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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-PPGCB
GRADIENTE SUCESSIONAL, SAZONALIDADE, E FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE
RIZOBACTÉRIAS DO SOLO EM UMA FLORESTA ESTACIONAL DECIDUAL
Cláudia Maria da Silva
Montes Claros - MG Agosto/2013
Cláudia Maria da Silva
GRADIENTE SUCESSIONAL, SAZONALIDADE, E FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE
RIZOBACTÉRIAS DO SOLO EM UMA FLORESTA ESTACIONAL DECIDUAL
Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério
Montes Claros - MG Agosto/2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros como requisito necessário para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.
S586g
Silva, Cláudia Maria da. Gradiente sucessional, sazonalidade, e fatores edáficos na composição e caracterização morfológica e bioquímica de rizobactérias do solo em uma floresta estacional decidual [manuscrito] / Cláudia Maria da Silva. – 2013. 58 f. : il. Bibliografia: 44-53. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Montes Claros - Unimontes, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas/PPGCB, 2013. Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério. 1. Floresta tropical seca. 2. Rizobactéria. 3. Sazonalidade. 4. Gradiente sucessional. 5. Promoção de crescimento vegetal. I. Valério, Henrique Maia. II. Universidade Estadual de Montes Claros. III. Título.
Catalogação Biblioteca Central Professor Antônio Jorge
Cláudia Maria da Silva Gradiente sucessional, sazonalidade, e fatores edáficos na composição e caracterização morfológica e bioquímica de rizobactérias do solo em uma floresta estacional decidual
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências
Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros, como requisito necessário para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas, avaliada e aprovada pela banca
examinadora:
Orientador: _____________________________________________________________
Prof. Dr. Henrique Maia Valério- Orientador- Unimontes
______________________________________________________________________
Prof. Dr. Magno Augusto Zaza Borges- Unimontes
______________________________________________________________________
Prof. Dr. Luc Felicianus Marie Rouws- Embrapa Agrobiologia
Data de aprovação: ___/___/2013
Montes Claros - Minas Gerais
AGRADECIMENTOS
À Deus por estar sempre no controle da minha vida e tornar tudo possível.
À toda a minha família, em especial aos meus queridos pais, meus melhores
amigos, por me proporcionarem um grande tesouro: o estudo. À minha irmã, Djenane,
meus irmãos Daniel e Marcelo, e a minha avó Alzira, por terem me incentivado e por
estarem sempre torcendo por minha vitória. E aos meus sobrinhos por me
proporcionarem tanta alegria.
Ao meu amor, Cleiton, por sua dedicação, paciência e por ter me acompanhado e
me ajudado durante a coleta e em muitos outros momentos da realização deste trabalho.
A todos os estagiários do Laboratório de Microbiologia Ambiental, em especial
a Fran e Jéssica pela amizade, disposição e ajuda durante o experimento, e à Luiz pelo
apoio sempre que precisamos.
Aos colegas de Mestrado em especial a Polly, Fá, Comis, Betys, Mi, Nanda,
Carols, Alex, Paulinho e Ani por ter compartilhado vários momentos e por me
privilegiar com suas amizades. À Fá e Comis, agradeço, também, pelo auxílio nas
análises estatísticas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas e a todos os professores
que contribuíram para minha formação profissional.
À CAPES pela concessão de bolsa, ao projeto SISBIOTA pelo apoio financeiro
e ao IEF pelo apoio nas coletas.
Ao pessoal da Embrapa Agrobiologia, em especial ao Prof. Dr. Luc Felicianus
Marie Rouws, pelo apoio.
Ao meu orientador Prof. Dr. Henrique Maia Valério por ter me recebido em seu
laboratório, pelo apoio e orientação.
À equipe do laboratório de Métodos Analíticos (em especial à Prof. Dr. Elytânia,
Cleide e Leide) por ter permitido a utilização dos equipamentos.
Ao pessoal do laboratório de Fitopatologia (Departamento de Ciências Agrárias)
da Unimontes-Campus Janaúba, em especial a Leandro (Pardal), Leandro, Acleide,
Gleika, pelo apoio e a Prof. Dr. Regina e Prof. Dr. Adelica por permitirem que eu
acompanhasse a rotina do laboratório.
Aos membros da banca por aceitaram o convite.
E a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para este trabalho tornar-se
realidade, o meu MUITO OBRIGADA!
“Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte não temerei mal nenhum, porque Tu estás comigo (...).”
(Salmo 23.4)
SILVA, Cláudia Maria, Mcs., Universidade Estadual de Montes Claros, Agosto de 2013, Gradiente sucessional, sazonalidade, e fatores edáficos na composição e caracterização morfológica e bioquímica de rizobactérias do solo em uma floresta estacional decidual. Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério.
RESUMO
As Florestas Tropicais Secas são biomas dominados por espécies vegetais
decíduas, com ampla distribuição no continente Sul Americano. Nelas, a variação
sazonal, os estágios sucessionais, além dos fatores físico-químicos do solo influenciam
fortemente sua estrutura e função e, com isso, a diversidade microbiana do solo pode ser
alterada. Neste contexto, as Rizobactérias Promotoras de Crescimento em Plantas são
interessantes alvos de estudo. O objetivo deste trabalho foi testar as seguintes hipóteses:
riqueza, abundância e atividade bioquímica bacteriana são influenciadas pela estação; e
riqueza, abundância e atividade bioquímica bacteriana são influenciadas pelos estágios
sucessionais de regeneração. Para verificar esses efeitos, bactérias isoladas do solo
foram caracterizadas morfologicamente e bioquimicamente. A produção de ácido indol-
3-acético, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio foram avaliadas.
As variáveis riqueza e abundância responderam à primeira hipótese testada, visto que
foram maiores no período chuvoso. A riqueza e abundância não variaram ao longo do
gradiente sucessional. A variável ácido indol-3-acético, a solubilização de fosfato e
Fixação Biológica de Nitrogênio não corresponderam às hipóteses testadas. A
morfologia, coloração de Gram e o teste de catalase mostraram que os isolados possuem
características morfológicas e fenotípicas muito próximas. Esses devem ser submetidos
a técnicas moleculares para serem identificados filogenéticamente. As características da
cobertura vegetal, através dos dados de fitossociologia, não influenciaram a distribuição
das morfoespécies, porém os fatores edáficos foram importantes.
Palavras-chave: Floresta Tropical Seca; rizobactéria; sazonalidade; gradiente
sucessional; promoção de crescimento vegetal.
SILVA, Cláudia Maria, Mcs., Universidade Estadual de Montes Claros, Agosto de 2013, Successional gradient, seasonality, and edaphics factors in the composition and morphological and biochemical characterization of rhizobacteria of soil in a Tropical Dry Forest. Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério.
ABSTRACT
The Tropical Dry Forests are biomes dominated by deciduous plant species,
widely distributed in the South American continent. In them, the seasonal, the
successional stages, beyond the soil physical-chemicals properties influence their
structure and function and, therefore, the microbial diversity of the soil can be changed.
In this context, the Growth Promoting Rhizobacteria in Plants are interesting targets of
study. The aim of this study was to test the following hypotheses: richness, abundance
and bacterial biochemical activity are influenced by the station; and richness, abundance
and bacterial biochemical activity are influenced by successional stages of regeneration.
For this, bacteria isolated from soil were characterized morphologically and
biochemically. The production of indole-3-acetic acid, phosphate solubilization and
Biological Fixation of Nitrogen has been verified. The Variables richness and
abundance responded the first hypothesis tested, since were higher during the rainy
season. The richness and abundance did not vary along of the successional gradient. The
variable indole-3-acetic acid, the phosphate solubilization and Biological Fixation of
Nitrogen did not correspond to the hypotheses tested. The morphology, Gram and
catalase show that the strains have characteristics very similar. These isolates must be
submitted to molecular techniques to be identified phylogenetically. The characteristics
of the vegetation, through of the data of phytosociology, did not influence the
distribution of morphospecies. But the edaphic factors were important.
Key words: Tropical Dry Forest; rhizobacteria; seasonality; successional gradient; plant
growth promotion.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 11
2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 17
2.1 Áreas de estudo ................................................................................................................. 17
2.2 Desenho amostral .............................................................................................................. 18
2.3 Amostragem dos isolados de rizobactérias e caracterização morfológica e bioquímica . 19
2.3.1 Coloração de Gram .................................................................................................... 20
2.3.2 Teste de catalase ........................................................................................................ 20
2.4 Suspensões bacterianas ..................................................................................................... 20
2.5 Produção de Ácido indol-3-acético (AIA) ......................................................................... 21
2.6 Solubilização de fosfato .................................................................................................... 22
2.7 Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) ........................................................................... 23
2.8 Atributos dos solos e aspectos da cobertura vegetal avaliados ........................................ 23
2.9 Análises dos dados ............................................................................................................ 24
3 RESULTADOS ........................................................................................................... 26
3.1 Efeito da estação e do estágio sucessional na riqueza e abundância de rizobactérias .... 26
3.2 Efeito da estação e do estágio sucessional na atividade bioquímica de rizobactérias ..... 34
3.2.1 Produção de AIA por rizobactérias............................................................................ 34
3.2.2 Solubilização de fosfato por rizobactérias ................................................................. 37
3.2.3 Fixação Biológica de Nitrogênio por rizobactérias ................................................... 38
4 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 40
4.1 Efeito da estação e do estágio sucessional na riqueza e abundância de rizobactérias .... 40
4.2 Efeito da estação e do estágio sucessional na atividade bioquímica de rizobactérias ..... 42
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 46
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 47
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 48
APÊNDICE .................................................................................................................... 58
ANEXOS ........................................................................................................................ 59
11
1 INTRODUÇÃO
As Rizobactérias Promotoras de Crescimento de Plantas (RPCP’s) são capazes de
colonizar as raízes, estimulando-as diretamente ou beneficiando o crescimento e o
desenvolvimento de plantas (Vessey, 2003). Essas bactérias, em geral, podem ser
classificadas em RPCPs extracelulares (eRPCP), quando presentes na rizosfera, no rizoplano
ou nos espaços entre as células do córtex da raiz, e em RPCP’s intracelulares (iRPCP),
quando presentes no interior de células de raízes, geralmente em estruturas nodulares
especializadas (Gray & Smith, 2005). Dentre os grupos estudados, as principais RPCP’s são
encontradas entre as Pseudomonas spp. não fluorescentes e fluorescentes; espécies de
Bacillus, Streptomyces, Rhizobium, Bradyrhizobium, Acetobacter e Herbaspirillum;
Agrobacterium radiobacter, Enterobacter cloacae e Burkholderia cepacia (Mariano et al.,
2004).
Em relação aos aspectos bioquímicos, a busca pelas rizobactérias e a investigação de
seus mecanismos de ação visam a exploração comercial como biofertilizantes, para aumentar
o crescimento de plantas (Vessey, 2003), o controle de pragas (Felton & Korth, 2000) e,
ainda, a recuperação de áreas degradadas (Lammel et al., 2013). No crescimento de plantas,
estudos mostram que tais mecanismos, frequentemente, estão envolvidos na produção de
fitormônios (como as auxinas, giberelinas e citocininas) (Da Silveira, 2008; Spaepen et al.,
2009), na solubilização de fosfato (Souchie et al., 2005), bem como na Fixação Biológica de
Nitrogênio (FBN) (Baldani & Baldani, 2005). Além disso, trabalhos relatam que essas
bactérias contribuem indiretamente para o desenvolvimento das plantas com a produção de
antibióticos (Gray & Smith, 2005; Glick, 1995; Moreira et al., 2010). Esses compostos inibem
o crescimento de diversos microrganismos fitopatogênicos, promovendo, portanto, um
eficiente controle biológico na natureza (Silva et al., 2004; Moreira et al., 2010; Ribeiro &
Cardoso, 2011). Por outro lado, os mecanismos de antagonismo direto relacionados ao
12
controle biológico de fitopatógenos, normalmente envolvem a produção de enzimas líticas
como quitinases (Kavino et al., 2010) e a produção de antibióticos difusíveis. O seqüestro de
ferro por sideróforos está associado tanto à promoção de crescimento quanto ao controle
biológico (Ahmad et al., 2008). Por isso, trabalhos vêm sendo realizados com a utilização de
rizobactérias com o objetivo de estudar sua ação contra fitopatógenos (Silva et al., 2004;
Moreira et al., 2010; Ribeiro & Cardoso, 2011).
Entre as auxinas, o ácido indol-3-acético (AIA) é o fitormônio mais estudado e o mais
produzido pelas bactérias, sendo requerido em baixas concentrações. Ele é conhecido por sua
capacidade de auxiliar no desenvolvimento da raiz, divisão celular e multiplicação celular.
Isso leva ao aumento do comprimento e do número de pêlos radiculares e da parte aérea
vegetal, aumentando, assim, a captação de nutrientes pelas plantas (Da Silveira, 2008). O AIA
é comumente produzido por várias RPCPs como, por exemplo, Aeromonas veronas,
Agrobacterium sp., Azospirillum brasilense, Bradyrhizobium sp., Rhizobium sp. e
Enterobacter sp. (Vessey, 2003). A produção por estas bactérias é, em muitos casos,
dependente do aminoácido triptofano e realizada sob diversas vias biossintéticas (Figura 1). A
biossíntese do AIA triptofano-dependente pode ser realizada por meio das vias: ácido indol-3-
pirúvico (AIP); indol-3-acetamida (IAM); triptamina (TAM); e indol-3-acetaldoxima (IAOx)
(Solano et al., 2008).
13
(Solano et al., 2008).
Figura 1. Rotas biossintéticas do ácido indol-3-acético (AIA) a partir do aminoácido triptofano em bactérias e
plantas. As enzimas em asterisco estão presentes somente em bactérias (Solano et al., 2008).
Além da produção de AIA pelas RPCPs a solubilização de fosfato é outro benefício
oferecido. Esse processo é de grande relevância para as plantas, visto que o fósforo exerce
papel importante no metabolismo vegetal, participando da fotossíntese, respiração,
armazenamento e transferência de energia, transferência de genes e reprodução (Stauffer &
Sulewski, 2004). Solos intemperizados com marcada limitação de fósforo são predominantes
nas regiões tropicais. Os solos agrícolas, de modo geral, apresentam teores totais de fósforo
variando de 200 a 3.000 mg.dm-3, porém, menos de 0,1 % encontram-se disponíveis às
plantas (Nahas, 1999). Assim, apesar da ampla distribuição de fósforo na natureza, a sua
IAIddesidrogenase
N
COOH
Ácido indol-3-acético (AIA)
H
AIPdescarboxilase
N O
Indol-3-acetaldeído(IAId)
H
NH
Triptofano(Trp)
Rota do ácido indol 3-pirúvico
NH 2
COOH
H
Ácido indol-3-pirúvico(AIP)
Trptransaminase
N
COOH
O
NH
O
Indol-3-acetamida (IAM)
NH2
Rota bacteriana
NH
Triptamina (TAM)
NH2
TAMNH
Indol-3-acetaldoxima
IAN
NOH
NH
Indol-3-acetonitrila (IAN)
N
* Trp
monoxigenase
* IAMhidrolase
Nitrilase
Aminaoxidase
Trpdescarboxilase
(A)
(B)
(C)
(D)
14
deficiência é comum por causa da forma altamente insolúvel encontrada, principalmente, em
solos ácidos de regiões tropicais e subtropicais (Souchie et al., 2005).
Dentre os processos mediados por microrganismos do solo na ciclagem de nutrientes a
Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) é realizada por microrganismos diazotróficos. Estes
podem ser de vida livre, estarem associados a espécies vegetais ou, ainda, estabelecerem
simbiose com leguminosas (Moreira e Siqueira, 2006). Sob condições de limitação de
nitrogênio mineral, os rizóbios induzem a formação de nódulos simbióticos nas raízes de
leguminosas. Nesses nódulos, a bactéria, na forma de bacteróide, converte nitrogênio
atmosférico em amônia, através da nitrogenase, que é utilizada pela planta como fonte de
nitrogênio. A amônia é, posteriormente, transformada em elementos essenciais para a planta,
como as proteínas (Neves, 1981; Neves e Rumijanek, 1998). A habilidade dos rizóbios para
fixar nitrogênio em simbiose com leguminosas é de considerável importância agrícola e
ambiental, visto que as leguminosas têm, a seu dispor, duas fontes de nitrogênio: o mineral,
proveniente do solo e/ou fertilizante e o nitrogênio gasoso, fixado biologicamente (Silveira &
Freitas, 2007). Assim, os estudos com bactérias diazotróficas são importantes, devido à
contribuição destas para o fornecimento de nitrogênio a diversos ecossistemas naturais ou
manejados (Moreira e Siqueira, 2006).
Com a expansão demográfica, a necessidade do uso de recursos do planeta está sendo
maximizada representando grande desafio para a ciência (Grapow & Blasi, 1998). As
Florestas Tropicais Secas (FTS’s), em particular, têm sido as preferidas para atividades
agrícolas e assentamentos em diversas regiões como, por exemplo, na América do Sul. No
entanto, a ocupação humana, o uso da terra, as taxas de desmatamento e o estado real de
conservação dos fragmentos restantes dessas florestas são pouco conhecidos (Espírito-Santo
et al., 2009). No Brasil, as Florestas Tropicais Secas (FTS’s) estendem-se por 27.367.815l
ha, o que representa 3,21% do território do país (Sevilha et al., 2004) e são, normalmente,
15
utilizadas para atividades agrícolas e assentamentos em diversas regiões (Espírito-Santo et al.,
2009). Nelas, a variação sazonal, os estágios sucessionais, além dos fatores físico-químicos do
solo influenciam fortemente sua estrutura e função e, com isso, a diversidade microbiana do
solo pode ser alterada. Essas florestas são caracterizadas por uma estação seca acentuada (3-6
meses) e chuvas concentradas durante a estação chuvosa (Murphy & Lugo, 1986). Suas
paisagens são muitas vezes um mosaico de uma gama de fases de sucessão remanescentes
(Madeira et al., 2009), devido ao restabelecimento de formações florestais secundárias
naturais resultantes da ocupação humana, seguida por abandono (Quesada et al., 2009).
Percepções sobre a distribuição de espécies são muito antigas e muitas teorias foram
formuladas a fim de explicar essa distribuição. A teoria da sucessão ecológica (Clements,
1916; Gleason, 1927) é uma das teorias na ecologia de comunidades, que contribuíram
consideravelmente para a compreensão espaço-temporal dos padrões de diversidade biológica
(Magurran, 2004). Assim, considera-se que ao longo do estágio sucessional, a diversidade,
inicialmente, é baixa, aumenta no estágio intermediário e em geral declina novamente no
clímax. Essa sucessão envolve um processo de substituição e não apenas a mera adição de
novas espécies (Towne, 2000).
Visto que a estação e o estágio sucessional são fatores que podem influenciar a
diversidade, um esforço integrado de pesquisa e prospecção tecnológica da biodiversidade de
microrganismos de solos é fundamental em FTS’s. Esse conhecimento pode ser utilizado para
a otimização do melhor período e local de coleta e indicação dos microrganismos para o uso
na recuperação de áreas degradadas. E, a escassez de dados sobre esse assunto torna essas
áreas ainda mais interessantes para serem estudadas, visto que dos estudos realizados em
florestas tropicais apenas 14% foram em ambientes secos, enquanto 86% foram em regiões
úmidas (Sánchez-Azofeifa et al. 2005). Além disso, para a agricultura, em particular, o ganho
de melhor entendimento sobre os benefícios da vida dos microrganismos no solo é muito
16
promissor (Kennedy et al., 2004), possibilitando seu uso em substituição aos fertilizantes
convencionais e como indicador da qualidade do solo (Zilli et al., 2003; Philippot et al.,
2013).
Alguns estudos já foram realizados em FTSs no Parque da Mata Seca no Norte de
Minas Gerais para avaliar como varia nesses ambientes a diversidade de Coleoptera (Neves et
al., 2010, Oliveira et al., 2011) em função da estação e, ainda, para avaliar a influência dos
estágios sucessionais na diversidade de herbívoros (Silva et al., 2011), Coleoptera (Neves et
al., 2010) e na composição e estrutura florística (Coelho et al., 2012). Entretanto, ainda não
foi registrado nenhum estudo avaliando a diversidade de microrganismos em função desses
fatores ecológicos e biológicos nas FTSs do Norte de Minas Gerais.
Assim, o objetivo deste trabalho foi testar as seguintes hipóteses:
i) Riqueza, abundância e atividade bioquímica bacteriana são influenciadas pela
estação. Com a predição de que riqueza, abundância, produção de AIA, solubilização de
fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio de rizobactérias sejam menores no período seco,
devido às flutuações na disponibilidade de água que resultam em baixa sobrevivência dos
microrganismos do solo.
ii) Riqueza, abundância e atividade bioquímica bacteriana são influenciadas pelos
estágios sucessionais de regeneração. Com a predição de que riqueza, abundância, produção
de AIA, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio de rizobactérias sejam
maiores nos estágios intermediários de sucessão, devido à maior riqueza de espécies de
plantas existente nesses locais, em especial as leguminosas.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Áreas de estudo
O estudo foi realizado em três unidades de conservação (UCs) no Norte de Minas Gerais:
na Reserva Biológica do Jaíba (criada em 1976, com 6.358 ha), no Parque Estadual Lagoa do
Cajueiro (1998; 20.500 ha) e na Reserva Biológica Serra Azul (1998; 7.200 ha), lo
municípios de Matias Cardoso e Jaíba, no Vale do Médio Rio São Francisco
anexo). Segundo a classificação de Koppen, o clima predominante na região é o Aw,
caracterizado pela existência de uma estação seca bem acentuada no
temperatura média anual é de 24,4°C e a precipitação média anual é de 871 mm (Antunes 1994),
fortemente concentrada na estação chuvosa (Outubro a Março)
Figura 3. Precipitação ( ) e temperatura média (
Tropicais Secas no Norte de Minas Gerais
A vegetação predominante nas UCs é
dominados por árvores decíduas
seca, crescendo em solos pre
As três UCs estudadas foram criadas a partir da expropriação de fazendas cuja principal
atividade econômica era a criação extensiva de gado em pastagens plantadas com gramíneas
MATERIAL E MÉTODOS
estudo foi realizado em três unidades de conservação (UCs) no Norte de Minas Gerais:
na Reserva Biológica do Jaíba (criada em 1976, com 6.358 ha), no Parque Estadual Lagoa do
Cajueiro (1998; 20.500 ha) e na Reserva Biológica Serra Azul (1998; 7.200 ha), lo
municípios de Matias Cardoso e Jaíba, no Vale do Médio Rio São Francisco
Segundo a classificação de Koppen, o clima predominante na região é o Aw,
caracterizado pela existência de uma estação seca bem acentuada no inverno (Peel
temperatura média anual é de 24,4°C e a precipitação média anual é de 871 mm (Antunes 1994),
fortemente concentrada na estação chuvosa (Outubro a Março) (Figura 3).
) e temperatura média ( ) mensais nas unidades de conservação de Florestas
Tropicais Secas no Norte de Minas Gerais (Médias históricas de dados obtidos da estação de Mocambinho
A vegetação predominante nas UCs é a Floresta Tropical Seca (FTS) que
por árvores decíduas, que perdem de 90 a 95% das suas folhas durante a estação
crescendo em solos predominantemente férteis e planos (Pezzinni et al
As três UCs estudadas foram criadas a partir da expropriação de fazendas cuja principal
a criação extensiva de gado em pastagens plantadas com gramíneas
17
estudo foi realizado em três unidades de conservação (UCs) no Norte de Minas Gerais:
na Reserva Biológica do Jaíba (criada em 1976, com 6.358 ha), no Parque Estadual Lagoa do
Cajueiro (1998; 20.500 ha) e na Reserva Biológica Serra Azul (1998; 7.200 ha), localizados nos
municípios de Matias Cardoso e Jaíba, no Vale do Médio Rio São Francisco (Figura 2, ver
Segundo a classificação de Koppen, o clima predominante na região é o Aw,
inverno (Peel, 2007). A
temperatura média anual é de 24,4°C e a precipitação média anual é de 871 mm (Antunes 1994),
unidades de conservação de Florestas
obtidos da estação de Mocambinho).
a Floresta Tropical Seca (FTS) que são biomas
95% das suas folhas durante a estação
et al., 2008).
As três UCs estudadas foram criadas a partir da expropriação de fazendas cuja principal
a criação extensiva de gado em pastagens plantadas com gramíneas
18
exóticas. O sistema de manejo dessas fazendas foi similar, com utilização periódica do fogo para
rebrota. Parte das FTS´s originais foram mantidas por exigência legal (20%, Código Florestal
Brasileiro), mas eram usadas para corte seletivo de madeira para construção de cercas e para
criação de gado. As antigas pastagens estão se regenerando desde a criação das UCs e algumas
áreas sofreram queimadas desde então. Assim, as UCs são constituídas por um mosaico de FTSs
em diferentes estágios sucessionais, cujo porte varia também em função de variações locais na
qualidade do solo e do relevo.
Os estágios sucessionais utilizados no presente estudo foram definidos a partir da estrutura
vertical (altura e número de estratos) e horizontal (densidade e área basal) dos fragmentos
florestais. Com base nisso, foram diferenciados três estágios principais de regeneração: inicial,
intermediário e tardio. Quando possível, a idade de cada fragmento foi determinada a partir de
entrevistas com antigos moradores e gerentes das fazendas a partir das quais as UC’s foram
criadas. O estágio inicial apresenta como principal componente o herbáceo-arbustivo, com
manchas esparsas de vegetação lenhosa de porte mais alto, formando um dossel descontínuo. No
estágio intermediário existem dois estratos verticais, sendo o primeiro composto de árvores
decíduas de crescimento rápido, que formam um dossel relativamente fechado. O segundo estrato
é composto por lianas, árvores adultas pertencentes a espécies tolerantes à sombra e árvores
juvenis. O estágio tardio apresenta três estratos verticais, sendo o primeiro constituído por árvores
de grande porte que formam um dossel bastante fechado. O segundo estrato é formado por árvores
juvenis de diferentes idades e tamanhos e o terceiro estrato é composto por espécies herbáceas e
arbustivas típicas de sub-bosque.
2.2 Desenho amostral As coletas foram realizadas na estação úmida (outubro/2011) e na estação seca
(Julho/2012), nos três estágios sucessionais (Inicial, Intermediário e Tardio) de cada UC. Uma
parcela de 30x60 m foi delimitada para cada estágio. No interior das parcelas foi feita uma
sub-parcela de 20x50 m, onde as amostragens de solo foram realizadas na profundidade de 0-
19
10 e de 10-20 cm. As amostras foram coletadas em triplicata (3 m de distância uma da outra),
as quais constituíram amostras compostas por parcela, que foram analisadas. Todas as
amostras de solo foram acondicionadas em sacos plásticos transparentes, devidamente
identificadas com etiquetas e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia Ambiental da
Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTES), no município de Montes Claros.
2.3 Amostragem dos isolados de rizobactérias e caracterização morfológica e bioquímica
Para a obtenção dos isolados da rizosfera foi utilizada a metodologia proposta por
Döbereiner et al. (1995). Assim, foram pesadas 10 g do solo pertencentes à amostra composta
de cada estágio. Em fluxo laminar, 90 mL de solução salina 0,85 % estéril foram adicionados
às 10 g de solo para se obter uma suspensão com substrato rizosférico. Dessa suspensão, 1 mL
foi adicionado a 9 mL da solução salina, suplementada com 200 µL de solução antifúngica
cicloheximida (1 mg/mL). Após a adição do antifúngico, a suspensão permaneceu em repouso
por 15 minutos. Logo após, as diluições seriadas foram realizadas até 10-5, sendo que foram
selecionadas para inóculo as diluições de 10-2, 10-3 e 10-4. Em placas de Petri, contendo meio
de cultura Standard Methods Agar (Agar Padrão de Contagem-APC), foram inoculadas 100
µL das diluições em triplicata. Após 24 horas de crescimento em estufa a 35 °C a leitura das
colônias foi realizada e foram agrupadas em morfoespécie. Para isso, observaram-se os
aspectos macromorfológicos das colônias, como a cor, tamanho, forma, crescimento,
opacidade, superfície, borda, elevação e produção de muco. Cada colônia, representante de
uma morfoespécie foi transferida para meio de cultura (APC) em placas para isolamento.
Estes isolados foram levados para estufa à 35 ºC por 24 horas. Após o crescimento, foi
retirada uma alçada de cada isolado que foram colocados em meio de cultura padrão, em
tubos de ensaio inclinado, e novamente foram levados para crescimento nas condições
anteriormente descritas. Após o crescimento no tubo de ensaio foi retirada uma alçada de cada
20
isolado que foi armazenada em microtubo com solução salina 0,85 % mantida em geladeira a
4 °C para análises posteriores.
Do total de isolados obtidos, foram selecionados, aleatoriamente, 30 isolados de cada
local de coleta, sendo 10 isolados de cada estágio sucessional, totalizando 90 amostras para a
estação úmida e 90 amostras para a estação seca. Os isolados selecionados foram observados
através da coloração de Gram em microscópio óptico e submetidos ao teste de Catalase.
2.3.1 Coloração de Gram
Esfregaços homogêneos em lâminas foram realizados e, depois de secos, foram
fixados com calor. O esfregaço foi corado por cerca de 1 minuto com solução de cristal
violeta (Laborclin, Brasil) e em seguida lavado com água corrente. Cobriu-se o esfregaço com
solução de lugol (Laborclin, Brasil) por cerca de 1 minuto e, posteriormente, lavou-o com
água corrente. O esfregaço foi descorado com solução de etanol + acetona 50% v/v e
novamente lavado com água corrente. Logo após, foi realizada a contra-coloração com
safranina por 1 minuto e lavagem final com água corrente. Após a secagem, as lâminas foram
observadas em microscópio para serem classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas.
2.3.2 Teste de catalase
Em uma lâmina foi colocada uma gota de peróxido de hidrogênio a 10% (v/v). Uma
amostra (colônia colhida com uma alça de inoculação) de bactérias com 24 horas de
crescimento foi aplicada sobre essa gota (Trabulsi & Alterthum, 2005). O aparecimento de
bolhas caracteriza o organismo como catalase-positivo. As bolhas são formadas pelo oxigênio
molecular liberado na reação.
2.4 Suspensões bacterianas
21
Os isolados foram submetidos ao ajuste da densidade ótica a 0,5 de absorbância, no
comprimento de onda de 540 nm em espectrofotômetro (DU® 640 Beckman), para
padronização da concentração de células bacterianas. Assim, a concentração obtida de cada
isolado foi de aproximadamente 1,5 x 108 UFC.ml-1, de acordo com a escala de McFarland
(NCCLS/CLSI, 2003). Para isso, foram utilizados 100 µL do isolado estoque (armazenado
anteriormente em solução salina 0,85%) que foi cultivado em 100 mL de meio Nutrient Broth
(Caldo Nutriente-CN), em erlenmeyer, por um período de 24 horas, em temperatura de 28 ºC,
sob agitação constante. Depois do período de crescimento, esses isolados foram transferidos
para tubos que foram centrifugados por 10 minutos a velocidade de 10.000 rpm a 10 °C. O
sobrenadante foi descartado e as suspensões foram preparadas adicionando-se ao precipitado a
solução salina a 0,85 % para posterior leitura no espectrofotômetro. Essa suspensão bacteriana
padronizada foi utilizada para os testes de concentração de AIA e de solubilização de fosfato e
de Fixação Biológica de Nitrogênio. A cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 foi
utilizada como controle positivo para todos os testes.
2.5 Produção de Ácido indol-3-acético (AIA) Os isolados selecionados foram submetidos à avaliação da produção de AIA de acordo
com o método colorimétrico descrito por Gordon & Weber (1951), com modificações. Da
suspensão descrita no item 2.4, foram inoculados 300 µL em tubos de vidro vedados contendo
15 mL de meio de cultura CN autoclavados. Posteriormente, foram adicionados 150 µL de
triptofano na concentração de 100 µg/mL, em fluxo laminar. Após 24h de desenvolvimento,
em estufa a 28 ºC e sob agitação constante, 2 mL da cultura foram transferidos para
microtubos que foram centrifugados por 10 min a velocidade de 10.000 rpm a 10 °C. Em
seguida, 2 mL do sobrenadante de cada amostra foram transferidos para tubos de ensaio (em
triplicata para cada isolado), sendo adicionados a estes 2 mL da solução de Salkowski
(FeCl3.6H2O 2 % + H2SO4 37 %). Esses tubos foram mantidos no escuro por 30 min.
22
(Hartmann et al., 1983) para posterior leitura em espectrofotômetro (DU® 640 Beckman), na
absorbância de 540 nm. Amostras com a coloração rosa - avermelhada revelam a presença de
AIA (Rodrigues et al., 2007). O controle negativo foi feito utilizando o meio de cultura CN.
Uma curva padrão da produção de AIA foi obtida com o hormônio sintetizado (Sigma), 98 %
de pureza, nas seguintes concentrações: 0, 1, 3, 5, 7, 10, 25, 50, 100 e 150 µg.mL-1.
2.6 Solubilização de fosfato
Para testar a capacidade de solubilização de fosfato dos isolados bacterianos, foram
inoculados, em três pontos equidistantes, 10 µL da suspensão bacteriana (item 2.4) em placas
de Petri (em triplicata, totalizando 3 placas com 3 pontos para cada isolado) com meio de
cultura LGIm (Tabela 1, ver anexo) (Nautiyal, 1999), contendo fosfato de cálcio tribásico
como fonte de fosfato. As amostras foram mantidas em estufa a 28ºC por 15 dias. Após esse
período, o diâmetro (mm) do halo em volta da colônia e o diâmetro da colônia propriamente
dita, de cada isolado, foram medidos com o auxílio de um paquímetro digital (Figura 4). Os
resultados foram expressos como índice de solubilização (IS) calculado segundo Berraqueiro
et al. (1976), onde:
IS = Diâmetro do halo / Diâmetro da colônia
Figura 4. Método utilizado para a medida do diâmetro do halo (mm) resultante da solubilização por
rizobactérias e do diâmetro das colônias (mm) de rizobactérias de uma Floresta Tropical Seca.
23
A escala de eficiência do índice de solubilização utilizada foi a de Silva Filho e Vidor
(2000). Índices inferiores a 2 caracterizam a baixa solubilização, índices entre 2 e 3 possuem
média solubilização, e índices acima de 3 possuem alta solubilização.
2.7 Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) Para avaliar a Fixação Biológica de Nitrogênio pelas bactérias, estas foram submetidas
ao crescimento em meio de cultura NFb, que não contém nitrogênio (Dobereiner et al., 1995)
(Tabela 2, ver anexo). O meio NFb foi inoculado com 300µL de suspensão bacteriana (item
2.4) em tubo de ensaio contendo 15mL do meio semi-sólido (em triplicata). As amostras
foram incubadas em temperatura de 28ºC por 7 dias. O resultado positivo é observado quando
há formação de colônia bacteriana, caracterizada por uma película em forma de véu, próximo
à superfície. Com o crescimento das bactérias o meio de cultura muda da cor verde-azulado
para azul, devido à alteração no pH.
2.8 Atributos dos solos e aspectos da cobertura vegetal avaliados
Para a análise do solo, foram coletadas cinco amostras em cada parcela (uma em cada
corner e uma no centro) a aproximadamente 20 cm de profundidade. Posteriormente, essas
amostras foram misturadas, formando uma amostra composta (aproximadamente 500g) para
cada parcela. As amostras de solo foram encaminhadas, para análise, ao Laboratório de Análise de
Solos, da Universidade Federal de Minas Gerais. Conforme procedimentos adotados pela
Embrapa (Embrapa, 1997) foram analisados o pH, Pmeh (Fósforo Mehlic), Prem (fósforo
remanescente), K, Ca, Mg, Al, H + Al, SB (soma de bases), t (capacidade de troca catiônica
efetiva), m (saturação por alumínio), T (capacidade de troca catiônica a pH 7,0), V (saturação
por bases), MO (matéria orgânica), Areia Grossa, Areia Fina, Silte e Argila.
As variáveis da cobertura vegetal analisadas foram: riqueza; altura; densidade e área
basal. Esses dados foram fornecidos pelo laboratório de Ecolologia e Propagação Vegetal da
Unimontes.
24
2.9 Análises dos dados Uma vez que os dados não apresentaram distribuição normal, para verificar se existe
correlação entre estação do ano e estágio sucessional com variações na riqueza e abundância
de rizobactérias, foram construídos modelos lineares generalizados (GLM), assumindo
distribuição de erros do tipo Poisson para o teste de riqueza e Quasipoisson para abundância
(Crawley, 2007). As variáveis explicativas foram a estação do ano e o estágio sucessional
para os modelos que consideraram como variável resposta a riqueza e a abundância de
rizobactérias.
Para testar se a composição de morfoespécies de rizobactérias varia entre o período
úmido e seco, foi realizado um escalonamento multidimensional não métrico (NMDS). A
ordenação foi feita utilizando-se dados de abundância, empregando-se o índice de
similaridade de Bray-Curtis. As análises foram realizadas no programa PC-Ord versão 6.0
(McCune & Mefford, 1997). Para verificar a significância do resultado da NMDS quanto à
diferença na composição de morfoespécies entre o período úmido e seco, foram utilizados os
escores para a realização de uma Anova. Para isso, foi construído um GLM assumindo
distribuição de erros Gaussian. Realizou-se também uma análise de espécies indicadoras para
determinar quais das morfoespécies foram mais características e que contribuíram mais para a
dissimilaridade observada (Dufrêne & Legendre, 1997). O teste de Monte Carlo foi utilizado
nesta análise para verificar diferenças significativas na distribuição das espécies em cada
estação e em cada estágio. Esse teste atribui um valor de significância estatística para cada
espécie, sendo as que apresentarem o P menor do que 0.05 consideradas indicadoras do
determinado estágio ou estação. O software utilizado para a realização da análise de espécie
indicadora foi o PC-Ord versão 6.0 (McCune & Mefford 1997).
Como as características da cobertura vegetal e do solo tendem a ser diferentes entre
estágios de sucessão foi realizada uma análise multivariada para verificar a influência desses
25
fatores na distribuição das rizobactérias entre os estágios. A análise de componentes
principais (PCA) foi realizada para verificar quais seriam as características mais importantes
do solo e da cobertura vegetal para serem utilizadas na análise de correspondência canônica
(CCA). As relações entre as características escolhidas pela PCA e a distribuição das
morfoespécies entre os estágios foram avaliadas por análise de correspondência canônica
(CCA). Para a CCA foram utilizadas apenas as variáveis: Fósforo remanescente (Prem);
Alumínio (Al); Hidrogênio + Alumínio (H+Al); m (Saturação por Alumínio); Areia grossa
(AG); Potássio (K); Silte; e Argila. Para testar a probabilidade de acerto das relações
encontradas entre as matrizes, empregou-se o teste de permutação de "Monte Carlo",
utilizando-se o Programa PC-Ord versão 6.0 (McCune & Mefford 1997). Os dados foram
organizados em duas matrizes: a de morfoespécies e a de variáveis ambientais (características
do solo).
Para avaliar a influência da estação do ano e do estágio sucessional na produção de
AIA, na solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio foram realizadas análises
de deviance via GLM assumindo a distribuição de erros Gaussian, Gaussian e
Quasibionomial, respectivamente. A estação do ano e o estágio sucessional foram
considerados como variáveis explicativas e a produção de AIA, a solubilização de fosfato e a
Fixação Biológica de Nitrogênio como variáveis resposta. Para todos os testes foi utilizado o
nível de significância de 0,05. As análises foram desenvolvidas no software estatístico R,
versão 2.10 (R Development core team, 2009) e os gráficos no programa SigmaPlot, versão
12.5.
26
3 RESULTADOS
3.1 Efeito da estação e do estágio sucessional na riqueza e abundância de rizobactérias
No total foram obtidos 826 isolados nas diluições, sendo que 441 são da coleta da
estação úmida e 385, da coleta da estação seca. O número total de morfoespécies de
rizobactérias amostradas foi 9 (Morfo1, Morfo2, Morfo3, Morfo4, Morfo5, Morfo6, Morfo7,
Morfo 8 e Morfo9). Sete morfoespécies (Morfo1, Morfo2, Morfo3, Morfo4, Morfo5, Morfo6
e Morfo7) são comuns para a estação úmida e para a estação seca e 2 morfoespécies (Morfo8
e Morfo9) ocorreram somente na coleta da estação úmida. A abundância geral de
morfoespécies foi maior na estação úmida, 12.230, do que na estação seca, 2.771. Em relação
aos estágios sucessionais, todas as 9 morfoespécies ocorreram nos estágios inicial e tardio. A
abundância de morfoespécies por estágio foi de 5.583 no inicial, 4.534 no intermediário e
4.884 no tardio.
De acordo com as análises, pôde-se constatar que a estação afeta significativamente a
riqueza e abundância de rizobactérias (p<0,001), sendo que tanto a riqueza quanto a
abundância foram maiores na estação úmida (Figura 5). O estágio não afetou a riqueza e
abundância de rizobactérias (p>0,05).
27
Figura 5. Riqueza e abundância de rizobactérias na estação seca e úmida em uma Floresta Tropical Seca. No
gráfico barras com letra diferente indica que os valores foram significativos (p<0,05) pela Análise de Variância.
O resultado que se refere à relação do estágio sucessional com a riqueza e abundância
de rizobactérias não foi como esperado. Os fatores edáficos (Tabela 3) e a cobertura vegetal
(Tabela 4, ver anexo) dos locais estudados indicam que, se ocorresse uma diferença
significativa da riqueza e abundância de morfoespécies de rizobactérias entre os estágios, a
diferença deveria ser explicada pelas características clássicas do estágio inicial de sucessão.
28
Tabela 3. Caracterização do conteúdo de nutrientes do solo (média ± EP) ao longo de três estágios sucessionais
em áreas de florestas tropicais secas em três unidades de conservação no norte de Minas Gerais. A concentração
de cada nutriente do solo foi comparada entre os estágios sucessionais através de modelos lineares generalizados.
Nutrientes
Estágios sucessionais
Inicial
Intermediário
Tardio
F
P
Prem (g.Kg-1)
33,46 (4,21)
32,60 (5,86)
38,03 (6,48)
0,271
0,77
K (g.Kg-1)
63,65 (28,31)
136,70 (70,93)
137,60 (101,42)
0,336
0,72
Al (mg/L)
0,93 (0,24)
0,06 (0,06)
0,16 (0,16)
7,493
0,02
H+Al (mg/L)
3,76 (0,84)
1,80 (0,15)
1,50 (0,20)
5,897
0,03
m (mg/L)
33,53 (2,72)
1,66 (1,66)
13,33 (13,33)
4,148
0,07
Areia Grossa (g.Kg-1)
47,06 (14,22)
37,80 (16,49)
45,33 (18,61)
0,008
0,91
Areia Fina (g.Kg-1)
14,93 (5,06)
23,53 (4,44)
20,66 (6,81)
0,626
0,56
Silte (g.Kg-1)
13,33 (3,33)
22,66 (11,68)
18,00 (10,26)
0,258
0,78
Argila (g.Kg-1) 24,66 (6,76) 16,00 (3,46) 16,00 (8,00) 0,616 0,57
3.1.2 Composição
A análise de composição de morfoespécies tanto na estação úmida quanto na estação
seca, quando avaliada entre os estágios, não separou nenhum grupo (p<0,05). Porém, ao
analisar somente as estações úmida e seca, o NMDS mostrou a formação de dois grupos,
sendo estes significativamente diferentes (p=0,001) quanto a composição de morfoespécies de
rizobactérias entre as estações (Figura 8). As morfoespécies indicadas pela análise como as
mais relacionadas com o padrão de dissimilaridade observado foram a Morfo4, Morfo8 e
Morfo9. Entretanto o resultado desse padrão não foi significativo para nenhuma dessas
morfoespécies (p>0,05).
29
Figura 8. Projeção dos escores da composição de espécies no escalonamento multidimensional não-métrico
(NMDS) para amostras de rizobactérias na estação úmida e seca (Medida de similaridade Bray-Curtis)
(a=Morfo1, b=Morfo2, c=Morfo3, d=Morfo4, e=Morfo5, f=Morfo6, g=Morfo7, h=Morfo8 e i=Morfo9).
A análise de NMDS, que é uma análise exploratória, mostrou a formação de dois
grupos (da estação úmida e da estação seca). A maioria das rizobactérias encontradas na
estação úmida se correlacionam negativamente com o eixo 1 e positivamente com o eixo 2,
enquanto que a maioria das encontradas na estação seca se correlacionam positivamente tanto
com o eixo 1 quanto com o eixo 2.
O resultado da PCA mostrou que apenas as variáveis edáficas estão relacionadas com
distribuição das rizobactérias nos estágios. Os dois eixos de ordenação da CCA no contexto
deste trabalho explicam 88% (54,5%=eixo 1 e 33,5=eixo 2) da variância total (Figura 9).
30
Figura 9. Análise de correspondência canônica (CCA) ordenando as morfoespécies de acordo com as
características ambientais/edáficas (Fósforo remanescente (Prem), Alumínio (Al), Hidrogênio + Alumínio
(H+Al), m (Saturação por alumínio), Areia grossa (AG), Potássio (K), Silte e Argila) representadas por vetores.
As siglas ini, int e tar numeradas indicam as três parcelas estudadas do estágio inicial, intermediário e tardio
respectivamente. Autovalor do eixo 1= 0,130 e eixo 2= 0,080; p = 0.0090. Teste de Monte Carlo: 1000
permutações.
As variáveis Saturação por alumínio (m), Silte, Alumínio (Al), Potássio (K) e Argila
relacionaram-se positivamente com o eixo 1 e negativamente com o eixo 2, enquanto que a
Areia grossa e o Fósforo remanescente (Prem) relacionaram-se positivamente com o eixo 2 e
negativamente com o eixo 1. E, Hidrogênio + Alumínio (H+Al) relacionaram-se
negativamente com os dois eixos. De acordo com o tamanho dos vetores, a CCA mostrou que
a variável Areia grossa (AG), Fósforo remanescente (Prem), Hidrogênio + Alumínio (H+Al) e
Argila são as que mais influenciam na distribuição das morfoespécies.
31
3.1.3 Caracterização morfológica e bioquímica
O agrupamento morfológico foi realizado considerando-se que os isolados tivessem no
mínimo 5 características em comum. A caracterização morfológica permitiu agrupar as
morfoespécies encontradas em três grupos (Grupo 1: Morfo1, Morfo2 e Morfo3; Grupo 2:
Morfo4, Morfo6, Morfo7 e Morfo8; Grupo 3: Morfo5 e Morfo9). O diagrama de Venn
(Figura 10) demonstra que 3 das 9 características morfológicas (Tabela 6, ver apêndice) são
comuns a todos os grupos. O grupo 1 e grupo 2 possuem 4 características morfológicas em
comum (crescimento, opacidade, elevação e produção de muco). O grupo 2 e o grupo 3
compartilham 3 características morfológicas (crescimento, opacidade e elevação). O grupo 3 e
o grupo 1 compartilham 3 características morfológicas (crescimento, opacidade e elevação).
Figura 10. Diagrama de Venn mostrando as interseções entre os grupos de Morfoespécies encontradas em
Florestas Tropicais Secas.
32 Tabela 6. Características morfológicas macroscópicas das colônias das 9 morfoespécies.
Morfo Mofo1 Morfo2 Morfo3 Morfo4 Morfo5 Morfo6 Morfo7 Morfo8 Morfo9
Cor
branca branca creme creme branca creme creme Creme amarela
Tamanho
<1mm <1mm >2 mm 1 a 2 mm >2 mm 1 a 2 mm >2 mm 1 a 2 mm >2 mm
Forma
circular circular espalha filiforme ramificada circular espalha margem radiada espalha
Crescimento
24 h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h
Opacidade
opaca opaca opaca opaca opaca opaca opaca opaca opaca
Superfície
lisa lisa lisa rugosa rugosa lisa lisa lisa Lisa
Borda
perfeita perfeita perfeita ondulada ondulada perfeita perfeita perfeita perfeita
Elevação
plana plana plana plana plana plana plana plana plana
Produção de muco não não não não não não não não sim
33
O agrupamento das morfoespécies permitiu verificar que existe uma alta similaridade
entre as morfoespécies de cada grupo, indicando que provavelmente são muito próximas.
Quanto à resposta a coloração de Gram (Figura 11) e teste de catalase, a maioria dos
isolados foi positivo (Figura 12) (Tabela 7). É necessário submeter os isolados deste estudo á
análise molecular para verificar de quais rizobactérias se tratam.
Figura 11. Microscopia óptica dos isolados JE22B-93 (A) e JE12A-28 (B) de Florestas Tropicais Secas em
aumento de 1000x.
Figura 12. Resultado do teste de catalase dos isolados 2LE12B-586 (A) e JI34B-86 (B) de Florestas Tropicais
Secas.
34
Tabela 7. Relação da forma e coloração das morfoespécies encontradas em Florestas tropicais Secas.
Morfoespécie
Forma Gram Catalase
Morfo1
cocos positivo positivo
Morfo2 cocos positivo negativo
Morfo3
estreptobacilos positivo negativo
Morfo4 bacilos positivo negativo
Morfo5
estreptobacilos positivo negativo
Morfo6 bacilos positivo positivo
Morfo7
bacilos positivo positivo
Morfo8 bacilos negativo positivo
Morfo9
cocos
positivo
positivo
3.2 Efeito da estação e do estágio sucessional na atividade bioquímica de rizobactérias
3.2.1 Produção de AIA por rizobactérias
A equação para o cálculo da concentração de AIA foi obtida através do preparo de
uma solução com o hormônio sintetizado conforme metodologia citada (Figura 13) e posterior
construção da curva padrão (Figura 14).
35
Figura 13. Amostras preparadas a partir do hormônio sintetizado (Sigma, 98% de pureza), para a construção da
curva padrão, onde A, B, C, D, E, F e G são 0, 1, 3, 5, 7, 10, 25, 50, 100 e 150 µg.mL-1, respectivamente.
Figura14. Curva padrão do ácido indolacético a partir do hormônio sintetizado (95%) utilizada para o cálculo da
concentração do AIA produzido pelas rizobactérias de Florestas Tropicais Secas. Absorvância medida em
nanômetros e concentração em µg/mL-1.
A produção de AIA pela cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 (Figura 15
A) foi de 123µg.mL-1. Dos isolados analisados três (SE33A-312, SE32A-316 e SI23B-377)
não produziram ácido indolacético. Esses três isolados pertencem às amostras da estação
úmida. A produção de ácido indolacético variou de 0.05 (produzido pelos isolados LI24A-204
e 2JT13B-823) a 134 µg.mL-1 (produzido pelo isolado ST33A-345) (Figura 15 B).
36
Figura 15. (A) Resultado para AIA da cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 (R1-R3= repetições e
B=branco) e (B) resultado para AIA, onde A é o isolado ST33A-345, B é o isolado ST12A-355, C é o isolado
SE32B-402 e B é o branco.
A estação do ano não afetou a produção de ácido indolacético (p<0,05). Entretanto, o
estágio sucessional afetou significativamente a produção de ácido indolacético por
rizobactérias (p<0,001). Adicionalmente, a análise de contraste mostrou que a produção de
ácido indolacético por bactérias encontradas nos estágios iniciais e intermediários foi menor
do que a produção encontrada nos estágios tardios. Além disso, essa não foi significativa entre
os estágios iniciais e intermediários (Figura 16).
Figura 16. Produção de ácido indol-3-acético (AIA) em µg/mL-1 por rizobactérias em função do estágio
sucessional em uma Floresta Tropical Seca. No gráfico barras com mesma letra indica que os valores não foram
significativos (p>0,05) e com letra diferente foi significativo (p<0,05) pela Análise de Contraste.
37
3.2.2 Solubilização de fosfato por rizobactérias A solubilização de fosfato foi observada somente para 25 dos 180 isolados analisados
e para a cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 (IS=3,8) (Figura 17 A). O maior IS
observado foi 1,88 para o teste com o isolado 2LT22A-646 (Figura 19 B). De acordo com a
classificação, os IS’s obtidos pela solubilização de fosfato são considerados baixos, pois todos
os IS’s foram menores que 2.
Figura 18. Solubilização de fosfato, após 15 dias de crescimento, (A) pela cepa padrão Burkholderia cepacia
ATCC 25416 e (B) pelo isolado 2LT22A-646 de rizobactéria de Floresta Tropical Seca.
As análises mostraram que a estação afeta significativamente a solubilização de
fosfato (p<0,001), tendo sido maior na estação seca. Esse resultado não corrobora com a
primeira hipótese deste estudo, visto que se esperava que o estresse hídrico observado nos
solos tropicais, sobretudo nos locais amostrados durante a estação seca, afetasse
negativamente a atividade bacteriana. Quanto ao estágio sucessional, este não afeta a
solubilização de fosfato pelas rizobactérias (p>0,05) (Figura 18).
38
Figura 18. Solubilização de fosfato por rizobactérias em função da estação seca e úmida em uma Floresta
Tropical Seca. A solubilização está expressa em Índice de solubilização (diâmetro do halo (mm)/diâmetro da
colônia (mm)). No gráfico barras com letra diferente indica que os valores foram significativos pela Análise de
Variância (p<0,05).
3.2.3 Fixação Biológica de Nitrogênio por rizobactérias
A sazonalidade e o estágio sucessional não afetaram significativamente a Fixação
Biológica de Nitrogênio pelas rizobactérias estudadas (p>0,05). A cepa padrão e a maioria
dos isolados foram positivas para a Fixação Biológica de Nitrogênio (Figura 18 A e B,
respectivamente).
39
Figura 18. (A) Fixação de nitrogênio pela cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 e (B) pelo isolado de
rizobactéria JI13A-12 de uma Floresta Tropical Seca.
40
4 DISCUSSÃO
4.1 Efeito da estação e do estágio sucessional na riqueza e abundância de rizobactérias
Neste trabalho, o conhecimento da diversidade morfológica dos microrganismos
estudados foi considerado e, através da separação das colônias em morfoespécie, foi possível
analisar a riqueza e abundância em função dos estágios e da estação. Muitos trabalhos ainda
são realizados considerando a classificação de bactérias em gênero ou ainda considerando
apenas os aspectos morfológicos para identificação (Ribeiro & Cardoso, 2011; Silva &
Melloni, 2011).
A hipótese que considerou o efeito da estação sobre a riqueza e abundância de
rizobactérias foi corroborada. Flutuações na disponibilidade de água são freqüentemente
observadas nos solos tropicais, com ciclos de seca e encharcamento, que resultam em baixa
sobrevivência dos microrganismos diazotróficos (Mary et al., 1994). Resultados semelhantes
a este trabalho foram encontrados para actinobactérias em que foi relatada uma maior
diversidade de espécies de actinobactérias para a estação úmida em todos os locais
amostrados (Nimnoi et al., 2011).
A comunidade microbiana da rizosfera pode ter sua estrutura e composição de
espécies diversificada em função não apenas de uma variável, mas do tipo de solo, espécie de
plantas, estado nutricional, idade, estresse, entre outros fatores ambientais (Cardoso &
Nogueira, 2007). A presença de plantas pioneiras pode reduzir a diversidade de diazotróficas
de vida livre e, diretamente ou indiretamente, influencia a estrutura da comunidade (Duc et
al., 2009). Considerando o tempo de regeneração natural e a estação diversos trabalhos
relatam que eles afetam a estrutura e sucessão de comunidades de diazotróficas em diferentes
ambientes (Rastetter et al., 2001; Nemergut et al., 2006) e, ainda, a diversidade filogenética
tende a aumentar com a idade em cada estágio (Mosberger & Lazzaro, 2008). Nas sucessões
em comunidades, se não houver nenhuma perturbação adicional às que geralmente ocorrem
41
em um ambiente, o número de espécies inicialmente aumenta devido à colonização,
decrescendo posteriormente devido à competição. Este padrão está bem estabelecido para
plantas, mas os poucos estudos sobre sucessão animal indicam, ao menos, um aumento
paralelo na riqueza de espécies nos estágios iniciais de sucessão. Entretanto, para muitas
generalizações, podem ser encontradas exceções importantes, e para a maioria delas as
explicações atuais não são inteiramente adequadas, sendo baseadas em estimativas
(estimadores) de riqueza pouco precisas (consistentes) (Begon et al., 2007).
Os efeitos sazonais são importantes reguladores das comunidades de diversos
organismos em florestas tropicais (Neves et al., 2010; Oliveira et al., 2011), sendo que a
umidade pode afetar positivamente a diversidade no caso da microbiota do solo (Shishido &
Chanway, 1998).
O tipo de solo é o fator mais importante na determinação da comunidade microbiana
da rizosfera (Xu et al., 2009). Esse impacto gerado em comunidades de rizobactérias varia em
relação às propriedades edáficas, tais como a textura, pH e teor de matéria orgânica e
porcentagem de argila (Nimnoi et al., 2011). Solos de argila são relatados como os que
exercem uma maior influência sobre as comunidades microbianas e geralmente suportam
maiores densidades populacionais do que solos arenosos (Marschner et al., 2004; Xu et al.,
2009).
A análise dos genes amplificados e seqüenciados de rDNA 16S se tornou a abordagem
mais importante para estudos de diversidade bacteriana. As novas tecnologias permitem
sequenciar várias amostras em uma única corrida e o custo-benefício é dividido (Lemos et al.,
2011). A abordagem morfológica utilizada neste trabalho ainda é importante para se dar início
aos estudos de diversidade de microrganismos (Ribeiro & Cardoso, 2011; Silva & Melloni,
2011). Análises filogenéticas podem contradizer expectativas que se baseiam apenas em
propriedades fenotípicas dos organismos. Como exmplo, a classificação fenotípica tradicional
42
considera Chromatium vinosum, espécie fotossintética, diferente de Escherichia coli que é
heterotrófica. No entanto, a análise filogenética baseada em rDNA 16S, e outras sequências,
mostrou que os dois organismos são semelhantes, e mesmo que utilizem diferentes fontes e
estratégias de obtenção de energia, compartilham a natureza de algumas vias biossintéticas e
mecanismos de regulação gênica (Hugenholtz & Pace, 1996).
4.2 Efeito da estação e do estágio sucessional na atividade bioquímica de rizobactérias Os resultados para produção in vitro de AIA não confirmaram nenhuma das hipóteses
testadas. Com relação à maior produção de AIA por bactérias encontradas no estágio tardio
não foi encontrado nenhum dado na literatura que corroborasse a diferença acentuada com
relação à produção pelas bactérias do estágio tardio.
Em solos de sucessão inicial o efeito da rizosfera de manchas de plantas de
Leucanthemopsis alpina (Asteraceae) pode influenciar o número de células bacterianas e
atividades fisiológicas intrínsecas não só dentro da zona de raiz, mas até mesmo, a 20 cm de
distância da planta (Miniaci et al., 2007). Plantas vasculares de estágios iniciais podem
aumentar a disponibilidade de C e N na sua zona de raiz e criar um efeito caracterizado por
um aumento acentuado do grau de culturabilidade da comunidade microbiana e uma mudança
nas populações bacterianas dominantes (Edwards et al., 2006).
O AIA é um importante fitormônio natural encontrado, em baixas concentrações, em
plantas (Pelzer et al., 2011) e está envolvido na regulação dos processos de crescimento e
desenvolvimento (Sanches et al., 2009). Quando produzido em altas concentrações, pode ter
efeito contrário, inibindo o crescimento da planta (Boiero et al., 2007). A avaliação da síntese
desse fitormônio por rizobactérias pode proporcionar mais um critério a ser utilizado na
seleção de cepas boas produtoras (Chagas Jr. et al., 2009). Para isso, muitos trabalhos
evidenciam a síntese de AIA por rizobactérias usando o L-triptofano como precursor
43
(Hameed et al., 2004; Sottero, et al., 2006). Diferenças significativas já foram observadas na
variação da produção de AIA, em diferentes concentrações de L-triptofano, com produção
acima de 100 µg.mL-1 (Chagas Jr. et al., 2009). Em outro caso, o nível mais elevado de
produção de AIA foi de 127 µg.mL-1 (Goudjal et al., 2013). Este valor foi menor que o
produzido pelo isolado mais produtivo no presente trabalho (134 µg.mL-1, produzido pelo
isolado ST33A-345).
A avaliação da produção de AIA foi realizada por meio da via dependente de L-
triptofano. Mas outros trabalhos consideram a avaliação dessa produção em relação à via não
dependente de L-triptofano. Noventa por cento do AIA produzido por Azospirillum
brasilense são sintetizados pela via não dependente de L-triptofano (Prinsen et al., 1993).
Mas, isolados de rizóbios são capazes de produzir AIA com ou sem a adição de triptofano
(Chagas Jr. et al., 2009).
A maior atividade bacteriana quanto à solubilização de fosfato observada na estação
seca pode ser explicada pelo fato de que, em situações de estresse hídrico, muitas reações no
solo ficam limitadas, o que consequentemente dificulta a absorção de alguns nutrientes pelas
plantas (Larcher, 2006). Diante disso, a ação das bactérias garante uma maior disponibilidade
de fósforo no solo, mantendo assim os benefícios oferecidos na associação entre planta e
microrganismos.
No período seco o pH do solo tende a ficar mais ácido e são liberados íons de Al, Fe e
Mn em excesso, o que precipita o fósforo, levando à diminuição da concentração de íons
PO43- (Larcher, 2006). Com isso, a absorção do fósforo é dificultada, uma vez que é associada
à atividade de microrganismos do solo como rizobactérias, que é baixa em solos ácidos como
os de FTS’s. Por outro lado, em solos alcalinos ocorre a formação de compostos de cálcio
cada vez mais insolúveis partindo do fosfato bicálcico (CaHPO4), primeiro mineral formado
pela reação do P com o Cálcio (Raij, 2004). A falta de dados consistentes em relação à
44
diferença na solubilização de fosfato por rizobactérias durante as estações nos permite inferir
pouco sobre o assunto. Por isso, o que se pode afirmar é que os microrganismos do solo
desempenham papel relevante na retenção e disponibilização desse nutriente em ecossistemas
naturais (Gallardo & Schlesing, 1995), sobretudo no início da estação chuvosa em que o
fósforo pode representar em torno de 60% do retorno anual de serrapilheira através da
atividade microbiana (Campo et al., 1998). Nesse sentido, a umidade favorece a ação dos
microrganismos de forma que os minerais nutritivos como o fósforo permanecem
indisponíveis por pouco tempo e voltam a estar disponíveis para as plantas (Larcher, 2006).
Cepas dos gêneros Pseudomonas, Bacillus e Rhizobium estão entre as bactérias mais
eficientes na solubilização de P (Rodriguez & Fraga, 1999). O estudo sobre a eficiência
desses microrganismos em solubilizar fosfato pode levar à seleção de isolados com alto
potencial para utilização na inoculação em plantas (Souchie, 2005).
Os resultados encontrados neste trabalho não corroboraram as hipóteses testadas visto
que esperava-se uma maior Fixação Biológica de Nitrogênio por rizobactérias encontradas na
estação úmida e nos estágios intermediários de sucessão. A umidade do solo estimula a
atividade de decomposição microbiana, que regula principalmente a ciclagem do nitrogênio
no ecossistema (Larcher, 2006). Com relação aos estágios sucessionais, a maior quantidade de
leguminosas poderia contribuir para a maior Fixação Biológica de Nitrogênio. Rizobactérias
que vivem nesses locais podem viver em associação com essas plantas otimizando a
disponibilização de Nitrogênio (Dobbelaere et al., 2003).
O estudo do potencial de fixação de nitrogênio in vitro por rizobactérias deve ser
aprofundado. Os genes nifH de isolados podem ser sequenciados e a quantificação do
potencial de fixação de nitrogênio pode ser realizada pela redução de acetileno a etileno
(Lammel et al., 2013). O gene nifH codifica uma das enzimas do complexo nitrogenase, que é
conhecida por catalisar a reação de Fixação Biológica de Nitrogênio. Ele é também uma
45
ferramenta útil para analisar e compreender as comunidades diazotróficas, bem como
classificá-las (Mosberger & Lazzaro, 2008; Jorquera et al., 2013). As bactérias com alto nível
de Fixação Biológica de Nitrogênio podem ser inoculadas em espécies de plantas nativas para
uso em restauração e reflorestamento de áreas degradadas, o que pode refletir em maiores
níveis de crescimento e fitness das plantas.
46
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os parâmetros analisados sobre os fatores edáficos e cobertura vegetal da área
estudada poderiam contribuir para o entendimento da atividade de microrganismos oriundos
de diferentes estágios. Entretanto, a produção de AIA foi maior no estágio tardio e a
solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio não teve diferença significativa. A
diferença entre os estágios, tanto para os fatores edáficos quanto para a cobertura vegetal, foi
significativa para os estágios iniciais de sucessão (p<0,05). Entretanto, dos nutrientes do solo,
somente o alumínio e H+Al foram significativos (p<0,05). Por isso, os resultados da análise
de solo e cobertura vegetal não serviram de parâmetros, nesse caso, para explicar a atividade
microbiana.
47
6 CONCLUSÕES
Vários estudos já foram realizados com o intuito de verificar a influência da
sazonalidade e do gradiente sucessional na riqueza e abundância de organismos em FTS’s.
Entretanto, este é o primeiro que teve por objetivo investigar a influência desses fatores na
riqueza, abundância, produção de AIA, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de
Nitrogênio de rizobactérias em FTS’s.
O conhecimento de qual é a estação e o estágio sucessional em que as rizobactérias
são mais eficientes para a produção de AIA, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de
Nitrogênio permite que sejam definidos o momento e o local de coleta para selecionar as
espécies mais promissoras. As análises desses parâmetros permitem afirmar que as bactérias
obtidas neste estudo são potenciais para a produção de AIA e FBN, que são caracteres
fenotípicos importantes na escolha de microrganismos mais eficientes para a recuperação de
áreas degradadas e revegetação com espécies de plantas nativas.
Os resultados para a morfologia, coloração de Gram e para o teste de catalase mostram
que os isolados possuem características muito próximas. Esses isolados devem ser submetidos
às técnicas moleculares e identificados para verificar se revelam novos Taxa de rizobactérias
bem como para confirmar aquelas já descritas.
Finalmente, estudos que visam identificar o padrão de distribuição, a atividade
bioquímica e a caracterização filogenética de rizobactérias em FTS’s contribuem para o
conhecimento desses microrganismos, que podem ser indicados para o uso na recuperação de
áreas degradadas e compor um banco de germoplasma ativo para estudos futuros e de
referência.
48
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58
APÊNDICE
Tabela 8. Modelos lineares generalizados completos construídos para testar os efeitos da estação, estágio e interação estação*estágio na riqueza, abundância, produção de
AIA, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio em rizobactérias de Florestas Tropicais Secas em três unidades de conservação no norte de Minas Gerais.
Variável resposta Distribuição de erro Variável explicativa Df Deviance P Residual deviance
Riqueza Poisson
Estação
1 77,162 2,2x10-16 355,77
Estágio
2 0,379 0,8273 432,93
Estação*Estágio 2 2,111 0,3481 353,66
Abundância Quasipoisson
Estação
1 6267,9 2x10-16 21774
Estágio
2 132,7 0,4724 28042
Estação*Estágio 2 31,2 0,8385 21743
Ácido indol-3-acético Gaussian
Estação
1 47,9 0,75389 283388
Estágio
2 19250,3 2,64x10-9 264138
Estação*Estágio 2 3899,4 0,01830 2,60239
Solubilização de fosfato Gaussian
Estação
1 3,2089 0,000639 150,01
Estágio
2 0,0142 0,974596 149,99
Estação*Estágio 2 0,0678 0,884097 148,46
Fixação Biológica de Nitrogênio Quasibinomial
Estação
1 0,2959 0,7522 49,144
Estágio
2 11,3773 0,1471 49,440
Estação*Estágio 2 5,2310 0,4142 43,913
59
ANEXOS
Figura 2. Localização do Parque Estadual Lagoa do Cajueiro, Reserva Biológica Serra Azul e Reserva Biológica Jaíba, localizados nos municípios de Matias Cardoso e Jaíba,
no Vale do Médio Rio São Francisco.
60
Tabela 1. Composição química do meio de cultura LGIm utilizado para o teste da capacidade das rizobactérias em solubilizar fosfato.
Componentes Quantidade (g.L -1)
Glicose 100
Mg.SO4.7H2O 0,2
NaMoO4.2H2O 0,002
FeCl3.6H2O 0,018
K2HPO4 0,2
KH2PO4 0,6
Ca3 (PO4)2 5
Agar 15
* Adicionar 5mL de Azul de bromotimol (Solução 0,5% em KOH 0,2N). * Adicionar água destilada e ajustar o pH para 5,5.
61
Tabela 2. Composição química do meio de cultura NFb utilizado para o teste da capacidade das rizobactérias para a Fixação Biológica de Nitrogênio.
Componentes Quantidade (g.L -1)
Ácido málico 5,0
Mg.SO4.7H2O 0,2
NaCl 0,1
CaCl2.2H2O 0,02
K2HPO4 0,5
KOH 4,5
Agar 1,75
*Adicionar 2mL de solução de micronutrientes, 2mL de Azul de bromotimol (Solução 0,5% em KOH 0,2N), 4mL de FeEDTA (Solução 1,64%), 1mL de solução de vitaminas e água destilada. Ajustar o pH para 5,8.
62
Tabela 4. Valores médios (média ± EP) das características estruturais de árvores (altura, área basal e densidade) e o índice de complexidade de Holdrige (HCI) em três
estágios sucessionais em três unidades de conservação de FTS’s no Norte de Minas Gerais. Diferenças entre as características estruturais foram testadas através de modelos
lineares generalizados e letras diferentes indicam diferenças significativas.
Estágios sucessionais Características estruturais
Riqueza Altura (m) Densidade (ind/há-0.1) Área basal (m2/há) HCI
Inicial 16,4 (2,35)a 4,76 (0,58)a 60,0 (16,41)a 5,86 (1,34)a 3,51 (1,5)a
Intermediário 32,2 (2,33)b 6,12 (0,31)b 154,6 (24,12)b 11,75 (3,08)a 45,02 (16,22)b
Tardio 20,8 (3,45)a 6,74 (0,40)b 131,3 (34,88)b 16,97 (0,92)b 33,33 (5,5)b