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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ADRIANA GASPARETTO SOLETTI
EFEITOS DA SAZONALIDADE SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA,
POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO E MUTAGÊNICO DOS
ÓLEOS ESSENCIAIS E FRAÇÕES DICLOROMETANO E ACETATO
DE ETILA DE Piper amplum E Piper cernuum
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE DOUTORADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ADRIANA GASPARETTO SOLETTI
EFEITOS DA SAZONALIDADE SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA,
POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO E MUTAGÊNICO DOS
ÓLEOS ESSENCIAIS E FRAÇÕES DICLOROMETANO E ACETATO
DE ETILA DE Piper amplum E Piper cernuum
Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz Co-orientadora: Profa. Dra. Angela Malheiros
Itajaí, Junho de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
S43e
Soletti, Adriana Gasparetto, 1983- Efeitos da sazonalidade sobre a composição química, potencial antimicrobiano, citotóxico e mutagênico dos óleos essenciais e frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum e Piper cernuum / Adriana Gasparetto Soletti, 2015. 183f. ; il.; fig.; tab. Cópia de computador (Printout(s)). Tese (Doutorado) Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz” Bibliografia: p.161-183 1. Óleos essenciais. 2. Plantas medicinais. 3. Piper amplum. 4. Piper cernuum. 5. Micoses. I. Título. CDU: 615.32
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
EFEITOS DA SAZONALIDADE SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA,
POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO E MUTAGÊNICO DOS
ÓLEOS ESSENCIAIS E FRAÇÕES DICLOROMETANO E ACETATO
DE ETILA DE Piper amplum E Piper cernuum
ADRIANA GASPARETTO SOLETTI
Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
____________________________________________________________ Clóvis Antônio Rodrigues, Doutor
Coordenador do Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas
Apresentada perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
____________________________________________________________ Doutor Alexandre Bella Cruz (Univali)
Presidente
____________________________________________________________ Doutora Angela Malheiros (Univali)
Co-orientador
____________________________________________________________ Doutor Clóvis Antônio Rodrigues (Univali)
Membro Interno
____________________________________________________________ Doutora Márcia Maria de Souza (Univali)
Membro Interno
____________________________________________________________ Doutor Obdulio Gomes Miguel (UFPR)
Membro Externo
____________________________________________________________ Doutor Ricardo Andrade Rebelo (FURB)
Membro Externo Itajaí (SC), Junho de 2015.
Dedico este trabalho ao meu marido Giancarlo, amor da minha
vida, por aceitar trilhar esse caminho ao meu lado, ao Aureus José, meu filhote de quatro patas, meu companheiro fiel, e aos meus pais, Alcebíades e Ângela, por investir e incentivar minha caminhada infinita em busca do conhecimento e, pelo exemplo de família, de homem, de mulher, de casal, de pai, de mãe, de luta, de fé, de coragem, de caráter, enfim, por tudo!
Amo vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, pelo amor, carinho, compreensão, fé, luta, dedicação, por serem meu alicerce, meu porto seguro e principalmente por acreditar e investir em mim para realização desse projeto. Pois tudo que faço é para que tenham orgulho do ser humano que me tornei.
Agradeço ao Meu Amor, Giancarlo, pelo amor, companheirismo, carinho, por acreditar nesse sonho, pela paciência em dias incomuns, pela presença mesmo não estando presente, pelas histórias que temos para contar, e especialmente pelas que ainda escreveremos.
Agradeço ao Aureus José, meu cãozinho, por sua presença constante que me anima, me encoraja e faz todos os meus dias muito mais felizes.
Agradeço aos meus irmãos Marcelo, Alexandra e Maurício, pelo apoio, torcida, amor, carinho, amizade, e especialmente pelo que somos juntos, uma base forte, consolidada no amor.
Agradeço aos meus sogros Sergio e Terezinha pelo apoio, torcida e por proporcionar uma vida em Balneário Camboriu muito mais confortável.
Aos meus cunhados, Diogo, Giorgia, Francine, Gustavo, Geíza pela torcida e em especial a Lígia que contribuiu na construção desse trabalho.
Aos meus sobrinhos lindos Bernardo, Enzo, Gabriela e Matheus por me permitirem amar de uma forma totalmente nova.
Agradeço a minha família em geral, que de alguma forma e de algum lugar torceram e acreditaram nesta conquista.
Agradeço a Elza e Jéssica pela torcida de sempre, pelo apoio em todas as circunstâncias, e pelas comidinhas que alimentavam meu coração.
Agradeço a todos os meus amigos amados que mesmo estando distantes, se fazem presente.
Agradeço a Ana Milda, Roseane e Luciane, amigas que ganhei nessa caminhada, pelo companheirismo, pela divisão da carga, pelos bons momentos que se eternizarão em meu coração.
Agradeço aos meus sempre alunos, especialmente àqueles que se tornaram amigos e hoje são frutos de imenso orgulho e admiração, mas que acima de tudo me fizeram ter a certeza que a docência é minha verdadeira paixão.
Agradeço a Deus, pela fé e principalmente por ser a única certeza em dias que a dúvida era constante.
Agradeço ao Alexandre Bella Cruz e Angela Malheiros meus orientadores, pela dedicação, exemplo, empenho, paciência, ensinamentos
científicos e de vida, por ser parte importante nesse capítulo da minha vida.
Agradeço ao Clóvis Antônio Rodrigues, Márcia Maria de Souza, Obdulio Gomes Miguel e Ricardo Andrade Rebelo, membros da banca que muito contribuiram com esse trabalho. Agradeço ao Juliano e Elenize, pela cooperação e amizade.
Agradeço ao Clóvis Antônio Rodrigues e em seu nome, todos os professores da UNIVALI, que fizeram parte dessa caminhada. Ao CNPQ e FAPESP pelo apoio financeiro.
“... mas é preciso ter manha, é preciso ter graça, é preciso ter sonho sempre. Quem traz na pele essa marca, possui a estranha mania de ter fé na vida...”
Maria Maria – Milton Nascimento
EFEITOS DA SAZONALIDADE SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA,
POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO E MUTAGÊNICO DOS
ÓLEOS ESSENCIAIS E FRAÇÕES DICLOROMETANO E ACETATO
DE ETILA DE Piper amplum E Piper cernuum
Adriana Gasparetto Soletti Itajaí, Junho de 2015
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz Co-orientador: Profa. Dra. Angela Malheiros Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 183 Espécies do gênero Piper têm sido investigadas como fonte de novos produtos naturais com atividades biológicas promissoras, destacando a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da sazonalidade na composição química, potencial antimicrobiano, citotóxico e mutagênico dos óleos essenciais e frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum nas diferentes estações do ano. Os óleos foram extraídos por hidrodestilação com clevenger, e o hidrolato foi submetido a partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. Os óleos foram caracterizados por CG/EM, índice de retenção, IV e RMN 1H e 13C. A atividade antimicrobiana foi realizada por bioautografia e diluição em ágar. O potencial citotóxico e mutagênico foi realizado pelo ensaio de mutação reversa sobre S. cerevisae. Nos óleos essenciais de P. amplum, foi possível identificar 43 substâncias (91,54 a 93,93%), sendo os majoritários β-cariofileno (15,5 a 20,58%), α-pineno (10,29 a 14,86%), cadin-4-en-7-ol (5,72 a 8,06%), α-guaieno (6,6 a 8%), α-copaeno (5,98 a 7,85%), germacreno D (4,44 a 8,61%), Limoneno (5,10 a 6,45%) e germacreno B (3,09 a 5,07%). Nos óleos de P. cernuum, identificou-se 27 substâncias (92,89 a 98,44%), sendo os majoritários trans-dihydroagarofurano (30 a 36,7%), 4-epi-cis-dihidroagarofurano (11,2 a 13,4%), γ-eudesmol (7,64 a 11,65%), β-cariofileno (5,94 a 8,69%), elemol (5,89 a 9,15%), α-pineno (2,63 a 5,43%) e canfeno (2,16 a 4,55%). Os óleos essenciais e as frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum apresentaram-se ativos contra bactérias Gram positivas, dermatófitos e C. neoformans, sem evidência de potencial mutagênico para todas as amostras referentes às quatro estações do ano. Contudo foi possível concluir que a sazonalidade influenciou no rendimento, na composição química, na atividade antimicrobiana e no potencial citotóxico das amostras testadas. Demonstrando a importância na determinação da época de coleta mais adequada para a obtenção de produtos naturais com composição química mais constante, melhor atividade biológica e menor toxicidade. Palavras-chave: P. amplum. P. cernuum. Atividade antibacteriana. Atividade antifúngica. Potencial citotóxico. Potencial mutagênico. Óleos essenciais.
EFFECTS OF SEASONALITY ON THE CHEMICAL COMPOSITION,
ANTIMICROBIAL, CYTOTOXIC AND MUTAGENIC POTENTIAL OF
ESSENTIAL OILS AND FRACTIONS OF DICHLOROMETHANE AND
ETHYL ACETATE OF Piper Amplum AND Piper Cernuum
Adriana Gasparetto Soletti Itajaí, June 2015
Supervisor: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz Co-supervisor: Prof. Dr. Angela Malheiros Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 183 Species of the Piper genus have been investigated as a source of new natural products with promising biological activities, particularly for the antimicrobial activity of the essential oils. This study aims to evaluate the influence of seasonality on the chemical composition, as well the antimicrobial, cytotoxic and mutagenic potential of essential oils and fractions of dichloromethane and ethyl acetate of P. amplum and P. cernuum in the different seasons of the year. The oils were extracted by Clevenger hydrodistillation, and the hydrolact was submitted to liquid-liquid partition with increasing polarity solvents. The oils were characterized by GC/MS, retention index, IR and 1H and 13C NMR. The antimicrobial activity was performed by bioautography and agar dilution. The cytotoxic and mutagenic potential were determined by the reverse mutation test on S. cerevisiae. It was possible to identify 43 substances in the essential oils of P. amplum (91.54 to 93.93%), the majority substances being β-caryophyllene (15.5 to 20.58%), α-pinene (10.29 to 14.86%), cadin-4-en-7-ol (5.72 to 8.06%), α-guaiene (6.6 8%), α-copaene (5.98 to 7.85%), germacrene D (4.44 to 8.61%), D-limonene (5.10 to 6.45%) and germacrene B (3.09 to 5.07%). In P. cernuum oils, 27 substances were identified (92.89 to 98.44%), the majority being trans-dihydroagarofurane (30 to 36.7%), 4-epi-cis-dihydroagarofurane (11.2 to 13.4%), γ-eudesmol (7.64 to 11.65%), β-caryophyllene (5.94 to 8.69%), elemol (5.89 to 9.15%), α-pinene (2.63 to 5.43%) and camphene (2.16 to 4.55%). The essential oils and fractions of dichloromethane and ethyl acetate of P. amplum and P. cernuum were active against Gram positive bacteria, dermatophytes and C. neoformans, with no evidence of mutagenic potential for all samples, for all four seasons of the year. However, it was possible to conclude that seasonality influences the performance, chemical composition, antimicrobial activity and cytotoxic potential of the tested samples, which demonstrates the importance of determining the most appropriate season for collection, in order to obtain natural products with the most constant chemical composition, best biological activity, and lowest toxicity. Keywords: P. amplum. P. cernuum. Antibacterial activity. Antifungal activity. Cytotoxic potential. Mutagenic potential. Essential oils.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Moléculas antibacterianas obtidas por modificação semissintética a partir de produto natural no período de 2006 a 2010............................................ 26
Figura 2: Mecanismos de resistência do Staphylococcus aureus aos antibióticos não β-lactâmicos e não glicopéptidos................................................ 29
Figura 3: Fases de crescimento de Saccharomyces cerevisiae em meio completo................................................................................................................ 43
Figura 4: Fatores de influência no conteúdo e acúmulo de metabólitos secundários em planta.......................................................................................... 47
Figura 5: Rota biossintética dos fenilpropanoides............................................... 51
Figura 6: Estruturas precurssoras dos terpenoides............................................. 52
Figura 7: Distribuição geográfica de Piper em ambos os hemisférios................. 58
Figura 8: Folhas de Piper amplum....................................................................... 63
Figura 9: Folhas de Piper cernuum...................................................................... 63
Figura 10: Extração de óleo essencial de Piper amplum e Piper cernuum por hidrodestilação com o auxílio do aparato Clevenger............................................ 67
Figura 11: Partição líquido-líquido dos hidrolatos de Piper amplum e Piper cernuum, com diclorometano e acetato de etila, e posterior eliminação dos solventes em rota evaporador............................................................................... 68
Figura 12: Preparo de inóculos bacterianos e de fungos leviduriformes............. 72
Figura 13: Ensaio de bioautografia para o direcionamento das pesquisas quanto à localização dos compostos bioativos para atividade antimicrobiana....................................................................................................... 74
Figura 14: Representação do procedimento de determinação de atividade antimicrobiana pelo método de diluição em ágar: (a) concentração inibitória mínima; (b) concentração microbicida mínima..................................................... 77
Figura 15: Representação da ativação da levedura Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C) para ensaio de mutagenicidade..................................................... 79
Figura 16: Representação da preparação do inóculo de Saccharomyces cerevisiae para o ensaio mutagênico.................................................................... 80
Figura 17: Representação do procedimento para realização da análise mutagênica............................................................................................................ 82
Figura 18: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano................................................................................... 89
Figura 19: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001)........................................................................................................... 97
Figura 20: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper amplum em relação a sazonalidade..................... 99
Figura 21: Análise comparativa dos compostos majoritários presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001)..................... 100
Figura 22: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano............................................................................ 102
Figura 23: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013)........................................................... 109
Figura 24: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum em relação a sazonalidade.................... 111
Figura 25: Análise comparativa dos compostos majoritários presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013)........................................................... 112
Figura 26: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano................................................................ 115
Figura 27: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano................................................................ 116
Figura 28: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano................................... 119
Figura 29: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.................................. 120
Figura 30: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper amplum obtidos na primavera..................................................................... 121
Figura 31: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper cernuum obtidos no inverno........................................................................ 122
Figura 32: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum...................................................... 126
Figura 33: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum e Piper cernuum nas estações de verão e outono.................................................................................. 127
Figura 34: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. aureus dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Santos et al. (2012) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006)............................. 132
Figura 35: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. pyogenes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003)................. 133
Figura 36: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra B. subtilis dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006)............................................ 134
Figura 37: Análise comparativa da atividade antifúngica contra M.gypseum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 137
Figura 38: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. mentagrophytes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012).................................................................................................................... 137
Figura 39: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. rubrum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 138
Figura 40: Análise comparativa da atividade antifúngica contra E. flocosum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 138
Figura 41: Análise comparativa da atividade antifúngica contra C. neoformans dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 139
Figura 42: Análise comparativa da atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.............................................................................. 146
Figura 43: Análise comparativa da atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.............................................................................. 150
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Quantidade de matéria prima vegetal seca e triturada de Piper amplum e Piper cernuum e quantidade de água destilada necessária para obtenção de óleo essencial por hidrodestilação................................................... 67
Tabela 2: Rendimento dos óleos essenciais obtidos a partir das folhas de Piper amplum e Piper cernuum coletadas ao final de cada estação.................... 84
Tabela 3: Densidade absoluta dos óleos essenciais obtidos de Piper amplum e Piper cernuum....................................................................................................... 87
Tabela 4: Rendimento das frações dicloromentano e acetato de etila obtidos a partir dos hidrolatos oriundos da extração dos óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum...................................................................................... 88
Tabela 5: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano........................................................................................................................ 90
Tabela 6: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano............... 103
Tabela 7: Valores de deslocamentos químicos de RMN 13C para as substâncias majoritárias presentes no óleo essencial de P. cernuum [ɣ v (ppm), CDCl3]................................................................................................................... 124
Tabela 8: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações............................................................................................... 130
Tabela 9: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações............................................................................................... 130
Tabela 10: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................ 136
Tabela 11: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................ 136
Tabela 12: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações................................................... 144
Tabela 13: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações.................................................. 145
Tabela 14: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................................................................................................... 148
Tabela 15: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................................................................................................... 149
Tabela 16: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. amplum nas quatro estações do ano............................... 154
Tabela 17: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. cernuum nas quatro estações do ano.............................. 155
Tabela 18: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. amplum nas quatro estações do ano................................................................................................................... 156
Tabela 19: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. cernuum nas quatro estações do ano................................................................................................................... 157
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4-NQO Óxido de Nitroquinoleína
ANOVA Análise de Variância.
CBM Concentração Bactericida Mínima.
CC Cromatografia em Coluna.
CCD Cromatografia em Camada Delgada.
CDC Center for Diseases Control and Prevention.
CFM Concentração Fungicida Mínima.
CG Cromatografia Gasosa.
CIM Concentração Inibitória Mínima.
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute.
CMM Concentração Microcida Mínima.
DAEC Escherichia coli difusamente aderente.
DMSO Dimetilsulfóxido.
EAEC Escherichia coli enteroagragativa.
EHEC Escherichia coli enterohemorrágica.
EIEC Escherichia coli enteroinvasora.
EM ou MS Espectrometria de Massa
EPEC Escherichia coli enteropatogênica.
ESBLs β-lactamases de espectro ampliado.
ETEC Escherichia coli enterotoxigênica.
eV Eletro volt.
FDA Food and Drug Administration.
GISA Staphylococcus aureus resistente a vancomicina e teicoplamina.
IK Indice de Kovats.
IR Indice de Retenção.
LT Termolábel.
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina.
NI Não Identificado.
NNIS National Nosocomical Infections Surveillance.
OECD Organization for economic Co-operation and Development.
PBP2a Penicilina ligada a proteína 2ª.
Rf Fator de retenção.
RMN Ressonância Magnética Nuclear.
SC Meio Mínimo Completo.
ST Termoestável.
TTC Cloreto 2,3,5 trifenil tetrazólico.
UFC/mL Unidades Formadoras de Colônias por Mililitros.
UFCs Unidades Formadoras de Colônias.
VISA Staphylococcus aureus resistente a vancomicina.
YEL Meio Líquido de Extrato de Levedura
YEPD Meio Ágar Extrato de Levedura
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 19
2 OBJETIVOS....................................................................................................... 21
2.1 Objetivo Geral............................................................................................. 21
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................... 21
3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................. 22
3.1 Atividade Antimicrobiana.......................................................................... 22
3.1.1 Staphylococcus aureus.................................................................... 27
3.1.2 Streptococcus pyogenes................................................................. 30
3.1.3 Bacillus subtilis................................................................................. 31
3.1.4 Escherichia coli................................................................................. 32
3.1.5 Dermatofitoses.................................................................................. 33
3.1.6 Micoses Oportunistas....................................................................... 34
3.1.6.1 Candidíase............................................................................. 34
3.1.6.2 Criptococose......................................................................... 37
3.1.6.3 Aspergilose............................................................................ 38
3.1.6.4 Mucormicose......................................................................... 39
3.2 Avaliação da Toxicidade........................................................................... 40
3.2.1 Mutagenicidade Sobre Saccharomyces cerevisiae....................... 41
3.3 Plantas Medicinais..................................................................................... 44
3.3.1 Metabolismo Secundário Vegetal e Influência Sazonal................ 46
3.3.2 Substâncias Obtidas de Plantas Medicinais e Atividade Antimicrobiana................................................................................................... 49
3.4 Óleos Essenciais....................................................................................... 49
3.4.1 Métodos Extrativos de Óleos Essenciais....................................... 53
3.4.2 Métodos de Caracterização de Óleos Essenciais.......................... 55
3.5 Família Piperaceae e o Gênero Piper....................................................... 57
3.5.1 Piper amplum.................................................................................... 62
3.5.2 Piper cernuum................................................................................... 63
4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 66
4.1 Material Vegetal.......................................................................................... 66
4.1.1 Obtenção dos Óleos Essenciais e Frações.................................... 66
4.1.2 Partição Líquido-Líquido.................................................................. 67
4.1.3 Caracterização dos Óleos Essenciais............................................. 68
4.2 Material Microbiológico............................................................................. 70
4.2.1 Micro-organismos……….................................................................. 70
4.2.2 Atividade Antimicrobiana................................................................. 71
4.2.3 Preparo de Inóculos Bacterianos.................................................... 71
4.2.4 Preparo de Inóculos Fúngicos......................................................... 72
4.2.5 Bioautografia..................................................................................... 73
4.2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)............... 74
4.2.7 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Fungicida Mínima (CFM)..................................................................................... 76
4.3 Avaliação de Mutagenicidade................................................................... 78
4.3.1 Ativação e Preparação do Ínoculo da Levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................................................. 78
4.3.2 Análise Mutagênica........................................................................... 80
4.3.3 Análise Estatística............................................................................ 83
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES...................................................................... 84
5.1 Obtenção dos Óleos Essenciais............................................................... 84
5.2 Densidade dos Óleos Essenciais............................................................. 86
5.3 Obtenção das Frações Diclorometano e Acetato de Etila..................... 87
5.4 Caracterização dos Óleos Essenciais...................................................... 88
5.4.1 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de Retenção – Piper amplum.................................................................. 89
5.4.2 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de Retenção – Piper cernuum................................................................ 101
5.4.3 Espectroscopia no Infravermelho – IV............................................. 113
5.4.4 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear – RMN......... 117
5.5 Bioautografia.............................................................................................. 125
5.6 Avaliação da Atividade Antimicrobiana................................................... 127
5.6.1 Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essencias de Piper amplum e Piper cernuum................................................................................... 129
5.6.2 Atividade Antimicrobiana das Frações Diclorometano e Acetato de Etila de Piper amplum e Piper cernuum...................................................... 142
5.7 Avaliação de Mutagenicidade Frente ao Saccharomyces cerevisiae... 151
6 CONCLUSÕES.................................................................................................. 160
REFERÊNCIAS..................................................................................................... 161
19
1 INTRODUÇÃO
Plantas medicinais é um tema relevante e que, de maneira geral, desperta o
interesse das pessoas, pois além de seu uso popular com finalidade terapêutica,
pode contribuir de forma significativa com informações que conduzam a geração de
novas tecnologias pela divulgação e emprego das propriedades terapêuticas dos
vegetais (CECHINEL; YUNES, 1998; MACIEL et al., 2002; PINTO et al., 2002).
De acordo com Gragg e Newman (2012) os produtos naturais continuam
desempenhando um papel muito importante no processo de descoberta e
desenvolvimento de novos fármacos. Nos últimos 30 anos, as indústrias
farmacêuticas investiram seus esforços na pesquisa de novos medicamentos, com
destaque também para o tratamento de doenças infecciosas (microbiana,
parasitárias e virais) e câncer.
Dentre as famílias de plantas pertencentes à flora brasileira tem-se a família
Pipereaceae, a qual possui muitas espécies que apresentam atividades biológicas
promissoras, como atividade antitumoral, antimicrobiana, antimalária, antiparasitária
e inseticida. Os representantes dessa família também são usados em problemas do
trato respiratório e aparelho digestivo (BENEVIDES et al., 1999; CAMPOS et al.,
2005; 2007; GUERRINE et al., 2009) sendo, portanto material promissor para a
busca de novos fitofármacos ou protótipos para síntese de medicamentos sintéticos.
As infecções humanas causadas por micro-organismos como bactérias e
fungos, constituem um sério problema de preocupação mundial, uma vez que a
resistência microbiana aos agentes antimicrobianos é uma consequência do uso
indevido e irracional desses medicamentos, proporcionando condições favoráveis
para o surgimento e propagação de micro-organismos resistentes (WHO, 2014).
Tendo em vista que o surgimento de micro-organismos resistentes é um
problema complexo, pesquisas para a busca de compostos de fonte natural com
atividade antimicrobiana se fazem necessário, de maneira a encontrar novos
agentes antimicrobianos que minimizem problemas comuns, tais como: resistência
microbiana, baixa solubilidade e alta toxicidade (SALVADOR et al., 2003).
Assim sendo, a busca de novas alternativas terapêuticas com toxicidade
relativa baixa para terapias antimicrobianas e pesquisas com produtos naturais
devem ser encorajadas.
20
Neste contexto as plantas podem ser fontes de alvos farmacológicos
interessantes, destacando os efeitos dos óleos essenciais de espécies de Piper,
uma vez que a literatura científica já aponta atividade antimicrobiana de P. aduncum
e P. tuberculatum contra fungos Cladosporium sphaerospermum e C.
caldospurioides (NAVICKIENE et al., 2006); ação bacteriostática e fungistática de P.
angustifolium (TIRILLINI; VELASQUEZ; PELLEGRINO, 1996); atividade
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Candida albicans de P. cernuum e
P. regnellii (COSTANTIN et al., 2001); atividade antifúngica frente a Cladosporium
sphaerospermum e C. caldospurioides de P. malacophyllum (LAGO et al., 2005); e
atividade antibacteriana de P. nigrum (DORMAN; DEANS, 2000).
Indústrias farmacêuticas empregam os óleos essenciais como matéria prima
para medicamentos devido às suas propriedades farmacológicas próprias ou para a
semi-síntese de novos fármacos. Na indústria alimentícia, são utilizados como
condimentos, aromatizantes e edulcorantes, e ainda estão presentes nas indústrias
de cosméticos, domissanitários e na aromaterapia (NIERO; MALHEIROS, 2012;
HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).
A utilização de óleos essenciais requer minuciosa caracterização química e
avaliação de possíveis modificações na sua composição, devido a variações de
fatores externos, destacando a sazonalidade, visto que a quantidade e, às vezes,
até mesmo a natureza das substâncias ativas não é constante durante o ano
(GLOBBO-NETO; LOPES, 2007), além da necessidade de avaliar não somente o
potencial farmacológico, mas também seu perfil toxicológico (HENRIQUES;
SIMÕES-PIRES; APEL, 2012), uma vez que substâncias presentes em óleos
essenciais são importantes na síntese ou semi-síntese de substâncias
antimicrobianas.
Sendo assim, a proposta do presente estudo foi avaliar o potencial
antimicrobiano, citotóxico e mutagênico de duas espécies pertencentes ao gênero
Piper, P. amplum e P. cernuum, analisando os efeitos da sazonalidade sobre essas
propriedades.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar a composição química, a atividade antimicrobiana e o potencial
citotóxico e mutagênico dos óleos voláteis e frações obtidas a partir do hidrolato de
Piper amplum e Piper cernuum coletadas nas diferentes estações do ano.
2.2 Objetivos Específicos:
• Realizar a extração dos óleos essenciais, por hidrodestilação, das folhas
secas de Piper amplum e Piper cernuum coletadas ao final de cada estação do ano;
• Proceder o fracionamento dos hidrolatos por partição líquido-líquido, com
solventes, diclorometano e acetato de etila;
• Estabelecer qualitativa e quantitativamente a composição química dos óleos
essenciais por cromatografia gasosa acoplada ao detector de massas (CG/EM),
índice de retenção, espectroscopia de ressonância magnética nuclear e
infravermelho;
• Realizar a bioautografia dos óleos e frações diclorometano e acetato de etila
para localizar as substâncias com potencial antimicrobiano;
• Quantificar a atividade antimicrobiana através da determinação da
concentração inibitória mínima e microbicida mínima dos óleos essenciais e frações
diclorometano e acetato de etila, das espécies de Piper nas quatro estações do ano,
através do método de diluição em ágar;
• Avaliar o potencial citotóxico e mutagênico dos óleos essenciais e frações
dicloromentano e acetato de etila das espécies de Piper nas diferentes estações do
ano, através do ensaio de mutação reversa sobre a levedura Saccharomyces
cerevisiae (XV-185-14C).
22
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Atividade Antimicrobiana
Um dos grandes avanços da humanidade foi a descoberta da penicilina, em
1928, para o tratamento de infecções bacterianas. Desde então a indústria
farmacêutica disponibilizou, antimicrobianos cada vez mais eficazes para o
tratamento de bactérias Gram positivas (LIMA, 2001; SALVADOR et al., 2003;
FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al., 2004; MIMS
et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al., 2015).
Dentre os antibióticos para terapia convencional, no período de 1940 a 1960,
destaca-se os β-lactâmicos (cefalosporina), aminoglicosídeos (estreptomicina),
tetraciclinas (clortetraciclina), macrolídeos (eritromicina), peptídeos (vancomicina) e
outros (cloranfenicol, rifamicina B, clindamicina e polimixina B), com apenas três
derivados sintéticos, a isoniazida, trimetropim e metronidazol, eficazes no tratamento
de infecções causadas por bactérias Gram positivas (LIMA, 2001; SALVADOR et al.,
2003; FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al., 2004;
MIMS et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al., 2015).
De 1960 a 1980 foram disponibilizados para uso terapêutico, antibióticos
semi-sintéticos eficazes no combate à bactérias Gram positivas e Gram negativas,
análogos aos antibióticos naturais já existentes. A maioria destes medicamentos foi
obtido a partir de protótipos microbianos, como derivados β-lactâmicos (análogos de
penicilina e cefalosporina, ácido clavulânico, aztreonam), análogos da tetraciclina,
derivados aminoglicosídicos (gentamicina, tobramicina, amicacina) (LIMA, 2001;
SALVADOR et al., 2003; FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004;
PEREIRA et al., 2004; MIMS et al., 2005; GUIMARÃES, MOMESSO e PUPO, 2010;
LING et al., 2015).
Entre os anos 1980 a 2000 houve uma redução de novos protótipos
antibióticos para utilização na antibioticoterapia, e ao mesmo tempo ocorreu
aumento na incidência de resistência bacteriana. Este período é marcado pela
introdução da classe das fluoroquinolonas sintéticas, desenvolvidas a partir do ácido
nalidíxico, além do imipenem (derivado β-lactâmico), análogos da eritromicina
(derivado macrolídeo), e a combinação de dois derivados semi-sintéticos de
23
produtos microbianos, quinupristina e dalfopristina, a qual foi aprovada para uso em
infecções causadas por Enterococcus faecium resistente à vancomicina em 1999
pelo FDA (Food and Drug Administration) (LIMA, 2001; SALVADOR et al., 2003;
FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al., 2004; MIMS
et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al., 2015).
Em 2001, apenas um antibiótico de origem sintética da classe das
oxazolidinonas foi disponibilizado, a linezolida, com uso principal para tratamento de
infecções por cocos Gram positivos, especialmente em casos de resistência aos
tratamentos convencionais (BARROS et al., 2008).
Os programas de descoberta de antibióticos de fontes naturais têm sido
retomados em algumas indústrias farmacêuticas, levando à aprovação do
lipodepsipeptídeo natural daptomicina pelo FDA em 2003 (LIMA, 2001; SALVADOR
et al., 2003; FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al.,
2004; MIMS et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al.,
2015).
Recentemente Ling et al. (2015), isolaram uma nova substância, teixobactina,
de um micro-organismo do solo, cujo mecanismo de ação sugerido pelos autores é a
inibição da síntese da parede celular através da ligação ao lipídio II (precursor do
peptidioglicano) e lipídio III (precursor do ácido teicoico).
A teixobactina é relatada como um promissor agente terapêutico, uma vez
que possui atividade contra micro-organismos Gram posivitos, como Enterococcus,
M. tuberculosis, Clostridium difficile, Bacillus anthracis e S. aureus, incluindo cepas
resistentes, e ainda em teste de desenvolvimento de resistência, por meio de
plaqueamento com doses baixas do composto, não foi possível obter mutações
resistentes à teixobactina de S. aureus e M. tuberculosis. No entanto os
pesquisadores não descartam o desenvolvimento de resistência dos micro-
organismos a essa substância mesmo que em longo prazo (LING et al., 2015).
Com a introdução e o uso extensivo e muitas vezes inapropriado dos
antibióticos, más condições de higiene, fluxo contínuo de viajantes, aumento de
pacientes imunocomprometidos, falta de adesão ao tratamento e demora no
diagnóstico das infecções microbianas, há favorecimento do aumento da resistência
e disseminação de micro-organismos multirresistentes (TAVARES, 2000;
SALVADOR et al., 2003; BERQUÓ et al., 2004; ROSSI; ANDREAZZI, 2005;
ANTUNES et al., 2006). Assim sendo, a resistência dos micro-organismos aos
24
antimicrobianos limita o tempo de vida útil dos antibióticos, resultando na pesquisa
constante de novas substâncias (LING et al., 2015).
A grande maioria dos micro-organismos resistentes a antimicrobianos surge
em decorrência de alterações genéticas, que podem ser cromossômicas ou extra
cromossômicas (PEREIRA et al., 2004; CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004;
GIEDRAITIENE et al., 2011).
A resistência cromossômica ocorre pela mutação espontânea em um lócus do
cromossomo microbiano que controla a sensibilidade à determinado agente
antimicrobiano. Já a resistência extra cromossômica ocorre por plasmídeos,
denominados fatores R, que podem estar livres no citoplasma ou integrados no
cromossomo do micro-organismo. Esses plasmídeos possuem genes para a
resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, e atuam, na grande maioria das
vezes, controlando a formação de enzimas capazes de destruir os agentes
antimicrobianos (PEREIRA et al., 2004; CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004;
GIEDRAITIENE et al., 2011).
De acordo com a OMS em 2012, as doenças cardiovasculares foram a
principal causa de morte com 13,2%. As doenças infecciosas são apresentadas
separadamente, como infecções respiratórias com taxa de morte de 5,5%, doenças
diarreicas com 2,7% de mortes e tuberculose com 1,6% de mortes, totalizando 9,8%.
Se adicionarmos a esse cálculo, o percentual de mortes por HIV/AIDS (2,7%), uma
vez que essa infecção viral torna o paciente imunodeprimido, ou seja, susceptível a
qualquer outro tipo de infecção, esse percentual resulta em 12,5%, sugerindo que as
doenças infecciosas, de forma geral, foram a segunda causa de morte neste
respectivo ano (WHO, 2014).
Assim sendo, as infecções humanas consistem em um sério problema, sendo
que frequentemente os patógenos são micro-organismos como bactérias e fungos,
que possivelmente podem ser de linhagens multirresistentes isolados tanto de
pacientes hospitalizados quanto de pacientes da comunidade em geral
(NASCIMENTO et al., 2000; SALVADOR et al., 2003; BERQUÓ et al., 2004;
FERRONATO et al., 2007; COIMBRA et al., 2012).
No decorrer do tempo as infecções fúngicas humanas também apresentaram
um aumento significativo, sendo as dermatomicoses as principais responsáveis por
esse aumento. Ocorrendo especialmente em pacientes imunocomprometidos que
incluem importantes fatores de risco como, neutropenia, leucopenia, administração
25
de corticoesteroides e outros agentes antifúngicos, hepatotoxicidade, reações
cutâneas e lesões teciduais (SIDRIM et al., 1999; SALVADOR et al., 2003).
O amplo uso de antibacterianos e antifúngicos tópicos e sistêmicos em
pacientes imunossuprimidos resultou no aumento de micro-organismos resistentes
aos antimicrobianos. Essa resistência está associada, principalmente, com
imunossupressão severa, reincidência as infecções e tempo de tratamento
prolongado (TEICHERT et al., 2002).
O tratamento das micoses humanas e infecções bacterianas não é sempre
efetivo, pois os fármacos antifúngicos e antibacterianos disponíveis produzem
recorrência ou causam resistência, além de apresentarem importante toxicidade e
alto custo, levando a não adesão ao tratamento, constituindo um problema de saúde
pública especialmente em países em desenvolvimento (FENNER et al., 2006; COS
et al., 2006).
Os medicamentos à base de plantas têm sido amplamente utilizados por
muitos séculos, sendo que entre 1981 e 2010, novos agentes anti-infecciosos foram
descobertos a partir de produtos naturais, modificação semissintética ou síntese a
partir destes, totalizando 118 com atividade antibacteriana, 29 com atividade
antifúngica, 14 com atividade antiparasitária e 110 com atividade antiviral (GRAGG;
NEWMAN, 2012).
Entre os anos de 2006 e 2010 foram aprovados três novos medicamentos
antibacterianos obtidos através da modificação semissintética a partir de produto
natural. Sendo o primeiro retapamulina (semissintético de pleuromutilina), o segundo
ceftobiprole medocaril (pró-fármaco da cefalosporina) e o terceiro agente
antibacteriano modificado foi vancomicina telavancina (Figura 1). Neste mesmo
período, apenas um antifúngico foi obtido a partir de modificação semissintética de
produto natural, sendo ele equinocandina derivado da anidulafungina, porém sem
uma estrutura química estabelecida (GRAGG; NEWMAN, 2012).
26
Figura 1: Moléculas antibacterianas obtidas por modificação semissintética a partir de produto natural no período de 2006 a 2010.
Fonte: GRAGG; NEWMAN, 2012.
A resistência a agentes antimicrobianos é grave e preocupante e requer não
somente a pesquisa de novas substâncias com propriedade antimicrobiana, mas
também o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento eficaz contra
infecções bacterianas e fúngicas, uma vez que, entre as causas apontadas para o
fenômeno está o uso abusivo e indiscriminado de fármacos antimicrobianos
(SALVADOR et al., 2003; CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004; COS et al.,
2006). Sendo cada vez mais importante a busca de novos fármacos com efeito
biocida ou biostático, e o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento
27
de infecções (GALES et al., 1997; FALCÃO et al., 2002; PEREIRA et al., 2004;
CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004; COS et al., 2006).
Entre as principais ferramentas na busca de novos modelos moleculares
estão a informação de como as plantas são utilizadas por diferentes grupos étnicos,
e o estudo farmacológico das preparações utilizadas no âmbito da etnobotânica e da
etnofarmacologia (RATES, 2001; YUNES; CECHINEL FILHO, 2001).
Assim o papel das plantas medicinais na busca e descoberta de novos
fármacos ganhou mais espaço, porém somente uma pequena porcentagem, cerca
de 15%, das 250.000 a 350.000 espécies vegetais estimadas no mundo foram
estudadas cientificamente (MALHEIROS et al., 2010).
Neste contexto, a comprovada ação antimicrobiana dos óleos essenciais
constitui em uma alternativa no tratamento de doenças infecciosas, sendo que
diversas espécies vegetais apresentam substâncias com potencial antimicrobiano
(BAKKALI et al., 2008).
A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais vem sendo intensamente
estudadas por muitos pesquisadores, através de vários métodos de análises in vitro
realizados por difusão, diluição ou bioautografia. O método de difusão consiste em
depositar a amostra em discos de papel ou poços, sobre o meio sólido contento o
inoculo microbiano, e após o período de incubação realiza-se a leitura do halo de
inibição em milímetros. O método de diluição, em meio sólido ou líquido, caracteriza-
se por ser um método quantitativo, permitindo a determinação da concentração
inibitória mínima (CIM). Por fim, a bioautografia é muito importante para a
localização da substância responsável pelo efeito microcida ou microstático
(HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).
3.1.1 Staphylococcus aureus
Dentre os estafilococos, a espécie S. aureus é o patógeno mais importante,
sendo encontrado no ambiente externo e nas narinas anteriores em cerca de 20 a
40% de adultos, constituindo frequentemente parte da microbiota normal no homem.
No entanto em condições apropriadas podem causar infecções oportunistas, que
vão de infecções cutâneas, relativamente benignas, a doenças sistêmicas
potencialmente fatais (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
28
Várias são as infecções associadas à S. aureus, como foliculite, furúnculos e
carbúnculos, impetigo, mastite, infecções de feridas, bacteremia e endocardite,
meningite, pericardite, infeções pulmonares, osteomielite/artrite séptica, piomiosite
(infecção dos músculos esqueléticos), intoxicação alimentar (exotoxinas), síndrome
de pele escaldada (toxinas antigênicas) e síndrome do choque tóxico (toxinas
antigênicas) (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,
2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Os fatores de virulência não são encontrados em todas as cepas de S.
aureus, destacando os polissacarídeos capsulares, que impedem a fagocitose e
promovem a aderência dos micro-organismos às células do hospedeiro, bem como à
dispositivos de próteses. A presença de peptideoglicano e ácido teicoico, aumentam
a rigidez e elasticidade da parede celular, contribuindo na aderência da bactéria às
mucosas. A proteína A, imunogênica, interfere na opsonização e ingestão dos micro-
organismos pelas células polimorfonucleares, ativando o complemento
desencadeando respostas de hipersensibilidade (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM,
2011; WINN et al., 2012).
A produção de enzimas como a β lactamase torna esse micro-organismo
resistente à penicilina e ampicilina. A síntese de hemolisinas, como a α e β
hemolisina, letal à uma ampla variedade de células. A produção de toxinas,
esfoliatinas ou epidermolíticas, estão associadas à síndrome da pele escaldada,
enterotoxinas A a E, H e I, associadas a intoxicação alimentar e superantígenos
associados a síndrome do choque tóxico (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM,
2011; WINN et al., 2012).
A resistência de S. aureus à penicilina tem importância essencialmente
histórica, sendo mediada pela aquisição de elementos genéticos que codificaram a
produção de β lactamases ou penicilinases, associada frequentemente a genes de
resistência a outros antibióticos (macrólidos, ácido fusídico e aminoglicosídeos)
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009;
JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Destacando nesse grupo os S. aureus resistentes a meticilina (MRSA), S.
aureus com resistência intermediária à glicopeptídeo (vancomicina e teicoplamina)
(GISA) ou S. aureus com resistência intermediária à vancomicina (VISA), que são
29
um desafio constante para as instituições de saúde, uma vez que ocorrem tanto em
ambiente hospitalar quanto na comunidade.
Dados do National Nosocomical Infections Surveillance (NNIS), do Center for
Diseases Control and Prevention (CDC), nos Estados Unidos da América (EUA),
mostraram que, desde 1999, a proporção de MRSA ultrapassa 50% entre os
pacientes em UTI. No Brasil, os índices de cepas MRSA são também bastante
elevados (40% a 80%), principalmente em UTIs.
A resistência do S. aureus aos antibióticos tem sido desenvolvida por
mutações em seus genes ou pela aquisição de genes de resistência de bactérias da
mesma espécie, ou não (MENDES, 2010).
Os principais mecanismos de resistência do S. aureus são apresentados na
Figura 2, onde a resistência que ocorre por mutação, gera uma alteração no sítio de
ação do antibiótico, enquanto que a resistência por aquisição de genes, transmitida
por plasmídeos e transposons, frequentemente envolve a inativação ou a destruição
do fármaco, podendo ainda destacar a bomba de efluxo e modificação do alvo
ribossômico (MENDES, 2010).
Figura 2: Mecanismos de resistência do Staphylococcus aureus aos antibióticos não β-lactâmicos e não glicopéptidos.
Fonte: MENDES, 2010.
30
3.1.2 Streptococcus pyogenes
A espécie S. pyogenes, pertence ao grupo A dos β hemolíticos. É um
patógeno humano de extrema importância, sendo a pele e as mucosas os únicos
reservatórios conhecidos para essa espécie (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM,
2011; WINN et al., 2012).
O principal fator de virulência dos estreptococos do grupo A consiste em um
antígeno de superfície celular denominado proteína M, que confere a esse micro-
organismo resistência a fagocitose e morte celular por polimorfonucleares, sendo
também capaz de formar complexo com o fibrinogênio, que se ligam aos neutrófilos,
liberando mediadores inflamatórios que induzem o extravasamento vascular,
componente patológico do choque tóxico estreptocócico (MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2009).
A camada mais externa da célula do S. pyogenes é composta por uma
cápsula de ácido hialurônico, não imunogênica, que impede a opsonização por
células fagocíticas. Ainda, os estreptococos do grupo A produzem duas hemolisinas,
a estreptolisina O e a estreptolisina S que apresentam toxicidade a vários tipos
celulares, além de exotoxinas pirogênicas (superantígenos), determinantes da
virulência na patogenia da síndrome estreptocócica, induzindo a proliferação dos
linfócitos T do hospedeiro resultando na liberação maciça de diversas citocinas,
levando a hipotensão e choque (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011;
WINN et al., 2012).
Os estreptococos do grupo A produzem também hialuronidase, que
despolimeriza a substância fundamental do tecido conjuntivo, permitindo sua
disseminação, bem como a estreptoquinase que hidrolisa os coágulos de fibrina
impedindo a formação de barreiras de fibrina na periferia das lesões estreptocócicas,
também permitindo sua disseminação (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011;
WINN et al., 2012).
A infecção mais comum causada por S. pyogenes é a faringite, mas podem
causar uma variedade de infecções cutâneas superficiais, incluindo o impetigo,
erisipela, celulite, sepse puerperal e infecções pós-parto (TRABULSI; ALTERTHUM,
31
2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM;
INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Na evolução da faringite por estreptococos do grupo A, existe a preocupação
quanto às complicações não supurativas, ou seja, a febre reumática e a
glomerulonefrite, sendo a primeira associada a faringite prévia e a segunda a
infecções faríngeas ou cutâneas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011;
WINN et al., 2012).
Quanto a utilização de antimicrobianos para o tratamento, prevenção e
controle de S. pyogenes, estes são muito sensíveis à penicilina, mas apresentam
resistência ou pouca resposta clínica observada para tetraciclinas e sulfonamidas o
que tem limitado o uso destes antimicrobianos. Por fim, é importante ressaltar que a
frequência de cepas resistentes aos novos macrolídeos (azitromicina e
claritromicina) tem aumentado (CAMPONOVO, 2002; MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2009).
3.1.3 Bacillus subtilis
O gênero Bacillus compreende um grande grupo de bacilos Gram positivos. O
Bacillus subtilis é uma espécie saprófita comum no solo e na água, é um organismo
esporulado, mas não patogênico, sendo muito utilizado no controle e validação de
cilos de esterilização por calor seco e óxido de etileno (TRABULSI; ALTERTHUM,
2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM;
INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Mesmo esse micro-organismo testado sendo não patogênico, justifica-se sua
avaliação antimicrobiana uma vez que outras espécies pertencentes a esse gênero
apresentam-se potencialmente patogênicas, como B. anthracis e B. cereus
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009;
JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Além disso, B. subtilis é muito utilizado em pesquisas, pois trata-se de um
indicador para possível atividade antimicrobiana frente a bacilos Gram positivos
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009;
JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
32
3.1.4 Escherichia coli
E. coli é a espécie bacteriana mais comumente isolada em laboratórios
clínicos associados a doenças infecciosas que podem acometer praticamente todos
os tecidos e sistemas orgânicos dos seres humanos (TRABULSI; ALTERTHUM,
2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM;
INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Está envolvida na sepse e no choque induzido por endotoxinas, além de
infecções do trato urinário e feridas, pneumonia em pacientes hospitalizados
imunossuprimidos, meningite em recém-nascidos, gastroenterite e colite
hemorrágica (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,
2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Dentre as cepas de E. coli diarregênica, tem-se a E. coli enterotoxigênica
(ETEC) que produzem enterotoxinas secretoras termolábeis (LT) e/ou termoestáveis
(ST) que não provocam lesão no epitélio mucoso, mas uma hipersecreção de cloro e
água deixando o intestino repleto de fluidos, resultando em uma diarreia líquida. A E.
coli enteropatogênica (EPEC), acomete habitualmente lactentes, aderindo-se às
células epiteliais intestinais em microcolônias localizadas produzindo lesões
histopatológicas, causando a destruição das microvilosidades intestinais, resultando
em vômitos e diarreia aquosa profusa. A E. coli enteroinvasiva (EIEC) invade as
células epiteliais causando diarreia aquosa, indistinguível da ETEC. A E. coli
enterohemorrágica (EHEC) não invadem as microvilosidades intestinais, somente se
aderem a elas produzindo enterohemolisinas denominada toxina Shiga, causando
diarreia abundante com sangue (colite hemorrágica), devido ao processo de
necrose. A E. coli enteroagregativa (EAEC) se adere às células epiteliais causando
diarreia aquosa mucoide. Por fim, tem-se ainda a E. coli difusamente aderente
(DAEC) que também se adere as células epitéliais resultando em diarreia aquosa
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009;
JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).
Cepas de E. coli possuem fatores de virulência específicos, que podem ser
organizados em duas categorias principais: adesinas e exotixinas (MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
A resistência de E. coli aos antibióticos β lactâmicos é conferida
especialmente as β lactamases de espectro ampliado (ESBLs), devido as enzimas
33
do tipo TEM ou SHV, denominadas ceftazidimases, codificadas em plasmídeos, que
hidrolisam penicilinas e cefalosporinas, principalmente a ceftazidima, mas são
inibidas pelo ácido clavulânico. Outro tipo de enzima, do tipo CTX-M são
consideradas cefotaximases, pois têm maior ação hidrolítica contra a cefotaxima. No
entanto, novas variantes dessas enzimas já foram identificadas e contribuem para a
crescente resistência de E. coli aos antibióticos (NARCISO et al., 2010).
3.1.5 Dermatofitoses
Dermatofitose é o termo que se refere a um complexo de doenças causadas
por várias espécies de fungos filamentosos relacionados aos gêneros Trichophyton,
Microsporum e Epidermophyton, reconhecidos como dermatófitos que podem causar
doenças em humanos e/ou animais, acometendo pele, pelos ou unhas, causando na
pele micoses cutâneas externas, ou seja, acometendo a camada mais externa – o
extrato córneo – e nas infecções nos pelos e unhas as camadas queratinizadas é
que são invadidas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2009).
No Brasil as espécies de dermatófitos mais comumente isoladas em
dermatofitoses são Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes,
Microsporum canis, Microsporum gypseum, Epidermophyton flocosum e
Trichophyton tonsurans (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2009).
As dermatofitoses recebem o nome de “tinhas” seguido pelo local anatômico
ou estrutura que afetam, assim sendo tem-se tinha capitis do couro cabeludo, tinha
barbae, tinha corporis, tinha cruris da região inguinal, tinha pedis do pé e tinha
unguium da unha (onicomicose) (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
M. canis e M. gypseum estão associados à tinha corporis e tinha capitis, T.
rubrum à tinha pedis, tinha corporis, tinha cruris e onicomicose assim como T.
mentagrophytes que também pode estar associado a tinha capitis. E E. flocosum
pode causar infecções do tipo tinha pedis, tinha cruris e onicomicose (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
O tratamento para infecções causadas por dermatófitos incluem agentes
tópicos, como os derivados azólicos (miconazol, clotrimazol, econazol, tioconazol e
34
itraconazol), terbinafina e haloprogina. Bem como os antifúngicos orais incluindo
griseofulvina, itraconazol, fluconazol e terbinafina (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
A falha do tratamento e/ou a recidiva da dermatofitose está geralmente
associada à interrupção da terapia antifúngica, entretanto a partir de um relato de
resistência de T. rubrum, isolado de uma paciente com onicomicose, à terbinafina,
passou-se a realizar estudos sobre os mecanismos de resposta e resistência dos
dermatófitos a diferentes antifúngicos, demonstrando que existe uma grande
diversidade de mecanismos de resistência que um único micro-organismo pode
desenvolver e/ou adquirir (PERES et al., 2010).
3.1.6 Micoses Oportunistas
Os fatores que predispõem as micoses oportunistas se classificam em
intrínsecos como neoplasias, diabetes, hemopatias diversas, AIDS e doenças que
alteram a imunidade celular, e extrínsecos como antibioticoterapia, corticoidoterapia,
antiblásticos, cirurgias de transplantes e ambientes hospitalares contaminados
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
Os agentes mais comuns causadores de micoses oportunistas são Candida
spp., Criptococcus spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp e Mucor spp. Sendo que
estima-se que anualmente a incidência de infecções por Candida é de 72 a 290 por
milhão de individuos, por C. neoformans é de 30 a 66 por milhão e por Aspergillus é
de 12 a 34 por milhão (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2009).
3.1.6.1 Candidíase
O gênero Candida pertence à família Crytococcaceae, tratando-se de
organismos eucariotos que podem ser unicelulares ou multicelulares. São
geralmente caracterizados pela forma leveduriforme, podendo apresentar formas
arredondadas ou ovais medindo aproximadamente de 2,0 a 4,0 µm (GUARRO,
1998) e reproduzem-se por brotamento ou gemulação.
35
Espécies do gênero Candida fazem parte da microbiota de cavidades (retal,
bucal, vaginal, uretral, nasal, aural) e da pele humanas. Estas espécies envolvem
um espectro amplo de doenças superficiais e invasivas (SEGAL; BAUM, 1994).
São considerados patógenos responsáveis por uma variedade de quadros
clínicos, desde desordens mucocutâneas, não comprometedoras ao indivíduo, a
exemplo de mulheres que desenvolvem candidíase vaginal, até infecções sistêmicas
neoplásicas (SEGAL; BAUM, 1994; DIGNANI; SOLOMKIN; ANAISSIE, 2003; WEIG;
GROB; MUHLSCHLEGEL, 1998).
Quando fatores de risco estão presentes nos hospedeiros humanos, incluindo
o uso prolongado e indiscriminado de antimicrobianos de amplo espectro, uso de
esteroides ou outras substâncias imunossupressoras, doenças como diabetes
mellitus e AIDS, e funções fagocitárias alteradas, infecções por Candida podem
comprometer vísceras como resultado de disseminação hematogênica da levedura
pelo organismo, especialmente em pacientes críticos, portadores de doenças
degenerativas e/ou neoplásicas (SEGAL; BAUM, 1994; DIGNANI; SOLOMKIN;
ANAISSIE, 2003; WEIG; GROB; MUHLSCHLEGEL, 1998).
Cerca de 100 espécies de Candida foram descritas, mas somente algumas
destas causam infecção (EGGIMANN; GARBINO; PITTET, 2003). As principais
espécies de interesse clínico são: Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida
tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida guilliermondii e Candida
lusitaniae (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003), sendo que C. albicans é a espécie
isolada com mais frequência de materiais clínicos, correspondendo de 90 a 100%
dos isolados mucosos e de 50 a 70% dos isolados de infecções sanguíneas
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
Algumas espécies, como C. albicans, apresentam a capacidade de
dimorfismo, ou seja, pode ser encontrada sob formas leveduriformes
(blastoconídios) no estado saprofítico, estando associado à colonização
assintomática, ou como formas filamentosas (pseudohifas e hifas verdadeiras),
forma necessária para invadir tecidos mais profundos em processos patogênicos
(MOLERO et al., 1998).
Além disso, neste fungo pode ocorrer a formação de clamidósporos, que são
esporos arredondados que possuem uma espessa parede celular, permitindo a
adaptação em diferentes sítios biológicos (LACAZ; PORTO; MARTINS, 1991;
CHAFFIN et al., 1998).
36
Os determinantes da patogenicidade das espécies de Candida spp dependem
dos fatores de virulência, que aumentam sua capacidade de colonizar mucosas,
superfícies sintéticas e invadir tecidos. Tais fatores podem ser: adesão às células e
tecidos dos hospedeiros, produção de enzimas hidrolíticas (proteases, fosfolipases,
lípases, hialuronidase e condroitina sulfatase), dimorfismo (formação de tubo
germinativo com consequente desenvolvimento da forma filamentosa), alteração
fenotípica da morfologia celular e da colônia (switching fenotípico), variabilidade
genotípica, variabilidade antigênica, imunomodulação dos mecanismos de defesa do
hospedeiro e hidrofobicidade da superfície celular (CALDERONE; FONZI, 2001;
GHANNOUM; ABU-ELTEEN, 1990; EGGIMANN; GARBINO; PITTET, 2003).
Verstrepen e Klis (2006) enfatizam, ainda, a notável capacidade de formação
de biofilme a partir da propriedade de adesão de alguns fungos como C. albicans,
característica de grande relevância médica e industrial, já que a presença de um
biofilme maduro dificulta a ação de antifúngicos e pode tornar-se um reservatório de
células com características de resistência a determinados medicamentos.
O número de pacientes predispostos a infecções causadas por micro-
organismos oportunistas, como espécies de Candida, vem crescendo
significativamente, principalmente em pacientes de risco destacando aqueles sob
tratamento para o câncer, transplantados, portadores do HIV, com distúrbios
endócrinos, gravidez, deficiência de ferro, xerostomia e desordens imunológicas
(SAMARANAYAKE; MacFARLANE, 1982; HUBE, 2000).
As candidíases são usualmente tratadas com derivados poliênicos
(anfotericina B), imidazólicos (fluconazol, cetoconazol, itraconazol), entretanto já
existem relatos de espécies de Candida resistentes a fluconazol. Nestes casos
utiliza-se anfotericina B ou uma equinocandina (anidulafingina, caspofingina ou
micafungina) (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,
2009).
O tratamento para as infecções por Candida tem enfrentado o desafio da
resistência do micro-organismo ao medicamento de escolha, identificada como a
maior causa de falha terapêutica no tratamento de doenças causadas por fungos
(BROSSCHE et al., 1998; DIEKEMA et al., 2002; TEICHERT et al., 2002).
Além disso, o efeito do fármaco dependente da espécie infectante, uma vez
que o mesmo medicamento pode ser ativo contra C. albicans, espécie mais
37
susceptível à maioria delas e não ter o mesmo efeito sobre C. tropicallis que exibe
uma resposta fraca à maioria dos antifúngicos (SOBEL; VASQUEZ, 2003).
Espécies de Candida desenvolvem resistência aos antifúngicos de várias
maneiras, destacando:
• Alteração na parede celular e membrana, dificultando a penetração do
antifúngico;
• Bomba de efluxo, removendo o antifúngico da célula;
• Mutação dos alvos dos antifúngicos, diminuindo sua capacidade de ligação;
• Ativação de vias alternativas que aumentam o metabolismo dos antifúngicos;
• Sequestro dos antifúngicos em organelas semelhantes a vacúolos; e
• Alteração cromossômica (EGGIMANN; GARBINO; PITTET, 2003).
3.1.6.2 Criptococose
A criptococose é uma micose sistêmica causada por Cryptococcus spp., um
fungo leveduriforme, basidiomiceto encapsulado. Existem quatro sorotipos (A, B, C e
D) e três espécies patogênicas, C. neoformans variação neoformans (sorotipo D), C.
neoformans var. grubii (sorotipo A) e C. gattii (sorotipo B e C) (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
Essa infecção fúngica é normalmente adquirida através da inalação de células
de Cryptococcus spp. que se encontram sob forma de aerossóis dispersos no meio
ambiente, podendo apresentar-se como um processo pneumônico ou, como uma
infecção do sistema nervoso central (SNC) devido a disseminação hematogênica e
linfática a partir da infecção primaria pulmonar (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
C. neoformans é altamente neurotrópico sendo a forma mais comum da
doença a meningite criptococócica. Ambas as meninges e o tecido cerebral
subjacente são envolvidos resultando em febre, cefaleia, meningite, distúrbios
visuais, estado mental anormal e convulsões (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
É importante ressaltar que o quadro clínico está diretamente associado ao
estado imune do paciente, sendo grave em pacientes aidéticos, e em outros
38
comprometidos e tratados com esteroides e/ou imunossupressores (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
Quando não tratada rapidamente, a meningite criptococócica evolui
rapidamente para a morte. Assim sendo, a administração rápida de uma terapia
antifúngica apropriada e o efetivo controle da pressão do SNC garante o sucesso da
terapia (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,
2009).
O tratamento consiste na administração de anfotericina B e flucitosina,
durante duas semanas (terapia de indução), seguida de fluconazol oral ou
itraconazol por mais oito semanas (terapia de consolidação). Pacientes com
síndrome da imunodeficiência humana (AIDS) geralmente necessitam de terapia de
manutenção por toda a vida, com fluconazol ou itraconazol. Em paciente não HIV
positivo, observa-se recidiva em até 26% dos casos dentro de 3 a 6 meses, nestes
casos o tratamento de consolidação é recomendado por até um ano (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
C. neoformans apresentam suscetibilidade in vitro a diferentes antifúngicos,
sendo a resistência deste micro-organismo aos antifúngicos um fenômeno pouco
frequente. No entanto, a terapia de longa duração com o fluconazol na criptococose
tem sido descrita como um dos fatores associados ao desenvolvimento de cepas
resistentes a este antifúngico. Devido a isso, o itraconazol tem sido apontado como
uma alternativa interessante ao fluconazol, devido à alta suscetibilidade de isolados
de C. neoformans a este antifúngico (SILVA et al., 2008).
3.1.6.3 Aspergilose
Aspergilose engloba várias doenças causadas por cerca de 19 espécies
pertencentes ao gênero Aspergillus, fungo filamentoso, sendo que a maioria das
infecções é causada por A. fumigatus, A. flavus, A. niger e A. terreus (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
O contato com esse micro-organismo pode causar reações alérgicas ou
doença pulmonar invasiva e destrutiva, e em pacientes imunossuprimidos pode
ocorrer a forma disseminada da doença (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
39
Os conídios dos Aspergillus spp. são constantemente inalados por estarem
dispersos no ar, solo e em material de decomposição, além desses sítios em
ambiente hospitalar podem ser encontrados em chuveiros, tanques de água entre
outros (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
As manifestações alérgicas, como sinusite alérgica, está associada a
obstrução e descarga nasal, cefáleia e dor facial. Quando os seios paranasais ou
vias aéreas inferiores, são colonizados por este micro-organismo pode resultar na
formação de aspergiloma, ou bola fúngica, que em geral são tratados cirurgicamente
quando há hemorragia pulmonar, sendo essa potencialmente fatal (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
As formas de aspergilose invasiva são conhecidas como aspergilose
disseminada ou pulmonar invasiva e localmente destrutiva, representando uma
infecção devastadora, observada em pacientes neutropênicos e imunossuprimidos.
Os pacientes apresentam febre e infiltrados pulmonares, acompanhados de dor
torácica pleurítica e hemoptise, além disso, a mortalidade normalmente é alta,
superando os 70% (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;
PFALLER, 2009).
Outra característica desses fungos é a disseminação hematogênica para
sítios extrapulmonares, como cérebro, coração, rins e trato gastrointestinal, é comum
devido a sua natureza angioinvasiva (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
A terapia antifúngica específica para aspergilose normalmente envolve a
administração de anfotericina B (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
3.1.6.4 Mucormicose
As mucormicoses são infecções fúngicas graves, especialmente causadas
por Mucor ramosissimus, Mucor pusillus, Absidia corymbifera, Rhizopus oryzae,
Rhizomucor sp. e Cunninghamella bertholettiae (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
A infeção pode acometer seios paranasais, cérebro, pulmões, aparelho
digestivo e outros órgãos (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;
ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
40
A principal característica de uma infecção causada por Rhizopus spp. é a
invasão dos vasos sanguíneos por suas hifas, resultando na mucormicose
rinocerebral, onde o fungo penetra provavelmente pela mucosa do nariz ou do seio
paranasal e se estende para a órbita ocular, meninges e lobos frontais do cérebro. A
disseminação se faz através dos vasos sanguíneos, cartilagem nasal e nervos.
Geralmente acomete diabéticos em acidose, sendo extremamente grave
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
A terapia inclui a reversão dos fatores predisponentes, retirada cirúrgica da
área infectada e administração de antifúngico, em geral, anfotericina B, de atividade
terapêutica limitada e muitos efeitos colaterais (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;
MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
3.2 Avaliação da Toxicidade
Para a população de modo geral os produtos naturais estão isentos de
reações adversas, ou seja, podem ser utilizados sem que haja risco algum. Fato
esse, que contribui significativamente para o aumento do uso de plantas medicinais
nos últimos anos. No entanto, esse desconhecimento dos efeitos secundários e
tóxicos de plantas utilizadas para fins terapêuticos pode levar a danos sérios
(NAVARRO MOLL, 2000; MENGUE et al., 2001). Além disso, a utilização
inadequada de um produto mesmo com baixa toxicidade, pode induzir a problemas
graves desde que existam outros fatores de risco como contraindicações ou uso
concomitante de outros medicamentos (SILVEIRA; BANDEIRA; ARRAIS, 2008).
Na década de 80 o confrei (Symphytum officinale L. Boraginaceae) era muito
utilizado no Brasil com a promessa de curar doenças como o câncer, porém estudos
posteriores comprovaram que essa planta é altamente hepatotóxica (BRASIL, 1992;
BARRACA, 1999; STICKEL; SEITZ, 2000). Outro exemplo é a Piper methysticum G.
Forst, popularmente conhecida como kava-kava, que foi responsável por muitos
casos de hepatotoxicidade na Europa (STICKEL et al., 2003; WHITTON et al., 2003;
CLOUATRE, 2004).
Mesmo com o crescente número de estudos científicos comprovando a
toxicidade de plantas medicinais utilizadas indiscriminadamente, ainda observa-se
que muitas dessas plantas continuam sendo utilizadas de forma inadequada e
irracional (OLIVEIRA; GONÇALVES, 2006).
41
Assim sendo, quando há o interesse em isolar ou desenvolver uma
substância com atividade farmacológica é de suma importância que seja realizada a
avaliação dos efeitos tóxicos, ainda em estágios iniciais do desenvolvimento de
novos fármacos (BELLA CRUZ et al., 2009).
Os testes para avaliar a toxicidade podem ser realizados através de métodos
in vitro, utilizando micro-organismos, células animais e/ou vegetais, e métodos in
vivo com modelos animais e humanos, esse último em fases finais dos ensaios
clínicos (MIGUEL; BOSCO, 2005).
Para tanto há agências que regulamentam os protocolos aceitos
internacionalmente para os ensaios biológicos, como a OECD (Organization for
Economic Co-operation and Development), e agências reguladoras como a ANVISA
(Agência Nacional de Vigilância Sanitária), através da resolução n° 90 de 16 de
março de 2004 (BRASIL, 2004), o FDA e a EPA, que exigem como testes
preliminares de toxicidade in vivo, os ensaios de toxicidade aguda, subcrônica e
reprodutiva, garantindo um grande avanço nos estudo com plantas medicinais tanto
nos aspectos farmacológicos quanto toxicológicos (BARROS, 2003).
Dentre os métodos para avaliar a toxicidade de produtos naturais dispõem-se
do teste com Artemia salina, que baseia-se na capacidade do extrato, composto ou
fração de matar os microcrustáceos cultivados em laboratório (CARBALLO et al.,
2002). O teste de toxicidade aguda que é realizado em mamíferos em um período de
24 horas, com administração de uma dose única ou doses múltiplas, geralmente por
via oral, de acordo com a RDC 90/2004 (BRASIL, 2004). O ensaio de
mutagenicidade sobre Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C), baseando-se na
mutação reversa para restauração ou compensação de um defeito gênico
responsável por um requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975; GASPARRI,
2005). E por fim, o teste de micronúcleo utilizado para o monitoramento de danos
mutagênicos em populações expostas a substâncias mutagênicas e carcinogênicas
(MERSCH; BEAUVAIS, 1997).
3.2.1 Mutagenicidade Sobre Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae é um organismo eucarioto amplamente estudado, semelhante às
células dos mamíferos no que se referem às macromoléculas, organelas e
proteínas. Possui vantagens como genoma pequeno e crescimento rápido em
42
condições adequadas, tornando-a uma ferramenta importante nas pesquisas sobre
mutagênese, reparo do DNA e mecanismos que respondem ao estresse oxidativo
(COSTA; FERREIRA, 2001; GASPARRI, 2005; MOURA, 2006). Essas leveduras
podem crescer tanto em condições anaeróbias quanto aeróbias e, portanto, são
expostas continuamente às espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas como
bioprodutos do metabolismo (COSTA; FERREIRA, 2001).
A S. cerevisiae pertence ao grupo das leveduras anaeróbias facultativas, ou
seja, esse micro-organismo fermenta hexoses, como a glicose e a frutose,
independente da concentração de oxigênio (COSTA; FERREIRA, 2001). A glicose é
a principal fonte de carbono para S. cerevisiae, dessa forma em meio rico (YEPD 2%
glicose), observa-se várias fases de crecimento microbiano, representadas na Figura
3.
A Fase Lag caracteriza-se pela adaptação do micro-organismo ao meio. Na
Fase Exponencial ocorre divisão celular a cada hora e meia, utilizando energia
obtida a partir da fermentação da glicose. Na Fase Diáuxica a disponibilidade de
glicose no meio diminui, ocorrendo a desrepressão catabólica, paralisando
momentaneamente a divisão celular para que as células se preparem para o
metabolismo respiratório. Na Fase Pós Diáuxica a divisão celular assume ritmo lento
– uma divisão a cada três ou quatro horas – utilizando o etanol, obtido durante a
fermentação, como fonte de carbono, e por fim a fase estacionária com ausência de
fontes de carbono, não havendo divisão celular, no entanto as células são capazes
de sobreviver por longos períodos de tempo (FUGE; WERNER, 1997).
43
Figura 3: Fases de crescimento de Saccharomyces cerevisiae em meio completo.
Fonte: FUGE; WERNER, 1997.
Os ensaios utilizando leveduras na determinação de agentes mutagênicos
ambientais e farmacológicos tem sido uma alternativa tendo em vista ser um ensaio
econômico, reprodutível, simples e rápido (MARTINS, 2010).
Os experimentos mais utilizados de mutações reversas consistem na
restauração ou compensação de um defeito gênico responsável por um
requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975; GASPARRI, 2005).
A restauração se deve a uma reversão exata do defeito original, enquanto que
a compensação pode ser devido a uma mutação secundária dentro do gene
(mutação supressora interna) ou por uma mutação externa, como no caso dos alelos
sem sentido, (nonsense – mutação que resulta na alteração de um códon que
determina um aminoácido para um códon de terminação da síntese protéica)
(HAWTHORNE; LEOPOLD, 1974; ATKIN et al., 1993; GASPARRI, 2005).
A reversão da auxotrofia (micro-organismo mutante que tem necessidade de
fatores de crescimento) para prototrofia (micro-organismo que não necessitam de
fatores de crescimento) pode ser causada por uma substituição, inserção ou deleção
de pares de bases, ou ainda uma mutação induzida por supressor do gene mutante
original (HENRIQUES; VALSA; GOMES, 1987; GASPARRI, 2005).
Para que seja identificada a mutação reversa é necessária a utilização de uma
linhagem com alterações genéticas adequadas, como no caso da linhagem haploide
44
de S. cerecisiae XV185-14c, isolada por Von Borstel. Essa linhagem permite a
detecção de dois tipos de mutações lócus especifico: recersões do alelo ocre lis1-1
(alterado no códon UAA de término de cadeia) ou do alelo missense his1-7 (códon
alterado codifica um aminoácido diferente), e reversões por deslocamento quando
de leitura do DNA (frameshift) verificadas no lóculs hom3-10. As células revertentes
podem ser detectadas pela semeadura em placas contendo meio seletivo no qual o
fator de crescimento inicialmente requerido não está presente, ou em concentrações
muito baixas, permitindo um background de crescimento (PARRY; PARRY, 1984;
GASPARRI, 2005).
Os resultados dos testes de mutagenicidade representam grande importância
no desenvolvimento de novos fármacos, pois a legislação prevê que para indústrias
farmacêuticas obterem um novo registro de medicamento é obrigatório a
apresentação de requisitos de segurança, incluindo entre outros, ensaios
toxicológicos referentes a mutagenicidade in vitro e in vivo (NUNES, 2008).
3.3 Plantas Medicinais
As plantas medicinais são utilizadas pela população de um modo geral para o
tratamento de enfermidades ou cura de diversas doenças, sendo essa prática
realizada desde os primórdios tendo continuidade até os dias de hoje como fonte
abundante de novas substâncias com potencial atividade biológica (GRAGG;
NEWMAN, 2012).
Neste processo os povos primitivos proporcionaram a identificação de
gêneros e espécies vegetais, o reconhecimento do habitat, a época da colheita, bem
como as partes dos vegetais que se adequavam ao uso medicinal (DI STASI, 1996;
CECHINEL; YUNES, 1998; TAVARES, 2000; MACIEL et al., 2002; CARVALHO et
al., 2002).
Segundo Calixto (2000) e Silva (2004) planta medicinal é toda e qualquer
espécie vegetal que contenha substâncias que exerçam algum tipo de ação
farmacológica com fins terapêuticos, podendo ser administrada sob qualquer forma
por alguma via ao homem, e que ainda possa servir como precursor para síntese
químico-farmacêutica.
As plantas medicinais, bem como os extratos vegetais com finalidade
terapêutica, possuem grande relevância na área farmacêutica, contribuindo para o
45
desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos e/ou como suporte de novas
estruturas químicas para elaboração de abordagens combinatórias (química e
bioquímica) otimizando suas atividades farmacológicas (SIMÕES; SCHENKEL,
2002; GRAGG; NEWMAN, 2012).
Existe um entusiasmo quanto às potencialidades de exploração de recursos
naturais, tendo em vista que no mercado mundial de medicamentos, estimado em
mais de 300 bilhões de dólares anuais, aproximadamente 40% são oriundos direta
ou indiretamente de fontes naturais, destes, 75% de origem vegetal e 25% de
origem animal ou de micro-organismos. Sendo que os países mais desenvolvidos
como Estados Unidos, Japão e países da Europa destacam-se nesse segmento,
enquanto que no Brasil os investimentos estão restritos a um número reduzido de
empresas (RODRIGUES; NOGUEIRA; PARREIRA, 2008; KLEIN et al., 2009). Assim
sendo, o uso terapêutico de recursos naturais, tenta legitimar-se juntamente com os
medicamentos industrializados, rotineiramente presente no cotidiano das pessoas
modernas.
No Brasil foi criada a Política de Práticas Integrativas e Complementares no
Sistema Único de Saúde (SUS), instituída pela Portaria MS n° 971, de 03 de maio de
2006, que contempla diretrizes, ações e responsabilidades do governo federal,
estadual e municipal para oferta de serviços e produtos da homeopatia, plantas
medicinais e fitoterapia, medicina tradicional chinesa/acupuntura, assim como para
observatórios de saúde do termalismo social e da medicina antroposófica,
promovendo a institucionalização destas práticas no SUS (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2006; RODRIGUES; SANTOS; AMARAL, 2006).
A Portaria MS n° 971, de 03 de maio de 2006 tem como objetivo ampliar as
opções terapêuticas aos usuários do SUS, com garantia de acesso a plantas
medicinais, a fitoterápicos, e a serviços relacionados à fitoterapia, com segurança,
eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade da atenção à saúde
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Somando-se a Política de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema
Único de Saúde, as ações decorrentes da Política Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos, aprovada por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006,
manifestadas em um Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,
instituída em 2007, visa “garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso
racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da
46
biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional”. Com
vistas a atingir o objetivo desse programa, dentre as proposições, destaca-se a de
“Promover e reconhecer as práticas populares e tradicionais de uso de plantas
medicinais, fitoterápicos e remédios caseiros” (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).
No ano de 2010, a ANVISA, através da Resolução nº 10 de 09 de março de
2010, elencou uma série de medidas para assegurar o uso de plantas por parte da
população, considerando a necessidade de contribuir para a construção do marco
regulatório para a produção, distribuição e uso de plantas medicinais,
particularmente sob a forma de drogas vegetais. Estes documentos levam em
consideração, dados etnofarmacológicos e estudos realizados com estas plantas,
oferecendo maior segurança para a população no que se refere ao modo de uso,
bem como, sua eficácia (BRASIL, 2010).
Dentre as plantas relacionadas no Anexo I da Resolução nº 10 de 09 de
março de 2010, destaca-se Allium sativum (alho), Anacardium occidentale (cajueiro),
Arctium lappa (bardana), Caesalpinia ferrea (jucá), Casearia sylvestris (erva de
bugre), Lippia sidoides (alecrim pimenta) como anti-séptico, Mikania glomerata
(guaco) bronquite infecciosa, Punica granatum (romã) infecções da mucosa da boca
e anti-séptico e Stryphnodendrom adstrigens (barbatimão) anti-séptico tópico na pele
e mucosas bucal e genital.
3.3.1 Metabolismo Secundário Vegetal e Influência Sazonal
As plantas possuem suas próprias defesas que as protegem de outras
plantas, insetos, fitófagos e herbívoros predadores de uma maneira geral. Estas
defesas podem ser de natureza morfológica que envolve o desenvolvimento de
cascas mais rígidas, espinhos entre outros e/ou de natureza química
biossintetizando substâncias do metabolismo secundário, fenômeno conhecido
como alelopatia, que é a ciência que estuda processos relacionados, principalmente,
a metabólitos secundários produzidos por algas, plantas, bactérias e fungos que
influenciam os processos biológicos com efeitos positivos e negativos e que estão
na gênese de micromoléculas potencialmente bioativas (PINTO et al., 2002;
SARTORATTO et al., 2004).
Embora uma planta possa conter centenas de metabólitos secundários, os
compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados e estudados
47
pela fitoquímica clássica. As principais classes de constituintes que podem ser
detectadas são: ácidos graxos; terpenoides; esteroides; fenóis; alcaloides;
cumarinas, flavonoides taninos entre outros (MACIEL et al., 2002; CECHINEL;
YUNES, 1998).
As plantas medicinais apresentam uma variação em diferentes níveis, tanto
no que diz respeito a conteúdo total, quanto na proporção de metabólitos
secundários. Isso ocorre devido aos estímulos decorrentes do ambiente, no qual a
planta se encontra, redirecionando a rota metabólica, resultando na biossíntese de
diferentes compostos (MORAIS, 2009).
As variações temporais e especiais, como é demonstrado na Figura 4,
acontencem de forma sazonal e diária, inter e intraplanta, inter e intraespecífica,
devido a modificações resultantes da interação de processos bioquímicos,
fisiológicos, ecológicos e evolutivos. Ou seja, os metabólitos secundários
representam uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante, onde
sua síntese é comumente afetada por condições ambientais (GOUVEA et al., 2012).
Figura 4: Fatores de influência no conteúdo e acúmulo de metabólitos secundários em planta.
Fonte: GOBBO-NETO; LOPES, 2007.
É importante ressaltar que estímulos decorrentes do ambiente apresentam
correlações entre si, exercendo infuência conjunta no metabolismo secundário.
48
Desta forma, a sazonalidade é apontada como um dos fatores de maior importância,
visto que a quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza das substâncias ativas
não é constante durante o ano (GLOBBO-NETO; LOPES, 2007; SIMÕES et al.,
2010; CUNHA, 2011).
As diferentes estações do ano ocorrem devido à inclinação da terra em
relação ao sol, e se caracterizam especialmente pelos padrões climáticos, incluindo
variações de temperatura, radiação solar (raios UV e IV), luminosidade, dias mais
longos ou curtos, e índice pluiviométrico (MORAIS, 2009).
A temperatura seja do ambiente ou solo, bem como a luminosidade
apresentam papel relevante na fotossíntese, pois a interação destes fatores garante
um ambiente ideal para o processo fisiológico, apesar de algumas espécies terem se
adaptado ao seu habitat natural, sendo capazes de resistir a variações de
temperatura (SOUZA et al.,2008).
As alterações de temperatura e luminosidade influenciam na variabilidade da
produção de óleos essenciais, na maioria das vezes, apresentam um aumento em
seu teor quando as plantas produtoras se encontram em ambientes com
temperatura elevada, porém, em dias muito quentes, pode-se observar perda
excessiva dos mesmos. A intensidade luminosa também interfere na concentração e
na composição dos óleos essenciais, devido ao desenvolvimento de estruturas
(tricomas glandulares) que biossintetisam e armazenam o óleo essencial (MORAIS,
2009).
A radiação solar, raios UV e IV, pode elevar a produção substâncias devido
ao fato de que as reações biossintéticas são dependentes de suprimentos de
esqueletos carbônicos, realizados por processos fotossintéticos e de compostos
energéticos que participam da regulação dessas reações (TAIZ; ZEIGER, 2004).
O excesso de água no solo pode alterar processos químicos e biológicos,
limitando a quantidade de oxigênio e acelerando a formação de compostos tóxicos à
raiz. Por outro lado, a percolação intensa da água provoca a remoção de nutrientes
e inibição do crescimento normal da planta. Os excedentes hídricos causam menos
problemas que a seca. A deficiência hídrica, caracterizada por diferentes formas e
intensidades, é a principal causa de perda de produtividade, porém, apresenta
correlação direta na concentração de metabólitos secundários, havendo relatos na
literatura de que o estresse hídrico geralmente induz um aumento na produtividade
de alguns terpenoides (HAAG, 1987; ORTOLANI; CAMARGO, 1987).
49
3.3.2 Substâncias Obtidas de Plantas Medicinais e Atividade Antimicrobiana
A presença de substâncias com potencial antimicrobiano nos vegetais não é
fato recente, no entanto as pesquisas sobre determinadas espécies vegetais com
propriedades antimicobianas têm sido ampliadas, especialmente considerando os
problemas relacionados ao uso de antibióticos (ROSA et al., 2011).
Desta forma, há conhecimento sobre alguns tipos de compostos derivados de
plantas, com importante atividade antimicrobiana. Destacando os compostos
fenólicos cita-se o ácido cafeico, que atua como antiviral e antibacteriano; os fenóis
hidroxilados, como o piragolol e o catecol, tóxicos para alguns micro-organismos; a
7-metiljuglona e plumbagina ativa contra E. coli, Salmonella thyphymurium e S.
aurerus. Dentre os flavonoides cita-se o isoprenil-flavonas, ativo contra
Streptococcus formadores de placas dentárias; luteolina, mirecitina efetivos contra S.
aureus resistentes a meticilina; mirecitina ativa contre B. cepacia; quercetina, rutina
e apigenina com efeito antimicrobiano importante contra E. coli e K. pneumoniae;
catequinas ativa contra Streptococcus mutans; dentre os terpenoides cita-se o
muzigadial, sesquiterpeno ativo contra bactérias Gram-positivas; tricorabdal A,
diterpeno que inibe diretamente Helicobacter pylori; ainda, dentre os alcaloides cita-
se a cassina, ativa contra S. aureus, B. subtilis e E. coli, entre outros (LIMA, 2001).
Em síntese, os resultados de pesquisas realizadas com plantas medicinais
quanto ao potencial bactericida e fungicida que extratos, frações, óleos essenciais e
demais produtos, exercem sobre as espécies microbianas, têm sido promissoras e
comprovadas, geralmente por estudos biológicos in vitro de susceptibilidade ou
sensibilidade (SOUZA et al., 2013).
3.4 Óleos Essenciais
Segundo a definição da ANVISA (BRASIL, 1999), os óleos essenciais “são
produtos de origem vegetal obtido por processo físico e podem se apresentar
isoladamente ou misturados entre si, retificados, desterpenados ou concentrados”.
Devido a sua frequente presença nos vegetais, os óleos essenciais
constituem um objeto de estudo visando atividades biológicas com potencial
terapêutico importante. Dentre algumas atividades farmacológicas já atribuídas aos
óleos essenciais pode-se citar: antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante,
50
anticolinesterásica, anti-helmíntica, antiparasitária, analgésica, sedativa, antitumoral,
e ainda como promotores de permeação de fármacos administrados por via
transdérmica (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).
As indústrias farmacêuticas e alimentícias empregam os óleos essenciais
tanto para uso humano como veterinário. A indústria farmacêutica os utiliza como
matéria prima para medicamentos devido às suas propriedades farmacológicas
próprias ou para a semi-síntese de novos fármacos. Na indústria alimentícia, são
utilizados como condimentos, aromatizantes e edulcorantes, e ainda estão presentes
nas indústrias de cosméticos, domissanitários e na aromaterapia (NIERO;
MALHEIROS, 2012; HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).
Conforme relatado por Bizzo e colaboradores (2009), existem 300 óleos
essenciais de importância comercial no mundo, movimentando cerca de US$ 15
milhões/ano, destes pode-se destacar os 18 principais como laranja (Citrus
sinensis), menta japonesa (Mentha arvensis), eucalipto – tipo cineol (Eucalyptus
globulus e Eucalyptus spp.), citronela (Cymbopogon winterianus e C. nardus),
hortelã-pimenta (Mentha piperita), limão (Citrus limon), eucalipto – tipo citronela
(Eucalyptus citriodora), cravo-da-índia (Syzygium aromaticum), cedro (Juniperus
virginiana e J. ashei), lima destilada (Citrus aurantifolia), spearmint (Mentha spicata),
cedro (Chamaecyparis funebris), sassafrás (Cinnamomum micranthum), cânfora
(Cinnamomum camphora), coentro (Coriandrum sativum), grapefruit (Citrus paradisi)
e patchouli (Pogostemon cablin).
Os óleos essenciais podem ser encontrados em todas as estruturas vegetais,
sendo mais frequente em folhas, flores e frutos, e constituem uma mistura complexa
de substâncias, com estruturas químicas heterogêneas. São constituídos por
substâncias de baixa massa molecular, principalmente misturas de fenilpropanoides
e terpenoides, especificamente monoterpenos (C10) e sesquiterpenos (C15), embora
diterpenos (C20) também possam estar presentes. Além desses, uma variedade de
hidrocarbonetos alifáticos (lineares, ramificados, saturados ou insaturados), ácidos,
álcoois, aldeídos, ésteres acíclicos ou lactonas e compostos com nitrogênio e
enxofre também foram identificados (OLIVEIRA et al., 2006; YUNES; CECHINEL
FILHO, 2007; SIMÕES et al., 2010).
Os fenilpropanoides se originam a partir da rota biossíntética do ácido
chiquímico, cujo biossíntese está esquematizada na Figura 5, que basicamente,
formam unidades de ácido cinâmico e p-cumárico. Esses por sua vez, por redução
51
enzimática originam os propenilbenzenos ou alilbenzenos, por oxidação com
degradação de cadeias lateriais originam os aldeídos aromáticos e por ciclizações
enzimáticas intramoleculares produzem cumarinas (SIMÕES et al., 2010).
Figura 5: Rota biossintética dos fenilpropanoides.
Fonte: SIMÕES et al., 2010.
Os terpenoides são substâncias originadas a partir da rota biossintética do
ácido mevalônico, esquematizada na Figura 6, por condensação aldólica, e hidrólise
originando a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA, que é reduzida a mevalonato, e então
52
convertido a isopreno, unidades pentacarbonadas. Essas por sua vez, sofrem
condesação, de um número variado de unidades isoprênicas, resultando nos
esqueletos terpenoides (SIMÕES et al., 2010; NIERO; MALHEIROS, 2012).
Figura 6: Estruturas precurssoras dos terpenoides.
Fonte: SIMÕES et al., 2010; NIERO; MALHEIROS, 2012.
Tratando-se de uma mistura complexa de constituintes voláteis, os óleos
essenciais brutos podem ser analisados quanti e qualitativamente por cromatografia
a gás acoplada a espectrometria de massas. Porém quando incluídos em formas
farmacêuticas, alimentos entre outros, sua análise requer processos de extração que
antecedem a análise propriamente dita (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL,
2012).
A utilização de óleos essenciais requer minuciosa caracterização química e
avaliação de possíveis modificações na sua composição, devido a variações
genéticas populacionais, variações da composição química em diferentes órgãos de
uma mesma planta, além da influência climática e edáfica (PAINTER, 1951; ANAYA
et al., 1974; OLIVEIRA, 2006; YUNES; CECHINEL FILHO, 2007).
A volatilidade dos óleos essenciais associada ao aroma torna essas
substâncias perceptíveis conferindo-lhes funções ecológicas especialmente como
inibidores da germinação (ação tóxica), na proteção contra predadores (micro-
organismos, fungos, insetos e herbívoros), na atração de polinizadores, na proteção
53
contra a perda de água, aumento da temperatura, entre outros (BRUNETON, 1991;
YUNES; CECHINEL FILHO, 2007; BAKKALI et al., 2008).
Pesquisas sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais demonstrou
que compostos fenólicos, como carvacrol, eugenol e timol apresentam ação efetiva
tanto bacteriostática como bactericida. Entre os terpenoides alifáticos tem-se o
geraniol e borneol. Os álcoois caracterizam-se pela ação bactericida. Alguns
aldeídos apresentam potente ação antimicrobiana, como neral, geraniol, citronelal e
mentona. E por fim, na classe dos fenilpropanoides pode-se destacar o
cinamaldeído, que demonstrou atividade antifúngica (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES;
APEL, 2012).
Para avaliação da atividade antimicrobiana tem-se utilizado ensaios in vitro
especialmente os métodos de difusão, diluição e bioautografia, sendo que esse
último permite relacionar possíveis efeitos microcidas e/ou microstáticos com
componentes presentes no óleo (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).
Assim como a grande maioria dos medicamentos, os óleos essenciais podem
apresentar toxicidade quando utilizados em doses elevadas. Já sendo conhecido
propriedades hepatotóxicas de algumas substâncias, como pulegona, composto
monoterpeno que de modo geral são considerados substâncias seguras, bem como
safrol que apresentou potencial genotóxico e carcinogênico. Logo, existe a
necessidade de avaliar não somente o potencial farmacológico de uma substância
de interesse, mas também seu perfil toxicológico (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES;
APEL, 2012).
3.4.1 Métodos Extrativos de Óleos Essenciais
Os métodos extrativos de óleos essenciais variam conforme a localização do
óleo na planta, bem como a proposta de utilização do mesmo (SIMÕES et al., 2010).
Dentre algumas técnicas, tem-se a enfloração, que consiste na extração de
óleos essenciais, de forma artesanal, não modificando a estrutura química dos
compostos e preservando o aroma, de folhas e flores com baixo teor de óleo e
delicadeza extrema. Neste processo, o material vegetal é depositado a temperatura
ambiente, sobre uma camada de gordura (apolar), durante certo período de tempo.
A seguir, o material vegetal esgotado é substituído por outro até a saturação total da
gordura que é então tratada com álcool. O álcool, por sua vez, é destilado a baixa
54
temperatura e o óleo essencial possui alto valor comercial (CLEVENGER, 1928;
FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003;
HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010) .
O arraste por vapor d’água é o método mais difundido de extração de óleos
voláteis, pois esses possuem pressão de vapor mais elevada que a da água, sendo,
por isso, arrastados pelo vapor d’água. A água é aquecida em um recipiente e o
vapor resultante desse processo é bombeado sob pressão para outro recipiente,
onde se encontra o material vegetal. O calor do vapor faz com que as paredes
celulares se abram. Dessa forma, o óleo que está armazenado entre as células
evapora junto com a água, até o tubo de resfriamento. A fase oleosa não se mistura
com a fase aquosa, podendo ser facilmente separados (CLEVENGER, 1928;
FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; BRAGA;
CREMASCO, 2003; CHENG, 2003; HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010).
Para extrações em pequena escala, realiza-se o processo de hidrodestilação,
empregando o aparato Clevenger. Diferentemente do arraste por vapor d’água, na
hidrodestilação o material vegetal é submetido ao contato direto com a água, e a
extração acontece em temperatura inferior a 100°C, protegendo os compostos
termolábeis. O óleo extraído fica retido no reservatório graduado do Clevenger,
também preenchido por água, após resfriamento do conjunto o óleo é então
coletado. Esse método fornece bons resultados, em curtos períodos de tempo,
porém em quantidade pequena (CLEVENGER, 1928; FARIAS, 1998; ARAÚJO,
1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003; HOSTETTMANN, 2003;
SIMÕES et al., 2010).
A prensagem ou expressão é o método é empregado para a extração dos
óleos voláteis de frutos cítricos. Os pericarpos desses frutos são prensados e a
camada que contém o óleo volátil é, então, separada. Posteriormente, o óleo é
separado da emulsão formada com água através de decantação, centrifugação ou
destilação fracionada (CLEVENGER, 1928; FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR,
2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003; HOSTETTMANN, 2003; LEITE, 2009;
SIMÕES et al., 2010).
Para a extração de óleos essenciais com solventes orgânicos as plantas são
imersas em solventes orgânicos apolares (hexano ou éter de petróleo) para extração
de compostos lipofílicos, e a separação realiza-se quimicamente, pela destilação em
temperaturas específicas, que causam somente a condensação do óleo e não dos
55
solventes. Neste caso, os óleos obtidos geralmente não são usados em
aromaterapia, pois geralmente contêm vestígios do solvente (CLEVENGER, 1928;
FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003;
HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010; SILVA et al., 2010).
Na extração por CO2 supercrítico, a parte vegetal de interesse é colocada em
um tanque, onde é injetado dióxido de carbono supercrítico. O CO2 é primeiramente
liquifeito através de compressão de 200 atmosferas e, em seguida, aquecido a uma
temperatura superior a 31°C. Nessa temperatura o CO2 atinge um quarto estado, no
qual sua viscosidade é análoga a de um gás, mas sua capacidade de dissolução é
elevada como a de um líquido. Uma fez efetuada a extração, reduz-se a pressão,
fazendo o CO2, retornar ao estado gasoso, resultando na sua eliminação. Esse
método permite recuperar os aromas naturais de vários tipos e não somente óleo
volátil, sendo utilizando para extração industrial de óleos voláteis (CLEVENGER,
1928; FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG,
2003; HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010; HENRIQUES, SIMÕES-PIRES,
APEL, 2012).
3.4.2 Métodos de Caracterização de Óleos Essenciais
Para a separação, purificação e o isolamento de substâncias de óleos
essenciais, geralmente, empregam-se diferentes técnicas cromatográficas como,
cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em coluna (CC),
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cromatografia gasosa (CG),
técnicas essas que também se destacam quanto ao conhecimento da composição
química, do princípio ativo e/ou do composto tóxico de uma planta (SOUZA-
MOREIRA; SALGADO; PIETRO, 2010).
A CCD é o método mais comum de análise, para uma caracterização prévia
da composição química de uma droga vegetal, pois ser fácil, versátil, rápido e
sensível, sendo que para a caracterização qualitativa da amostra, é necessário o
emprego de substâncias padrões. A CC é uma técnica eficaz para separação e
isolamento de compostos de misturas complexas, sendo seu maior recurso a
possibilidade de variação de polaridade da fase móvel (CALDERARI, 2002).
O método de CG é mais preciso na identificação de compostos voláteis,
permitindo a quantificação de substâncias presentes, bem como a verificação de
56
alterações na constituição química de uma amostra. Esse método consiste na
separação dos componentes voláteis da amostra, baseando-se na distribuição
desses constituintes entre a fase estacionária (sólida ou líquida) e a fase móvel
(gás). Neste método a identificação dos compostos de forma individual é realizada
através da comparação dos tempos de retenção da amostra. Para maior
confiabilidade da identificação dos compostos, tem-se o índice de retenção (IR) que
relacionam o tempo de retenção dos compostos sob análise com o tempo de
retenção de um padrão (série homologa de hidrocarbonetos) (SOUZA-MOREIRA;
SALGADO; PIETRO, 2010).
A CLAE permite uma ampla análise de diferentes compostos com relativa
facilidade de manuseio, necessitando a solubilidade das amostras na fase móvel e
uma possível interação com a fase estacionária. Essa técnica pode detectar
compostos moleculares, iônicos, ionizáveis, orgânicos ou inorgânicos, a níveis de
concentrações de ppm e ppb ou inferiores (CIOLA, 2003; SOUZA-MOREIRA;
SALGADO; PIETRO, 2010).
No que diz respeito à identificação e determinação estrutural realiza-se o
acoplamento das técnicas cromatografias a métodos espectrométricos, como
espectrofotometria de UV-visível (DAD), espectrometria de massas (MS e MS-MS) e
ressonância magnética nuclear (RMN), fornecendo informações adicionais que
auxiliam a propor, com maior segurança, a estrutura molecular de substâncias
naturais (MONACHE, 2001; SOUZA-MOREIRA; SALGADO; PIETRO, 2010).
A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) é
muito utilizada na caracterização de misturas complexas, permitindo a separação
dos constituintes pelo processo cromatográfico, seguida da análise pelo
espectrômetro de massas, que indica a massa molecular e o seu padrão de
fragmentação. Esse padrão de fragmentação pode ser comparado eletronicamente
com o banco de dados da biblioteca de especro de massas, permitindo a elucidação
estrutural da amostra por análise comparativa (SIMÕES et al., 2010).
A espectroscopia na região do infravermelho fornece informações dos grupos
funcionais presentes nas moléculas que compõe os óleos essências, porém é uma
técnica pouco seletiva no caso de misturas complexas (CHAAR, 2002).
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 13C e 1H é muito útil
para elucidação estrutural de compostos orgânicos. Geralmente é aplicada para
substâncias puras diluindo-as em solventes deuterado (SIMÕES et al., 2010).
57
O espectro de RMN 1H, fornece os deslocamentos químicos dos hidrogênios
presentes na molécula. A integração indica a quantidade de hdrogênios em um sinal
e as constantes de acoplamento (J) indicam a forma espacial dos hidrogênios
(MONACHE, 2001).
Os espectros de RMN 13C fornecem os deslocamentos químicos de vários
tipos de carbonos presentes na molécula, que estão distribuídos em um campo de 0
a 220 ppm, muito mais amplo que o de hidrogênio (0 a 16 ppm), permitindo uma
melhor distinção dos tipos de carbonos (MONACHE, 2001).
3.5 Família Piperaceae e o Gênero Piper
A família Piperaceae apresenta-se como uma das maiores famílias dentre as
angiospermas, sendo composta por 12 gêneros, distribuídos mundialmente. No
entanto dois gêneros destacam-se com maior importância, o gênero Piper e
Peperomia com aproximadamente 2000 e 1700 espécies distribuídas a nível mundial
(QUIJANO-ABRIL et al., 2006; WANKE et al., 2007; JUNQUEIRA, 2007; VANIN et
al., 2008).
No Brasil encontra-se quatro gêneros pertencentes a família Piperaceae,
destacando os gêneros Peperomia e Piper com maior diversidade de espécies,
sendo 166 e 265 espécies respectivamente (YUNCKER, 1966, 1972, 1973, 1974;
TEBBS, 1990; JOLY, 1998; JARAMILLO; MANOS 2001; ARIAS et al., 2006).
O gênero Piper é nativo, e ocorre de norte a sul do Brasil, podendo ser
encontrado no Norte (Roraima, Amapá, Pará, Amazonas, Tocantins, Acre,
Rondônia), Nordeste (Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba,
Pernambuco, Bahia, Alagoas, Sergipe), Centro-Oeste (Mato Grosso, Goiás, Distrito
Federal, Mato Grosso do Sul), Sudeste (Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo,
Rio de Janeiro), Sul (Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul) (GUIMARÃES et
al., 2012).
Mundialmente o gênero Piper possui aproximadamente 2000 espécies já
identificadas, com distribuição nas regiões tropicais e subtropicais, como África,
Ásia, Pacífico Sul, Andes, América Central, Amazônia e Mata Atlântica. Na Figura 7
é apresentado os números de espécies encontradas por região. Destacando a
Amazônia, Ásia, América Central e Mata Atlântica, como as regiões com maior
número de espécies do gênero Piper, sendo, portanto, uma fonte importante de
58
matéria prima para a pesquisa de susbtâncias bioativas (SENGUPTA; RAY, 1987;
PARMAR et al., 1997; JARAMILLO; MANOS 2001; WANKE et al., 2007).
Figura 7: Distribuição geográfica de Piper em ambos os hemisférios.
Fonte: JARAMILLO; MANOS 2001.
As espécies de Piper ocorrem de forma comum em regiões quentes e úmidas,
ou seja, regiões tropicais, sendo geralmente arbustivas e herbáceas, podendo ainda
apresentar-se como pequenas árvores ou vinhas. Possuem folhas simples e
alternadas, apresentando caules divididos por nodos salientes, e galhos de fácil
quebradura. Outra característica morfológica importante é a presença de
inflorescências ou infrutescências (YUNCKER, 1958; CRONQUIST, 1981; EVANS,
1991; JARAMILLO; MANOS 2001, MEDEIROS; GUIMARÃES 2007).
Diversas espécies de Piper são empregadas na produção de condimentos
devido ao sabor picante/forte e cheiro aromático, como a Piper nigrum (pimentas
branca e preta). Sendo também utilizadas para o tratamento de algumas
enfermidades, na medicina tradicional da China, no sistema Ayurvédico da Índia e
na América Latina, devido às propriedades biológicas e farmacológicas de seus
compostos (PIO-CORREA, 1974; GUIMARÃES et al., 1978; DI STASI et al., 1989;
MA et al., 2004; SANTOS et al., 2012).
Mesmo com forte evidência científicas do potencial terapêutico das espécies
do gênero Piper, apenas 10% dessas foram estudadas sob o ponto de vista
fitoquímico. Neste gênero destaca-se uma composição variada de metabólitos
59
secundários, como alcaloides, lignanas, neolignanas, lactonas, chalconas,
fenilpropanoídes, amidas, flavonoides, óleos essenciais entre outros, bem como um
número expressivo de compostos isolados (SENGUPTA; RAY, 1987; BENEVIDES et
al., 1999; AHMAD; TAWAN, 2002; MA et al., 2004; CORREA et al., 2011; SANTOS
et al., 2012).
No quadro 1 estão apresentadas algumas espécies pertencentes ao gênero
Piper investigadas como fonte de novos produtos naturais com atividades biológicas
promissoras, como atividade antitumoral, antimicrobiana, antimalária, antiparasitária,
inseticidas, problemas do trato respiratório e aparelho digestivo entre outras
(BENEVIDES et al., 1999; GUERRINE et al., 2009).
Destacando, também neste Quadro, pesquisas utilizando óleos essenciais
obtido de espécies de Piper, como a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais
de P. aduncum e P. tuberculatum contra fungos Cladosporium sphaerospermum e
C. caldospurioides (NAVICKIENE et al., 2006); ação bacteriostática e fungistática de
P. angustifolium (TIRILLINI; VELASQUEZ; PELLEGRINO, 1996); atividade
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Candida albicans de P. cernuum e
P. regnellii (COSTANTIN et al., 2001); atividade antifúngica frente a Cladosporium
sphaerospermum e C. caldospurioides de P. malacophyllum (LAGO et al., 2005); e
atividade antibacteriana de P. nigrum (DORMAN; DEANS, 2000).
60
Quadro 1: Atividade biológica de diferentes espécies do gênero Piper. Espécie Atividade Biológica Classe/Substância Fonte
Piper aduncum
Antiviral (poliovirus) - LOHEZIC-LE DEVEHAT et al.,
2002
Antiparasitária (formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonenses)
Chalconas TORRES-SANTOS et al., 1999
a;b
Antimicrobiana e molusquicida - LENTZ et al., 1998; ORJALA et al., 1993
Antifúngica (Cladosporium sphaerospermum e C.
caldospurioides) Óleo essencial NAVICKIENE et al., 2006
Piper angustifolium Lam. Bacteriostática e fungistática Óleo essencial TIRILLINI; VELASQUEZ;
PELLEGRINO, 1996
Piper auritum Antiespasmódica - MILIAN; TORRES; RODRIGUEZ, 2001
Piper betle Linn.
Antibacteriana (Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Estreptococcus pneumoniae e Klebsiella aerogenes)
Antifúngica moderada Antibacteriana (bactérias anaeróbias que causam halitose)
- SHITUT; PANDIT; MEHTA,
1999 RAMJI et al., 2002
Piper cernuum Antimicrobiana (Staphylococcus aureus e Candida albicans) Óleo essencial COSTANTIN et al., 2001
Piper crassinervium Kunth Antifúngica (Cladosporium cladosporioides e Cladosporium
sphaerospermum) Flavonas e hidroquinonas
feniladas DANELUTTE et al., 2003
Piper cubeba Antiviral (hepatite C) Extrato aquoso HUSSEIN et al., 2000
Piper futokadzura Sieb. Defesa contra insetos Piperona SIMOES et al., 2000
Piper gibbilimbum Antibacteriana (Staphylococcus epidermidis e Bacillus cereus) Alquifenóis ORJALA et al., 1998
ABE; TAKIKAWA; MORI, 2001
Piper guineense Antifúngica (fungos filamentosos e leviduruformes) - NGONO NGANE et al., 2003
Piper hispidum Antimalária - JENETT-SIEMS et al., 1999
Piper lanceaefolium Antifúngica (Candida albicans) - LOPEZ; MING; TOWERS, 2002
Piper longum
Defesa contra insetos Amidas e alcaloides SUNG-EUN LEE, 2000
YANG et al., 2002
Antiparasitária (Giardia lamblia e Entamoeba histolytica) - TRIPATHI et al., 1999 GHOSHAL; PRASAD;
LAKSHMI, 1996
61
Piper malacophyllum Antifúngica (Cladosporium sphaerospermum e C.
caldospurioides) Óleo essencial LAGO et al., 2005
Piper methysticum Forst Antimicrobiana - COSTA, 1994
BRUNETON, 1991
Piper nigrum
Antibacteriana Óleo essencial DORMAN; DEANS, 2000
Patógenos veiculados por alimentos Compostos fenólicos PRADHAN; VARIYAR;
BANDEKAR, 1999
Defesa contra insetos Amidas presentes em frutos PARK et al., 2002
Piper regnellii Antimicrobiana (Staphylococcus aureus e Candida albicans) Óleo essencial COSTANTIN et al., 2001
Antibacteriana e antifúngica (dermatófitos) Extrato das folhas PESSINI et al., 2003 e 2005
KOROISHI, 2008
Piper sarmentosum Antimalária - NAJIB NIK; RAHMAN et al.,
1999
Piper solmsianum Antibacteriana e antifúngica Conocarpano e
eupomatenoide-5 CAMPOS, 2006; CAMPOS et
al., 2005; CAMPOS et al., 2007.
Piper tuberculatum Jacq. Antitumorais e hipotensoras Amidas SIMOES et al., 2000
Antifúngica (Cladosporium sphaerospermum e C.
caldospurioides) Óleo essencial NAVICKIENE et al., 2006
62
3.5.1 Piper amplum
A espécie P. amplum é conhecida popularmente como caabepa, jaborandi,
murta ou pariparoba. Distribui-se geograficamente pelo Brasil nos estados da Bahia,
Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro e Santa Catarina (GUIMARÃES;
MONTEIRO, 2006).
Assim como a grande maioria das espécies desse gênero, são plantas
arbustivas, com folhas de tamanho avantajado, com pecíolo de 3-3,5 cm de
comprimento e bainha caniculada e ramos cilíndricos, estriados, nodosos, glabros,
entrenós com cerca de 4-9 cm de comprimento, como representado na Figura 8
(GUIMARÃES; VALENTE, 2001).
Santos et al. (2001) e Angnes (2005) analisaram o óleo essencial das folhas
frescas de P. amplum, obtidos por hidrodestilação com aparato Clevenger, por
CG/EM e índice de retenção (IR), sendo que Santos et al. (2001) identificou 17
substâncias. Destas 22,5% eram monoterpenos e 34,9% sesquiterpenos,
destacando como compostos majoritários α-pineno (16,78%), β-cariofileno (9,82%),
E-nerolidol (8,3%), germacreno D (5,28%) e limoneno (3,5%). Angnes (2005)
caracterizou 19 constituintes, cerca de 90%, sendo 21,4% monoterpenos e 68,8%
sesquiterpenos, apresentando como substâncias majoritárias, β-cariofileno (24,4%),
valenceno (16,4%), α-pineno (12,9%), α-cadinol (8,5%), α-copaeno (4,2%) e
limoneno (3,8%).
Na literatura científica não existem relatos e/ou pesquisas sobre atividades
biológicas dos óleos essenciais desta espécie. No entanto, Muller (2011) testou o
extrato etanólico de P. amplum frente a quatro espécies de Candida, sendo elas C.
albicans, C. krusei, C. parapsilosis e C. cerevisiae, observando a ausência de
atividade antifúngica do extrato para todas as espécies testadas.
63
Figura 8: Folhas de Piper amplum.
Fonte: O autor (2013).
3.5.2 Piper cernuum
A espécie P. cernuum é conhecida popularmente como pau-de-cobra-cipó e
rabo-de-gambá. Caracteriza-se por ser um arbusto com folhas grandes, que estão
representadas na Figura 9, encontrado comumente na Amazônia, Nordeste, Sudeste
e Sul do Brasil. É utilizada na medicina popular na forma de infuso de folhas, para
fins analgésicos, dores no trato digestivo, problemas hepáticos, renais, bem como
para circulação (STIPP, 2000; DI STASI et al., 2002).
Figura 9: Folhas de Piper cernuum.
Fonte: O autor (2013).
64
Na literatura científica consta um único trabalho científico sobre a avaliação
fitoquímica a partir das folhas de P. cernuum, citando o isolamento de derivados de
ácido cinâmico, entre os quais o 3,4-dimetoxi-diidrocinamato de metila, ácido 3,4-
dimetoxi-diidrocinamico, 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-diidrocinamato de metila
(diidrosinapato de metila) e 3,5 dimetoxi-4-hidroxi-cinamato de metila (sinapato de
metila) e a lignana cubenina (DANELUTTE et al., 2005).
Alguns trabalhos foram encontrados relatando a obtenção e análise de óleos
essenciais a partir das folhas de P. cernuum. Torquilho et al. (2000) identificaram 26
constituintes (92,9%) presentes no óleo essencial das folhas frescas, destacando
como majoritários o cis-dihidroagarofurano (32,3%), α-pineno (10,2%), β-pineno
(7,4%), 10-epi-ɣ-eudesmol (7,1%) e β-elemol (6,7%). Já Costantin et al. (2001)
identificaram 36 constituintes (98,91%), sendo 27,5% monoterpenos e 71,4%
sesquiterpenos, destacando como majoritários biciclogermacreno (21,88%), β-
cariofileno (20,69%), α-pineno (7,16%), germacreno D (6,68%) e β-pineno (6,15%).
Costantin et al. (2001) e Zaindan (2005), avaliaram a atividade antimicrobiana
do óleo essencial de P. cernuum pelo método de difusão em ágar, relatando
atividade antibacteriana frente a S. aureus, Costantin et al. (2001) relata ainda
atividade antifúngica frente a Candida albicans.
Mesquita et al. (2005), analisaram óleo essencial das folhas de P. cernuum
por CG/EM e índice de retenção (IR), identificando 32 substâncias (76,6%), sendo
na coleta referente ao ano de 1999, 7,2% eram monoterpenos e 81,9%
sesquiterpenos. Na coleta realizada no ano de 2001, 9,9% eram monoterpenos e
72,6% sesquiterpenos, destacando como compostos majoritários trans-
dihidroagarofurano (22,4%), 10-Epi-γ-eudesmol (16,8%), germacreno D (9,0%),
elemol (7,2%), α-pineno (4,1%) e β-eudesmol (4,1%).
Assis et al. (2013), identificaram 16 compostos (94,4%) presentes no óleo
essencial de P. cernuum, utilizando CG/EM, CG/DIC e índice de retenção. Sendo
que neste óleos só foram encontrados sesquiterpenos. Os constituintes majoritários
foram o epi-cubebol (13,1%), β-elemeno (11,6%), espatulenol (9,6%), valeranone
(9,1%), β-cariofileno (8,3%), cis-β-guaieno (8,2%), óxido de cariofileno (7,7%) e ɣ-
muuroleno (7,6%).
Com relação a atividade antimicrobiana, Aguiar (2003) avaliou o óleo
essencial de P. cernuum através do método de difusão em ágar, observando a
inatividade da amostra frente a S. aureus, E. coli e P. aeruginosa.
65
Cordova et al. (2010), avaliou a atividade antimicrobiana do extrato bruto
hidroalcoólico das partes aéreas de P. cernuum, frente a molicutes (Mycoplasma
arginini, M. hominis e Ureaplasma urealyticum), pelo método de microdiluição em
caldo, observando atividade pela inibição de crescimento bacteriano, com CIM
variando de 5000 a 1250 ppm.
66
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material Vegetal
As folhas de Piper amplum e Piper cernuum foram coletadas no município de
Blumenau/SC (latitude: 26°97’69,66” S, longitude: 49/06’24,31” O e altitude: 200 m),
ao final de cada estação do ano, inverno (15 de setembro de 2012), primavera (15
de dezembro de 2012), verão (15 de março de 2013) e outono (15 de junho de
2013). As exsicatas foram preparadas e enviadas para o Herbário Dr. Roberto
Miguel Klein da Universidade Regional de Blumenau, sendo identificadas e
depositadas no sob o números 41606 e 4154, respectivamente.
4.1.1 Obtenção dos Óleos Essenciais e Frações
As folhas de Piper amplum e Piper cernuum foram coletadas nas quatro
estações do ano, sendo realizadas no mesmo local, dos mesmos arbustos e no
mesmo período do dia com o objetivo de reduzir o número de fatores interferentes e
tendo somente a sazonalidade como variável na produção de seus metabólitos
secundários.
As folhas foram secas em sala de secagem com temperatura ambiente e
umidade controlada, durante 5 a 7 dias, com o objetivo de minimizar a perda de
compostos voláteis. Posteriormente foram trituradas com auxílio de triturador de
plantas, até granulometria padronizada correspondente tamis de malha 9.
A obtenção do óleo essencial deu-se utilizando a técnica de hidrodestilação
com o auxílio do aparato Clevenger (Figura 10), durante um período de quatro
horas, sendo o procedimento repetido por mais quatro horas no dia seguinte. A
quantidade de água utilizada, especificada na Tabela 1, foi dependente da
necessidade da planta, uma vez que a mesma apresenta forte tendência a inchar
em contato com água.
67
Tabela 1: Quantidade de matéria prima vegetal seca e triturada de Piper amplum e Piper cernuum e quantidade de água destilada necessária para obtenção de óleo essencial por hidrodestilação.
Estações do Ano / Plantas
Piper amplum (g)
Água Destilada (mL)
Piper cernuum (g)
Água Destilada (mL)
Inverno 2012 237,79 3000 205,93 3000 Primavera 2012 119,27 2000 179,43 3500
Verão 2012/2013 156,36 2500 176,33 3800 Outono 2013 200,27 3000 195,82 4000
Figura 10: Extração de óleo essencial de Piper amplum e Piper cernuum por hidrodestilação com o auxílio do aparato Clevenger.
Aos óleos obtidos em cada estação, foi adicionado sulfato de sódio anidro, em
quantidade suficiente, para retirada da água restante. Posteriormente os óleos foram
armazenados em congelador, em eppendorf protegidos da luz (SIMÕES et al.,
2010). O rendimento extrativo de óleo essencial foi expresso em massa (g) e
porcentagem (%).
A densidade absoluta (g/mL) dos óleos essenciais obtidos foi realizada a
partir da verificação de volume (mL) e massa (g), em replicata (n=3), e calculou-se a
média e o coeficiente de variação (Cv = desvio médio x 100 / valor médio).
4.1.2 Partição Líquido-Líquido
Ao término do período de obtenção dos óleos essenciais, o hidrolato foi
filtrado e submetido à partição líquido-líquido com solventes imiscíveis entre si e em
ordem crescente de polaridade. Os solventes utilizados para a extração foram o
diclorometano e acetato de etila. Para cada 1000 mL de hidrolato foi utilizado 250
68
mL de cada solvente, repetindo o procedimento por mais duas vezes para cada
solvente, totalizando 750 mL de cada solvente supracitado.
As alíquotas das extrações foram reunidas, e a elas adicionou-se sulfato de
sódio anidro, em quantidade suficiente, para retirada da água restante. As frações
diclorometando e acetato de etila foram filtradas e concentradas em evaporador
rotatório, em temperatura máxima de 50 °C, para obtenção do resíduo seco (Figura
11). O rendimento extrativo das frações foi expresso em massa (g) e porcentagem
(%), a partir dos resultados obtidos.
Figura 11: Partição líquido-líquido dos hidrolatos de Piper amplum e Piper cernuum, com diclorometano e acetato de etila, e posterior eliminação dos solventes em rota evaporador.
4.1.3 Caracterização dos Óleos Essenciais
A análise química dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum foi
realizada por CG-EM e CG-DIC, utilizando metodologia proposta por Costantin et al.
(2001), com adaptações.
69
Os óleos essenciais foram diluídos em diclorometano na concentração de 1%.
As análises foram realizadas por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de
massas (CG/EM Shimadzu, QP2010 S) com coluna capilar Rtx-1 (100%
metilpolisilocsano, 30 m X 0,25 mm X 0,10 µm). Foi utilizado gás Hélio como
carreador em um fluxo de 0,8 mL/min, com temperatura de 300°C no injetor, modo
de injeção split. O volume injetado foi de 1 µL com razão de divisão de 40:1 e
programa de temperatura de 80 °C a 310 °C. As amostras foram analisadas utilizado
o espectrômetro de massas operando a 70 eV. A identificação dos compostos foi
realizada por comparação dos seus espectros de massas com os espectros da base
de dados NIST (Mass Spectral Library).
Os óleos também foram analisados por cromatografia gasosa (CG Shimadzu,
2010) acoplada detector de ionização de chamas (DIC), nas mesmas condições
descritas acima, exceto, temperatura de 310 °C no injetor, modo de injeção sliptless,
com volume injetado de 1,4 µL com razão de divisão de 1:50.
Os Índices de retenção (IR) foram calculados com base nos tempos de
retenção de uma série de alcanos lineares (C7 a C40 – SUPELCO), analisados nas
mesmas condições descritas, utilizando a equação de Van Den Dool e Kratz (1963),
demonstrada abaixo, uma vez que utilizou-se programa de temperatura programada
(MÜHLEN, 2009; ALVES; VICTOR, 2010).
Onde, IR significa índice de retenção; i a diferença do número de carbonos
entre os hidrocarbonetos que eluem depois e antes; Tr (X) o tempo de retenção da
substância desconhecida; Tr (HA) o tempo de retenção do hidrocarboneto que elui
antes da substância desconhecida; Tr (HD) o tempo de retenção do hidrocarboneto
que elui depois da substância desconhecida; N o número de carbonos do
hidrocarboneto que elui antes da substância desconhecida.
Foram também realizadas análises dos óleos essenciais por ressonância
magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) e carbono-13 (RMN de 13C), bem
como análises por infravermelho (IV).
70
Para a análise por RMN os óleos essenciais das duas espécies de Piper
foram diluídos em clorofórmio deuterado na concentração de 0,04 g/mL tendo como
referência o tetrametilsilano e analisados em aparato Bruker Avance DPX 300.
As análises por IV dos óleos essenciais das duas espécies de Piper, foi
realizada através da técnica DRIFTS (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform
Spectroscopy), em celas de Seleneto de Zinco, utilizando o Espectrômetro
Interfotométrico por Transformada de Fourier IRPrestige – 21, SHIMADZU (Tokyo,
Japan).
Realizou-se a comparação dos dados obtidos com os dados disponíveis na
literatura.
4.2 Material Microbiológico
As bactérias foram mantidas em ágar Mueller-Hinton e os fungos
leviduriformes em ágar Sabouraud dextrosado, conservadas sob refrigeração (4 °C)
no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia dos Cursos de Farmácia e
Biomedicina da UNIVALI, campus de Itajaí, SC, sendo repicadas em intervalos de 15
a 30 dias para manter a viabilidade das colônias microbiana.
Os fungos filamentosos foram armazenados em ágar Sabouraud dextrosado,
conservados à temperatura ambiente na micoteca do mesmo Laboratório acima
citado, sendo também repicados em intervalos de 15 a 30 dias para manter a
viabilidade das colônias microbiana e prevenir transformações pleomórficas.
4.2.1 Micro-organismos
Para a avaliação antibacteriana, foram utilizadas cepas padronizadas a partir
do American Type Culture Collection (ATCC), sendo Staphylococcus aureus (ATCC
25923), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Bacillus subtilis (ATCC 14579) e
Escherichia coli (ATCC 11775).
Para a avaliação antifúngica foram utilizadas cepas padronizadas a partir do
American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, EUA, e Ceremic (C),
Centro de Referencia Micológica, Facultad de Ciencias y bioquímicas
Farmacêuticas, Rosario, Argentina, sendo Microsporum canis (C 112), Microsporum
gypseum (C115), Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9972), Trichophyton rubrum
71
(C137), Epidermophyton flocosum (C114), Aspergillus fumigatus (ATCC 26934),
Rhizopus sp. (C135), Candida albicans (ATCC 10231) e Criptococcus neoformans
(ATCC 32264).
4.2.2 Atividade Antimicrobiana
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração
microbicida mínima (CMM) dos óleos essenciais e frações, diclorometano e acetato
de etila, das espécies de Piper das diferentes estações do ano através do método de
diluição em ágar, que consistiu em diluições seriadas dos óleos e frações, em meio
de cultura apropriados, para bactéria ou fungo, seguida por incubação e posterior
verificação da menor concentração que inibiu o crescimento microbiano (KALEMBA;
KUNICKA, 2003; OSTROSKY et al., 2008).
Para a determinação das CMMs, a partir de cada uma das concentrações que
não apresentaram crescimento microbiano no ensaio da CIM, foi realizado as
respectivas subculturas em meio de cultura isento de óleo essencial ou fração, e
novamente, seguido de incubação e posterior verificação da menor concentração
que inibiu o crescimento microbiano.
Para localização das substâncias com atividade antimicrobiana em um
cromatograma obtido em CCD, foi realizado o ensaio de bioautografia
(HAMBURGUER; CORDEL, 1987; RAHALISON et al., 1994).
4.2.3 Preparo de Inóculos Bacterianos
Cada espécie bacteriana utilizada no presente trabalho foi transferida do meio
de manutenção para o meio ágar Mueller Hinton e incubada a 35°C por 18-24 horas,
para ativar a respectiva cultura.
Após reativação de cada espécie bacteriana, foi preparado o inóculo
microbiano, conforme demonstrado na Figura 12, selecionando de 4 a 5 colônias
bacterianas, que foram transferidas para um tubo de ensaio com 5 mL de solução de
cloreto de sódio a 0,86% estéril, seguido por homogeneização em agitador de tubos
por 15 segundos. A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520
nm, por comparação com a escala de McFarland nº 0,5, equivalente a
72
aproximadamente 1,5 x 108 células/mL, para o método de diluição em ágar (CLSI,
2009).
4.2.4 Preparo de Inóculos Fúngicos
Cada espécie de fungo leviduriforme utilizado nesta pesquisa foi cultivado em
ágar Sabouraud dextrosado, por pelo menos duas vezes para assegurar a
viabilidade das culturas jovens de 24 e 48 horas a 30 °C. Para o preparo do inóculo
fúngico, também demonstrado na Figura 12, foram selecionadas 5 colônias da
levedura, com aproximadamente 1 mm de diâmetro, que foram suspensas em 5 mL
de solução de cloreto de sódio a 0,85% estéril, seguido por homogeneização em
agitador de tubos por 15 segundos. A densidade do inóculo foi ajustada por
espectrofotometria a 520 nm por comparação com a escala de McFarland nº 0,5
levando a concentração equivalente a aproximadamente 1 x 106 a 5 x 106 células/mL
(ESPINEL-INGROFF; PFALLER, 1995).
Figura 12: Preparo de inóculos bacterianos e de fungos leviduriformes.
Os inóculos dos fungos filamentosos foram preparados removendo os
conídeos de cada fungo a partir da cultura jovem previamente cultivada em ágar
73
Sabouraud dextrosado à temperatura ambiente de 7 a 10 dias. Com auxílio de uma
alça, a superfície da cultura foi raspada e o material foi transferido para um tubo com
10 mL com água estéril e homogeneizado em agitador de tubos.
A suspensão conidial foi filtrada, com auxílio de uma gaze, para remoção das
hifas e novamente homogeneizada e ajustada para 1 x 106 conídeos/mL pela adição
de água, utilizando uma câmara de Neubauer para determinação do número de
conídeos (LLOP et al., 2000).
4.2.5 Bioautografia
As amostras foram dissolvidas em solvente apropriado e aplicadas em placas
de CCD (sílica gel 60). Em seguida, as placas foram previamente submetidas à
eluição em diferentes sistemas de solventes para a escolha daquele que pudesse
fornecer a melhor resolução, ou seja, melhor separação entre as substâncias.
Para a realização da bioautografia dos óleos essenciais das diferentes
estações do ano das duas espécies de Piper, os mesmos foram aplicados em placa
de CCD sem diluições. Após absorção completa da alíquota de 1 µL de óleo
essencial puro pela sílica, foi realizada a corrida cromatográfica, em cuba saturada,
utilizando como fase móvel hexano: acetato de etila (95:5), que foi o sistema de
solventes que apresentou os melhores resultados de resolução.
Para a realização da bioautografia das frações diclorometano e acetato de
etila oriundas a partir dos hidrolatos gerados da extração dos óleos essenciais das
diferentes estações do ano das duas espécies de Piper, foi empregado solução com
concentração de 4 mg/mL das frações em acetona e, aplicou-se alíquotas de 10 µL
das amostras por ponto. Após absorção completa da alíquota das amostras pela
sílica e evaporação do solvente, foi realizada a corrida cromatográfica, em cuba
saturada, utilizando como fase móvel hexano: acetato de etial (60:40), que para
essas amostras foi o sistema de solventes com melhores resoluções.
Após a eluição e eliminação total dos resíduos dos solventes utilizados na
eluição das placas, foi distribuída sobre cada placa de CCD uma fina camada de
meio de cultura sólido fundido e arrefecido contendo inóculo microbiano (106
células/mL), as placas foram incubadas a 35 °C por 18 a 24 horas.
Para facilitar a leitura dos resultados, após o período de incubação foi
borrifado nas placas uma solução aquosa de cloreto de 2,3,5 trifenil tetrazólico (TTC)
74
(20 mg/mL) e estas foram novamente incubadas a 35 °C por mais 4 horas, como
demonstrado na Figura 13.
O critério empregado para a interpretação dos resultados de bioautografia foi
o aparecimento de zonas claras em torno das substâncias isoladas na CCD,
sugerindo a respectiva atividade antimicrobiana (RAHALISON et al., 1994).
Figura 13: Ensaio de bioautografia para o direcionamento das pesquisas quanto à localização dos compostos bioativos para atividade antimicrobiana.
4.2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O método consiste em preparar diluições sucessivas das amostras a serem
testadas, em meios de cultura sólidos ou líquidos, semeados com bactéria ou fungo
em estudo. Depois do período de incubação, verifica-se a menor concentração da
amostra que inibiu o crescimento do micro-organismo utilizado no ensaio.
Os valores da CIM foram determinados através da diluição dos componentes
obtidos das espécies de Piper, em ágar empregando a metodologia descrita por
CLSI (2009) com modificações.
75
Os óleos essenciais foram utilizados puros, enquanto que as frações
diclorometano e acetato de etila foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) na
concentração inicial de 40 g/L. As amostras foram adicionadas em séries de 10
frascos com capacidade para 5 mL para realização da diluição seriada.
Para os óleos utilizou-se solução aquosa de tween 80 a 1% para facilitar a
diluição obtendo diferentes concentrações, de 25000 a 48 ppm. Já para as frações
obtidas dos hidrolatos foi utilizado água destilada como agente de diluição obtendo
concentrações de 1000 a 2 ppm. Em seguida, a cada frasco foi adicionado 1 mL de
meio de cultura ágar Mueller-Hinton para bactérias e 1 mL de ágar Sabouraud
dextrosado para os fungos leviduriformes e fungos filamentosos, seguido por
imediata homogeneização da mistura.
Após a solidificação dos meios de cultura, os micro-organismos, previamente
ativados, foram inoculados nas séries correspondentes, com auxílio de alça
calibrada de 1µL em cada frasco (meio de cultivo), correspondendo a uma
quantidade de 1,5 x 105 células bacterianas, 1 x 103 a 5 x 103 células fúngicas
leviduriformes. Para os fungos filamentosos foi empregado alça calibrada de 10 µL
correspondendo a 1 x 104 conídeos. Os frascos foram incubados a 35 °C por 18 a 24
horas para as bactérias, a 30°C por 24 a 48 horas para fungos leviduriformes, e a
temperatura ambiente (25 °C) por 5 a 15 dias para os fungos filamentosos, conforme
ilustrado na Figura 14a.
Decorrido o período de incubação, realizou-se as leituras da CIM através da
verificação visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi
considerada CIM a inibição total do crescimento microbiano.
Durante os testes foram utilizados controles de meio de cultura, de micro-
organismo e solventes utilizados na solubilização das amostras, a fim de verificar
seu efeito sobre o micro-organismo. A concentração final de DMSO não excedeu
2,5%. A leitura dos resultados foi considerada válida somente quando houve
crescimento microbiano nos controles. Os ensaios foram realizados em triplicata.
76
4.2.7 Determinação da Concentração Microbicida Mínima: Bactericida Mínima
(CBM) e Fungicida Mínima (CFM)
Para determinar a concentração microbicida (bactericida ou fungicida) mínima
foram selecionadas as culturas que apresentaram inibição do desenvolvimento
bacteriano ou fúngico no ensaio da CIM, conforme ilustração da Figura 14b, sendo
realizadas suas respectivas subculturas em meio de cultura próprio para cada tipo
de micro-organismo (bactéria ou fungo) isento do componente supostamente
inibitório (óleo essencial ou fração do hidrolato) e novamente seguido de incubação
nas mesmas condições anteriormente relatadas para a determinação da CIM, e
posterior verificação da menor concentração que inibiu o crescimento do micro-
organismo em questão.
Para a interpretação dos resultados foi considerado que a inibição no ensaio
de CIM e crescimento de micro-organismo na subcultura (CBM ou CFM) significa
ação bacteriostática ou fungistática e a ausência do crescimento na subcultura
significa ação bactericida ou fungicida (BARON; FINEGOLD, 1990).
77
Figura 14: Representação do procedimento de determinação de atividade antimicrobiana pelo método de diluição em ágar: (a) concentração inibitória mínima; (b) concentração microbicida mínima.
78
4.3 Avaliação de Mutagenicidade
Para essa análise foi utilizada a linhagem haploide Saccharomyces cerevisiae
(XV-185-14C), como descrito por Medina et al. (2008), com algumas modificações.
4.3.1 Ativação e Preparação do Ínóculo da Levedura Saccharomyces cerevisiae
Os procedimentos realizado para ativação e preparação do inóculo da
levedura S. cerevisiae são ilustrados nas Figuras 15 e 16.
A ativação da levedura se deu a partir de dois repiques consecutivos em meio
YEPD solidificado (2% de dextrose, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura,
2% ágar) o qual foi incubado a 30°C durante 24 a 48 horas protegido da luz
(AUSUBEL et al., 1989).
Após o segundo repique (ativação) realizado conforme descrição acima, em
frasco de Erlenmeyer, protegido da luz, contendo 20mL de YEL (2% de dextrose, 2%
de bactopeptona, 1% de extrato de levedura) foi inoculado uma colônia
característica isolada da linhagem de Saccharomyces cerevisiae e incubado sob
agitação orbital (DIST), a 180 rpm e 30°C, durante 24 horas, para atingir a fase
estacionária.
Decorrido o período de incubação, coletou-se uma alíquota (100 µL) que foi
diluída 1:10 em solução salina fosfato tamponada (PBS - Na2HPO4 10 mM, KH2PO4
1,76 mM, KCl 2,7 mM e NaCl 137mM; pH 7,4), após homogeneização a solução
resultante foi novamente diluída 1:10 nas mesmas condições. Desta última diluição
foi coletada uma alíquota para contagem de células em câmara de Neubauer com
auxilio de microscópio óptico. Para a continuação do experimento foi utilizado como
critério contagem de 170 a 200 ou mais células, com 70% em processo de
germinação, garantindo que desta forma as culturas possuíam concentração de 1 a
2 x 108 células/mL.
79
Figura 15: Representação da ativação da levedura Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C) para ensaio de mutagenicidade.
Posteriormente à contagem de células, a cultura contida no Erlenmeyer foi
transferida para tubo Falcon e centrifugada a 5000 rpm por 5 minutos, sendo o
sobrenadante desprezado. A partir deste ponto realizou-se o processo de lavagem
do precipitado formado, que consistiu em adicionar PBS em quantidade suficiente
para suspender e homogeneizar o precipitado formado no tubo Falcon, submetendo-
o novamente ao processo de centrifugação nas mesmas condições. O processo de
lavagem foi repetido por mais uma vez para eliminar os aminoácidos histidina,
metionina e lisina presentes no caldo YEL.
Ao final do processo de lavagem, ao precipitado foi adicionada solução PBS
em quantidade estabelecida pela fórmula abaixo, para que obtivesse um inóculo
com concentração estimada de 1 x 108 células/mL.
80
TI = CCL x 106 x VTCL (mL)
109
Onde, TI significa o tamanho do inóculo em células por mililitro; CCL é o
número de células da cultura liquida em YEL; VTCL é o volume total da cultura
liquida em YEL.
Figura 16: Representação da preparação do inóculo de Saccharomyces cerevisiae para o ensaio mutagênico.
4.3.2 Análise Mutagênica
Para a realização da análise mutagênica, representada na Figura 17, foi
empregado o meio mínimo completo (SC) suplementado com todos os aminoácidos,
e os meios SC sem histidina (SC-his), SC sem lisina (SC-lis) e SC sem metionina
(SC-met), dos quais os respectivos aminoácidos foram omitidos, conforme descrito
por Ausubel e colaboradores (1989).
Inicialmente foi preparado uma série de diluições das amostras, obtendo para
os óleos essenciais as concentrações de 25000, 12500 e 6250 ppm em solução
aquosa de tween 80 1%, e para as frações diclorometano e acetato de etila as
concentrações de 1000, 500 e 250 ppm em solução PBS.
81
Como controle negativo foi utilizado a solução de PBS, e como controle
positivo foi utilizado a substância óxido de nitroquinoleína (4-NQO 5 µM) (Sigma).
Para cada amostra, foi preparada uma série de eppendorf (1,5 mL) que
incluía os controles e as diluições da amostra. A cada eppendorf foi adicionado 850
µL de solução PBS e 100 µL do inóculo recém-preparado, conforme item anterior,
atingindo um volume final equivalente a 1 mL. As células do inóculo foram tratadas
por 1 hora a 30 °C, sob agitação de 800 rpm.
Decorrido o período de tratamento determinou-se a sobrevivência do micro-
organismo através de semeadura em meio mínimo completo (SC). Para tanto, foram
realizadas três diluições decimais de cada amostra tratada, semeando uma alíquota
de 100 µL da última diluição com auxílio de alça de Drigalski, em placa contendo
meio mínimo completo (SC), correspondendo a concentração de 1 x 103 células/mL.
Para a detecção de mutação induzida (revertentes das marcas auxotróficas
his1-7, lis 1-1, hom3-10) procedeu a semeadura de 100 µL das amostras recém-
tratadas, sem diluição (concentração aproximada de 1 x 108 células/mL), com auxilio
da alça de Drigalski, nos meios mínimos seletivos (SC-his, SC-lis e SC-met).
Todas as placas foram incubadas a 30 °C, na ausência de luz, durante 5 dias
e posteriormente ao período de incubação foi realizado a contagem de unidades
formadoras de colônias (UFC).
82
Figura 17: Representação do procedimento para realização da análise mutagênica.
83
4.3.3 Análise Estatística
Os testes de citotoxicidade e mutagenicidade sobre a levedura S. cerevisiae
foram realizados em duplicata, e os resultados analisados estatisticamente utilizando
o Teste ANOVA-Tukey HSD (honestly significant difference), comparando as
estações do ano, bem como os tratamentos dos óleos essenciais e frações com o
controle negativo (PBS). Foi considerado estatisticamente significativo *p<0,05,
**p<0,001 e ***p<0,0001.
84
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Obtenção dos Óleos Essenciais
As duas espécies de Piper foram avaliadas em relação a porcentagem de
óleo extraído. Na Tabela 2 estão apresentados os rendimentos para as duas
espécies nas diferentes coletas realizadas ao final de cada estação. O maior
rendimento de óleo essencial foi nas coletas realizadas no final do outono, e o
menor rendimento nas coletas realizadas no final do inverno. Observou-se também,
rendimentos similares de óleos essenciais para P. amplum nas coletas realizadas no
final da primavera e do verão, e para P. cernuum foi verificado que inverno e
primavera apresentaram rendimentos semelhantes, assim como verão e outono.
Tabela 2: Rendimento dos óleos essenciais obtidos a partir das folhas de Piper amplum e Piper cernuum coletadas ao final de cada estação.
Estações do Ano / Plantas Rendimento
Piper amplum Massa óleo (g) (%)
Piper cernuum Massa óleo (g) (%)
Inverno 2012 1,644 (0,691) 3,067 (1,489) Primavera 2012 1,188 (0,996) 2,984 (1,663)
Verão 2012/2013 1,410 (0,902) 3,656 (2,073) Outono 2013 2,352 (1,175) 4,228 (2,159)
A sazonalidade influenciou no rendimento de óleo essencial para as duas
espécies, sendo que na estação de outono obtiveram-se os maiores rendimentos, e
os menores rendimentos foram obtidos no inverno. Indicando que condições
ambientais, como índice pluviométrico, intensidade das radiações solares e
especialmente baixas temperaturas, contribuem tanto para o rendimento quanto
para a síntese de metabólitos secundários (CERQUEIRA et al., 2009).
A redução dos rendimentos de óleos essenciais, principalmente no inverno,
pode ser explicada pelo acionamento do mecanismo natural que degrada
metabólitos secundários e direciona seus compostos químicos para a manutenção
do metabolismo primário (TAIZ; ZEIGER, 2004).
Óleos essenciais das folhas frescas de P. amplum coletadas em maio,
agosto, novembro de 2003 e janeiro, maio e novembro de 2004, obtidos por Angnes
(2005), por hidrodestilação com Clevenger, apresentaram rendimento variando de
0,06 a 0,12%. O mês de novembro, referente à primavera, apresentou o maior
85
rendimento, porém não superior aos rendimentos obtidos no presente estudo
(1,175%) onde a diferença foi a utilização de folhas secas. Isto sugere que além da
sazonalidade e localização geográfica, o processo de secagem do material vegetal
pode influenciar no rendimento do óleo essencial.
Com relação à P. cernuum, Torquilho et al. (2000) utilizaram folhas frescas
coletadas em outubro de 1995 (primavera), com rendimento de óleo essencial de
1,9%. Resultado diferente ao observado na mesma estação no presente estudo
(1,663%).
Mesquita et al. (2005), realizaram extração de óleo essencial de P. cernuum,
em anos distintos, a partir das folhas secas a temperatura ambiente, sem descrever
época ou mês de coleta. Das coletas realizadas no ano de 1999, obtiveram
rendimento de 1,7%, já as coletas referentes ao ano de 2001, o rendimento de óleo
reduziu para 0,6%. O rendimento de óleo da coleta de 1999 foi similar ao do
presente trabalho na estação de primavera (1,663%), porém no ano de 2001 o
rendimento foi inferior aos encontrados no presente trabalho para qualquer uma das
estações do ano (1,489 a 2,159%).
Em estudo realizado por Aguiar (2003), o óleo essencial de P. cernuum foi
obtido a partir de amostras coletadas no inverno e primavera de 1999, verão e
primavera de 2000 e duas coletas no verão de 2001. Para a extração do óleo
utilizou-se folhas frescas em todas as amostras, com exceção de uma amostra
coletada no inverno de 1999, que foi utilizado folhas secas. Os rendimentos dos
óleos essenciais obtidos a partir das folhas frescas variaram de 0,32 a 0,52%,
enquanto que o rendimento do óleo obtido a partir das folhas secas coletadas no
inverno apresentou um resultado de 1,67%, superior para a mesma estação do
presente estudo (1,489%).
Entre os procedimentos de controle de qualidade pós-colheita de plantas
medicinais, a secagem é um processo crucial à preparação adequada das drogas
vegetais, que objetiva levar as plantas a baixos teores de umidade. O teor de
umidade residual acima de 10% favorece o desenvolvimento de fungos e bactérias,
bem como possibilita a atividade hidrolítica de diversas enzimas presentes nas
células vegetais, levando à degradação dos princípios ativos (SIMÕES et al., 2010).
Desse modo, o processo de secagem permite a conservação das plantas,
mantendo sua qualidade física e química por mais tempo. No caso de plantas
produtoras de óleo essencial, a secagem deve ser criteriosa em razão da
86
volatilidade dos óleos essenciais. Por isso, a definição de metodologias de secagem
mais apropriadas para cada espécie é necessária, visando a assegurar os teores de
substâncias ativas (VON HERTWIG, 1991).
A localização dos óleos essenciais nas plantas varia de acordo com a família
botânica a qual pertence, podendo ocorrer em estruturas secretoras especializadas,
tais como pêlos ou tricomas glandulares (Lamiaceae), corpos oleíferos (Apiaceae),
bolsas lisígenas ou esquizolisígenas (Pinaceae, Rutaceae) ou células
parenquimáticas diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae e Poaceae), como é o caso
de P. amplum e P. cernuum (SIMÕES et al., 2010; LEWINSOHN et al.,1998), que
podem contribuir para a minimização da perda de substâncias voláteis durante o
processo de secagem.
Poucas são as informações encontradas na literatura científica relatando
estudo com P. amplum e P. cernuum, relacionando a época de colheita em função
da produção de princípios ativos, o que seria de grande importância uma vez que a
composição dos metabólitos secundários nas plantas ocorre durante o crescimento
em decorrência a fatores genéticos, ambientais e técnicas de cultivo, sendo a época
da coleta um dos fatores de maior importância, uma vez que a quantidade de
constituintes ativos não é constante durante o ano (BOTREL et al., 2010).
Além disso, as variações de rendimentos dos óleos essenciais observadas no
presente estudo são indicativos de que uma rede complexa de fatores e/ou
condições ambientais, tais como temperatura, umidade, duração e intensidade das
irradiações solares, índice pluviométrico, interação com polinizadores e predadores
contribuem tanto para o rendimento quanto para a síntese de metabólitos
secundários (CERQUEIRA et al., 2009).
5.2 Densidade dos Óleos Essenciais
Para cada óleo essencial de P. amplum e P. cernuum extraídos nas quatro
estações do ano, foi calculado a densidade absoluta (g/mL), que estão apresentados
na Tabela 3.
A média da densidade absoluta de P. amplum variou de 0,9397 a 0,9507
g/mL, e a densidade de P. cernuum variou de 0,9833 a 0,9957 g/mL. O coeficiente
de variação calculado demonstra um conjunto de dados homogêneos para este
estudo.
87
Tabela 3: Densidade absoluta dos óleos essenciais obtidos de Piper amplum e Piper cernuum.
Estações do Ano / Plantas
Piper amplum Piper cernuum
Densidade Absoluta g/mL (Valor Médio ± Desvio Médio)
Coeficiente de Variação (%)
Densidade Absoluta g/mL (Valor Médio ± Desvio Médio)
Coeficiente de Variação (%)
Inverno 2012 0,9397 ± 0,0009 0,096 0,9893 ± 0,0024 0,242 Primavera 2012 0,9507 ± 0,0009 0,095 0,9947 ± 0,0022 0,221
Verão 2012/2013 0,9400 ± 0,0007 0,074 0,9880 ± 0,0040 0,405 Outono 2013 0,9410 ± 0,0013 0,138 0,9833 ± 0,0016 0,163
Os valores de densidade obtidos foram maiores que os observados no estudo
realizado por Aguiar (2003), em que o óleo essencial de P. cernuum, obtido das
folhas frescas coletadas no verão, apresentou densidade média de 0,9539 g/mL.
A variação de densidade absoluta observada entre as amostras das duas
espécies de Piper, do presente estudo, bem como no estudo realizado por Aguiar
(2003), podem ter origem na variabilidade da sua composição, pelas condições
ambientais (SIMÕES et al., 2010). Sendo importante ressaltar que somente o estudo
realizado por Aguiar (2003) apresenta densidade absoluta de óleos essenciais de
acordo com a época de colheita, porém não trata-se de um estudo sobre influência
da sazonalidade em aspectos dos óleos essenciais.
A densidade de óleos essenciais, dentre outras análises físico-químicas,
como rotação ótica e índice de refração, são métodos simples e de baixo custo, com
extrema importância para detectar adulterações, que são muito comuns na
comercialização de óleos essenciais, como a adição de óleos inertes para aumento
de rendimento (SANTOS et al., 2009).
5.3 Obtenção das Frações Diclorometano e Acetato de Etila
A partir do hidrolato resultante das hidrodestilações realizadas para obtenção
dos óleos essenciais das duas espécies de Piper, procedeu-se a partição líquido-
líquido, com solventes em ordem crescente de polaridade, diclorometano e acetato
de etila. Os rendimentos resultantes após eliminação do solvente em evaporador
rotatório estão apresentados na Tabela 4.
O rendimento de resíduo seco em todas as amostras não ultrapassou a faixa
de 0,3%, sendo os maiores rendimentos para as frações diclorometano e acetato de
etila para P. amplum, as estações de primavera e outono, respectivamente, e para
88
P. cernuum, as estações de verão para a fração diclorometano, e primavera para a
fração acetato de etila. Os menores rendimentos de resíduo seco para as duas
frações para ambas as espécies de Piper se deu no inverno.
Os rendimentos das frações de acetato de etila, exceto para as estações
verão e outono para P. cernuum, foram superiores aos obtidos no fracionamento
com diclorometano. Este resultado era esperado uma vez que a extração foi
realizada com água e aquecimento e isto favorece a extração de substâncias mais
polares.
Tabela 4: Rendimento das frações dicloromentano e acetato de etila obtidos a partir dos hidrolatos oriundos da extração dos óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum.
Estações do Ano / Plantas Frações Rendimento (%)
Piper amplum Resíduo Seco
Piper cernuum Resíduo Seco
Inverno 2012 Diclorometano 0,034 0,052
Acetato de Etila 0,109 0,113
Primavera 2012 Diclorometano 0,114 0,207
Acetato de Etila 0,121 0,250
Verão 2012/2013 Diclorometano 0,055 0,263
Acetato de Etila 0,124 0,236
Outono 2013 Diclorometano 0,057 0,213
Acetato de Etila 0,146 0,196
5.4 Caracterização dos Óleos Essenciais
A análise química dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum nas
coletas feitas nas quatro estações foi realizada por CG-EM e CG-DIC. A
identificação dos compostos foi realizada por comparação dos seus espectros de
massas com os espectros da base de dados NIST (Mass Spectral Library) e pelo
valor dos índices de retenção (IR) calculados com base nos tempos de retenção de
uma série de alcanos lineares (C7 a C40 – SUPELCO). A quantificação se deu pela
área relativa dos picos cromatográficos.
Para as duas espécies de Piper, a análise por CG-DIC, foi menos sensível na
identificação de susbtâncias em pequenas concentrações nos óleos essencais,
quando comparada a análise por CG-EM.
De acordo com Henriques, Simões-Pires e Apel (2012) os óleos essenciais
brutos, por tratar-se de uma mistura de substâncias voláteis, podem ser analisados
diretamente por cromatografia a gás sem tratamento prévio, além de uma simples
89
diluição, permitindo análise semi-quantitativa, e qualitativa quando acoplado a
espectrometria de massas.
5.4.1 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de
Retenção – Piper amplum
Os óleos de Piper amplum obtidos nas coletas realizadas ao final das
diferentes estações do ano apresentaram perfis cromatográficos semelhantes. Na
Figura 18 podem ser visualizados os cromatogramas, onde se observa mudanças na
intensidade de alguns picos cromatográficos. Isto indica pequenas variações de
concentração dos constituintes dos óleos essenciais nas distintas estações do ano.
Figura 18: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano.
Quarenta e três substâncias foram determinadas e identificadas por CG/EM e
índice de retenção, representando 92,58% no inverno, 91,54% na primavera, 92,71
% no verão e 93,93% no outono. Na Tabela 5 estão apresentadas as substâncias
encontradas no óleo e as suas porcentagens nas coletas realizadas.
90
Tabela 5: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano.
Classe Terpênica / Constituinte Químico IRCalc. Estrutura
Química
Piper amplum
Inverno Primavera Verão Outono
Pico T.R. (min) % Pico T.R.
(min) % Pico T.R. (min) % Pico T.R.
(min) %
Hidrocarbonetos monoterpenos
α-pineno 934
1 4.052 10,29 1 4.062 11,01 2 4.058 14,86 1 4.059 12,02
Canfeno 948
2 4.249 0,13 2 4.256 0,15 3 4.253 0,17 2 4.256 0,11
β-pineno 975
3 4.650 0,23 3 4.657 0,26 4 4.655 0,27 3 4.657 0,30
β-mirceno 984
4 4.765 0,28 4 4.771 0,35 5 4.770 0,34 4 4.773 0,32
α-felandreno 1002
5 5.052 0,98 5 5.059 1,26 6 5.058 1,14 5 5.060 1,18
δ-3-careno 1015
6 5.198 0,04 6 5.204 0,04 7 5.203 0,06 6 5.206 0,08
p-cimene -
7 5.309 0,98 7 5.317 0,95 8 5.316 0,86 8 5.318 0,52
Limoneno 1023
8 5.491 5,73 8 5.500 5,10 9 5.498 6,45 9 5.499 5,11
β-ocimeno -
9 5.759 0,11 9 5.768 0,05 11 5.767 0,12 10 5.769 0,12
91
ɣ-terpineno -
10 6.016 0,04 10 6.022 0,04 12 6.021 0,05 11 6.023 0,06
(+)-4-careno -
x x x 11 6.636 0,05 13 6.638 0,05 x x x
(4E,6Z)-2,6-Dimetil-2,4,6-octatrieno -
11 7.459 0,15 13 7.467 0,06 14 7.468 0,14 x x x
Monoterpenos oxigenados
4-Carvomenthenol -
12 8.475 0,07 15 8.480 0,09 15 8.483 0,06 x x x
α-terpineol 1180
13 8.715 0,06 16 8.721 0,08 16 8.725 0,06 x x x
Mirtenol -
14 8.865 0,17 17 8.872 0,28 17 8.873 0,05 x x x
Piperitone -
16 10.021 0,10 19 10.024 0,11 18 10.026 0,13 x x x
Acetato Mirtenol -
18 11.990 0,32 21 11.995 0,69 19 11.995 0,23 12 11.998 0,36
Hidrocarbonetos sesquiterpenos
Elixeno -
20 12.700 1,99 23 12.709 2,62 21 12.709 1,46 14 12.709 2,46
92
α-cubebeno 1344
21 13.057 0,25 24 13.063 0,28 22 13.062 0,45 15 13.065 0,18
(+)-Cicloisosativeno -
22 13.523 0,31 25 13.528 0,22 23 13.530 0,33 16 13.532 0,23
Ylangeno -
23 13.611 0,09 26 13.618 0,07 24 13.617 0,13 17 13.625 0,06
α-copaeno 1370
24 13.734 7,85 27 13.745 6,35 25 13.736 5,98 18 13.738 6,25
β-elemeno 1383
25 14.025 0,95 28 14.030 0,61 28 14.031 1,51 19 14.034 1,13
β-cariofileno 1411
27 14.768 20,36 32 14.788 17,49 32 14.763 15,50 20 14.773 20,58
β-cubebeno -
28 14.965 0,90 33 14.971 0,72 33 14.970 1,15 21 14.972 0,63
α-guaieno 1442
30 15.192 7,04 35 15.200 7,01 35 15.197 8,03 23 15.200 6,6
α-cariofileno 1450
33 15.533 2,58 38 15.539 2,48 38 15.536 2,08 26 15.540 2,58
Sativeno -
34 15.709 0,33 40 15.712 0,29 39 15.717 0,38 27 15.720 0,28
ɣ-muuroleno 1476
36 16.033 2,42 43 16.042 1,83 40 16.041 3,06 29 16.045 1,92
93
Germacreno D 1483
37 16.156 5,53 44 16.165 4,44 41 16.165 8,04 30 16.168 8,61
β-selineno 1487
38 16.285 1,71 45 16.293 1,61 42 16.292 1,65 31 16.295 1,54
Germacreno B 1555
40 16.523 3,18 47 16.534 3,85 44 16.527 3,09 33 16.533 5,07
δ-guaieno -
42 16.739 1,78 49 16.749 2,13 46 16.744 2,39 35 16.746 1,71
Calameneno -
44 16.963 0,15 51 16.969 0,15 49 16.968 0,13 37 16.970 0,08
δ-cadineno -
45 17.090 2,84 52 17.100 2,64 50 17.097 3,26 38 17.098 2,67
4-Isopropil-1,6-dimethil-1,2,3,4,4a,7-
hexahidronaftaleno -
46 17.307 0,32 53 17.314 0,32 51 17.315 0,27 39 17.316 0,25
α-muuroleno -
48 17.450 0,12 55 17.450 0,11 53 17.450 0,20 41 17.452 0,11
Sesquiterpenos oxigenados
Ent-espatulenol 1571
52 18.193 1,04 59 18.206 2,21 55 18.197 0,40 45 18.204 0,19
94
Óxido de Cariofileno -
53 18.339 1,66 60 18.347 1,17 56 18.341 0,47 46 18.344 0,73
Globulol -
54 18.433 2,99 61 18.440 3,81 57 18.436 1,86 47 18.439 2,96
2-(4a,8-Dimethil-2,3,4,4a,5,6,7,8-octahidro-2-
naphthalenil)-2-propanol -
x x x 65 18.810 0,13 x x x x x x
Cadin-4-en-7-ol 1637
66 19.908 6,34 74 19.928 8,06 68 19.909 5,72 58 19.914 6,77
α-bisobolol 1688
69 20.609 0,17 78 20.613 0,37 69 20.619 0,13 60 20.618 0,16
Identificados (%) 92,58 91,54 92,71 93,93 Hidrocarbonetos monoterpenos (%) 18,96 19,32 24,51 19,82
Monoterpenos oxigenados (%) 0,72 1,25 0,53 0,36 Hidrocarbonetos sesquiterpenos (%) 60,70 55,22 59,09 62,94
Sesquiterpenos oxigenados (%) 12,20 15,75 8,58 10,81
95
Os picos com tempo de retenção entre 4,00 e 7,50 minutos correspondem a
18,96 a 24,51% do total e são os hidrocarbonetos monoterpenos. Os picos com
tempo de retenção entre 8,40 a 12,0 minutos correspondem aos monoterpenos
oxigenados, representando de 0,36 a 1,25% do total das substâncias identificadas.
Os picos com tempo de retenção entre 12,70 a 17,50 minutos são constituídos por
estruturas da classe dos hidrocarbonetos sesquiterpenos e correspondem a 55,22 a
62,94%. Por fim os sesquiterpenos oxigenados são encontrados entre 17,90 a 20,70
minutos e representam de 8,58 a 15,75%.
Diante disso, aparentemente a sazonalidade influencia quantitativamente nas
classes das substâncias identificadas, ou seja, em todas as estações notou-se
variação na concentração total de hidrocarbonetos monoterpenos, monoterpenos
oxigenados, hidrocarbonetos sesquiterpenos e sesquiterpenos oxigenados, com
predominância de sesquiterpenos em relação aos monoterpenos, e de
hidrocarbonetos em relação aos oxigenados. Destaca-se em especial a estação de
verão, que apresentou menor concentração de sesquiterpenos e maior concentração
de monoterpenos, em comparação as demais estações.
Comparando as diferentes estações do ano, percebe-se que no outono e no
verão houve maior concentração de substâncias nos óleos de P. amplum,
demonstrando que as variações de temperatura exercem influência no
desenvolvimento do vegetal, afetando, portanto a produção de metabólitos
secundários, que em geral, nos óleos essenciais, parece aumentar em temperaturas
mais elevadas, apesar de dias muito quentes levarem a uma perda excessiva destes
metabólitos (EVANS, 1996).
A estação de verão (2012/2013) foi acometida por um período intenso e curto
de chuva, sendo que o estresse hídrico ou o efeito da seca frequentemente tem
consequências significantes nas concentrações de metabólitos secundários em
plantas, dependendo do grau de estresse e do período em que ocorre. Os seus
efeitos em curto prazo podem levar a um aumento da concentração dos metabolitos
secundários, enquanto que em longo prazo o efeito é oposto (HAAG, 1987,
ORTOLANI; CAMARGO, 1987).
Ainda é notório que intensidade de luz e radiação ultravioleta são fatores que
também influenciam a concentração e/ou composição de metabólitos secundários,
especialmente nos óleos essenciais que são fotossensíveis (GLOBBO-NETO;
96
LOPES, 2007), no entanto as amostras do presente estudo foram coletadas de um
único espécime vegetal que encontrava-se parcialmente inserido na mata.
Das amostras de P. amplum coletadas por Angnes (2005), três perfis
cromatográficos foram identificados, referentes às coletas em maio de 2003, janeiro
e novembro de 2004, relatando maior concentração de constituintes voláteis na
primavera, devido à atração de polinizadores, e no verão, pelos mecanismos de
defesa contra a perda de água. Diferentemente nesse estudo, o maior rendimento
de substâncias voláteis foi no outono (93,93%), seguido pelo verão (92,71%),
inverno (92,58%) e primavera (91,54%).
Angnes (2005) ainda analisou o óleo essencial das folhas frescas de P.
amplum, coletadas em novembro de 2004 (primavera) por CG/EM e índice de
retenção, caracterizando 19 constituintes (90%). Do total de substâncias
identificadas, 21,4% eram monoterpenos e 68,8% sesquiterpenos, corroborando
com o presente estudo onde também observou-se predomínio dessa classe
terpênica.
Santos et al., (2001), analisaram o óleo essencial das folhas frescas de P.
amplum, coletadas no outono, por CG/EM e índice de retenção, identificando 17
substâncias (57,4%), sendo 22,5% monoterpenos e 34,9% sesquiterpenos,
porcentagem inferior de identificação de substâncias quando comparadas ao
presente estudo em todas as estações, sendo o outono, a estação com maior teor
de substâncias voláteis identificadas (93,93%).
O presente estudo se destaca devido à 43 substâncias identificadas, quando
em comparação com Santos et al. (2001) e Angnes (2005), com 17 e 19 substâncias
respectivamente. No entanto a porcentagem de monoterpenos e sesquiterpenos se
assemelham no presente estudo em comparação com Angnes (2005), porém se
diferem em relação a Santos et al. (2001), que apresenta uma porcentagem próxima
entre essas duas classes terpênicas. Para melhor visualização, estas informações
estão apresentadas na Figura 19.
97
Figura 19: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001).
98
Na Figura 20, estão apresentadas as substâncias majoritárias presentes nos
óleos de P. amplum, com seus respectivos rendimentos. Destacando o β-cariofileno
(15,5 a 20,58%), α-pineno (10,29 a 14,86%), cadin-4-en-7-ol (5,72 a 8,06%), α-
guaieno (6,6 a 8,0%), α-copaeno (5,98 a 7,85%), germacreno D (4,44 a 8,61%),
Limoneno (5,10 a 6,45%) e germacreno B (3,09 a 5,07%) (Tabela 5). Desses, α-
pineno e Limoneno são monoterpenos, cadin-4-en-7-ol sesquiterpeno oxigenado e
os demais sesquiterpenos.
A sazonalidade também influencia quantitativamente a composição dos óleos
essenciais, sendo que das 8 substâncias majoritárias, β-cariofileno, germacreno D e
germacreno B (37,5%) apresentaram maior teor no outono; α-pineno, α-guaieno e
Limoneno (37,5%) apresentaram maior teor no verão; cadin-4-en-7-ol (12,5%) maior
teor na primavera; e α-copaeno (12,5%) maior teor no inverno.
Na pesquisa realizada a partir dos óleos essenciais das folhas frescas de P.
amplum, Santos et al. (2001) destacaram como substâncias majoritárias, o α-pineno
(16,78%), β-cariofileno (9,82%), E-nerolidol (8,3%), germacreno D (5,28%) e
limoneno (3,5%). E Angnes (2005) relatou como substâncias majoritárias β-
cariofileno (24,4%), valenceno (16,4%), α-pineno (12,9%), α-cadinol (8,5%), α-
copaeno (4,2%), e limoneno (3,8%).
Na Figura 21 está apresentada uma análise comparativa das substâncias
majoritárias e suas concentrações em comparação à Santos et al. (2001) e Angnes
(2005).
99
Figura 20: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper amplum em relação a sazonalidade.
100
Figura 21: Análise comparativa dos compostos majoritários comuns presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001).
101
Em comum ao presente estudo, Santos et al. (2001) e Angnes (2005) também
destacam dentre as substâncias majoritárias α-pineno e Limoneno, Santos et al.
(2001) relata ainda a presença de Germacreno D, e Angnes (2005) α-copaeno.
Santos et al. (2001), destaca concentrações de 16,78% para α-pineno, 5,28%
para germacreno D e 3,5% para Limoneno, para as amostras coletadas no outono,
sendo que no presente estudo para a mesma estação destaca-se maior
concentração para Limoneno (5,11%) e Germacreno D (8,61%).
Angnes (2005) apresenta concentrações de 12,9% para α-pineno, 3,8% para
Limoneno e 4,2% para α-copaeno, para as amostras coletadas na primavera, sendo
que no presente estudo para a mesma estação observou-se maior concentração
para Limoneno (5,1%) e α-copaeno (6,35%).
De fato, os metabólitos secundários representam uma interface química entre
as plantas e o ambiente. Os estímulos decorrentes do ambiente, no qual a planta se
encontra, podem redirecionar a rota metabólica, ocasionando a biossíntese de
diferentes compostos e/ou variação na concentração destes (SIMÕES et al., 2010).
Muitos fatores podem estar envolvidos na biossíntese de metabólitos
secundários, dentre estes fatores, podem-se ressaltar as interações planta/micro-
organismos, planta/insetos e planta/planta; idade e estádio de desenvolvimento;
fatores como luminosidade, temperatura, pluviosidade, nutrição, época e horário de
coleta, bem como técnicas de colheita e pós – colheita. É válido ressaltar que estes
fatores podem apresentar correlações entre si, não atuando isoladamente, podendo
exercer influência conjunta no metabolismo secundário (CUNHA, 2011).
Contudo, o ideal é que, juntamente com os ensaios para verificação da
atividade biológica, seja realizada a análise química dos óleos essenciais a fim de
determinar as melhores condições de colheita favorecendo a obtenção de matérias
primas vegetais de melhor qualidade, o que possibilitará a obtenção de óleos
essenciais com composição química mais constante, acarretando resultados de
atividades biológicas mais confiáveis (MORAIS, 2009).
5.4.2 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de
Retenção – Piper cernuum
Os óleos de Piper cernuum obtidos nas coletas realizadas no final das
diferentes estações do ano apresentaram perfis cromatográficos similares. Na Figura
102
22 podem ser visualizados os cromatogramas, onde observa-se diferenças na
intensidade de alguns picos cromatográficos, sugerindo pequenas variações de
concentração para alguns constituintes dos óleos essenciais nas distintas estações,
como foi também observado para P. amplum.
Figura 22: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.
Vinte e sete substâncias foram determinadas e identificadas por CG/EM e
índice de retenção, representando 93,80% no inverno, 93,19% na primavera,
98,44% no verão e 92,89% no outono (Tabela 6).
103
Tabela 6: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano.
Classe Terpênica / Constituinte Químico IRCalc. Estrutura
Química
Piper cernuum
Inverno Primavera Verão Outono
Pico T.R. (min) % Pico T.R.
(min) % Pico T.R. (min) % Pico T.R.
(min) %
Hidrocarbonetos monoterpenos
α-pineno 933
1 4.047 5,43 1 4.040 2,63 1 4.050 4,10 1 4.047 4,88
Canfeno 947
2 4.246 4,55 2 4.239 2,16 2 4.249 3,22 2 4.245 3,00
β-pineno 974
3 4.646 1,52 3 4.639 0,73 3 4.649 1,10 3 4.646 1,27
β-mirceno 984
4 4.760 0,27 4 4.755 0,12 4 4.763 0,21 4 4.761 0,19
Limoneno 1023
5 5.485 0,57 5 5.481 0,27 5 5.487 0,41 5 5.486 0,36
Monoterpenos oxigenados
Metil Geranate -
6 11.892 1,22 6 11.893 0,58 8 11.897 0,81 6 11.897 0,60
Hidrocarbonetos sesquiterpenos
Elixeno -
7 12.689 0,82 7 12.689 0,79 10 12.697 0,80 7 12.694 0,75
α-copaeno 1370
9 13.711 0,92 8 13.710 0,48 12 13.717 0,73 8 13.714 0,54
104
β-bourboneno -
10 13.901 0,09 x x x 13 13.906 0,05 9 13.900 0,06
β-elemeno 1383
11 14.009 0,46 9 14.010 0,27 14 14.014 0,34 10 14.015 0,33
β-cariofileno 1410
13 14.736 8,69 10 14.730 6,18 16 14.746 6,28 12 14.735 5,94
ɣ-elemeno -
15 14.993 0,25 12 14.993 0,20 18 15.000 0,21 14 14.999 0,19
α-bergamoteno -
16 15.115 0,19 13 15.116 0,11 19 15.121 0,15 15 15.118 0,14
(-)-aristoleno -
17 15.233 0,14 14 15.231 0,06 20 15.234 0,11 16 15.234 0,10
α-cariofileno 1468
20 15.511 1,05 15 15.512 0,73 23 15.514 0,90 18 15.514 0,78
Germacreno D -
23 16.141 2,89 18 16.139 2,05 27 16.152 2,00 21 16.143 1,99
β-cadideno -
25 16.381 1,89 19 16.373 1,48 29 16.409 1,53 23 16.381 1,55
Sesquiterpenos oxigenados
4-epi-cis-dihidroagarofurano
1488
27 16.544 12,61 21 16.537 12,29 30 16.581 11,23 24 16.544 13,37
105
Trans-dihidroagarofurano 1488
28 16.642 32,68 22 16.630 36,40 31 16.679 36,68 25 16.642 30,03
Elemol 1546
35 17.523 5,89 27 17.524 7,84 37 17.547 7,66 30 17.534 9,15
(+/-)-trans-nerolidol 1559
36 17.876 0,43 28 17.876 0,44 38 17.882 0,46 31 17.881 0,47
Guaiol 1598
40 18.688 0,92 32 18.691 0,95 44 18.702 1,57 35 18.695 1,46
2-(4a,8-Dimethyl-2,3,4,4a,5,6,7,8-
octahydro-2-naphthalenyl)-2-propanol
-
42 18.914 0,32 34 18.916 0,46 47 18.927 0,58 37 18.920 0,60
ɣ-eudesmol 1629
44 19.214 8,29 36 19.216 12,93 49 19.251 13,29 39 19.225 11,99
β-eudesmol 1644
50 19.798 0,98 42 19.800 1,68 54 19.816 2,21 45 19.802 1,81
α-eudesmol -
52 19.917 0,66 44 19.914 1,24 56 19.931 1,68 47 19.919 1,19
Bulnesol -
54 20.194 0,07 46 20.197 0,12 58 20.201 0,13 49 20.200 0,15
106
Identificados (%) 93,80 93,19 98,44 92,89 Hidrocarbonetos monoterpenos (%) 12,34 5,91 9,04 9,70 Monoterpenos oxigenados (%) 1,22 0,58 0,81 0,60 Hidrocarbonetos sesquiterpenos (%) 17,39 12,35 13,10 12,37 Sesquiterpenos oxigenados (%) 62,85 74,35 75,49 70,22
107
Os picos com tempo de retenção entre 4,00 e 5,50 minutos correspondem a
5,91 a 12,34% do total e são os hidrocarbonetos monoterpenos. O pico com tempo
de retenção entre 11.891 e 11.898, corresponde a monoterpeno oxigenado com
concentração de 0,58 a 1,22%. Os picos com tempo de retenção entre 12,6 a 16,4
minutos são constituídos por estruturas da classe dos hidrocarbonetos
sesquiterpenos e correspondem a 12,35 a 17,39% do total. Por fim os
sesquiterpenos oxigenados são encontrados entre 17,5 a 20,3 minutos e
representam de 62,85 a 75,49%.
Assim como para P. amplum, a sazonalidade também influenciou
quantitativamente nas classes das substâncias identificadas, ou seja, em todas as
estações notou-se variação na concentração total de hidrocarbonetos
monoterpenos, monoterpenos oxigenados, hidrocarbonetos sesquiterpenos e
sesquiterpenos oxigenados, com predominância de sesquiterpenos em relação aos
monoterpenos, e de hidrocarbonetos monoterpenos em relação aos monoterpenos
oxigenados.
Mas diferentemente de P. amplum, nos óleos de P. cernuum coletados ao
final de cada estação do ano, houve predominância de sesquiterpenos oxigenados
em relação aos hidrocarbonetos sesquiterpenos.
Comparando o teor de substâncias voláteis presentes nos óleos de P.
cernuum nas diferentes estações do ano, nota-se que a estação de verão
apresentou maior concentração destas substâncias. Esta estação caracteriza-se, de
modo geral, com o aumento de temperatura e luminosidade, dias mais longos, bem
como maior radiação UV e IV.
Diante disso, elevações de temperatura, na maioria das vezes, apresentam
aumento no teor de metabólitos secundários, porém, em dias muito quentes, pode-
se observar perda excessiva dos mesmos. A intensidade luminosa também interfere
na concentração e na composição dos óleos essenciais, devido ao desenvolvimento
de estruturas (tricomas glandulares) que biossintetisam e armazenam o óleo
essencial (MORAIS, 2009).
A radiação solar, raios UV e IV, pode elevar a produção substâncias devido
ao fato de que as reações biossintéticas são dependentes de suprimentos de
esqueletos carbônicos, realizados por processos fotossintéticos e de compostos
energéticos que participam da regulação dessas reações (TAIZ; ZEIGER, 2004).
108
A estação de verão (2012/2013) referente ao presente estudo foi acometida
por um período intenso e curto de chuva. O excesso de água apresenta correlação
direta na concentração de metabólitos secundários, havendo relatos na literatura de
que o estresse hídrico geralmente induz um aumento na produtividade de alguns
terpenoides (HAAG, 1987; ORTOLANI; CAMARGO, 1987).
Na Figura 23, tem-se uma análise comparativa da concentração de
hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, nas
diferentes estações, com outros autores.
A partir das análises dos óleos essenciais as folhas de P. cernuum por
CG/EM e índice de retenção, Costantin et al. (2001) identificaram 36 substâncias
(98,91%), sendo 27,5% monoterpenos e 71,4% sesquiterpenos, Mesquita et al.
(2005) identificaram 32 substâncias (89,1 e 83,4%), sendo que na coleta referente
ao ano de 1999, 7,2% eram monoterpenos e 81,9% sesquiterpenos, na coleta
realizada no ano de 2001, 10,8% eram monoterpenos e 72,6% sesquiterpenos, e
Assis et al. (2013), identificou 16 substâncias (94,4%) todas sesquiterpenos.
Em comparação com o presente estudo, Costantin et al. (2001) apresentaram
maior quantidade e porcentagem de identificação de substâncias voláteis presentes
no óleo essencial. No estudo realizado por Mesquita et al. (2005) foram identificadas
mais substâncias que o presente estudo, porém com menor porcentagem para as
duas coletas realizadas em 1999 e 2000. Ainda, Assis et al. (2013) identificaram
menos substâncias porém com porcentagem superior as estações de inverno,
primavera e outono do presente estudo.
A concentração de sesquiterpenos para o presente estudo bem como para
Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013), foi superior aos
monoterpenos, sendo que para esse último Costantin et al. (2001) relata
concentração superior aos demais, e Assis et al. (2013) destacaram a ausência
dessa classe terpênica.
Somente Costantin et al. (2001) relataram o mês de coleta de material
vegetal, referindo-se a estação de outono, que ao comparar com os resultados deste
trabalho na mesma estação, nota-se concentração maior de sesquiterpenos e menor
concentração de monoterpenos, indicando que mesmo tratando-se da mesma
espécie e com coleta realizada na mesma estação do ano, pode ocorrer
variabilidade na composição química dos óleos essenciais, também pelo localização
geográfica onde a planta está inserida.
109
Figura 23: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013).
110
Para P. cernuum no presente estudo, como substâncias majoritárias, foram
encontradas trans-dihidroagarofurano (30,03 a 36,68%), 4-epi-cis-dihidroagarofurano
(11,23 a 13,37%), γ-eudesmol (7,64 a 11,65%), β-cariofileno (5,94 a 8,69%), elemol
(5,89 a 9,15%), α-pineno (2,63 a 5,43%) e canfeno (2,16 a 4,55%) (Tabela 6).
Desses α-pineno e canfeno são monoterpenos, β-cariofileno é sesquiterpenos, trans-
dihidroagarofurano, 4-epi-cis-dihidroagarofurano, elemol e γ-eudesmol são
sesquiterpenos oxigenados.
Como está apresentado na Figura 24, a sazonalidade também influencia
quantitativamente a composição dos óleos essenciais, sendo que das 7 substâncias
majoritárias identificadas, α-pineno, canfeno e β-cariofileno apresentam maior teor
no inverno, γ-eudesmol maior concentração na primavera, trans-dihidroagarofurano
maior teor no verão, 4-epi-cis-dihidroagarofurano e elemol maior teor no outono.
Na pesquisa realizada com os óleos essenciais de P. cernuum, Torquilho et
al. (2000) apresentaram como substancias majoritárias o cis-dihidroagarofurano
(32,3%), α-pineno (10,2%), β-pineno (7,4%), 10-epi-ɣ-eudesmol (7,1%) e β-elemol
(6,7%). Costantin et al. (2001) relataram a presença de biciclogermacreno (21,88%),
β-cariofileno (20,69%), α-pineno (7,16%), germacreno D (6,68%) e β-pineno
(6,15%). Mesquisa et al. (2005) identificaram como majoriatários o trans-
dihidroagarofurano (22,4%), 10-Epi-γ-eudesmol (16,8%), germacreno D (9,0%),
elemol (7,2%), α-pineno (4,1%) e β-eudesmol (4,1%). E Assis et al. (2013)
destacaram o epi-cubebol (13,1%), β-elemeno (11,6%), espatulenol (9,6%),
valeranone (9,1%), β-cariofileno (8,3%), cis-β-guaieno (8,2%), óxido de cariofileno
(7,7%) e ɣ-muuroleno (7,6%).
Na Figura 25 está apresentada uma análise comparativa das substâncias
majoritárias e suas concentrações em comparação aos estudos realizados por
Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001), Mesquisa et al. (2005) e Assis et al.
(2013).
111
Figura 24: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum em relação a sazonalidade.
112
Figura 25: Análise comparativa dos compostos majoritários comuns presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001), Mesquisa et al. (2005) e Assis et al. (2013).
113
Dentre as substâncias majoritárias, α-pineno é comum para o presente
estudo, e também para Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001) e Mesquita et
al. (2005), sendo que esses autores apresentaram maior concentração para essa
substância, exceto as estações de inverno e outono do presente estudo em
comparação com Mesquita et al. (2005).
Costantin et al. (2001) e Assis et al. (2013) apresentaram em comum com o
presente estudo o β-cariofileno, sendo somente a estação de inverno com teor
superior ao resultado encontrado por Assis et al. (2013).
Ainda, em comum com os resultados apresentados por Mesquita et al. (2005)
tem-se o trans-dihidroagarofurano e o elemol, sendo o primeiro com maior teor em
todas as estações, e o segundo com concentração superior na primavera, verão e
outono do presente estudo.
Assim como foi observado para P. amplum, a natureza dos metabólitos
secundários, assim como a teor das substâncias majoritárias, variou também para os
óleos de P. cernuum em comparação a outras pesquisas. Desta forma, as
justificativas quanto aos metabólitos secundários e suas variações descritas nos
resultados apresentados para P. amplum, se aplicam da mesma forma para P.
cernuum.
5.4.3 Espectroscopia no Infravermelho - IV
Os óleos essenciais também foram analisados por infravermelho (IV), sendo
que os espectros resultantes das análises apresentam um rico agregado de bandas
de absorção, fornecendo informações estruturais sobre as substâncias presentes
nos óleos essenciais (FELICIANO et al., 2012).
Nas Figuras 26 e 27 estão apresentados os espectros de IV dos óleos das
duas espécies de Piper obtidos das coletas realizadas no final das diferentes
estações do ano.
A composição dos óleos essenciais tanto de P. amplum quanto de P.
cernuum é constituída principalmente por mono e sesquiterpenos, e destes os
sesquiterpenos se destacam. Idependente das estruturas, todos os compostos,
mono e sesquiterpenos, apresentaram bandas de absorção características de
estiramentos de ligações CH alifáticos entre 2850 a 2980 cm-1 e deformação destas
ligações entre 1500 a 1300 cm-1. Acima de 3000 cm-1 estão os estiramentos de
114
ligações CH olefínicos, estas são de fraca intensidade. Para estas ligações são
observados bandas de deformação próximo a 900 cm-1. Assim como os
estiramentos de C=C estão em aproximadamente 1600 cm-1.
As duas espécies de Piper apresentam sesquiterpenos oxigenados (Piper
amplum entre 8,58 a 15,75% e Piper cernumm entre 62,85 a 75,49%), dos quais,
exceto o óxido de cariofileno, possuem a função álcool. Os estiramentos das
ligações OH estão entre 3500 a 3300 cm-1 e C-O entre 1300 a 1100 cm-1. Estas
bandas de absorção são geralmente mais intensas, porém nos espectros dos óleos
estas se apresentam de fraca intensidade, pois estão em baixa proporção em
relação às demais ligações.
É importante ressaltar que essa técnica apresentou limitações, uma vez que
há diferenças no teor das substâncias presentes nos óleos essenciais nas diferentes
estações do ano para as duas espécies de Piper, o que não é observados nos
espectros de IV.
A análise de P. amplum por espectroscopia no infravermelho realizada por
Angnes (2005), é semelhante ao presente estudo.
115
Figura 26: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano.
Legenda: a) inverno; b) primavera; c) verão; d) outono.
116
Figura 27: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.
Legenda: a) inverno; b) primavera; c) verão; d) outono.
117
No espectro de IV a região abaixo de 1500 cm-1 é conhecida como região de
impressão digital, onde são encontradas bandas de absorção específicas das
substâncias. Sendo essa geralmente utilizada no controle de qualidade para
confirmação de estruturas.
Avaliando a região entre 1500 e 700 cm-1 nos espectros dos óleos das duas
espécies percebe-se que o óleo da P. cernuum apresenta maior aglomerado de
bandas, ficando evidente a diferença na composição química dos óleos das duas
espécies, além de que o óleo de P. cernuum sugere a presença de substâncias mais
elaboradas sob o ponto de vista químico devido a maior quantidade de bandas
nessa região.
As principais fraudes e/ou problemas relacionados aos produtos naturais são,
a substituição de determinada espécie por outra semelhante, e adulteração de parte
ou do todo da planta por outra espécie. Sendo este um problema persistente uma
vez que as plantas são entidades muito complexas, podendo possuir centenas de
metabólitos secundários (VILEGAS; CARDOSO; QUEVEDO, 2012).
Desta forma, observando as diferenças espectrais dos óleos das duas
espécies de Piper do presente estudo, a análise por espectroscopia no IV, pode ser
útil no controle de qualidade para verificação da autenticidade da espécie em
questão, tendo em vista que trata-se de uma metodologia de fácil análise e maior
acessabilidade.
5.4.4 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear - RMN
A ressonância magnética nuclear (RMN) vem sendo utilizada nos últimos
anos no controle de qualidade de espécies vegetais. Na ressonância magnética
nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) obtem-se informações dos esqueletos de
hidrogênio presentes nas estruturas. Já na ressonância magnética nuclear de
carbono-13 (RMN de 13C) são encontrados os carbonos presentes. Os espectros
possuem regiões que são características de determinados tipos de carbonos e seus
hidrogênios, que são utilizados para a identificação das substâncias.
Os óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum obtidos nas coletas das
distintas estações foram avaliados por RMN 1H, resultando em espectros idênticos
entre si para as duas espéceis de Piper. Diante dessa semelhança, optou-se em
118
somente analisar um óleo, de qualquer estação, para cada espécie de Piper por
RMN 13C.
Os espectros de RMN 1H podem ser visualizados nas Figuras 28 e 29. Para
cada uma das espécies os espectros de RMN 1H foram idênticos para os óleos das
quatro coletas representativas das diferentes estações do ano, porém os espectros
das duas espécies apresentam diferenças que as distinguem uma da outra.
A natureza terpênica pode ser visualizada na região de 0,6 a 2,5 ppm, região
esta característica de hidrogênios alifáticos. Assim como a região de 4,0 a 6,0 ppm
são encontrados os hidrogênios ligados a carbonos oxigenados e hidrogênios
olefínicos, respectivamente.
Os espectros de carbono (Figuras 30 e 31) são mais facilmente avaliados do
que os espectros de RMN 1H, pois eles podem fornecem para cada carbono um
sinal. Desta forma, são visualizados nos espectros vários sinais entre 15 e 55 ppm,
nesta região são encontrados os carbonos alifáticos, já entre 105 a 155 ppm estão
os carbonos olefínicos, entre 70 e 100 ppm estão os carbonos oxigenados e nesta
região fica evidenciada a diferença na composição química dos óleos avaliados.
119
Figura 28: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano.
120
Figura 29: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.
121
Figura 30: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper amplum obtido na primavera.
122
Figura 31: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper cernuum obtido no inverno.
123
Inicialmente houve dificuldade para a identificação das duas substâncias
majoritárias presentes nos óleos de P. cernuum, uma vez que elas não se
encontravam na biblioteca NIST (Mass Spectral Library) disponível no laboratório.
Estudos com essa mesma espécie, apresentaram como majoritários
isômeros dihidriagarofurano (MESQUITA, et al. 2005). Diante disso, a RMN 13C foi
utilizada para a correta identificação destas duas substâncias. Com a análise dos
espectros e comparação com Cavalli et al. (2004), foi possível identificar as duas
substâncias majoritárias, trans-dihidroagarofurano e 4-epi-cis-dihidroagarodurano.
Além das duas substâncias majoritárias, foi também possível identificar os sinais
relativos às outras substâncias majoritárias conforme apresentados na Tabela 7
(FERREIRA et al., 2001; MAATOOQ, 2002).
Diante disso, a RMN 13C, pode ser útil na identificação de substâncias
majoritárias presentes em misturas complexas. E, assim como análise por IV,
também pode ser uma ferramenta no controle de qualidade de óleos essenciais, a
fim de evitar adulterações e ou problemas com a legitimidade da espécie vegetal.
124
Tabela 7: Valores de deslocamentos químicos de RMN 13C para as substâncias majoritárias presentes no óleo essencial de P. cernuum [δ v (ppm), CDCl3]. Carbonos α-pineno Canfeno β-cariofileno 4-epi-cis-dihydroagarofurano Trans-dihydroagarofurano Elemol ɣ-eudesmol
1 47.03 42.21 53.56 37.19 37.41 39.69 40.35
2 144.51 47.03 39.86 17.74 16.88 39.86 19.51
3 116.01 24.79 30.05 30.52 29.36 22.58 33.11
4 31.27 28.86 48.08 43.07 40.35 49.32 124.31
5 41.14 46.90 154.90 86.99 87.82 28.47 134.99
6 38.11 98.99 40.35 42.21 38.50 52.68 26.35
7 31.45 35.03 29.46 43.40 44.54 147.88 49.32
8 26.35 25.37 124.31 25.78 24.95 112.04 23.30
9 20.79 25.37 134.99 37.96 37.99 24.79 42.21
10 22.98 - 34.78 39.69 38.50 72.72 34.42
11 - 28.35 81.58 80.96 20.79 72.72
12 - 30.05 31.27 30.52 27.13 27.13
13 - 22.58 23.30 23.54 27.13 26.95
14 - 111.64 25.20 22.84 147.88 24.79
15 - 16.29 16.88 17.74 111.64 19.51
125
5.5 Bioautografia
A bioautografia é um método de rastreio para a detecção de atividade
biológica, sendo simples, de baixo custo, relativamente rápido e sem a necessidade
de equipamentos sofisticados. Além disso, permite o biodirecionamento para o
isolamento de substâncias ativas (CHOMA; GRZELAK, 2011).
O teste da bioautografia foi realizado utilizando Staphylococcus aureus (ATCC
25923), pois nos ensaios preliminares esta bactéria apresentou sensibilidade aos
componentes das espécies de Piper, resultando em ensaio importante para indicar
as substâncias que apresentavam atividade antibacteriana.
Ainda para o ensaio de bioautografia, inicialmente também foi empregado
outro micro-organismo sensível, o Microsporum gypseum (C115), no entanto o
crescimento deste fungo não foi homogêneo em toda a superfície do meio de
cultura, inviabilizando a leitura dos resultados e por este motivo o micro-organismo
em questão não foi empregado na bioautografia.
Para melhor análise dos resultados da bioautografia, tanto para os óleos
essenciais quanto para as frações diclorometano e acetato de etila para as duas
espécies de Piper, preparou-se placas de CCDs idênticas sendo que uma foi
revelada com anisaldeído sulfúrico e aquecimento, e luz UV 365 nm, e com outra
realizou-se a bioautografia.
Como pode ser observado nos resultados de bioautografia, Figura 32a, a área
clara com Rf de 0,29 em destaque se refere à inibição do crescimento bacteriano
(halo de inibição), provocada por uma substância ou mistura de substâncias com
efeito antibacteriano. Esta atividade foi observada nas amostras em todas as
estações nas duas espécies de Piper, sendo que no inverno observou-se halos de
inibição menos intensos, provavelmente pela baixa concentração de amostra nos
pontos 1 e 2.
Na figura 32b está apresentada a placa que foi eluida com fase móvel
composta por hexano: acetato de etila (95:5) e revelada com uma solução de
anisaldeido sulfúrico. Os óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, em todas as
estações, apresentam mono e sesquiterpenos na composição, consequentemente
as manchas com valores de Rf maiores são referentes aos compostos mais
apolares, que são os monoterpenos. As manchas com menores valores de Rf, como
o caso das bandas referentes aos halos de inibição, com Rf variando de 0,28 a 0,30,
126
podem ser de sesquiterpenos. As duas espécies apresentam vários sesquiterpenos
na sua composição, por isso não se pode afirmar quais são as substâncias que
podem ter contribuido para a formação do halo de inibição.
Figura 32: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum.
(a) CCD submetida à bioautografia frente a S. aureus; (1) óleo essencial de P. amplum no inverno; (2) óleo essencial de P. cernuum no inverno; (3) óleo essencial de P. amplum na primavera; (4) óleo essencial de P. cernuum na primavera; (5) óleo essencial de P. amplum no verão; (6) óleo essencial de P. cernuum no verão; (7) óleo essencial de P. amplum no outono; (8) óleo essencial de P. cernuum no outono; (b) CCD eluida em fase móvel composta por hexano: acetato de etila (95:5) e revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento.
Na revelação das placas de CCDs para as frações de dicloromentano e
acetato de etila, referente às estações de inverno, primavera e outono, não foi
possível observar nenhum halo de inibição de crescimento microbiano, sugerindo
que o sistema de solventes utilizados para a eluição das CCDs, hexano: acetato de
etila (60:40), não foi adequado para rastreamento de compostos com atividade
antimicrobiana, uma vez que no ensaio de diluição em ágar foi possível observar
pequena atividade antimicrobiana frente a S. aureus.
Como pode ser observado nos resultados da bioautografia, Figura 33a, a área
clara com Rf de 0,34 e 0,54 em destaque se refere à inibição do crescimento
bacteriano (halo de inibição), provocada, provavelmente, por uma substância ou
mistura de substâncias de média polaridade com atividade antibacteriana. Esta
atividade foi observada para a fração dicloromentano de P. cernuum no verão.
127
Na figura 33b está apresentada a placa que foi eluida com fase móvel
composta por hexano: acetato de etila (60:40), com revelação com anisaldeído
sulfúrico e aquecimento.
Figura 33: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum e Piper cernuum nas estações de verão e outono.
(a) CCD submetida à bioautografia frente a S. aureus; (1) fração diclorometano de P. amplum no outono; (2) fração diclorometano de P. amplum no verão; (3) fração diclorometano de P. cernuum no verão; (4) fração diclorometano de P. cernuum no outono. (b) CCD eluida em fase móvel composta por hexano: acetato de etila (60:40), com revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento; (1) fração diclorometano de P. amplum no verão; (2) fração diclorometano de P. amplum no outono; (3) fração diclorometano de P. cernuum no verão; (4) fração diclorometano de P. cernuum no outono.
A bioautografia consiste na separação preliminar de substâncias de acordo
com sua polaridade, assim sendo esses compostos, previamente separados, podem
apresentar a atividade antibacteriana mais evidenciada, quando comparados com
misturas complexas, que podem não destacar a possível atividade antimicrobiana de
alguns compostos presentes em concentrações relativamente baixa, ou a inatividade
devido a possível interação entre as substâncias presentes nessas misturas.
5.6 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
A sensibilidade dos micro-organismos aos antimicrobianos é representada
pela concentração inibitória mínima (CIM), que corresponde à menor concentração
do antimicrobiano capaz de inibir o desenvolvimento visível do micro-organismo.
128
Assim sendo esse método é o mais adequado para a avaliação da susceptibilidade
do micro-organismo ao antimicrobiano testado, uma vez que a partir deste pode
ainda estabelecer a concentração microcida mínina (CMM), que corresponde à
menor concentração do antimicrobiano capaz de destruir o micro-organismo
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer organismo
responsável por um processo infeccioso que exija terapia antimicrobiana, quando é
impossível predizer a sensibilidade desse organismo, mesmo conhecendo a sua
identificação. Os testes de sensibilidade são indicados, com maior frequência,
quando se acredita que o organismo causador pertence a uma espécie capaz de
apresentar resistência aos agentes antimicrobianos normalmente usados
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos óleos puros
(25000 a 48 ppm) e das frações diclorometano e acetato de etila diluídas em
dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração inicial de 40 µg/µL (1000 a 2 ppm), frente
aos micro-organismos estudados, foi realizada pelo método de diluição em ágar.
Sequencialmente ao estabelecimento da CIM, determinou-se a concentração
bactericida mínima (CBM) e a concentração fungicida mínima (CFM). A partir desses
ensaios pode-se avaliar o potencial citotóxico das amostras testadas, tendo em vista
a capacidade dos mesmos em inviabilizar o metabolismo microbiano.
Infelizmente não existe um consenso sobre o nível de inibição aceitável para
produtos naturiais, dessa forma alguns autores comparam a atividade antimicrobiana
de produtos naturais com antibióticos sintéticos padrões, considerando como boa
atividade antimicrobiana aquele produto que apresentar resultado similar ou com
níveis de inibição superior ao antibiótico utilizado como padrão (KALEMBA;
KUNINCKA, 2003). Desta forma, não é simples estabelecer um critério para
avaliação da atividade antimicrobiana, pois depende da finalidade do que está em
análise.
No presente trabalho, para os resultados dos testes da atividade
antimicrobiana foi considerada a revisão de Kalemba e Kunincka (2003), que relatam
não haver relação entre os antibióticos utilizados como padrões na avaliação
antimicrobiana e os compostos de plantas.
129
Desta forma, optou-se em comparar a atividade antimicrobiana de outros
óleos essenciais sobre os mesmos micro-organismos utilizados no presente estudo,
submetidos a análises com os óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum.
5.6.1 Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essencias de Piper amplum e Piper
cernuum
Os óleos de P. amplum demonstraram atividade contra bactérias Gram
positivas, B. subtilis e S. pyogenes. Enquanto que os óleos essenciais de P.
cernuum além desses dois micro-organismos, também apresentaram atividade
contra S. aureus, conforme demonstrado na Tabela 8 e 9.
130
Tabela 8: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações (n=3).
Óleos Essenciais
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Bactérias Gram Positivas Bactérias Gram Negativas
S. aureus S. pyogenes B. subtilis E. coli
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inverno 2012 6250 / 12500 780 / 12500 6250 / 12500 > 25000 / NR Primavera 2012 12500 / 25000 780 / 780 1560 / 3120 > 25000 / NR
Verão 2012/2013 12500 / 25000 780 / 3120 3120 / 6250 > 25000 / NR Outono 2013 6250 / 25000 1560 / 6250 195 / 6250 > 25000 / NR
Staphylococcus aureus (S. aureus); Streptococcus pyogenes (S. pyogenes); Bacillus subtilis (B. subtilis); Escherichia coli (E. coli); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
Tabela 9: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações (n=3).
Óleos Essenciais
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Bactérias Gram Positivas Bactérias Gram Negativas
S. aureus S. pyogenes B. subtilis E. coli
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inverno 2012 780 / 3120 780 / 780 390 / 390 > 25000 / NR Primavera 2012 1560 / 12500 780 / 1560 390 / 780 > 25000 / NR
Verão 2012/2013 780 / 25000 780 / 780 48 / 48 > 25000 / NR Outono 2013 780 / 780 780 / 3120 48 / 48 > 25000 / NR
Staphylococcus aureus (S. aureus); Streptococcus pyogenes (S. pyogenes); Bacillus subtilis (B. subtilis); Escherichia coli (E. coli); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
131
Como está demonstrado na Figura 34, os óleos essenciais de P. cernuum,
especialmente nas estações de inverno, verão e outono, apresentaram melhor
atividade contra S. aureus, quando comparados aos óleos de P. amplum do
presente estudo, bem como em relação aos resultados apresentados por Costantin
et al. (2001) que avaliou a atividade antibacteriana dos óleos essenciais de P.
cernuum e P. regnelli, Santos et al. (2012) que analisou o óleo essencial de P.
malacophyllum, e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006) que avaliaram
diversas plantas aromáticas.
Os resultados encontrados para atividade antimicrobiana pelo método de
diluição em ágar foram confrontados com os resultados da bioautografia para os
óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum frente a S. aureus. Assim sendo,
observa-se que a possível atividade contra essa bactéria Gram positiva visualizada
no ensaio de bioautografia, em todas as estações, para ambas as espécies de Piper,
pode ser confirmada na análise de diluição em ágar, uma vez que todas as amostras
de P. amplum e P. cernuum demonstraram atividade antibacteriana frente a esse
micro-organismo (CIM 780 a 12500 ppm).
132
Figura 34: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. aureus dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Santos et al. (2012) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006).
133
Como é apresentado na Figura 35, os óleos de P. amplum nas estações de
inverno, primavera e verão, e os óleos de P. cernuum em todas as estações
apresentaram melhor atividade antibacteriana contra para S. pyogenes, em
comparação ao cinnamon, substância considerada ativa por Kalemba e Kunincka
(2003), contra esse micro-organismo.
Figura 35: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. pyogenes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003).
Os resultados de atividade antibacteriana contra B. subtilis encontrados no
presente estudo, destacados na Figura 36, demonstram que os óleos de P. cernuum
no verão e outono, bem como o óleo de P. amplum no outono são promissores em
relação a outros estudos realizados com plantas aromáticas e/ou substâncias
presentes em óleos essenciais descritos por Kalemba e Kunincka (2003) e
Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006).
134
Figura 36: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra B. subtilis dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006).
135
Os óleos de P. amplum e P. cernuum apresentaram bons resultados contra os
dermatófitos, bem como atividade antifúngica contra C. neoformans. Os resultados
estão apresentados nas tabelas 10 e 11. Nas Figuras 37, 38, 39, 40 e 41 estão
apresentados os resultados da atividade antifúngica, dos óleos essenciais das duas
espécies de Piper do presente estudo. A atividade antifúngica dos óleos foi mais
promissora que os óleos de outras duas espécies de Piper analisadas por Santos et
al. (2012) e Santos (2009).
Os óleos essenciais das duas espécies de Piper se comportaram de maneira
distinta frente a cada micro-organismo, e nas diferentes estações do ano. Contra M.
gypseum a estação de verão, primavera e inverno para P. cernuum, e a estação de
primavera para P. amplum apresentaram os melhores resultados. Para a atividade
antifúngica contra T. mentagrophytes destaca-se as estações de inverno, verão e
outono para P. cernuum, e a estação de verão para P. amplum. Os resultados
antifúngicos contra T. rubrum, demonstram maior efetividade para os óleos de P.
cernuum na primavera, verão e outono, além da estação de outono para P. amplum.
Contra E. flocosum, observa-se melhor atividade antifúngica na primavera verão e
outono para P. cernuum, e a estação de outono para P. amplum. Por fim, os
resultados obtidos contra C. neoformans, demonstram que os óleos essenciais de P.
cernuum, em todas as estações, são promissores na atividade antifúngica frente a
esse micro-organismo.
136
Tabela 10: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).
Óleos Essenciais
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Filamentosos Leveduras
Dermatófitos Oportunistas
M. can M. gyp T. men T. rub E. flo A. fum Rhi sp C. alb C.neo
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inverno 2012 > 25000 / NR 1560 / 1560 97 / 97 780 / 12500 48 / 97 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 780 / 12500
Primavera 2012 > 25000 / NR 195 / 195 97 / 12500 195 / 25000 195 / 780 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 780 / 6250
Verão 2012/2013 > 25000 / NR 780 / 3120 48 / 48 390 / 12500 97 / 390 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 1560 / 12500
Outono 2013 > 25000 / NR 780 / 1560 195 / 3120 97 / 6250 48 / 195 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 780 / 25000 Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
Tabela 11: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).
Óleos Essenciais
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Filamentosos Leveduras
Dermatófitos Oportunistas
M. can M. gyp T. men T. rub E. flo A. fum Rhi sp C. alb C.neo
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inverno 2012 > 25000 / NR 195 / 195 48 / 48 195 / 6250 195 / 390 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 48
Primavera 2012 > 25000 / NR 97 / 97 97 / 195 48 / 6250 48 / 195 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 48
Verão 2012/2013 > 25000 / NR 48 / 6250 48 / 48 48 / 780 48 / 390 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 97
Outono 2013 > 25000 / NR 390 / 3120 48 / 195 48 / 780 48 / 97 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 48 Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
137
Figura 37: Análise comparativa da atividade antifúngica contra M. gypseum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).
Figura 38: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. mentagrophytes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012).
138
Figura 39: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. rubrum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).
Figura 40: Análise comparativa da atividade antifúngica contra E. flocosum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).
139
Figura 41: Análise comparativa da atividade antifúngica contra C. neoformans dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).
Os resultados de atividade antifúngica dos óleos essenciais de P. amplum e
P. cernuum do presente estudo são também promissores quando comparados a
óleos essenciais obtidos de outras plantas aromáticas, cujos autores classificaram a
atividade antifúngica promissora, como o óleo de Cinnamomum suvabenium (CIM de
470 a 2520 ppm) (KALEMBA; KUNINCKA, 2003) e Melaleuca alternifolia (CIM de 80
a 600 ppm) (HAMMER; CARSON; RILEY, 2002).
Alguns estudos sobre avaliação da composição química do óleo essencial de
outras espécies de Piper, bem como a avaliação de sua atividade antifúngica foram
realizados, no entanto os autores destacam a necessidade de novas análises.
Navickiene et al. (2006) avaliaram a atividade antifúngica dos óleos
essenciais das folhas de três espécies de Piper, obtidos por hidrodestilação com
utilização de Clevenger, bem como a composição química desses óleos por CG-EM.
Para P. aduncum, os autores relatam como compostos majoritários, linalol (31,7%),
biciclogermacreno (11,2%), nerolidol (10,4%) e β-cariofileno (9,1%), para P.
arboreum biciclogermacreno (49,5%) e β-cariofileno (25,1%), e para P. tuberculatum
β-cariofileno (40,2%), β pineno (12,5%), α pineno (10,4%), trans-ocimeno (8,6%) e β
farneseno (8,3%). Para avaliação da atividade antifúngica frente ao Cladosporium
140
cladosporioides e C. sphaerospermum, os autores utilizaram a técnica de
bioautografia, não observando atividade antifúngica promissora.
Vieira et al. (2011) realizaram extração do óleo essencial das folhas frescas
de P. diospyrifolium por hidrodestilação utilizando o aparato Clevenger. E analisaram
esse óleo por CG-MS e índice de Kovats, observando como compostos majoritários
o (E)-eudesma-6,11-diene (21,12%), β-cariofileno (16,76%), ɣ muuroleno (10,57%),
limoneno (8,47%), e germacreno B (6,2%). Para a atividade antifúngica utilizaram o
método de disco difusão frente a C. albicans (12,3 mm), C. parapsilosis (15 mm) e C.
tropicalis (9,3 mm), relatando atividade antifúngica interessante para o óleo na
concentração de 20000 ppm.
Mesmo observando a influência da sazonalidade na atividade antimicrobiana
e na composição quantitativa das substâncias presentes nos óleos essenciais, das
duas espécies de Piper, obtidos a partir das coletas nas quatro estações, não foi
possível estabelecer uma correlação direta, entre o aumento da concentração de
substâncias com a melhora da atividade antimicrobiana. Isto sugere que a atividade
antimicrobiana possa estar relacionada ao conjunto de substâncias presentes nos
óleos e não necessariamente a uma, ou a um conjunto de substâncias majoritárias,
uma vez que substâncias presentes em menor concentração podem contribuir com a
ação farmacológica, possivelmente pelo sinergismo entre os compostos
(HENRIQUES et al., 2012).
Contudo, conhecendo as substâncias majoritárias presentes nos óleos de P.
amplum e P. cernuum, alguns autores relatam a atividade antimicrobiana dessas
substâncias, de forma isolada ou como majoritária em óleos de diversas plantas
aromáticas.
Os sesquiterpenos agarofuranos são considerados importantes indicadores
quimiotaxonômicos (BRÜNING; WAGNER, 1978). Membros deste grupo tem atraído
interesse devido a sua ampla gama de atividades biológicas (XIA et al., 2002), tais
como citotóxica, inseticida (NÚÑEZ, et al. 2004; WHITSON, et al. 2006),
imunossupressora (DUAN, et al. 2001), anti-HIV (HORIUCH et al. 2006), antitumoral
(GONZÁLEZ, et al. 2000) e quimioprotetora (PERESTELO et al. 2010). Ainda,
estudos relataram que ésteres de dihidroagarofurano têm sido referidos como
eficazes no combate de micro-organismos resistentes, devido à capacidade de
reverter mecanismos de resistência bacteriana, como no caso da bomba de efluxo
(LEE; FLOREANCIG, 2004).
141
Autores destacam que -ariofileno, germacreno D e germacreno B são
substâncias majoritárias em diversos óleos essenciais que possuem atividade
antimicrobiana frente a diferentes micro-organismos (JUTEAU et al., 2002;
GONZAGA et al., 2003; IACOBELLIS et al., 2005; CHAVAN; SHINDE; NIRMAL,
2006).
Derivados de β-cariofileno, usados como conservante de alimentos,
medicamentos e cosméticos, têm sido estudados, a partir de testes in vitro, como
antifúngico para tratamento de dermatofitóses, sendo comparados com
medicamentos como ciclopirox olamina e sulconazol (YANG et al., 1999; SCHMIDT
et al., 2010). No presente estudo, tem-se dentre as substâncias majoritárias, o β-
cariofileno, com maior concentração no outono (20,58%) para P. amplum e no
inverno (8,7%) para P. cernuum, o que pode justificar a forte atividade antifúngica
frente à maioria de dermatófitos analisados. Porém não é possível correlacionar a
melhoria da atividade antimicrobiana às estações de outono para P. amplum e
inverno para P. cernuum, devido a maior concentração de β-cariofileno.
Bakkali et al. (2008), relata que Limoneno tem capacidade citotóxica frente a
S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae, na concentração de 600 a
5000 ppm. E Henriques, Simões-Pires e Apel (2012), descreveram que o limoneno
possui um grupamento alílico que influencia o efeito inibidor, especialmente contra
bactérias Gram negativas.
Nos óleos essenciais das duas espécies de Piper foi evidenciada a presença
de Limoneno, sendo que em P. amplum a concentração encontrada foi de 5,11 a
6,45%, e para P. cernuum de 0,27 a 0,57%. Substância que pode ter contribuído
para a atividade antimicrobiana observada, no entanto sem atividade evidenciada
contra E. coli.
Costantin et al. (2001) na avaliação de atividade antimicrobiana do óleo de P.
cernuum pelo método de difusão em ágar, utilizaram como padrão o eugenol na
concentração de 50000 ppm. E concluíram que essa substância é muito ativa para
S. aureus (23,6 mm) e C. albicans (29,3 mm). Na presente pesquisa a CIM dos óleos
essenciais frente a S. aureus, tanto para P. amplum (CIM de 6250 a 12500 ppm)
quanto para P. cernuum (CIM de 780 a 1560 ppm), foram menores que a
concentração de eugenol utilizada por Costantin et al. (2001), demonstrando que as
duas espécies de Piper são promissoras quanto sua atividade antimicrobiana.
142
No presente trabalho, dentre as substâncias majoritárias, tem-se o α-pineno
tanto no óleo essencial de P. amplum (10,29 a 14,86%), quanto no óleo de P.
cernuum (2,63 a 5,43%). De acordo com Burt (2004) α-pineno é uma substância
importante encontrada em óleos essenciais com atividade antibacteriana.
A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais pode variar de acordo com
sua a composição química, e esta por sua vez está susceptível a fatores como a
sazonalidade, apontada como um dos fatores de maior importância, visto que a
quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza das substâncias ativas não é
constante durante o ano (GLOBBO-NETO; LOPES, 2007). As estações do ano se
caracterizam, de modo geral, pelas variações de temperatura, índice pluviométrico,
intensidade de luz e radiação ultravioleta.
É importante ressaltar que o óleo essencial de uma planta pode conter
constituintes majoritários, porém substâncias presentes em menor concentração
podem contribuir com a ação farmacológica, possivelmente pelo sinergismo entre os
compostos (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).
5.6.2 Atividade Antimicrobiana das Frações Diclorometano e Acetato de Etila
de Piper amplum e Piper cernuum
Os resultados da atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato
de etila de P. amplum e P. cernuum obtidos a partir dos hidrolatos referentes às
coletas das quatro estações do ano estão apresentados nas Tabelas 12 e 13.
Comparando a atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato
de etila das duas espécies de Piper, como é demonstrado nas Figuras 42, as
frações diclorometano de P. amplum foram mais efetivas contra S. aureus e B.
subtilis, quando em comparação com as frações de P. cernuum. E, sem atividade
promissora contra S. pyogenes para as frações diclorometano e acetato de etila de
P. amplum e P. cernuum.
Muller (2011) avaliou a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos das
partes aéreas de P. amplum, P. cernuum e P. aduncum. A P. cernuum foi inativa
frente a todos os micro-organismos testados, incluindo, S. aureus, S. pyogenes, B.
subtilis (Gram positivas) e ainda E. coli (Gram negativas), na concentração máxima
testada de 1000 ppm. Já a P. amplum apresentou atividade contra B. subtilis (CIM
250 ppm), S. aureus (CIM 1000 ppm), e inatividade frente a S. pyogenes (Gram
143
positivas) e E. coli (Gram negativas). P aduncum também apresentou atividade
antimicrobiana frente a S. pyogenes (CIM 250 ppm), B. subtilis (CIM 62,5 ppm) e S.
aureus (CIM 31,25 ppm).
Zaidan et al. (2005) realizaram experimento avaliando a atividade
antimicrobiana de extratos metanólicos das folhas secas de P. sarmentosum, na
concentração de 2000 µg/disco, relatando atividade frente a S. aureus (halo de
inibição de 9 mm).
Diante disso, em comparação a Muller (2011) e Zaidan et al. (2005) que
realizaram procedimentos extrativos diretamente das partes aéreas, o presente
estudo optou pelo fracionamento do hidrolato, resultante das extrações dos óleos
essenciais com solventes em ordem crescente de polaridade, para a pesquisa de
atividade antimicrobiana. Sendo que esse produto também pode ser considerado
alvo de pesquisa para substâncias bioativas termorresistentes, em virtude da
atividade antimicrobiana apresentada.
O dado comum em todos os estudos, incluindo o presente, é a inatividade das
amostras testadas frente às bactérias Gram negativas, nas concentrações máximas
testadas. A literatura relata que bactérias Gram negativas são mais resistentes aos
antimicrobianos, devido a sua membrana externa (HANAMANTHAGOUDA et al.,
2010).
A atividade antibacteriana observada a partir dos halos de inibição de
crescimento microbiano encontrados na bioautografia frente a S. aureus, para as
frações diclorometando no verão e outono e fração acetato de etila no verão para P.
amplum, bem como para a fração acetato de etila no verão para P. cernuum, foi
também evidenciada no teste de diluição em ágar, demonstrando que a
bioautografia pode contribuir na busca de substâncias bioativas.
144
Tabela 12: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações (n=3).
Frações
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Bactérias Gram Positivas Bactérias Gram Negativas
S. aureus S. pyogenes B. subtilis E. coli
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inve
rno
2012
Diclorometano 250 / 1000 1000 / > 1000 250 / 250 > 1000 / NR
Acetato de Etila 1000 / > 1000 > 1000 / NR 500 / 1000 > 1000 / NR
Prim
aver
a 20
12 Diclorometano 125 / 500 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR
Acetato de Etila > 1000 / NR > 1000 / NR > 1000 / NR > 1000 / NR
Ver
ão
2012
/201
3 Diclorometano 250 / 1000 1000 / > 1000 250 / 250 > 1000 / NR
Acetato de Etila 500 / 1000 > 1000 / NR 500 / 500 > 1000 / NR
Out
ono
2013
Diclorometano 250 / 500 1000 / 1000 250 / 250 > 1000 / NR
Acetato de Etila > 1000 / NR > 1000 / NR 1000 / 1000 > 1000 / NR
Staphylococcus aureus (S. aureus); Streptococcus pyogenes (S. pyogenes); Bacillus subtilis (B. subtilis); Escherichia coli (E. coli); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
145
Tabela 13: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações (n=3).
Frações
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Bactérias Gram Positivas Bactérias Gram Negativas
S. aureus S. pyogenes B. subtilis E. coli
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inve
rno
2012
Diclorometano 1000 / > 1000 1000 / > 1000 1000 / > 1000 > 1000 / NR
Acetato de Etila 500 / > 1000 > 1000 / NR > 1000 / NR > 1000 / NR
Prim
aver
a 20
12 Diclorometano 500 / > 1000 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR
Acetato de Etila 1000 / > 1000 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR
Ver
ão
2012
/201
3 Diclorometano 1000 / > 1000 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR
Acetato de Etila 500 / > 1000 > 1000 / NR 1000 / 1000 > 1000 / NR
Out
ono
2013
Diclorometano > 1000 / NR > 1000 / NR 1000 / > 1000 > 1000 / NR
Acetato de Etila 1000 / > 1000 > 1000 / NR 1000 / > 1000 > 1000 / NR
Staphylococcus aureus (S. aureus); Streptococcus pyogenes (S. pyogenes); Bacillus subtilis (B. subtilis); Escherichia coli (E. coli); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
146
Figura 42: Análise comparativa da atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.
147
Os resultados da atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de
etila de P. amplum e P. cernuum obtidos a partir dos hidrolatos referentes às coletas
das quatro estações do ano (Tabelas 14 e 15), demonstram que as frações são
promissoras para os dermatófitos, bem como contra C. neoformans. As frações
diclorometano de P. amplum e P. cernuum, bem como a fração de acetato de etila
de P. cernuum, nesta ordem, foram as mais efetivas na atividade antifúngica, como
é demonstrado na Figura 43.
Neste estudo observou-se também a inatividade das frações diclorometano e
acetato de etila das duas espécies de Piper contra C. albicans na concentração
máxima testada de 1000 ppm, assim como observado por Muller (2011), para os
extratos etanólicos de P. amplum e P. cernuum frente a C. albicans, C. krusei, C.
parapsilosis e S. cerevisiae.
Foi possível observar diferenças nos resultados da atividade antimicrobiana
em relação às estações do ano, assim como para os óleos essenciais, o que pode
estar relacionado às variações químicas dos extratos analisados, atribuídas a
aspectos edáficos e climáticos que alteram a produção das substâncias ativas nas
plantas (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Contudo, não foi possível estabelecer uma correlação direta entre a
sazonalidade, substâncias majoritárias e atividade antimicrobiana. Uma vez que, não
foi realizada avaliação da composição química das frações diclorometano e acetato
de etila para as duas espécies de Piper, por tratar-se de uma análise experimental
para utilização do hidrolato em pesquisa de substâncias bioativas.
148
Tabela 14: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).
Frações
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Filamentosos Leveduras
Dermatófitos Oportunistas
M. can M. gyp T. men T. rub E. flo A. fum Rhi sp C. alb C.neo
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inve
rno
2012
Diclorometano >1000 / NR 125 / >1000 62,5 / 125 62,5 / 62,5 62,5 / 250 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 125 / 125
Acetato de Etila 1000 / >1000 250 / >1000 250 / 500 125 / 250 62,5 / 125 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 1000 / >1000
Prim
aver
a 20
12 Diclorometano 250 / >1000 125 / 125 62,5 / 250 62,5 / 62,5 62,5 / 250 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 250 / 500
Acetato de Etila >1000 / NR 1000 / 1000 1000 / >1000 250 / 250 500 / >1000 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR
Ver
ão
2012
/201
3 Diclorometano 1000 / >1000 125 / 500 125 / 1000 62,5 / 125 62,5 / 125 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 250 / 1000
Acetato de Etila >1000 / NR 500 / >1000 500 / 500 250 / 500 62,5 / 1000 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR
Out
ono
2013
Diclorometano 500 / >1000 125 / 125 62,5 / 62,5 62,5 / 62,5 62,5 / 250 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 125 / 125
Acetato de Etila >1000 / NR 250 / 250 500 / >1000 500 / 500 250 / 500 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR
Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
149
Tabela 15: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).
Frações
Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)
Filamentosos Leveduras
Dermatófitos Oportunistas
M. can M. gyp T. men T. rub E. flo A. fum Rhi sp C. alb C.neo
CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM
Inve
rno
2012
Diclorometano >1000 / NR 250 / >1000 125 / 500 250 / 500 250 / 1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR
Acetato de Etila >1000 / NR 500 / >1000 250 / >1000 250 / >1000 250 / >1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR
Prim
aver
a 20
12 Diclorometano >1000 / NR 125 / 125 125 / 125 125 / 500 125 / 250 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 125 / 125
Acetato de Etila >1000 / NR 250 / 250 125 / 125 125 / 500 125 / >1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 1000 / >1000
Ver
ão
2012
/201
3 Diclorometano >1000 / NR 125 / 1000 125 / 125 62,5 / 1000 125 / 500 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 500 / 1000
Acetato de Etila >1000 / NR 250 / 1000 125 / 125 125 / >1000 62,5 / 500 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR
Out
ono
2013
Diclorometano >1000 / NR 250 / 250 125 / >1000 62,5 / 1000 125 / 1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR
Acetato de Etila >1000 / NR 500 / 500 250 / >1000 125 / >1000 125 / >1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 1000 / >1000
Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).
150
Figura 43: Análise comparativa da atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.
151
5.7 Avaliação de Mutagenicidade Frente ao Saccharomyces cerevisiae
Mutações reversas consistem na restauração ou compensação de um defeito
gênico responsável por um requerimento nutricional. A linhagem haploide de
Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C) trata-se de um micro-organismo
geneticamente modificado para auxotrofia, ou seja, com necessidade de fatores de
crescimento, neste caso aminoácidos histidina, lisina e metionina (PARRY; PARRY,
1984; GASPARRI, 2005).
Para analisar a mutagenicidade, dos óleos essenciais e frações diclorometano
e acetato de etila obtidas da partição dos hidrolatos de P. amplum e P. cernuum nas
quatro estações, foi utilizado o teste de mutação reversa frente à linhagem haploide
acima citada. Foi avaliado a capacidade das amostras causarem mutação reversa
nesse micro-organismo tornando-o prototrófico, isto é, sem a necessidade de fatores
de crescimento. Esse ensaio também possibilita avaliar a citotoxicidade das
amostras.
Os resultados da avaliação da sobrevivência (citotoxicidade) para os óleos
essenciais de P. amplum, apresentados na Tabela 16, mostram que os tratamentos
não influenciam a viabilidade celular, porém as estações de inverno e verão
apresentaram diferença estatística significante quando comparadas com o controle
negativo (PBS), sugerindo que a sazonalidade pode influenciar no potencial
citotóxico.
Para os óleos de P. cernuum percebe-se o contrário, as estações do ano não
influenciaram a viabilidade celular, mas o tratamento de 25000 ppm apresentou
diferença estatística significante quando comparadas com o controle negativo (PBS),
sugerindo que o aumento de concentração pode potencializar a citotoxidade (Tabela
17).
Para as frações dicloromentano de P. amplum a sazonalidade não influenciou
a viabilidade celular, mas o tratamento de 1000 ppm apresentou diferença estatística
significante quando comparadas com o controle negativo (PBS), sugerindo que o
aumento da concentração pode reduzir a viabilidade celular (Tabela 18). Porém para
as frações acetato de etila de P. amplum tanto as estações de verão e primavera,
quanto os tratamentos de 1000 e 500 ppm, apresentaram diferença estatística
significante quando comparadas com o controle negativo (PBS), sugerindo que a
152
sazonalidade e aumento de concentrações pode reduzir a viabilidade celular (Tabela
18).
Os resultados das frações diclorometano e acetato de etila de P. cernuum,
apresentados na Tabela 19, demonstram que os tratamentos não influenciaram a
viabilidade celular, porém as estações de verão e inverno das frações
dicloromentano e a estação verão das frações acetato de etila, apresentaram
diferença estatística significante quando comparadas com o controle negativo (PBS),
sugerindo que a sazonalidade pode contribuir no potencial citotóxico.
Os resultados apresentados acima podem ser validados tendo em vista que
nos ensaios realizados o controle positivo (4 NQO) demonstrou baixa viabilidade
celular em todas as análises, apresentando diferença estatística significante quando
comparadas com o controle negativo (PBS), que apresentou 100% de viabilidade
celular, comprovando o potencial citotóxico do 4 NQO (Tabelas 16, 17, 18 e 19).
Estudos realizados por Péres et al. (2009) para avaliação da citotoxicidade
dos óleos essenciais de P. gaudichaudianum, utilizando ensaio cometa e teste de
micronúcleo, demonstraram que os óleos dessa espécie de Piper possuem forte
efeito citotóxico, genotóxico e mutagênico em células V79 (células de fibroblastos de
pulmão de Hamster chinês).
Assis et al. (2013) avaliaram a citotoxicidade em Artemia salina dos óleos
essenciais de P. cernuum, P. glabratum, P. hispidum e P. madeiranum, e
demonstraram que P. glabratum e P. madeiranum, com DL50 de 45,61 ppm e 49,64
ppm respectivamente, foram as mais tóxicas; P. cernuum apresentou toxicidadade
moderada, DL50 de 200,03 ppm e P. hispidum baixa toxicidade ou não toxicidade,
DL50 de 404,80 ppm.
Em análise prévia, dos resultados desta pesquisa, os óleos essenciais de P.
amplum não apresentaram citotoxicidade nas estações de primavera e verão, assim
como para todos os tratamentos analisados. E para P. cernuum também observou-
se ausência de potencial citotóxico para todas as estações do ano, bem como para
os tratamento de 6250 e 12500 ppm. Sugerindo que essas amostras são
promissoras para a continuidade de novas análises para a confirmação da ausência
de toxicidade.
Muller (2011) avaliou o potencial citotóxico de extratos de P. amplum e P.
cernuum, pelo ensaio com Artemia salina, relatando citotoxicidade para as amostras
analisadas.
153
No presente estudo também foi observado possível potencial citotóxico nas
frações de acetato de etila na primavera e verão, e nas concentrações de 1000 e
500 ppm, bem como nas frações diclorometano a 1000 ppm para P. amplum. Já
para P. cernuum o potencial citotóxico foi observado nas frações diclorometando no
inverno e verão, assim como para a fração de acetato de etila no verão.
De um modo geral os monoterpenos são considerados substâncias seguras,
no entanto dependendo da dose utilizada podem causar reações tóxicas. Já os
sesquiterpenos presentes em óleos essenciais têm seus efeitos citotóxicos descritos
sobre algumas linhagens de células tumorais. Como exemplos o E-nerolidol, β-
cariofileno e α-humuleno que são conhecidos pela atividade citotóxica, contra células
de adenocarcinoma renal (ACHN), carcinoma de protata, melanoma e câncer de
mama, porém sem conhecimento de seu mecanismo (PÉRES et al., 2009).
Assim sendo, é necessário que outras análises sejam realizadas para garantir
a segurança quanto ao potencial citotóxico das amostras de óleos e frações
dicloromentano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum.
154
Tabela 16: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. amplum nas quatro estações do ano.
Óleos Essenciais
Tratamento (ppm)
Sobrevivência (%) (media e desvio
padrão)
Revertentes his 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Revertentes lis 1/108 sobreviventesb
(média e desvio padrão)c
Revertentes met 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Inverno 2012***
25000 19,9 ± 9,2 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 22,0 ± 2,1 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 6250 29,7 ± 7,8 2,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Primavera 2012
25000 97,1 ± 4,2 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 12500 115,1 ± 2,1 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 6250 147,4 ± 8,5 2,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0
Verão 2012/2013***
25000 33,6 ± 2,1 3,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 43,4 ± 3,5 2,0 ± 0,0 3,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 6250 44,4 ± 6,4 2,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0
Outono 2013
25000 48,8 ± 9,9 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 87,7 ± 7,8 2,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 6250 88,3 ± 0,7 2,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7
PBS 0 100,0 ± 3,5 1,5 ± 0,7 2 ± 0,0 1 ± 0,0 4 NQO 1 4,1 ± 3,5* 245 ± 17,0*** 301 ± 15,6*** 263 ± 22,6***
Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle Positivo); Tampão Salina Fosfato (PBS – Controle Negativo); aRevertentes de lócus-específico; bRevertentes de lócus não-específico; cmédia e desvio-padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo controle negativo (PBS) *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001 no teste ANOVA (Tukey HSD Test – honestly significant difference).
155
Tabela 17: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. cernuum nas quatro estações do ano.
Óleos Essenciais
Tratamento (ppm)
Sobrevivência (%) (media e desvio
padrão)
Revertentes his 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Revertentes lis 1/108 sobreviventesb
(média e desvio padrão)c
Revertentes met 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Inverno 2012
25000 19,2 ± 2,1*** 1,5 ± 0,7 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 24,0 ± 4,2 2,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 6250 142,6 ± 6,4 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Primavera 2012
25000 30,1 ± 3,5*** 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 12500 40,4 ± 5,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 6250 88,9 ± 9,2 1,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7
Verão 2012/2013
25000 43,0 ± 8,5*** 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 12500 62,0 ± 9,2 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 6250 65,9 ± 7,1 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7
Outono 2013
25000 35,6 ± 6,4*** 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 59,8 ± 3,5 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 6250 69,1 ± 9,2 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0
PBS 0 100,0 ± 5,7 0,5 ± 0,7 1 ± 0,0 2 ± 1,4 4 NQO 1 13,7 ± 2,1* 262,5 ± 17,7*** 283 ± 26,9*** 261,5 ± 38,9***
Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle Positivo); Tampão Salina Fosfato (PBS – Controle Negativo); aRevertentes de lócus-específico; bRevertentes de lócus não-específico; cmédia e desvio-padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo controle negativo (PBS) *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001 no teste ANOVA (Tukey HSD Test – honestly significant difference).
156
Tabela 18: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. amplum nas quatro estações do ano.
Frações Tratamento
(ppm)
Sobrevivência (%) (media e desvio
padrão)
Revertentes his 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Revertentes lis 1/108 sobreviventesb
(média e desvio padrão)c
Revertentes met 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Inve
rno
2012
Diclorometano 1000 22,0 ± 1,4** 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 62,6 ± 0,7 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 74,2 ± 2,1 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Acetato de Etila
1000 59,0 ± 3,5* 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 60,8 ± 7,8* 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 73,8 ± 4,9 1,0 ± 0,0 1,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0
Prim
aver
a 20
12 Diclorometano
1000 45,4 ± 7,8** 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 500 80,9 ± 9,2 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 250 93,1 ± 3,5 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7
Acetato de Etila*
1000 38,3 ± 8,5* 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 71,8 ± 6,4* 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 250 81,9 ± 9,2 2,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0
Ver
ão
2012
/201
3 Diclorometano 1000 40,7 ± 4,2** 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 500 91,7 ± 7,8 2,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 106,4 ± 5,7 2,0 ± 1,4 0,5 ±0,7 0,0 ± 0,0
Acetato de Etila*
1000 44,0 ± 4,9* 2,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 500 48,0 ± 4,9* 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 55,0 ± 6,4 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Out
ono
2013
Diclorometano 1000 56,5 ± 7,1** 3,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 57,8 ± 3,5 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 250 96,4 ± 8,5 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0
Acetato de Etila
1000 66,4 ± 6,4* 2,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 500 70,0 ± 9,2* 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 88,6 ± 5,7 2,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0
PBS 0 100,0 ± 4,2 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 2 ± 1,4 4 NQO 1 16,0 ± 5,7* 292 ± 19,8*** 267,5 ± 16,3*** 320,5 ± 17,7***
Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle Positivo); Tampão Salina Fosfato (PBS – Controle Negativo); aRevertentes de lócus-específico; bRevertentes de lócus não-específico; cmédia e desvio-padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo controle negativo (PBS) *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001 no teste ANOVA (Tukey HSD Test – honestly significant difference).
157
Tabela 19: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. cernuum nas quatro estações do ano.
Frações Tratamento
(ppm)
Sobrevivência (%) (media e desvio
padrão)
Revertentes his 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Revertentes lis 1/108 sobreviventesb
(média e desvio padrão)c
Revertentes met 1/108 sobreviventesa
(média e desvio padrão)c
Inve
rno
2012
Diclorometano** 1000 23,0 ± 4,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 42,0 ± 9,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 46,6 ± 7,1 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Acetato de Etila 1000 62,1 ± 9,9 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 500 99,7 ± 5,7 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 100,9 ± 3,5 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7
Prim
aver
a 20
12 Diclorometano
1000 77,8 ± 4,9 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 500 89,3 ± 7,8 2,5 ± 07 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 113,1 ± 5,7 2,0 ± 0,0 2,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0
Acetato de Etila 1000 69,3 ± 7,1 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 500 103,5 ± 7,1 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 133,6 ± 9,2 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 2,5 ± 0,7
Ver
ão
2012
/201
3 Diclorometano** 1000 28,4 ± 1,4 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 500 35,0 ± 7,8 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 39,5 ± 6,4 1,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7
Acetato de Etila*
1000 44,0 ± 9,9 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 2,0 ± 0,0 500 47,7 ± 5,7 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 2,0 ± 1,4 250 52,8 ± 7,8 0,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7
Out
ono
2013
Diclorometano 1000 60,7 ± 9,2 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 1,0 ± 1,4 500 65,4 ± 3,5 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 250 98,4 ± 4,9 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7
Acetato de Etila 1000 99,5 ± 8,5 1,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 500 102,3 ± 5,7 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 250 109,1 ± 4,9 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7
PBS 0 100,0 ± 9,9 1,5 ± 0,7 1 ± 1,4 1 ± 0,0 4 NQO 1 14,5 ± 4,9* 261 ± 18,4*** 320,5 ± 19,1*** 289 ± 19,8***
Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle Positivo); Tampão Salina Fosfato (PBS – Controle Negativo); aRevertentes de lócus-específico; bRevertentes de lócus não-específico; cmédia e desvio-padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo controle negativo (PBS) *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001 no teste ANOVA (Tukey HSD Test – honestly significant difference).
158
A partir dos resultados da avaliação da mutagenicidade, os óleos essenciais e
frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum nas diferentes
estações do ano e nas diferentes concentrações, não apresentaram atividade
mutagência sobre a linhagem haploide de S. cerevisiae (XV-185-14C) de revertentes
de his 1/108 sobreviventes, revertentes de lis 1/108 sobreviventes e revertentes de
hom 1/108 sobreviventes, na concentração máxima testada de 25000 ppm para os
óleos essenciais e 1000 ppm para as frações. Além disso, também pode-se observar
pela análise estatística que a sazonalidade não influenciou o potencial mutagênico
das amostras analisadas no presente estudo (Tabelas 16, 17, 18 e 19).
O controle negativo (PBS) apresentou um pequeno crescimento microbiano
em todos os ensaios, o que sugere que esse micro-organismo é revertente de
histidina, lisina e metionina de forma espontânea. Logo, desconsiderando o
crescimento microbiano espontâneo, assegura-se mais efetivamente a ausência de
potencial mutagênico das amostras testadas.
Nos experimentos realizados, o controle positivo (4 NQO) demonstrou
mutação aumentada de revertentes de his 1/108 sobreviventes, revertentes de lis
1/108 sobreviventes e revertentes de hom 1/108 sobreviventes, comprovando sua
mutagenicidade conhecida.
Santin et al. (2011) avaliaram a mutagenicidade do extrato etanólico das
partes aéreas de P. aduncum e Muller (2011) avaliou a mutagenicidade dos extratos
etanólico das partes aéreas de P. cernuum, P. amplum e P. aduncum frente à
linhagem haploide de S. cerevisiae (XV-185-14C). Os autores observaram ausência
de potencial mutagênico na concentração máxima testada de 500 ppm.
No presente estudo, as frações diclorometano e acetato de etila das duas
espécies de Piper analisadas, não demonstraram mutagenicidade neste mesmo
ensaio, na concentração máxima testada de 1000 ppm, sugerindo uma maior
segurança quanto a concentração, quando comparadas com os resultados
encontrados por Santin et al. (2011) e Muller (2011).
Em estudo realizado por Gomes-Carneiro et al. (2005), através do teste de
Ames, observou-se que α-pineno não apresentou genotoxicidade nem
mutagenicidade. Connor e demais pesquisadores em 1985, utilizaram o mesmo
teste supracitado, e apresentaram resultado negativo para mutagenicidade do
limoneno. Ainda, Bakkali et al. (2008) também descreve que α-pineno e limoneno
são substâncias desprovidas de mutagenicidade.
159
As afirmações de Gomes-Carneiro et al. (2005), Connor et al. (1985) e Bakkali
et al. (2008) vão de encontro aos resultados de ausência de potencial mutagênico
dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum no presente estudo, destacando
que α-pineno é uma das substâncias majoritárias presente nos óleos essenciais de
P. amplum (10,29 a 14, 86%), e P. cernuum (2,63 a 5,43%), bem como Limoneno
nos óleos essenciais de P. amplum (5,10 a 6,45%), mas também presente nos óleos
de P. cernuum (0,27 a 0,57%).
De acordo com Oga (2003), os testes de mutagênese têm sido utilizados
como testes de triagem para prever o potencial carcinogênico de substâncias, no
entanto, esses testes somente avaliam as substâncias que causam câncer por
mecanismos mutagênicos, ou seja, com ação direta no material genético. Sendo
assim, quando observa-se resultados negativos de mutagenicidade frente a S.
cerevisiae, considera-se um indicativo de que essas substâncias não possuem ação
carcinogênica, no entanto o câncer pode se desenvolver por outros mecanismos não
mutagênicos, logo outros testes devem ser realizados.
A partir de todos os testes realizados com os óleos essenciais e frações
diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum nas diferentes estações
do ano, os resultados são animadores quanto ao potencial antimicrobiano e a
segurança. Porém ainda se faz necessário a continuidade de pesquisas com essas
duas espécies de Piper, especialmente quanto à análise química das frações obtidas
a partir de hidrolato resultado de extração de óleo essencial, além de diferentes
testes quanto à citotoxicidade e mutagenicidade para obtenção de substâncias
bioativas mais seguras.
160
6 CONCLUSÕES
• A sazonalidade influenciou no rendimento, na composição química, na
atividade antimicrobiana e no potencial citotóxico das amostras testadas;
• Análises por CG/EM, índice de retenção e RMN 13C, permitiu identificar quali
e quantitativamente 43 e 27 substâncias nos óleos essenciais de P. amplum e P.
cernuum respectivamente;
• As substâncias majoritárias encontradas nos óleos de P. amplum foram β-
cariofileno, α-pineno, cadin-4-en-7-ol, α-guaieno, α-copaeno, germacreno D,
limoneno e germacreno B;
• As substâncias majoritárias encontradas nos óleos de P. cernuum foram
trans-dihidroagarofurano, 4-epi-cis-dihidroagarofurano, γ-eudesmol, β-cariofileno,
elemol, α-pineno, canfeno;
• Os óleos de P. amplum e P. cernuum apresentaram-se ativos contra bactérias
Gram positivas, dermatófitos e levedura oportunista C. neoformans, com potencial
citotóxico mais evidenciado no inverno e verão, para P. amplum, e na concentração
de 25000 ppm para P. cernuum, porém sem atividade mutagênica em todas as
estações, nas diferentes concentrações;
• As frações diclorometano e acetato de etila provenientes do fracionamento
dos hidrolatos de P. amplum e P. cernuum apresentaram atividade antibacteriana
frente a bactérias Gram positivas e apresentaram-se promissores para os
dermatófitos e levedura oportunista C. neoformans;
• A citotoxicidade das frações diclorometano e acetato de etila, para P. amplum
e P. cernuum, sofreram influência da sazonalidade e das concentrações utilizadas,
porém sem evidência quanto ao potencial mutagênico, em todas as estações e
concentrações utilizadas;
• Foi possível observar diferenças nos resultados da atividade antimicrobiana e
potencial citotóxico em relação às estações do ano, tanto para os óleos essenciais
quanto para as frações, entretanto, para os óleos essenciais, não foi possível
relacionar de forma direta a variação da composição quantitativa, nas diferentes
estações do ano, com a maior efetividade da atividade antimicrobiana e aumento do
potencial citotóxico.
161
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