídeos (SP,
NKB, NKA e CGRP).
Como o resultado obtido no modelo de nocicepção induzido pela capsaicina,
foi significativo, sugere-se que o ácido limonéxico esteja também, atuando na
inibição da dor neurogênica, onde estaria inibindo os mediadores químicos óxido
nítrico, glutamato e neuropeptídeos ( SP, NKB, NKD, e CGRP).
5.7.4 Modelo de dor induzido pelo glutamato
No último modelo avaliado observou-se que o efeito antinociceptivo do ácido
limonéxico também está presente quando a dor é induzida pelo glutamato. Conforme
mostrado na figura 20, o tratamento dos animais com ácido limonéxico promoveu um
efeito antinociceptivo, sobretudo, com a dose de 30 mg/Kg. A IM calculada neste
modelo foi de 40,88% enquanto que a DI50 foi de 47,14 (36,51- 60,95) mg/Kg
Figura 20: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente sobre a nocicepção
induzida pelo glutamato em camundongos. Cada barra representa a média de resultados de 6 a 8
animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças estatísticas quando
comparadas com o controle, representado pela barra fechada ** P <0,01
*** P< 0,001
0
100
200 ControleÁcido Limonéxico
Tratamento (mg/kg i.p)
**
C 60
IM = 40.80%
10 30
***
DI50= 47.17 (36.51-60.93)mg/kg
Tem
po
de
Rea
ção
(s)
74
O glutamato é um neurotransmissor (aminoácido excitatório) que está
envolvido na dor neurogênica induzida pela formalina e pela capsaicina. Além disso,
é um dos neurotransmissores chave do SNC e é usado na transferência de
informações entre os neurônios. Em fibras aferentes do tipo C ocorre a co-existência
de neuropeptídeos com o glutamato, funcionando este como neuromodulador do
processo doloroso (FISHER, et al., 2000). Também, há uma concentração muito
grande de receptores para o glutamato no corno dorsal da medula e, em neurônios
intrínsecos desta localidade. Os aminoácidos excitatórios como o glutamato podem
atuar em dois tipos de receptores, nos ionotrópicos como o N-Metil-D-aspartato
(NMDA), Kainato e AMPA, os quais são ligados a canais iônicos, e também nos
metabotrópicos que são ligados à proteína G.
O glutamato liberado dos neurônios aferentes primários atuando em
receptores AMPA é responsável pela primeira transmissão sináptica pela última
sinapse que ocorre no corno dorsal da medula na transmissão do impulso doloroso.
Os receptores metabotrópicos para o glutamato são expressos somente durante o
aumento da excitabilidde espinal associada à hiperalgesia periférica (MALMBERG e
YAKSH, 1995). também, em condições de dores crônicas, tem sido reportado o
envolvimento na neurotransmissão do impulso doloroso. Associado a isto,
antagonistas do receptor NMDA produzem analgesia (JENSEN e YAKSH, 1992).
Estes receptores parecem estar envolvidos não somente na nocicepção induzindo a
síntese de NO através da ativação da NO-sintase, como também no
desenvolvimento da tolerância a opióides, pois os inibidores da enzima têm se
mostrado como excelentes preventores da tolerância desenvolvida a estes agentes
analgésicos.
Em 2002, Beirith e colaboradores propuseram que o glutamato pode ser
utilizado como agente na indução da nocicepção. Levando isto em consideração,
substâncias que diminuem a nocicepção induzida por este neurotransmissor podem
estar atuando em seus receptores como antagonistas ou inibindo a síntese de óxido
nítrico pelo bloqueio da NO-sintase (BEIRITH, SANTOS, CALIXTO, 2002)
O ácido limonéxico nas doses de 30 e 60mg/Kg, mais significativamente na
de 30mg/Kg, mostrou inibir a nocicepção causada pelo glutamato. Sugere-se
portanto que exerceu atividade antinociceptiva, inibindo possivelmente a síntese de
óxido nítrico, atuando desta forma na dor neurogência.
75
De uma forma geral a transmissão da dor é um mecanismo que envolve
interações muito complexas de estruturas periféricas e cerebrais, desde a superfície
da pele até o córtex cerebral (FÜRST, 1999). A dor pode ser definida segundo o
Comitê de Taxonomia da Associação Internacional para o Estudo da Dor (I.A.S.P)
como uma sensação e experiência desagradável associada com um dano tecidual
atual ou potencial, ou descrita como tal dano (MERSKEY E BOGDUK, 1994;
MILLAN, 1999). Além disso, a dor pode ser denominada de acordo com o tipo da
lesão e/ou dos mediadores envolvidos em nociceptiva, neurogênica, neuroática e
psicogência, a qual está associada respectivamente, com estimulação excessiva de
nociceptores, com lesão ao tecido neuronal, com a disfunção de um nervo ou com
fatores psicológicos (MILLAN, 1999).
A dor, além de uma sensação, é uma experiência. O componente sensorial da
dor é denominado nocicepção, que pode ser definida como a resposta fisiológica a
uma lesão tecidual (RUSSO E BROSE, 1998). Desta forma, segundo os autores
pode-se dizer que ela possui dois componentes: o sensorial e o emocional,
enquanto que o componente emocional é a resposta emocional do processo
doloroso em si vale dizer então, que a nocicepção é unipresente em todos os
indivíduos normais mas, a “dor” na sua forma mais abrangente é bastante particular.
Isto é importante porque as sensações possuem vias neuroanatômicas importantes
com receptores específicos que permitem a detecção e medida de um estímulo. Já
as experiências incorporam componentes sensoriais com influências pessoais e
ambientais.
Em termos de duração, um episódio de dor pode ser transitório, agudo ou
crônico. No tipo transitório, a ativação dos nociceptores é feita na ausência de
qualquer dano tecidual. Na dor aguda, ocorre geralmente lesão e ativação dos
nociceptores. Já a dor crônica é causada geralmente por uma lesão ou patologia,
sendo que esta também pode ser perpetuada pó outros fatores que não os
causadores da dor (LOESER E MELZACK, 1999).
Os nociceptores, receptores da dor, são terminações nervosas livres, não
especializadas, que respondem a estímulos nociceptivos, detectando deste modo a
presença de lesão tecidual. Os estímulos desencadeantes podem ser mecânicos
(estresse/lesão mecânica dos tecidos), térmicos (temperaturas extremas) ou
químicos (histamina, bradicinina, prostaglandinas, etc.), atuando pela modificação do
potencial de membrana do receptor (MILLAN, 2002).
76
Os resultados descritos anteriormente sobre os efeitos antinociceptivos do
ácido limonéxico são bastante interessantes. Através dos resultados, pôde-se
verificar que o composto exibiu efeito antinociceptivo tanto em dores do tipo
neurogênica (relacionados a resultados obtidos no modelo da capsaicina, glutamato
e fase I da formalina) e dores inflamatórias (relacionado aos resultados obtidos no
modelo do ácido acético e fase II da formalina). Além disso, pode-se sugerir que o
efeito obtido possa estar vinculado ao antagonismo dos efeitos de
neurotransmissores envolvidos no processo doloroso, principalmente a bradicinina, a
histamina, a serotonina e as prostaglandinas, uma vez que são liberadas quando
estímulos químicos como a formalina, o ácido acético e a capsaicina são usadas
para produzir algesia.
Na literatura pesquisada não há citação de que o ácido limonéxico nem outro
compostos isolado de R. echinata houvessem sido testados nestes ou em outros
modelos de nocicepção . Sendo portanto, os resultados obtidos com o ácido
limonéxico neste experimento inéditos. Ainda, sugere-se que este composto possa
vir a ser um candidato ou protótipo a fármaco com ação analgésica, para isto mais
estudos são necessários.
77
6 CONCLUSÕES
� Isolou-se dos galhos de Raulinoa echinata os triterpenos em mistura
isobaurenol/ multiflorenol, o ácido limonéxico em grande quantidade, os
alcalóides furoquinolínicos maculina e flindersiamina, e o alcalóide alquil-
quinolínico , e 2-n-nonil-4 quinolona, substâncias estas não encontradas nas
raízes, com exceção dos triterpenos em mistura.
� Das raízes de Raulinoa echinata isolou-se os limonóides degradados
fraxinelona, fraxinelonona e epóxifraxinelona, sendo que os dois primeiros
não foram encontrados em outras partes da planta.
� Determinou-se por difração de Raios- X a posição do grupamento epóxi da
epóxifraxinelona em α e Me- 30 em β.
� Não se observou atividade biológica das frações e compostos isolados nos
modelos de citoxidade sobre Artemia salina e atividade antimicrobiana.
� Em concordância com os resultados obtidos nos modelos farmacológicos
testados o ácido limonéxico parece estar inibindo a produção de mediadores
endógenos envolvidos na modulação da dor, tais como: bradicinina,
serotonina, histamina, prostaglandinas, glutamato, substância P, óxido nítrico
além dos neuropeptídeos (SP, NKA, NFB, e CGRP). Porém faz-se necessário
pesquisas adicionais e com outros modelos para uma melhor avaliação.
� No ensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens rubropilosa observou-se a
diminuição da longevidade mediana das formigas pelo ácido limonéxico
enquanto o limonóide degradado foi inativo.
78
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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