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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRO-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Programa de Pós-graduação em Ciência Animal
MARCONI BOMFIM DE SANTANA
ALTERNATIVAS AOS ANTIMICROBIANOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO PARA LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS
DESAFIADOS COM E. coli K99+
ILHÉUS - BAHIA - BRASIL
2013
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MARCONI BOMFIM DE SANTANA
ALTERNATIVAS AOS ANTIMICROBIANOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO PARA LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS
DESAFIADOS COM E. coli K99+
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa
Cruz, como parte das exigências
para obtenção do título de Mestre
em Ciência Animal. Área de
concentração: Comportamento e
Produção Animal.
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL
2013
3
MARCONI BOMFIM DE SANTANA
ALTERNATIVAS AOS ANTIMICROBIANOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO PARA LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS
DESAFIADOS COM E. coli K99+
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Comportamento e Produção Animal.
Ilhéus – BA, 22/02/2013
BANCA EXAMINADORA
Leandro Batista Costa – DSc
UESC/DCAA
(Orientador)
Luís Gustavo Tavares Braga - DSc
UESC/DCAA
Valdomiro Shigueru Miyada – PhD
ESALQ/USP
4
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO – UESC/BA
S232 Santana, Marconi Bomfim de. Alternativas aos antimicrobianos promotores de cresci- mento para leitões recém-desmamados desafiados com E. coli K99+ / Marconi Bomfim de Santana. - Ilhéus: UESC, 2013 64f. Orientador: Leandro Batista Costa. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Mestrado em Ciência Animal. Inclui referências e apêndices.
1. Nutrição animal. 2. Alimentação animal. 3. Suínos- Alimentação. 4. Suínos - Nutrição. I. Costa, Leandro Batis- ta (orientador). II. Título.
CDD – 636.085
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
5
DEDICATÓRIA
“Dedico esta dissertação a minha família pela fé e confiança demonstrada”
“Aos meus amigos pelo apoio incondicional”
“Aos professores pelo simples fato de estarem dispostos a ensinar”
“Aos orientadores pela paciência demonstrada no decorrer do trabalho”
“Enfim, a todos que de alguma forma tornaram este caminho mais fácil de ser”
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por me dar saúde, conceber forças para
sempre prosseguir na jornada da vida, por proporcionar sempre no meu interior
fé incondicional.
Ao meu pai José Raimundo Silva de Santana pelo incontestável exemplo de
vida, inspiração como pai e como homem, amor incondicional.
À minha mãe Tânia C. Bomfim de Santana, por seu carinho e preocupação
com esse filho querido, amor incondicional.
Ao meu orientador Leandro Batista Costa, pelos ensinamentos, pela confiança
e por essa grande oportunidade em minha vida.
Aos eternos amigos e companheiros André Bomfim, Keko, Ivan Ferraz,
Neomara Lisboa, Arthur Sampaio, Ives Samir, Renan Bombinho, Roberto
Marinho a quem sempre posso contar, irmãos que escolhi.
À minha namorada Erica Novaes, pelo carinho, compreensão, respeito e acima
de tudo, amor.
Aos grandes amigos e colegas Diego Brandão e Daniel Cruz pelo incontestável
apoio, e por estarem presentes em todos os momentos desta jornada.
À Gabriela Borges, Inara Leal e Tainá Coutinho pela amizade e pela ajuda na
conclusão deste trabalho.
7
Às amigas do laboratório de micologia Poly, Clarinha, Candice e Gilvia pela
amizade e carinho.
Aos colegas de sala Junior Oliveira, Kauana, Felipe e Licuri.
À colega Carla Andrade (ESALQ/USP) pela ajuda na realização das análises
estatísticas.
Aos amigos da UFLA – MG, Vinícius Cantarelli, Cezar Garbossa, Fernando
Moraes, Josiane Nascimento, Hebert e toda galera do NESUI pelo apoio,
receptividade e amizade.
À Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC pela estrutura acadêmica para
que eu pudesse concluir este trabalho.
À Universidade Federal de Lavras - UFLA pelo apoio e parceria para realização
do experimento.
À empresa Auster Nutrição Animal LTDA pelo apoio e fornecimento de
materiais para a conclusão deste trabalho.
À FAPESB pelo apoio financeiro através da bolsa de estudo.
Aos professores que contribuíram com as análises do experimento,
Roberta Hilsdor (UFLA), José Augusto Azevêdo, Fabiana Lessa Silva, Amauri
Arias Wenceslau, Antônio Roberto Paixão, João Luciano Andreoli, George
Albuquerque e Renato Fontana (UESC).
8
ALTERNATIVAS AOS ANTIMICROBIANOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO PARA LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS DESAFIADO S
COM E. coli K99+
RESUMO
Foi conduzido um experimento para avaliar os efeitos da mistura de
extratos vegetais, butirato de sódio e nucleotídeos, sobre o desempenho, a
histologia do epitélio intestinal, a morfometria dos órgãos e o pH do conteúdo
digestório de leitões recém-desmamados desafiados com E. coli K99+. Foram
utilizados 90 leitões híbridos comerciais, com idade média de 21 dias e peso
médio inicial e final de 6,35 ± 0,34 e 17,15 ± 2,08 kg, respectivamente. Os
leitões foram distribuídos em um delineamento em blocos casualizados
completos, com cinco tratamentos, seis repetições por tratamento e três
animais por unidade experimental (dois machos e uma fêmea ou duas fêmeas
e um macho). Os tratamentos testados foram: Controle - dieta basal;
Antimicrobiano – dieta basal com 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm –
dieta basal com 1000 ppm de extratos vegetais + butirato de sódio +
nucleotídeos; 1500 ppm – dieta basal com 1500 ppm de extratos vegetais +
butirato de sódio + nucleotídeos e 2000 ppm – dieta basal com 2000 ppm de
extratos vegetais + butirato de sódio + nucleotídeos. Os aditivos foram
compostos de 32% de butirato de sódio, 2% a 3% de nucleotídeos obtidos da
hidrólise da levedura Saccharomyces cerevisiae e 5% de extratos vegetais,
sendo 2% de Glycyrrhiza glabra (raiz doce), 1,5% de Rosmarinus officinalis
(alecrim) e 1,5% de Peumus boldus (bodo). No sétimo dia de experimento (28
dias de idade) os animais foram privados de água e ração por 3 horas.
9
Posteriormente receberam via intragástrica 60 mL da solução de bicarbonato
de sódio na concentração de 1,4 % (p/v) para neutralizar o pH gástrico.
Decorridos 30 minutos, os leitões foram infectados com E. coli - K99+, na
concentração de 5,0 x 109 ufc/mL, voltando a receber ração e água a vontade
após 2 horas da infecção. O experimento teve duração de 35 dias e ao final,
após jejum de 12h, foi abatido um animal por gaiola (unidade experimental)
para avaliação da histologia do epitélio intestinal, da morfometria de órgãos e
do pH do conteúdo digestório. O animal abatido foi escolhido de acordo com o
peso vivo sendo aquele que apresentava o peso mais próximo da média do
peso dos animais de cada unidade experimental. Para determinação das
variáveis de desempenho, os animais foram pesados no início, aos 14 dias e
aos 35 dias de experimentação, sendo quantificadas as rações consumidas e
as sobras. Não foram observadas diferenças (P<0,05) para o desempenho,
para a histologia intestinal, para a morfometria dos órgãos e para o pH do
conteúdo digestório através da análises de polinômios ortogonais ou mesmo
pelos contrastes de interesse. De um modo geral, o sulfato de colistina e a
combinação de extratos vegetais, de butirato de sódio e de nucleotídeos não
foram eficientes em promover melhora nas características produtivas de leitões
recém-desmamados desafiados com E. coli K99+.
Palavras-chave: butirato de sódio, extratos vegetais, nucleotídeos, nutrição, suínos
10
ALTERNATIVES TO ANTIMICROBIAL GROWTH PROMOTERS FOR
WEANLING PIGS CHALLENGED WITH E. coli K99+
ABSTRACT
An experiment was conducted to evaluate the effects of plant extracts
mixture, sodium butyrate and nucleotides on the performance, intestinal
epithelial histology, morphometry of organs and pH of the digestive contents of
weanling pigs challenged with E. coli K99+. A total of 90 commercial hybrid
piglets were used; these piglets had a average age of 21 days and average
initial and final weights of 6.35 ± 0.34 and 17.15 ± 2.08 kg, respectively. The
piglets were distributed in a randomized complete block design with five
treatments, six replication per treatment and three animals per experimental unit
(two males and one female or two females and one male). The treatments
were: Control – basal diet; Antimicrobial – basal diet with 40 ppm colistin
sulfate; 1000 ppm – basal diet with 1000 ppm of a mixture of plant extracts +
sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm – basal diet with 1500 ppm plant
extracts + sodium butyrate + nucleotides; and 2000 ppm – basal diet with 2000
ppm plant extracts + sodium butyrate + nucleotides. The additives were
composed of 32% sodium butyrate, 2% to 3% nucleotides prepared from
Saccharomyces cerevisiae yeast hydrolysis and 5% plant extracts, including 2%
Glycyrrhiza glabra (sweet root), 1.5% Rosmarinus officinalis (rosemary) and
1.5% Peumus boldus (boldo). The animals were deprived of food and water for
3 h on the seventh day of the experiment (28 days old). Subsequently, the
piglets received 60 mL of a sodium bicarbonate solution at a concentration of
11
1.4% (w/v) intragastrically to neutralize the gastric pH. After 30 minutes, the
piglets were infected with E. coli K99+, at a concentration of 5.0 x 109 cfu/mL,
and were given food and water ad libitum 2 h after infection. The experiment
lasted 35 days, and at the end, following a 12 h fast, one animal per pen
(experimental unit) was slaughtered to assess the intestinal epithelium
histology, morphometry of the organs and pH of the digestive contents. The
selected slaughtered animal was the animal whose live weight was closest to
the animals’ average weight in each experimental unit. The animals were
weighed to assess the performance variables at the beginning of the
experiment, at day 14 and at day 35 of the experiment, quantifying the
consumed feed and the excess. No differences were found (P < 0.05) regarding
the performance, intestinal histology, morphometry of the organs and pH of the
digestive contents through the analysis of orthogonal polynomials or even by
the contrasts of interest. In general, colistin sulfate and the combination of plant
extracts, sodium butyrate and nucleotides were not effective in promoting
improvement of the productive characteristics of weanling pigs challenged with
E. coli k 99+.
Keywords: , herbal extracts, nucleotides, nutrition, pigs, sodium butyrate
13
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 15
2. OBJETIVO ............................................................................................................ 17
3. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 18
3.1. SISTEMA DIGESTÓRIO DE LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS E INCIDÊNCIA DE DIARREIA ................................................................................... 18
3.2. Escherichia coli (E. coli) .................................................................................... 20
3.3. NUCLEOTÍDEOS .............................................................................................. 22
3.4. ÁCIDOS ORGÂNICOS ..................................................................................... 24
3.5. EXTRATOS VEGETAIS ................................................................................... 26
4. ARTIGO CIENTÍFICO ......................................................................................... 31
4.1. Introduction ........................................................................................................ 34
4.2. Materials and Methods ..................................................................................... 36
4.2.1.Animals and facilities ............................................................................... 37
4.2.2.Experimental diets ................................................................................... 37
4.2.3.Animal infection ....................................................................................... 38
4.2.4.Samplings and measurements ................................................................ 39
4.2.5.Statistical analysis ................................................................................... 40
4.3. Results ................................................................................................................ 40
4.3.1.Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day ......... 40
4.3.2.Performance from day 1 to day 14 .......................................................... 40
4.3.3.Performance from day 1 to day 35 .......................................................... 41
4.3.4.Intestinal epithelium histology .................................................................. 41
4.3.5.Morphometry ........................................................................................... 41
4.3.6.pH of the digestive contents .................................................................... 41
4.4. Discussion .......................................................................................................... 41
14
4.4.1.Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day ......... 41
4.4.2.Performance from day 1 to day 14 .......................................................... 42
4.4.3.Performance from day 1 to day 35 .......................................................... 43
4.4.4.Intestinal histology ................................................................................... 46
4.4.5.Morphometry ........................................................................................... 47
4.4.6.pH of the digestive contents .................................................................... 48
4.5. Conclusion ......................................................................................................... 49
4.6. References ........................................................................................................ 49
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 59
APÊNDICES ........................................................................................................... 662
ANEXOS ................................................................................................................. 74
15
1. INTRODUÇÃO
A globalização da suinocultura moderna tem ocasionado mudanças
importantes na produção suinícola mundial. A intensificação da produção de
carne suína, no intuito de atender à demanda populacional cada vez maior,
tornou este produto a fonte de proteína animal mais produzida e mais
consumida em todo o mundo (FAO, 2013)
No entanto, a produção cada vez mais intensiva da suinocultura
predispõe os animais ao estresse, tornando-os mais susceptíveis a problemas
entéricos, causando alterações na microbiota intestinal responsáveis pela
diminuição da produtividade. A diarreia pós-desmame é um dos principais
problemas entéricos na produção de suínos, podendo ser causada pela
colonização do epitélio intestinal por microrganismos patogênicos como
Escherichia coli enterotoxinogênica, Salmonella typhimurium e Clostridium spp
(STEWART; CHESSON, 1993).
Desde a década de 50, os aditivos antimicrobianos vêm sendo utilizados
na produção de suínos com o intuito de aumentar a produtividade dos animais
criados em condições cada vez mais intensivas, aumentando a taxa de
crescimento e a eficiência alimentar, por inibir o metabolismo bacteriano,
reduzindo a competição direta pelos nutrientes entre as bactérias e o
hospedeiro (BUTOLO, 1999).
Apesar da comprovada capacidade de aumentar o desempenho de
suínos, o uso de antimicrobianos como promotores de crescimento vem sendo
restringido em vários países. Desde a proibição do uso de antibióticos na
alimentação animal pela União Europeia em 2006, os estudos vêm sendo
intensificados na busca por produtos alternativos que garantam máximo
crescimento dos animais sem afetar a qualidade do produto final. Dentre estes
produtos estão os probióticos, prebióticos, ácidos orgânicos, nucleotídeos,
óleos essenciais, extratos vegetais e outros ingredientes alimentares
adicionados às dietas dos animais (LALLÈS et al., 2009).
Na literatura há evidências dos efeitos benéficos da utilização de
extratos vegetais (HUANG et al., 2010; OETTING et al., 2006; WINDISCH et
16
al., 2008; YAN et al., 2012), ácidos orgânicos (MANZANILLA et al., 2006; PIVA
et al., 2002; ROTH; KIRCHGESSNER, 1998) e nucleotídeos (ABREU et al.,
2010; ANDRADE et al., 2011; CARLSON; VEUM, 2001) na alimentação de
suínos. No entanto, os conhecimentos sobre a eficácia desses grupos de
aditivos, utilizados conjuntamente em dietas para leitões recém-desmamados,
são escassos e pouco conclusivos, necessitando de mais estudos que possam
comprovar seus efeitos como potenciais substitutos dos antibióticos e
quimioterápicos promotores de crescimento de suínos.
17
2. OBJETIVO
Avaliar os efeitos de extratos vegetais, butirato de sódio e nucleotídeos
sobre o desempenho, a histologia do epitélio intestinal, a morfometria dos
órgãos e o pH do conteúdo digestório de leitões recém-desmamados
desafiados com E. coli K99+.
18
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. SISTEMA DIGESTÓRIO DE LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS
E INCIDÊNCIA DE DIARREIA
Na suinocultura, para que haja máximo aproveitamento do potencial
genético dos animais, é necessário que sejam supridos de adequados aportes
de nutrientes (carboidratos, lipídios, aminoácidos, minerais e vitaminas), sendo
que tal processo ocorre pela digestão dos alimentos e absorção dos nutrientes.
Digestão é o processo no qual as macromoléculas são quebradas em
moléculas menores. Por outro lado, a absorção é o transporte destas pequenas
moléculas através da membrana plasmática das células intestinais. Estes dois
processos são extremamente importantes para assimilação de nutrientes pelo
organismo e, consequentemente, para o desenvolvimento do animal. Não há
absorção sem uma prévia digestão, da mesma forma que é inviável se os
nutrientes digeridos não puderem ser absorvidos. Para que ocorra um processo
de digestão e absorção eficiente faz-se necessário a manutenção da
integridade das células epiteliais da mucosa intestinal (MAIORKA et al., 2002).
Dentro do sistema de produção da suinocultura intensiva é praticada a
desmama dos leitões dos 14 aos 28 dias de idade, conhecida como desmama
precoce, com o intuito de maximizar a produção. Esta prática é comercialmente
vantajosa, contudo é considerada um evento bastante estressante para os
neonatos. Em muitos casos está ligada ao crescimento de bactérias
patogênicas no trato gastrintestinal, à atrofia das vilosidades intestinais, ao
aumento na incidência de diarreia (FRYDENDAHL, 2002), ao baixo
desempenho (ODLE et al., 1996) e ao aumento da mortalidade dos animais
(McCRACKEN et al., 1999).
Os leitões possuem sistema digestório imaturo, no qual é insuficiente a
secreção de ácido clorídrico (HCl) no estômago, além de limitada produção e
atividade de enzimas pancreáticas e intestinais, propiciando menor digestão e
absorção de nutrientes. Além disso, a desmama precoce causa alterações na
fisiologia dos leitões e induz à elevação do pH estomacal, provocando redução
na atividade bactericida gástrica (HENTON; HUNTER, 1994).
19
O sistema digestório dos leitões está adaptado ao leite materno,
havendo, nesta fase, maior produção de lactase (enzima responsável pela
degradação da lactose do leite). No entanto, com o amadurecimento do animal
e a ingestão de dietas sólidas, há redução na atividade desta enzima e
produção de outra enzima (pepsina). O fornecimento gradativo de dieta sólida,
substituindo os produtos lácteos por fontes de proteína vegetal, irá estimular a
produção de HCl no estômago, promovendo a queda do pH. Além disso,
através de estímulos hormonais, a chegada do quimo mais ácido ao intestino
delgado estimulará a produção de enzimas pancreáticas (tripsina,
quimotripsina, amilase e lipase) e intestinais (maltase, sacarase e
aminomeptidase dentre outras) promovendo maior digestão dos nutrientes da
dieta (CUNNINGHAM, 1992).
No entanto, com a desmama é observado histologicamente redução na
altura dos vilos e aumento na profundidade de criptas. A atrofia das vilosidades
pode ser provocada por redução na taxa de renovação celular e ou maior taxa
de perda celular (COSTA et al., 2011), predispondo os animais à problemas
entéricos (diarreia).
A diarreia é o aumento da frequência de defecação ou maior volume de
fezes, que pode estar relacionada ao desequilíbrio entre os mecanismos
secretórios, absortivos e regulatórios relacionados ao trato gastrintestinal. A
diarreia pode ser classificada em três principais categorias: diarreia secretória,
mal absortiva e efusiva (MOESER; BLIKSLAGER, 2007). Na diarreia secretória
ocorre excesso de secreção de fluidos ultrapassando a capacidade absortiva
do intestino resultando em disfunção fisiológica. Esse tipo de diarreia é
causada principalmente pelas toxinas termolábeis (LT) e termoestáveis (ST)
produzidas por Escherichia coli. A toxina LT liga-se a receptores presentes nos
enterócitos causando secreção de cloreto e saída de sódio e água da célula
por osmose. A ST inibe a absorção de água pelos enterócitos. Além destas
toxinas, outros fatores estão associados à diarreia secretória através da
estimulação de reflexos nervosos como prostaglandinas, citocinas, histaminas
e quininas (DUBREUIL, 2008).
A diminuição da área absortiva do intestino grosso, independente da
causa, resulta na redução de absorção de água e eletrólitos. Este excesso de
água e solutos não absorvidos pelo intestino delgado passam para o intestino
20
grosso, ultrapassando sua capacidade absortiva, resultando em diarreia
malabsortiva. Lesões na mucosa do epitélio intestinal como microlesões ou
esfoliações da membrana celular podem favorecer a passagem de fluidos
intersticiais para a luz intestinal, promovendo a diarreia efusiva (BROWN et al.,
2007).
3.2. Escherichia coli (E. coli)
A E. coli faz parte de um grupo pertencente à família das
enterobactérias, denominados como bacilos gram-negativos, anaeróbicos
facultativos e que colonizam o trato gastrintestinal da espécie humana e
animais homeotérmicos. Em leitões, a E. coli é a principal responsável pela
diarreia, doença do edema e septicemia. Contudo, as maiores perdas
econômicas para a suinocultura intensiva estão associadas com as duas
primeiras patologias, sendo a diarreia causada pelas cepas de E. coli uma das
principais responsáveis pela morbidade e mortalidade em leitões recém-
desmamados (WILSON; FRANCIS, 1986).
De um modo geral, a E. coli permanece inofensiva no trato
gastrintestinal dos animais, no entanto, em situações adversas, no qual o
hospedeiro encontra-se enfraquecido e imunologicamente debilitado, cepas
não patogênicas destas bactérias podem causar infecções. As fezes são a
principal fonte de contaminação para animais susceptíveis e, em condições
ideais de umidade e temperatura, a E. coli pode sobreviver por até 11 semanas
(BRITO et al., 1999). O mecanismo de ação da sua patogenicidade está
baseado na lesão denominada “Attaching and Effacing” que é caracterizado
pela fixação do microrganismo às paredes do epitélio intestinal havendo
destruição das vilosidades (TRABULSI et al., 2002).
A E. coli é considerada uma das espécies mais versáteis em virtude da
sua capacidade de adaptação a diferentes ambientes e também pela
particularidade quanto ao mecanismo de patogenicidade e virulência. Ela é
capaz de provocar infecções entéricas conhecidas como Escherichia coli
diarreiogênicas (DEC) que são classificadas principalmente em: E. coli
enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli produtora de
toxina de shigas (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli
21
enteroinvasora (EIEC) e E. coli que adere de forma difusa à parede do epitélio
intestinal (DAEC) (KAPER et al., 2004).
A identificação de cepas de E. coli pode ser realizada através da técnica
de reação em cadeia da polimerase (PCR) por determinação de fatores de
virulência como hemolisinas, exotoxinas, sideróforos, endotoxina e adesinas
presentes na parede celular do microrganismo. Além disso, a E. coli também
apresenta diversos sorotipos de acordo com a presença de diferentes
antígenos fimbriais, somáticos e capsulares, os quais podem ser determinados
pela utilização de antisoros (BERTSCHINGER et al., 1990).
A tipificação sorológica é fundamental para caracterização da espécie.
Este agente é classificado em sorogrupos e sorotipos com base em seus
antígenos de superfície e fimbriais: antígenos (O) somáticos, antígenos (H)
flagelares, antígenos (K) capsulares e (F) fimbriais, que são importantes na
patogênese (KAPER et al., 2004). Na literatura existem 183 antígenos O, 53
antígenos H e 100 antígenos K (ORSKOV; ORSKOV, 1992).
A maior enfermidade entérica que acomete suínos neonatos e recém-
desmamados é a colibacilose, podendo ser provocada por cepas de ETEC.
Esta enfermidade, na maioria dos casos, pode provocar diarreia branda sem
nenhuma evidência de desidratação até sinais de severa desidratação
caracterizados por fezes amareladas e aquosas ou sanguinolentas
(BERTSCHINGER et al., 1990).
Esta bactéria adere-se a mucosa intestinal dos leitões através da
presença de adesinas fimbriais, como por exemplo a K88 (F4) e a K99 (F5),
que são responsáveis pela ligação a receptores específicos nas células do
epitélio intestinal com posterior produção de toxinas termolábeis (LT I e LT II) e
termoestáveis (STa e STb). Dentre as fímbrias, a F4 e a F5 são as principais
encontradas em isolados de fezes de leitões recém-desmamados com diarreia
(LUA et al., 1977), sendo que o gene responsável por sua expressão está
localizado no mesmo plasmídeo que apresenta o gene da hemolisina.
As toxinas LT estão correlacionadas tanto em função quanto em
estruturas às enterotoxinas da cólera, expressa pelo Vibrio cholerae (SIXMA et
al., 1993). Estas toxinas são divididas em dois grupos sendo a LT I presente
em cepas de E. coli patogênica tanto para humanos como para animais e a LT
II raramente observadas em humanos, porém são encontradas principalmente
22
em cepas isoladas de animais. As toxinas ST são responsáveis por causar
danos histológicos às células epiteliais devido à atrofia parcial ou perda das
vilosidades intestinais (CHAO; DREYFUS, 1997).
Além de suínos, outras espécies animais como ruminantes, macacos,
cães e humanos podem ser acometidos pela EPEC (TENG et al., 2004).
Contudo, é na suinocultura que os problemas com diarreia neonatal e pós-
desmama estão associados à presença deste microrganismo. A EPEC adere-
se às células epiteliais do intestino delgado e grosso, contudo, o duodeno e o
ceco são os locais de maior prevalência destes microrganismos
(BERTSCHINGER et al., 1990). A adesão da E. coli ao epitélio intestinal
provoca degeneração dos enterócitos, causando rearranjo no citoesqueleto da
célula e encurtamento das microvilosidades (GYLES; FAIRBROTHER, 2004).
3.3. NUCLEOTÍDEOS
Os nucleotídeos são compostos naturais, essenciais por participar de
processos metabólicos importantes como a produção de DNA e RNA. É
formado por uma base nitrogenada, um monossacarídeo pentose, e de um a
três grupos fosfato. Quando há ausência do grupo fosfato o composto é
conhecido como nucleosídeo. As bases nitrogenadas podem ser púricas
(adenina, guanina) ou pirimídicas (citosina, timina e uracila) (CHAMPE;
HARVEY, 1996).
O núcleo das células (nucleoproteína) é a principal fonte de nucleotídeo
das dietas. O processo de digestão inicia-se quando as nucleoproteínas são
clivadas pelas proteases, liberando ácidos nucleicos. Em seguida sofrem
hidrólise parcial no estômago, havendo exposição às fosfoesterases e às
nucleases pancreáticas, dando origem aos nucleotídeos e aos nucleosídeos,
no qual mais de 90% de todo o nucleotídeo ingerido é absorvido pelo
organismo (UAUY et al., 1994).
Os nucleotídeos atuam em vários processos bioquímicos essenciais
para o funcionamento do organismo (LEHNINGER et al., 1995). A principal
função dos nucleotídeos, no animal, é a reação de transferência de grupos
fosfatos tanto do ATP como de outros nucleotídeos trifosfato. Atuam como
transportadores imediatos na síntese de alguns carboidratos, lipídios e
23
proteínas, além de componentes estruturais de coenzimas essenciais, como a
coenzima A (CoA), a flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e a nicotinamida
adenina dinucleotídeo (NAD+) (RODWELL et al., 2002). Os nucleotídeos não
são considerados essenciais nutricionalmente, pois é sintetizado pelo
organismo pela via de novo utilizando aminoácidos como precursores ou a
partir da degradação de nucleotídeos e aminoácidos da dieta por via de
salvamento. Contudo, em circunstância de rápido crescimento, estado de
doença, distúrbio endógeno ou consumo limitado de nutrientes, o organismo
necessita de quantidades maiores do que são sintetizados ou absorvidos,
passando a ser considerado semi ou até mesmo essenciais (GARCIA, 2007).
Em tecidos e órgãos como o cérebro, medula óssea, eritrócitos e
mucosa intestinal, onde a divisão mitótica é extremamente rápida, os
nucleotídeos dietéticos apresentam papel importante tornando disponíveis
bases e nucleosídeos que podem ser prontamente utilizados na síntese de
nucleotídeos via salvamento. Além disso, os nucleotídeos podem favorecer o
crescimento de algumas bactérias benéficas da microbiota intestinal como as
bifidobactérias, semelhantes às encontradas no leite materno. Esses
microrganismos, em virtude do seu metabolismo, diminuem o pH do meio
inibindo o crescimento de enterobactérias responsáveis por inúmeras doenças
e distúrbios entéricos como a diarreia (PELÍCIA et al., 2010).
Os nucleotídeos desempenham importante papel na manutenção e
desenvolvimento do trato gastrintestinal (UAUY et al., 1994). Além disso,
apresentam efeitos benéficos na altura das vilosidades e na profundidade das
criptas (DELL’ORTO, et al., 2002). Uauy et al. (1994) observaram que a
suplementação de 0,8% de nucleotídeos em dietas para ratos jovens promoveu
maior altura de vilosidades e aumento no conteúdo de proteína total e de DNA
no intestino. Andrade et al. (2011), estudando diferentes concentrações de
nucleotídeos em dietas para leitões recém-desmamados, observaram redução
linear (P<0,01) da profundidade de criptas e aumento linear (P<0,01) da
relação altura de vilosidade/profundidade de cripta no duodeno dos leitões com
a inclusão de níveis crescentes de nucleotídeos.
Apesar dos resultados favoráveis encontrados por alguns autores
(ABREU et al., 2010; ANDRADE et al., 2011; PELÍCIA et al., 2010), ainda são
24
necessários mais estudos para esclarecer os modos de ação e os níveis ideais
deste aditivo na alimentação de leitões recém-desmamados.
3.4. ÁCIDOS ORGÂNICOS
Os ácidos orgânicos (ácidos graxos de cadeia curta) são constituintes
naturais de tecidos animais e de plantas, estando amplamente distribuídos na
natureza podendo, também, ser produzidos a partir da fermentação de alguns
microrganismos no trato gastrintestinal de suínos (PARTANEN; MROZ, 1999).
Contêm uma ou mais carboxilas em sua molécula, apresentando de um a sete
carbonos dissociados, sendo considerados ácidos fracos, podendo ser
encontrados na forma livre e em sais de potássio, cálcio e sódio (DIBNER;
BUTTIN, 2002).
Na indústria alimentícia, os ácidos orgânicos são utilizados há algumas
décadas como conservantes de alimentos, protegendo contra microrganismos
e aumentando a conservação de alimentos fermentados, como as silagens
(CANIBE et al., 2001), além de conferir odor, sabor e cor às bebidas e aos
alimentos de uma forma geral (MROZ, 2005). Na alimentação animal tem-se
explorado o uso de acidificantes em diferentes combinações e níveis, buscando
melhorar cada vez mais os índices produtivos. Na literatura são encontrados
trabalhos com resultados satisfatórios na digestibilidade das proteínas, dos
aminoácidos e da energia (BLANK et al., 1999; GABERT; SAUER, 1995), além
do seu efeito antimicrobiano sobre patógenos existentes no trato gastrintestinal
dos animais (HANSEN et al., 2007; WALSH et al., 2007).
Os ácidos orgânicos, na sua forma livre, são voláteis apresentando
sabor e odor muito forte, além de pouca solubilidade em água. Contudo, a
utilização destes aditivos na alimentação animal ocorre após o encapsulamento
das moléculas com coadjuvantes lipídicos, permitindo que estes ácidos não
volatilizem, não interferindo na palatabilidade e, consequentemente, no
consumo dos animais (MROZ, 2005). O processo de encapsulamento faz com
que os ácidos possam chegar ao intestino delgado sem que sofram uma prévia
hidrólise no estômago. Desta forma, o ácido poderá chegar intacto as partes
posteriores do trato digestório (duodeno, jejuno íleo e intestino grosso)
podendo promover a redução do pH intestinal, aumentando sua eficiência no
25
controle de microrganismos patogênicos que competem com o hospedeiro
pelos substratos digeridos (MROZ et al., 2000).
Para os ácidos orgânicos, quanto maior for a constante de dissociação
(K) menor será o pKa do ácido, sendo assim, maior será o poder acidificante
deste aditivo e, consequentemente, mais eficiente a inibição da atividade
microbiana. A forma não dissociada dos ácidos permite que estes adentrem o
citoplasma dos microrganismos através da membrana celular. No interior da
célula microbiana o ácido pode dissociar-se em cátions e prótons reduzindo o
pH citoplasmático, no qual até então é mantido em torno de 7,0, promovendo a
morte da célula do microrganismo por desnaturação da proteína e do DNA,
além de comprometer outros processos vitais (CHERRINGTON et al., 1991),
como transporte de substratos e fosforilação oxidava (VIOLA; VIEIRA, 2003).
A inibição de alguns microrganismos que habitam a microbiota intestinal
de suínos como a E. coli e a Salmonella, que competem com o animal pelos
nutrientes e, consequentemente, causa diversos problemas entéricos, é um
importante objetivo da utilização dos ácidos orgânicos. Alguns estudos têm
demonstrado o efeito antimicrobiano de ácidos orgânicos em combater
microrganismos patogênicos, diminuindo a mortalidade de leitões recém-
desmamados (CANIBE et al., 2001; PAPENBROCK et al., 2005). Knarreborg et
al. (2002), avaliando a eficiência de alguns ácidos orgânicos sobre a população
de coliformes observaram diminuição do crescimento destas bactérias, no qual
o ácido benzóico apresentou maior efeito quando comparado ao ácido
propiônico.
Blank et al. (2001), estudando a utilização de ácido fumárico em dietas
para suínos, observaram redução da atividade microbiana no intestino delgado,
verificado a partir das baixas concentrações de produtos da sua fermentação
como amônia, aminas, ácido láctico e lipopolissacarídeos (usados como
indicador do número de bactérias gram-negativas). Kasprowicz-Potocka et al.
(2009) observaram efeito modulador no padrão de AGV no intestino delgado de
suínos alimentados com formiato de sódio e com ácido benzóico. Os ácidos
orgânicos podem ter efeito direto na histologia do epitélio intestinal, uma vez
que produtos da fermentação microbiana como AGV estimulam a proliferação
de células intestinais (PARTANEN; MROZ, 1999). Owusu-Asiedu et al. (2003),
avaliando a adição de ácido fumárico em dietas para suínos, observaram maior
26
altura das vilosidades e maior relação altura de vilosidades/profundidade de
cripta do jejuno, podendo o ácido fumárico ter reduzido a colonização de
bactérias patogênicas no trato gastrintestinal dos animais.
Dentre os ácidos orgânicos estudados como substitutos dos
antimicrobianos na dieta de leitões recém-desmamados, destaca-se o butirato
de sódio (forma molecular C4H7O2Na) (Figura 1).
Figura 1. Fórmula molecular do butirato de sódio
Os benefícios da adição do butirato de sódio na alimentação animal
estão relacionados à modulação da microbiota intestinal (CASTILLO et al.,
2006), a maior absorção de água e sódio (BOND et al., 1976), além de
importante função reguladora na proliferação e na diferenciação de células
intestinais (SENGUPTA et al., 2006). Segundo Costa et al. (2011) o butirato de
sódio é considerado um possível substituto dos antimicrobianos promotores de
crescimento em dietas para leitões recém-desmamados.
3.5. EXTRATOS VEGETAIS
A utilização de extratos vegetais e plantas medicinais para o tratamento
de doenças e enfermidades é considerada uma prática milenar. Desde a Idade
Média, os árabes utilizavam os extratos de plantas e óleos essenciais na
conservação de alimentos, para embalsamamento de corpos, como anti-
inflamatórios e analgésicos locais (BAKKALI et al., 2008). Esses aditivos fazem
parte de uma classe de produtos como potenciais substitutos aos
antimicrobianos e, devido à preocupação da população por alimentos mais
saudáveis, vêm sendo utilizados em diversas pesquisas relacionadas à
alimentação animal. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a
27
melhor fonte para obtenção de drogas são as plantas medicinais (BRASIL,
2006).
Os óleos essenciais são produtos voláteis extraídos de plantas com
potencial medicinal, através do processo de destilação por arrastamento com
vapor de água ou destilação sob pressão. Estes são misturas altamente
complexas que podem conter inúmeras substâncias com composições
químicas variadas. A principal diferença entre óleo essencial e extrato vegetal é
o método de extração (LANGHOUT, 2005). Os extratos são preparados por
percolação e maceração, utilizando como solvente o etanol ou a água ou outro
carreador que posteriormente possa ser eliminado (ANVISA, 2005).
Estas plantas possuem diferentes mecanismos de defesa podendo ser:
mecânicas (espinhos, células pétreas, folhas com bordas cortantes) e as
químicas (substâncias que tornam as folhas, raízes e outras partes das plantas
indigeríveis, tóxicas ou impalatáveis) (OETTING, 2005). Atravez de técnicas
laboratoriais foi possível isolar princípios ativos presentes em diferentes fontes
vegetais. Segundo Martins et al. (2000) princípios ativos são componentes
químicos que podem estar presentes em diferentes partes das plantas, ou
áreas especificas, conferindo às plantas medicinais alguma atividade
terapêutica.
As substâncias ativas presentes em diferentes partes das plantas podem
ser classificadas de acordo com suas características físicas, químicas ou
biológicas. De acordo com Martins et al. (2000), glucosídeos, alcalóides,
saponinas, compostos fenólicos, mucilagem, terpenoides, flavonóides, taninos
e óleos essenciais são os principais princípios ativos produzidos pelas plantas.
Segundo a ANVISA (2005), os extratos vegetais devem conter os princípios
aromáticos, sápidos, voláteis e fixos correspondentes ao respectivo produto
natural. No entanto, o processo de interação das plantas com o meio ambiente
pode influenciar diretamente na composição e na qualidade dos extratos
vegetais, além dos métodos de extração que também podem influenciar na
qualidade do produto final.
Para os extratos vegetais, todas as moléculas são extraídas totalmente
(extrato bruto), não havendo interesse no isolamento específico de uma ou
mais substâncias. A presença de vários compostos em apenas um só produto
pode apresentar efeitos sinérgicos, conferindo aos extratos vegetais maior
28
vantagem quando comparados aos antimicrobianos tradicionais com apenas
um princípio ativo (KAMEL, 2000).
Os principais benefícios associados ao uso de extratos vegetais estão
relacionados com a melhora na palatabilidade da ração, no estímulo da
secreção de enzimas endógenas, na modulação da microbiota intestinal e na
redução de infecções subclínicas (LAUGHOUT, 2005). Segundo Kohlert et al.
(2000), os compostos presentes nos extratos vegetais são rapidamente
metabolizados e absorvidos no trato digestório dos animais, levando a acreditar
que haja um risco mínimo de acúmulo nos tecidos, tornando este aditivo
fitogênico uma alternativa aos antibióticos promotores de crescimento.
A atividade antimicrobiana é mais um dos efeitos relacionados ao uso
dos extratos vegetais, que é determinada pela quantidade de substância
necessária para inibir o crescimento de um determinado microrganismo
(OSTROSKY et al., 2008). O método mais utilizado e recomendado para
determinação da atividade antimicrobiana é o de microdiluição em placas, pois
esta metodologia possibilita maior número de repetições, aumentando a
confiabilidade do resultado (MENDES et al., 2011).
Yan et al. (2012), estudando a atividade antimicrobiana de extratos
vegetais de trigo, tomilho, cúrcuma, pimenta do reino e gengibre em dietas para
leitões recém-desmamados, concluíram que a mistura de extratos foi capaz de
diminuir a concentração de E. coli fecal e melhorar o desempenho dos leitões.
Huang et al. (2011), avaliando a atividade antimicrobiana de diversas plantas
chinesas como alternativas aos antibióticos, concluíram que a combinação de
extratos possibilitou diminuição na contagem de coliformes no cólon dos
leitões.
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais e óleos essenciais deve-
se à capacidade de interação com a membrana celular do microrganismo,
promovendo desestabilização destas, através da alteração dos gradientes de
íons de Hidrogênio (H+) e Potássio (K+), provocando desnaturação e
coagulação das proteínas, resultando em perda do controle quimiosmótico da
célula afetada e, consequentemente, morte da bactéria (DORMAN; DEANS,
2000). A característica lipofílica, intrínseca aos extratos vegetais, é a
responsável pelo seu acúmulo na parede celular dos microrganismos e
posterior rompimento. As bactérias gram-negativas como E. coli e Salmonella
29
apresentam carácter hidrofílico devido a composição de sua membrana celular
(lipossacarídeos), formando uma barreira contra a permeabilidade de
substâncias hidrofóbicas como os extratos vegetais e óleos essências,
tornando estes microrganismos mais resistentes aos aditivos fitogênicos
(DORMAN; DEANS 2000).
Outra importante função dos extratos vegetais é seu efeito antioxidante
que está relacionado com a presença de compostos fenólicos, além de outros
compostos como terpenóides (presentes no carvacrol, eugenol e timol) e
flavonóides (presentes no tomilho e orégano).
Existem dois tipos de classificação para os antioxidantes: antioxidantes
primários, substâncias que interrompem a reação de oxidação lipídica através
da doação de hidrogênio (H+) ou elétrons aos radicais livres, transformando-os
em produtos mais estáveis e os antioxidantes secundários, compostos que
podem reduzir ou retardar a taxa de oxidação por hidroperóxidos (SHAHIDI;
NACZK, 2004). Os extratos vegetais retardam a oxidação dos constituintes
lipídicos presentes nos alimentos, aumentando a vida útil destes produtos. Na
indústria ainda é comum o uso de antioxidantes sintéticos como o BHT (butil
hidroxitolueno) e o BHA (butil hidroxianisol). Contudo, devido à possível
toxicidade destes e à demanda atual por produtos mais saudáveis, diversos
estudos têm sido desenvolvidos avaliando a adição de antioxidantes naturais
como alternativas mais saudáveis (HUANG et al., 2011; SELANI, 2010;
TRAESEL et al., 2011; YAN et al., 2012).
Henn et al. (2010), avaliando o potencial antioxidante do óleo essencial
de orégano em dietas para leitões recém-desmamados, concluíram que o
aditivo fitogênico é um excelente antioxidante, principalmente em inibir a
oxidação de ácidos graxos. Em outro estudo, no qual foi avaliado o efeito da
inclusão de flavonóides juntamente com mananoligossacarídeos na ração de
frangos de corte, foi observado menor oxidação da gordura da carcaça das
aves em comparação a outros aditivos (probióticos e antibióticos) (BATISTA,
2005). Outros trabalhos têm demonstrado efeito benéfico dos extratos vegetais
como antioxidantes em dietas para animais não-ruminantes (JANG et al., 2008;
WANG et al., 2006; WANG et al., 2008; ZHANG et al., 2009).
Outro efeito dos extratos vegetais está relacionado à maior eficiência na
digestão dos alimentos por proporcionar pH ideal e estimular maior síntese de
30
enzimas digestivas. Segundo Mellor (2000), os extratos vegetais podem
aumentar a produção de saliva e dos sucos gástricos e pancreáticos,
favorecendo a digestão dos alimentos. Wang et al. (2011) observaram que
plantas medicinais chinesas foram capazes de melhorar o metabolismo,
aumentar a secreção de sucos digestivos e a atividade de enzimas digestivas
em leitões. Huo et al. (2004) observaram aumento na digestibilidade da matéria
seca (MS) e melhora na conversão alimentar de frangos de corte alimentados
com dieta contendo mistura de plantas chinesas (Radix astragali, Radix
atractylodis, Radix codonopsis e Rhizoma smilacis glabrae). Yakhkeshi et al.
(2011) avaliaram os efeitos de ácidos orgânicos, probióticos e extratos vegetais
em dietas para frangos e observaram melhor desempenho e redução na
população de bactérias patogênicas do trato gastrintestinal das aves que
receberam a mistura dos três aditivos quando comparado àquelas que
receberam o tratamento antibiótico.
A utilização de extratos vegetais como promotores de crescimento na
alimentação de suínos tem gerado maior aceitação, dado à preocupação dos
riscos decorrentes da utilização de antibióticos na alimentação animal. No
entanto, é necessário maior aprofundamento em estudos relacionados à
composição química deste aditivo, aos modos de ação, aos princípios ativos e
níveis ideais de adição, buscando o uso seguro e racional deste produto.
31
4. ARTIGO CIENTÍFICO
Alternatives to antimicrobial growth promoters for weanling pigs challenged with E.
coli k99+
Santana, M.B.1; Costa, L.B.1*; Cantarelli, V.S.2; Melo, A.D.B.1; Cruz, D.R.1; Garbossa,
C.A.P2; Andrade, C.3
1Santa Cruz State University (Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC) – Dept. of Agricultural and Environmental Sciences (Depto. de Ciências Agrárias e Ambientais), Rod. Jorge Amado km 16 - Salobrinho - 45662-900 – Ilhéus, BA Bahia – Brazil.
32
[email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]; +55 (73) 3680-5262.
2Federal University of Lavras, Department of Animal Science (Universidade Federal de
Lavras, Departamento de Zootecnia), Caixa Postal 3037, CEP: 37200-000, Lavras –
MG Minas Gerais – Brazil. [email protected]; [email protected]; +55 (41)
9918-2442.
3University of São Paulo/"Luiz de Queiroz” College of Agriculture – Department of
Animal Science (Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz” – USP/ESALQ – Departamento de Zootecnia), C.P. 09 – 13418-900 –
Piracicaba, SP – Brazil. [email protected]; +55 (19) 3429-4135.
*Corresponding author: [email protected]
33
Abstract
An experiment was conducted to evaluate the effects of plant extracts mixture,
sodium butyrate and nucleotides on the performance, intestinal epithelial histology,
morphometry of organs and pH of the digestive contents of weanling pigs challenged
with E. coli K99+. A total of 90 commercial hybrid piglets were used; these piglets had
a average age of 21 days and average initial and final weights of 6.35 ± 0.34 and 17.15
± 2.08 kg, respectively. The piglets were distributed in a randomized complete block
design with five treatments, six replication per treatment and three animals per
experimental unit (two males and one female or two females and one male). The
treatments were: Control – basal diet; Antimicrobial – basal diet with 40 ppm colistin
sulfate; 1000 ppm – basal diet with 1000 ppm of a mixture of plant extracts + sodium
butyrate + nucleotides; 1500 ppm – basal diet with 1500 ppm plant extracts + sodium
butyrate + nucleotides; and 2000 ppm – basal diet with 2000 ppm plant extracts +
sodium butyrate + nucleotides. The additives were composed of 32% sodium butyrate,
2% to 3% nucleotides prepared from Saccharomyces cerevisiae yeast hydrolysis and
5% plant extracts, including 2% Glycyrrhiza glabra (sweet root), 1.5% Rosmarinus
officinalis (rosemary) and 1.5% Peumus boldus (boldo). The animals were deprived of
food and water for 3 h on the seventh day of the experiment (28 days old).
Subsequently, the piglets received 60 mL of a sodium bicarbonate solution at a
concentration of 1.4% (w/v) intragastrically to neutralize the gastric pH. After 30
minutes, the piglets were infected with E. coli K99+, at a concentration of 5.0 x 109
cfu/mL, and were given food and water ad libitum 2 h after infection. The experiment
lasted 35 days, and at the end, following a 12 h fast, one animal per pen (experimental
unit) was slaughtered to assess the intestinal epithelium histology, morphometry of the
organs and pH of the digestive contents. The selected slaughtered animal was the animal
34
whose live weight was closest to the animals’ average weight in each experimental unit.
The animals were weighed to assess the performance variables at the beginning of the
experiment, at day 14 and at day 35 of the experiment, quantifying the consumed feed
and the excess. No differences were found (P < 0.05) regarding the performance,
intestinal histology, morphometry of the organs and pH of the digestive contents
through the analysis of orthogonal polynomials or even by the contrasts of interest. In
general, colistin sulfate and the combination of plant extracts, sodium butyrate and
nucleotides were not effective in promoting improvement of the productive
characteristics of weanling pigs challenged with E. coli k 99+.
KEYWORDS: herbal extracts, nucleotides, nutrition, pigs, sodium butyrate
4.1. Introduction
In intensive pig farming, the post-weaning period is considered as the most
critical phase in a piglets life because different stressors affect these animals, giving
them a predisposition to enteric problems. Those problems are linked to the piglets
gastrointestinal tract immaturity, resulting in an incomplete digestion of proteins and
carbohydrates and thus providing a medium rich in substrates for the development of
pathogenic bacteria (Oetting et al., 2006).
In piglets, E. coli is mainly responsible for diarrhea, edema disease and
septicemia. However, the greatest economic losses in intensive pig production are
associated with the first two conditions, being diarrhea caused by strains of E. coli
responsible for morbidity and mortality in weanling pigs (Wilson and Francis, 1986).
Traditionally, antibiotics have been used in pig feed as growth promoters and in
the treatment of gastrointestinal infections to alleviate such enteric problems. However,
35
the possible bacterial resistance to antibiotics and presence of antibiotic residues in
animal manure led European Union ban on the use of antibiotics as growth promoters in
pig feed, starting in January 2006. Thus, new substitutes of these additives shall be
developed to ensure productivity in the pork production chain. These potential
substitutes include nucleotides, organic acids, plant extracts, enzymes, probiotics,
prebiotics and symbiotics.
The main benefits associated with the use of plant extracts are related to
improvement in palatability of the feed, stimulating the secretion of endogenous
enzymes, modulating the intestinal microbiota, reducing subclinical infections and
performance improvement (Ao et al., 2011; Huang et al., 2010; Langhout, 2005).
According Kohlert et al. (2000), the compounds present in plant extracts are rapidly
metabolized and absorbed in the digestive tract of animals, leading to believe that there
is a minimal risk of accumulation in tissues, so that these additives may be possible
alternatives for antibiotic growth promoter.
Although the antimicrobial effects of various plant extracts have been proven in
in vitro experiments (Kalemba and Kunicka, 2003; Lambert et al., 2001), their
mechanisms of action are still unknown. According to Costa et al. (2011) and Oetting et
al. (2006), the antimicrobial activity of extracts lies in their ability to disrupt bacterial
cells the alteration of membrane permeability. However, further studies are needed to
confirm this effect in vivo. Furthermore, plant extracts may supposedly promote other
effects, namely, antioxidant and anti-inflammatory effects (Huang et al., 2010;
Windisch et al., 2008).
Sodium butyrate is a salt derived from butyric acid, and its molecular formula is
C4H7O2Na. Initially, the main function of organic acids in pig feed was to maintain the
stomach pH and thereby improve nutrient digestion, promoting balance of the intestinal
36
microbiota (Roth and Kirchgessner, 1998). However, the organic-acid effect correlates
not only with a decrease in the gastric pH but also with a decrease in the dietary
buffering capacity, stimulation of the production of pancreatic secretions and reduced
colonization with pathogenic microorganisms, both in the feed and in the
gastrointestinal tract of animals (Knarreborg et al., 2002).
Nucleotides are intracellular compounds that are involved in numerous
metabolic processes and are essential for cell growth (Mateo et al., 2004). Nucleotides
act as precursors of deoxyribonucleic acids (DNA) and ribonucleic acid (RNA) and are
key sources of energy, especially in the form of ATP. The benefits of supplementing
with nucleotides may be related to improvement in histological features (Andrade et al.,
2011) and also to the growth of bifidobacteria, similar to that found in breast milk,
promoting improved intestinal health in piglets (Uauy, 1994).
However, results regarding the mechanisms of action of these additives and their
real effect on pig development are still inconsistent. The aim of the present study was to
evaluate the effects of plant extracts mixture, sodium butyrate and nucleotides on the
performance, intestinal epithelium histology, morphometry of the organs and pH of the
digestive contents of weanling pigs challenged with E. coli K99+.
4.2. Materials and Methods
The experiment was approved by the Ethics Committee on Animal Use
(Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA) of Santa Cruz State University
(Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC), Ilhéus – Bahia, protocol number
029/2009.
37
4.2.1. Animals and facilities
The experiment was conducted at the Swine Research Station (Centro
Experimental de Suínos - CES) of the Federal University of Lavras (Universidade
Federal de Lavras - UFLA) in Lavras, MG. The two nurseries where the animals were
kept have 56 metal pens, arranged in four groups of seven pens each. Each pen has an
area of 3.5 m2 including a feeder, a piglet nipple waterer and ancillary heating provided
by a brooder with 300 W incandescent light bulbs. Steel trays were placed below the
pens to measure the axcess with greater accuracy. The entire facility was previously
disinfected and whitewashed before starting the experiment.
A total of 90 commercial hybrid piglets were used. These piglets had average
age of 21 days, average initial weight of 6.35 ± 0.34 kg and average final weight of
17.15 ± 2.08 kg. The piglets were distributed according to a randomized complete block
design, with five treatments, six replication per treatment and three animals per
experimental unit (two males and one female or two females and one male). The
animals received water and feed ad libitum throughout the experimental period (35
days). The temperature was recorded daily in the morning and afternoon, with average
of 28.5 ºC for the maximum and 24 ºC for the minimum temperature.
4.2.2. Experimental diets
The experimental treatments were: Control – basal diet; Antimicrobial – basal
diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm – basal diet with 1000 ppm of a mixture of
plant extracts + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm – basal diet with 1500 ppm
plant extracts + sodium butyrate + nucleotides; and 2000 ppm – basal diet with 2000
ppm plant extracts + sodium butyrate + nucleotides. The additives (commercial product
38
- Auster Animal Nutrition Ltda) were composed of 32% sodium butyrate, 2% to 3%
nucleotides prepared from Saccharomyces cerevisiae yeast hydrolysis and 5% plant
extracts, including 2% Glycyrrhiza glabra (sweet root), 1.5% Rosmarinus officinalis
(rosemary) and 1.5% Peumus boldus (boldo). These additives were through a process of
microencapsulation to reduce the odor and/or flavor of these products in the feed to
avoid negatively affecting the piglets intake.
The experimental diets (Table 1) were isocaloric and isonitrogenous, formulated
to meet the requirements of piglets in the pre-initial (day 1 to day 14 of the experiment)
and initial (day 14 to day 35 of the experiment) phases of the experiment, as
recommended by Rostagno et al. (2005).
4.2.3. Animal infection
The inoculum was prepared with Escherichia coli K99+ provided by the Osvaldo
Cruz Foundation (Fundação Osvaldo Cruz - FIOCRUZ). A scoop of the sample from
FIOCRUZ was transferred to an Erlenmeyer flask containing 50 mL tryptic soy broth
(TSB) and incubated at 37 °C for 24 h. The growth curve of E. coli was determined to
prepare the inoculum; this curve was estimated by assessing the optical density at a
wavelength of 600 nm and a subsequent plate count (Tortora, 2005). Then, the exact
concentration of the inoculum was determined using the absorbance measured by a
spectrophotometer SP-22 (Biospectro) and the E. coli growth curve.
All the animals were deprived of food and water for 3 h on the seventh day of
the experiment (28 days old). Subsequently, the piglets received 60 mL of a sodium
bicarbonate solution at a concentration of 1.4% (w/v) intragastrically to neutralize the
gastric pH. After 30 minutes, the piglets were infected with E. coli K99+, at a
39
concentration of 5.0 x 109 cfu/mL, and were given food and water ad libitum 2 h after
infection.
4.2.4. Samplings and measurements
To assess the performance variables (daily feed intake, daily weight gain and
feed conversion), the animals were weighed at the beginning, at day 14 and at day 35 of
the experiment, quantifying the feed intake and the axcess. At the end of the
experiment, after fasting for 12 h, one animal per pen (experimental unit) was
slaughtered to assess the intestinal epithelium histology, morphometry of the organs and
pH of the digestive contents. The slaughtered animal was chosen according to live
weight as the animal whose weight was closest to the average weight of the animals in
each experimental unit.
Following slaughter, the abdominal cavity was opened by longitudinal incision,
and the digestive organs (stomach, jejunum and cecum) were removed to measure the
pH of their respective contents. Then, the empty stomach, liver and cecum were
weighed for the morphometric analysis. For the intestinal histology analyses, samples of
approximately 3 cm in length from the duodenum (removed at 15 cm from the pyloric
sphincter) and the jejunum (removed at 1.5 m from the ileocecal junction) were washed
with saline solution (NaCl, 0.9%) and fixed in buffered formalin (10.0%).
Subsequently, these samples were transported to the Histopathology Laboratory of the
Department of Veterinary Medicine, Santa Cruz State University (Universidade
Estadual de Santa Cruz – UESC), where they were embedded in paraffin and
microtomized to mount them on slides. Then, the villus height (VH) and crypt depth
40
(CD) ratio were measured on images taken with a light microscope (Olympus DP71)
then calculated relationVH:CD.
4.2.5. Statistical analysis
The data were submitted to analysis of variance using the PROC GLM of SAS
(Statistical Analysis System, 2001). The degrees of freedom of the factor level were
broken down into their individual components (linear, quadratic and cubic) by
orthogonal polynomials. Contrasts were also tested: C1 (Control treatment x
Antimicrobial treatment); C2 (Control treatment x mean 1000, 1500 and 2000 ppm) and
C3 (Antimicrobial treatment x mean 1000, 1500 and 2000 ppm) on all of the variables
using a significance level of 5%.
4.3. Results
4.3.1. Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day
Growth performance preinfection and postinfection was not affected by dietary
treatment (Table 2).
4.3.2. Performance from day 1 to day 14
The piglets’ live weight at day 14 (P14), average daily feed intake (ADFI),
average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) were not affected (P > 0.05) by the
treatments (Table 3) during the experimental period from day 1 to day 14.
41
4.3.3. Performance from day 1 to day 35
The piglets’ live weight at day 35 (P35), ADFI, ADG and FC were not affected
(P > 0.05) by the treatments (Table 4) during the experimental period from day 1 to day
35.
4.3.4. Intestinal epithelium histology
The piglets’ intestinal epithelium histology was not affected (P > 0.05) by the
treatments (Table 5).
4.3.5. Morphometry
The piglets’ organ morphometry was not affected (P > 0.05) by the treatments.
However, Antimicrobial showed an increase of 11.86% compared with Control in the
relative liver weight (Table 6).
4.3.6. pH of the digestive contents
The pH of the digestive contents of the piglets was not affected (P > 0.05) by the
treatments (Table 7).
4.4. Discussion
4.4.1. Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day
42
Though beneficial effects faced by different studies on the benefits of plant
extracts (Czech et al., 2009; Kim et al., 2010; Windisch et al., 2008) organic acids (Piva
et al., 2002; Zanelato et al., 2008) nucleotides (Yu et al., 2002) on performance, no
effects were observed for present experiment.
Bhandari et al. (2008), who found no difference in the performance of piglets
infected with E. coli K88+ according author in this experiment, the level of disease
induced by the E. coli challenge model occurred within a 24- to 48-h period, and by d
14 postinfection the animals were fully recovered. Also find no differences in intestinal
pH, plasma urea nitrogen, intestinal ammonia, and VFA or in intestinal villus
morphology. These criteria were measured to provide an indication of the effect of feed
additives on intestinal health. However, these measures may be considered an index of
recent events in the gut and are not necessarily good indicators of past infections, unless
they were severe (Nagy and Fekete, 2005).
4.4.2. Performance from day 1 to day 14
The data from this study are consistent with those found by Bhandari et al.
(2008), who found no difference in the performance of piglets infected with E. coli
K88+ use of blood plasma, probiotics and organic acids as alternatives to feed
antibiotics. Botsoglou et al. (2002b) also found no improvement in the performance of
supplemented animals compared to those fed the control diet, free of any growth
promoter, while studying two levels of essential oil (50 and 100 mg/kg feed) added to
broiler feed.
Conversely, Abreu et al. (2010) found that a treatment consisting of swine
plasma and nucleotides enabled greater daily weight gain and daily feed intake than the
43
negative control treatment while studying nucleotides, glutamine and swine plasma as
alternatives to antibiotics. Carlson and Veum, (2001) found that piglets supplemented
with yeast extract showed higher growth than those fed a diet containing blood plasma.
In the literature, there is great disagreement regarding the effects of plant
extracts, organic acids and nucleotides on piglet performance. Some studies show
results favorable to the inclusion of such supplements (Oetting et al. 2006; Yan et al.
2012), and others show no effect (Botsoglou et al., 2002b; Cross et al., 2003; Utiyama
et al., 2006).
Plant extracts, sodium butyrate and nucleotides added together to the
experimental diets did not improve the piglets' performance during the evaluation
period. A basal diet composed of quality and highly digestible ingredients is believed to
limit the development of pathogenic bacteria in the intestinal tract and, consequently,
would hinder the effect of additives in providing improved animal performance (Lee et
al., 2003).
The aim of infection with E. coli in the present study was to alter the
experimental conditions to approximate those found under commercial conditions,
allowing the growth-promoting additives to express their potential as performance
enhancers. However, the piglets fed the negative control diet showed similar
performance compared to the animals receiving the other treatments. The absence of
challenges in the experimental facilities or the use of a complex and highly digestible
diet may have contributed to the lack of effect of the growth-promoting additives.
4.4.3. Performance from day 1 to day 35
These results from the present study agree with those found by Fukayama et al.
(2005), who also observed no difference between treatments regarding ADFI, ADG and
44
FC from day 1 to day 42 when studying extract as an additive in broiler feed. Similarly,
Weber and Kerr (2007) also found no difference when studying the effect of sodium
butyrate on the performance of newly weaned piglets.
In contrast, there are studies in the literature showing the positive effect on the
performance of piglets resulting from diet supplementation with plant extracts (Huang
et al., 2011; Yan et al., 2012), organic acids (Piva et al., 2002; Manzanilla et al., 2006)
or nucleotides (Carlson and Veum, 2001).
Kiarie et al. (2011) found an increased daily feed intake of piglets infected with
E. coli K88+ and fed Saccharomyces cerevisiae yeast extract in contrast to those fed the
control diet. In another study, Muhammad et al. (2012) found that a treatment with 6 g
of an herbal mixture diluted with water resulted in a greater weight gain of animals than
the negative control treatment, when assessing the anticoccidial effect of different
sources of plant extracts in broilers challenged with sporulated oocysts.
The beneficial effects of plant extracts may be linked to increased digestive
secretions, immune stimulation, antimicrobial and anticoccidial activity as well as
antioxidant and antiviral properties (Yan et al., 2012).
The K99+ antigen found in Escherichia coli strains is responsible for causing
diarrhea in piglets in calves and lambs. The binding of antigens to the animals’
intestinal mucosa occurs through the expression of the active glycolipid receptors found
in enterocytes. Teneberg et al. (1990), when studying the expression of active glycolipid
receptors in the intestinal mucosa of 3-day-old newborn piglets and adult pigs, only
detected the expression of these receptors in younger animals.
In the present experiment, the challenge provided to animals using E. coli K99+
was ineffective because it failed to impair the piglets’ performance. A possible
explanation for this lack of E. coli-induced negative effects is the decreased expression
45
of active glycolipid receptors in the piglets’ intestinal mucosae, hindering bacterial
colonization in the gastrointestinal tract, because the piglets were infected at 28 days of
age, when their digestive tract is still in a developmental stage. In recent decades,
antibiotics have been used in pig diets as growth promoters due to their antimicrobial
effect. However, this effect is highly dependent on the state of animal health and the
health and safety conditions of the herd (Chesson, 1994; Mateo et al., 2006) in addition
to the quality and digestibility of the feed ingredients (Costa et al., 2011).
Costa et al. (2007) found a better FC in piglets that were fed a combination of
two antimicrobials than in those fed the other treatments while studying the
supplementation of newly weaned piglets’ diet with extracts of cloves, oregano and
antibiotics (75 ppm colistin sulfate + 75 ppm tiamulin). In another experiment, Oetting
et al. (2006) found improvements in the P35, ADFI and ADG of piglets receiving an
antimicrobial treatment consisting of 50 ppm zinc bacitracin + 50 ppm olaquindox + 50
ppm colistin sulfate in contrast to those that received the control treatment or a
treatment with increasing levels of plant extracts. In the present study, another possible
explanation for the lack of improvement in the performance of the animals from the
positive control treatment relative to the negative control may result from the low
concentration of colistin sulfate or the non-combination of antimicrobials in the piglets
diet because the combination or increased levels of antimicrobials provide improved
performance in commercial conditions. Antimicrobials may interfere with animal
metabolism and control subclinical diseases, thereby promoting improved efficiency in
the use of nutrients from food, with a significant effect on animal performance (Menten,
1995).
46
4.4.4. Intestinal histology
In the post-weaning period, there is usually intestinal villous atrophy, given the
higher rate of epithelial peeling caused by solid feed intake, adhesion of pathogenic
bacteria to enterocytes and toxin production (Oetting et al., 2006).
The results of the present study corroborate those found by Abreu et al. (2010),
who found no differences in the duodenum and jejunum regarding VH, CD and VH:CD
while assessing the effects of glutamine, nucleotides and swine plasma in feeds for
weaned piglets. Oetting et al. (2006) also found no differences between treatments in
the duodenum and jejunum regarding VH and CD while studying the effect of
antibiotics and plant extracts on piglets’ intestinal morphology at 56 days of age.
In another study, Demir et al. (2003) found a decrease (P < 0.05) in the CD of
broilers fed thyme in contrast to those fed the control treatment. While studying
different concentrations of nucleotides in feeds for recently weaned piglets, Andrade et
al. (2011) found a linear decrease (P < 0.01) in CD and a linear increase (P < 0.01) in
VH:CD in the piglets’ duodenum with the inclusion of increasing levels of nucleotides.
The positive effects of additives on the piglets’ intestinal histology may be
related to the decreased turnover rate of mature cells from the intestinal epithelium,
promoting decreased turnover of enterocytes and, thereby, maintaining their increased
integrity. This process leads to an increased production of enzymes, improved feed
digestion and, consequently, an increased absorption of nutrients (Cera et al., 1988).
Short-chain fatty acids, especially sodium butyrate, have been linked to
intestinal development by stimulating epithelial cells and promoting further
development of intestinal villi (Costa et al., 2011). However, Biagi et al. (2006) found
no difference in acetic, propionic, butyric and n-butyric acid synthesis in the jejunum,
47
ileum and cecum of animals, thereby showing no effect on the intestinal epithelium
morphology, while studying pig-feed supplementation with levels of gluconic acid.
According to these authors, a possible reason for the lack of a gluconic-acid effect on
these animals’ intestinal morphology may be their age because the tissue samples were
collected at the end of the experiment, six weeks after weaning, from animals with a
more-developed digestive system.
4.4.5. Morphometry
The current experimental results agree with those found by Oetting et al. (2006),
who found no difference in the relative weight of the liver, empty stomach and empty
cecum while studying different levels of plant extracts in weanling pigs’ feed. Andrade
et al. (2011) also found no difference in the morphometry of the stomach, liver and
pancreas of newly weaned piglets while studying treatment with nucleotide levels in
substituted of antibiotics.
Conversely, Bhandari et al. (2008) noted a higher relative liver weight of piglets
infected with E. coli K88+ that received a combination of additives (blood plasma +
probiotics + organic acids) in contrast to the control-treatment piglets.
In the present study, the animals receiving antimicrobial treatment showed,
numerically, an increased relative liver weight. The enlarged liver may be indicative of
this organ’s increased activity in the digestive process, leading to an increase in its size.
According Utiyama et al. (2006), the animal's metabolism can be enhanced by using
antimicrobials, promoting increased cytosolic enzyme activity with incorporation into
liver proteins by the activation of amino acids and, consequently, affecting animal
48
performance. However, in the current experiment, no increase was found in the live
weight of the animals that received antimicrobial treatment at day 35 of the experiment.
4.4.6. pH of the digestive contents
The current experimental results agree with those some studies, wherein
supplementing the piglets’ feed with plant extracts (Costa et al., 2011; Wang et al.,
2011) or organic acids (Biagi et al., 2007) had no effect on the pH of the digestive
contents of the stomach, jejunum and cecum. Conversely, Manzanilla et al. (2004)
found an increase in the pH of the stomach contents of weanling pigs fed formic acid or
plant extracts in comparison to the control treatment. Risley et al. (1992) found a
decrease in gastric pH in treated animals compared to animals without additives in their
feed while using organic acids in the diet of newly weaned piglets.
Costa et al. (2011) also found no changes in the pH of the stomach, jejunum and
cecum contents of weanling pigs fed phytogenic additives or sodium butyrate.
According to these authors, a possible explanation for the lack of change in the pH of
digestive contents could be the buffering capacity of the feed. Patience and Wolynetz
(1990) defined the buffering capacity as the amount of HCl needed to lower the pH
down to 3 to 4, depending on the mineral and protein content found. The basal diet for
this experiment consisted of kaolin clay (mineral), protein sources and other sources of
minerals, possibly increasing the buffering capacity of the feed and precluding pH
variation in the contents of such organs.
49
4.5. Conclusion
The combination of plant extracts, sodium butyrate and nucleotides or colistin
sulfate did not yield improvements in performance, changing the pH of the digestive
contents or affecting the morphometry of the organs and the intestinal epithelium
histology of weanling pigs challenged with E. coli K99+ and fed with complex and
highly digestible diets.
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Ingredients (%) Pre-Initial Diet Initial Diet
(day 1 to day 14) (day 14 to day 35) Corn 48.88 52.35 Soybean meal (46%) 27.10 21.94 Milk product1 15.27 5.60 Micronized soybean 1.57 6.86 Soybean oil 1.11 2.56 Sugar 1.11 1.01 L-Lysine.HCl (78%) 0.77 0.31 DL-Methionine (99%) 0.18 0.03 L-Threonine (98,5%) 0.37 0.07 L-Tryptophan (98%) 0.08 0.02 Dicalcium phosphate 1.99 1.43 Limestone 0.85 0.67 Common salt 0.41 0.35 Vitamin supplement2 0.05 0.05 Mineral supplement3 0.05 0.05 Kaolin and/or growth promoter4 0.20 6.69 Calculated Values Metabolizable energy (kcal/kg) 3363 3270 Crude protein (%) 19.76 17.92 Calcium (%) 0.98 0.72 Total phosphorus (%) 0.75 0.62 Digestible lysine (%) 1.52 1.08 Digestible threonine (%) 0.96 0.62 Digestible tryptophan (%) 0.26 0.18 Digestible methionine (%) 0.43 0.28 Lactose (%) 10.92 4.00
1Commercial product, Prius L68 – Auster Animal Nutrition Ltda. 2Amount per kg of feed: vit. A – 11.500 UI; vit. D3 – 5.850 UI; vit. E – 45 UI; vit. K3 – 3 mg; thiamine – 1.8 mg; riboflavin – 5.1 mg; pyridoxine – 3.5 mg; vit. B12 – 24 mcg; folic acid – 0.82 mg; pantothenic acid – 18 mg; niacin – 37.5 mg; biotin – 0.14 mg; selenium – 0.35 mg; ethoxyquin – 0.042 mg. 3Amount per kg of feed: manganese – 60 mg; zinc – 150 mg; iron – 100 mg; copper – 10 mg; iodine – 1.2 mg. 4Growth promoter; Commercial Product, Auster Animal Nutrition Ltda.
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Table 2 - Means of initial live weight (P1), live weight at day 14 (P14), average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) for the period preinfection from 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day the experiment
Trectments1 Contrasts2
Variable Control Antimicrobial 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
C1 C2 C3 SE3
Initial BW (kg)
6.36 6.35 6.35 6.35 6.36 - - - -
7 day BW (kg)
7.32 7.14 7.17 7.14 7.08 0.26 0.15 0.93 0.08
14 day BW (kg)
9.10 8.94 8.96 9.03 8.79 0.48 0.35 0.94 0.09
ADG (g)
Preinfection, d 0 to 7
138 113 118 114 123 0.28 0.31 0.77 0.01
Postinfection, d 7 to 14
254 257 256 270 244 0.89 0.89 0.98 0.01
ADFI (g)
Preinfection, d 0 to 7
180 154 163 187 134 0.31 0.37 0.71 0.01
Postinfection, d 7 to 14
457 446 458 450 455 0.69 0.91 0.70 0.01
FC (g)
Preinfection, d 0 to 7
1.37 1.37 1.59 1.71 1.18 0.99 0.56 0.57 0.08
Postinfection, d 7 to 14
1.81 1.74 1.78 1.68 1.92 0.54 0.89 0.54 0.04
1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.
3Pooled standard error.
56
Table 3 - Means of initial live weight (P1), live weight at day 14 (P14), average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) for the period from day 1 to day 14 of the experiment
Variables Treatments1 Contrasts2
SE3
Control Antimicrobial 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
C1 C2 C3
P1 (kg) 6.36 6.35 6.35 6.35 6.36 - - - -
P14 (kg) 9.10 8.94 8.96 9.03 8.79 0.48 0.35 0.94 0.085
ADFI (g) 318 298 310 318 302 0.34 0.60 0.51 0.007
ADG (g) 196 185 187 192 173 0.51 0.38 0.94 0.006
FC 1.63 1.63 1.68 1.66 1.77 0.96 0.35 0.31 0.029 1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.
3Pooled standard error.
Table 4 - Means of initial live weight (P1), live weight at day 35 (P35), average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) for the period from day 1 to day 35 of the experiment
Variables Treatments1 Contrasts2 SE3
Control Antimicrobial 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
C1 C2 C3
P1 (kg) 6.36 6.35 6.35 6.35 6.36 - - - -
P35 (kg) 17.19 16.76 17.31 17.49 16.69 0.58 0.53 0.97 0.23
ADFI (g) 591 544 589 618 542 0.30 0.30 0.86 0.01
ADG (g) 309 294 315 318 285 0.50 0.52 0.82 0.01
FC 1.92 1.82 1.87 1.94 1.93 0.30 0.22 0.96 0.03 1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.
3Pooled standard error.
57
Table 5 - Mean villus height (VH, μm), crypt depth (CD, μm) and the ratio of villus height:crypt depth (VH: CD) in the duodenum and jejunum of the piglets according to treatments
Variables
Treatments1 Contrasts2 SE3
Control Antimicrobial 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
C1 C2 C3
Duodenum VH (μm) 224.72 221.24 227.27 192.49 200.27 0.48 0.16 0.56 11.80 CD (μm) 97.48 94.50 81.20 94.72 73.09 0.86 0.40 0.29 5.14 VH:CD 2.24 2.78 2.92 2.06 2.83 0.17 0.51 0.31 0.11 Jejunum VH (μm) 201.76 197.02 223.75 178.74 209.35 0.75 0.57 0.89 5.17 CD (μm) 87.16 83.64 95.6 79.23 83.36 0.76 0.85 0.90 3.52 VH:CD 2.47 2.43 2.40 2.29 2.60 0.91 1.00 0.88 0.09
1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.
3Pooled standard error.
Table 6 - Mean live weight at day 35 (P35) and mean relative weights (percentage of live weight) of the stomach, liver and cecum, according to the treatments
Variables Treatments1 Contrasts2
SE3 Control Antimicrobial
1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
C1 C2 C3
P35 17.19 16.76 17.31 17.49 16.69 0.58 0.53 0.97 0.23 Empty stomach (%)
0.71 0.72 0.74 0.79 0.78
0.17 0.93 0.08 2.47
Liver (%) 2.23 2.53 2.26 2.38 2.39 0.35 0.24 0.99 8.88 Empty cecum (%)
0.21 0.22 0.21 0.19 0.22
0.21 0.76 0.07 1.01
1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.
3Pooled standard error.
58
Table 7 - pH values of the stomach, jejunum and cecum contents
Organs Treatments1 Contrasts2
SE3 Control Antimicrobial
1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
C1 C2 C3
Stomach 1.34 1.58 1.77 1.54 1.34 0.52 0.92 0.50 0.12
Jejunum 6.69 6.14 6.16 6.45 6.68 0.14 0.33 0.40 0.12
Cecum 6.10 5.98 6.28 6.09 6.08 0.58 0.35 0.77 0.07 1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.
3Pooled standard error.
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67
APÊNDICE A - Peso vivo (kg) dos animais ao 1º, 14º e 35º dia do período experimental, considerando a média da unidade experimental
Dias de experimento Bloco
Tratamentos1
Controle Antimicrobiano 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
1 6,91 6,89 6,85 6,83 6,90 2 6,62 6,62 6,63 6,64 6,66
1° dia 3 6,36 6,36 6,36 6,35 6,37 4 6,25 6,26 6,26 6,26 6,25 5 6,06 6,05 6,06 6,05 6,05 6 5,95 5,92 5,94 5,99 5,94
Média 6,36 6,35 6,35 6,35 6,36
1 9,71 9,02 9,82 9,27 9,11 2 8,70 9,36 8,28 8,99 9,27
14° dia 3 8,93 9,08 9,01 9,20 8,36 4 9,71 9,49 9,36 9,62 8,44 5 8,97 8,21 8,25 8,28 8,75 6 8,60 8,49 9,07 8,82 8,80
Média 9,10 8,90 9,00 9,00 8,80
1 18,13 18,81 19,26 17,11 15,68 2 16,11 16,95 16,13 18,13 17,33
35° dia 3 16,49 17,35 17,05 17,50 15,29 4 19,38 17,69 18,68 18,39 17,46 5 16,18 16,77 15,93 16,73 17,81 6 16,87 12,97 16,79 17,10 16,57
Média 17,20 16,80 17,30 17,50 16,70 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo.
68
APÊNDICE B - Consumo diário de ração por leitão (g) nos períodos de 1 a 14 e
1 a 35 dias, considerando a média da unidade experimental
Dias de experimento
Tratamentos1
Blocos Controle Antimicrobiano 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
1 0,35 0,27 0,34 0,31 0,28 2 0,26 0,34 0,21 0,3 0,33
1° ao 14° dia 3 0,30 0,31 0,30 0,35 0,28 4 0,39 0,33 0,37 0,37 0,33 5 0,29 0,25 0,29 0,26 0,28 6 0,33 0,30 0,34 0,32 0,30
Média 0,32 0,30 0,31 0,32 0,30
1 0,67 0,65 0,65 0,59 0,49
1° ao 35° dia 2 0,52 0,58 0,47 0,61 0,58 3 0,59 0,61 0,56 0,66 0,51 4 0,65 0,60 0,68 0,65 0,53 5 0,52 0,54 0,58 0,56 0,59 6 0,60 0,28 0,59 0,64 0,55
Média 0,59 0,54 0,59 0,62 0,54 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo.
69
APÊNDICE C - Ganho diário de peso por leitão (g) nos períodos de 1 a 14 e 1 a 35 dias, considerando a média da unidade experimental
Dias de experimento Blocos
Tratamentos1
Controle Antimicrobiano 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
1 0,20 0,15 0,21 0,18 0,16 2 0,15 0,20 0,12 0,17 0,19
1° ao 14° dia 3 0,18 0,19 0,19 0,20 0,14 4 0,25 0,23 0,22 0,24 0,16 5 0,21 0,15 0,16 0,16 0,19 6 0,19 0,18 0,22 0,21 0,20
Média 0,20 0,19 0,19 0,19 0,17
1 0,32 0,34 0,35 0,29 0,21 2 0,27 0,30 0,28 0,33 0,30
1° ao 35° dia 3 0,29 0,31 0,31 0,32 0,25 4 0,38 0,33 0,35 0,35 0,29 5 0,29 0,31 0,28 0,30 0,34 6 0,31 0,18 0,31 0,32 0,30
Média 0,31 0,29 0,31 0,32 0,28 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo
70
APÊNDICE D - Conversão alimentar nos períodos de 1 a 14 e 1 a 35 dias, considerando a média da unidade experimental
Dias de experimento Blocos
Tratamentos1
Controle Antimicrobiano 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
1 1,77 1,77 1,61 1,80 1,79 2 1,72 1,72 1,79 1,76 1,78
1° ao 14° dia 3 1,62 1,58 1,60 1,74 1,99 4 1,57 1,45 1,67 1,52 2,09 5 1,38 1,60 1,87 1,61 1,46 6 1,72 1,63 1,53 1,56 1,49
Média 1,63 1,63 1,68 1,66 1,77
1 2,08 1,92 1,84 2,00 2,26
1° ao 35° dia 2 1,93 1,96 1,67 1,87 1,90 3 2,02 1,93 1,83 2,07 2,00 4 1,74 1,84 1,91 1,87 1,81 5 1,80 1,75 2,05 1,83 1,77 6 1,91 1,56 1,91 2,02 1,80
Média 1,92 1,83 1,87 1,94 1,93 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo.
71
APÊNDICE E – Valores de altura de vilosidade (AV μm), profundidade de cripta (PC μm), relação altura de vilosidade:profundidade de cripta (AV:PC) dos animais abatidos ao final do período experimental
Tratamentos1 Bloco AV
Duodeno PC
Duodeno AV:PC
Duodeno AV
Jejuno PC
Jejuno AV:PC Jejuno
1 299,32 119,44 2,51 156,50 44,56 3,51
2 200,60 83,49 2,40 179,43 77,37 2,32
3 174,90 66,14 2,64 196,39 82,79 2,37
Controle 4 210,47 128,16 1,64 264,06 92,68 2,85
5 177,33 77,78 2,28 173,04 85,97 2,01
6 285,70 109,90 2,60 241,15 139,58 1,73
Média 224,72 97,49 2,35 201,76 87,16 2,47
1 394,05 144,60 2,73 198,01 69,58 2,85
2 327,74 95,82 3,42 210,28 69,67 3,02
3 196,89 55,98 3,52 229,47 104,12 2,20
Antimicrobiano 4 210,52 116,31 1,81 205,36 112,66 1,82
5 219,65 102,44 2,14 181,40 82,02 0,45
6 158,60 51,88 3,06 157,61 63,80 2,47
Média 221,24 94,50 2,78 197,02 83,64 2,14
1 386,46 148,02 2,61 238,83 90,28 2,65
2 198,52 52,93 3,75 229,18 112,53 2,04
3 235,04 97,44 2,41 211,81 96,64 2,19
1000 ppm 4 181,85 75,31 2,41 219,95 116,27 1,89
5 154,74 50,00 3,09 219,05 79,78 2,75
6 207,01 63,51 3,26 223,69 78,11 2,86
Média 227,27 81,20 2,92 223,75 95,60 2,40
1 262,87 100,32 2,62 168,64 73,77 2,29
2 155,93 66,20 2,36 185,99 75,31 2,47
3 189,88 88,02 2,16 174,15 90,86 1,92
1500 ppm 4 150,37 93,52 1,61 192,02 86,85 2,21
5 207,26 122,28 1,70 187,35 64,46 2,91
6 188,61 98,29 1,92 164,29 84,11 1,95
Média 192,49 94,77 2,06 178,74 79,23 2,29
1 193,15 66,46 2,91 204,31 90,16 2,27
2 239,15 92,68 2,58 192,62 91,53 2,10
2000 ppm 3 207,27 83,52 2,48 186,61 93,43 2,00
4 - - - - - -
5 163,72 72,69 2,25 217,51 77,68 2,80
6 198,07 50,14 3,95 245,73 64,00 3,84
Média 200,27 73,10 2,83 209,35 83,36 2,60 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo
72
APÊNDICE F - Pesos (kg) dos órgãos digestórios estômago, ceco e fígado e
peso vivo (kg) dos animais abatidos ao final do período experimental
Órgãos Blocos
Tratamentos1
Controle Antimicrobiano 1000 ppm
1500 ppm
2000 ppm
1 0,12 0,15 0,14 0,11 0,13 2 0,12 0,13 0,12 0,13 0,15
Estômago vazio 3 0,13 0,13 0,13 0,12 0,12 4 0,14 0,12 0,13 0,16 0,15 5 0,11 0,11 0,12 0,14 0,15 6 0,13 0,11 0,14 0,13 0,13
Média 0,13 0,12 0,13 0,13 0,14
1 0,34 0,44 0,36 0,28 0,40 2 0,40 0,44 0,30 0,38 0,36
Ceco vazio 3 0,34 0,40 0,46 0,32 0,42 4 0,44 0,34 0,40 0,32 0,34 5 0,26 0,36 0,34 0,26 0,38 6 0,42 0,28 0,32 0,32 0,38
Média 0,37 0,38 0,36 0,31 0,38
1 0,42 0,49 0,45 0,39 0,44 2 0,40 0,42 0,40 0,41 0,46
Fígado vazio 3 0,42 0,45 0,41 0,38 0,43 4 0,55 0,44 0,39 0,42 0,39 5 0,28 0,39 0,32 0,42 0,42 6 0,32 0,41 0,40 0,38 0,41
Média 0,40 0,44 0,40 0,40 0,42
1 18,1 18,8 19,3 17,1 15,7 2 16,1 17,0 16,1 18,1 17,3
Peso vivo 3 16,5 17,4 17,1 17,5 15,3 4 19,4 17,7 18,7 18,4 17,5 5 16,2 16,8 15,9 16,7 17,8 6 16,9 13,0 16,8 17,1 16,6
Média 17,2 16,8 17,3 17,5 16,7 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo.
73
APÊNDICE G - Valores de pH do estômago, do jejuno e do ceco
Órgãos Blocos
Tratamentos1
Controle Antimicrobiano 1000 ppm
1500 ppm 2000 ppm
1 0,71 1,15 3,77 3,18 2,48 2 1,35 2,22 1,29 1,02 1,40
Estômago 3 1,21 1,74 1,47 1,00 0,97 4 2,06 1,66 1,30 1,35 0,97 5 1,35 1,15 1,18 1,11 1,39 6 1,33 1,55 1,60 1,55 0,82
Média 1,34 1,58 1,77 1,54 1,34
1 5,99 6,27 4,68 7,25 6,44 2 8,03 5,93 7,29 7,02 6,88
Jejuno 3 6,34 6,04 6,89 6,44 7,12 4 6,53 5,84 6,05 6,14 6,49 5 6,67 6,06 6,22 4,87 6,65 6 6,58 6,67 5,85 6,95 6,51
Média 6,69 6,14 6,16 6,45 6,68
1 5,91 6,42 5,76 5,80 5,91 2 5,90 5,25 6,09 5,55 6,36
Ceco 3 6,64 5,45 6,26 5,73 5,55 4 6,30 6,44 6,43 6,79 6,79 5 5,92 6,34 6,36 6,60 6,11 6 5,90 5,95 6,75 6,05 5,76
Média 6,10 5,98 6,28 6,09 6,08 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo.
75
NORMAS DA REVISTA LIVESTOCK SCIENCE
INTRODUCTION
Types of article
1. Original Research Articles (Regular Papers)
2. Review Articles
3. Short Communications
4. Position Papers
5. Technical Notes
6. Book Reviews
Original Research Articles should report the results of original research.
The material should not have been previously published elsewhere, except in a
preliminary form. They should not occupy more than 12 Journal pages.
Review Articles should cover subjects falling within the scope of the
journal which are of active current interest. Reviews will often be invited, but
submitted reviews will also be considered for publication. All reviews will be
subject to the same peer review process as applies for original papers. They
should not occupy more than 12 Journal pages.
A Short Communication is a concise but complete description of a limited
investigation, which will not be included in a later paper. Short Communications
may be submitted to the journal as such, or may result from a request to
condense a regular paper, during the peer review process. They should not
occupy more than 5 journal pages (approximately 10 manuscript pages)
including figures, tables and references.
Position Papers are informative and thought-provoking articles on key
issues, often dealing with matters of public concern. These will usually be
invited, but a submitted paper may also be considered for publication. They
should not occupy more than 12 Journal pages.
A Technical Note is a report on a new method, technique or procedure
falling within the scope of Livestock Science. It may involve a new algorithm,
computer program (e.g. for statistical analysis or for simulation), or testing
method for example. The Technical Note should be used for information that
cannot adequately incorporated into an Original Research Article, but that is of
sufficient value to be brought to the attention of the readers of Livestock
76
Science. The note should describe the nature of the new method, technique or
procedure and clarify how it differs from those currently in use if cannot be
incorporated. They should not occupy more than 5 Journal pages. Book
Reviews will be included in the journal on a range of relevant books which are
not more than two years old.
Ethics in publishing
For information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal
publication
seehttp://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/ethica
lguidelines.
Policy and ethics
The work described in your article must have been carried out in
accordance with The Code of Ethics of the World Medical Association
(Declaration of Helsinki) for experiments involving
humanshttp://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html; EU
Directive 2010/63/EU for animal
experimentshttp://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_
en.htm; Uniform Requirements for manuscripts submitted to Biomedical
journals http://www.icmje.org. This must be stated at an appropriate point in the
article. Unnecessary cruelty in animal experimentation is not acceptable to the
Editors of Livestock Science.
Language (usage and editing services)
Please write your text in good English (American or British usage is
accepted, but not a mixture of these). Authors who feel their English language
manuscript may require editing to eliminate possible grammatical or spelling
errors and to conform to correct scientific English may wish to use the English
Language Editing service available from Elsevier's
WebShop http://webshop.elsevier.com/languageediting/ or visit our customer
support sitehttp://support.elsevier.com for more information.
Referees
77
Please submit, with the manuscript, the names, addresses and e-mail
addresses of three potential referees. Note that the editor retains the sole right
to decide whether or not the suggested reviewers are used.
PREPARATION
Article structure
Manuscripts should have numbered lines, with wide margins and double
spacing throughout, i.e. also for abstracts, footnotes and references. Every
page of the manuscript, including the title page, references, tables, etc., should
be numbered. However, in the text no reference should be made to page
numbers; if necessary, one may refer to sections. Avoid excessive usage of
italics to emphasise part of the text.
Manuscripts in general should be organised in the following order:
• Title should be clear, descriptive and not too long
• Abstract
• Keywords (indexing terms)
• Introduction
• Material studied, area descriptions, methods, techniques
• Results
• Discussion
• Conclusion
• Acknowledgment and any additional information concerning research grants,
and so on
• References
• Figure captions
• Figures (separate file(s))
• Tables (separate file(s))
Essential title page information
• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval
systems. Avoid abbreviations and formulae where possible.
• Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous
(e.g., a double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation
78
addresses (where the actual work was done) below the names. Indicate all
affiliations with a lower-case superscript letter immediately after the author's
name and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of
each affiliation, including the country name and, if available, the e-mail address
of each author.
• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at
all stages of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that
phone numbers (with country and area code) are prov ided in addition to
the e-mail address and the complete postal address. Contact details must
be kept up to date by the corresponding author.
• Present/permanent address. If an author has moved since the work
described in the article was done, or was visiting at the time, a 'Present address'
(or 'Permanent address') may be indicated as a footnote to that author's name.
The address at which the author actually did the work must be retained as the
main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are used for such
footnotes.
Abstract
A concise and factual abstract is required. The abstract should state
briefly the purpose of the research, the principal results and major conclusions.
An abstract is often presented separately from the article, so it must be able to
stand alone. For this reason, References should be avoided, but if essential,
then cite the author(s) and year(s). Also, non-standard or uncommon
abbreviations should be avoided, but if essential they must be defined at their
first mention in the abstract itself. The abstract should not be longer than 400
words.
Keywords
Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using
American spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts
(avoid, for example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only
abbreviations firmly established in the field may be eligible. These keywords will
be used for indexing purposes.
79
Nomenclature and units
Follow internationally accepted rules and conventions: use the
international system of units (SI). If other quantities are mentioned, give their
equivalent in SI. You are urged to consult IUB: Biochemical Nomenclature and
Related Documents: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ for further information.
Authors and Editors are, by general agreement, obliged to accept the
rules governing biological nomenclature, as laid down in the International Code
of Botanical Nomenclature, the International Code of Nomenclature of Bacteria,
and the International Code of Zoological Nomenclature.
All biotica (crops, plants, insects, birds, mammals, etc.) should be identified by
their scientific names when the English term is first used, with the exception of
common domestic animals. All biocides and other organic compounds must be
identified by their Geneva names when first used in the text. Active ingredients
of all formulations should be likewise identified.
Math formulae
Present simple formulae in the line of normal text where possible and use
the solidus (/) instead of a horizontal line for small fractional terms, e.g., X/Y. In
principle, variables are to be presented in italics. Powers of e are often more
conveniently denoted by exp. Number consecutively any equations that have to
be displayed separately from the text (if referred to explicitly in the text).
Equations should be numbered serially at the right-hand side in parentheses. In
general only equations explicitly referred to in the text need be numbered.
The use of fractional powers instead of root signs is recommended. Powers of e
are often more conveniently denoted by exp. Levels of statistical significance
which can be mentioned without further explanation are *P< 0.05,**P< 0.01
and***P< 0.001.
In chemical formulae, valence of ions should be given as, e.g. Ca2+ , not
as Ca++. Isotope numbers should precede the symbols, e.g. 18O.
The repeated writing of chemical formulae in the text is to be avoided where
reasonably possible; instead, the name of the compound should be given in full.
Exceptions may be made in the case of a very long name occurring very
frequently or in the case of a compound being described as the end product of a
gravimetric determination (e.g. phosphate as P2O5).
80
Footnotes
Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively
throughout the article, using superscript Arabic numbers. Many wordprocessors
build footnotes into the text, and this feature may be used. Should this not be
the case, indicate the position of footnotes in the text and present the footnotes
themselves separately at the end of the article. Do not include footnotes in the
Reference list. Table footnotes Indicate each footnote in a table with a
superscript lowercase letter.
Artwork
Electronic artwork
General points
• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.
• Embed the used fonts if the application provides that option.
• Aim to use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times New
Roman, Symbol, or use fonts that look similar.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide captions to illustrations separately.
• Size the illustrations close to the desired dimensions of the printed version.
• Submit each illustration as a separate file.
A detailed guide on electronic artwork is available on our website:
http://www.elsevier.com/artworkinstructions
You are urged to visit this site; some excerpts fro m the detailed
information are given here.
Formats
If your electronic artwork is created in a Microsoft Office application
(Word, PowerPoint, Excel) then please supply 'as is' in the native document
format. Regardless of the application used other than Microsoft Office, when
your electronic artwork is finalized, please 'Save as' or convert the images to
one of the following formats (note the resolution requirements for line drawings,
81
halftones, and line/halftone combinations given below): EPS (or PDF): Vector
drawings, embed all used fonts. TIFF (or JPEG): Color or grayscale
photographs (halftones), keep to a minimum of 300 dpi.
TIFF (or JPEG): Bitmapped (pure black & white pixels) line drawings, keep to a
minimum of 1000 dpi. TIFF (or JPEG): Combinations bitmapped line/half-tone
(color or grayscale), keep to a minimum of 500 dpi.
Please do not:
• Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG);
these typically have a low number of pixels and limited set of colors;
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content.
Color artwork
Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF,
EPS or MS Office files) and with the correct resolution. If, together with your
accepted article, you submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no
additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g.,
ScienceDirect and other sites) regardless of whether or not these illustrations
are reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print,
you will receive information regarding the costs fr om Elsevier after receipt
of your accepted article. Please indicate your preference for color: in print or
on the Web only. For further information on the preparation of electronic
artwork, please see http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Please note: Because of technical complications which can arise by converting
color figures to 'gray scale' (for the printed version should you not opt for color
in print) please submit in addition usable black and white versions of all the
color illustrations.
Tables
Number tables consecutively in accordance with their appearance in the
text. Place footnotes to tables below the table body and indicate them with
superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of
82
tables and ensure that the data presented in tables do not duplicate results
described elsewhere in the article.
References
References concerning unpublished data and "personal communications"
should not be cited in the reference list but may be mentioned in the text.
Reference style
Text: All citations in the text should refer to:
1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity)
and the year of publication;
2. Two authors: both authors' names and the year of publication;
3. Three or more authors: first author's name followed by 'et al.' and the year of
publication. Citations may be made directly (or parenthetically).
Groups of references should be listed first alphabetically, then
chronologically. Examples: 'as demonstrated (Allan, 2000a, 2000b, 1999; Allan
and Jones, 1999). Kramer et al. (2010) have recently shown ....'
List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted
chronologically if necessary. More than one reference from the same author(s)
in the same year must be identified by the letters 'a', 'b', 'c', etc., placed after the
year of publication.
Examples:
Reference to a journal publication:
Van der Geer, J., Hanraads, J.A.J., Lupton, R.A., 2010. The art of writing a
scientific article. J. Sci. Commun. 163, 51–59.
Reference to a book:
Strunk Jr., W., White, E.B., 2000. The Elements of Style, fourth ed. Longman,
New York.
Reference to a chapter in an edited book:
Mettam, G.R., Adams, L.B., 2009. How to prepare an electronic version of your
article, in: Jones, B.S., Smith , R.Z. (Eds.), Introduction to the Electronic Age. E-
Publishing Inc., New York, pp. 281–304.
83
Journal abbreviations source
Journal names should be abbreviated according to Index Medicus
journal abbreviations: http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html;
List of title word abbreviations: http://www.issn.org/2-22661-LTWA-
online.php; CAS (Chemical Abstracts Service):
http://www.cas.org/content/references/corejournals.
Video data
Elsevier accepts video material and animation sequences to support and
enhance your scientific research. Authors who have video or animation files that
they wish to submit with their article are strongly encouraged to include links to
these within the body of the article. This can be done in the same way as a
figure or table by referring to the video or animation content and noting in the
body text where it should be placed. All submitted files should be properly
labeled so that they directly relate to the video file's content. In order to ensure
that your video or animation material is directly usable, please provide the files
in one of our recommended file formats with a preferred maximum size of 50
MB. Video and animation files supplied will be published online in the electronic
version of your article in Elsevier Web products, including
ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. Please supply 'stills' with your
files: you can choose any frame from the video or animation or make a separate
image. These will be used instead of standard icons and will personalize the link
to your video data. For more detailed instructions please visit our video
instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Note: since
video and animation cannot be embedded in the print version of the journal,
please provide text for both the electronic and the print version for the portions
of the article that refer to this content.
Supplementary data
Elsevier accepts electronic supplementary material to support and
enhance your scientific research. Supplementary files offer the author additional
possibilities to publish supporting applications, high-resolution images,
background datasets, sound clips and more. Supplementary files supplied will
be published online alongside the electronic version of your article in Elsevier
84
Web products, including ScienceDirect:http://www.sciencedirect.com. In order
to ensure that your submitted material is directly usable, please provide the data
in one of our recommended file formats. Authors should submit the material in
electronic format together with the article and supply a concise and descriptive
caption for each file. For more detailed instructions please visit our artwork
instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Submission checklist
The following list will be useful during the final checking of an article prior
to sending it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for
further details of any item.
Ensure that the following items are present:
One author has been designated as the corresponding author with
contact details:
• E-mail address
• Full postal address
• Phone numbers
All necessary files have been uploaded, and contain:
• Keywords
• All figure captions
• All tables (including title, description, footnotes)
Further considerations
• Manuscript has been 'spell-checked' and 'grammar-checked'
• References are in the correct format for this journal
• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice
versa
• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other
sources (including the Web)
• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on
the Web (free of charge) and in print, or to be reproduced in color on the Web
(free of charge) and in black-and-white in print
• If only color on the Web is required, black-and-white versions of the figures are
also supplied for printing purposes