UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE …€¦ · genótipo-fenótipo e investigação de outras CNVs (Copy Number Variations) no genoma, foram incluídos 27 indivíduos

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

MATHEUS DE MELLO COPELLI

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE DESEQUILÍBRIOS

GENÔMICOS EM INDIVÍDUOS COM HIPÓTESE DIAGNÓSTICA DE

SÍNDROME DE DELEÇÃO 22q11.2

CAMPINAS

2017


IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE DESEQUILÍBRIOS

GENÔMICOS EM INDIVÍDUOS COM HIPÓTESE DIAGNÓSTICA DE

SÍNDROME DE DELEÇÃO 22q11.2

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de mestre em Ciências, Área

de Concentração Genética Médica.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes

COORIENTADOR: Prof. Dr. Társis Antônio Paiva Vieira

Este exemplar corresponde à versão final da

dissertação defendida pelo aluno Matheus de

Mello Copelli, e orientado pela Profa. Dra.

Vera Lúcia Gil da Silva Lopes.

CAMPINAS

2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO


Orientador (a) PROF(A). DR(A). VERA LUCIA GIL DA SILVA LOPES

Coorientador (a) PROF(A). DR(A). TARSIS ANTONIO PAIVA VIEIRA

MEMBROS:

1. PROF(A). DR(A). VERA LUCIA GIL DA SILVA LOPES

2. PROF(A). DR(A). MARA SANCHES GUARAGNA

3. PROF(A). DR(A). CLAUDIA VIANNA MAURER MORELLI

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 24 de fevereiro de 2017.

Dedico este trabalho ao meu irmão Renato (in memorian)

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, pela presença constante nos momentos de ausência, me

proporcionando tudo o que sempre precisava. E, também, pela confiança de

entender que a distância era algo momentâneo e necessário. Obrigado.

A minha orientadora, Vera, por me conceder a oportunidade de trabalhar

junto com esse grupo, por todo suporte e ajuda durante a realização desse

trabalho, pela disposição e paciência comigo. Fico muito feliz de poder ter

convivido esse tempo com você, e poder levar um pouco disso para meu futuro.

Obrigado por me proporcionar essa grande experiência, profissional e pessoal,

que tive durante a realização desse trabalho.

Ao meu co-orientador, Társis, sempre presente e disposto a ajudar e

esclarecer todas as dúvidas e problemas que apareciam no decorrer do trabalho,

além de ter tido muita paciência comigo. Agradeço por ter feito parte disso, e

também por todos ensinamentos durante a convivência no laboratório. Tenho

certeza que me servirão de espelho, tanto no lado profissional, como pessoal.

A minha amiga Ilária, por toda a disposição e amizade, desde o primeiro

dia que cheguei no laboratório. Só tenho a agradecer por tudo o que fizestes por

mim durante esse tempo, sempre disposta a ajudar e a conversar. Com toda

certeza, você tem grande parte nesse trabalho. Obrigado por todo o carinho, os

conselhos, os momentos de diversão, e principalmente pela amizade.

A minha amiga Tânia, por ter me acolhido e ter me ensinado os primeiros

passos no laboratório. Sempre vou lembrar do primeiro puxão de orelha que você

me deu por e-mail, por ter deixado a bancada suja! Obrigado por sempre ter tido

paciência de me aturar, mesmo quando eu ia te atrapalhar no meio dos

experimentos, te chamando para tomar café. Também, por sempre me escutar,

pelas conversas, pelos momentos divertidos, e por ser essa grande amiga és!

A minha amiga Ana Paula, pela façanha de me aturar todos os dias, e

pela enorma paciência que tivestes. Sei que te tirei muitas vezes do sério, a

maioria de forma propositada, mas no fundo sempre gostei muito de você!

Obrigado por tudo o que me ensinou, por toda a ajuda, e pelos bons momentos

que tivemos, dentro e fora do laboratório. Obrigado por ter feito parte de tudo

isso, e principalmente pela amizade!

A minha “mãe” de Campinas, Nilma, por todo carinho que teve comigo.

Sempre de bom humor e aguentando todas as brincadeiras e apelidos que eu

inventava para você. Era muito bom chegar de manhã e sempre conversar com

você. Obrigado pelos cafés com a presidenta, e pelo prazer de me ouvir todas

as manhãs cantando Frank Sinatra. Fiquei muito feliz de ter te conhecido, e

acima de tudo, ganhar uma segunda mãe e uma grande amiga!

Aos amigos do laboratório de citogenética, Miriam, Milena, Jair, Tato,

Mariana, Samira, Isabela, Ana Paula, Flávia e Rafael, e também os amigos do

Projeto Crânio Face Brasil, Elaine, Roberta e Fernanda. Todos me receberam e

me trataram muito bem, sempre sendo gentis e proporcionando bons momentos

de aprendizado, além de muitas risadas.

Aos amigos do laboratório de genética molecular, em especial, Stephanie,

Roby, Luciana R, Nailú, Fábio, Alexandre, Fernando, Simoni, Karina, Tati,

Cynthia, Luciana B, Marilza, obrigado por todos os momentos compartilhados!

Aos membros da banca examinadora, pela disponibilidade de dar suas

contribuições para a elaboração desta dissertação.

Aos pacientes e seus familiares que aceitaram participar deste estudo.

À FAPESP, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.

RESUMO

A síndrome de deleção 22q11.2 (S. Del 22q11.2) representa a microdeleção

mais comum na espécie humana, com prevalência de 1/4000 -1/5000 nascidos

vivos. O quadro clínico é heterogêneo, e os principais sinais incluem defeitos

cardíacos congênitos (DCC) principalmente conotruncais, anomalias palatais,

hipocalcemia, deficiência imunológica, dificuldade de aprendizagem, atraso no

desenvolvimento e manifestações psiquiátricas. Diferentes métodos

laboratoriais são utilizados para detectar a deleção. Devido à grande

heterogeneidade clínica, em uma porcentagem significativa dos pacientes com

essa hipótese diagnóstica, a deleção em 22q11.2 não é detectada após a

triagem por FISH (Fluorescence in situ Hybridization) ou MLPA (Multiplex

Ligation-dependent Probe Amplification). O objetivo desse trabalho foi identificar

e caracterizar desequilíbrios genômicos em pacientes com hipótese diagnóstica

de S. Del 22q11.2. Todos os indivíduos foram investigados por meio da técnica

de Hibridação genômica em arrays (aGH), utilizando o chips CytoScan HD e

750K (Affymetrix). Para a caracterização dos pontos de quebra, correlação

genótipo-fenótipo e investigação de outras CNVs (Copy Number Variations) no

genoma, foram incluídos 27 indivíduos com deleção em 22q11.2. Para a

identificação de desequilíbrios genômicos em outras regiões, foram incluídos 32

indivíduos previamente testados pelas técnicas de FISH e/ou MLPA, sem

deleção em 22q11.2. Entre os indivíduos com deleção em 22q11.2, os pontos de

quebra proximais variaram entre as posições genômicas 18.644.790 a

18.916.842 (hg19 - 272 kb – quatro genes) e os pontos de quebra distais

variaram entre as posições genômicas 21.465.659 a 21.915.509 (hg 19 - 449 kb

– nove genes) e além disso, foram identificadas outras 794 CNVs no genoma de

todos os indivíduos, sendo 237 duplicações e 557 deleções. Entre os 32

indivíduos sem deleção em 22q11.2, foram encontrados desequilíbrios

genômicos patogênicos em quatro indivíduos (12,5%) e variantes de significado

incerto em outros quatro indivíduos (12,5%). A investigação por aGH permitiu a

determinação dos pontos de quebra nos casos com deleção em 22q11.2, além

da definição diagnóstica em quatro indivíduos. Ainda, reforçou o papel da

investigação de genitores e da necessidade de diferentes técnicas laboratoriais

para a elucidação diagnóstica de desequilíbrios genômicos.

Palavras-chave: deleção 22q11.2, aGH, CNVs, desequilíbrios genômicos.

ABSTRACT

The 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2 DS) is the most common microdeletion

in humans, with an incidence of 1/4000 – 1/5000 live births. The clinical

phenotype is highly heterogeneous, but commonly includes conotruncal cardiac

defects, palatal abnormalities, hypocalcemia, imunnodeficiency, learning

disabilities, developmental delay and psychiatrics disorders. Different methods

are used for deletion screening of patients with 22q11.2 DS clinical suspicion.

However, due to heterogenous phenotype, many patients do not show 22q11.2

deletion after screening with FISH (Fluorescence in situ Hybridization) and/or

MLPA (Multiplex Ligation-dependent probe Amplification). The aim of this study

was to investigate and characterize genomic imbalances in patients with 22q11.2

DS clinical suspicion. Genomic imbalances screening was performed by array

Genomic Hybridization (aGH) (CytoScan chip HD / 750K, Affymetrix). To

investigate proximal/distal breakpoints, genotype-phenotype correlation and

other CNVs throughout the whole genome, 27 individuals with 22q11.2 DS were

included. Genomic imbalances were investigated in 32 patients with clinical

suspicion, but without 22q11.2 deletion. Among the 27 individuals with 22q11.2

DS, aGH showed proximal breakpoints ranging from 18.644.790 – 28.916.842

genomic positions (hg19 - 272 kb – four genes) and distal breakpoints ranging

from 21.465.659 – 21.915.509 genomic positions (hg19 - 449 kb – nine genes).

In addition, 794 CNVs were identified throughout the genome (237 duplications

and 557 deletions). Among the 32 individuals without 22q11.2 deletion, four

individuals (12,5%) showed pathogenic genomic imbalances and four (12,5%)

showed variants of uncertain significance (VOUS). This strategy allowed the

breakpoints mapping of individuals with 22q11.2 deletion, besides diagnostic

conclusion for four individuals. Also, reinforces the need for investigation of the

patient’s parents and the need to use distinct laboratorial techniques to elucidate

genomic imbalances.

Key words: 22q11.2 deletion syndrome, aGH, CNVs, genomic imbalances.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Esquema dos rearranjos resultantes da recombinação homóloga não

alélica intercromossômica e intracromossômica, ocorrendo entra as LCRs

presentes na região 22q11.2 ............................................................................ 25

Figura 2: LCRs e alguns genes presentes na região 22q11.2, a extensão da

deleção típica e da deleção menor e localização das sondas de FISH comumente

utilizadas N25 e TUPLE1 ................................................................................. 26

Figura 3: Nomenclatura proposta para deleções na região 22q11.2 ............... 27

Figura 4: Fluxograma utilizado para a interpretação e classificação das CNVs

encontradas. ..................................................................................................... 48

Figura 5: Ilustração dos pontos de quebra em cada indivíduo com a deleção

22q11.2 típica de ~3 Mb. .................................................................................. 54

Figura 6: Distribuição, a partir do tamanho, das CNVs encontradas no genoma

dos indivíduos com deleção em 22q11.2.... ..................................................... 64

Figura 7: Distribuição das CNVs por tipo: deleções e duplicações. ................ 68

Figura 8: Distribuição das CNVs com base no tamanho (kb)..... ..................... 69

Figura 9: Perfil de hibridação genômica (aGH) da paciente 2, evidenciando uma

duplicação em Xq25-q26.1 (1.077 Mb) ............................................................ 73

Figura 10: Perfil de hibridação genômica comparativa (aCGH) da paciente 2,

evidenciando a mesma duplicação encontrada em Xq25-q26.1 ...................... 73

Figura 11: Perfil de hibridação genômica (aGH) da paciente 10, evidenciando

uma duplicação em 20q12-q13.12 (1.068 Mb) e uma deleção em 21q22.3 (4.787

Mb). .................................................................................................................. 74


evidenciando a mesma duplicação em 20q12-q13.12 e a mesma deleção em

21q22.3, encontradas por aGH. ....................................................................... 75

Figura 13: FISH em metáfase de sangue periférico da paciente 10, mostrando a

hibridação da sonda em apenas um cromossomo, confirmando a deleção na

região 21q22.3. ................................................................................................ 75

Figura 14: Perfil de hibridação genômica (aGH) do paciente 20, evidenciando

uma duplicação em 12q24.33 (0.516 Mb). ....................................................... 75

Figura 15: Perfil de hibridação genômica (aGH) do paciente 43, evidenciando

uma duplicação em Xq24-q26.1 (10.587 Mb)................................................... 76

Figura 16: Perfil de hibridação genômica comparativa (aCGH) do paciente 43,

evidenciando a mesma duplicação em Xq24-q26.1 encontrada por aGH ........ 76

Figura 17: Perfil de hibridação genômica comparativa (aCGH) da genitora (a) e

irmã (b) do paciente 43, evidenciando a mesma duplicação em Xq24-q26.1

encontrada no paciente......................................................................................77


uma deleção em Xq21.1 (6.821 Mb) ................................................................ 77


evidenciando a mesma deleção encontrada por aGH ...................................... 78


uma deleção em 16p11.2 (0.894 Mb). .............................................................. 78


uma deleção em 3p26.1 (0.606 Mb)...................................................................79


evidenciando a mesma deleção encontrada por aGH. ..................................... 79


uma duplicação em 6p25.3-p24.1 (11.472 Mb) e uma deleção em 9p24.3-9p22.3

(14.921 Mb). ..................................................................................................... 80

Figura 24: Cariótipos parciais da paciente 206 e de sua genitora. .................. 80

Figura 25: FISH em metáfase de sangue periférico da paciente 206 e de sua

genitora, com sondas obtidas de clones de BAC. ............................................ 81

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Genes presentes no intervalo dos pontos de quebra da região proximal

e distal da deleção em 22q11.2.........................................................................56

Tabela 2. Sinais clínicos associados em cada indivíduo com deleção em

22q11.2..............................................................................................................58

Tabela 3. Sinais clínicos observados nos 27 indivíduos com deleção em 22q11.2,

evidenciando a quantidade de sinais observados em cada grupo

separadamente..................................................................................................60

Tabela 4. Quantidade de CNVs no genoma dos indivíduos com deleção em

22q11.2..............................................................................................................62

Tabela 5. Quantidade de CNVs por cromossomo nos indivíduos com deleção em

22q11.2..............................................................................................................63

Tabela 6. Duplicações mais frequentes encontradas nos indivíduos com deleção

em 22q11.2........................................................................................................65

Tabela 7. Deleções mais frequentes encontradas nos indivíduos com deleção

em 22q11.2........................................................................................................65

Tabela 8. Duplicações ausentes nos indivíduos do grupo controle que

apresentam genes OMIM..................................................................................67

Tabela 9. Deleções ausentes nos indivíduos do grupo controle que apresentam

genes OMIM......................................................................................................67

Tabela 10. Variantes patogênicas e de significado incertoencontradas em

indivíduos com hipótese não confirmada de S. Del 22q11.2, ordenadas por

indivíduo.............................................................................................................70

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

aCGH: array Comparative Genomic Hybridization

aGH: array Genomic Hybridization

APAE: Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais

APLN: Apelin

AR: Androgen receptor

BCRP2: Breakpoint cluster region pseudogene 2

BMPER: BMP binding endothelial regulator

BRWD3: Bromodomain and WD repeat domain containing 3

CAIF: Centro de Atendimento Integral ao Fissurado Labiopalatal

CAISM: Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher

CAKUT: Congenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract

CGH: Comparative Genomic Hybridization

ChAS: Chromosome Analysis Suite

CHD7: Chromodomain helicase DNA binding protein 7

CN: Copy Number

CNV: Copy Number Variation

COMT: Catechol-O-methyltransferase

CRA: Chromosome Resolution Additive

CRKL: CRK like proto-oncogene, adaptor protein

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole

DCC: Defeitos Cardíacos Congênitos

DECIPHER: Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans

DGV: Database of Genomic Variants

DGCR6: DiGeorge syndrome critical region gene 6

DIP2A: Disco interacting protein 2 homolog A

DMRT1: Doublesex and mab-3 related transcription factor 1



DNA: Deoxyribonucleic acid

DOCK8: Dedicator of cytokinesis 8

EDTA: Etilenediaminotetracetato dissódico 2H2O

EP400: E1A binding protein p400

EYA1: EYA transcriptional coactivator and phosphatase 1

FAMERP: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

FAM230B: Family with sequence similarity 230 member B

FCM: Faculdade de Ciências Médicas

FGF8: Fibroblast growth factor 8

FGF10: Fibroblast growth factor 10

FISH: Fluorescence in situ Hybridization

FOXC1: Forkhead box C1

FOXF2: Forkhead box F2

GGT3P: Gamma-glutamyltransferase 3 pseudogene

GRIA3: Glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 3

GRM7: Glutamate metabotropic receptor 7

HIC2: Hypermethylated in cancer 2

HIRA: Histone cell cycle regulator

HMM: Hidden Markov Model

KANK1: KN motif and ankyrin repeat domains 1

Kb: Kilobase

KCL: Cloreto de potássio

LCR: Low Copy Repeat

MAPD: Median Absolute Pairwise Difference

Mb: Megabase

MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MMP17: Matrix metallopeptidase 17

NAHR: Non Allelic Homologous Recombination

NPHS2: NPHS2 podocin

NRN1: Neuritin 1

OCRL: OCRL, inositol polyphosphate-5-phosphatase

OFCC1: Orofacial cleft 1 candidate 1

OFC1: Orofacial cleft 1

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man

PCFB: Projeto Crânio Face Brasil

PCNT: Pericentrin

PCR: Polymerase Reaction Chain

PITX2: Paired like homeodomain 2

PI4KAP2: Phosphatidylinositol 4-kinase alpha pseudogene 2

POM121L8P: POM121 transmembrane nucleoporin like 8, pseudogene

POU3F4: POU class 3 homeobox 4

PRODH: Proline dehydrogenase 1

PTPRD: Protein tyrosine phosphatase, receptor type D

PTPRT: Orotein tyrosine phosphatase, receptor type T

PUS1: Pseudouridylate synthase 1

RDNPM: Retardo do desenvolvimento neuropsicomotor

RFLPs: Restriction Fragment Length Polymorphisms

RIMBP3B: RIMS binding protein 3B

RIMBP3C: RIMS binding protein 3C

RNA: Ribonucleic acid

RREB1: Ras responsive element binding protein 1

SASH3: SAM and SH3 domain containing 3

SERPINB6: Serpin family B member 6

SFSWAP: Splicing factor SWAP homolog

SHANK3: SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3

SMARCA1: SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of

chromatin, subfamily a, member 1

SMARCB1: SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of

chromatin, subfamily b, member 1

SNPQC: Single Nucleotide Polymorphism Quality Control

SNP: Single Nucleotide Polymorphism

STAG2: Stromal antigen 2

SUS: Sistema Único de Saúde

SVCF: Síndrome Velocardiofacial

S. Del 22q11.2: Síndrome de deleção 22q11.2

TBX1: T-box 1

TBX22: T-box 22

TCLE: Termo de consentimento livre e esclarecido

TDAH: Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade

TGA: Transposição das Grandes Artérias

TFAP2A: Transcription factor AP-2 alpha

THOC2: THO complex 2

TMEM191C: Transmembrane protein 191C

TOP3B: Topoisomerase (DNA) III beta

TRPM2: Transient receptor potential cation channel subfamily M member 2

TSPEAR: Thrombospondin type laminin G domain and EAR repeats

UBE2L3: Ubiquitin conjugating enzyme E2 L3

UFD1L: Ubiquitin fusion degradation 1 like

UCSC: University of California, Santa Cruz

ULK1: Unc-51 like autophagy activating kinase 1

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

USP18: Ubiquitin specific peptidase 18

VLDLR: Very low-density lipoprotein receptor

XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis

XPNPEP2: X-prolyl aminopeptidase (aminopeptidase P) 2

WavinessSD: Waviness Standard Deviation

WNT5A: Wnt family member 5A

SUMÁRIO

1. Introdução .............................................................................................. 22

2. Revisão de Literatura ............................................................................. 24

2.1. Síndrome de deleção 22q11.2................................................................ 24

2.2. Mecanismo de origem da deleção 22q11.2 ............................................ 24

2.3. Manifestações clínicas da S. Del 22q11.2 .............................................. 28

2.4. Diagnóstico laboratorial da S. Del 22q11.2 ............................................ 31

2.5. S. Del 22q11.2 e o Projeto Crânio-Face Brasil ....................................... 34

3. Objetivos ................................................................................................ 36

3.1. Objetivo geral ......................................................................................... 36

3.2. Objetivos específicos .............................................................................. 36

4. Casuística e Métodos ............................................................................. 37

4.1. Aspectos éticos ...................................................................................... 37

4.2. Casuística ............................................................................................... 37

4.3. Métodos .................................................................................................. 38

4.3.1. Caracterização dos pontos de quebra e correlação genótipo-fenótipo em

indivíduos com deleção em 22q11.2 ................................................................ 38

4.3.2. Comparação das CNVs no genoma dos pacientes com deleção 22q11.2 e

um grupo de indivíduos controle. ..................................................................... 39

4.3.3. Identificação dos desequilíbrios genômicos em pacientes negativos para a

deleção 22q11.2 ............................................................................................... 39

4.3.3.1. Coleta e processamento inicial das amostras .................................. 40

4.3.3.2. Extração de DNA genômico ............................................................. 40

4.3.3.3. Técnica de Hibridação genômica em arrays (aGH) ......................... 41

4.3.3.4. Análise dos dados gerados pela técnica de aGH ............................ 46

4.4. Validação dos resultados ....................................................................... 49

4.4.1. Cariótipo ................................................................................................. 49

4.4.2. FISH ....................................................................................................... 50

4.4.3. aCGH ..................................................................................................... 51

5. Resultados.............................................................................................. 54

5.1. Caracterização dos pontos de quebra em indivíduos com deleção em

22q11.2 e correlação genótipo-fenótipo em indivíduos com deleção em 22q11.2

...........................................................................................................................54

5.2. Comparação das CNVs no genoma entre os indivíduos com deleção

22q11.2 e com um grupo controle. ................................................................... 62

5.3. Identificação de desequilíbrios genômicos em pacientes sem deleção em

22q11.2. ........................................................................................................... 68

6. Discussão ............................................................................................... 82

6.1. Caracterização dos pontos de quebra e correlação genótipo-fenótipo em

indivíduos com deleção 22q11.2 ...................................................................... 82

6.2. Comparação das CNVs no genoma dos pacientes com deleção 22q11.2 e

no grupo de indivíduos controle. ...................................................................... 85

6.3. Identificação dos desequilíbrios genômicos por meio da técnica de aGH

em pacientes negativos para a deleção 22q11.2 ............................................. 91

6.3.1. Desequilíbrios genômicos relevantes encontrados nos 32 indivíduos com

suspeita clínica de S. Del 22q11.2. .................................................................. 92

7. Conclusões ........................................................................................... 110

8. Referências .......................................................................................... 111

10. Anexos ................................................................................................. 140

10.1. Parecer do Comitê de Ética em pesquisa da Unicamp. ....................... 140

10.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ...................................... 144

10.3. Análise estatística dos grupos A1 x B1 e A2 x B2 ................................ 149

22

Introdução

A Síndrome de deleção 22q11.2 (S. Del 22q11.2) tem uma prevalência de

1/4000 a 1/5000 nascimentos (Swillen et al., 2000) e é a microdeleção mais

comum na espécie humana. Entretanto, é provável que sua incidência seja maior

do que a descrita, devido a sua grande variabilidade fenotípica (McDonnald-

McGinn e Zackai, 2008).

O fenótipo é extremamente variável, sendo as principais características

defeitos cardíacos congênitos (DCC, principalmente conotruncais), anomalias

palatais, hipocalcemia, deficiência imunológica, dificuldade de aprendizagem e

atraso no desenvolvimento (Robin e Shprintzen, 2005; Oh et al., 2007; Siversten

et al., 2007; McDonald-McGinn e Sullivan, 2011). Além disso, os pacientes com

a deleção 22q11.2 frequentemente apresentam alterações psiquiátricas,

principalmente esquizofrenia (Bassett e Chow, 2008; Drew et al., 2011; Williams

et al., 2013).

A microdeleção na banda q11.2 do cromossomo 22 foi descrita em 1992

(Scambler et al., 1992) e a partir desse ano, a técnica de Hibridação in situ por

Fluorescência (FISH – Fluorescence in situ Hybridization) começou a ser

utilizada, de maneira rotineira, para a detecção da deleção em 22q11.2, em

pacientes com suspeita clínica da síndrome (McDonald-McGinn e Sullivan,

2011).

Todavia, mesmo se não houver a detecção da deleção pelo método de

FISH, não se pode excluir a presença de alterações na região 22q11.2, visto que

alguns indivíduos podem apresentar deleções menores ou fora da região de

cobertura da sonda utilizada, as quais são detectadas por técnicas moleculares

com maior resolução (Verhagen et al., 2012; Molck et al., 2013; Bengoa-Alonso

et al., 2016).

As técnicas baseadas em arrays, embora mais dispendiosas, trazem a

vantagem de identificar deleções típicas e atípicas com a mesma confiança e,

ainda, outros desequilíbrios cromossômicos em qualquer região do genoma, em

um único experimento.

A aplicação das técnicas de arrays em indivíduos com suspeita clínica da

S. Del 22q11.2, porém sem a deleção em 22q11.2, auxilia na identificação de

23

desequilíbrios genômicos relacionados ao fenótipo, fora da região 22q11.2,

permitindo a conclusão diagnóstica e o aconselhamento genético dos indivíduos

e (ou) suas famílias (Prescott et al., 2005; Busse et al., 2011).

De fato, equilibrar diagnóstico e pesquisa é sempre um desafio. Apesar

das técnicas baseadas em arrays serem mais informativas, sua aplicação em

larga escala em países com menor acesso à tecnologia e (ou) onde o

financiamento da saúde é predominantemente público, depende de articulação

de propostas que visem à aplicação de conhecimento científico em benefício de

um maior contingente populacional.

Neste estudo, considerou-se os aspectos acima citados para abordar a

investigação diagnóstica de indivíduos com suspeita de S. Del 22q11.2.

24

1. Revisão de Literatura

1.1. Síndrome de deleção 22q11.2

A S. Del 22q11.2 também é conhecida por diversos outros nomes:

síndrome de DiGeorge, síndrome Velocardiofacial (SVCF), síndrome de

Sedlačková, síndrome de Cayler, síndrome de Shprintzen e CATCH22 (Robin e

Shprintzen, 2005) todas decorrentes da mesma deleção no cromossomo 22. O

motivo para as diferenças na nomenclatura dessa condição genética é a enorme

heterogeneidade fenotípica observada (Kobrynski e Sullivan, 2007). No entanto,

em um esforço sistemático para padronizar a nomenclatura dessa condição, é

recomendado que os indivíduos que possuem a deleção típica do cromossomo

22, na região q11.2, sejam descritos de acordo com a etiologia genética, isto é,

portador da síndrome de deleção 22q11.2.

1.2. Mecanismo de origem da deleção 22q11.2

Dentre os indivíduos com deleção na região 22q11.2, aproximadamente

90% possuem uma deleção de 3 Mb com pontos de quebra idênticos (Morrow et

al., 1995; Edelmann et al., 1999). Menos de 10% tem deleções menores

alinhadas com os mesmos pontos de quebra proximais, mas um ponto de quebra

distal que abrange somente 1.5 Mb. A região 22q11 apresenta uma grande

frequência de rearranjos de novo devido a uma susceptibilidade que é atribuída

a presença de grandes blocos de DNA repetitivo, as Low Copy Repeats (LCRs),

que compartilham uma grande homologia entre suas sequências (> 96%)

(Shaikh et al., 2000). Sabe-se que existem oito LCRs na região 22q11.2,

denominadas LCRs A-H, sendo a LCR A a mais proximal (Shaikh et al., 2000).

A análise da sequência das LCRs A e D mostrou que elas têm uma sequência

de 250 kb em comum, com 97 – 98% de homologia e devido à grande

similaridade existente entre essas sequências, o pareamento desigual entre elas

na meiose pode levar à deleção típica de 3 Mb que causa a S. Del 22q11.2

(Shaikh et al., 2000).

25

As deleções de 1.5 Mb ocorrem entre as LCRs A-B, que por sua vez

compartilham uma sequência homóloga de 135 kb, favorecendo o

desalinhamento durante a meiose (Shaikh et al., 2000).

A grande maioria dos rearranjos em 22q11.2 são causados pela

recombinação homóloga não alélica (Non Allelic Homologous Recombination -

NAHR) entre as LCRs presentes na região (McDermid e Morrow, 2002) e esse

mecanismo prediz que deleções e duplicações em 22q11.2 poderiam ser

encontradas em números iguais, contudo, deleções são encontradas mais

frequentemente que as duplicações (Shaikh et al., 2007) (Figura 1).

Figura 1: Esquema dos rearranjos resultantes da recombinação homóloga não alélica

intercromossômica e intracromossômica, ocorrendo entra as LCRs presentes na região

22q11.2 (McDonald-McGinn et al., 2015).

As LCRs na região 22q11.2 são maiores, mais complexas e com uma

maior homologia do que quaisquer outras LCRs presentes no genoma

associadas com síndromes de deleção (McDonald-McGinn e Sullivan, 2011).

Provavelmente, por isso a deleção em 22q11.2 é a mais comum entre as

microdeleções encontradas em humanos (Figura 2).

26

Figura 2: LCRs e alguns genes presentes na região 22q11.2, a extensão da deleção

típica (aproximadamente 3 Mb) e da deleção menor (aproximadamente 1.5 Mb) e

localização das sondas de FISH comumente utilizadas N25 e TUPLE1. (Adaptado de

McDonnald-McGinn et al., 2015).

Recentemente Burnside (2015) propôs uma padronização na

nomenclatura das deleções na região 22q11.2, nomeando os tipos de deleções

de acordo com as LCRs envolvidas, seus pontos de quebra e os fenótipos

associados a cada tipo de deleção. De acordo com essa proposta, a deleção

comum de 3 Mb que envolve as LCRs A-D e a deleção menor de 1,5 Mb

envolvendo as LCRs A-B são chamadas de deleções proximais, juntamente com

deleções que abrangem as LCRs A-E e A-F. Enquanto deleções envolvendo as

LCRs B-D e C-D, e que não incluem os genes TBX1 ou HIRA, são denominadas

deleções centrais.

Por sua vez, as deleções distais foram subdivididas em 3 grupos: As de

tipo 1, envolvendo as LCRs C-E, D-E e D-F, além de uma deleção envolvendo

as LCRs B-F (Molck et al., 2013), as deleções do tipo 2 envolvendo as LCRs E-

F, e por último, as deleções do tipo 3, classificadas dessa maneira devido à

deleção dos genes SMARCB1 e INI1, e que envolvem as LCRs D-H, E-H e F-H

(Figura 3).

27

Figura 3: Nomenclatura proposta por Burnside (2015) para deleções na região 22q11.2

(Adaptado de Burnside, 2015).

Em uma minoria dos casos (<5%), indivíduos com o fenótipo da S. Del

22q11.2 podem apresentar outras alterações nesta região, tais como deleções

atípicas ou translocações (Shaikh et al., 2000). Mutações de ponto, deleções ou

duplicações envolvendo apenas éxons ou o gene TBX1 também já foram

relatadas em pacientes com sinais clínicos da síndrome, sem a deleção típica

(Yagi et al., 2003; Chen et al., 2014).

A haploinsuficiência do TBX1 na S. Del 22q11.2 tem sido considerada

responsável pelas anomalias faciais e cardíacas, hipoplasia do timo,

insuficiência velofaríngea com fenda palatal e disfunção da paratireoide com

hipocalcemia (Merscher et al., 2001; Yagi et al., 2003). Além do TBX1, existem

outros 35 genes dentro da região comumente deletada, e atualmente permanece

controverso quais outros genes nesta região contribuem para o fenótipo

(McDonald-McGinn e Sullivan, 2011).

O TBX1 também regula a expressão de vários fatores de transcrição e de

crescimento, incluindo: FGF8, FGF10, PITX2, CHD7, VEFR3, EYA1, WNT5A, e

BMPER, podendo influenciar na patogênese da S. Del 22q11.2 (Scambler, 2000;

Castellanos et al., 2014). Outros genes na região 22q11.2, como HIRA, UFD1L,

28

CRKL também estão sendo relacionados com a patogênese da S. Del 22q11.2

(Scambler, 2000; Emanuel, 2008).

O padrão de herança dessa condição genética foi descrito nos anos 80

como autossômico dominante (Shprintzen et al., 1981; Williams et al., 1985). A

investigação em pais assintomáticos de indivíduos com a deleção estimou que

as deleções eram herdadas em 8 a 28% dos casos (Digilio et al., 1997; Ryan et

al., 1997; McDonald-McGinn et al., 1999). Assim, a maioria das deleções são

mutações de novo. Entretanto, para a realização do aconselhamento genético

nas famílias é imprescindível que se realize a investigação dos genitores. Para

os portadores da deleção o risco de recorrência é 50% (Kobrynski e Sullivan,

2007).

Quanto à origem parental, demonstrou-se que, em indivíduos com a S.

Del 22q11.2, a deleção tem origem materna em 56% das vezes. Contudo a idade

materna não contribui com essa frequência, também não existindo evidências

que relacionem a idade paterna como fator contribuinte (Delio et al., 2013).

1.3. Manifestações clínicas da S. Del 22q11.2

A S. Del 22q11.2 apresenta um espectro clínico extremamente variável e

que acomete diversos órgãos e sistemas.

Os defeitos cardíacos congênitos são a maior causa de morbimortalidade

na S. Del 22q11.2 e estão presentes em aproximadamente 70% dos casos.

Dentre estes, destacam-se as anomalias congênitas conotruncais e, em

especial, comunicação interventricular e interrupção de arco aórtico tipo B,

Tetralogia de Fallot e atresia pulmonar (Digilio et al., 1997; Goldmuntz et al.,

1998; Swillen et al., 2000; Marino et al., 2001; Oh et al., 2007; Siversten et al.,

2007; Shprintzen, 2008; McDonald-McGinn e Sullivan, 2011; Monteiro et al.,

2013).

Imunodeficiência é um dos achados comuns em indivíduos com S. Del

22q11.2 e acredita-se que os efeitos são causados devido a hipoplasia do timo.

Com um espaço limitado dentro do órgão para o desenvolvimento dos linfócitos

T, consequentemente haveria uma diminuição na quantidade de linfócitos T no

sangue periférico (McDonald-McGinn e Sullivan, 2011). De fato, um número

29

diminuído de linfócitos T no sangue periférico é visto em 75-80% de crianças

com a S. Del 22q11.2 (Sullivan et al., 1999; Jawad et al., 2001; Chinen et al.,

2003; Markert et al., 2003).

As anomalias palatais também são muito comuns em pacientes com S.

Del 22q11.2. Essas são encontradas em cerca de 70% dos casos. Embora

inicialmente relatado como um achado comum em crianças com fenda palatal

(Shprintzen et al., 1978), as formas mais comuns de anomalias palatais na S.

Del 22q11.2 são insuficiência velofaríngea e fenda palatal submucosa

(Shprintzen, 1982; McDonald-McGinn et al., 1999; Shprintzen, 2000; Shprintzen,

2005a,b; McDonald-McGinn e Sullivan, 2011). As anomalias palatais contribuem

para problemas na alimentação e qualidade da fala (McDonald-McGinn e

Sullivan, 2011) afetando principalmente recém-nascidos e crianças.

A microcefalia pode estar presente em aproximadamente 50% dos

indivíduos com a S. Del 22q11.2 (Barnea-Goraly et al., 2005; Campbell et al.,

2006).

Problemas de fala e audição são comumente encontrados durante a

infância (Kobrynski e Sullivan, 2007). A audição é muito importante para o

aprendizado da fala. Cerca de 45% tem perda da audição condutiva e 10% dos

pacientes com S. Del 22q11.2 tem perda da audição neurossensorial (Digilio et

al., 1999). A perda da audição condutiva muitas vezes é associada com as

anomalias palatais, entretanto microtia e anotia também são descritas algumas

vezes (Digilio et al., 2009). Problemas na fala incluem defeitos na fonação, no

aprendizado da fala e na compreensão (Golding-Kushner et al., 1985).

As alterações comportamentais da S. Del 22q11.2 incluem transtorno de

hiperatividade e déficit de atenção, pouca capacidade de interação social e

impulsividade (Niklasson et al., 2005; Parissis e Milona, 2005; Antshel et al.,

2006; Lajiness-O’Neill et al., 2006).

Os distúrbios psiquiátricos também estão presentes no espectro

fenotípico da S. Del 22q11.2. Diversos trabalhos foram realizados em adultos

com a síndrome, e cerca de 1/3 dos indivíduos apresentavam distúrbios

psiquiátricos na vida adulta, sendo a maioria deles distúrbios esquizoafetivos e

esquizofrenia (Bassett et al., 2003; Gothelf et al., 2005; Bassett et al., 2008; Jolin

et al. 2009; Drew et al., 2011; McDonald-McGinn e Sullivan, 2011; Williams et

al., 2013).

30

Muitos pacientes podem ter a suspeita da síndrome no período pré-natal,

a partir de características fenotípicas, como, por exemplo, cardiopatias e

hipocalcemia idiopática. A confirmação, contudo, exige teste laboratorial

específico (McDonald-McGinn e Sullivan, 2011).

Dois genes são relacionados por diversos autores como responsáveis por

algumas manifestações psiquiátricas, cognitivas e comportamentais da S. Del

22q11.2. O gene COMT (Catechol-O-methyltransferase), que está localizado na

região tipicamente deletada em 22q11.2 e metaboliza o neurotransmissor

dopamina, sendo expresso em elevados níveis no córtex pré-frontal, e o gene

PRODH (Proline dehydrogenase), também localizado na região 22q11.2 e que

tem função de catalisar a primeira etapa do catabolismo das prolinas (Murphy et

al., 1999; Lawrence et al., 2003; Bish et al., 2006; Gothelf et al., 2007; Raux et

al., 2007).

A variabilidade fenotípica vista na S. Del 22q11.2 ainda não está bem

esclarecida, mas fatores como o tamanho da região deletada e também

polimorfismos em genes que estão dentro dessa região e em outros locais do

genoma podem contribuir para sua ocorrência (Shprintzen, 2008).

O manejo de indivíduos com S. Del 22q11.2 requer uma abordagem com

equipe multidisciplinar, devido ao seu imenso espectro fenotípico. Guias de

manejos apropriados para indivíduos com a S. Del 22q11.2 estão disponíveis

(Bassett et al., 2011; Habel et al., 2014; Fung et al., 2015; Gil-da-Silva-Lopes et

al., 2015). O diagnóstico precoce fornece a melhor oportunidade para monitorar

o prognóstico e otimizar o cuidado do paciente.

31

1.4. Diagnóstico laboratorial da S. Del 22q11.2

Kelley e cols. (1982) descreveram uma monossomia parcial do

cromossomo 22 associada com a síndrome DiGeorge. Foi a primeira descrição

da deleção vista em nível microscópico, por meio do cariótipo com bandamento

G. Por ser uma deleção submicroscópica de 3 Mb, a visualização pelo cariótipo

com bandas G é incomum. Mesmo a utilização do bandamento com alta

resolução revelou que menos de 15% dos pacientes possuem deleções visíveis

na região 22q11.2 (Driscoll et al., 1992). Assim, comparado com outras técnicas,

o uso do cariótipo é pouco eficaz na confirmação diagnóstica da S. Del 22q11.2.

Até o momento, a técnica de FISH é o procedimento de diagnóstico mais

utilizado e acessível, tendo um baixo custo e alta confiabilidade (Shprintzen,

2008; Vieira et al., 2013). Essa técnica tem sido utilizada para detectar a deleção

típica desde 1992 (McDonald-McGinn e Sullivan, 2011). Em um estudo

multicêntrico com mais de 700 indivíduos com deleção em 22q11, a técnica de

FISH viabilizou o diagnóstico em 96,1% dos casos (Poirsier et al., 2015). Apesar

de detectar a deleção mais comum na região 22q11.2, esta técnica é limitada no

sentido de não conseguir identificar desequilíbrios genômicos fora da região

específica da sonda utilizada (normalmente TUPLE1, N25 ou TBX1). Desse

modo, deleções atípicas, que não envolvem a região proximal à LCR A, não são

detectadas, quando se utiliza essas sondas (McDonald-McGinn e Sullivan,

2011).

Diferentes estudos mostram microdeleção em 22q11.2, a partir da

suspeita clínica, em aproximadamente 12% dos pacientes (Kitsiou-Tzeli et al.,

2004; Carmen Montes et al., 2013). Em análise clínica padronizada realizada por

este grupo de pesquisa, observou-se a microdeleção em 22q11.2 em 28% e 35%

dos casos (Sgardioli, 2011; Vieira et al., 2013). Essa diferença na confirmação

da deleção, está relacionada com a abordagem utilizada na triagem dos

pacientes para a realização do exame. Observou-se que, se durante a análise

clínica, indivíduos apresentarem manifestações concomitantes, dentre elas,

dismorfismos faciais, voz anasalada e cardiopatia congênita, há possibilidade de

que esses indivíduos tenham uma confirmação diagnóstica da deleção, e, assim,

o diagnóstico laboratorial deve ser considerado (Fung et al., 2008; Vogels et al.,

32

2014). Outras aberrações cromossômicas, ou mesmo microdeleções em outras

regiões genômicas também podem ser encontradas em pacientes com achados

clínicos sugestivos de S. Del 22q11.2, porém sem esta microdeleção.

Em estudo anterior deste grupo de pesquisa, Monteiro e cols. (2013)

propuseram critérios clínicos que poderiam indicar a necessidade de realização

de testes confirmatórios para a S. Del 22q11.2. Estes critérios foram utilizados

para desenvolvimento de software específico (CranFlow® – BDEL22) com o

objetivo de serem validados, cujo estudo está em curso. Neste, a partir dos

critérios clínicos registrados, é realizado exame de triagem utilizando a técnica

de FISH.

Alternativas à técnica de FISH para a detecção da deleção 22q11.2 têm

sido utilizadas. Entres estas, encontram-se a análise de marcadores polimórficos

de DNA, que podem ser marcadores de DNA microssatélite (Restriction

Fragment Length Polymorphisms - RFLPs) ou polimorfismos de nucleotídeo

único (Single Nucleotide Polymorphism - SNPs) (Pereira et al., 2003; Gioli-

Pereira et al., 2006; Sandrin-Garcia et al., 2007; Rosa et al., 2009) e a utilização

de reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction - PCR) em

tempo real (Weksberg et al., 2005).

Além destas técnicas, uma técnica que têm sido extensivamente utilizada

é a Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), que permite testar

a região 22q11.2 com diferentes sondas, abrangendo todas as LCRs, além de

outras regiões cromossômicas, nas quais deleções e/ou duplicações foram

associadas a pacientes com características clínicas da S. Del 22q11.2

(Fernández et al., 2005). Esta técnica é baseada na PCR e permite a hibridação

simultânea e amplificação por um único par de primers de mais de 40 sondas

diferentes em um mesmo ensaio (Sorensen et al., 2010) sendo uma ferramenta

eficiente, rápida e econômica para a triagem de deleções em pacientes com S.

Del 22q11.2 (Fernández et al., 2005; Jalali et al., 2008). Esta abordagem traz

como vantagem, também, o uso de DNA, excluindo a necessidade de cultura

celular, como na técnica de FISH. Entretanto, sua realização exige aparato

tecnológico para biologia molecular e a reunião de maior número de amostras

para efetuar o experimento, visando reduzir custos. Tratando-se de doença rara,

esses aspectos podem contribuir para a demora na conclusão da investigação

(Vieira et al., 2013).

33

A partir do desenvolvimento e da aplicação da tecnologia de Hibridação

genômica em arrays (aGH), foi possível a identificação e caracterização das

deleções na região 22q11.2, assim como a análise de outras regiões

cromossômicas. O uso desta técnica revelou 15 a 30% de deleções atípicas na

região 22q11.2 (McDonald-McGinn e Sullivan, 2011). Esta tecnologia aumenta a

resolução e a capacidade de detectar variações no número de cópias genômicas

comparadas com os métodos citogenéticos convencionais, e permite uma rápida

triagem de desequilíbrios genômicos submicroscópicos (Brunet et al., 2009).

A técnica de aGH necessita da utilização de equipamentos complexos e

insumos laboratoriais mais onerosos, o que ainda limita seu uso em larga escala

no Brasil. Entretanto, esta e outras técnicas citadas estão disponíveis na rede

privada e planos de saúde, regulamentados pela Agência Nacional de Saúde,

além de incluídas nos procedimentos de atenção às pessoas com doenças raras

no SUS, e codificada dentro da portaria 199 de 30 de janeiro de 2014, ainda não

implantada.

Embora em grandes serviços o tempo para o resultado de aGH seja

comparável ao FISH, esta ainda não é uma realidade de países em

desenvolvimento (Jehee et al., 2011).

Outras aberrações cromossômicas, ou mesmo microdeleções em outras

regiões genômicas também podem ser encontradas em pacientes com achados

clínicos sugestivos de S. Del 22q11.2, porém sem esta microdeleção. Diferentes

trabalhos encontraram outras aberrações cromossômicas em 1,7% a 3,7% dos

pacientes (Smith et al., 2002; Brunet et al., 2006; Fernandez et al., 2008,

Sgardioli, 2011). Microdeleções em 10p14-15, 4q34 e 17p13.3 já foram

encontradas em pacientes com fenótipo sugestivo de S. Del 22q11.2 (Greenberg

et al., 1988; Tsai et al., 1999; Lindstrand et al., 2010).

Quatro diferentes trabalhos que investigaram desequilíbrios genômicos,

por meio da técnica de hibridação genômica em arrays, em pequenos grupos de

pacientes com características clínicas da S. Del. 22q11.2, sem deleção em

22q11 detectada pela técnica de FISH, encontraram alterações em 1q21.1,

1q43, 5q11.2, 5q35, 7p22.1, 7q36.2, 6p24, 9p24, 16p11.2, 19p13.3 e deleção

distal em 22q11. No total, foram encontradas alterações em 10 de 52 pacientes

estudados (Prescott et al., 2005; Tokuyasu et al., 2007; Brunet et al., 2009; Busse

et al., 2011).

34

1.5. S. Del 22q11.2 e o Projeto Crânio-Face Brasil

Em 2003, foi criado o Projeto Crânio-Face Brasil (PCFB), motivado pela

grande importância e prevalência de anomalias craniofaciais, além da falta de

informação sistematizada nessa área no Brasil. Dentro das anomalias

craniofaciais, as anomalias palatais são frequentes e a S. Del 22q11.2, destaca-

se entre as etiologias de fendas de palato. Nesse contexto, desde sua criação,

o PCFB desenvolveu diferentes estudos visando diagnóstico mais efetivo, além

do cuidado com os indivíduos portadores dessa condição clínica.

Com o objetivo de investigar as possíveis causas genéticas em pacientes

com fenótipo da S. Del 22q11.2, Sgardioli (2011) utilizou a associação de

diferentes abordagens técnicas na investigação de 109 indivíduos: avaliação

clínica padronizada, cariótipo, FISH, MLPA e sequenciamento dos genes TBX1

e FGF8. Neste estudo, obteve-se conclusão diagnóstica em 42,1% dos

indivíduos.

Contribuindo também com estratégias para um diagnóstico mais preciso

de pacientes com suspeita de S. Del 22q11.2, 100 indivíduos com alterações no

palato foram investigados através de exames de cariótipo, FISH e MLPA, sendo

que em 38% foi possível a confirmação diagnóstica (Vieira et al., 2013). Além

disso, um conjunto de orientações para a investigação de pacientes com

diferentes manifestações da S. Del 22q11.2 foi proposto para maximizar as

chances de estabelecer um diagnóstico mais preciso da deleção em 22q11.2

(Monteiro et al., 2013). Para validar esta estratégia, o PCFB desenvolveu a

aplicação CranFlow® - Craniofacial anomalies: Flow, registration and

management of cases. Esta aplicação baseada na web registra dados clínicos

evolutivos e genéticos de pacientes e familiares com defeitos craniofaciais

participantes da Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais, que inclui diretório

específico para S. Del 22q11.2.

A investigação de deleções atípicas e de variações no número de cópias

(Copy number variations – CNV) em regiões genômicas fora da região 22q11.2,

levou a outro estudo do PCFB. Molck (2015) investigou 78 indivíduos com

suspeita de S. Del 22q11.2 e cardiopatia congênita, além de 30 pacientes com

deleção em 22q11.2, por meio da técnica de aGH. Esse trabalho permitiu a

35

detecção de CNVs potencialmente relevantes fora da região 22q11.2 em

pacientes com a deleção 22q11.2, além de identificar CNVs potencialmente

relevantes já descritas em síndromes de anomalias múltiplas, nos indivíduos

onde a deleção em 22q11.2 não foi detectada.

Em vista da relevância clínica e epidemiológica da S. Del 22q11.2, sua

variabilidade fenotípica, que se sobrepõe a outras condições geneticamente

determinadas, as técnicas laboratoriais disponíveis, assim como suas

possibilidades diagnósticas e limitações, este estudo, inserido no PCFB,

contribuiu para a investigação de indivíduos com hipótese diagnóstica desta

condição clínica.

36

2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

Identificar e caracterizar desequilíbrios genômicos em pacientes

com hipótese diagnóstica da S. Del 22q11.2.

2.2. Objetivos específicos

Caracterizar os pontos de quebra e realizar correlação genótipo-

fenótipo em indivíduos com deleção em 22q11.2.

Comparar outras CNVs no genoma dos pacientes com deleção em

22q11.2 e um grupo de indivíduos controle.

Identificar desequilíbrios genômicos em pacientes em que a

deleção 22q11.2 não foi detectada.

37

3. Casuística e Métodos

3.1. Aspectos éticos

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade

de Ciências Médicas da UNICAMP, sob CAAE nº. 16525913.1.0000.5404

(Anexo I). O termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) foi assinado pelo

participante ou por seu responsável (Anexo II).

3.2. Casuística

Para a caracterização dos pontos de quebra, correlação genótipo-fenótipo

e a comparação de outras CNVs no genoma, além da deleção 22q11.2, foram

incluídos 27 indivíduos com deleção típica de aproximadamente 3 Mb em

22q11.2, previamente investigados com o chip CytoScan HD (Affymetrix®) em

um estudo anterior desse grupo de pesquisa (Molck, 2015).

Para a investigação dos desequilíbrios genômicos, foram incluídos 32

novos indivíduos, com a suspeita clínica de S. Del 22q11.2, nos quais a deleção

em 22q11.2 não foi identificada por meio da técnica de FISH ou MLPA. Todos

os indivíduos são oriundos de centros participantes do PCFB, e tiveram

avaliação dismorfológica padronizada realizada por médicos geneticistas.

Os indivíduos investigados foram registrados na Base de Dados de S.

Deleção 22q11.2, vinculada ao Projeto Crânio-Face Brasil e são acompanhados

em diferentes serviços de referência em genética e /ou anomalias craniofaciais.

Assim, tanto o registro quanto a coleta de material biológico obedeceram a rotina

de consultas padrão, assim como a comunicação dos resultados. Portanto, era

esperado que o processo de investigação e conclusão diagnóstica poderia se

prolongar para além do tempo estabelecido para este estudo.

Os centros participantes do PCFB que contribuíram nesse estudo foram:

38

Serviço de Genética Médica – Depto. de Genética Médica da

FCM/UNICAMP (Campinas-SP). Responsável: Profa. Dra. Vera Lúcia Gil

da Silva Lopes.

Centrinho Prefeito Luiz Gomes (Joinville - SC). Responsáveis: Fga. Ana

Carolina Xavier e Dr. Rômulo Moumbach.

Serviço de Genética da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto

– Hospital de Base – FAMERP (São José do Rio Preto - SP).

Responsável: Profa. Dra. Agnes Cristina Fett Conte

Serviço Ambulatorial da APAE, São Paulo- SP. Responsável: Dra. Fabíola

Paoli Monteiro

Centro de Atendimento Integral ao Fissurado Labiopalatal - CAIF (Curitiba

- PR). Responsável: Dra. Josiane de Souza (Atualmente, Dra. Elaine

Lustosa Mendes)

Serviço de Genética Perinatal – CAISM – UNICAMP (Campinas - SP).

Responsável: Dra. Carolina Araújo Moreno.

3.3. Métodos

3.3.1. Caracterização dos pontos de quebra e correlação genótipo-

fenótipo em indivíduos com deleção em 22q11.2

A análise refinada da região dos pontos de quebra foi realizada por meio

do software Chromosome Analysis Suite (versão 3.1.0.15) (ChAS) e os genes

presentes nos intervalos proximais e distais foram investigados em base de

dados quanto a sua função, expressão e sinais clínicos associados. Utilizou-se

o UCSC genome browser (GRCh37/hg19) com as seguintes bases de dados

configuradas dentro do UCSC: Clinical Genome Resource (ClinGen), Database

of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans (DECIPHER), Database

of Genomic Variants (DGV), Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), além

de revisão de literatura específica para cada gene.

A correlação genótipo-fenótipo foi efetuada agrupando os indivíduos com

base na diferença de tamanho entre os pontos de quebra distais e proximais.

Dois grupos foram separados com base na diferença dos pontos de quebra

39

distais e dois grupos com base nos pontos de quebra proximais, permitindo a

comparação entre os fenótipos de indivíduos com pontos de quebra distintos.

Para a comparação dos resultados obtidos após o agrupamento dos indivíduos,

foi empregada como metodologia estatística os testes Qui-Quadrado ou exato

de Fisher, com o nível de significância adotado de 5%.

3.3.2. Comparação das CNVs no genoma dos pacientes com deleção

22q11.2 e um grupo de indivíduos controle.

Além da deleção 22q11.2, outras CNVs presentes no genoma desses

indivíduos foram investigadas nessa etapa, que foi realizada por meio do

software ChAS. Para isso, não foi utilizado nenhum filtro de tamanho das CNVs,

e como recomendação da Affymetrix® para a detecção de CNVs com pouco

risco de resultados falso-positivos, o número mínimo de marcadores

consecutivos alterados foi limitado para 25, no caso de deleção, e de 50 no caso

de duplicação. Sendo assim, todas as CNVs que possuíssem o mínimo de

marcadores, para uma análise confiável, foram consideradas na análise,

independente do tamanho. As CNVs encontradas no genoma dos 27 pacientes

com deleção em 22q11.2, foram comparadas com 112 indivíduos controle da

população brasileira, provenientes de um consórcio de pesquisadores da

FCM/UNICAMP, além da comparação com dados disponíveis no Database of

Genomic Variants (DGV) e no aDGV, uma base de dados de variantes

genômicas da Affymetrix®, incluída no software ChAS.

3.3.3. Identificação dos desequilíbrios genômicos em pacientes

negativos para a deleção 22q11.2

Todos os indivíduos foram previamente testados pelas técnicas de FISH

utilizando a sonda DiGeorge/VCFS TUPLE1 + 22q13.3 Deletion Probe

Combination (Cytocell Aquarius®) e/ou MLPA, utilizando o kit P250-B2 DiGeorge

(MRC-Holland MLPA).

40

3.3.3.1. Coleta e processamento inicial das amostras

Para a extração de DNA genômico, foram coletados de 8 a 12 mL de

sangue periférico em tubos contendo como anti-coagulante EDTA a 10%

(etilenediaminotetracetato dissódico 2H2O) com pH 8,0.

Este processo foi executado nos serviços participantes do PCFB e

enviados via transportadora ao Laboratório de Citogenética Humana e

Citogenômica da FCM/UNICAMP.

3.3.3.2. Extração de DNA genômico

A extração do DNA genômico foi realizada utilizando o kit

NucleospinBlood XL (Macherey-Nagel) com pequenas modificações.

Em um tubo tipo Falcon de 50 mL foram adicionados até 10 mL de sangue

total, 500 μL de proteinase K e 10 mL do tampão de lise, seguido de agitação

utilizando um agitador de tubos (vórtex) em alta velocidade durante 15 segundos.

Após, os tubos foram incubados em banho-maria (56ºC) por um período de

aproximadamente 20 minutos. Depois do tempo de incubação, os tubos foram

deixados em temperatura ambiente por um período de 10 a 15 minutos. Em

seguida foram adicionados 10 mL de etanol absoluto (Merck) e os tubos foram

invertidos por 10 vezes. Após essa etapa, 15 mL dessa amostra foram

transferidos para um novo tubo com uma coluna coletora, seguido de

centrifugação por 3 minutos a 3600 rpm. Após essa primeira centrifugação, mais

15 mL da amostra foram adicionados ao mesmo tubo com a coluna coletora,

seguido de centrifugação por 5 minutos a 3600 rpm. O material que sobrou no

fundo da coluna foi descartado, e, em seguida foram adicionados 7,5 mL de

tampão de lavagem, seguido de centrifugação por 2 minutos a 3600 rpm.

Novamente, 7,5 ml de tampão de lavagem foram adicionados, seguidos de

centrifugação por 10 minutos a 3600 rpm. A coluna, então, foi transferida para

um novo tubo, e aproximadamente 500 μL de tampão de eluição, pré-aquecido

à 70ºC, foram adicionados diretamente na coluna. Esse tubo ficou em

temperatura ambiente por cerca de 2 minutos, seguido de centrifugação por 2

41

minutos a 3600 rpm. Após essa última etapa, o DNA foi transferido para um

criotubo de 1 mL e armazenado em freezer a -20ºC.

3.3.3.3. Técnica de Hibridação genômica em arrays (aGH)

A técnica de aGH foi realizada utilizando a plataforma GeneChip System

CytoScan HD™ ou 750K™ (Affymetrix®) e o kit de reagentes compatível

(Affymetrix®). O chip CytoScan HD™ (Affymetrix®) contém mais de 2.6 milhões

de marcadores polimórficos e não polimórficos. Essas sondas de

oligonucleotídeos fornecem uma ampla cobertura do genoma, com um

espaçamento médio de aproximadamente 1 kb em regiões gênicas e não

gênicas, 880 pb nos genes RefSeq e 659 pb nos genes OMIM, permitindo a

detecção de alterações estruturais, como deleções ou duplicações, ao longo de

todo o genoma. O chip CytoScan 750k™ (Affymetrix®) contém cerca de 750 mil

marcadores polimórficos e não polimórficos, com um espaçamento médio de 4

kb na extensão total do genoma, 36 kb nos genes RefSeq e 3,4 kb nos genes

OMIM.

Preparação das amostras: As amostras foram quantificadas no

espectrofotômetro EPOCH™ (BioTeK®) e os seguintes parâmetros foram

analisados: comprimentos de onda A260/A280, A260/A230 e A320, além do

valor correspondente à concentração do DNA (ng/μL). Os valores esperados

para esses padrões foram: A260/A280: 1,8 – 2,0; A260/A230: > 1,1; A320: < 0,1;

e a concentração do DNA foi esperada acima de 50 ng/μL. Amostras com valores

fora do normal eram purificadas, na tentativa de obter valores dentro dos padrões

esperados. Esse DNA foi submetido a um gel de agarose a 1%, a fim de avaliar

a sua integridade. Em seguida, as amostras foram diluídas para uma

concentração final de 50 ng/μL e um volume de 15 μL.

Digestão: Primeiramente foram adicionados 5 μL de DNA genômico em

uma placa de 96 poços. Como controle positivo, foram adicionados 5 μL de um

DNA genômico de referência (contido no kit), e como controle negativo 5 μL de

tampão TE low EDTA. Preparou-se o mix de digestão contendo (por amostra):

11,55 μL de água livre de nuclease, 2 μL do tampão da enzima Nsp I, 0,2 μL de

100x BSA e 1 μL da enzima Nsp I. O mix foi colocado no vórtex, na

42

microcentrífuga para um spin, e então com uma pipeta monocanal, foram

distribuídos 14,75 μL em cada poço contendo as amostras de DNA genômico,

totalizando 19,75 μL em cada poço. A placa então foi selada, colocada no vórtex

por três vezes e centrifugada por 1 minuto a 2000 rpm. Em seguida, a reação foi

incubada em um termociclador nas seguintes condições: 37ºC – 2 horas, 65ºC –

20 minutos e 4ºC indefinidamente. Nessa etapa a enzima Nsp I faz a digestão

do DNA em fragmentos de diversos tamanhos, deixando uma extremidade livre

de 4 pb de comprimento em cada um desses fragmentos.

Ligação: Preparou-se um mix de ligação contendo os seguintes

reagentes: 2,5 μL do tampão da enzima T4 DNA ligase, 0,75 uL do adaptador da

Nsp I e 2 μL da enzima T4 DNA ligase. Esse mix foi colocado no vórtex por três

vezes, seguido de um spin. Em seguida, 5,25 μL desse mix de ligação foram

adicionados às amostras digeridas pela enzima Nsp I na etapa de digestão,

totalizando 25 μL em cada poço. Após a adição do mix, a placa foi selada,

colocada no vórtex por três vezes e centrifugada por 1 minuto a 2000 rpm. Em

seguida, a reação foi incubada em um termociclador nas seguintes condições:

16ºC – 3 horas, 70ºC – 20 minutos e 4ºC indefinidamente. Ao final dessa etapa,

devido a ação da enzima T4 DNA ligase, os adaptadores específicos se ligaram

as extremidades livres de 4 pb deixados pela Nsp I, finalizando a ligação.

Amplificação por PCR: Após o término da ligação, as amostras foram

diluídas em 75 μL de água livre de nuclease, totalizando 100 μL em cada poço.

A placa foi selada, colocada no vórtex por três vezes e centrifugada durante 1

minuto a 2000 rpm. Em seguida, alíquotas de 10 μL foram transferidas para outra

placa de 96 poços, em quadruplicata, para a amplificação por PCR. O mix da

PCR foi preparado utilizando os seguintes reagentes: 39,5 μL de água livre de

nuclease, 10 μL de tampão da enzima Taq DNA polimerase TITANIUM, 20 μL

de reagente GC – Melt, 14 μL de dNTP, 4,5 μL do primer 002 e 2 μL da enzima

Taq DNA polimerase TITANIUM. Esse mix foi colocado no vórtex por três vezes,

e 90 μL foram adicionados aos poços contendo as alíquotas provenientes da

ligação. A placa foi selada, colocada no vórtex por três vezes e centrifugada por

1 minuto a 2000 rpm. Em seguida, a reação foi incubada em um termociclador

nas seguintes condições: 94 ºC – 3 minutos, 94ºC – 30 segundos (30 ciclos),

60ºC – 45 segundos (30 ciclos), 68ºC – 15 segundos (30 ciclos), 68ºC – 7

minutos e 4ºC indefinidamente.

43

Ponto de verificação 1: Foi realizada a eletroforese em gel de agarose a

2% para a verificar se todas as etapas anteriores ocorreram corretamente. Para

o gel de agarose foi utilizado um tampão de amostra 6X DNA Loading Dye, e

como marcador, GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder. Os fragmentos

amplificados pela PCR deveriam estar entre 150 e 2000 pb.

Purificação do produto da PCR: Nesta etapa, o controle negativo foi

descartado. Assim, as quatro alíquotas amplificadas de cada amostra, foram

colocadas juntas em um microtubo de 1,5 mL. Em seguida, 720 μL de Purification

beads foram adicionadas em cada amostra, sendo invertidas durante dez vezes

e deixadas em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação em

temperatura ambiente, os tubos foram centrifugados por três minutos a 16.100

rcf e transferidos para um suporte magnético (MagnaRack™ Life Technologies).

A partir do momento em que os tubos foram colocados no suporte, as beads

magnéticas se acoplaram ao DNA sendo atraídos pelo imã do suporte,

permitindo o descarte do sobrenadante. Após isso, foram adicionados 1 mL de

tampão de lavagem em cada amostra, e os tubos foram colocados em um

suporte no vórtex, na velocidade máxima, durante 2 minutos. Em seguida, os

tubos foram centrifugados por 3 minutos a 16.100 rcf e colocados no suporte

magnético novamente. O sobrenadante foi descartado e os tubos novamente

foram centrifugados por 30 segundos a 16.100 rcf. Ao final, o sobrenadante foi

descartado e os tubos foram deixados em temperatura ambiente durante 10

minutos, com as tampas abertas, de modo que qualquer resíduo do tampão de

lavagem pudesse evaporar por completo. Após a evaporação completa, foram

adicionados 52 μL de tampão de eluição diretamente nas amostras. Os tubos

foram fechados, e colocados em um suporte do vórtex, na velocidade máxima

durante 10 minutos. Em seguida, esses tubos foram centrifugados por 3 minutos

a 16.100 rcf. Concluída a centrifugação, os tubos foram colocados novamente

no suporte magnético durante 10 minutos, até que todas as beads magnéticas

aderissem à parede do tubo. O volume de 47 μL da amostra eluída foi transferido

para uma nova placa de 96 poços. Essa placa foi selada, colocada no vórtex por

três vezes e centrifugada por 1 minuto a 2000 rpm.

Ponto de verificação 2: Os produtos purificados da PCR (2 μL) foram

quantificados no espectrofotômetro (EPOCH) e os seguintes padrões foram

44

observados: Concentração: ≥ 300 ng/μL; Razão A260/A280 entre 1,8 – 2,0 e

Razão A320 < 0,1.

Fragmentação: Antes de começar essa etapa, a centrífuga foi colocada

na temperatura de 4ºC. O mix da fragmentação foi preparado utilizando os

seguintes reagentes: 271,2 μl de água livre de nuclease, 343,8 μL de tampão de

fragmentação e 4,8 μL da enzima DNAse I (na concentração de 2,5 U/μL).

Depois, o mix foi colocado no vórtex por três vezes, e 10 μL do mix da

fragmentação foram adicionados aos poços contendo o produto da PCR

purificado, totalizando 55 μL. A placa foi selada, colocada mais uma vez no

vórtex por três vezes e centrifugada por 1 minuto a 2000 rpm. Em seguida, a

reação foi incubada em um termociclador nas seguintes condições: 37ºC – 35

minutos, 95ºC – 15 minutos e 4ºC indefinidamente.

Ponto de verificação 3: Foi realizada a eletroforese em gel de agarose a

3% para verificar se a etapa de fragmentação ocorreu corretamente. Para o gel

de agarose foi utilizado o tampão de amostra 6X DNA Loading Dye, e como

marcador, GeneRuler Ultra Low Range DNA ladder. Os fragmentos da reação

de fragmentação devem conter fragmentos entre 25 a 125 pb.

Pré-marcação: O mix de pré-marcação foi preparado utilizando os

seguintes reagentes: 14 μL de tampão da TdT, 2 μL do reagente de marcação

do DNA e 3,5 μL da enzima TdT. Em seguida o mix foi colocado no vórtex por

três vezes. Com uma pipeta monocanal, 19,5 μL do mix de pré-marcação foram

adicionados à placa contendo o DNA fragmentado, totalizando 70,5 μL. A placa

foi selada, colocada no vórtex por três vezes e centrifugada por 1 minuto a 2000

rpm. Em seguida, a reação foi incubada em um termociclador nas seguintes

condições: 37ºC – 4 horas, 95ºC – 15 minutos e 4ºC indefinidamente.

Hibridação: Antes de começar a etapa de hibridação, os chips utilizados,

CytoScan HD™ ou 750K™, foram retirados da geladeira e colocados em

temperatura ambiente. O mix da hibridação foi preparado utilizando os seguintes

reagentes: 165 μL do tampão de hibridação 1, 15 μL do tampão de hibridação 2,

7 μL do tampão de hibridação 3, 1 μL do tampão de hibridação 4 e 2 μL do

reagente oligo control 0100. Após a adição de todos reagentes, o mix foi

colocado no vórtex por três vezes. Em seguida, 190 μL foram adicionados em

cada poço contendo as amostras pré-marcadas. A placa foi selada, colocada no

vórtex por três vezes e centrifugada por 1 minuto a 2000 rpm. Em seguida a

45

reação foi incubada em um termociclador nas seguintes condições: 95ºC – 10

minutos e 49ºC indefinidamente. Com as amostras a 49ºC e dentro do

termociclador, foram adicionados 200 μL de cada amostra em seu respectivo

chip. Os septos foram vedados com adesivo e imediatamente os chips foram

levados ao forno de hibridação (GeneChip® Hybridization Oven 640; Affymetrix

Inc) onde permaneceram por um período de 16 horas a 50ºC e 60 rpm.

Lavagem e marcação: Previamente à lavagem, tampões de coloração 1 e

2 e o tampão de array (Array Holding Buffer) foram aliquotados em respectivos

microtubos de 1,5 mL. Cada conjunto de três tubos contendo os reagentes

citados correspondia a um chip, sendo posicionados na parte frontal da estação

de lavagem. Após as 16 horas de hibridação no forno, o conteúdo que havia sido

adicionado ao chip foi transferido novamente para a placa, sendo substituído por

200 μL de tampão de array. Em seguida, os chips foram colocados na estação

de lavagem (GeneChip® Fluidics Station 450; Affymetrix Inc.), sendo quatro de

cada vez. Na estação de lavagem foram executados dois passos: a remoção do

excesso de marcador e a coloração. Para isso, dois recipientes contendo os

tampões de lavagem A e B e outro recipiente contendo água estéril foram

posicionados na parte lateral da estação de lavagem. Após esses

procedimentos, foi iniciada a execução automática das etapas de lavagem e

coloração dos chips CytoScan.

Escaneamento: Ao término da lavagem, os chips foram colocados no

equipamento GeneChip® Scanner 3.000 7G para iniciar o escaneamento dos

mesmos. São utilizados programas específicos para a captação de imagem

gerada por cada chip analisado. Essa imagem pode ser observada com o

programa de visualização GeneChip® Operating software (GCOS) (Affymetrix®)

o qual permite verificar o padrão de sondas controle do sistema, que estão

dispostas nas extremidades e no centro de cada chip, através disso pode-se

confirmar se a hibridação dos arrays ocorreu de forma adequada.

46

3.3.3.4. Análise dos dados gerados pela técnica de aGH

A partir dos dados gerados pelo array, as CNVs foram determinadas

através do software ChAS (Chromosome Analysis Suite), onde a estimativa do

número de cópias é baseada no cálculo do algoritmo Hidden Markov Model

(HMM), além da confirmação do sexo de cada indivíduo por meio do algoritmo

Y-Gender.

Os dados foram visualizados no ChAS em formas de gráficos e tabelas,

onde foi possível observar cada CNV encontrada, e todas as informações

referentes a cada uma, permitindo determinar a localização genômica, CNstate

(CN), que se refere a informação do número de cópias de cada segmento, onde

para uma cópia diploide o CN=2, para deleções o CN<2 (CN=1 perda de uma

cópia, CN=0 perda de duas cópias) e para duplicações o CN>2 (CN=3 ganho de

uma cópia, CN=4 ganho de duas cópias), o tamanho da CNV e os genes

incluídos na região, e se esses genes estão presentes no OMIM (Online

Mendelian Inheritance in Man), além dos gráficos log2ratio, weighted log2 e o

allele peaks. Para a avaliação da qualidade desses dados gerados pelo

experimento de aGH, três parâmetros de qualidades (SNPQC - Single

Nucleotide Polymorphism Quality Control; MAPD - Median Absolute Pairwise

Difference; WavinessSD - Waviness Standard Deviation) recomendados pelo

fabricante, também foram visualizados na interface do ChAS, e indicaram se

esses dados foram confiáveis ou não para a análise do número de cópias.

SNPQC: É um parâmetro que fornece informações sobre a qualidade do

experimento, a partir dos dados gerados pela análise de SNPs. A estimativa da

distribuição dos alelos em homozigose (AA ou BB) e em heterozigose (AB) é

realizada calculando a distância entre eles. Desse modo, quanto melhor for a

separação dessas distribuições, melhor será a capacidade de identificar o

genótipo com base na sua posição no cluster. Arrays com SNPQC ≥ 15 foram

considerados de alta qualidade.

MAPD: É um parâmetro que mede a variação de curto alcance dos

conjuntos de sondas do array em todo o genoma, representando a mediana da

distribuição das alterações no log2ratio entre sondas adjacentes. Se o gráfico do

log2ratio variar muito, isso diminuirá a qualidade na determinação do número de

47

cópias. Arrays com MAPD ≤ 0,25 são capazes de determinar corretamente o

número de cópias.

WavinessSD: É um parâmetro que mede a variação de longo alcance dos

conjuntos de sondas do array em todo genoma, medindo o desvio padrão do

log2ratio da faixa de variação de grandes segmentos. Arrays com WavinessSD

≤ 0,12 são considerados adequados.

Também há um recurso no ChAS que permite filtrar as variantes com base

no número de marcadores desejados. Como recomendação da Affymetrix® para

evitar a detecção de CNVs com pouco risco de resultados falso-positivos,

considera-se o número de marcadores mínimo de 25, para de deleção, e de 50

para duplicação. Além disso, também no intuito de evitar a detecção de

resultados falso-positivos, dois outros recursos, Smoothed e Joined, foram

verificados. Esses dois recursos podem combinar segmentos de ganhos

adjacentes, com CNstate diferentes, ou também podem unir segmentos de

ganho ou perda, que estão separados por intervalos pequenos, daqueles

segmentos com cópias normais.

Como modelo de referência, foram utilizados os dados disponíveis no

software ChAS. O arquivo modelo de referência do ChAS inclui os dados de

CNVs de 380 indivíduos controle executados como parte de um conjunto de nove

operadores que processaram aproximadamente 48 amostras únicas em duas

rodadas cada, com randomização das amostras de DNA, reagentes e

instrumentos utilizados. A amostra de DNA consistiu em 284 amostras do projeto

HapMap de três grupos étnicos distintos, contendo pelo menos uma réplica de

cada uma das 270 amostras do HapMap (Gibbs et al., 2003): 90 africanos

(Yoruba), 90 asiáticos e 90 caucasianos, derivadas de linhagens celulares

pertencentes ao Instituto de Pesquisa Médica Coriell (Coriell Institute of Medical

Research), e 96 amostras de DNA a partir de sangue de indivíduos saudáveis

pertencentes a companhia BioServe Biotechnologies (BioServe, Beltsville, USA).

O grupo controle de referência da população brasileira, utilizado como

auxílio na interpretação dos resultados, foi montado utilizando dados de CNVs

de arrays realizados com o DNA de 112 indivíduos da população geral brasileira,

obtidos por meio de um consórcio de pesquisadores da FCM/UNICAMP.

Após a verificação dos padrões de qualidade e do cuidado para a não

inserção de CNVs com risco de falso-positivo, todos as CNVs detectadas pelo

48

software ChAS foram interpretadas e classificadas de acordo com o fluxograma

padronizado no Laboratório de Citogenética Humana e Citogenômica da

Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP (Figura 4).

Figura 4: Fluxograma utilizado para a interpretação e classificação das CNVs

encontradas.

Nenhum filtro de tamanho foi delimitado, todas as CNVs com o mínimo de

marcadores necessários foram incluídas na análise. Cada CNV foi interpretada

de modo individual, comparando-a com os indivíduos do grupo controle e do

aDGV, presentes no ChAS, seguido da verificação da presença ou ausência de

genes, além da descrição da CNV em indivíduos com fenótipos normais e

anormais nas seguintes bases de dados:

UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu);

Clinical Genome Resource (ClinGen, http://www.clinicalgenome.org)

Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans

(DECIPHER, https://decipher.sanger.ac.uk);

Database of Genomic Variants (DGV version 1,

http://projects.tcag.ca/variation);

Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM®,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim);

National Center for Biotechnology Information (NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov);

49

3.4. Validação dos resultados

A validação dos resultados ocorreu por meio de técnicas de citogenética

clássica e molecular. As técnicas foram utilizadas de acordo com a necessidade

de cada caso, e incluíram: Cariótipo, FISH e aCGH (array Comparative Genomic

Hybridization).

3.4.1. Cariótipo

Para o exame do cariótipo, foi realizada a cultura de linfócitos baseada na

descrição de Moorhead et al. (1960) com modificações.

Cultura de linfócitos: Foram adicionados 0,5 a 1 mL de sangue total

heparinizado em frascos âmbar de 15 mL contendo: 5 mL de meio de cultura

RPMI-1640 (Gibco) com 20% de soro fetal bovino (Gibco) e 0,015 mL de fito-

hemaglutinina (Gibco), seguido da incubação a 37ºC por 72 horas. Uma hora e

meia antes do término das 72 horas, foram adicionados 0,05 mL de Chromosome

Resolution Additive (CRA). Faltando 30 minutos para o término da incubação,

foram adicionados 0,05 mL de colchicina.

Hipotonia e lavagem: Depois de 72 horas, usando uma solução hipotônica

de KCL 0,075M, foi realizada a hipotonia direta a 37ºC por um período de 1 hora

e 15 minutos. A interrupção da hipotonia foi realizada utilizando 0,5 a 1 mL de

fixador metanol (Merck) e ácido acético (Merck) na proporção de 3:1. Após a

interrupção da hipotonia, o pellet era lavado e centrifugado cerca de 3 a 4 vezes

utilizando fixador na proporção de 3:1.

Preparação das lâminas: As lâminas para microscopia foram mergulhadas

em etanol, e em seguida mergulhadas em água deionizada, escorridas e secas

com papel macio. Após fixação, foram pingadas, com pipetas Pasteur, de três a

quatro a gotas do material sobre as lâminas. Em seguida foram colocadas em

uma estufa na temperatura de aproximadamente 55°C durante alguns minutos e

foram observadas em microscópio de contraste de fase.

Bandamento G: O bandamento foi realizado de acordo com a técnica

descrita por Sanchez et al. (1973), com modificações. As lâminas foram deixadas

em estufa a 60°C por aproximadamente 24 horas e em seguida foram incubadas

50

em tampão fosfato de Sorensen 0,06M pH 6,8 em banho-maria a 37°C por um

período de 10 a 30 minutos. Após a incubação, as lâminas foram coradas com

corante Wright (Merck) diluído em tampão fosfato de Sorensen na proporção de

1:3 por tempo que variou de três a seis minutos.

Análise cromossômica: Foram analisadas ao microscópio óptico comum

20 metáfases de cada indivíduo (por dois analisadores diferentes, sendo que

cada um analisou dez metáfases). A resolução obtida foi de aproximadamente

400/500 bandas. Cerca de duas a três metáfases de cada indivíduo foram

capturadas e cariotipadas utilizando o sistema de cariotipagem BANDView da

Applied Spectral Imaging®.

3.4.2. FISH

Para a realização da técnica de FISH foram utilizadas suspensões

celulares obtidas a partir de cultura de linfócitos.

Preparação e pré-tratamento das lâminas: Pingou-se o material em

lâminas limpas em álcool e estas permaneceram por uma noite em estufa a

37°C. As lâminas foram observadas ao microscópio de contraste de fase para

marcar a área onde seria aplicada a sonda, incubadas em uma solução de 2x

SSC (pH 7,0) a 37º C (+/- 1ºC) durante 20 a 60 minutos e desidratadas em uma

série de etanóis a 70%, 85% e 100% por 1 minuto cada.

Co-desnaturação: Aplicou-se 5 μL da sonda diluída na proporção 1:1, em

tampão de hibridação, sobre a área previamente selecionada da lâmina; cobriu-

se com lamínula de 11x22 mm e selou-se com cola especial. As lâminas foram

colocadas em uma placa aquecida a 75ºC (+/- 1ºC) por 5 a 10 minutos.

Hibridação: As lâminas com a sonda, após desnaturação, foram

colocadas em uma caixa úmida e escura, em estufa a 37°C (+/- 1ºC) por uma

noite.

Pós-hibridação: Removeu-se a lamínula e toda a cola, cuidadosamente;

colocou-se as lâminas em uma solução de 2x SSC/0.1% Tween 20 (pH 7,0) por

2 minutos em temperatura ambiente; a seguir em uma solução de 0,4x SSC a

72ºC (+/-1ºC) (pH 7,0) por 2 minutos; e por fim em uma solução de 2xSSC/0,05%

Tween 20 (pH 7,0) em temperatura ambiente por 30 segundos, sem agitação.

51

Após secarem rapidamente em temperatura ambiente, aplicou-se 8 μL de DAPI

e cobriu-se com uma lamínula de 12x24 mm.

Análise: Foram analisadas 20 metáfases em microscópio de fluorescência

da Olympus® com filtros de fluorescência adequados e as imagens foram

capturadas utilizando o software FISHView da Applied Spectral Imaging®.

3.4.3. aCGH

Para a técnica de aCGH, a plataforma utilizada foi a SurePrint G3 human

CGH array 8x60k (Agilent Technologies), juntamente com o kit de reagentes

compatível (Agilent Technologies). O array 8x60k contém um total de 62.976

sondas, distribuídas por todo genoma, com um espaçamento médio de 40 kb

entre as sondas, permitindo a detecção de CNVs ao longo de toda extensão do

genoma.

Preparo das amostras: Antes do início da técnica, a eletroforese em gel

de agarose a 1% foi realizada, a fim de avaliar a integridade do DNA. Após, os

DNAs utilizados como teste, assim como o DNA controle, masculino e feminino

(contidos no kit), foram quantificados no espectrofotômetro Qubit® (Life

Technologies) e diluídos em TE 1X pH 8,0 para uma concentração final de 35

ng/μL.

Digestão: Foram pipetados 10,1 µL das amostras em tubos 0,2 mL. O mix

de digestão foi preparado, contendo: 17 µL de água livre de nuclease, 22,1 µL

de tampão 10X Restriction Enzime, 1,7 µL de BSA, 4,25 µL da enzima Alu I e

4,25 µL da enzima RSA I. Foram adicionados 2,9 µL do mix em cada tubo das

amostras, completando um volume final de 13 µL. Em seguida, a reação foi

incubada em um termociclador nas seguintes condições: 37ºC – 2 horas, 65ºC –

20 minutos e 4ºC indefinidamente.

Marcação: Após a digestão dos DNAs, foi realizada a marcação dos DNAs

teste e controle com fluoróforos. Foram adicionados às amostras 2,5 µL de

Random Primer e incubadas no termociclador nas seguintes condições: 98ºC –

3 minutos e 4ºC indefinidamente. Em seguida foram preparados dois mixs de

marcação contendo cada um: 85 µL de tampão 5X Reaction, 42,4 µL de 10X

52

dNTPs, 25,5 µL do fluoróforo Cyanine 3-dUTP (Cy3) ou 25,5 µL do fluoróforo

Cyanine 5-sUTP (Cy5) e 8,5 µL da enzima Exo (-) Klenow. Foram adicionados

9,5 µL do mix de marcação em cada amostra, sendo a marcação com Cy3 feita

para os DNAs controle e do Cy5 para os DNAs teste, totalizando um volume de

25 µL. Em seguida as amostras foram incubadas no termociclador nas seguintes

condições: 37ºC – 2 horas, 65 ºC – 10 minutos e 4ºC indefinidamente.

Purificação: As amostras foram purificadas utilizando filtros Amicon

30kDa. Foram adicionados a cada amostra 430 µL de TE 1X (pH 8.0). Em

seguida os DNAs marcados e diluídos foram colocados em colunas com filtros

acopladas a tubos coletores de 2 mL e centrifugados por 10 minutos a 14.000 g.

O produto filtrado foi descartado, e em seguida, adicionou-se 480 µL de TE 1X

(pH 8.0) e centrifugou-se por 10 minutos a 14.000 g. O produto retido na coluna

com os filtros, foi colocado de forma invertida em novo tubo coletor e centrifugado

por 1 minuto a 1.000 g em temperatura ambiente. Em seguida, as amostras

purificadas foram concentradas em um concentrador para um volume final de 9,5

µL.

Quantificação: Foi retirado 1,5 µL de cada amostra para quantificação no

Nanodrop (Thermo Scientific™) utilizando o programa microarray DNA 50.

Foram medidas as absorbâncias: A260nm (DNA), A550nm (Cy3) e A650nm

(Cy5) e em seguida calculado a atividade específica e o rendimento do DNA

marcado:

Atividade específica* = pmol por μL do dye

μg por μL de gDNA

*pmol dyes por μg gDNA

Rendimento (μg) = Concentração do DNA (ng/μL) x Volume da amostra (μL)

1.000 ng/μL

Os valores atingidos deveriam ser:

Rendimento: 3-5 µg

Atividade especifica Cy3 (pmol/µg): 20-25

Atividade especifica Cy5 (pmol/µg): 15-25

53

Após, as amostras controle marcadas com Cy3 e amostras teste

marcadas com Cy5 foram combinadas em novos tubos, totalizando um volume

de 16 µL.

Hibridação: Um mix de hibridação foi preparado contendo os seguintes

reagentes: 17 µL de DNA Cot-1 (1,0 mg/mL), 38,25 µL 10X aCGH Blocking Agent

e 191,25 µL do tampão 2X HI-RPM Hybridization. Foram adicionados 29 µL do

mix em cada tubo contendo o DNA marcado, totalizando um volume de 45 µL.

Em seguida as amostras foram incubadas no termociclador nas seguintes

condições: 98ºC – 3 minutos exatamente e imediatamente a 37 ºC – 30 minutos.

Foram adicionados 40 µL de cada amostra aos poços correspondentes da

lamínula e em seguida a lâmina de array foi posicionada formando um

“sanduíche”, envolvidas por uma câmara própria de hibridação. Esta câmara foi

fechada e colocada na prateleira rotatória do forno de hibridação a 20 rpm por

24 horas em uma temperatura de 67 ºC.

Lavagem: A lâmina de array e a lamínula foram separadas manualmente

e mergulhadas em tampão de lavagem 1 (Agilent Oligo aCGH/ChIP-onChip

Wash Buffer 1) em temperatura ambiente. A lâmina então lavada em tampão de

lavagem 1 por 5 minutos com agitação magnética em temperatura ambiente. Em

seguida, foi lavada em tampão de lavagem 2 (Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-Chip

Wash Buffer 2) por 1 minuto com agitação magnética e a 37ºC. Na última etapa,

foi lavada em acetonitrila por 30 segundos em temperatura ambiente.

Escaneamento: Após as lavagens a lâmina de array foi colocada no

suporte auxiliar SureScan e escaneadas no equipamento Agilent G4900DA

SureScan Microarray Scanner System (Agilent Technologies) utilizando o

protocolo recomendado AgilentG3_CGH.

Análise dos dados gerados: A imagem da lâmina foi gerada através do

software Feature Extraction v.11.5.1.1 (Agilent Technologies). O arquivo gerado

a partir desse software foi utilizado como input para efetuar a análise dos dados

brutos no software CytoGenomics v.3.0.1.1 (Agilent Technologies). Como

método de análise, foi utilizado o método proposto pela empresa, Default

Analysis Method- CGH v2, que considera como confiável o mínimo 3 sondas

subsequentes. Foram considerados 17 parâmetros padrões (QC metrics) na

análise de qualidade dos experimentos e na análise das CNVs. Todas os

54

parâmetros considerados estão disponíveis no manual completo da lâmina

utilizada, disponível no site do fabricante (www.agilent.com) .

4. Resultados

4.1. Caracterização dos pontos de quebra em indivíduos com deleção

em 22q11.2 e correlação genótipo-fenótipo em indivíduos com

deleção em 22q11.2

Nos 27 indivíduos com deleções típicas em 22q11.2, incluídos na

caracterização dos pontos de quebra, o tamanho da deleção variou de 2.549 a

3.271 Mb. Os pontos de quebra da região proximal variaram de 18.644.790 a

18.916.842 e da região distal de 21.465.659 a 21.915.509 (GRCh37/hg19)

(Figura 5).

Figura 5: Ilustração dos pontos de quebra em cada indivíduo com a deleção 22q11.2

típica de ~3 Mb. As barras correspondem ao tamanho da deleção em cada indivíduo. A

linha pontilhada à esquerda corresponde à região proximal variavelmente deletada de

272 kb. A linha pontilhada à direita corresponde à região distal variavelmente deletada

de 449 kb. O intervalo genômico, assim como os genes presentes nessa região

varialvemente deletada estão listados ao lado da respectiva região (GRCh37/hg19).

55

Na região variavelmente deletada dos pontos de quebra proximais, que

abrange 272 kb, estão presentes três genes: USP18, GG3TP e DGCR6, e na

região que compreende os pontos de quebra distais, que abrange 449 kb, estão

presentes 9 genes: BCRP2, FAM230B, POM121L8P, RIMBP3B, RIMBP3C,

HIC2, TMEM191C, PI4KAP2 e UBE2L3. A localização exata de cada gene,

assim como a sua função, expressão e os sinais clínicos associados estão

descritas nas Tabelas 1 e 2.

56

Tabela 1. Genes presentes no intervalo dos pontos de quebra da região proximal e distal da deleção em 22q11.2 (GRCh37/hg19)

Proximal 18.644.790 – 18.916.842

Gene Localização Genômica

(GRCh37/hg19) Nome Função / Expressão Sinais clínicos associados

USP18

18.632.757 – 18.660.162

Ubiquitin specific peptidase 18

Codifica uma proteína que participa do processo de ubiquitinação. Expresso no

Fígado e timo

Pode ter influência na função imune, pois interage diretamente com proteínas envolvidas

na regulação imune1; Leiomiosarcoma2 (modelo animal – camundongo)

GGT3P

18.761.201 – 18.779.474

Gamma-glutamyltransferase 3 pseudogene

Desconhecidas

Desconhecidos

DGCR6

18.893.735 – 18.899.601

DiGeorge syndrome critical region gene 6

Envolvido na migração das células da crista neural, desenvolvimento dos arcos faríngeos e na regulação de outros genes

que causam a síndrome de deleção 22q11.2 distal

Susceptibilidade à esquizofrenia3 (estudo de associação)

Distal 21.465.659 – 21.915.509

BCRP2 21.457.304 – 21.476.575 Breakpoint cluster region

pseudogene 2 Desconhecida Desconhecidos

FAM230B 21.521.192 – 21.546.445 Family with sequence

similarity 230 Desconhecida Desconhecidos

POM121L8P 21.636.713 – 21.652.015 Transmembrane nucleoporin-like 8

pseudogene Desconhecida Desconhecidos

57

RIMBP3B 21.738.039 – 21.743.455

ou 21.899.957 – 21.905.373

RIMS binding protein 3

Expresso quase que exclusivamente nos testículos, no estágio haploide,

desempenhando algum papel na espermatogênese de camundongos.

Envolvido na atividade óxido redutase e em processos metabólicos

Desconhecidos

RIMBP3C 21.737.662 – 21.743.455

ou 21.899.957 – 21.905.750

RIMS binding protein 3

Expresso quase que exclusivamente nos testículos, no estágio haploide,

desempenhando algum papel na espermatogênese de camundongos.

Envolvido na atividade óxido redutase e em processos metabólicos

Desconhecidos

HIC2 21.771.692 – 21.805.750 Hypermethylated in cancer 2 Codifica um fator de transcrição

relacionado ao gene HIC1 Cardiopatia congênita4 (modelo animal –

camundongo)

TMEM191C 21.821.458 – 21.824.224 Transmembrane protein

191C Desconhecida Desconhecidos

PI4KAP2 21.827.286 – 21.871.780 Phosphatidylinositol 4-kinase

Alpha pseudogene 2

Catalisa a reação 1-phosphatidyl-1D-myo-inositol + ATP = 1-phosphatidyl-1D-myo-

inositol 4 phosphate + ADP + 2H (+). Desconhecidos

UBE2L3 21.903.735 – 21.978.323 Ubiquitin-conjugating-

enzyme E2L3 Envolvido em processos de ubiquitinação Desconhecidos

Chen et al., 20111; Chinyengetere et al., 20152; Liu et al., 20023; Dykes et al., 20144

58

Tabela 2. Sinais clínicos associados em cada indivíduo com deleção em 22q11.2

Indivíduo Deleção 22q11.2

Sinais clínicos associados Início Fim

1 18.648.866 21.915.509 CIV, estenose pulmonar, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, dismorfismos faciais, RDNPM, dificuldade de aprendizagem, hipoacusia condutiva, ectasia piélia a esquerda, polidactilia e sindactilia (mãos e pés)

2 18.916.842 21.800.797 Tetralogia de Fallot com estenose pulmonar, dismorfismos faciais, escroto em cachecol, pênis embutido

3 18.644.790 21.798.907 Tetralogia de Fallot com estenose pulmonar, persistência do canal arterial, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, dismorfismos faciais, hipotireoidismo, RDNPM, escoliose, dedos afilados, aumento da distância 1os e 2os artelhos

4 18.916.842 21.798.907 CIA, CIV, interrupção de arco aórtico, palato assimétrico, voz anasalada, dismorfismos faciais, RDNPM, RGE, polegares e háluces alargados, háluces valgos, sobreposição 2os e 3os artelhos

5 18.644.790 21.800.797 CIV, arco aórtico à direita, hipoplasia de artéria pulmonar, dismorfismos faciais, pneumonias de repetição, RDNPM, dificuldade de aprendizagem,

6 18.644.790 21.465.659 CIA, úvula bífida, voz anasalada, dismorfismos faciais, imunodeficiência, RDNPM, distúrbios psiquiátricos, dificuldade de aprendizagem, hipoacusia condutiva, esplenomegalia discreta, RGE, escoliose

7 18.644.790 21.800.797 Tetralogia de Fallot, interrupção de arco aórtico, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, dismorfismos faciais, dificuldade de aprendizagem, hipoacusia neurossensorial, falange distal de ambos quilodáctilos imóveis

8 18.644.790 21.804.716 Interrupção de arco aórtico, arco aórtico à direita, hipocalcemia secundária a hipoparatireoidismo (paciente faleceu no período neonatal)

9 18.644.790 21.800.797 CIV, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, dismorfismos faciais, infecções de repetição, RDNPM, dificuldade de aprendizagem, impulsividade, baixa estatura, agenesia renal esquerda, RGE, lordose e cifose

10 18.916.842 21.465.659 CIV, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, dismorfismos faciais, infecções de repetição, RDNPM, dificuldade de aprendizagem, baixa estatura, refluxo urinário grave, RGE, lordose e cifose

11 18.644.790 21.800.797 CIA, úvula bífida, voz anasalada, disfagia, dismorfismos faciais, microcefalia, atraso motor e de comportamento, dificuldade de aprendizagem, baixa estatura, hipoacusia neurossensorial, RGE

12 18.916.842 21.465.659 CIA, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, palato alto, dismorfismos faciais, RDNPM, dificuldade de aprendizagem, baixa estatura,

13 18.916.842 21.800.797 CIV, dismorfismos faciais, infecções de repetição, RDNPM, alterações neurológicas, hérnia umbilical

14 18.916.842 21.465.659 Interrupção de arco aórtico, dismorfismos faciais, microcefalia, imunodeficiência, ausência de timo, RDNPM, baixa estatura,

15 18.644.790 21.800.797 CIV, fenda palatal submucosa, dismorfismos faciais, microcefalia, infecções de repetição, atraso de linguagem, dificuldade de aprendizagem, hipoacusia condutiva,

59

16 18.644.790 21.798.907 Tetralogia de Fallot, fenda palatal submucosa, orelhas baixas e dismórficas, atraso de linguagem,

17 18.916.842 21.465.659 CIV, insuficiência velofaríngea, dismorfismos faciais, otites de repetição, RDNPM, dificuldade de aprendizagem, hipoacusia condutiva, RGE

18 18.916.842 21.798.907 CIA, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, dismorfismos faciais, microcefalia, RDNPM, dificuldade de aprendizagem, baixa estatura

19 18.916.842 21.800.797 CIV, fenda palatal submucosa, dismorfismos faciais, infecções de repetição, atraso de linguagem,

20 18.644.790 21.915.509 CIV, insuficiência velofaríngea, dismorfismos faciais, infecções de repetição, RDNPM,

21 18.916.842 21.915.096 CIA, dismorfismos faciais, infecções de repetição, hipoacusia condutiva, alterações neurológicas, escoliose

22 18.916.842 21.915.096 CIA, voz anasalada, dismorfismos faciais, infecções de repetição, RDNPM,

23 18.916.842 21.465.659 Truncus arteriosus, úvula bífida, voz anasalada, fenda palatal submucosa, dismorfismos faciais, atraso de linguagem, dificuldade de aprendizagem, hipoacusia condutiva leve

24 18.644.790 21.915.509 Presença de regurgitação pela válvula tricúspide para o átrio direito, insuficiência velofaríngea, fenda palatal submucosa, dismorfismos faciais,

25 18.916.842 21.915.096 Persistência do canal arterial, fenda palatal e submucosa, dismorfismos faciais, atraso de linguagem, baixa estatura

26 18.644.790 21.915.096 CIV, válvula aórtica bicúspide displásica, fenda palatal submucosa, face alongada, infeções de repetição, dificuldade de aprendizagem, hipoacusia mista bilateral, alterações neurológicas

27 18.916.842 21.800.797 Tetralogica de Fallot com estenose pulmonar, voz anasalada, dismorfismos faciais, RDNPM, escoliose, pés e mãos alongados

CIA: comunicação interatrial; CIV: comunicação interventricular; RGE: refluxo gastroesofágico; RDNPM: retardo do desenvolvimento neuropsicomotor

60

Para a correlação genótipo-fenótipo, os 27 indivíduos com deleção em

22q11.2 foram agrupados a partir da diferença entre os pontos de quebra

proximal e distal na região da deleção. A comparação foi efetuada utilizando

apenas os grupos dentro de cada ponto de quebra (A1 x B1 e A2 x B2).

Com relação aos pontos de quebras proximais, os indivíduos foram

classificados dentro de dois grupos:

A1: 18.644.790 a 18.648.666 – 13 indivíduos

B1: 18.916.842 – 14 indivíduos

Já para o ponto de quebra distal, os indivíduos foram classificados dentro dos

grupos:

A2: 21.465.659 – 6 indivíduos

B2: 21.798.907 a 21.915.509 – 21 indivíduos

A Tabela 3 mostra a frequência de sinais clínicos em cada grupo.

Tabela 3. Sinais clínicos observados nos 27 indivíduos com deleção em 22q11.2,

evidenciando a quantidade de sinais observados em cada grupo

separadamente.

Sinais clínicos Grupo A1

n/N Grupo B1

n/N Grupo A2

n/N Grupo B2

n/N Total

Cardiopatia congênita 27/27

Tetralogia de fallot 3/13 2/14 0/6 5/21 5/27

Interrupção de arco aórtico 2/13 2/14 1/6 3/21 4/27

CIV 7/13 5/14 2/6 10/21 12/27

CIA 3/13 5/14 2/6 6/21 8/27

Outros 5/13 2/14 1/6 6/21 7/27

Anomalias palatais 18/27

Fenda palatal 0/13 1/14 0/6 1/21 1/27

Fenda palatal submucosa 4/13 3/14 1/6 6/21 7/27

Insuficiência velofaríngea 6/13 4/14 3/6 7/21 10/27

Úvula bífida 2/13 1/14 2/6 1/21 3/27

Dismorfismos faciais 26/27

Face alongada 9/13 7/14 5/6 11/21 16/27

61

Nariz típico 9/13 8/14 4/6 13/21 17/27

Ptose palpebral 5/13 11/14 6/6 10/21 16/27

Hipertelorismo 4/13 2/14 2/6 4/21 6/27

Alterações imunológicas / infecções recorrentes

8/13 7/14 4/6 11/21 15/27

Atraso de desenvolvimento 6/13 9/14 5/6 10/21 15/27

Atraso de fala 5/13 6/14 4/6 7/21 11/27

Dificuldade de aprendizagem 8/13 5/14 5/6 8/21 13/27

Distúrbios comportamentais 3/13 3/14 3/6 3/21 6/27

Distúrbios neurológicos 1/13 2/14 0/6 3/21 3/27

Perda de audição 9/27

Condutiva 4/13 3/14 3/6 4/21 7/27

Neurossensorial 3/13 0/14 0/6 3/21 3/27

Alterações ofotalmológicas 3/13 1/14 1/6 3/21 4/27

Alterações urinárias 3/13 3/14 2/6 4/21 6/27

Alterações gastrointestinais 5/13 6/14 4/6 7/21 11/27

Alterações esquelética 5/13 5/14 2/6 8/21 10/27

Baixa estatura 2/13 5/14 3/6 4/21 7/27

CIV: comunicação interventricular; CIA: comunicação interatrial; n: número de indivíduos

apresentando o sinal clínico; N: número total de indivíduos apresentando o sinal clínico.

Após a análise estatística, não foi encontrada nenhuma diferença

significativa na comparação entre os grupos analisados e os pontos de quebras

proximais e distais, no que se refere aos sinais clínicos presentes nos indivíduos

investigados (Anexo 3).

62

4.2. Comparação das CNVs no genoma entre os indivíduos com deleção

22q11.2 e com um grupo controle.

Entre os 27 indivíduos com a deleção em 22q11.2 que foram submetidos

a técnica de aGH, todos apresentaram outras CNVs, além da deleção em

22q11.2. Foram encontradas no total 794 CNVs (além da deleção em 22q11.2),

sendo 237 duplicações (29,85%) e 557 deleções (70,15%) (Tabela 4).

Salientando que o número total diz respeito ao total de CNVs encontradas nos

indivíduos, contabilizando também as CNVs que se repetiram em mais de um

indivíduo.

A média de CNVs encontrada nos indivíduos investigados por aGH foi

29,4, sendo que o indivíduo com menor número apresentou 15 CNVs, e o com

maior número apresentou 129 CNVs. Com relação aos 112 indivíduos do grupo

controle da população brasileira, a média foi de 24,3 CNVs por indivíduo, sendo

que o indivíduo com o menor número apresentou 7 CNVs, e o maior apresentou

74 CNVs.

Tabela 4. Quantidade de CNVs no genoma dos indivíduos com deleção em

22q11.2.

Indivíduo Duplicações Deleções Nº total de CNVs

1 5 12 17 2 4 13 17

3 10 22 32

4 9 21 30

5 8 9 17

6 3 14 17

7 10 16 26

8 10 27 37

9 10 7 17

10 9 11 20

11 6 9 15

12 14 13 27

13 6 13 19

14 9 120 129

15 9 23 32

16 4 14 18

17 10 23 33

18 5 20 25

19 12 20 32

20 12 24 36

21 8 18 26

22 8 18 26

63

23 12 16 28

24 18 17 35

25 8 22 30

26 14 20 34

27 4 15 19

Total 237 557 794

O cromossomo 20 foi o que apresentou o menor número de CNVs entre

os indivíduos investigados, com um total de quatro CNVs. Em oposição, o

cromossomo X apresentou um total de 187 CNVs, apresentando o maior número

entre os cromossomos (Tabela 5).

Tabela 5. Quantidade de CNVs por cromossomo nos indivíduos com deleção em

22q11.2.

Cromossomo Duplicação Deleção Nº de CNVs

1 6 46 52 2 2 14 16

3 5 31 36

4 4 20 24

5 6 20 26

6 2 33 35

7 5 29 34

8 4 23 27

9 2 19 21

10 5 18 23

11 4 48 52

12 10 18 28

13 0 9 9

14 33 31 64

15 2 12 14

16 20 16 36

17 11 16 27

18 1 8 9

19 3 9 12

20 2 2 4

21 0 6 6

22 25 18 43

X

78 109 187

Y 7 2 9

Total 237 557 794

Quanto ao tamanho das CNVs, 617 (77,7%) possuiam tamanho entre 1 e

100 kb, 131 (16,5%) entre 101 e 299 kb, além de 46 (5,8%) CNVs maiores que

300 kb (Figura 6).

64

Figura 6. Distribuição, a partir do tamanho, das CNVs encontradas no genoma

dos indivíduos com deleção em 22q11.2 do presente estudo.

Das 237 duplicações encontradas, excluindo as repetições em mais de

um indivíduo, chegou-se a um número total de 161 duplicações, sendo que, 107

(66,46%) estavam presentes em ao menos um dos indivíduos do grupo controle,

e 54 (33,54%) não foram encontradas em nenhum dos indivíduos do grupo

controle. Das 557 deleções encontradas, excluindo as repetições em mais de um

indivíduo, chegou-se a um número total de 441 deleções, sendo que 235

(53,29%) estavam presentes em ao menos um dos indivíduos do grupo controle,

e 206 (46,71%) não foram encontradas em nenhum dos indivíduos pertencentes

ao grupo controle. As CNVs mais frequentes, encontradas ao menos em três

indivíduos com deleção em 22q11.2, estão descritas na tabela a seguir,

evidenciando a sua localização genômica, presença de genes, tamanho e

frequência nos indivíduos do grupo controle da população brasileira, assim como

a presença no DGV (Tabelas 6 e 7).

617

131

46

0

100

200

300

400

500

600

700

1-100 kb 101-299 kb > 300 kb

65

Tabela 6. Duplicações mais frequentes encontradas nos indivíduos com deleção em 22q11.2.

Localização Início (pb) Fim (pb) Tamanho

(kb) Genes

envolvidos

Indivíduos com deleção 22q11.2 (%)

Grupo controle da população brasileira (%)

DGV

16p13.3 1.129.251 1.252.891 123 SSTR5,

C1QTNF8, CACNA1H

3/27 (11,1%) 3/112 (2,6%) Presente

16p11.1-p11.2 34.471.297 34.755.816 284 LOC283914, LOC146481,

LOC100130700 6/27 (22,2%) 10/112 (8,9%) Presente

17q12 34.425.362 34.477.480 52 CCL4 3/27 (11,1%) 17/112 (15,17%) Presente

22q11.22 23.124.497 23.258.369 133 MIR650, IGLL5 14/27 (51,8%) 65/112 (58%) Presente

Xp22.31 6.696.273 6.698.675 2 Sem genes 4/27 (14,8%) 12/112 (10,7%) Presente

Xq26.3 134.928.992 134.966.528 37 CT45A4, CT45A5,

CT45A6 5/27 (18,5%) 26/112 (23,2%) Presente

Xq28 152.927.509 152.984.574 57 PNCK, SLC6A8,

BCAP31 4/27 (14,8%) 2/112 (1,7%) Presente

pb: pares de base; kb: kilobase.

Tabela 7. Deleções mais frequentes encontradas nos indivíduos com deleção em 22q11.2.


(kb) Genes

envolvidos

Indivíduos com deleção

22q11.2

Grupo controle da população

brasileira

Nº descrições no DGV

1p13.3 111.376.206 111.393.284 17 Sem genes 4/27 (14,8%) 16/112 (14,2%) Presente

1q21.3 152.761.994 152.773.905 11 LCE1D 6/27 (22,2%) 33/112 (29,4%) Presente

3q28 189.363.665 189.371.964 8 TP63 3/27 (11,1%) 24/112 (21,4%) Presente

66

8p11.2 39.247.097 39.386.952 139 ADAM5, ADAM3A 11/27 (40.7%) 70/112 (62,5%) Presente

11p15.4 5.783.909 5.809.230 25 OR52N5, OR52N1 5/27 (18,5%) 56/112 (50%) Presente

11q11 55.374.018 55.452.996 78 OR4P4, OR4S2,

OR4C6 4/27 (14,8%) 34/112 (30,3%) Presente

14q11.2* 22.594.506 22.940.386 345 Sem genes 1/27 (3,7%) 49/112 (43,7%) Presente

Xp22.3 1.024.439 1.102.581 78 Sem genes 3/27 (11,1%) 14/112 (12,5%) Presente

Xp21.3 29.160.655 29.174.711 14 IL1RAPL1 4/27 (14,8%) 14/112 (12,5%) Ausente

Xq24 120.009.891 120.090.575 80

CT47A9, CT47A3, CT47A12, CT47A5, CT47A11, CT47A10,

CT47A1, CT47A8, CT47A4, CT47A2, CT47A6, CT47A7

6/27 (22,2%) 12/112 (10,7%) Presente

Xq27.1 139.059.289 139.066.966 7 Sem genes 5/27 (18,5%) 4/112 (3,5%) Presente

pb: pares de base; kb: kilobase.

*Essa CNV foi incluída na tabela por ser a de maior tamanho e sobrepor a todas as extensões das outras 21 CNVs de tamanhos variáveis nessa mesma região.

67

Com relação às CNVs ausentes nos indivíduos do grupo controle, das

duplicações: para 35 havia diversas descrições em indivíduos do DGV, uma

apresentava uma única descrição, 12 estavam ausentes no DGV e não

continham nenhum gene OMIM ao longo de sua extensão, além de quatro CNVs

ausentes no DGV, porém, com genes OMIM em sua extensão (Tabela 8).

Tabela 8. Duplicações ausentes no grupo controle que apresentam genes

OMIM.


(kb) Genes

envolvidos

Indivíduos com

deleção 22q11.2

DGV

6p21.2 38.939.581 39.607.133 667

DNAH8, GLP1R,

SAYSD1, KCNK5,

KCNK17, KCNK16, KIF6

1/27 Ausente

10q23.2 88.586.190 88.708.342 122 BMPR1A, MMRN2

1/27 Ausente

18q12.2 34.911.263 34.957.581 46 CELF4 1/27 Ausente

22q11.2 22.312.374 22.578.983 267 TOP3B 1/27 Presente

pb: pares de base; kb: kilobase; destacados em negrito estão os genes OMIM

No que diz respeito às deleções ausentes nos indivíduos do grupo

controle, das 206 encontradas: para 132 havia diversas descrições em

indivíduos do DGV, 17 apresentavam apenas uma única descrição, 25 estavam

ausentes no DGV e não continham nenhum gene OMIM ao longo de sua

extensão, além de 32 CNVs ausentes no DGV, porém, com genes OMIM em sua

extensão. Dessas 32 CNVs, foi averiguado a função, expressão e trabalhos

descritos na literatura acerca dos genes OMIM presentes nessas CNVs, e desse

modo, quatro foram consideradas relevantes e estão descritas na Tabela 9.

Tabela 9. Deleções ausentes no grupo controle que apresentam genes OMIM.

pb: pares de base; kb: kilobase; destacados em negrito estão os genes OMIM


(kb) Genes

envolvidos

Indivíduos com

deleção 22q11.2

DGV

4q31.3 151.321.707 151.417.370 95 LRBA 1/27 Ausente

6q16.3 102.198.913 102.216.216 17 GRIK2 1/27 Ausente

11q14.3 88.399.784 88.436.138 36 GRM5 1/27 Ausente

22q13.33 51.168.366 51.171.538 3 SHANK3 2/27 Presente

68

4.3. Identificação de desequilíbrios genômicos em pacientes sem

deleção em 22q11.2.

A análise de CNVs dos 32 indivíduos com suspeita de S. Del 22q11.2,

identificou um total de 645 CNVs, sendo 439 deleções e 206 duplicações (Figura

7). O número total de CNVs em cada indivíduo variou de 8 a 60, tendo um

número médio de 21,15 CNVs por indivíduo.

Figura 7: Distribuição das CNVs por tipo: deleções e duplicações.

As CNVs ocorreram ao longo de todos os cromossomos, tanto

autossomos, como sexuais. Um número expressivo de CNVs ocorreu no

cromossomo X (145) sendo 22,48% do total de CNVs, enquanto apenas três

CNVs foram encontradas no cromossomo Y.

Das 645 CNVs descritas em todos os indivíduos, 463 (71,78%)

apresentaram tamanho de 1-100 kb, sendo 405 deleções e 58 duplicações, 116

(17,98%) entre 101-299 kb, sendo 52 deleções e 64 duplicações, e 66 (10,23%)

possuíam um tamanho maior que 300 kb, sendo 15 deleções e 51 duplicações

(Figura 8).

439

206

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Deleções Duplicações

69

Figura 8: Distribuição das CNVs com base no tamanho (kb).

Após a interpretação das CNVs encontradas, considerando tamanho,

síndromes de deleção/duplicação já conhecidas, presença de genes descritos

no OMIM, e informações das bases de dados e na literatura, em quatro

indivíduos (4/32 – 12,5%) a CNV encontrada foi considerada uma variante

patogênica (Tabela 10); e em outros quatro indivíduos (4/32 – 12,5%) a CNV

encontrada foi considerada uma variante de significado incerto (Tabela 10). Nos

demais indivíduos (24/32 – 75%) não foram encontradas CNVs com potencial

patogênico.

405

52

15

58 64 51

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

1-100 kb 101-299 kb > 300 kb

deleções duplicações

70

Tabela 10. Variantes patogênicas e de significado incerto encontradas em indivíduos com hipótese não confirmada de S. Del 22q11.2,

ordenadas por indivíduo.

Indivíduo Crom. Localização Início (pb) Fim (pb) Tamanho

(Mb)

Tipo de

CNV

Origem da

CNV Classificação Genes OMIM

2 X Xq25-q26.1 127.858.672 128.935.251 1.077 dup materna Variante de significado incerto

SMARCA1, OCRL, APLN, XPNPEP2, SASH3

10 20 20q12-q13.12 41.500.568 42.568.152 1.068 dup materna Variante de significado incerto

PTPRT, SRSF6, L3MBTL1, SGK2, MYBL2, TOX2

10 21 21q22.3 43.310.796 48.097.372 4.787 del de novo Patogênica

UMODL1, ABCG1, TFF3, TFF2, TFF1, TMPRSS3,

UBASH3A, RSPH1, SLC37A1, PDE9A, WDR4, NDUFV3, PKNOX1, CBS,

U2AF1, CRYAA, SIK1, HSF2BP, RRP1B, PDXK, CSTB, RRP1, AGPAT3,

TRAPPC10, PWP2, C21orf33, ICOSLG,

DNMT3L, AIRE, PFKL, C21orf2, TRPM2, TSPEAR,

UBE2G2, SUMO3, PTTG1IP, ITGB2,

LINC00163, ADARB1, POFUT2, COL18A1,

SLC19A1, PCBP3, COL6A1, COL6A2, FTCD, SPATC1L,

LSS, MCM3AP, PCNT, DIP2A, S100B, PRMT2

20 12 12q24.33 131.963.230 132.479.079 0.516 dup de novo Variante de significado incerto

SFSWAP, MMP17, ULK1, PUS1, EP400

71

43 X Xq24-q26.1 119.113.155 129.700.543 10.587 dup materna Patogênica

LAMP2, CUL4B, MCTS1, C1GALT1C1, GLUD2,

GRIA3, THOC2, RHOXF2, RHOXF1, ZBTB33, STAG2, SH2D1A, TENM1, ACTRT1, SMARCA1, OCRL, APLN,

XPNPEP2, SASH3, ZDHHC9, UTP14A,

BCORL1, ELF4, AIFM1, RAB33A, SLC25A14,

GPR119

47 X Xq21.1 77.398.962 84.220.346 6.821 del desconhecida Variante de significado incerto**

CYSLTR1, LPAR4, P2RY10, ITM2A, TBX22, BRWD3,

HMGN5, SH3BGRL, POU3F4, CYLC1, RPS6KA6

49 16 16p11.2 29.427.215 30.321.320 0.894 del desconhecida Patogênica

BOLA2, SPN, QPRT, KIF22, MAZ, PRRT2, PAGR1, MVP, CDIPT, KCTD13,

TAOK2, HIRIP3, DOC2A, FAM57B, ALDOA, PPP4C,

TBX6, YPEL3, MAPK3, CORO1A, SULT1A3

102 3 3p26.1 7.068.146 7.674.195 0.606 del paterna Variante de significado incerto

GRM7

206 6* 6p25.3-p24.1 156.974 11.629.164 11.472 dup de novo Patogênica

IRF4, HUS1B, FOXQ1, FOXF2, FOXC1, GMDS,

WRNIP1, SERPINB1, SERPINB9, SERPINB6, NQO2, RIPK1, BPHL,

TUBB2A, TUBB2B, SLC22A23, FAM50B,

PRPF4B, ECI2, CDYL, RPP40, LYRM4, FARS2,

72

NRN1, F13A1, LY86, RREB1, SSR1, CAGE1, DSP, BMP6, BLOC1S5,

EEF1E1, SLC35B3, HULC, TFAP2A, GCNT2, PAK1IP1,

MAK, GCM2, ELOVL2, ERVFRD-1, NEDD9

206 9* 9p24.3-p22.3 203.861 15.125.789 14.921 del de novo Patogênica

DOCK8, KANK1, DMRT1, DMRT3, DMRT2,

SMARCA2, VLDLR, KCNV2, KIAA0020, RFX3, GLIS3,

SLC1A1, PPAPDC2, CDC37L1, AK3, RCL1,

MIR101-2, JAK2, INSL6, INSL4, RLN2, RLN1, CD274, PDCD1LG2,

KIAA1432, ERMP1, MLANA, IL33, UHRF2, GLDC,

KDM4C, PTPRD, TYRP1, MPDZ, NFIB, ZDHHC21,

CER1, FREM1 *Derivada de um rearranjo cromossômico materno, aparentemente equilibrado, envolvendo os cromossomos 6 e 9. ** A mesma alteração é patogênica em pacientes do sexo masculino

Crom.: cromossomo; mb: megabase; pb: pares de base; del: deleção; dup: duplicação.

73

A paciente 2, do sexo feminino, apresentou uma duplicação de 1.077 Mb

na região Xq25-q26.1 (127.858.672 – 128.935.251 - GRCh37/hg19) (Figura 9).

A técnica de aCGH confirmou a duplicação nessa região (Figura 10).


duplicação em Xq25-q26.1 (1.077 Mb).


evidenciando a mesma duplicação encontrada em Xq25-q26.1.

Após investigação por aCGH dos genitores da paciente 2, foi constatado

que essa duplicação é de origem materna. Após revisão de literatura, essa

duplicação foi considerada uma variante de significado incerto.

A paciente10, do sexo feminino, apresentou uma duplicação de 1.068 Mb

na região 20q12-q13.12 (41.500.568 – 42.568.152 - GRCh37/hg19) e uma

deleção de aproximadamente 4.787 Mb na região 21q22.3 (43.310.796 –

48.097.372 – GRCh37/hg19) (Figura 11) sendo submetida a técnica de aCGH,

que revelou as mesmas alterações encontradas por aGH (Figura 12). Ainda, foi

realizada a técnica de FISH na paciente 10, confirmando a deleção na região

21q22.3 (Figura 13). Ambos os genitores também foram investigados por aCGH,

74

onde foi constatado que a duplicação em 20q12-q13.12 foi herdada da mãe, e a

deleção em 21q22.3 ocorreu de novo. Após revisão de literatura, a duplicação

em 20q foi considerada uma variante de significado incerto, e a deleção em 21q

foi considerada uma variante patogênica.


duplicação em 20q12-q13.12 (1.068 Mb) e uma deleção em 21q22.3 (4.787 Mb).

75


evidenciando a mesma duplicação em 20q12-q13.12 e a mesma deleção em 21q22.3,

encontradas por aGH.

Figura 13: FISH em metáfase de sangue periférico da paciente 10, mostrando a

hibridação da sonda em apenas um cromossomo, confirmando a deleção na região

21q22.3.

O paciente 20, do sexo masculino, apresentou uma duplicação de 0.516

Mb na região 12q24.33 (131.963.230 – 132.479.079 - GRCh37/hg19) (Figura

14).

Figura 14: Perfil de hibridação genômica (aGH) do paciente 20, evidenciando uma

duplicação em 12q24.33 (0.516 Mb).

76

Após a investigação por aCGH nos genitores, foi constatado que a

duplicação encontrada no paciente 20 é de novo. Após revisão de literatura, essa

duplicação foi considerada uma variante de significado incerto.

O paciente 43, do sexo masculino, apresentou uma duplicação de

aproximadamente 10.587 Mb na região Xq24-q26.1 (119.113.155 – 129.700.543

– GRCh37/hg19) (Figura 15) sendo submetido também a técnica de aCGH, que

revelou a mesma duplicação na região Xq24-q26.1 (Figura 16). A mãe e a irmã

do paciente também foram submetidas à técnica de aCGH, que revelou a mesma

duplicação na região Xq24-q26.1 em ambas (Figura 17). Após revisão de

literatura, a duplicação encontrada no paciente foi considerada uma variante

patogênica.

Figura 15: Perfil de hibridação genômica (aGH) do paciente 43, evidenciando uma

duplicação em Xq24-q26.1 (10.587 Mb).

Figura 16: Perfil de hibridação genômica comparativa (aCGH) do paciente 43,

evidenciando a mesma duplicação em Xq24-q26.1 encontrada por aGH.

77

Figura 17: Perfil de hibridação genômica comparativa (aCGH) da genitora (a) e irmã (b)

do paciente 43, evidenciando a mesma duplicação em Xq24-q26.1 encontrada no

paciente.

A paciente 47, do sexo feminino, apresentou uma deleção de 6.821 Mb

na região Xq21.1 (77.398.962 – 84.220.346 - GRCh37/hg19) (Figura 18). A

técnica de aCGH revelou a mesma deleção na região Xq21.1(Figura 19). A

mesma alteração é considerada patogênica em pacientes do sexo masculino.

Porém, como essa paciente é do sexo feminino, e ainda não sabemos o perfil de

inativação do cromossomo X alterado, não podemos classifica-la como

patogênica. Assim, ela foi considerada uma variante de significado incerto nessa

paciente.


deleção em Xq21.1 (6.821 Mb).

78


evidenciando a mesma deleção encontrada por aGH.


em 16p11.2 (29.427.215 -30.321.320 - GRCh37/hg19) (Figura 20) em uma

região que corresponde a síndrome de microdeleção 16p11.2 (OMIM #611913).

Após revisão de literatura, a deleção encontrada na paciente foi considerada

uma variante patogênica, que causa uma síndrome já conhecida e estabelecida.


deleção em 16p11.2 (0.894 Mb).


na região 3p26.1 (7.068.146 – 7.674.195 - GRCh37/hg19) (Figura 21) sendo

submetida também a técnica de aCGH, que revelou a mesma deleção nessa

região (Figura 22). Após revisão de literatura, a deleção encontrada na paciente

foi considerada uma variante de significado incerto.

79


deleção em 3p26.1 (0.606 Mb).


evidenciando a mesma deleção encontrada por aGH.

A paciente 206, do sexo feminino, apresentou uma duplicação de 11.472

Mb na região 6p25.3-p24.1 (156.974 – 11.629.164 – GRCh37/hg19) e uma

deleção de 14.921 Mb na região 9p24.3-p22.3 (203.861 – 15.125.789) (Figura

23). O resultado do cariótipo foi 46,XX,der(9)t(6;9)(p24;p22) e os pais dessa

paciente também foram submetidos ao exame de cariótipo, onde o resultado

paterno foi normal, e o materno revelou uma translocação recíproca

aparentemente equilibrada entre os cromossomos 6 e 9, 46,XX,t(6;9)(p24;p22)

(Figura 24). A técnica de FISH foi realizada na paciente e na sua genitora,

confirmando a deleção da região 9p24.2-9p24.3 e também confirmando a

translocação na genitora (Figura 25). Sendo assim, após revisão de literatura,

as alterações encontradas na paciente foram consideradas variantes

patogênicas.

80


duplicação em 6p25.3-p24.1 (11.472 Mb) e uma deleção em 9p24.3-9p22.3 (14.921

Mb).

Figura 24: Cariótipos parciais da paciente 206 e de sua genitora. a) Cromossomo 9

derivado de uma translocação entre os braços curtos dos cromossomos 6 e 9,

resultando em deleção parcial do braço curto do 9 (pter p22) e duplicação parcial do

braço curto do cromossomo 6 (pter p24). b) Translocação recíproca aparentemente

equilibrada entre os braços curtos dos cromossomos 6 e 9, com pontos de quebra em

p24 e p22, respectivamente.

81

Figura 25: FISH em metáfase de sangue periférico da paciente 206 e de sua genitora,

com sondas obtidas de clones de BAC. a) Paciente 206, observando-se um sinal para

a sonda da região 9p24.2 e 9p24.3 (RP11-48M17) e dois sinais para a sonda da região

9q34 (RP11-644H13) utilizada como controle, evidenciando a deleção parcial no braço

curto do cromossomo 9 na região p24.2 e p24.3. b) Genitora, no cromossomo derivado

9 (da translocação 6;9 identificada no cariótipo) não foi observado sinal para a sonda da

região 9p24.2 e 9p24.3 (RP11-48M17) e observou-se um sinal para a sonda da região

9q34 (RP11-644H13) utilizada como controle. O sinal da sonda RP11-48M17 (9p24.2 e

9p24.3) foi observado em outro cromossomo submetacêntrico, confirmando a

translocação observada pelo cariótipo.

82

5. Discussão

5.1. Caracterização dos pontos de quebra e correlação genótipo-

fenótipo em indivíduos com deleção 22q11.2

Dos 27 indivíduos com deleção 22q11.2 que foram investigados, os

pontos de quebra da região proximal variaram entre as localizações genômicas

18.644.790 - 18.916.842, num intervalo variavelmente deletado que se estende

por 272 kb, e abriga quatro genes, entre eles, os genes USP18, DGCR6 e

PRODH. Já para a região distal, os pontos de quebra variaram entre as

localizações genômicas 21.465.659 - 21.915.509, com um intervalo

variavelmente deletado de 449 kb, que contém nove genes, entre eles o gene

HIC2.

No que diz respeito à região proximal, os genes USP18 e DGCR6 estão

deletados em 13 indivíduos.

O gene USP18 codifica uma enzima que participa dos processos de

ubiquitinação, clivando a ubiquitina ISG15, atuando assim como um regulador

negativo da via de sinalização do interferon tipo 1 (Chen et al., 2011; Malhotra et

al., 2013). O gene USP18 pode exercer um papel importante na função imune

interagindo diretamente com proteínas que estão envolvidas na regulação

imune, como demonstrado por diversos autores (Ritchie et al., 2004; Osiak et al.,

2005; Kim et al., 2006; Malakhova et al., 2006). Desse modo, não pode ser

descartada a possibilidade desse gene ter relação com a imunodeficiência que

é observada em indivíduos portadores da S. Del 22q11.2.

O gene DGRC6 está envolvido na migração das células da crista neural,

no desenvolvimento dos arcos faríngeos e pode estar envolvido também na

regulação de outros genes que causam a S. Del 22q11.2 (Edelmann et al., 2001;

Hierck et al., 2004). Esse gene possui uma cópia com 97% de similaridade

(DGCRL6), que também está dentro da região comumente deletada na S. Del

22q11.2, além de possuírem perfil de expressão e funções similares, e ainda,

existe uma diferença de apenas sete aminoácidos entre eles (Edelmann et al.,

2001). Além disso, estudos de associação sugerem que esse gene também

estaria relacionado com uma susceptibilidade à esquizofrenia (Liu et al., 2002).

83

Dos 27 indivíduos investigados nesse estudo, 15 apresentam alterações

imunológicas e/ou infecções recorrentes. Todavia, o fenótipo não pode ser

atribuído a um único gene. Esquizofrenia e outros comportamentos

esquizoafetivos também não foram relatados nessa amostra. Entretanto, como

os indivíduos são jovens, seria importante o seguimento clínico, o qual poderá

ser registrado de maneira uniformizada no aplicativo CranFlow® (PCFB) durante

as consultas de rotina. Com isso, no futuro será possível reavaliar esses

achados.

Dentro da região proximal variavelmente deletada, ainda existe o gene

GGT3P. Porém, até o momento, sua função e expressão parecem não estar

relacionadas com nenhuma manifestação fenotípica observada na S. Del

22q11.2.

No que diz respeito à região distal, de todos os genes presentes na região

variavelmente deletada, com exceção do gene HIC2, a função e expressão dos

outros parecem não estar relacionadas com nenhuma manifestação fenotípica

observada na S. Del 22q11.2.

O gene HIC2 está localizado na região distal da deleção 22q11.2, mais

precisamente no fim da LCR D, codificando um fator de transcrição relacionado

ao gene HIC1, sendo também, considerado um homólogo deste mesmo gene

(Rauch et al., 1999). Em modelo animal, camundongos com deleção homozigota

do gene HIC1 faleceram ao nascimento apresentando acrania, excenfalia, fenda

de palato, anomalias de membros e onfalocele, sugerindo que é um gene

necessário para um desenvolvimento normal (Saitta et al., 1999). As deleções

distais 22q11.2 normalmente resultam de deleções com pontos de quebra

próximos a LCR D e distal à LCR E ou F, e dentro dessa região não está incluído

o gene TBX1, conhecidamente relacionado ao fenótipo cardíaco na S. Del

22q11.2. Recentemente foi demonstrado, em modelo animal, que a

haploinsuficiência do HIC2 leva ao aparecimento de cardiopatias congênitas,

sugerindo que, além do gene TBX1, o gene HIC2 pode ser um gene relacionado

a cardiopatias congênitas que ocorrem na S. Del 22q11.2 distal, além de poder

contribuir com o fenótipo cardíaco observado nos indivíduos com S. Del 22q11.2,

juntamente com o TBX1 e outros possíveis genes candidatos (CRKL e MAPK1)

(Dykes et al., 2014).

84

A formação dos grupos para a correlação genótipo-fenótipo levou em

conta a presença dos genes mencionados acima. Para a região proximal, o

grupo A1 apresentou pontos de quebra mais proximais, com deleção do gene

USP18 e ausência do gene DGCR6, e o grupo B1, com pontos de quebras mais

distais, não apresentou a deleção de nenhum desses genes. Para a região distal,

o grupo A2, com pontos de quebras mais proximais, não apresentou a deleção

do gene HIC2, e o grupo B2, com pontos de quebras mais distais, apresentou a

deleção do gene HIC2. Devido ao fato de apenas seis indivíduos apresentarem

pontos de quebra que não envolviam o gene HIC2, não foi possível estabelecer

uma comparação entre uma média aproximada de indivíduos em cada grupo.

Entretanto, após a análise estatística não foi observado nenhum valor de p com

resultado significativo.

Como demonstrado anteriormente, alguns genes dessas regiões (proximal e

distal) variavelmente deletada apresentam relações com o fenótipo observado

nos indivíduos portadores da S. Del 22q11.2, podendo esses genes contribuírem

com alguns sinais clínicos observados no grupo de indivíduos com S. Del

22q11.2. A averiguação dos genes que estão presentes nessas regiões pode

contribuir com mais informações acerca do fenótipo da S. Del 22q11.2, que se

apresenta muito heterogêneo (Bittel et al., 2009). Deve-se mencionar, ainda, que

a técnica de aGH apresenta uma extensa cobertura do genoma, porém não

completa, e, portanto, não há precisão absoluta dos pontos de quebra. Sendo

assim, são necessários mais estudos a respeito da relação entre esses genes o

fenótipo dos indivíduos com S. Del 22q11.2. A utilização de técnicas mais

refinadas e com maior poder de resolução, aliadas as já utilizadas, se torna

essencial para a determinação precisa dos pontos de quebra, devido as

variações que podem ocorrer por conta das LCRs.

85

5.2. Comparação das CNVs no genoma dos pacientes com deleção

22q11.2 e no grupo de indivíduos controle.

Dos indivíduos com deleção em 22q11.2 investigados por aGH em um

estudo anterior deste grupo de pesquisa, foram encontradas 794 CNVs no

genoma todo (237 duplicações e 557 deleções). De todas as CNVs encontradas

nesses indivíduos, 260 não estavam presentes em nenhum dos indivíduos do

grupo controle (54 duplicações e 206 deleções), e dentre estas, oito CNVs (4

duplicações e 4 deleções) foram consideradas relevantes, ou por conta de seu

tamanho, genes relevantes já relacionados com algum fenótipo conhecido, e

também por não estarem presentes em indivíduos no DGV.

Com relação as duplicações (quatro pacientes), as quatro consideradas

relevantes foram encontradas nas regiões: 6p21.2, 10q23.2, 18q12.2 e 22q11.2.

Com relação as deleções (três pacientes), as quatro consideradas relevantes

foram encontradas nas regiões: 4q31.3, 6q16.3, 11q14.4 e 22q13.33. A

discussão abaixo leva em consideração apenas o achado de cada paciente, já

que os genitores ainda não puderam ser investigados.

Duplicações

O paciente 5 apresentou uma duplicação em 10q23.3, com um tamanho

de 122 kb. Essa duplicação envolve dois genes, entre eles o gene BMPR1A.

O gene BMPR1A (Bone morphogenetic protein receptor type 1A) pertence

a superfamília TGF-beta/ BMP, que são moléculas envolvidas na regulação da

proliferação, migração e diferenciação celular, além da apoptose (Reddi e Reddi,

2009). Em modelo animal, deleções no gene BMPR1A levaram a cardiopatia

congênita em camundongos (Gaussin et al., 2002). Em humanos, a deleção do

gene BMPR1A já foi sugerida como relacionada a cardiopatias congênitas na

síndrome de deleção 10q22.23 (Breckpot et al., 2012), além da duplicação do

mesmo gene já ter sido relacionada com cardiopatia congênita, microcefalia e

deficiência intelectual moderada (Tang et al., 2015). Com base nesses relatos,

essa CNV pode estar contribuindo, de alguma forma, com as cardiopatias

congênitas observadas no paciente 5, que incluem: Comunicação

86

interventricular (CIV), arco aórtico à direita e hipoplasia de artéria pulmonar. Esta

pode ter um efeito aditivo à deleção 22q11.2 neste fenótipo específico.

O paciente 13 apresentou uma duplicação em 6p21.2, com um tamanho

de 667 kb. Essa duplicação envolve sete genes, entre eles o gene KIF6.

O gene KIF6 (Kinesin family member 6) é um membro da superfamília de

cinesinas, e é expresso no tecido vascular, principalmente nas artérias

coronárias, além disso, está envolvido no transporte celular de proteínas

complexas, organelas e mRNA ao longo dos microtúbulos (Rosenfeld et al.,

2003; Iakoubova et al., 2008). Alguns trabalhos sugerem que polimorfismos

nesse gene estão relacionados a um risco aumentado de desenvolver doenças

coronárias ao longo da vida (Iakoubova et al., 2010; Shiffman et al., 2010).

Apesar desse gene ser expresso no tecido vascular, os indivíduos portadores

desses polimorfismos não nascem com cardiopatias congênitas, principalmente

as que ocorrem com mais frequência na S. Del 22q11.2. Os outros genes

presentes na extensão dessa CNV, a princípio parecem não estar relacionados

com nenhum dos sinais clínicos apresentados pelo paciente, nos levando a crer

que essa CNV é uma variante benigna e que não está relacionada ao fenótipo

observado nesse indivíduo.

O paciente 20 apresentou uma duplicação em 18q12.2, com um tamanho

de 46 kb. Essa duplicação envolve apenas o gene CELF4.

O gene CELF4 (CUGBP, Elav-like family member 4) pertence a uma

família de genes altamente conservados, e codifica uma proteína que se liga ao

RNA e age como um regulador do splicing, sendo expresso em vários tecidos,

principalmente no cérebro fetal e adulto (Meins et al., 2002). Em modelo animal,

já foi mostrado que o homólogo do gene CELF4 é expresso no sistema nervoso

central, sugerindo que esse gene desempenha um papel importante no

desenvolvimento do cérebro e dos olhos (Wu et al., 2010; Wagnon et al., 2011).

Em humanos, estudos mostraram que a haploinsuficiência do gene CELF4 está

relacionada com problemas comportamentais e de desenvolvimento,

convulsões, anomalias dos olhos, obesidade (Halgren et al., 2012) arco aórtico

interrompido e defeito de septo atrial (Chen et al., 2013). Todas as evidências

mencionadas sugerem que a deleção do gene CELF4 está relacionada com

esses fenótipos. Entretanto, não se pode descartar que a sua duplicação

também possa estar relacionada a fenótipos alterados.

87

O paciente 27 apresentou uma duplicação em 22q11.2, com o tamanho

de 267 kb. Essa duplicação envolve o gene TOP3B.

O gene TOP3B (Topoisomerase (DNA) III beta) codifica a enzima DNA

topoisomerase III – beta. A deleção nesse gene já foi associada com distúrbios

do neurodesenvolvimento (Stoll et al., 2013). Entretanto, nós encontramos uma

microduplicação de 267 kb envolvendo esse gene. Microduplicações envolvendo

esse gene já foram descritas na literatura, tanto em indivíduos com fenótipo

normal como anormal. Uma microduplicação do gene TOP3B foi encontrada em

uma família, na qual o probando apresentava como sinais clínicos: fronte

proeminente, hipertelorismo, fissura palpebral, ptose, nariz largo, filtro longo,

lábio fino, orelhas grandes, entre outros, sendo a microduplicação herdada de

sua mãe, que apresentava um fenótipo mais leve (Tarsitano et al., 2014). Outra

descrição envolvendo microduplicação do gene TOP3B, foi em um indivíduo que

apresentava cardiopatia congênita, dismorfismo facial, atraso de

desenvolvimento, atraso psicomotor moderado e hipocalcemia, sendo a

microduplicação herdada de sua mãe que não apresentava nenhum fenótipo

anormal (Pires et al., 2014).

Entretanto, apesar dessa CNV de 267 kb envolvendo o gene TOP3B ter

sido descrita tanto em indivíduos normais e afetados, estar presente em 3,7%

dos indivíduos do grupo controle e 18 indivíduos no DGV, além do fato de estar

presente em indivíduos no DECIPHER, não fica claro se há contribuição dessa

CNV no fenótipo desses indivíduos. O paciente 27 apresenta alguns sinais

clínicos que incluem: dismorfismos faciais, cardiopatia congênita (Tetralogia de

Fallot com estenose pulmonar), além de RDNPM, semelhantes aos casos

descritos na literatura. Estudos funcionais desse gene podem contribuir a fim de

esclarecer o possível envolvimento dessa CNV em manifestações clínicas.

Deleções

Paciente 6

O paciente 6 apresentou três deleções: 4q31.3, 6q16.3 e 11q14.3. O

paciente 6 apresenta um fenótipo que inclui: comunicação interatrial, úvula

bífida, voz anasalada, dismorfismos faciais, infecções de repetição, RDNPM,

88

distúrbios psiquiátricos, hipoacusia condutiva, esplenomegalia discreta e

escoliose.

4q31.3

A deleção 4q31.3 tem o tamanho de 95 kb e envolve o gene LRBA.

O gene LRBA codifica uma proteína do citosol, localizada no retículo

endoplasmático, complexo de golgi, vesículas endocitórias e nos lisossomos,

sendo expressada em quase todos os tipos de células (Lopez-Herrera et al.,

2012). Sua função está ligada a resposta imune, autofagia e na regulação das

células (Lopez-Herrera et al., 2012). A deficiência dessa proteína foi descrita pela

primeira vez em 2012 como uma deficiência imune comum, associada com

citopenias autoimune apresentando um padrão autossômico recessivo,

encontrada primeiramente em pacientes com infecções respiratórias

recorrentes, hipogamaglobulinemia e diminuição da memória dos linfócitos B

(Alangari et al., 2012; Burns et al., 2012; Lopez-Herrera et al., 2012). Problemas

de imunodeficiência são encontrados em indivíduos com S. Del 22q11.2. O

paciente 6 apresenta um quadro de infecções de repetição. Além da deleção em

22q11.2, a deleção do LRBA também pode contribuir para este fenótipo.

6q16.3

A deleção em 6q16.3 tem o tamanho de 17 kb e envolve o gene GRIK2.

O gene GRIK2 é um membro da família de receptores de glutamato

Kainate, que são expressos no sistema nervoso central, e codifica um repector

chamado GLUK2 (Bettler et al., 1992). Em camundongos com haploinsuficiência

do homólogo GRIK2, foi encontrado um fenótipo semelhante ao visto em

indivíduos com autismo (Micheau et al., 2014). A deleção do gene GRIK2 já foi

descrita em duas famílias com deficiência intelectual não sindrômica, problemas

comportamentais, epilepsia e distonia (Motazacker et al., 2007; Córdoba et al.,

2015). A deleção do gene GRIK3, pertencente à mesma família do gene GRIK2,

já foi descrito em uma menina apresentando um fenótipo que inclui um grave

atraso de desenvolvimento e outros dismorfismos (Takenouchi et al., 2013).

Estudos de associação com polimorfismos presentes nos genes da família

Kainate, já foram relacionados a problemas neuropsiquiátricos, como

esquizofrenia e transtorno bipolar (Begni et al., 2002; Kilic et al., 2010; Sampaio

et al., 2012; Hirata et al., 2012). Como foi mencionado que o gene GRIK2 é um

receptor de glutamato expresso no sistema nervoso central, além de relatos em

89

que a deleção dele está envolvida com atraso de desenvolvimento e problemas

neuropsiquiátricos, não podemos excluir que a deleção desse gene possa

contribuir para o fenótipo apresentado por esse indivíduo.

11q14.3

A deleção 11q14.3 tem o tamanho de 35 kb e envolve o gene GRM5.

O gene GRM5 pertence à família de receptores de glutamato do tipo

metabotrópico, que codifica o receptor de glutamato metabotrópico 5 (mGluR5),

sendo expresso abundantemente nos neurônios da raíz dorsal da medula

espinhal (Alvarez et al., 2000; Pitcher et al., 2007), e também nos neurônios

corticais, hipocampais e estriatais, que são regiões fortemente associadas com

a fisiopatologia da esquizofrenia (Romano et al., 1995). Devido a sua expressão

ampla no cérebro, o mGluR5 está relacionado com várias funções desse órgão,

incluindo a atividade locomotora espontânea, a resposta a novos ambientes,

assim como a ansiedade e funções cognitivas, como por exemplo, a memória

espacial (Kinney et al., 2003; Balschun et al., 2006; Jew et al., 2013). O mGluR5

também está envolvido na potenciação a longo prazo e na depressão de longa

duração, ambos mecanismos envolvidos na aprendizagem e nos processos de

memória, e que estão afetados na esquizofrenia (Barch e Ceaser, 2012;

Mukherjee e Manahan-Vaughan, 2013). Um estudo de associação identificou

três SNPs no gene GRM5 que estavam associados com esquizofrenia (Ayalew

et al., 2012). Recentemente foi demonstrado que o mGluR5 está envolvido na

regulação dos processos motores (Guimarães et al., 2015). Devido ao fato do

gene GRM5 estar expresso em várias regiões do cérebro, além de estar

envolvido em diversas funções no cérebro, e ainda, a existência de trabalhos

que relacionam o gene com distúrbios psiquiátricos, não podemos descartar o

envolvimento dessa CNV com o fenótipo do paciente 6.

Paciente 20 e 21

Os pacientes 20 e 21 apresentaram a mesma deleção em 22q13.33, com

o tamanho de 3 kb. A deleção encontrada nos dois pacientes envolve apenas o

gene SHANK3. O paciente 20 apresenta um fenótipo que inclui: insuficiência

velofaríngea, dismorfismos faciais, infeções de repetição e RDNPM; Já o

90

paciente 21 apresenta um fenótipo que inclui: comunicação interatrial (CIA),

infeções de repetição, hipoacusia condutiva e escoliose.

O gene SHANK3 (SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3) codifica

uma proteína que desempenha um papel importante no complexo pós-sináptico

dos neurônios, em áreas do cérebro que estão relacionadas com aprendizado,

cognição e comunicação (Sala et al., 2005; Saupe et al., 2011). Indivíduos com

mutações ou deleções intragênicas no gene SHANK3 geralmente apresentam

deficiência intelectual e autismo (Durand et al., 2007; Gong et al., 2012). Além

disso, o gene está localizado na banda q13.33 do cromossomo 22, onde a

deleção dessa região causa a síndrome de Phelan-McDermid (OMIM # 606232)

(Phelan et al., 2012). Atualmente, existe a hipótese de que a deleção do gene

SHANK3 contribui com as manifestações neurológicas dessa síndrome (Wilson

et al., 2003; Macedoni-Lukšič et al., 2013).

Atualmente não está esclarecido se a CNV encontrada nos dois indivíduos

que parcialmente deleta uma região exônica do gene SHANK3, contribuiu com

alguma manifestação clínica apresentada por eles. Entretanto, esses indivíduos

não apresentam nenhuma manifestação neurológica semelhante às

apresentadas pelos indivíduos com deleção no SHANK3 descritos na literatura.

A CNV encontrada nos indivíduos com S. Del 22q11.2, e que está ausente

no grupo controle da população brasileira, a princípio, não está, relacionada com

o quadro clínico apresentado pelos indivíduos investigados. No entanto, algumas

CNVs possuem genes que podem contribuir, de alguma forma, com o fenótipo

observado nesses indivíduos. Porém, para poder inferir se essas CNVs estão

realmente influenciando no fenótipo, há a necessidade primeiramente da

confirmação dessas alterações utilizando outras técnicas, e então a realização

de estudos funcionais nesses genes de interesse.

Outras CNVs encontradas nos 27 indivíduos com deleção 22q11.2

Com relação às outras CNVs encontradas no genoma dos 27 indivíduos

investigados, e que estavam presentes tanto no grupo controle da população

brasileira, como no aDGV e DGV, podemos considerá-las variantes normais que

ocorrem na população brasileira, não estando, a princípio, relacionadas com o

quadro clínico observado nos indivíduos com S. Del 22q11.2. No entanto, para

inferir com maior precisão a relação dessas CNVs com o quadro clínico desses

91

indivíduos, e levando em conta tamanho amostral do nosso estudo (27), seria

ideal aumentar o número de indivíduos investigados, a fim de constatar se há

diferença estatisticamente significativa entre as frequências de CNVs específicas

nos indivíduos do grupo controle com os indivíduos portadores da deleção

22q11.2.

5.3. Identificação dos desequilíbrios genômicos por meio da técnica de

aGH em pacientes negativos para a deleção 22q11.2

Tendo em vista a heterogeneidade e variabilidade clínica da S. Del

22q11.2, muitas vezes as manifestações se sobrepõem com outras condições

clínicas, dificultando a suspeita e interferindo no direcionamento do diagnóstico

laboratorial (McDonald-McGinn e Sullivan, 2011). Para tanto, sugere-se que a

investigação laboratorial seja realizada por aGH. Entretanto, é possível a

otimização de recursos, baseados em estratégias de suspeição clínica (Monteiro

et al., 2013), associado a técnicas de menor custo.

A especificidade da técnica de FISH limita seu uso para a detecção de

alterações fora da região das sondas utilizadas, necessitando a utilização de

outras abordagens para a detecção de deleções atípicas e fenocópias, como a

técnica de MLPA, ou mesmo uma varredura completa do genoma, com as

plataformas de array.

A utilização de aGH nos 32 indivíduos sem a microdeleção em 22q11.2,

permitiu a descoberta de dez desequilíbrios genômicos em oito indivíduos, sendo

cinco variantes de significado incerto e cinco variantes patogênicas, levando a

uma conclusão diagnóstica em quatro desses indivíduos, reforçando a

importância da utilização das técnicas de array em indivíduos com suspeita não

confirmada de S. Del 22q11.2.

92

5.3.1. Desequilíbrios genômicos relevantes encontrados nos 32

indivíduos com suspeita clínica de S. Del 22q11.2.

Paciente 2

A paciente 2, do sexo feminino, apresentou uma duplicação em Xq25-

q26.1 (1.077 Mb; 127.858.672 - 128.935.251 - GRCh37/hg19). Essa região

contém cinco genes: SMARCA1, OCRL, APLN, XPNPEP2 e SASH3. Dentre

estes, destaca-se o gene SMARCA1, também conhecido como SNF2L.

A paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: deficiência intelectual,

úvula bífida, orelhas dismórficas e de implantação baixa, face alongada,

hipertelorismo, ptose, RDNPM, atraso/distúrbio de linguagem, dificuldade de

aprendizagem, dificuldade alimentar, baixa estatura e estrabismo.

A CNV encontrada não está descrita no DGV. No DECIPHER, apenas

dois indivíduos (253547 do sexo feminino e 292493 do sexo masculino)

apresentam CNVs com tamanho semelhante (985 kb e 438 kb) sobrepondo os

mesmos genes encontrados na paciente 2. Entretanto, não há descrição dos

sinais clínicos do indivíduo 253547, apenas sabe-se que é uma CNV herdada.

Já o indivíduo 292493 apresenta autismo.

O gene SMARCA1 (SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent

regulator of chromatin, subfamily a, member 1) pertence a uma superfamília de

proteínas, que são complexos de remodelação da cromatina, e desempenha

funções em diversos locais do núcleo, incluindo a regulação da transcrição,

junção da cromatina e replicação do DNA (Gangaraju et al., 2007). Esse

complexo é muito ativo no cérebro, regulando genes que são necessários para

o desenvolvimento neuronal do mesencéfalo, além de sua expressão ectópica

nos neuroblastos promover diferenciação neuronal em camundongos (Barak et

al., 2003). No desenvolvimento do cérebro, o gene SMARCA1 tem sua

expressão aumentada durante o término da diferenciação (Lazzaro e Picketts,

2001).

Como o gene SMARCA1 desempenha algumas funções no

desenvolvimento do cérebro, não está descartada a hipótese de haver alguma

relação entre a CNV encontrada, que envolve esse gene, com fenótipo de

deficiência intelectual apresentado pela paciente. Entretanto, não há

93

informações suficientes para classificar essa CNV como patogênica, além da

paciente ser do sexo feminino, havendo a possibilidade do cromossomo X

portador da CNV estar inativado, necessitando da confirmação do estudo de

desvio de inativação, na tentativa de uma classificação mais embasada.

Portanto, no momento, essa CNV é uma variante de significado incerto.

Paciente 10

A paciente 10, do sexo feminino, apresentou uma duplicação em 20q12-

q13.12 (1.068 Mb; 41.500.568 – 42.568.152 - GRCh37/hg19) e uma deleção em

21q22.3 (4.787 Mb; 43.310.796 – 48.097.372 – GRCh/hg19).

A paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: prolapso do folheto

posterior da válvula mitral com refluxo de grau mínimo, insuficiência

velofaríngea, úvula bífida, voz anasalada, disfagia, deficiência intelectual,

orelhas dismórficas e de implantação baixa, face alongada, hipertelorismo,

RDNPM e dificuldade de aprendizagem.

No DECIPHER não foi encontrada nenhuma duplicação em 20q12-q13.12

semelhante à da paciente. Duplicações menores (140 a 370 kb) foram

encontradas em três indivíduos descritos no DECIPHER, todas envolvendo o

gene PTPRT e com sinais clínicos que incluem: deficiência intelectual,

microcefalia, atraso de desenvolvimento, dismorfismos faciais e distúrbios

comportamentais (288576; 289027 e 290118). Todavia, os indivíduos 289027 e

290118 apresentam outras CNVs que podem estar contribuindo com as

manifestações clínicas apresentadas por eles. Não há nenhum relato dessa

duplicação em indivíduos descritos no DGV.

A duplicação em 20q12-q13.12 envolve oito genes, entre eles, o gene

PTPRT. O gene PTPRT (Protein tyrosine phosphatase, receptor type T) é um

receptor tipo T da proteína tirosina fosfatase, membro da família de proteínas

PTP, que são moléculas que regulam uma variedade de processos celulares,

incluindo crescimento e diferenciação celular, ciclo mitótico, oncogênese e a

estrutura de suas proteínas sugerem que podem estar relacionadas aos

processos de sinalização e adesão celular (Paul e Lombroso, 2003; Aricescu,

2007). Há relatos da expressão desse gene em diversos tecidos, incluindo o

coração e o sistema nervoso central (Paul e Lombroso, 2003; Besco et al., 2006).

94

Mutações no sítio catalítico e deleção de 150 kb do gene PTPRT já foram

encontradas em indivíduos com deficiência intelectual e defeitos cardíacos

congênitos (Schuurs-Hoeijmakers et al., 2013).

A duplicação em 20q12-q13.12 encontrada na paciente foi herdada de sua

genitora, que não apresenta nenhuma manifestação clínica. O fato de não existir

nenhuma duplicação semelhante no DECIPHER e no DGV, não exclui a

possibilidade que essa alteração possa influenciar na presença de alguns sinais

clínicos nesta paciente. Além disso, há o relato de trabalhos que indicam a

expressão do gene PTPRT no sistema nervoso central, coração, e mutações

causando deficiência intelectual e cardiopatias congênitas. A análise funcional

do gene PTPRT pode ser uma opção de investigação para excluir ou confirmar

a participação do gene no fenótipo da paciente. No entanto, não há evidências

suficientes que suportem uma classificação patogênica dessa CNV,

classificando-a no momento como uma variante de significado incerto.

A deleção terminal em 21q22.3 envolve 94 genes, entre eles, os genes

TRPM2, TSPEAR, PCNT, DIP2A e S100B2.

O gene TRPM2 (Transient receptor potential cation channel subfamily M

member 2) codifica uma proteína que é um receptor de canal de cálcio, envolvida

nos processos de estresse oxidativo, induzindo a morte celular e processos

inflamatórios.

O gene TSPEAR (Thrombospondin type laminin G domain and EAR

repeats) codifica um peptídeo que está associado com epilepsia. Ambos genes

já foram associados com transtorno bipolar (McQuillin et al., 2006).

Os genes PCNT (Pericentrin), DIP2A (Disco interacting protein 2 homolog

A) e S100B (S100 calcium binding protein B) já foram candidatos a causarem

Dislexia (Poelmans et al., 2009).

Deleções na região mais terminal do braço longo do cromossomo 21

(q22.2-q22.3) têm sido relacionadas com um fenótipo que varia de moderado,

incluindo dismorfismos leves e deficiência intelectual moderada, até grave,

incluindo dismorfismos e malformações complexas (Ehling et al., 2004; Bertini et

al., 2008; Roberson et al., 2011; Chen et al., 2012).

Recentemente, dois trabalhos identificaram o cromossomo 21 em anel e

com deleção da região terminal 21q22.3, em mosaico, em indivíduos com

dismorfismos faciais e deficiência intelectual (Specchio et al., 2010; Chen et al.,

95

2012). Em modelo animal, a deleção correspondente da região 21q22.3 causou

defeitos cognitivos em camundongos (Yu et al., 2010).

Há diversas descrições no DECIPHER de indivíduos apresentando

deleção terminal da região 21q22.3, deleções maiores, que sobrepõe totalmente

ou deleções menores dentro da região deletada da paciente. O fenótipo desses

indivíduos é muito variável, alguns apresentando sinais clínicos similares aos

encontrados na paciente, que incluem: deficiência intelectual, atraso de

desenvolvimento, atraso de fala e linguagem, dismorfismos faciais e

hipertelorismo. Não há nenhum indivíduo com essa mesma deleção descrito no

DGV.

No momento, com base no que foi mencionado acima, há evidências

suficientes que suportem uma classificação patogênica dessa CNV.

Paciente 20

O paciente 20, do sexo masculino, apresentou uma duplicação em

12q24.33 (0.516 Mb; 131.963.230 – 132.479.079 - GRCh37/hg19). Essa

duplicação engloba cinco genes, destacando-se os genes ULK1 e PUS1.

O paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: orelhas dismórficas e

de implantação baixa, hipertelorismo, microcefalia, deficiência intelectual,

RDNPM, atraso de linguagem, dificuldade de aprendizagem, refluxo

gastroesofágico, escoliose, coloboma de íris, atrofia cerebral, anomalias de

corpo caloso, hipoplasia cerebelar e polimicrogiria.

Não foi encontrada nenhuma CNV semelhante em indivíduos no DGV. No

DECIPHER não existem duplicações semelhantes, apenas com tamanho muito

superior e com sinais clínicos distintos. Há apenas a ocorrência de duplicações

maiores, com sinais clínicos semelhantes, que incluem deficiência intelectual,

atraso de desenvolvimento e linguagem, dificuldade de aprendizagem e

microcefalia (2050; 1617; 289076 e 288877). Porém, os indivíduos 2050 e 1617

possuem diversas outras CNVs que podem estar relacionadas ao fenótipo

apresentado por eles. Além disso, a CNV do indivíduo 289076 e do 288877,

estão classificadas como benignas no DECIPHER.

O gene ULK1 (Unc-51 like autophagy activating kinase 1) é um importante

iniciador do processo de autofagia, no qual componentes do citosol e proteínas

96

aberrantes são englobados por vesículas denominadas autofagossomos, sendo

o processo de autofagia relacionado com algumas doenças neurodegenerativas

(Sasaki, 2011; Tanji et al., 2011; Choi et al., 2013; Miki et al., 2016).

O gene PUS1 (Pseudouridylate synthase 1) converte a uridina em

pseudouridina após a incorporação dos nucleotídeos no RNA, estando envolvido

na modificação pós-transcricional de tRNA no citoplasma e na mitocôndria

(Metodiev et al., 2015). Mutações nesse gene causam a síndrome de Miopatia

Mitocondrial e Anemia Sideroblástica (MLASA) (OMIM #600462) (Inbal et al.,

1995; Casas et al., 2004; Cao et al., 2016).

Recentemente a investigação de CNVs em indivíduos com Transposição

das Grandes Artérias (TGA) identificaram uma duplicação em 12q24.33,

englobando oito genes, entre eles, os genes SFSWAP, MMP17, ULK1, PUS1 e

EP400, presentes na duplicação encontrada no paciente 20, sugerindo que

esses genes conferem risco aumentado para TGA (Constain et al., 2016).

Duplicações apenas da região 12q24.33 não são comuns na literatura, a

grande maioria das duplicações que afetam essa região são oriundas de

duplicações maiores, e originadas a partir de translocações cromossômicas

(Chen et al., 2006; Chen et al., 2013; Tezcan e Bredaki, 2015).

Com base nas informações mencionadas acima, a CNV encontrada no

paciente pode ser classificada como uma variante de significado incerto, não

havendo elementos concretos que a relacionem com os sinais clínicos

observados no paciente.

Paciente 43

O paciente 43, do sexo masculino, apresentou uma duplicação em Xq24-

q26.1 (10.587 Mb; 119.113.155 – 129.700.543 - GRCh37/hg19). A mesma

duplicação na região Xq24-q26.1 foi encontrada na genitora e na irmã do

paciente. A região duplicada dos três indivíduos engloba 39 genes, entre eles os

genes GRIA3, THOC2, XIAP e STAG2.

O paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: microcefalia, fenda

labiopalatal, orelhas dismórficas e de implantação baixa, nariz desabado, fendas

palpebrais estreitas e oblíquas para cima, sinofre, assimetria facial, RDNPM,

sobreposição dos dedos do pé, hiperxtensibilidade articular, criptorquidia

97

bilateral, escoliose, heterotopia de substância cinzenta e polimicrogiria. A irmã

apresenta microcefalia, atraso de desenvolvimento, deficiência intelectual,

hiperatividade e refluxo gastroesofágico. A mãe não apresenta nenhum sinal

aparente.

Duplicações de diferentes tamanhos e que englobam a CNV encontrada

no paciente 43 são descritas em indivíduos presentes no DECIPHER. A maioria

delas com fenótipo de deficiência intelectual, atraso de desenvolvimento,

distúrbios de fala (275289; 279051; 290060; 285400; 287249; 250183; 285178;

300665; 307707; 273458) e um indivíduo com heterotopia de substância

cinzenta periventricular, hipoplasia cerebelar, dislexia e distúrbios cognitivos

(283869). Não há relatos dessa CNV presente em indivíduos descritos no DGV.

Duplicações na extensão do cromossomo X em homens podem levar um

fenótipo mais grave, decorrente da dissomia funcional dos genes duplicados,

enquanto mulheres heterozigotas para as mesmas alterações, podem ser

fenotipicamente normais, ou ter uma apresentação mais leve do fenótipo, como

consequência da inativação do cromossomo X (Cheng et al., 2005; Bonnet et al.,

2009; Moller et al., 2014; Philippe et al., 2013; Di Benedetto et al., 2014).

Microduplicações na região Xq25 vêm sendo relatadas nos últimos anos,

principalmente após a implementação das técnicas de array. Duplicações que

envolviam o gene GRIA3 foram associadas com o fenótipo de deficiência

intelectual (Chiyonobu et al., 2007; Bonnet et al., 2009; Guilmatre et al., 2009).

Também foram encontradas duas duplicações (1.2 e 5 Mb) em indivíduos com

deficiência intelectual e dismorfismos faciais, sugerindo que a duplicação dos

genes GRIA3 e STAG2 poderiam contribuir para as manifestações fenotípicas

observadas nesses indivíduos (Philippe et al., 2013).

A comparação dos indivíduos descritos até o momento, juntamente com

mais oito indivíduos de duas famílias, com duplicações com tamanho de

aproximadamente 600 kb, e com fenótipos semelhantes, possibilitou a

delimitação de uma região crítica de aproximadamente 270 kb, envolvendo os

genes XIAP e STAG2, sugerindo que esses dois genes são responsáveis pela

deficiência intelectual, atraso de fala e a face característica presente nos

indivíduos (hipoplasia malar, prognatismo, queda palpebral, epicanto, lábios

finos e face hipotônica) (Di Benedetto et al., 2014).

98

Essa região crítica, mais tarde foi refinada para 173 kb, envolvendo

apenas o gene STAG2, sugerindo que a microduplicação Xq25 é uma condição

genética clinicamente reconhecida, causada principalmente pela duplicação do

gene STAG2, que de algum modo acaba criando uma instabilidade nos outros

genes da região, sendo responsável, principalmente, pelo fenótipo de deficiência

intelectual (Leroy et al., 2015).

O gene GRIA3 (Glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 3) é um

tipo de receptor de glutamato ionotrópico, que são repectores de

neurotransmissão excitatória no cérebro dos mamíferos, ativados em inúmeros

processos neurofisiológicos normais, sendo esse gene já relacionado ao retardo

mental ligado ao X (Ozawa et al., 1998).

O gene THOC2 (THO complex 2) é uma proteína do complexo THO, que

faz parte do processo de transcrição/exportação (TREX), envolvido no processo

de exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma, e também na integridade

do genoma (Wang et al., 2013). Uma translocação (X;8) com ponto de quebra

resultando na desregulação do gene THOC2, já foi descrita em uma menina com

atraso motor e de fala, distúrbios comportamentais e hipoplasia cerebelar

congênita (Di Gregorio et al., 2013). Mutações no gene THOC2 já foram

relacionadas com deficiência intelectual ligada ao X (Kumar et al., 2015).

O gene XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) é um inibidor de apoptose

que está implicado na regulação da morte neuronal, distúrbio que pode levar a

manifestações neurológicas (Christie et al., 2007). A expressão aumentada do

gene XIAP, induz poliubiquitinação e a degradação de proteínas PTEN, que é

uma causa conhecida de doenças neurológicas, como o autismo e a deficiência

intelectual (Van Themsche et al., 2009).

O gene STAG2 (Stromal antigen 2) codifica uma proteína que é

componente do complexo de coesão, complexo essencial para a manutenção da

união entre as cromátides irmãs durante a segregação cromossômica, no

processo de divisão celular, também estando envolvido em outros processos

celulares, como a replicação do DNA, controle da expressão gênica, formação

da heterocromatina e reparo do DNA (Solomon et al., 2011; Kim et al., 2012).

Duplicações em genes que fazem parte do complexo de coesão, têm sido

associadas com deficiência intelectual e anomalias craniofacias (Yan et al.,

2009; Baquero-Montoya et al., 2013) e talvez o aumento da expressão do gene

99

STAG2 possa contribuir para distúrbios de desenvolvimento e anomalias

craniofacias.

A duplicação encontrada no paciente envolve os genes GRIA, XIAP,

THOC2 e STAG2, todos expressos e envolvidos em processos no cérebro

humano. Todos os indivíduos portadores de microduplicações na região Xq25

envolvendo esses genes, tem sinais clínicos semelhantes que incluem

deficiência intelectual e a face característica.

A duplicação dos genes GRIA3, XIAP, THOC2 e STAG2 podem estar

relacionadas com o atraso de desenvolvimento, distúrbios na fala e no

comportamento, deficiência intelectual e outros dismorfismos faciais observados

no paciente e em sua irmã. Além disso, os demais genes duplicados, ou em

combinação, podem estar associados aos demais sinais clínicos apresentados

pelo paciente. O fenótipo mais leve observado na irmã, como o fenótipo normal

observado na genitora é esperado, devido à inativação do cromossomo X. É

necessária a investigação do padrão de inativação do cromossomo X na genitora

e na irmã, na tentativa de identificar se há uma inativação preferencial do

cromossomo X. Além da análise em linfócitos de sangue periférico, a

investigação em outros tecidos seria interessante, para efeito de comparação,

visto que os genes presentes na região duplicada apresentam lugares distintos

de expressão. Uma alternativa seria a análise em células do epitélia bucal, onde

foi mostrado que existe uma forte correlação entre os padrões de inativação

encontrados nessas células, com o de regiões onde é mais difícil de se obter

células, como por exemplo, o cérebro (de Hoon et al., 2015).

A CNV presente no paciente pode ser considerada patogênica, levando

em consideração os sinais clínicos e os genes acima mencionados. No que diz

respeito a genitora e a irmã, o fenótipo mais leve poderia ser justificado pela

inativação preferencial do cromossomo X.

Paciente 47

A paciente 47, do sexo feminino, apresentou uma deleção em Xq21.1

(6.821 Mb; 77.398.962 – 84.220.346 - GRCh37/hg19). A deleção envolve 17

genes, destacando-se os genes TBX22, BRWD3 e POU3F4.

100

A paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: fenda palatal, orelhas

dismórficas e de implantação baixa, face alongada, queda palpebral, RDNPM,

dificuldade de aprendizagem, hipoacusia condutiva à direita e mista à esquerda,

cisto do septo pelúcido, cavum vergão, cavum do céu interposto, proeminências

do espaço subaracnóide nos lobos parietais, constipação e ânus imperfurado.

No DECIPHER há a descrição de três casos com deleções maiores e

menores, envolvendo os genes TBX22, BRWD3 e POU3F4, em mulheres que

apresentam alguns sinais clínicos frequentes e que estão presentes na paciente,

como deficiência intelectual, atraso de desenvolvimento, fenda palatal,

dismorfismos faciais, deficiência auditiva e constipação (272627; 256233 e

274363). Não há descrição dessa deleção em indivíduos descritos no DGV.

Na literatura não foi encontrado nenhum relato de mulheres com deleção

patogênica, semelhante com a encontrada na paciente. Uma deleção de 5.8 Mb

foi descrita em um menino com deficiência intelectual, fenda palatal, deficiência

auditiva, baixa estatura e dismorfismos faciais. A deleção foi herdada da mãe,

que apresentava um fenótipo mais brando, incluindo leves dismorfismos faciais,

mãos grandes e deficiência auditiva (Giordano et al., 2015).

O gene TBX22 (T-box 22) codifica um fator de transcrição t-box e está

envolvido no processo de palatogênese (Braybrook et al., 2002; Bush et al.,

2002). Mutações no gene TBX22 são conhecidas como causa de fenda palatal

com anquiloglossia ligada ao X dominante, assim como fenda palatal isolada

(Andreou et al., 2007). Outras mutações de ponto, deleções, inserções ou

duplicações entre 1 a 3 pares de base no gene TBX22, levando a uma proteína

truncada ou a substituição do aminoácido, também são a causa de fenda palatal

isolada ou ligada ao X com anquiloglossia (Braybrook et al., 2001; Marcano et

al., 2004; Chaabouni et al., 2005; Pauws et al., 2013). Mutações na região

promotora, que causam a perda de função do TBX22, também foram associadas

à fenda palatal (Fu et al., 2015).

O fenótipo de indivíduos com mutações no gene TBX22 é variável mesmo

em indivíduos da mesma família, desde mulheres assintomáticas até homens e

mulheres apresentando sinais como: úvula bífida, fenda palatal submucosa e

fenda palatal com presença de anquiloglossia com padrão de herança ligado ao

X dominante (Pauws et al., 2013).

101

O gene BRWD3 (Bromodomain and WD repeat domain containing 3) é

expresso em diversos tecidos, incluindo o cérebro, e também durante o

desenvolvimento embrionário. Foi descoberto pela primeira vez no ponto de

quebra de uma translocação (X;11) (Kalla et al., 2005).

Foi demonstrado que o gene BRWD3 desempenha um importante papel

na ubiquitinação, como parte do sistema ubiquitina/proteassomo (Ozturk et al.,

2013). Esse sistema é fundamental no desenvolvimento do cérebro, sendo

regulador na plasticidade sináptica e na formação da memória de longo prazo

(Jarome et al., 2013).

Em homens, mutações que causam a perda de função do gene BRWD3

são associadas com fenótipos de deficiência intelectual, macrocefalia,

dismorfismos faciais, problemas esqueléticos e distúrbios comportamentais

(Field et al., 2007; Grotto et al., 2014).

O gene POU3F4 (POU class 3 homeobox 4) é expresso principalmente

no cérebro, ouvido interno e no pâncreas nos mamíferos (Tantin, 2013),

desempenhando função na regulação das células tronco neurais, diferenciação

do hipotálamo e desenvolvimento do ouvido interno (Andersen e Rosenfeld,

2001).

A surdez de causa genética tem, na maioria das vezes, um padrão de

herança autossômico (75% recessivo; 20% dominante) e aproximadamente de

1 a 5% são ligadas ao X (Petersen et al., 2008). Uma das causas mais comuns

de surdez ligada ao X, são mutações no gene POU3F4 ou pequenas deleções

em uma região de 900 kb adjacente ao gene, causando problemas em seus

elementos regulatórios (De Kok et al., 1996; Li et al., 2010).

Os genes TBX22, BRWD3 e POU3F4 podem contribuir para a fenda

palatal, deficiência intelectual e deficiência auditiva encontrados na paciente.

Espera-se que alterações no cromossomo X possam ter consequências

mais graves em homens do que em mulheres, devido à dissomia funcional e à

inativação preferencial do cromossomo X, respectivamente. O fato da mãe do

indivíduo com a deleção de 5.8 Mb (Giordano et al., 2015) apresentar um

fenótipo mais brando, comparado com os sinais encontradas na nossa paciente,

indica que ela possa ter o cromossomo X alterado preferencialmente inativado.

Baseado na descrição acima, como ainda não sabemos o padrão de

inativação do cromossomo X dessa paciente, embora essa deleção seja

102

parcialmente patogênica, no momento essa CNV foi classificada como uma

variante de significado incerto.

Paciente 49

A paciente 49, do sexo feminino, apresentou uma deleção em 16p11.2

(0.894 Mb; 29.427.215 – 30.321.320 - GRCh37/hg19), localização genômica que

compreende uma síndrome conhecida, a síndrome de microdeleção 16p11.2

(OMIM #611913) caracterizada por uma deleção de aproximadamente 593 kb

entre as posições genômicas 29.6 – 30.2 Mb (GRCh37/hg19).

A paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: insuficiência mitral,

fenda palatal submucosa, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, disfagia,

dismorfismos faciais, deficiência intelectual, RDNPM, atraso de linguagem,

dificuldade de aprendizagem e obesidade.

No DECIPHER há a descrição de diversos indivíduos apresentando CNVs

que compreendem a região descrita da síndrome de microdeleção 16p11.2,

sobrepondo a deleção e sinais clínicos encontrados na paciente 49.

A região 16p11.2 possui blocos de sequências repetitivas de DNA (LCRs)

que possuem 99.5% de homologia, e predispõe um pareamento desigual

durante a meiose, ocasionando a deleção em 16p11.2 (Ghebranious et al.,

2007).

A primeira descrição de deleção na região 16p11.2 foi em um indivíduo

com retardo de crescimento, malformações congênitas e dismorfismos faciais,

onde foi detectada por meio do cariótipo e posteriormente confirmada por CGH

(Comparative Genomic Hybridization - CGH) (Hernando et al., 2002).

A partir do uso das técnicas de array, outras deleções na região 16p11.2-

p12.2 começaram a ser descritas frequentemente, como, por exemplo, deleções

de aproximadamente 7 a 8 Mb em quatro indivíduos, com fenótipos que incluem

dismorfismos faciais, fendas orofaciais, defeitos cardíacos, infecções

recorrentes, baixa estatura, hipotonia, atraso cognitivo e de desenvolvimento

(Ballif et al., 2007), além de outros indivíduos com deleções e fenótipos

semelhantes em 16p11.2-p12.2 (Battaglia et al., 2009; Hempel et al., 2009).

Deleções menores, envolvendo a região conhecida da síndrome, vêm

sendo relatadas, com fenótipos variáveis, evidenciando uma heterogeneidade

103

fenotípica, que inclui o autismo, deficiência intelectual, anomalias das válvulas

aórticas, atraso de desenvolvimento, problemas comportamentais, dismorfismos

faciais, epilepsia, microcefalia e obesidade de início precoce (Ghebranius et al.,

2007; Weiss et al., 2008; Marshall et al., 2008; Biljsma et al., 2009; Shimojima et

al., 2009; Bochukova et al., 2010; Shinawi et al., 2010).

Diante dos sinais clínicos apresentados pela paciente, que corresponde

normalmente aos encontrados em indivíduos com essa síndrome, além da

extensão da deleção, que sobrepõe a região crítica da síndrome, podemos

concluir que a CNV encontrada é patogênica, correspondendo à síndrome de

microdeleção 16p11.2.

Paciente 102

A paciente, do sexo feminino, 102 apresentou uma deleção em 3p26.1

(606 kb; 7.068.146 – 7.674.195 - GRCh37/hg19). Essa região contém apenas o

gene GRM7.

A paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: fenda palatal

submucosa, insuficiência velofaríngea, voz anasalada, face alongada,

hipertelorismo, queda palpebral, fendas palpebrais estreitas, hipoplasia malar,

imunodeficiência, RDNPM, atraso de linguagem, dificuldade de aprendizagem,

refluxo gastroesofágico e esquizofrenia.

Não foi encontrada descrição semelhante à essa CNV no DGV. No

DECIPHER apenas um indivíduo (288127) apresentava uma CNV semelhante,

porém com tamanho menor e classificada como benigna. Entretanto

apresentava outra CNV classificada como possivelmente patogênica, além de

um fenótipo distinto da nossa paciente.

O gene GRM7 (Glutamate metabotropic receptor 7) é um dos tipos de

receptores de glutamato metabotrópicos. Esses receptores tem um papel

importante na função do cérebro, estando presente em todas as regiões

envolvidas com a aprendizagem, memória, ansiedade e percepção da dor. Além

disso, estão altamente expressos nos neurônios pré e pós-sinápticos no

cerebelo, córtex cerebral, hipocampo, córtex cingulado e córtex frontal

(Shigemoto et al., 1997; O’Connor et al., 2010). Devido a sua atuação na

104

comunicação neuronal e na sinaptogênese, os receptores de glutamato

controlam diversos processos celulares e cognitivos (Riedel et al., 2003).

Alguns trabalhos já associaram polimorfismos no gene GRM7 com

esquizofrenia (Ohtsuki et al., 2008; Ganda et al., 2009; Shibata et al., 2009),

transtorno bipolar (Alliey-Rodrigues et al., 2011; Kandaswamy et al., 2014),

déficit de atenção e hiperatividade (Mick et al., 2008; Park et al., 2013) e autismo

(Yang e Pan, 2013).

Recentemente algumas CNVs foram encontradas dentro do gene GRM7,

todas relacionadas com fenótipos de autismo, transtorno bipolar, atraso de

desenvolvimento, deficiência intelectual (Elia et al., 2011; McQuillin et al., 2011;

Kandaswamy et al., 2014; Liu et al., 2015). Todavia, nenhuma CNV descrita

nesses indivíduos possui um tamanho semelhante ao encontrado em nossa

paciente.

Diante dos achados da literatura, que associam polimorfismos no gene

GRM7 com esquizofrenia, além da CNV estar presente em quase toda extensão

do gene, englobando a grande maioria dos polimorfismos descritos, e com base

na função e atuação do gene GRM7, é provável que a CNV encontrada nesse

gene possa estar relacionada com o quadro de esquizofrenia apresentado pela

paciente, além de contribuir para a deficiência intelectual. No entanto, é

necessária a análise funcional desse gene, a fim de esclarecer sua contribuição

com esses quadros mencionados acima. Dessa maneira, no momento, essa

CNV permanece classificada como uma variante de significado incerto, porém,

com um potencial patogênico que ainda necessita ser esclarecido.

Paciente 206

A paciente 206, do sexo feminino, apresentou uma duplicação em 6p25.3-

p24.1 (11.472 Mb; 156.974 – 11.629.164 – GCRh/hg19) e uma deleção em

9p22.3-p24.3 (14.921 Mb; 203.861 – 15.125.789 – GCRh/hg19), decorrente de

uma translocação envolvendo os cromossomos 6 e 9

(46,XX,der(9)t(6;9)(p24;p22) que foi herdada da genitora, portadora da

translocação de forma aparentemente equilibrada.

A paciente apresenta os seguintes sinais clínicos: fenda palatal, palato

alto e estreito, voz anasalada, assimetria facial, hipertelorismo, fendas palpebrais

105

estreitas, boca pequena, pescoço curto e alado, orelhas assimétricas e de

implantação baixa, atraso motor e de linguagem, dificuldade de aprendizagem,

deficiência intelectual, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH),

deficiência auditiva, paralisia do IV par craniano, agenesia renal unilateral e

frouxidão ligamentar.

A duplicação em 6p25.3-p24.1 envolve 78 genes, entre eles, os genes

FOXF2, FOXC1, SERPINB6, NRN1, RREB1, TFAP2A e OFCC1.

No DECIPHER há a descrição de sete indivíduos com duplicação em 6p

(261723; 257370; 291515; 284585; 261470; 253176 e 287064). O indivíduo

291515 apresenta uma duplicação terminal em 6p (11.6 Mb) e uma deleção

terminal em 9p (3.2 Mb), entretanto há apenas um sinal clínico descrito nesse

indivíduo (ptose palpebral). O indivíduo 284585 apresenta uma duplicação

terminal em 6p (5.9 Mb) e sinais clínicos em comum com a paciente 206, entre

eles, atraso de desenvolvimento, atraso motor, fenda palpebral e agenesia renal

unilateral. Não há a descrição dessa duplicação em indivíduos escritos no DGV.

Duplicações intersticiais e distais envolvendo o braço curto do

cromossomo 6, fazem parte de um grupo de alterações cromossômicas,

caracterizado por retardo de crescimento pré e pós-natal, atraso de

desenvolvimento, deficiência intelectual, dismorfismos faciais característicos,

deficiência auditiva, malformações congênitas (mais comumente cardiopatias),

defeitos renais e oculares (Giardino et al., 2002; Jankauskienė et al., 2016). A

maioria dos indivíduos com duplicação em 6p possui um cromossomo derivado

de uma translocação balanceada, resultando assim em uma deleção terminal de

qualquer outro cromossomo e uma duplicação terminal em 6p (Giardino et al.,

2002).

O gene FOXF2 (Forkhead box F2) faz parte de uma família de genes (Fox)

que são fatores de transcrição que se ligam ao DNA. Alguns genes da família

Fox, incluindo o FOXF2, já foram encontrados expressos no mesênquima facial

derivado da crista neural, sugerindo que esses fatores de transcrição podem

estar mediando a função de algumas vias no desenvolvimento craniofacial

(Jeong et al., 2004). Mutações no gene FOXF2 já foram descritas em indivíduos

com fenda palatal (Jochumsen et al., 2008). Alguns trabalhos sugerem a

participação do gene FOXF2 no desenvolvimento palatal em modelo animal,

106

sugerindo que mutações nesse gene contribuem com casos de fenda palatal

(Wang et al., 2003; Nik et al., 2016; Xu et al., 2016).

A região genômica OFC1 (Orofacial Cleft 1) está presente na banda p24.3

do cromossomo 6, e há evidências de que essa região possui algum papel na

etiologia de diversos casos com fendas orofaciais, originadas devido a

alterações cromossômicas nessa região (Davies et al., 1995; Davies et al., 1998;

Chen et al., 2009). Dentro dessa região, estão presentes os genes TFAP2A e

OFCC1.

O gene OFCC1 (Orofacial cleft 1 candidate 1) codifica uma proteína de

função desconhecida, porém é expresso no palato alto (Davies et al., 2004) e

está associado com a presença de fendas orofaciais (Davies et al., 2004;

Salahshourifar et al., 2011).

O gene TFAP2A (Transcription factor AP-2 alpha) é um membro da família

AP-2 de fatores de transcrição, sendo expresso durante o desenvolvimento

embrionário nos arcos branquiais, na crista neural e na epiderme presuntiva (Luo

et al., 2003). Mutações nesse gene estão implicadas como uma das causas da

síndrome Branquio-óculo-facial (BOFS) (OMIM #113620) (Milunsky et al., 2011),

que entre outros sinais clínicos, apresenta fendas orofaciais.

O gene FOXC1 (Forkhead box C1) codifica um fator de transcrição que

regula a expressão de alguns genes, entre eles o gene NPHS2 (NPHS2 podocin)

que é o gene da podocina, uma proteína com função renal, sendo que mutações

nesse gene causam defeitos renais (He et al., 2014). Anomalias congênitas dos

rins e trato urinário (Congenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract –

CAKUT) são vistas nas duplicações em 6p, e o gene FOXC1 pode ser um

importante fator causal dessas anomalias nesses indivíduos (Yoshimura-

Furuhata et al., 2015). A duplicação do gene FOXC1 não pode ser considerada

o único fator genético para o surgimento das CAKUT, outros genes presentes

nas regiões duplicadas podem ter alguma contribuição etiológica (Yoshimura-

Furuhata et al., 2015). Variações no número de cópias no gene FOXC1 também

já foram associadas com defeitos no desenvolvimento ocular (Lehmann et al.,

2000).

O gene SERPINB6 (Serpin family B member 6) é expresso nas células

ciliadas do ouvido interno em camundongos (Simarci et al., 2010) e mutações

107

nesse gene estão associadas com perda da audição neurossensorial (Simarci et

al., 2010; Tan et al., 2013).

O gene NRN1 (Neuritin 1) é expresso na diferenciação pós-mitótica dos

neurônios no desenvolvimento do sistema nervoso, nas estruturas neuronais

associadas com a plasticidade (Naeve et al., 1997; Mirza et al., 2004). O gene

RREB1 (Ras responsive element binding protein 1) codifica um fator de

transcrição, sendo expresso em diversos tecidos: coração, placenta, pulmões,

fígado, músculo esquelético, rins e pâncreas (Thiagalingam et al., 1997). A

haploinsuficiência de ambos os genes foi considerada potencialmente

responsável pelos fenótipos de deficiência intelectual, atraso de

desenvolvimento e dismorfismos faciais visto em alguns indivíduos (Kuipers et

al., 2013). Em outro trabalho, a haploinsuficiência do gene NRN1 também já foi

sugerida como responsável pelo atraso de desenvolvimento (Qi et al., 2015).

A deleção em 9p24.3-p22.3 envolve 52 genes, entre eles, os genes

DOCK8, KANK1, VLDLR e PTPRD.

Diversas deleções estão descritas em indivíduos inseridos no DECIPHER,

envolvendo totalmente ou parcialmente a região deletada na paciente. Dentre os

sinais clínicos presentes nesses indivíduos, que também estão presentes na

paciente, destacam-se os seguintes: deficiência intelectual, atraso de

desenvolvimento, atraso motor e de linguagem, fenda palatal, dismorfismos

faciais, orelha de implantação baixa e deficiência auditiva. Não há descrição

dessa deleção em nenhum indivíduo descrito no DGV.

Monossomias de parte do braço curto do cromossomo 9 resultam na

síndrome de deleção 9p (OMIM #158170), que apresenta um fenótipo variável,

dependendo do tamanho da deleção, incluindo: deficiência intelectual, atraso de

desenvolvimento, motor e de fala, hipotonia, trigonocefalia, dismorfismos faciais,

orelhas de implantação baixa, palato alto e estreito e anomalias genitais, entre

outros (Swinkels et al., 2008). Anomalias gonadais e genitais são

frequentemente observadas em indivíduos com deleção em 9p, ocorrendo na

região mais distal, sendo atribuídas aos genes DMRT1, DMRT2 e DMRT3.

Em alguns casos, monossomia parcial em 9p está associada a

translocações desbalanceadas (Witters et al., 2004; Brisset et al., 2006).

O gene DOCK8 (Dedicator of cytokinesis 8) pertence à família de

proteínas dedicador de citocinese DOCK-180, que participam da reorganização

108

do citoesqueleto (Ruusala e Aspenstrom, 2004). O gene DOCK8 é expresso em

múltiplas regiões do cérebro humano, e está relacionado com retardo mental

com padrão autossômico dominante MRD2 (OMIM #614113) (Griggs et al.,

2008). Há relatos de indivíduos com deleção do gene DOCK8 apresentando

deficiência intelectual e atraso de fala (Griggs et al., 2008; Hauge et al., 2008).

O gene KANK1 (KN motif and ankyrin repeat domains 1) codifica uma

proteína envolvida na regulação da polimerização da actina e mobilidade celular,

sendo expresso no cérebro fetal, células tubulares renais, células glandulares do

cólon e órgãos digestivos. Além disso, a deleção no gene KANK1 foi associada

com paralisia cerebral congênita, quadriplegia espástica e deficiência intelectual

(Lerer et al., 2005). Também foi relatada a deleção do gene KANK1 em uma

família em que os pacientes apresentavam autismo, atraso motor e deficiência

intelectual (Vanzo et al., 2013).

O gene VLDLR (Very low density lipoprotein receptor) codifica um repector

de proteína de baixa densidade, que está envolvido na migração neuronal.

Mutações nesse gene causam ataxia cerebelar autossômica recessiva,

deficiência intelectual e síndrome de desequilíbrio 1 (OMIM #224050) (Boycott

et al., 2005; Moheb et al., 2008; Ozaelik et al., 2008; Turkmen et al., 2008).

O gene PTPRD (Protein tyrosine phosphatase, receptor type D) é um

receptor do tipo tirosina fosfatase que está associado com trigonocefalia (Jehee

et al., 2005; Mtsui et al., 2013). A deleção homozigota desse gene foi sugerida

como causa de trigonocefalia, deficiência auditiva e deficiência intelectual em um

indivíduo (Choucair et al., 2015).

Os genes FOXF2, OFCC1 e TFAP2A estão presentes no

desenvolvimento palatal, havendo relatos que mutações acometendo os

mesmos são as causas de fendas orofaciais, inclusive fenda palatal. A paciente

apresente fenda palatal e palato alto e estreito, podendo a expressão

aumentada, ou a perda de função devido a duplicação desses genes, estar

relacionado de alguma maneira ao fenótipo apresentado por ela.

Os genes SERPINB6 e PTPRD já foram associados com deficiência

auditiva, e podem estar relacionados com a deficiência auditiva apresentada pela

paciente. O gene FOXC1 que está associado a defeitos renais, pode estar

relacionado com a agenesia renal unilateral encontrada na paciente.

109

Os genes NRN, DOCK8, KANK1, VLDLR e PTPRD, já foram

demonstrados acima que estão envolvidos com fenótipos de deficiência

intelectual, atraso desenvolvimento, motor e de fala, além de dismorfismos

faciais, podem estar relacionados a esses mesmos fenótipos que também foram

encontrados na paciente.

Há evidências suficientes que suportam a classificação dessas CNVs

como patogênicas. Porém, não se pode descartar que outros genes que não

foram mencionados acima, e que estão dentro das regiões acometidas pela

duplicação e pela deleção, podem estar envolvidos, de algum modo, na

manifestação clínica observada na paciente.

A variabilidade etiológica da presente casuística revela as dificuldades na

abordagem clínica de indivíduos com anomalias congênitas e déficit intelectual.

Retrata, também, as estratégias possíveis para conclusão diagnóstica e, ainda,

as incertezas decorrentes de achados laboratoriais que não estão bem

caracterizados quanto à sua patogenicidade. Todos esses aspectos decorrem

da raridade de cada condição clínica e do avanço tecnológico, que permitiu

demonstrar achados genômicos, levantando hipóteses a serem elucidadas.

110

7. Conclusões

Este estudo permitiu concluir que:

A caracterização dos pontos de quebra evidenciou genes presentes na

região varialvemente deletada que tem funções conhecidas e

relacionadas com a S. Del 22q11.2.

A correlação genótipo-fenótipo entre os indivíduos com deleção 22q11.2

e em grupo de indivíduos controle, não permite delinear um padrão

característico para esta condição clínica, não mostrando uma associação

significante entre outras CNVs no genoma e a presença de deleção em

22q11.2 nos 27 indivíduos com a S. Del 22q11.2. Entretanto, o tamanho

amostral pode ter influenciado neste resultado.

Algumas CNVs encontradas possuem genes que são expressos ou

exercem função que podem ser relacionas com parte do quadro clínico

apresentado pelos indivíduos com deleção 22q11.2 Assim, é necessário

a confirmação dessas CNVs e o estudo funcional desses genes para

determinação de correlação genótipo-fenótipo.

Dos 32 casos em que a hipótese de S. Del 22q11.2 não foi confirmada,

quatro apresentaram CNVs patogênicas e quatro CNVs de significado

incerto, classificadas após a combinação de diferentes técnicas

laboratoriais. Contudo, em algumas situações, a investigação dos

genitores poderá contribuir para o diagnóstico final.

111

8. Referências

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140

10. Anexos

10.1. Parecer do Comitê de Ética em pesquisa da Unicamp.

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10.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

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10.3. Análise estatística dos grupos A1 x B1 e A2 x B2

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Documents

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE …€¦ · genótipo-fenótipo e investigação de outras CNVs (Copy Number Variations) no genoma, foram incluídos 27 indivíduos