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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
LIVIA BRUNETTI APOLLONI
EFEITO DO HORMÔNIO ANDROSTENEDIONA SOBRE O
DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS
CAPRINOS ISOLADOS
FORTALEZA – CEARÁ
2015
LIVIA BRUNETTI APOLLONI
EFEITO DO HORMÔNIO ANDROSTENEDIONA SOBRE O
DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS CAPRINOS
ISOLADOS
FORTALEZA – CEARÁ
2015
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-graduação em
Ciências Veterinárias (PPGCV) por minha formação e capacitação profissional. Á
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
incentivo concedido na forma de bolsa de estudo e ao Laboratório de Manipulação de
Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) por todo suporte oferecido para a
realização deste trabalho.
À Deus primeiramente, por ter me concedido a oportunidade de lutar para realizar meus
sonhos, por ter iluminado meus caminhos e meus passos e por ter colocado anjos
disfarçados de amigos nessa trajetória.
À minha mãe Marli Brunetti Apolloni e ao meu pai Luis Antônio Apolloni, por todo
amor dedicado a mim diariamente, mesmo nos dias em que eu não merecia tanto amor
assim. Por toda a paciência e dedicação concedida a minha pessoa, e principalmente
pelo exemplo de perceverança que levarei comigo por toda vida.
Àquela que chegou e se tornou minha segunda mãe. Àquela que encheu meu coração de
amor nos dias mais difíceis, que me deu a mão nos momentos em que eu mais precisava
e que me fez ter fé que tudo no final daria certo. Àquela que soube, com a maneira mais
doce e paciente que poderia existir, transmitir todo o seu conhecimento, me ajudando a
adquirir as ferramentas necessárias para concluir esta etapa da minha vida. Àquela que
foi minha co-orientadora mas, que acima de tudo, foi o melhor presente que eu poderia
ganhar. Àquela que foi o elemento chave para a conclusão deste trabalho, me dando
suporte emocional e científico. Àquela que foi essencial para essa trajetória, que será
sempre lembrada com o coração cheio de saudade. Àquela que eu não sei expressar com
palavras o quanto é especial para mim, mas que eu espero ter demonstrado isso á ela
todos os dias em que convivemos. Jamily Bezerra Bruno por todo o carinho dedicado a
mim, muito obrigada.
Aos meus amigos Lívia Miranda, Marcos Vinícius do Amaral, Matheus Neiva da Matta,
Gustavo Pontel, Jéssica Cilense de Andrade, Marina Mansur, Mariane Crespoline dos
Santos, Laís Simonetti, Milena Chales Pereira e Heloísa Pinotti que dividiram comigo
todas as alegrias e angústias presentes nesta trajetória. Que se fizeram presentes, mesmo
na ausência a cada momento. Dedico.
À minha equipe Anna Clara Accioly Ferreira, Victor Macêdo Paes, Jesus de los Reyes
Cadenas Moreno e Francisco Léo Nascimento de Aguiar, que foram
extremamente eficientes e dedicados para a realização deste trabalho, me oferecendo o
auxílio necessário para concluir o experimento proposto bem como a escrita do artigo
técnico.
Ao Benner Geraldo Alvez que chegou para deixar perfeitamente completo e finalizar a
realização deste trabalho com êxito, contribuindo com todo o seu conhecimento,
criatividade e paciência. À Kele Amaral Alves sua esposa, pelos conselhos e apoio.
Aos meus grandes amigos Franciele Lunardi e Francisco Léo Nascimento de Aguiar
pelas infinitas conversas, conselhos, amor, alegria e todos os bons sentimentos
recebidos e compartilhados. À minha amiga Marcela Pinheiro Paz, pelo
companheirismo, disposição e tranquilidade que sempre me dedicou em todos os dias
desta caminhada. À vocês três, que esse seja o começo de uma grande amizade para
toda a vida.
Aos funcionários do PPGCV, Adriana, Sr. João e Daniela, em especial ao Cesár que
desde o início me acolheu com carinho.
À todos os membros da equipe do LAMOFOPA que me deram apoio e contribuíram de
forma direta ou indireta para a execução deste trabalho.
Ao Dr. Felipe Zandonadi Brandão, Dr. Johan Smitz e ao Dr. Gary Apgar pela
contribuição na realização deste trabalho.
Aos membros da banca Dra. Jamily Bezerra Bruno, Dr. Felipe Zandonadi Brandão e Dr.
Luis Alberto Vieira, por gentilmente terem aceitado o convite de participar da minha
banca examinadora, contribuindo para a finalização desta dissertação.
Ao meu orientador José Ricardo de Figueiredo, pela confiança depositada em mim, por
ter aberto as portas do seu laboratório e ter me dado a oportunidade de crescer
profissionalmente e pessoalmente. Por ter dividido comigo todo seu conhecimento e ter
transmitido toda a sua calma e serenidade necessárias para minha permanência. Por
acreditar que eu poderia ir sempre além do esperado, fazendo assim com que eu
quebrasse minhas próprias barreiras. Por mesmo sem saber, ter sido um exemplo de
profissional a ser seguido por mim, sempre.
Enfim, a todos vocês, meu muito obrigada!
RESUMO
Este estudo investigou o efeito de androstenediona (A4) sozinha ou em associação com
diferentes formas de adição do hormônio folículo-estimulante recombinante bovino
(FSH) sobre o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos isolados. Os folículos
foram mecanicamente isolados a partir de fragmentos do tecido ovariano e cultivados
durante 18 dias em α-MEM suplementado ou não com A4 (10 ng/ml) sozinha ou em
associação com uma concentração fixa (A4+FixFSH: 100 ng/ml) ou sequencial
(A4+SeqFSH: Dia 0: 100 ng/ml; Dia 6: 500 ng/ml; 12 Dia: 1000 ng/ml) de FSH. Após
18 dias, os oócitos foram recuperados para a maturação in vitro e posterior análise do
status meiótico através do microscópio de fluorescência. Ao final do cultivo in vitro,
somente o tratamento A4+SeqFSH apresentou menor (P < 0.05) taxa de folículos
intactos, probabilidade de sobrevivência e retomada da meiose, assim como maior (P <
0.05) percentagem de folículos degenerados e/ou extrusos após formação de antro. Os
resultados em geral mostraram também uma correlação positiva entre os folículos que
apresentaram crescimento rápido e os folículos que degeneraram e/ou extrusaram após a
formação do antro. Em relação a produção hormonal, a adição de A4 sozinha ou em
associação com o FSH não aumentou (P> 0.05) os níveis de estradiol ou de
androstenediona após o dia 6, quando comparados com o controle. No entanto, no dia
18 os níveis de androstenodiona foram menores (P < 0.05) no tratamento A4+SeqFSH
quando comparado com A4 sozinha ou ao tratamento A4+FixFSH, porém a produção
de estradiol não diferiu (P > 0.05). Em conclusão, este estudo demonstrou que o
crescimento folicular acelerado afetou negativamente a morfologia dos folículos pré-
antrais caprino cultivados in vitro. Além disso, a associação de androstenodiona com
concentrações crescentes de FSH foi prejudicial para o desenvolvimento folicular, uma
vez que esta associação acelerou o crescimento in vitro dos folículos cultivados.
Palavras-chave: cultivo in vitro, folículos secundários, cabra, FSH, andrógeno, taxa de
crescimento.
ABSTRACT
This study investigated the effect of androstenedione (A4) alone or in association with
different concentrations of bovine recombinant FSH on the in vitro culture of isolated
goat preantral follicles. Follicles were mechanically isolated from the ovarian tissue and
cultured for 18 days in 훼-MEM supplemented or not with A4 (10 ng/ml) alone or in
association with fixed (A4+FixFSH: 100 ng/ml) or sequential (A4+SeqFSH: Day 0: 100
ng/ml; Day 6: 500 ng/ml; Day 12: 1000 ng/ml) concentrations of FSH. After 18 days,
the oocytes were recovered for in vitro maturation and fluorescence analysis. At day 18
of culture, only A4+SeqFSH treatment showed a lower (P < 0.05) rate of intact follicles,
survival probability and meiotic resumption, as well as higher (P < 0.05) percentage of
degeneration and/or extrusion after antrum formation. Take together, these results
showed a positive correlation between fast-growing follicles and follicles that
degenerated and/or extruded after antrum formation. When compared to control, the
addition of A4 alone or in association of FSH did not increase (P > 0.05) the estradiol
production or androstenedione levels on Day 6. However on Day 18, the
androstenedione levels was significantly lower in A4+SeqFSH treatment when
compared to A4 alone or to A4+FixFSH treatments, while the estradiol production did
not differ (P > 0.05). In summary, this study demonstrated that accelerated follicle
growth negatively impacted the morphology of caprine preantral follicle cultured in
vitro. In addition, the association of androstenedione with increasing concentration of
FSH was detrimental to follicular survival and development.
Keywords: in vitro culture, secondary follicles, goat, FSH, androgens, growth rates
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
Figura 1 - Representação esquemática da esteroidogênese nas células
ovarianas. Nas células da teca, os andrógenos (androstenediona e
testosterona) são produzidos em resposta ao estímulo do hormônio
luteinizante (LH) através da captação do colesterol circulante. Após
difundir-se para as células da granulosa, os andrógenos são
convertidos em estrógenos (estrona e estradiol) pela enzima
aromatase sob a ação do FSH..........................................................
30
Figura 2 - Ação genômica do receptor de andrógeno. (1) Ligação do
andrógeno ao seu receptor (AR) no citoplasma celular; (2)
Dissociação da proteína de choque término (HSP) do complexo e
recrutamento da importina-훼 e proteína 70 associada ao receptor de
andrógeno (ARA70) para translocação do complexo para o núcleo;
(3) Formação de um dímero de complexos ligantes-receptores; (4)
Ligação dos dímeros a sequência do DNA responsiva aos
andrógenos (ARE) e; (5) Início da transcrição gênica dos genes
alvos..................................................................................................
33
Figura 3 - Ação não-genômica do receptor de andrógeno. (1) Ativação do AR
e interação com moléculas sinalizadoras (PI3K e RTK) localizadas
na membrana plasmática; (2) Ativação das vias AKT e MAPK pela
PI3K e RTK, respectivamente. (3) Fosforilação dos AR pelas
moléculas sinalizadoras (independente da ligação de seus ligantes)
(4) Translocação nuclear dos AR. (5) Sinalização de cascatas
através vias AKT e MAPK que regulam receptores nucleares (RN) e
fatores de transcrição (FT) e/ou; (6) Eventos sinalizadores
citoplasmáticos, tais como a liberação de cálcio (Ca2+) intracelular
pelo reticulo endoplasmático e mitocôndria. .....................................
34
Capítulo 2
Figure 1 - Percentage of intact follicles during in vitro culture in medium
containing androstenedione associated or not with fixed and
sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+
plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione
and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus
11
androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. A,B Within day,
uncommon uppercase letters indicate difference (P < 0.05). a,b
Within treatment, uncommon lowercase letters indicate difference
(P < 0.05). ‡ Tended to differ from Day 18 (P < 0.08).
...........................................................................................................
73
Figure 2 - Follicle survival probability (Kaplan-Meier plot) during in vitro
culture in medium containing androstenedione associated or not
with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+;
A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;
A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH. * Differed from control ( P < 0.05). ......
74
Figure 3 - Percentage of degenerated follicles during in vitro culture in
medium containing androstenedione associated or not with fixed
and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-
MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;
A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH.a,b Within treatment, uncommon lowercase
letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within the
same day (P > 0.05). ....................................................................
75
Figure 4 - Percentage of extruded follicles during in vitro culture in medium
containing androstenedione associated or not with fixed and
sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+
plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione
and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within
treatment, uncommon lowercase letters indicate difference (P <
0.05). Among treatments within the same day (P > 0.05). ............
76
Figure 5 - (A) Representation of follicles (n = 169) classified according to
growth rate in non-, slow-, and fast-growing. (B) Frequency
distributions of follicles in growing categories during in vitro
culture in medium containing androstenedione associated or not
with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+;
A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
12
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;
A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH. a,b Within the same growing categories,
uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). # Tended
to differ from control (P < 0.06). † Tended to differ from control (P
< 0.07)…………………………………………………………….
77
Figure 6 - Relationship between antrum formation and follicle diameter. Each
point of the graph is a follicle recorded during in vitro culture (n =
169). The follicles evaluated were defined by binary values (without
antrum formation = 0; presence of antrum formation = 1) to
dependent variable. A logistic regression (antrum predicted
probability) is represented by the equation and the black line [Logit
P = -1.916 + (0.0131 × follicle diameter); P < 0.05]………………..
78
Figure 7 - Mean (± SEM) daily growth rate of follicles according to their
ability to form antrum and maintain normal morphology. a,b,c
Uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). ...........
79
Figure 8 - Effect of the addition of androstenedione associated or not with
fixed and sequential concentrations of FSH on the antrum formation
and maintenance of normal morphology. Control: α-MEM+; A4: α-
MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;
A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH. a,b Within the same antrum conditions,
uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). ............
80
Figure 9 - Relationship between antrum phenotypes conditions and follicular
growth. Each point of graph is a follicle recorded during in vitro
culture (n = 169). The follicles evaluated were defined by binary
values (absence of antrum formation = 1; antrum maintenance = 2;
follicles degenerated and/or extruded after antrum formation = 3) to
dependent variable. A linear regression is represented by the
equation and the black line [Antrum formation conditions = 1.955 +
(0.0162 × follicular growth); R2 = 0.08; r = 0.28; P < 0.001]. ..........
81 Figure 10 - Percentage of meiotic resumption, germinal vesicle (GV), germinal
vesicle breakdow (GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II
(MII) of oocytes from preantral follicles cultured in vitro in
13
medium containing androstenedione associated or not with fixed
and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-
MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;
A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH. a,b Within the same parameter, values with
different letters differ (P < 0.05). # Tended to differ from
A4+SeqFSH (P < 0.06). ………………………………………….
82 Figure 11 - Regression analysis of the chromatin configuration (GV, germinal
vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII,
metaphase II) and oocyte diameter. Each point of graph is a oocyte
evaluated after in vitro maturation (n = 68). The oocytes evaluated
were defined by values (GV = 2; GVBD = 3; MI = 4; and MII = 5)
to chromatin configuration (dependent variable). A linear
regression is represented by the equation and the black line
[chromatin configuration = 1.507 + (0.00791 × oocyte diameter);
R2 = 0.06; r = 0.24; P < 0.05]. ..........................................................
83 Figure 12 - Mean (± SEM) androstenedione levels from preantral follicles
cultured in vitro in medium containing androstenedione associated
or not with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-
MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+
plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;
A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH. A,B,C Within day, uncommon uppercase
letters indicate difference (P < 0.05). † Tended to differ from A4 (P
< 0.07). Within treatment between days (P > 0.05). ....................
84
14
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1 - Efeito dos andrógenos no desenvolvimento folicular in vitro ..................... 35
Capítulo 2
Table 1 - Mean (± SEM) diameter of normal follicles cultured in vitro for 18 days in
medium containing androstenedione associated or not with fixed and
sequential concentrations of FSH ................................................................. 71
Table 2 - Mean (± SEM) daily growth of normal follicles cultured in vitro for 18 days
in medium containing androstenedione associated or not with fixed and
sequential concentrations of FSH ................................................................. 72
15
LISTA DE ABREVIAÇÕES
A4 Androstenedione (Androstenediona)
AMH Anti-Mullerian Hormone (Hormônio Anti-Mulleriano)
AR Androgen receptor (receptor de andrógeno)
ARA70 Proteína 70 associada ao receptor de andrógeno
ARE Elementos responsivos aos andrógenos
AREG Anfiregulina
ARKO AR knockout (Nocaute para o receptor de andrógeno)
BSA Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)
°C Graus Celsius
Ca2+ Cálcio
Calceína - AM Calceína acetoximetil
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
cDNA Complementary DNA (DNA Complementar)
CG Células da granulosa
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2 Carbon dioxide (Dióxido de Carbono)
COX-2 Ciclooxigenase-2
CV
CYP17
Coefficient of variation (coeficiente de variação)
Cytochrome P450 17-alpha hydroxylase
CYP19 P450 aromatase
D6, D12, D18 Day 6, Day 12, Day 18 (Dia 6, Dia 12, Dia 18)
DHT Dihydrotestosterone (Dihidrotestosterona)
DNA Ácido desoxirribonulceico
Dr. Doctor (Doutor)
Dra. Doctor (Doutora)
E2 Estradiol
EGF Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal)
FGF Fibroblast growth factor (Fator de crescimento de fibroblastos)
FSH Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante)
Fig Figura
FIV Fertilização in vitro
FixFSH FSH em uma concentração fixa
FSHR FSH Receptor (Receptor para FSH)
FT Fator de transcrição
G Gauge
GH Growth Hormone (Hormônio do crescimento)
h Horas
HSP Proteína de choque término
IGF-I
IGF-II
Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à
insulina-I)
Insulin-like growth factor-II (Fator de crescimento semelhante à
insulina-II)
IVM In vitro maturation (maturação in vitro)
kg Quilograma
LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais
LH Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante)
LHR Luteinizing hormone receptor (Receptor do hormônio
luteinizante)
LRH-1 Receptor homólogo do fígado -1
M Molar
MEM Minimal essential medium (Meio essencial mínimo)
mg Miligrama
min Minutos
miRNA microRNA
mL Mililitro
Mm mili-molar
mm milímetro
mRNA Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)
MOEPF Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles
MOIFOPA Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-
antrais
MI Metaphase I (Metáfase I)
MII Metaphase II (Metáfase II)
nM Nanomol
ng Nanograma
P4 Progesterona
P450scc Enzima da clivagem da cadeia lateral do colesterol
P < 0.05 Probabilidade de erro menor do que 5%
p. Página
PBS Phosphate buffered saline (Tampão fosfato-salino)
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
pg Picograma
PH potencial hidrogeniônico
PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
qPCR Quantitative PCR
RIA Radioimmunoassay (radioimunoensaio)
rbFSH Recombinant bovine FSH (FSH recombinante bovino)
RN Receptor Nuclear
RT-PCR Real time PCR (PCR em tempo real)
SEM Standard error of means (Erro padrão da média)
SET Protein patient SE translocation
SeqFSH FSH em concentrações crescentes
SF-1 Fator esteroidogênico-1
StAR Proteína Reguladora Aguda da Esteroidogênese
T Testosterona
TC
TCM-199
Theca cell (célula da teca)
Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199)
TRL Trilostano
U Unidade
UECE Universidade Estadual do Ceará
UFF Universidade Federal Fluminense
USA United States of America
UZ Universitair Ziekenhuis
VG Germinal vesicle (Vesícula germinal)
VGBD Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal)
α-MEM Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa)
μg Microgramas
μL Microlitro
μm Micrômetro
µM Micromolar
3β-HSD 3β-hydroxysteroid dehydrogenase
17β-HSD 17훽-hydroxisteroid dehydrogenase
% Porcentagem
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 20
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 22
2.1 CAPÍTULO 1 ........................................................................................................... 22
3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 50
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS ................................................................................. 52
5. OBJETIVOS ............................................................................................................ 53
5.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 53
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 53
6. CAPÍTULO 2 ........................................................................................................... 54
7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 90
8. PERSPECTIVAS .................................................................................................... 91
REFERÊNCIAS .................................................................................................. 92
20
1. INTRODUÇÃO
Biotécnicas de reprodução animal vêm sendo desenvolvidas visando aumentar o
potencial reprodutivo e a produtividade dos rebanhos, proporcionando uma grande
revolução na multiplicação de animais de elevado potencial econômico (ARAÚJO,
2013). Dentre estas biotécnicas destaca-se a Manipulação de Oócitos Inclusos em
Folículos Ovarianos Pré-Antrais (MOIFOPA) cujo objetivo é a recuperação de um
grande número de oócitos inclusos em folículos pré-antrais, visando seu cultivo in vitro
e sua completa maturação para uma posterior fecundação in vitro (FIV) (FIGUEIREDO
et al., 2008).
O desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro que garanta a ativação e o
crescimento folicular até o estádio antral, no qual os oócitos possam ser recuperados e
maturados in vitro é importante para o conhecimento dos fatores que controlam a
foliculogênese (ANDRADE et al., 2005). Sendo assim, a composição do meio é
essencial para a obtenção do sucesso no cultivo in vitro, uma vez que este deve prevenir
ao máximo o processo de atresia folicular.
Estudos vem sendo realizados testando a adição e associação de diferentes
substâncias (hormônios: LIMA-VERDE et al., 2010; SARAIVA et al., 2010;
MAGALHÃES et al., 2011; CHAVES et al., 2012; fatores de crescimento: MATOS et
al., 2007; BRUNO et al., 2009) ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais
visando maximizar o número de folículos viáveis após o cultivo, buscando completa
maturação oocitária. Dentre os hormônios destacam-se os andrógenos, os quais estão
diretamente relacionados com o processo de foliculogênese (LIMA-VERDE et al.,
2011). Pesquisas avaliando seus efeitos no cultivo in vitro de folículos pré-antrais vem
sendo realizadas em diferentes espécies a fim de melhorar o desenvolvimento folicular e
maturação oocitária in vitro (murinos: TARUMI et al., 2014; suínos: TASAKI et al.,
2013; caprinos: LIMA-VERDE et al., 2010; bovinos: YANG; FORTUNE, 2006;
primatas não humano: RODRIGUES et al., 2015).
De acordo com Lima-Verde et al. (2010) a adição de androstenediona (A4)
associada ao FSH no meio de cultivo de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de
tecido ovariano caprino, teve um papel importante na manutenção da percentagem de
folículos normais durante o cultivo. Já quando adicionada isoladamente (A4: 50 e 100
ng/ml) promoveu um aumento significativo no diâmetro oocitário após um curto
período de cultivo. Apesar destas informações, pouco se sabe sobre os reais efeitos
21
deste andrógeno associado ou não ao FSH (em diferentes concentrações) no cultivo in
vitro de folículos pré-antrais caprino isolados.
Assim, para um maior esclarecimento da importância deste projeto, a revisão de
literatura a seguir (Capítulo 1) abordará os aspectos relacionados à foliculogênese e a
biotécnica de MOIFOPA (“Ovário artificial”), a importância dos andrógenos no
desenvolvimento folicular, bem como sua síntese e expressão de seus receptores, além
do seu mecanismo de ação, dando ênfase nos principais resultados envolvendo a
utilização destes hormônios no meio de cultivo in vitro de células ovarianas. Vale
ressaltar que a presente revisão de literatura deu origem à um artigo de revisão
intitulado “Papel do andrógenos na foliculogênese em mamíferos” submetido no
periódico “Acta Scientiae Veterinariae”.
22
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CAPÍTULO 1
Papel dos Andrógenos na Foliculogênese em Mamíferos
The Role of Androgens in Mammals Folliculogenesis
Submetido no Periódico: Acta Scientiae Veterinariae
Em: Novembro de 2015
Qualis: B1
23
Acta Scientiae Veterinariae
Review Article
Papel dos Andrógenos na Foliculogênese em Mamíferos
The Role of Androgens in Mammals Folliculogenesis
Livia Brunetti Apolloni, Jamily Bezerra Bruno, Benner Geraldo Alves & José Ricardo
de Figueiredo
Laboratório de Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Pré-Antrais
(LAMOFOPA), Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV),
Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brasil. CORRESPONDENCE:
L.B. Apolloni [[email protected] – Fax: +55 (85) 31019840]. LAMOFOPA,
Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE). Av. Dr. Silas
Munguba, 1700, Campus do Itaperi. CEP 60.740-003 Fortaleza, CE, Brazil.
ABSTRACT
Background: The production of steroid hormones is a physiological process termed
steroidogenesis. An important stage of this process is the conversion of androgens into
estrogens through aromatase enzyme. Ovarian cells (i.e., granulosa and theca cells)
participate on the production of steroid hormones that are directly related with follicle
development. Furthermore, androgens are important in the process of folliculogenesis,
promoting follicular growth in different species. Thus, the aim of this review was to
present the process of synthesis, mechanism of action, and importance of androgens in
folliculogenesis. Additionally, the main results of in vitro culture of ovarian cells in the
presence of these hormones were emphasized.
Review: Folliculogenesis begins in prenatal life in most of species and can be defined as
the process of formation, follicular growth, and oocyte maturation. Preantral follicles
represent 95% of the follicular population and assisted reproductive technologies have
been developed (e.g., Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles -
MOEPF) in order to avoid the great follicle loss that occurs naturally in vivo by atresia.
The MOEPF aim to obtain a large number of competent oocytes from preantral follicles
and then subject to in vitro maturation, fertilization, and culture for embryo production.
However, the development of an efficient medium to ensure the follicular survival and
oocyte maturation is the major challenge of this biotechnology. To achieve the success
24
on in vitro culture, the effects of substances as androgens on follicular development
have been evaluated. Androgens are steroid hormones produced in theca cells (TC) that
are fundamental for follicular growth. These cells provide all the androgens required by
the developing follicles for conversion into estrogens by the granulosa cells (GC).
Androgens receptors (AR) are localized in cell cytoplasm of all follicular categories,
being more expressed in preantral follicles. The androgen pathway initiates through its
connection to its receptor, making a complex androgen-AR, that in the nucleus helps on
the process of gene transcription related with follicular survival. This mechanism is
androgen receptor genomic activity. In addition to genomic action, there is an androgen
receptor non-genomic activity. This occurs through activation of AR and its interaction
with different signaling molecules located on the cell membrane, triggering events that
aid in the follicular development. Regardless of the androgens actions, ovarian cells of
several species subjected to in vitro culture have shown the importance of these
hormones on the follicle development. Recent studies demonstrated that androgens
addition on the culture medium stimulated the activation of preantral follicles (bovine
and caprine), antrum formation (swine), survival (non-primate), and oocyte maturation
(antral follicles; bovine). Also, some studies suggest that the addition of these hormones
on in vitro culture is dose-dependent and species-specific.
Conclusion: This review shows the role of androgens in different stages of follicular
development and its action as a substrate for steroidogenesis and transcription of genes
related to follicular survival and oocyte maturation. However, when these hormones
should be added during in vitro follicular culture and which concentration is required
remains unclear, being necessary more studies to elucidate these aspects.
Keywords: follicles, in vitro culture, androgens, steroidogenesis.
Descritores: folículos, cultivo in vitro, andrógenos, esteroidogênese.
I. INTRODUÇÃO
II. FOLICULOGÊNESE E O “OVÁRIO ARTIFICIAL”
III. SÍNTESE E IMPORTÂNCIA DOS ANDRÓGENOS NA
FOLICULOGÊNESE OVARIANA
IV. RECEPTORES DE ANDRÓGENOS (AR)
V. MECANISMO DE AÇÃO DOS ANDRÓGENOS
VI. PRINCIPAIS RESULTADOS OBTIDOS NO CULTIVO IN VITRO DE
FOLÍCULOS COM ANDRÓGENOS
25
VII. CONCLUSÃO
VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
I. INTRODUÇÃO
A foliculogênese é um evento fisiológico complexo e responsável pela
formação, crescimento e maturação folicular [95]. Durante este processo, diversos
hormônios e fatores de crescimento estão envolvidos, tais como as gonadotrofinas (LH
e FSH) e os hormônios esteróides (andrógenos e estrógenos) [45].
Estudos avaliando o cultivo folicular in vitro, demonstraram que a adição de
hormônios [46,77], fatores de crescimento [10,56] entre outras substâncias [73,82]
auxiliam no desenvolvimento de folículos pré-antrais nas espécies mamíferas. Dentre os
hormônios estudados, os andrógenos destacam-se por sua importância no ovário
mamífero e nos processos reprodutivos das fêmeas.
Apesar de existirem trabalhos relacionados com o estudo dos andrógenos em
diferentes espécies [74,91,107], alguns aspectos relativos à sua ação direta no
desenvolvimento folicular ainda permanecem pouco esclarecidos e contraditórios. Nesta
revisão serão abordados tópicos envolvendo a importância dos andrógenos no
desenvolvimento folicular, bem como sua síntese e expressão de seus receptores, além
do seu mecanismo de ação, dando ênfase nos principais resultados envolvendo a
utilização destes hormônios no meio de cultivo in vitro de células ovarianas.
II. FOLICULOGÊNESE E O “OVÁRIO ARTIFICIAL”
A foliculogênese é um evento iniciado na vida pré-natal na maioria das espécies
e pode ser definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular,
iniciando-se com a formação do folículo primordial e culminando com o estádio de
folículo pré-ovulatório [95]. Durante este processo, a morfologia folicular é alterada,
uma vez que o oócito cresce e as células da granulosa e tecais circundantes se
diferenciam. De acordo com seu grau de evolução, os folículos podem ser divididos em
pré-antrais ou não cavitários (primordiais, primários e secundários) e antrais ou
cavitários (terciários e pré-ovulatórios) [7], sendo que os folículos pré-antrais
representam cerca de 90-95% de toda a população folicular [28].
Os folículos primordiais são constituídos por um oócito quiescente, esférico ou
oval, circundado por células da granulosa de formato pavimentoso ou pavimentoso e
cuboidais [71]. Seu núcleo é relativamente grande e ocupa uma posição central a
excêntrica mostrando um nucléolo evidente. A zona pelúcida nesse estádio ainda não é
26
observada, verificando-se apenas uma justaposição do oócito e células da granulosa,
sem nenhuma junção específica [49]. Acredita-se que a ativação dos folículos
primordiais seja regulada por um balanço entre fatores inibitórios e estimulatórios
originários tanto do ovário quanto de outras glândulas endócrinas [95]. Sendo assim,
uma vez ativado o folículo caracteriza-se como primário e apresenta uma única camada
de células da granulosa de formato cúbico circundando o oócito. A partir desse estádio o
oócito passa a manter um estreito contato com essas células mediado por endocitose [9].
Na continuação do desenvolvimento folicular, os folículos secundários são
caracterizados por possuírem um oócito circundado por duas camadas de células da
granulosa de formato cubóide. Com o desenvolvimento dos folículos, aumenta o
número de microvilos e inicia-se a formação da zona pelúcida, bem como das células da
teca externa, a partir do estroma intersticial [95]. A partir do crescimento destes
folículos e organização das células da granulosa em várias camadas, ocorre a formação
de uma cavidade repleta de líquido denominada antro [9], sendo que a partir deste
estádio os folículos passam a ser chamados de terciários ou antrais, os quais evoluem
para folículos pré-ovulatórios ou De Graaf.
O desenvolvimento dos folículos antrais é caracterizado por uma fase de
crescimento, recrutamento, seleção e dominância [95] sendo a formação de folículos
pré-ovulatórios um pré-requisito para a ovulação e formação do corpo lúteo, bem como
da manutenção da fertilidade [23]. Porém, os sinais que interrompem a latência do
folículo primordial quiescente e induzem o início do seu crescimento em direção à
ovulação ou atresia ainda não são completamente conhecidos.
É sabido que o número de folículos por ovário varia entre espécies e indivíduos,
sendo aproximadamente 1.500 na camundonga [79], 235.000 na vaca [6], 35.000 na
cabra [48] e 2.000.000 na mulher [25]. Porém 99,9% desta grande população folicular
presente no ovário mamífero não chega à ovulação pois sofre um processo natural
denominado atresia [28], reduzindo significantemente o número de oócitos à serem
ovulados e diminuindo assim o potencial reprodutivo das fêmeas. Pesquisadores
propuseram a existência de formação de novas células germinativas em mulheres [11] e
camundongas [41] durante a vida adulta, sugerindo pela primeira vez a existência da
neogênese (formação de novos ovócitos), desafiando assim o “dogma” instituído pela
literatura sobre a existência finita de uma reserva de oócitos ao nascimento. Outros
estudos realizados por Zou et al. [110] e White et al. [105] comprovaram a existência de
células-tronco presentes na superfície do epitélio ovariano capazes de serem
transformadas em oócitos tanto em camundongas quanto em mulheres.
27
Visando evitar a enorme perda folicular que ocorre naturalmente in vivo pela
atresia, têm sido desenvolvidos sistemas de cultivo in vitro de folículos pré-antrais e
antrais que tem possibilitado o estudo dos fatores que controlam este processo, além de
auxiliarem na compreensão da foliculogênese in vitro. Dentre eeses sistemas de cultivo,
destaca-se a MOIFOPA (Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-
Antrais) também conhecida como “Ovário artificial”, uma biotécnica de reprodução
assistida que vem sendo desenvolvida como alternativa para a recuperação de folículos
pré-antrais, visando à obtenção de um grande número de oócitos competentes
maturados in vitro para a produção de embriões. Esta biotécnica encontra-se em
desenvolvimento e vem sendo aprimorada nos últimos anos, contribuindo
significativamente para a pesquisa fundamental [2,8,74,75,91,92,107] por meio da
elucidação da foliculogênese inicial, uma vez que permite acompanhar o
desenvolvimento folicular a partir da fase pré-antral.
A partir da MOIFOPA é possível a conservação de folículos isolados
[8,16,73,77] ou inclusos em tecido ovariano [46,72] visando à estocagem por curto [39]
ou longo período [26,50] e/ou descongelamento/aquecimento para posterior utilização
no cultivo folicular in vitro [51]. Associada à criopreservação e transplante de tecido
ovariano [3,20,80] pode auxiliar na preservação da fertilidade de mulheres que são
submetidas a tratamentos quimio/radioterápicos [27]. Na medicina veterinária, apesar da
mesma ainda não ter sido transferida para o sistema reprodutivo, no futuro poderá
contribuir para o aumento da produtividade de animais de alto valor genético, além de
auxiliar na preservação de animais ameaçados de extinção [81].
No tocante ao cultivo folicular, este pode ser realizado de duas maneiras, a
saber: o cultivo in situ, no qual os folículos são cultivados inclusos no tecido ovariano
[10] ou o cultivo de folículos isolados, nos quais os mesmos são isolados
enzimaticamente [96] e/ou mecanicamente [8] a partir de fragmentos do córtex
ovariano.
O cultivo in situ tem como vantagem preservar a integridade tridimensional dos
folículos, através da presença das células do estroma, assemelhando-se às condições in
vivo [4]. Já o cultivo de folículos isolados proporciona a obtenção de um grande número
de folículos primários e/ou secundários intactos, o acompanhamento individual dos
folículos, além de favorecer uma maior perfusão do meio durante o cultivo [1]. Vale
ressaltar que a eficiência do cultivo folicular in vitro pode ser avaliada através de
diferentes técnicas, tais como: (i) histologia clássica [72]; (ii) microscopia eletrônica de
28
transmissão [24]; (iii) microscopia de fluorescência [8]; (iv) produção hormonal [74] e
(v) biologia molecular [16].
O sistema de cultivo que apresenta melhores resultados é conhecido como
cultivo “em dois passos”, no qual foi relatado o nascimento de 53 camundongos a partir
de folículos primordiais desenvolvidos, maturados e fecundados in vitro [63]. Neste
modelo é efetuado inicialmente o cultivo in situ, com o objetivo de maximizar a
ativação folicular e o crescimento dos folículos primordiais até o estádio secundário,
sendo posteriormente realizado o isolamento dos mesmos para o cultivo in vitro dos
folículos isolados até a fase antral [93]. No entanto, apesar dos avanços observados, a
produção de nascimentos a partir de folículos pré-antrais cultivados in vitro ainda não
foi alcançada em espécies domésticas, se limitando apenas a produção de pequeno
número de embriões na espécie caprina [55] e ovina [52].
Nota-se que, nas espécies domésticas, a composição do meio é um importante
fator para obtenção de sucesso no cultivo folicular in vitro. Neste contexto, estudos têm
sido realizados com o objetivo de avaliar os efeitos da adição de diferentes substâncias
ao meio de cultivo, tais como hormônios [16,46,55,73] e fatores de crescimento [10,56]
que atuam regulando a ativação e o crescimento folicular, com a finalidade de
proporcionar um ambiente favorável para o completo desenvolvimento destes folículos
até a fase pré ovulatória.
Estudos demonstram ainda que a adição de piruvato, glutamina, hipoxantina e
ITS (insulina, transferrina e selênio), aumentam o percentual de folículos
morfologicamente normais e estimulam o crescimento folicular [19,83]. Além destes,
tem-se observado que o ácido ascórbico atua beneficamente sobre a foliculogênese, com
o papel de reduzir as taxas de apoptose de folículos pré-antrais em camundongos [61] e
estimular a manutenção da viabilidade em caprinos, após cultivo de longa duração [82].
Já a adição de andrógenos ao meio de cultivo têm apresentado resultados
contraditórios, uma vez que o hiperandrogenismo induz alterações na morfologia e
função de oócitos em desenvolvimento, bem como diminui as taxas de sobrevivência de
folículos secundários em roedores [91]. Porém Tasaki et al. [92] observaram que a
adição de um andrógeno (androstenediona) ao meio de cultivo de folículos porcinos,
proporcionou o aumento nas taxas de formação de antro. Além disso, Rodrigues et al.
[74] demonstraram que a adição de outro andrógeno (dihidrotestosterona) ao meio de
cultivo de folículos secundários de macacas, teve efeito benéfico sobre a taxa de
sobrevivência folicular após 40 dias de cultivo.
29
Assim, a proposta desta revisão foi abordar a síntese e importância da adição dos
andrógenos ao meio de cultivo folicular, bem como os principais resultados obtidos nos
estudos realizados até o momento, para melhor esclarecimento do mecanismo de ação e
atuação na foliculogênese destes hormônios.
III. SÍNTESE E IMPORTÂNCIA DOS ANDRÓGENOS NA
FOLICULOGÊNESE OVARIANA
A ideia que os andrógenos podem regular o desenvolvimento folicular inicial
teve início em meados dos anos 90, com estudos que observaram a expressão de
receptores de andrógenos (AR) no ovário [70]. Estes estudos mostraram a expressão de
AR em células da teca (CT), células da granulosa (CG) e no oócito de folículos em
diferentes estádios de desenvolvimento nas mais variadas espécies
[12,15,34,42,43,103].
É sabido que, durante a foliculogênese, os andrógenos aromatizáveis
(androstenediona e testosterona) produzidos no ovário são sintetizados nas CT sob ação
do hormônio luteinizante (LH) em um processo chamado esteroidogênese [59], que tem
como resultado final a conversão de andrógenos em estrógenos (estrona e estradiol)
[89]. Este processo inicia-se com a captação do colesterol circulante para dentro da
mitocôndria da CT através da enzima StAR (proteína reguladora aguda da
esteroidogênese), onde encontra-se a desmolase (P450scc), que converte o colesterol em
pregnenolona sendo esta última convertida em progesterona (P4) por meio da enzima
3훽-hidroxidesidrogenase (3훽-HSD) [31,94]. A P4, por sua vez, poderá exercer suas
funções biológicas no organismo ou servir como substrato para a produção de outros
andrógenos. Seguindo pela esteroidogênese, a androstenediona (A4) é produzida a
partir da P4 pela ação da enzima CYP17 (citocromo P450-17훼-hidroxilase) que, assim
como a P4, poderá exercer suas funções no organismo ou ser convertida em testosterona
(T), sob ação da 17 훽 -hidroxidesidrogenase (17 훽 -HSD). A testosterona tem três
caminhos, a saber: atuar no organismo, converter-se em dihidrotestosterona através da
5훼-redutase ou ser convertida em estradiol (E2) pela P450 aromatase (CYP19), nos
quais ambas as conversões são realizadas na CG [45]. Outra via para a produção de E2
seria a aromatização da A4 em estrona nas CG pela CYP19, e esta em E2 pela 17훽-
HSD, finalizando assim este processo [99] (Figura 1).
30
Figura 1. Representação esquemática da esteroidogênese nas células ovarianas. Nas células da teca, os andrógenos (androstenediona e testosterona) são produzidos em resposta ao estímulo do hormônio luteinizante (LH) através da captação do colesterol circulante. Após difundir-se para as células da granulosa, os andrógenos são convertidos em estrógenos (estrona e estradiol) pela enzima aromatase sob a ação do FSH.
Os andrógenos são os esteroides predominantes produzidos durante o
desenvolvimento folicular inicial e estão presentes em altas concentrações no fluido
folicular [53], porém dependendo do estágio de desenvolvimento do folículo, a
esteroidogênese nas CG pode aumentar ou diminuir, devido a atividade da P450
aromatase [45]. A ligação andrógeno-receptor regula a produção e expressão de alguns
genes, como por exemplo o IGF-1 que, por sua vez, estimula a proliferação das CG e
aumenta os efeitos do FSH que induz a expressão da P450 aromatase [98].
Os hormônios esteróides estão envolvidos tanto na morte quanto na
sobrevivência celular [74,91]. Narkwichean et al. [62] administraram in vivo a
desidroepiandrostenediona (andrógeno oriundo das células adrenais) em ovelhas e
observaram que este pode ser útil no tratamento clínico do envelhecimento ovariano,
aumentando o número de folículos responsivos a gonadotrofinas e estimulando assim o
desenvolvimento folicular. Outro estudo demonstrou que a suplementação oral de
desidroepiandrostenediona aumenta os níveis de IGF-1, gerando um efeito positivo
sobre o desenvolvimento folicular e a qualidade oocitária em mulheres [13].
Em espécies poliovulatórias, estudos com camundongos knockout para
receptores de andrógenos (ARknockout) indicaram um papel estimulador dos
andrógenos sobre o crescimento e desenvolvimento folicular [100,102]. Otala et al. [66]
cultivaram fragmentos ovarianos humanos na presença de andrógenos, estradiol e uma
substância inibitória aos estímulos androgênicos (casodex) e observaram que na
31
presença dos andrógenos houve uma redução nas taxas de apoptose, o que não foi
alcançado com a adição de estradiol. Já na presença do casodex, este efeito positivo não
foi encontrado, o que confirma a importância dos andrógenos no cultivo folicular.
O cultivo folículos pré-antrais de camundongos na presença de um anticorpo
anti-andrógeno associado ou não a androstenediona demonstrou que, no tratamento com
o anti-andrógeno, o crescimento e diferenciação folicular foram inibidos, porém esses
efeitos foram restaurados com a adição da androstenediona [60]. Em ratas tratadas in
vivo com androstenediona no pós-parto, foi observada uma redução nos níveis de
apoptose folicular [33].
Apesar destes resultados, os andrógenos podem exercer efeitos antagonistas na
função folicular quando presentes em altas concentrações, inibindo o desenvolvimento
folicular e aumentando as taxas de apoptose [109]. O hiperandrogenismo está associado
a síndrome do ovário policístico [30], tendo como características a anovulação e
infertilidade, que também estão relacionadas a um aumento nas anormalidades
metabólicas, o que pode levar a obesidade, resistência à insulina, doenças
cardiovasculares e diabetes do tipo 2 [29,32,68].
IV. RECEPTORES DE ANDRÓGENOS (AR)
Receptores de andrógenos (AR) são proteínas, membros da superfamília de
receptores nucleares esteroidais que consistem em receptores de mineracorticóides,
glicocorticóides, estrogênios e progesterona [36,58]. Os AR estão agrupados dentro da
classe I, os quais incluem receptores do hormônio da tireóide, receptores de ácido
retinóico, receptores ativado por proliferador de peroxissoma e receptores de vitamina
D [21].
Quando não associados ao seu ligante, os AR estão localizados no citoplasma de
algumas células, onde se associam com as proteínas de choque térmico [35,47],
proteínas do citoesqueleto [97] e outras chaperonas [47,67]. A ligação específica
hormônio-receptor ocorre através da presença de um andrógeno, que difunde-se através
da membrana plasmática e liga-se ao seu receptor no citoplasma, podendo agir
localmente, mimetizando a ação de alguns fatores de crescimento, ou dirigir-se para o
núcleo das células. Para a realização desta translocação, o AR sofre uma alteração
conformacional e transloca-se para o núcleo, carregando o hormônio específico [14].
Dentro do núcleo, a ligação hormônio-receptor acopla-se ao DNA como um
homodímero e melhora a transcrição de genes relacionados à maturação oocitária e
ovulação, como por exemplo o gene anfiregulina (AREG) e o ciclooxigenase-2 (COX-
32
2) [108], agindo por interação direta com a maquinaria de transcrição basal ou através
de co-ativadores.
No ovário, as CG são altamente responsivas aos andrógenos, no entanto, apenas
a testosterona (T) e a dihidrotestosterona (DHT; andrógeno puro, não aromatizável) se
ligam diretamente aos AR enquanto que a androstenediona pode mediar sua ação
através da sua conversão intrácrina a um andrógeno mais potente (T ou DHT) que tem
maior afinidade aos AR, para então, exercer seus efeitos androgênicos [99]. Esta ligação
andrógeno-receptor está intimamente envolvida com a fertilidade feminina [108], sendo
que a conservação evolutiva da expressão destes receptores em ovários mamíferos
suporta a ideia que a ação dos andrógenos é mediada por AR e influencia o
desenvolvimento folicular ovariano [99]. No entanto, isso só foi confirmado na última
década, por meio de modelos de camundongos AR knockout (ARKO). Esses animais
apresentaram deficiência reprodutiva, com redução nas taxas de fertilidade,
desenvolvimento folicular anormal bem como redução nas taxas de ovulação [17,101].
Os AR foram localizados em folículos primordiais e primários de roedores [43],
ovinos [42], suínos [12] e bovinos [34]. Foram observados nas CG e CT de folículos
pré-antrais de ratos [43], bovinos [76], ovinos [42], equinos [57], primatas não humanos
[37] e humanos [38]. Em folículos antrais de ratas foi observada sua presença nas CG e
células do cúmulus [87]. Em ovinos [42], bovinos [76] e suínos [84] os AR foram
localizados em CG e CT, sendo mais predominante nas CG dos folículos antrais. A
imunocoloração para os AR também esteve presente em CG e CT humanas de folículos
antrais e pré-ovulatórios [86].
V. MECANISMO DE AÇÃO DOS ANDRÓGENOS
Os andrógenos podem agir de duas maneiras: via receptores intracelulares, que
estão localizados no citoplasma das células, ou através da modificação da atividade
gênica nuclear [22].
Inicialmente o AR encontra-se inativo e acoplado a uma proteína de choque
término (HSP) no citoplasma das células. Após a ligação do andrógeno ao AR, o
complexo é ativado e dissocia-se da HSP. Outras proteínas tais como a importina-훼 e a
proteína 70 associada ao AR (ARA70) são recrutadas para ajudar a estabilizar o AR e
promover sua translocação nuclear. Uma vez localizado no núcleo, este complexo forma
um dímero com uma segunda molécula de AR ativada, que se liga então a uma
sequência específica no DNA conhecida como ARE (elementos responsivos aos
andrógenos) [5]. Acredita-se que a ligação do AR ao ARE estabilize os fatores de
33
transcrição nos promotores dos genes alvo, induzindo assim um alto nível de iniciação
de transcrição [40,64]. Esta resposta clássica é denominada de genômica, uma vez que
envolve a transcrição de genes (Figura 2).
Figura 2. Ação genômica do receptor de andrógeno. (1) Ligação do andrógeno ao seu receptor (AR) no citoplasma celular; (2) Dissociação da proteína de choque término (HSP) do complexo e recrutamento da importina-훼 e proteína 70 associada ao receptor de andrógeno (ARA70) para translocação do complexo para o núcleo; (3) Formação de um dímero de complexos ligantes-receptores; (4) Ligação dos dímeros a sequência do DNA responsiva aos andrógenos (ARE) e; (5) Início da transcrição gênica dos genes alvos.
Wu et al. [104] relataram o aumento da expressão do receptor homólogo do
fígado -1 (LRH-1), que funciona como um fator de transcrição para a enzima CYP19,
na presença de testosterona em CG murina. Além deste estudo, tem-se relatos de alguns
fatores de transcrição que ativam as enzimas esteroidogênicas na presença de outros
hormônios, como o fator esteroidogênico-1 (SF-1), que se liga na região promotora da
proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR) bem como na mesma região da
CYP17, promovendo maior expressão dessas enzimas na presença de LH em CT
bovinas. Outro fator de transcrição que estimula a expressão das enzimas citadas
anteriormente é o GATA-6, representante da família de fatores de transcrição GATA
[59].
Estudos relataram que a proteína “patient SE translocation” (SET) pertencente a
uma família de proteínas de multitarefas, envolvida na apoptose e montagem do
nucleossoma, também funciona como um fator de transcrição para a CYP17 e 3훽-HSD,
promovendo uma super expressão das mesmas em CT de ratas transfectadas com a
proteína em questão [18,106]. Li et al. [44] demonstraram que o receptor nuclear órfão
34
(NR4A1) tem função transcricional sobre todas as enzimas esteroidogênicas
encontradas nas CT de camundongas.
Além da ação genômica clássica dos andrógenos via receptor intracelular, existe
ainda a atividade não genômica de receptores de andrógenos. O AR pode iniciar
respostas não genômicas através da sua ativação e interação com moléculas
sinalizadoras, tais como PI3K e RTK localizadas na membrana plasmática que ativam
as vias AKT e MAPK, respectivamente. Estas moléculas sinalizadoras também podem
fosforilar os AR, prevenindo a degradação dos mesmos (independente da ligação de
seus ligantes) e promovendo sua translocação nuclear. Além disso, uma vez ativadas,
essas vias também sinalizam cascatas que regulam outros receptores nucleares (RN) e
fatores de transcrição (FT) e/ou eventos sinalizadores citoplasmáticos, tais como a
liberação de cálcio (Ca2+) intracelular pelo reticulo endoplasmático e mitocôndria [5]
(Figura 3).
Figura 3. Ação não-genômica do receptor de andrógeno. (1) Ativação do AR e interação com moléculas sinalizadoras (PI3K e RTK) localizadas na membrana plasmática; (2) Ativação das vias AKT e MAPK pela PI3K e RTK, respectivamente. (3) Fosforilação dos AR pelas moléculas sinalizadoras (independente da ligação de seus ligantes) (4) Translocação nuclear dos AR. (5) Sinalização de cascatas através vias AKT e MAPK que regulam receptores nucleares (RN) e fatores de transcrição (FT) e/ou; (6) Eventos sinalizadores citoplasmáticos, tais como a liberação de cálcio (Ca2+) intracelular pelo reticulo endoplasmático e mitocôndria.
Machelon et al. [54] demonstraram que a adição de androstenediona causou um
aumento rápido de cálcio citosólico em CG luteinizadas humanas, envolvendo os canais
de cálcio dependentes da voltagem e fosfolipase C. A mobilização do cálcio intracelular
é seguida por um influxo de cálcio do meio extracelular, sendo que o mesmo funciona
como um segundo mensageiro intracelular proporcionando proliferação e diferenciação
35
das células. Outro estudo demonstrou que a adição de andrógenos no meio de cultivo de
CG promoveu a ativação da via MAPK, que por sua vez fosforilou uma proteína
sinalizadora de vias intra e extranucleares (paxilina), promovendo a expressão de um
microRNA antiapoptótico (miRNA-125b) [78]. Apesar desses estudos, a base molecular
dos efeitos AR não-genômicas ainda não foi totalmente esclarecida.
VI. PRINCIPAIS RESULTADOS OBTIDOS NO CULTIVO IN VITRO DE
FOLÍCULOS COM ANDRÓGENOS
Os efeitos dos andrógenos sobre a foliculogênese estão sendo avaliados com o
auxílio da biotécnica de MOIFOPA, a partir de diferentes sistemas de cultivo in vitro
em diferentes espécies mamíferas (Tabela 1).
Tabela 1. Efeito dos andrógenos no desenvolvimento folicular in vitro.
Referência Animal Metodologia Principais resultados
MURRAY et al. [60] Roedor
Cultivo de 6 dias de folículos pré-antrais na presença de: (i) um anticorpo anti-andrógeno em
associação ou não com 1μg/ml A4; (ii) um antagonista do AR
(casodex) em associação ou não com 1μg/ml DHT
Adição do anticorpo anti-andrógeno inibiu o crescimento folicular, efeito
este que foi revertido com a adição de A4. No tratamento com o casodex, o
crescimento folicular também foi inibido e revertido posteriormente
com a adição de DHT
SPEARS et al. [85] Roedor
Cultivo de 6 dias de folículos pré-antrais na presença de FSH em
associação ou não com 1μg/ml de A4
O tratamento com FSH promoveu o crescimento folicular o qual foi melhorado na presença de A4
ROMERO & SMITZ. [75] Roedor
Cultivo de 13 dias de folículos pré-antrais na presença de: (i) 20 ou 200 nM de A4 associada ou
não ao FSH; (ii) 20, 200 nM ou 2 μM de T associada ou não ao FSH
As concentrações superiores a 200 nM de ambos os andrógenos
prejudicaram a maturação oocitária
OKUTSU et al. [65] Roedor
Cultivo de 10 dias de folículos pré-antrais na presença de 10-5 M
de A4
A4 promoveu uma luteinização precoce nas células da granulosa
TARUMI et al. [90] Roedor
Cultivo de 12 dias de folículos pré-antrais na presença de 10-10,
10-8 e 10 -6 M de DHT e E2
O tratamento com DHT (10 -6 M) apresentou maior diâmetro folicular. Uma redução na produção de P4 e
danos na retomada da meiose foram observados nos folículos cultivados
com 10 -6 M de E2
36
SEN et al. [78] Roedor
Expressão do microRNA-125b, sobrevivência folicular e formação
de antro foram analisadas no cultivo de ovário inteiro e
folículos pré-antrais na presença de DHT e FSH em diferentes
concentrações
Na presença de DHT a expressão do microRNA-125b, o diâmetro folicular e a formação de antro apresentaram
um aumento
TAKETSURU et al. [88] Bovino
Folículos antrais iniciais foram cultivados por 14 dias na presença de 0,10 e 100 ng/ml de A4 ou E2
Na presença de A4 as taxas de maturação foram similares ao
controle in vivo
YANG & FORTUNE et al.
[107] Bovino
Fragmentos do córtex ovariano foram cultivados por 10 dias na
presença de: 10-7 e 10-6 M de T ou 10-6 M de E2; (ii) 10-7 M de T em
associação flutamida
T promoveu um aumento na transição de folículos primários para
secundários, a qual foi inibida na presença de flutamida e não ocorreu
no tratamento com E2
LIMA-VERDE et al. [46] Caprino
Fragmentos do córtex ovariano foram cultivados por 7 dias na
presença de 1, 10, 50, 100 ng/ml de A4 associada ou não com FSH
A4 (50 ng/ml) promoveu um aumento nos diâmetros folicular e oocitário.
As concentrações 50 ou 100 ng/ml de A4 associadas ao FSH apresentaram
93.3% de folículos viáveis
RODRIGUES et al. [74]
Primata não
humano
Cultivo de 40 dias de folículos pré-antrais encapsulados na
presença de: (i) 50 ng/ml de DHT associada ou não ao TRL; (ii) 10 ou 50 ng/ml de T associadas ao
TRL
O tratamento com DHT aumentou a sobrevivência folicular em mais de
80% quando comparado ao controle. Entretanto, uma diminuição na produção de E2 foi observada
A4: androstenediona; DHT: dihidrotestosterona; E2: estradiol; P4: progesterona; T: testosterona; TRL:
trilostano.
O cultivo de folículos secundários isolados de primatas não humanos, com a
adição de dihidrotestosterona (50 ng/ml) mostrou um aumento na produção de estradiol,
mesmo na presença de um inibidor da síntese de esteróides, e uma taxa de sobrevivência
folicular significativamente superior ao controle após 40 dias de cultivo [74]. Outro
estudo avaliou o efeito deste mesmo hormônio no cultivo in vitro de folículos pré
antrais isolados de camundongas, revelando um aumento significativo no diâmetro
folicular bem como maiores taxas de formação de antro no tratamento com 10-6 M de
dihidrotestosterona, quando comparado ao controle. Além dos resultados de
desenvolvimento folicular, esses autores obtiveram altas taxas de maturação oocitária
(75-80%) em todos os tratamentos na presença do andrógeno [90].
Sen et al. [78] avaliaram a ação da dihidrotestosterona no ovário de
camundongos e observaram que a mesma aumenta a expressão de um microRNA
responsável por reduzir as taxas de apoptose, além de proporcionar um aumento
37
significativo no diâmetro folicular e proporcionar maiores taxas de folículos antrais na
associação desse andrógeno ao FSH.
Yang & Fortune [107] observaram que o cultivo de fragmentos ovarianos
bovinos com adição de 10-7 e 10-10 M de testosterona promoveu maior transição de
folículos primários para secundários após 10 dias. Considerando que Hampton et al.
[34] detectaram a expressão do mRNA para AR em folículos primários bovinos,
conlcuiu-se que a testosterona exerce um papel estimulatório na foliculogênese inicial.
O cultivo in vitro de fragmentos do córtex ovariano caprino com a adição de
androstenediona (10 ng/ml) e FSH manteve o desenvolvimento folicular entre os dias 1
e 7 de cultivo. Além disso, 50 e 100 ng/ml de androstenediona associada ao FSH
apresentaram uma percentagem de 93,3% de folículos viáveis ao longo de 7 dias de
cultivo [46].
Taketsuru et al. [88] observaram que a adição de 10 e 100 ng/ml de
androstenediona no cultivo de folículos antrais bovinos, resultou em taxas de maturação
de 67% e 65%, respectivamente, sendo similares ao controle in vivo (86%). Porém a
adição de androstenediona e testosterona (em concentrações de 200 nM) no cultivo de
folículos pré-antrais de roedores reduziram as taxas de extrusão do primeiro corpúsculo
polar em 32% e 48%, respectivamente [75]. Este achado sugere que altas concentrações
de andrógenos durante a foliculogênese podem prejudicar a formação do fuso meiótico
durante a retomada da meiose.
Trabalhos têm mostrado que a exposição de folículos pré-antrais a altas
concentrações de andrógenos induz a luteinização precoce nas células da granulosa [65]
e reduz o crescimento e a viabilidade folicular [91], o que pode ser comparado a
síndrome do ovário policístico em mulheres.
Além destes efeitos, o hiperandrogenismo pode levar a uma secreção prematura
de estradiol, aumentando a responsividade dos folículos em desenvolvimento ao FSH,
levando à inibição da secreção deste hormônio e consequente parada no
desenvolvimento folicular [69], o que reforça o fato da adição de andrógenos ser
concentração hormônio-dependente.
VII. CONCLUSÃO
A presente revisão mostra o relevante papel dos andrógenos nos diferentes
estádios de desenvolvimento folicular, atuando através de seus receptores em CG e CT,
servindo como um substrato para a esteroidogênese ou agindo na transcrição de genes
relacionados a sobrevivência folicular, além de auxiliarem na maturação oocitária. Estes
38
hormônios são essenciais no processo reprodutivo das fêmeas, regulando a
foliculogênese e modulando os efeitos de outros hormônios, como por exemplo, o FSH.
No entanto, apesar dos estudos já realizados enfocando a ação dos andrógenos nos
folículos ovarianos, a forma como estes hormônios devem ser adicionados no cultivo
folicular in vitro, bem como a concentração a ser utilizada, ainda permanecem pouco
esclarecidas, sendo indispensáveis mais estudos para elucidar estes aspectos.
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50
3. JUSTIFICATIVA
A execução de um projeto de pesquisa se justifica pela contribuição original
dos resultados à ciência. Dessa forma, serão abordados a seguir três aspectos que
justificaram a execução deste trabalho: importância do modelo animal, da biotécnica de
MOIFOPA e originalidade do protocolo utilizado.
a. Escolha da espécie:
O rebanho nacional da espécie caprina está concentrado em mais de 90% na
região nordeste e desempenha extrema importância socioeconômica para esta região.
Além disso, pode ser utilizada como modelo experimental por apresentar semelhanças
morfofisiológicas com o ovário humano, contribuindo para o aperfeiçoamento de
biotécnicas reprodutivas, visando maximizar o potencial reprodutivo de animais
domésticos de alto valor zootécnico ou ameaçados de extinção, bem como auxiliar no
tratamento de mulheres com problemas de infertilidade.
b. Importância da biotécnica de MOIFOPA:
Como já mencionado anteriormente, os folículos pré-antrais representam a quase
totalidade da população folicular ovariana (cerca de 90-95%), armazenando assim a
maioria dos oócitos presentes em ovários mamíferos. Porém a grande maioria dos
folículos não chegam à fase ovulatória, sendo eliminados pelo processo de atresia,
reduzindo significativamente o potencial reprodutivo das fêmeas. Neste contexto, a
biotécnica de MOIFOPA tem como objetivo resgatar estes folículos do ovário antes que
os mesmos se tornem atrésicos e cultivá-los in vitro até a completa maturação oocitária.
Diante disso, o desenvolvimento de um sistema de cultivo eficiente poderá fornecer
subsídios para uma melhor compreensão sobre os fatores que regulam o crescimento
folicular e maturação oocitária in vitro.
c. Originalidade do protocolo:
No que se refere à espécie caprina, os fatores que regulam a foliculogênese in
vitro ainda são limitantes para o sucesso da biotécnica de MOIFOPA, devido aos
resultados inconstantes em relação aos meios de bases utilizados. Na tentativa de
melhorar os meios de desenvolvimento de folículos pré-antrais in vitro, o Laboratório
de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA) vem
testando o efeito de diferentes de hormônios (FSH: RODRIGUES et al., 2010; GH:
51
MAGALHÃES et al., 2011; insulina e FSH: CHAVES et al., 2012; A4: LIMA-VERDE
et al., 2010) e fatores de crescimento (IGF-1: YUAN e GIUDICE, 1999; FGF: MATOS
et al., 2007; VEGF: BRUNO et al., 2009). Dentre os hormônios estudados, destacam-se
a A4 e o FSH, que desempenham um papel importante na regulação do
desenvolvimento folicular.
Baseado em estudos in vitro no cultivo de folículos pré-antrais caprinos
isolados, a utilização do FSH, adicionado em momentos específicos do cultivo e de
maneira crescente (SeqFSH: Dia 0: 100 ng/ml; Dia 6: 500 ng/ml; 12 Dia: 1000 ng/ml)
combinado à insulina na concentração 10 ng/ml promoveu melhores taxas de
sobrevivência folicular e retomada da meiose (CHAVES et al., 2012). Outro estudo
avaliou o efeito de concentrações fixas de FSH (100 e 1000 ng/ml) no cultivo de
folículos pré-antrais caprinos e observou que ambas as concentrações aumentaram a
taxa de crescimento diário durante o cultivo (RODRIGUES et al., 2010). Entretanto,
Saraiva et al. (2010) demonstraram que a adição de concentrações crescentes de FSH
promoveu melhores taxas de sobrevivência, formação de antro, crescimento, bem como
retomada da meiose, quando comparado à utilização do FSH em uma concentração fixa
(100 ng/ml) no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos isolados.
Em relação aos andrógenos, a adição de androstenediona tem apresentado
resultados controversos, demonstrando ser concentração dependente e espécie
específica. O cultivo de folículos pré-antrais isolados de roedores demonstrou que a
adição de androstenediona reduziu a taxa de sobrevivência folicular, de maneira dose
dependente (TARUMI et al., 2012). Por outro lado, o cultivo de folículos pré-antrais
suínos em meio contendo androstenediona aumentou as taxas de formação de antro
(TASAKI et al., 2013). Na espécie caprina, o cultivo de folículos pré-antrais inclusos
em fragmentos do córtex ovariano na presença de androstenediona (10 ng/ml) associada
ao FSH em uma concentração fixa (50 ng/ml) manteve a percentagem de folículos
normais durante o cultivo in vitro (LIMA-VERDE et al., 2010).
Embora a importância do FSH no controle da foliculogênese tenha sido bem
estabelecida, a associação da androstenediona ao FSH (seja em concentrações
crescentes ou fixa) ainda não foi testada no cultivo in vitro de folículos pré-antrais
isolados caprinos. Sendo assim, o presente estudo demonstra pela primeira vez a
influência da androstenediona associada ou não ao FSH, em diferentes concentrações,
no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos e os seus efeitos sobre a produção de
estradiol.
52
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
Diante do exposto, foram formuladas as seguintes hipóteses científicas:
A androstenediona associada ou não ao FSH, em diferentes formas de adição,
influenciam positivamente na manutenção da sobrevivência folicular e no
crescimento de folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro,
permitindo que seus oócitos se tornem meioticamente competentes.
A androstenediona associada ou não ao FSH, em diferentes concentrações,
estimula a produção de estradiol a partir de folículos pré-antrais caprinos
isolados cultivados in vitro.
53
5. OBJETIVOS
5.1 GERAL
Avaliar os efeitos da adição da androstenediona associada ou não a
concentrações crescentes ou fixa do FSH sobre o cultivo in vitro de folículos
secundários isolados a partir de ovários caprinos.
5.2 ESPECÍFICOS
Investigar o efeito da adição de androstenediona (10 ng/ml) associada ou não a
concentrações crescentes de FSH (dia 0 ao dia 6= 100 ng/ml; dia 6 ao dia 12=
500 ng/ml; dia 12 ao dia 18= 1000 ng/ml) ou fixa (100 ng/ml), sobre as taxas de
sobrevivência folicular, formação de antro e maturação oocitária a partir de
folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro.
Avaliar se a adição de androstenediona, associada ou não ao FSH, afeta as
concentrações de estradiol e androstenediona durante o cultivo in vitro de
folículos pré-antrais caprinos isolados.
54
6. CAPÍTULO 2
Accelerated follicle growth during the culture of isolated caprine preantral follicles
is detrimental to follicular survival and oocyte meiotic resumption
Crescimento folicular acelerado durante o cultivo de folículos pré-antrais caprinos
isolados é prejudicial na sobrevivência folicular e retomada da meiose
Artigo submetido ao periódico: Theriogenology
Em: Novembro de 2015
Qualis: A2
55
Accelerated follicle growth during the culture of isolated caprine preantral follicles
is detrimental to follicular survival and oocyte meiotic
Livia Brunetti Apollonia, Jamily Bezerra Brunoa, Benner Geraldo Alvesa, Anna Clara
Accioly Ferreiraa, Victor Macêdo Paesa, Jesus de los Reyes Cadenas Morenoa,
Francisco Léo Nascimento de Aguiara, Felipe Zandonadi Brandãob, Johan Smitzc, Gary
Apgard, José Ricardo de Figueiredoa
a Laboratory of Manipulation of Oocyte Enclosed in Preantral Follicles – LAMOFOPA,
Faculty of Veterinary, University of Ceará, Fortaleza, Brazil
b Department of Animal Reproduction, Faculty of Veterinary, Federal University
Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
c Follicles Biology Laboratory, Center for Reproductive Medicine, UZ Brussel,
Laarbeeklaan 101, B-1090 Brussels, Belgium
d Department of Animal Science, Food and Nutrition, Southern Illinois University-
Carbondale, USA.
* Corresponding author. Tel: +55 85 3101 9852; Fax: + 55 85 3101-9840.
E-mail address: [email protected] (José Ricardo de Figueiredo).
56
ABSTRACT
This study investigated the effect of androstenedione (A4) alone or in association with
different concentrations of bovine recombinant FSH on the in vitro culture of isolated
goat preantral follicles. Follicles were mechanically isolated from the ovarian tissue and
cultured for 18 days in 훼-MEM supplemented or not with A4 (10 ng/ml) alone or in
association with fixed (A4+FixFSH: 100 ng/ml) or sequential (A4+SeqFSH: Day 0: 100
ng/ml; Day 6: 500 ng/ml; Day 12: 1000 ng/ml) concentrations of FSH. After 18 days,
the oocytes were recovered for in vitro maturation and fluorescence analysis. At day 18
of culture, only A4+SeqFSH treatment showed a lower (P < 0.05) rate of intact follicles,
survival probability and meiotic resumption, as well as higher (P < 0.05) percentage of
degeneration and/or extrusion after antrum formation. Take together, these results
showed a positive correlation between fast-growing follicles and follicles that
degenerated and/or extruded after antrum formation. When compared to control, the
addition of A4 alone or in association of FSH did not increase (P > 0.05) the estradiol
production or androstenedione levels on Day 6. However on Day 18, the
androstenedione levels was significantly lower in A4+SeqFSH treatment when
compared to A4 alone or to A4+FixFSH treatments, while the estradiol production did
not differ (P > 0.05). In summary, this study demonstrated that accelerated follicle
growth negatively impacted the morphology of caprine preantral follicle cultured in
vitro. In addition, the association of androstenedione with increasing concentration of
FSH was detrimental to follicular survival and development.
Keywords: secondary follicles, goat, FSH, androgens, growth rates.
57
1. Introduction
Ovarian function depends on multiple integrated processes that culminate in the
production of competent oocytes during folliculogenesis. FSH plays an important role in
folliculogenesis [1]. Regardless the FSH addition in in vitro culture media (i.e., fixed or
increased concentrations) [2,3] it provides for the maintenance of follicular growth and
survival as well as stimulates steroidogenesis [4]. Among the steroidal hormones, addition
of androgens (androstenedione, dihidroandrostenediona, dihydrotestosterone and
testosterone) promotes follicular growth in different species [5-7] through the stimulation
of their receptors. Androgen receptors are located in the cytoplasm of granulosa cells
(GC), theca cells (TC) and oocytes [8] of preantral follicles [9-11]; and antral [9, 10, 12],
being the GC more responsive to androgens [13].
An important tool to investigate in vitro folliculogenesis, including the effect of
different substances, is the media culture of preantral follicles [14]. Studies evaluating the
role of androstenedione on in vitro follicule culture have been shown controversial with
findings being both concentration-dependent and species specific. For example, addition
of androstenedione in a dose dependent manner reduced the survival rate of isolated mice
preantral follicles [15]. On the other hand, culture of isolated swine preantral follicles in
medium containing androstenedione improved antrum formation rates [16]. In another
study, after in vitro culture of goat preantral follicles (primordial and primary) enclosed in
ovarian tissue, androstenedione associated with FSH maintained the percentage of normal
follicles during the culture [17]. However, the effect of androstenedione and FSH on in
vitro culture of isolated secondary preantral follicles has not been investigated in caprines.
It is well known that goats are spread worldwide having social and economic importance
in many countries. In addition, the goat has been proposed as an important animal model
for women [18].
58
Therefore, the objective of this study was to investigate the effect of
androstenedione addition, associated or not with FSH (fixed or sequencial concentration)
to the culture medium, evaluating the following endpoints: (i) folicular survival and
growth, (ii) antrum formation, (iii) hormonal production (androstenedione and estradiol),
and (iv) meiotic resumption of caprine isolated secondary follicles.
2. Material and Methods
2.1 Chemicals
Unless stated otherwise, all the chemicals and culture media used for this study
were purchased from Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA).
2.2 Source of ovaries
Ovaries (n= 60) from 30 adults (between 1 and 3 years old), non-pregnant,
mixed-breed goats (Capra hircus) were collected at a slaughterhouse. Immediately
postmortem, pairs of ovaries were washed in 70% alcohol for 10 seconds and then twice
in minimum essential medium plus HEPES (MEM-HEPES) supplemented with 100
µg/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin. After which, the ovaries were
transported within 4 h to the laboratory in MEM-HEPES at 4°C [19].
2.3 Isolation and selection of preantral follicles
In the laboratory, the surrounding fatty tissue and ligaments were stripped from
the ovaries. Ovarian cortical slices (1–2 mm thick) were excised from the ovarian
surface using a surgical blade under sterile conditions and subsequently placed in
holding medium consisting of MEM-HEPES with antibiotics. Preantral follicles,
approximately 150-200 µm in diameter without antral cavities (secondary follicles),
59
were visualized under a stereomicroscope (model SMZ 645; Nikon, Tokyo, Japan) and
mechanically isolated by using 26-gauge (26 G) needles. Approximately 10 secondary
follicles were isolated from each ovarian pair. These follicles were then transferred to
100 µL droplets containing basic culture medium for the evaluation of quality. Only
secondary follicles that displayed the following characteristics were selected for culture:
an intact basement membrane, two or more layers of granulosa cells and a visible
oocyte that was round and centrally located within the follicle, without any dark
cytoplasm. Then, isolated follicles were pooled and randomly allocated to the
treatments [20].
2.4 In vitro culture of preantral follicles
After selection, the follicles were individually cultured (one follicle per droplet)
in 100 µL droplets of culture medium under mineral oil in Petri dishes (60x15 mm;
Corning, Sarstedt, Newton, NC, USA). The medium used was α-MEM (pH 7.2– 7.4;
Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) supplemented with 3.0 mg/mL bovine serum
albumin (BSA), 10 ng/mL insulin, 5.5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL selenium, 2 mM
glutamine, 2 mM hypoxanthine and 50 μg/mL ascorbic acid, here in after referred as α-
MEM+ [20]. Incubation was conducted at 39°C and 5% CO2 in air for 18 days. Fresh
media were prepared and incubated for 1 h prior to use, with 60 μL medium being
changed in each drop every 2 days. The experimental conditions were replicated four
times and at least 40 follicles were used per treatment.
2.5 Experimental design
Follicles were randomly assigned to four different treatments as follows: 1) α-
MEM+ alone (control group); 2) 훼-MEM+ supplemented with androstenedione (A4: 10
ng/ml); 3) α-MEM+ plus A4 (10 ng/ml) associated with recombinant bovine FSH -
60
rbFSH (Nanocore, São Paulo, Brazil) in increasing concentrations (Sequential FSH:
from day 0 to day 6 = 100 ng/mL; from day 6 to day 12 = 500 ng/mL; from day 12 to
day 18 = 1000 ng/mL; A4+SeqFSH); 4) α-MEM+ plus A4 (10 ng/ml) associated with a
fixed concentration of rbFSH (FixFSH: 100 ng/ml; A4+FixFSH). Concentrations of A4
and rbFSH were chosen based on previous work performed by our group (A4: [17];
SeqFSH: [3]; FixFSH: [2]).
2.6 Morphological evaluation of follicle development
Follicles were evaluated during culture (days 0, 6, 12 and 18) to the following
end-points: integrity of the basement membrane, morphology of the oocyte and
surrounding granulosa cells, and morphological signs of degeneration such as darkness.
The percentage of morphologically intact follicles was calculated by excluding the
follicles which experienced rupture of the basement membrane and had degenerated .
The percentage of degenerated follicles was calculated using the number of follicles that
exhibited dark and/or misshapen cytoplasm of the oocyte and surrounding cumulus
cells. Then, the percentage of extruded follicles was calculated using the number of
follicles that showed rupture of the basement membrane. The follicular diameter was
measured only in morphologically intact follicles every 6 days with the aid of an ocular
micrometer attached to a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan;
magnification: X 100). Two perpendicular diameters were recorded for each follicle and
the average of these two values was reported as the follicular diameter. To evaluate
daily follicular growth, the mean increase in follicular diameter was calculated as
follows: the diameter of morphologically intact follicles at day 18 minus their diameter
at day 0, divided by 18 days. In vitro cultured follicles were divided into three growing
categories: (i) non-growing: follicles that didn’t grow during the culture; (ii) slow-
growing: follicles with a daily growth between 0.1 - 7.0 휇m/day; and (iii) fast-growing:
61
follicles with a daily growth between 7.1 - 34 휇m/day. Also, antral cavity formation was
defined as a visible translucent cavity within the granulosa cell layers.
2.7 In vitro maturation
At the end of the culture period, all the morphologically intact follicles were
carefully and mechanically opened with 26 G needles under a stereomicroscope for
oocyte recovery. Only oocytes (≥ 110 μm) with homogeneous cytoplasm and
surrounded by at least one compact layer of cumulus cells were selected for in vitro
maturation (IVM). The oocyte recovery rate was calculated by the ratio between the
number of oocytes ≥ 110 μm (including zona pellucida) and the total number of normal
and degenerated oocytes (smaller and larger than 110 휇 m). The cumulus-oocyte
complexes were selected and washed three times in maturation medium consisting of
TCM-199 supplemented with 1% BSA, 5 μg/ml of luteinizing hormone (LH), 0.5
μ g/mL of rbFSH, 10 ng/mL of epidermal growth factor (EGF), 50 ng/mL of
recombinant insuline-like growth factor (IGF), 100 μM of cysteamine, 1 mM of
pyruvate, and 1μg/mL of estradiol [21]. After washing, oocytes were transferred to 100
µL drops of maturation medium under mineral oil and then incubated for 32 hours at
39oC with 5% CO2 in air.
2.8 Assessment of oocyte viability and chromatin configuration
Fluorescence microscopy was used to analyze the viability of the oocytes from
the caprine follicles classified as morphologically normal under the stereomicroscope,
after culture. Briefly, the oocytes were incubated in 5.5 μL calcein-AM, 88.5 μ l
ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 5.0 μL
Hoechst 33342 and 1.0 μL glutaraldehyde (Sigma, Deisenhofen, Germany) at 37◦C, for
30 min.
62
After the incubation, oocytes were washed three times in TCM 199 HEPES and
placed in 3 μL droplets of mounting medium (6.25 mL of PBS, 6.25 mL of glycerol and
6.25 휇L Hoechst), covered with cover slip on slide and evaluated under a fluorescence
microscope (Nikon, Eclipse 80i, Tokyo, Japan). Oocytes with cytoplasm stained by
calcein-AM (green) were classified as viable and those that had chromatin marked with
ethidium homodimer-1 (red) were considered to be degenerated. Hoechst was used to
analyze the oocyte chromatin configuration for intact germinal vesicles (GV), meiotic
resumption (germinal-vesicle breakdown (GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II
(MII).
2.9 Androstenedione and Estradiol Assay
To evaluate the relationship between follicle development and hormone
production, 60 μL of culture medium from all the follicles were collected every 6 days
(Days 6, 12 and 18) to quantify androstenedione (A4) and estradiol (E2) production.
Androstenedione was measured by direct radioimmunoassay from DIAsource
Immunoassay (androstenedione-RIA-CT, DIASource Europe, Nivelles, Belgium) with a
sensitivity of 70 ng/l and a total imprecision profile (CV = 10%) for concentrations
between 100 and 7,000 ng/l. Hormone Assay for E2 (DSL4800) secretion was
determined by double antibody radioimmunoassay (RIA) using a commercial kit
Immunotech (catalog No: DSL4800, IMMUNOTECH s.r.o. - Radiová 1 - 102 27
Prague 10 - Czech Republic). The analytical sensitivity of the assay was 2.2 pg/mL
(assay range, 2.2-750 pg/ml). Intra-assay: samples were assayed 12 times in the same
run. The coefficients of variation were ≤ 8.9%. Inter-assay: samples were assayed in
duplicate in 8 different runs. The coefficients of variation were ≤ 12.2%. All samples
were assayed in the same RIA to eliminate inter- assay variability.
63
2.10 Statistical analysis
All statistical analyses were performed using Sigma Plot 11 (Systat Software
Inc., USA). Data that were not normally distributed (Shapiro-Wilk test) were submitted
to logarithmic transformation. Follicle and oocyte diameter, and follicular growth
among treatments were compared by Kruskal-Wallis test, while the Wilcoxon signed
test was used to analyze the effect of treatment within days of culture. The proportion of
follicular variables (intact, degenerated, extruded, antrum formation, and meiotic
resumption) among treatments and days of culture were analyzed by Fisher’s exact test.
A linear regression analysis was performed to evaluate the association of oocyte
diameter with chromatin configuration and the relationship of follicular growth and
antrum phenotype, while the logistic regression analyzed the association between
follicle diameter and antrum formation. The follicle survival probability throughout the
culture was plotted using Kaplan-Meier method and the difference among survival
curves (treatments) was evaluated using log rank test. Data are presented as mean
(±SEM) and percentage and the results were considered different when P < 0.05.
Probability values > 0.05 and ≤ 0.1 indicated that a difference approached significance.
3. Results
3.1 Follicular morphology
A total of 169 follicles were selected for in vitro culture with a mean of 42.2 ±
0.6 follicles analyzed per treatment. The effect of A4 (10 ng/mL) associated or not with
different concentrations of FSH on the percentage of intact follicles was assessed over
18 days of culture (Fig. 1). Except for the control, the percentage of intact follicle
decreased (P < 0.05) from day 0 to day 18 and tended to decrease (P < 0.08) only in the
A4+SeqFSH treatment from day 12 to day 18. In addition, this treatment was lower on
64
day 18 compared to the control (P < 0.05). The effect of treatments on follicle survival
probability was evaluated by Kaplan Meier method (Fig. 2). The only treatment that
showed a reduction (73.8%; P < 0.05) in the follicle survival on Day 18 was the
A4+SeqFSH when compared to the control group.
The rate of degenerated follicles was similar (P > 0.05) among the treatments
(Fig. 3). However, from Day 12 to Day 18 the A4+SeqFSH treatment showed an
increase (P < 0.05) in the percentage (11.9%) of degenerated follicles. The percentage
of follicular extrusion is shown (Fig. 4). No difference was observed among treatments
(P > 0.05). However, treatments containing FSH increased (P < 0.05) the percentage of
extruded follicles from day 0 to day 18.
3.2 Follicular diameter and growth rate
The average values of follicular diameter during in vitro culture of isolated
preantral follicles is shown (Table 1). Regardless of the treatment, a progressive
increase (P < 0.05) in follicular diameter throughout the culture period was observed.
However, the follicle diameter was similar (P > 0.05) among treatments irrespective of
the culture period. The daily growth rate is shown (Table 2), and the A4+SeqFSH
treatment tended (P < 0.09) to be higher than control group in the second third of
culture perdiod (D6-D12). Moreover, only A4+SeqFSH treatment the growth rate
tended to be higher (P < 0.07) in the second third compared to the first third of culture.
The frequency distributions of follicles classified according to growing rates is shown
(Fig. 5A,B). We observed that the A4+SeqFSH treatment presented a reduction (P <
0.05) in the percentage of slow-growing follicles compared to control and A4
treatments. Additionally, FSH treatments showed a higher (P > 0.05) percentage of fast
growing follicles compared to control (Fig. 5B).
65
3.3 Antrum formation
Regardless of treatment, the percentage of antrum formation increased (P <
0.05) from Day 0 until Day 12 of culture and remained constant until the end of the
culture period (data not shown). A positive correlation between antrum formation and
follicular diameter during in vitro culture was observed by logistic regression analysis
(Fig. 6). When taken together, the mean growth rate of follicles that formed antrum
followed by degeneration and extrusion was 1.8-fold superior than follicles that
maintained the antrum (Fig. 7). When the treatments were compared to each other using
this end points (Fig. 8), the A4+SeqFSH had a decrease (P < 0.05) in the percentage of
follicles that maintained the antrum but an increase (P < 0.05) in the percentage of
follicles that degenerated or extruded after antrum formation compared control group.
These results could be confirmed by the positive association between antrum formation
phenotypes and follicular growth rates (Fig. 9).
3.4 Oocyte parameters and chromatin configuration
No difference in the oocyte recovery rate (≥ 110 µm), oocyte diameter (µm) and
oocyte viability (%) were observed among the treatments (P > 0.05) after 18 days of
culture (data not shown). The A4+SeqFSH treatment had a percentage of meiotic
resumption lower (P < 0.05) than the control group and, this treatment tended to differ
(P < 0.06) from A4+FixFSH treatment. Metaphase II (MII) was observed only in the
control and A4+FixFSH treatments (Fig. 10). Finally, as expected a positive
relationship between chromatin configuration and oocyte diameter was observed using
a regression analysis (Fig. 11).
3.5 Hormonal production
66
Regardless of treatment, androstenedione concentrations were similar (P > 0.05)
between 6 and 18 days of culture. However, at 18 days there was a decrease in
androstenedione levels of A4+SeqFSH compared with A4 (tended to differ; P < 0.07)
and A4+FixFSH treatments (P < 0.05; Fig. 12). No difference (P > 0.05) was observed
among treatments on the estradiol concentration during the in vitro culture (data not
shown).
4. Discussion
This study demonstrated for the first time the effect of androstenedione, in
association or not with FSH (different concentrations), on the in vitro culture of isolated
caprine secondary follicles. In general, we observed that androstenedione, associated
with increasing concentrations of FSH (A4+SeqFSH) hampered the follicular
development and survival in vitro.
Previous studies in caprines, have shown that the presence of increasing
concentrations of FSH the addition of others substances such as activin A [22]
epidermal growth factor [23] and IGF-II [24] did not impair follicular development and
improved meiosis resumption of the oocytes recovered from in vitro growth of preantral
follicles. Unlike the positive effects of those substances associated with increasing FSH
concentrations, in our study the androstenedione caused a deleterious effect on the in
vitro culture of preantral follicles, when associated with increasing concentrations of
FSH and no effects when associated with fixed FSH concentration. Even though we
expected positive results, these findings clearly show the timeliness of this study.
In our study, we observed that the percentage of morphologically intact follicles,
as well as the follicular survival probability decreased, whereas the rate of degenerated
follicles increased at the end of culture in the A4+SeqFSH treatment. Several authors
67
have described that during the in vitro culture of preantral follicles, the addition of FSH
either in increasing concentrations [3] or in decreasing concentrations associated to
dihydrotestosterone [7] increased follicle survival. It is well known that follicular
growth and atresia depends on a delicate balance between gonadotropin and paracrine
factors [25]. Therefore, we suggest that increasing concentrations of FSH associated
with androstenedione may cause a toxic effect, compromising the follicular physiology
through the inappropriate proliferation of GC [26].
In relation to extrusion rates, FSH treatments (fixed and sequential) presented an
increase of the rate of extruded follicles between Day 0 and Day18. It is known that
androgens increase the expression of FSH receptor (FSHR) in the GC [27,28]. Thus, we
propose that the association of androstenedione with FSH may have potentiated the
action of this hormone in the intrafollicular environment, hyperstimulating the
proliferation of GC [26] and consequently, causing the rupture of basal membrane and
releasing the cumulus-oocyte complexes. These findings are supported by the fact that
FSH treatments presented higher proportion of follicles in fast-growing category than
control group. Additionally, using the linear regression analysis it was possible to
observe a correlation between fast-growing follicles and follicles that degenerated
and/or extruded after antrum formation, implying that follicles require a slow growth
rate to maintain follicular viability.
In the present study, the A4+SeqFSH treatment was the only one that had lower
percentage of follicles that formed antrum and remained intact until the end of the
culture when compared to control. This fact can be explained by the high rates of
degeneration and/or extrusion after antrum formation observed in this treatment. Other
study tested the effect of different concentrations of androstenedione (10 and 100
ng/ml) in medium FSH-free on the in vitro culture of bovine early antral follicles and
68
demonstrated that both concentrations were able to maintain the antrum intact until the
end of culture [29].
This is the first study that evaluated the production of androstenedione during
the in vitro culture of goat preantral follicles. Despite the difference in androstenedione
concentrations at the onset of culture (0 ng/ml-control vs 10 ng/ml-A4 treatments), the
androstenedione levels on Day 6 were equivalent between control and A4 treatments. In
other words, the concentration of androstenedione was reduced at least 66 times in A4
treatments indicating a high rate of metabolization of androstenedione by cultured
follicles in these treatments. In addition, follicles cultured in the medium containing low
insulin were able to reduce adequate levels of androstenedione, resulting in equivalent
production of estradiol both on Day 6 and 18 of culture. This clearly shows that the
excessive metabolization of androstenedione was not used for estradiol production.
During the steroidogenesis process, androstenedione can be converted either to: (i)
testosterone by 17훽-HSD (17훽-hydroxisteroid dehydrogenase) which itself can then be
aromatised into estradiol by P450arom (CYP19) in CG (A4TE2), (ii) estrone by
P450arom (CYP19) for subsequent conversion in estradiol by 17훽-HSD in CG (A4
E1 E2), or (iii) testosterone by 17훽-HSD in TC which itself can then be converted
into dihydrotestosterone by 5훼-reductase in GC (A4 T DHT) [8]. Therefore, in our
study, we suggest that the major pathway used by the follicles cultured in A4 treatments
was A4DHT since the estradiol production did not differ among treatments regardless
the culture period. This assumption can be support by Bogovish and Richards [30]
which demonstrated the ability of GC from rodents to generate dihydrotestosterone
when treated with androstenedione. Moreover, WU et al. [31] demonstrated that the
addition of testosterone in medium containing FSH or not, promoted a stimulatory
effect of CYP19 in mice GC, which correlated with estradiol production.
69
Similar to the other studied end points the A4+SeqFSH treatment also showed
lower rates of meiosis resumption than control after oocyte in vitro maturation. The
control medium used in our experiment was previously developed by our team [20] that
defined the appropriated insulin concentration (10 ng/ml). Insulin is a major factor
related to follicular survival, growth and production of steroids hormones [20]. Like
androgens [27], studies have reported that insulin increases the expression of FSHR
[32,33]. We believe that androstenedione associated with insulin enhanced the action of
FSH on the in vitro culture of preantral follicles. The high FSH concentrations used in
the A4+SeqFSH treatment caused a deleterious effect on the meiosis resumption. This
result is in agreement with Sánchez et al. [26] that reported that higher concentrations of
FSH increased the levels of LH receptors (LHR) in mice cumulus cells, compromising
oocyte competence, since the upregulation of LHR is related to low oocyte quality [34].
In our study, surviving follicles were divided into three categories (non-, slow-
and fast-growing follicles), according to their growth rates. The growth rates are an
important parameter to evaluate the efficiency of follicular development in culture.
However, in our study, accelerated follicle growth was correlated with degeneration
and/or extrusion which may allow it to be used as a tool to predict follicular fate in
vitro. On the other hand, Xu et al. [35] demonstrated that in the culture of monkeys
preantral follicles, the production of anti-mullerian hormone (AMH) was correlated
with follicular growth, wherein early AMH production can predict further development
of cultured preantral follicles. Other studies using activin A in the culture medium of
isolated caprine preantral follicles showed that the treatment with the highest percentage
of fast-growing follicles also presented high meiotic resumption rates [23]. Differences
in the species, in the medium composition as well as in the classification on the follicle
growth categories may explain this controversial finding. For instance, in the culture of
isolated caprine preantral follicles, Silva et al. [23] classified fast-growing follicles as
70
those which showed growth rate higher than 10휇m/day, while in our study the follicles
that had a daily growth between 7.1 - 34 휇m/day were classified as fast-growing
follicles. Besides the presence of androstenedione in the majority of our treatments,
Silva et al. [23] used higher insulin concentration in the basic medium. This correlation
indicates that in the presence of androstenedione and increasing concentrations of FSH
the acceleration of follicular development was detrimental for efficiency of caprine
preantral follicles cultured in vitro.
In summary, the addition of androstenedione alone or associated with fixed
concentrations of FSH did not improve either follicular survival, development or steroidal
levels after in vitro culture. Moreover, increasing FSH concentrations associated with
androstenedione had a detrimental effect on follicle survival and oocyte meiotic
resumption. Finally, this study demonstrated that accelerated follicle growth negatively
affected the morphology of caprine preantral follicle cultured in vitro.
Acknowledgments
This work was carried out at the Laboratory of Manipulation of Oocytes and
Ovarian Preantral Follicles (LAMOFOPA), Faculty of Veterinary Medicine of Ceará
State University, Fortaleza, CE, Brazil, and supported by CNPq (407594/2013-2). Livia
Brunetti Apolloni is recipient of a grant from CAPES Brazil and José Ricardo de
Figueiredo is recipient of a grant from CNPq Brazil.
Disclosures
Conflict of interest: None of the authors declared having any conflict of interest.
71
Tables
Table 1.
Mean (± SEM) diameter of normal follicles cultured in vitro for 18 days in medium
containing androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations
of FSH.
Follicular diameter (µm)
Treatments Day 0 Day 6 Day 12 Day 18
Control 202.1 ± 7.4 a 238.7 ± 12.1 b 258.2 ± 13.9 c 289.3 ± 18.8 d
A4 213.4 ± 7.5 a 240.4 ± 11.1 b 271.6 ± 14.0 c 311.5 ± 21.3 d
A4+SeqFSH 202.1 ± 9.4 a 224.8 ± 12.8 b 278.9 ± 18.6 c 317.9 ± 29.9 d
A4+FixFSH 208.5 ± 7.9 a 240.9 ± 11.1 b 293.3 ± 18.4 c 325.9 ± 26.3 d
Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and fixed concentrations of rbFSH.. a,b,c,d Within treatment, uncommon
lowercase letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within the same day
(P > 0.05).
72
Table 2.
Mean (± SEM) daily growth of normal follicles cultured in vitro for 18 days in medium
containing androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations
of FSH.
Follicular growth (µm/day) on different intervals of culture
Treatments D0-D6 D6-D12 D12-D18 Overall (D0-D18)
Control 6.1 ± 1.4 Aa 3.2 ± 1.6 Aa 5.2 ± 1.5 Aa 4.8 ± 0.8 A
A4 4.5 ± 1.4 Aa 5.2 ± 2.0 ABa 6.6 ± 1.6 Aa 5.4 ± 1.1 A
A4+SeqFSH 3.8 ± 2.0 Aa 9.0 ± 2.2 B†b# 6.5 ± 2.7 Aab 6.4 ± 1.5 A
A4+FixFSH 5.4 ± 1.4 Aa 8.7 ± 2.1 ABa 5.4 ± 1.8 Aa 6.5 ± 1.2 A
Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. A,B Within interval time,
uncommon uppercase letters indicate difference (P < 0.05). † Tended to differ from
control group within the same interval of culture (P < 0.09). a,b Within treatment,
uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). # Tended to differ from D0-
D6 interval (P < 0.07).
73
Figures and legends
Figure 1. Percentage of intact follicles during in vitro culture in medium containing
androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations of FSH.
Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. A,B Within day, uncommon
uppercase letters indicate difference (P < 0.05). a,b Within treatment, uncommon
lowercase letters indicate difference (P < 0.05). ‡ Tended to differ from Day 18 (P <
0.08).
74
Figure 2. Follicle survival probability (Kaplan-Meier plot) during in vitro culture in
medium containing androstenedione associated or not with fixed and sequential
concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione;
A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;
A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. *
Differed from control ( P < 0.05).
75
Figure 3. Percentage of degenerated follicles during in vitro culture in medium
containing androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations
of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+
plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+
plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH.a,b Within treatment,
uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within
the same day (P > 0.05).
76
Figure 4. Percentage of extruded follicles during in vitro culture in medium containing
androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations of FSH.
Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within treatment, uncommon
lowercase letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within the same day
(P > 0.05).
77
Figure 5. (A) Representation of follicles (n = 169) classified according to growth rate in
non-, slow-, and fast-growing. (B) Frequency distributions of follicles in growing
categories during in vitro culture in medium containing androstenedione associated or
not with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+
plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione and sequential
concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH. a,b Within the same growing categories, uncommon lowercase
letters indicate difference (P < 0.05). # Tended to differ from control (P < 0.06). †
Tended to differ from control (P < 0.07).
78
Figure 6. Relationship between antrum formation and follicle diameter. Each point of
the graph is a follicle recorded during in vitro culture (n = 169). The follicles evaluated
were defined by binary values (without antrum formation = 0; presence of antrum
formation = 1) to dependent variable. A logistic regression (antrum predicted
probability) is represented by the equation and the black line [Logit P = -1.916 +
(0.0131 × follicle diameter); P < 0.05].
79
Figure 7. Mean (± SEM) daily growth rate of follicles according to their ability to form
antrum and maintain normal morphology. a,b,c Uncommon lowercase letters indicate
difference (P < 0.05).
80
Figure 8. Effect of the addition of androstenedione associated or not with fixed and
sequential concentrations of FSH on the antrum formation and maintenance of normal
morphology. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-
MEM+ plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-
MEM+ plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within the same
antrum conditions, uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05).
81
Figure 9. Relationship between antrum phenotypes conditions and follicular growth.
Each point of graph is a follicle recorded during in vitro culture (n = 169). The follicles
evaluated were defined by binary values (absence of antrum formation = 1; antrum
maintenance = 2; follicles degenerated and/or extruded after antrum formation = 3) to
dependent variable. A linear regression is represented by the equation and the black line
[Antrum formation conditions = 1.955 + (0.0162 × follicular growth); R2 = 0.08; r =
0.28; P < 0.001].
82
Figure 10. Percentage of meiotic resumption, germinal vesicle (GV), germinal
vesicle breakdow (GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II (MII) of oocytes
from preantral follicles cultured in vitro in medium containing androstenedione
associated or not with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-
MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus
androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+
plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within the same
parameter, values with different letters differ (P < 0.05). # Tended to differ from
A4+SeqFSH (P < 0.06).
83
Figure 11. Regression analysis of the chromatin configuration (GV, germinal
vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II)
and oocyte diameter. Each point of graph is a oocyte evaluated after in vitro
maturation (n = 68). The oocytes evaluated were defined by values (GV = 2;
GVBD = 3; MI = 4; and MII = 5) to chromatin configuration (dependent variable).
A linear regression is represented by the equation and the black line [chromatin
configuration = 1.507 + (0.00791 × oocyte diameter); R2 = 0.06; r = 0.24; P < 0.05].
84
Figure 12. Mean (± SEM) androstenedione levels from preantral follicles cultured
in vitro in medium containing androstenedione associated or not with fixed and
sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus
androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione and sequential
concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed
concentrations of rbFSH. A,B,C Within day, uncommon uppercase letters indicate
difference (P < 0.05). † Tended to differ from A4 (P < 0.07). Within treatment
between days (P > 0.05).
85
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90
7. CONCLUSÕES
Em conclusão, a suplementação do meio base com 10 ng/ml de androstenediona
ou sua associação com uma concentração fixa de FSH (100 ng/ml) não melhorou o
desenvolvimento de folículos pré-antrais isolados caprino, bem como a taxa de
retomada da meiose durante cultivo in vitro. Adicionalmente, associação de
androstenediona a concentrações crescentes de FSH prejudicou as taxas de
sobrevivência, formação de antro e retomada da meiose, além de aumentar a
percentagem de folículos degenerados e/ou extrusos após formação de antro. Além
disso, esta associação demonstrou-se prejudicial ao desenvolvimento folicular, uma vez
que acelerou o crescimento dos folículos pré-antrais cultivados in vitro nas condições
estudadas.
91
8. PERSPECTIVAS
O presente trabalho demonstrou que a adição de 10 ng/ml de androstenediona
associada a concentrações crescentes de FSH foi prejudicial para o desenvolvimento
folicular e maturação oocitária dos folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro.
Assim a etapa seguinte será testar outras concentrações de androstenediona
isoladamente ou em associação a diferentes concentrações fixas de FSH visando o
estabelecimento de um meio de cultivo eficiente para folículos pré-antrais isolados
caprino.
92
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