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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
MICHELI SEVERO SIELSKI
“EFEITO DOS GLICOSAMINOGLICANOS: HEPARINA, HEPARINA DE
BAIXO PESO MOLECULAR E DERMATAN SULFATO NA TROMBOSE
ARTERIAL E NA FORMAÇÃO DA CAMADA NEOINTIMA EM
CAMUNGONGOS”
CAMPINAS
2019
MICHELI SEVERO SIELSKI
EFEITO DOS GLICOSAMINOGLICANOS: HEPARINA, HEPARINA DE BAIXO
PESO MOLECULAR E DERMATAN SULFATO NA TROMBOSE ARTERIAL E NA
FORMAÇÃO DA CAMADA NEOINTIMA EM CAMUNGONGOS
ORIENTADORA: PROF(A). DR(A). CRISTINA PONTES VICENTE
CAMPINAS
2019
Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Biologia Celular e Estrutural do
Instituto de Biologia da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do
título de Doutora em Biologia Celular
e Estrutural, na Área de BIOLOGIA
CELULAR
Este arquivo digital corresponde à
versão final da Tese defendida pela
candidata Micheli Severo Sielski e
orientada pela profa. Dra. Cristina
Pontes Vicente
Campinas, 12 de dezembro de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Dra. Cristina Pontes Vicente (Orientadora)
Dr. Mauro Sérgio Gonçalves Pavão
Dra. Silvia Borges Pimentel de Oliveira
Dra. Juliana Aparecida Preto de Godoy
Dra. Maria Andréia Delbin
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Biologia
Celular e Estrutural do Instituto de Biologia.
AGRADECIMENTOS
Ao Pai eterno, criador, gratidão pela vida, pela família, pelos amigos, por pessoas
maravilhosas que tem colocado em meu caminho. Pelas dificuldades que nos tornam
mais fortes, pelos momentos bons que trazem leveza.
A minha família amada ...Ao meu pai, que ensinou tudo o que pode, sempre fez o
melhor por nós. Pai os ensinamentos foram muitos, e irei levá-los comigo, falhas
tivemos, mas ficaram para trás, e apenas os momentos bons ficaram guardados. A
minha mãe, meu alicerce, meu exemplo de ser humano, paciência e amor. Sem você eu
não conseguiria. Ao meu irmão, amigo e conselheiro, meu presente. Tenho muito
orgulho de ti e da bondade que leva em teu coração. Amo muito vocês.
Á minha orientadora, Cristina, por ter aberto as portas de seu laboratório, pela
confiança depositada, mas principalmente pela paciência, carinho e dedicação que
ensinou e me orientou. Cris minha eterna e sincera gratidão.
Aos meus colegas e amigos de laboratório Luiz e Andressa. Pela ajuda nos
experimentos, troca de ideias, discussões, mas principalmente pelas risadas, palavras
de conforto, por serem um ombro amigo, companhia nos almoços, cafés e conversas.
Vocês fizeram e fazem meus dias melhores.
Aos amigos que de alguma forma estiveram presentes nos últimos 4 anos, e fizeram
parte dessa caminhada: Carol, Andres, Leonardo, Kaleb. Michel.
Ao Toni, pela amizade, ajuda no laboratório, preparo de soluções, conversas e pelas
comidinhas que trouxe, deixando nossos intervalos mais doce (rsrsr).
A amiga Karin, seu incentivo, palavras de conforto foram fundamentais. Pode contar
comigo sempre.
Camila e Eric, pela amizade, ajuda, por todas as comidinhas maravilhosas que fizeram
e me convidaram, por sempre me receberem tão carinhosamente em sua casa, podem
continuar me convidando (rsrsrs).
Giane, minha querida amiga, pela companhia nos cafés da tarde, pelas ideias trocadas,
paciência, ensinamentos, sempre disposta a ajudar.
Juliana, toda sua ajuda foi fundamental na minha caminhada, seu incentivo,
conhecimento compartilhado, contribuiu muito para minha aprendizagem e
crescimento. Sou muito grata a você por toda ajuda e carinho.
A minha família de coração, a qual me adotou e me recebeu tão carinhosamente... Vó
Lurdinha obrigado pela preocupação, pelos cafezinhos quentinhos cheios de carinho.
Japa pela sua amizade tão sincera e verdadeira. Layza e Emily pela companhia e
carinho. Amo vocês.
Aos amigos Cris e Rick, por me acolherem e me ajudarem. Me fortalecer em momentos
difíceis, pelas conversar, viagens. Rick por todas as comidinhas gostosas que fez e
lembrava de mim, pelos cheesecakes, deixando minha estadia aí mais doce. Cris por me
oferecer sua amizade, por toda ajuda, no laboratório e dia-a-dia, pelas experiências
trocadas, conselhos e até pelos puxões de orelha. Vizinho (rsrsr), eu nunca mais vou
esquecer de anotar TUDO no caderno de protocolo.
A Maria B Grant, por abrir as portas de seu laboratório, confiança depositada, sempre
disponível para conversar e ajudar.
Ao time da Drª Grant: Mariana, Sérgio, Cris, Jason, Yvonne, Bright, Rum, Chao,
Dibyendu pelos ensinamentos, ajuda no laboratório, conselhos. Mari, Jason, Cris e
Yvonne pela companhia nas “lectures” e “lunch provided”. Meus 6 meses não teria o
mesmo sentido e alegria sem vocês.
A amiga Ana, pelo carinho e por toda a palavra de conforto nos momentos difíceis.
Dani, obrigada por guardar minha bagunça.
Ao Professor Dr. Claudio, pelas contribuições nos trabalhos, pelo uso de
equipamentos, pelos cafés.
Neto pela ajuda no laboratório, preparo de soluções, conversas trocadas.
Ao Laboratório Multiusuário de Biologia Celular e Molecular (OCRC), pelo
empréstimo do microscópio de fluorescência BX51, Olympus.
Ao Laboratório do Professor Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, pelo
empréstimo do Criostato.
Aos Laboratórios dos professores Dr. Hernandes Carvalho, Dr. Edson Rosa Pimentel,
Dr. Murilo Geraldo, pelo empréstimo de equipamentos e reagente.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 (bolsa
PDSE número do processo 88881.190062/2018-01).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (processo
número 168696/2017-7) pela concessão de parte da bolsa de estudo.
RESUMO
A trombose arterial é caracterizada pela formação de um coágulo no lúmen do vaso em
decorrência a uma ativação ou ruptura endotelial. Após a formação do trombo ocorre o
remodelamento do vaso podendo resultar na proliferação exacerbada das células
musculares lisas (CML) com consequente formação da camada neointima e reestenose
do vaso. Os principais tratamentos para a trombose envolvem a ação de anticoagulantes
como a heparina não fracionada (HNF) e a heparina de baixo peso molecular (HBPM),
estes são glicosaminoglicanos (GAGs) que inibem a cascata de coagulação, mas
apresentam algumas limitações em sua utilização. Desta forma é necessário o estudo de
tratamentos alternativos, como o uso do Dermatan sulfato (DS) que atua como
anticoagulante e vem sendo estudado como tratamento alternativo. Nosso objetivo é
comparar o efeito da HNF, HBPM e do DS, na proliferação e migração das CML
isoladas de aorta de camundongos, e o efeito dos mesmos na trombose arterial e
formação da camada neointima em camundongos. Para tal, isolou-se as CML e testou-
se in vitro sua proliferação e capacidade de migração. Foram feitas também análises in
vivo, onde induziu-se a trombose na carótida com uma sonda metálica e os animais
foram tratados com HNF, HBPM ou DS. Os animais foram sacrificados 3 e 21 dias após
a cirurgia para análise do trombo e da camada neointima. Como resultados, observamos
que todos os GAGs promoveram uma diminuição na proliferação das CML, quando
tratadas por 24 horas, mas não alteram a migração das mesmas. Nas análises in vivo,
houve uma diminuição na área do trombo em todos os grupos tratados em relação ao
grupo controle, sendo que a HBPM e o DS apresentaram valores similares. Na resposta
inflamatória dos vasos 3 dias após a lesão nos diferentes tratamentos, verificou-se uma
diminuição das células marcadas com Ly6G e CD11b, nos grupos tratados com HNF e
DS. Para a molécula de adesão ICAM-1, o grupo tratado com DS, apresentou
diminuição na expressão desta proteína. Sobre o remodelamento da matriz extracelular,
o DS diminuiu a expressão de da MMP-2 latente e ativa e a HNF diminuiu a MMP-2
ativa. Na formação da camada neointima, 21 após a lesão, ocorreu uma diminuição
significativa nos grupos tratados com HNF e DS em relação aos grupos controle e com
HBPM. Nós concluímos que todos os GAGs reduzem a proliferação de CML in vitro e
diminuem a área de trombo após 3 dias. HNF e DS, atuaram no processo inflamatório
diminuindo a presença de células inflamatórias e no remodelamento da matriz
extracelular diminuindo a expressão da MMP-2 ativa, reduzindo deste modo a formação
da camada neointima. Embora o DS apresente uma menor atividade anticoagulante em
relação a HNF e HBPM, ele demonstrou similar resposta anti-inflamatória e de
diminuição da camada neointima com a HNF podendo se sugerir sua utilização como
uma droga coadjuvante no tratamento da trombose arterial e recuperação do vaso após
lesão arterial.
ABSTRACT
Arterial thrombosis is characterized by the obstruction of the artery lumen by the
formation of a clot, which occurs in response to an endothelial injury or activation.
After the formation of the thrombus, remodeling of the vessel occurs, which may result
in the exacerbated proliferation of smooth muscle cells (SMC) with consequent
formation of the neointimal layer and restenosis of the vessel. The main treatments for
thrombosis involve the action of anticoagulants such as unfractionated heparin (UFH)
and low molecular weight heparin (LMWH), these are glycosaminoglycans (GAGs) that
inhibit the coagulation cascade but have some limitations in their use. Thus, it is
necessary to study alternative treatments, such as the use of Dermatan sulfate (DS),
which acts as an anticoagulant and has been studied as an alternative anticoagulant
treatment. The objective of our study is to evaluate and compare the effect of UFH,
LMWH and DS on smooth muscle cell (SMC) proliferation and migration in vitro, and
in arterial thrombosis and neointimal layer in mice. For this purpose, SMC were isolated
and their proliferation and migration capacity were tested in vitro. In the in vivo
analyzes, carotid thrombosis was induced with a metal probe and the animals were
treated with UFH, LMWH or DS. The animals were sacrificed 3 and 21 days after
surgery for analysis of the thrombus and neointimal layer. As results, we observed that
all GAGs decreased SMC proliferation in vitro and there was no difference in cell
migration after 24 hours of treatments. In animals submitted to arterial injury, we
observed a decrease in thrombus area in all treated groups when compared to controls,
with LMWH and DS with similar values. We observed a decrease in the presence of
Ly6G e CD11b positive cells, which are the main markers of inflammatory cells in the
UFH and DS. For the adhesion molecule ICAM-1, the group treated with DS showed a
decrease in the expression of this protein. DS also decreased the expression of latent and
active MMP-2 and UFH decreased active MMP-2. In the formation of the neointimal
layer, 21 after the injury, there was a significant decrease in the groups treated with
UFH and DS compared to the control and LMWH groups.
We conclude that all GAGs can act in SMC cell proliferation in vitro and have reduced
the thrombus area. UFH and DS after 3 days. HNF e DS, decrease the presence of
inflammatory cells ancd acted in matrix remodeling decreasing the expression of active
MMP-2 reducing the formation of the neointimal layer. Although DS has a lower
anticoagulant activity in relation to UFH and LMWH, it demonstrated similar anti-
inflammatory response and capacity to decreased neointimal layer to UFH
demonstrating that it can be used as an adjunct treatment in the treatment of arterial
thrombosis and vessel recovery after injury.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Artéria carótida ........................................................................................................ 21
Figura 2: Esquema do rompimento da placa de ateroma e formação do trombo arterial . 24
Figura 3: Visão geral da cascata de coagulação sanguínea ................................................... 26
Figura 4: Novo modelo da cascata de coagulação .................................................................. 28
Figura 5: Esquema dos principais eventos envolvidos na formação da camada neointima.
..................................................................................................................................................... 31
Figura 6: Unidade dissacarídica da heparina. ........................................................................ 35
Figura 7: Imagem ilustrativa dos locais de atuação da antitrobina na cascata de
coagulação .................................................................................................................................. 36
Figura 8: Fórmula química dos fragmentos da HBPM ......................................................... 39
Figura 9: Imagem ilustrativa do local de atuação da HBPM na cascata de coagulação, ... 40
Figura 10: Molécula de dissacarídeo que compõe o Dermatan sulfato. ............................... 41
Figura 11: Modelo da ativação do HCII, ................................................................................ 42
Figura 13: Desenho experimental do estudo. .......................................................................... 52
Figura 14: Imagem das células de músculo liso isoladas da artéria aorta de camundongos.
..................................................................................................................................................... 56
Figura 15: Imunofluorescência das células de músculo liso.. ................................................ 57
Figura 18: Proliferação celular por MTT ............................................................................... 60
Figura 19 : Cicatrização das células de músculo liso in vitro ................................................ 61
Figura 20: Zimografia in vitro para atividade das gelatinases nas células de músculo liso
extraídas da aorta de camundongo .......................................................................................... 62
Figura 21: Tempo de TTPa ...................................................................................................... 64
Figura 22: Tempo de trombina (TP) do plasma dos camundongos, ..................................... 65
Figura 23: Cortes transversais das artérias carótidas de camundongos C57Bl6 ................ 66
Figura 24: Porcentagem da área de trombo das artérias carótidas 3 dias após a lesão
arterial ........................................................................................................................................ 67
Figura 25: Número de células marcada para ICAM-1. ......................................................... 68
Figura 26: Imunofluorescência para ICAM-1 ........................................................................ 69
Figura 27: Número de células marcadas para Ly6G no lúmen das artérias carótidas. ...... 70
Figura 28: Imunofluorescência para LY6g ............................................................................. 71
Figura 29: Número de células marcadas para CD11b nas artérias carótidas ..................... 72
Figura 30:Imunofluorescência para CD11b de artérias carótidas lesionadas de
camundongos C57Bl06 .............................................................................................................. 73
Figura 31: Número de células marcadas para CD34 nas artérias carótidas, 3 dias após a
lesão ............................................................................................................................................ 74
Figura 32:Imunofluorescência para CD34 de artérias carótidas lesionadas de
camundongos C57Bl06. ............................................................................................................. 75
Figura 33: Zimografia para MMP-2 e MMP-9 na artéria carótida de camundongo
C57BL06 3 dias após lesão........................................................................................................ 76
Figura 34: Zimografia para MMP-9 ativa. ............................................................................. 77
Figura 35: Zimografia para MMP-2 latente. ......................................................................... 78
Figura 36: Zimografia para MMP-2 ativa. ............................................................................. 79
Figura 37: Cortes transversais das artérias carótidas de camundongos .............................. 80
Figura 38: Porcentagem da área de neointima das artérias carótidas 21 dias após a lesão
arterial ........................................................................................................................................ 81
Figura 39:Imunofluorescêsncia para CD31 ............................................................................ 82
Figura 40: Número de células CD31 positivas nas artérias carótidas de camundongos ..... 83
Figura 41: Zimografia in situ da artéria carótida de camundongo C57Bl6, 21 dias após a
lesão ............................................................................................................................................ 85
Figura 42: Atividade in situ das gelatinases nas artéria carótida de camundongos, 21 dias
após a lesão. ................................................................................................................................ 85
Figura 43: Formação do trompo após lesão arterial. ............................................................. 96
Figura 45: Formação do trombo e a atuação da HBPM ........................................................ 97
Figura 46: Formação do trombo e a atuação do DS .............................................................. 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ApoB- Apolipoproteína B
AT- Antitrombina
AVC- Acidente vascular cerebral
BSA- Albumina de soro bovino
CD34- Cluster of Differentiation 34
CD11b- Cluster of Differentiation 11b
CD31- Cluster of Differentiation 31
C57bl/6- Camundongo da linhagem black 6
DAPI- 4`6 diamino -2 fenilindole
DMEM- meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco
DS- Dermatan sulfato
FITC- Isotiocianato de Fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate)
FT- Fator tecidual
GAG- Glicosaminoglicano
HBPM- Heparina de baixo peso molecular
HCII- Cofator II da heparina
HIT- Trombocitopenia induzida por heparina
HNF- heparina não fracionada
ICAM-1 – Molécula de adesão intercelular (CD54)
LDL- Lipoproteína de baixa densidade
Ly6g- Antígeno linfocitário do complexo 6, locus G
MEC- Matriz extra-celular
MMP- Metaloproteinases
OMS- Organização mundial de saúde
PK- Prekallikrein
PAI-1 - Inibidor do ativador de plasminogênio tipo 1
PDGF- Fator de crescimento derivado de plaquetas
PF4- Fator de plaqueta 4
SRB- sulforadamina B
SFB- Soro fetal bovino
TIMPs- Inibidores teciduais de metaloproteinases
tPA- Ativador do plasminogênio tecidual
uPA- Ativador de plasminogênio uroquinase
UFH- Heparina não fracionada
VCAM-1- Proteína de adesão celular 1
vWF- Fator de willebrand
Sumário
I. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 19
1. Doenças cardiovasculares ................................................................................................... 19
2. A estrutura dos vasos sanguíneos ....................................................................................... 20
3. Principais fatores de risco indutores de trombose ............................................................. 21
4. Trombose ............................................................................................................................ 23
5. Cascata de coagulação ........................................................................................................ 25
6. Trombose e inflamação ....................................................................................................... 28
7. Reestenose e neointima ...................................................................................................... 29
8. Ação das metaloproteinases no remodelamento vascular ................................................. 31
9. Efeito dos glicosaminoglicanos na cascata de coagulação.................................................. 33
9.1 Heparina ........................................................................................................................ 34
9.2 Heparina de baixo peso molecular ................................................................................ 38
9.3 Dermatan sulfato........................................................................................................... 40
10. Modelo de lesão arterial ................................................................................................... 42
II. OBJETIVO ............................................................................................................................. 44
III. OBJETIVO ESPECÍFICOS .................................................................................................... 44
IV. MATERAIS E MÉTODOS .......................................................................................................... 45
V. EXPERIMENTOS IN VITRO COM CULTURA CELULAR ............................................................... 45
1. Animais ............................................................................................................................ 45
2. Isolamento e cultivo das células de músculo liso ................................................................ 45
3. Caracterização das células de músculo liso ......................................................................... 46
4. Ensaio de proliferação com sulforodamina B ..................................................................... 47
5. Ensaio de proliferação com MTT ......................................................................................... 47
6. Ensaio de cicatrização ......................................................................................................... 48
7. Zimografia para gelatinases em células de músculo liso .................................................... 48
VI. EXPERIMENTOS COM ANIMAIS .............................................................................................. 49
1. Lesão arterial ................................................................................................................... 49
2. Divisão dos grupos .............................................................................................................. 51
3. Tempo parcial de tromboplastina ativada (TTPa) ............................................................... 52
4. Tempo de Protrombina (TP) ................................................................................................ 53
5. Determinação da presença de células progenitoras e de células inflamatórias por
imunofluorescência ................................................................................................................. 53
6. Zimografia para gelatinases dos tecidos ............................................................................. 54
7. Zimografia in situ ................................................................................................................. 55
8. Análise estatística ................................................................................................................ 55
VII. RESULTADOS ......................................................................................................................... 56
VIII. RESULTADOS COM CÉLULAS ................................................................................................ 56
1.Caracterização das células de músculo liso por imunohistoquimica ................................... 56
2. Efeito dos glicosaminoglicanos na proliferação celular de células de músculo liso por
sulforodamina B ...................................................................................................................... 57
3. Efeito dos glicosaminoglicanos na proliferação celular de células de músculo liso por MTT
.........................................................................................................................................59
4. Papel dos glicosaminoglicanos na cicatrização celular ....................................................... 60
5. Efeito dos glicosaminoglicanos na atividade das gelatinases in vitro em células de músculo
liso ........................................................................................................................................61
IX. RESULTADOS COM ANIMAIS .................................................................................................. 63
1. O tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) ........................................................ 63
2. O tempo de Protrombina (TP) ........................................................................................ 64
1. Os glicosaminoglicanos diminuíram a área de trombo ................................................... 65
2. Efeito dos glicosaminoglicanos no processo inflamatório .............................................. 67
3. O número de células progenitoras CD34 não é aumentando pelo tratamento com os
diferentes GAGs ...................................................................................................................... 74
4. A HNF e o DS foram capazes de diminuir a atividade da MMP-2 ativa, 3 dias após a
lesão arterial ............................................................................................................................ 76
4.1 A HNF e o DS foram capazes de diminuir a área da camada neointima, 21 dias após a
lesão ........................................................................................................................................ 79
5. Os GAGs não foram capazes de aumentar a reendotelização nas artérias 21 dias após a
lesão ........................................................................................................................................ 81
6. Os GAGs não alteraram a atividade gelatinolítica 21 dias após a lesão ......................... 83
X. DISCUSSÃO .............................................................................................................................. 86
XI. RESUMO DOS RESULTADOS ................................................................................................... 95
XII. ESQUEMA DOS RESULTADOS OBTIDOS IN VIVO ................................................................... 96
XIII. CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 98
XIII. BIBLIGRAFIA .......................................................................................................................... 99
XIV. ANEXOS .............................................................................................................................. 114
1. Comitê de ética ............................................................................................................. 114
2. Carta de mudança do projeto ....................................................................................... 115
3. Certificado de mudança de nome de projeto ............................................................... 116
4. Declaração ..................................................................................................................... 117
5. Declaração ..................................................................................................................... 118
6. Estágio PDSE .................................................................................................................. 119
19
I. INTRODUÇÃO
1. Doenças cardiovasculares
Segundo a organização mundial da saúde (OMS), em 2016, as doenças
cardiovasculares foram uma das principais causas de mortes prematuras (indivíduos
com menos de 70 anos), representando 31% dos óbitos globais, sendo que destas 85%
ocorreram em decorrência a ataques cardíacos e infarto do miocárdio. A maior parte dos
óbitos ocorreram em países subdesenvolvidos. No Brasil estas doenças foram
responsáveis por 28% das mortes prematuras (OMS, 2016).
Associação Americana do Coração, estima que em 2035, nos EUA 45,1% da
população apresentará alguma forma de doença cardiovascular e os custos diretos com
estas doenças podem chegar a 1,1 trilhão de dólares. Além disso, o acidente vascular
cerebral (AVC), a hipertensão e doenças do coração estão entre as 15 doenças que mais
geram incapacidades em pacientes, sendo essa incapacidade relacionada a dificuldade
em realizar atividades diárias, limitação funcional e limitação na capacidade de realizar
trabalhos domésticos e em empregos, isso tem por consequência a geração de mais
gastos diretos e indiretos com pacientes que apresentam doenças cardiovasculares [1].
Dentre as doenças cardiovasculares, a trombose é a doença subjacente mais
comum, e está relacionada ao tromboembolismo, à trombose venosa profunda, AVC e
ao infarto agudo do miocárdio. Estas duas últimas são as que levam mais pacientes à
óbito e estão associadas a trombose arterial - por essa razão a trombose que acomete as
artérias é a que tem maior impacto [2]. Devido às altas taxas de mortalidade, à
diminuição da expectativa de vida, à perda da produtividade e aos gastos exorbitantes
com a saúde, justifica-se a necessidade de mais pesquisas que visem a profilaxia e o
tratamento das doenças arteriais.
20
2. A estrutura dos vasos sanguíneos
O sistema cardiovascular é formado pelo coração e pelos vasos sanguíneos
(artérias e veias), sendo estes os responsáveis por levar oxigênio e nutrientes para todos
os tecidos do corpo [3].
Estruturalmente falando, as artérias e veias são organizadas em três camadas: a
íntima, média e a adventícia (Figura 1).
A camada íntima é a mais interna do vaso e está diretamente em contato com o
sangue [4, 5], sendo formada por uma monocamada de células endoteliais, também
conhecida como camada endotelial. Ela desempenha diversas funções, incluindo tráfego
e fluidez do sangue, angiogênese [6], regulação da hemostasia e a formação de trombos
em caso de dano endotelial. Esta camada medeia também a troca de solutos entre o
sangue e os tecidos, inibe a inflamação, adesão de moléculas, plaquetas e a proliferação
de células de musculo lisa da camada média [7]. A disfunção desta camada, causada por
fatores como a aterosclerose, diabetes e inflamação leva a um aumento da expressão de
moléculas de adesão, síntese de fatores pró inflamatórios e pró trombóticos [8], ativação
plaquetária e produção de citocinas tendo como consequência o desenvolvimento de
doenças como a aterosclerose, trombose, hipertensão e síndromes inflamatórias [9].
A camada média tem como função dar resistência e elasticidade aos vasos
sanguíneos auxilinado na regulação da pressão arterial [10]. Ela é formada pelas
laminas elásticas [11] e por células de músculo liso, circundadas por matriz
extracelular, composta por colágeno dos tipos I e III, fibronectina e proteoglicanos [12-
14]. As células musculares apresentam fenótipo contrátil e quiescente, porém se
receberem algum estímulo, podem adquirir fenótipo proliferativo e migratório, o que
pode causar o estreitamento do vaso sanguíneo. [10, 15]. Este tipo de mudança de
fenótipo pode ocorrer devido a liberação de quimiocinas e fatores de crescimento como
resposta a um dano endotelial causado por cirurgias de angioplastia [16].
A camada mais externa dos vasos é adventícia formada pelos fibroblastos e o
tecido conjuntivo. Nesta camada são encontrados microvasos responsáveis por nutrir a
camada média [17].
21
Figura 1: Artéria carótida (A) Fotografia com microscópio contraste de fase, de um
corte transversal de uma artéria carótida de camundongo, corada com hematoxilina
eosina (HE). Camada íntima representada pela letra (a), camada média (b) e camada
adventícia (c). Aumento 20x.
3. Principais fatores de risco indutores de trombose
A trombose é caracterizada pela formação de um coágulo nos vasos sanguíneos,
levando a oclusão destes, parcialmente ou totalmente, impedindo o fluxo sanguíneo e
oxigenação dos tecidos, podendo levar a necrose e a isquemias dos tecidos [18]. A
aterosclerose acomete as artérias e também pode ser um gatilho para trombose arterial,
enquanto a trombose acomete as artérias e as veias, e pode ser causada pela exposição a
vários fatores de risco.
A aterosclerose, um dos principais fatores de risco para a trombose arterial, se
desenvolve pelo acumulo de lipídios nas paredes das artéria de médio e grande calibre
como carótida, aorta, artérias coronárias e cerebrais [19], ocorre predominantemente em
locais de maior fluxo sanguíneo, ramos e bifurcações de artérias e arcos aórticos [20].
Tem como fator de risco o aumento da concentração sanguínea de apoliproteína B (Apo
B), e da lipoproteína de baixa densidade (LDL) [21].
Nesta doença a disfunção endotelial, leva a expressão de moléculas de adesão
pelo endotélio, como P-selectina e a molécula de adesão vascular -1 (VCAM-1) [22],
22
promovendo a permeabilidade de lipoproteínas para camada subendotelial e a adesão de
monócitos e linfócitos circulantes à parede do vaso [23, 24]. Na camada íntima, os
monócitos irão amadurecer em macrófagos, que irão internalizar as moléculas de LDL
presentes no espaço subendotelial onde irão se transformar em células espumosas [25].
Em paralelo, os macrófagos se proliferam e aumentam a expressão de fatores e citocinas
inflamatórias, sendo esta caracterizada como a fase inicial da aterosclerose [26].
Na progressão da doença ocorre a infiltração de macrófagos e células T, no local
das placas de ateroma, as células de músculo liso sintetizam matriz extracelular (MEC),
estimuladas pela liberação de fatores de crescimento e ocorre a migração das células de
músculo liso da camada média para a camada íntima do vaso, fazendo com que as
lesões evoluam de uma placa rica em lipídeos para uma lesão fibrótica e posteriormente
para formação de placas calcificadas associadas à parede do vaso sanguíneo. [24].
Locais onde a capa fibrosa é menos espessa e são encontrados uma maior
infiltração de macrófagos espumosos [27] tem uma perda das células de músculo liso
levando a diminuição da produção de colágeno e ao estreitamento da capa fibrosa,.
Estes locais são mais propensos a sofrerem rupturas que desencadeiam processos
trombóticos vasculares [28, 29]. Além disso, os macrófagos liberam metaloproteinases
capazes de degradar todos os componentes da matriz extracelular (MEC) aumentando a
possibilidade de ruptura destas placas[20, 28].
Em resposta a ruptura, que leva a perda da integridade vascular e exposição da
camada subendotelial, ocorre o estímulo para a formação do trombo [26]. Os principais
determinantes para a formação de trombos nestes locais são: a trombogenicidade de
material exposto, alteração no fluxo sanguíneo e a propensão trombótica sistêmica [21].
Outro fator de risco indutor de trombose é o câncer, muito associado a trombose
venosa, pacientes com câncer tem 30% mais chances de desenvolverem trombos e isso
pode estar associado com a agressividade do tumor [30] e ocorre pela liberação de
fatores produzidos pelas células tumorais capazes de ativar o sistema homeostático,
entre eles o fator tecidual (TF), micropartículas oriundas de células tumorais, moléculas
de adesão e citosinas inflamatórias [31].
A gravidez, aumenta o risco em 4 ou 5 vezes das chances de trombose, devido a
hipercoagulabilidade do sangue pelo aumento dos fatores VII, VIII, X, vWF e
fibrinogênio circulantes envolvidos na coagulação no sangue, os riscos de trombose são
maiores nos primeiro trimestre e após o nascimento, sendo esta uma adaptação do corpo
da mulher para evitar hemorragias [32].
23
Outros fatores como idade, tratamentos hormonais, imobilidade, diabetes,
obesidade, cirurgias, o uso de bebidas alcoólicas e tabaco estão associados ao risco de
desenvolver trombos [33].
Como consequência, os trombos podem interromper o fluxo sanguíneo, levando
à necrose dos tecido ou se deslocar e chegar ao coração, cérebro, membros inferiores e a
outros órgãos [34, 35], tendo como consequência infarto do miocárdio, acidente
vascular cerebral ou embolia pulmonar [18].
4. Trombose
O médico alemão Rudolf Virchow, cunhou o termo trombose e foi o primeiro
médico a demostrar uma relação entre a trombose venosa e embolia pulmonar, a ele foi
atribuída a chamada tríade de Virchow, que descreve os três grupos de fatores
trombogênicos; hipercoagulabilidade (estimulada pela alteração da produção de fatores
envolvidos na coagulação sanguínea), alteração no fluxo sanguíneo (estase, por
exemplo) e a disfunção ou perda endotelial [36].
A trombose é a formação de um coágulo dentro do lúmen do vaso, que pode
obstruir total ou parcialmente o lúmen do vaso, resultando na diminuição do fluxo
sanguíneo nos órgãos e tecidos distais, restringindo a entrega de nutrientes e oxigênio
podendo levar a necrose dos tecidos. Estes trombos também podem se deslocar e obtruir
vasos de menor calibre , o que pode culminar em distúrbios locais ou crônicos [18].
Esta doença acomete veias e artérias, e estes trombos diferem em sua
composição e causa. Os trombos venosos, possuem uma maior quantidade de células
vermelhas e fibrina, e são também conhecidos como coágulos vermelhos. Entre as
principais causas da trombose venosa estão hipercoagulabilidade, estase do sangue,
imobilidade e cirurgias. Alguns fatores de risco como tabagismo, gravides, câncer,
idade, uso de hormônios aumentam os risco de desenvolvimento de trombos venosos
[37].
Já os trombos arteriais apresentam uma maior quantidade de plaquetas, por isso
podem ser chamados de trombos brancos [37]. Ocorrem principalmente em
consequência a uma lesão endotelial, decorrente de uma ruptura de placa de ateroma ou
cirurgia de revascularização [38].
24
O dano endotelial leva a exposição de proteínas da matriz subendotelial como o
fator de von Willebrand (vWF), fibras de colágeno, fibronectina e laminina, levando à
ativação e adesão de plaquetas no local da lesão a fim de evitar a perda sanguínea,
iniciando a formação do trombo (Figura 2) [38]. A adesão de plaquetas dará o suporte
necessário para o complexo de coagulação sanguínea, que levará a ativação de trombina
e da fibrina (Figura 2). Além da formação de fibrina, a ativação da trombina também é
responsável por uma maior ativação plaquetária, sendo assim responsável pelo
crescimento e estabilidade de trombo [39].
Figura 2: Esquema do rompimento da placa de ateroma e formação do trombo arterial.
Imagem adaptada de Koupenova at al. [40]
A fibrina insolúvel, juntamente com as plaquetas, formam o trombo, que é o
resultado de uma série de ativações de proteínas solúveis no sangue, principalmente por
enzimas do tipo serino-proteases. Esta sequência de ativações caracteriza a cascata de
coagulação sanguínea [41].
25
5. Cascata de coagulação
A cascata de coagulação é didaticamente dividida em duas vias: a via intrínseca
e a via extrínseca. As duas vias resultam numa via comum, que leva a formação do
coágulo de fibrina (Figura 3) [42, 43].
Na via extrínseca ocorre a exposição do fator tecidual (FT), uma proteína
integral de membrana, que atua como receptor e cofator para o fator VII, que é
encontrado em células que circundam o lúmen do vaso, como células de músculo liso,
fibroblastos, plaquetas, monócitos, neutrófilos e em micropartículas celulares [43, 44].
Alguns estudos mostram, que em pacientes com câncer, este fator está aumentado e por
isso estes pacientes tem mais chance a desenvolverem trombos [45]. Quando o FT é
exposto ele se liga ao fator VIIa formando o complexo (FT:FVIIa) que irá ativar o fator
X (FXa) [42, 46], entrando então na via comum entre a extrínseca a e intrínseca.
A via intrínseca ou via de contato, é iniciada pela exposição de moléculas e
superfícies negativas, mudando a conformação do fator XII, ativando-o (FXIIa), essa
enzima então converte o pré-calicreína plasmática (PK) na sua forma ativa, a calicreína
gerando um feedback positivo. A calicreína é o ativador mais eficiente do fator XII, e
sua atividade é aumentada com a ação de seu cofator, o cinogênio (HK) de alto peso
molecular [47]. Assim, o XIIa, ativa o seu substrato o XIa, e este por sua vez ativa o
fator IX, ativando o fator X (FXa) [41].
Com a ativação do fator X, em FXa as duas vias tornam-se comuns (Figura 3),
levando a ativação da protrombina (II) em trombina (IIa), e o fibrinogênio em fibrina,
resultando na formação do coágulo de fibrina, este ajuda dar estabilidade ao trombo
[48].
Após a formação do coágulo de fibrina ocorre a fibrinólise, onde o trombo é
degradado. A plasmina é a responsável pela quebra da fibrina, ela circula no sangue na
forma inativa de plasminogênio, na presença da fibrina o tPA (ativador de plasmina)
cliva o plasminogênio em plasmina. O tPA é uma serino-protease, sintetizado por
células endoteliais [49]. O plaminogênio também pode ser ativado pelo uPA (ativador
de plaminogênio uroquinase) produzido por monócitos e macrófagos.
Ambos os ativadores tem uma meia vida curta na circulação sanguínea devido à
presença de altas concentrações do seu inibidor, o inibidor de plasminogênio-1 (PAI-1)
26
[50]. O PAI-1 é liberado por plaquetas ativadas dentro e no entorno do trombo, para
impedir a fibrinólise prematura [49, 51].
Além de degradar a fibrina, a plasmina também é responsável por degradar o
fibrinogênio e os fatores: VIII, IX, XI e XII, que podem prejudicar o potencial
homeostático. A plasmina é inativada pela alfa2- antiplasmina, este se liga ao seu sítio
ativo inativando-a [51].
Figura 3: Visão geral da cascata de coagulação sanguínea. Via intrínseca, ou via de
contato onde ocorre a ativação do fator XIIa, que resulta na ativação do FXIa, em
seguida do FIXa e do fator Xa. Via extrínseca, onde ocorre a exposição do fator
tecidual, este se liga ao fator VIIa, formando o complexo FT-VIIA, este complexo ativa
o fator Xa. Via comum da cascata de coagulação, onde o fator Xa, ativa a protrombina
em trombina, este ativa o fibrinogênio em fibrina, levando a formação do coágulo de
fibrina. Figura adaptada de Robertson, 2018. [48]
Nos últimos anos, novas descobertas foram feitas relacionadas com a cascata de
coagulação in vivo. Dessa forma foi proposto um novo modelo de cascata de
coagulação, este se baseia na expressão de TF em superfícies celulares [52]. (Figura 4)
27
Neste modelo, as células que expressam em sua superfície a glicoproteína TF
são expostas, o TF se liga ao fator FVII do sangue ativando-o e formando o complexo
FVIIa/TF, que irá ativar pequenas quantidades dos fatores FIX e FX. O FXa se associa
ao seu cofator, FVa, formando um complexo na superfície celular chamado de
protrombinase. O FV também pode ser ativado por proteínas não coagulantes resultando
na ativação do FVa e formando o complexo protrombinase [52].
Este complexo ativará pequenas quantidades de protrombina (FII) em trombina,
estas quantidades não são suficientes para ativação do fibrinogênio em fibrina, porém
este processo é importante na fase de amplificação da cascata. Assim a coagulação
sanguínea irá para fase de amplificação apenas quando ocorre a lesão vascular [53, 54].
Com a lesão vascular, ocorre a exposição do vWF e do colágeno, levando a
ativação plaquetária formando o plug primário. Nesta fase, a trombina ativada pelo
complexo FVIIa/TF interage com o vWF e as plaquetas resultando na formação da
fibrina estável. A trombina ativada pelo complexo protrombinase é importante para uma
ativação plaquetária máxima, permitindo a entrada de íons cálcio e a liberação de
quimosinas que atraem mais fatores da coagulação. [55].
Na fase de propagação o FXa se associa ao FVa ligado as plaquetas, resultando
na formação da protrombinase e a uma maior conversão da protrombina em trombina,
fibrinogênio em fibrina [56].
Com a formação do trombo, alguns anticoagulantes naturais são ativados para
evitar a total obstrução do lúmen do vaso, são estes a proteína C, proteína S, a
antitrombina (AT) e o inibidor da via do TF (TFPI) [52]. Estas moléculas regulam a
formação do trombo e quando estimuladas cessão a ativação da cascata de coagulação.
28
Figura 4: Novo modelo da cascata de coagulação, fase de iniciação, amplificação e
propagação. Figura adaptada[52].
Esse novo formato de apresentação da cascata de coagulação busca correlacionar
as 2 vias, demonstrando que ao invés de duas vias separadas, elas estão diretamente
correlacionadas e não devem acontecer de forma isolada durante a coagulação
sanguínea.
6. Trombose e inflamação
A inflamação é uma característica central envolvida em praticamente todas as
patologias que atingem o sistema vascular [57], responsável por ativar o endotélio sendo
assim um risco para a trombose [58].
O recrutamento de plaquetas é umas das primeiras respostas do endotélio ativado
ou de uma lesão arterial. [59]. As plaquetas ativadas liberam fatores pró-inflamatórios,
29
e se ligam a leucócitos circulantes recrutando-os para o local da lesão [60]. Além disso,
o endotélio ativado, aumenta sua permeabilidade e expressa moléculas de adesão P e E-
selectina, mediando a adesão, rolagem e transmigração dos leucócitos para o endotélio,
aumentando ainda mais a inflamação na parede do vaso e as chance de trombose [61-
63].
A ativação da trombina também gera no local da lesão um ambiente pró-
inflamatório, tendo efeito direto nos monócitos, células de músculo liso, linfócitos e
células endoteliais [64]. A expressão de moléculas importantes na migração e adesão de
leucócitos como ICAM-1, VCAM-1, P- selectina e E-selectina estão aumentadas na
presença da trombina, que afetam a regeneração do vaso e podem em caso de excesso
de ativação podem levar a produção de neoíntima [65, 66]. ICAM-1 é uma proteína
transmembrana que medeia o acoplamento de leucócitos nas células endoteliais na
resposta imune e seus níveis também estão correlacionadas com a síndrome pós
trombótica [67].
Além disso, a integrina CD11b desempenha um papel importante na inflamação
por mediar a adesão e migração de macrófagos durante a inflamação [68], e a proteína
de superfície de membrana Ly6G expresso por neutrófilos, [69] também tem importante
papel na inflamação, assim estas proteínas podem ser utilizadas como marcadores
inflamatórias e ser utilizados como marcadores para quantificar a inflamação no local
das lesões.
7. Reestenose e neointima
A reestenose é o estreitamento do lúmen dos vasos sanguíneos pela formação da
camada neointima, está é formada pela proliferação exacerbada das CML, promovida
pela cicatrização de lesões no tecido vascular [70]. O aparecimento da restenose é uma
das principais limitações de cirurgias de revascularização e atinge cerca de 30% a 40%
dos pacientes submetidos a este tipo de cirurgia [71]. Estas lesões possuem uma
constituição e morfologia diferente das placas de ateromas, sendo constituídas
principalmente de MEC e células de músculo liso [72].
Após uma lesão vascular, em decorrência de uma angioplastia ou colocação de
stent (Figura 5), acontece a fase inicial a formação do trombo pós stent e a inflamação
30
vascular, iniciada pela adesão plaquetária e formação de coágulo de fibrina, neste
momento também serão recrutados monócitos para o local [70, 73], ocorrendo a
liberação de fatores de crescimento pelos monócitos e também pelas plaquetas que
liberam por exemplo o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), envolvido
na proliferação das células de músculo liso [74].
Na segunda fase (Figura 5), ocorre a migração das células endoteliais e de
músculo liso cobrindo a superfície no local lesionado, estas células secretam MEC e
proteoglicanos, caracterizando a fase granular da cicatrização [70]. As principais células
que proliferam nesta fase são as de músculo liso. Elas apresentam dois fenótipos, um
contrátil e quiescente e um migratório e proliferativo. O primeiro está presente na
camada média do tecido vascular normal, contribuindo para vasomotricidade e suporte
dos vasos e não responsivo aos fatores de crescimento [70]. Já o fenótipo migratório e
proliferativo aparece quando ocorre a lesão vascular, em respostas a liberação dos
fatores de crescimento[7]. Nele está aumentada a proliferação e migração destas células
da camada média para o lúmen do vaso, promovendo um crescimento exacerbado e
diminuição do lúmen, levando a estenose vascular, pela formação desta camada interna
que chamamos de neointima. [75, 76].
Em camundongos, observou-se que após 7 dias da colocação de stent, inicia-se a
formação da camada neointima, neste período ela está associada ao trombo e tecido
inflamatório, aumentando de tamanho progressivamente na terceira e quarta semanas
após lesão vascular[77]. Em estudos feitos em humanos, foi observada a formação da
neointima entre 6 meses e 1 ano após cirurgia de revascularização[78].
A terceira fase da cicatrização dos vasos é a de remodelamento e síntese, e se
caracteriza pela secreção e deposição de MEC, formada de proteoglicanos e colágeno,
pelas células de músculo liso [70, 79]. A MEC é responsável pelo aumento desta
camada, sendo que apenas 11% desta camada é formada por células [80].
31
Sendo a reestenose do vaso uma complicação comum e perigosa da cirurgias de
revascularização, tratamentos e estudos que visam inibir ou diminuir este processo são
importantes para o sucesso das cirurgias vasculares e no reparo do endotélio
lesionado[81].
Figura 5: Esquema dos principais eventos envolvidos na formação da camada
neointima. (A) Formação da placa de ateroma na parede de uma artéria, com
estreitamento do lúmen do vaso sanguíneo prejudicando a oxigenação dos tecidos, (B)
cirurgia de revascularização como a colocação do stent, para recuperação do lúmen do
vaso, causando uma trombose pós-stent; (C) lesão endotelial causada pelo stent, com
formação do trombo e posteriormente da camada neointima, em resposta a injuria
endotelial, tendo como consequência a restenose do vaso. Imagem adaptada de Finney
2018 [82].
8. Ação das metaloproteinases no remodelamento vascular
Com a colocação do stent, ocorre inicialmente a denudação endotelial e
formação do trombo, pós-stent, o trombo é degradado, e inicia-se a fase de migração e
proliferação, das células de músculo liso, devido a liberação de citocinas e mitógenos
pelas plaquetas, células inflamatórias e células endoteliais, então inicia-se a fase de
remodelamento [83, 84].
No remodelamento vascular estão envolvidos processos como a degradação e
reorganização da MEC, pela atividade enzimáticas das metaloproteinases (MMPs) [85].
As MMPs também conhecidas como matrixinas, são uma família de endoproteases
zinco-dependentes capazes de degradar diferentes componentes da MEC. São secretadas
32
por diferentes tipos de células e tecidos, como o tecido conjuntivo, fibroblastos,
osteoblastos, células endoteliais, de músculo liso, macrófagos, neutrófilos e linfócitos
[86].
As atividades destas enzimas estão envolvidas em processos como proliferação,
migração, diferenciação, angiogênese e reparo de tecidos. Alterações nas atividades das
MMPs podem ser observadas em processos fisiológicos e patológicos, tais como;
gravidez, cicatrização de feridas, progressão e invasão tumoral, doenças
cardiovasculares, aterosclerose, aneurismas e infarto do miocárdio [87]. Estas atividades
podem ser reguladas por diferentes vias, como pela ativação pós-transcricional de
zimogênios e pela atividade de inibidores teciduais das metaloproteinasses (TIMPs)
[88].
No tecido vascular, estas enzimas participam do remodelamento vascular,
vascularização, angiogênese, migração e crescimento celular [86]. Neste tecido
alterações nas atividades das MMPs estão relacionadas principalmente a processos
patológicos tais como: aterosclerose, reestenose, dilatação aneurismática e ruptura de
placas ateroscleróticas [89].
A reestenose, após uma intervenção vascular, ocorre em dois processos distintos
como a hiperplasia da íntima e o remodelamento construtivo, sendo que as MMPs
podem estar envolvidas nos dois processos [90]. A hiperplasia da íntima é o
espessamento da camada íntima normal, tendo como consequência o estreitamento do
lúmen do vaso, acompanhada pela a degradação da membrana basal do vaso, permitindo
assim, a migração das células de músculo liso, essencial neste processo. Em um estudo
envolvendo porcos e um modelo de enxerto de ponte de safena foi demonstrado que um
aumento da atividade de MMP-2 e MMP-9 estava relacionado com o aumento da
migração de células de músculo liso e a formação da camada neointima [91]. MMPs do
tipo 2 e 9, são gelatinases muito estudadas no tecido vascular, sendo responsáveis pela
degradação da membrana basal, do colágeno do tipo IV, da laminina e elastina[92].
A atividade de MMP-2, está envolvida com a migração e proliferação de células
de músculo liso, quando colocado estas células em cultura com o PDFG, houve um
aumento na atividade da MMP-2 aumentando a migração e proliferação [93], além
disso em camundongos Knockout para MMP-2 e MMP-9, foi observada uma
diminuição da camada neointima, com 14 dias após lesão por ligamento na artéria
carótida, esta diminuição foi mantida 28 dias após a lesão, dando suporte para a ideia de
33
que a MMP-9 e 2, influenciam na reestenose do vaso. [94] Em humanos a atividade de
MMP-2 e MMP-9 está relacionada com a instabilidade da placa de ateroma[95] e
consequente a inicialização da trombose.
O remodelamento construtivo é o resultado de alterações no metabolismo do
colágeno e elastina devido a alterações na atividade das MMPs após uma cirurgia de
angioplastia, os mecanismos deste processo ainda não são bem conhecidos [90, 96].
Estas alterações levam a perda do diâmetro do vaso [89, 97].
9. Efeito dos glicosaminoglicanos na cascata de coagulação
Os glicosaminoglicanos (GAGs) são polímeros de açúcares, em geral não
encontrados livres no organismo, mas estão ligados covalentemente a um core proteico
formando os proteoglicanos, estes são sintetizados pelas células e secretados na MEC
onde desempenham as mais variadas funções, [98].
Os GAGs são polissacarídeos de cadeias longas e lineares presentes na
superfície celular e MEC. Alguns deles como o heparan sulfato (HS), heparina (HNF) e
dermatan sulfato (DS), estão envolvidos no controle da coagulação sanguínea, onde eles
se ligam as serpinas (inibidores de serino-proteases), tais como a antitrombina (AT) e o
cofator II da heparina (HCII) aumentando sua capacidade de inibir diferentes serino-
proteases envolvidas na cascata de coagulação. Sendo que, o HS e a heparina se ligam à
antitrombina (AT) e o DS ao cofator II da heparina (HCII) [99].
A heparina vem sendo utilizada na clínica e prevenção de distúrbios
trombóticos desde 1930, quando foi purificada de fígado e pulmão bovino [99, 100],
porém seu uso apresenta alguns efeitos colaterais, tais como hemorragias,
trombocitopenia, osteoporose, necroses na pele [101, 102], estes efeitos foram
minimizados, quando do surgimento da heparina de baixo peso molecular (HBPM), que
é uma porção da heparina convencional, produzida através da degradação química da
heparina. Comercialmente a HBPM é vendida com diversos nomes comerciais como:
Dalteparina (Fragmin) [103], Enoxaparina (Clexane) [104], Enoxaparina (Lovenox)
[105]. Porém, seu alto custo é um limitante no uso deste medicamento, e por esta razão
a HNF continua sendo a mais utilizada na profilaxia de tromboembolismo [106].
34
O Danaparoide, é outro medicamento utilizado como anticoagulante, sendo este
composto de diferentes GAGs, como o HS (84%), o DS (12%) e o condroitin sulfato
(4%). Este medicamento é responsável por inativar o fator Xa, da cascata de
coagulação, consequentemente a formação de trombina e fibrina, também atua na
agregação plaquetária [107]. Este pode ser utilizados em tratamento como da
trombocitopenia induzida por heparina, pois ele interrompe o complexo PF4- heparina
[108]. Seu uso também é indicado em pacientes com retinopatias e nefropatias [107].
9.1 Heparina
A heparina ou heparina não fracionada (HNF) é um glicosaminoglicano (GAG)
sulfatado de cadeia linear, carregado negativamente. A estrutura da heparina consiste
em um polissacarídeo linear, altamente sulfatado de unidades dissacarídicas repetitivas
de ácido α-L-idurônico ou β-D-glucurônico ligados à α-D-glucosamina por ligações do
tipo α-1,4. Apresenta sulfatação no C2 do ácido L-idurônico (70-90%), sendo raramente
sulfatada no ácido D-glucurônico. A glucosamina é usualmente sulfatada nas posições
N- e C6. As ligações intradissacarídicas são do tipo -1,4 para o ácido idurônico e -1,4
para o ácido glucurônico (Figura 6) [109]. O padrão de sulfatação e a quantidade de
sulfatação dos GAGs esta diretamente relacionada com sua atividade biológica,
mediando sua interação com diferentes moléculas.
A heparina é muito utilizada como uma droga anticoagulante, sendo uma das
principais escolhas no tratamento de doenças trombóticas [110], foi descoberta em 1916
por Jay McLean [111].
35
Figura 6: Unidade dissacarídica da heparina, figura adaptada [112].
Sua atividade antitrombótica ocorre por sua interação com a antitrombina III
(AT-III). A AT-III é uma glicoproteína presente no plasma em concentrações
aproximadas de 150µg/ml (2,6µM), é a molécula anticoagulante mais importante
encontrada nos mamíferos, sintetizada pelo fígado, possui uma meia vida de 3 dias,
após esse período é degradada [113], pertence à família das serpinas (serino-proteases).
Esta molécula inibe principalmente a atividade da trombina e do fator Xa, e mais
fracamente inibe a ação dos fatores XIIa, XIa e IXa da cascata de coagulação (Figura 7)
[114].
Ela circula no sangue com baixa atividade inibitória, mas seu potencial
anticoagulante é aumentado 1000 vezes na presença da heparina. São encontradas duas
isoformas na circulação, a alpha e a beta, sendo que a β-isoforma apresenta uma maior
afinidade pela heparina [115].
36
Figura 7: Imagem ilustrativa dos locais de atuação da antitrobina na cascata de
coagulação. Nela, mostramos onde ocorre a atuação com o complexo AT-heparina,
setas com a letra (a) indicam onde a interação ocorre fracamente e setas indicadas pela
letra (b), onde a interação é mais forte. Figura adaptada [116, 117].
A ativação da AT-III, requer a ligação de uma sequência especifica do domínio
pentassacarídico da heparina ao domínio desta serpina, essa interação provoca uma
mudança na conformação de AT-III resultando numa forte ligação entre essas moléculas
e acelerando a inibição do FXa [115]. Além dessa interação, a trombina requer uma
ligação com a HNF formando um complexo ternário, inibindo e aumentando em 2000
vezes a inibição deste fator [118].
Além do seu papel anticoagulante, a AT-III tem um importante efeito anti-
inflamatório, podendo se ligar ao endotélio promovendo a liberação de prostaciclina,
um vasodilatador, que é inibidor plaquetário, e da adesão de leucócitos [115].
A HNF é amplamente utilizada na prevenção e tratamento de doenças
trombóticas, suas vantagens são baixo custo, reversibilidade, seu efeito é reversível com
protamina, que é uma proteína básica que interage com a heparina e desfaz seu efeito
catalítico com a AT, por isso é utilizado como um neutralizador da heparina [119].
Além disso é de fácil acesso, diminui o tempo de coagulação em pacientes que recebem
diálise. Sua meia-vida é curta e sua atividade de fácil monitoramento, pelo teste de
37
tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) [120, 121], também podem ser
utilizados o teste de tempo de protrombina (PT), contagem de plaquetas, atividade anti-
Xa e níveis de fibrinogênio [122].
O TTPa é um teste de coagulação que mede principalmente a via intrínseca da
cascata de coagulação, foi descrito pela primeira vez em 1953, modificado em 1958 e
1961, porém continua sendo muito utilizado, muitas instituições optam pelo uso deste
teste para o monitoramento da atividade da HNF, por ser um teste de baixo custo em
relação a outros e fácil manuseio, o resultado deste ser utilizado para ajustar a dosagem
da heparina[123, 124].
Apesar destas vantagens, o uso continuado da heparina pode causar alguns
efeitos colaterais [101]. Como a trombocitopenia induzida por heparina (HIT), que é
caracterizada pela diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50%, em relação a
quantidade de plaquetas no início do tratamento [108]. Nesta patologia ocorre a geração
induzida pela heparina, de anticorpos IgG, que reconhecem o complexo fator 4 de
plaquetas (PF4) e heparina na superfície das plaquetas, resultando numa ativação
plaquetária e formação de micropartículas favorecendo reações de coagulação, as
plaquetas ativadas também irão liberar PF4 levando a um ciclo progressivo na ativação
plaquetária e coagulação [125, 126].
Esta complicação atinge de 8% a 50% dos pacientes tratados com este
anticoagulante, sendo que 50% destes apresentam complicação como trombose nos
membros inferiores, embolia pulmonar, trombose periférica arterial e AVC [108, 127,
128]. De 10 a 20% dos pacientes começam desenvolver a HIT nos primeiros quatro dias
de terapia, porém é mais comum entre os dias 5 a 10 de tratamento [125]. Quando
diagnosticados, devido aos riscos de desenvolver trombose, mesmo após suspender o
uso da heparina é necessário o uso de um anticoagulante alternativo e de ação rápida
[127].
O risco de desenvolver HIT depende do tipo da heparina utilizada, ocorre mais
frequentemente em pacientes que sofreram uma cirurgia de grande porte em relação a
pequenas cirurgias [129]. A incidência desta complicação é 10 vezes maior, em
pacientes que receberam heparina em relação aos tratados com heparina de baixo peso
molecular [130].
Outra complicação do tratamento com heparina, é a hemorragia, menos comum
e independente da HIT [131], no entanto, essa complicação pode ser muito grave e
inclui hemorragias retro-peritoneal, gastrointestinal ou adrenal. Pacientes que se
38
submeteram a cirurgias de revascularização são mais propensos a desenvolverem este
tipo de complicação [125]. Minimizar a exposição de pacientes a heparina, utilizando
um anticoagulante alternativo é a melhor forma de prevenir os efeitos colaterais
causados por este tratamento.
Outras funções da heparina também são conhecidas como a capacidade de se
ligar a moléculas de adesão como as selectinas e integrinas, expostas no
desenvolvimento do processo inflamatório. Já foi descrito que ela reduz o recrutamento
de leucócitos no local de lesão, é capaz de inibir a proliferação de células de músculo
liso na lesão vascular, pode inibir a liberação de espécies reativas de oxigênio, e estudos
indicam também a capacidade de inibir a angiogênese e metástases nos tumores [132].
9.2 Heparina de baixo peso molecular
No final da década de 1970 e início de 1980 [133], foi introduzida a heparina de
baixo peso molecular (HBPM), essa vem sendo utilizada como um tratamento
alternativo a HNF, já que seus efeitos colaterais são menores em relação a heparina
convencional. Ela é produzida por uma despolimerização enzimática ou química da
HNF, produzindo fragmentos de cadeias médias (Figura 8). Dessa forma, assim como a
heparina, é um GAG formado por cadeias de um ácido idurônico ou glicurônico e uma
glicosamina [134]. Esta redução química reduz o peso molecular da heparina não
fracionada de aproximadamente 18 000 Dáltons para 4000 Dáltons e introduz um
resíduo de ácido urônico não saturado e resíduos 1,6 anidroaçucares em algumas
cadeias de da HBPM [135]. As HBPM são vendidas comercialmente com diferentes
nomes, em nosso trabalho utilizamos a Enoxaparina (Clexane) produzida pela Sanofis-
Aventis.
39
Figura 8: Fórmula química dos fragmentos da HBPM, obtidos por reações de
despolimerização, Enoxaparina e Dalteparina. Imagem adaptada [136].
Entre as vantagens em relação a HNF: sua resposta em relação a dose é mais
previsível e sua meia vida no plasma sanguíneo é maior [137]. Apresenta um menor
risco de desenvolver trombocitopenia, podendo ser utilizadas por pacientes que
precisam fazer tratamento de anticoagulantes em casa, já que não depende de
monitoramento laboratorial [138, 139]. As chances de um quadro hemorrágico são
menores, sendo que quadro hemorrágicos graves atingem de 0- 3%, e hemorragias fatais
de 0- 0,8% dos pacientes [140], sua atuação na inibição plaquetária é menor em relação
a HNF [141] e pode ser administrada via oral [142].
A HBPM é muito utilizada a trombose associada ao câncer [143], pacientes que
precisam fazer tratamento para trombose venosa profunda em casa [144], durante a
gravidez e no tratamento preventivo em arritmias cardíacas[145].
Sua atividade anticoagulante é similar com a heparina, se dá pela interação da
sequência pentassacarídica com a antitrombina, provocando uma mudança
conformacional nesta molécula, acelerando a inibição em 1000 vezes do FXa da cascata
de coagulação. A principal diferença com a heparina, é pelo fato das cadeias de HBPM
não terem tamanho suficiente para interagir com a trombina e formar o complexo
ternário, assim sua principal atividade está em inativar o FXa (Figura 9) [134].
40
Figura 9: Imagem ilustrativa do local de atuação da HBPM na cascata de
coagulação, indicando onde ocorre a atuação com o complexo AT-HBPM (seta) Figura
adaptada [117].
Apesar de apresentar algumas vantagens em relação a HNF, a HBPM apresenta
algumas limitações, como seu alto custo [106] não é indicada em pacientes com
doenças renais, por ela ser excretada pelo rim, também pode ser bioacumulada neste
órgão e aumentar o risco de sangramento [146, 147] e não tem agente de reversão [121].
Diferentemente da HNF a HBPM não é neutralizada pela protamina, isso pode estar
relacionado com o tamanho da molécula da HBPM e seu grau de sulfatação, já que um
estudo relacionou o grau de sulfatação com a atividade de neutralização pela protamina
[148]. Além disso os valores de TTPa, podem variar conforme o tipo de HBPM, um
estudo ex vivo mostrou que na concentração de 1U/ml, quando utilizado a Enoxaparina
os valores de TTPa ficaram aproximadamente de 54 e 69 segundos, cerca do dobro do
valor normal e enquanto na mesma concentração a Tinzaparina os valores foram de 101
e 140 s [149].
9.3 Dermatan sulfato
41
O dermatan sulfato (DS), inicialmente conhecido como condroitin sulfato B, é
um glicosaminoglicano de cadeia linear, sulfatado, formado por dissacarídeos repetidos
de galactosamina e um ácido glicurônico ou um ácido idurônico (Figura 10), sendo que
o tamanho da cadeia e o grau de sulfatação são variáveis, e o grau de sulfatação
influenciam na sua função anticoagulante [150]. Em nosso estudo o DS (sigma)
utilizado foi extraído de mucosa intestinal de suínos, com sulfatações no carbono 4.
Conforme o organismo em que é extraído, o Dermatan sulfato pode apresentar
diferenças no grau, posição das sulfatações e na sua função anticoalulante. Por exemplo
o DS extraído de Ascídias, como a Ascidia nigra e Styela plicata apresentam diferenças
na sulfatação quando comparados a mamíferos e a elas mesmo. A Ascidia nigra possui
uma sulfatação, [4--L-IdoA(2SO4)-13--D-GalNAc(6SO4)-1], sendo sua atividade baixa
no teste de aPTT e apresenta baixa capacidade de potencializar o HCII, já o DS extraído
de Styela plicata, [4--L-IdoA(2SO4)-13-(-D-GalNAc(4SO4)-1], é um potente ativador
de HCII e pode aumentar o aPTT em 4 vezes [151].
Figura 10: Molécula de dissacarídeo que compõe o Dermatan sulfato. Figura
adaptada[152].
Produzido por vários tipo celulares, estando localizado na superfície celular, é
um dos principais componentes da MEC de tecido conjuntivo [153] de tecidos fibrosos
e conjuntivos; como pele, tendão, músculos, vasos sanguíneos, ossos e cartilagens
[154]. Na MEC, tem função estrutural, já na superfície celular são receptores para
fatores de crescimento e citocinas [150], atuam como reguladores enzimáticos e
moléculas sinalizadoras em resposta a um dano celular, cicatrização de feridas e
42
infecções [155]. Uma atividade que vem sendo bastante estudada é sua função
anticoagulante e antitrombótica [156].
O efeito anticoagulante do DS, ocorre pela interação com o cofator II da
heparina (HCII). O HCII é uma serpina (inibidor de serina protease), presente no plasma
em concentrações de 1µmol/l aproximadamente a metade da concentração de AT 2,6
µmol, e tem meia vida de 2 a 3 dias [157, 158] , capaz de interagir e inativar a trombina,
é um homólogo a AT [159], sua ação é muito lenta, mas na presença do DS a taxa de
inibição é aumentada em 1000 vezes [160, 161]. Essa interação ocorre pela sequência
de 6 sacarídeos do DS, que tem alta afinidade com HCII [162] (Figura 11). O DS
também atua aumentando o efeito da proteína C ativada, está inibe alguns dos fatores da
cascata de coagulação [163].
Figura 11: Modelo da ativação do HCII, in vivo com a interação com do DS,
endógeno e exógeno, e sua atuação na cascata de coagulação, onde o complexo HCII e
DS interagem e inibem a trombina. Modelo adaptado de Tollefsen 2010 [157].
10. Modelo de lesão arterial
Estudos com modelos de lesões arteriais in vivo que resultem na formação de
trombos e também da camada neointima são muito utilizados para entender os
mecanismos envolvidos nesta doença e a atuação dos fármacos nestes processos. Uma
das maiores limitações destes modelos, é tentar simular a trombose de forma
relacionada aos processos envolvidos nos seres humanos. Os principais modelos
43
utilizados para a indução da trombose, são; lesão mecânica, eletroquímica, fotoquímica
e lesão química [164].
O modelo de lesão mecânica, simula uma cirurgia de angioplastia e resulta em
uma resposta morfológica similar a observada em pacientes submetidos a angioplastia
coronariana [165]. Nesta cirurgia de revascularização (angioplastia), um cateter com um
balão e um stent na ponta é introduzido no paciente, este percorre os vasos sanguíneos
até o local onde a artéria está com o lúmen do vaso prejudicado, neste local, o balão
existente é inflado, de forma que o stent seja expandido e recupere o lúmen do vaso
[166]. O modelo animal utiliza uma sonda metálica de maior calibre que a artéria, a
sonda é inserida no lúmen vaso e passada três vezes pelo mesmo antes de ser removida,
devido a sonda ter maior calibre que o vaso, ela provoca uma lesão na camada íntima
levando a denudação endotelial. Com este modelo também foi observada a migração e
proliferação das células de músculo liso para o lúmen do vaso levando a formação da
camada neointima e o estreitamento do mesmo [167]. Foi observado em camundongos
que 8 dias após a lesão a camada neointima já estava formada, e após a segunda e
terceira semana a mesma aumentou de tamanho podendo alcançar 100% do lúmem do
vaso [165, 167].
A angioplastia pode causar complicações como a trombose (stent trombose), que
pode ocorrer na fase inicial, até 30 dias após a cirurgia, ou em estágio tardio, 30 dias
após o procedimento. Nas primeiras 24 horas, é classificada como trombose aguda e
após as primeiras 24 horas até o dia 30, subaguda. A trombose causada pela colocação
de stens tem uma incidência de morte de 20 a 40% dos pacientes submetidos a cirurgia
de revascularização do miocárdio, este índice aumenta para 50 a 70%, se o paciente
repetir a cirurgia [168]. Sendo assim é importante o uso de um anticoagulante, que pode
ser combinado com tratamentos antiplaquetários neste tipo de procedimento [169].
A reestenose da artéria submetida a angioplastia, é um problema que leva ao
estreitamento do lúmen do vaso e aparece nos pacientes, 6 meses após a cirurgia é
consequência de uma série de alterações causada pela intervenção cirúrgica, como
ruptura da lâmina elástica, desnudação do endotélio e liberação de citocinas por células
inflamatórias [170].
44
II. OBJETIVO
Estudar o efeito do DS, HBPM e Heparina na proliferação de células musculares
in vitro e comparar a atividade destes glicosaminoglicanos: na trombose arterial e
verificar a influência dos mesmo na formação da camada neointima em camundongos
C57BL6.
III. OBJETIVO ESPECÍFICOS
Experimentos in vitro:
Isolar e caracterizar células de músculo liso da aorta dos camundongos C57Bl6.
Avaliar in vitro a proliferação e migração nas células de músculo liso após a
exposição aos glicosaminoglicanos.
Avaliar a atividades das MMPs-2 e 9 nas células de músculo liso.
Avaliar o processo de cicatrização in vitro
Análises in vivo:
Comparar o efeito dos diferentes glicosaminoglicanos na trombose arterial por
análise histoquímica, na coagulação pela análise do TTPa e TT, na inflamação
local por inunohistoquímica pela presença de células CD11b e ICAM-1
positivas, e do remodelamento da matriz extracelular pela atividade das MMPs-2
e 9, envolvidas na reestenose dos vasos 3 dias após a lesão arterial.
Analisar e comparar o efeito dos glicosaminoglicanos na formação da camada
neointima por análise histoquímica e na reendotelização por imunohistoquímica
com CD31 (marcador de células endoteliais) do vaso lesionado, 21 dias após a
lesão arterial.
45
IV. MATERAIS E MÉTODOS
V. EXPERIMENTOS IN VITRO COM CULTURA CELULAR
1. Animais
Para os experimentos foram utilizados camundongos machos selvagens da
linhagem C57BL/6J com 8 semanas de idade adquiridos do CEMIB/Unicamp, pesando
aproximadamente 25±2 gramas. Os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética
em experimentação Animal/Unicamp (CEUA), sob o número de protocolo 4027-1. Os
camundongos foram mantidos no biotério do Departamento de Biologia Celular e
Estrutural, sob responsabilidade da Profª Dra Cristina Pontes Vicente, em gaiolas micro-
isoladoras, receberam água e ração (NUVILAB) ad libitum, e foram colocados em ciclo
claro e escuro de 12 horas. Os animais foram utilizados para isolar as células de
músculo liso e divididos em grupos com lesão arterial.
2. Isolamento e cultivo das células de músculo liso
As células de músculo liso foram isoladas da artéria aorta de camundongos
C57BL/6J, para isto adaptou-se o protocolo de Ray, J. at. al [171]. Resumidamente, os
camundongos foram eutanasiados com aprofundamento de anestesia (quetamina,
500mg/kg). Após fez-se uma incisão na região torácica para dissecar a artéria aorta, em
seguida removeu-se a camada adventícia com o auxílio de pinças, e fez-se um corte
longitudinal e uma raspagem com auxílio de bisturi na região interna da aorta afim de
evitar a contaminação por outros tipos celulares.
Em seguida lavou-se a aorta em PBS acrescido de 1% de penicilina, após o
tecido foi colocada em placas petri contendo colagenase II 1mg/mL (Sigma) e tripsina
(Nutricell) 1:5 em meio DMEM (Nutricell) onde as artérias foram cortadas em pedaços
46
de 1- 2mm com bisturi, após este procedimento o material foi passado para tubos falcon
de 15ml, colocados em estufa de CO2 a 37ºC por 50 min para digestão do tecido, os
tubos eram homogeneizados a 10min. Após este período o material foi centrifugado á
1500rpm por 10min, o precipitado foi homogeneizado com DMEM suplementado de
15% de soro fetal bovino (SFB) (Nutricell), 1% de penicilina e plaqueados em placas de
6well, mantidos em estufa úmida de CO2 a 37ºC. Após 72h foi acrescido 500ul de
DMEM 15% SFB. A troca de meio foi feita a cada 48h até as células atingirem a
confluência. Quando confluentes, as culturas foram passadas por tripsinização e
utilizadas para os experimentos entre a 6º e 8º passagem.
3. Caracterização das células de músculo liso
Para a caracterização das células musculares e confirmação do seu fenótipo foi feito
uma imunofluorescência, do modo descrito a seguir. As células foram cultivadas em
placa de 24 poços com lamínulas. Após a confluência, as células foram fixadas, com
paraformaldeído (4%) e Triton X-100 (0,6%) por 20 minutos a 4ºC, em seguida
permeabilizadas com Tween 20 (0,1%) em PBS por 5 min, bloqueou-se com PBS/BSA
(soro albumina bovina) (2%) acrescido de Triton X-100 (0,8%) por 1h. O anticorpo
primário alfa-actina (Invitrogen), para células de músculo liso, foi diluído (1:100) e
incubado overnight a 4ºC. Após a incubação, as células foram lavadas 3x de 5min com
PBS para retirar o excesso de anticorpo primário, incubou-se com o anticorpo
secundário, anti-rabbit Alexa Fluor 594 (Invitrogen), diluído 1:250 por 1h a temperatura
ambiente. Lavou-se 3x com PBS e para a marcação dos núcleos foi utilizado com DAPI
(0,5 μg/mL em metanol), incubados por 10 minutos a 37ºC, lavou-se 3x em PBS. As
lâminas foram montadas, em meio para fluorescência, observadas em Microscópio de
Fluorescência (Olympus BX60, câmera QColor 3) e capturadas pelo programa
QCapture 4.0.
47
4.Ensaio de proliferação com sulforodamina B
Para o ensaio de proliferação, 1x103 células de músculo liso/poço, foram
plaqueadas em placas de 96 poços, com 150µL de DMEM suplementado com 15%
SFB, após 24h de cultivo, fez-se a troca do meio e foram adicionados os tratamentos.
No grupo controle as células foram mantidas em DMEM com 15% de SFB, para os
tratamentos adicionou-se; Heparina (50 e 25µg/mL), HBPM (50 e 25 µg/mL) e DS (50
e 25µg/mL), após 24h ou 48h fez-se o ensaio de sulforrodamina B.
Este ensaio mede a densidade celular baseado no teor de proteína celular [172].
O corante sulforodamina B é um corante rosa brilhante com dois grupos sulfônicos que
têm a capacidade de se ligar elestrostaticamente aos resíduos básicos dos aminoácidos,
permitindo então uma dosagem de proteínas totais na cultura celular [173].
Para este ensaio, as células foram fixadas em ácido tricloroacético 50% (TCA),
por 1h à 4ºC, em seguida adicionou-se o corante sulforrodamina B (0,4%), por 30min a
4ºC, lavou-se as células 4x com ácido acético glacial, para remover o excesso do
corante e o mesmo foi solubilizado com 150µl de trizma base 10uM, a leitura
espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 940 nm em um leitor de
microplacas (Biotek® - Synergy/USA). A partir deste ensaio escolheu-se o tempo e a
concentração dos tratamentos.
5. Ensaio de proliferação com MTT
Realizamos o ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl) -2,5-difenil
tetrazolium), este também é um ensaio muito utilizado para medir a proliferação celular.
Para a realização do MTT as células foram plaqueadas, cultivadas e tratadas da mesma
forma que no ensaio anterior. Porém para este o ensaio foi realizado apenas na
concentração de 25µg/mL durante 24 horas.
No ensaio de MTT o substrato foi acrescido nas células numa concentração de
5mg/mL e incubado no escuro por 3 horas a 37ºC, em seguida removeu-se o meio de
cultura e adicionado 100ul de solvente DMSO, agitou-se por 15min fez-se a leitura da
placa em leitor de ELISA a um comprimento de onda de 595nm.
48
6. Ensaio de cicatrização
O ensaio de cicatrização foi realizado da seguinte maneira: as células de
músculo liso foram semeadas em placas de 24 poços, em um n=3/grupo, numa
densidade de 5x104 células/poço, estas cresceram em meio DMEM com 15% de SFB,
até atingirem confluência. Em seguida, simulou-se uma lesão em linha paralela ao longo
do diâmetro da placa, com o auxílio de uma ponteira de 200µl estéril, trocou-se o meio,
adicionando-se os tratamentos com os GAGs, o grupo controle foi adicionado apenas
DMEM suplementado com SFB.
Foram realizados, três tratamentos diferentes, Heparina (25µg/mL), HBPM (25
µg/mL) e DS (25µg/mL), as drogas foram adicionadas ao meio DMEM com 1% de
SFB, para o controle foi adicionado apenas DMEM com 1% de SFB. Após a lesão, as
placas foram fotografadas em microscopia utilizando time lapse (a cada 30 minutos por
24 horas) no microscópio Zeiss Observer Z.1 (Zeiss, Alemanha), através do software
Zeiss Zen, em aumento de 200x. A análise da cicatrização foi feita pelo software Fiji
Image J nos tempos 0, 6, 12, 18 e 24h.
7. Zimografia para gelatinases em células de músculo liso
Para a extração de proteínas das células de músculo liso trabalhamos com placas
de 10cm² confluentes para cada tratamento e o controle. Os tratamentos foram feitos
numa concentração de 25µg/mL durante 24h, após este período, as células foram
tripsinizadas e a extração proteica realizada com tampão de extração (Tris 50nM, NaCl
0,2M, Triton X-100, CaCl2, pH 7,4 com coquetel anti-protease), para cada placa
utilizou-se 100ul. As células foram homogeneizadas com auxílio de sonicador, e as
amostras foram colocadas em gelo por 2h para extração das proteínas. As amostras
foram centrifugadas a 4ºC, numa velocidade de 8000rpm por 20 min, o sobrenadante foi
coletado e quantificado por Bradford. Utilizou-se 20ug de proteína em cada poço para
cada tratamento analisado.
O gel de poliacrilamida de 10% contendo 1% de gelatina foi desenvolvido a 4ºC
após o final da eletroforese foi lavado por 2x de 30min sob agitação, numa solução de
2,5% de Triton X-100 e incubado a 37ºC por 24h sob agitação em uma solução de Tris
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HCL50mM, NaCl 0,1M, CaCl2, ácida sódica 0,02%, pH7,4. O gel foi corado com
Coomassie brilhant blue R-250 (Sigma) por 30min. Depois disso os géis foram lavados
com uma solução contendo etanol 30% e ácido acético 10% para observação das bandas
com atividade das enzimas. As bandas em imagem negativa foram quantificadas usando
o software ImageJ.
VI. EXPERIMENTOS COM ANIMAIS
1. Lesão arterial
Para a lesão arterial, fez-se uma adaptação do protocolo de Leidenfrost et. al
[174], resumidamente, os camundongos machos C57BL6 com 8 semanas de idade,
foram anestesiados com uma injeção intramuscular com 16 mg/kg de xilazina e 100
mg/kg de quetamina, fez-se uma incisão na cervical média para isolar a artéria carótida
comum esquerda (Figura 12, A), interrompeu-se o fluxo sanguíneo da artéria utilizando
um clamp atraumático na região distal da carótida comum e na carótida interna, a
carótida externa foi puncionada com uma agulha 30G e uma sonda metálica de 0,63mm
de diâmetro foi introduzida através dela até a artéria carótida comum. Repetiu-se esse
movimento 3x. Este procedimento provoca uma dilatação do vaso de cerca de 2,5 vezes
do seu tamanho (Figura 12, B e E), o que leva a uma lesão arterial devido a desnudação
do endotélio. Após este procedimento, a sonda foi retirada e a carótida externa foi ligada
nos dois lados da arteriotomia. Em seguida, removeu-se os grampos e o fluxo foi
restaurado (Figura 12, C). Os animais foram suturados (Figura 12, D) com fio de sutura
sintético absorvível 6.0 e mantidos por 3 dias para observação do trombo ou por 21 dias
após a lesão, para observação da camada neointima.
50
Figura 12: Modelo de lesão arterial na carótida. (A) isolamento da artéria carótida,
(B) colocação da sonda no vaso, (C) artéria carótida ligada nos dois lados da
arteriotomia, carótida externa (seta menor), carótida comum (seta maior), (D)
camundongo suturado após o procedimento, (E) sonda utilizada na lesão, (F) injeção do
PBS ou dos tratamentos feita pela veia da cauda do camundongo.
51
2. Divisão dos grupos
Para os experimentos os animais foram divididos nos seguintes grupos:
1- Grupo lesionado: animais com lesão arterial, injetados com PBS e sacrificados 3
dias após a lesão.
2- Grupo lesionado e tratado com heparina: animais com lesão arterial tratados com
heparina e sacrificados 3 dias após a lesão
3- Grupo lesionado e tratado com HBPM: animais com lesão arterial tratados com
HBPM e sacrificados 3 dias após a lesão.
4- Grupo lesionado e tratado com DS: animais com lesão arterial tratados com DS
e sacrificados 3 dias após a lesão.
5- Grupo lesionado: animais com lesão arterial injetados com PBS e sacrificados
21 dias após a lesão.
6- Grupo lesionado e tratado com heparina: animais com lesão arterial tratados com
heparina e sacrificados 21 dias após a lesão.
7- Grupo lesionado e tratado com HBPM: animais com lesão arterial tratados com
HBPM e sacrificados 21 dias após a lesão.
8- Grupo lesionado e tratado com DS: animais com lesão arterial tratados com DS
e sacrificados 21 dias após a lesão.
Após a lesão arterial os animais receberam injeções com PBS nos grupos
controle ou com os GAGs nos grupos tratados. As injeções foram ministradas
15min, 12h, 24h e 48h após a indução do trombo, nas seguintes concentrações: DS
de mucosa intestinal de porco (Sigma catálogo n: 3788) 10mg/kg, HBPM 1mg/kg
(Clexane, Sanofi-Aventis, Brasil) e heparina (Cristália, SP) 1mg/kg. Estas doses
foram escolhidas baseadas em trabalhos anteriores do laboratório[175].
52
Figura 13: Desenho experimental do estudo. Divisão dos grupos, tratamentos e doses
utilizados, período após lesão arterial.
3. Tempo parcial de tromboplastina ativada (TTPa)
O TTPa determina o tempo de coagulação do plasma citratado (3,8% citrato de
sódio). Para isso é adicionado um ativador plasmático e fosfolipídios no plasma este é
incubado, após a incubação ocorre a ativação com cloreto de cálcio. É medido o tempo
de formação do coágulo após adição do cálcio. Este teste avalia os fatores da via
intrínseca da cascata de coagulação.
Para este teste, 3 dias após a lesão arterial os animais dos diferentes grupos: CT,
HNF, HBPM e DS, foram anestesiados e o sangue coletado, pela veia cava dos animais,
com seringas de 1ml e agulhas de 26g com 10% de citrato (3,8%), após o sangue foi
53
centrifugado a 3000rpm por 10 min para separação do plasma, o TTPa foi medido com
a utilização de Kit.
O Kit utilizado foi TTPa Clot (BIOS Diagnósica), o teste foi realizado da
seguinte maneira: incubou-se 50 µl de amostra à 37ºC em bloco térmico, foi adicionado
50µl do reagente TTPa clot (e incubou-se por 2min a 37ºC, em seguida adicionou-se
50µl de cloreto de cálcio (pré-aquecido a 37ºC) e iniciou-se a medição do tempo no
coagulômetro CLOTimer (Clot S.P, Brasil). O teste foi realizado em duplicada (n=3),
nos grupos controle ou tratados sacrificados 72horas após lesão.
4. Tempo de Protrombina (TP)
O TP avalia os fatores da via extrínseca da cascada de coagulação. O teste
consiste em avaliar o tempo de formação do coágulo de fibrina após a adição do fator
tissular e cálcio. O fator tissular ou fator III é responsável por ativar o fator X da cascata
de coagulação resultando na formação do coágulo de fibrina. Foi coletado o sangue
venoso dos camundongos, como descrito acima, com 3,8% de citrato de sódio
(proporção de 1:9), o sangue foi centrifugado à 3000rpm por 10min e coletou-se o
plasma. Para o teste utilizou-se o kit TP CLOT (BIOS Diagnósica), o ensaio foi
realizado da seguinte maneira: pipetou-se em uma cubeta pré-aquecida 50ul do plasma e
incubou-se por 1min, adicionou-se 100ul do reagente para o teste protrombina
previamente aquecido à 37ºC. A medição do tempo formação do coágulo foi realizada
no coagulômetro CLOTimer (Clot S.P, Brasil). Realizou-se os testes em duplicada
(n=3), nos grupos controle ou tratados sacrificados 72 horas após lesão.
5. Determinação da presença de células progenitoras e de células
inflamatórias por imunofluorescência
Para a análise imunofluorescência, as lâminas contendo os cortes histológicos
da artéria carótida, de todos os grupos foram descongeladas por 20 minutos em
temperatura ambiente e fixadas em metanol, durante 20 minutos a 4ºC. Em seguida
lavou-se as lâminas 2 vezes com PBS por 5 minutos cada, e incubou-se com PBS/ BSA
1% durante 1 hora para o bloqueio de antígenos inespecíficos, as lâminas foram lavadas
54
novamente com PBS (2 vezes de 5 minutos) e incubou-se com o anticorpo primário
overnight, a 4ºC.
Na marcação de células inflamatórias foi utilizado o anticorpo Ly6G anti-mouse
(Sigma) na concentração 1:80, este marcador é expresso principalmente por neutrófilos,
mas também por eosinófilos e monócitos. Também foi utilizado o CD11b anti-mouse
(invitrogen) na concentração 1:80, este marcador é expresso por células inflamatórias
como granulócitos, monócitos/macrófagos. Para a análise da expressão de ICAM-1,
uma molécula de adesão expressa por células endoteliais ativadas, utilizou-se o
anticorpo ICAM-1 anti-mouse, (R&D system) na diluição de 1:100.
O anticorpo CD 34 (ebioscience) na diluição de 1:100 foi utilizado para a
marcação de células tronco hematopoiéticas, o anticorpo CD31, (invitrogen), na
diluição de 1:100, foi utilizado para avaliar a presença de células endoteliais no vaso,
estudando o processo de reendotelização da artéria.
Após a incubação com o anticorpo primário as lâminas foram lavadas 3 vezes
em PBS, durante 5 minutos cada, e incubadas com o anticorpo secundário anti-Rat
AlexaFluor 488, (1:250) durante 1 hora, e lavados por 3 vezes por 5 minutos com PBS.
A marcação dos núcleos foi feita com DAPI (0,5µg/ml) durante 10 minutos à 37ºC. As
lâminas foram montadas com meio de montagem para fluorescência Vectashield e
fotografados em microscópio de fluorescência BX51, Olympus e analisados pelo
software CellSens. Para contagem utilizou-se o programa ImageJ®.
6. Zimografia para gelatinases dos tecidos
As artérias carótidas lesionadas e tratada com os diferentes glicosaminoglicanos,
3 dias após a lesão foram coletadas e fez-se a extração de proteínas, com tampão de
extração (Tris 50nM, NaCl 0,2M, Triton X-100, CaCl2, pH 7,4 com coquetel anti-
protease), foi utilizado 100µl para um pool de 3 carótidas por grupo. Os tecidos foram
homogeneizados com auxílio de sonicador, e as amostras foram colocadas em gelo por
2h sob agitação. O material centrifugou-se o material a 4ºC, numa velocidade de
8000rpm por 20 min, o sobrenadante foi coletado e quantificado por Bradford. Utilizou-
se 20ug de proteína em cada poço para cada tratamento analisado.
Este protocolo de zimografia de gelatinases dos tecidos foi o mesmo utilizado
para a zimografia em células de músculo liso.
55
7. Zimografia in situ
As artérias carótidas, dos animais lesionados, com e sem tratamento, 21 dias
após a lesão, foram coletadas e embebidas em OCT (Tissue-Tek Optimal Cutting
temperature Compound, Torrance-USA), armazenadas em biofreezer -80 e processadas
em criostato, para obtenção dos cortes histológicos na espessura de 8µm de espessura. A
atividade gelatinolítica foi medida in situ, nos cortes das artérias carótidas utilizando a
DQ Gelatin (Invitrogen, Carlsbad-USA), este reagente é um substrato de gelatinases
conjugado com fluorescência que é liberada nos locais onde ocorre clivagem enzimática
deste. Para a zimografia as lâminas foram descongeladas, por 20min em temperatura
ambiente, lavadas por 10min em PBS para remoção do OCT e incubadas com o
reagente DQ Gelatin (12,5-100 µg/ml) preparado no tampão de reação (10mM CaCl2, 1
mM ZnCl2, 50 mM Tris, pH 7.6) no escuro por 2 horas, a 37ºC. Depois, as lâminas
foram lavadas por 2x de 5min em PBS, e os núcleos corados com DAPI por 15min. As
lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência (Observer Z.1, Zeiss,
Oberkochen, Germany) em aumento de 20x utilizando o software AxioZision 4.8. A
atividade proteolítica foi detectada pelo aumento da intensidade de fluorescência devido
a atividade enzimática, pela degradação do substrato e liberação da fluorescência, as
análises foram feitas com o programa Image J (densidade integrada), subtraindo-se a
autofluorescência da lâmina elástica, lâmina branco incubada apenas com o tampão de
incubação.
8. Análise estatística
Análise estatística foi realizada com One-Way ANOVA, seguido de pós teste
turkey. Valores de p menores ou igual a 0,05 (p≤0,05) foram considerados
significativos.
56
VII. RESULTADOS
VIII. RESULTADOS COM CÉLULAS
1- Caracterização das células de músculo liso por imunohistoquimica
As células de músculo liso isoladas das artérias aorta de camundongos, levaram
aproximadamente 15 dias para atingir a confluência em placas de 6 poços, sendo que
eram observadas a adesão das primeiras células com 5 dias de cultura e com 7 dias a
formação de pequenas colônias (Figura 14). Após atingirem confluência as células eram
tripsinizadas e os experimentos foram feitos entre a 3ª e 8ª passagem.
Figura 14: Imagem das células de músculo liso isoladas da artéria aorta de
camundongos. 7 dias de cultivo. Fotografia obtida em microscópio contrate de fase,
aumento 20x.
57
A confirmação de fenótipo das células foi feita por imunohistoquímica com o
anticorpo alfa-actina para células de músculo liso, como mostrada na figura abaixo
(Figura 15).
Figura 15: Imunofluorescência das células de músculo liso. DAPI (A), anticorpo
alfa-actina conjugado com AlexaFluor 594 (B) e sobreposição das imagens(C).
Aumento 20x.
2. Efeito dos glicosaminoglicanos na proliferação celular de células de
músculo liso por sulforodamina B
Para o ensaio de proliferação celular, as células de músculo liso, isoladas das
artérias aortas dos camundongos foram semeadas em placas de 96 well, e tratadas com:
heparina, heparina de baixo peso molecular ou dermatan sulfato, durante 24h e 48h, em
duas concentrações diferentes destes GAGs 25µg/ml e 50µg/ml.
Após 24 horas de tratamento os grupos tratados com os diferentes GAGs
apresentaram uma diminuição na proliferação celular em relação ao grupo controle (sem
tratamento), nas duas concentrações utilizadas (25µg/ml e 50µg/ml), sendo que não foi
observado diferença entre os diferentes glicosaminoglicanos. (Figura 16). Os valores da
absorbância para o grupo controle foram de 0,918±0,048, o grupo tratado com HNF
apresentou 0,612±0,02 (25µg/ml) e 0,662±0,07 (50µg/ml), para a HBPM os valores
encontrados foram de 0,667±0,03 (25µg/ml) e 0,601±0,02 (50µg/ml) , e para o DS os
valores foram de 0,703±,04 (25µg/ml) e 0,626±0,02 (50µg/ml) (P≤0,0001).
58
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Figura 16: Proliferação das células de músculo liso, com sulforodamina B. 24 horas
de cultivo células com os tratamentos HNF, HBPM e DS e no grupo controle (CTR),
nas concentrações de 25 e 50ug/ml. Valores estatísticos significativos *, P≤0,05, n=5.
(ANOVA).
Com 48 horas de tratamento não foi observada diferença significativa entre os
grupos tratados em relação ao controle, e aos diferentes tratamentos. As diferentes
concentrações também não demostraram diferença significativa (Figura 17).
59
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0 .2
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0 .8
Figura 17: Proliferação das células de músculo liso, com sulforodamina. A
proliferação foi analisada durante 48 horas de tratamento (HNF, HBPM e DS) nos
grupos controle (CTR) e nas concentrações de 25 e 50ug/ml. n=5. (ANOVA).
Estes dados nos indicam que os glicosaminoglicanos, nas concentrações de 25 e
50µg/ml foram capazes de diminuir a proliferação de células de músculo liso durante 24
horas, porém com 48 horas este resultado não foi mantido. A dosagem de HNF e HBPM
usada in vivo corresponde a aproximadamente 25µg/mL plasma e de DS 250 µg/mL
plasma em um animal de 25g.
3. Efeito dos glicosaminoglicanos na proliferação celular de células de
músculo liso por MTT
Para o ensaio de proliferação celular com MTT foi escolhida apenas a
concentração de 25µg/ml, tendo em vista que as diferentes concentrações dos GAGs
não apresentaram diferença significativa no experimento anterior. Este foi realizado no
tempo de 24 horas de tratamento, pois no ensaio anterior não verificamos diferença
significativa com 48 horas de tratamento.
60
O teste de proliferação por MTT confirmou que as células de músculo liso
isoladas da artéria aorta dos camundongos, apresentam uma diminuição significativa de
cerca de 36 % na proliferação quanto tratadas com os diferentes GAGs em relação ao
grupo controle, os valores da absorbância para o grupo controle foram de 0,336±0,08, o
grupo tratado com HNF apresentou 0,205±0,005, para o tratamento com HBPM os
valores foram de 0,209±0,01 e com DS os resultados foram de 0,206±0,02, sendo que
não foi observado diferença significativa entre os tratamentos (P≤0,05). (Figura 18).
Figura 18: Proliferação celular por MTT, durante 24 horas, grupo controle (CTR) e
nos grupos tratados com HNF, HBPM e DS, na concentração de 25ug/ml. Diferença
significativa **, P≤0,005 (ANOVA). n=3.
4. Papel dos glicosaminoglicanos na cicatrização celular
Para o ensaio de cicatrização células, as CML foram plaqueadas em placas de 24
well, após confluentes foi feito uma lesão com auxílio de uma ponteira (P200) em
seguida foram adicionados os GAGs na concentração de 25 ug/ml, e a migração das
células foi monitorada durante 24 horas. Não foi observada diferença significativa na
cicatrização destas células entre os tratamentos ou grupo controle (Figura 19).
61
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Figura 19 : Cicatrização das células de músculo liso in vitro, com os diferentes
GAGs e grupo controle, durante 24 na concentração de 25µg/ml. Não houve diferença
significativa (ANOVA).
5. Efeito dos glicosaminoglicanos na atividade das gelatinases in vitro em
células de músculo liso
Para o ensaio de zimografia para gelatinases, as células de músculo liso, foram
cultivadas com os diferentes glicosaminoglicanos na concentração de 25µg/ml em
DMEM e SFB, durante 24 horas, no grupo controle as células foram cultivadas com o
meio de cultivo. Após o tratamento, fez-se a extração de proteínas com as células
tripsinizadas.
Foi possível observar apenas a atividade da gelatinase MMP-2 nestas células, em
todos os grupos, e não foi observado diferença significativa da atividade gelatinolítica
dos tratamentos em relação ao grupo controle e entre os tratamentos. (Figura 20).
62
Figura 20: Zimografia in vitro para atividade das gelatinases nas células de
músculo liso extraídas da aorta de camundongo. (A) atividade da banda MMP-2
ativa (62 KDa). (B) Análise da intensidade das bandas com software imageJ, nos grupos
63
tratados e grupo controle. N=5. Não há diferença significativa entre os grupos.
(ANOVA)
IX. RESULTADOS COM ANIMAIS
1. O tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) já está
normalizado 3 dias após o tratamento com os diferentes GAGs.
O TTPa foi realizado no plasma dos camundongos tratados com 4 doses dos
glicosaminoglinanos sendo elas 15mim, 12, 24 e 48 horas após a indução do trombo e
sacrificados 72 horas após a lesão, ou seja, os animais foram sacrificados e o plasma
coletado, 24 horas após o término dos tratamentos. E neste tempo não foi observada
diferença significativa no TTPa, entre os grupos tratados ou controle. (Figura 21)
64
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Figura 21: Tempo de TTPa, do plasma dos camundongos tratados com os
glicosaminoglicanos e no grupo controle, 72 horas após a lesão arterial. Grupos não
apresentam diferença significativa. (ANOVA). N=3
2. O tempo de Protrombina (TP) já está normalizado 3 dias após o
tratamento com os diferentes GAGs.
O tempo de TP foi medido no plasma dos camundongos, nos grupos tratados ou
no grupo controle, 72 horas depois da indução do trombo, onde eles receberam 4 doses
dos diferentes tratamentos, sendo elas 15 minutos, 12, 24 e 48 horas após lesão arterial.
Neste tempo de 72 duas após lesão e 24 horas após o término do tratamento, o TP do
plasma não apresentou diferença significativa em comparação com os grupos tratados
ou controle. (Figura 22)
65
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Figura 22: Tempo de trombina (TP) do plasma dos camundongos, 72 horas após a
lesão, nos grupos tratado com os diferentes GAGs e grupo controle. Não foi observada
diferença significativa entre os grupos. (ANOVA). N=3.
1. Os glicosaminoglicanos diminuíram a área de trombo de forma
similar, 3 dias após a lesão arterial
As artérias lesionadas foram isoladas, cortadas em cortes seriados, e coradas
com hematoxilina eosina em diferentes porções, para área de trombo escolheu-se a
imagens com a maior porção do trombo. (Figura 23 e 24). A área de trombo foi
calculada para os diferentes tratamentos e grupo controle, 3 dias após a lesão arterial.
A figura 24 indica a porcentagem da área de trombo em relação a área total do
vaso, foi verificado que em todos os tratamentos com os GAGs houve uma diminuição
significativa na área de trombo em relação ao grupo controle, sendo que entre os
tratamentos não se observou diferença significativa.
66
Para o grupo controle os valores da área de trombo são 81,22 ± 10,9%, para o
grupo tratado com heparina os valores são 27,5 ± 20,0%, no grupo tratado com HBPM
os valores encontrados são 35,61 ± 17,05% e no grupo tratado com DS os valores são
38,84 ± 21,02%. Ocorreu uma redução de 66, 56,2 e 52,18% da área de trombo nos
tratamentos de heparina, HBPM e DS respectivamente em relação a área de trombo do
grupo controle.
Estes resultados nos mostram que os GAGs utilizados diminuem a área de
trombo 3 dias após a lesão arterial, sendo que a heparina foi o anticoagulante que
apresentou o melhor resultado neste aspecto.
Figura 23: Cortes transversais das artérias carótidas de camundongos C57Bl6, 3
dias após a lesão, coradas com hematoxilina e eosina, 3 dias após a lesão arterial. (A)
67
Carótida controle, (B) carótida tratada com heparina, (C) carótida tratada com HBPM e
(D) carótida tratada com DS. Barra= 50µm. Aumento 20x.
Figura 24: Porcentagem da área de trombo das artérias carótidas 3 dias após a
lesão arterial, tratadas com Heparina, HBPM, DS e grupo controle. n=5, **p<0,005 e
***p<0,0005 (ANOVA).
2. Efeito dos glicosaminoglicanos no processo inflamatório
2.1 O DS diminui o número de células ICAM-1 positivas na parede do vaso
Para verificar a presença da molécula de adesão intercelular -1 (ICAM-1) foi
realizada uma imunofluorescência, nos grupos tratados e no grupo controle, 3 dias após
a lesão arterial. A ICAM-1, é uma molécula de adesão expressa por células do sistema
imune e células endoteliais ativadas.
Para a molécula de ICAM-1 foi observado uma diminuição significativa no grupo
tratado com DS, em relação ao grupo controle e ao grupo tratado com HBPM (Figuras
68
25 e 26), sendo que ocorreu uma diminuição de 44,5% em relação ao grupo controle e
40,2% em relação ao grupo tratado com HBPM.
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Figura 25: Número de células marcada para ICAM-1, na parede das artérias
carótidas, 3 dias após a lesão arterial, nos grupos controle e nos grupos tratados. n=3.
Diferença significativa no grupo tratado com DS em relação ao grupo controle
*p<0,05(ANOVA).
69
Figura 26: Imunofluorescência para ICAM-1, de artéria carótidas lesionadas de
camundongos C57Bl06, 3 dias após a lesão, Os cortes foram analizados utilizando-se o
anticorpo anti-ICAM- 1 e o anticorpo secundário marcado com fluoresceína (FITC)
verde. (A) CTR grupo controle, (B) grupo tratado com heparina, (C) grupo tratado com
HBPM e (C) grupo tratado com DS. Núcleos corado com DAPI. Setas indicam LY6g
positivas. Aumento de 20x. Barra 100 µm.
70
2.2 O número de células inflamatórias no lúmen do vaso (LY6G) é diminuído
pelo tratamento com todos os 3 GAGs
Para verificar o efeito dos glicosaminoglicanos na inflamação, foi medido por
imunofluorescência a presença de LY6g, um antígeno presente em monócitos,
granulócitos e macrófagos.
Foi observado uma diminuição significativa do número de células marcados com
LY6g no lúmen do vasos, 3 dias após lesão arterial, nos grupos tratados com o GAGs.
No grupo tratado com HNF essa diminuição foi de 45%, com HBPM 55%, e no com
DS 63%. Sendo que não houve diferença significativa entre os diferentes tratamentos
(Figuras 27 e 28).
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Figura 27: Número de células marcadas para Ly6G no lúmen das artérias
carótidas, 3 dias após a lesão, no grupo controle e nos grupos tratados. n=3, **p<0,005
e *p<0,05 (ANOVA). Diferença significativa entre os tratamentos em relação ao grupo
tratado.
71
Figura 28: Imunofluorescência para LY6g, de artérias carótidas lesionadas de
camundongos C57Bl06. Artérias carótidas 3 dias após a lesão. (A) CTR grupo controle,
(B) grupo tratado com heparina, (C) grupo tratado com HBPM e (C) grupo tratado com
DS. Núcleos corado com DAPI. Setas indicam LY6g positivas. Aumento de 20x. Barra
100 µm.
2.3 O número de células inflamatórias CD11b no lúmen do vaso é diminuído
pelo tratamento com HNF e DS
As células inflamatórias do lúmen do vaso também foram quantificadas com o
marcador CD11b, este é expresso na superfície das membranas de células como os
72
monócitos, neutrófilos, macrófagos e granulócitos. Esta proteína tem por função regular
a adesão e migração das células mediante a um processo inflamatório.
Utilizando este marcador nas carótidas 3 dias após lesão arterial, nós observamos
uma diminuição significativa no grupo que foram tratados com HNF e DS em relação
ao grupo controle e ao grupo tratado com HBPM.
Em relação ao grupo controle nós obtivemos uma diminuição de células marcadas
para CD11b, de 56% para o grupo tratado com HNF e de 55% para o grupo tratado com
DS. Já em relação ao grupo que foi tratado com HBPM nós pudemos observar uma
diminuição de 51% nos animais tratados com HNF e de 48% no grupo que recebeu o
tratamento de DS (Figura 29e 30).
Com esses resultados foi verificado que os tratamentos com HNF e DS, são capazes
de diminuir a quantidade de células inflamatórias CD11b no local da lesão. Sendo que o
grupo que recebeu o tratamento com HBPM demostrou o mesmo perfil para estas
células que o grupo controle.
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Figura 29: Número de células marcadas para CD11b nas artérias carótidas, 3 dias
após a lesão, grupo controle (CTR) e nos grupos tratados com HNF, HBPM e DS. n=3,
(ANOVA). Diferença significativa p≤0,05.
73
Figura 30:Imunofluorescência para CD11b de artérias carótidas lesionadas de
camundongos C57Bl06. Artérias carótidas 3 dias após a lesão. (A) CTR grupo
controle, (B) grupo tratado com heparina, (C) grupo tratado com HBPM e (C) grupo
tratado com DS. Núcleos corado com DAPI, setas indicam células cd11b positivas.
Aumento de 20x, barra 100 µm.
74
3. O número de células progenitoras CD34 não é aumentando pelo
tratamento com os diferentes GAGs
A fim de verificar a presença de células tronco de origem hematopoiética no lúmen
e parede do vaso, foi realizado uma imunofluorescência utilizando-se o anticorpo CD34,
no grupo controle e nos grupos tratados com HNF, HBPM e DS, 3 dias após a lesão
arterial.
Neste período, de 72 horas após a lesão, não foi encontrada diferença significativa
no número de células CD34 positivas entre os grupos (Figuras 31 e 32). Sendo assim os
tratamentos não influenciam na migração de células tronco hematopoiéticas da medula
óssea para o local da lesão.
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Figura 31: Número de células marcadas para CD34 nas artérias carótidas, 3 dias
após a lesão. No grupo controle e nos grupos tratados. n=3, (ANOVA). Sem diferença
significativa entre os grupos.
75
Figura 32:Imunofluorescência para CD34 de artérias carótidas lesionadas de
camundongos C57Bl06. Artérias carótidas 3 dias após a lesão.(A) CTR grupo controle,
(B) grupo tratado com heparina, (C) grupo tratado com HBPM e (C) grupo tratado com
DS. Núcleos corado com DAPI, setas indicam células CD34 positivas. Aumento de 20x,
barra 100 µm.
76
4. A HNF e o DS foram capazes de diminuir a atividade da MMP-2 ativa, 3
dias após a lesão arterial
A análise da atividade das gelatinases MMP-2 e MMP-9, nas artérias carótidas dos
camundongos 3 dias após a lesão arterial. Foi realizado com gel de acrilamida com um
pool de carótidas (n=3), para cada um dos grupos (CTR, HNF, HBPM e DS).
Foi possível identificar as seguintes MMPs por meio da zimografia (Figura 33),
MMP-2 ativa (62 kDa), MMP-9 latente (92 kDa) e MMP-9 ativa (83kDa).
Figura 33: Zimografia para MMP-2 e MMP-9 na artéria carótida de camundongo
C57BL06 3 dias após lesão. A banda de 83kDa correspondente a MMP-9 ativa. Na
sequência observamos a presença da banda de 72KDa, correspondente a MMP-2 latente
e a banda de 62 kDa, correspondente a MMP-2 ativa.
77
A atividade da MMP-9 ativa, apresentou o mesmo perfil para os diferentes
grupos (Figura 34). No grupo controle a intensidade das bandas foi de 38175,5 ± 7401
(pixels), para o grupo tratado com HNF a intensidade foi de 31759,91 ± 7476 (pixels), o
grupo tratado com HBPM os valores foram de 41732,88 ± 7400 (pixels) e para o grupo
tratado com DS os valores foram de 30755,94 ± 2737 (pixels) (Figura 34).
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Figura 34: Zimografia para MMP-9 ativa. Análise da intensidade das bandas,
analisadas pelo software ImageJ. Não há diferença significativa entre os grupos.
(ANOVA). N=3.
Para a atividade da MMP-2 latente o grupo tratado com DS, apresentou uma
diminuição significativa em relação ao grupo CTR, e aos tratamentos com HNF e
HBPM (Figura 35). Entre os outros grupos, CTR, HNF e HBPM não foram observadas
diferenças na atividade da MMP-2 latente. Sendo os valores encontrados para o grupo
controle de 530045,83 ± 4382, o grupo tratado com HNF com 49923,24 ± 1060, o
grupo tratado com HBPM 50929,91 ± 5911, e o grupo que recebeu tratamento com DS
37181,82 ± 3356.
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***
Figura 35: Zimografia para MMP-2 latente. Análise da intensidade das bandas, pelo
software ImageJ. N=3. Diferença significativa **p<0,005 e *p<0,05 (ANOVA).
Na análise da MMP-2 ativa, observamos uma diminuição significativa da
atividade desta gelatinase nos grupos tratados com HNF e DS em relação ao grupo
tratado com HBPM (Figura 36), não se observou diferença estatística dos grupos
tratados em relação o grupo controle. Os valores do grupo controle foram de 33229,95 ±
5548, para o grupo tratado com HNF 25169,07 ± 3322, no grupo que recebeu a HBPM
45723,15 ± 9251, e o grupo tratado com DS 24012,76 ± 4217.
Com estes dados nos observamos que não houve diferença na atividade da
MMP-9 ativa nos grupos estudados, a MMP-2 latente apresentou uma diminuição
apenas no grupo tratado com DS, e foi encontrada uma diminuição da atividade da
MMP-2 ativa nos grupos tratado com HNF e DS.
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Figura 36: Zimografia para MMP-2 ativa. Análise da intensidade das bandas, pelo
software ImageJ. N=3. Diferença significativa**p<0,005 (ANOVA).
4.1 A HNF e o DS foram capazes de diminuir a área da camada
neointima, 21 dias após a lesão
As artérias foram isoladas 21d após as lesões, cortadas e coradas com
hematoxilina eosina (Figura 37). A área de neointima foi calculada nos diferentes
tratamentos e no grupo controle.
A porcentagem da área de neointima em relação a área total do vaso, foi
calculada para os diferentes glicosaminoglicanos, foi observada uma diminuição
significativa desta nos animais tratados com heparina e DS em relação ao grupo
controle, o grupo tratado com HBPM não mostrou diferença estatística comparado com
o controle. Em comparação com os tratamentos, os grupos tratados com heparina e DS
apresentaram uma diminuição significativa em relação ao grupo tratado com HBPM.
80
Para o grupo controle os valores da área de neointima são 93,5 ± 6,2%, para o
grupo tratado com heparina os valores são 34 ± 23,0%, no grupo tratado com HBPM os
81,06 ± 21% e no grupo tratado com DS 45,7 ± 24,02% (Figura 38).
Os grupos tratados com heparina e DS apresentaram uma porcentagem de área
de neointima de 63,45 e 50,8% menor em relação ao grupo controle, respectivamente.
Em relação ao grupo tratado com HBPM essa porcentagem foi de 58% para os animais
tratados com heparina e 43% para os animais tratados com DS.
Estes resultados indicam que a heparina e o DS foram capazes de diminuir a
formação da camada neointima 21dias após a lesão arterial, e a HBPM não teve
influência sobre está camada.
Figura 37: Cortes transversais das artérias carótidas de camundongos: 21 dias após
a lesão arterial, coradas com hematoxilina e eosina. (A) Carótida controle, (B) carótida
tratada com heparina, (C) carótida tratada com HBPM e (D) carótida tratada com DS.
Barra= 50µm. Aumento de 20x
81
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*** **
Figura 38: Porcentagem da área de neointima das artérias carótidas 21 dias após a
lesão arterial, tratadas com os glicosaminoglicanos Heparina, HBPM, DS e grupo
controle. n=5, **p<0,005 e ***p<0,0005 (ANOVA).
5. Os GAGs não foram capazes de aumentar a reendotelização nas artérias 21
dias após a lesão
Para verificar se os GAGs utilizados aumentam a migração das células
endoteliais e a reendotelização do tecido, foram realizados nos cortes histológicos
das artérias 21 dias após a lesão arterial. Foram realizadas análises de
imunofluorescência com o anticorpo CD31, que é expresso por células endoteliais e
por essa razão é utilizado como um marcador de endotélio.
Em nossos resultados, os GAGs utilizados nos tratamentos não aumentaram a
presença das células endoteliais (Figuras 39 e 40).
82
Figura 39:Imunofluorescêsncia para CD31, 21 dias após lesão arterial, grupo
controle (CTR), grupo tratado com HNF, HBPM e DS.
83
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Figura 40: Número de células CD31 positivas nas artérias carótidas de
camundongos, 21 dias após a lesão arterial. Sem diferença significativa. (ANOVA).
6. Os GAGs não alteraram a atividade gelatinolítica 21 dias após a lesão
A atividade das gelatinases foi medida através do ensaio de zimografia in situ,
nos cortes histológicos das artéria carótidas, nos diferentes grupos tratados e no controle
21 dias após a lesão arterial.
Os valores encontrados foram de 30,31 ± 5,38 para o grupo controle, 60,93 ±
17,67 para o grupo tratado com HNF, 69,83 ± 39,18 nos animais tratados com HBPM e
59,76 ± 24, 07 no grupo tratado com DS (Figura 41 e 42). Neste período os grupos não
apresentaram diferença significativa entre eles.
84
85
Figura 41: Zimografia in situ da artéria carótida de camundongo C57Bl6, 21 dias
após a lesão: (A) branco sem adição de DQ gelatin, (B) artéria carótida não lesionada,
(C) lesionado 21 dias sem tratamento, (D) lesionado 21 dias tratado com heparina, (E)
lesionado 21 dias tratado com HBPM e (F) lesionado 21 dias tratados com DS.
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Figura 42: Atividade in situ das gelatinases nas artéria carótida de camundongos,
21 dias após a lesão. Sem lesão, grupo controle, lesionado e não tratado e grupos
tratados com heparina, HBPM e DS respectivamente. N=3. Os grupos não apresentaram
diferença significativa entre eles.
86
X. DISCUSSÃO
A proliferação e migração de células de músculo liso da camada média para o
lúmen do vaso causando a reestenose do vaso é um problema que atinge cerca de 20-
30% dos pacientes submetidos a colocação de stents metálicos e 10% pacientes que
receberam stents farmacológicos, e apesar da incidência desta patologia ter diminuído
com o uso de stents farmacológicos, ele ainda atinge muitos pacientes submetidos à
cirurgia de revascularização [7], gerando consequências, como maior gasto com a saúde
e a perda de produtividade e qualidade de vida destes estes indivíduos.
Deste modo, neste trabalho buscamos estudar o efeito dos glicosamminoglicanos
na proliferação das células musculares lisas de artérias in vivo e in vitro, buscando
entender seu papel na restenose após lesão arterial. Para tal, isolamos células de
músculo liso da aorta de camundongos C57Bl6, e analisamos, se os
glicosamnoglicanos: HNF, HBPM e DS, seriam capazes de diminuir a migração e
proliferação destas células in vitro. Foram utilizadas as concentração de 25 e 50µg/ml
dos GAGs em cultura celular, estas concentrações foram baseadas em estudos anteriores
do laboratório [176], onde foram testados diferentes doses de HNF e DS na proliferação
e migração de células progenitoras endoteliais (CPE) e HUVEC, e as concentrações de
25 e 50µg/ml foram capazes de aumentar a proliferação das CPE e HUVECs, nos tempo
de 48 horas, e com 72 horas, a concentração de 50µg/ml inibiu a proliferação destas
linhagens [176]. Estas doses estão também relacionadas as doses in vivo que são de
cerca de 25µg/mL plasma para a HNF e para a HBPM e de 250µg/mL para o DS.
Nossos resultados in vitro, mostraram uma redução na proliferação das células
de músculo liso isoladas da artéria aorta de camundongo, quando tratadas por 24 horas,
nas concentrações de 25 e 50 µg/ml com os GAGs (HNF, HBPM e DS).
Yang et al. (2012), demostrou que células de músculo liso isoladas de cordão
umbilical humano (HUASMC), quando colocadas em uma superfície revestida com
HNF, apresentaram inibição na adesão e proliferação. Neste mesmo trabalho, foi
verificado que a linhagem HUVECs (células endoteliais de cordão umbilical)
apresentou um aumento da proliferação, adesão e migração quando cultivada em
superfície coberta com heparina. Sugerindo, que a HNF, pode estar atuando na inibição
das CML e ao mesmo tempo na reendotelização do tecido lesionado, e desta forma
contribuindo in vivo para a diminuição da camada neointima [177].
87
Beamish et al. [178], em um experimento onde cultivou células de músculo liso
de artéria coronária humana, sobre um hidro gel contendo heparina, observou a inibição
da proliferação das mesmas, e quando cultivadas com a HNF as células expressavam
um maior número de marcador para o fenótipo contrátil. Ao expressarem mais
marcadores para o fenótipo contrátil, estas células seriam menos propensas a
desenvolver o fenótipo proliferativo e migratório, o que seria positivo para diminuição
da camada neointima.
Gu at al (2010) [179], demonstrou que a HBPM também foi capaz de inibir a
proliferação de CML isoladas de aorta de ratos, e esta inibição era maior e mais
prolongada quando este anticoagulante estava associado a um sistema de entrega de
drogas. Quando a HBPM estava associada a este sistema, também era possível observar
uma diminuição da migração destas células com 1 e 3 dias de tratamento. Estes dados
corroboram com os resultados obtidos neste trabalho.
Com estes dados, o objetivo foi verificar, se in vivo, os diferentes GAGs eram
capazes de inibir a proliferação das CML, inibindo a formação da camada neointima.
Também verificamos e comparamos o efeito dos anticoagulantes na trombose arterial in
vivo. Para isto foi utilizado um modelo de lesão mecânica para a indução da trombose e
reestenose.
Os modelos animais, são importantes para entender e avaliar os mecanismos das
doenças, e o efeito das drogas sobre elas. Sendo assim para avaliar o efeito dos GAGs in
vivo, nós escolhemos um modelo de trombose arterial mecânico, que simula uma
cirurgia de angioplastia, além da formação do trombo neste modelo ocorre o
crescimento das células de músculo liso da camada média para o lúmen do vaso,
caracterizando a reestenose do vaso pela formação da camada neointima [165].
Outros modelos animais também são capazes de induzir a formação do trombo e
neoítima, como o modelo de lesão química por cloreto férrico, também utilizado em
outros trabalho do laboratório [180]. Apesar deste modelo ser de fácil manuseio, e
monitoramento, capaz de formar trombos oclusivo e a camada neoíntima, ele também
apresenta algumas desvantagens, já que os mecanismos de formação de trombo não são
bem conhecidos e são divergentes [181]. Em nosso trabalho optamos por um modelo
mecânico por ele ter uma resposta morfológica similar a pacientes submetidos a
angioplastia [165].
Os camundongos foram divididos em quatro grupos, para avaliarmos o efeito
dos GAGs na trombose arterial, o grupo controle, recebeu PBS- Controle (1), o tratado
88
com HNF (2), HBPM (3) e DS (4). Estes animais receberam quatro doses de tratamento,
15 minutos, 12, 24 e 48 horas após a lesão arterial. Estes períodos de tratamentos foram
estabelecidos baseados em estudos anteriores do laboratório, onde Godoy et al (2015)
[182], demonstraram que o tratamento com DS, ministrado nestes tempos, diminuiu a
área de trombo arterial 1 e 3 dias após a lesão.
As doses utilizadas nos tratamentos foram de 1 mg/ml para a HNF e HBPM, e
10 mg/ml para o DS. A escolhas destas foram baseadas em dados anteriores do
laboratório, onde Silva, 2017 [175], verificou que estas doses prolongavam o tempo de
formação de trombo arterial, em modelo de trombose com cloreto férrico em
camundongos. O cofator II da heparina, no qual o DS se liga para atuar na cascata de
coagulação está em uma concentração menor no plasma em relação a ATIII, sendo
1,2µM e 2,6µM respectivamente [158], justificando a utilização de uma dosagem maior
para o DS.
A utilização de anticoagulantes requer testes que ajudem a monitorar os fatores
de coagulação no sangue, e evitar problemas como sangramentos. Dois dos testes
utilizados são os de TTPa e TP. Estes são utilizados para verificar a coagulação
sanguínea, e determinar a tendência de sangramentos ou de coagulação do sangue. O
TTPa é utilizado para medir a via intrínseca da cascata de coagulação e o TP para medir
os fatores da via extrínseca [183, 184].
Para monitorar o efeito anticoagulante dos GAGs no plasma dos camundongos,
realizamos o teste de TTPa e TP, nos diferentes grupos (CTR, HNF, HBPM e DS), três
dias após a lesão arterial. Neste tempo, os teste de TTPa e TP apresentavam valores
normais. A HBPM possui uma meia vida plasmática de duas a quatro horas, quando
injetada intravenosamente, de três a seis horas quando administrada de forma
subcutânea. O tempo de meia-vida da HNF é ainda mais curto, cerca de 20 min [134] e
o DS também é relatado em literatura, tendo uma meia vida curta, de 1 a 3horas,
quando injetados em dose única intravenoso [185]. Considerando que nossos animais
foram sacrificados 72 horas após a lesão, ou seja, 24 horas após receberem as últimas
doses de tratamento, se justifica o fato do TTPa e TP não terem sido alterados em
relação ao grupo controle.
Porém quando estes GAGs são administrados pouco tempo antes da realização
dos testes, prolongaram o tempo de TTPa, [186, 187]. O DS, prolongou o tempo de
TTPa em humanos, esse efeito é dose dependente e em menos de três os efeitos
desaparecem, com 5 minutos após a administração de DS já possível ver o
89
prolongamento de teste de TTPA, estes valores variaram de 41s para uma dose de
0,5mg/kg e 53s em doses de 2 mg/kg, 1 hora após eles valores caíram para 35 e 45s
segundo respectivamente e com 3 horas os valores foram de 33 e 35s, similar ao valor
inicial de 33s.[188] A heparina quando administrada na concentração de 12 U/Kg
prolonga o tempo de TTPa para 130s, nas primeiras 6 horas quando administrada em
pacientes[189]. Em ratos, a HNF na concentração de 0,3mg/Kg prolonga o TTPa de
forma acentuada, enquanto a HBPM na dose de 0,3mg/kg e o DS 3 mg/kg prolongam o
tempo levemente em doses não hemorrágicas [190].
Em nossos resultados com a área de trombo, nos grupos sacrificados três dias
após lesão arterial, foi observado que todos os grupos que receberam tratamentos com
os GAGs, apresentaram uma diminuição no tamanho do trombo, em relação ao grupo
controle. Os animais tratados com HNF foram os que apresentaram uma maior
diminuição da área de trombo, e os grupos que receberam HBPM e DS apresentaram
resultados muitos semelhantes.
Em literatura também é relatado que estes GAGs, são capazes de inibir ou
prolongar o tempo de formação de trombo em diferentes modelos de trombose.
Em um modelo de trombose arterial por estimulação elétrica, em ratos Wistar, a
HNF, na concentração de 300U/kg, foi capaz de reduzir o peso seco dos trombos
arteriais, quando administrada 10 minutos antes da indução do coágulo. Neste mesmo
estudo, foi verificado que a HNF, também diminuiu o peso seco de trombo venoso,
induzido na veia cava de ratos, em modelo de cloreto férrico, quando injetada três
minutos antes do formação do trombo venoso na concentração de 300U/Kg [186].
A administração de HBPM, de forma intravenosa ou subcutânea, 15 minutos ou
2 horas antes da indução da lesão arterial respectivamente, foi capaz de diminuir o peso
do trombo induzido em artérias carótidas de ratos no modelo de lesão por de cloreto
férrico [191].
Em outro estudo, realizado com ratos, quando a trombose foi induzida na veia
jugular, a HBPM administrada de forma oral em dose única ou em doses repetidas, foi
capaz de reduzir a incidência de trombo em pelo menos 50% em relação aos animais
controle, tratados com solução salina, os trombos dos animais tratados também eram
mais estáveis que os controles. Neste mesmo trabalho, o grupo mediu a quantidade de
HBPM no endotélio da veia cava, em animais tratados com doses repetidas do
anticoagulante e verificou uma correlação negativa entre a quantidade de HBPM
90
encontrado no endotélio com a porcentagem da incidência de trombo e de trombos
estáveis [192].
Vicente et. al (2004) [187], também observou a atividade antitrombótica do DS,
neste trabalho foi induzida a trombose arterial na carótida de camundongos, com um
modelo de rosa de bengala. Os animais tratados com DS receberam as injeções 15
minutos antes, da indução do trombo por rosa de bengala, em concentrações diferentes
(2,5 a 20 mg/Kg), e o fluxo sanguíneo foi monitorado com uma sonda de ultrassom até
a formação do trombo, verificou-se um aumento no tempo de formação do trombo nos
animais tratados com DS, este aumento foi dose dependente até a dose de 10mg/Kg,
sendo que com a dose de 20 mg/kg não se observou uma diferença significativa.
Neste mesmo trabalho, realizou-se a indução do trombo com o rosa de bengala
na artéria carótida em animais knockout para o cofator II da heparina (HCII), estes
animais tiveram uma redução no tempo de oclusão do vaso quando comparados com os
animais HCII+/+, quando o HCII foi restaurado nos animais knockout o tempo de
formação de trombo voltava aumentar. Mostrando que a atividade antitrombótica do DS
é dependente de sua ligação com o HCII [187].
Kozlowski et al. (2011) [193], em um experimento utilizando o modelo de
trombose por cloreto férrico na artéria carótida de camundongos, mostrou que o DS
quando administrado 10 minutos antes da indução do trombo, foi capaz de prolongar o
tempo de oclusão do vaso sanguíneo, e que os animais tratados com este GAG
apresentaram uma área de trombo menor, e na composição destes coágulos a quantidade
de plaquetas estava reduzida.
Como mostrado neste trabalho e em outros, os GAGs diminuem a área de
trombo e inibem a sua formação, isto ocorre devido principalmente a sua atuação na
cascata de coagulação sanguínea.
A HNF atua se ligando a AT, dessa forma inibe vários dos fatores de coagulação
sanguínea, principalmente o fator Xa e a trombina, ela também é capaz de se ligar a
HCII, porém sua afinidade maior está em formar o complexo com AT [194]. A HBPM,
também forma um complexo com a AT, aumentando a atividade desta serpina, inibindo
a trombina, por ter um tamanho menor que a HNF, este complexo inibe o fator Xa de
forma moderada. Já o DS, atua na cascata, formando um complexo com o HCII,
inibindo a trombina [195].
Os GAGs ao se ligarem as serpinas, aumentando sua atuação e inibindo os
fatores citados acima, irão impedir a atuação e formação da trombina e a conversão do
91
fibrinogênio em fibrina, inibindo o aumento do trombo, além disso, ao inibir a
trombina, impedirá uma maior ativação plaquetária refletindo no tamanho do coágulo.
Em nossos cortes histológicos, corados com HE, foi observado a presença de
células nos trombos, a partir disso fomos investigar quais eram as células presentes nos
vasos. Para isso, realizou-se a técnica de imunofluorescência utilizando marcadores para
células inflamatória, LY6g, CD11b, ICAM-1 (expresso por células endoteliais
ativadas), e o CD 34 expresso por células tronco de origem hematopoiética.
Em nossos resultados, a HNF diminuiu a quantidade das células inflamatórias
LY6G e CD 11b, em relação ao grupo controle. O grupo tratado com HBPM apresentou
uma diminuição das células LY6g e os animais que receberam DS apresentaram uma
diminuição das células marcadas com ICAM-1, LY6g e CD11b. A marcação com
CD34, não apresentou diferença significativa entre os grupos.
O efeito anti-inflamatório da HNF e da HBPM, já vem sendo relatado em
literatura. Foi demostrado que a administração de TNF-alfa, intraperitoneal em
camundongos induz uma resposta inflamatória, onde, duas horas após a injeção, ocorre
um aumento de leucócitos rolantes, e após cinco horas ocorre uma interação entre
leucócitos e células endoteliais, e que o pré-tratamento com 500U /Kg de HNF diminuiu
a rolagem e adesão de leucócitos, após duas horas da administração de TNF-alfa[196].
Porém, neste mesmo trabalho, a administração da heparina não foi capaz de inibir a
expressão das moléculas inflamatórias como P-selectina, ICAM e V-CAM [196], o que
corrobora com nossos dados, já que a HNF não foi capaz de diminuir a expressão de
ICAM-1. Ao induzir a expressão de CD11b por leucócitos, o grupo verificou que a
resposta de adesão dos leucócitos, diminuía significativamente, sugerindo que a
heparina interfere neste processo pela sua iteração com a molécula CD11b [196] Este
dado também está de acordo com nossos resultados, pois foi observado uma diminuição
de células positivas para CD11b, no grupo tratado com HNF.
Downing et al. [197], em um modelo de trombose venosa por ligadura em ratos,
também observou a diminuição de neutrófilos e de células inflamatórias totais nos
trombos dos animais tratados com HNF e com HBPM.
Godoy at al [198], verificou que o tratamento com DS, foi capaz de reduzir a
expressão de P-selectina, 1 dia após a lesão arterial, e com três dias após lesão houve
uma redução das células CD45+ no trombo, isto pode estar relacionado com a inibição
da trombina, em decorrência da formação do complexo DS+HCII. Estes dados estão de
92
acordo com o nosso trabalho, onde verificamos a diminuição da inflamação local nos
animais tratados com DS.
Como consequência da lesão arterial ocorreu a formação do trombo, a
inflamação local e então o tecido passa pelo remodelamento, neste processo estão
envolvidos principalmente a atividades mas MMPs responsáveis pela degradação da
matriz extracelular, no remodelamento vascular as MMPs mais envolvidas são a MMP-
2 e MMP-9 [199].
Em nossos resultados, com três dias após a lesão, não foi observada alteração da
expressão da MMP-9 em nenhum dos tratamentos, no entanto, ocorreu uma diminuição
da MMP-2 ativa nos animais que receberam heparina em relação ao grupo tratado com
HBPM, e o grupo que recebeu o DS apresentou uma diminuição da expressão de MMP-
2 latente em relação aos grupos controle, HNF e HBPM e uma diminuição da MMP-2
ativa, quando comparado com os animais tratados com HBPM.
Wang et al. 2011 [200], demostrou em cultura de células de músculo liso de
aorta de ratos, que o aumento da expressão da MMP-2 por estas células está envolvido
com uma maior migração, sugerindo que o aumento da expressão de MMP-2 ativa pode
estar envolvida na reestenose da artéria após cirurgia de angioplastia.
Li et al. 2014[201], em experimentos com modelo de angioplastia em ratos,
analisou o efeito da água do mar profundo, na formação da camada neointima 14 dias
após a lesão na carótida, o trabalho mostrou que o tratamento com esta água reduz a
camada neointima, e a expressão da MMP-2 na camada média. Sugerindo que a
diminuição desta MMP pode estar relacionada com a inibição da formação da camada
neointima. Em cultura de células de músculo liso de aorta de rato, o grupo verificou,
que a água do mar profundo, diminui a migração destas células por diminuir a atividade
da MMP-2.
Em nossos resultados os grupos tratados com HNF e DS diminuíram a atividade
da MMP-2, sugerindo que a diminuição desta pode estar relacionada com a diminuição
da formação da camada neointima.
Avaliamos o efeito dos GAGs na formação da camada neointima, para isto os
animais foram sacrificados 21dias após a lesão arterial, este período foi baseado no
trabalho de Godoy et al. [198], onde foi observado a reestenose do vaso 21 dias após a
lesão mecânica e também foi relatado a diminuição desta camada quando os animais
foram tratados com DS, e com a combinação de DS e células mononucleares. Em
93
nossos resultados a HNF e o DS diminuíram a formação da camada neointima em
relação ao grupo controle e ao tratado com HBPM.
Ahn et al. [202], isolou a artéria carótida de porcos, e fez uma cirurgia de
angioplastia com a colocação de stents metálicos ou cobertos com heparina, com 4
semanas após a cirurgia os animais foram sacrificados e a artéria coletada para analise
histológica. Em seus resultados, Ahn et al, mostrou que os stents cobertos com HNF,
foram capazes de inibir a formação da camada neoitima, e que esta inibição pode estar
ligada a atividade anti-proliferativa da heparina.
Por outro lado, pacientes submetidos a colocação de stens cobertos ou não com
heparina, ao serem avaliados por angiografia não mostraram diferença significativa na
presença de reestenose do vaso entre os dois grupos, sugerindo se o tipo e marca do
stent escolhido pode ter influenciado no resultado [203].
Hanke at al [204], estudou efeito da HBPM em coelhos submetidos a
angioplastia, e em seus resultados, o grupo observou uma diminuição do número de
células de músculo liso 3 e 7 dias após a cirurgia nos grupos tratados, no entanto,
quando os animais submetidos a angioplastia foram sacrificados com 28 dias a camada
neointima dos animais tratado com HBPM não apresentava diferença em relação ao
grupo controle, sugerindo um efeito limitado da HBPM em relação a inibição da
reestenose do vaso.
Takamori et al. [205], relacionou a incidência de reestenose após a colocação de
stents, com os níveis de HCII. Para o estudo 134 pacientes foram divididos, em três
grupos, classificados em níveis altos, normal e baixo de HCII circulante, após 6 meses
foi medido a estenose do vaso, e o grupo classificado com um nível alto de HCII
apresentou a menor taxa de estenose em relação ao grupo normal e ao grupo com baixos
níveis de HCII. O grupo sugere que maiores níveis de HCII se ligam ao DS encontrado
no tecido vascular, formando o complexo HCII/DS, que inativa a trombina e também é
eficiente em inativar a migração de células de músculo liso.
Resultados similares aos estudos anteriores foram encontrados em nosso
trabalho, a HNF e o DS foram capazes de inibir a proliferação da camada neoitima, já os
grupos tratados com HBPM não apresentaram diferença estatística.
Analisamos a atividade gelatinolítica 21 dias após lesão arterial, e neste período
não houve alteração no perfil das gelatinases em nenhum dos tratamentos em relação ao
grupo controle.
94
Em um estudo de cicatrização de feridas em ratos, foi observada a atividade da
MMP-9 ao longo do tempo, e com 24 dias não foi mais observado a atividade desta
MMP no local da lesão [206]. Este dado corrobora com os nosso já que observamos
atividade de MMPs com 3 dias após lesão arterial, mas com 21 dias a lesão a atividade
foi igual ao grupo não lesionado.
95
XI. RESUMO DOS RESULTADOS
Resumos dos resultados in vitro
As CML foram isoladas da artéria aorta de camundongos C57bl6 e
caracterizadas.
Todos os GAGs estudados, inibiram a proliferação das CML isoladas, 24 após
os tratamentos nas concentrações de 25 e 50 µg/ml
Os GAGs, não foram capazes de alteração a migração de CLM
As CML, apresentaram atividade de MMP-2 ativa, porém os tratamentos não
alteração o perfil desta expressão.
Resumos dos resultados in vivo
A HNF, HBPM e o DS foram capazes de atuar inibindo a formação do trombo,
induzido por lesão mecânica em camundongos três dias após a lesão arterial. Os
animais tratados com heparina apresentaram uma maior diminuição na área do
trombo.
O TTPa e o TP, não apresentaram diferença entre os grupos, três dias após a
lesão (24 horas após a última dose de tratamento).
Os três GAGs estudados foram capazes de diminuir a presença de células LY6g
no trombo, a HNF e o DS também diminuíram a presença de células CD11b
positivas e apenas o DS inibiu a expressão da molécula de ICAM-1 no endotélio
inflamado. O DS obteve o melhor resultado em relação a inflamação no local da
lesão.
Em relação as células CD34 positivas, nenhum dos GAGs foi capaz de aumentar
a mobilização de células para o local lesionado.
A HNF e o DS diminuíram a atividade da MMP-2 ativa, mas nenhum dos
tratamentos foi capaz de alterar o perfil da MMP-9, 3 dias após a lesão arterial.
A HNF e o DS foram capazes de inibir a formação da camada neointima, 21 dias
após a lesão arterial. Sendo que a HNF apresentou o melhor resultado.
Os tratamentos com os GAGs não foram capazes de aumentar a reendotelização
nos vasos lesionados.
A atividade gelatinolítica não foi alterada em nenhum dos tratamentos 21 dias
após o vaso ser lesionado.
96
XII. ESQUEMA DOS RESULTADOS OBTIDOS IN VIVO
Figura 43: Formação do trombo após lesão arterial.
Figura 44: Formação do trombo e os efeitos da Heparina
97
Figura 45: Formação do trombo e a atuação da HBPM
Figura 46: Formação do trombo e a atuação do DS
98
XIII. CONCLUSÃO
Neste trabalho comparamos os efeitos de diferentes GAGs: HNF, HBPM e DS,
em CML isoladas da artéria aorta de camundongos (in vitro), e utilizamos um modelo
de lesão arterial mecânico capaz de simular os processos fisiológicos envolvidos na
colocação de stents coronarianos, sendo eles a formação de trombo pós stent e a
formação da camada neoítima (In vitro).
A HNF e HBPM são anticoagulantes muito utilizados na clínica médica no
tratamento e prevenção de doenças trombóticas, já o DS também tem atividade
anticoagulante descrita porém ainda não é utilizado na clínica médica.
Em nosso trabalho, o DS mostrou ser capaz de inibir a formação de trombos,
inflamação e formação da camada neointima, tendo resultados semelhantes ou até mais
significativos que a HBPM. Sendo assim nosso grupo acredita que ele possa ter
potencial para ser utilizados em tratamentos humanos como um tratamento alternativo,
tendo em vista as limitações da HNF e HBPM.
In vitro, nossos resultados mostraram que os GAGs utilizados podem, diminuir a
proliferação das CML, podendo resultar em uma diluição da camada neointima e
redução da reestenose do vaso.
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114
XIV. ANEXOS
1. Comitê de ética
115
2. Carta de mudança do projeto
116
3. Certificado de mudança de nome de projeto
117
4. Declaração
118
5. Declaração
119
6. Estágio PDSE
Diferenciação de IPSC de pacientes saudáveis e pacientes diabéticos em ECFC
O objetivo da realização do PDSE, foi aprender novas técnicas de cultura,
diferenciação e caracterização celular, considerando que alguns trabalhos do laboratório
utilizam as EPC (antiga nomenclatura para ECFC) no reparo vascular após indução da
trombose.
As ECFCs (células endoteliais formadoras de colônias), são células encontradas
no cordão umbilical ou no sangue periférico[207]. São altamente proliferativas e tem a
capacidade de formar novos vasos in vivo e in vitro. Estudos mostram que elas migram
para locais de lesão endotelial participando da reendotelização, melhoram o fluxo
sanguíneo após infarto do miocárdio, isquemias e derrames [208].
Apesar de serem encontrados no sangue periférico, elas estão em uma população
muito pequena, e fatores como idade, doenças coronárias e diabetes este número é ainda
menor[207] .
As IPSC são células tronco pluripotentes induzidas, capazes de se diferenciar em
varias tipo celulares e participar do reparo dos tecidos [209].
Com isso nosso objetivo foi diferenciar células IPSC de pacientes saudáveis e
diabéticos, e verificar in vitro sua capacidade de formar vasos.
Metodologia
Diferenciação de IPSC em ECFC
As IPSC de pacientes saudáveis e diabéticos, foram cultivadas em meio mTeSR,
após a formação de pequenas colônias se iniciava o processo de diferenciação celular.
Na diferenciação as células eram cultivadas em meio Stemline II, acrescido dos fatores
de crescimento Activin A, VEGF, FGF e BMP4. Esses meio era trocado um dia sim
outro não, e cresciam por 12 dias[210].
No dia 12, elas eram marcadas com os anticorpos CD31, CD144 e NRP-1 elas
eram passada na citometria de fluxo (cell sorting) para separação das células
marcadas[210].
120
Cultivo das ECFC
Após o sorting essas células eram semeadas em colágeno tipo II, e cultivadas em
meio 50% Stemline II e 50% EGM-2 nas primeiras 48h, após este meio era trocado por
meio 25% Stemine II e 75% EGM-2 e após 48h com esse meio, o trocava-se o meio
para 100% EGM-2, permanecendo neste até atingirem a confluência, quando eram
tripsinizadas e expandidas [210].
Caracterização por citometria
Após a segunda passagem as células eram caracterizadas por citometria de fluxo,
com os principais marcadores para ECFC. Foram utilizados os anticorpos CD31,
CD144, NRP-1, CD 146 e o KDR [211] .
Ensaio de formação de tubos
Após serem caracterizados eram feitos os ensaio de formação de tubo em
matrigel. Onde 100k de células eram colocadas em placas de 48 well com matrigel
previamente preparado. As células eram cultivadas de 6 a 8 horas em estufa de CO2,
após eram tiradas fotos em contraste de fase.
Resultados
Caracterização celular
As células IPSC de pacientes saudáveis e de pacientes diabéticos, foram capazes
de se diferenciar em ECFC e apresentaram os principais marcadores para esta linhagem,
como o CD31, CD144, NRP-1, CD146 e KDR. Não foi encontrado diferenças entre
estes marcadores para as células de origem de pacientes saudáveis ou diabéticos.
121
Figura 47: Análise com citometria de fluxo dos principais marcadores para ECFC. Não
foi encontrada diferença significativa na expressão dos marcadores para ECFC
derivadas de pacientes saudáveis e de pacientes diabéticos (ANOVA)
Formação de tubos
As células de pacientes saudáveis e pacientes diabéticos, formaram estruturas
semelhante a vasos quando cultivadas em matrigel, e não foi observado diferença na
formação destes tubos, quanto ao comprimento dos tubos quando comparados os
controles dos diabéticos.
Figura 48: Fotografias em microscópio contraste de fase do ensaio in vitro da formação
de estruturas semelhantes a vasos, de ECFC derivadas de pacientes saudáveis (A) e de
pacientes diabéticos (B) Aumento 20x. (C) Gráfico do comprimento dos tubos, não foi
observado diferença significava. (Anova)
122
Figura 49: Fotografias em microscópio contraste de fase do ensaio in vitro da formação
de estruturas semelhantes a vasos, de ECFC derivadas de pacientes saudáveis (A) e de
pacientes diabéticos (B) Aumento 20x. (C) Gráfico do comprimento dos tubos, não foi
observado diferença significava. (Anova).
Conclusão
As células de pacientes saudáveis e de paciente diabéticos foram capazes de se
diferenciar em ECFC e foram funcionais em estudo in vitro, a diferenciação de IPSC em
ECFC pode ser uma boa estratégia para terapia celular autólogas, células de origem de
pacientes saudáveis ou de pacientes com patologias são capazes de diferenciar da
mesma forma.
Com este estágio foi alcançado o objetivo de aprender novas técnicas com
cultura celular, as quais podem ser implementadas no laboratório. Além das técnicas
aprendidas, a experiência trouxe muito conhecimento pessoal, novos amigos e o
aprendizado com uma nova cultura, recomendo para todos que tiverem a oportunidade.