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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
TALITA ELISA BERTÉ
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS
COMPOSTOS TARAXEROL E ÁCIDO URSÓLICO: IMPLICAÇÕES
SOBRE O PROCESSO DE MEMÓRIA
Itajaí - 2009
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
TALITA ELISA BERTÉ
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS
COMPOSTOS TARAXEROL E ÁCIDO URSÓLICO: IMPLICAÇÕES
SOBRE O PROCESSO DE MEMÓRIA
Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Dra. Márcia Maria de Souza Co-orientadora: Dra. Cristiani Bürger
Itajaí, Maio de 2009.
2
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS
COMPOSTOS TARAXEROL E ÁCIDO URSÓLICO: IMPLICAÇÕES
SOBRE O PROCESSO DE MEMÓRIA
Talita Elisa Berté
‘Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
Itajaí (SC), 14 maio 2009
Márcia Maria de Souza, Doutora Orientador
Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Doutora Márcia Maria de Souza (Univali) Presidente
Doutora Cristiani Bürger (Univali) Co-orientador
Doutora Nara Lins Meira Quintão (Univali) Membro
Doutora Ana Lúcia Severo Rodrigues (UFSC) Membro externo
3
Dedico este trabalho aos meus pais os quais são
meu alicerce. À Larissa minha irmã querida e
também ao meu grande amor Eduardo.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por estar sempre presente e nas horas mais difíceis ter me
ajudado a escolher o caminho certo.
Agradeço aos meus familiares, em especial minha mãe Marizete, meu pai Silvino e
minha irmã Larissa por serem a base de meus princípios e de minha formação. Um
agradecimento especial para o meu grande amor e companheiro Eduardo pelo
apoio, carinho e compreensão.
Às orientadoras, Márcia Maria de Souza e Cristiani Bürger, agradeço pelo apoio,
incentivo e pela orientação científica.
Às professoras colaboradoras Christiane Meyre da Silva Bittencourt e Ângela
Malheiros, pela contribuição na orientação dos ensaios fitoquimicos do presente
trabalho.
Agradeço a professora Nara Lins Meira Quintão pelo apoio e incentivo, e
acompanhamento do trabalho desde a fase de projeto.
Às amigas Maggie, Carla, Ticiana, Gislaine e Rosana pelo apoio, auxílio e amizade.
Agradeço também aos alunos da graduaçãoem Farmácia: Bruna, Fernanda,
Patrícia,Taíse, Mauricio e Diogo.
Finalmente agradeço em especial a Profa. Dra. Daniela Marti Barros e Dra. Beatriz
Moleta e suas equipes os quais foram responsaveis pela analise histológica e por
parte da análise estatística dos dados.
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TALITA ELISA BERTÉ Maio/2009
Orientador: Márcia Maria de Souza, Doutora Co-orientadora: Cristiani Bürger, Doutora Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas Número de página: 98 Nos últimos anos os compostos obtidos de plantas medicinais têm constituído alvos terapêuticos importantes para o tratamento de várias patologias neuropsiquiátricas e/ou neurodegenerativas. Os fitoconstituintes com atividade anticolinesterásica que possuem efeitos facilitatórios nos processos de memória atualmente estão sendo muito estudados. Este trabalho teve como objetivo isolar o composto taraxerol (TRX) da planta Eugenia umbelliflora e testá-lo, juntamente com o ácido ursólico (AU), em ensaios bioautográficos, ensaios in vitro e in vivo, verificando seus efeitos sobre atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) e sobre os processos de memória de longa duração (MLD) através do modelo de esquiva inibitória. A atividade anticolinesterásica do TRX e AU foi avaliada em testes bioautográficos e em seguida por teste in vitro com encéfalo e hipocampo de ratos Wistar através do método de Ellman e colaboradores (1961). A partir dos resultados in vitro, estes compostos foram avaliados in vivo infundidos diretamente no hipocampo de ratos, utilizando-se o teste de esquiva inibitória. Neste experimento, os animais sofreram estereotáxia (A= -4,2, L= ± 3,0, V= - 1,3) para implante de cânula-guia. Decorrido o tempo de recuperação dos animais, os mesmos foram treinados e testados avaliando-se os efeitos dos compostos sobre as etapas da memória (aquisição, consolidação e evocação). Para tanto, os animais foram infundidos (região CA1) com os compostos respectivamente 5 minutos antes do treino, imediatamente após o treino e 5 minutos antes do teste. Durante as sessões de treino os animais eram colocados sobre a plataforma do aparato, cronometrando-se a latência de descida. Após a descida, os animais levavam choques de 0,4 mA. Nas sessões de teste (24 horas após o treino) o mesmo procedimento era feito, desta vez com omissão dos choques. Também foi verificado se, os compostos em estudo produziam efeito reversor da amnésia induzida pela escopolamina (5 µg/sítio) no modelo de esquiva inibitória, sendo a escopolamina injetada diretamente no hipocampo 5 minutos antes da infusão dos compostos. Os resultados bioautográficos confirmaram a atividade anticolinesterásica de ambos os compostos, de 180 à 15 µg para TRX e 180 a 6 µg para o AU. Pelo método de Ellman, o TRX apresentou atividade anticolinesterásica somente no hipocampo nas concentrações de 0,89 e 1,77 µM (20,8 ± 1,99 e 23,9% ± 2.42, respectivamente). O AU produziu efeito inibitório no encéfalo de ratos na concentração de 0,27 µM (14,0% ± 1,76) e em hipocampo nas concentrações de 0,01, 0,08, 0,44 e 0,89 µM (14,84% ± 5,49, 18,3% ± 1,82, 29,94% ± 12,6 e 17,83% ± 3,36). No teste de esquiva inibitória o TRX produziu efeito facilitatório significativo no processo de consolidação da memória, revertendo a amnésia induzida pela escopolamina nos processos de aquisição, consolidação e evocação. O AU promoveu um efeito facilitatório da memória na etapa de consolidação e reverteu a amnésia induzida por escopolamina nas etapas de aquisição e consolidação da memória. PALAVRAS-CHAVE: acetilcolinestese. ácido ursólico. memória. taraxerol.
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TALITA ELISA BERTÉ Maio/2009
Advisor: Márcia Maria de Souza, Doutora Co-Advisor: Cristiani Bürger, Doutora Concentacion Area: Natural Productos and Bioactive Synthetic Substance Numbers pages: 98
In recent years, compounds obtained from medicinal plants have been
constituted important therapeutic targets for the treatment of various neuropsychiatric and/or neurodegenerative pathologies. The phytoconstituent with anticholinesterasic activities that currently possess facilitatory effects in the memory processes are being very studied. This study seeks to isolate the taraxerol compound (TRX) from Eugenia umbelliflora plant and test it, together with ursolic acid (UA), in bioauthographic in vitro and in vivo assays, determining their effects on the acetylcholinesterase enzyme activity (AChE) and on of long-term memory (LTM) process, through the inhibitory avoidance model. The anticholinesterasic activity of TRX and UA was assessed in bioauthographic test and later by in vitro test with encephalon and hippocampus of Wistar rats by the method of Ellman et al. (1961). Based the in vitro results, these compounds were assessed in vivo, infusing them directly in the rats’ hippocampus, using the test of inhibitory avoidance. In this experiment, the animals underwent stereotactic surgery (A= - 4.2, L= ± 3.0, V= - 1.3) for the implantation of guide-cannulas. Once the recovery time of the animals had elapsed, they were trained and tested, assessing the effects of the compounds in the study of memory atages (acquisition, consolidation and retrieval). For this purpose, the animals were injected with the compounds respectively 15 minutes before training, immediately after training and 15 minutes before the test. During the training sessions, the animals were placed on the apparatus platform, and the etep-down latency was timed. Each time this occured, the animals received 0,4mA shocks. In the test sessions (24 hours after training), the same procedure was carried out, but this time omitting the shocks. It was also observed whether the compounds studied produced a escpolamine (5 µg/sítio) induced amnesia reserval effect in the inhibitory avoidance model, with the scopolamine being injected directly in the hippocampus 5 minutes before the infusion of compounds. The bioautographic results confirmed the anticholinesterasic activity of both compounds, from 180 to 15 �g for TRX and 180 to 6 �g for UA. By the method of Ellman, TRX presented anticholinesterasic activity only in the hippocampus in concentrations of 0.89 and 1.77 �M (20,8 ± 1,99 and 23,9% ± 2,42 respectively). UA produced inhibitory effect on rats’ encephalon at concentrations of 0,27 �M (14,0% ± 1,76) and in the hippocampus at concentrations the 0,017, 0,08, 0,44 e 0,89 µM (14,84% ± 5,49, 18,3% ± 1,82, 29,94% ± 12,6 e 17,83% ± 3,36 respectively). In the test of inhibitory avoidance, TRX produced significant facilitatory effect in the process of consolidation of memory, reverting amnesia induced by scopolamine in this process, as well as in the processes of acquisition and retrieval. UA promoted a facilitatory effect of memory in the consolidation step and reverted the amnesia induced by scopolamine in the steps of acquisition and consolidation of memory. KEYWORDS: acetylcholinesterase. ursolid acid. memory. taraxerol.
8
LISTA DE FIGURAS Figura 1 Processo de formação da memória. A- fase inicial, B-fase tardia.......................... 20
Figura 2 Representação esquemática do hipocampo e seus microcircuitos........................ 22
Figura 3 Isoformas da AChE. .............................................................................................. 24
Figura 4 Sítio catalítico da AChE......................................................................................... 25
Figura 5 Estrutura química do TRX..................................................................................... 30
Figura 6 a) Frutos maduros; b) Frutos verdes; c) Folhas; d) Partes aéreas de E.umbelliflora
Berg..................................................................................................................................... 32
Figura 7 Estrutura química do AU ....................................................................................... 32
Figura 8 Animal apoiado no equipamento de estereotaxia.. ................................................ 38
Figura 9 Desenho esquemático de secções coronais dos pólos septal. Assinalados os
campos CA1, CA3 e o giro denteado (GD) do hipocampo. .................................................. 39
Figura 10 Microinjeção intracerebral.. ................................................................................. 40
Figura 11 Tarefa da esquiva inibitória.. ............................................................................... 41
Figura 12 Esquema representativo da investigaçãodo efeito do AU sobre a deambulação
dos animais através do MOF.. ............................................................................................. 43
Figura 13 Labirinto em Cruz Elevado.. ................................................................................ 45
Figura 14 Espectro de RMN-1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX. ...................................... 48
Figura 15 Espectro de RMN-13C/ APT (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX. ........................... 49
Figura 16 Método de bioautografia por CCD com TRX a) 1: 180 µµµµg; 2: 150 µµµµg; 3: 120 µµµµg; 4:
90 µµµµg; 5: 60 µµµµg; 6: 30 µµµµg b) 1: 90 µµµµg; 2: 60 µµµµg; 3: 30 µµµµg; 4: 15 µµµµg; 5: 6 µµµµg........................... 51
Figura 17 Método de bioautografia por CCD com AU A) 1: 180 µµµµg; 2: 150 µµµµg; 3: 120 µµµµg; 4:
90 µµµµg; 5: 60 µµµµg; 6: 30 µµµµg B) 1: 90 µµµµg; 2: 60 µµµµg; 3: 30 µµµµg; 4: 15 µµµµg; 5: 6 µµµµg. ........................ 52
Figura 18 Efeito do TRX (0,89 - 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em encéfalo. ............. 53
Figura 19 Efeito do TRX (0,89 – 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em hipocampo de ratos.
............................................................................................................................................ 53
Figura 20 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em encéfalo......................................... 54
Figura 21 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em hipocampo..................................... 54
Figura 22 Efeito da administração intrahipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do
TRX 1,77 uM/sítio) sobre a aquisição da memória de ratos testados na tarefa da esquiva
inibitória. As colunas brancas representam as sessões de treino e as escuras o teste........ 56
Figura 23 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do
TRX 1,77 uM/sítio) sobre a consolidação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva
inibitória... ............................................................................................................................ 56
9
Figura 24 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL) e do
TRX 1,77 uM/sítio) sobre a evocação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva
inibitória. .............................................................................................................................. 57
Figura 25 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a aquisição da memória
de ratos na esquiva inibitória. .............................................................................................. 58
Figura 26 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM/sítio) sobre a consolidação da
memória de ratos na esquiva inibitória................................................................................. 59
Figura 27 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a evocação da memória
de ratos na esquiva inibitória.. ............................................................................................. 60
Figura 28 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX
(1,77 uM/sítio) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por
escopolamina (5 µg/sítio)..................................................................................................... 61
Figura 29 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX
(1,77 uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por
escopolamina (5 µg/sítio)..................................................................................................... 62
Figura 30 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX
(1,77 uM/sítio) sobre evocação da memória de animais com a amésia induzida, por
escopolamina (5 µg/sítio)..................................................................................................... 63
Figura 31 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do AU
(4,54 mM) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por
escopolamina (5 µg/sítio)..................................................................................................... 64
Figura 32 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0.5uL), e do AU
(4,54uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por
escopolamina (5 µg/sítio)..................................................................................................... 64
Figura 33 Efeito da administração aguda do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam (0,75
�g/sítio), administrados pela via intracerebral (hipocampo) sobre os parâmetros: número de
cruzamentos (crossing) (A) e número de atividade exploratória (rearings) (B). .................... 66
Figura 34 Efeito da administração intra-hipocampal do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam
(0,75 µg/sítio), em ratos submetidos ao modelo do LCE. Freqüência de entrada nos braços
abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos
braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). ............................ 68
10
LISTA DE ABREVEATURAS A� – peptídeo beta-amilóide
AU – ácido ursólico
ACh - acetilcolina
AChE – acetilcolinesterase
AMG – amígdala
AMPA – ácido �-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazola-4-proprionico
BChE – butirilcolinesterase
CA – corno de Amon
Ca2+ - cálcio
cAMP – monofosfato de adenosina cíclico
CaMKII – proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina
cm - centímetro
CCD – cromatografia em camada delgada
CL – corpos de Lewy
CREB –
DA – Doença de Alzheimer
DCL – demência com corpos de Lewy
DH - Doença de Huntington
DNA – ácido desoxirribonucléico
DTNB – ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
DFT – demência frontotemporal
DV – demência vascular
EPM – erro padrão da média
ERK – proteína quinase regulada por sinal extra-celular
FDA – Food and Drug Administration
g - grama
GABA – ácido gama-amino butírico
GD – giro denteado
HPN - hidrocefalia de pressão normal
IAChE – inibidores da acetilcolinesterase
IM – inibição máxima
11
LCE – labirinto em cruz elevado
LTD – long-term depression (depressão de longo prazo)
LTP – long-term potentiation (potenciação de longo prazo)
MCD – memória de curta duração
mg – miligramas
min - minuto
mL – mililitros
mM - minimolar
mGluR – receptor metabotrópico de glutamato
MOF – Modelo de Open Field
mRNA – ácido ribonucléico mensageiro
MLD – memória de longa duração
NMDA - N-metil-D-aspartato
NOS – óxido nítrico sintetase
PKA – proteína quinase depende de cAMP
PKC – proteína quinase dependente de cálcio e fosfolipídeo
RMN 13C – ressonância magnética nuclear de 13C
RMN 1H – ressonância magnética nuclear de 1H
SCPD – substância cinzenta parequedutal dorsal
SNC – sistema nervoso central
SNP – sistema nervoso periférico
SWK - síndrome de Wernicke-korsakoff
TRX – taraxerol
5HT – serotonina
µg – micrograma
µL - microlitro
µM - micromolar
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................14�
2 OBJETIVOS...........................................................................................................16�
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 16�
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 16�
3 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................17�
3.1 Memória .................................................................................................... 17�
3.1.1 Classificação das memórias .........................................................................18�
3.1.2 Mecanismos modulatórios de memórias .....................................................19�3.3 Papel da neurotransmissão colinérgica na memória.....................................22�
3.3 Doenças que envolvem déficit de memória.......................................... 25�
3.5 Taraxerol................................................................................................... 30�
3.6 Ácido ursólico.......................................................................................... 32�
4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................34�
4.1 Obtenção dos compostos....................................................................... 34�
4.2 Animais..................................................................................................... 35�
4.4 Ensaios farmacológicos in vitro ......................................................................36�
4.4.1 Avaliação da atividade anticolinesterásica em cérebro total e hipocampo de ratos ....................................................................................................................36�4.4.2 Ensaio enzimático ..........................................................................................37�
4.5 Ensaio farmacológico in vivo................................................................. 37�
4.5.1 Cirurgia-esteriotáxica e implantação de cânulas ........................................37�
4.5.2 Microinjeção intracerebral dos compostos na região CA1 do hipocampo..................................................................................................................................39�4.5.3 Avaliação da atividade dos compostos sobre as etapas da memória no do modelo de esquiva-inibitória..................................................................................40�4.5. 4 Avaliação da atividade dos compostos sobre a amnésia induzida por escopolamina través do modelo de esquiva-inibitória ........................................41�
4.5.5 Histologia .............................................................................................. 42�
4.5. 6 Testes complementares................................................................................42�
4.5.6.1 Efeito dos compostos sobre a atividade exploratória dos animais
submetidos ao teste do campo aberto (Open Field) ............................................42�
4.5.6.2 Efeito dos compostos sobre a ansiedade de animais submetidos ao
teste do labirinto em cruz elevado.........................................................................44�
4.6 Drogas e/ou reagentes............................................................................ 45�
13
4.6.1 Líquor artificial ...............................................................................................45�
4.7 Análise estatística ................................................................................... 46�
5 RESULTADOS.......................................................................................................47�
5.1 Obtenção e identificação do taraxerol .................................................. 47�
5.2 Avaliação da atividade da AChE ............................................................ 50�
5.2.1 Bioautografia do TRX.....................................................................................50�
5.2.2 Resultados da Bioautografia do AU ................................................... 51�
5.3.1 Atividade anticolinesterásica do TRX...........................................................52�
5.3.2 Atividade anticolinesterásica do AU.............................................................53�
5.4 Resultados dos ensaios farmacológicos in vivo ................................. 55�
5.4.1 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais no modelo de esquiva inibitória.....................................................................................................55�
5.4.2 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais com amnésia induzida por escopolamina ....................................................................................60�
5.5 Testes complementares.......................................................................... 65�
5.5.1 Efeito do AU sobre a atividade exploratória dos animais submetidos ao teste do campo aberto (Open Field) ......................................................................65�5.5.2 Efeito do AU sobre a ansiedade dos animais submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado .......................................................................................67�
6 DISCUSSÃO ..........................................................................................................69�
8 REFERÊNCIAS......................................................................................................81�
ANEXO 1...................................................................................................................99�
14
1 INTRODUÇÃO
Conceitualmente, a memória é a faculdade de conservar ou readquirir idéias
ou imagens. Para a formação de uma memória é necessário que ocorra
anteriormente o processo de aprendizado, que é a aquisição ou incorporação de
novas informações. De uma forma simplificada a memória nada mais é do que a
capacidade que possui os indivíduos de armazenar, conservar e evocar
aprendizados anteriores (AMÁDIO et al., 2004). Por tratar-se de um processo
biológico essencial à sobrevivência dos organismos vivos, os processos de
plasticidade neural envolvidos na memória já foram detectados e estudados em
varias espécies de animais, variando desde invertebrados até os seres humanos
(IZQUIERDO, 2002). A memória pode ser modulada por vários sistemas de
neurotransmissores como o sistema glutamatérgico, GABAérgico, serotonérgico,
histaminérgico, dopaminérgico, oxidonitrérgico e colinérgico, dentre outros
(IZQUIERDO et al, 2006). O comprometimento na memória pode ocorrer em várias
doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas, destacando-se principalmente a
doença de Alzheimer (DA).
A acetilcolina (ACh) é um dos neurotransmissores mais estudados no sistema
nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico (SNP). Esse neurotransmissor é
sintetizado a partir de acetil coenzima A (acetil CoA), a qual é formada durante o
processo de respiração celular e a formação da colina, um importante produto do
metabolismo dos lipídeos (TAYLOR; BROWN, 1999). Tem importância fundamental
nas funções desempenhadas pelo SNC, sendo associada com as funções
cognitivas, processamento de informações sensoriais, organização cortical do
movimento e controle do fluxo sanguíneo cerebral (SCREMIN et al., 1997).
A acetilcolinesterase (AChE) é uma serina hidrolase que desempenha papel
essencial no mecanismo colinérgico. Ela é uma enzima que catalisa a hidrólise da
ACh na transmissão do impulso nervoso na sinápse colinérgica entre neurônios
colinérgicos. A enzima está ligada à membrana basal entre as membranas pré- e
pós-sinápticas desempenhando seu papel fisiológico (STRYAER, 1995; RANG et al.,
2004).
Estudos e métodos que levam ao aumento da neurotransmissão colinérgica
são extremamente importantes para a busca de substâncias com um potencial
terapêutico contra doenças neurodegenerativas que possuem a neurotransmissão
colinérgica diminuída, como na DA. Atualmente o tratamento farmacológico mais
15
utilizado para inibir os déficits cognitivos no início da doença consistem em aumentar
a função colinérgica usando inibidores da AChE (DAVIES, 1982; ATTA-UR-
RAHMAN, 2004; CUMMINGS, 2000; ELLIS, 2005).
Os fármacos anticolinesterásicos de uso clínico aprovados pela Food and
Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos para o tratamento da DA são a
tacrina, donepezil, rivastigmina e galantamina (EMRE; CUMMINGS; LANE, 2007).
Entretanto, todos apresentam limitações clínicas quanto ao seu uso, devido tanto a
meia-vida curta quanto aos seus efeitos colaterais indesejáveis (SUNG et al., 2002).
Estudos continuam sendo realizados no sentido de buscar novos compostos
com atividade anticolinesterásica com mais efetividade do que os existentes e/ou
apresentando menos efeitos colaterais. Na maioria das vezes, os compostos
selecionados com tal atividade farmacológica são oriundos de produtos naturais,
principalmente de plantas.
Neste contexto, dois compostos terpênicos, o taraxerol (TRX) e o ácido
ursólico (AU) vem despertando interesse científico. Ambos apresentam atividade
anticolinesterásica quando testados in vitro. Como somente a atividade enzimática in
vitro não qualifica um composto como candidato potencial a um anticolinesterásico a
ser terapeuticamente utilizado, o presente estudo se propõe a estudar a atividade
anticolinesterásica dos compostos em modelo animal in vivo e seus efeitos sobre a
memória (em suas várias etapas), utilizando-se o teste da esquiva inibitória.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar a atividade anticolinesterásica in vitro e in vivo dos compostos TRX
e AU e analisar seus efeitos sobre o processo de memória de longa duração (MLD)
de ratos através do modelo de memória o teste da esquiva inibitória.
2.2 Objetivos Específicos
• Isolar o composto TRX a partir das folhas da planta Eugenia umbelliflora
através da técnica de cromatografia em coluna aberta;
• Avaliar o efeito inibitório do TRX e AU sobre a atividade da AChE através do
ensaio bioautográfico por cromatografia em camada delgada (CCD);
• Analisar a atividade anticolinesterárica do TRX e AU através de ensaios in
vitro em encéfalo e hipocampo de ratos;
• Avaliar os efeitos do TRX e do AU infundido diretamente no hipocampo de
ratos sobre os processos de aquisição, consolidação e evocação da memória
de ratos através do teste da esquiva inibitória;
• Verificar se o TRX e AU revertem o déficit cognitivo induzido pela
escopolamina nos animais.
17
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Memória
A memória é um processo dinâmico associado a modificações na morfologia,
bioquímica e fisiologia do SNC que pode ser analisada em diferentes níveis de
organização biológica (AMADIO et al., 2004).
Para a formação de uma memória é fundamental que ocorra primeiramente
umprocesso de aprendizado, que é a aquisição ou incorporação de novas
informações, promovendo a modificação de um comportamento após uma
experiência vivida. A memória nada mais é do que a capacidade de adiquirir,
armazenar estas informações e recordar aprendizados anteriores (IZQUIERDO,
2002).
A formação de uma nova memória é dependente de processos neuronais que
iniciam com a aquisição de uma informação, seguido pelo seu armazenamento da
informação (consolidação) e por fim o processo de evocação, quando a memória
está pronta para ser recordada (ABEL; LATTAL, 2001).
A aquisição, simplismente definindo é a apresentação ao indivíduo do evento
a ser aprendido. Nos seres humanos pode ser a informação e nos animais uma
tarefa. Este processo é praticamente automático e ocorre essencialmente através da
associação de estímulos e respostas. A associação de estímulos é intensa e se
manifesta como memória de uma experiência recém-vivida, que na maioria das
vezes, é fiel e precisa ao estímulo que conduziu a sua criação. Entretanto, a
intensidade e discernimento poderão diminuir com o passar do tempo.
Armazenamos aquilo que nos parece ser necessário e suficiente, devido às
circunstâncias ou indivíduos. Esse processo de filtração e fixação progressiva da
informação adquirida é chamada de consolidação. Na consolidação a informação é
armazenada e sua modulação é influenciada por fatores emocionais, sendo que, em
situações de necessidade as informações adquiridas e consolidadas poderão ser
evocadas pelo indivíduo (ABEL; LATTAL, 2001; AMÁDIO et al., 2004).
A evocação, em inglês retrieval, é o processo no qual acontece o resgate das
informações consolidadas. Estudos indicam que a evocação conta com processos
individuais e que pode ser estudada independentemente das demais etapas do
processo de formação de memória (EINSTEN et al., 2005).
18
A aprendizagem e a formação de um novo comportamento, ou modificação de
um pré-existente, é a conseqüência dos processos envolvidos na memória. Porém,
grande parte dos estudiosos do assunto restringe o processo de aprendizagem
somente à aquisição de novos conhecimentos enquanto que a memória seria a
retenção dos mesmos (IZQUIERDO, 1992; MORGADO, 1999; KESNER, 2007).
3.1.1 Classificação das memórias
As memórias podem ser classificadas de diferentes formas, dependendo o
critério de classificação adotado. Entretanto, os critérios mais adotados referem-se
quanto ao seu conteúdo e de acordo com seu tempo de duração. Pelo seu conteúdo
as memórias podem ser divididas em declarativa e não declarativa. Quanto ao seu
tempo de duração as memórias pode ser: imediata, de curta e de longa duração.
A memória declarativa é aquela evocada pelo consciente e conseguimos
verbalizá-la, é uma memória para fatos e eventos que ocorreram em nossa vida,
como uma viagem ou um casamento. A memória não declarativa, também chamada
de memória de procedimento, é aquela evocada pelo inconsciente e que não
conseguimos verbalizar, é uma memória relacionada com hábitos, habilidades
motoras e comportamentos, como andar de bicicleta ou dirigir um automóvel (BEAR;
CONNORS; PARADISO, 2002).
Dentre as memórias declarativas a memória pode ser dividida em memória
imediata, na qual as informações são mantidas por apenas alguns segundos, não
deixando traços ou produzindo arquivos, como por exemplo, a memória de um
número de telefone que consultamos na lista telefônica e que logo esquecemos
após o uso. Ela difere da memória de curta duração, onde o período de aquisição e
evocação é um pouco mais demorado. A memória de curta duração dura minutos ou
poucas horas, sendo a memória de trabalho (work memory) um exemplo. É o tipo de
memória que utilizamos para estabelecer conexões de raciocínio quando estamos
mantendo um diálogo ou quando estamos analisando uma situação e procedendo a
julgamentos. Dependendo dos fatores, uma memória de curta duração pode se
transformar em memória de longa duração. Entretanto, ambos os tipos de memórias
são processos independentes (IZQUIERDO et al. 1998; AMÁDIO et al., 2004). A
memória de longa duração dura meses ou anos, formando arquivos de memórias
que são relativamente permanentes, podendo ser modulados ou alimentados
durante os anos de nossa vida. Elas são as memórias de nossa infância, memórias
19
permanentes relacionadas com nossas atividades profisionais, o vocabulário básico
da nossa língua, memórias de nossas relações de afeto, etc. Essas memórias
geralmente são perdidas quando estruturas-chave do SNC são afetadas por
doenças (IZQUIERDO, 2002; SQUIRE; KANDEL, 2003; PREDIGER et al., 2008).
3.1.2 Mecanismos modulatórios de memórias
Acredita-se que um aumento na liberação de neurotransmissores,
principalmente glutamato, seja o primeiro passo para a formação da memória
(McGAUGH, 2000; McGAUGH; IZQUIERDO, 2000). O glutamato liberado se liga aos
receptores glutamatérgicos ácido-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico
(AMPA), cainato, N-metil-D-aspartato (NMDA) e metabotrópicos (mGluR),
provocando a abertura dos canais de cálcio voltagem dependente, e aumentando a
concentração de cálcio intracelular. Como conseqüência disso, são ativadas
enzimas como proteína quinase (PKC), proteína quinase cálcio-calmodulina
dependente (CaMKII), proteína quinase A (PKA), etc, que por sua vez ativam
mecanismos intracelulares que culminam com a síntese protéica, e no aumento da
transmissão de informações entre neurônios. Tais alterações entre os neurônios têm
sido denominadas "plasticidade sináptica" (McGAUGH, 2000; McGAUGH, 2002;
McGAUGH; IZQUIERDO, 2000) (Figura 01).
A plasticidade pode ocorrer sob a forma de curto e longo prazos. A
plasticidade de curto prazo envolveria somente alterações covalentes de proteínas
pré-existentes, ao passo que a plasticidade de longo prazo requer alterações na
expressão gênica e síntese protéica para o estabelecimento de novas conexões
(FREY; HUANG; KANDEL, 1993; BAILEY et al., 1999; SCHAFE et al., 2001).
O possível mecanismo bioquímico para explicar a consolidação da memória é
conhecido como potenciação de longo prazo, do inglês long-term potentiation (LTP).
Assim a LTP, como também a LTD, depressão de longo prazo (long-term
potentiation), são os principais mecanismos neurais subjacentes a formação de
memórias por um longo período de tempo (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993).
A LTP na região CA1 do hipocampo envolve e requer inicialmente uma
ativação de receptores AMPA, mGluR e NMDA nas sinapses de células piramidais.
Essa indução é sensível para a inibição dos receptores GABAA. A ativação dos
receptores AMPA despolariza os receptores NMDA, os quais ficam sensíveis a ação
do glutamato e assim permite a entrada de Ca2+ na célula. O aumento da
20
concentração de Ca2+ próximo a membrana sináptica estimula a atividade local da
CaMKII, que promove a fosforilação do AMPA e outros receptores de glutamato.
Pré-sinapticamente, este aumento de Ca2+ também ocorre, o qual aumenta a
atividade da PKC que fosforila a proteína GAP-43, aumentando ainda mais a
transmissão glutamatérgica mobilizando as vesículas sinápticas. Pós-
sinapticamente, a PKC aumenta a fosforilação dos receptores de glutamato e
eventualmente também aumenta a fosforilação da PKA, um constituinte do fator de
transcrição. A CaMKII fica ativa entre 2 à 3 horas. A PKC tem seu pico em 30 min e
se extende por 1 a 2 horas. Entre 3 a 4 horas depois do início da consolidação da
memória, o receptor dopaminérgico D1 fica estimulado e aumenta os níveis de
AMPc, e conseqüentemente a PKA, que fosforila o CREB (Proteína de ligação dos
elementos responsivos ao AMPc). Há também um aumento evidente de proteína
quinase regulada por sinal (ERK) que é ativada por alguns tipos de PKAs, que são
essenciais para a manutencao da LTP na região CA1, e CREB. O CREB importante
para a síntese de mRNA e subseqüente síntese protéica (IZQUIERDO et al., 2008).
Figura 1 Processo de formação da memória. A- fase inicial, B-fase tardia. Adaptado de De Souza, 2001.
PLC
γβα
PIP2PIP2
IP3IP3
DAGDAG
Glutamato
IP3IP3
PKC
GAP43
PKC
PP
+++
GAP43
Ca2+
Na+
PKC
PKGPKG
NO CO PAFNO CO PAF
PP
CREB
P PPP PP
CaMKIICREB
CaMKII
PKC
PKAPKA
A
PLC
γβα
Glu
PKC
GAP43
PKC
GAP43
Ca2+
Na+
PKC
CaMKII
PKA
PKGPKG
PP
PKA
CREB
P PPP PP
CREB
MAPKMAPK
B
21
3.2 Estruturas envolvidas na memória
Após o caso H.M. ocorrido em 1958, onde na tentativa de cura de processos
epilépticos intensos refratário ao tratamento farmacológico optou-se pela lobotomia
parcial do cérebro do paciente e a conseqüente incapacidade do mesmo em formar
memórias de longa duração, os neurocientistas começaram a associar os diversos
tipos de memória com as estuturas cerebrais (EICHENBAUM, 2004). Algumas
estruturas do lobo temporal medial têm grande importância no aprendizado e no
processo de memória, principalmente na etapa de consolidação. Dentre essas
estruturas destaca-se o hipocampo (AHMED; FREY, 2005; IZQUIERDO et al., 2006;
IZQUIERDO et al., 2008).
O hipocampo (figura 2) é uma estrutura em forma de “cavalo-marinho”
formada por duas camadas de neurônios, dobradas uma sobre a outra, sendo uma
denominada Giro Denteado (GD) e a outra Corno de Amon (CA). O CA é dividido em
quatro partes ou camadas celulares, sendo as camadas CA1 e CA3 as mais
importantes (MILLER; O`CALLAGHA, 2005). Vários estudos bioquímicos e
moleculares já foram e, continuam sendo realizados na região CA1 do hipocampo,
inclusive estudos sobre o seu papel na consolidação da memória (AHMED; FREY
2005; IZQUIERDO et al., 2006).
Os neurônios do GD projetam axônios, chamados de fibras musgosas, que
estabelecem sinapses em células da região CA3, que por sua vez, projetam axônios,
que se ramificam. Um ramo deixa o hipocampo pelo fórnix, e o outro ramo, chamado
colateral de Schaffer, forma sinapses excitatórias em neurônios da região CA1
(figura 1). A informação neural é transmitida a partir da região CA1 para as outras
áreas, constituindo uma saída da informação pré-processada no hipocampo (BEAR;
CONNORS; PARADISO, 2002; WATTS; THOMSON, 2005).
O hipocampo tem grande importância na formação da memória, uma vez que
manipulações farmacológicas e bioquímicas nesta área alteram a memória em
diferentes tarefas (IZQUIERDO; MEDINA, 1995; RUBIN et al., 2000; BERLESE et
al., 2005). Além disso, é nessa região que se manifestam primeiramente os
processos neurodegenerativos implicados com a DA (ELDER; GASPERI; SOSA,
2006).
22
Figura 2 Representação esquemática do hipocampo e seus microcircuitos. Fonte. GUERRA, 2006.
3.3 Papel da neurotransmissão colinérgica na memória
O sistema colinérgico tem papel fundamental nos processos de aprendizado e
memória (WINKLER et al., 1995). A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor que
tem efeitos principalmente excitatórios e são mediados por vários subtipos de
receptores nicotínicos (ionotrópicos) e muscarínicos (metabotrópicos), sendo alguns
desse último, inibitórios (ROUSE et al., 1999; KANDEL, 2000; RANG et al., 2004).
O efeito facilitário da ACh na aprendizagem de novas informações e na
memória já é bem conhecido, o qual foi verificado através de extensivos estudos e
experimentos utilizando-se agonistas e antagonistas de receptores colinérgicos
(KREMIN; HASSELMO, 2007; NIEWIADOMSKA; BAKSALERSKA-PAZERA;
RIEDEL, 2009).
A ACh encontra-se alojada em vesículas nas terminações nervosas, e quando
há despolarização do neurônio colinérgico, as vesículas são liberadas nas
extremidades dos nervos e a ACh liberada entra na sinapse podendo ligar-se a um
receptor ou ser degradada (NIEWIADOMSKA; BAKSALERSKA-PAZERA; RIEDEL,
2009).
Quando a ACh liga-se ao receptor muscarínico dispara um sinal da
membrana ao citoplasma. O receptor estando ativado leva a proteína G a
desacoplar suas subunidades (G�, G� e G�), e isto ocorre devido a G� que desliga-
se do GDP e liga-se ao GTP, estimulando uma cascata de sinalização intracelular
(SELBIE; HILL, 1998).
O papel principal do sistema colinérgico muscarínico sobre a memória parece
ser o de desempenhar um efeito modulatório (SEGAL; AUERBACH, 1997). Os
23
diferentes subtipos de receptores muscarínicos (M1, M2, M3, M4 e M5) são
importantes para a regulação independente de respostas excitatórias ou inibitórias
via outros neuromoduladores e segundos mensageiros (KIMURA; BAUGHMAN,
1997).
A ACh possui uma meia-vida muito curta após sua liberação devido a
presença da AChE que hidrolisa o éster ligado à molécula, conduzindo assim, à
perda da atividade estimulatória da mesma (NIEWIADOMSKA; BAKSALERSKA-
PAZERA; RIEDEL, 2009).
A AChE é uma glicoproteína globular encontrada nos neurônios colinérgicos,
nas proximidades das sinapses colinérgicas e em concentrações elevadas na junção
neuromuscular, possuindo um papel regulatório na neurotransmissão colinérgica
(MASSOULIÉ et al., 1993; MASSOULIÉ; BON, 2006).
Esta enzima está amplamente distribuída no SNC e também é encontrada em
eritrócitos, linfócitos e plaquetas de mamíferos (SILVA, 1998). Ela existe em duas
classes de formas moleculares: como oligômeros homoméricos simples de
subunidades catalíticas e como associações heteroméricas de subunidades
catalíticas e subunidades estruturais. Os oligômeros homoméricos simples
aparecem como: monômeros, dímeros e tetrâmeros, dando origem, assim, às
formas globulares (G): G1, G2 e G4. As formas estruturais assimétricas (A) (A4, A8 e
A12; figura 3) são conseqüências das associações heteroméricas de subunidades
catalíticas e subunidades estruturais (MASSOULIÉ et al., 1993; MASSOULIÉ; BON,
2006; TELESA, 2001). As formas homoméricas são encontradas solúveis na célula,
provavelmente com o intuito de exportação, ou então se apresentam associadas à
membrana externa da célula por meio de uma seqüência de aminoácidos
hidrofóbicos intrínsecos ou de um glicofosfolipídeo acoplado (TELESA, 2001).
A AChE que se apresenta nas formas heteroméricas encontra-se associada
com a lâmina basal externa na sinapse, esta por sua vez é particularmente
abundante na junção neuromuscular (TAYLOR; BROWN, 1999). A maior parte da
AChE encontrada no tecido nervoso é do tipo globular, predominantemente G4,
ligada à membrana (MASSOULIÉ et al, 1993). O centro ativo da AChE, demonstrado
pela estrutura tridimensional (figura 3), é formado por resíduos da chamada tríade
catalítica: serina 203, histidina 447 e glutamato 334 (SHAFFERMAN et al., 1992).
24
Figura 3 Isoformas da AChE. Fonte.http://www.chemistry.emory.edu/justice/test/ach_inactivation.htm, aceso em: 27/03/09.
O centro ativo da AChE tem dois subsítios: um sítio carregado negativamente
(aniônico), ao qual a cadeia de nitrogênio quaternário da ACh carregada
positivamente se liga, e um sítio esterásico contendo os verdadeiros resíduos
catalíticos, o qual aloja o grupamento éster e carbonila da ACh (Figura 4) (TAYLOR;
BROWN, 1999). Com base nas ligações de compostos bi-quaternários foi proposto
um segundo sítio aniônico que se tornou conhecido como sítio aniônico periférico
(peripherical anionic site-PAS) (NUNES-TAVARES et al., 2002).
A AChE é classificada como uma serina-hidrolase. Seu mecanismo catalítico
assemelha-se ao de outras hidrolases, onde o grupamento hidroxila da serina torna-
se altamente nucleofílico por um sistema de reposição de cargas que envolvem o
grupamento carboxila do glutamato, o imidazol da histidina e a hidroxila da serina
(TAYLOR et al., 1999). Quando ocorre o ataque enzimático sobre o éster, é formado
um intermediário tetraédrico entre a enzima e o éster que se rompe e forma um
conjugado acetil-enzima, com a liberação concomitante da colina. A acetil-enzima é
passível de hidrólise e resulta na liberação de acetato e na regeneração da enzima
ativa (TAYLOR et al., 1999).
Como a diminuição da função colinérgica contribui para os sintomas da
demência, as pessoas com DA são beneficiadas com terapias com agentes
inibidores da enzima que degrada a acetilcolina conhecidos como IAChE
25
(anticolinesterásicos), os quais potencializam a transmisao colinérgica (ELLIS,
2005).
Figura 4 Sítio catalítico da AChE. Fonte. SOREQ; SEIDMAN, 2001.
3.3 Doenças que envolvem déficit de memória
A demência é uma síndrome clínica caracterizada por déficits cognitivos
múltiplos, adquiridos e persistentes, capazes de interferir de maneira substancial nas
atividades de vida diária da pessoa portadora da síndrome (TAVARES, 1992;
CUMMINGS; REICHMAN, 1998). É mais prevalente nos segmentos da população
com idade mais avançada, principalmente naqueles com mais de 75 anos
(CUMMINGS; REICHMAN, 1998). A Doença de Alzheimer (DA) e a Demência com
corpos de Lewy (DCL) são os principais representantes de demências
neurodegenerativas (TAVARES; AZEREDO, 2003).
A DCL se apresenta com declínio cognitivo, alucinações visuais recorrentes,
flutuações no estado cognitivo, sinais parkinsonianos extrapiramidais e sensibilidade
aumentada ao uso de neurolépticos. No exame neuropatológico há presença de
corpos de Lewy (CL) em regiões corticais e subcorticais (TAVARES; AZEREDO,
2003). Os CL são formados especialmente por proteínas �-sinucleína, por proteínas
neurofilamentares e pela ubiquitina. Fatores genéticos e/ou epigenéticos são os
26
possíveis responsáveis pelo surgimento dos CL nos neurônios (SUNG et al., 2001;
TROJANOWASKI et al., 1998).
As pessoas com DCL apresentam boa resposta ao uso dos inibidores da
AChE. Em muitos casos, apresentam melhor resposta terapêutica ao tratamento
com esses medicamentos do que pacientes portadores de DA (McKEITH et al.,
1992; WESNES et al., 2002).
A DA é a demência mais comum que acomete idosos, sendo uma doença
neurológica crônica e progressiva caracterizada por múltiplos distúrbios corticais na
memória, julgamento, orientação, compreensão, aprendizagem e linguagem. A
neurodegeneração na DA é irreversível, com perda de memória seguida de
completa demência (FILLEY, 1995; BROOKMEYER; GRAY; KAWAS, 1998).
Atualmente, devido ao aumento na espectativa de vida, o número de doenças
que acometem os idosos vêm sofrendo acréscimo. Em relação a DA este número
tem aumentado gradativamente no mundo. A DA afeta aproximadamente 1% a 3%
das pessoas em torno de 60 anos, 3% a 12% das pessoas entre 70 à 80 anos, e
sobe para 25% a 35% naquelas que têm 85 anos ou mais. A qualidade de vida dos
idosos é afetada pela demência devido à degeneração dos neurônios cerebrais
(CAMPS et al., 2000; AGARWAL et al., 2002; WALSH; SELKOE, 2004).
O papel do depósito do peptídeo �-amilóide (A�) no cérebro como um fator
que provocaria a DA teve sua sustentação científica crescente depois de sua
descoberta por Glenner em 1984. O depósito de peptídeo A� é considerado o
primeiro evento da DA. Entretanto, placas contendo formas agregadas de
fragmentos do peptídeo A� podem ser encontradas no córtex normal de pessoas
idosas, pois o depósito do mesmo no cérebro é uma conseqüência inevitável da
idade. Assim, foi observado que uma fração significativa da população idosa deve
apresentar essas placas niveladas na ausência de manifestações de demência,
sendo discutida a idéia de que depósito amilóide é somente um dos maiores entre
os diversos fatores causadores da doença, embora ele certamente contribua para o
seu mecanismo fisiopatológico (TERRY et al., 1987; GOATE; CHATIER-HARLIN;
MILLAN, 1991; BRAAK; BRAAK, 1997; NEVE; McPHIE, 2000; RANG et al., 2004).
A classe terapêutica dos IAChE produz melhora de sintomas cognitivos,
comportamentais e funcionais relacionados às demências hipocolinérgicas, que têm
a DA como principal representante (LAKS; ENGELHARDT, 2003).
A tacrina foi o primeiro fármaco aprovado para o tratamento da DA,
conferindo ao usuário melhoras modestas da memória e da cognição em cerca de
27
40%. Entretanto não há melhoras de outras alterações funcionais que afetam a
qualidade de vida do paciente com DA. A tacrina exige a posologia de quatro vezes
ao dia e produz como efeitos colaterais os sintomas colinérgicos como náuseas,
cólicas abdominais, diminuição da pressão arterial, bradicardia, aumento da micção
e hepatotoxicidade (ALMEIDA, 1998; RANG et al., 2004).
O donepezil, aprovado pela FDA em 1996, também tem sua eficácia limitada
e é hepatotóxico, mas proporciona ao doente uma melhora na qualidade de vida.
Entretanto tem uma meia-vida muito longa tornando-se uma desvantagem,
principalmente pelo paciente ser idoso. A rivastigmina tem um efeito mais
prolongado que os demais fármacos e, por ser mais seletivo para o SNC, possui
menos efeitos colaterais periféricos. Já, a galantamina (disponível na Europa desde
1997 e liberado pela Anvisa em 2000), um alcalóide de plantas da família
Amaryllidaceae (Galanthus nivalis), atua parcialmente na inibição da colinesterase e
parcialmente na ativação alostérica dos receptores colinérgicos nicotínicos cerebrais
(FREITAS et al., 2002; RANG et al., 2004).
Devido aos muitos fatores que estão relacionados com a DA, várias formas de
tratamento podem ser utilizadas além dos IAChE, tais como: bloqueio dos
receptores NMDA, utilização de agentes antioxidantes, antilipidêmicos e
antiinflamatórios (HELMUTH, 2002; SCARPINI; SCHELTENS; FELDMAN, 2003).
A memantina, um antagonista não-competitivo com afinidade moderada pelo
receptor NMDA, é recomendada para o tratamento das fases moderada a grave da
DA. Este fármaco, que, no início foi testado no tratamento da doença de Parkinson
devido ao seu potencial efeito dopamimético, mais tarde revelou-se eficaz no
tratamento da DA, embora tenha efeito relativamente discreto (WINBLAD; PORITIS,
1999; REISBERG et al., 2003; TARIOT et al., 2004; AREOSA; SHERRIFF;
McSHANE, 2005).
Ainda, em conseqüência da melhor qualidade e ao aumento na expectativa
de vida das pessoas, outros tipos de demência estão ganhando espaço no mundo.
Hoje já estão bem conhecidas demências como a vascular, demência fronto-
temporal, Doença de Huntington (DH), Doença de Creutzfeldt-Jakob e outras
demências do tipo reversíveis e infecciosas.
O termo demência vascular (DV) compreende uma variedade de síndromes
demenciais secundárias e comprometimento vascular do SNC. Essa denominação
engloba quadros causados por múltiplas lesões tromboencefálicas (demência por
múltiplos infartos), lesões únicas em territórios estratégicos (tálamo, giro angular
28
esquerdo), estados lacunares, alterações crônicas da circulação cerebral, lesões
externas da substância branca (doença de Binswanger), angiopatia amilóde, e
quadros decorrentes de acidente vascular cerebrais hemorrágicos (hemorragias sub-
durais, sud-aracnóides ou intracerebrais) (NITRINI, 1995; VEGA; FACCIO, 1995).
A demência fronto-temporal (DFT) manifesta-se especialmente no período
pré-senil, entre 45 a 65 anos de idade, ocorrendo na mesma proporção em homens
e mulheres. A história familiar de demência é observada em metade dos casos,
sugerindo importante papel de fatores genéticos no desenvolvimento da DFT
(SNOWDEN; NEARY; MANN, 2002; BOTTINO, 2000).
A DFT caracteriza-se por siginificativa alteração da personalidade e do
comportamento, com relativa preservação das funções cognitivas apraxia, gnosia e
memória (TEIXEIRA Jr.; SALGADO, 2006). Ao contrário do que ocorre em outras
demências primárias, como na DA e na DCL, estudos neuroquímicos não
evidenciaram alterações do sistema colinérgico na DFT (FRANCIS et al., 1993).
Desse modo, os inibidores da AChE utilizados no tratamento dessas demências
primárias não beneficiam os pacientes com DFT (LITVAN, 2001; PERRY; MILLER,
2001; SNOWDEN; NEARY; MANN, 2002).
A Doença de Huntington (DH) é uma doença autossômica dominante
heterodegenerativa caracterizada por distúrbio do movimento, sintomas psiquiátricos
e demência. É causada pela expansão do trinucleotídeo CAG no gene que codifica a
proteína huntingtina, localizado no cromossomo 4 (4p.16.3). A demência torna-se
usualmente aparente após o surgimento dos sintomas coréicos e psiquiátricos. A
memória é afetada em todos os aspectos e o aparecimento de afasia, apraxia,
agnosia e disfunção cognitiva global ocorrem mais tardiamente (QUINN; SCHREAG,
1998).
A Doença de Creutzfeldt-Jacob é uma doença ocasionada por príons em
humanos. Trata-se de uma enfermidade infecciosa e invariavelmente fatal, que
atinge o SNC e caracteriza-se por demência rapidamente progressiva e
envolvimento focal variável do córtex cerebral, gânglios da base, cerebelo, tronco
cerebral e medula espinhal. Embora a transmissão de humanos para animais tenha
sido demonstrada experimentalmente, a transmissão entre seres humanos (por
transplante de córnea, implantação de eletrodos corticais etc) parece ser rara
(JOHNSON; GIBBS, 1998).
As demências reversíveis são raras, porém de grande importância do ponto
de vista diagnóstico, pois o tratamento adequado pode reverter o declínio cognitivo.
29
Entre as doenças ou condiçoões clínicas que podem gerar demências reversíveis
estão: hidrocefalia de pressão normal (HPN), pelagra, deficiência de vitamina B12,
hipotiroidismo e depressão (GALLUCCI NETO; TAMELINI; FORLENZA, 2005).
Tanto a depressão quando a demência causam lentificação psíquica, apatia,
irritabilidade, descuido pessoal, dificuldade de concentração e memória e também
mudanças de comportamento e personalidade. Contudo, a depressão pode ser um
sintoma da demência e não é rara a coexistência dessas (RASKIND, 1998).
As infecções que fazem parte das demências infecciosas são: AIDS, sífilis,
encefalite herpética e neurocisticercose. O alcoolismo também pode ocasionar
demência. E por fim, tem-se ainda, a síndrome de Wernicke-korsakoff (SWK) que
ocorre pela deficiência de tiamina associada ao uso crônico de álcool. A SWK é um
transtorno neurológico agudo caracterizado por ataxia, disfunção vestibular, delírio e
pela variedade de anormalidades da motricidade ocular. Se não tratada
adequadamente pode evoluir para síndrome amnésica crônica (Síndrome de
Korsakoff), onde há prejuízo grave de memória recente e aprendizado (GALLUCCI
NETO; TAMELINI; FORLENZA, 2005).
3.4 Princípios ativos obtidos de plantas com atividade anticolinesterásica
Como relatado anteriormente, os agentes anticolinesterásicos comumente
usados na terapêutica da DA possuem limitações de uso devido à meia-vida curta e
aos efeitos indesejáveis (SUNG et al., 2002). Por isto, atualmente, muitas pesquisas
estão sendo desenvolvidas para encontrar compostos com atividade
anticolinesterásica em produtos naturais, principalmente em extratos de plantas
(NINO et al., 2006). Em famílias já pesquisadas, como Amaryllidaceae
(HOUGHTON; REN; HOWES, 2006; RHEE et al., 2004), Boraginaceae (AHMAD et
al. 2003, Chenopodiaceae (FERHEEN et al., 2005), Lamiaceae (AHMAD et al.,
2005. Liliaceae (ATTA-UR-RAHMAN et al. 2002), e Solanaceae (CHOUDHARY et
al., 2004) foram encontrados vários compostos com atividade anticolinesterásica.
O extrato da Thespesia populnea (Malvaceae) originária das regiões tropicais
da Índia apresentou atividade anticolinesterásica em teste in vitro utilizando o
método de Ellman e colaboradores (1961) modificado por Voss e Sachsse (1970),
utilizando-se cérebro total de camundongos Swiss albino. Os animais tratados com o
extrato apresentaram uma melhora significativa de memória (VASUDEVAN; PARLE,
2006).
30
Os alcalóides iperacina, forticina, delavina, persicanidina A e imperialina
extraídos da Fritillaria imperialis (Liliaceae) apresentam atividade anticolinesterásica
in vitro (tanto em AChE quanto em BChE) (ATTA-UR-RAHMAN et al., 2002).
Recentemente, extratos metanólicos de vinte e sete plantas da flora
colombiana foram testados. Entre as plantas que apresentaram atividade
anticolinesterásica encontravam-se plantas das famílias Asteraceae, Euphorbiaceae,
Malastomataceae, Rubiaceae e Solananceae (NINO et al., 2006).
Diversas plantas com compostos alcalóides e terpenóides apresentaram
atividade inibitória sobre a AChE, entre estas plantas está a Vaccinium aldhami
(Ericaceae), da qual foi extraído o composto triterpeno TRX que apresentou
atividade anticolinesterásica in vitro (LEE et al, 2004) e também o ácido triterpeno
pentacíclico Ácido Ursólico (AU) que foi extraído da Origanum majorana L. (CHUNG
et al., 2001).
3.5 Taraxerol
No universo científico, o TRX (figura 5), um composto triterpênico, não é um
dos mais estudados, pois este, quando é solicitado na base de dados PUBMED,
está presente em apenas 53 trabalhos, sendo 10 destes com estudos relacionados à
atividade biológica, o restante são trabalhos que citam seu isolamento. Outro dado
curioso é que este triterpeno desperta grande interesse na comunidade chinesa, os
quais detem mais de 75% das publicações.
Figura 5 Estrutura química do TRX
O TRX é referido pela primeira vez na literatura em 1963, em trabalho
referente ao seu isolamento da planta Clitoria ternatea Linn por Banerjee e
HO
H
H
H
31
Chakravarti (BANERJEE; CHAKRAVARTI, 1963). O composto está presente em
várias partes das plantas, desde as raízes até as partes aéreas. Em raízes o
composto foi isolado de plantas como Pseudostellaria heterophylla (LI; YANG, 2008)
e Pterospermum heterophyllum (SHI et al., 2008).
O TRX está presente nas partes aéreas de Vaccinium oldhami pertencente à
família Ericaceae. É encontrado nas flores da Chrysanthemum morifolium, Matricaria
matricarioides, Cosmos bininnatus, Carthamus tinctorius, Taraxacum platycarpum
(AKIHISA et al., 1996; LEE et al., 2004). Nas folhas, o composto foi encontrado em
plantas como Erythrophleum fordii (TSAO et al., 2008), Macaranga triloba (JANG et
al., 2004) e Sebastiania adenophora (MACÍAS-RUBALCAVA et al., 2007). No caule
o composto foi isolado de plantas como a Vepris punctata (CHARTUVEDULA et al,
2004). Encontramos o TRX nas cascas da Styrax japônica (KWON et al., 2008).
Este triterpeno está presente ainda em todas as partes de Excoecaria agallocha
(TIAN, et al., 2008), Vaccinium iteophyllum (WEI et al., 2007), Hietacium pilosella L
(GAWRONSKA-GRZYWACZ; KRZACZEK, 2007), Strobilanthes callosus (SINGH;
SAHU; SHARMA, 2002), Ventilago leiocarpa (LIN; CHOU; KUO, 2001)
Crossostephium chinense, (YANG et al., 2008) e na planta Clitoria ternatea, a qual
seu extrato é utilizado em formulações Ayurvédicas (KUMAR et al., 2008).
Particularmente o TRX é encontrado ainda nas folhas da Eugenia umbelliflora
Berg. (figura 6) (planta arrolada nesse estudo), a qual pertence à família Myrtaceae
introduzida no Brasil e é utilizada na medicina popular no tratamento da diabetes. A
E. umbelliflora Berg é conhecida popularmente como baguaçu, guapê e guamirim.
Na ilha de Santa Catarina é popularmente pronunciado como “biguaçu” (REITZ,
1969; KUSKOSKI, 2000).
Akihisa e colaboradores (1996) demonstraram em seus estudos que o
composto TRX apresentou atividade antiinflamatória. Essa propriedade foi
comprovada por Singh, Sahu e Sharma (2002) os quais evidenciaram o efeito anti-
inflamatório deste triterpeno em modelo de edema de pata induzido por carragenina.
Chaturvedula e colaboradores (2004) demonstraram que o TRX apresentou
atividade citotóxica contra células cancerígenas de ovário humano. Tsao e
colaboradores (2008) comprovaram que o TRX inibe potentemente (CI50 de 24,2 µM)
a atividade da enzima óxido nítrico sintetase (NOS) das células gliais.
Recentemente, Yang e colaboradores (2008) confirmaram a capacidade do
TRX de inibir o crescimento de células Hela e BGC-823, apresentando uma CI50 de
73,4 µmol x (-1) e 73,3 µmol x L(-1), respectivamente.
32
Quanto aos efeitos do composto com relação à atividade anticolinesterásica,
Lee e colaboradores (2004) demonstraram que o TRX possui essa atividade. O
composto foi encontrado em algumas plantas da flora catarinense já estudadas em
nossos laboratórios.
Figura 6 a) Frutos maduros; b) Frutos verdes; c) Folhas; d) Partes aéreas de E.umbelliflora Berg. Fonte: Delgado; Barbedo, 2007.
3.6 Ácido ursólico
Do ponto de vista científico, entre os compostos naturais mais estudados, o
AU (figura 7) vem ocupando a segunda posição, perdendo somente para a
quercetina.
Figura 7 Estrutura química do AU
Em revisão na base de dados PUBMED verificou-se que desde sua
descoberta e isolamento da planta T. vulgaris por Rowe e colaboradores em 1949,
mais de seiscentos artigos foram publicados, os quais relatam sua presença em
a)
b) c) d)
33
vários gêneros e famílias, bem como os estudos referentes à sua atividade biológica
e farmacológica.
O AU é um ácido triterpênico pentacíclico que já foi isolado de muitas plantas,
sendo algumas delas Eriobotrya japonica, Rosmarinns officinalis, Glechoma
hedeaceae, Origanum majorana L. (CHUNG et al., 2001), Prunela vulgaris (LEE et
al., 2008), Ilex paraguariensis (PREDIGER et al., 2008), Helichrysum picardii
(SANTOS ROSA et al., 2007), Clerodendrum serratum (VIDYA et al., 2007), Salvia
sclareoides (RAUTER et al., 2007) e em nosso estudo Alamanda cathartica.
Foram relatadas para o AU atividades antiinflamatória, anti-reumática,
antiviral, antioxidante, anti-artrítica e anti-tumoral (SILVA et al., 2008; KANG et al.,
2008), incluindo inibição de tumores de pele (HUANG et al., 1994). Ele também
induz a diferenciação celular para regulação da expressão de genes específicos em
camundongos F9 (LEE et al., 1994), e mostrou possuir um efeito anti-angiogênico
(SOHN et al., 1993). Além disso, foi relatado que o AU apresenta uma atividade anti-
invasiva sobre HT1080 em células fibrosarcoma humanas (CHA et al., 1996).
Estudos realizados na China em 2009 por Tang e colaboradores revelaram
que o AU é capaz de inibir mecanismos apoptóticos via bcl-2, isto é, o AU aumenta
os níveis de bcl-2 (anti-apoptótica) ativado pela caspase-3 (TANG et al., 2009). Além
disso, estudos anteriores na Korea mostraram que o AU tem moderada atividade
citotóxica in vitro, especificamente nas células tipo A549, SK-OV-3, SK-MEL-2 e
HCT15 (LEE et al., 2008).
O AU também desperta interesse em outras áreas de estudos farmacológicos,
como por exemplo, distúrbios metabólicos. Jang e colaboradores (2009) mostraram
que o AU exibiu efeito anti-diabético e propriedades imunomodulatórias por
aumentar os níveis de insulina com preservação das células beta-pancreáticas.
Além disso, o AU também modula os níveis de glicose no sangue, proliferação de
células T e produção de citocinas por linfócitos, em camundongos diabéticos
induzidos por estreptozotocina e alimentados com uma dieta rica em gordura (JANG
et al., 2009). O AU apresentou atividade antibacteriana significativa, embora limitada
à bactérias Gram-positivas (FONTANAY et al., 2008).
Em 2001, Chung e colaboradores relataram a atividade anticolinesterásica em
células PC12. Além disso, Rauter et al (2007) demonstraram que o AU inibe a
atividade colinesterásica tanto da enzima AChE quanto da Butirilcolinesterase
(BuChE) (RAUTER et al., 2007).
34
Devido ao relato da atividade anticolinesterásica do AU em trabalhos
anteriores da literatura, neste trabalho estudou-se o efeito do AU e do TRX utilizando
metodologia diversificada das apresentadas anteriormente. Além disso, procurou-se
estudar o efeito de ambos os compostos sobre a memória de animais através da
infusão direta dos mesmos no cérebro dos animais.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção dos compostos
4.1.1 Obtenção do taraxerol A extração do composto TRX foi realizada sob a orientação da Professora
Dra. Christiane Meyre da Silva Bittencourt. O composto foi extraído conforme
descrito a baixo.
As folhas da Eugenia umbelliflora foram coletadas no município de Porto Belo
no mês de junho de 2007. A planta em estudo foi identificada pelo Professor Msc.
Oscar Benigno Iza, cuja exsicata encontra-se depositada no Herbarium Barbosa
Rodrigues, Itajaí-SC, sob o número VC Filho 50.
As folhas da planta foram secas em estufa de circulação de ar na temperatura
máxima de 40°C. O material vegetal foi triturado para aumentar a superfície de
contato e melhorar o rendimento em relação à planta seca e submetido à extração
utilizando Metanol (MeOH) durante 7 dias. Após este período o extrato foi
concentrado à pressão reduzida em evaporador rotativo à temperatura de 50°C até
um volume desejado.
O extrato metanólico concentrado foi ressuspendido em solução de
Etanol:H2O (7:3) e submetido à partição com solventes de polaridade crescente
iniciando com hexano e na seqüência diclorometano e acetato de etila.
Considerando a presença do composto de interesse na fração de hexano, a mesma
foi submetida à concentração para obtenção do resíduo seco. A fração hexânica foi
submetida à purificação utilizando cromatografia em coluna aberta (CC) com sílica
gel como fase estacionária e mistura de hexano e acetato de etila com aumento
gradativo de polaridade como fase móvel. A obtenção do TRX, composto de
interesse para os ensaios biológicos, foi monitorada por cromatografia em camada
35
delgada (CCD) com auxílio de padrão previamente identificado.
4.1.2 Obtenção do ácido ursólico O AU foi isolado durante os experimentos realizados no Trabalho de
Conclusão de Curso da aluna Viviane Nart, sob a orientação da professora Dr.
Ângela Malheiros. A metodologia do isolamento do AU está descrita na monografia
NART, V. Isolamento de princípios ativos de interesse farmacológico das
partes aéreas da Allamanda cathartica. 2007, 90 f. Monografia – Bacharel em
Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí SC, 2007.
4.2 Animais
Tanto os ensaios farmacológicos in vitro quanto in vivo foram utilizados ratos
Wistar machos (250 a 300g). Os animais foram obtidos do Biotério Central da Univali
e mantidos no biotério da farmacologia experimental, com ciclo claro/escuro de 12
horas e aclimatados a temperatura de 22 ± 2º C. Os animais foram tratados com
água e ração ad libitum, exceto durante os experimentos. Para o processo de
adaptação, os animais permaneceram no ambiente de realização dos testes 1h
antes dos experimentos. Os protocolos experimentais foram apresentados ao
Comitê de ética em Pesquisa da Univali, e os experimentos foram realizados
mediante aprovação (número do protoloco 232/07) (anexo 01).
4.3 Avaliação da atividade anticolinesterásica (Bioautografia)
A utilização de métodos de detecção rápidos e eficientes de substâncias
bioativas é uma etapa extremamente importante no processo de descoberta de
novas moléculas (RATES, 2001). O screening para metabólitos bioativos a partir de
um organismo vegetal pode envolver ensaios que permitem evidenciar atividade
antibiótica, com inibição in vitro, farmacológica ou uso de modelos experimentais in
vivo. O método de bioautografia deve fornecer resultados rápidos, com baixo custo,
deve ser sensível e requerer pouco material de partida.
O procedimento foi conduzido segundo metodologia anteriormente
empregada por Marston, Kissling e Hostettmann (2002), com algumas modificações.
O TRX e AU solubilizados em solvente apropriado foram aplicadas em placa
cromatográfica de sílica gel e eluídas em mistura de solvente anteriormente
36
determinado (Diclorometano e Metanol). Após migração das amostras, a placa foi
submetida à secagem com auxílio de secador. A placa foi borrifada com a solução
da enzima (AChE da enguia elétrica em tris-hidroximetilaminometano pH 7,8) e
submetida novamente à secagem. Para incubação da enzima a placa foi transferida
para um tanque contendo água com o auxílio de uma pinça, mantendo a umidade
atmosférica na temperatura de 37oC em estufa por 20 minutos de incubação.
Decorrido os 20 minutos a placa foi borrifada com uma solução contendo acetato de
1-naftil e fast blue B promovendo a formação de coloração púrpura em toda a placa
cromatográfica após 2 minutos.
A atividade anticolinesterásica foi determinada pelo aparecimento de
manchas brancas após 5 minutos em comparação à amostra padrão,
demonstrando desta forma a ação inibitória das substâncias avaliadas sobre a
atividade da enzima.
4.4 Ensaios farmacológicos in vitro
4.4.1 Avaliação da atividade anticolinesterásica em cérebro total e hipocampo
de ratos
Neste experimento foram utilizados 20 animais: 10 animais foram sacrificados
para a obtenção do encéfalo e 10 para a obtenção do hipocampo. Os animais foram
sacrificados através de decaptação por guilhotina e o encéfalo foi removido. O
encéfalo foi dissecado, pesado e homogeneizado em 10 volumes de Tris-HCl 10
mM, pH 7,2 contendo sacarose 160 mM. O homogenato foi submetido à
centrifugação (1.000 g/10 min à 4ºC) e o sobrenadante obtido (fração S1) foi
separado e armazenado à -20ºC até o momento dos ensaios enzimáticos. O
hipocampo foi homogeneizado em 20 volumes do tampão Tris-HCl 10 mM. Para
esta estrutura cerebral, o homogenenato foi submetido a 1.000 g/15 min à 4ºC. O
sobrenadante obtido (fração S1) também foi armazenado à -20ºC até o momento
dos ensaios enzimáticos (PEREIRA; ADAMS; SILVA, 2004).
37
4.4.2 Ensaio enzimático
A atividade específica da AChE de encéfalo e hipocampo foi determinada pelo
método espectrofotométrico de Ellman e colaboradores (1961), modificado por
Pereira, Adams e Silva (2004). Este método espectrofotométrico é um dos métodos
mais utilizados para a análise das atividades da butirilcolinesterase e da
acetilcolinesterase (FURLANELLO, 2006).
O meio de análise continha 50 µL de ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
(DTNB) 1mM, 990 µL de tampão fosfato de potássio 24 mM (pH 7,2), 50 µL de
material enzimático e 10 µL da solução contendo os compostos. A reação foi iniciada
pela adição de 25 µL de acetiltiocolina 0,8 mM (substrato), sendo monitorada
durante 4 min a 412 nm em espectrofotômetro em temperatura ambiente (24 a
25˚C). A atividade da AChE foi expressa em µmol de acetiltiocolina
hidrolisada/hora/miligrama de proteína (PEREIRA; ADAMS; SILVA, 2004). A
concentração de proteína das amostras do homogeneizado de encéfalo e
hipocampo foi determinada pelo método de azul Coomasine (BRADFORD, 1976),
utilizando-se a albumina sérica bovina como padrão. O efeito inibitório dos
compostos foi avaliado nas concentrações de 0,89, 1,77 e 3,6 µM para TRX e 0,017,
0,09, 0,27, 0,44, 0,89, 1,78 e 3,6 µM para AU.
4.5 Ensaio farmacológico in vivo
4.5.1 Cirurgia-esteriotáxica e implantação de cânulas
Para avaliar a atividade dos compostos sobre a memória, os compostos foram
infundidos no hipocampo e, para tanto foi necessário o procedimento de
estereotaxia. Todo o procedimento foi realizado segundo descrito por De Souza
(2000) e Cammarota e colaboradores, (2005) com algumas modificações. Os ratos
foram anestesiados com uma mistura de quetamina (80mg/kg, i.p.) e xilazina (75
mg/kg, i.p.) e fixados no equipamento estereotáxico (Insight®). Após a verificação da
anestesia (evidenciado pela perda de todos os reflexos, principalmente o doloroso)
foi realizada a tricotomia de toda a parte superior de sua cabeça e posterior
adaptação ao aparelho. Em seguida foi realizada a assepsia da área com álcool
38
iodado 10% e uma solução de xilocaína com epinefrina (2%) foi infundida
subcutaneamente por todo o campo cirúrgico. A calota craniana foi exposta numa
área de 3 a 4 mm anteriores à sutura coronariana, através de remoção de uma área
ovalada. O periósteo de toda a região foi raspado. Em seguida, o crânio foi
reposicionado no aparelho estereotáxico de forma que o bregma e o lambda
ficassem em um mesmo plano horizontal (De- SOUZA, 2001; CAMMAROTA et al.,
2005).
Para o implante das cânulas (obtidas de agulhas comuns 25x7) na região
CA1 da região dorsal do hipocampo (CA1), as coordenadas obedecidas, segundo
Paximos e Watson (1986) foram as seguintes: 1 mm acima da região CA1 da região
dorsal do hipocampo (A= - 4.2, L= ± 3.0, V= - 1.3). Uma vez adaptadas as cânulas
bilateralmente nas regiões do hipocampo (CA1), o osso craniano foi seco e a área
aberta foi preenchida com uma prótese de polímero autopolimerisável que ao
endurecer incorporou todas as peças em uma prótese sólida (De SOUZA, 2001;
CAMMAROTA et al., 2005).
Como tratamento pós-operatório os animais receberam paracetamol (200
mg/kg) por via oral. Esperaram-se no mínimo 48 horas após o procedimento
cirúrgico para a realização do teste de esquiva inibitória.
Figura 8 Animal apoiado no equipamento de estereotaxia. Fonte. BERTÉ, 2009.
39
Figura 9 Desenho esquemático de secções coronais dos pólos septal. Assinalados os campos CA1, CA3 e o giro denteado (GD) do hipocampo. Adaptado. Fonte. http://www.scielo.br/img/revistas/prc/v19n1/31305f1.gif. Acesso em: 15/04/2009.
4.5.2 Microinjeção intracerebral dos compostos na região CA1 do hipocampo
Para a infusão dos compostos na região CA1 (figura 5 e figura 9) foram
utilizadas agulhas de 13 mm de comprimento e 0,3 mm de diâmetro, adaptadas a
partir de agulhas odontológicas, conectadas a microseringas (Hamilton®) de 0,5 µL,
por um tubo de polietileno. As agulhas tinham 1 mm de comprimento a mais do que
a cânula-guia de forma que o composto foi realmente microinjetado na região
estudada. As seringas foram preenchidas com uma solução de TRX na
concentração de 1,77 µM e AU 4,54 mM ambos diluídos em líquor artificial. Para a
microinjeção, o animal foi mobilizado na altura do colo com o auxílio de um pano
(figura 6) e com o alicate foi retirado o mandril adaptado à cânula durante o ato
cirúrgico. Com o auxílio de agulhas odontológicas de 20 mm (K-FILE Colorinox),
usadas para a desobstrução do canal dentário, as cânulas-guias foram limpas.
Posteriormente a agulha foi adaptada ao tubo de polietileno contendo os compostos
e, suavemente introduzida através da cânula. Ao final da injeção a agulha foi
deixada no local por 15 segundos adicionais (De- Souza, 2001; MAZZAMBANI,
2005).
40
Figura 10 Microinjeção intracerebral. Fonte: MAZZAMBANI, 2005.
4.5.3 Avaliação da atividade dos compostos sobre as etapas da memória no do
modelo de esquiva-inibitória
Na tarefa da esquiva inibitória o comportamento explorador habitual do animal
é inibido pela aplicação de choques. Assim a aprendizagem se manifesta através da
inibição do comportamento exploratório natural do animal. O aparelho utilizado
consistiu de uma caixa automatizada medindo 50 cm de comprimento, 25 cm de
largura e 25 cm de altura, com a face frontal em vidro (Albarsch®). O assoalho é
constituído de uma grade de barras de bronze, com 1 mm de diâmetro, espaçada 1
cm umas das outras, através da qual é possível aplicar uma diferença de potencial
regulável de 0 a 1 mA. Sobre o assoalho foi adaptado uma plataforma de madeira
(regulável), sobre a qual cada animal é colocado (figura 7).
Nas sessões de treino os animais foram colocados sobre a plataforma,
cronometrando-se a latência de descida completa do animal da plataforma (com as
quatro patas na grade de bronze), quando isso ocorria era aplicado choques de 0,4
mÅ por 2 segundos entrecortados até a reação de subida para a plataforma
(IZQUIERDO et al., 1998; De SOUZA, 2001; CAMMAROTA et al., 2005).
Para o teste da aquisição da memória os compostos foram injetados
diretamente no hipocampo 5 min antes do treino na esquiva inibitória. Decorridas 24
h após o treino, o mesmo procedimento foi realizado, desta vez com omissão dos
choques. No teste de consolidação da memória os animais foram treinados e
imediatamente após o treino, foram injetados com os compostos, aguardando 24 h
após o treino para a medida da memória. Na evocação da memória os compostos
41
foram injetados 5 min antes do teste, tendo os mesmos sido treinados conforme
procedimento descrito.
Durante o teste, o tempo máximo permitido para cada animal permanecer
sobre a plataforma foi de 180 s (IZQUIERDO et al, 2000; PREDIGER et al., 2008).
Os animais cuja diferença de latência ultrapassaram este limite, ficaram computados
com este valor (IZQUIERDO et al., 2000). A latência para a descida entre o teste e o
treino foi considerada como índice de retenção de memória.
Figura 11 Tarefa da esquiva inibitória. Fonte. BERTÉ, 2009.
4.5. 4 Avaliação da atividade dos compostos sobre a amnésia induzida por
escopolamina través do modelo de esquiva-inibitória
Para verificar a influência dos compostos sobre a amnésia induzida por
escopolamina (5 µg/sítio), antagonista muscarínico, durante aquisição da memória a
escopolamina foi infundida diretamente no hipocampo 5 min antes da injeção dos
compostos, os quais por sua vez, foram injetados 5 min antes do treino da esquiva
inibitória. Decorrido 24 h após o treino, o teste foi realizado. Para verificar a
influência dos compostos sobre a amnesia induzida por escopolamina durante
consolição da memória a escopolamina foi infundida diretamente no hipocampo
imediatamente após o treino e 5 min antes da injeção dos compostos. Aguardou-se
24 h após o treino para a medida da memoria. Na evocação da memória a
escopolamina foi injetada no hipocampo também 5 min antes da injeção dos
42
compostos que foram por sua vez injetados 5 min antes do teste, tendo os mesmos
sido treinados conforme procedimento descrito (HUNSAKER t al., 2007).
4.5.5 Histologia
Ao término de cada teste os animais foram sacrificados em câmara de CO2,
em seguida foi infundida uma solução de azul de metileno 2% (0,5 µL) para
demarcação do local da implantação das cânulas e então foram decapitados com
guilhotina para a dissecação do encéfalo. Os encéfalos retirados foram fixados em
uma solução de formaldeído 10% e enviados para a análise histológica. Os animais
que não apresentaram a correta implantação da cânula nas regiões em estudo
foram desprezados na análise estatística dos ensaios comportamentais.
As análises histológicas foram realizadas na Universidade Federal do Rio
Grande (FURG) sob orientação da Professora Dra. Beatriz Moleta.
4.5. 6 Testes complementares
Os testes complementares foram realizados pelos alunos de graduação em
Farmácia Maurício Fracasso e Diogo Adolfo dos Santos.
4.5.6.1 Efeito dos compostos sobre a atividade exploratória dos animais
submetidos ao teste do campo aberto (Open Field)
Como objetivo de verificar se a administração dos compostos poderia afetar o
sistema motor dos animais e comprometer os resultados referentes ao
comportamento de cada um no teste da esquiva inibitória, foi utilizado o teste do
campo aberto ou Open field. Devido a escassez do TRX, somente o AU foi testado.
Através do modelo do campo aberto pode-se verificar se os compostos em
estudo exercem algum efeito sobre a memória, ansiedade ou sobre o sistema motor
dos animais, conforme o protocolo experimental adotado (De-SOUZA, 2001
MAZZAMBANI, 2005, RODRIGUES et al., 2002). O teste foi realizado em um campo
aberto circular (Insigth®) de acrílico com as paredes transparentes (figura 8). O chão
do aparato era dividido em 8 quadrados iguais agrupados circularmente e um centro
dividido em outras 4 partes. Os parâmetros comportamentais observados nesse
43
teste foram os números de cruzamentos (crossings) e o número de atividade
exploratória (rearings). A redução dos parâmetros comportamentais relacionados à
atividade exploratória e cruzamentos observados durante o experimento podem ser
considerados indicativa de efeitos depressores com possível efeito sobre o sistema
motor dos animais (MAZZAMBANI, 2005).
Para realizar o experimento foram infundidas 1,0 µg/sítio (4,54 mM) de AU na
região CA1 do hipocampo e posteriormente (5 min) os animais foram testados. Os
animais foram colocados no centro do aparato e os parâmetros comportamentais
foram registrados por um período de 6 minutos. Dois grupos foram utilizados como
controle: um (controle negativo), onde os animais receberam o veículo (solução
salina) e outro (controle positivo), onde os animais receberam midazolam (0,75
µg/sítio).
Após a passagem pelo Open Field os animais utilizados nesse experimento
foram imediatamente avaliados no teste do labirinto em cruz elevado.
Figura 12 Esquema representativo da investigaçãodo efeito do AU sobre a deambulação dos animais através do MOF. Fonte. Fracasso, 2008.
44
4.5.6.2 Efeito dos compostos sobre a ansiedade de animais submetidos ao
teste do labirinto em cruz elevado
Com o objetivo de verificar se o grau de ansiedade nos animais poderia
influenciar nos efeitos do AU sobre a memória, os animais foram primeiramente
testados no modelo do labirinto em cruz elevado. Conforme observação anterior,
somente o AU foi testado.
O labirinto em cruz elevado (LCE) foi adaptado do modelo de Montgomery
criado em 1955 (figura 9). Este pesquisador desenvolveu um labirinto elevado no
qual a intensidade do medo natural induzida poderia ser medida pela variação da
proporção do comportamento exploratório entre os braços abertos e fechados do
aparato. Em 1985 o modelo foi validado farmacologicamente, etologicamente e
fisiologicamente por Pellow e colaboradores. Nesse teste, drogas com perfil
ansiolítico como diazepam, midazolan, clordiazepóxido e fenobarbital tendem a
aumentar a exploração e a tempo de permanência nos braços abertos, enquanto
que, drogas com perfil ansiogênico como a picrotoxina, ioimbina, anfetamina e
cafeína tendem a diminuir esses parâmetros comportamentais (PELOW et al., 1985;
PELLOW; FILE, 1987; ARAGÃO et al., 2006).
O LCE para ratos consiste de dois braços abertos (50 x 10 cm2) e dois braços
fechados (50 x 10 x 15cm3 ). A área central (10 x 10 cm3) é elevada á 70 cm do chão
(figura 9).
As medidas comportamentais registradas foram: a freqüência de entradas e o
tempo despendido nos braços abertos e fechados (RODGERS; COLE, 1994). Foram
considerados como entradas em um dos braços do LCE quando o animal colocou as
quatro patas dentro do respectivo braço.
45
Figura 13 Labirinto em Cruz Elevado. Fonte. Fracasso, 2008.
4.6 Drogas e/ou reagentes
Os reagentes (metanol, hexano, diclorometano e acetato de etila) utilizados
na obtenção dos compostos são de grau comercial da marca VETEC e SYNTH.
Foram utilizados Tris (Labsynth), sacarose (Cromato), ácido 5,5-ditio-bis-(2-
nitrobenzóico (DTNB) (Sigma), fosfato de potássio (Cromato), acetiltiocolina (Across
Orgawics), ketamina (Vetbrands), xilazina (Agener União), cloridrato de lidocaína +
epinefrina 2% (Cristália), acrílico auto polimerizante (Clássico Indústria Brasileira),
paracetamol (Medley) e escopolamina (Sigma-Aldrich), acetato de 1-naftil (Acros
Organics), Sal Fast Blue B (Fluka), acetilcolinesterase da enguia elétrica (SIGMA
C2888-1KU), ácido clorídrico HCl (Cromato) e álcool iodado 10% (Lifar).
4.6.1 Líquor artificial
Para diluição dos compostos foi utilizado líquor artificial preparado conforme
descrito por File et al. (1999). Para 200 ml de líquor artificial foram utilizados: 147,6
mg de cloreto de Sódio NaCl (Merck), 460 mg de bicarbonato de sódio NaHCO3
(Merck), 35,6 mg cloreto de potássio KCl (Merck), 1,2 mg de fosfato de potássio
KH2PO4 (Cromato), 26,4 mg de cloreto de cálcio CaCl2 (Merck), 32,8 mg de cloreto
de magnésio MgCl2 (Merck), 13,6 mg de fosfato de sódio NaHPO4 (Merck) e 257,2
mg de glicose (Cromato).
46
4.7 Análise estatística
Para os testes paramétricos os dados obtidos foram apresentados com
médias seguidas pelos respectivos erro padrão da média (EPM). Os dados foram
submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via, quando necessário, foram
submetidos a testes de múltipla comparação a partir do modelo pos hoc de Dunnet,
utilizando o software GrafhPad ® e INSTAT ®. Para os testes não paramétricos como
o modelo da esquiva inibitória, foi utilizado o test de Mann-Whitney para
comparações entre os grupos e Kruskal-Wallis e Wilcoxon para comparações entre
treinos e testes. Os resultados foram apresentados como medianas seguidas dos
intervalos interquartis. Foram considerados estatisticamente significantes os valores
de p menor do que 0,05 (p<0,05).
47
5 RESULTADOS
5.1 Obtenção e identificação do taraxerol
O TRX foi isolado por Cromatografia de Coluna (CC) da fração hexano do
extrato metanólico das folhas da Eugenia umbelliflora. Este composto apresentou-se
como cristais brancos, solúvel em diclorometano. Sua estrutura foi confirmada
através de análises de RMN 1H e RMN 13C e comparadas com dados da literatura
(MAHATO; KUNDU, 1994). Algumas frações contendo TRX foram submetidas à
lavagem com hexano para obtenção de sólido branco e reunidas ao composto puro
isolado.
No espectro de RMN 1H (figura 14) observa-se dois duplo-dubletos em � 5,53
referentes ao hidrogênio olefínico H15 e em ��3,19 referente ao H3. Na região de��
1,10 a 0,80 observam-se oito sinais como simpletos referentes às metilas 23 a 30.
No espectro de RMN de 13C/APT (figura 15) pode-se evidenciar treze sinais
referentes à CH/CH3 e 17 sinais referentes a C/CH2. Observam-se em � 158,1 e
116,9 os carbonos olefínicos C14 e 15, respectivamente. Em � 79,1 sinal
característico de carbono ligado à oxigênio atribuído para o C3. Observam-se ainda
oito sinais característicos das metilas entre � 15,4 e 33,3 ppm.
As atribuições dos sinais de RMN 1H e 13C (figura 14 e 15) estão dispostas na
Tabela 1 e encontram-se de acordo com os dados encontrados na literatura para o
TRX (MAHATO; KUNDU, 1994; LAPHOOKHIEO; KARALAI; PONGLIMANONT,
2004; LEE et al., 2004).
48
Figura 14 Espectro de RMN-1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX.
49
Figura 15 Espectro de RMN-13C/ APT (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX.
50
Tabela 1 Valores de deslocamentos químicos (�, ppm) de RMN 1H e 13C para o TRX e dados da literatura para o TRX.
Posição RMN-¹H
δ � (ppm)
Literatura* Taraxerol δ � (ppm)
RMN-¹³C / APT
δ (ppm)
Literatura** Taraxerol �δ �(ppm)
1 38,0 (CH2) 38,1 2 27,2 (CH2) 27,3 3 3,2 dd
J= 13,6; 6,4 Hz 3,19 dd
J= 11,2; 4,4 Hz 79,1(CH) 79,2
4 - - 39,0 (C) 39,1 5 0,91m 0,90, m 55,6 (CH) 55,7 6 1,45, m 18,8 (CH2) 19,0 7 1,60, m 1,65, m 35,1 (CH2) 35,3 8 - - 38,8 (C) 38,9 9 0,92, m 48,8 (CH) 48,9
10 - - 37,7 (C) 37,9 11 1,45, m 17,5 (CH2) 17,7 12 1,30, m 35,8 (CH2) 35,9 13 - - 37,6 (C) 37,9 14 - - 158,1(C) 158,1 15 5,54, dd, J=
7,9, 3,0 HZ 5,53, dd, J= 7,6,
3,6 Hz 116,9 (CH) 117,0
16 2,0, m; 1,9, dd, 10,5; 3,6, Hz
1,65, m; 1,94, dd; 14,7; 2,7Hz
36,7 (CH2) 36,9
17 - - 37,7 (C) 38,1 18 1,45, m 49,3 (CH) 49,4 19 1,35, m; 2,05, m 41,4 (CH2) 41,4 20 - - 28,8 (C) 29,0 21 1,30, m 33,7(CH2) 33,9 22 1,62, m 33,1(CH2) 33,2 23 0,91, s 0,91, s 28,0 (CH3) 28,1 24 0,93, s 0,93, s 15,4 (CH3) 15,6 25 0,98, s 0,98, s 15,4 (CH3) 15,6 26 1,09, s 1,09, s 29,9 (CH3) 30,1 27 0,82, s 0,82, s 25,9 (CH3) 26,0 28 0,80, s 0,80, s 29,8 (CH3) 30,1 29 0,95, s 0,95, s 33,3 (CH3) 33,5 30 0,91, s 0,91, s 21,3 (CH3) 21,3
CDCl3 300 MHz
CDCl3 300 MHz
CDCl3 75,5 MHz
CDCl3 100 MHz
* LAPHOOKHIEO; KARALAI; PONGLIMANONT, 2004. ** LEE et al., 2004.
5.2 Avaliação da atividade da AChE
5.2.1 Bioautografia do TRX
O efeito do TRX sobre a atividade da AChE foi detectada após o
aparecimento de halos brancos nas regiões onde continham o composto (figura 16).
Nas concentrações usadas (180, 120, 90, 60, 30, 15 e 6 µg), o composto inibiu a
enzima nas concentrações de 180 a 15 µg. Não foi observada efeito do TRX na
51
concentração de 6 µg. Como pode ser observado, o TRX apresentou um fator de
retenção de 0,47 (Rf= 0,47) e reação positiva na biaoutografia. Nesta metodologia foi
descartada a hipótese de interferências do solvente utilizado, uma vez que, o
diclorometano foi evaporado antes da aplicação da solução de albumina contendo
AChE.
Figura 16 Método de bioautografia por CCD com TRX a) 1: 180 µg; 2: 150 µg; 3: 120 µg; 4: 90 µg; 5: 60 µg; 6: 30 µg b) 1: 90 µg; 2: 60 µg; 3: 30 µg; 4: 15 µg; 5: 6 µg. A pesquisa foi realizada em CCD sílica gel, eluído com H: AcOEt (8:2) e reagentes específicos.
5.2.2 Resultados da Bioautografia do AU
Da mesma forma que foi pesquisada a atividade anticolinesterásica do TRX
foi pesquisada a atividade do AU sobre a atividade da AChE. Surgiu halos brancos
nas regiões onde continham o composto e assim, foi detectada sua atividade em
todas as concentrações utilizadas (180, 150, 120, 90, 60, 30, 15 e 6 µg) (figura 17).
Como pode ser observado, o AU apresentou um fator de retenção de 0,58 (Rf= 0,58)
e reação positiva na biaoutografia. Como anteriormente, foi descartada a hipótese
de interferências do solvente utilizado, uma vez que, o diclorometano: metanol (1:1)
foi evaporado antes da aplicação da solução de albumina contendo AChE.
a) b)
52
Figura 17 Método de bioautografia por CCD com AU A) 1: 180 µg; 2: 150 µg; 3: 120 µg; 4: 90 µg; 5: 60 µg; 6: 30 µg B) 1: 90 µg; 2: 60 µg; 3: 30 µg; 4: 15 µg; 5: 6 µg. A pesquisa foi realizada em CCD sílica gel, eluído com H: AcOEt (7:3) e reagentes específicos.
5.3.1 Atividade anticolinesterásica do TRX
Na figura 18 estão representados os resultados obtidos com o TRX com
relação a sua atividade anticolinesterásica em encéfalo. No ensaio enzimático
realizado, nenhuma das concentrações do TRX utilizadas apresentaram inibição da
atividade da AChE de forma significativa quando comparadas com o grupo controle.
Entretanto, quando o ensaio enzimático foi realizado utilizando-se o hipocampo
(Figura 19), verificou-se que o composto nas doses mais baixas produziu inibição da
atividade da enzima de forma significantiva quando comparado com o controle. As
IMs (percentagens de inibições máximas) calculadas para esse experimento foram
de 20,8% ± 1,99 e 23,9% ± 2,42 respectivamente.
B A B
53
Controle 0.89 1.77 3.60
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Concentração (uM)
Ati
vida
de A
ChE
( µµ µµM
ATC
/min
/g p
rote
ina)
Figura 18 Efeito do TRX (0,89 - 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em encéfalo. Cada coluna representa a média de 5 experimentos (n=5) realizados em duplicata e, as barras verticais os ± EPM. ANOVA de uma via com teste de comparação múltipla de Dunnett.
Controle 0.89 1.77 3.60
250
500
750
** **
Concentração (uM)
umol
ace
tiltio
colin
ahi
drod
/h/m
g pr
oteí
na
Figura 19 Efeito do TRX (0,89 – 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em hipocampo de ratos. Cada coluna representa a média de 5 experimentos em duplicata (n=5) e as barras verticais os EPM. ANOVA de uma via com o teste de comparação múltipla de Dunnett. **p < 0,01 em relação ao controle.
5.3.2 Atividade anticolinesterásica do AU
Nos ensaios referentes aos efeitos do AU sobre a atividade colinesterásica no
encéfalo (figura 20) foi observado que o composto promoveu inibição dessa
54
atividade (efeito anticolinesterásico) na concentração de 0,27 µM com IM de
aproximadamente 14,0% ± 1,76.
Entretanto, nos experimentos realizados com hipocampo (Figura 21) foram
observados inibições da atividade enzimática da AChE nas concentrações de 0,017,
0,09, 0,44 e 0,89 µM com IM de aproximadamente 14,84% ± 5,49, 18,3% ± 1,82,
29,94% ± 12,6 e 17,83% ± 3,36, respectivamente.
C 0.017 0.09 0.27 0.44 0.89 1.78 3.60
100200300400500600700800900
10001100
**
Concentração (uM)
umol
ace
tiltio
colin
a h
idro
l/h/m
g pr
oteí
na
Figura 20 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em encéfalo. Cada coluna representa a média de 7 experimentos (n=7) em duplicata e as barras verticais os ± EPM. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett. ** p < 0,01 em relação ao controle.
C 0.017 0.09 0.26 0.44 0.89 1.78 3.600
250
500
750
1000
*** ** *
Concentração (uM)
umol
ace
tiltio
colin
a h
idro
l/h/m
g pr
oteí
na
Figura 21 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em hipocampo. Cada coluna representa a média de 7 experimentos (n=7) em duplicata e as barras verticais os ± EPM. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett. * p > 0,05 e ** p< 0,01 em relação ao controle.
55
5.4 Resultados dos ensaios farmacológicos in vivo
5.4.1 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais no modelo de
esquiva inibitória
No presente estudo procurou-se estudar o efeito do TRX e AU sobre a
memória da esquiva inibitória, avaliando somente a MLD e suas etapas (aquisição,
consolidação e evocação).
Como mostra a figura 22, no processo de aquisição da memória, houve
aprendizagem da tarefa da esquiva inibitória pelos animais tratados com veículo
(controle negativo) e TRX de forma significantiva. Quando se compara o efeito do
composto na sessão de teste, observa-se que o tratamento dos animais com o
mesmo, não promoveu alterações na aquisição da memória dos animais, uma vez
que no teste os animais tratados e não tratados tiveram o mesmo comportamento
Na figura 23 estão representados os resultados obtidos com o TRX sobre o
processo de consolidação da memória dos animais testados na esquiva inibitória.
Tais resultados demonstram que o tratamento dos animais com o composto TRX
promoveu fascilitação do processo de consolidação da memória de forma
significativa quando se compara controles e tratados na sessão de teste (p<0,05).
Também se observa que os animais aprenderam a tarefa nos dois grupos de
tratamento, uma vez que houve diferenças significativas quando se compara as
sessões de treino com as de teste em cada um dos grupos estudado.
56
0
60
120
180TreinoTeste
Veículo Taraxerol
**
*
Latê
ncia
de
Des
cida
(s)
Figura 22 Efeito da administração intrahipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a aquisição da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória. As colunas brancas representam as sessões de treino e as escuras o teste. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam diferenças significativas quando se compara treino e teste (* p<0,05 e ** p<0,01). Teste de Kruskal-Wallis.
0
60
120
180TreinoTeste
Veículo Taraxerol
**
**#
Latê
ncia
de
Des
cida
(s)
Figura 23 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a consolidação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória. As colunas brancas representam a sessão de treino e as escuras o teste. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). ** denotam diferenças significativas quando se compara treino e teste (** p< 0,01). # denotam diferenças significativas quando se compara o tratamento com o controle na sessão de teste # p < 0,05. Teste de Kruskal-Wallis entre treino e teste e Mann-Whitney entre os grupos.
57
Com relação ao processo de evocação da memória (figura 24), o TRX não
promoveu diferença estatísticamente significativas quando feita as comparações
entre veículo e tratamento nas sessões de teste. Entretanto, em ambos os
tratamentos observou-se o aprendizado da tarefa.
0
60
120
180TreinoTeste
** *
Veículo Taraxerol
Latê
ncia
de
Des
cida
(s)
Figura 24 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a evocação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória. As colunas brancas representam a sessão de treino e as escuras o teste. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam diferenças significativas quando se compara treino e teste (* p<0,05 e ** p<0,01). Teste de Kruskal-Wallis.
Após a verificação dos efeitos do TRX sobre a memória da esquiva inibitória,
investigou-se o efeito do AU com o mesmo modelo farmacológico, também
avaliando separadamente seu efeito sobre a aquisição, consolidação e sobre a
evocação. Na figura 25 observa-se que quando infundido diretamente no
hipocampo, o AU promoveu aumento significativo e estatisticamente significante (P <
0,05) da latência de descida da plataforma na sessão de teste, facilitando a
aquisição da memória dos animais. Também se observa na mesma figura que os
animais tratados com AU não tiveram melhor aprendizagem da tarefa quando se
compara com o grupo tratado com veículo .
58
0
60
120
180TreinoTeste
* *
Veículo AU
Latê
ncia
de
Des
cida
(s)
Figura 25 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a aquisição da memória de ratos na esquiva inibitória. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos indicam diferenças significantes quando comparado treino e teste (* p<0,05). Teste de Kruskal-Wallis.
Na figura 26 estão representados os resultados obtidos com o AU sobre a
consolidação da memória de animais submetidos ao teste da esquiva inibitória.
Observa-se que o tratamento com o AU promoveu aumento da latência de descida
da plataforma de forma estatisticamente significante (p<0,05), indicando que o
mesmo é um agente facilitador da consolidação da memória nesses animais.
59
0
60
120
180TreinoTeste
*
*#
Veículo AU
Latê
ncia
de
Des
cida
(s)
Figura 26 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM/sítio) sobre a consolidação da memória de ratos na esquiva inibitória. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). * indicam diferenças significantes quando se compara treino com teste e, # denotam diferenças estatísticas quando se compara tratados e controles na sessão de teste (p<0,05). Teste de Kruskal-Wallis quando comparado treino e teste e teste Mann-Whitney quando existe comparação entre os grupos.
Com relação a etapa de evocação da memória (figura 27), o tratamento dos
animais com AU, quando infundido no hipocampo dos mesmos, não produziu
nenhuma alteração na memória dos animais comparando-se com o grupo controle
que recebeu veículo. Em ambos os casos, os animais tiveram o mesmo
desempenho no teste da esquiva inibitória, não sendo detectados com o tratamento
com o AU nem efeito amnésico nem efeito facilitatório.
60
0
30
60
90TreinoTeste
Veículo AU
**
Latê
ncia
da
Des
cida
(s)
Figura 27 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a evocação da memória de ratos na esquiva inibitória. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). * indicam diferenças significativas quando se compara treino e teste (* p<0,05). ANOVA teste de Kruskal-Wallis.
5.4.2 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais com amnésia
induzida por escopolamina
No presente estudo, também nos propusemos a verificar o efeito do TRX e do
AU sobre os processos de aquisição, consolidação e evocação da memória no
modelo de esquiva inibitória em animais com amnésia induzida por escopolamina.
Da mesma forma que nos testes anteriores, foi avaliado somente a MLD.
Na figura 28, estão representados os resultados dos estudos com relação a
aquisição. Pode-se observar que a escopolamina foi capaz de induzir amnésia nos
animais de forma significativa (p <0,01) quando se compara com o grupo controle
nas sessões de teste. Além disso, também pode ser observado que os animais pré-
tratados com a escopolamina não exibem aprendizagem da tarefa por si só.
Observa-se também que o TRX reverte o efeito amnésico da escopolamina de forma
estatisticamente significante (p<0,05).
Na etapa de consolidação (figura 29), percebe-se o mesmo perfil
farmacológico dos tratamentos onde a escopolamina induziu amnésia de forma
estatisticamente significante, sendo que o tratamento com o TRX produziu reversão
deste quadro amnésico, também de forma significativa (p<0,05) quando comparado
com os animais tratados somente com escoplamina, pode-se perceber que o TRX
também melhorou a consolidação da memória.
61
0
60
120
180
TreinoTeste** * *
Veículo TRX Esc TRX + Esc
#La
tênc
ia d
a D
esci
da (
s)
Figura 28 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e **p<0,01), # denotam diferenças estatísticas quando comparado os animais que receberam Esc+TRX na sessão de teste com os que receberam somente escopolamina (# p<0,05) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.
62
0
60
120
180
TreinoTeste
**
**
**
*#
Veículo TRX Esc TRX+Esc
+
Figura 29 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Astriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e ** p<0,01), + denotam diferenças estatísticas quando comparado teste do tratamento com controle (+ p<0,05) e # denotam diferenças estatísticas significativas quando comparado animais que receberam Esc+TRX com aqueles que recebram somente escopolamina (# p<0,05) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.
Quando avaliado o efeito do TRX e da escopolamina no processo de
evocação de memória (figura 30), foi possível perceber que a escopolamina afetou a
evocação da memória dos animais no modelo de esquiva inibitória de forma
estatisticamente significante causando amnésia nos animais, e o tratamento com
TRX foi capaz de reverter este processo amnésico (p<0,001).
63
0
60
120
180TesteTreino
** * **
Veículo TRX Esc TRX+Esc
#
Latê
ncia
de
desc
ida
(s)
Figura 30 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre evocação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e **p<0,01), # denotam diferenças estatísticas na sessão de teste quando se compara os animais que receberam TRX/escop com aqueles que receberam somente escopolamina (#p<0,5) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.
Depois de verificado o efeito do AU sobre as etapas da memória, também foi
avaliado se esse composto poderia reverter a amnésia induzida pela escopolamina
em animais submetidos ao teste da esquiva inibitória. O AU foi efetivo em reverter a
amnéseia induzida por escopolamina de forma significativa no processo de
aquisição (p<0,05) (Figura 31).
No processo de consolidação da memória (figura 32) o mesmo perfil
farmacológico foi observado com o AU. O composto facilita a consolidação da
memória e quando testado em animais amnésicos, ele consegue reverter a amnésia
induzida pela escopolamina. Neste processo o AU apresentou reversão total da
amnésia, isto é percebido quando comparado testes do controle com AU+Esc,
apresentando um p< 0,05.
64
0
60
120
180
TreinoTeste
**
** **#
Veículo AU Esc Esc+AU
Latê
ncia
de
Des
cida
(s)
Figura 31 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do AU (4,54 mM) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). ** denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (**p<0,01), # denotam diferenças estatísticas na sessão de teste quando se compara os animais que receberam AU/escop com aqueles que receberam somente escopolamina (# p<0,05) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.
0
60
120
180TreinoTeste
**
** *
Veículo AU Esc AU+Esc
#
+ ##
Latê
ncia
da
Des
cida
(s)
Figura 32 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0.5uL), e do AU (4,54uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e **p<0,01), + denotam diferenças estatísticas quando se compara os tratamentos na sessão de teste com o controle (+ p<0,01); # denotam diferenças estatísticas na sessão de teste quando se compara os animais que receberam AU/escop com aqueles que receberam somente escopolamina e quando comparado com o controle (# p< 0,05, ## p<0,01) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.
65
5.5 Testes complementares
5.5.1 Efeito do AU sobre a atividade exploratória dos animais submetidos ao
teste do campo aberto (Open Field)
A figura 33 mostra o efeito do tratamento dos animais com AU (4,54 mM),
administrado no hipocampo em animais testados no modelo Open Field. A que o
tratamento com AU não produziu modificação nos números de cruzamentos
(crossing), quando comparados com o grupo controle negativo (veiculo) (figura 33,
A). Entretanto com relação ao número de rearings (Figura 33, B) o tratamento
promoveu um aumento desse parâmetro de forma estatisticamente significante
(F(10.143) = 0, 7376, p < 0,01). No mesmo experimento observa-se também que o
tratamento dos animais com midazolan, um benzodiazepínico, (controle positivo)
(0,75µg/sitio) produziu aumento do número rearings de forma estatisticamente
significante quando comparado com o veículo (F(10.143) = 0, 7064, p < 0,01).
66
Figura 33 Efeito da administração aguda do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam (0,75 �g/sítio), administrados pela via intracerebral (hipocampo) sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de atividade exploratória (rearings) (B). Cada coluna representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01 ).
Veículo Àcido ursólico Midazolan0
40
80VeículoÀcido ursólicoMidazolan
A
Núm
ero
de C
ruza
men
tos
Veículo Àcido ursólico Midazolan0
10
20 B ** **
Tratamento (1ug/sítio)
Núm
ero
de R
eari
ngs
67
5.5.2 Efeito do AU sobre a ansiedade dos animais submetidos ao teste do
labirinto em cruz elevado
Os resultados representados neste modelo (Figura 34) demonstraram que o
AU, promoveu um aumento significativo (F(6.348) = 6,07, p < 0,01) na freqüência de
entradas nos braços abertos (Figura 34, A), quando comparados ao grupo controle
(veiculo). Também se pode observar que o tempo de permanência nos braços
abertos (Figura 34, B), foi aumentado de forma significativa (F(17,794) = 5,13, p < 0,01)
com o tratamento com o AU. Da mesma forma, verificou-se que o AU diminuiu
(Figura 34, C) significativamente o número de entradas nos braços fechados (F(33,378)
= 2,30, p < 0,01). Com relação ao tempo de permanência nos braços fechados
(Figura 34, D), o AU também promoveu uma diminuição significativa desse
parâmetro comportamental (F (17.794) = 5,13, p < 0,01).
Também foi observado nesse experimento o clássico efeito ansiolítico do
midazolam. O fármaco produziu respectivamente um aumento da freqüência e do
tempo de permanência nos braços abertos do aparato (Figura 34 C e D) (F (15,610) =
3,19, p < 0,05; F (17,794) = 3,54, p < 0,01).
68
Figura 34 Efeito da administração intra-hipocampal do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam (0,75 µg/sítio), em ratos submetidos ao modelo do LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteríscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (** p < 0,01).
Veículo Àcido ursólicoMidazolan0
50
100
Veículo Àcido ursólico Midazolan
A**
Freq
uênc
ia E
ntra
das
Abe
rto
(%)
Veículo Àcido ursólicoMidazolan0
50
100 B **
**
Tem
po d
e P
erm
anên
cia
Abe
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(%)
Veículo Àcido ursólicoMidazolan0
50
100
**
C
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Freq
uênc
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ado
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Veículo Àcido ursólicoMidazolan0
50
100 D
****
Tem
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e P
erm
anên
cia
Fech
ado
(%)
69
6 DISCUSSÃO
As plantas superiores representam uma rica fonte de novas moléculas com
propriedades farmacológicas para o desenvolvimento de novas drogas. Durante as
últimas décadas, o interesse na investigação de produtos naturais levou à introdução
na terapêutica de vários fármacos importantes, tais como os agentes antitumorais
vinblastina e taxol ou o agente antimalária artemisinina (QUEIROZ, WOLFENDER,
HOSTETTMAN, 2009).
O sucesso obtido com a investigação dos produtos naturais é condicionado
pela cuidadosa seleção vegetal, a qual se baseia em diversos critérios, tais como, os
dados quimiotaxinômicos e as informações de medicina tradicional.
Uma estratégia primordial que está sendo utilizada na obtenção de novos
compostos é o chamado isolamento bioatividade-guiados, no qual ensaios
farmacológicos ou biológicos são utilizados para orientar o isolamento de compostos
bioativos de um extrato obtido de uma planta. Registros na literatura reportaram o
uso da técnica pela primeira vez em 1987 por Duch e colaboradores os quais
obtiveram do extrato de Stizophyllum riparium cinco terpenos com propriedades
citotóxicas contra células tumorais leucêmicas do tipo P-388. Nos anos
subseqüentes até os dias de hoje a técnica do estudo de isolamento bioatividade-
guiados tem sido efetivamente aplicada pelos profissionais químicos-farmacêuticos
oferecendo aos farmacologistas compostos com as mais diversas propriedades,
dentre as quais se pode destacar propriedade tripanossomicida (Da SILVA MOTA et
al., 2009), antifúngica (SCHUFFLER et al., 2009), analgésicas (ZHENG et al., 2009),
anti-osteoporótica (WU et al., 2009), antiplaquetária (CHIA et al., 2008), ansiolítica
(AGUIRRE-ERNÁNDEZ et al., 2007), anticolinesterásica (ROLLINGER et al., 2006;
SUNG et al., 2002) , anticonvulsivante (AWAD et al. 2009), dentre outras.
No presente estudo os compostos AU e TRX foram obtidos respectivamente
de extratos de plantas como Alamanda cathartica e Eugenia umbeliflora. Após o
isolamento e a comprovação da estrutura de ambos os compostos iniciou-se o
estudo com a bioautografia, que se fundamenta na desacetilação do acetato de 1-
naftil para gerar o 1-naftol por ação da enzima AChE, o qual reage com o reativo
Fast Blue B, para produção de coloração púrpura pela formação do corante azóico
na placa cromatográfica (MARSTON; KISSLING; HOSTETTMANN, 2002).
A bioautografia por CCD é uma técnica relativamente simples e de baixo
custo, considerando sua fácil execução, rapidez e reprodutibilidade (COLLINS;
70
BRAGA; BONATO, 2006), embora seja um teste qualitativo (TREVISAN et al., 2006).
Este método vem sendo utilizado para a localização de compostos com
propriedades antifúngicas, antibacterianas e antioxidantes a partir de matrizes
vegetais que após procedimentos de purificação, identificação e ensaios
complementares vem a contribuir para a descoberta de interessantes compostos
líderes para o desenvolvimento de medicamentos de uso clínico (PIETERS;
VLIETINCK, 2005).
O efeito do TRX sobre a atividade da AChE foi detectado após o
aparecimento de halos brancos nas regiões onde continham o composto nas
concentrações de 180, 120, 90, 60, 30 e 15 µg. Já com o AU foi percebido halos
brancos em todas as concentrações testadas (180, 150, 120, 90, 60, 30, 15 e 6 µg).
Os dados obtidos no presente estudo confirmam a atividade anticolinesterásica dos
compostos AU e TRX, conforme descrito Chung et al. (2001) e Lee et al. (2004).
Uma vez que a atividade anticolinesterásicas dos compostos em estudo foi
confirmada por ensaio de bioatividade-guiada, procedeu-se novo experimento para
verificar o efeito dos compostos sobre a enzima quando esta se encontra em seu
local de origem, ou seja, nas sinapses colinérgicas. Para tanto, o método de Ellman
foi realizado em tecido cerebral. Trata-se de um experimento simples, onde a
enzima contida na amostra (nesse caso, o encéfalo e hipocampo) hidrolisa a
acetiltiocolina, gerando como produto a tiocolina, a qual reage com o reagente de
Ellman (DTNB) tornando a reação de cor amarelada (TREVISAN; MACEDO, 2003;
ELLMAN, 1961).
Estudos realizados por Lee e colaboradores (2004) demonstraram que o TRX
exibiu atividade anti-AChE (inibição de 80%) quando avaliado na região mesolímbica
do cérebro de camundongos na concentração de 400 µM. Com o objetivo de
confirmar estes resultados e avaliar se, este composto exerce sua ação na área
cerebral envolvida no processo de memória (o hipocampo), o mesmo foi submetido
à análise utilizando como fonte da enzima o encéfalo e hipocampo de ratos. Nossos
resultados demonstraram que o TRX não tem efeito inibitório sobre a atividade da
AChE no encéfalo, entretanto houve inibição da atividade enzimática no hipocampo,
e esse efeito foi observado utilizando-se concentrações variando entre 0,89 a 3,6.
µM. Ou seja, doses muito menores do que a utilizada por Lee e colaboradores.
Embora tenha sido tentado no presente estudo utilizar as mesmas concentrações
utilizadas por Lee et al. (2004) para verificar o efeito do TRX sobre a atividade da
enzima, não fora obtido sucesso, uma vez que a reação ocorre em meio polar e o
71
TRX é um composto apolar, precipitando em concentrações mais elevadas. Lee e
colaboradores não esclarecem qual solvente fora utilizado em seus experimentos,
entretanto, sabe-se que solventes orgânicos podem desnaturar a enzima por
diminuírem a constante dielétrica do meio (MARZZOCO; TORRES, 2007).
No ensaio enzimático realizado com o AU, houve inibição da AChE na
concentração de 0,27 µM no encéfalo, já em hipocampo a atividade enzimática foi
inibida com as concentrações de 0,01, 0,09, 0,44 e 0,89 µM. Não foi observado
inibição enzimática em todas as concentrações em hipocampo, apesar de ser
encontrado nessa estrutura feixes colinérgicos bastante caracterizados (DASHNIANI
et al., 2009). Além disso, no presente trabalho, durante os experimentos não foi
possível determinar que tipo de isoformas da AChE poderiam estar sendo inibidas
pelos compostos TRX ou AU, o que explicaria efeitos diferentes desses compostos
no hipocampo. Das e colaboradores (2005) demonstraram a presença de três
isoformas, (G1, G2 e G4) as quais são distribuídas de diferentes formas por todo o
SNC.
Chung e colaboradores (2001) avaliaram o efeito do AU sobre a atividade
enzimática utilizando cultura de células PC12. Neste trabalho foi observado que o
AU apresenta uma CI50 de 7,5 nM, que é sete vezes maior quando comparado com
a tacrina (1nM), tais resultados sugerem que o AU é eficaz com relação a inibição
enzimática, entretanto, a tacrina (droga de referência na terapêutica do Alzheimer)
mostrou-se mais potente.
A variabilidade da inibição da AChE no ensaio inibitório com TRX e AU pode
ser também explicada pela diferenças da densidade colinérgica encontrada nas
estruturas cerebrais. Maior densidade reflete em atividade enzimática aumentada, e
menor densidade em atividade diminuída quando comparada com amostras
diferentes. Em estudos sobre a atividade anti-AChE em ratos diabéticos induzidos
com aloxano, Milatovic e Dettbarn (1996) demonstraram que no estriado, que é rico
em vias colinérgicas a atividade enzimática é aumentada, já no hipocampo não foi
encontrado nenhuma variação significativa (MAZZANTI et al., 2004).
Com relação ao sistema colinérgico e sua relação com a memória, várias
revisões foram encontradas na literatura e a maioria delas enfatiza a importância
desse sistema nos processos de memória, sem, entretanto especificar em qual (is)
etapa (s) o sistema é mais importante (JELTSCH-DAVID; KOENIG; CASSEL, 2008;
AMENTA; TAYEBATI , 2008; MUSIAL; BAJDA; MALAWSKA, 2007). Foi verificado
recentemente, que a ingesta prolongada e deficiente de colina pode produzir
72
distúrbios cognitivos causados por uma redução dos níveis ACh, bem como da
memória, além de distúrbios de crescimento de várias regiões cerebrais (LIAPI et
al., 2009). Esses dados confirmam com outros resultados anteriores obtidos por
Meck e colaboradores (2008) onde foi verificado que a disponibilidade de colina
durante períodos críticos do desenvolvimento cerebral influencia o desempenho
cognitivo na idade adulta e velhice, bem como enfatiza a importância da nutrição
para o sucesso cognitivo perinatal (MECK et al., 2007).
Outro fato que corrobora com a crença de que a liberação de ACh é importante
nos processos de memória é a de que o papel dos receptores muscarínicos na LTP
em muitas áreas do SNC, incluindo o hipocampo, tem sido extensivamente estudado
(LUO et al., 2008). A LTP é bloqueada por antagonistas muscarínicos e, considerada
um processo de plasticidade sináptica e modelo natural de memória (BLISS;
COLIGRIDGE, 1993; IZQUERDO, 1993).
O enfoque principal dos atuais estudos de memória em seres humanos é
direcionado aos efeitos da ACh sobre ela e sua relação com a DA, uma vez que os
principais medicamentos utilizados na terapêutica da doença são os
anticolinesterásicos, os quais por inibição da AChE promovem aumento dos
estoques de ACh no sistema nervoso central. Estudos de imagem realizados por
Shinotoh e sua equipe (2003) mediram a quantidade de AChE em pacientes com a
doença e encontraram uma redução siginicativa da enzima na amigdala (-33%), no
hipocampo (-14%) e neocortex (-20%).
Para esclarecer se os depósitos do peptídeo �-amilóide encontrados nos
cérebros de portadores de DA eram realmente responsáveis pelos distúrbios
colinérgicos e, estes por sua vez, por prejuízos de memória Watanabe e
colaboradores (2009) utilizaram animais transgênicos (Tg 2576) os quais
superexpressam o percussor mutante da proteína β-amilóide e, são descritos como
modelos de memória. Nesses animais e em camundongos normais foi medida a
liberação de ACh e sua relação com a idade dos mesmos. Esses autores verificaram
que o prejuízo da memória foi detectado em animais mais velhos tanto nos normais
quanto nos trangêbicos e, esse déficit estava claramente ligados a diminuição da
liberação de ACh. Mas as disfunções das sinapses colinérgicas podem não ser
causadas predominantemente por depósito das placas neuríticas, uma vez que o
prejuízo de memória ocorreu em ambos os grupos de animais (WATANABE et al,
2009).
73
Após ter-se confirmado a atividade anti-AChE dos compostos TRX e AU,
iniciou-se o estudo do processo de memória de longa duração, nas três etapas
principais, aquisição, consolidação e evocação através do modelo de esquiva
inibitória.
Grande parte do que se conhece atualmente a respeito dos mecanismos
celulares e moleculares envolvidos nos fenômenos de plasticidade neuronal deve-se
à descrição do fenômeno da LTP feito por Bliss e Lomo (1973). A LTP (long term
potentiation) ou potenciação de longa duração consiste em um aumento na
eficiência da transmissão sináptica em neurônios de estruturas cerebrais como o
hipocampo, em resposta a um estímulo de alta freqüência. Ao longo dos anos
demonstrou-se que a LTP compartilha inúmeras e importantes características do
aprendizado e novas memórias, sendo apontado pela grande maioria dos estudiosos
do assunto como o mecanismo de memória neuronal (BLISS; COLIGRIDGE, 1993;
IZQUERDO, 1993; IZQUERDO, 1994; EICHENBAUM, 1997; RAO; FINKBEINER,
2007; McLEOD; SUNDRAM; DREAN, 2008; WOSTYN; AUDENAERT; DE DEYN,
2008).
As características que a LTP possui elegendo-a como possível mecanismo de
memória são: indução rápida (aquisição); grande labilidade durante o período pós-
indução (consolidação), em que ocorre seu estabelecimento perdurável e permite
sua manutenção, mantendo-se por longo período na ausência de estimulação; e, por
último, expressão imediata da resposta quando é novamente aplicado o estímulo
original (evocação) (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993; REYMANN, 1993; IZQUERDO,
1993; RAO; FINKBEINER, 2007; McLEOD; SUNDRAM; DREAN, 2008).
No presente trabalho, os experimentos demonstraram que AU e TRX se
mostraram como agentes facilitadores do processo de memória, porém com atuação
diferente conforme a etapa do processo estudada. O tratamento com AU melhora a
aquisição e consolidação da memória dos animais, e não afeta a evocação,
enquanto que o TRX não afeta o processo de aquisição, porém afeta os processos
de consolidação e evocação.
Estudos farmacológicos bioquímicos e moleculares foram realizados ao longo
desses anos, para tentar desvendar quais os mediadores envolvidos em cada etapa
da memória. Hoje se sabe que o sistema GABAérgico é de fundamental importância
para a formação da memória e a etapa de aquisição da memória conta também,
com a participação do sistema glutamatérgico, principalmente dos receptores NMDA
e ativação de PKA no hipocampo (BOURTCHOULADZE at al., 1998). De acordo
74
com Barros (2001) e Lin (2001 e 2003) com suas respectivas equipes, o IP3 tem
papel fundamental na aquisição da memória, formação de MLD e MCD e PLD.
O processo de consolidação da memória envolve inicialmente a ativação dos
receptores de glutamato NMDA, AMPA/kainato e mGluRs, ativação de PKA, PKC e
CaMKII na região CA1 do hipocampo (JERUSALINSKY et al., 1992; IZQUIERDO;
MEDINA, 1997; CAMMAROTA et al., 1998; VIANNA et al., 2000). A expressão de
genes e a síntese protéica é essencial para a formação da MLD (IGAZ et al., 2004).
Segundo Cammarota e colaboradores (2000) 2 a 3 horas após o treino com animais,
a atividade de PKA é aumentada na região CA1, e essa atividade depende da
ativação prévia de receptores NMDA. Depois da ativação de PKA tem-se também a
ativação de ERK (signal-regulated kinase) nesta região, que coincide com o
aumento da fosforilação do fator de trancrição CREB e então tem-se a expressão de
genes e síntese protéica (IGAZ et al., 2002). Receptores dopaminérgico D1
juntamente com receptor �-noradrenérgico apresentam papel facilitatório da
memória nesta etapa, entretanto receptores serotonérgicos como 5HT-A1 é deletério
para a consolidação na região CA1, 6 horas após o treino (ARDENGHI et al., 1997).
Ainda na consolidação da memória, etapa com mais mecanismos envolvidos,
ocorre ativação de receptores dopaminérgicos D1 3 a 4 horas após o treino dos
animais, melhorando a consolidação da memória através de uma estimulação
indireta de PKA via adenilato ciclase (ARDENGHI et al., 1997). Também já é
conhecida a participação dos receptores �1, �2 e �1 noradrénergicos na
consolidação da memória (GIBBS; SUMMERS, 2001a; GIBBS; SUMMERS, 2001b;
GIBBS; SUMMERS, 2002), como também dos receptores de histamina H1 e H2 (DE
ALMEIDA; IZQUIERDO, 1986, 1988; XU et al., 2009).
A etapa de evocação da memória é menos dependente do hipocampo
(BONTEMPI et al., 1999; ANAGNOSTARAS; MAREN; FANSELOW, 1999). Segundo
alguns estudos, os receptores NMDA e a ativação de PKA e PKC, são importantes
para a aquisição, essenciais para a consolidação, mas desnecessárias para a
evocação (STEELE; MORRIS, 1999; BOURTCHOULADZE et al., 1998; GOOSENS;
HOLT; MAREN, 2000). Mansuy e colaboradores (1998) encontraram a
superexpressão de CaMKII� e serina/treonina fosfatase após evocação da memória
espacial.
A evocação também requer PKA e ERK na região CA1, basolateral da
amigdala, córtex entorrinal e parietal, e córtex circular anterior, indicando que a
75
evocação não acontece somente no hipocampo, desta forma, esta etapa está
distante de ser um evento passivo (BARROS et al., 2003).
Os resultados do presente trabalho não só enfatizam que o AU e o TRX
produzem a melhora da cognição dos animais, atuando de forma diferente nos
processos de aquisição e a consolidação e evocação da tarefa da esquiva-inibitória,
como também estabelecem uma relação entre o seus mecanismos de ação com o
sistema colinérgico, ou seja, a capacidade desses compostos de inibir a ação da
AChE, o que leva ao aumento das concentrações de ACh e, a alteração da amésia
induzida por escopolamina, um antagonista muscanínico. Os resultados sugerem
que o bloqueio competitivo de receptores muscarínicos cerebrais pela escopolamina
é revertido pelo aumento da demanda de ACh nas sinapses, induzida pelo efeito de
ambos os compostos sobre a atividade da AChE.
Dados farmacológicos demonstram claramente o papel dos receptores
colinérgicos, tanto muscarínicos quanto nicotínicos, na codificação de novas
memórias. Estudos realizados com lesões localizadas de neurônios colinérgicos ou
infusões de antagonistas demostram a importância desde sistema nos processo de
cognição. Além disso, modelos computacionais ajudam a esclarecer a função da
modulação colinérgica com efeitos celulares específicos em regiões cerebrais
importantes nos processos de memória (HASSELMO, 2006).
As similaridades entre alterações relacionadas à memória de pacientes
portadores da DA e animais tratados com escopolamina já foram relatados por
Rubio (2007). Devido a esse fator, a escopolamina tem sido utilizada como
ferramenta farmacológica para se produzir um dos primeiros modelos animais dessa
desordem, ou pelo menos sua sintomatologia primordial, o défict de memória.
Ainda com relação a possíveis mecanismos de ação dos compostos em estudo,
relacionando ACh, AU e DA, Lu et al. (2007) demonstraram que o composto produz
melhora da cognição de animais idosos tratados com D-galactose, a qual produz
neurotoxidade em regiões hipocampais e é considerado um dos melhores modelos
animais atuais de DA. Os autores demonstraram que efeito o do AU contra a
neurotoxidade induzida pela D-galactose pode estar relacionado com a produção de
enzimas com propriedades antioxidantes, além da redução do processo de
peroxidação lipídica. De fato, a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS)
tem sido apontada nos últimos anos, como um dos fatores envolvidos na morte
celular em vários processos neurodegenerativos, como ocorre nas DP e DA
(OLANOW, 1994; CASTEGNA et al., 2002; DE LULLIS et al., 2005; ZHANG et al.,
76
2005; JUN LU et al. 2007). Por outro lado, como ressaltado anteriormente, estudos
têm recentemente sugerindo que o AU inibe a indução da formação do peptídeo �-
amilóide, o que diminui a produção de radicais livres e a peroxidação lipídica em
células neurais, ocorrendo desta maneira uma redução dos efeitos neurotóxicos, da
apoptose e da morte celular neste grupo (HARKANY, 1999; HEO et al., 2002; DAN
LIU et al., 2008).
Os resultados obtidos por Lu et al. (2007) reforçam outros dados descritos
anteriormente por Shih e colaboradores (2002), os quais mostram que o efeito
antioxidante do AU protege o hipocampo de animais contra a neurotoxidade
produzida por aminoácidos excitatórios como o cainato via receptores AMPA. De
fato, Shih e colaboradores (2002) verificaram que culturas de células isoladas do
hipocampo e submetidas a um tratamento com cainato, quando incubadas com o
AU, tiveram redução dos efeitos neurotóxicos do cainato. Os autores sugeriram que
o AU poderia estar exercendo seus efeitos por: (i) modulação dos receptores AMPA
afetando o sítio de ligação do kainato com esses receptores, (ii), promover a
proteção das mitocôndrias das células hipocampais e, (iii) produzir a diminuição da
produção de radicais livres. Os autores também referem que o efeito anti-radicais
livres do AU pode ser observado em outros tecidos como, por exemplo, os
hepatócitos, e que podem também estar relacionado com os efeitos tanto
antiinflamatórios (MARTIN-ARAGON, et al, 2001), quanto anti-tumorais (YOU et al.,
2001) já detectados com o AU.
O AU é um composto bastante estudado e, desde seu isolamento e
identificação por Rowe e colaboradores (1949) o triterpeno AU vem sendo
constantemente estudado, tendo apresentado as mais variadas propriedades
farmacológicas variando entre efeitos periféricos e centrais. O interesse no
composto como possível candidato a medicamento é tamanho, que só perde para o
flavonóide quercetina, o qual é considerado como o fitoconstituinte com maior
número de estudos.
Os possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos do TRX detectados nesse
trabalho não são tão óbvios e correlacionados, como visto com o AU. O composto foi
isolado pela primeira vez de flores de várias plantas da família das Compositae
como, por exemplo, Calendula officinalis, onde foi descrito seu primeiro efeito
farmacológico, o efeito antiinflamatório (AKIHISA et al., 1996). O composto também
apresenta efeitos centrais em células gliais reduzindo a atividade de óxido nítrico,
(TSAO et al., 2008) é antiinflamatório (SINGH, SAHU, SHARMA, 2002), e
77
antitumoral (JANG et al., 2004; CHATURVEDULA et al., 2004). Seus efeitos centrais
como atividade ansiolítica, antidepressiva, anticonvulsivante, antioxidante e, até
mesmo sua relação com a peptídeo β-amiloide ainda merecem ser estudados. E
talvez não tenham sido feitos devido ao baixo rendimento do composto e da sua
presença como fitoconstituinte em menor escala nas plantas quando comparamos
com o AU. Portanto, a única hipótese relacionada ao seu efeito facilitador da
memória até o momento identificado, resulta exclusivamente na sua capacidade de
inibir a enzima AChE.
Relacionando a estrutura química de ambos os compostos utilizado no
presente estudo, pode-se observar uma diferença estrutural entre os triterpenos AU
e o TRX, principalmente no que se refere a presença de grupo carboxílico no C-17
do AU, não observado no TRX e, em relação a posição da dupla ligação, no AU
encontra-se entre os carbonos 11 e 12 e no TRX nos carbonos 14 e 15.
Apesar destes compostos pertencerem a mesma classe química dos
triterpenos, as pequenas diferenças supracitadas podem alterar a conformação
espacial da molécula contribuindo ou não de maneira efetiva à ligação com
receptores endógenos. Entretanto, os experimentos realizados no presente estudo,
não fornecem subsídios suficientes para uma extrapolação entre os efeitos
biológicos encontrados com ambos os compostos e uma correlação entre a estrutura
e a atividade de ambos.
Durante esse trabalho alguns experimentos farmacológicos adicionais foram
requeridos para verificar se os efeitos dos compostos sobre a memória poderiam ter
sofrido interferências de traços de ansiedade dos animais ou de possíveis
interferências sobre o sistema motor dos mesmos. Conforme dito anteriormente,
nestes experimentos foram utilizados somente o AU.
O MOF é um teste utilizado para analisar comportamentos baseados em
situações de conflito natural. Normalmente o conflito no animal é a exploração e a
aversão a ambientes abertos e claros. O número total de cruzamentos (crossings)
durante o teste é considerado um índice de atividade locomotora, enquanto que o
numero de levantadas (rearings) é considerado um índice de atividade exploratória
(LOTUFO et al., 2004). Dessa forma, o modelo pode descriminar se a substância-
teste exibe efeito ansiolítico ou efeito depressor inespecífico atuando em regiões
cerebrais envolvidas também coma atividade exploratória do animal (SILVA et al.,
2006). Os resultados apresentados demonstram que o AU não produziu efeito sobre
o sistema motor dos animais, uma vez que o número de cruzamentos não foi
78
alterado quando comparado com o grupo controle. Entretanto, a atividade
exploratória foi significativamente aumentada, o que sugere que o AU possa ter um
efeito estimulante inespecífico sobre o SNC ou efeito ansiol’itico semelhante ao
midazolam.
O fato de não produzir alteração significativa no número de cruzamentos foi
de fundamental importância, uma vez que, em outros modelos animais como o
labirinto em cruz elevado e o teste da esquiva inibitória, poderíamos obter resultados
“falsos-positivos”.
Os resultados também demonstraram que o tratamento com midazolan
produziu um aumento no número de rearings. Tal resultado já era esperado uma vez
que o fármaco realmente causa ansiólise. O midazolam é um medicamento derivado
do grupo das imidazobenzodiazepinas utilizado para o tratamento da insônia
(AMORIN; ARAÚJO; MONTENEGRO; SILVA, 2008).
Em nossos estudos, também foi analisado o efeito do AU infundido no
hipocampo, sobre a ansiedade dos animais uma vez que traços de ansiedade
podem modular positiva ou negativamente memórias, dependendo do tipo (TRYON;
McKAY, 2008). Além disso, o sistema septo-hipocampal interage nesses processos
juntamente com outras estruturas cerebrais como a substância cinzenta
periaquedutal (SCPD) e a amígdala (AMG) (IZQUIERDO, 2002; PAUL et al., 2008).
Com esse intuito foi utilizado como modelo experimental o labirinto em crus elevado
(LCE).
O LCE é o modelo animal de ansiedade mais utilizado no mundo. Um
levantamento feito através do site da internet, web of science (a partir do portal
CAPES: www.periodicos.capes.gov.br), mostrou que, de 1987 até o ano de 2008,
foram produzidos aproximadamente 15.200 trabalhos científicos indexados
utilizando ou citando o LCE, dos quais mais de 250 deles realizados no Brasil. Ao
longo desses anos, os resultados obtidos em experimentos que utilizaram este
modelo têm contribuído não só para o desenvolvimento de novos compostos
ansiolíticos, como também para o conhecimento das bases neurobiológicas da
ansiedade e, mais recentemente, na avaliação da idade emocional de animais
submetidos a técnicas de deleção gênica.
O modelo do LCE assenta-se no comportamento exploratório espontâneo de
roedores em um ambiente com dois níveis de maior (braços abertos) ou menor
(braços fechados com paredes) característica aversiva. Esse fato gera inicialmente
um conflito aproximação-esquiva aos braços abertos, resultado da tendência
79
exploratória do roedor e do medo/novidade. Handley e Mithani (1984) mostraram
que este tipo de labirinto era sensível a drogas ansiolíticas (maior atividade nos
braços abertos) e ansiogênicas (menor atividade nos braços abertos), o que foi
confirmado por vários pesquisadores. Alguns fatos notáveis mostram que neste
modelo os animais apresentam aumento dos níveis de corticosterona plasmática;
analgesia bloqueada por drogas ansiolíticas, aprendizado de uma resposta de
esquiva; e aumento na atividade de neurônios em áreas envolvidas com as
respostas de medo/ansiedade, tais como AMG, hipotálamo e SCPD, entre outras
(CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005).
Quando os animais permanecem nos braços abertos, manifestam
comportamentos de medo espontâneo, tais como congelamento, defecação e
micção. Nestas mesmas superfícies altas e estreitas apresentam posturas de
estiramento e imersão da cabeça abaixo do piso na lateral da superfície (head-
diping). Para evitar essa situação ansiogênica, os animais permanecem maior tempo
nos braços fechados (BELZUNG; GRIEBEL, 2001; CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005;
WITKIN, 2008). O comportamento animal natural é caracterizado por evitar a entrada
nos braços do aparelho. Essa tendência é diminuída quando administrada-se
fármacos ansiolíticos, como por exemplo, o midazolam ou diazepam, com o
tratamento há tendência em aumentar a freqüência e o tempo de permanência dos
animais nos braços abertos, enquanto que substâncias ansiogênicas, como a
ioimbina, tende a um aumento da freqüência de entrada e o tempo de permanência
dos animais nos braços fechados (PELLOW et al., 1985; ARAGÃO et al., 2006).
Justifica-se o uso do midazolam como controle positivo, por ser um
benzodiazepínico e aumentar a percentagem de entradas e tempo de permanência
dos animais nos braços abertos, diminuindo esses parâmetros comportamentais nos
braços fechados.
O efeito do AU no modelo LCE foi semelhante aos efeitos obtidos pelo
tratamento com midazolam na concentração de 0,75µg/sitio. Esse resultado foi
observado quando os animais aumentaram a freqüência de entrada nos braços
aberto permanecendo maior tempo nesses braços, bem como, diminuíram a
freqüência de entrada e o tempo de permanência nos braços fechados. Tais
resultados demonstraram que o AU não só apresenta efeito ansiolítico quando
administrado por via sistêmica com demonstrado por Taviano e colaboradores
(2007) como também apresenta efeito ansiolítico quando administrado centralmente
no hipocampo.
80
7 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam os dados já existentes
na literatura sobre a atividade anticolinesterásicas dos compostos AU e TRX.
Os resultados do AU sobre a memória estendem resultados obtidos
anteriormente e indicam que o AU pode interferir no processo de memória atuando
na consolidação.
Com relação ao TRX, os resultados obtidos indicam que o composto pode
interferir nos processo de memória, tanto na consolidação e evocação.
Entretanto ambos os compostos revertem a amnésia induzida por
escopolamina, sendo que o AU reverteu o quadro amnésico durante os processos
de aquisição e consolidação, enquanto que com o tratamento com o TRX esses
efeitos foram observados nas três etapas da memória.
Estes resultados indicam parcialmente que um dos possíveis efeitos destes
compostos podem ser mediados via sistema colinérgico, uma vez que ambos
revertem a amnésia induzida por escopolamina além de terem atividade
anticolinesterásica.
Os resultados em conjunto também apontam que ambos os compostos, (mas
principalmente o AU) possuem potencial farmacológico como candidato a fármaco
para tratamento de doenças neuropsiquiátricas e/ou neurodegenerativas
relacionadas com déficit de memória.
81
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