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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA
MOLECULAR
CLONAGEM DO GENE MpATG8 DE Moniliophthora perniciosa EM
Saccharomyces cerevisiae E ANÁLISE DA VARIAÇÃO DE
EXPRESSÃO GÊNICA AO LONGO DO CICLO DE VIDA DE M.
perniciosa
WAGNER GONÇALVES MACENA
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Novembro de 2008
WAGNER GONÇALVES MACENA
CLONAGEM DO GENE MpATG8 DE Moniliophthora perniciosa EM
Saccharomyces cerevisiae E ANÁLISE DA VARIAÇÃO DE
EXPRESSÃO GÊNICA AO LONGO DO CICLO DE VIDA DE M.
perniciosa
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Novembro de 2008
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para obtenção do título de Mestre
em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e
Biologia Molecular de Microrganismos
WAGNER GONÇALVES MACENA
CLONAGEM DO GENE MpATG8 DE Moniliophthora perniciosa EM
Saccharomyces cerevisiae E ANÁLISE DA VARIAÇÃO DE
EXPRESSÃO GÊNICA AO LONGO DO CICLO DE VIDA DE M.
perniciosa
_______________________ ________________________
Prof. Dr. João Carlos Teixeira Dias Prof. Dr. Abelmon Gesteira
(UESC) (UESC)
___________________________ ________________________
Prof. Dr. Antonio Vargas de O. Figueira Prof. Dra. Cristina Pungartnik
(CENA/USP) (UESC – Orientadora)
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para obtenção do título de Mestre
em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e
Biologia Molecular de Microrganismos
“Posso crer que em minha vida O milagre vai acontecer Posso ver as promessas Sendo liberadas sobre mim Sendo liberadas sobre mim Hoje o meu milagre vai chegar Eu vou crer, não vou duvidar O preço que foi pago ali na cruz Me dá vitória, nesta hora Tua morte, tua cruz, teu sangue Derramado no calvário Está selado, foi consumado Vivo, hoje livre do pecado Vivo as promessas dos milagres” Composição: André Valadão
“Ouvindo esta música chorei e me fortifiquei muitas vezes quando ia para UESC,
angústia e incertezas me consumiam em meio a tantas dificuldades, muitas destas vezes
pensei até em desistir. Contudo o Senhor Deus me mostrou mais uma vez que Ele é
Deus e Ele está no controle de todas as coisas” Wagner Macena.
À minha esposa Tharcilla Macena, quem
tanto me incentivou e sempre esteve do
meu lado nos momentos mais difíceis
desta caminhada.
DEDICO
AGRADECIMENTO A DEUS, grande amigo e consolador por tantas bênçãos derramadas em minha vida, só
Ele é digno de toda honra e louvor.
À minha amada esposa Tharcilla a quem tanto amo, e que me proporcionou ser um
homem realizado.
Aos meus pais e irmãos, pessoas que amo muito e sempre estiveram comigo em todas as
decisões, esta vitória é fruto de muito sacrifício por parte de vocês que me trouxeram
até aqui.
Aos meus sogros e cunhadas que sempre foram uma segunda família para mim. Esta,
sem sombra de dúvida também é uma vitória de vocês.
Ao meu pastor Rosemar e irmão Gerson pelas orações e cuidado. Deus permaneça lhes
abençoando.
Ao pequeno grupo da IBE pelas orações e amizade dos irmãos.
Aos colegas de laboratório Sônia, Regineide, Tatiana e Gabrielle, obrigado pelo
companheirismo, ajuda e momentos de descontração.
À amiga, madrinha e colega Carol Santini, pela grande ajuda nos momentos difíceis.
Aos amigos Braz Tavares e em especial Cristiano Villela que muito me ajudaram neste
período. Coisas que só um amigo faria por outro.
À minha orientadora Cristina Pungartnik por tudo que me transmitiu durante este
período de aprendizagem, sou muito grato, Deus abençoe sempre.
Ao Prof. Carlos Priminho, pelos ensinamentos e dicas fundamentais para este trabalho.
À Professora Acássia pelas dicas e fornecimento de material.
Aos colegas dos laboratórios de Monitoramento Ambiental, Genética, Cultura de
Tecidos, Citogenética, o meu muito obrigado.
Ao Dr Martin Brendel pela amizade e experiência transmitida.
Ao Dr Júlio Cascardo pela amizade e dicas importantíssimas para o trabalho.
Ao Dr Abelmon pela amizade e ajuda no laboratório.
À secretária do colegiado, Luciana, pela gentileza e agilidade em resolver os
probleminhas.
Ao programa de pós-graduação em Genética e Biologia Molecular.
À Fapesb pela bolsa e financiamento do projeto.
A todos que de alguma maneira contribuíram para o meu crescimento...
MUITO OBRIGADO!
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS................................................................................................. i
LISTA DE TABELAS................................................................................................ iii
RESUMO .................................................................................................................... iv
ABSTRACT................................................................................................................. vi
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1
1.1 Autofagia............................................................................................................... 1
1.1.1 Mecanismo molecular da autofagia................................................................... 3
1.1.1.1 Formação do autofagossomo. ........................................................................ 5
1.1.1.2 Sistema de conjugação de Atg8p.................................................................... 6
1.1.1.3 Sinalização da autofagia.................................................................................. 6
1.2. O fungo Moniliophthora perniciosa.................................................................... 8
2 OBJETIVO GERAL................................................................................................ 13
2.1 Objetivos Específicos............................................................................................ 13
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 14
3.1 Linhagens, plasmídeos e primers utilizados......................................................... 14
3.2 Condições de cultivo............................................................................................. 15
3.2.1 Bactéria.............................................................................................................. 15
3.2.1.1 Escherichia coli............................................................................................... 15
3.2.2 Fungos................................................................................................................ 15
3.2.2.1 Saccharomyces cerevisiae............................................................................... 15
3.2.2.2. Moniliophthora perniciosa............................................................................ 16
3.3. Microscopia óptica .............................................................................................. 17
3.4. Análises de bioinformática................................................................................... 17
3.5. Análises moleculares............................................................................................ 18
3.5.1. Extração de RNA, e RT-qPCR......................................................................... 18
3.5.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)............................................................ 18
3.5.3 PCR em tempo real............................................................................................ 19
3.5.4 Amplificação e transformação de bactérias....................................................... 20
3.5.5 Extração de plasmídeos de bactérias.................................................................. 20
3.5.6 Transformação de levedura................................................................................ 21
3.6 Clonagens específicas .......................................................................................... 21
3.6.1 Subclonagem em vetor de transformação.......................................................... 21
3.6.2 Subclonagem em vetor de expressão em levedura............................................. 22
3.6.3 Obtenção de clones de levedura contendo o gene de interesse.......................... 24
3.6.4 Exposição a mutagênico e sobrevivência .......................................................... 24
3.6.4.1 Teste semi-qualitativo com levedura.............................................................. 24
4 RESULTADOS........................................................................................................ 25
4.1 Análise de bioinformática .................................................................................... 25
4.1.1 Caracterização in silico da seqüência do gene MpATG8................................... 25
4.2 Expressão gênica de MpATG8 durante o cultivo in vitro de Moniliophthora
perniciosa utilizando a técnica de PCR em tempo real............................................... 28
4.3 Análise da expressão gênica de MpATG8 durante o cultivo in vitro de
Moniliophthora perniciosa nos meios 1, 2 e 3, utilizando a técnica de PCR em
tempo real.................................................................................................................... 28
4.4 Microscopia óptica de Moniliophthora perniciosa durante o cultivo in vitro nos
meios 1, 2 e 3.............................................................................................................. 31
4.5 Expressão heteróloga em levedura........................................................................ 32
4.5.1 Clonagem do gene.............................................................................................. 32
4.5.2. Caracterização fenotípica do mutante............................................................... 34
5 DISCUSSÃO........................................................................................................... 36
5.1 Caracterização in silico da seqüência do gene MpATG8...................................... 36
5.2 Análise da expressão gênica de MpATG8............................................................. 36
5.3 Análise das amostras em microscopia óptica........................................................ 40
5.4 Expressão heteróloga do gene MpATG8 no mutante Scatg8Δ............................. 40
6 CONCLUSÕES....................................................................................................... 43
7 PERSPECTIVAS..................................................................................................... 44
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 45
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação das etapas do processo autofágico em Saccharomyces
cerevisiae. ...................................................................................................................
3
Figura 2. Modificações pós-traducionais ocorridas em ATG8 na formação do
autofagossomo.............................................................................................................
4
Figura 3. Representação do funcionamento do mecanismo TOR frente à condições
externas de nutrição.....................................................................................................
7
Figura 4. Ciclo de vida de M. perniciosa em T. cacao ............................................... 10
Figura 5. Morfologia das hifas de M. perniciosa......................................................... 11
Figura 6. Vetor pGEM-T easy utilizado na clonagem................................................. 22
Figura 7. Vetor para transformação de bactérias e leveduras...................................... 23
Figura 8. Seqüência de nucleotídeos e os aminoácidos deduzidos da proteína
MpATG8......................................................................................................................
25
Figura 9. Alinhamento de múltiplas seqüências de aminoácidos de diferentes
organismos utilizando o software ClustalW................................................................
26
Figura 10. Análise filogenética do MpATG8 com seqüências de proteínas
relacionadas à autofagia...............................................................................................
27
Figura 11. Mapa de restrição enzimático da seqüência MpATG8............................... 27
Figura 12. Análise de expressão diferenciada do MpATG8, em diferentes fases de
desenvolvimento em bolachas.....................................................................................
28
Figura 13. Análise de expressão diferenciada do MpATG8, em M. perniciosa
cultivado em meio 1.....................................................................................................
29
Figura 14. Análise de expressão diferenciada do MpATG8, em M. perniciosa
cultivado em meio 2.....................................................................................................
30
Figura 15. Análise de expressão diferenciada do MpATG8, em M. perniciosa
cultivado em meio 3.....................................................................................................
30
Figura 16. Alteração morfológica em hifas de M. perniciosa após 21dias de
crescimento em meio 2................................................................................................
31
Figura 17. Aparecimento de bolhas nas hifas de M. perniciosa quando cultivado
em meio 1, 2 e 3 ..........................................................................................................
31
Figura 18. Alteração da morfologia das hifas de M. perniciosa e presença de
cristais no meio............................................................................................................
32
Figura 19. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto da reação de
ii
amplificação de MpATG8 utilizando primers pDNR-LIB.......................................... 32
Figura 20. Eletroforese em gel de agarose: vetor pRS313 e V001 digeridos ............. 33
Figura 21. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto de PCR de colônia
de bactérias DH5α transformadas com V002..............................................................
33
Figura 22. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto de PCR, de colônia
de leveduras transformadas, utilizando primers ATG8...............................................
34
Figura 23. Teste em gota de transformantes de levedura em fase estacionária .......... 34
Figura 24. Teste em gota de transformantes de levedura em fase exponencial........... 35
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Linhagens de bactéria e leveduras.utilizadas neste trabalho....................... 14
Tabela 2. Plasmídeo e primers utilizados neste trabalho............................................ 14
Tabela 3. Análise e comparação de alinhamento das seqüências de aminoácidos
em relação à proteína MpATG8 utilizando Clustal W2.............................................
26
iv
RESUMO
Macena, Wagner Gonçalves, M.sc., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Novembro de
2008. CLONAGEM DO GENE MpATG8 DE Moniliophthora perniciosa EM Saccharomyces
cerevisiae E ANÁLISE DA VARIAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA AO LONGO DO CICLO
DE VIDA DE M. perniciosa. Orientadora: Dra. Cristina Pungartnik. Co-orientadora: Dr. Martin
Brendel. Colaborador: Dr. Júlio C. M. Cascardo.
A autofagia é um transporte não seletivo de constituintes citoplasmáticos para um vacúolo, onde
proporcionará a lise destes constituintes visando à disponibilidade de matéria-prima para
manutenção das funções básicas da célula. Este mecanismo é induzido devido à carência
nutritiva de fontes de carbono, nitrogênio, fosfato ou sulfato. Distúrbios no processo autofágico
podem ser letais ou causar patologias em eucariotos superiores. Pelo menos 27 genes
relacionados com autofagia (ATG) foram identificados no processo autofágico em
Saccharomyces cerevisiae; a maioria se enquadra em três grandes grupos de acordo a sua
função: a) autofagia não seletiva (17 genes); b) autofagia seletiva (7 genes); c) degradação de
corpos de autofágicos (2 genes). Em leveduras S. cerevisiae, a proteína ATG8 é essencial para a
rota autofágica. Depois de umas séries de modificações pós-traducionais, ATG8 promove a
formação do autofagossomo e a entrega deste para o vacúolo e subseqüente degradação. O fungo
basideomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa é o agente causador da vassoura-de-
bruxa, a principal doença que afeta a produção de cacau (Theobroma cacao L.) no Brasil e na
Bahia em especial. O acúmulo recente de conhecimentos sobre os mecanismos de interação
planta/patógeno levou à necessidade de aprofundamento sobre a fisiologia e biologia celular do
fungo, que poderão auxiliar no desenvolvimento de medidas de controle mais eficientes da
doença. Com objetivo de descrever o processo autofágico em M. perniciosa, foram feitas
análises de expressão gênica de MpATG8 durante o crescimento de M. perniciosa in vitro
(“bolacha” utilizada para a produção de basidiocarpos), por meio da técnica de Real-Time PCR.
As fases de crescimento em bolacha caracterizam-se pelas mudanças de coloração do meio
(branco, amarelo, rosa, formação de primórdios e produção de basidiocarpos). Para induzir a
formação de basidiocarpo, o fungo passa por um período de uma semana com ausência de
hidratação. Neste período, foram feitas coletas antes de iniciar a ausência de rega e no 10º dia de
ausência de água. Em meio sintético foi realizado um ensaio com M. perniciosa crescido em
meios com concentrações diferentes, sendo 2% de peptona, glicose e glicerol (Meio 1), 0,5% de
v
peptona e glicose (Meio 2) e 0,5% de peptona e glicerol (Meio 3). Foram feitas as coletas para
análise de expressão gênica e microscopia óptica em dias determinados, sendo eles 14, 21, 28,
35, 42 dias Este trabalho visou demonstrar a existência do mecanismo autofágico em M.
perniciosa, e analisar a expressão de MpATG8 durante o crescimento in vitro e complementação
fenotípica do mutante atg8Δ em leveduras. Os resultados da análise da expressão gênica
demonstraram um crescente aumento da expressão MpATG8 ao longo das fases de crescimento,
tendo seu maior ponto de expressão no primórdio e uma queda de expressão na fase de
basidiocarpo. Os resultados do Real-Time PCR demonstraram uma pequena variação na
expressão gênica no meio 1, e uma grande variação nos meios 2 e 3 como era esperado. Na
microscopia óptica, foi possível observar grandes variações morfológicas das hifas como
espessamento, formação de bolhas e outras ao longo das fases de crescimento, porém não foi
estabelecida nenhuma relação direta entre a autofagia e as alterações encontradas. Foi feita a
subclonagem em Saccharomyces cerevisiae do fragmento amplificado da biblioteca de cDNA de
MpATG8 (730pb), junto com o vetor tipo “shuttle-vetor” de levedura (pRS313). A
complementação fenotípica foi feita após clonagem do gene MpATG8 em mutante para o gene
em questão. Os resultados revelaram que a levedura com o fenótipo mutante comporta-se
semelhante às linhagens selvagens, quando transformadas com o gene MpATG8.
vi
ABSTRACT
Macena, Wagner Gonçalves, M.sc., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, November,
2008. CLONING OF MpATG8 GENE OF Moniliophthora perniciosa IN Saccharomyces
cerevisiae AND ANALISYS OF THE VARIATION OF GENETIC EXPRESSION ALONG M.
perniciosa LIFE CYCLE. Advisor: Dra. Cristina Pungartnik. Advisory Committee Members: Dr.
Martin Brendel and Dr. Júlio C. M. Cascardo.
Autophagy is a non-selective transport of cytoplasmatic constituent to a vacuole to provide the
lyses of these constituent aiming the availability of raw material for the maintenance of the basic
functions of the cell. This mechanism is induced due to the lack of nutrients sources such as
carbon, nitrogen, phosphate or sulfate. Disturbances in the autophagyc process could be lethal or
cause pathologies in superior eukaryotic. At least 27 genes are related to autophagy (ATG) and
were identified in the autophagyc process in Saccharomyces cerevisiae; grouped according to its
function: a) non-selective autophagy (17 genes); b) selective autophagy (7 genes); c) degradation
of autophagyc bodies (2 genes). In S. cerevisiae Atg8 protein is essential for the autophagyc
pathway. After a few post-translational modifications, ATG8 promotes the formation of
autophagosome and the delivery to the vacuole and subsequent degradation. The basidiomycete
fungi hemibiotrophic Moniliophthora perniciosa is the witche's broom causing agent, the main
disease affecting cocoa production (Theobroma cacao L.). Recent accumulation of knowledge
on the mechanisms of the phytopathogen interaction suggests the need of an in-depth research
effort to understand physiology and cellular biology of this fungi; which could help the
development of more efficient control of the disease. In order to describe the autophagyc process
in M. perniciosa, genetic expression analyses of MpATG8 was performed using the Real-Time
PCR technique during M. perniciosa in vitro growth (artificial growing system used for the
basidiocarps production). The growth phases in artificial growing system are characterized by
the changes of colors of the media (white, yellow, light rose, dark rose, primordial formation,
basidiocarps production). To induce basidiocarps formation, the fungi spends a period of one
week in absence of hydration. During this period, samples were taken at the day before
beginning the watering absence and at the 10th day after absence of water. Also, M. perniciosa
was grown in different media: 2% of peptone, glucose and glycerol (Media 1); 0,5% of peptone
and glucose (Media 2); and 0,5% of peptone and glycerol (Media 3); samples were taken at 14,
21, 28,35 and 42 days and used for genetic expression analysis and optical microscopy. This
vii
work aimed to demonstrate the existence of the autophagyc mechanism in M. perniciosa, and to
analyze the expression of MpATG8 during the growth in vitro and phenotypic complementation
of ATG8 in yeasts. Genetic expression analysis demonstrated an increased expression of
MpATG8 during growth phases, having its higher expression in the primordial followed by
decreased expression decreased in the basidiocarps phase. Real-Time PCR results showed a
small variation in the genetic expression in Media 1, and a great variation in Medias 2 and 3, as
expected. By using optical microscopy it was possible to observe many morphologic variations
of the hypha as thickening and formation of bubbles along the growth phases, but it was not
established any direct relationship between autophagy and the alterations found. The subcloning
of the amplified fragment of a cDNA library of MpATG8 (730pb) was made in Saccharomyces
cerevisiae with the yeast vector type "shuttle-vector" (pRS313). Phenotypic complementation
was observed after cloning the gene MpATG8 in the yeast mutant atg8Δ. Results reveal that the
yeast with the mutant phenotype behaves as the wild type strains when transformed with the
gene MpATG8.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Autofagia
A sobrevivência de organismos como os fungos dependem da manutenção do
equilíbrio celular, que é conhecido como homeostase. Para isso, é necessário que haja
um controle entre a síntese e a degradação de proteínas, ácidos nucléicos, ribossomos, e
organelas (Ohsumi, 2001; Suzuki e Ohsumi, 2007). A homeostase celular é mantida
através da degradação de constituintes celulares. Em eucariotos existem dois tipos de
mecanismos de degradação: através de proteossomos e lisossomos (Monastyrska et al.,
2005). Os proteossomos são importantes no controle e degradação de proteínas, de
modo que, deficiências neste mecanismo celular podem acarretar doenças em eucariotos
(Dahlmann, 2007). O lisossomo é uma organela dinâmica que está envolvida em
diversas funções fisiológicas, como transporte de enzimas e processos de degradação,
tornado-se fundamental para o equilíbrio celular (Baba et al., 1997).
Existem pelo menos três caminhos diferentes para a degradação lisossomal de
proteínas: a) a rota direcionada citoplasma vacúolo (Cvt); b) a rota de importação
vacuolar para degradação (Vid); e c) a rota da autofagia (Suzuki & Ohsumi, 2007;
Kawamata, et al., 2008). Como resultado da degradação de proteínas e fornecimento de
aminoácidos, a autofagia apresenta-se como uma valiosa estratégia contra ameaças
como patógenos, estresse, tumores, envelhecimento ou acúmulo de proteínas tóxicas
(Reggiori et al., 2005; Hu et al., 2008). Assim, a autofagia é o principal mecanismo de
degradação de proteínas e organelas celulares, e possui papel fundamental para manter
na manutenção da homeostase e desenvolvimento celular durante sua diferenciação
(Alvares et al., 2008b).
A autofagia possui papéis importantes na fisiologia e fisiopatologia de todos os
tipos de células: a) degradação de proteína e organelas, b) morte celular programada
tipos I (apoptose) e II, e c) desenvolvimento, diferenciação e remodelamento celular
(Yang et al., 2005; Reggiori et al., 2005). Já foi demonstrado que a autofagia é uma
resposta transitória, sendo este processo bem caracterizado em leveduras e humanos
(Yang et al., 2005). A autofagia também pode interferir no desenvolvimento normal de
2
vários organismos, podendo afetar, por exemplo, a esporulação em leveduras e a
formação de pupa em Drosophila melanogaster (Yang et al., 2005; Klionsky et al.,
2008).
Duas formas de autofagia envolvendo o rearranjo dinâmico de membranas foram
identificadas em células de eucariotos, são elas: A microautofagia e a macroautofagia
(Levine & Klionsky, 2004). Estes dois mecanismos diferem quanto ao caminho pelo
qual o material citoplasmático é integrado ao compartimento de lise, e possuem em
comum, os passos finais de degradação:
• A microautofagia envolve o engolfamento do citoplasma diretamente na
superfície do vacúolo, por invaginação, protusão e septação (Levine & Klionsky,
2004).
• A macroautofagia envolve a formação de vesículas de dupla membrana
citoplasmática, a qual isola porções do citoplasma. A fusão completa destas
vesículas com o vacúolo, resulta na entrega da vesícula interna (corpo
autofágico) no lúmen do compartimento de degradação (Ohsumi, 2001; Levine
& Klionsky, 2004).
Durante o processo autofágico, ocorre um mecanismo seletivo de captura e
degradação - ubiquitina-proteossomo - e outro não seletivo, a macroautofagia, ou
também chamada autofagia propriamente dita (Suzuki & Ohsumi, 2007). Esse último, é
a principal rota para captura de constituintes citoplasmáticos para degradação no
vacúolo (Ohsumi, 2001). Esta captura acontece através da formação da membrana de
isolamento (IM) e fusão de suas extremidades, formando uma vesícula, que possui
dupla membrana, a qual recebe o nome de autofagossomo (Suzuki & Ohsumi, 2007).
A estrutura pré-autofagossomal (PAS) é ainda pouco caracterizada, contudo,
sabe-se que somente após o surgimento desta estrutura é que acontece a formação da
membrana de isolamento (Figura 1). A PAS serve ainda como local para formação da
membrana da rota Cvt (Levine & Klionsky, 2004). A formação da IM é diferente dos
sistemas de endomembranas já conhecidos (retículo endoplasmático e complexo de
Golgi). Apesar de não se saber ao certo, qual a origem desta membrana, acredita-se na
3
participação significativa do retículo endoplasmático na sua formação (Suzuki et al.,
2001; Levine & Klionsky, 2004; Kawamata, et al., 2008).
Figura 1. Autofagia em Saccharomyces cerevisiae. Representação da formação das membranas de isolamento (IM) a partir da estrutura pré autofagossomal (PAS), e a conclusão do processo autofágico até a degradação dos corpos autofágicos. (i) sinalização de déficit nutricional; (ii) transmissão destes sinais para a maquinaria que formará o autofagossomo, conhecido como o PAS; (iii) geração de uma IM a partir da PAS; (iv) expansão da IM; (v) fusão das extremidades principais da IM para completar formação do autofagossomo; (vi) fusão da membrana exterior do autofagossomo com a membrana vacuolar e liberação subseqüente do corpo autofágico (membrana interna do autofagossomo); (vii) desintegração do corpo autofágico e seu conteúdo; (viii) transportes de aminoácidos resultantes e lipídeos para o citoplasma, para posterior reutilização (adaptado de Suzuki e Ohsumi, 2007).
1.1.1 Mecanismo molecular da macroautofagia
A levedura S. cerevisiae, há muitos anos é utilizada como modelo eucariótico
para estudos bioquímicos, genéticos e de expressão gênica (Bharucha, N., & Kumar, A.,
2007). É de fácil e segura manipulação, e apresenta grande quantidade de informações
sobre o processo autofágico bem como de mutantes para este (Ohsumi 2007). Em S.
cerevisiae existem pelo menos 27 genes relacionados com autofagia (ATG,
“autophagy”) identificados. A maioria se enquadra em três grandes grupos de acordo
com a sua função: a) autofagia não seletiva (17 genes); b) autofagia seletiva (7 genes);
c) degradação de corpos autofágicos (2 genes). Sendo que um gene ainda não está
classificado (Wang, e Klionsky, 2003; Suzuki e Ohsumi, 2007). É interessante notar
que, embora a maioria destes genes tenha sido identificada inicialmente em leveduras,
4
muitos deles são funcionais em eucariotos superiores (Wang & Klionsky, 2003; Levine
& Klionsky 2004; Nair & Klionsky, 2005; Suzuki & Ohsumi, 2007)
Em leveduras S. cerevisiae, bem como em mamíferos, a proteína ATG8
(APG8/AUT7) é essencial para a rota autofágica. Esta proteína sofre uma série de
modificações pós-traducionais, além de promover a formação do autofagossomo e a
entrega deste ao vacúolo, para subseqüente degradação do seu conteúdo (Figura 2)
(Kirisako et al., 2000; Ketelaar et al., 2004). O mutante de levedura S. cerevisiae para o
gene atg8Δ é viável, contudo, não é capaz de fazer autofagia (Wilson et al., 2002).
A proteína ATG8 em S. cerevisiae possui 117 aminoácidos e está presente no
início da formação das membranas de isolamento, tanto do autofagossomo como dos
corpos autofágicos (Kirisako et al., 1999). Estudos de fracionamento celular também
demonstraram que ATG8 é a principal proteína do processo de fechamento da
membrana (Kirisako et al., 2000). Esta característica torna ATG8 boa alternativa para o
estudo de dinâmica de membrana durante autofagia.
Figura 2. Modificações pós-traducionais ocorridas em ATG8 em levedura. ATG4 promove a clivagem na arginina residual do C-terminal de ATG8, posteriormente ATG3 auxilia na conjugação da glicina C-terminal de ATG8 com a fosfatidiletanolamina e, ATG7 (enzima ATP - dependente) ativa ATG12 para conjugação com ATG5 e ATG8 com fosfatidiletanolamina. A presença de aminopeptidase é importante no fechamento do autofagossomo. (modificado de Ketelaar et al., 2004).
5
1.1.1.1. Formação do autofagossomo
Existe ainda discussão quanto à origem das membranas do autofagossomo.
Inicialmente foi proposto que, o retículo endoplasmático liso e o Golgi, representavam a
fonte de membranas para autofagossomo (Klionsky & Emr, 2000). Entretanto, acredita-
se atualmente que o fagóforo, uma organela pouco caracterizada, pode ser a principal
fonte da membrana na formação do autofagossomo e de estruturas relacionadas
(Klionsky & Emr, 2000; Yang et al., 2005). Neste processo, é possível que lipídeos
sejam levados em uma estrutura contendo a proteína ATG9 transmembranar,
fornecendo assim lipídeos à PAS possibilitando a expansão da IM (Reggiori et al.,
2005; Suzuki & Ohsumi, 2007).
A proteína ATG8 após passar pelas modificações pós-traducionais, é conjugada
com fosfatidiletanolamina (PE) e forma a ATG8-PE, que junto com a ATG16
(complexo ATG5-ATG12) associam-se firmemente à membrana de isolamento. A
presença de PE é fundamental, porém não é o único componente que constitui a
vesícula, fazendo-se necessária a incorporação de outros lipídeos. A rota de ATG8-PE
não foi descrita completamente, contudo, é provável que ATG8-PE seja entregue à PAS
no término da formação da IM ou na extremidade em expansão (Figura 2) (Ohsumi,
2001).
Existe também um fixador de proteínas que pode fazer um papel fundamental na
nucleação da vesícula, que é o fosfatidilinositol (PtdIns) 3-kinase complexo I (Kihara et
al., 2001). O fosfatidilinositol 3-fosfato (PtdIns(3)P) é um lipídeo envolvido na
formação do autofagossomo, contudo também não é suficientemente abundante para a
quantidade de lipídeos necessária para a expansão da IM (Suzuki & Ohsumi, 2007; Hu
et al. 2008).
A presença de ATG8-PE também é importante no sistema de conjugação de
ATG12-ATG5. A metade dos genes ATG essenciais para autofagia estão envolvidos
nestes sistemas de conjugação, sendo estes bem conservados em eucariotos. De algum
modo, estes sistemas de conjugação estão interligados, visto que quando algum está
defeituoso o outro não consegue formar a PAS (Yang et al., 2005).
6
1.1.1.2. Sistema de conjugação de ATG8
O processamento de ATG8 é mediado por ATG4 (cisteína protease), através da
clivagem simples na arginina residual, conseqüentemente deixando exposta a glicina no
C terminal de ATG8. ATG8 pode ser ativada por ATG7 (Enzimático -E1), através de
uma reação dependente de ATP e logo transferida a ATG3 (E2) (Figura 2) (Ketelaar et
al., 2004).
Ao contrário do esperado, no passo final do seu processamento, ATG8 não
forma um conjugado com outras proteínas, mas interage com PE, um fosfolipídeo
abundante na membrana. Esta adição de lipídeos conduz a uma mudança
conformacional de ATG8, necessária para a dinâmica da membrana autofágica.
Posteriormente, ATG8 - PE é desconjugada através de ATG4, por quebra lipídeo-
proteína, e provê uma nova fonte de ATG8 no citoplasma (Suzuki & Ohsumi, 2007).
Estes ciclos de conjugação e desconjugação são importantes para a progressão normal
da autofagia (Ichimura et al., 2004).
1.1.1.3. Sinalização da autofagia
Em leveduras e células de mamíferos, a autofagia é um evento biológico
fundamental, que acontece sob condições normais de crescimento. Assim, deve haver
uma seqüência nos mecanismos de receptação de sinais extracelular ou intracelular, de
forma que estes sejam transmitidos aos fatores reguladores, para promoverem ou
inibirem a autofagia, quando for necessário (Huang & Klionsky, 2002).
Existem vários complexos de sinalização e diversas rotas envolvidas na
iniciação e desenvolvimento da autofagia. A proteína fosfatase 2A (PP2A) e o alvo de
rapamicina (TOR destacam-se ao exercer um importante papel para a sinalização do
processo autofágico, porém a peça central nesta rota de sinalização é o TOR (Hansen et
al., 2008). TOR é uma serina/treonina quinase, envolvida na maioria das rotas de
regulação que controlam a resposta em mudanças de condições nutricionais e
metabolismo energético. TOR age como um regulador da autofagia, exercendo sobre
ela, um efeito inibitório (Figura 3) (Hansen et al., 2008). A inativação de TOR é
7
necessária para o prolongamento da membrana pré-autofagossomal e o aumento da
expressão de genes autofágicos específicos, como ATG8 (Hansen et al., 2008).
Figura 3. Representação do funcionamento do mecanismo TOR frente às condições externas de nutrição. TOR é sensível à disponibilidade de nutrientes, mas quando este encontr-se disponível, promove associação de Tap42 com PP2A, ficando a tradução e transcrição ativas. Na falta de nutrientes ou presença de rapamicina, Tap42 não é fosforilada e PP2A então defosforila outras proteínas, que eventualmente conduzem a uma variedade de respostas anti-proliferativas, e induz a autofagia (adaptado de Rohde et al., 2001).
Com o entendimento do processo autofágico, este tem sido amplamente
relacionado a vários processos biológicos, como o estresse nutricional; apresentação de
antígenos; defesa contra bactérias invasoras, vírus, e outros patógenos intracelulares;
diferenciação e no desenvolvimento celular (Picazarri et al., 2008). Em organismos
multicelulares este processo também se encontra relacionado à neurodegeneração,
cardiopatias, infecções por patógenos, desordens musculares, câncer, e morte celular
não apoptótica (Alvares et al., 2008b). Em plantas é ativado para a reciclagem de
nutrientes, senescência, e indução à resposta hipersensível (Fujioka et al., 2008).
8
Conservada ao longo de bilhões de anos, a autofagia desempenha um papel
indispensável em eucariotos (Alvares et al., 2008a). Como a autofagia está envolvida na
diferenciação celular em eucariotos superiores, é possível que ela também esteja
envolvida nos processos de diferenciação ao longo das fases de desenvolvimento dos
parasitas. É o que se observa em Trypanosoma cruzi, uma vez que a autofagia está
substancialmente aumentada durante a diferenciação para mudança de fase deste
parasita (Alvares et al., 2008b). Devido a este importante papel para a diferenciação e
sobrevivência de Trypanosoma cruzi, sugere-se que a inibição da autofagia pode ser
considerada uma estratégia moderna para tratamento de infecções causadas por T. cruzi
(Alvares et al., 2008a).
A autofagia também tem sido estudada no processo de infecção de Oryza sativa
pelo fitopatógeno Magnaporthe grisea, onde a mitose, e a morte celular - mediada por
autofagia - é essencial para formação do apressório. O apressório medeia a penetração
do fungo no hospedeiro. Em cepas mutantes para genes envolvidos no processo
autofágico (MgATG8 e MgATG1), há a formação de apressório, mas este é ineficiente
no processo de penetração em Oryza sativa (Veneault-Fourrey et al., 2006; Liu et al.,
2007). Do mesmo modo, mutantes Clk1 (homólogo do MgATG1) de Colletotrichum
lindemuthianum, também não conseguem causar doença em Phaseolus vulgaris, devido
à incapacidade do apressório em mediar a penetração na cutícula do hospedeiro
(Dufresne et al., 1998).
1.2. O fungo Moniliophthora perniciosa
O fungo causador da doença vassoura-de-bruxa foi descrito em 1915 por Stahel,
como Marasmius perniciosus. Em 1942, Singer o reclassificou como Crinipellis
perniciosa (Stahel) (Singer, 1942) e em 2005 ele recebeu o nome atual: Moniliophthora
perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora (Aime e Phillips-Mora, 2005).
Taxonomicamente, M. perniciosa é classificado na divisão Eumycota,
subdivisão Basidiomycotina, classe Basidiomycetes, subclasse Homobasidiomycetidae,
ordem Agaricales e família Tricholomataceae (Purdy e Schmidt, 1996). Baseado em
caracteres morfológicos, Pegler (1978) descreveu três variedades para esta espécie:
Crinipellis perniciosa var. perniciosa, C. perniciosa var. ecuatoriensis e C. perniciosa
9
var. citriniceps. Todas são fitopatógenos de cacaueiro (Theobroma cacao L.) causando a
doença vassoura-de-bruxa.
M. perniciosa é um fungo hemibiotrófico com dois tipos de micélios: o
biotrófico (parasítico) e o necrotrófico (saprofítico) (Kilaru & Hasenstein, 2004). O
ciclo de vida do fungo inicia-se com a germinação dos basidiósporos sobre a base dos
tricomas ou as cuticulas, com posterior penetração nos estômatos, tecidos lesados ou de
forma direta (Sreenivasan & Dabydeen, 1989). Estes tubos germinativos penetram em
tecidos meristemáticos formando um micélio haplóide, que invade os espaços
intercelulares do tecido, com hifas irregulares monocarióticas (Figura 4), e com
ausência de grampos de conexão (Figura 5a) (Silva & Matsuoka, 1999). A planta
infectada sofre perda de dominância apical, resultando em super brotação, chamada de
vassoura verde, além de anomalias em frutos e almofadas florais (Evans & Bastos,
1979).
O crescimento de M. perniciosa dicariótico, dá origem a um micélio de fase
secundária (saprotrófico), no qual as hifas são mais finas e apresentam grampos de
conexão (Figura 5b) (Silva & Matsuoka, 1999). Nesta fase, M. perniciosa causa
necrose, apodrecimento e morte dos tecidos afetados da planta, formando as vassouras
secas. Unicamente nesta fase da vida do fungo e após um período de seca, aparecem os
basidiomas, os quais produzem numerosos esporos que disseminam cada vez mais a
doença (Andebrhan & Furtek, 1994; Orchard et al., 1994).
10
Figura 4. Ciclo de vida de M. perniciosa em T. cacao (Cotomacci, 2004). As setas indicam os estágios do desenvolvimento: 1) Formação dos basidiósporos (Delgado, 1976); 2) Dispersão e infecção dos esporos no cacaueiro; 3) Germinação do esporo penetrando o tecido vegetal através dos estômatos e formando o micélio monocariótico intercelular; 4) Hipertrofia e hiperplasia do tecido cacaueiro, vassoura verde; 5) Formação do micélio dicariótico intracelular através de grampo de conexão; 6) Necrose do tecido cacaueiro formando a vassoura seca; 7) Período de condições ambientais favoráveis, como umidade e luz; 8) Formação do basidiocarpo; 9) Basidiocarpo maduro.
11
Figura 5. Morfologia das hifas de M. perniciosa (a) micélio haplóide de M. perniciosa (corado com vermelho Congo) proliferando dentro de um ramo de vassoura verde em Theobroma cacao. Escala = 10 µm. (b) micélio saprofítico de M. perniciosa com grampos de conexões. Escala = 2 µm (adaptado de Griffith, 2004).
Quando a doença é estabelecida em uma plantação, a produção sofre queda de
até 90% (Griffith et al., 2003). Devido à grande importância econômica da vassoura-de-
bruxa, numerosos esforços têm sido realizados na tentativa de estabelecer um plano de
controle efetivo e economicamente viável para esta doença (Purdy e Schmidt, 1996).
Um exemplo é o estudo de controle biológico, como o caso de Trichoderma
stromaticum, um parasita de basidiocarpos e micélio de M. perniciosa (Sanogo et al.,
2002).
A estratégia de controle considerada mais promissora foi o uso de variedades de
cacaueiros resistentes a M. perniciosa. Alguns clones de cacaueiros resistentes foram
distribuídos para os produtores da Bahia através da CEPLAC (Comissão Executiva de
Planejamento da Lavoura Cacaueira) (Oliveira & Luz, 2005).
No Equador, demonstrou-se que variedades resistentes podem tornar-se
suscetíveis ao longo de várias gerações (Bartley et al., 1986). Um estudo demonstrou
que a variabilidade genética de M. perniciosa na Bahia é muito baixa (foram
encontrados apenas dois genótipos), ao contrário da variabilidade encontrada na região
amazônica (Rincones et al., 2006). Estes dados indicam que estes clones resistentes,
podem ser muito sensíveis às novas introduções do fungo proveniente da Amazônia
12
(Rincones et al., 2006). As pesquisas realizadas até o momento não têm mostrado
opções de controle efetivo, devido principalmente à falta de conhecimentos sobre a
biologia básica do fungo e da sua interação com o hospedeiro. Para contribuir com os
conhecimentos genéticos, criou-se o Programa Genoma da Vassoura-de-bruxa
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura), que visou seqüenciar o genoma do fungo e do
hospedeiro. A partir deste trabalho inicial, pesquisas de diferentes áreas têm sido
desenvolvidas, como biologia celular, morfologia, bioquímica, fisiologia vegetal e
genética molecular, tendo diversos pesquisadores envolvidos (Filho et al., 2005; Melo et
al., 2006; Garcia et al., 2005; Ceita et al., 2006; Rincones et al., 2006; Gesteira et al.,
2007; Lopes et al., 2008; Pirovani et al., 2008).
O genoma de M. perniciosa foi parcialmente seqüenciado, possibilitando
análises moleculares de genes de interesse e direcionamento de novos projetos com o
intuito de elucidar a biologia deste organismo. Esforços foram feitos nos últimos anos
para entender a base biológica e molecular do fungo e a interação planta-patógeno
(Filho 2005; Melo et al., 2006; Garcia et al., 2007; Gesteira et al., 2007; Santos et al.,
2008; Lopes et al., 2008; Pirovani et al., 2008).
13
2. OBJETIVO GERAL
Analisar a variação da expressão gênica de MpATG8 durante as diferentes fases
de crescimento de Moniliophthora perniciosa, bem como realizar a expressão
heteróloga deste, na levedura Saccharomyces cerevisiae.
2.1. Objetivos Específicos
• Analisar quantitativamente a variação da indução da expressão gênica durante as
diferentes fases de crescimento de Moniliophthora perniciosa;
• Caracterizar a expressão heteróloga de MpATG8 no mutante atg8Δ de S.
cerevisiae.
14
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Linhagens, plasmídeos e primers utilizados
As linhagens de bactéria e leveduras que foram utilizadas neste trabalho,
encontra-se descritas na Tabela 1. Os plasmídeos e primers que foram utilizados neste
trabalho estão descritos na Tabela 2. Os pares de primers Actina e pDNR-LIB foram
sintetizados por (Integrated DNA Technologies), já o par de o primer ATG8 foi
sintetizado por (Bioneer Oligo Synthesis Report).
Tabela 1. Linhagens de bactéria e leveduras.
Bactéria
Linhagem Características
DH5α lacZM15(lacZY A-argF) recA1 end A1 hsdR17(r k, m k+) phoA supE44 thi gyr A96 relA1
Leveduras Linhagem Características Fonte
BY10000 MAT α his 3Δ 1 leu 2Δ 0 lys 2Δ 0 ura 3Δ 0 EUROSCARF
BYatg8Δ MAT a his 3Δ 1 leu 2Δ 0 met 15Δ 0 ura 3Δ 0 YBL078w::KanMX4
EUROSCARF
WM001 MAT α his 3Δ 1 leu 2Δ 0 lys 2Δ 0 ura 3Δ 0 pRS313 Este trabalho
WM002 MAT α his 3Δ 1 leu 2Δ 0 lys 2Δ 0 ura 3Δ 0 V002 Este trabalho
WM003 MAT a his 3Δ 1 leu 2Δ 0 met 15Δ 0 ura 3Δ 0 YBL078w::KanMX4 V002
Este trabalho
WM004 MAT a his 3Δ 1 leu 2Δ 0 met 15Δ 0 ura 3Δ 0 YBL078w::KanMX4 pRS313
Este trabalho
Tabela 2. Plasmídeos e primers utilizados neste trabalho
Plasmídeos
Plasmídeo Origem Hospedeiro Características / Composição pRS313 S. cerevisiae E. coli
S. cerevisiae 4967PB; HIS3 –f1 ori(NaeI) –T7 promotor -LacZ /MCS -T3 promotor – pMB1 ori –bla – CEN6 –ARSH4
pGEM-T Easy
E. coli E. coli 3015PB;Ampr -f1 ori(NaeI) –T7 promotor – LacZ
V001 E. coli E. coli Ampr -f1 ori(NaeI) –T7 promotor – LacZ / (pGEM-T Easy::MpATG8)
V002 S. cerevisiae E. coli S. cerevisiae
HIS3 –f1 ori(NaeI) –T7 promotor -LacZ /MCS -T3 promotor – pMB1 ori –bla – CEN6 –ARSH4 / (pRS313::MpATG8)
15
Primers Primers Forward (F) Reverse (R) Produto Tm ºC pDNR-LIB
5'ATCAGTCGACGGTACCGGAC3’
5' ACAGCTATGACCATGTTCAC 3’ 800 pb 58,5 F 49,3 R
ATG8 5’ATTCAAGGATGAGCACCCC3’ 5’ TGACATAGACGAATTGGCCC 3’ 180 pb 55,0 F 54,5 R
Actina 5' CCATCTACACCACAATGGAGGA 3' 5´CCCGACATAGGAGTCCTTCTG3' 150 pb 58,4 F 57,3 R
3.2. Condições de cultivo
3.2.1. Bactéria
3.2.1.1. Escherichia coli
Para o cultivo bacteriano foram utilizados os seguintes meios: LB (10 g/L
triptona bacteriológica, 5 g/L extrato de levedura, 10 g/L NaCl, ágar 20 g/L) e LBA (LB
acrescido de ampicilina na concentração de 100 µg/mL). Após preparo dos meios,
aferiu-se o pH para 7,5 e foram autoclavados por 15 minutos a 121ºC a 1 atm. No
preparo de LBA, somente após a autoclavagem do meio LB e posterior resfriamento que
adicionava-se 100 µg/mL de ampicilina. As bactérias DH5-α foram inoculadas em meio
líquido por 16 h a 37ºC 180rpm, após este período foram estocadas em glicerol 25% e
armazenadas a -20ºC. Para se ter meio sólidos, estes eram autoclavados com 2% de
Ágar.
3.2.2. Fungos
3.2.2.1. Saccharomyces cerevisiae
Para cultivo de leveduras foram utilizados os meios: YPD (20 g/L glicose, 10
g/L peptona, 20 g/L extrato de levedura), SC (1,7 g/L base nitrogenada para leveduras
sem aminoácidos e sem sulfato de amônia, 5 g/L sulfato de amônia, 20 g/L dextrose,
0,04 g/L hemisulfato de adenina, 0,02 g/L L-histidina, 0,06 g/L L-leucina, 0,03 g/L L-
Lisina, 0,04 g/L L-Triptofano, 0,02 g/L Uracil) e SC-His (meio SC sem o aminoácido
histidina). Para os meios SC e SC-His cada aminoácido foi preparado isoladamente,
16
unindo todos os constituintes deste meio, somente depois de autoclavados. Todos os
meios e aminoácidos foram previamente autoclavados por 15 minutos a 121ºC a 1 atm.
Para se ter meio sólidos, estes eram autoclavados com 2% de Agar.
De cada estoque de levedura BY10000 e BYatg8Δ (isogênico da BY10000),
foram coletadas 100 µL e inoculados em meio sólido YPD, e colocado para crescimento
a 30°C por 24 h. Para crescimento exponencial coletou-se uma colônia isolada e
inoculou-a em 10 mL de meios líquidos YPD, SC e SC-His. Incubou-se a 30ºC por 18h,
sem agitação, até atingir 1-2 x 107 células/mL e cerca de 30% de brotos, os quais foram
contados utilizando-se câmara de Neubauer e microscópio óptico. Para crescimento até
fase estacionária, coletou-se uma colônia isolada e inoculou-a em 10 mL de meios
líquidos YPD, SC e SC-His, incubou-se a 30ºC por 72hs sem agitação.
3.2.2.2. Moniliophthora perniciosa
Para o cultivo de M. perniciosa foram utilizados os seguintes meios: CPD (2%
ágar, 2% de peptona e 2% de glicose), meio 1 (2% ágar, 2% de peptona, 2% de glicose e
2% de glicerol ), meio 2 (2% ágar, 0,5% de peptona e 0,5% de glicose) e meio 3 (2%
ágar, 0,5% de peptona e 0,5% de glicerol). Todos os meios foram autoclavados por 15
minutos a 121ºC a 1 atm e plaqueados em placas de Petri estéreis. O fungo foi
inoculado em meio CPD e após 8 dias de crescimento, coletou-se uma amostra de 0,5
cm² do micélio foi retirada das extremidades e re-inoculada no centro de uma placa de
Petri contendo os meios: meio 1, meio 2, meio 3. Incubou-se a 25ºC até os períodos de
coleta 14, 21, 28, 35 e 42 dias.
O meio de crescimento do fungo dicariótico para produção de basidiocarpo in
vitro (meio bolachas) foi feito de acordo com Niella, et al., (1999).O meio e composto
de: 37% de vassoura seca moída (colhida no campo), 1,5% CaSO4. 2.H2O, 9,9% aveia
em flocos, 51,7% água; foi preparado unindo todos estes compostos, homogenizando-os
e eram colocados em placas de Petri de vidro. Foi autoclavados por 15 minutos a 121ºC
a 1 atm. Nestes foram feitos 5 inóculos de aproximadamente 0,5 cm², oriundos do
micélio crescido em CPD. Posteriormente foram incubados a 25ºC, até o fungo crescer
por toda a placa. Foram então pendurados no inferior de frascos previamente
esterilizados, e incubados a 25ºC com fotoperíodo de 12 horas (claro e escuro), regados
17
a cada dois dias com auxílio de seringa contendo 20 mL deágua, ambos estéreis.
Coletou-se parte do micélio para extração de RNA nas seguintes fases: branca (período
de 15 dias pós inoculado), amarela (18 dias pós inoculado), rosa (22 dias pós
inoculado), antes do tratamento (25 dias pós inoculado - ficou um período de dez dias
sem molhar o meio), pós-tratamento (35 dias pós inoculado - momento em que os meios
voltaram a ser molhados), primórdio (56 dias depois de inoculado), e basidiocarpo (59
dias pós inoculado).
3.3. Microscopia óptica
As observações foram feitas utilizando-se o microscópio óptico Olympus CX41.
As lâminas foram preparadas a partir do fungo M. perniciosa cultivado nos meios 1, 2 e
3 nos períodos pré-determinados de crescimento (14, 21, 28, 35 e 42 dias). Amostras de
1cm2 foram retiradas do micélio com auxílio de lâmina de bisturi estéril. A amostra foi
colocada em lâmina de vidro, e observou-se ao microscópio sem auxilio de corante.
Foram utilizados os aumentos de 100X, 200X e 400X. As imagens foram capturadas
utilizando-se a câmera Olympus C7070WZ.
3.4. Análises de bioinformática
A análise de bioinformática iniciou-se com a pesquisa no banco de dados do
projeto genoma da vassoura-de-bruxa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura). Pesquisou-se genes envolvidos no processo autofágicos de M. perniciosa. Para analisar
a semelhança do gene encontrado com genes de outros organismos, utilizou-se
ferramentas do NCBI (The National Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) como tBlastX, usada para pesquisar seqüências
similares a MpATG8, e ORF Finder, utilizada para encontrar o quadro aberto de leitura
do gene. As seqüências de proteínas foram alinhadas utilizando-se o programa de
alinhamento de seqüências Clustal W2 (www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html).
Com o conhecimento do quadro aberto de leitura, foi possível desenhar o par de primers
ATG8, que também foi utilizado na técnica de PCR em tempo real.
18
A relação filogenética das seqüências foi determinada pelo programa MEGA
(Tamura et al., 2007), já a massa molecular e o ponto isoelétrico da proteína deduzida,
identificados com o auxílio da ferramenta de bioinformática Translate tools
(www.expasy.ch/tools/dna.html).
3.5. Análises moleculares
3.5.1. Extração de RNA, e RT-qPCR
A extração de RNA foi feita a partir de dois tipos de amostras: As cultivadas em
meios 1, 2 e 3, e as crescidas em meio bolacha. Dentre as amostras cultivadas em meio
bolacha, coletou-se uma amostra de cada fase de crescimento, caracterizado pela
coloração do micélio e o tratamento submetido, (item 3.2.2.2). Já as amostras dos meios
sintéticos 1, 2 e 3 foram coletadas nos períodos pré-estabelecidos, todas as amostras
foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e estocadas a -80ºC. Para a
extração de RNA, todas as amostras foram maceradas em nitrogênio líquido e
imediatamente submetidas à extração de RNA utilizando-se o kit de extração da
Ambion (RiboPure™ Kit).
As alíquotas de RNAs totais, de todas as amostras extraídas, foram tratadas com
DNAse I - RNAse Free (Fermentas®), seguindo as instruções do fabricante. Os RNAs
tratados foram visualizados em gel de agarose a 1% em tampão 1X TAE (Tris-Acetate -
Tris 40mM, Ac. Acetico 20mM, EDTA 1mM) por 40 minutos a 80 V, para verificar a
eficácia do tratamento.
A síntese de cDNA foi realizada utilizando-se 300 ng de RNA total, 20 unidades
de inibidor de RNAse (Fermentas®), 1 mmol/L de dNTPs Mix, 0,5 µg de primers oligo
(dT) e 200 unidades de RevertAidTMH Minus M-MuLV (Fermentas®). A reação foi
incubada a 42ºC por 60 minutos, em seguida incubou-se a 70ºC por 10 minutos.
3.5.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Realizou-se a técnica de PCR a fim de obter o gene MpATG8 e de confirmar a
inserção do mesmo em leveduras e bactérias, utilizando-se os pares de primers pDNR-
LIB e ATG8 respectivamente (Tabela 2).
19
A PCR foi realizada em termociclador Eppendorf MasterCycler®, utilizando-se
em cada reação as seguintes condições de tempo e temperatura: 1 ciclo de 95ºC por 5
min, 35 ciclos de 95ºC por 40 s, 58ºC por 45 s, e 72ºC por 45 s, finalizando com 1 ciclo
de 72°C por 10 minutos. A PCR foi amplificada contendo as seguintes proporções de
reagentes: 2,5 µL de tampão 10X da reação para a Taq DNA polimerase (100 mM Tris-
HCl, pH 8,8 a 25°C, 500 mM KCl, 0,8%) concentração final de 1X; 1 mM de cloreto de
magnésio (MgCl2), 0,2 μM/L de cada primer, 0,4 mM/L de deoxinucleotídeos (dATP,
dTTP, dCTP e dGTP), 2 unidades de enzima Taq DNA polimerase (Fermentas®) e água
ultra pura estéril para um volume final de 25 μL. Como molde para cada reação
utilizou-se 50 ng do DNA alvo. Realizou-se eletroforese em gel de agarose de 1,0 % a
80V por 40 minutos, corado com 0,5 µg/mL de Brometo de Etídio e os fragmentos
foram visualizados em transluminador de luz UV.
3.5.3. PCR em tempo real
A PCR em tempo real foi realizada no equipamento ABI PRISM 7500 Sequence
Detection System® (Applied Biosystems, Foster City, CA). O pare de primer utilizados
para detecção da expressão do gene MpATG8, foi ATG8 e o par de primer Actina para
expressão do gene constitutivo (Tabela 2). As reações continham um volume final de 25
µL, sendo composta por: 0,2 mM de cada primer, 3 ng de cDNA e 12,5 µL SYBR
Green (Master Mix (Applied Biosystems®) e água ultra pura estéril para completar o
volume fnal. Utilizou-se as seguintes condições de tempo e temperatura: 94ºC por 10
min para ativação da enzima Taq (Amplitaq Gold®); 40 ciclos de 94ºC por 45s para
desnaturação e 60ºC por 45s para anelamento e extensão. Todas as reações foram feitas
em triplicatas e de uma amostra biológica, analisadas quanto à presença de dímeros de
primers ou amplificações inespecíficas por meio de curvas de dissociação. O amplicon
do gene ATG8 possui Tm 80ºC, já o amplicon do gene da Actina 84,4ºC. O controle
negativo da reação foi processado seguindo os mesmos padrões acima citados. Os dados
gerados no equipamento foram coletados e analisados usando o Software 7500 System
SDS software (Applied Biosystems®, Foster City, CA).
20
3.5.4. Amplificação e transformação de bactéria
Uma colônia isolada de E. coli DH5α, cultivada em meio LB sólido, foi
inoculada em 3mL de meio LB líquido e incubada a 37ºC por 15 h, 180 rpm. Em
seguida transferiu-se a cultura para 300 mL de meio LB líquido. Incubou-se à 37ºC sob
agitação de 180 rpm, até atingir fase exponencial de crescimento (0,5 a 0,7 de
absorbância em 600 nm de comprimento de onda). Após centrifugação, as células
precipitadas foram lavadas 3 vezes com solução de CaCl2 0,1 mol/L para remoção do
meio de crescimento e incubadas em 50 mL de CaCl2 0,1 mol/L por 30 min a 4ºC, sendo
novamente centrifugadas a 5000 rpm por 5 min. Descartou-se o sobrenadante e
ressuspendeu-se o precipitado em 5 mL de CaCl2 0,1 mol/L, ao qual adicionou-se
glicerol estéril para uma concentração final de 15%. Foram feitas alíquotas de 250 µL e
estocou-se a -80ºC.
Para a transformação bacteriana utilizou-se uma alíquota das células cálcio
competente, e adicionou-se a esta, 200 a 1000 ng de DNA plasmidial. Homogenizou-se
e foi dado um choque térmico colocando a 42ºC por 45 seg. e imediatamente em gelo
por 5 min. Adicionou-se 1 mL de meio LB e incubou-se a 37ºC por 1 h a 180 rpm. Após
transformação, realizou-se centrifugação por 30 segundos a 5000 rpm, descartou-se o
sobrenadante e adicionou-se 200 µL de água ultra pura estéril às células. A amostra foi
plaqueada em meio sólido LBA, com IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) e
X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranosideo) como substrato para a enzima
β-galactosidase, nas concentrações de 200 μg/mL e 20 μg/mL, respectivamente. Em
seguida as placas foram incubadas a 37°C por 16 h.
3.5.5. Extração de plasmídeos de bactérias
Para extração de DNA plasmidial, os clones transformados foram cultivados em
3 mL de meio LB 15h, 37oC, com agitação orbital, 180 rpm. A amostra foi centrifugada
a 13000 rpm por 20s e o precipitado foi ressuspendido em 100 µL de Solução I
(Sacarose 50 mM, Tris HCl 25 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0) e incubado a 25°C por 5
min. Adicionou-se 200 µL de Solução II (NaOH a 0,2 N, 1% de SDS-Dodecil sulfato de
sódio) gelada e incubou-se a 4°C, por 5 min. A reação foi neutralizada com 150 µL de
Solução III (294,42 g/L de acetato de potássio e 115 mL/L de ácido acético glacial, pH
21
4,8) e mantida a 4°C, por 5 min. Centrifugou-se a 13000 rpm por 1 min e o
sobrenadante recuperado. Em seguida o sobrenadante foi precipitado com 0,9 mL de
etanol absoluto a -20°C por 30 min, e logo centrifugado a 13000 rpm durante 1 min. O
precipitado foi lavado em etanol 70%, seco em fluxo de exaustão e ressuspenso em 40
µL de água ultra pura estéril, estocou-se a -20°C.
3.5.6. Transformação de levedura
Uma colônia isolada de cada linhagem de levedura (BY10000 e BYatg8Δ)
cultivada em meio YPD solido, foi inoculado de 10 mL em meio YPD líquido a 30°C
por 12 -16 h, até atingir 2 a 6 x 107 células/mL. Centrifugou-se 3 mL da cultura a 5000
rpm por 5 min. e ressuspendeu-se em 1 mL de água estéril. Centrifugou-ses por 5 min.a
5000 rpm, descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu novamente em 1 mL de acetato
de lítio a 0,1 M. Centrifugou-se nas mesmas condições e ressuspendeu-se em 0,5 mL de
polietileno glicol (PEG) a 50% e acetato de lítio a 0,1M. Para transformação, adicionou-
se às células, 100 µg de DNA de esperma de salmão e 200 a 1000 ng de DNA
plasmidial. Incubou-se a 25°C por 15 min. e imediatamente submeteu-se a um choque
térmico a 42°C por 15 minutos. Centrifugou-se por 10 seg. a 3000 rpm, ressuspendeu-se
em 0,5 mL de TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0). Semeou-se em meio sólido
seletivo (SC-His) e incubou-se a 30ºC por 96 horas.
3.6. Clonagens específicas
3.6.1. Subclonagem em vetor de transformação
Para o preparo do plasmídeo V001, foi necessário obter o inserto (MpATG8)
através de uma reação de amplificação, utilizando-se o par de primers pDNR-LIB
(Tabela 2) a partir do cDNA do clone presente na biblioteca integrante do projeto
vassoura-de-bruxa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/). O fragmento amplificado
apresentou um tamanho aproximado de 850 pb. O produto da amplificação foi ligado ao
vetor de clonagem pGEM-T easy (Figura 6), utilizando-se 0,5 µg de vetor, 1 µg inserto,
1 µL de tampão 10X da enzima T4 DNA ligase, 10 U de T4 DNA ligase e completou-se
o volume para 10 µL com água ultra pura estéril. Incubou-se por 16 h a temperatura
ambiente e posteriormente a 65ºC por 10 min. Em seguida o plasmídeo V001 foi
22
introduzido em bactéria E. coli DH5α, através de transformação. A amostra foi
plaqueada em meio sólido LBA, com IPTG e X-gal. Em seguida a placa foi incubada a
37°C por 16 h.
As colônias brancas (possíveis transformantes) foram coletadas e inoculadas em
meio LBA líquido, por a 15 h a 37ºC, 180 rpm, em seguida adicionou-se glicerol estéril
para uma concentração final de 25%, e estocou-se em microtubos a -20 ºC.
Para confirmação dos clones transformantes, inoculou-se 30 µL do estoque em
3mL de meio LBA a 37 ºC por 15 h a 180 rpm, seguido de extração plasmidial. Os
plasmídeos extraídos foram digeridos com EcoRI nas seguintes condições de reação: 1
µg de vetor , 2 µL de tampão 10X, 10U de EcoRI e completou-se o volume para 20 µL
com água ultra pura estéril. Incubou-se por 16 h a 37ºC e posteriormente a 65ºC por 10
min. Foi realizada eletroforese em gel de agarose 1,0 % a 80 V por 30 minutos, sendo
os fragmentos visualizados em transluminador de luz UV. O fragmento de 850 pb
(MpATG8) oriundo da digestão foi recuperado através de purificação de gel, utilizando-
se o kit (SV Gel and PCR Clean-Up System) seguindo as instruções do fabricante
(Promega Wizard®).
Figura 6. Vetor pGEM-T easy utilizado na clonagem de MpATG8.
3.6.2. Subclonagem em vetor de expressão em levedura
23
O plasmídeo V002 foi obtido a partir da ligação do vetor pRS313 (figura 7)
digerido com EcoRI (figura 19), e posteriormente ligado a um inserto de
aproximadamente 850 pb, oriundo da digestão de V001, também com EcoRI (Figura
19). As condições da digestão foram às seguintes: 1 µg de vetor, 2 µL de tampão 10X,
10U de EcoRI e completou-se o volume para 20 µL com água ultra pura estéril.
Incubou-se por 16 h a 37ºC e posteriormente a 65ºC por 10min. Já as condições
utilizadas para a ligação foram: 0,5 µg de vetor, 1 µg inserto, 1 µL de tampão 10X, 10
U de T4 DNA ligase, e completou-se o volume para 10 µL com água ultra pura estéril.
Incubou-se por 16 h a temperatura ambiente em seguida a 65ºC por 10 min.
Após o preparo do plasmídeo V002 o mesmo foi inserido em bactéria E. coli
DH5α, seguindo a mesma metodologia do item 3.5.4. As colônias brancas foram
coletadas e inoculadas em meio líquido LBA crescidas a 37ºC por 15 h a 180 rpm, em
seguida adicionou-se glicerol estéril para uma concentração final de 25%, e estocou-se
em microtubos a -20 ºC. Para confirmação da transformar dos clones, foram feitos PCR
de colônias brancas, utilizando-se par de primers ATG8 (Figura 21).
24
Figura 7. Vetor para transformação de bactérias e leveduras.
3.6.3. Obtenção de clones de levedura contendo o gene de interesse
O plasmídeo V002 inserido na bactéria DH5α, foi extraído após cultivo
bacteriano, introduzido em leveduras BY10000 e BYatg8Δ, recebendo os nomes
WM001 e WM003 respectivamente. Leveduras BY10000 e BYatg8Δ também foram
transformadas com o vetor pRS313, recebendo os nomes WM002 e WM004
respectivamente. Os clones de leveduras foram transformados conforme protocolo
descrito no item 3.5.4. Em seguida as colônias transformadas foram inoculadas em meio
líquido SC-His, a 30ºC por 72 h a 180 rpm. Posteriormente foram estocadas em glicerol
estéril a 25% e armazenados a -20ºC. A transformação do clone WM003 foi confirmada
por técnica de PCR, utilizando-se o par de primer ATG8 (Figura 22).
3.6.4. Exposição a mutagênico e sobrevivência
3.6.4.1 Teste semi-qualitativo com levedura
Os clones WM001, WM002, WM003, WM004 após crescidos até fase
estacionária foram diluídos seriadamente (1x106, 1x105, 1x104, 1x103, 1x102
células/mL). Quando crescidos até fase exponencial foram diluídos a (1x106, 1x105,
1x104, 1x103 células/mL). Os clones foram expostos a paraquat (dicloreto de 1,1’-
dimetil-4-4’-bipiridina) aplicando-se 10 µL de cada diluição em meio sólido SC-His
contendo (0 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM de paraquat). Em seguida as placas foram
incubadas a 30ºC por 96 horas.
4. R
4.1.
4.1.
par p
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L. bicolor DQISITHAVSTMRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYPDRIPVICEKADRTDIPTIDKKKY 60 M. perniciosa -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYPDRIPVICEKADRTDIPTIDKKKY 49 C. cinerea -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYPDRIPVICEKADRTDIPTIDKKKY 49 U. maydis -----------MRSAFKNEHSFEKRKAEAERIRQKYPDRIPVICEKADRTDIPTIDKKKY 49 G. lindemuthiana -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYSDRIPVICEKVEKSDIATIDKKKY 49 P. anserina -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYADRIPVICEKVEKSDIATIDKKKY 49 N. fischeri -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYADRIPVICEKVEKSDIATIDKKKY 49 P. chrysogenum -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYADRIPVICEKVEKSDIATIDKKKY 49 P. nodorum -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYNDRIPVICEKVEKSDIATIDKKKY 49 S. sclerotiorum -----------MRSKFKDEHPFEKRKAEAERIRQKYSDRIPVICEKVEKSDIATIDKKKY 49 A. thaliana ----------MAISSFKHEHPLEKRQAEAARIREKYPDRIPVIVERAEKSDVPDIDKKKY 50 * **.**.:***:*** ***:** ****** *:.:::*:. ****** L. bicolor LVPSDLTVGQFVYVIRKRIKLAPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSAIYEEHKDEDNFLYVSY 120 M. perniciosa LVPSDLTVGQFVYVIRKRIKLAPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSAIYEEHKDEDNFLYVSY 109 C. cinerea LVPSDLTVGQFVYVIRKRIKLAPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSAIYEEHKDEDNFLYVSY 109 U. maydis LVPSDLTVGQFVYVIRKRIKLAPEKAIFIFVDEVLPATAALMSAIYEEHKDEDGFLYVSY 109 G. lindemuthiana LVPADLTVGQFVYVIRKRIKLSPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSSIYEEHKDEDGFLYITY 109 P. anserina LVPADLTVGQFVYVIRKRIKLSPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSSIYEEHKDEDGFLYITY 109 N. fischeri LVPADLTVGQFVYVIRKRIKLSPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSSIYEEHKDEDGFLYITY 109 P. chrysogenum LVPADLTVGQFVYVIRKRIKLSPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSSIYEEHKDEDGFLYITY 109 P. nodorum LVPADLTVGQFVYVIRKRIKLSPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSSIYEEHKDEDGFLYITY 109 S. sclerotiorum LVPSDLTVGQFVYVIRKRIKLSPEKAIFIFVDEVLPPTAALMSSIYEEHKDEDGFLYISY 109 A. thaliana LVPADLTVGQFVYVVRKRIKLSPEKAIFIFVKNILPPTAAIMSAIYEEHKDEDGFLYMSY 110 ***:**********:******:*********.::**.***:**:*********.***::* L. bicolor SGENTFGQEGWVELPVDDMD-- 140 M. perniciosa SGENTFGQEGWIELPSDS---- 127 C. cinerea SGENTFGQEDWIELPLDA---- 127 U. maydis SGENTFGQL------------- 118 G. lindemuthiana SGENTFGGFETA---------- 121 P. anserina SGENTFGGFETA---------- 121 N. fischeri SGENTFGDC--------------118 P. chrysogenum SGENTFGDL--------------118 P. nodorum SGENTFGEAI------------ 119 S. sclerotiorum SGENTFGEALEEAN-------- 123 A. thaliana SGENTFGIFF------------ 120
******* Figura 9. Alinhamento de múltiplas seqüências de aminoácidos de diferentes organismos utilizando o software ClustalW. Os resíduos marcados em asterisco (*) representam os aminoácidos conservados em todas as espécies alinhadas. Os números de acesso de cada organismo são os mesmos mostrados na Tabela 3.
Tabela 3 - Análise e comparação de alinhamento das seqüências de aminoácidos em
relação à proteína MpATG8 utilizando Clustal W2
Espécie Acesso NCBI Aminoácidos Similaridade % Coprinopsis cinerea XP_001833603.1 127 97 Laccaria bicolor AAB53650.1 195 97 Ustilago maydis XP_761714.1 118 94 Neosartorya fischeri XP_001264924.1 118 88 Penicillium chrysogenum EF107741.1 118 88 Phaeosphaeria nodorum XP_001264924.1 119 87 Sclerotinia sclerotiorum XP_001597408.1 123 86 Podospora anserina XP_001909318.1 121 85 Glomerella lindemuthiana ABO46011.1 121 85 Arabidopsis thaliana AAM64870.1 120 76
27
A análise filogenética foi construída pelo método Neighbor-Joining (Saitou &
Nei, 1987) utilizando-se o software MEGA 4.0. Utilizou-se um gene de Arabidopsis
thaliana (AAM64870.1) como grupo externo (Figura 10). Visualizou-se que as
seqüência de aminoácidos de ATG8 de ascomicetos e basideomicetos foram
posicionados separadamente como dois grupos principais, e assim como mostrado na
Tabela 3, Coprinopsis cinerea e Laccaria bicolor, foram os mais relacionados à
proteína MpATG8.
Figura 10. Análise filogenética do MpATG8 com seqüências de proteínas relacionadas à autofagia. A árvore foi construída baseada no alinhamento das seqüências de aminoácidos utilizando o MEGA 4.0. Os números sobre os ramos correspondem aos valores de bootstrap para 1000 réplicas. A árvore é mostrada com os comprimentos dos ramos, na mesma unidade das distâncias evolutivas utilizadas para inferir a filogenia. As distâncias evolutivas foram computadas usando o método de correlação de Poisson (Zuckerkandl & Pauling 1965).
.
Figura 11. Mapa de restrição enzimático da seqüência MpATG8 utilizando o software NEBcutter.
28
4.2. Expressão gênica de MpATG8 durante o cultivo in vitro de
Moniliophthora perniciosa utilizando a técnica de PCR em tempo real.
As amostras de cDNA foram produzidas a partir da extração de RNA do fungo
M. perniciosa quando cultivado em meio bolacha, de acordo com item 3.2.2.2. Em
seguida submetidas à técnica de PCR em tempo real. Para a análise dos resultados no
software utilizado, foi necessário determinar uma amostra que representa o padrão de
expressão (quantificação relativa - RQ 1,000) ao qual as demais amostras foram
comparadas. Utilizou-se como padrão a primeira fase de crescimento do fungo (branca).
Comparando-se a esta, a fase amarela apresentou um RQ de 0,871, na fase rosa RQ
1,130, antes do estresse (AT) RQ 1,115, pós estresse (PT) RQ 1,711, Primórdio RQ
1,988 e Basidiocarpo RQ 0,886 (Figura 12).
Figura 12. Análise de expressão diferenciada do MpATG8, utilizando a técnica de PCR em tempo real, em diferentes fases de desenvolvimento do fungo M. perniciosa em meio bolacha.
4.3. Análise da expressão gênica de MpATG8 durante o cultivo in vitro de
Moniliophthora perniciosa nos meios 1, 2 e 3 utilizando a técnica de PCR
em tempo real.
Os resultados gerados por esta análise foram obtidos a partir de RNA extraído de
uma amostra biológica, sendo esta analisada em triplicata. Para a análise foi necessário
determinar um padrão de expressão do gene a partir de uma das amostras analisadas,
1,0000,871
1,130 1,115
1,711
1,988
0,886
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
Qua
ntificação Re
lativa ‐R
Q
Meio Bolacha
29
deste modo determinou-se a amostra meio 1, 14 dias ( RQ 1.000). Os demais pontos de
expressão dos três meios utilizados foram analisados em relação a este. Os resultados de
todas as amostras referem-se à expressão de MpATG8 em relação à expressão do gene
constitutivo actina, também analisado pelo software.
Observou-se que no meio 1 durante o período de crescimento de 14 dias, 21 dias
e 28 dias, apresentou respectivamente RQ de 1,000; 0,908 e 0,540. O aumento da
expressão neste meio só foi observado em 35 dias, com RQ 1,659 e 42 dias com RQ
2,650 (Figura 13).
Figura 13. Análise de expressão diferencial do MpATG8 em M. perniciosa cultivados em meio contendo 2% de peptona, 2% glicose e 2% glicerol e analisado a cada sete dias a partir do 14º dia até 42º dia.
No meio 2, observou-se uma expressão no primeiro ponto da coleta ,14 dias,
com RQ 1,264, já no ponto seguinte, 21dias, teve RQ 161,558 onde observou-se a maior
expressão encontrada nesta análise. No estágio subseqüente, 28 dias, a expressão gênica
teve uma queda acentuada, registrando valores de RQ 1,017. Em 35 dias a expressão
gênica voltou a subir para RQ 5,988 e manteve-se com valores próximos em 42 dias,
RQ 5,698 (Figura 14).
1,0000,908
0,540
1,659
2,650
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias
Qua
ntificação Re
lativa ‐RQ
Meio 1
30
Figura 14. Análise de expressão diferencial do MpATG8 em M. perniciosa, crescido em meio contendo 0,5% peptona e 0,5% glicose e analisado a cada sete dias a partir de 14º dia até 42º dia.
No meio 3 com o fungo crescido por 14 dias, obteve-se RQ 1,264, já na amostra
seguinte, 21 dias, RQ 11,209. Observou-se aumento na expressão de MpATG8, seguido
de diminuição em 28 dias RQ 3,411 e, novamente aumento em 35 dias, RQ 86,754,
voltando a baixar os níveis de expressão para RQ 4,981 em 42 dias (Figura 15).
Figura 15. Análise de expressão diferencial do MpATG8, em M. perniciosa crescido em meio contendo 0,5% peptona e 0,5% glicerol e analisado a cada sete dias a partir de 14º dia até 42º dia.
1,269
161,558
1,017 5,988 5,698
0,000
20,000
40,000
60,000
80,000
100,000
120,000
140,000
160,000
180,000
14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias
Qua
ntificação Re
lativa ‐RQ
Meio 2
1,264
11,2093,411
86,754
4,981
0,000
10,000
20,000
30,000
40,000
50,000
60,000
70,000
80,000
90,000
100,000
14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias
Qua
ntificação Re
lativa ‐RQ
Meio 3
4.4.
vitro
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e agl
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enco
inicia
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Figurapres
Figur3.
Microsco
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s, dentre as
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ra 16. Alterasentando espe
ra 17. Aparec
opia óptica
os 1, 2 e 3os cultivado
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atípicas. N
idamente o
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Cristais fora
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nem mesmo
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cimento de b
a de Moni
. s nestes me
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espessamen
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Figura 17)
(Figura 18-A
am observad
ungo, o qua
o para a obse
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iliophthor
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e 3. Esta
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célio de alg
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e bolhas atíp
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31
vo in
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mento
a 16),
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rutura
mente
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1, 2 e
Figuraprescresc
4.5.
4.5.
pDN
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Expressão
1. Clonage
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ra 19. Eletroificação de to genoma.
Foi feita
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u-se em el
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Figura 22. Eletroforese em gel de agarose 1%, 80V, 30min. mostrando o produto PCR de colônia de leveduras transformadas, utilizando primer ATG8. Amostra 1: levedura transformada com V002 (WM003). Controle negativo: levedura (WM004), BYatg8Δ transformada com pRS313.
4.5.2. Caracterização fenotípica do mutante
As leveduras transformadas (WM001, WM002, WM003, WM004) foram
cultivadas até a fase estacionária em meio líquido SC-His, foram submetidas a teste de
sobrevivência em meio sólido SC-His com diferentes concentrações de paraquat (0,
100, 150, 200 µM). Foi possível observar que WM004 possui uma menor capacidade de
sobrevivência na última diluição (1x102) em especial quando exposto a 150 µM e 200
µM de paraquat em comparação às demais amostras. Observouse também que o clone
WM003, apresentou uma capacidade de sobrevivência semelhante às cepas WM001 e
WM002 (Figura 23).
Figura 23. Teste em gota em meio SC-His contendo paraquat em diferentes concentrações. Amostras foram cultivadas até a fase estacionária, inoculadas após diluição seriada e gotejados 10µL de cada uma das diluições.
Quando as amostras (WM001, WM002, WM003, WM004) foram crescidas em
meio líquido SC-His até a fase exponencial, estas foram padronizadas, diluídas e
posteriormente inoculadas em meio sólido SC-His com paraquat (mesmas doses). Após
35
período de crescimento observou-se que WM004 na presença de paraquat 100 µM e 150
µM, novamente apresentou uma menor capacidade de sobrevivência comparado às
demais cepas. Esta observação tornou-se mais evidente nas duas últimas diluições. Já a
levedura WM003 sobreviveu mesmo na presença de 100 µM e 150 µM de paraquat, fato
este só observado nas linhagens WM001 e WM002 (Figura 24).
Figura 24. Teste em gota em meio SC-His contendo paraquat em diferentes concentrações, amostras cultivadas até a fase exponencial, inoculadas após diluição seriada e gotejados 10µL.
Os resultados demonstraram que a levedura WM004 não possui a mesma
capacidade de sobrevivência quando comparada com WM003, esta apresentou fenótipo
semelhante ao encontrado nas linhagens WM001, WM002, indicando uma
complementação do fenótipo do mutante por expressão de MpATG8 em levedura.
36
5. DISCUSSÃO
5.1 Caracterização in silico da seqüência do gene MpATG8
A análise de bioinformática da seqüência do cDNA encontrada no banco de
dados proporcionou informações do alto grau de conservação desta seqüência (Figura
9), bem como sua comparação a partir dos aminoácidos com proteínas ATG8 de
diferentes organismos (Tabela 3). Foi possível observar na figura 8 a seqüência de 127
aminoácidos, deduzidos a partir da seqüência de nucleotídeos de MpATG8. Este gene é
responsável por codificar a proteína ATG8, sendo esta fundamental para a formação do
autofagossomo, estrutura primordial para a execução da autofagia (Nebauer et. al.,
2007).
A análise filogenética demonstrou o agrupamento das seqüências analisadas em
três ramos, que eram constituídos por ascomicetos, basideomicetos e eudicotiledônea
(Figura 10). A seqüência de aminoácidos do ATG8 de M. perniciosa apresentou maior
grau de similaridade com Coprinopsis cinere e Laccaria bicolor, sendo 97% para
ambos (Tabela 3).
5.2 Análise da expressão gênica de MpATG8
A proteína ATG8 é de fundamental importância para o equilíbrio e
sobrevivência em condições críticas de estresse e nutrição (Picazarri et al., 2008).
Devido ao seu papel no desenvolvimento da autofagia, o gene e a proteína ATG8/ATG8
têm sido alvos de muitos estudos, a fim de entender os mecanismos de sobrevivência e
mudanças de fases no ciclo de vida em organismos como, Hansenula polymorpha,
Magnaporthe grisea, Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana,
Schizosaccharomyces pombe, Colletotrichum gloeosporioides, Entamoeba invadens,
Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Trypanosoma cruzi dentre outros (Levine
& Klionsky, 2004; Monastyrska et al., 2005; Veneault-Fourrey et al., 2006; Liu et al.,
2007; Nazarko el al., 2007; Kohda et al., 2007; Palmer et al., 2007; Nesher et al., 2008;
Picazarri et al., 2008; Hu et al., 2008; Alvares et al., 2008b).
MpATG8 foi alvo deste estudo com o intuito de contribuir para o conhecimento
do mecanismo autofágico em M. perniciosa. Assim, observou-se a expressão gênica no
37
fungo, cultivado em meio bolacha, através de análise diferencial utilizando-se o gene
actina como constitutivo e, os resultados demonstraram que o gene é expresso durante
todo o período de vida do fungo (Figura 12). Observou-se porém, um aumento da
expressão (RQ 1,711) logo após o tratamento ao qual foi submetido (dez dias sem
molhar). Este aumento reflete certamente a necessidade deste gene no processo
autofágico, o qual contribui para a manutenção da homeostase. O período de seca pode
ser o fator determinante para o aumento da expressão do gene em estudo, estimulado
possivelmente, devido à menor absorção de nutrientes nestas circunstâncias. Isto pode
ser explicado uma vez que, a nutrição da maioria dos fungos dá-se por absorção,
processo no qual, enzimas adequadas hidrolisam macromoléculas, tornando-as
assimiláveis através de mecanismos de transporte (Trabulsi & Alterthum, 2005). A
expressão de MpATG8 continuou aumentando no primórdio (RQ 1,988). Já na fase
subseqüente - basidiocarpo - apresentou-se uma diminuição nos valores de expressão.
Kimura et al., (2007) em estudo com Aspergillus oryzae, relaram que neste
organismo o conidióforo é nutrido por processo autofágico executado nas hifas do
micélio vegetativo e os nutrientes são transportados por vacúolos até o micélio aéreo,
não necessitando de fontes externas de nitrogênio para a formação de conídios. Frente à
diminuição da expressão de MpATG8 no basidiocarpo, é possível que este mesmo
processo que ocorre em A. oryzae esteja ocorrendo em M. perniciosa.
Os fatos que levaram a variação da expressão gênica não foram elucidados por
este trabalho, sendo necessários trabalhos subseqüentes que vislumbrem monitorar o
conteúdo nutricional do meio em que se desenvolve o fungo, bem como a expressão de
outros genes relacionados à autofagia nas fases de desenvolvimento do mesmo,
inclusive no período de germinação dos esporos. Uma vez que, trabalhos já relataram a
importância do processo autofágico durante a formação do apressório, bem como sua
eficiência para penetra a cutícula da planta hospedeira (Veneault-Fourrey et al., 2006;
Liu et al., 2007).
Apesar destes dados serem preliminares e representarem apenas uma réplica
biológica, o trabalho em desenvolvimento por Gomes, D.S. (dissertação de mestrado em
andamento na Universidade Estadual de Santa Cruz) também já foi possível observar
um perfil de expressão de MpATG8 semelhante ao aqui relatado.
38
Com o intuito de observar a indução da expressão do gene MpATG8, cultivou-se
M. perniciosa em meios com diferentes concentrações de nutrientes. Meio 1 (2% ágar,
2% de peptona, 2% de glicose e 2% de glicerol), meio 2 (2% ágar, 0,5% de peptona e
0,5% de glicose) e meio 3 (2% ágar, 0,5% de peptona e 0,5% de glicerol) onde os meios
2 e 3 continham uma quantidade inferior de nutrientes se comparados com o meio 1. A
análise de expressão gênica ocorreu utilizando cDNA sintetizado através RNA extraído
do fungo cultivado nos meios em 14, 21 28, 35 e 42 dias. Utilizou-se como primeira
coleta (14 dias), por representar o tempo em que o fungo normalmente precisa para
ocupar todo o meio e possivelmente, a partir deste momento os níveis nutricionais
começariam a reduzir com maior intensidade.
No meio 1, observou-se uma variação da expressão de MpATG8 (Figura 13),
constatando um perfil de expressão semelhante de 14 a 28 dias, uma vez que teve-se 14
dias (controle estabelecido RQ 1,000), 21 dias com RQ 0,908 e 28 dias com RQ 0,540.
Porém este último apresentou um erro padrão maior que as demais amostras analisadas.
Este perfil de expressão demonstrou que o gene em estudo apresenta um nível basal de
expressão mesmo estando em condições nutritivas (Wang & Kliosky 2003; Picazarri et
al., 2008). Nas amostras com 35 e 42 dias de cultivo do fungo, ocorreu um aumento da
expressão representado por RQ 1,659 em 35 dias e RQ 2,650 em 42 dias. É provável
que este aumento tenha sido devido ao envelhecimento do fungo ou à diminuição de
nutrientes no meio, isto estaria induzindo a utilização do processo autofágico e
expressão de MpATG8, entretanto o valor nutricional do meio não foi quantificado.
No meio 2, observou-se uma expressão gênica aumentada em 14 dias (RQ
1,269), quando comparada com o controle estabelecido (meio 1, 14 dias, RQ 1,000)
(Figura 14). Em 21 dias neste mesmo meio, encontrou-se um aumento da expressão
gênica, com valor de RQ 161,558. Já em 28 dias a amostra teve RQ de 1,017, uma
grande redução de expressão em relação ao ponto anterior. Como a autofagia
proporciona aminoácidos, fosfolipídeos e outros elementos necessários para o
metabolismo basal bem como reserva destes nutrientes (Wang & Klionsky, 2003; Rose
et al., 2006; Palmer et al., 2007), seria possível associar este declínio ao acúmulo de
nutrientes gerado pela atividade autofágica, representado pela expressão de MpATG8
em 21 dias.
39
A expressão de MpATG8 em 35 e 42 dias no meio 2, apresentou-se de forma
moderada se comparada com a expressão do gene em 21 dias. O processo autofágico
apesar de proporcionar uma estratégia de sobrevivência em condições de carência
nutricional, a sua ativação é limitada pelas circunstâncias celulares, apresentando
aumento, seguido de diminuição da expressão do gene ATG8 (Rose et al., 2006). Já foi
demonstrado que a autofagia é uma resposta transitória, sendo este processo bem
caracterizado em leveduras e humanos (Yang et al., 2005).
Nas duas últimas amostras do meio 2, observou-se uma constância na expressão
de MpATG8 com valores de RQ 5,988 para 35 dias e 5,698 para 42 dias. Nas condições
às quais o fungo estava submetido, ele parece regular a expressão de MpATG8
juntamente com o mecanismo autofágico. Os resultados demonstraram que MpATG8
durante o experimento atingiu um alto grau de expressão, diminuindo os valores logo
em seguida, com posterior aumento limitado aparentemente pelas circunstâncias
nutritiva e celular.
O perfil de expressão de MpATG8 no meio 3 (Figura 15), também apresentou
uma variação durante o período de cultivo. Na primeira amostra 14 dias, observou-se
uma expressão (RQ 1,264) semelhante à expressão de meio 2, 14 dias, com RQ de
1,269. Na amostra 21 dias, observou-se RQ de 11,209, um aumento de expressão
seguido por uma diminuição na amostra 28 dias, RQ 3,411. Observou-se a partir de 21
dias, um aumento na expressão de MpATG8 que não mais retornou aos valores iniciais,
mantendo-se sempre mais expresso que o controle. Em 35 dias neste meio, foi
observado o maior valor de quantificação relativa 86,754, tornando a diminuir para RQ
4,981 na última amostra, 42 dias. Os valores aqui encontrados representaram a
necessidade momentânea do aumento da expressão de MpATG8, possivelmente
acompanhado pela atividade autofágica, o que pode ter contribuído para a manutenção
da homeostase nestas condições de crescimento. As células utilizam o mecanismo
autofágico em níveis basais, porém em carência nutricional este mecanismo apresenta-
se aumentado, promovendo elevação na concentração intracelular de nutrientes (Rose et
al., 2006).
É bem verdade que a expressão isolada de um gene não é suficiente para
comprovar a atividade de um mecanismo como a autofagia, que em modelo eucariótico
40
(S. cerevisiae.) requer uma participação de 27 genes (Suzuki & Ohsumi, 2007). No
entanto a estreita relação entre ATG8 e o mecanismo autofágico já foi relatada em
diversos trabalhos (Ohsumi, Y. 2001; Suzuki et al., 2001; Meiling-Wesse et al., 2004;
Levine & Klionsky, 2004; Yorimitsu et al., 2007; Rajawat & Bossis. 2008; Hu et al.,
2008; Klionsky et al., 2008; Alvares et al., 2008b).
5.3 Análise das amostras em microscopia óptica
A observação do micélio de M. perniciosa cultivados nos meios 1, 2 e 3,
utilizando-se a microscopia óptica, não trouxe nenhuma relação direta com o
mecanismo autofágico, já que a técnica utilizada não possibilitou a observação de
corpos autofágicos, nem vacúolos no interior das hifas. Porém, observou-se estruturas
incomuns ao longo das hifas de M. perniciosa, dentre estas o aparecimento de bolhas
associadas às hifas, bem como o espessamento das mesmas. Foi possível observar que o
aparecimento de hifas com morfologia muito diferente dos padrões normais, no meio 2
(21 dias) (Figura 16), coincidindo com o período de maior expressão de MpATG8 nas
análises de PCR em tempo real (Figura 14).
Observou-se a presença de cristais (não classificados) nos micélios 1, 2 e 3
(Figura 18 B). Em trabalho realizado por Rio et al., (2008) foi constatada a presença de
cristais de oxalato de cálcio produzidos por M. perniciosa, quando cultivado em meio
(Ágar-Água). O fato de saber que M. perniciosa produz cristais de oxalato de cálcio é
uma informação relevante, uma vez que Cessna et al., (2000) associaram o aumento da
virulência do fitopatógeno (Sclerotinia sclerotiorum) com sua capacidade de produção
de ácido oxálico. É interessante relatar a possível associação de um mecanismo de
sobrevivência a estresse nutricional (autofagia), com o aumento da virulência deste
fitopatógeno (produção de ácido oxálico), isso possivelmente o torna muito mais
resistente e prejudicial ao hospedeiro.
5.4. Expressão heteróloga do gene MpATG8 no mutante Scatg8Δ
Após a construção dos clones WM001, WM002, WM003 e WM004, estes foram
submetidos a testes de sobrevivência ao agente tóxico paraquat, nas fases estacionária e
exponencial de crescimento.
41
Uma cultura de levedura em fase estacionária possui uma maior resistência
intrínseca à maioria dos agentes tóxicos, uma vez que o processo de divisão celular está
diminuído. Por outro lado, as células em crescimento exponencial estão em constante
divisão celular, e interagem fortemente com o ambiente, através da ativação de
permeases de importação e exportação, como alguns transportadores do tipo ABC
(Decottignies et al., 1998). Assim, através do transporte ativo estas células são muito
mais sensíveis aos agentes tóxicos (Viau et al., 2006).
O agente químico paraquat é um herbicida bastante utilizado na agricultura,
possui efeito positivo contra uma grande variedade de ervas daninhas (Ekmekci &
Terzioglu, 2005). O mecanismo de ação está possivelmente ligado a um ciclo redox,
onde a molécula de paraquat é reduzida pela NADPH-citocromo c redutase (Bonneh-
Barkay et al., 2005). Pode ocorrer desbalanceamento entre a geração de radicais de
oxigênio, a capacidade celular de defesa diminuída, e por conseqüência diferentes
danos, como mutações no DNA (Peter et al., 1992). Uma única molécula de paraquat
pode sofrer repetidos ciclos de redução e oxidação produzindo grandes quantidades de
espécies reativas de oxigênio (EROs). O dano causado por EROs já foi observado em
diversos tipos celulares no entanto se este possui uma relação com o processo
autofágico, isso ainda não foi determinado (Yu et al 2006).
Foi possível observar a sobrevivência dos clones sob o efeito do paraquat, onde
se verificou que o clone WM004, apresentou uma menor capacidade de sobrevivência,
em especial quando exposto a 150 µM e 200 µM, tanto na fase exponencial como na
estacionária de crescimento (Figura 23 e 24). Interessante relatar a capacidade de
sobrevivência do clone WM003 que, apesar de em menor número de colônias crescidas,
se comparado com WM001 e WM002, conseguiu sobreviver a 200 µM de paraquat,
quando crescido na fase estacionária, e a 150 µM de paraquat quando crescido na fase
exponencial, onde apresentou uma sobrevivência semelhante aos clones WM001e
WM002. Ketelaar et al., (2004) demonstraram que, S. cerevisiae mutante (Scatg8Δ)
pode restabelecer o mecanismo autofágico quando transformada com o homólogo
(AtATG8) de Arabidopsis thaliana
Em trabalho realizado por Zhang et al., (2007) foi demonstrado que S. cerevisiae
atg8Δ não possui a mesma capacidade de sobrevivência, quando submetida à carência
42
nutricional, se comparada às leveduras selvagens. Kohda et al., (2007) demonstraram
que levedura mutante para gene autofágico atg8Δ, assim como outros atg mutantes, não
conseguem sofrer diferenciação sexual quando cultivados em condições de estresse
nutricional, e que o processo autofágico quando ativado, possibilita através da
reciclagem, uma fonte de nutrientes para a diferenciação sexual. Palmer et al., (2007)
relataram a importância dos genes ATG para a sobrevivência de C. albicans em
hospedeiros onde se encontram escassez nutrientes, sendo os mutantes sensíveis a esta
condição.
O clone WM003 é mutante de S. cerevisiae (Scatg8Δ) transformado com
MpATG8 e aparentemente apresentou uma maior capacidade de sobrevivência
comparado ao clone mutante sem o gene MpATG8 (WM004). Apesar dos dados aqui
gerados serem preliminares, é notório que o gene MpATG8 possui uma função
importante ao longo da vida de M. perniciosa e que possivelmente é a mesma função
executada por outros genes ATG8 em outros eucariotos.
43
6. CONCLUSÕES
• Os resultados demonstrados pela análise de bioinformática trouxeram
informações relevantes sobre a seqüência analisada.
• Ao longo da vida dicariótica de M. perniciosa, cultivado em bolachas, foi
observado que MpATG8 foi expresso diferentemente nas fases de crescimento,
tendo aumentado a expressão após período de seca e no primórdio
• M. perniciosa quando cultivado em meios 2 e 3, apresentou uma grande
variação na expressão do MpATG8 se comparado como o mesmo fungo crescido
em meio 1, este rico em nutrientes.
• A técnica de PCR em tempo real foi muito útil, gerando dados de alta
confiabilidade para análises de expressão gênica.
• Utilizando as ferramentas moleculares os clones de levedura foram produzidos
com sucesso.
• O gene MpATG8 conferi uma maior capacidade de sobrevivência ao mutante
Scatg8Δ, porém novos experimentos para fazem-se necessários para comprovar
a complementação fenotípica.
44
7. PERSPECTIVAS
Para uma melhor compreensão dos mecanismos de adaptação e sobrevivência de M.
perniciosa durante suas fases do ciclo de vida, faz-se necessária a complementação dos
dados obtidos, sobre referente a expressão gênica e processo autofágico de M.
perniciosa, através das seguintes perspectivas:
• Validação dos dados gerados pela técnica de PCR em tempo real através de
novas réplicas biológicas.
• Complementação fenotípica através de mais testes experimentais em meios
contendo outras condições nutricionais ou até drogas que bloqueiem a autofagia,
como a rapamicina.
• Análise citológica do fungo M. perniciosa crescido em condição pouco nutritiva,
utilizando microscopia eletrônica de transmissão bem como análise dos clones
de leveduras construídos, vislumbrando a observação de autofagossomo.
• Busca de outros genes da cascata autofágica no genoma de M. perniciosa, e
caracterização da expressão destes durante a vida do fungo.
• Investigação sobre agentes químicos ou biológicos que venham bloquear a
autofagia em M. perniciosa e analisar a capacidade de sobrevivência in vitro do
fungo nestas circunstâncias.
45
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGATEP R.; KIRKPATRICK, R. D.; PARCHALIUK, D. L.; WOODS, R. A.; GIETZ,
R. D. Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-
stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol. Technical
Tips Online (http://tto.trends.com), 1998.
AIME, M. C. & PHILLIPS-MORA, W. The causal agents of witches’ broom and frosty
pod rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of Marasmiaceae.
Mycologia, v. 97, n. 5, p. 1012–1022, 2005.
ALVAREZ, V. E.; KOSEC, G.; SANT'ANNA, C.; TURK, V.; CAZZULO, J .J.;
TURK, B. Autophagy is involved in nutritional stress response and differentiation in
Trypanosoma cruzi. J. Biol. Chem v. 283 n.6 p. 3454-3464, 2008a.
ALVAREZ, V. E.; KOSEC, G.; SANT'ANNA, C.; TURK, V.; CAZZULO, J. J.;
TURK, B. Blocking autophagy to prevent parasite differentiation: A possible new
strategy for fighting parasitic infections? Autophagy. n. 1 v. 3 p. 361-363, 2008b.
ANDEBRHAN, T. & FURTEK, D. B. Random amplified polymorphic DNA (RAPD)
analysis of Crinipellis perniciosa isolates from different hosts. Plant Pathology, v. 43,
n.6, p. 1020-1027, 1994.
AUSUBEL, F. M.; KINGSTON, R. E.; MOORE, D. D.; SEIDMAN, J. G.; SMITH, J.
A.; STRUHL, K. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, 1989.
BABA, M; OSUMI, M.; SCOTT, S. V.; KLIONSKY, D. J.; OHSUMI, Y. Two distinct
pathways for targeting proteins from the cytoplasm to the vacuole/lysosome. The
Journal of Cell Biology, v. 139, n.7, p. 1687–1695, 1997.
BARTLEY, B.G.D. Cacao (Theobroma cacao L.) breeding for durable resistance in
perennial crops. FAO Plant Production and Protection Paper 70. Rome, p. 25–42, 1986.
46
BIRNBOIM, H. C. & J. DOLY. A rapid alkaline extraction procedure for
screeningrecombinant plasmud DNA. Nucleic Acids Research n. 7 p. 1513-1523, 1979.
BHARUCHA, N., & KUMAR, A. Yeast genomics and drug target identification.
Combinatorial chemistry & high throughput screening. v. 10, p. 618-634, 2007.
BONNEH-BARKAY, D. REANEY, S. H.; LANGSTON, W.J.; DI MONTE, D. A.
Redox cycling of the herbicide paraquat in microglial cultures. Brain research.
Molecular brain research v. 1341 p. 52-56, 2005.
CESSNA, S. G.; SEARS, V. E.; DICKMAN, B. M.; LOW, P. S. Oxalic acid, a
pathogenicity factor for Sclerotinia sclerotiorum, suppresses the oxidative burst of the
host. Plant The Plant Cell, v. 12, p. 2191–2199, 2000.
COTOMACCI, C. Análise genômica do sistema mating type de Crinipellis perniciosa,
fungo causador da doença vassoura-de-bruxa em Theobroma cacao. Dissertação.
UNICAMP, Campinas, 75 f, 2004.
DAHLMANN, B. Role of proteasomes in disease. BMC Biochemistry, v 8, p. 1-12,
2007.
DANN, S. G. & THOMAS, G. The amino acid sensitive TOR pathway from yeast to
mammals. FEBS Letters, v. 580, p. 2821–2829, 2006.
DAGERT, M. & EHRLICH, S. D. Prolanged incubation in calcium choride improves
the competence of Escherichia coli cells. v. 6, p. 23-28, 1979.
DECOTTIGNIES, A.; GRANT, A. M.; NICHOLS, J. W.; DE WET, H.; MCINTOSH,
D. B.; GOFFEAU, A. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed
yeast ABC protein Yor1p. Journal of biological chemistry n. 273 p. 12612-12622, 1998.
DUFRESNE, M.; BAILEY, J. A.; DRON, M.; LANGIN, T. clk1, a serine/threonine
protein kinase-encoding gene, is involved in pathogenicity of Colletotrichum
47
lindemuthianum on common bean. The American Phytopathological Society, v. 11, n. 2,
1998.
EKMEKCI, Y. & TERZIOGLU, S. Effects of oxidative stress induced by paraquat on
wild and cultivated wheats. Pesticide Biochemistry and Physiology. p. 1-13, 2005.
EVANS, H.C.; BASTOS, C.N. Uma avaliação do ciclo de vida da vassoura-de-bruxa
(Crinipellis perniciosa) do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, v. 4, n.1, p. 104, 1979.
FILHO, D.F.; PUNGARTNIK, C.; CASCARDO, J.C.M.; BRENDEL, M. Broken
hyphae of the basidiomycete Crinipellis perniciosa allow quantitative assay of toxicity.
Current Microbiology, v. 52, p. 407–412, 2006.
FUJIOKA, Y.; NODA, N. N.; FUJII, K.; YOSHIMOTO, K.; OHSUMI, Y.; INAGAKI,
F. In vitro reconstitution of plant atg8 and atg12 conjugation systems essential for
autophagy. J. Biol. Chem., v. 283, n. 4, p. 1921-1928, 2008.
GARCIA, O.; MACEDO, J.A.N., TIBÚRCIO, R.; ZAPAROLI, G.; RINCONES, J.;
BITTENCOURT, L.M.C.; CEITA, G.O.; MICHELI, F.; GESTEIRA, A.; MARIANO,
A.C.; SCHIAVINATO, M.A.; MEDRANO, F.J.; MEINHARDT, L.W.; PEREIRA,
G.A.G.; CASCARDO, J.C.M. Characterization of necrosis and ethylene-inducing
proteins (NEP) in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of
witches’ broom in Theobroma cacao. Mycological Research, v.111, p. 443–455, 2007.
GEORGE,M. D.; BABA, M.; SCOTT, S. V.; MIZUSHIMA, N.; GARRISON, ,B. S.;
OHSUMI, Y.; KLIONSKY, D. J. Apg5p functions in the sequestration step in the
cytoplasm-to-vacuole targeting and macroautophagy pathways. Molecular Biology of
the Cell, v.11, p. 969–982, 2000.
GESTEIRA, A.S.; MICHELI, F.; CARELS, N.; SILVA, A.C.; GRAMACHO, K.;
SCHUSTER , I.; MACE DO, J. N.; PEREIRA, G.A.G.; CASCARDO, J.C.M.
48
Comparative analysis of expressed genes from cacao meristems infected by
Moniliophthora perniciosa. Annals of Botany, v. 100, p. 129–140, 2007.
GRIFFITH, G. W. Witches’ brooms and frosty pods: threats to world cacao production
Biologist. v. 51, n. 2, p. 71 – 75, 2004.
GRIFFITH, G. W.; NICHOLSON, J.; NENNINGER, A.; BIRCH, R. N.; HEDGER, J.
N. Witches’ brooms and frosty pods: two major pathogens of cacao. New Zealand J.
Bot. v.41, p. 423-435, 2003.
HANSEN, M.; CHANDRA, A.; MITIC, L. L.; ONKEN, B.; DRISCOLL, M.;
KENYON, C. A role for autophagy in the extension of lifespan by dietary restriction in
C. elegans. PLoS Genetics, v. 4, p. 0001–0014, 2008.
HU, G.; HACHAM, M.; WATERMAN, S. R.; PANEPINTO, J.; SHIN, S.; LIU, X.;
GIBBONS, J.; VALYI-NAGY, T.; OBARA, K.; JAFFE, H. A.; OHSUMI, Y.;
WILLIAMSON, P. R. PI3K signaling of autophagy is required for starvation tolerance
and virulence of Cryptococcus neoformans. J. Clin. Invest. doi:10.1172/JCI32053.
2008.
HUANG, W.; KLIONSKY, D.J. Autophagy in yeast: a review of the molecular
machinery. Cells Structure And Function, v.27, p. 409 – 420, 2002.
ICHIMURA, Y.; IMAMURA, Y., EMOTO, K.; UMEDA, M.; NODA, T.; OHSUMI,
Y. In vivo and in vitro reconstitution of Atg8 conjugation essential for autophagy. The
Journal Of Biological Chemistry, v. 279, n. 39, p. 40584–40592, 2004.
KAWAMATA, T.; KAMADA, Y.; KABEYA, Y.; SEKITO,T.; OHSUMI, Y.
Organization of the pre-autophagosomal structure responsible for autophagosome
formation. Mol. Bio. Cell., v. 19, p. 2039-2050, 2008.
49
KETELAARA, T.; VOSSB, C.; DIMMOCKA, S. A.; THUMMB, M.; HUSSEYA, P. J.
Arabidopsis homologues of the autophagy protein Atg8 are a novel family of
microtubule binding proteins. FEBS Letters, v. 567, p. 302–306, 2004.
KIEL, J. A. K. W.; KOMDUUR, J. A.; VAN DER KLEI, I. J.; VEENHUIS, M.
Macropexophagy in Hansenula polymorpha: facts and views. FEBS Letters, v. 549, p.
1– 6, 2003.
KIHARA,A.; NODA, T.; ISHIHARA, N.; OHSUMI, Y. Two distinct Vps34
phosphatidylinositol 3–kinase complexes function in autophagy and carboxypeptidase y
sorting in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Cell Biology, v.152, n. 3, p. 519–
530, 2001.
KILARU, A. & HASENSTEIN, K.H. Biochemistry and cell biology development and
pathogenicity of the fungus Crinipellis perniciosa on interaction with cacao leaves. The
American Phytopathological Society, v. 95, n.1, p. 101- 107, 2005.
KIMURA, T.; ARIOKA, M.; KITAMOTO, K. Autophagy during conidiation and
conidial germination in filamentous fungi. Autophagy, v. 3, n. 2, p. 128-129, 2007.
KIRISAKO, T.; BABA, M.; ISHIHARA, N.; MIYAZAWA, K.; OHSUMI, M.;
YOSHIMORI, T.; NODA, T.; OHSUMI, YOSHINORI. Formation process of
autophagosome is traced with Apg8/Aut7p in yeast. The Journal of Cell Biology, v.
147, n. 2, p. 435–446, 1999.
KIRISAKO,T.; ICHIMURA, Y.; OKADA,H.; KABEYA,Y.; MIZUSHIMA, N.;
YOSHIMORI, T.;OHSUMI, M.; TAKAO, T.; NODA,T.; OHSUMI, Y. The reversible
modification regulates the membrane-binding state of Apg8/Aut7 essential for
autophagy and the cytoplasm to vacuole targeting pathway. The Journal of Cell
Biology, v.151, n. 2, p. 263–275, 2000.
KLIONSKY, D. J.; CUERVO, A. M.; SEGLEN, P. O. Methods for monitoring
autophagy from yeast to human. Autophagy v. 3, n. 3, p. 181-206, 2007.
50
KLIONSKY, D. J.; CUERVO, A. M.; SEGLEN, P. O. Methods for monitoring
autophagy from yeast to human. Autophagy, v. 3, p. 181-206, 2007.
KLIONSKY, D. J.; EMR, S. D. Autophagy as a regulated pathway of cellular
degradation. Science, v. 290, p. 1717 – 1721, 2000.
KOHDA, T. A.; TANAKA, K.; KONOMI, M.; SATO, M.; OSUMI, M.;
YAMAMOTO, M. Fission yeast autophagy induced by nitrogen starvation generates a
nitrogen source that drives adaptation processes. Genes to Cells, n.12 p. 155-170, 2007.
LEVINE, B.; KLIONSKY, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms
and biological functions of autophagy. Dev Cell., v. 6, p. 463–477, 2004.
LIU, X.; LU, J.; ZHANG, L.; DONG, B.; MIN, H.; LIN, F. Involvement of a
Magnaporthe grisea Serine/threonine kinase gene, Mgatg1, in appressorium turgor and
pathogenesis. Eukaryotic Cell, p. 997–1005, 2007.
LOPES, M.A.; GOMES, D.S.; KOBLITZ, M.G.B.; PIROVANI, C.P.; CASCARDO,
J.C.M.; GÓES-NETO, A.; MICHELI, F. Use of response surface methodology to
examine chitinase regulation in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa,
Mycological Research, doi: 10.1016/j.mycres.2007.10.017, 2007.
MEILING-WESSE, K., BARTH H.; VOSS, C.; ESKELINEN, E., EPPLE, U.D.;
THUMM, M. Atg21 is required for effective recruitment of atg8 to the
preautophagosomal structure during the cvt pathway. The Journal Of Biological
Chemistry, v. 279, n. 36, p. 37741–37750, 2004.
MELO, S. C. O.; PUNGARTNIK, C.; CASCARDO, J. C. M.; BRENDEL, M. Rapid
and efficient protocol for DNA extraction and molecular identification of the
basidiomycete Crinipellis perniciosa. Genetics and Molecular Research, v. 5, n.4, p.
851-855, 2006.
51
MIZUSHIMA, N.; NODA, T.; OHSUMI, Y. Apg16p is required for the function of the
Apg12p-Apg5p conugate in the yeast autophagy pathway. The EMBO Journal, v. 18,
n.14, p. 3888-3896, 1999.
MIZUSHIMA, N.; OHSUMI, Y.; YOSHIMORI, T. Autophagossome formation in
mammalian cells. Cell Structure And Function, v. 27, p. 421-429, 2002.
MONASTYRSKA I.; VAN DER HEIDE, M.; KRIKKEN, A.M.; KIEL, J. A. K. W.,
VAN DER KLEI, I. J.; VEENHUIS, M. Atg8 is essential for macropexophagy in
Hansenula polymorpha. J. Clin. Invest, v. 6, p. 66–74, 2005.
NAIR, U. & KLIONSKY, D. J. Molecular mechanisms and regulation of specific and
nonspecific autophagy pathways in yeast. The Journal Of Biological Chemistry v. 280,
n. 51, p. 41785–41788, 2005.
NAZARKO, T. Y.; FARRÉ, J.; POLUPANOV, A. S.; SIBIRNY, A. A.;
SUBRAMANI, S. Autophagy-related pathways and specific role of sterol glucoside
in yeasts. Autophagy v.3 n.3, p. 263-265, 2007.
NAKATOGAWA, H.; ICHIMURA,Y. OHSUMI, Y. Atg8, a ubiquitin-like protein
required for autophagosome formation,mediates membrane tethering and hemifusion.
Cell, v. 130, p. 165–178, 2007.
NEBAUER, R.; ROSENBERGER, S.; DAUM, G. Phosphatidylethanolamine, a
limiting factor of autophagy in yeast strains bearing a defect in the carboxypeptidase y
pathway of vacuolar targeting. The journal of biological chemistry v. 282, n. 23, p.
16736–16743, 2007.
NESHER, I.; BARHOOM, S.; SHARON, A. Cell cycle and cell death are not necessary
for appressorium formation and plant infection in the fungal plant pathogen
Colletotrichum gloeosporioides. BMC Biology, v. 6, n. 9, p. 1-11, 2008.
52
NIELLA, G.; RESENDE, M. L.; CASTRO, H. A.; DE CARVALHO, G. A.; SILVA, L.
H. C. P. Aperfeiçoamento da metodologia de produção artificial de basidiocarpos de
Crinipellis perniciosa. Fitopatologia Brasileira. v. 24, n. 4, p. 523-527, 1999.
OHSUMI, Y. Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems. Nature
Reviews Molecular Cell Biology, v. 2, p. 211 – 216, 2001.
ORCHARD, J.; COLLIN, H.A.; HARDWICK, K.; ISAAC, S. Changes in morphology
and measurement of cytokinin levels during the development of witches-brooms on
cocoa. Plant Pathology, v.43, n.1, p. 65-72, 1994.
PALMER, G. E.; KELLY, M. N.; STURTEVANT, J. E. Autophagy in the pathogen
Candida albicans. Microbiology v.153, p. 51–58, 2007.
PICAZARRI, K.; NAKADA-TSUKUI, K.; NOZAKI, T. Autophagy during
Proliferation and Encystation in the Protozoan Parasite Entamoeba invadens. Infection
and immunity. p. 278–288, 2008.
PIROVANI, C. P.; CARVALHO, H. A.; MACHADO, R. C.; GOMES, D.S.; ALVIM,
F. C.; POMELLA, A. W.; GRAMACHO, K. P.; CASCARDO, J. C.; PEREIRA, G. A.;
MICHELI F. Protein extraction for proteome analysis from cacao leaves and meristems,
organs infected by Moniliophtora perniciosa, the causal agent of the witche`s broom
disease. Electrophoresis, doi: 10.1002/elps.200700743, 2008.
PURDY, L. H. & SCHMIDT, R. A. Status of cacao witches’ broom: Biology,
epidemiology, and management. Annu Rev. Phytopathol. v. 34, p.573–594, 1996.
RAJAWAT, Y. S. & BOSSIS, I. Autophagy in aging and in neurodegenerative
disorders. Hormones, v.7, n.1, p. 46-61, 2008.
REGGIORI, F.; SHINTANI, T.; NAIR, U.; KLIONSKY, DJ. Atg9 cycles between
mitochondria and the pre-autophagosomal structure in yeasts. Autophagy. v. 1, p. 101-9,
2005.
53
RINCONES, J.; MAZOTTI, G D.; GRIFFITH, G.W.; POMELA, A.; FIGUEIRA, A.;
LEAL, G.; QUEIROZ, A. M. V.; PEREIRA, J. F.; AZEVEDO, R. A.; PEREIRA, G. A.
G.; MEINHARDT, L. W. Genetic variability and chromosome-length polymorphisms
of the witches’ broom pathogen Crinipellis perniciosa from various plant hosts in South
America. Mycological Research, v. 1 1 0, p. 8 2 1 – 8 3 2, 2006.
RIOS, M. C. S.; OLIVEIRA, B. V.; TOMAZELLA, D. P. T.; DA SILVA,
J.A.F.;PEREIRA, G. A. G. Production of calcium oxalate crystals by the basidiomycete
Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease of cacao. Curr
Microbiol. v.4, p. 363-370. 2008.
ROHDE, J.; HEITMAN, J.; CARDENAS, M. E. The TOR Kinases link nutrient sensing
to cell growth. The Journal Of Biological Chemistry, v. 276, n. 13, p. 9583–9586, 2001.
ROSE, T. L.; BONNEAU, L.; DER, C.; MARTY-MAZARS, D.; MARTY, F.
Starvation-induced expression of autophagy-related genes in Arabidopsis. Biol. Cell n.
98, p. 53–67, 2006.
SAITOU, N. & NEI, M. The neighbor-joining method: A new method for
reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution n. 4, p. 406-425,
1987.
SANTOS, R.X. Efeito da variação da fonte de carbono na resposta à agentes
mutagênicos do fungo moniliophthora perniciosa em fase dicariótica de crescimento.
Dissertação. UESC, Ilhéus, 124f, 2008.
SREENIVASAN, T. N.; DABYDEEN, S. Moder of penetration of young cocoa leaves
by Crinipellis perniciosa. Plant Dis., v. 73, p. 478-481, 1989.
SILVA, S. D. V. M.; MATSUOKA, K. Histologia da interação Crinipellis perniciosa
em cacaueiros suscetível e resistente a vassoura-de-bruxa. Fitopatologia Brasileira, v. 4,
n.1, p. 54-59, 1999.
54
SUZUKI, K.; OHSUMI, Y. Molecular machinery of autophagosome formation in yeast,
Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters, v. 581, p. 2156–2161, 2007.
SUZUKI, K.; KIRISAKO, T.; KAMADA, Y.; MIZUSHIMA, N.; NODA, T.;
OHSUMI, Y. The pre-autophagosomal strutucture organized by concerted functions of
TPG genes is essential for autophagosome formation. The EMBO Journal. v. 20 n. 21 p.
5971-5981, 2001.
TAMURA, K.; DUDLEY, J.; NEI, M.; KUMAR, S. MEGA4: Molecular evolutionary
genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution n.
24, p. 1596-1599, 2007.
TRABULSI, L. R. & ALTERTHUM, F. Microbiologia. Editora Atheneu, 4ªed. revisada
e atualizada. p. 456, 2005.
VENEAULT-FOURREY, C.; BAROOAH, M.; EGAN, M.; WAKLEY, G.; TALBOT,
N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.
Science, v. 312, p. 580-583, 2006.
VIAU, C.; PUNGARTNIK, C.; SCHMITT, M. C.; BASSO, T. S.; HENRIQUES, J. A.
P.; BRENDEL, M. Sensitivity to Sn2+ of the yeast Saccharomyces cerevisiae depends
on general energy metabolism, metal transport, anti-oxidative defenses, and DNA
repair. BioMetals n. 19, p. 705-714, 2006.
VINCZE, T.; POSFAI, J.; ROBERTS, R.J. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Res. n.31p. 3688-3691, 2003.
ZHANG, Y.; QI, H.; TAYLOR, R.; XU, W.; LIU, L. F.; JIN, S. The role of autophagy
in mitochondria maintenance characterization of mitochondrial functions in autophagy-
deficient S. cerevisiae strains. Autophagy v.3, n. 4, p. 337-346, 2007.
55
ZUCKERKANDL, E. & PAULING, L. Evolutionary divergence and convergence in
proteins, p. 97-166 in Evolving Genes and Proteins, edited by V. Bryson and H.J.
Vogel. Academic Press, New York, 1965.
WANG, C & KLIONSKY, D. J. The molecular mechanism of autophagy. Molecular
Medicine, v. 9, p. 65-76, 2003.
WILSON, W.A.; WANG Z.; ROACH PJ. Systematic identification of the genes
affecting glycogen storage in the yeast Saccharomyces cerevisiae: implication of the
vacuole as a determinant of glycogen level. Mol Cell Proteomics. v.3, p. 232-42, 2002.
YANG, Y.; LIANG, Z.; GU, Z.; QIN, Z. Molecular mechanism and regulation of
autophagy. Acta Pharmacologica Sinica, v.26, p. 1421–1434, 2005.
YORIMITSU, T.; ZAMAN, S.; BROACH, ,J. R.; KLIONSKY, D. J. Protein Kinase A
and Sch9 cooperatively regulate Induction of autophagy in Saccharomyces cerevisiae.
Molecular Biology of the Cell, v.18, p. 4180–4189, 2007.
YU, L.; WAN, F.; DUTTA, S.; WELSH, S.; LIU, Z.; FREUNDT, E.; BAEHRECKE,
E. H.; LENARDO, M. Autophagic programmed cell death by selective catalase
degradation. PNAS, v. 103, n. 13, p. 4952–4957, 2006.
![[Michelson borges] Duvidar para crer](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/55ca8968bb61ebc44c8b457b/michelson-borges-duvidar-para-crer.jpg)
